CN110573146A - 用于治疗子宫内膜异位症的gpr84的抑制剂和拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者的G蛋白偶联受体84(GPR84)的拮抗剂或抑制剂，以及筛选这种拮抗剂或抑制剂的方法以及诊断方法。

Description

用于治疗子宫内膜异位症的GPR84的抑制剂和拮抗剂
本发明涉及人GPR84的抑制剂和拮抗剂用于治疗和/或预防子宫内膜异位症的用途。根据本发明的抑制剂和拮抗剂是抗体、核酸、适体或小分子。本发明还提供发现此类抑制剂和拮抗剂的测定法和筛选技术。
发明背景
子宫内膜异位症影响5-10%的育龄女性且被定义为子宫内膜组织在异位位置中的生长，其主要发现于骨盆腔内。此子宫外生长伴随着作为主要疾病体征的促炎性巨噬细胞的浸润，其导致慢性发炎微环境且促成慢性疼痛症状。
具有子宫内膜异位症的女性的腹膜病变和体液的特征在于白细胞的浸润，所述白细胞除了T-淋巴细胞，还包括自然杀伤(NK)细胞和吞噬性巨噬细胞[1, 2]，其一起促成表征该疾病的促炎性环境。除了浸润白细胞的存在以外，子宫内膜异位症的特征在于炎性介体(诸如细胞因子和生长因子，包括两种促疼痛介体TNFα和IL-1β[3])的升高水平。
中链脂肪酸(MCFFA)是具有6至12个碳的尾部的脂肪酸且可活化GPR84 [4]。对于动物代谢存在两种FA来源，外源衍生的(膳食) FA和内源合成的FA。后者的生物合成由FASN催化[5]。MCFFA刺激软骨细胞中的IL6的释放[6]且肉豆蔻酸提高人冠状动脉平滑肌(HCASM)和内皮(HCEC)细胞中的IL6和IL8水平[7]。
GPR84属于游离脂肪酸(Free Fatty Acid；FFA)受体的组[8]。FFA受体的组由4种GPCR (FFA1-FFA2)以及新成员GPR42和GPR84组成。FFA受体参与生物过程诸如代谢和免疫功能[8]。
相比于具有更广泛表达模式的所有其他FFA受体，已描述GPR84主要在各种白细胞群体中表达[8]。
直到现在，子宫内膜异位症无法治愈，却存在两种类型的干预：疼痛的治疗和子宫内膜异位症相关的不育的治疗。关于药物疗法，可使用激素疗法(孕酮、孕激素、外源性雌激素、口服避孕药、达那唑(Danazol)(Danocrine)、孕三烯酮、促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂或芳香化酶抑制剂)、NSAID、阿片类或己酮可可碱，同时进一步手术移除子宫内膜、粘连、切除子宫内膜瘤和恢复正常骨盆解剖构造。药物和手术干预产生大致等效的疼痛缓解益处。发现医药和手术干预的疼痛复发分别为44%和53% (24)。
然而，如今治疗选项均有限且不令人满意，仍需要提供就效力、可持续性、减少的副作用、患者依从性等而言更好的治疗选项。
发明概述
根据本发明的独立权利要求的方法和手段满足这些和其他目的。从属权利要求与具体实施方案相关。
本发明的实施方案
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所述装置或组合物的具体组分部分或结构特征或所述方法的方法步骤，因为此类装置和方法可以变化。还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，而非意欲限制。仅凭某些措施记载在相互不同的从属权利要求中的事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。必须注意的是，如说明书和后附加权利要求中所用，单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”和“该(the)”包括单数和/或复数指示物，除非上下文另有明确指明。进一步，在权利要求中，词语“包含”不排除其他要素或步骤。仅凭某些措施记载在相互不同的从属权利要求中的事实并不表示这些措施的组合不能有利地使用。
此外，应理解，在给出由数值界定的参数范围的情况下，范围被认为包括这些限制值。
进一步应理解，本文公开的实施方案并不意味着理解为彼此不相关的个别实施方案。与一个实施方案一起讨论的特征意味着还结合本文所示的其他实施方案进行公开。如果，在一种情况下，特定特征不与一个实施方案一起公开，但与另一个实施方案一起公开，则技术人员将理解，不一定意味着所述特征并不意味着与所述另一实施方案一起公开。技术人员将理解，还对于其他实施方案公开所述特征是本申请的主旨，但仅出于清楚的目的并且为了将说明书保持在可管控的文卷范围内，这尚未进行。
在本发明的上下文中，“抑制”或“降低”应理解为相比于对照、例如未处理的对照，将测量的结果降低至少20%，优选地至少50%，更优选地至少75%。当考虑本公开的教导时，适合的对照对于技术人员而言是显而易见的。技术人员可以从相关文献轻易获取测定所述抑制或降低的适合测定法。在一个实施方案中，正使用下文所提及的cAMP释放测定法以测定所述抑制或降低。
“抑制”和“拮抗”以及“抑制剂”和“拮抗剂”在本文中可互换地使用。
在一个优选实施方案中，术语“抑制”是指特异性抑制。“特异性抑制”表示抑制指名的受体，而其他受体，优选地其他G蛋白偶联受体(GPCR)不被显著抑制。在优选的实施方案中，“GPR84的特异性抑制”是指抑制GPR84活性，同时不显著抑制一种或多种膜转运蛋白或其他G蛋白偶联受体(GPCR)，优选地选自以下的一种或多种：去甲肾上腺素(NET)、多巴胺(DAT)、钾通道hERG、钾通道(KATP)、GPR40。在优选的实施方案中，“其他G蛋白偶联受体(GPCR)”是指GPR40。
在优选的实施方案中，GPR84的特异性抑制是指相比于对照，将GPR84活性抑制至少20%，优选地至少50%，更优选地至少75%，同时将选自其他G蛋白偶联受体(GPCR)、优选地选自去甲肾上腺素(NET)、多巴胺(DAT)、钾通道hERG、钾通道(KATP)和GPR40的一种或多种膜转运蛋白的活性抑制至多75%，更优选地至多50%、又更优选地至多10%。技术人员可从相关文献轻易获取测定所述抑制或降低的合适测定法。在一个实施方案中，正使用下文所提及的cAMP释放测定法以测定所述抑制或降低。其他受体的抑制可如实施例的实验中所例示进行评价。
根据本发明的一个实施方案，提供了G蛋白偶联受体84 (GPR84)的拮抗剂或抑制剂，其用于治疗和/或预防患者，所述患者：
· 患有子宫内膜异位症，
· 处于发展子宫内膜异位症的风险下，和/或
· 正就子宫内膜异位症进行诊断。
本发明的发明人令人惊讶地发现GPR84在炎性细胞类型和子宫内膜异位症患者的患病组织中表达，并且还显示GPR84抑制对此病况诸如炎性疼痛具有缓解作用。尤其，GPR84抑制在体外子宫内膜异位症模型内降低促炎性和促疼痛介体，诸如IL-1β和TNFα。因此，通过使用降低TNFα和IL-1β水平两者的子宫内膜异位症相关的升高水平的方法来治疗子宫内膜异位症和其相关症状有可能治疗子宫内膜异位症的症状和疾病进展。在具体实施方案中，所述拮抗剂或抑制剂用于治疗子宫内膜异位症相关的炎性疼痛。
此外，本文中显示GPR84激动剂(例如中链脂肪酸(MCFA))存在于子宫内膜异位组织和病变中，且促成表征疾病的提高炎性介体。
如本文所用，术语“GPR84的拮抗剂或抑制剂”是指能够将GPR84的活性直接或间接降低或抑制优选地至少20%、优选地至少50%、更优选地至少75%的化合物。技术人员可从相关文献轻易获取测定所述抑制或降低的合适测定法。在一个实施方案中，正使用下文所提及的cAMP释放测定法测定所述抑制或降低。
优选地，GPR84的拮抗剂或抑制剂是如上文所定义的GPR84的选择性抑制剂。
这种GPR84活性是例如GPR84的下游效应功能，如例如人和小鼠PBMC或巨噬细胞中的炎性介体释放。
所述降低或抑制可例如通过降低或抑制内源性和合成GPR84激动剂结合实现。所述激动剂结合的降低或抑制可例如通过与GPR84蛋白的竞争性或变构结合发生。
GPR84的优选激动剂是中链游离脂肪酸(MCFFA)，优选具有9至14的碳链长度(参见25，19，其通过引用并入本文)。这些尤其包括2-OH癸酸和癸酸，其为尤其优选的GPR84激动剂。
用于GPR84的人工激动剂是6-正辛基氨基尿嘧啶(6-OAU) (参见17，通过引用并入本文)。描述其他优选的人工激动剂；例如3,3'-二吲哚基甲烷(参见19，通过引用并入本文)和蒽贝素(Embelin)(参见WO2007027661 A1，通过引用并入本文)。下表显示一些根据本发明的所选择激动剂：
配体/激动剂 结构
癸酸
2-羟基癸酸
6-正辛基氨基尿嘧啶
3,3′-二吲哚基甲烷
蒽贝素
在一个实施方案中，拮抗剂是特异性结合GPR84的抗体，优选单克隆抗体，或是其抗原结合片段或衍生物。抗体优选地是单克隆抗体(mAb)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”应是指抗体组合物，其具有同质抗体群体，即由完整免疫球蛋白、或其抗原结合片段或衍生物组成的同质群体。尤其优选的，这种抗体选自：IgG、IgD、IgE、IgA和/或IgM，或其片段或衍生物。
如本文所用，术语“片段”应是指保留靶标结合能力的这种抗体的片段，例如：
• CDR(互补决定区)，
• 高变区，
• 可变结构域(Fv)，
• IgG重链(由VH、CH1、铰链、CH2和CH3区组成)，
• IgG轻链(由VL和CL区组成)，和/或
• Fab和/或F(ab)2。
如本文所用，术语“衍生物”应是指蛋白构建体，其在结构上不同于常见抗体概念(例如scFv、Fab和/或F(ab)2，以及双特异性抗体构建体、三特异性抗体构建体或更高的特异性抗体构建体或单价抗体)、但仍与所述常见抗体概念具有一定结构关系且进一步保留靶标结合能力。在下文解释全部这些项目。
技术人员已知的其他抗体衍生物是双功能抗体、骆驼科抗体、纳米抗体、结构域抗体、具有由scFvs组成的两条链的二价同二聚体、IgAs (由J链和分泌组分连接的两个IgG结构)、鲨鱼抗体、由新世界灵长类动物框架加非新世界灵长类动物CDR组成的抗体、包含CH3+VL+VH的二聚化构建体和抗体缀合物(例如连接到毒素、细胞因子、放射性同位素或标记物的抗体或片段或衍生物)。这些类型完全描述于文献中且可基于本公开内容由技术人员使用，增加另外的本发明活性。
如上所讨论，GPR84经充分指明以使得技术人员能够制备针对其的抗体，诸如单克隆抗体。常规方法涵盖杂交瘤、嵌合/人源化、噬菌体展示/转基因哺乳动物和其他抗体工程改造技术。
先前已描述用于生产杂交瘤细胞的方法(参见[30]，通过引用并入本文)。主要地，例如，用人GPR84蛋白免疫小鼠，随后为从所述小鼠的B细胞分离和分离的B细胞与骨髓瘤细胞的融合。
用于产生和/或选择嵌合或人源化mAb的方法是本领域中已知的。主要地，例如，将未参与靶标结合的来自鼠抗GPR84抗体的蛋白序列置换为对应的人序列。例如，Genentech的US6331415描述嵌合抗体的生产，同时医学研究委员会(Medical Research Council)的US6548640描述CDR移植技术，且Celltech的US5859205描述人源化抗体的生产。全部这些公开内容通过引用并入本文。
用于产生和/或选择全人mAb的方法是本领域中已知的。这些可涉及使用用人GPR84免疫的转基因动物，或使用合适的展示技术，如酵母展示、噬菌体展示、B细胞展示或核糖体展示，其中在固定相中针对人GPR84筛选来自文库的抗体。
体外抗体文库以及其他公开于MorphoSys的US6300064和MRC/Scripps/Stratagene的US6248516中。噬菌体展示技术例如公开于Dyax的US5223409中。转基因哺乳动物平台例如描述于TaconicArtemis的EP1480515A2中。全部这些公开内容通过引用并入本文。
IgG、scFv、Fab和/或F(ab)2是技术人员众所周知的抗体形式。能够实现的相关技术可得自相应的教科书。
如本文所用，术语“Fab”是指包含抗原结合区的IgG片段，所述片段由来自抗体的每个重链和轻链的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。
如本文所用，术语“F(ab)2”是指由通过一个或多个二硫键彼此连接的两个Fab片段组成的IgG片段。
如本文所用，术语“scFv”是指单链可变片段，其是用短接头(通常为丝氨酸(S)或甘氨酸(G))连接在一起的免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合体。尽管移除恒定区且引入连接肽，但此嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特异性。
修饰的抗体形式是例如双特异性或三特异性抗体构建体、基于抗体的融合蛋白、免疫缀合物等。这些类型完全描述于文献中且可基于本公开内容由技术人员使用，其增加另外的本发明活性。此外，单价抗体也已先前描述于US 2004/0033561 A1 (其中称为单功能抗体)或WO2007048037中；两者均通过引用并入本文。
基于GPR84的氨基酸序列的公开可得性，发现能够例如通过结合其活性中心而充当GPR84的拮抗剂的合适抗体或片段或衍生物因此对于技术人员而言是常规问题。
用于科学研究的针对GPR84的多克隆抗体是商购可得的，仅举几例，例如来自ThermoFischer (PA5-32843)、Santa Cruz Biotechnology (H-300, D-15)或NovusBiologicals (NBP1-84768)，因此证明技术人员能够制备针对GPR84的治疗性抗体。
因为GPR84是7-跨膜受体蛋白，所以抗体或其片段或衍生物可结合GPR84的胞外或胞内结构域。在后者情况下，所述抗体或其片段或衍生物需要汇集或运输至胞内空间中。常规技术可用于此目的，其在其他地方公开(26 - 28，通过引用并入本文)。
在一个实施方案中，所述拮抗剂或抑制剂是核酸抑制剂。此实施方案可例如包含至少特异性结合编码GPR84蛋白的多核苷酸的子区段的核酸分子。
优选地，所述多核苷酸编码GPR84蛋白，所述GPR84蛋白包含如Uniprot中在参考编号Q9NQS5所公开的AA序列，优选根据SEQ ID NO: 1的AA序列。
许多核酸抑制剂方法依赖于这种抑制性核酸分子与靶序列，即编码GPR84的多核苷酸的碱基配对。所述编码GPR84的多核苷酸可以是mRNA或基因组DNA。
优选地，所述抑制剂选自siRNA、shRNA、crRNA或引导RNA。
siRNA是可经化学修饰以提高稳定性的短人工RNA分子。因为siRNA是双链的，所以“有义”和“反义”链的原则也适用。有义链具有与转录的mRNA相同的碱基序列，且反义链具有互补序列。在技术上，向患者施用的siRNA分子被称为Argonaut的胞内酶结合，以形成所谓的RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex；RISC)。siRNA的反义链将RISC引导至靶mRNA，其中反义链与靶mRNA杂交，其然后由RISC切割。以这种方式，中断相应mRNA的翻译。RISC可随后切割其他mRNA。递送技术例如公开于其他地方([29]，通过引用并入本文)。基于GPR84的不同mRNA同种型的公开可得性，发现siRNA的合适序列对于技术人员而言是常规问题。
shRNA是可用于经由RNA干扰(RNAi)来沉默靶基因表达的具有紧密发夹弯的人工RNA分子。shRNA可例如借助质粒或通过病毒或细菌载体递送至细胞。shRNA是有利的RNAi介体，因为其具有相当低的降解和周转速率。相应质粒包含适合于表达shRNA的启动子，如聚合酶III启动子，诸如U6和H1，或聚合酶II启动子。一旦质粒或载体已整合至宿主基因组中，shRNA就在核中转录。产物模拟pri-微RNA (pri-miRNA)且通过Drosha处理。所得pre-shRNA通过输出蛋白(Exportin)5从核输出。此产物然后通过Dicer处理且装载于RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其后以与siRNA中的相同方式进行沉默。基于GPR84的不同mRNA同种型的公开可得性，发现shRNA的合适序列对于技术人员而言是常规问题。
第一核酸分子可以是CRISPR Cas系统的引导RNA (31)，所述引导RNA包含能够与GPR84基因的基因组链杂交的靶标特异性crRNA (“小干扰CRISPR RNA”) (或第一核酸分子可单独为crRNA)。引导RNA/crRNA能够将Cas酶(其为核酸内切酶)引导至GPR84基因，Cas酶在此处实施序列特异性链破坏。通过产生一个或多个双链破坏，GPR84基因因此可被沉默。为了使用所述系统用于GPR84的体内基因沉默，需要专用递送技术，其包含递送媒介物，诸如脂质纳米颗粒，如例如在其他地方所讨论的(32)。基于GPR84基因的基因组序列的公开可得性，发现用于包含在引导RNA中的crRNA的合适序列对于技术人员而言是常规问题。
在另一个实施方案中，所述第一核酸分子也可以是CRISPR Cpf1系统的引导RNA(33)，所述引导RNA包含靶标特异性crRNA (“小干扰CRISPR RNA”)。类似于CRISPR/Cas，引导RNA能够将Cpf1酶(核酸内切酶)引导至GPR84基因。关于技术考虑，例如用于体内应用的递送和发现第一核酸分子的合适序列，适用如同CRISPR/Cas的相似方面。
CRISPR技术的进一步实施方案目前处于开发中，其使用不同核酸内切酶。然而，所有这些方法均使用与靶序列杂交的靶标特异性RNA (如CRISPR Cas中的引导RNA或crRNA)。在所有这些情况下，靶标特异性RNA胜任本文所讨论的优选实施方案的含义中的第一核酸分子。关于技术考虑，例如用于体内应用的递送和发现第一核酸分子的适合序列，如同CRISPR Cas的相似方面适用。
微RNA (缩写为miRNA)是在植物、动物和一些病毒中发现的小的非编码RNA分子(含有约22个核苷酸)，其在RNA沉默和基因表达的转录后调节中发挥功能。
在一个实施方案中，所述拮抗剂或抑制剂是适体。适体是对预定靶标具有特异性结合特性的寡核苷酸。其经由称为SELEX (“通过指数富集的配体的系统进化”)的组合方法，从含有最多达1015种不同序列的随机合成文库获得。适体特性由其3D形状决定，所述形状由分子内折叠产生，所述分子内折叠由其一级序列驱动。适体3D结构通过氢键键合、静电和堆叠相互作用精巧地适用于其同源靶标的识别。适体通常展现高亲和力(对于小分子约微摩尔(µM)和对于蛋白皮摩尔(pM)的Kd)。
例如在通过引用并入本文的34中给出关于生成靶标特异性适体的技术库的概述。适体也可递送至胞内空间中，如35中所公开(通过引用并入本文)。
基于不同GPR84同种型的氨基酸序列的公开可得性，发现能够例如通过与其活性中心结合而充当GPR84的拮抗剂的合适适体，因此对于技术人员而言是常规问题。
在另一个尤其优选的实施方案中，所述拮抗剂或抑制剂是小分子。优选地，所述小分子是有机分子，和/或所述小分子具有小于≤ 550 DA、优选地≤ 500 DA、更优选地≤450 DA的分子量。
优选地，由抗体、适体或小分子抑制或拮抗的GPR84蛋白包含如Uniprot中在参考编号Q9NQS5所公开的AA序列，优选根据SEQ ID NO: 1的AA序列。
在本发明的优选实施方案中，所述拮抗剂或抑制剂将激动剂诱导的GPR84活化降低或抑制至少20%，更优选地至少50%、又更优选地至少75%。技术人员可从相关文献轻易获取测定所述抑制或降低的合适测定法。在一个实施方案中，正使用下文所提及的cAMP释放测定法测定所述抑制或降低。
根据本发明的一个实施方案，所述拮抗剂或抑制剂抑制激动剂诱导的GPR84活化，优选地
· 蒽贝素诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地9.4 nM或更小，和/或
· 2-OH癸酸诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM，优选地10 µM或更小，更优选地16nM或更小。
优选地，在GPR84 cAMP释放测定法中测定蒽贝素诱导的GPR84活化和/或2-OH癸酸诱导的GPR84活化。
通过潜在抑制剂对激动剂诱导的GPR84活化的抑制可例如根据以下原则在cAMP释放测定法中测试：
GPR84活性抑制细胞中的cAMP产生。GPR84的抑制因此导致细胞中的cAMP含量增加。然而，当通过测定对cAMP水平的影响来测试物质的抑制潜能时，必须确定观察到的影响是GPR84特异性的而非总体cAMP诱导作用。优选的选项为研究物质(潜在抑制剂)是否逆转GPR84激动剂的抑制作用。通过GPR84的Galphai信号传导的激动剂抑制膜腺苷酸环化酶诱导的细胞cAMP产生。在GPR84激动剂存在的情况下添加GPR84抑制剂(或GPR84拮抗剂)导致膜腺苷酸环化酶诱导的cAMP产生的(重新)增加。因此，对GPR84的拮抗作用导致细胞中的cAMP含量增加。潜在抑制剂的拮抗作用优选通过其在GPR84激动剂和膜腺苷酸环化酶活化剂(诸如毛喉素)存在的情况下暴露来测试。同样可利用通过膜腺苷酸环化酶活化非特异性提高cAMP水平的任何其他化合物或物质。可添加防止cAMP的降解的一种或多种化合物以确保此第二信使的足够积累。此类化合物包括磷酸二酯酶抑制剂，例如3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)。
技术人员将承认随着评价对激动性GPR84诱导的作用，测定GPR84特异性抑制，同上。为了进一步强化GPR84特异性，可使用过表达GPR84的细胞，例如但不限于“cAMP HunterTM CHO-K1 GPR84 Gi细胞”(DiscoverX; # 95-0158C2)。
通过测定与如上文所概述的潜在GPR84抑制剂接触的细胞中的cAMP含量并将其与适当对照比较，有可能确定拮抗作用。相比于对照，cAMP含量的增加表明GPR84拮抗作用且将化合物定性为抑制剂。优选地，如果相比于无潜在抑制剂的适当对照，物质使与潜在抑制剂、GPR84的激动剂、膜腺苷酸环化酶诱导的cAMP产生的活化剂和磷酸二酯酶抑制剂接触的细胞的cAMP含量增加至少20%，将其定性为GPR84的抑制剂。
技术人员能够使用常用技术检测细胞中的cAMP含量(水平)。常用技术可例如采用竞争性测定法。原则上，使可检测示踪剂与cAMP结合剂在应测定其cAMP含量的样品存在的情况下接触，其中可检测示踪剂与cAMP竞争性地结合cAMP结合剂。竞争性测定法经建构以便允许例如通过使用用于荧光共振能量转移(FRET)测定法的相容染料，检测与cAMP结合剂结合的示踪剂的相对量。在样品存在的情况下，样品中含有的cAMP与示踪剂竞争结合cAMP结合剂。如果样品是细胞，则可使细胞在将其应用于测定法之前经受裂解以便释放胞内cAMP含量。与cAMP结合剂结合的示踪剂的检测量与样品中的cAMP含量成反比。换言之，结合cAMP结合剂的示踪剂的强烈信号表明样品中的低cAMP含量，且-反之亦然-结合cAMP结合剂的示踪剂的较弱信号表明样品中的较高cAMP含量。最大信号在cAMP不存在的情况下获得。细胞内的cAMP含量的降低可因此通过在竞争性测定中比较相比于阴性对照和/或在添加所述潜在抑制剂之前，在添加测试抑制剂之后细胞中的cAMP含量来测定。在暴露于潜在抑制剂的样品中检测到更多结合cAMP结合剂的cAMP表明所述潜在抑制剂对GPR84的抑制(拮抗)作用。相比于竞争性测定中的对照，对于用潜在抑制剂处理的样品而言竞争性测定中的较弱信号因此表明潜在抑制剂对GPR84的抑制作用。
实际cAMP量的定量可例如借助基于荧光染料标记的cAMP示踪剂(例如cAMP-d2，(Cisbio；cAMP femto 2试剂盒；# 62AM5PEJ …])和cAMP结合剂，诸如标记的抗cAMP抗体，例如Eu-穴状合物标记的抗cAMP抗体(Cisbio；cAMP femto 2试剂盒；# 62AM5PEJ)的竞争测定实现。在细胞裂解后，存在的任何细胞cAMP竞争示踪剂与抗体的结合。如果使用用于示踪剂和cAMP结合剂的相容荧光染料，则这种信号可例如使用FRET来测量。取决于染料，使用如技术人员显而易见的不同发射和激发波长。对于d2/Eu-穴状化合物的组合，例如同上，在337 nm下激发后用适当的高通量荧光(HTRF)读取器(例如RubiStar；BertholdIndustries)测量665 nm和620 nm下的FRET诱导的发射。鉴于检测系统的竞争性质，激动剂处理导致较低的cAMP水平且增强HTRF信号。在毛喉素、激动剂和拮抗剂存在的情况下HTRF信号的任何减弱均指示通过GPR84的抑制性Galphai信号传导的消除，且因此指示对GPR84的抑制作用。
检测物质的抑制的示例性程序可如下进行：
1. 制备即可用于测定的冷冻细胞
为了冷冻细胞(cAMP HunterTM CHO-K1 GPR84 Gi细胞；DiscoverX；# 95-0158C2)的复苏，从液氮储存取出一个小瓶并在37℃下的水浴中快速解冻大约1至3分钟。其后立即通过倾析将细胞仔细转移至含有15 ml预温热全细胞培养基(HAM's F12；10 % FCS；无选择标记物)的50 ml Falcon管中。使用轻微涡旋辅助其再悬浮。在下一步骤中，经由持续5分钟的低g离心(Hereaus Multifuge 4 KR；400 rpm；rcf = 44g)立即收集细胞以避免过度压缩细胞沉淀。使用轻微倾析以除去培养基。最后，通过将细胞沉淀仔细地再悬浮于5 ml最终测定培养基(HAM's F12；10 % FCS；无选择标记物)来实现测定准备。在最后步骤中，测定细胞活力和实际细胞数目(Omni Life Science；Casy Cell Counter/Analyzer)，然后校正待接种的最终细胞数目的体积，即2500个细胞/µl。细胞接种借助多通道吸液管或适当的大容量试剂分配器实现。
2. 激动作用的测试(384孔形式)：
将2 µl即可用于测定的冷冻细胞直接接种至非无菌384孔板(Greiner；白色；#784075；5000个细胞/孔)的孔中。其后立即添加2 µl的2X激动剂/2X EC80毛喉素(最终浓度= 8 µM，Sigma；#F6886)溶液，所述溶液在测定培养基(HAM's F12；10% FCS；2 mM谷氨酰胺；无选择标记物)中制备。在60分钟孵育时间后，添加2 µl如所提供的cAMP-d2示踪剂(Cisbio；cAMPfemto 2试剂盒；# 62AM5PEJ)，随后分别添加2 µl细胞裂解缓冲液(根据制造商说明书制备的检测试剂)中含有的抗cAMP抗体。所有添加均使用多通道吸液管(ThermoFisher/ThermoScientific:E1-ClipTipTM；#4671010)或大容量试剂分配器(ThermoFisher Scientific:Multidrop Combi)进行。在60分钟后使用适当的HTRF读取器(BMG Labtech: Pherastar)测定时间分辨的FRET (TR-FRET)信号。
3. 拮抗作用的测试(384孔形式)：
在第一步骤中，将1 µl预定测试范围中的4X拮抗剂溶液(在测定培养基中制备；HAM'sF12；10% FCS；2 mM谷氨酰胺；无选择标记物)添加至非无菌384孔板(Greiner；白色；#784075；其后立即将2 µl即可用于测定的冷冻细胞直接接种至板(5000个细胞/孔)中)的孔中。细胞在潜在抑制剂(拮抗剂)存在的情况下孵育30分钟，然后添加同样在测定培养基中制备的1 µl 4X激动剂EC80 (最终浓度：蒽贝素=6.00*10-6 M，6-正辛基氨基尿嘧啶=1.34*10-7M)/4X EC80毛喉素(最终浓度=8 µM)溶液。在孵育60分钟之后，添加2 µl cAMP-d2示踪剂，随后添加2 µl细胞裂解缓冲液(根据制造商说明书制备的检测试剂)中含有的抗cAMP抗体。所有添加均使用多通道吸液管(ThermoFisher/Thermo Scientific:E1-ClipTipTM；#4671010)或大容量试剂分配器(ThermoFisher Scientific: Multidrop Combi)进行。在60分钟后使用适当的HTRF读取器(BMG Labtech: Pherastar)测定时间分辨的FRET (TR-FRET)信号。
在本发明的一个实施方案中，根据本发明的拮抗剂或抑制剂是选自包含以下的列表的组之一的成员：
· 二氢吡啶并异喹啉酮
· 二氢嘧啶并异喹啉酮。
优选地，所述拮抗剂或抑制剂是US2016244442 A1、WO2016169911 A1、US2016039807 A1和/或WO2015197550 A1(其内容通过引用并入本文)中的任一者中公开的二氢吡啶并异喹啉酮之一。同样优选地，所述拮抗剂或抑制剂是WO2014095798 A1(其内容通过引用并入本文)中公开的二氢嘧啶并异喹啉酮之一。在尤其优选的实施方案中，所述拮抗剂或抑制剂是以下之一：
WO 2014095798 A1的化合物139 (参见其中的段落[0380])
在本发明的一个实施方案中，子宫内膜异位症的特征在于：
· 相比于正位子宫内膜，异位病变中的中链游离脂肪酸(MCFFA)的存在增加
· 相比于取自对照患者的单核细胞和/或巨噬细胞，取自子宫内膜异位症患者的单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84的表达增加
· 相比于取自对照患者的单核细胞和/或巨噬细胞，取自子宫内膜异位症患者的单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84阳性细胞的分数较高。
其中，术语MCFFA涵盖优选地C9-C14脂肪酸，优选地癸酸和/或肉豆蔻酸，而术语ACOT优选地涵盖ACOT4和ACOT9。
本发明进一步提供了将妇科病况表征为子宫内膜异位症的方法，所述方法提供以下步骤：
a) 从患者的异位子宫内膜病变取样品(涂片、活检物、刮擦物)，
b) 测定和/或定量该样品中的中链游离脂肪酸(MCFA)的存在或不存在，和
c) 将所得参数中的至少一者与(i)获得自对照患者或同一患者的正位子宫内膜或(ii)取自合适文献或数据库的相应(对照)参数比较，
其中相比于对照，MCFFA的增加的存在归因于子宫内膜异位症的存在。
另外，本发明提供了将妇科病况表征为子宫内膜异位症的方法，所述方法提供以下步骤：
a) 从患者取得包含单核细胞和/或巨噬细胞的样品，优选血液样品，
b) 测定和/或定量该样品中包含的单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84的表达，
c) 将所得参数与(i)获得自健康患者的单核细胞和/或巨噬细胞或(ii)取自合适文献或数据库的相应(对照)参数比较，
其中相比于对照，单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84的增加表达归因于子宫内膜异位症的存在。
另外，本发明提供了将妇科病况表征为子宫内膜异位症的方法，所述方法提供以下步骤：
a) 从患者取得包含单核细胞和/或巨噬细胞的样品，优选血液样品，
b) 测定和/或定量该样品中包含的单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84阳性细胞的分数，
c) 将所得参数与(i)获得自健康患者的该样品中所包含的，或(ii)取自合适文献或数据库的相应(对照)参数比较。
在所有以上三种情况下，如果获得的参数偏离对照，则将妇科病况定性为子宫内膜异位症。优选地，在测定到以下的情况下将妇科病况定性为子宫内膜异位症：相比于针对MCFFA测定的对照参数增加的水平；或相比于单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84的对照参数增加的表达；或相比于该样品中包含的单核细胞和/或巨噬细胞中的GPR84阳性细胞的对照参数增加的分数。在另一个实施方案中，确定的MCFAA的存在指示妇科病况。在参数定性或指示为妇科的这种情况下，可向患者施用本发明的抑制剂或拮抗剂。
优选地，大于3.4 µM、更优选地大于4.0 µM、甚至更优选大于4.5 µM、又更优选地大于5.0 µM的MCFFA浓度归因于子宫内膜异位症或病变。
根据本发明的一个其他方面，提供了上文公开的拮抗剂或抑制剂(用于制造药剂)用于治疗正就子宫内膜异位症进行诊断、患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险下的人或动物受试者，或用于预防这种病况的用途。此外，提供了包含根据上文公开内容的拮抗剂或抑制剂的药物组合物。此外，提供了根据上文公开内容的药物组合物和一种或多种其他治疗活性化合物的组合。
此外，提供了用于治疗或预防与不期望的GPR84表达相关的子宫内膜异位症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据上文公开内容的药物组合物或组合。
根据本发明的一个其他实施方案，在施用弗氏完全佐剂之后，拮抗剂或抑制剂在体内发炎爪子模型中显示疼痛减轻特性。
根据本发明的一个其他方面，提供了用于鉴定化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者，所述方法包括在GPR84 cAMP释放测定法中，根据它们是否抑制以下各项来筛选一种或多种测试化合物：
· 蒽贝素诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地9.4 nM或更小；和/或
· 2-OH癸酸诱导GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地16 nM或更小；和/或
· 6-正辛基氨基尿嘧啶诱导GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地20 nM或更小。
在一个实施方案中，如果化合物抑制所述蒽贝素诱导的GPR84活化的IC50值为5 mM或更小、优选地10 µM或更小、更优选地9.4 nM或更小和/或抑制所述2-OH癸酸诱导的GPR84活化的IC50值为5 mM或更小、优选地10 µM或更小、最优选地16 nM或更小，则视为其适用于所述治疗和/或预防中。
根据本发明的一个其他方面，提供了用于鉴定化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者，在所述方法中评价测试化合物对以下各项的抑制作用：
a) GPR84配体或GPR84激动剂刺激的应答，或
b) 未刺激的GPR84活性。优选地，对所述应答或活性展现抑制作用的化合物被视为适合于所述用途和/或治疗。根据本发明的又一个其他方面，提供了用于鉴定化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者中的子宫内膜异位症，其中所述拮抗剂或抑制剂可通过包括以下步骤的方法鉴定：
a1) 使测试化合物与GPR84多肽接触，和
b1) 检测所述测试化合物与所述GPR84多肽的结合；
或
a2) 测定GPR84多肽在特定浓度的测试化合物下或在所述测试化合物不存在的情况下的活性，和
b2) 测定所述多肽在不同浓度的所述测试化合物下的活性；
或
a3) 测定GPR84多肽在特定浓度的测试化合物下的活性，和
b3) 测定GPR84多肽在已知为GPR84多肽的调节剂的化合物存在的情况下的活性。
这些和其他实施方案尤其可用于在多种药物筛选技术中的任一者中通过使用GPR84或其结合片段筛选治疗性化合物。因为GPR84是G蛋白偶联受体，所以本领域中常用的方法中的任一者都有可能用于鉴定GPR84配体。例如，G蛋白偶联受体、诸如GPR84的活性可使用多种适当的功能测定法中的任一者测量，其中受体的活化导致某种第二信使系统，诸如腺苷酸环化酶、鸟苷酸环化酶、钙动员或肌醇磷脂水解的水平的可观察变化。
或者，这种测试中所用的多肽或片段游离在溶液中，粘附至固体支持物，承载于细胞表面上或定位在胞内。一种药物筛选方法利用真核或原核宿主细胞，其用表达多肽或片段的重组核酸稳定转化。在竞争性结合测定中针对此类转化细胞筛选药物。呈存活或固定形式的此类细胞用于标准结合测定。
例如测量GPR84和试剂之间的复合物的形成。或者，可以检查由所测试试剂引起的GPR84和配体之间的复合物形成的减少。
因此，本发明提供了筛选影响GPR84信号转导的药物候选物、药物或任何其他试剂的方法。本领域中众所周知的这些方法包括使这种试剂与GPR84多肽或其片段接触和测定(i)试剂和GPR84多肽或片段之间的复合物的存在，或(ii)GPR84多肽或片段和细胞之间的复合物的存在。在此类竞争性结合测定中，通常标记GPR84多肽或片段。在合适的孵育之后，使游离GPR84多肽或片段与呈结合形式存在的GPR84多肽或片段分离，且游离或未复合的标记物的量是特定试剂结合GPR84或干扰GPR84试剂复合物的能力的量度。
药物筛选的另一种技术提供了具有与GPR84多肽的合适结合亲和力的化合物的高通量筛选。简言之，在固体基板，诸如塑针或某种其他表面上合成大量不同小肽测试化合物。使肽测试化合物与GPR84多肽反应且洗涤。然后通过本领域中众所周知的方法检测结合的GPR84多肽。还将纯化的GPR84直接包被至板上以用于前述药物筛选技术中。另外，使用非中和抗体捕获肽并将其固定于固体支持物上。
另一种技术是如在上文进一步描述和在实施例的实验中作为高通量筛选的cAMP释放。
本发明还涵盖使用竞争性药物筛选测定，其中能够结合GPR84的中和抗体与测试化合物特异性竞争与GPR84多肽或其片段结合。以此方式，使用抗体检测与GPR84共有一种或多种抗原决定簇的任何肽的存在。
根据本发明的一个其他方面，提供了鉴定化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者，所述方法包括以下步骤：
a) 提供使用正位或异位子宫内膜的子宫内膜切片测定，
b) 在测试化合物存在或不存在的情况下用GPR84激动剂处理切片，和
c) 测定测试化合物是否减少GPR84激动剂诱导的细胞因子、生长因子和/或趋化因子表达和/或分泌。
在优选的实施方案中，在步骤c)中降低的表达和分泌归因于适用于治疗和/或预防中的所述用途中的化合物。
所述细胞因子、生长因子和趋化因子包括但不限于IL-1β以及TNFα。此方法的实例显示于实验部分中。所述激动剂包括中链脂肪酸，优选地完全饱和中链脂肪酸，更优选地癸酸。
根据本发明的一个其他方面，提供了用于鉴定化合物的方法，所述化合物用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者中的子宫内膜异位症，所述方法包括以下步骤：
a) 提供人腹膜单核细胞或GPR84表达单核细胞细胞系、诸如THP1或U937的制备物，
b) 用测试化合物处理细胞，和
c) 测定测试化合物是否降低诱导外周血单核细胞的趋化性的趋化因子、优选IL-1β和TNFα的释放。
在优选的实施方案中，诱导趋化性的趋化因子、优选IL-1β和TNFα的所述释放的降低归因于适用于治疗和/或预防中的所述用途中的化合物。
GPR84表达单核细胞细胞系、诸如THP1或U937是本领域技术人员已知的[参见4和9，其通过引用并入本文]。
优选地，在步骤b)中，测量指示GPR84多肽的活性的信使分子的释放或表达的抑制。优选地，所述方法是US2015330968A1(其内容通过引用并入本文)中公开的方法之一。优选地，所述测试化合物选自：癸酸、十一酸、十二酸、2,5-二羟基-3-十一碳基-2,5-环己二烯-1,4-二酮(蒽贝素)、二十碳-5,8,11,14-四烯酸、5S,6R-二羟基-二十碳-7,9,11,14-四烯酸、二吲哚基甲烷和吲哚-3-甲醇。优选地，所述信使分子是环状AMP (cAMP)。
实施例
尽管已经在附图和前面的描述中详细地举例说明和描述了本发明，但此类举例说明和描述将被认为是说明性的或示例性的而不是限制性的；本发明不限于所公开的实施方案。本领域技术人员可以在实施请求保护的发明中通过研究附图、公开内容和所附权利要求来理解和实现所公开的实施方案的其他变型。任何参考标记不应被解释为限制范围。
本文公开的全部氨基酸序列均从N-末端至C-末端显示；本文公开的全部核酸序列均以5'-＞3'显示。
实验
体外测定1：GPR84配体和拮抗剂表征
GPR84激动剂的剂量反应实验在384孔板形式中使用cAMP HunterTM CHO-K1 GPR84 Gi细胞系统(DiscoverX) (用DMF12 HAM，9% FBS；300 ug/ml潮霉素；800 ug/ml遗传霉素；2mMGlut；1% Pen/Strep培养的PathHunter® CHO-K1 hGPR84 β-抑制蛋白细胞系)进行。在接种前测定细胞活力和数目(Omni Life Science；Casy细胞计数器/分析仪)且激动剂处理随后为60分钟孵育时间以在高通量BMG Labtech Pherastar仪器上使用时间分辨的FRET(TR-FRET)测定cAMP水平。对于拮抗剂剂量反应，在添加如表1中所述的激动剂前，将细胞在拮抗剂存在的情况下孵育30分钟。在60分钟孵育之后，通过如上文所述的TR-FRET测定cAMP水平。使用GraphPad Prism拟合数据。
获得的数据概述于表1中：
表1：
实施例 激动作用EC<sub>50</sub> [M] 拮抗作用IC<sub>50</sub> [M]
蒽贝素 3.8 x 10<sup>-6 </sup>M n.a.
癸酸 10 x 10<sup>-6 </sup>M n.a.
2-OH-癸酸 24 x 10<sup>-6 </sup>M n.a.
CMPD 139 (和6-正辛基氨基尿嘧啶 1.34 X 10<sup>-7</sup>M) n.a. 20 x 10<sup>-9</sup>M
CMPD 139 (和蒽贝素 6.00 10<sup>-6 </sup>M) n.a. 9.4 x 10<sup>-9</sup>M
CMPD 139 (和40 x 10<sup>-6 </sup>M 2-OH癸酸 n.a. 16 x 10<sup>-9</sup>M
n.a.：不适用。
离体测定1：GPR84配体相关的子宫内膜炎症测定
将作为子宫内膜异位症病变的替代物的人正位子宫内膜组织活检组织切成小切片，用HBSS缓冲液[ThermoFischer，14175095]洗涤并在补充有5% FCS的DMEM/F12培养基[ThermoFischer，11320-033]中孵育3小时。移除培养基并置换为补充有GPR84激动剂(癸酸)和GPR84拮抗剂CMPD139的组合的DMEM/F12，2% CCS (活性炭剥离)。在21小时之后，根据供应商的说明书，用Bio-Plex平台定量上清液中的细胞因子。使用GraphPad软件(LaJolla，USA)分析数据。
在该设置中，GPR84配体令人惊讶地提高先前确定与子宫内膜异位症相关的几种促炎细胞因子和生长因子的水平。这些介体包括IL1β和TNFα。相比于单独用GPR84的激动剂的处理，用10-5 M的拮抗剂CMPD 139与作为激动剂的癸酸组合处理降低所有测量的细胞因子和生长因子。结果显示于表2中。因此，GPR84的活化促成与子宫内膜异位症相关的炎症且拮抗剂能够减少炎症。
体外测定2：来自PBMC的GPR84配体相关的ILβ和TNFα释放
通过Ficoll-Paque Plus (Biochrom)密度梯度离心，从全血分离PBMC。简言之，使PBMC以250 g离心30秒，并在37℃下在5% CO2环境中，在具有10%热失活FBS、L-谷氨酰胺(10 g/L)、青霉素(100 IU/mL)和链霉素(100 ng/mL)的RPMI 1640培养基[Gibco，目录号11875093]中再悬浮和培养。细胞用LPS (100 ng/ml，Sigma-Aldrich)刺激24小时并用GPR84激动剂6-正辛基氨基尿嘧啶和拮抗剂CMPD 139处理4 h。通过ELISA (MesoscaleDiscovery，Germany)分析IL-1β和TNFα浓度。CMPD139降低GPR84提高的IL-1β和TNFα水平，如表3中所示。
腹膜组织的免疫组织化学
将福尔马林(3.7%)固定、石蜡包埋的组织的横向切片脱石蜡、水化，并使用自动LeicaMultistainer和Coverslipper (Leica ST5020+CV 5030, Leica Microsystems,Germany)进行H&E [苏木精和伊红染料]染色。
为了检测GPR84-和CD68-表达细胞，抗GPR84-IgG (A91742，兔多克隆，Sigma-Aldrich，Germany)和抗CD68-IgG (KP1，小鼠单克隆，Abcam，Germany)分别用作一抗。应用Dako Envision+ System-HRP (Dako，USA)和GBI永久红(GBI，USA)底物溶液来发展特异性染色。载片另外用H&E复染。图1是这种载片的显微照片。
子宫内膜异位症的异位病变中的GPR84表达的免疫组织化学。异位腹膜病变富含浸润骨髓细胞(CD68)且与GPR84共同染色。
子宫内膜异位症患者相对于对照的腹腔中的GPR84阳性细胞的测定
通过ficoll密度梯度离心，收集来自腹水的单核细胞(n = 3/组)并在-80℃下冷冻。为了测量GPR84表达，使细胞在冰上解冻30 min并用PBS洗涤。然后，根据制造商的说明，用可固定活力染料eFluor® 780 (eBioscience，目录号65-0865)染色细胞，随后用1%固定缓冲液(BioLegend，目录号420801)固定。Fc受体通过20%人血清和5 µL/100 µL人TruStain FcXFc受体封闭血清(BioLegend，目录号422301)封闭，并将细胞用补充有1% BSA和0.1%皂苷的PBS透化。透化的细胞然后与GPR84抗体(Bioss，目录号bs-15353R)和兔IgG同种型对照(Bioss，目录号bs-0295P-PE)在冰上孵育1小时。在染色之后，将细胞洗涤两次并在流式细胞仪(BD LSRFORTESSA；BD Bioscience)上采集。
流式细胞术分析显示相对于对照患者，来自子宫内膜异位症患者的巨噬细胞中的GPR84的较高表达水平(图2)。
子宫内膜组织中的MCFA的测定
使用与质谱(GC/MS)检测(Agilent 7890 GC/5975 MSD)偶联的气相色谱，测定作为其对应甲酯衍生物的正位(子宫内膜)和异位(病变)子宫内膜组织中的单独游离中链脂肪酸(MCFA；癸酸和肉豆蔻酸)的含量。样品用甲醇HCl溶液处理延长的时间段以将游离脂肪酸完全转化为其甲酯。记录具有四种特征性离子的选择的离子监测(SIM)模式中的色谱图用于定量单独的甲酯衍生物。与正位子宫内膜(对照)相比，子宫内膜病变(病变)中的癸酸和肉豆蔻酸水平较高。统计学分析；未配对t检验，显著性差异(P ＜ 0.05)。
CFA疼痛模型中的CMPD139的作用
在动态承重(DWB)模型中，在施用弗氏完全佐剂(CFA)之后(24 h)，在发炎爪子中测量体内CMPD139对炎性疼痛的效力[10]。使用预防性设置研究在炎症的小鼠CFA模型中，在重复口服和皮下施用(3x)之后，用CMPD139的重复预防性治疗对疼痛的作用。在第0天，在注射CFA前2 h和6-8h后施用GPR84拮抗剂CMPD139 (90或30 mg/kg，p.o.+s.c.，3x剂量)。在应用CFA后24 h，在DWB测试前2 h给予第三剂量的CMPD139。用单因素方差分析进行统计分析，随后使用GraphPad PRISM软件针对媒介物对照组进行Bonferroni氏多重比较检验，*p＜0.05。
参考文献
在本说明书中参考以下文章。为了实现本发明的目的，其内容通过引用并入本文。
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<213> G蛋白偶联受体84
<400> 1
Met Trp Asn Ser Ser Asp Ala Asn Phe Ser Cys Tyr His Glu Ser Val
1 5 10 15
Leu Gly Tyr Arg Tyr Val Ala Val Ser Trp Gly Val Val Val Ala Val
20 25 30
Thr Gly Thr Val Gly Asn Val Leu Thr Leu Leu Ala Leu Ala Ile Gln
35 40 45
Pro Lys Leu Arg Thr Arg Phe Asn Leu Leu Ile Ala Asn Leu Thr Leu
50 55 60
Ala Asp Leu Leu Tyr Cys Thr Leu Leu Gln Pro Phe Ser Val Asp Thr
65 70 75 80
Tyr Leu His Leu His Trp Arg Thr Gly Ala Thr Phe Cys Arg Val Phe
85 90 95
Gly Leu Leu Leu Phe Ala Ser Asn Ser Val Ser Ile Leu Thr Leu Cys
100 105 110
Leu Ile Ala Leu Gly Arg Tyr Leu Leu Ile Ala His Pro Lys Leu Phe
115 120 125
Pro Gln Val Phe Ser Ala Lys Gly Ile Val Leu Ala Leu Val Ser Thr
130 135 140
Trp Val Val Gly Val Ala Ser Phe Ala Pro Leu Trp Pro Ile Tyr Ile
145 150 155 160
Leu Val Pro Val Val Cys Thr Cys Ser Phe Asp Arg Ile Arg Gly Arg
165 170 175
Pro Tyr Thr Thr Ile Leu Met Gly Ile Tyr Phe Val Leu Gly Leu Ser
180 185 190
Ser Val Gly Ile Phe Tyr Cys Leu Ile His Arg Gln Val Lys Arg Ala
195 200 205
Ala Gln Ala Leu Asp Gln Tyr Lys Leu Arg Gln Ala Ser Ile His Ser
210 215 220
Asn His Val Ala Arg Thr Asp Glu Ala Met Pro Gly Arg Phe Gln Glu
225 230 235 240
Leu Asp Ser Arg Leu Ala Ser Gly Gly Pro Ser Glu Gly Ile Ser Ser
245 250 255
Glu Pro Val Ser Ala Ala Thr Thr Gln Thr Leu Glu Gly Asp Ser Ser
260 265 270
Glu Val Gly Asp Gln Ile Asn Ser Lys Arg Ala Lys Gln Met Ala Glu
275 280 285
Lys Ser Pro Pro Glu Ala Ser Ala Lys Ala Gln Pro Ile Lys Gly Ala
290 295 300
Arg Arg Ala Pro Asp Ser Ser Ser Glu Phe Gly Lys Val Thr Arg Met
305 310 315 320
Cys Phe Ala Val Phe Leu Cys Phe Ala Leu Ser Tyr Ile Pro Phe Leu
325 330 335
Leu Leu Asn Ile Leu Asp Ala Arg Val Gln Ala Pro Arg Val Val His
340 345 350
Met Leu Ala Ala Asn Leu Thr Trp Leu Asn Gly Cys Ile Asn Pro Val
355 360 365
Leu Tyr Ala Ala Met Asn Arg Gln Phe Arg Gln Ala Tyr Gly Ser Ile
370 375 380
Leu Lys Arg Gly Pro Arg Ser Phe His Arg Leu His
385 390 395

Claims (18)

1.G蛋白偶联受体84 (GPR84)的拮抗剂或抑制剂，其用于治疗和/或预防患者中的子宫内膜异位症，所述患者：
· 患有子宫内膜异位症，
· 处于发展子宫内膜异位症的风险下，和/或
· 正就子宫内膜异位症进行诊断。
2.根据权利要求1所述的拮抗剂或抑制剂，其是特异性结合GPR84的抗体，优选单克隆抗体，或是其抗原结合片段或衍生物。
3.根据权利要求1所述的拮抗剂或抑制剂，其为核酸抑制剂。
4.根据权利要求3所述的拮抗剂或抑制剂，其包含至少特异性结合编码GPR84蛋白的多核苷酸的子区段的核酸分子。
5.根据权利要求3或4所述的拮抗剂或抑制剂，其中所述多核苷酸编码GPR84蛋白，所述GPR84蛋白包含如Uniprot中在参考编号Q9NQS5所公开的AA序列，优选根据SEQ ID NO: 1的AA序列。
6.根据权利要求3所述的拮抗剂或抑制剂，其为适体。
7.根据权利要求1所述的拮抗剂或抑制剂，其为小分子。
8.根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂或抑制剂，其中被所述抗体、适体或小分子抑制或拮抗的所述GPR84蛋白包含如Uniprot中在参考编号Q9NQS5所公开的AA序列，优选根据SEQ ID NO: 1的AA序列。
9.根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂或抑制剂，其抑制：
· 蒽贝素诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地9.4 nM或更小，和/或
· 2-OH癸酸诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地16 nM或更小，和/或
· 6-正辛基氨基尿嘧啶诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地20 nM或更小，
如GPR84 cAMP释放测定法中所测定。
10.根据权利要求1和7至9中任一项所述的拮抗剂或抑制剂，其是选自包含以下的列表的组之一的成员：
· 二氢吡啶并异喹啉酮
· 二氢嘧啶并异喹啉酮。
11.根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂，其中所述子宫内膜异位症的特征在于：
· 相比于正位子宫内膜，在异位病变中存在中链游离脂肪酸(MCFFA)和/或酰基-CoA硫酯酶(ACOT)和/或脂肪酸合酶(FASN)；和/或
· 相比于取自对照患者的巨噬细胞，取自子宫内膜异位症患者的巨噬细胞中的GPR84表达增加；和/或
· 相比于取自对照患者的单核细胞和/或巨噬细胞，取自子宫内膜异位症患者的单核细胞和/或巨噬细胞中GPR84阳性细胞的分数较高。
12.根据前述权利要求中任一项所用的拮抗剂，其中所述治疗是治疗子宫内膜异位症相关的炎性疼痛。
13.根据前述权利要求中任一项所述的拮抗剂或抑制剂(用于制造药剂)用于治疗正就子宫内膜异位症进行诊断、患有子宫内膜异位症或处于发展子宫内膜异位症的风险下的人或动物受试者，或用于预防这种病况的用途。
14.药物组合物，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的拮抗剂或抑制剂。
15.根据权利要求14的药物组合物与一种或多种其他治疗活性化合物的组合产品。
16.用于治疗或预防与不期望的GPR84表达相关的子宫内膜异位症的方法，其包括向有此需要的受试者施用有效量的根据权利要求14所述的药物组合物或根据权利要求15所述的组合产品。
17.鉴定用于治疗和/或预防患有子宫内膜异位症、处于发展子宫内膜异位症的风险下和/或正就子宫内膜异位症进行诊断的患者中的子宫内膜异位症的化合物的方法，所述方法包括在GPR84 cAMP释放测定法中，根据它们是否抑制以下各项来筛选一种或多种测试化合物：
· 蒽贝素诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地9.4 nM或更小，和/或
· 2-OH癸酸诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地16 nM或更小，和/或
· 6-正辛基氨基尿嘧啶诱导的GPR84活化，其中IC50值为5 mM或更小，优选地10 µM或更小，更优选地20 nM或更小。
18.根据权利要求17所述的方法，其中如果化合物抑制蒽贝素诱导的GPR84活化的IC50值为5 mM或更小、最优选地9.4 nM或更小和/或2-OH癸酸诱导的GPR84活化的IC50值为5 mM或更小、最优选地16 nM或更小，则视为其适用于所述治疗和/或预防中。
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