KR20200003830A

KR20200003830A - 자궁내막증의 치료를 위한 gpr84의 억제제 및 길항제

Info

Publication number: KR20200003830A
Application number: KR1020197033271A
Authority: KR
Inventors: 프랑크 자허; 마이크 오벤도르프; 게르노트 랑게르; 에스트라다 페르난도 마르티네즈; 우도 오페르만; 캐서린 쉥
Original assignee: 바이엘 파마 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2017-05-16
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2020-01-10
Also published as: JP2020519662A; CA3063489A1; AU2018269328A1; PE20191746A1; AR111801A1; BR112019023999A2; EP3624781A1; TW201900214A; SG11201909783VA; EP3403649A1; US20210401823A1; MX2019013734A; CN110573146A; WO2018210822A1

Abstract

본 발명은 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 G 단백질-커플링된 수용체 84 (GPR84)의 길항제 또는 억제제 뿐만 아니라 그와 같은 길항제 또는 억제제의 스크리닝 방법 뿐만 아니라 진단 방법에 관한 것이다.

Description

자궁내막증의 치료를 위한 GPR84의 억제제 및 길항제

본 발명은 인간 GPR84 억제제 및 길항제의, 자궁내막증의 치료 및/또는 예방을 위한 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 억제제 및 길항제는 항체, 핵산, 압타머(aptamer) 또는 소형 분자이다. 본 발명은 또한 그와 같은 억제제 및 길항제를 탐색하기 위한 검정 및 스크리닝 기술을 제공한다.

자궁내막증은 생식 연령의 여성 중 5-10 %에 영향을 주고 있는데, 주로 골반 강 내에서 발견되는 자궁외 위치에서의 자궁내막 조직의 성장으로 정의된다. 이와 같은 자궁-외 성장에는 만성적으로 염증화된 미세환경으로 이어지며 만성 통증 증후군에 기여하는 기본적인 질환 징후로서의 전-염증성 대식세포의 침윤이 동반된다.

자궁내막증이 있는 여성의 복막 병변 및 액은 T-림프구 이외에 자연 살해 (NK) 세포 및 포식성 대식세포를 포함한 백혈구의 침윤을 특징으로 하는데 [1, 2], 이들은 합쳐져 질환을 특징짓는 전-염증성 환경에 기여한다. 백혈구 침윤의 존재 이외에, 자궁내막증은 시토카인과 같은 염증 매개인자, 및 2종의 전-통각 매개인자(pro-algesic mediator)인 TNF알파 및 IL-1베타를 포함한 성장 인자의 농도 상승을 특징으로 한다 [3].

중간-사슬 지방산 (MCFFA)은 6 내지 12개 탄소 원자의 테일(tail)을 갖는 지방산으로, GPR84를 활성화할 수 있다 [4]. 동물 대사를 위한 FA의 두 가지 공급원이 존재하는데, 외인성-유래 (식이) FA 및 내인성-합성 FA이다. 후자의 생합성은 FASN에 의해 촉매된다 [5]. MCFFA는 연골세포에서 IL6의 방출을 자극하는데 [6], 미리스트산은 인간 관상 동맥 평활근 (HCASM) 및 내피 (HCEC) 세포에서 IL6 및 IL8 농도를 증가시킨다 [7].

GPR84는 유리 지방산 (FFA) 수용체의 군에 속한다 [8]. FFA 수용체의 군은 4종의 GPCR (FFA1-FFA2) 및 새로운 구성원인 GPR42 및 GPR84로 이루어진다. FFA 수용체는 대사 및 면역 기능과 같은 생물학적 과정과 연관되어 있다 [8].

더 넓은 발현 패턴을 갖는 모든 다른 FFA 수용체와 달리, GPR84는 주로 다양한 백혈구 군집에서 발현되는 것으로 기술되어 있다 [8].

지금까지, 자궁내막증의 치료법은 존재하지 않지만, 두 가지 개입 유형이 존재하는데: 통증의 치료 및 자궁내막증-연관 불임의 치료이다. 약제 치료법과 관련하여서는, 호르몬 치료법 (프로게스테론, 프로게스틴, 제노에스트로겐, 경구 피임제, 다나졸 (다노크린), 게스트리논, 고나도트로핀-방출 호르몬 (GnRH) 효능제 또는 아로마타제 억제제), NSAID, 아편유사제 또는 펜톡시필린이 투여될 수 있으며, 동시에 자궁내막, 유착의 추가적인 수술적 제거, 자궁내막종의 절제, 및 정상적인 골반 구조의 복구가 사용될 수 있다. 약제 및 수술적 개입은 대략 동등한 통증-경감 이익을 산출한다. 통증의 재발은 의약 및 수술 개입에서 각각 44 및 53 %인 것으로 밝혀져 있다 (24).

그러나, 오늘날 치료 선택사항은 제한되면서도 만족스럽지 않아서, 효능, 지속성, 부작용 감소, 환자 순응성 등의 면에서 더 우수한 치료 선택사항을 제공하는 것에 대한 요구가 남아 있다.

상기 및 기타 목적은 본 발명의 독립 청구항에 따른 방법 및 수단에 의해 충족된다. 종속 청구항은 구체적인 실시양태에 관한 것이다.

본 발명을 상세하게 기술하기 전에, 기술되는 장치 또는 조성물의 특정 구성요소 부분 또는 구조적 특징, 또는 기술되는 방법의 방법 단계로 본 발명이 제한되지는 않는다는 것이 이해되어야 하는데, 그와 같은 장치 및 방법이 가변적일 수 있기 때문이다. 본원에서 사용되는 용어가 특정 실시양태를 기술하는 것만을 목적으로 하며, 제한하고자 하는 것이 아니라는 것 역시 이해되어야 한다. 특정 수단이 서로 다른 종속 청구항에서 언급된다는 단순한 사실이 해당 수단의 조합이 유리하게 사용될 수 없음을 표시하는 것은 아니다. 청구범위의 어떠한 참조 기호도 영역을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다. 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용될 때, 단수 형태에는 문맥상 분명하게 달리 지정되지 않는 한 단수 및/또는 복수의 언급이 포함된다는 것을 주지해야 한다. 또한, 청구범위에서, "포함하는"이라는 말이 다른 요소 또는 단계를 배제하는 것은 아니다. 특정 수단이 서로 다른 종속 청구항에서 언급된다는 단순한 사실이 해당 수단의 조합이 유리하게 사용될 수 없음을 표시하는 것은 아니다.

숫자 값에 의해 한계가 정해지는 파라미터 범위가 주어지는 경우, 상기 범위는 해당 한계 값을 포함하는 것으로 여겨진다는 것 또한 이해되어야 한다.

본원에서 개시되는 실시양태가 서로 관계가 없게 되는 개별 실시양태로 이해되어야 함을 의미하지는 않는다는 것 또한 이해되어야 한다. 하나의 실시양태를 사용하여 논의되는 특징은 본원에서 나타내는 다른 실시양태와 연계하여서도 개시될 수 있음을 의미한다. 일례로, 특정 특징이 하나의 실시양태를 사용하여서는 개시되지 않으나 또 다른 것을 사용하여서는 개시되는 경우, 통상의 기술자라면, 그것이 반드시 해당 특징이 상기 다른 실시양태를 사용하여 개시될 수 있음을 의미하지는 않는다는 것을 의미하지는 않음을 이해하고 있을 것이다. 통상의 기술자라면, 다른 실시양태를 위해서도 상기 특징을 개시하는 것이 본 출원의 요지라는 것, 그러나 단지 명료성을 목적으로, 그리고 감당가능한 양으로 명세서를 유지하기 위하여, 그것이 수행되지는 않았다는 것을 이해하고 있을 것이다.

본 발명 맥락에서의 "억제" 또는 "감소"는 측정되는 결과를 대조군, 예컨대 미-처리 대조군과 비교하였을 때 적어도 20 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 더욱 바람직하게는 적어도 75 %까지 감소시키는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시내용의 교시를 고려해 볼 때, 적합한 대조군은 통상의 기술자에게 자명한 것이다. 상기 억제 또는 감소를 측정하는 데에 적합한 검정은 관련 문헌에서 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다. 한 실시양태에서는, 본원에서 하기에 언급되는 cAMP 방출 검정이 상기 억제 또는 감소를 측정하는 데에 사용된다.

"억제"와 "길항하는 것" 뿐만 아니라, "억제제"와 "길항제"는 본원에서 호환가능하게 사용된다.

바람직한 실시양태에서, "억제"라는 용어는 특이적 억제를 지칭한다. "특이적 억제"는 다른 수용체, 바람직하게는 다른 G-단백질 커플링된 수용체(G-protein coupled receptor) (GPCR)는 유의하게 억제되지 않으면서 거명된 수용체를 억제하는 것을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, "GPR84의 특이적 억제"는, 1종 이상의 멤브레인 수송체 또는 다른 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR), 바람직하게는 노르에피네프린 (NET), 도파민 (DAT), 칼륨 채널 hERG, 칼륨 채널 (KATP), GPR40으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상은 유의하게 억제하지 않으면서, GPR84 활성을 억제하는 것을 지칭한다. 바람직한 실시양태에서, "다른 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)"는 GPR40을 지칭한다.

바람직한 실시양태에서, GPR84의 특이적 억제는, 다른 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR)로 이루어진 군에서 선택되는; 바람직하게는 노르에피네프린 (NET), 도파민 (DAT), 칼륨 채널 hERG, 칼륨 채널 (KATP) 및 GPR40으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상 멤브레인 수송체의 활성은 75 % 이하, 더욱 바람직하게는 50 % 이하, 더욱 더 바람직하게는 10 % 이하까지 억제하면서, 대조군과 비교하였을 때 적어도 20 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 더욱 바람직하게는 적어도 75 %까지 GPR84 활성을 억제하는 것을 지칭한다. 상기 억제 또는 감소를 측정하기 위한 적합한 검정은 관련 문헌에서 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다. 한 실시양태에서는, 본원에서 하기에 언급되는 cAMP 방출 검정이 상기 억제 또는 감소를 측정하는 데에 사용된다. 다른 수용체의 억제는 실시예의 실험에 예시되어 있으며와 같이 평가될 수 있다.

본 발명의 한 실시양태에 따라, 하기 환자의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 G 단백질-커플링된 수용체 84 (GPR84)의 길항제 또는 억제제가 제공된다:

자궁내막증으로 고통받고 있는 환자,

자궁내막증이 발병할 위험이 있는 환자, 및/또는

자궁내막증으로 진단되는 환자.

본 발명의 발명자들은 놀랍게도 자궁내막증 환자의 염증 세포 유형 및 이환된 조직에서 GPR84가 발현된다는 것을 발견하였으며, 또한 GPR84 억제가 이와 같은 이상, 예컨대 염증성 통증에 대하여 경감 효과를 갖는다는 것을 밝혔다. 특히, GPR84 억제는 시험관내 자궁내막증 모델에서 전-염증 및 전-통각 매개인자, 예컨대 IL-1베타 및 TNF알파를 감소시켰다. 이에 따라, TNF알파 및 IL-1베타 양자 농도의 자궁내막증과 연관된 상승된 농도를 감소시키는 방법을 사용한 자궁내막증 및 그 연관 증상의 치료는 자궁내막증의 증상 및 질환 진행을 치료하는 데에 있어서 잠재력을 갖는다. 구체적인 실시양태에서, 상기 길항제 또는 억제제는 자궁내막증-연관 염증성 통증을 치료하기 위한 것이다.

또한, 본원에서는, GPR84 효능제, 예컨대 중간 사슬 지방산 (MCFA)이 자궁내막 조직 및 병변에 존재하며, 질환을 특징짓는 염증 매개인자의 상승에 기여한다는 것을 밝힌다.

본원에서 사용될 때, "GPR84의 길항제 또는 억제제"라는 용어는 GPR84의 활성을 바람직하게는 적어도 20 %, 바람직하게는 적어도 50 %, 더욱 바람직하게는 적어도 75 %까지 직접적인 것 또는 간접적인 것 중 어느 하나로 감소시키거나 억제할 수 있는 화합물을 지칭한다. 상기 억제 또는 감소를 측정하기 위한 적합한 검정은 관련 문헌에서 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다. 한 실시양태에서는, 본원에서 하기에 언급되는 cAMP 방출 검정이 상기 억제 또는 감소를 측정하는 데에 사용된다.

바람직하게는, GPR84의 상기 길항제 또는 억제제는 상기에서 정의된 바와 같은 선택적 GPR84 억제제이다.

예를 들면, 그와 같은 GPR84 활성은 예컨대 인간 및 뮤린 PBMC 또는 대식세포에서의 염증 매개인자 방출과 같은 GPR84의 하류 이펙터 기능이다.

상기 감소 또는 억제는 예를 들면 내인성 및 합성 GPR84 효능제 결합을 감소시키거나 억제하는 것에 의해 달성될 수 있다. 효능제 결합의 상기 감소 또는 억제는 예를 들면 GPR84 단백질에의 경쟁적 또는 알로스테리형 결합에 의해 이루어질 수 있다.

GPR84의 바람직한 효능제는 바람직하게는 9 내지 14의 탄소 사슬 길이를 갖는 중간 사슬 유리 지방산 (MCFFA)이다 (본원에 참조로 포함되는 25, 19 참조). 여기에는 특히 2-OH 데칸산 및 데칸산이 포함되는데, 이들은 특히 바람직한 GPR84 효능제이다.

GPR84의 인공 효능제는 6-n-옥틸아미노우라실 (6-OAU)이다 (본원에 참조로 포함되는 17 참조). 기타 바람직한 인공 효능제가 기술되어 있는데; 예를 들면 3,3'-디인돌릴메탄 (본원에 참조로 포함되는 19 참조) 및 엠벨린(Embelin) (본원에 참조로 포함되는 WO2007027661 A1호 참조)이다. 하기 표는 본 발명에 따른 일부 선택된 효능제를 나타낸다.

한 실시양태에서, 길항제는 GPR84에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체이거나, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체이다. 상기 항체는 바람직하게는 모노클로날 항체 (mAb)이다.

본원에서 사용될 때, "모노클로날 항체"라는 용어는 균질한 항체 군집, 즉 전체 이뮤노글로불린, 또는 그의 항원 결합 단편 또는 유도체로 이루어진 균질한 군집을 포함하는 항체 조성물을 지칭할 수 있다. 특히 바람직하게는, 그와 같은 항체는 IgG, IgD, IgE, IgA 및/또는 IgM, 또는 이들의 단편 또는 유도체로 이루어진 군에서 선택된다.

본원에서 사용될 때, "단편"이라는 용어는 표적 결합 능력을 보유하는 그와 같은 항체의 단편, 예를 들면 하기를 지칭할 수 있다:

CDR (상보성 결정 영역),

초가변 영역,

가변 도메인 (Fv),

IgG 중쇄 (VH, CH1, 힌지, CH2 및 CH3 영역으로 이루어짐),

IgG 경쇄 (VL 및 CL 영역으로 이루어짐), 및/또는

Fab 및/또는 F(ab)₂.

본원에서 사용될 때, "유도체"라는 용어는 일반적인 항체 개념과 구조적으로 상이하지만 예를 들면 scFv, Fab 및/또는 F(ab)₂ 뿐만 아니라 2-, 3- 또는 더 고급의 특이적 항체 구축물 또는 1가 항체와 같이 아직 소정의 구조적 관련성은 가지고 있으며, 추가적으로 표적 결합 능력을 보유하는 단백질 구축물을 지칭할 수 있다. 이러한 모든 항목은 하기에서 설명한다.

통상의 기술자에게 알려져 있는 다른 항체 유도체로는 이분절체, 낙타류 항체, 나노바디, 도메인 항체, scFv로 이루어진 2개의 사슬을 갖는 2가 단일이량체, IgA (J 사슬 및 분비 구성요소에 의해 연결되어 있는 2개의 IgG 구조), 샤크 항체, 신세계 영장류 골격 더하기 비-신세계 영장류 CDR로 이루어진 항체, CH3+VL+VH를 포함하는 이량체화된 구축물, 및 항체 접합체 (예컨대 독소, 시토카인, 방사성동위원소 또는 표지에 연결된 항체 또는 단편 또는 유도체)가 있다. 이러한 유형에 대해서는 문헌에 충분히 기술되어 있어서, 본 개시내용을 바탕으로 추가적인 창의적인 활동을 부가하여 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다.

상기에서 논의된 바와 같이, GPR84는 통상의 기술자가 그에 대하여 모노클로날 항체와 같은 항체를 제조하는 것을 가능하게 하기에 충분하게 구체화되어 있다. 일상적인 방법에는 하이브리도마, 키메라화/인간화, 파지 디스플레이/트랜스제닉 포유동물, 및 기타 항체 공학 기술이 포함된다.

하이브리도마 세포의 제조 방법에 대해서는 이미 기술되어 있다 (본원에 참조로 포함되는 [30] 참조). 기본적으로, 예를 들면 마우스가 인간 GPR84 단백질에 의해 면역화된 후, 상기 마우스로부터의 B-세포 단리 및 단리된 B-세포의 골수종 세포와의 융합이 이어진다.

키메라 또는 인간화 mAb의 제조 및/또는 선택 방법은 관련 기술분야에 알려져 있다. 기본적으로, 예를 들면 표적 결합에 연관되어 있지 않은 뮤린 항-GPR84 항체로부터의 단백질 서열이 상응하는 인간 서열로 대체된다. 예를 들어, 제넨테크(Genentech)의 US6331415호는 키메라 항체의 제조에 대해 기술하고 있는 반면, 메디칼 리서치 카운실(Medical Research Council)의 US6548640호는 CDR 그래프팅 기술에 대해 기술하고 있으며, 셀테크(Celltech)의 US5859205호는 인간화된 항체의 제조에 대해 기술하고 있다. 이들 개시내용 모두는 본원에 참조로 포함된다.

완전 인간 mAb의 제조 및/또는 선택 방법이 관련 기술분야에 알려져 있다. 여기에는 인간 GPR84에 의해 면역화된 트랜스제닉 동물의 사용, 또는 라이브러리로부터의 항체가 정상 단계에서 인간 GPR84에 대하여 스크리닝되는, 효모 디스플레이, 파지 디스플레이, B-세포 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 적합한 디스플레이 기술의 사용이 포함될 수 있다.

시험관내 항체 라이브러리는 특히 모르포시스(MorphoSys)의 US6300064호 및 MRC/스크립스(Scripps)/스트라타진(Stratagene)의 US6248516호에 개시되어 있다. 파지 디스플레이 기술은 예를 들면 디악스(Dyax)의 US5223409호에 개시되어 있다. 트랜스제닉 포유동물 플랫폼은 예를 들면 타코닉아르테미스(TaconicArtemis)의 EP1480515A2호에 기술되어 있다. 이들 개시내용 모두는 본원에 참조로 포함된다.

IgG, scFv, Fab 및/또는 F(ab)₂는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있는 항체 포맷이다. 관련 구현 기술은 각 교재로부터 이용가능하다.

본원에서 사용될 때, "Fab"라는 용어는 항원 결합 영역을 포함하는 IgG 단편과 관련되는 것으로, 상기 단편은 항체의 중쇄 및 경쇄 각각으로부터의 하나의 불변 및 하나의 가변 도메인으로 구성된다.

본원에서 사용될 때, "F(ab)₂"라는 용어는 하나 이상의 디술피드 결합에 의해 서로 연결된 2개의 Fab 단편으로 이루어진 IgG 단편과 관련된다.

본원에서 사용될 때, "scFv"라는 용어는 보통 세린 (S) 또는 글리신 (G)인 짧은 링커에 의해 서로 연결된 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 융합체인 단일-사슬 가변 단편과 관련된다. 이와 같은 키메라 분자는 불변 영역의 제거 및 링커 펩티드의 도입에도 불구하고, 원래 이뮤노글로불린의 특이성을 유지하고 있다.

변형된 항체 포맷으로는 예를 들면 2- 또는 3특이성 항체 구축물, 항체-기반 융합 단백질, 면역접합체 등이 있다. 이러한 유형에 대해서는 문헌에 충분히 기술되어 있어서, 본 개시내용을 바탕으로 추가적인 창의적인 활동을 부가하여 통상의 기술자에 의해 사용될 수 있다. 또한, 1가인 항체 역시 US 2004/0033561 A1호 (본원에서는 모노바디로 지칭됨) 또는 WO2007048037호에 이미 기술되어 있으며; 모두 본원에 참조로 포함된다.

이에 따라, 예를 들면 해당 활성 중심에 결합하는 것에 의해 GPR84의 길항제로 작용할 수 있는 적합한 항체, 또는 단편 또는 유도체를 탐색하는 것은 GPR84 아미노산 서열의 공공 이용가능성으로 볼 때 통상의 기술자에게는 일상적인 문제이다.

과학 연구를 위한 GPR84의 폴리클로날 항체는 예를 들어 소수만 거명하자면 서모피셔(ThermoFischer) (PA5-32843), 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology) (H-300, D-15) 또는 노부스 바이올로지칼스(Novus Biologicals) (NBP1-84768)로부터 시중에서 구입가능하며, 이에 따라 통상의 기술자가 GPR84에 대한 치료용 항체를 제조할 수 있음을 입증하고 있다.

GPR84가 7-막횡단 수용체 단백질이기 때문에, 항체 또는 그의 단편 또는 유도체는 GPR84의 세포외 또는 세포내 도메인에 결합할 수 있다. 후자의 경우, 항체 또는 그의 단편 또는 유도체는 세포내 공간으로 전송 또는 수송될 필요가 있다. 일상적인 기술이 이와 같은 목적으로 이용가능하며, 다른 곳 (본원에 참조로 포함되는 26-28)에 개시되어 있다.

한 실시양태에서, 상기 길항제 또는 억제제는 핵산 억제제이다. 이와 같은 실시양태는 예를 들면 GPR84 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 서브스트레치(substretch)에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 따른, 참조 번호 Q9NQS5하에 유니프롯(Uniprot)에 개시된 바와 같은 AA 서열을 포함하는 GPR84 단백질을 코딩한다.

많은 핵산 억제제 접근법이 그와 같은 억제성 핵산 분자의 표적 서열, 즉 GPR84를 코딩하고 있는 폴리뉴클레오티드와의 염기 쌍형성에 의존한다. GPR84를 코딩하고 있는 상기 폴리뉴클레오티드는 mRNA 또는 게놈 DNA 중 어느 하나일 수 있다.

바람직하게는, 상기 억제제는 siRNA, shRNA, crRNA 또는 안내 RNA로 이루어진 군에서 선택된다.

siRNA는 안정성을 강화하도록 화학적으로 변형될 수 있는 짧은 인공 RNA 분자이다. siRNA는 이중-가닥이기 때문에, '센스' 및 '안티센스' 가닥의 원리도 적용된다. 센스 가닥은 전사되는 mRNA의 것과 동일한 염기 서열을 가지며, 안티센스 가닥은 상보성인 서열을 갖는다. 기술적으로, 환자에게 투여되는 siRNA 분자는 아르고넛(Argonaut)으로 지칭되는 세포내 효소에 의해 결합되어, 소위 RNA-유도된 침묵화 복합체 (RISC)를 형성한다. siRNA의 안티센스 가닥은 RISC를 표적 mRNA로 안내하고, 거기에서 이후 RISC에 의해 절단되는 표적 mRNA와 안티센스 가닥이 혼성화된다. 그와 같은 방식으로, 각 mRNA의 번역은 중단된다. 이후, RISC는 다른 mRNA를 절단할 수 있다. 전달 기술은 예를 들면 다른 곳 (본원에 참조로 포함되는 [29])에 개시되어 있다. siRNA용으로 적합한 서열을 탐색하는 것은 GPR84의 여러 mRNA 이소형의 공공 이용가능성으로 볼 때 통상의 기술자에게는 일상적인 문제이다.

shRNA는 RNA 간섭 (RNAi)을 통하여 표적 유전자 발현을 침묵화하는 데에 사용될 수 있는 긴밀한 헤어핀 회전을 갖는 인공 RNA 분자이다. shRNA는 예를 들면 플라스미드에 의해, 또는 바이러스 또는 세균 벡터를 통하여 세포로 전달될 수 있다. shRNA는 그것이 상대적으로 낮은 분해율 및 전환율을 갖는다는 점에서 유리한 RNAi 매개인자이다. 각 플라스미드는 폴리머라제 III 프로모터 예컨대 U6 및 H1 또는 폴리머라제 II 프로모터와 같은 shRNA를 발현하는 데에 적합한 프로모터를 포함한다. 일단 플라스미드 또는 벡터가 숙주 게놈에 통합되고 나면, shRNA는 핵에서 전사된다. 생성물은 프리-마이크로RNA (pri-miRNA)와 유사하며, 드로샤(Drosha)에 의해 프로세싱된다. 생성되는 전-shRNA는 엑스포틴(Exportin) 5에 의해 핵으로부터 외수송된다. 이와 같은 생성물은 이후 다이서(Dicer)에 의해 프로세싱되어, RNA-유도된 침묵화 복합체 (RISC)에 적재되고, 이후 siRNA에서와 동일한 침묵화가 이어진다. shRNA용으로 적합한 서열을 탐색하는 것은 GPR84의 여러 mRNA 이소형의 공공 이용가능성으로 볼 때 통상의 기술자에게는 일상적인 문제이다.

첫 번째 핵산 분자는 크리스퍼(CRISPR) Cas 시스템 (31)의 안내 RNA일 수 있는데, 상기 안내 RNA는 GPR84 유전자의 게놈 가닥과 혼성화될 수 있는 표적 특이적 crRNA ("소형 간섭 크리스퍼 RNA")를 포함한다 (또는 첫 번째 핵산 분자는 crRNA 단독일 수 있음). 상기 안내 RNA/crRNA는 엔도뉴클레아제인 Cas 효소를 GPR84 유전자로 안내할 수 있으며, 거기에서 Cas 효소는 서열특이적 가닥 절단을 수행한다. 하나 이상의 이중 가닥 절단을 생성시킴으로써, GPR84 유전자는 결과적으로 침묵화될 수 있다. GPR84의 생체내 유전자 침묵화에 상기 시스템을 사용하기 위해서는, 예를 들면 다른 곳 (32)에서 논의되는 바와 같은 지질 나노입자와 같은 전달 비히클을 포함하는 전용 전달 기술이 필요하다. 안내 RNA에 포함되는 crRNA용으로 적합한 서열을 탐색하는 것은 GPR84 유전자 게놈 서열의 공공 이용가능성으로 볼 때 통상의 기술자에게는 일상적인 문제이다.

또 다른 실시양태에서, 상기 첫 번째 핵산 분자는 크리스퍼 Cpf1 시스템 (33)의 안내 RNA일 수도 있는데, 상기 안내 RNA는 표적 특이적 crRNA ("소형 간섭 크리스퍼 RNA")를 포함한다. 크리스퍼/Cas와 유사하게, 상기 안내 RNA는 엔도뉴클레아제인 Cpf1 효소를 GPR84 유전자로 안내할 수 있다. 기술적 고려사항, 예컨대 생체내 적용을 위한 전달 및 첫 번째 핵산 분자용으로 적합한 서열의 탐색과 관련하여서는, 크리스퍼/Cas에서와 유사한 측면이 적용된다.

크리스퍼 기술의 추가적인 실시양태가 다양한 엔도뉴클레아제를 사용하여 현재 개발 중에 있다. 그러나, 이러한 모든 접근법은 표적 서열과 혼성화되는 표적-특이적 RNA (크리스퍼 Cas에서와 같은 안내 RNA 또는 crRNA)를 사용한다. 이러한 모든 경우에서, 표적-특이적 RNA는 본원에서 논의되는 바람직한 실시양태의 의미에서 첫 번째 핵산 분자로 적격이다. 기술적 고려사항, 예컨대 생체내 적용을 위한 전달 및 첫 번째 핵산 분자용으로 적합한 서열의 탐색과 관련하여서는, 크리스퍼 Cas에서와 유사한 측면이 적용된다.

마이크로RNA (약어로 miRNA)는 식물, 동물 및 일부 바이러스에서 발견되는 소형 비-코딩 RNA 분자로 (약 22개 뉴클레오티드 함유), RNA 침묵화 및 유전자 발현의 전사-후 조절에서 기능한다.

한 실시양태에서, 길항제 또는 억제제는 압타머이다. 압타머는 사전-결정된 표적에 대하여 특이적 결합 특성을 갖는 올리고뉴클레오티드이다. 그것은 셀렉스(SELEX) ("지수적 보강에 의한 체계적인 리간드 전개(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment)")로 명명된 조합 과정을 통하여 10¹⁵종까지의 서로 다른 서열을 함유하는 무작위 합성 라이브러리로부터 수득된다. 압타머 특성은 해당 일차 서열에 의해 추진되는 분자내 접힘에 기인하는 그의 3D 형상에 의해 좌우된다. 압타머 3D 구조는 수소 결합, 정전기 및 적층 상호작용을 통한 해당 동계 표적의 인식에 대하여 정교하게 적합화되어 있다. 압타머는 일반적으로 높은 친화성을 나타낸다 (소형 분자에 대하여 대략 마이크로몰 (μM), 및 단백질에 대하여 피코몰 (pM)의 Kd).

표적 특이적 압타머를 생성시키기 위한 기술 목록에 대한 개관은 예를 들면 본원에 참조로 포함되는 34에 제시되어 있다. 압타머는 35 (본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 세포내 공간으로 전달될 수도 있다.

이에 따라, 예를 들면 해당 활성 중심에 결합하는 것에 의해 GPR84의 길항제로 작용할 수 있는 적합한 압타머를 탐색하는 것은 여러 GPR84 이소형 아미노산 서열의 공공 이용가능성으로 볼 때 통상의 기술자에게는 일상적인 문제이다.

또 다른 특히 바람직한 실시양태에서, 길항제 또는 억제제는 소형 분자이다. 바람직하게는, 상기 소형 분자는 유기 분자이고/거나, 상기 소형 분자는 ≤ 550 DA, 바람직하게는 ≤ 500 DA, 더욱 바람직하게는 ≤ 450 DA의 작은 분자량을 갖는다.

바람직하게는, 항체, 압타머 또는 소형 분자에 의해 억제되거나 길항되는 GPR84 단백질은 바람직하게는 서열식별번호: 1에 따른, 참조 번호 Q9NQS5하에 유니프롯에 개시된 바와 같은 AA 서열을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 길항제 또는 억제제는 효능제-유도된 GPR84-활성화를 적어도 20 %, 더욱 바람직하게는 적어도 50 %, 더욱 더 바람직하게는 적어도 75 %까지 감소시키거나 억제한다. 상기 억제 또는 감소를 측정하는 데에 적합한 검정은 관련 문헌에서 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다. 한 실시양태에서는, 본원에서 하기에 언급되는 cAMP 방출 검정이 상기 억제 또는 감소를 측정하는 데에 사용된다.

본 발명의 한 실시양태에 따라, 길항제 또는 억제제는 효능제-유도된 GPR84-활성화를 억제하며, 바람직하게는 하기이다:

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 9.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 엠벨린-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나,

5 mM, 바람직하게는 10 μM 이하, 가장 바람직하게는 16 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화를 억제함.

바람직하게는, 엠벨린-유도된 GPR84-활성화 및/또는 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화는 GPR84 cAMP 방출 검정에서 측정된다.

잠재적 억제제에 의한 효능제-유도된 GPR84-활성화의 억제는 예를 들면 하기의 원리에 따른 cAMP 방출 검정에서 시험될 수 있다:

GPR84 활성은 세포에서의 cAMP 생성을 억제한다. 따라서, GPR84의 억제는 세포 내 cAMP 함량의 증가를 초래한다. 그러나, cAMP 농도에 대한 효과를 측정하는 것에 의해 물질의 억제 잠재력을 시험하는 경우, 그것은 관찰되는 효과가 일반적인 cAMP 유도 효과보다는 GPR84-특이적이 되도록 이루어져야 한다. 바람직한 선택사항은 물질 (잠재적 억제제)이 GPR84 효능제의 억제 효과를 반전시키는지를 조사하는 것이다. GPR84에 의한 갈파이(Galphai) 신호전달의 효능제는 멤브레인 아데닐릴 사이클라제-유도된 세포 cAMP 생성을 억제한다. GPR84 억제제 (또는 GPR84 길항제)의 첨가는 GPR84 효능제의 존재하에서 멤브레인 아데닐릴 사이클라제-유도된 cAMP 생성의 (재)-증가를 초래한다. 이에 따라, GPR84에 대한 길항 효과는 세포에서의 증가된 cAMP 함량을 초래한다. 잠재적 억제제의 길항 효과는 바람직하게는 GPR84 효능제 및 멤브레인 아데닐릴 사이클라제-활성화제, 예컨대 포르스콜린 존재에의 그의 노출에 의해 시험된다. 멤브레인 아데닐릴 사이클라제-활성화를 통하여 비특이적으로 cAMP 농도를 증가시키는 임의의 다른 화합물 또는 물질도 사용될 수 있다. 이와 같은 두 번째 메신저의 충분한 축적을 보장하기 위하여, cAMP의 변성을 방지하는 1종 이상의 화합물이 첨가될 수도 있다. 그와 같은 화합물에는 포스포디에스테라제 억제제, 예컨대 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)이 포함된다.

통상의 기술자라면, 상기에서 효능작용성 GPR84 유도에 대한 효과가 평가될 때 GPR84-특이적 억제가 측정된다는 것을 알고 있을 것이다. GPR84-특이성을 더 강화하기 위해서는, GPR84를 과발현하는 세포, 예컨대 "cAMP 헌터(Hunter)™ CHO -K1 GPR84 Gi 세포" (디스커버엑스(DiscoverX); # 95-0158C2)가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기에서 개괄한 바와 같이 잠재적 GPR84 억제제와 접촉된 세포에서 cAMP 함량을 측정하는 것, 및 그것을 적절한 대조군과 비교하는 것에 의해, 길항 효과를 측정하는 것이 가능하다. 대조군과 비교하였을 때의 cAMP 함량의 증가는 GPR84 길항 효과를 표시하며, 그 화합물을 억제제로서 적격화한다. 바람직하게는, 물질은 그것이 잠재적 억제제, GPR84의 효능제, 멤브레인 아데닐릴 사이클라제-유도된 cAMP 생성의 활성화제 및 포스포디에스테라제 억제제와 접촉된 세포의 cAMP 함량을 잠재적 억제제가 없는 적절한 대조군과 비교하였을 때 적어도 20 %까지 증가시키는 경우에, GPR84의 억제제로서 적격화된다.

통상의 기술자라면, 일반적인 기술을 사용하여 세포에서의 cAMP 함량 (농도)를 검출할 수 있다. 일반적인 기술은 예를 들면 경쟁 검정을 사용할 수 있다. 원칙적으로, 검출가능한 트레이서가 해당 cAMP 함량이 측정되어야 할 샘플의 존재하에서 cAMP 결합제와 접촉되는데, 여기서 검출가능한 트레이서는 cAMP와 경쟁적으로 cAMP 결합제에 결합한다. 경쟁 검정은 예를 들면 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 검정용으로 상용성인 염료를 사용한 cAMP 결합제에 결합된 트레이서의 상대적인 양의 검출을 가능하게 하는 것으로 해석될 수 있다. 샘플의 존재하에서는, 샘플에 함유되어 있는 cAMP가 cAMP 결합제에 결합하는 데에 있어서 트레이서와 경쟁한다. 샘플이 세포인 경우에는, 그것을 검정에 적용하기 전에 세포내 cAMP 내용물을 방출시키기 위하여 세포가 용해에 적용될 수 있다. cAMP 결합제에 결합된 트레이서의 검출량은 샘플 중 cAMP 함량에 반비례한다. 다른 말로 하면, cAMP 결합제에의 트레이서 결합의 강한 신호는 낮은 샘플 중 cAMP 함량을 표시하며, - 그 반대도 마찬가지여서 - cAMP 결합제에의 트레이서 결합의 더 약한 신호는 더 높은 샘플 중 cAMP 함량을 표시한다. 최대 신호는 cAMP의 부재하에서 수득된다. 이에 따라, 세포 내 cAMP 함량의 감소는 경쟁 검정에서 음성 대조군 및/또는 상기 잠재적 억제제의 첨가 전과 비교하였을 때, 시험 억제제 첨가 후의 세포에서의 cAMP 함량을 비교하는 것에 의해 측정될 수 있다. 잠재적 억제제에 노출된 샘플에서의 cAMP 결합제에의 더 많은 cAMP 결합의 검출은 GPR84에 대한 상기 잠재적 억제제의 억제 (길항) 효과를 표시한다. 이에 따라, 경쟁 검정에서 대조군과 비교하였을 때의 잠재적 억제제로 처리된 샘플에 있어서의 경쟁 검정에서의 더 약한 신호는 GPR84에 대한 잠재적 억제제의 억제 효과를 표시한다.

실제 cAMP 양의 정량은 예를 들면 형광 염료-표지 cAMP 트레이서 (예컨대 cAMP-d2, [시스바이오(Cisbio); cAMP 펨토(femto) 2 키트; # 62AM5PEJ ...]) 및 cAMP 결합제, 예컨대 표지된 항-cAMP 항체, 예를 들면 유-크립테이트 표지된 항-cAMP 항체 (시스바이오; cAMP 펨토 2 키트; # 62AM5PEJ)를 바탕으로 하는 경쟁 검정의 도움으로 달성될 수 있다. 세포 용해시에는, 존재하는 모든 세포성 cAMP가 항체에 대한 트레이서의 결합에 대하여 경쟁한다. 상용성인 트레이서용 형광 염료 및 cAMP 결합제가 사용되는 경우, 그와 같은 신호는 예를 들면 FRET을 사용하여 측정될 수 있다. 통상의 기술자라면 자명할 바와 같이, 염료에 따라 상이한 방출 및 여기 파장이 사용된다. 예를 들어 상기 d2/유-크립테이트 조합의 경우, 337 nm에서의 여기 후 적절한 고-처리량 형광 (HTRF) 판독기 (예컨대 루비스타(RubiStar); 베르톨드 인더스트리즈(Berthold Industries))를 사용하여 665 nm 및 620 nm에서의 FRET 유도 방출이 측정된다. 검출 시스템의 경쟁 특성으로 인하여, 효능제 처리는 더 낮은 cAMP 농도를 초래하며, HTRF 신호를 증가시킨다. 포르스콜린, 효능제 및 길항제 존재하에서의 HTRF 신호의 소정의 감소는 GPR84에 의한 억제성 갈파이 신호전달의 무산, 및 그에 따른 GPR84에 대한 억제 효과를 표시한다.

물질의 억제를 검출하기 위한 대표적인 절차는 하기와 같이 수행될 수 있다:

1. 검정 준비 냉동 세포의 제조

냉동된 세포 (cAMP 헌터(Hunter)™ CHO-K1 GPR84 Gi 세포; 디스커버엑스; # 95-0158C2)의 소생을 위하여, 액체 질소 저장으로부터 1개의 바이알을 취하여, 수조에서 37 ℃로 약 1 내지 3분 동안 빠르게 해동시킨다. 이후 즉시 15 ml의 사전-가온된 완전 세포 배양 배지 (HAM's F12; 10 % FCS; 선택 마커 없음)를 함유하는 50 ml 팔콘 튜브(Falcon Tube)에 따름으로써, 조심스럽게 세포를 이전한다. 약한 선회를 사용하여 그의 재현탁을 돕는다. 다음 단계에서는, 세포 펠렛의 과-압축을 방지하기 위하여 5분 동안의 낮은 g의 원심분리 (헤레아우스 멀티퓨지(Hereaus Multifuge) 4 KR; 400 rpm; rcf = 44 g)를 통해 곧바로 세포를 수확한다. 약한 경사분리를 사용하여 배지를 제거한다. 최종적으로, 5 ml의 최종 검정 배지 (HAM's F12; 10 % FCS; 선택 마커 없음)에 세포 펠렛을 조심스럽게 재-현탁함으로써, 검정 준비를 달성한다. 마지막 단계로, 세포 생존율 및 실제 세포 수를 측정한 후 (옴니 라이프 사이언스(Omni Life Science); 케이시(Casy) 세포 계수기/분석기), 시딩될 최종 세포 수 (즉 2500 세포/㎕)에 맞추어 부피를 보정한다. 다-채널 피펫 또는 적절한 일괄 시약 분배기 중 어느 하나의 도움으로 세포 시딩을 달성한다.

2. 효능작용의 시험 (384-웰 포맷):

2 ㎕의 검정 준비 냉동 세포를 바로 비-멸균 384-웰 플레이트 (그레이너(Greiner); 백색; # 784075; 5000 세포/웰)의 웰에 시딩한다. 이후 즉시 검정 배지 (HAM's F12; 10 % FCS; 2 mM 글루타민; 선택 마커 없음) 중에 제조된 2 ㎕의 2X 효능제/2X EC80 포르스콜린 (최종 농도 = 8 μM, 시그마(Sigma); #F6886) 용액을 첨가한다. 60분의 인큐베이션 시간 후, 제공받은 그대로의 cAMP-d2 트레이서 (시스바이오; cAMP 펨토 2 키트; # 62AM5PEJ) 2 ㎕를 첨가한 후, 이어서 세포 용해 완충제 중에 함유된 항-cAMP 항체 2 ㎕를 별도로 첨가한다 (검출 시약은 제조자의 제원에 따라 제조됨). 모든 첨가는 다-채널 피펫 (서모피셔/서모 사이언티픽(ThermoFisher/Thermo Scientific); E1-클립팁(ClipTip)™; # 4671010) 또는 일괄 시약 분배기 (서모피셔이언티픽; 멀티드롭 콤비(Multidrop Combi)) 중 어느 하나를 사용하여 수행된다. 60분 후에 적절한 HTRF 판독기 (BMG 랩테크(Labtech): 페라스타(Pherastar))를 사용하여, 시간 분해 FRET (TR-FRET) 신호를 측정한다.

3. 길항작용의 시험 (384-웰 포맷):

첫 번째 단계로, 예정된 시험 범위의 4X 길항제 용액 (하기 검정 배지 중에 제조됨: HAM´s F12; 10 % FCS; 2 mM 글루타민; 선택 마커 없음) 1 ㎕를 비-멸균 384-웰 플레이트 (그레이너; 백색; # 784075)의 웰에 첨가한다. 이후 즉시 2 ㎕의 검정 준비 냉동 세포를 바로 플레이트에 시딩한다 (5000 세포/웰). 잠재적 억제제 (길항제)의 존재하에 30분 동안 세포를 인큐베이팅한 후, 역시 검정 배지 중에 제조된 4X 효능제 EC80 (최종 농도: 엠벨린 = 6.00*10^-6 M, 6-n-옥틸아미노우라실 = 1.34*10^-7M) / 4X EC80 포르스콜린 (최종 농도 = 8 μM) 용액 1 ㎕를 첨가한다. 60분의 인큐베이션 후, 2 ㎕의 cAMP-d2 트레이서를 첨가한 후, 이어서 세포 용해 완충제 중에 함유된 항-cAMP 항체 2 ㎕를 첨가한다 (검출 시약은 제조자의 제원에 따라 제조됨). 모든 첨가는 다-채널 피펫 (서모피셔/서모 사이언티픽; E1-클립팁™; # 4671010) 또는 일괄 시약 분배기 (서모피셔이언티픽; 멀티드롭 콤비) 중 어느 하나를 사용하여 수행된다. 60분 후에 적절한 HTRF 판독기 (BMG 랩테크: 페라스타)를 사용하여, 시간 분해 FRET (TR-FRET) 신호를 측정한다.

본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 길항제 또는 억제제는 하기를 포함하는 목록에서 선택되는 군 중 하나의 구성원이다:

디히드로피리도이소퀴놀리논

디히드로피리미디노이소퀴놀리논

바람직하게는, 상기 길항제 또는 억제제는 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 US2016244442 A1호, WO2016169911 A1호, US2016039807 A1호 및/또는 WO2015197550 A1호 중 어느 것에 개시되어 있는 디히드로피리도이소퀴놀리논 중 1종이다. 역시 바람직하게는, 상기 길항제 또는 억제제는 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 WO2014095798 A1호에 개시되어 있는 디히드로피리미디노이소퀴놀리논 중 1종이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 길항제 또는 억제제는 하기 중 1종이다:

본 발명의 한 실시양태에서, 자궁내막증은 하기를 특징으로 한다:

정소(eutopic) 자궁내막과 비교하였을 때의 자궁외 병변에서의 중간 사슬 유리 지방 (MCFFA) 산 존재의 증가,

대조군 환자로부터 채취된 단핵구 및/또는 대식세포와 비교하였을 때의 자궁내막증 환자로부터 채취된 단핵구 및/또는 대식세포에서의 GPR84 발현의 증가,

대조군 환자로부터 채취된 단핵구 및/또는 대식세포와 비교하였을 때의 자궁내막증 환자로부터 채취된 단핵구 및/또는 대식세포에서의 더 큰 GPR84 양성 세포 분율.

여기서, MCFFA라는 용어는 바람직하게는 C₉-C₁₄ 지방산, 바람직하게는 데칸산 및/또는 미리스트산을 포괄하는 반면, ACOT이라는 용어는 바람직하게는 ACOT4 및 ACOT9를 포괄한다.

본 발명은 또한 부인과 이상을 자궁내막증인 것으로 규정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 제공하며:

a) 환자의 자궁외 자궁내막 병변으로부터 샘플 (도말표본, 생검물, 찰과물)을 채취하는 단계,

b) 상기 샘플에서 중간 사슬 유리 지방산 (MCFA)의 존재 또는 부재를 측정 및/또는 정량하는 단계, 및

c) 수득된 파라미터 중 적어도 1종을 (i) 대조군 환자 또는 동일 환자의 정소 자궁내막으로부터 수득되거나, 또는 (ii) 적합한 문헌 또는 데이터베이스로부터 입수된 각각의 (대조군) 파라미터와 비교하는 단계,

여기서 대조군과 비교하였을 때의 MCFFA의 존재 증가는 자궁내막증의 존재로 귀결된다.

또한, 본 발명은 부인과 이상을 자궁내막증인 것으로 규정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 제공하며:

a) 단핵구 및/또는 대식세포를 포함하는 환자로부터의 샘플, 바람직하게는 혈액 샘플을 채취하는 단계,

b) 상기 샘플에 포함되어 있는 단핵구 및/또는 대식세포에서의 GPR84의 발현을 측정 및/또는 정량하는 단계,

c) 수득된 파라미터를 (i) 건강한 환자의 단핵구 및/또는 대식세포로부터 수득되거나, 또는 (ii) 적합한 문헌 또는 데이터베이스로부터 입수된 각각의 (대조군) 파라미터와 비교하는 단계,

여기서 대조군과 비교하였을 때의 단핵구 및/또는 대식세포에서의 GPR84 발현의 증가는 자궁내막증의 존재로 귀결된다.

또한, 본 발명은 부인과 이상을 자궁내막증인 것으로 규정하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 하기의 단계를 제공한다:

b) 상기 샘플에 포함되어 있는 단핵구 및/또는 대식세포 중 GPR84 양성 세포의 분율을 측정 및/또는 정량하는 단계,

c) 수득된 파라미터를 (i) 건강한 환자의 해당 샘플에 포함되어 있는 것으로부터 수득되거나, 또는 (ii) 적합한 문헌 또는 데이터베이스로부터 입수된 각각의 (대조군) 파라미터와 비교하는 단계.

상기 세 가지 경우 모두에서, 수득되는 파라미터가 대조군으로부터 벗어나는 경우, 그 부인과 이상은 자궁내막증인 것으로 규정된다. 바람직하게는, 부인과 이상은 MCFFA에 대하여 측정된 대조군 파라미터와 비교하였을 때의 농도 증가; 또는 대조군 파라미터와 비교하였을 때의 단핵구 및/또는 대식세포에서의 GPR84의 발현 증가; 또는 대조군 파라미터와 비교하였을 때의 해당 샘플에 포함되어 있는 단핵구 및/또는 대식세포 중 GPR84 양성 세포의 분율 증가가 측정되는 경우에 자궁내막증인 것으로 규정된다. 또 다른 실시양태에서, 측정되는 MCFAA의 존재는 부인과 이상을 표시한다. 그와 같은 경우, 파라미터는 본 발명의 부인과 억제제 또는 길항제가 환자에게 투여될 수 있음을 규정하거나 표시한다.

바람직하게는, 3.4 μM 초과, 더욱 바람직하게는 4.0 μM 초과, 더욱 더 바람직하게는 4.5 μM 초과, 더욱 더 바람직하게는 5.0 μM 초과의 MCFFA 농도는 자궁내막증 또는 병변으로 귀결된다.

본 발명의 다른 한 측면에 따라, 상기에서 개시된 길항제 또는 억제제의, 자궁내막증으로 진단되거나, 자궁내막증으로 고통받거나, 또는 자궁내막증이 발병할 위험이 있는 인간 또는 동물 대상체의 치료에서의 (약제의 제조를 위한), 또는 그와 같은 이상의 예방을 위한 용도가 제공된다. 또한, 상기 개시내용에 따른 길항제 또는 억제제를 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 또한, 상기 개시내용에 따른 제약 조성물과 1종 이상의 다른 치료 활성 화합물의 조합물이 제공된다.

또한, 바람직하지 않은 GPR84의 발현과 연관된 자궁내막증의 치료 또는 예방 방법이 제공되며, 상기 방법은 상기 개시내용에 따른 제약 조성물 또는 조합물의 유효량을 바람직하지 않은 GPR84의 발현과 연관된 자궁내막증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 한 실시양태에 따라, 길항제 또는 억제제는 프로인트 완전 아주반트(complete Freunds' adjuvant)의 투여 후 생체 내의 염증화된 발 모델에서 통증 감소 특성을 나타낸다.

본 발명의 다른 한 측면에 따라, 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 화합물의 식별 방법이 제공되며, 상기 방법은 1종 이상 시험 화합물이 GPR84 cAMP 방출 검정에서

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 9.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 엠벨린-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나;

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 16 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나;

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 20 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 6-n-옥틸아미노우라실-유도된 GPR84-활성화를 억제하는지

에 대해 스크리닝하는 것을 포함한다.

한 실시양태에서, 화합물은, 그것이 5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 9.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 상기 엠벨린-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나 5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 16 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 상기 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화를 억제하는 경우, 상기 치료 및/또는 예방에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨진다.

본 발명의 다른 한 측면에 따라, 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 화합물의 식별 방법이 제공되며, 상기 방법에서는 시험 화합물의

a) GPR84-리간드 또는 GPR84-효능제 자극 반응, 또는

b) 비자극 GPR84 활성

에 대한 억제 효과가 평가된다.

바람직하게는, 상기 반응 또는 활성에 대하여 억제 효과를 나타내는 화합물은 상기 용도 및/또는 치료에 적합한 것으로 여겨진다. 본 발명의 또 다른 한 측면에 따라, 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자에서의 자궁내막증의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 화합물의 식별 방법이 제공되며, 여기에서는 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 길항제 또는 억제제가 식별될 수 있다:

a1) 시험 화합물을 GPR84 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및

b1) 상기 GPR84 폴리펩티드에 대한 상기 시험 화합물의 결합을 검출하는 단계;

또는

a2) 시험 화합물의 특정 농도에서, 또는 상기 시험 화합물의 부재하에서 GPR84 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계; 및

b2) 상기 시험 화합물의 다른 농도에서 상기 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계;

또는

a3) 시험 화합물의 특정 농도에서 GPR84 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계; 및

b3) GPR84 폴리펩티드의 조절인자인 것으로 알려져 있는 화합물의 존재하에서 GPR84 폴리펩티드의 활성을 측정하는 단계.

이들 및 다른 실시양태는 다양한 약물 스크리닝 기술 중 어느 것에서 GPR84 또는 그의 결합 단편을 사용하여 치료용 화합물을 스크리닝하는 데에 특히 유용하다. GPR84는 G 단백질 커플링된 수용체이기 때문에, 관련 기술분야에서 일반적으로 사용되는 방법 중 임의의 것이 잠재적으로 GPR84 리간드를 식별하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, GPR84와 같은 G 단백질 커플링된 수용체의 활성은 수용체의 활성화가 아데닐레이트 사이클라제, 구아닐릴사이클라제, 칼슘 가동화 또는 이노시톨 인지질 가수분해와 같은 소정 제2 메신저 시스템의 관찰가능한 수준 변화를 초래하는 다양한 적절한 기능성 검정 중 어느 것을 사용하여 측정될 수 있다.

대안적으로, 그와 같은 시험에 사용되는 폴리펩티드 또는 단편은 용액 중에서 유리되거나, 고체 지지체에 고정되어 있거나, 세포 표면상에 보유되거나, 또는 세포 내에 위치되는 것 중 어느 하나이다. 한 가지 약물 스크리닝 방법은 그 폴리펩티드 또는 단편을 발현하는 재조합 핵산에 의해 안정하게 형질전환되는 진핵 또는 원핵 숙주 세포를 이용한다. 약물은 경쟁적 결합 검정에서 그와 같은 형질전환된 세포에 대하여 스크리닝된다. 생존가능하거나 고정된 형태 중 어느 하나인 그와 같은 세포는 표준 결합 검정용으로 사용되고 있다.

측정되는 것은 예를 들면 GPR84와 작용제 사이의 복합체 형성이다. 대안적으로는, 시험되는 작용제에 의해 야기되는 GPR84와 리간드 사이 복합체 형성의 감소를 조사할 수 있다.

이에 따라, 본 발명은 GPR84 신호 전달에 영향을 주는 약물 후보, 약물 또는 임의의 기타 작용제의 스크리닝 방법을 제공한다. 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 이러한 방법은 그와 같은 작용제를 GPR84 폴리펩티드 또는 그의 단편과 접촉시키는 것, 및 (i) 작용제와 GPR84 폴리펩티드 또는 단편 사이 복합체의 존재에 대하여, 또는 (ii) GPR84 폴리펩티드 또는 단편과 세포 사이 복합체의 존재에 대하여 검정하는 것을 포함한다. 그와 같은 경쟁적 결합 검정에서, GPR84 폴리펩티드 또는 단편은 통상적으로 표지되어 있다. 적합한 인큐베이션 후, 유리 GPR84 폴리펩티드 또는 단편이 결합된 형태로 존재하는 것으로부터 분리되는데, 유리되거나 복합체화되지 않은 표지의 양은 GPR84에 결합하거나 GPR84-작용제 복합체에 간섭하는 특정 작용제 능력의 척도가 된다.

또 다른 약물 스크리닝 기술은 GPR84 폴리펩티드에 대하여 적합한 결합 친화성을 갖는 화합물의 고처리량 스크리닝을 제공한다. 간단하게 언급하자면, 플라스틱 핀 또는 소정의 다른 표면과 같은 고체 기재상에서 많은 수의 상이한 소형 펩티드 시험 화합물이 합성된다. 펩티드 시험 화합물은 GPR84 폴리펩티드와 반응된 후, 세척된다. 다음에, 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 결합된 GPR84 폴리펩티드가 검출된다. 정제된 GPR84가 상기언급된 약물 스크리닝 기술에서 사용하기 위하여 플레이트상에 직접 코팅되기도 한다. 또한, 펩티드를 포획하고 고체 지지체상에 그것을 고정하기 위하여, 비-중화 항체가 사용된다.

또 다른 기술은 본원의 상기 및 실시예 실험에서 고-처리량 스크린으로 추가 기술되는 바와 같은 cAMP 방출이다.

본 발명은 또한 GPR84에 결합할 수 있는 중화 항체가 GPR84 폴리펩티드 또는 그의 단편에 결합하는 것에 대하여 시험 화합물과 특이적으로 경쟁하는 경쟁적 약물 스크리닝 검정의 사용을 고려한다. 이와 같은 방식으로, 항체는 GPR84와 하나 이상의 항원 결정인자를 공유하는 임의 펩티드의 존재를 검출하는 데에 사용된다.

본 발명의 다른 한 측면에 따라, 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 화합물의 식별 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a) 정소 또는 자궁외 자궁내막을 사용한 자궁내막 슬라이스 시편을 제공하는 단계,

b) 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 슬라이스를 GPR84 효능제로 처리하는 단계, 및

c) 시험 화합물이 GPR84-효능제-유도된 시토카인, 성장 인자 및/또는 케모카인 발현 및/또는 분비를 감소시키는지를 측정하는 단계.

바람직한 실시양태에서, 단계 c)에서의 발현 및 분비의 감소는 화합물이 치료 및/또는 예방에서의 상기 용도에 적합한 것으로 귀결된다.

상기 시토카인, 성장 인자 및 케모카인에는 IL-1베타 뿐만 아니라 TNF알파도 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이와 같은 접근법의 예는 실험 부문에 나타내었다. 상기 효능제에는 중간-사슬 지방산, 바람직하게는 완전 포화 중간-사슬 지방산, 더욱 바람직하게는 데칸산이 포함된다.

본 발명의 다른 한 측면에 따라, 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자에서의 자궁내막증의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 화합물의 식별 방법이 제공되며, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:

a) 인간 복막 단핵 세포 또는 GPR84 발현 단핵구 세포주, 예컨대 THP1 또는 U937의 조제물을 제공하는 단계,

b) 세포를 시험 화합물로 처리하는 단계, 및

c) 시험 화합물이 말초혈액 단핵 세포의 화학주성을 유도하는 케모카인, 바람직하게는 IL-1베타 및 TNF알파의 방출을 감소시키는지를 측정하는 단계.

바람직한 실시양태에서, 화학주성을 유도하는 케모카인, 바람직하게는 IL-1베타 및 TNF알파 방출의 상기 감소는 화합물이 치료 및/또는 예방에서의 상기 용도에 적합한 것으로 귀결된다.

GPR84 발현 단핵구 세포주, 예컨대 THP1 또는 U937에 대해서는 관련 기술분야 통상의 기술자에게 알려져 있다 [본원에 참조로 포함되는 4 및 9 참조].

바람직하게는, 단계 b)에서는, GPR84 폴리펩티드의 활성을 표시하는 메신저 분자의 방출 또는 발현의 억제가 측정된다. 바람직하게는, 상기 방법은 그 내용이 본원에 참조로 포함되는 US2015330968A1호에 개시되어 있는 방법 중 하나이다. 바람직하게는, 상기 시험 화합물은 카프르산, 운데칸산, 라우르산, 2,5-디히드록시-3-운데실-2,5-시클로헥사디엔-1,4-디온 (엠벨린), 아이코사-5,8,11,14-테트라이노산, 5S,6R-디히드록시-아이코사-7,9,11,14-테트라이노산, 디인도릴메탄 및 인돌-3-카르비놀로 이루어진 군에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 메신저 분자는 고리형 AMP (cAMP)이다.

[ 실시예 ]

도면 및 전기한 상세한 설명으로 본 발명이 상세하게 예시 및 기술되기는 하였지만, 그와 같은 예시 및 기술은 제한적인 것이 아니라 예시 또는 전형으로 여겨져야 하며; 본 발명이 개시되는 실시양태로 제한되는 것은 아니다. 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위를 연구함으로써, 청구된 발명을 실시함에 있어서 관련 기술분야 통상의 기술자에 의해 개시되는 실시양태에 대한 다른 변형이 이해 및 수행될 수 있다. 어떠한 참조 기호도 영역을 제한하는 것으로 해석되어서는 아니 된다.

본원에서 개시되는 모든 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 나타내었으며; 본원에서 개시되는 모든 핵산 서열은 5'→3'로 나타내었다.

실험

시험관내 검정 1: GPR84 리간드 및 길항제 특징화

384-웰 플레이트 포맷에서 cAMP 헌터(Hunter)™ CHO-K1 GPR84 Gi 세포 시스템 (디스커버엑스) (DMF12 HAM, 9 % FBS; 300 ug/ml 하이그로마이신; 800 ug/ml 제네티신; 2 mM Glut; 1 % 펜(Pen) / 스트렙(Strep)을 사용하여 배양된 패스헌터(PathHunter)® CHO-K1 hGPR84 β-어레스틴(Arrestin) 세포주)을 사용하여, GPR84 효능제의 투여량 반응 실험을 수행하였다. 세포 생존율 및 수를 측정한 후 (옴니 라이프 사이언스(Omni Life Science); 케이시(Casy) 세포 계수기/분석기), 시딩하고, 이어서 60-분 인큐베이션 시간에 의해 효능제 처리를 수행함으로써, 고-처리량 BMG 랩테크 페라스타(Pherastar) 기기에서 시간-분해 FRET (TR-FRET)을 사용하여 cAMP 농도를 측정하였다. 길항제 투여량-반응을 위해, 길항제의 존재하에 30분 동안 세포를 인큐베이팅한 후, 표 1에 기술되어 있으며와 같이 효능제를 첨가하였다. 60-분 인큐베이션 후, 상기한 바와 같이 TR-FRET에 의해 cAMP 농도를 측정하였다. 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)을 사용하여 데이터를 피팅하였다.

수득된 데이터를 하기 표 1에 요약하였다:

<표 1>

생체외 검정 1: GPR84 리간드 연관 자궁내막 염증 검정

자궁내막증 병변의 대용물로서, 인간 정소 자궁내막 조직 생검물을 소형 슬라이스로 절단하여, HBSS 완충제 [서모피셔, 14175095]로 세척하고, 5 % FCS가 보충된 DMEM/F12 배지 [서모피셔, 11320-033]에서 3시간 동안 인큐베이팅하였다. 배지를 제거하고, GPR84 효능제 (데칸산)와 GPR84 길항제 CMPD139의 조합물이 보충된 DMEM/F12, 2 % CCS (숯 탈거)로 대체하였다. 21시간 후, 바이오-플렉스(Bio-Plex) 플랫폼을 사용하여 공급자의 지침에 따라 상청액 중 시토카인을 정량하였다. 그래프패드 소프트웨어 (미국 라졸라)를 사용하여, 데이터를 분석하였다.

이와 같은 설정에서, GPR84 리간드는 놀랍게도 이미 자궁내막증에 관련되어 있는 것으로 알려져 있는 몇 가지 전염증성 시토카인 및 성장 인자의 농도를 증가시켰다. 이러한 매개인자에는 IL1β 및 TNF알파가 포함되었다. 효능제로서의 데칸산과 조합된 10^-5 M의 길항제 CMPD 139를 사용한 처리는 GPR84 효능제 단독을 사용한 처리와 비교하였을 때 모든 측정된 시토카인 및 성장 인자를 감소시켰다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이에 따라, GPR84의 활성화는 자궁내막증과 연관된 염증에 기여하며, 길항제는 염증을 감소시킬 수 있었다.

<표 2>

시험관내 검정 2: PBMC로부터의 GPR84 리간드 연관 IL베타 및 TNF알파 방출

피콜-패크 플러스(Ficoll-Paque Plus) (바이오크롬(Biochrom)) 밀도 구배 원심분리에 의해 전혈로부터 PBMC를 단리하였다. 간단하게 말하자면, PBMC를 250 g로 30초 동안 원심분리한 후, 5 % CO₂ 환경에서 37 ℃로 10 % 열-불활성화 FBS, L-글루타민 (10 g/L), 페니실린 (100 IU/mL) 및 스트렙토마이신 (100 ng/mL)을 포함하는 RPMI 1640 배지 [기브코(Gibco), CAT No. 11875093]에 재현탁 및 배양하였다. LPS (100 ng/ml, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich))를 사용하여 24시간 동안 세포를 자극하고, GPR84 효능제 6-n-옥틸아미노우라실 및 길항제 CMPD 139로 4시간 동안 처리하였다. ELISA (메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery), 독일)에 의해 IL-1베타 및 TNF알파 농도를 분석하였다. CMPD139는 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 GPR84 상승 IL-1베타 및 TNF알파 농도를 감소시켰다.

<표 3>

복막 조직의 면역조직화학

포르말린 (3.7 %)-고정된 파라핀-매립 조직의 단면을 탈파라핀화하고, 수화한 후, 자동 라이카 멀티스테이너(Leica Multistainer) 및 커버슬립퍼(Coverslipper) (라이카 ST5020+CV 5030, 라이카 마이크로시스템즈(Leica Microsystems), 독일)를 사용하여 H&E [하에마톡실린 및 에오신 염색] 염색하였다.

GPR84- 및 CD68-발현 세포의 검출을 위하여, 각각 일차 항체로서 항-GPR84-IgG (A91742, 토끼 폴리클로날, 시그마-알드리치, 독일) 및 항-CD68-IgG (KP1, 마우스 모노클로날, 아브캄(Abcam), 독일)를 사용하였다. 특이적 염색을 현상하는 데에는, 다코 엔비젼(Dako Envision)+ 시스템-HRP (다코, 미국) 및 GBI 퍼머넌트 레드(permanent red) (GBI, 미국) 기질 용액을 적용하였다. 추가적으로, 슬라이드를 H&E를 사용하여 대조-염색하였다. 도 1은 그와 같은 슬라이드의 현미경사진이다.

자궁내막증의 자궁외 병변에서의 GPR84 발현의 면역조직화학. 자궁외 복막 병변은 침윤성 골수양 세포 (CD68)가 풍부하며, GPR84와 공동-염색된다.

자궁내막증 환자 대 대조군의 복막강에서의 GPR84 양성 세포의 측정

피콜 밀도 구배 원심분리에 의해 복막액으로부터의 단핵 세포 (군 당 n = 3)를 수집하고, -80 ℃에서 냉동하였다. GPR84 발현을 측정하기 위하여, 얼음상에서 30분 동안 세포를 해동하고, PBS로 세척하였다. 다음에, 고정가능 생존율 염료 이플루오르(eFluor)® 780 (이바이오사이언스(eBioscience), cat. #65-0865)을 사용하여 제조자의 지침에 따라 세포를 염색한 후, 이어서 1 % 고정 완충제 (바이오레전드(BioLegend), cat. # 420801)를 사용하여 고정하였다. 20 % 인간 혈청 및 5 μL/100 μL의 인간 트루스테인(TruStain) FcX Fc 수용체 차단 혈청 (바이오레전드, cat. # 422301)에 의해 Fc 수용체를 차단하고, 1 % BSA 및 0.1 % 사포닌이 보충된 PBS를 사용하여 세포를 투과시켰다. 다음에, 투과된 세포를 얼음상에서 1시간 동안 GPR84 항체 (바이오스(Bioss), cat. # bs-15353R) 및 토끼 IgG 이소형 대조군 (바이오스, cat no# bs-0295P-PE)과 함께 인큐베이팅하였다. 염색 후, 세포를 2회 세척하고, 유동 세포측정기 (BD 엘에스알포르테싸(LSRFORTESSA); BD 바이오사이언스(Bioscience))상에 포착하였다.

유동 세포측정법 분석은 대조군 환자에 대비하여 자궁내막증 환자 유래 대식세포에서 더 높은 GPR84 발현 농도를 나타내었다 (도 2).

자궁내막 조직에서의 MCFA의 측정

질량 분광법 (GC/MS) 검출 (아길렌트(Agilent) 7890 GC/5975 MSD)과 연계된 기체 크로마토그래피를 사용하여, 정소 (자궁내막) 및 자궁외 (병변) 자궁내막 조직에서의 개별 유리 중간-사슬 지방산 (MCFA; 데칸산 및 미리스트산)의 함량을 그의 상응하는 메틸 에스테르 유도체로서 측정하였다. 오랜 시간 기간 동안 메탄올계 HCl 용액을 사용하여 샘플을 처리함으로써, 유리 지방산을 그의 메틸 에스테르로 완전히 전환시켰다. 개별 메틸에스테르 유도체의 정량을 위하여, 4종의 특징적인 이온을 사용한 선택 이온 모니터링(Selected Ion Monitoring) (SIM) 모드의 크로마토그램을 기록하였다. 데칸산 및 미리스트산 농도는 정소 자궁내막 (대조군)에 비해 자궁내막 병변 (병변)에서 더 높았다. 통계 분석; 비쌍형성 t-검정, 유의한 차이 (P < 0.05).

<표 4>

CFA 통증 모델에서의 CMPD139의 효과

동적 중량-부담(dynamic weight-bearing) (DWB) 모델 [10]에서 프로인트 완전 아주반트 (CFA) (24시간)의 투여 후 염증화된 발에서 염증성 통증에 대한 생체 내에서의 CMPD139의 효능을 측정하였다. 예방 설정을 사용하여, 마우스 CFA 염증 모델에서의 반복적인 경구 및 피하 투여 (3x) 후의 통증에 대한 CMPD139를 사용한 반복되는 예방적 처리의 효과를 조사하였다. 0일차에, CFA 주사 2시간 전 및 6-8시간 후에, GPR84 길항제 CMPD139 (90 또는 30 mg/kg, p.o.+s.c., 3x 투여)를 투여하였다. CFA 적용 24시간 후, DWB 시험 2시간 전에 세 번째 CMPD139 투여분을 제공하였다. 일-원 분산 분석에 의해 통계 분석을 수행한 후, 이어서 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 비히클 대조군에 대하여 본페로니 다중 비교 검정(Bonferroni's multiple comparison test) (*p < 0.05)을 수행하였다.

<표 5>

[참고문헌]

본 명세서에서는 하기의 논문을 참조하였다. 본 발명의 구현을 목적으로, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

서열식별번호: 1 - G-단백질 커플링된 수용체 84

SEQUENCE LISTING <110> Bayer Pharma AG <120> Inhibitors and antagonists of GPR84 for the treatment of endometriosis <130> 163084 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> G-Protein coupled receptor 84 <400> 1 Met Trp Asn Ser Ser Asp Ala Asn Phe Ser Cys Tyr His Glu Ser Val 1 5 10 15 Leu Gly Tyr Arg Tyr Val Ala Val Ser Trp Gly Val Val Val Ala Val 20 25 30 Thr Gly Thr Val Gly Asn Val Leu Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ile Gln 35 40 45 Pro Lys Leu Arg Thr Arg Phe Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Thr Leu 50 55 60 Ala Asp Leu Leu Tyr Cys Thr Leu Leu Gln Pro Phe Ser Val Asp Thr 65 70 75 80 Tyr Leu His Leu His Trp Arg Thr Gly Ala Thr Phe Cys Arg Val Phe 85 90 95 Gly Leu Leu Leu Phe Ala Ser Asn Ser Val Ser Ile Leu Thr Leu Cys 100 105 110 Leu Ile Ala Leu Gly Arg Tyr Leu Leu Ile Ala His Pro Lys Leu Phe 115 120 125 Pro Gln Val Phe Ser Ala Lys Gly Ile Val Leu Ala Leu Val Ser Thr 130 135 140 Trp Val Val Gly Val Ala Ser Phe Ala Pro Leu Trp Pro Ile Tyr Ile 145 150 155 160 Leu Val Pro Val Val Cys Thr Cys Ser Phe Asp Arg Ile Arg Gly Arg 165 170 175 Pro Tyr Thr Thr Ile Leu Met Gly Ile Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ser 180 185 190 Ser Val Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Ile His Arg Gln Val Lys Arg Ala 195 200 205 Ala Gln Ala Leu Asp Gln Tyr Lys Leu Arg Gln Ala Ser Ile His Ser 210 215 220 Asn His Val Ala Arg Thr Asp Glu Ala Met Pro Gly Arg Phe Gln Glu 225 230 235 240 Leu Asp Ser Arg Leu Ala Ser Gly Gly Pro Ser Glu Gly Ile Ser Ser 245 250 255 Glu Pro Val Ser Ala Ala Thr Thr Gln Thr Leu Glu Gly Asp Ser Ser 260 265 270 Glu Val Gly Asp Gln Ile Asn Ser Lys Arg Ala Lys Gln Met Ala Glu 275 280 285 Lys Ser Pro Pro Glu Ala Ser Ala Lys Ala Gln Pro Ile Lys Gly Ala 290 295 300 Arg Arg Ala Pro Asp Ser Ser Ser Glu Phe Gly Lys Val Thr Arg Met 305 310 315 320 Cys Phe Ala Val Phe Leu Cys Phe Ala Leu Ser Tyr Ile Pro Phe Leu 325 330 335 Leu Leu Asn Ile Leu Asp Ala Arg Val Gln Ala Pro Arg Val Val His 340 345 350 Met Leu Ala Ala Asn Leu Thr Trp Leu Asn Gly Cys Ile Asn Pro Val 355 360 365 Leu Tyr Ala Ala Met Asn Arg Gln Phe Arg Gln Ala Tyr Gly Ser Ile 370 375 380 Leu Lys Arg Gly Pro Arg Ser Phe His Arg Leu His 385 390 395

Claims

자궁내막증으로 고통받고/거나,

자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나,

자궁내막증으로 진단되는
환자에서의 자궁내막증의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 G 단백질-커플링된 수용체 84 (GPR84)의 길항제 또는 억제제.
제1항에 있어서, GPR84에 특이적으로 결합하는 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체이거나, 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체인 길항제 또는 억제제.
제1항에 있어서, 핵산 억제제인 길항제 또는 억제제.
제3항에 있어서, GPR84 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 적어도 서브스트레치에 특이적으로 결합하는 핵산 분자를 포함하는 길항제 또는 억제제.
제3항 또는 제4항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 바람직하게는 서열식별번호: 1에 따른, 참조 번호 Q9NQS5하에 유니프롯에 개시된 바와 같은 AA 서열을 포함하는 GPR84 단백질을 코딩하는 것인 길항제 또는 억제제.
제3항에 있어서, 압타머인 길항제 또는 억제제.
제1항에 있어서, 소형 분자인 길항제 또는 억제제.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 항체, 압타머 또는 소형 분자에 의해 억제되거나 길항되는 GPR84 단백질이 바람직하게는 서열식별번호: 1에 따른, 참조 번호 Q9NQS5하에 유니프롯에 개시된 바와 같은 AA 서열을 포함하는 것인 길항제 또는 억제제.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, GPR84 cAMP 방출 검정에서 측정하였을 때

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 9.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 엠벨린-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나,

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 16 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나,

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 20 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 6-n-옥틸아미노우라실-유도된 GPR84-활성화를 억제하는
길항제 또는 억제제.
제1항 및 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,

디히드로피리도이소퀴놀리논

디히드로피리미디노이소퀴놀리논
을 포함하는 목록에서 선택되는 군 중 하나의 구성원인 길항제 또는 억제제.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 자궁내막증이

정소(eutopic) 자궁내막과 비교하였을 때의 자궁외 병변에서의 중간 사슬 유리 지방 (MCFFA) 산, 및/또는 아실-CoA 티오에스테라제 효소 (ACOT) 및/또는 지방산 신타제 (FASN)의 존재; 및/또는

대조군 환자로부터 채취된 대식세포와 비교하였을 때의 자궁내막증 환자로부터 채취된 대식세포에서의 GPR84 발현의 증가; 및/또는

대조군 환자로부터 채취된 단핵구 및/또는 대식세포와 비교하였을 때의 자궁내막증 환자로부터 채취된 단핵구 및/또는 대식세포에서의 더 큰 GPR84 양성 세포 분율
을 특징으로 하는 것인 길항제.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료가 염증성 통증과 연관된 자궁내막증의 치료인 길항제.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 길항제 또는 억제제의, 자궁내막증으로 진단되거나, 자궁내막증으로 고통받거나, 또는 자궁내막증이 발병할 위험이 있는 인간 또는 동물 대상체의 치료에서의 (약제의 제조를 위한), 또는 그와 같은 이상의 예방을 위한 용도.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 길항제 또는 억제제를 포함하는 제약 조성물.
제14항에 따른 제약 조성물과 1종 이상의 다른 치료 활성 화합물의 조합물.
제14항에 따른 제약 조성물 또는 제15항에 따른 조합물의 유효량을 바람직하지 않은 GPR84의 발현과 연관된 자궁내막증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 바람직하지 않은 GPR84의 발현과 연관된 자궁내막증의 치료 또는 예방 방법.
1종 이상 시험 화합물이 GPR84 cAMP 방출 검정에서

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 9.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 엠벨린-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나,

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 16 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나,

5 mM 이하, 바람직하게는 10 μM 이하, 더욱 바람직하게는 20 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 6-n-옥틸아미노우라실-유도된 GPR84-활성화를 억제하는지
에 대해 스크리닝하는 것을 포함하는, 자궁내막증으로 고통받고/거나, 자궁내막증이 발병할 위험이 있고/거나, 자궁내막증으로 진단되는 환자에서의 자궁내막증의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한 화합물의 식별 방법.
제17항에 있어서, 화합물이 5 mM 이하, 가장 바람직하게는 9.4 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 상기 엠벨린-유도된 GPR84-활성화를 억제하고/거나 5 mM 이하, 가장 바람직하게는 16 nM 이하의 IC₅₀ 값으로 상기 2-OH 데칸산-유도된 GPR84-활성화를 억제하는 경우, 화합물이 상기 치료 및/또는 예방에서 사용하기에 적합한 것으로 여겨지는 것인 방법.