BR112019023999A2 - inibidores e antagonistas de gpr84 para o tratamento de endometriose - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere a um antagonista ou inibidor do receptor 84 acoplado à proteína G (GPR84) para uso no tratamento e/ou na prevenção de um paciente que sofre de, que corre risco de desenvolver e/ou foi diagnosticado com endometriose, assim como a métodos para triar tal antagonista ou inibidor assim como métodos para diagnóstico.

Description

"INIBIDORES E ANTAGONISTAS DE GPR84 PARA O TRATAMENTO DE ENDOMETRIOSE"

[0001] A presente invenção se refere ao uso de inibidores e antagonistas do GPR84 humano para o tratamento e/ou prevenção de endometriose. os inibidores e antagonistas de acordo com a invenção são anticorpos, ácidos nucleicos, aptâmeros ou moléculas pequenas. A invenção também fornece tecnologias de ensaios e de triagem para encontrar tais inibidores e antagonistas. Antecedentes da Invenção

[0002] A endometriose afeta 5-10 % das mulheres em idade de reprodução e é definida como o crescimento de tecido endometrial em localizações ectópicas, encontradas principalmente na cavidade pélvica. Esse crescimento extrauterino é acompanhado por infiltração de macrófagos pró-inflamatórios como um sinal cardinal da doença que leva a um microambiente com inflamação crônica e que contribui para sintomas de dor crônica.

[0003] Lesões peritoneais e fluídos de mulheres com endometriose são caracterizados "pela infiltração de leucócitos incluindo células Natural Killer (NK) e macrófagos fagocíticos [1, 2] além de linfócitos T, que juntos contribuem para um ambiente pró-inflamatório que caracteriza a doença. Além da presença de leucócitos de infiltração, a endometriose é caracterizada por níveis de mediadores inflamatórios, como citocinas e fatores de crescimento incluindo TNFalfa e IL-lbeta [3], dois mediadores pró-analgésicos.

[0004] Ácidos graxos de cadeia média (MCFFA) são ácidos graxos com caudas de 6 a 12 carbonos e podem ativar o GPR84

[4]. Há duas fontes de FAs para metabolismo animal, FAs derivados de maneira exógena (dietéticos) e FAs derivados de maneira endógena. A biossíntese dos últimos é catalisada por FASN [5]. Os MCFFAs estimulam a liberação de IL6 em condrócitos [6] e o ácido mirístico aumenta os níveis de IL6 e IL8 em músculo liso arterial coronário humano (HCASM) e células endoteliais (HCEC) [7].

[0005] O GPR84 pertence ao grupo de receptores de ácido graxo livre (FFA [Free Fatty Acid]) [8]. O grupo de receptores de FFA consistem em 4 GPCRs (FFAI-FFA2) e os novos membros GPR42 e GPR84. O receptor de FFA está envolvido em processos biológicos, como funções metabólicas e imunes [8].

[0006] Em contrapartida a todos os outros receptores de FFA que têm um padrão de expressão mais amplo, o GPR84 foi descrito como expressado principalmente em várias populações de leucócitos [8].

[0007] Até então, não há cura para endometriose, embora haja dois tipos de intervenções: tratamento de dor e tratamento de infertilidade associada à endometriose. Em relação a terapias farmacêuticas, terapias “hormonais (progesterona, progestinas, xenoestrógenos, contraceptivos orais, Danazol (Danocrina), gestrinona, agonistas de hormônio liberador de Gonadotropina (GnRH) ou inibidores de aromatase), NSAIDs, opioides ou Pentoxifilina podem ser administrados, ao passo que remoção cirúrgica adicional do endométrio, adesões, resseção de endometriomas e restauração de anatomia pélvica normal podem ser usados. As intervenções farmacêuticas e cirúrgicas podem produzir benefícios de alívio de dor aproximadamente equivalentes. Constatou-se que a recorrência da dor era 44 e 53 por cento com intervenções medicinais e cirúrgicas, respectivamente (24).

[0008] No entanto, ambas as opções de tratamento são limitadas e insatisfatórias atualmente, deixando uma demanda para fornecer melhores opções de tratamento em termos de eficácia, sustentabilidade, efeitos colaterais reduzidos, adesão do paciente e similares. Sumário da invenção

[0009] Esses e outros objetos são obtidos com métodos e meios de acordo com as reivindicações independentes da presente invenção. As reivindicações dependentes se referem a modalidades específicas. Modalidades da Invenção

[0010] Antes de a invenção ser descrita detalhadamente, deve-se entender que a presente invenção não se limita a partes componentes particulares ou recursos estruturais dos dispositivos ou composições descritas ou etapas de processo dos métodos descritos uma vez que tais dispositivos e métodos podem variar. Deve-se entender, também, que a terminologia usada no presente documento serve para fins descritivos das modalidades particulares apenas e não deve ser limitativa. O simples fato de que determinadas medidas são mencionadas em reivindicações mutuamente dependentes diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não possa ser usada como vantagem. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitantes do escopo. Deve ser observado que, como usado no relatório descritivo e nas reivindicações anexas,

as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" e/ou os referentes no plural, exceto se o contexto claramente ditar de outro modo. Além disso, nas reivindicações, a palavra “compreendendo” não exclui outros elementos ou etapas. O simples fato de que determinadas medidas são mencionadas em reivindicações mutuamente dependentes diferentes não indica que uma combinação dessas medidas não possa ser usada como vantagem.

[0011] Ademais, deve-se entender que, caso as faixas de parâmetro que sejam delimitadas por valores numéricos, as faixas são consideradas como inclusivas desses valores de limitação.

[0012] Deve-se entender adicionalmente que as modalidades reveladas no presente documento não devem ser entendidas como modalidades individuais que não estão relacionadas entre si. Os recursos discutidos com uma modalidade devem ser revelados também em combinação com outras modalidades mostradas no presente documento. Se, em um caso, um recurso específico não for revelado com uma modalidade, porém com outra, a pessoa versada entenderá que não significa necessariamente que o dito recurso não deve ser revelado com a dita outra modalidade. A pessoa versada na técnica entenderá que a ideia central do presente pedido é revelar o dito recurso também para outra modalidade, porém que isso não foi feito apenas a título de clareza e para manter o relatório descritivo em um volume gerenciável.

[0013] A “inibição” ou “redução” no contexto da presente invenção deve ser entendida como reduzindo o resultado medido em pelo menos 20 % em comparação a um controle, por exemplo, um controle não tratado, de preferência, em pelo menos 50 %, com mais preferência, em pelo menos 75 %. Os controles adequados são evidentes para a pessoa versada na técnica ao considerar o ensinamento da presente revelação. Os ensaios adequados para determinar a dita inibição Ou redução estão prontamente disponíveis para a pessoa versada na técnica a partir da literatura pertinente. Em uma modalidade, os ensaios de liberação de cAMP citados no presente documento são usados para determinar a dita inibição ou redução.

[0014] A “inibição” e “antagonização”, assim como o “inibidor” e “antagonista” são usados de maneira intercambiável no presente documento.

[0015] Em uma modalidade preferencial, o termo “inibição” se refere à inibição específica. A “inibição específica” denota uma inibição do receptor citado ao mesmo tempo que outros receptores não são inibidos de maneira significativa, de preferência, outros receptores acoplados à proteina G (GPCR). Em uma modalidade preferencial, “inibição específica de GPR84” se refere a uma inibição da atividade de GPR84 ao mesmo tempo que não inibe de maneira significativa um ou mais transportadores de membrana ou outros receptores acoplados à proteína G (GPCR), de preferência, um ou mais selecionados a partir do grupo que consiste em Norepinefrina (NET), Dopamina (DAT), hERG de Canal de Potássio, Canal de Potássio (KATP), GPR40. Em uma modalidade preferencial, “outros receptores acoplados à proteína G (GPCR)” se refere ao GPR40.

[0016] Em uma modalidade preferencial, a inibição específica do GPR84 se refere a uma inibição da atividade de GPR84 em pelo menos 20 % em comparação a um controle, de preferência, em pelo menos 50 %, com mais preferência, em pelo menos 75 %, ao mesmo tempo que inibe a atividade do um ou mais transportadores de membrana selecionados a partir do grupo que consiste em outros receptores acoplados à proteína G (GPCR); de preferência, selecionados a partir do grupo que consiste em Norepinefrina (NET), Dopamina (DAT) hERG de Canal de Potássio, Canal de Potássio (KATP) e GPR40; em, no máximo, 75 %, com mais preferência, em, no máximo, 50 %, ainda com mais preferência, em, no máximo, %. Os ensaios adequados para determinar a dita inibição ou redução estão prontamente disponíveis para a pessoa versada na técnica a partir da literatura pertinente. Em uma modalidade, os ensaios de liberação de cAMP citados no presente documento são usados para determinar a dita inibição ou redução. A inibição dos outros receptores pode ser avaliada como exemplificado nos experimentos do Exemplo.

[0017] De acordo com uma modalidade da invenção, um antagonista ou inibidor do receptor 84 acoplado à proteína G (GPR84) é fornecido para uso no tratamento e/ou prevenção de um paciente º que sofre de, º que corre risco de desenvolver e/ou o que foi diagnosticado com endometriose.

[0018] Os inventores da presente invenção constataram supreendentemente que o GPR84 é expresso em tipos de células inflamatórias e em tecidos doentes de paciente com endometrioses e, também, mostraram que a inibição de GPR84 ten um efeito de alívio nessa condição, como dor inflamatória. De modo específico, a inibição de GPR84 reduziu mediadores pró-inflamatórios e pró-analgésicos, como IL-lbeta e TNFalfa, dentro de um modelo de endometriose in vitro. Por conseguinte, o tratamento de endometriose e seus sintomas associados ao uso de um método para reduzir níveis elevados tanto de TNFalfa quanto de IL- lbeta associados à endometriose tem o potencial de tratar sintomas e a progressão da doença de endometriose. Em uma modalidade particular, o antagonista ou inibidor é para tratar dor inflamatória associada à endometriose.

[0019] Além disso, é mostrado no presente documento que os agonistas de GPR84, por exemplo, ácidos graxos de cadeia média (MCFA) estão presentes em tecidos e lesões endometriais e contribuem para os mediadores inflamatórios de elevação que caracterizam a doença.

[0020] Como usado no presente documento, o termo “antagonista ou inibidor de GPR84” se refere a um que tem capacidade para reduzir ou inibir ou direta ou indiretamente a atividade do GPR84, de preferência, em pelo menos 20 %, de preferência, em pelo menos 50 %, com mais preferência, em pelo menos 75 %. Os ensaios adequados para determinar a dita inibição ou redução estão prontamente disponíveis para a pessoa versada na técnica a partir da literatura pertinente. Em uma modalidade, os ensaios de liberação de cAMP citados no presente documento são usados para determinar a dita inibição ou redução.

[0021] De preferência, o antagonista ou inibidor de GPR84 é um inibidor seletivo para o GPR84, como definido acima.

[0022] Tal atividade de GPR84 é, por exemplo, uma função efetora a jusante de GPR84, como, por exemplo, liberação de mediador inflamatório em PBMC ou macrófagos humanos ou de camundongo.

[0023] A dita redução ou inibição pode ser realizada, por exemplo, reduzindo-se ou inibindo-se a ligação de agonista de GPR84 endógena e sintética. A dita redução ou inibição da ligação de agonista pode ocorrer, por exemplo, por ligação competitiva ou alostérica à proteína GPR84.

[0024] Os agonistas preferenciais de GPR84 são ácidos graxos livres de cadeia média (MCFFA), de preferência, com comprimentos de cadeia de carbono de 9 a 14 (consultar 25, 19, que são incorporados no presente documento a título de referência). Estes incluem, entre outros, ácido 2-OH decanoico e ácido decanoico, que são agonistas de GPR84 particularmente preferenciais.

[0025] Um agonista artificial para GPR84 é 6-n- octilaminouracila (6-OAU) (consultar 17, incorporado no presente documento a título de referência). Outros agonistas artificiais preferenciais são descritos; por exemplo, 3,3'-di-indolilmetano (consultar 19, incorporado no presente documento a título de referência), e Embelina (consultar o documento WO2007027661 Al, incorporado a título de referência no presente documento). A tabela a seguir mostra alguns agonistas selecionados de acordo com à invenção: Ácido Decanoico o Codes

Ácido 2- Oo

OH 7 octilaminouracila dA i

PS FD ASAS

Í 3,3'-di- =

N K Embelina OD no. AAA Me

OH O

[0026] Em uma modalidade, o antagonista é um anticorpo, de preferência, um anticorpo monoclonal, que se liga especificamente ao GPR84 ou é um fragmento de ligação a antígeno ou derivado do mesmo. O anticorpo é, de preferência, um anticorpo monoclonal (mAb).

[0027] Como usado no presente documento, o termo “anticorpo monoclonal” deve se referir a uma composição de anticorpo que tem uma população de anticorpos homogêneos, isto é, uma população homogênea que consiste em uma imunoglobulina inteira ou um fragmento de ligação a antígeno ou derivado do mesmo. De preferência particular, tal anticorpo é selecionado a partir do grupo que consiste em IgG, IgD, IgE, IgA e/ou IgM ou um fragmento ou derivado do mesmo.

[0028] Como usado no presente documento, o termo “fragmento” deve se referir a fragmentos de tal anticorpo que retêm capacidades de ligação de alvejamento, por exemplo, o uma CDR (região de determinação de complementaridade), e uma região hipervariável, o um domínio variável (Fv), .º uma cadeia pesada de IgG (que consiste nas regiões de VH, CHl, de articulação, CH2 e CH3), e uma cadeia leve de IgG (que consiste em regiões de VL e CL), e/ou º um Fab e/ou F(ab)2.

[0029] Como usado no presente documento, o termo “derivado” deve se referir a construtos de proteína que estão estruturalmente diferentes, porém que ainda têm alguma relação estrutural com o conceito comum de anticorpo, por exemplo, scFv, Fab e/ou F(ab),, assim como bi-, tri- ou superiores construtos de anticorpo específicos ou anticorpos monovalentes e que retêm adicionalmente capacidades de ligação de alvejamento. Todos esses itens são explicados abaixo.

[0030] Outros derivados de anticorpo conhecidos pelas pessoas versadas na técnica Diacorpos, Anticorpos de Camelídeo, Nanocorpos, Anticorpos de Domínio, homodímeros bivalentes com duas cadeias que consistem em scFvs, IgAs (duas estruturas de IgG unidas por uma cadeia J e um componente secretor), anticorpos de tubarão, anticorpos que consistem em novas estruturas de primatas mais CDR de primata mundial não novo, construtos dimerizados que compreendem CH3+VL+VH e conjugados de anticorpo (por exemplo, anticorpo ou fragmentos ou derivados a uma toxina, uma citocina, um radioisótopo ou um identificador). Esses tipos são bem descritos na literatura e podem ser usados pela pessoa versada na técnica com base na presente revelação, com adição de atividade da invenção adicional.

[0031] Como discutido acima, o GPR84 é especificado suficientemente para possibilitar que uma pessoa versada na técnica produza um anticorpo, como um anticorpo monoclonal contra o mesmo. Os métodos rotineiros abrangem hibridoma, quimerização/humanização, exibição de fago/mamíferos transgênicos e outras tecnologias de modificação de anticorpo.

[0032] Os métodos para a produção de uma célula de foram descritos anteriormente (consultar [30], incorporado no presente documento a título de referência). Essencialmente, por exemplo, um camundongo é imunizado com uma proteína GPR84 humana, seguida pelo isolamento de B do dito camundongo e fusão da célula B isolada com uma célula de mieloma.

[0033] Os métodos para a produção e/ou seleção de mAbs quiméricos ou humanizados são conhecidos na técnica. Essencialmente, por exemplo, as sequências de proteínas do anticorpo anti-GPR84 de camundongo que não estão envolvidos na ligação-alvo são substituídos por sequências humanas correspondentes. Por exemplo, o documento US6331415 de Genentech descreve a produção de anticorpos quiméricos, ao passo que o documento US6548640 da Medical Research Council descreve técnicas de enxerto de CDR e o documento US5859205 da Celltech descreve a produção de anticorpos humanizados. Todas essas revelações são incorporadas no presente documento a título de referência.

[0034] Os métodos para a produção e/ou seleção de mAbs completamente humanos são conhecidos na técnica. Estes podem envolver o uso de um animal transgênico que é imunizado com GPR84 humano ou o uso de uma técnica de exibição adequada, como exibição de levedura, exibição de fago, exibição de célula B ou exibição de ribossomo, em que os anticorpos de uma biblioteca são triados em relação ao GPR84 humano em uma fase estacionária.

[0035] As bibliotecas de anticorpo in vitro são, entre outros, reveladas no documento US6300064 por MorphoSys e US6248516 por MRC/Scripps/Stratagene. As técnicas de Exibição de Fago são, por exemplo, reveladas no documento US5223409 da Dyax. As plataformas de mamíferos transgênicos são, por exemplo, descritas no documento EP1l480515A2 por TaconicArtemis. Todas essas revelações são incorporadas no presente documento a título de referência.

[0036] IgG, scFv, Fab e/ou F(ab);: são formatos de anticorpo bem conhecidos pela pessoa versada na técnica. As técnicas de viabilização relacionadas estão disponíveis a partir dos respectivos livros didáticos.

[0037] Como usado no presente documento, o termo “Fab” se refere a um fragmento de IgG que compreende a região de ligação, em que o dito fragmento é composto de um domínio constante e um domínio variável de cada cadeia pesada e leve do anticorpo.

[0038] Como usado no presente documento, o termo “F(ab)/” se refere a um fragmento de IgG que consiste em dois fragmentos Fab conectados um ao outro por uma ou mais ligações de bissulfeto.

[0039] Como usado no presente documento, o termo “scFv” se refere um fragmento variável de cadeia única que são uma fusão das regiões variáveis das cadeias pesada e leve de imunoglobulinas, ligadas entre si com um conector curto, normalmente serina (S) ou glicina (G). A molécula quimérica retém a especificidade da imunoglobulina original, apesar da remoção das regiões constantes e a introdução de um peptídeo de conector.

[0040] Os formatos de anticorpo modificados são, por exemplo, construtos de anticorpo biespecíficos ou triespecíficos, proteínas de fusão à base de anticorpo, imunoconjugados e similares. Esses tipos são bem descritos na literatura e podem ser usados pela pessoa versada na técnica com base na presente revelação, com adição de atividade da invenção adicional. Além disso, anticorpos monovalentes “também foram descritos anteriormente no documento US 2004/0033561 Al (chamado nesse documento de monocorpos) ou MWO2007048037; ambos são incorporados no presente documento a título de referência.

[0041] A constatação de um anticorpo adequado Ou fragmento ou derivado que tem capacidade para atuar como uma antagonista de GPR84, por exemplo, ligando-se seu centro ativo, é, então, uma questão de rotina para a pessoa versada na técnica, com base na disponibilidade pública das sequências de aminoácidos de GPR84.

[0042] Os anticorpos policlonais contra GPR84 para pesquisa científica estão comercialmente disponíveis, por exemplo, junto à ThermoFischer (PA5S-32843), Santa Cruz Biotechnology (H-300, D-15) ou Novus Biologicals (NBPl- 84768), por exemplo, demonstrando, então, que a pessoa versada na técnica tem capacidade para Produzir um anticorpo terapêutico contra GPR84.

[0043] Devido ao fato de que o GPR84 é uma proteína do receptor 7-transmembranar, o anticorpo ou seu fragmento ou derivado pode se ligar a um domínio extracelular ou intracelular de GPR84. No último caso, o anticorpo ou fragmento ou derivado do mesmo precisa ser canalizado ou trafegado no espaço intracelular. Tecnologias rotineiras estão disponíveis para esse propósito, as quais são reveladas em outro local (26 - 28, incorporado no presente documento a título de referência).

[0044] Em uma modalidade, o antagonista ou inibidor é um inibidor de ácido nucleico. Essa modalidade pode compreender, por exemplo, uma molécula de ácido nucleico que se liga especificamente a pelo menos um subestiramento de um polinucleotídeo que codifica uma proteína GPR84.

[0045] De preferência, o dito polinucleotídeo codifica para uma proteína GPR84 que compreende uma sequência AA, como revelado em Uniprot sob o número de referência Q9NQS5, de preferência, de acordo com a SEQ ID NO: 1.

[0046] Muitas das abordagens de inibidor de ácido nucleico dependem do pareamento de base de tal molécula de ácido nucleico inibidora com a sequência-alvo, isto é, o polinucleotídeo que codifica um GPR84. o dito polinucleotídeo que codifica um GPR84 pode ou ser um mRNA ou um DNA ou genômico.

[0047] De preferência, o dito inibidor é selecionado a partir do grupo que consiste em um siRNA, um shRNA, crRNA ou um RNA-guia.

[0048] O siRNA são moléculas de RNA artificiais curtas que podem ser modificadas quimicamente para intensificar a estabilidade. Devido ao fato de que o siRNA são de fita dupla, o princípio da dita “senso” e “antissenso” também se aplica. As fitas senso têm uma sequência de base idêntica àquela do mRNA transcrito, e a fita antissenso tem a sequência complementar. Tecnicamente, uma molécula de siRNA administrada a um paciente é ligada por uma enzima intracelular chamada de Argonaut para formar um então chamado complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). A fita antissenso do siRNA quia o RISC para o mRNA-alvo, em que a fita antissenso hibridiza com o mRNA-alvo, que é, em seguida, clivado por RISC. Dessa maneira, a tradução do mMRNA respectivo é interrompida. Em seguida, o RISC pode clivar mais mRNAs. Tecnologias de entrega são reveladas, por exemplo, em outro local ([29], incorporado no presente documento a título de referência). A constatação de uma sequência adequada para o SsiRNA é uma questão de rotina para a pessoa versada na técnica, com base na disponibilidade pública das diferentes isoformas de mRNA do GPR84.

[0049] O ShRNA é uma molécula de RNA artificial com uma virada de grampo de cabelo firme pode ser usada para silenciar a expressão de gene alvo por meio da interferência de RNA (RNAi). O shRNA pode ser entregue às células, por exemplo, por meio de um plasmídeo ou através de vetores bacterianos. O ShRNA é um mediador vantajoso de RNAi pelo fato de que tem uma taxa relativamente baixa de degradação e virada. Os plasmídeos respectivos compreendem um promotor adequado para expressar o sShRNA, como um promotor de polimerase III, como U6 e Hl ou um promotor de polimerase II. Após o plasmídeo ou vetor se integrar no genoma hospedeiro, oO ShRNA é transcrito no núcleo. O produto imita pri-microRNA (pri-miRNA) e é processado por Drosha. O pré-shRNA resultante é exportado do núcleo pela Exportina 5. Em seguida, esse produto é processado por Dicer e carregado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), após isso, o mesmo silenciamento segue como no SiRNA. A constatação de uma sequência adequada para o ShRNA é uma questão de rotina para a pessoa versada na técnica, com base na disponibilidade pública das diferentes isoformas de mRNA do GPR84.

[0050] A primeira molécula de ácido nucleico pode ser o RNA-guia de um sistema CRISPR Cas (31), em que o RNA-guia compreende um crRNA-alvo específico (“RNA de CRISPR pequeno interferente”) com capacidade de hibridização com uma fita genômica do gene GPR84 (ou, a primeira molécula de ácido nucleico pode o crRNA sozinho). O RNA/crRNA-guia pode direcionar a enzima Cas, que é uma endonuclease, para oO gene GPR84, em que a enzima Cas realiza as rupturas de fita específicas de sequência. Criando-se uma ou mais rupturas de fita dupla, o gene GPR84 pode, então, ser silenciado. A fim de usar o dito sistema para silenciamento de gene in vivo do GPR84, é exigida uma tecnologia de entrega dedicada que compreende um veículo de entrega, como nanopartículas de lipídeo, como discutido, por exemplo, em outro local (32). A descoberta de uma sequência adequada para o crRNA compreendida no RNA-guia é uma questão de rotina para a pessoa versada na técnica, com base na disponibilidade pública da sequência genômica do gene GPR84.

[0051] Em outra modalidade, a dita primeira molécula de ácido nucleico também pode ser o RNA-guia de um sistema CRISPR Cpfl (33), em que o RNA-guia compreende um crRNA- alvo específico (“WCRISPR RNA pequeno interferente”). Semelhante a CRISPR/Cas, o RNA guia tem capacidade para direcionar a enzima Cpfl, que é uma endonuclease, ao gene GPR84. Em relação às considerações técnicas, por exemplo, a entrega para aplicações in vivo e a descoberta da sequência adequada para a primeira molécula de ácido nucleico, aspectos similares como CRISPR/Cas se aplicam.

[0052] As modalidades adicionais da tecnologia de CRISPR estão atualmente em desenvolvimento, com diferentes endonucleases. No entanto, todas essas abordagens usam um RNA de alvo específico (o RNA ou crRNA guia como em CRISPR Cas) que hibridiza com a sequência-alvo. Em todos esses casos, o RNA de alvo específico se qualifica como a primeira molécula de ácido nucleico no sentido da modalidade preferencial discutida no presente documento. Em relação às considerações técnicas, por exemplo, a entrega para aplicações in vivo e a descoberta da sequência adequada para a primeira molécula de ácido nucleico, aspectos similares como CRISPR Cas se aplicam.

[0053] A microRNA (abreviado como miRNA) é uma molécula de RNA de não codificação pequena (que contém cerca de 22 nucleotídeos) encontrada em plantas, animais e alguns vírus que funcionam no silenciamento de RNA e regulação pós- transcricional da expressão de gene.

[0054] Em uma modalidade, o antagonista ou inibidor é um aptâmero. Os aptâmeros são oligonucleotídeos que têm propriedades de ligação específica para um alvo pré- determinado. Os mesmos são obtidos de uma biblioteca sintetizada aleatoriamente que contém até 10'”* sequências diferentes através de um processo de combinação chamado de SELEX (“Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment”). As propriedades de aptâmero são ditadas pelo seu formato 3D, que resulta de dobra intramolecular, conduzida por sua sequência primária. Uma estrutura de aptâmero 3D é requintadamente adaptada ao reconhecimento de seu alvo cognato através da ligação de hidrogênio, interações eletroestáticas e de empilhamento. Os aptâmeros exibem geralmente alta afinidade (Ka em torno de micromolar (UM) com moléculas pequenas e picomolares (pM) para proteínas).

[0055] É fornecida uma visão geral no repertório técnico para gerar aptâmeros de alvo específico, por exemplo, em 34, que é incorporado no presente documento a título de referência. Os aptâmeros também podem ser entregues no espaço intracelular, como revelado em 35 (incorporado no presente documento a título de referência).

[0056] A constatação de um aptâmero que tem capacidade para atuar como uma antagonista de GPR84, por exemplo, ligando-se seu centro ativo, é, então, uma questão de rotina para a pessoa versada na técnica, com base na disponibilidade pública das sequências de aminoácidos das diferentes isoformas de GPR84.

[0057] Em outra modalidade particularmente preferencial, o antagonista ou inibidor é uma molécula pequena. De preferência, a dita molécula pequena é uma molécula orgânica e/ou a dita molécula pequena tem um peso molecular menor que < 550 DA, de preferência, < 500 DA, com mais preferência, < 450 DA.

[0058] De preferência, a proteína GPR84 que é inibida ou antagonizada pelo anticorpo, pelo aptâmero ou pela molécula pequena compreende uma sequência AA, como revelado em Uniprot sob o número de referência Q9NQS5, de preferência, de acordo com SEQ ID NO: 1.

[0059] Em uma modalidade preferencial da invenção, oO antagonista ou inibidor reduz ou inibe a ativação de GPR84 induzida por agonista em pelo menos 20 8%, com mais preferência, em pelo menos 50 &%, com ainda mais preferencial, em pelo menos 75 %. Os ensaios adequados para determinar a dita inibição ou redução estão prontamente disponíveis para a pessoa versada na técnica a partir da literatura pertinente. Em uma modalidade, os ensaios de liberação de cAMP citados no presente documento são usados para determinar a dita inibição ou redução.

[0060] De acordo com uma modalidade da invenção, oO antagonista ou inibidor inibe ativação de GPR84 induzida por agonista, de preferência, º ativação de GPR84 induzida por embelina com um valor de ICsy de 5 mM ou menos, de preferência, 10 uM ou menos, com mais preferência, 9,4 nM ou menos, e/ou º ativação de GPR84 induzida por ácido 2-OH- decanoico com um valor de ICso de 5 mM, de preferência, 10 UM ou menos ou menos, com máxima preferência, de 16 nM ou menos.

[0061] De preferência, a ativação de GPR84 induzida por embelina e/ou ativação de GPR84 induzida por ácido 2-OH- decanoico é determinada em um ensaio de liberação de GPR84 CAMP.

[0062] A inibição de ativação de GPR84 induzida por agonista por um inibidor potencial pode ser testada, por exemplo, em um ensaio de liberação de cAMP de acordo com os seguintes princípios:

[0063] A atividade de GPR84 reprime a produção de cAMP nas células. A inibição de GPR84, portanto, resulta em um teor de cAMP nas células. No entanto, durante o teste do potencial de inibição de uma substância determinando-se os efeitos nos níveis de cAMP, há de se certificar que os efeitos observados são GPR84-específicos e não um efeito de indução de cAMP geral. Uma opção preferencial é investigar se uma substância (inibidor potencial) reverte o efeito de inibição de um agonista de GPR84. Os agonistas da sinalização de Galphai por GPR84 inibem a produção de cAMP celular induzido por adenilil ciclases. A adição de um inibidor de GPR84 (ou antagonista de GPR84) resulta em um (re) aumento da produção de cAMP induzida por adenilil ciclases membranar na presença de um agonista de GPR84. Por conseguinte, os efeitos antagonistas em GPR84 resultam no teor de cAMP aumentado na célula. O efeito antagonista de um inibidor potencial é testado, de preferência, por sua exposição a e na presença de um agonista de GPR84 e um agente de ativação de adenilil ciclases membranares, como forscolina. Qualquer outro composto ou substância que aumenta de maneira não específica os níveis de cAMP através da ativação de adenilil ciclases membranar pode ser empregado também. Um ou mais compostos que impedem a degeneração de cAMP podem ser adicionados para garantir o acúmulo suficiente desse segundo mensageiro. Tais compostos incluem inibidores de fosfodiesterase, por exemplo, 3- Isobutil-l-metilxantina (IBMX).

[0064] A pessoa versada na técnica terá conhecimento de que a inibição específica de GPR84 é determinada à medida que o efeito na indução de GPR84 agonista é avaliado, supra. A fim de reforçar adicionalmente a especificidade de GPR84, as células que superexpressam o GPR84 podem ser usadas, por exemplo, porém sem limitação, “cAMP HunterTM CHO-K1 GPR864 Gi cells” (DiscoverX; * 95-0158C2).

[0065] Determinando-se o teor nas células em contato com o inibidor de GPR84 potencial, como delineado acima, e comparando aos controles apropriados, é possível determinar os efeitos antagonistas. Um aumento no teor de cAMP em comparação ao controle indica que os efeitos antagonistas de GPR84 qualificam o composto como um inibidor. De preferência, uma substância é qualificada como um inibidor de GPR84, caso aumente o teor de cAMP de uma célula em contato com o inibidor potencial, um agonista de GPR84, um ativador de produção de cAMP induzida por adenilil ciclases membranar, e um inibidor de fosfodiesterase em pelo menos % em comparação ao controle apropriado sem o inibidor potencial.

[0066] A pessoa versada na técnica tem capacidade para detectar o teor de cAMP (níveis) em uma célula que usa habilidades comuns. As técnicas comuns podem empregar, por exemplo, um ensaio competitivo. A princípio, um rastreador detectável é colocado em contato com um agente de ligação ao cAMP na presença de uma amostra cujo teor de cAMP deve ser determinado, em que o rastreador detectável se liga ao agente de ligação ao cAMP de maneira competitiva ao cAMP. O ensaio competitivo deve ser construído de modo a permitir a detecção da quantidade relativa do rastreador ligado ao agente de ligação ao cAMP, por exemplo, com o uso de corantes compatíveis para um ensaio de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Na presença da amostra, o cAMP contido na amostra compete com o rastreador na ligação ao agente de ligação ao cAMP. Caso a amostra seja uma célula, a célula pode ser submetida à lise a fim de liberar o teor de cAMP intracelular antes de aplicar o mesmo ao ensaio. A quantidade detectada do rastreador ligado ao agente de ligação ao cAMP é inversamente proporcional ao teor de cAMP na amostra. Em outras palavras, os sinais intensos para o rastreador que se liga ao agente de ligação ao cAMP indicam um baixo teor de cAMP na amostra, e - vice-versa - sinais menos intensos para o rastreador que se liga ao agente de ligação ao cAMP indicam um teor de cAMP superior na amostra. O sinal máximo é obtido na ausência de cAMP. A diminuição no teor de cAMP dentro de uma célula pode, então, ser determinada em comparação ao teor de cAMP em uma célula após a adição do inibidor de teste em comparação a um controle negativo e/ou antes da adição do dito inibidor potencial em um ensaio competitivo. A detecção de mais cAMP que liga ao agente de ligação ao cAMP nas amostras expostas ao inibidor potencial indica o efeito de inibição (antagonista) do dito inibidor potencial em GPR84. Os sinais menos intensos no ensaio competitivo para as amostras tratadas com o inibidor potencial em comparação aos controles no ensaio competitivo, portanto, indicam o efeito de inibição do inibidor potencial em GPR84.

[0067] A quantificação das quantidades reais do cAMP pode, por exemplo, ser obtida com a ajuda de um ensaio de competição com base em um rastreador de cAMP identificado com corante fluorescente (por exemplo, cAMP-d2, (Cisbio; Kit cAMP femto 2; nº 62AM5PEJ ..]) e agentes de ligação a CAMP, como anticorpos anti-cAMP identificados, por exemplo, anticorpo anti-cAMP identificado com Eu-criptato (Cisbio; Kit cAMP femto 2; nº 62AM5PEJ). Mediante a lise celular, qualquer cAMP celular presente compete pela ligação do rastreador ao anticorpo. Tal sinal pode ser medido, por exemplo, com o uso do FRET, caso corantes fluorescentes compatíveis com o rastreador e com o agente de ligação ao CAMP sejam usados. Dependendo dos corantes, diferentes emissões e comprimentos de onda de excitação são usados uma vez que ficam evidentes para as pessoas versadas na técnica. Para a combinação de d2/Eu-criptato, por exemplo, supra, as emissões induzidas por FRET a 665 nm e 620 nm são medidas seguindo a excitação a 337 nn com um leitor apropriado de fluorescência de alto rendimento (HTRF) (por exemplo, RubiStar; Berthold Industries). Visto que a natureza competitiva do sistema de detecção, o tratamento com agonista resulta em níveis de cAMP inferiores e aumenta o sinal de HTRF. Qualquer diminuição no sinal de HTRF na presença de forscolina, agonista e antagonista é indicativa da anulação da sinalização de Galphai de inibição por GPR84 e, logo, para o efeito de inibição em GPR84.

[0068] Um procedimento exemplificativo para detectar a inibição de uma substância pode ser conduzido de acordo com o seguinte:

1. Preparação de células congeladas prontas para ensaio

[0069] Para a ressuscitação de células congeladas

(células cAMP HunterTM CHO-Kl GPR84 Gi; DiscoverX; nº 95- 0158C2), um frasco é retirado do armazenamento de nitrogênio líquido e rapidamente descongelado em um banho de água a 37 ºC por 1 a 3 minutos. Imediatamente após isso, as células são transferidas cuidadosamente decantando-se em um Tubo Falcon de 50 ml que contém 15 ml de um meio de cultura de célula completamente pré-aquecido (HAM's F1l2; % FCS; sem marcadores de seleção). Turbilhonamento suave é usado para auxiliar a ressuspensão das mesmas. Em uma próxima etapa, as células são colhidas imediatamente por meio de centrifugação de baixo teor de g por 5 minutos (Hereaus Multifuge 4 KR; 400 rpm; rcf = 44 gq) para evitar compactação excessiva da pélete celular. A decantação suave é usada para se livrar do meio. Por fim, a prontidão do ensaio é obtida ressuspendendo-se cuidadosamente o pélete celular em 5 ml do meio de ensaio final (HAMs Fl12; 10 & FCS; nenhum marcador de seleção). Em uma última etapa, a viabilidade celular e o número real de célula são determinados (Omni Life Science; Contador/Analisador de Células Casy) antes de corrigir o volume para que o número celular final seja semeado, isto é, 2500 células/pl. A semeadura de célula é alcançada ou com a ajuda de pipetas de múltiplos canais ou dispersadores a granel de reagente apropriados.

2. Teste para Agonismo (formato de 384 poços):

[0070] 2u7l de células congeladas prontas para ensaio são semeadas diretamente nos poços de uma placa de 384 poços não estéreis (Greiner; branco; nº 784075; 5000 células/poço). Imediatamente após isso, 2 pl de uma solução de 2 X agonista/2 X EC80 forscolina (concentração final =

8 uM, Sigma; nºF6886) são adicionados, que é preparado no meio de ensaio (HAMs Fl12; 10 % de FCS; 2 mM de Glutamina; sem marcadores de seleção). Após 60 minutos de tempo de incubação, 2 pl do rastreador cAMP-d2, como fornecido (Kit Cisbio; cAMP femto 2; nº 62AM5PEJ) são adicionados seguidos por uma adição separada de 2 pl do anticorpo anti-cAMP contido no tampão de lise celular (reagentes de detecção preparados de acordo com as especificações do fabricante). Todas as adições são realizadas com o uso de pipetas de múltiplos canais, (ThermoFisher/Thermo Scientific:El- ClipTipTM; nº 4671010) ou dispensadores de reagente a granel (ThermoFisher Scientific: Multidrop Combi). Sinais de FRET resolvida no tempo (TR-FRET) são determinados 60 minutos depois com o uso de um leitor HTRF apropriado (BMG Labtech: Pherastar).

3. Teste para Antagonismo (formato de 384 poços):

[0071] Em uma primeira etapa, 1 pl de uma solução de antagonista a 4 X na faixa de teste predefinida (preparada no meio de ensaio; HAM F12; 10 % de FCS; 2 mM de Glutamina; sem marcadores de seleção) é adicionado nos poços de uma placa de 384 poços não estéreis (Greiner; branco; nº 784075; Imediatamente depois, 2 ul das células congeladas prontas para ensaio são semeados diretamente na placa (5000 células/poço)). As células são incubadas na presença do inibidor potencial (antagonista) por 30 minutos antes de adicionar 1 pl de uma solução de antagonista EC80 a 4 X (concentrações finais: Embelina = 6,00*10-º M, 6-n- octilaminouracila = 1,34*107M) / 4 X EC80 de forscolina (concentração final = 8 1uM) preparada em um meio de ensaio também. Após 60 minutos de incubação, 2 pl do rastreador cCcAMP-d2 são adicionados seguidos pela adição de 2 ul do anticorpo anti-cAMP contido no tampão de lise celular (reagentes de detecção preparados de acordo com as especificações dos fabricantes). Todas as adições são realizadas com o uso de pipetas de múltiplos canais, (ThermoFisher/Thermo Scientific:El-ClipTipTM; nº 4671010 ou dispensadores de reagente a granel (ThermoFisher Scientific: Multidrop Combi). Sinais de FRET resolvida no tempo (TR-FRET) são determinados 60 minutos depois com o uso de um leitor HTRF apropriado (BMG Labtech: Pherastar).

[0072] Em uma modalidade da invenção, o antagonista ou inibidor de acordo com a invenção é um membro de um dentre os grupos selecionados a partir da lista que compreende: o Di-hidropiridoisoquinolinona .º Di-hidropirimidinoisoquinolinona

[0073] De preferência, o dito antagonista ou inibidor é um dentre as di-hidropiridoisoquinolinonas reveladas em qualquer um dentre US2016244442 Al, WO2016169911 Al, US2016039807 Al e/ou MWO2015197550 Al, cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Do mesmo modo, de preferência, o dito antagonista ou inibidor é uma dentre as di- hidropirimidinoisoquinolinonas reveladas no documento WO2014095798 Al, cujo conteúdo é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade. Em uma modalidade particularmente preferencial, o dito antagonista ou inibidor é um dentre o seguinte:

NnZ Composto 139 do | documento WO O 2014095798 Al (consultar parágrafo

[0380] no mesmo) Oo N< | ox Dx NÉ CH;

[0074] Em uma modalidade da presente invenção, a endometriose é caracterizada por oº presença aumentada de ácidos graxos livres de cadeia média ((MCFFA) em lesões ectópicas, em comparação a endométrio eutópico o. expressão aumentada de GPR84 em monócitos e/ou macrófagos obtidos de um paciente com endometriose, em comparação a monócitos e/ou macrófagos obtidos de um paciente de controle oº fração maior de células GPR84-possitivas em monócitos e/ou macrófagos obtidos de um paciente com endometriose, em comparação a monócitos e/ou macrófagos obtidos de um paciente de controle.

[0075] No mesmo, o termo MCFFA abrange, de preferência, Ca-C1s ácidos graxos, de preferência, ácido decanoico e/ou ácido mirístico, ao passo que o termo ACOT abrange, de preferência, ACOT4 e ACOT9.

[0076] A invenção compreende adicionalmente um método para caracterizar uma condição ginecológica como sendo endometriose, em que o dito método fornece as seguintes etapas: a) obter uma amostra (mancha, biópsia, raspagem) de uma lesão endometrial ectópica de um paciente, b) determinar e/ou quantificar a presença ou ausência de ácidos graxos livres de cadeia média (MCFA), nessa amostra, e c) comparar pelo menos um dentre os parâmetros obtidos com o parâmetro respectivo (controle) (i) obtido do endométrio eutópico de um paciente de controle ou do mesmo paciente ou (ii) obtido da literatura ou bandos de dados,

[0077] em que a presença aumentada de MCFFA em comparação ao controle é atribuída à presença de endometriose.

[0078] Além disso, a invenção compreende adicionalmente um método para caracterizar uma condição ginecológica como sendo endometriose, em que o dito método fornece as seguintes etapas: a) obter uma amostra de um paciente que compreende monócitos e/ou macrófagos, de preferência, uma amostra sanguínea, b) determinar e/ou quantificar a expressão de GPR84 em monócitos e/ou macrófagos compreendidos nessa amostra c) comparar o parâmetro obtido com o parâmetro respectivo (controle) (i) obtido de monócitos e/ou macrófagos de um paciente saudável, ou (ii) obtido da literatura ou banco de dados adequados,

[0079] em que a expressão aumentada de monócitos e/ou macrófagos de GPR84 em comparação ao controle é atribuída à presença de endometriose.

[0080] Além disso, a invenção compreende adicionalmente um método para caracterizar uma condição ginecológica como sendo endometriose, em que o dito método fornece as seguintes etapas: a) obter uma amostra de um paciente que compreende monócitos e/ou macrófagos, de preferência, uma amostra sanguínea, b) determinar e/ou quantificar a fração de monócitos e/ou macrófagos de células GPR84-positivas compreendidos nessa amostra, c) comparar o parâmetro obtido com o parâmetro respectivo (controle) (i) obtido do compreendido na amostra de um paciente saudável, ou (ii) obtido da literatura ou bancos de dados adequados.

[0081] Em todos os três casos acima, caso o parâmetro obtido desvie do controle, a condição ginecológica se qualifica como sendo endometriose. De preferência, as condições ginecológicas se qualificam como sendo endometriose no caso de níveis aumentados em comparação aos parâmetros de controle determinados para MCFFA; ou expressão aumentada em comparação ao parâmetro de controle de monócitos e/ou macrófagos de GPR84; ou uma fração aumentada em comparação ao parâmetro de controle de células GPR84-positivas monócitos e/ou macrófagos compreendido nessa amostra são determinadas. Em uma outra modalidade, a presença determinada de MCFAA é indicativa das condições ginecológicas. Caso os parâmetros se qualifiquem ou sejam indicativos da condição ginecológica, o inibidor ou antagonista da presente invenção pode ser administrado ao paciente.

[0082] De preferência, uma concentração de MCFFA maior que 3,4 uM é atribuída à endometriose ou lesões, com mais preferência, mais que 4,0 pM, com ainda mais preferência, mais que 4,5 uM, ainda com mais preferência mais que 5,0 UM.

[0083] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido o uso do antagonista ou inibidor revelado acima (para a fabricação de um medicamento) no tratamento de um indivíduo humano ou animal que foi diagnosticado com, sofre ou corre risco de desenvolver endometriose ou para a prevenção de tal condição. Além disso, é fornecida uma composição farmacêutica que compreende um antagonista Ou inibidor, de acordo com a revelação acima. Além disso, uma combinação de uma composição farmacêutica de acordo com a revelação acima, e um ou mais outros compostos terapeuticamente ativos são fornecidos.

[0084] Além disso, é fornecido um método para tratar ou prevenir endometriose associada à expressão indesejada de GPR84 é fornecida, em que o método compreende administrar a um indivíduo com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz da composição farmacêutica ou a combinação de acordo com a revelação acima.

[0085] De acordo com outra modalidade da invenção, oO antagonista ou inibidor demonstra propriedades de redução de dor em um modelo de patas inflamadas in-vivo após a administração do adjuvante de Freund completo.

[0086] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um composto para uso no tratamento e/ou prevenção de um paciente que sofre, que corre risco de desenvolver e/ou foi diagnosticado com endometriose, em que o método compreende a triagem de um ou mais compostos de teste em um ensaio de liberação de GPR84 CAMP a fim de saber se os mesmos inibem.

e ativação de GPR84 induzida por embelina com um valor de ICss de 5 mM ou menos, de preferência, 10 UM Ou menos, com mais preferência, 9,4 nM ou menos; e/ou e ativação de GPR84 induzida por ácido 2-OH-decanoico com um valor de ICso de 5 mM ou menos, de preferência, puM ou menos, com mais preferência, de 16 nM ou menos; e/ou e ativação de GPR84 induzida por 6-n-octilaminouracila com um valor de ICso de 5 mM ou menos, de preferência, 10 pM ou menos, com mais preferência, 20 nM ou menos.

[0087] Em uma modalidade, um composto é considerado como adequado para uso no dito tratamento e/ou prevenção caso iniba a dita ativação de GPR84 induzida por embelina com um valor de ICso de 5 mM ou menos, de preferência, 10 puM ou menos, com mais preferência, 9,4 nM ou menos e/ou a dita ativação de GPR84 induzida por ácido 2-OH-decanoico com um valor de ICsº de 5 mM ou menos, de preferência, 10 UM ou menos, com mais preferência, de 16 nM ou menos.

[0088] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um composto para uso no tratamento e/ou prevenção de um paciente que sofre, que corre risco de desenvolver e/ou foi diagnosticado com endometriose, em que no método, o impacto de inibição de um composto em a) uma resposta estimulada por ligante de GPR84 ou agonista de GPR84, ou b) a atividade de GPR84 não estimulada

[0089] é avaliado. De preferência, um composto que exibe um impacto inibidor na dita resposta ou atividade é considerado adequado para o dito uso e/ou tratamento. De acordo com ainda outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um composto para uso no tratamento e/ou prevenção de endometriose em um paciente que sofre, que corre risco de desenvolver, e/ou foi diagnosticado com endometriose, em que o antagonista ou inibidor pode ser identificado por um método que compreende as etapas de: al) colocar composto de teste em contato com um polipeptídeo de GPR84, e bl) detectar a ligação do dito composto de teste ao dito polipeptídeo de GPR84;

[0090] ou a2) determinar a atividade de um polipeptídeo de GPR84 em uma determinada concentração de um composto de teste ou na ausência do dito composto de teste, e b2) determinar a atividade do dito polipeptídeo em uma concentração diferente do dito composto de teste;

[0091] ou a3) determinar a atividade de um polipeptídeo de GPR84 em uma determinada concentração de um composto de teste, e b3) determinar a atividade de um polipeptídeo de GPR84 na presença de um composto conhecido como um regulador de um polipeptídeo de GPR84.

[0092] Essas e outras modalidades são particularmente úteis para triar compostos terapêuticos com o uso de GPR84 ou fragmentos de ligação do mesmo em qualquer uma dentre uma variedade de técnicas de triagem de fármaco. Visto que GPR84 é um receptor acoplado à proteína G, qualquer um dos métodos usados comumente na técnica pode ser usado potencialmente para identificar os ligantes de GPR84. Por exemplo, a atividade de uma receptor acoplado à proteína G, como GPR84 pode ser medida com o uso de qualquer um dentre uma variedade de ensaios funcionais apropriados nos quais a ativação do receptor resulta em uma mudança observável no nível de algum sistema de mensageiro, como adenilato ciclase, guanililciclase, mobilização de cálcio ou hidrólise de fosfolipídeo de inositol.

[0093] Alternativamente, o polipeptídeo ou fragmento empregado em tal teste é livre em solução, afixado a um suporte sólido, transportado em uma superfície celular ou localizado intracelular. Um método de triagem celular utiliza células hospedeiras eucarióticas ou procarióticas que são transformadas estavelmente com ácidos nucleicos recombinantes que expressam o polipeptídeo ou fragmento. Os fármacos são triados em relação a tais células transformadas em ensaios de ligação competitivos. Tais células, em forma viável ou em forma fixa, são usadas para ensaios de ligação padrão.

[0094] É medida, por exemplo, a formação de complexos entre GPR84 e o agente. Alternativamente, pode-se examinar a diminuição na formação de complexo entre GPR84 e um ligante causado pelo agente que é testado.

[0095] Desse modo, a presente invenção fornece métodos para triar candidatos de fármaco, fármacos ou quaisquer outros agentes que afetam transdução de sinal de GPR84. Esses métodos, bem conhecidos na técnica, compreendem colocar tal agente em contato com o polipeptídeo de GPR84 ou um fragmento do mesmo e submeter a ensaio (1) em busca da presença de um complexo entre o agente e o polipeptídeo de GPR84 ou fragmento ou (ii) para a presença de um complexo entre o polipeptídeo de GPR84 ou fragmento e a célula. Em tais ensaios de ligação competitivos, o polipeptídeo de GPR84 ou fragmento é identificado tipicamente. Após a incubação adequada, o polipeptídeo de GPR84 livre ou fragmento é separado desse presente em forma ligada, e a quantidade de identificador livre ou não complexado é uma medida da capacidade do agente particular para se ligar a GPR84 ou para interferir com complexo GPR84-agente.

[0096] Outra técnica para triagem de fármaco fornece triagem de rendimento para compostos que têm afinidade de ligação adequada a polipeptídeos de GPR84. Em suma, grandes números de diferentes compostos de peptídeo pequeno são sintetizados em um substrato sólido, como pinos plásticos ou alguma outra superfície. Os compostos de teste de peptídeo são reagidos com polipeptídeo de GPR84 e lavados. Em seguida, o polipeptídeo de GPR84 ligado é detectado por métodos bem conhecidos na técnica. O GPR84 purificado também é revestido diretamente nas placas para uso nas técnicas de triagem de fármaco mencionadas acima. Além disso, os anticorpos não neutralizantes são usados para capturar o peptídeo e imobilizar o mesmo no suporte sólido.

[0097] Outra técnica é a liberação de cAMP como descrito adicionalmente acima no presente documento e nos experimentos do Exemplo como uma triagem de alto rendimento.

[0098] A presente invenção também contempla o uso de ensaios de triagem de fármaco competitivos nos quais os anticorpos neutralizantes com capacidade para ligação a GPR84 competem especificamente com um composto de teste pela ligação a polipeptídeos de GPR84 ou fragmentos dos mesmos. Dessa maneira, os anticorpos são usados para detectar a presença de qualquer peptídeo que compartilha um ou mais determinantes antigênicos com GPR84.

[0099] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um composto para uso no tratamento e/ou prevenção de um paciente que sofre, que corre risco de desenvolver e/ou foi diagnosticado com endometriose, em que o método compreende as etapas de: a) fornecer um ensaio de lâmina de endométrio com o uso de endométrio eutópico ou ectópico, b) tratar as lâminas com um agonista de GPR84 na presença ou ausência do composto de teste, e c) determinar a possibilidade de o composto de teste reduzir citocina induzida por agonista de GPR84, fatores de crescimento e/ou expressão e/ou secreção de quimiocina.

[0100] Em uma modalidade preferencial, a redução de expressão e secreção na etapa c) é atribuída ao composto que é adequado no dito uso no tratamento e/ou prevenção.

[0101] As ditas citocinas, fatores de crescimento e quimiocinas incluem, porém sem limitação, IL-lbeta assim como TNFalfa. Os exemplos dessa abordagem são mostrados na seção experimental. Os ditos agonistas incluem ácidos graxos de cadeia média, de preferência, ácidos graxos de cadeia média completamente saturados, com mais preferência, ácido decanoico.

[0102] De acordo com outro aspecto da invenção, é fornecido um método para identificar um composto para uso no tratamento e/ou prevenção endometriose de um paciente que sofre, que corre risco de desenvolver e/ou foi diagnosticado com endometriose, em que o método compreende as etapas de: a) fornecer uma preparação de células mononucleares peritoneais humanas ou linhagem celular de monócitos de expressão de GPR84, como THPl1 ou U937 b) tratar células com o composto de teste, e c) determinar se o composto de teste reduz a liberação de quimiocinas que induzem quimiotaxia de células mononucleares de sangue periférico de preferência, IL- lbeta e TNFalfa.

[0103] Em uma modalidade, a redução preferencial da dita liberação de quimiocinas que induz quimiotaxia, de preferência, IL-lbeta e TNFalfa, é atribuída ao composto que é adequado no dito uso no tratamento e/ou prevenção.

[0104] A linhagem celular de monócitos de expressão de GPR84, como THPl ou U937, é conhecida pelas pessoas versadas na técnica [consultar 4 e 9, que são incorporados no presente documento a título de referência].

[0105] De preferência, na etapa Db) a inibição de liberação ou expressão de uma molécula mensageira indicativa da atividade de polipeptídeo de GPR84 é medida.

De preferência, o dito método é um dentre os métodos revelados no documento US2015330968Al, cujo conteúdo é incorporado a título de referência no presente documento. De preferência, o dito composto de teste é selecionado a partir do grupo que consiste em ácido cáprico, ácido undecanoico, ácido láurico, 2,5-di-hidroxi-3-undecil-2,5- ciclo-hexadieno-1,4-diona (Embelina), ácido icosa- 5,8,11,14-tetrainoico, ácido 58, 6R-di-hidroxi-icosa- 7,9,11,14-tetrainoico, di-indorilmetano e indol-3-carbinol. De preferência, a dita molécula mensageira é AMP cíclico (CAMP) .

EXEMPLOS

[0106] Embora invenção tenha sido ilustrada e descrita detalhadamente nos desenhos e na descrição supracitada, tais ilustração e descrição devem ser consideradas como ilustrativas ou exemplificativas e não restritivas; a invenção não se limita às modalidades reveladas. Outras variações nas modalidades reveladas podem ser entendidas e efetuadas pelas pessoas versadas na técnica na prática da invenção reivindicada, a partir de um estudo dos desenhos, da revelação e das reivindicações anexas. Quaisquer sinais de referência não devem ser interpretados como limitantes do escopo.

[0107] Todas as sequências de aminoácidos reveladas no presente documento são mostradas da extremidade N a extremidade C; todas as sequências de ácido nucleico reveladas no presente documento são mostradas 5'->3'. Experimentos Ensaio in vitro 1: Caracterização de ligante e antagonista de GPR84

[0108] Os experimentos de resposta de dose para agonistas de GPR84 foram realizados com o uso do sistema de células CAMP Hunter!" CHO-K1 GPR84 Gi (DiscoverX) (PathHuntero CHO-Kl hNGPR84 B-Arrestina linhagem celular cultivada com DMF12 HAM, 9% de FBS; 300 ug/ml de Higromicina; 800 ug/ml de Geneticina; Glut 2mM; 1 % de Pen/Strep) e, um formato de placa com 384 poços. A viabilidade e o número de células foram determinados (Omni Life Science; Contador/Analisador de Células Casy) antes de semeadura, e o tratamento com agonista foi seguido por um tempo de incubação de 60 minutos para determinar os níveis de cAMP com o uso de FRET resolvida no tempo (TR-FRET) em um instrumento de alto rendimento BMG Labtech Pherastar. Para respostas de dose antagonistas, as células foram incubadas na presença de antagonistas por 30 minutos antes de adicionar agonistas, como descrito na Tabela 1. Em seguida de uma incubação de 60 minutos, os níveis de cAMP foram determinados por TR-FRET, como descrito acima. Os dados foram ajustados com o uso de GraphPad Prism.

[0109] Os dados obtidos são resumidos na Tabela 1: Tabela 1: Exemplo ECso de Agonismo |ICso de o meo CMPD 139 n.a. 20 x 10-ºM (com 6-n- octilaminouracila a 1,34 X 10M)

Exemplo ECso de Agonismo /1ICsoº de FE. CMPD 139 n.a. 9,4 x 10 M (com embelina 6,00 107º M) CMPD 139 n.a. 16 x 10-M (com ácido 2-OH- decanoico a 40 x 107 6 M) n.a.: não aplicado Ensaio ex vivo 1: Ensaio de inflamação endometrial associada a ligante de GPR84

[0110] Biópsias de tecido de endométrio eutópico humano como substitutos para lesão por endometriose foram cortadas em lâminas pequenas, lavadas com tampão de HBSS [ThermoFischer, 14175095] e incubadas em meio DMEM/F12 [ThermoFischer, 11320-033], suplementado com 5 % de FCS por 3 horas. O meio foi removido e substituído por DMEM/F12, 2% de CCS (removidos de carvão) suplementados com combinações de agonista de GPR84 (ácido decanoico) com o antagonista de GPR84 CMPD139. Após 21 horas, as citocinas no sobrenadante foram quantificadas com a plataforma Bio- Plex de acordo com as instruções do fornecedor. Os dados foram analisados com o uso do Software GraphPad (La Jolla, EUA).

[0111] Nesse ambiente, os ligantes de GPR84 aumentaram surpreendentemente os níveis de diversas citocinas pró- inflamatórias e fatores de crescimento estabelecidos anteriormente como relevantes em endometriose. Esses mediadores incluíram ILIB e TNFalfa. O tratamento com o antagonista CMPD 139 em 10º M combinado com ácido decanoico como um agonista reduziu toda a citocina medida e os fatores de crescimento em comparação ao tratamento com um agonista de GPR84 sozinho. Os resultados são mostrados na Tabela 2. Desse modo, a ativação de GPR84 contribui para a inflamação associada à endometriose, e os antagonistas podem reduzir a inflamação. Tabela 2: Amostra | Veículo Ácido Decanoico lÁcido Decanoico (10 pM) (10 puM)

UU TU ENT IL- Ensaio In vitro 2: Liberação de ILbeta e TNFalfa associada ao Ligante GRP84 de PBMCs

[0112] Os PBMCs foram isolados pela configuração de gradiente de densidade Ficoll-Paque Plus (Biochrom) do sangue total. Em suma, as PBMCs foram centrifugadas a 250 g por 30 s e suspensas novamente e cultivadas em meio RPMI 1640 [Gibco, nº CAT 11875093] com 10 % de FBS inativada por calor, L-Glutamina (10 g9/l), penicilina (100 IU/ml) e estreptomicina (100 ng/ml) a 37 ºC em um ambiente de 5 % de CO2. As células foram estimuladas com LPS (100 ng/ml, Sigma-Aldrich) por 24 horas e tratadas com o agonista de GPR84 G6-n-octilaminouracila e o antagonista CMPD 139 por

4 h. As concentrações de IL-lbeta e TNFalfa foram analisadas por ELISA (Mesoscale Discovery, Alemanha). O CMPD139 reduziu os níveis elevados de GPR84 IL-lbeta e TNFalfa, como mostrado na Tabela 3 Tabela 3: Amostra | Veículo 6-n- 6-n- loctilaminouracila octilaminouracila (10 puM) (10 uM)+ CMPD 139 (10 puM) IL-

TNF Imuno-histoquímica de tecido peritoneal

[0113] As seções transversais de tecido embebido com formalina fixa (3,7 %) foram desparafinizadas, hidratadas e marcadas com H&E [marcação com Haematoxilina e Eosina] com o uso de um Leica Multistainer e Coverslipper automático (Leica ST5020+CV 5030, Leica Microsystems, Alemanha).

[0114] Para a detecção de células que expressam GPR84 e CD68, IgG anti-GPR84 (A91742, policlonal de coelho, Sigma- Aldrich, Alemanha) e IgG anti-CD68 (KPl, monoclonal de camundongo, Abcam, Alemanha) foram usados como anticorpos primários, respectivamente. O Dako Envisiont System-HRP (Dako, EUA) e a solução de substrato vermelho permanente de GBI (GBI, EUA) foram aplicados para desenvolver a marcação específica. As lâminas foram contramarcadas adicionalmente com H&E. A Fig. 1 é uma fotomicrografia de tal lâmina.

[0115] Imuno-histoquímica da expressão de GPR84 em lesões ectópicas de endometriose. As lesões peritoneais ectópicas são ricas em células mieloides infiltrantes (CD68) e comarcação com GPR84. Determinação de células GPR84-positivas na cavidade peritoneal do paciente com endometrioses vs. controles

[0116] As células mononucleares do fluido peritoneal (n = 3 por grupo) foram coletadas por configuração de gradiente de densidade ficoll e congeladas a -80 ºC. Para medir a expressão de GPR84, as células foram descongeladas em gelo por 30 min e lavadas com PBS. Em seguida, as células foram marcadas com Corante de Viabilidade Fixável eFluoro 780 (eBioscience, nº de catálogo 65-0865) de acordo com instruções do fabricante, seguida por fixação com 1 % de tampão de Fixação (BioLegend, nº de catálogo 420801). Os receptores de Fc foram bloqueados por 20 % de soro humano e pl/100 pl de soro de bloqueio de receptor humano TruStain FcX Fc (BioLegend, nº de catálogo 422301), e as células foram permeabilizadas com PBS suplementado com 1 % de BSA e 0,1 % de saponina. Em seguida, as células permeabilizadas foram incubadas com anticorpo de GPR84 (Bioss, nº de catálogo bs-15353R) e controle de isótipo de IgG de coelho (Bioss, nº de catálogo bs-0295P-PE) por 1 hora no gelo. Após a marcação, as células foram lavadas duas vezes e obtidas em um citômetro de fluxo (BD LSRFORTESSA; BD Bioscience).

[0117] A análise por citometria de fluxo mostrou níveis de expressão superiores de GPR84 em macrófagos de paciente com endometrioses vs. pacientes de controle (Fig. 2).

Determinação de MCFA em tecido endometrial

[0118] O teor dos ácidos graxos de cadeia média livres individuais (MCFA; ácido decanoico e ácido mirístico) em tecido endometrial eutópico (endométrio) e ectópico (lesão) foi determinado como derivados de éster metílico correspondente dos mesmos com o uso de cromatografia gasosa acoplada à detecção por espectrometria de massa (GC/MS) (Agilent 7890 GC/5975 MSD). As amostras foram tratadas com solução de HCl metanólico por um tempo prolongado para converter completamente ácidos graxos livres nos éteres metílicos dos mesmos. O modo Cromatogramas em Monitoramento de Íon Selecionado (SIM) com quatro íons característicos foram registrados para quantização de derivados de éster metílico individual. Os níveis de ácido decanoico e de ácido mirístico são superiores na lesão endometrial (Lesões) em comparação a endométrio eutópico (Controles). Análise estatística; teste T não pareado, diferença significativa (P < 0,05). Tabela 4: Concentrações de MCFA Amostra Ácido Decanoico Ácido Mirístico ro Fer E) Lesões (n = 5) 0,5103 o,1902 6,596 0,3424 Controles (n=5) 0,3185 0,2019 6,784 0,6641 Efeitos de CMPD139 no modelo de dor de CFA

[0119] A eficácia de CMPD139 in vivo em dor inflamatória foi medida em patas inflamadas após a administração de adjuvantes completos de Freunds (CFA) (24 h) no modelo de sustentação de peso dinâmico (DWB) [10]. Os efeitos do tratamento preventivo repetitivo com CMPDI39 na dor seguindo administração oral e subcutânea repetida (3x) no modelo de CFA de camundongo de inflamação foram investigados com o uso de um ambiente preventivo. O antagonista de GPR84 CMPD139 (90 ou 30 mg/kg, p.o.ts.c., 3x doses) foi administrado 2 h antes da injeção de CFA e 6-8 h depois no dia 0. Em 24 h, após a aplicação de CFA, a terceira dose de CMPD139 foi dada 2 h antes do teste de DWB. Uma análise estatística foi realizada com análise unidirecional de variância, seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni contra grupos de controle de veículo com o uso do software GraphPad PRISM, *p<0,05. Tabela 5: Exemplo | mg/kg Distribuição em peso (% de p.o./s.c. | IDsi/contra) 2 h após a última dose média +/-

SD verei | == PL HO OS CMPD139 | 3x 90+90 mg 60,37 +/- 15,45 * CMPD139 | 3x 30+ 55,82 +/-17,38 mg Referências

[0120] Os artigos a seguir são citados presente relatório descritivo. A título de viabilização da presente invenção, o conteúdo dos mesmos é incorporado no presente documento a título de referência.

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MWNSSDANFSCYHESVLGYRYVAVSWGVVVAVTGTVGNVLTLLALAIQPKLRTRENLLI ANLTLADLLYCTLLQPFSVDTYLHLHWRTGATFCRVFGLLLFASNSVSILTLCLIALGR YLLIAHPKLFPOQVFSAKGIVLALVSTWVVGVASFAPLWPIYILVPVVCTCSFDRIRGRP YTTILMGIYFVLGLSSVGIFYCLIHROQVKRAAQÇALDOYKLROAS IHSNHVARTDEAMPG RFOELDSRLASGGPSEGISSEPVSAATTOTLEGDSSEVGDOINSKRAKQMAEKSPPEAS AKAQPIKGARRAPDSSSEFGKVTRMCFAVFLCFALSYIPFLLLNILDARVOQAPRVVHML AANLTWLNGCINPVLYAAMNRQFROAYGSILKRGPRSFHRLH

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES EMENDADAS l. Uso de um antagonista ou inibidor de receptor 84 acoplado à proteína G (GPR84) caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de endometriose em um paciente U que sofre de, o que corre risco de desenvolver e/ou º que foi diagnosticado com endometriose, em que a endometriose é representada pela presença de ácidos graxos livres de cadeia média (MCFFA) e/ou enzimas acil-CoA tioesterase (ACOT) e/ou sintases de ácido graxo (FASN) em lesões ectópicas, em comparação a endométrio eutópico.
2. 2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de referido antagonista ou inibidor ser um anticorpo, de preferência, um anticorpo monoclonal, que se liga especificamente ao GPR84 ou é um fragmento de ligação a antígeno ou derivado do mesmo.
3. 3. Uso, de acordo com a reivindicação l, caracterizado pelo fato de referido antagonista ou inibidor ser um inibidor de ácido nucleico.
4. 4, Uso, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que referido ácido nucleico se liga especificamente a pelo menos um subestiramento de um polinucleotídeo que codifica uma proteína GPR84.
5. 5. Uso, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico codifica uma proteína GPR84 que compreende uma sequência de aminoácido, como revelado em Uniprot sob o número de referência Q9NQS5, de preferência, de acordo com a SEQ ID NO: 1.
6. 6. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de referido antagonista ou inibidor ser um aptâmero.
7. 7. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de referido antagonista ou inibidor ser uma molécula pequena.
8. 8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações mencionadas acima, caracterizado pelo fato de que a proteína GPR84 que é inibida ou antagonizada pelo anticorpo, pelo aptâmero ou pela molécula pequena compreende uma sequência de aminoácido, como revelado em Uniprot sob o número de referência Q9NQS5, de preferência, de acordo com SEQ ID NO:

   1.
9. 9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 7 ou 8, caracterizado pelo fato de referido antagonista ou inibidor ser um membro de um dentre os grupos selecionados a partir da lista que compreende: º Di-hidropiridoisoquinolinona e Di-hidropirimidinoisoquinolinona.
10. 10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que a endometriose se particulariza por .º expressão aumentada de GPR84 em macrófagos obtidos de um paciente com endometriose, em comparação aos macrófagos obtidos de um paciente de controle; e/ou o fração maior de células GPR84-possitivas em monócitos e/ou macrófagos obtidos de um paciente com endometriose, em comparação a monócitos e/ou macrófagos obtidos de um paciente de controle.
11. 11. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações mencionadas acima caracterizado pelo fato de que o dito tratamento é o tratamento de dor inflamatória associada a endometrioses.
12. 12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um composto é considerado adequado para uso no dito tratamento e/ou prevenção caso iniba a dita ativação de GPR84 induzida por embelina com um valor de IC50 de 5 mM ou menos, com máxima preferência, 9,4 nM ou menos e/ou à dita ativação de GPR84 induzida por ácido 2-OH-decanoico com um valor de IC50 de 5 mM ou menos, com máxima preferência, de 16 nM ou menos.