CN109575134A - 异嗜性抗体阻断剂hbr-6及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种异嗜性抗体阻断剂HBR‑6，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe‑Thr‑Ala‑Asp‑Thr‑Ser‑Ser，CDR2：Glu‑Asp‑Asp‑Pro，CDR3：Val‑Leu‑Asp‑Ser‑Asp‑Gly‑Ser‑Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn‑Ile‑Pro‑Lys‑Leu‑Leu‑Ile‑Tyr，CDR2：Ile‑Val‑Met‑Thr，CDR3：Gln‑Gly‑Glu‑Asp‑Ile‑Ala‑Thr‑Tyr‑Arg，具备良好的亲和性。同时本发明还提出了异嗜性抗体阻断剂HBR‑6的制备方法。

Description

异嗜性抗体阻断剂HBR-6及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，尤其是一种异嗜性抗体阻断剂HBR-6及其制备方法。
背景技术
阻断剂，也叫受体拮抗剂，指能与受体结合，并能阻止激动剂产生效应的一类配体物质。拮抗剂对相应受体有亲和性，但没有效能，从而抑制了激动剂对受体的作用。拮抗剂可以结合受体的活性位点，也可以结合别构位点，甚至单独结合通常没有生物调节作用的位点来达到效果。拮抗剂和受体结合性质不同，所以结合时间有长有短，结合的可逆性也有不同。
拮抗剂分为竞争性拮抗剂和非竞争性拮抗剂等类型。大部分药物拮抗剂都与内源性配体或底物竞争受体结合位点来达到效果。
受体是可被配体结合而激活的大型蛋白质分子。受体可以结合在细胞膜上，也可存在于细胞内部，比如在细胞核或线粒体中。受体在活性位点与配体以非共价键结合，一个受体上可以有多个结合不同配体的位点。配体和受体在活性位点或别构位点结合后，都可以调节受体的活性。拮抗剂可以通过结合活性位点、别构位点，或者单独结合通常不参与生物调节的位点来产生效果。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种异嗜性抗体阻断剂HBR-6，包括其可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，具备良好的亲和性。
实现本发明目的的技术解决方案为：
异嗜性抗体阻断剂HBR-6，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe-Thr-Ala-Asp-Thr-Ser-Ser，CDR2：Glu-Asp-Asp-Pro，CDR3：Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr，CDR2：Ile-Val-Met-Thr，CDR3：Gln-Gly-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Arg。
进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，所述重链可变区氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，所述重链可变区核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
进一步的，本发明的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，所述轻链可变区核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明还提出异嗜性抗体阻断剂HBR-6的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：采用33％-50％硫酸铵纯化抗体；
步骤2：进行戊二醛交联；
步骤3：对抗体进行处理；
步骤4：配制试剂：透析缓冲液和饱和硫酸铵。
本发明采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：
本发明筛选出异嗜性抗体阻断剂HBR-6，并获得其重链和轻链可变区，测序后得到其独特的核苷酸序列，具有良好的亲和性。
附图说明
图1是本发明的亲和力数据结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
实施例1
异嗜性抗体阻断剂HBR-6，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe-Thr-Ala-Asp-Thr-Ser-Ser，CDR2：Glu-Asp-Asp-Pro，CDR3：Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr，CDR2：Ile-Val-Met-Thr，CDR3：Gln-Gly-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Arg。
重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。
如图1所示，异嗜性抗体阻断剂HBR-6具备良好的亲和力，与其他阻断剂相比如下表所示：
表1
异嗜性抗体阻断剂HBR-6的制备方法具体包括以下步骤：
步骤1：采用33％-50％硫酸铵纯化抗体；
步骤2：进行戊二醛交联；
步骤3：对抗体进行处理；
步骤4：配制试剂：透析缓冲液和饱和硫酸铵。
实施例2
异嗜性抗体阻断剂HBR-6的制备方法如下：
一、33％-50％硫酸铵纯化抗体
1)脱脂棉过滤M0102腹水，量取过滤后的腹水体积，加入等体积0.01M PBS(pH7.4)，混匀，在慢速搅拌状态下用量筒缓慢匀速倒入二倍腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度为50％；
2)磁力搅拌器上中速搅拌5min，混匀，4℃静置1h；
3)混匀分装入离心杯，配平，10000r/min，4℃离心25min；
4)弃上清，沉淀用原两倍腹水体积0.01M PBS(pH7.4)重悬溶解，用0.01M PBS(pH7.4)进行透析(透析液≥10L/次)，期间换液三次，换液时间不少于4小时；
5)解透析袋，将抗体转移至烧杯，在缓慢搅拌状态下用量筒缓慢匀速倒入原腹水体积的饱和硫酸铵溶液，此时硫酸铵饱和度约为33％；
6)磁力搅拌器上中速搅拌5min，混匀，4℃静置1h；
7)混匀分装入离心杯，配平，12000r/min，4℃离心25min；
8)弃上清，沉淀用原腹水体积1/2的0.01M PBS pH7.4溶解，用0.01M PBS(pH7.4)进行透析(透析液≥10L/次)，期间换液3次，换液时间不少于4小时；
9)收集抗体，观察是否有沉淀。
9-1)有沉淀的样品用快速滤纸过滤去除沉淀，量取抗体体积；
9-2)无沉淀的抗体，直接量取抗体体积。轻轻混匀抗体，使用微量紫外分光光度计测定A280nm的蛋白含量，并记录测量值；
10)用0.01M PBS(pH7.4)稀释至17mg/ml，使用微量紫外分光光度计测定抗体浓度(A280模式测)，并记录测量结果，准备进行戊二醛交联。
二、戊二醛交联
1)量取上一步纯化得到的抗体(抗体浓度为：17mg/ml)体积，倒入烧杯中，置于冰浴1h；
2)将冰浴放在在磁力搅拌器上(在交联过程中始终保持冰量没过抗体液面)，边快速搅拌边加入25％戊二醛(250mg/ml)至终浓度为0.4mg/ml，加入时间约20S；
3)继续冰浴慢速搅拌10min；
4)在快速搅拌下，均匀加入甘氨酸(2M)至终浓度为0.01M，慢速搅拌30min。
5)样品0.01M PBS(pH7.4)缓冲液透析(透析液≥10L/次)，期间换液二次，换液时间不少于6小时；
6)解透析袋，样品5500r/min，4℃离心18min，取上清，使用紫外分光光度计测定抗体浓度，并记录测量结果。
三、抗体处理
慢速滤纸过滤，使用紫外分光光度计OD280nm检测抗体浓度，用0.01M PBS(pH7.4)缓冲液稀释至10mg/ml，加入总体积2％甘油甘油，再加入总体积0.1％Proclin300，-20℃保存。
四、试剂配制
1)透析缓冲液：10mM PBS(pH7.4)
品名 原料来源 1L标准量
磷酸氢二钠 北京益利 2.87g
磷酸二氢钠 北京益利 0.31g
氯化钠 北京益利 9g
超纯水 自制，质检合格 定容至1L
用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量超纯水，搅拌溶解，用2.5MNaoH调pH至7.4，定容至1L。
2)饱和硫酸铵
品名 原料来源 1L标准量
硫酸铵 北京益利 800g
超纯水 自制，质检合格 定容至1L
用电子天平称取上述试剂，倒入1L烧杯中，再加入适量超纯水，加热搅拌溶解，趁热过滤，静置至结晶析出，备用。
保存条件：-20℃(避免反复冻融)。
缓冲液：0.01M PBS(pH7.4)+2％甘油。
防腐剂：0.1％Proclin300。
检验依据：JDPJ-STP036-02。
物理性状：无色或淡黄色透明液体，无沉淀和絮状物。
效价(EIA)≤50μg/ml。
序列表
<110> 南京京达生物技术有限公司
<120> 异嗜性抗体阻断剂HBR-6及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu
1 5 10 15
Trp Ser Ala Asn Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Pro Asn Tyr Gly Phe
20 25 30
Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Gln Leu Gln Gln Ser Gly
35 40 45
Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala
50 55 60
Thr Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Asp
65 70 75 80
Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr Met Val Gln Ser
85 90 95
Ser Ile Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly
100 105 110
Arg Val Ser Ala Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Val Thr Ser Ser Ala Lys
115 120 125
Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly Asp Thr
130 135 140
Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Arg Cys Leu Val Lys Gly Tyr Ser Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Leu Pro Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Leu Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Asn Thr Leu Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Thr Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Gly Lys Glu Phe Lys
195 200 205
Cys Lys Asp Asn Asn Lys Asp Leu Ala Ala Pro Ile Arg Arg Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Ala Lys Gly Ser Val Cys Pro Arg Cys Lys Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Gly Pro Pro Lys Ile Lys
245 250 255
Asn Val Leu Met Ile Ser Lys Ser Pro Ile Val Thr Tyr Val Val Val
260 265 270
Asp Lys Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Gly
275 280 285
Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Asp Asp Tyr Ala Tyr Thr Leu Tyr
290 295 300
His Ser Thr Leu Arg Ala Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln Ala Gln Asp
305 310 315 320
Trp Met Pro Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Thr Pro Pro Arg Glu Glu
325 330 335
Glu Arg Thr Lys Lys Gln Val Thr Arg Thr Cys Met Val Arg Asp Phe
340 345 350
Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu
355 360 365
Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
370 375 380
Phe Val Tyr Lys Leu Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Thr Ser
385 390 395 400
Pro Ser Gln Ser Ile Thr Arg Asn Val Ala Asn Pro Ala Ser Ser Pro
405 410 415
Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His
420 425 430
Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg
435 440
<210> 2
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Val Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
1 5 10 15
Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Thr Ser Asn Arg Asp
20 25 30
Arg Ala Asp Leu Ile Gly Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
35 40 45
Ala Asp Val Ala Pro Thr Ala Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
50 55 60
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Tyr Cys Gln Gln Gly Gln
65 70 75 80
Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Phe Leu Asn Lys Asn Pro Trp Thr Asp Gln
85 90 95
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
100 105 110
Asp Val Leu Ser Lys Ser Cys Asp Ser Lys His Ser Thr Tyr Ser Thr
115 120 125
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
130 135 140
Tyr Thr Thr Glu Ala Thr His Ile Ile Ser Thr Ser Pro Ile Val Arg
145 150 155 160
Ser Phe Asn Asp Arg Phe Lys Asp Ser Asn Val Lys Cys Glu Ile Asp
165 170 175
Gly Ser Glu Arg Leu His Thr Gly Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Gly Glu
195 200 205
Asp Ile Ala Thr Tyr Arg Asn Glu Gly Ile Gln Asn Gly Val Leu
210 215 220
<210> 3
<211> 1329
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggtgtgga tcgagtgggt gaagcagaga cccggccacg gcctggagtg gagcgccaac 60
atcctgcccg gcagcggcag ccccaactac ggcttcccct actggggcca gggcaccctg 120
gtgacccagc tgcagcagag cggcgccgag ctgatgaagc ccggcgccag cgtgaagatc 180
agctgcaagg ccaccggcta caccttcagc agctacaacg agaagttcaa gggcaaggac 240
accttcaccg ccgacaccag cagcaacacc gcctacatgg tgcagagcag catcaccagc 300
gaggacagcg ccgtgtacta ctgcgccaga agaggcagag tgagcgccga gagaaacagc 360
tacagcgtga ccagcagcgc caagaccacc gcccccagcg tgtaccccct ggcccccgtg 420
tgcggcgaca ccaccggcag cagcgtgacc ctgagatgcc tggtgaaggg ctacagcccc 480
gagcccgtga ccctgccctg gaacagcggc agcctgagca gcggcgtgca caccctgccc 540
gccgtgctgc agagcggcct gaacaccctg agcagcagcc tgacccccag aggccccacc 600
atcaagcccg gcaaggagtt caagtgcaag gacaacaaca aggacctggc cgcccccatc 660
agaagaacca tcagcaaggc caagggcagc gtgtgcccca gatgcaagtg ccccgccccc 720
aacctgctgg gcggccccag cgtgttcatc ggccccccca agatcaagaa cgtgctgatg 780
atcagcaaga gccccatcgt gacctacgtg gtggtggaca agagcgagga cgaccccgac 840
gtgcagatca gctggttcgt gggcaacgtg gaggtgcaca ccgcccagga cgactacgcc 900
tacaccctgt accacagcac cctgagagcc gtgagcgccc tgcccatcca ggcccaggac 960
tggatgccca gagcccccca ggtgtacgtg acccccccca gagaggagga gagaaccaag 1020
aagcaggtga ccagaacctg catggtgaga gacttcatgc ccgaggacat ctacgtggag 1080
tggaccaaca acggcaagac cgagctgaac tacaagaaca ccgagcccgt gctggacagc 1140
gacggcagct acttcgtgta caagctgctg agagtggaga agaagaactg ggtgaccagc 1200
cccagccaga gcatcaccag aaacgtggcc aaccccgcca gcagccccaa ggtggacaag 1260
aagatcgagt gcagcgtggt gcacgagggc ctgcacaacc accacaccac caagagcttc 1320
agcagatga 1329
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<211> 671
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgccagcc agaacatcaa ggtgtggctg agctggtacc agcagaagcc cggcaacatc 60
cccaagctgc tgatctacaa gaccagcaac gagacagagc cgacctgatc ggcggcggcg 120
gcaccaagct ggagatcaag agagccgacg tggcccccac cgccagcatc ttccccccca 180
gcagcgagca gctgaccagc ggcggcgcca gcgtggtgtg ctactgccag cagggccaga 240
gctacccctt caccttcttc ctgaacaaga acccctggac cgaccaggac atcgtgatga 300
cccagacccc cagcagcctg agcgccagcc tgggcgacgt gctgagcaag agctgcgaca 360
gcaagcacag cacctacagc accagcagca ccctgaccct gaccaaggac gagtacgaga 420
gacacaacag ctacaccacc gaggccaccc acatcatcag caccagcccc atcgtgagaa 480
gcttcaacga cagattcaag gacagcaacg tgaagtgcga gatcgacggc agcgagagac 540
tgcacaccgg cgtgagcagc agattcagcg gcagcggcag cggcaccgcc ttcaccctga 600
ccatcagcag cctgcagggc gaggacatcg ccacctacag aaacgagggc atccagaacg 660
gcgtgctgtg a 671

Claims (6)

1.异嗜性抗体阻断剂HBR-6，其特征在于，包括重链和轻链，其中，重链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Phe-Thr-Ala-Asp-Thr-Ser-Ser，CDR2：Glu-Asp-Asp-Pro，CDR3：Val-Leu-Asp-Ser-Asp-Gly-Ser-Tyr；轻链的3个互补决定区CDR序列分别为，CDR1：Asn-Ile-Pro-Lys-Leu-Leu-Ile-Tyr，CDR2：Ile-Val-Met-Thr，CDR3：Gln-Gly-Glu-Asp-Ile-Ala-Thr-Tyr-Arg。
2.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，其特征在于，所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，其特征在于，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，其特征在于，所述重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
5.根据权利要求1所述的异嗜性抗体阻断剂HBR-6，其特征在于，所述轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
6.异嗜性抗体阻断剂HBR-6的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：采用33％-50％硫酸铵纯化抗体；
步骤2：进行戊二醛交联；
步骤3：对抗体进行处理；
步骤4：配制试剂：透析缓冲液和饱和硫酸铵。
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CN111393523A (zh) * 2020-01-27 2020-07-10 江苏帆博生物制品有限公司 一种ha阻断剂的制备方法、抗体检测系统
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