JP7321931B2 - 細胞外ベシクル(ev)の組成物およびその医学的使用 - Google Patents
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Description
新たな毛細血管の形成(新血管形成)は、虚血後の組織をレスキューする際の重要なイベントである。一連の膨大な前臨床および臨床データは、幹細胞が、血管形成を改善することにより治癒プロセスに関与しうることを示している。さらに、組織の損傷部位における幹細胞の一時的な検出から、パラクリン機構が主に幹細胞の作用に関与しうることが示唆されている。かかるパラクリン機構の中には、エンドサイトーシスによりエンドソーム膜区画から導出されるベシクルである「エキソソーム」、および細胞形質膜の出芽(budding)により生成するベシクルである「エクトソーム/マイクロベシクル」が含まれる。エキソソームおよびエクトソーム/マイクロベシクルは、特徴および生物学的活性が重複するため、最近では、「細胞外ベシクル」(EV)というより包括的な用語が提案されている。EVは、生理的状態でもおよび病理学的状態でも、強力な細胞間コミュニケーションに関与するビヒクルである。最近の研究では、EVカーゴの輸送が受容細胞の運命を決定し得ることを示す証拠が得られている。実際、受容細胞への、核酸およびタンパク質を含むEVカーゴの輸送は、それらの作用の中でも最も重要な機構である。
これまで、最も研究されたEVは、それらの由来する細胞の効果を模倣する能力から、幹細胞により放出されるものであった。病理学的条件に応じて、標的細胞に対する様々な表現型の変化が示された。幹細胞由来のEVの作用機構を特徴づけるために、トランスクリプトームおよびプロテオミクス分析が行われた。特に、骨髄または脂肪組織から導出される間葉系幹細胞から回収されたEVにより、強い血管新生促進プロファイルが示された。これは、虚血関連疾患を含む臨床的設定におけるこれらのEVの潜在的なインパクトを示唆するものであった。
後述する例において詳細に例示されるように、上記の試験により本発明者らは、力価試験において測定した結果、血管内皮成長因子(VEGF)を参照血管新生促進成長因子として用いた場合に、血液成分に由来するEVが強い血管新生促進活性を有し、それにより、血液成分に由来するEVが、特に虚血性疾患および虚血性傷害の治療的処置または創傷癒合において効果的であることを見出した。
本発明のEV組成物により処置される虚血性疾患または虚血性傷害は、好ましくは血管の疾患または傷害である。さらにより好ましくは、それは急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患、または急性腎臓虚血からなる群から選択される。
本発明の使用のためのsEVが単離される血液成分は、好ましくは血液、血清または血漿である。より好ましくは、sEVは、健常なドナーの供血から調製される。
上記の実施形態の全てにおいて、EVはヒト細胞に由来するのが好ましい。
さらに、上記の実施形態の全てにおいて、組成物は医薬調製物であってもよく、それは上記で定義されるEVならびに薬学的に許容される担体、ビヒクルまたは希釈剤を含む。担体、ビヒクルまたは希釈剤、ならびに所望の医薬剤形の調製物に必要とされる他のいかなる賦形剤の選択も、当業者の技量の範囲内である。
上記したように、本発明者らは、血液成分から単離されたEVが強い血管新生促進活性を有し、特に虚血性疾患および虚血性傷害の処置において、または創傷癒合においてそれらが効果的であることを見出した。
当然ながら、本発明の第1の態様に係る、血液成分から単離されたEVを含む組成物と同等の血管新生活性を有するEVを含むいかなる組成物も、それからEVが調製される供給源にかかわりなく、虚血性疾患および虚血性傷害の処置、また創傷癒合において同様に、または少なくとも同等に効果的である。
BrdUアッセイは、好ましくはマトリゲルに播種されたHMEC細胞を使用する。BrdU細胞増殖アッセイにおいて、陽性対照に血清(好ましくは10%の血清)が添加される。陰性対照は、血清を添加しないことを除き、陽性対照と同じ培地である。BrdUアッセイは、好ましくは標的細胞当たり10000 EVの濃度に基づき行う。
測定されたEVの活性が、測定された陽性対照の活性の所定のパーセンテージを超える(例えば測定された陽性対照の活性の>50%)場合、試験されたEV調製物は活性であると考えられる。
- BrdU細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ;
- BrdU細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ;
- BrdU細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ;
- 以下の式:
を含む力価試験において測定したとき、該組成物は少なくとも50%の活性%を有する。
- 細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ;
- 細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ;
- 細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ;
- 以下の式:
を含む力価試験において測定したとき、該組成物は少なくとも50%の活性%を有する。
開示される実施形態のいずれかに係るEV組成物は、BrdUアッセイにより測定した場合の培養細胞の増殖を促進するその能力により、培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての使用に適する。
さらに、上記の力価試験は、複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地から単離されたEVのスクリーニングに、またさらなる処理に用いるための血管新生促進活性を有する調製物の同定に適する。
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からEVを単離するステップと、
単離されたEVから、所定のEV濃度の1つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各EVサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
2つ以上の活性EVサンプルをプールするステップを含んでもよい。
本願明細書の後半で例示する実験結果は、健常なドナーの血清または他の血液成分に由来するEVが、インビトロおよびインビボで血管新生シグナルを誘導することができ、またsEVをプールした場合であってもこの効果が失われないことを示す。sEVはまた、PADのインビボ前臨床モデルにおいて再灌流を改善する。
したがって、本発明はまた、血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、トランスフォーミング成長因子β1(TGFb1)、TGFb1をコードする核酸またはTGFb1発現誘導剤を担持する細胞外ベシクル(EV)、ならびに、アンジオスタチンまたはアンジオスタチン放出を誘導できる剤を担持する細胞外ベシクル(EV)を含む組成物に関する。
トランスフォーミング成長因子β1(TGFb1)またはTGFb1をコードする核酸またはTGFb1発現を誘導する剤を担持するEV、ならびにアンジオスタチンまたはアンジオスタチン放出を誘導できる剤を担持するEVは、適切な天然供給源を用いて単離してもよく、または、活性成分の所望の組合せを含むよう設計されてもよい。
上記で定義される本発明の組成物は、好ましくは医薬組成物である。前記医薬組成物は、上記の活性成分に加えて、とりわけ、選択された医薬剤形、投与ルートおよび投与レジメン、ならびに患者の特徴および処置される疾患などを考慮し、当業者により選択される薬学的に許容される賦形剤および/または担体および/または希釈剤をさらに含む。
本発明は、後述する例により詳細に理解されるが、それは例示のみを目的として提供されるものであり、その際、添付の図面を参照する。
1.1. 血清EVの単離
所内の血液バンク審査委員会(Review Board of Blood Bank)によるインフォームドコンセントおよび承認の後、健常な血液ドナー(n=18)からのヒト血清が、トリノ健康科学都市(Citta della Salute e della Scienza di Torino)の血液バンクにより提供された。全てのヒトおよび動物実験は、欧州ガイドライン(European Guidelines)および方針に従い実施され、またチューリン大学の倫理委員会により、およびイタリア保健院(Italian Institute of Health)により承認された。20分間、3,000rpmで血清を遠心単離して残渣を除去することにより、110mlの血清バッグから各ドナー由来のsEVを得た。上清を次に4℃で2時間、100,000で超遠心分離した。次にEVペレットを、DMSOを1%含有するRPMIで1mlの最終量で再懸濁し-80℃で保存した。次にsEVを解凍し、生物学的アッセイおよび分子的解析に用いた。
sEV FACS解析を、Guava easyCyte(商標)フローサイトメーター(ミリポア社、ドイツ)により実施した。
単核細胞/マクロファージ(CD14、CD15)、白血球(CD45)、接着分子(alpha6、CD44、CD29)、内皮細胞(CD31、KDR)および血小板(CD42b、CD62P、P SEL)に対する特異的マーカーを認識する抗体と、健常なドナーからのsEVとをインキュベートした。FITC、またはPEマウスの非免疫アイソタイプIgG(ベクトンディッキンソン社、Franklin Lakes、NJ)を対照として使用した。sEVを、4℃で1時間、特異的抗体または対照アイソタイプ抗体とインキュベートし、FACSにより解析した。
ナノサイトLM10システム(Nanosight社、Amesbury、英国)によりsEVを解析した。簡潔には、sEV調製物を滅菌した0.9%の生理食塩水で希釈(1:1000)し、Nanoparticle Analysis SystemおよびNTA 1.4 Analytical Softwareを備えたナノサイトLM10により解析した。各患者の全EV数は、前記装置により得られた値(微小粒子/ml)を、分析のために行った希釈倍率、およびsEVを再懸濁したマイクロリットル数で乗算することにより得た。
予備的試験において、ヒトの微小血管内皮細胞(HMEC)に対する最良の生物学的応答を得るのに必要なsEVの数を評価するため、投与量応答曲線を作成した。略語ECを試験全体にわたり用いる。4つの異なるsEVサンプルを用いることにより、5×104個sEV/標的細胞が最も効果的なsEV投与量であることがわかった。ゆえに、5×104個EV/標的細胞を、インビトロ試験全体にわたり採用した。
したがって、単一のサンプル由来のsEVについて、BrdU細胞増殖アッセイ、またはインビトロ細管形成アッセイ、またはそれらの両方により、それらの血管新生促進活性を評価した。
以下の式を適用した:
異なる2つのsEVサンプル(1:1)を混合することにより、sEVのプールを得た。プールされたsEVをまた、BrdU細胞増殖アッセイおよびインビトロ血管新生アッセイにより評価した。
実施したBrdU細胞増殖アッセイおよびインビトロ血管新生アッセイの詳細を以下に示す。
HMEC細胞(ATCC CRL 3243)を、EBM(LONZA)+10%のFBS培地300μl中、96ウェル(ウェル当たり3000個の細胞)に播種した。24時間後に、HMEC細胞を、3時間、FBSフリーのDMEMで飢餓状態にし、次にFBSフリーのDMEM中、ウェル当たり30×106個のEV(標的細胞当たり10000個のEV)と共に再懸濁して刺激した。FBSフリーDMEMおよびDMEM+10%FBSを、陰性および陽性対照として用いた。4時間のEV刺激の後、10μlのBrdU(BrdU最終濃度10μM)を各ウェルに添加し、HMEC細胞を18時間インキュベートした。
効果の%を算出するため、EV刺激されたサンプルに由来するODを、以下のように測定した。すなわち、陰性対照(FBS無しDMEM)のODを効果0%として設定し、陽性対照(DMEM+10%FBS)のODを効果100%として設定し、EV刺激されたサンプルのODを、以下の式により効果の%として換算した:
(サンプルOD-陰性対照OD)/(陽性対照OD-陰性対照OD)×100
24ウェルプレートを、成長因子を減らしたマトリゲルの薄層で被覆し、37℃で1時間静置した。1.25×109個のEV(標的細胞当たり50000個EV)を再懸濁させたFBSフリーの500μlのEBM(内皮基本培地)(LONZA社)と共に、マトリゲル被覆ウェルにHUVEC細胞(ATCC CRL 1730)を播種(1ウェルあたり25000細胞)した。陰性および陽性対照として、FBS無しEBMおよびFBS無しEBM+10ng/mlのhVEGF(Abcam社)を使用した。24時間後に、各ウェル5枚の顕微鏡写真を撮影し、毛細管様構造をImageJソフトウェアによりカウントし、EVサンプルの視野当たりの毛細管様構造の平均カウント数を算出した。
(サンプルCLSC-陰性対照CLSC)/(陽性対照CLSC-陰性対照CLSC)×100。
sEVの力価は、全体的効果パーセンテージに関して表される、BrdUおよびインビトロ細管形成試験の効果のパーセンテージの算術平均として算出した。
動物試験は、国立衛生研究所(National Institute of Health)の実験動物の管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に従い実施した。前述のように、皮下組織から基底膜の固体ゲルへの血管成長を測定することにより、血管新生を評価した(Lopatina T, Bruno S, Tetta C, Kalinina N, Porta M, Camussi G. Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential. Cell Commun Signal. 2014;12(1):26. doi:10.1186/1478-811X-12-26)。最初に、EC(1×106細胞/注入)を、sEV(EC 1×106個当たり、5×1010個EV)と共に一晩インキュベートした。次に、オスの重症複合免疫不全(SCID)マウス(6週齢)の皮下に、事前に刺激したECと混合した、0.5mlの氷冷済BDマトリゲルマトリックス・成長因子減少タイプ(Matrigel Matrix Growth Factor Reduced)(BD Biosciences社、Franklin Lakes、NJ)を注入した。非刺激の同数のECを陰性対照として用いた。マトリゲルプラグを10日後に切除し、4時間4%パラホルムアルデヒドで固定した。マトリゲル含有パラフィン切片(5~8μm厚)をトリクローム染色法により染色した。血管のルーメン領域は、前述のように測定した(Lopatina T, Bruno S, Tetta C, Kalinina N, Porta M, Camussi G. Platelet-derived growth factor regulates the secretion of extracellular vesicles by adipose mesenchymal stem cells and enhances their angiogenic potential. Cell Commun Signal. 2014;12(1):26. doi:10.1186/1478-811X-12-26)。
SCIDマウス(Charles River Laboratories社)(7~8週齢および18~22gの体重)に、ゾラゼパムを80mg/Kgでi.m.注射し麻酔した。手術後に動物を慎重にモニターし、必要に応じケトロラク(Ketorolac、5mg/Kg)を投与し痛覚を消失させた。
無菌条件下、各マウスの左の後肢の中央部の皮膚を小切開した。左の大腿動脈の近位端部および伏在動脈の遠位部を結紮し、解体し、切除した。覆っている皮膚を、滅菌済みの6-0絹糸で縫合した。予備実験において、種々のsEV数およびsEV投与ルートを評価した。後者については、静脈内(iv)もしくは筋肉内(i.m.)単独で、または様々な組合せを含めた。動物の苦痛および処置に対する反応を考慮し、最良の投与経路が以下の通りと判断した:T0(1×1010 iv)、T1およびT2(0.5×1010 i.m.)。組織学的解析のため、動物を7日目に安楽死させた。
麻酔後、脱毛クリームを使用して両足から毛髪を除去し、次にマウスを3分間、37℃でヒートプレートに配置し、温度差を最小化した。Laser Doppler Blood Flow(LDBF)アナライザ(PeriScan PIM 3 System、Perimed社、Stockholm、Sweden)を使用して後肢血流を測定した。手術の直前、および手術後0、3、7日目に、LDBF分析を後肢および足に対し実施した。種々のカラー画素を使用し、レーザー周波数の変化として血流を示した。スキャン後、保存したイメージを分析し、血流を定量化した。環境中の照明および温度により生じるデータ変動を排除するため、後肢血流を、左(虚血性)と右(非虚血性)のLDBFの比として表した。
腓腹筋の中の毛細管密度を、免疫蛍光分析により定量化した。筋肉サンプルをOCT化合物(Miles社)に包埋し、液体窒素中で瞬間凍結した。組織切片(5μm厚)を調製し、マウスCD31に対するモノクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology社、Santa Cruz、CA)を用いる免疫蛍光法により毛細管内皮細胞を同定した。各組織塊の3つの異なる断面からの15のランダムに選ばれた顕微鏡視野を基に、マウス試料ごとの毛細管内皮細胞をカウントした。毛細管密度を、高倍率(x400)1視野あたりのCD-31陽性箇所の数として表した。
虚血および非虚血の肢の腓腹筋を、手術後7日目に切除し、8時間、4%パラホルムアルデヒドで直ちに固定し、さらにパラフィン包埋した。組織切片をヘマトキシリン-エオジンで染色した。光学顕微鏡を用い、×200の倍率でスライドを観察した。全筋繊維を、ならびに再生プロセスを表す小さい直径および複数の中心核を有する繊維をカウントするため、虚血性の肢部の全ての傷害領域からイメージを得た。全ての非虚血性の肢部から得たランダムなイメージを対照とした。
種々のsEV由来のタンパク質を、NP40溶解バッファー(150mMのNaCl、50mMのTRIS-HCl(pH 8)、1%のNP40)により抽出した。2つの非オーバーラップアレイの組合せを含み、60のヒト血管新生タンパク質の発現を定量的に測定する、Quantibody(登録商標)Human Angiogenesisアレイ1000(Ray Biotech社)を使用し、血管新生タンパク質のプロファイリングを実施した。サンプル毎にタンパク質25μgをロードした。データからバックグラウンドを減算し、タンパク質濃度をアレイの種々の標準曲線から得た。機能性アノテーション富化分析は、FunrichソフトウェアおよびCytoscapeのgeMANIAプラグインを用いて実行した。
sEVの全RNAを、オールインワン(All in One)(Norgen社、Thorold、ON、カナダ)抽出法を使用して単離した。RNA濃度および純度は、NanoDrop1000分光光度計により検出した。260~280nmの吸光度が1.8~2.0のサンプルを採用した。
製造業者の指示に従い、RT2 First Strandキット(SA Biosciences社)を用いcDNAを合成した。sEVサンプルごとにcDNAを200ngローディングし、Angiogenesis RT2 Profiler PCR Array(PAHS 024、SA Biosciences社)を用いた遺伝子発現プロファイリングを実施した。血管新生における84の主要な遺伝子の発現プロファイルを分析した(ウェブサイト:http://www.sabiosciences.comに利用可能な遺伝子のリスト)。StepOne Plus(登録商標)システム(AB Applied Biosciences社)を使用して定量的逆転写酵素PCR(RT-PCR)を実施した。遺伝子発現の相対値を、ΔΔCT法を用いて測定した。sEV投与により形成される細管様構造に対しても、Angiogenesis RT2 Profiler PCR Arrayを行った。ECを回収し、RNeasy Miniキット(Qiagen、GmbH、Germany)で精製し、Angiogenesis RT2 Profiler PCR Arrayを使用しcDNAに逆転写し、処理した。PCRアレイに存在する5つの内因性制御遺伝子:β-2-ミクログロブリン(B2M)、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPRT1)、60S酸性リボソームタンパク質P0(RPLP0)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)およびb-アクチン(ACTB)を用いて正規化した。各処置サンプルの、対照サンプルに対する変化倍率は、2-ΔΔCtに対応した。ECの処置の有無による遺伝子発現の変化を、増加/減少倍率として示した。Expression SuiteおよびFunrich Softwareを使用し、データをさらに分析した。
2.1 sEVの特徴解析
sEV中の種々の細胞集団(血小板、内皮、単核細胞、白血球および接着分子標識)の表面抗原を、Guava FACS解析により試験した。解析から、血清由来のEVは種々の血球集団から来ている不均一な集合体であることが示された(図1)。
ナノサイト分析においては、健常なドナー間でのsEVの数およびサイズの顕著な違いに留意しなかった。110mlのバッグから回収したsEVの平均粒子濃度は約6.16×108粒子/mlであり(図2A)、sEVの直径は約210nm、183nmのモード粒径であった(図2B)。2×1011個の全粒子から、sEVのRNAおよびタンパク質の回収量は、分析した全サンプル(n=18)において、300~500ng(RNA)および約1μg(タンパク質)と同等であった(図2C)。
血管新生促進活性によりsEVを選択するため、内部対照としてVEGFを使用した「力価試験」を実施した。ECの増殖および管状構造の形成を誘導する能力の解析において、VEGFの血管新生促進効果の約50%を示すときに、効果的なsEVであるものとした。図3に示すように、18のうちの14のsEVサンプルが、VEGF活性の50%超の値を示した。さらにこれらの結果を評価するため、顕著な血管新生促進活性を有するsEVを選択してプールし、それらの生物学的活性を解析した。注目すべきは、これらのプールされたsEVが、個別的なsEV調製物に匹敵する生物学的効果を示すことが立証されたことである(図4A)。これは、プールされたときでもsEV生物活性が失われなかったことを示す。
本発明者らの力価試験を確認するため、インビボSCIDマウスモデルを使用しインビボ実験を実施した。その際、ECをsEV(5×104個sEV/細胞)で処置し、マトリゲルと混合し、SCIDマウスに皮下注入した。1週後に、丘疹を除去し、解析した。図4Bに示すように、インビボで解析した場合もsEVは血管新生促進活性を示す。プールされたsEVを解析したときも、同様の効果が検出された(図4B)。
ヒトのPADを模倣する虚血後肢マウスモデルにおいて、sEVの血管新生効果を評価した。全量で2×1010個のsEVを、手術後毎日(介入の直後(T0)に1x1010、1日目(T1)および2日目(T2)に0.5×1010)投与した。投与方法の違いが血管新生の効果に影響するか否かを評価するため、sEVを以下のいずれかで投与した
i)T0、T1およびT2に尾静脈内に静注により投与(データ示さず)、
ii)T0、T1およびT2に虚血性後肢の筋肉内に直接投与(データ示さず)、および
iii)T0に静注により、T1およびT2に筋肉内に投与。介入の直後にsEVを静注し、続いて筋内投与することが最良の応答を誘導することがわかった。虚血後肢の血液灌流を、Laser Doppler Perfusionイメージングを使用して評価した。手術直後、虚血性および非虚血性の後肢の比率が、CTL群では0.13±0.06、およびsEV群(n=10/群)では0.12±0.04に減少した。sEV処置群において、後肢灌流の比率は、CTL群と比較し、手術後7日目に顕著に増加した(0.89±0.26 対 0.6±0.18(p<0.05))(図5)。虚血後肢の毛細管密度は、一貫して、対照群と比較し、sEV処置マウスにおいて顕著に増加した(22.4±5.5 対 11.2±1.8(p<0.05))(図6)。
組織の損傷(腓腹筋)の解析から、sEV処置マウスの筋肉では、筋肉の損傷領域が減少し(図7)、また血管密度が増加することがわかった。ゆえに、本発明者らのモデルでは、sEVは虚血により誘導される損傷からの保護を提供すると考えられる。
上記の結果を踏まえ、sEVにより担持される血管新生関連miR、mRNAおよびタンパク質の、かかる機能効果を発揮する際の寄与を解析した。その際、第一に、新血管形成に関与することが公知のmiR(Caporali A, Emanueli C. MicroRNAs in postischemic vascular repair. Cardiol Res Pract. 2012;1(1). doi:10.1155/2012/486702)を評価した。
図8において示されるリアルタイムPCR解析は、有効なsEVが、無効なsEVと比較し、周知の血管新生促進miRであるmiR-126、miR17-5p、miR-92a、miR-21およびmiR-24を顕著に富化したことを立証するものである(有効なsEV 対 無効なsEVの変動係数CVは、miR-126の17%からmiR-21の33%にわたる)。
mRNAおよびタンパク質マイクロアレイ分析に基づき、第一の15の血管新生mRNAおよびsEVにより発現されるタンパク質を選択した(図9)。TGFb1およびアンジオスタチンがmRNAおよびタンパク質において共通に検出されることが観察された(TGFb1:28.8のmRNA平均Ct値および6.3ng/mlのタンパク質量、アンジオスタチン:28.2のmRNA平均Ct値および11.5ng/mlのタンパク質量)。
血管新生促進のきっかけを誘導する際のsEVカーゴの生物学的関連性を確認するため、sEVまたはVEGF(陽性対照)に応答して形成される毛細管様構造から回収されたECに対するmRNA-血管新生マイクロアレイ解析を行い、未処置のEC(内部対照)と比較した。
sEVおよびVEGFにより発揮される血管新生促進効果がほぼ同等であったにもかかわらず、異なる遺伝子発現のパターンが検出され、すなわち、sEV処置(4つのサンプルを解析)により、63の血管新生関連遺伝子が上方制御され、21の遺伝子が下方制御され(図11~12)、一方、VEGF処置により、48の遺伝子が上方制御され、36の遺伝子が下方制御された(図12)。各処置において、対照サンプル(未処置のEC)と比較し≧3の増加倍率で上方制御された転写物について、さらなる試験に供した。これに基づき、以下の10種の最も高発現する遺伝子を選択した。sEV処置については、PTGS1、ID1、THBS1、SERPINE1、FN1、SERPINF1、ERBB2、TIE1、IFNGおよびCXCL9であり、VEGF処置については、IL6、VEGFA、VEGFC、PTGS1、PGF、TIE1、PECAM1、ID1、JAG1およびNOS3である(図13)。また、図13において示されるベン図は、PTGS1、ID1およびTIE1遺伝子が、両方の処置で共通することを示す。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔1〕細胞外ベシクル(EV)の医薬調製物を製造する方法であって、
複数の体液調製物から、または細胞培養の馴化培地からEVを単離するステップと、
単離されたEVから、所定のEV濃度の1つまたは複数のサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各EVサンプルの活性を試験するステップと、
所定の活性を超えるサンプルを、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと
を含み、
2つ以上の活性EVサンプルをプールするステップを含んでもよい、方法。
〔2〕力価試験が前記〔2〕から〔8〕までのいずれか1項に定義される、前記〔1〕に記載の方法。
〔3〕EVがヒト細胞由来である、前記〔1〕または〔2〕に記載の方法。
〔4〕血管新生促進治療による虚血性疾患もしくは虚血性傷害の処置または創傷癒合における使用のための、血液成分から単離された細胞外ベシクル(EV)(EV)の組成物。
〔5〕血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル(EV)の組成物であって、
- BrdU細胞増殖アッセイにより組成物の活性を測定するステップ;
- BrdU細胞増殖アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ;
- BrdU細胞増殖アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ;
- 以下の式:
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも50%の活性%を有する組成物。
〔6〕陽性対照が、10%の血清を補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり10000個のEVによるHMEC細胞の刺激を含む、HMEC細胞ベースのBrdU細胞増殖アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞および血清を補充されない培地を使用したBrdU細胞増殖アッセイである、前記〔5〕に記載の組成物。
〔7〕力価試験が本明細書の例1.4.1に従い実施される、前記〔5〕または〔6〕に記載の組成物。
〔8〕血管新生促進治療により良好な影響を受ける疾患または傷害の処置における使用のための、または創傷癒合における使用のための細胞外ベシクル(EV)の組成物であって、
- 細管形成アッセイにより組成物の活性を測定するステップ;
- 細管形成アッセイにより陰性対照の活性を測定するステップ;
- 細管形成アッセイにより陽性対照の活性を測定するステップ;
- 以下の式:
を含む力価試験において測定したとき、少なくとも50%の活性%を有する組成物。
〔9〕陽性対照が、10ng/mlのVEGFを補充した内皮基本培地を使用し、細胞当たり50000個のEVによる細胞の刺激を含む、HUVEC細胞ベースのインビトロ細管形成アッセイであり、
陰性対照が、同じ細胞およびVEGFを補充されない培地を使用したインビトロ細管形成アッセイである、前記〔8〕に記載の組成物。
〔10〕力価試験が本明細書の例1.4.2に従い実施される、前記〔8〕または〔9〕に記載の組成物。
〔11〕前記〔2〕から〔4〕までのいずれか1項に記載のBrdU細胞増殖アッセイと、前記〔5〕からまで7のいずれか1項に記載の細管形成インビトロアッセイの両方を含む力価試験において測定したとき、少なくとも50%の活性%を有する、前記〔5〕から〔10〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔12〕EVが、血液成分から単離された細胞外ベシクル(sEV)である、前記〔5〕から〔11〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔13〕健常なドナーの供血から調製される、前記〔5〕から〔12〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔14〕EVが、細胞培養の馴化培地から単離された細胞外ベシクルである、前記〔5〕から〔11〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔15〕医薬調製物である、前記〔4〕から〔14〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔16〕処置される対象の体重1kgあたり1×10 11 ~5×10 12 個のEVを含む、前記〔4〕から〔15〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔17〕血清または血漿または馴化培地に存在する全てのEVを捕捉しているバルク調製物である、前記〔4〕から〔16〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔18〕EVがヒト細胞由来である、前記〔4〕から〔17〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔19〕疾患または傷害が、血管の疾患または傷害である、前記〔4〕から〔18〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔20〕疾患または傷害が、急性心筋梗塞、急性脳血管疾患、急性および慢性末梢動脈疾患または急性腎臓虚血である、前記〔4〕から〔18〕までのいずれか1項に記載の組成物。
〔21〕培養細胞の増殖を促進するための培養培地への添加剤としての、前記〔4〕から〔18〕までのいずれか1項に記載の組成物の使用。
Claims (5)
- 細胞外ベシクル(EV)の医薬調製物を製造する方法であって、
血液成分の複数の調製物のそれぞれからEVサンプルを調製するステップと、
力価試験において、各EVサンプルの血管新生促進活性を試験するステップ、ここで、前記力価試験が細管形成アッセイ及びBrdU細胞増殖アッセイの一方又は両方であるステップと、
所定の血管新生促進活性を超えるサンプル(活性EVサンプル)を、医薬調製物へのさらなる処理用に選択するステップと、
2つ以上の活性EVサンプルをプールするステップとを含む、方法。 - 力価試験が細管形成アッセイ及びBrdU細胞増殖アッセイの両方である、請求項1に記載の方法。
- 血液成分が血清である、請求項1に記載の方法。
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