TW201900214A - 用於治療子宮內膜異位之gpr84抑制劑及拮抗劑 - Google Patents

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梅克 歐班朵福
吉諾特 蘭格爾
艾斯特拉達 費南度 馬丁涅茲
優度 歐柏曼
凱瑟琳 香
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Abstract

本發明係關於一種用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者之G蛋白偶聯受體84 (G protein-coupled receptor 84；GPR84)的拮抗劑或抑制劑，以及篩選此類拮抗劑或抑制劑之方法以及診斷方法。

Description

用於治療子宮內膜異位之GPR84抑制劑及拮抗劑
本發明係關於人類GPR84之抑制劑及拮抗劑用於治療及/或預防子宮內膜異位之用途。根據本發明之抑制劑及拮抗劑係抗體、核酸、適體或小分子。本發明亦提供尋找此類抑制劑及拮抗劑之分析及篩選技術。
子宮內膜異位影響5-10%生育年齡之女性且定義為子宮內膜組織在異位位置中之生長，其主要發現於骨盆腔內。此子宮外生長伴隨著作為主要疾病徵象之促炎性巨噬細胞之浸潤，其產生慢性發炎微環境且促進慢性疼痛症狀。
患有子宮內膜異位之女性之腹膜病變及體液的特徵為除T-淋巴細胞以外包括自然殺手(Natural Killer；NK)細胞及噬菌細胞巨噬細胞[1, 2]之白血球之浸潤，其共同促進表徵疾病之促炎性環境。除浸潤白血球之存在以外，子宮內膜異位之特徵在於炎性介體，兩種促疼痛介體之較高含量，該等炎性介體諸如細胞介素及包括TNFα及IL-1β [3]之生長因子。
中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acids；MCFA)係具有6至12個碳之尾端之脂肪酸且可活化GPR84 [4]。對於動物代謝存在兩種FA源，外源衍生之(膳食) FA及內源合成之FA。後者之生物合成由FASN催化[5]。MCFFA刺激軟骨細胞中之IL6釋放[6]且肉豆蔻酸提高人類冠狀動脈平滑肌(human coronary arterial smooth muscle；HCASM)及內皮(HCEC)細胞中之IL6及IL8含量[7]。
GPR84屬於游離脂肪酸(Free Fatty Acid；FFA)受體群組[8]。FFA受體之群組由4種GPCR (FFA1-FFA2)以及新成員GPR42及GPR84組成。FFA受體涉及諸如代謝之生物過程及免疫功能[8]。
相比於具有較廣泛表現模式之全部其他FFA受體，已描述GPR84主要在各種白血球群體中表現[8]。
迄今為止，子宮內膜異位無法治癒，卻存在兩種類型之介入：疼痛治療及子宮內膜異位相關之不育治療。關於藥物療法，可投與激素療法(孕酮、孕激素、外源性雌激素、口服避孕藥、達那唑(Danazol)(達諾克林(Danocrine))、孕三烯酮、促性腺激素釋放激素(GnRH)促效劑或芳香酶抑制劑)、NSAID、類鴉片或己酮可可鹼，同時另外可使用子宮內膜之手術移除、黏合、子宮內膜瘤之切除及正常骨盆解剖之復原。藥物及手術介入產生大致等效之疼痛緩解益處。發現醫藥及手術介入之疼痛復發分別為44%及53% (24 )。
然而，如今治療選擇均有限且不能令人滿意，從而需要提供就功效、可持續性、減少之副作用、患者順應性及類似者而言更佳之治療選擇。
此等及其他目的以根據本發明之獨立項之方法及手段滿足。附屬項與具體實施例相關。
在詳細描述本發明之前，應瞭解本發明不限於所描述之裝置或組合物之特定組件部分或結構特徵或所描述之方法之方法步驟，因為此類裝置及方法可變化。亦應理解，本文所用之術語僅出於描述特定實施例之目的，且不欲作為限制。某些手段敍述於彼此不同之附屬項中的純粹實情並非表明此等手段不能有利地組合使用。申請專利範圍中之任何參考記號均不應視為限制範疇。必須指出，除非上下文另外清楚指示，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用，單數形式「一(a/an)」及「該」包括單數及/或複數個指示物。此外，在申請專利範圍中，字「包含」並未排除其他元件或步驟。某些手段敍述於彼此不同之附屬項中的純粹實情並非表明此等手段不能有利地組合使用。
此外應理解，倘若給定由數值定界之參數範圍，則認為範圍包括此等限制值。
此外應理解本文所揭示之實施例不意欲理解為彼此不相關之單獨實施例。用一個實施例論述之特徵意謂亦結合本文中展示之其他實施例揭示。若在一種情況下，具體特徵不用一個實施例而用另一實施例揭示，則熟練人員將理解不必意謂該特徵不意欲用該另一實施例揭示。熟練人員將理解本申請案之要旨為揭示該特徵亦適用於另一實施例，但僅出於清楚起見且將說明書保持在可管理範圍中，此尚未進行。
在本發明之情形中，「抑制」或「降低」應理解為相比於對照，例如未經處理之對照將所量測之結果降低至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少75%。當考慮本發明之教示時，適合之對照對於熟練人員而言為顯而易見的。熟練人員可自相關文獻中輕易獲取測定該抑制或降低之適合分析。在一個實施例中，正使用下文中本文所提及之cAMP釋放分析測定該抑制或降低。
「抑制」及「拮抗」以及「抑制劑」及「拮抗劑」在本文中可互換地使用。
在一較佳實施例中，術語「抑制」指代特異性抑制。「特異性抑制」表示抑制指定受體，同時其他受體，較佳地其他G蛋白偶聯受體(GPCR)不受顯著抑制。在一較佳實施例中，「GPR84之特異性抑制」指代抑制GPR84活性同時不顯著抑制一或多種膜轉運體或其他G蛋白偶聯受體(GPCR)，較佳地選自由以下組成之群的一或多者：去甲腎上腺素(NET)、多巴胺(DAT)、鉀通道hERG、鉀通道(KATP)、GPR40。在一較佳實施例中，「其他G蛋白偶聯受體(GPCR)」指代GPR40。
在一較佳實施例中，GPR84之特異性抑制指代相比於對照將GPR84活性抑制至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少75%，同時將選自由其他G蛋白偶聯受體(GPCR)組成之群，較佳地選自由去甲腎上腺素(NET)、多巴胺(DAT)、鉀通道hERG、鉀通道(KATP)及GPR40組成之群之一或多種膜轉運體的活性抑制至多75%，更佳地至多50%、又更佳地至多10%。熟練人員可自相關文獻中輕易獲取測定該抑制或降低之適合分析。在一個實施例中，正使用下文中本文所提及之cAMP釋放分析測定該抑制或降低。其他受體之抑制可如實例之實驗中所例示評估。
根據本發明之一個實施例，提供G蛋白偶聯受體84 (GPR84)之拮抗劑或抑制劑以供治療及/或預防以下患者使用 · 患有子宮內膜異位 · 處於罹患子宮內膜異位風險下及/或 · 經診斷患有子宮內膜異位。
本發明之發明人意外發現GPR84在發炎性細胞型及子宮內膜異位患者之患病組織中表現，以及展示GPR84抑制對諸如發炎性疼痛之此病狀具有緩解作用。尤其，GPR84抑制在活體外子宮內膜異位模型內降低促炎性及促疼痛介體，諸如IL-1β及TNFα。因此，藉由使用降低TNFα及IL-1β含量兩者之子宮內膜異位相關之較高含量的方法來治療子宮內膜異位及其相關症狀有可能治療子宮內膜異位之症狀及疾病進展。在一特定實施例中，拮抗劑或抑制劑係用於治療子宮內膜異位相關之發炎性疼痛。
此外，本文中展示GPR84促效劑(例如中鏈脂肪酸(MCFA))存在於子宮內膜異位組織及病變中，且促進表徵疾病之提高炎性介體。
如本文所用，術語「GPR84之拮抗劑或抑制劑」指代能夠將GPR84之活性直接或間接降低或抑制較佳地至少20%，較佳地至少50%，更佳地至少75%之化合物。熟練人員可自相關文獻中輕易獲取測定該抑制或降低之適合分析。在一個實施例中，正使用下文中本文所提及之cAMP釋放分析測定該抑制或降低。
較佳地，GPR84之拮抗劑或抑制劑係如上文所定義之GPR84之選擇性抑制劑。
此類GPR84活性係例如GPR84之下游效應功能，如人類及小鼠PBMC或巨噬細胞中之發炎性介體釋放。
該降低或抑制可例如藉由降低或抑制內源性及合成GPR84促效劑結合實現。該促效劑結合之降低或抑制可例如藉由與GPR84蛋白之競爭性或立體異位結合發生。
GPR84之較佳促效劑係中鏈游離脂肪酸(MCFFA)，較佳地碳鏈長度為9至14 (參見25 ，19 ，其以引用之方式併入本文中)。此等尤其包括2-OH癸酸及癸酸，其為尤其較佳之GPR84促效劑。
用於GPR84之人工促效劑係6-正辛基胺基尿嘧啶(6-OAU) (參見17 ，以引用之方式併入本文中)。描述其他較佳之人工促效劑；例如3,3'-二吲哚甲烷(參見19 ，以引用之方式併入本文中)及摁貝素(Embelin)(參見WO2007027661 A1，以引用之方式併入本文中)。下表展示一些根據本發明之所選擇促效劑：
在一個實施例中，拮抗劑係特異性結合於GPR84之抗體，較佳單株抗體，或係其抗原結合片段或衍生物。抗體較佳地係單株抗體(mAb)。
如本文所用，術語「單株抗體」應指代具有同質抗體群體，亦即由整個免疫球蛋白組成之同質群體之抗體組合物，或其抗原結合片段或衍生物。尤其較佳的，此類抗體選自由以下組成之群：IgG、IgD、IgE、IgA及/或IgM，或其片段或衍生物。
如本文所用，術語「片段」應指代保留標靶結合能力之此類抗體之片段，例如 • 互補決定區(complementarity determining region；CDR)、 • 高變區、 • 可變域(Fv)、 • IgG重鏈(由VH、CH1、鉸鏈、CH2及CH3區組成)、 • IgG輕鏈(由VL及CL區組成)及/或 • Fab及/或F(ab)2 。
如本文所用，術語「衍生物」應指代結構上不同，但仍與常見抗體概念(例如scFv、Fab及/或F(ab)2 ，以及雙特異性抗體構築體、三特異性抗體構築體或更高的特異性抗體構築體或單價抗體)具有一定結構關係，且進一步保留標靶結合能力之蛋白質構築體。在下文解釋全部此等項目。
熟練人員已知之其他抗體衍生物係雙功能抗體、駱駝科抗體、奈米抗體、結構域抗體、具有由scFvs、IgAs (由J鏈及分泌組分連接之兩種IgG結構)組成之兩條鏈之二價均二聚體、鯊魚抗體、由新世界靈長類動物框架加非新世界靈長類動物CDR組成之抗體、包含CH3+VL+VH之二聚構築體及抗體結合物(例如抗體或與毒素相關之片段或衍生物、細胞介素、放射性同位素或標籤)。此等類型詳細描述於文獻中且可基於本發明由熟練人員使用，進一步增加本發明活性。
如上所述，GPR84經充分說明以使熟練人員能夠製備抗體，反之諸如單株抗體。常規方法涵蓋融合瘤、嵌合/人類化、噬菌體呈現/轉殖基因哺乳動物及其他抗體工程改造技術。
先前已描述用於生產融合瘤細胞之方法(參見[30]，以引用之方式併入本文中)。主要地，例如小鼠用人類GPR84蛋白免疫接種，繼之以自該小鼠之B細胞分離及經分離之B細胞與骨髓瘤細胞之融合。
用於生產及/或選擇嵌合或人類化mAb之方法係此項技術中已知的。主要地，例如未涉及標靶結合之來自小鼠抗GPR84抗體之蛋白質序列被對應人類序列置換。舉例而言，Genentech之US6331415描述嵌合抗體之生產，同時醫學研究委員會(Medical Research Council)之US6548640描述CDR接枝技術且Celltech之US5859205描述人類化抗體之生產。此等全部揭示內容以引用之方式併入本文中。
用於生產及/或選擇全人類mAb之方法係此項技術中已知的。此等可涉及使用用人類GPR84免疫接種之基因轉殖動物，或使用適合之顯示技術，如酵母展示、噬菌體呈現、B細胞展示或核糖體展示，其中來自程式庫之抗體在固定相中針對人類GPR84篩選。
活體外抗體程式庫以及其他揭示於MorphoSys之US6300064及MRC/Scripps/Stratagene之US6248516中。噬菌體呈現技術例如揭示於Dyax之US5223409中。轉殖基因哺乳動物平台例如描述於TaconicArtemis之EP1480515A2中。此等全部揭示內容以引用之方式併入本文中。
IgG、scFv、Fab及/或F(ab)2 係熟練人員熟知之抗體型式。能夠實現之相關技術可獲自各別教科書。
如本文所用，術語「Fab」係指包含抗原結合區之IgG片段，該片段由來自抗體之各重鏈及輕鏈之一個恆定域及一個可變域構成。
如本文所用，術語「F(ab)2 」係指由藉由一或多個二硫鍵彼此連接之兩個Fab片段組成之IgG片段。
如本文所用，術語「scFv」係指單鏈可變片段，其係免疫球蛋白之重鏈及輕鏈之可變區的融合體，與短連接子(通常為絲胺酸(S)或甘胺酸(G))連接在一起。儘管移除恆定區且引入連接肽，但此嵌合分子保留原始免疫球蛋白之特異性。
經修飾之抗體型式係例如雙特異性或三特異性抗體構築體、基於抗體之融合蛋白、免疫共軛物及類似者。此等類型詳細描述於文獻中且可基於本發明由熟練人員使用，進一步增加本發明活性。此外，單價抗體亦已先前描述於US 2004/0033561 A1 (其中稱為單價抗體)或WO2007048037中；兩者均以引用之方式併入本文中。
基於GPR84之胺基酸序列之公眾可用性，發現能夠例如藉由與其活性中心結合充當GPR84之拮抗劑之適合抗體或片段或衍生物因此對於熟練人員而言係慣例問題。
用於科學研究之對GPR84之多株抗體係市售的，僅舉幾例，例如購自ThermoFischer (PA5-32843)、Santa Cruz Biotechnology (H-300, D-15)或Novus Biologicals (NBP1-84768)，因此證明熟練人員能夠製備對GPR84之療法抗體。
因為GPR84係7-跨膜受體蛋白，所以抗體或其片段或衍生物可與GPR84之胞外或胞內域結合。在後者情況中，抗體或其片段或衍生物需要彙集或運輸至胞內空間中。常規技術可用於此目的，其揭示於其他地方(26 - 28，以引用之方式併入本文中)。
在一個實施例中，拮抗劑或抑制劑係核酸抑制劑。此實施例可例如包含至少特異性結合於編碼GPR84蛋白之聚核苷酸之子序列段的核酸分子。
較佳地，該聚核苷酸編碼GPR84蛋白，該GPR84蛋白包含Uniprot中參考編號Q9NQS5所揭示之AA序列，較佳係根據SEQ ID NO: 1。
許多核酸抑制劑方法依賴於此類抑制性核酸分子與靶序列，亦即編碼GPR84之聚核苷酸之鹼基配對。該編碼GPR84之聚核苷酸可為mRNA或基因組DNA。
較佳地，該抑制劑選自由siRNA、shRNA、crRNA或引導RNA組成之群。
siRNA係可經化學修飾以提高穩定性之短人工RNA分子。因為siRNA係雙股，所以亦適用「有義」及「反義」之原則。有義股具有與經轉錄之mRNA相同之鹼基序列，且反義股具有互補序列。技術上，向患者投與之siRNA分子與稱為Argonaut之胞內酶結合，形成所謂的RNA誘導靜默複合物(RNA-induced silencing complex；RISC)。siRNA之反義股將RISC引導至標靶mRNA，其中反義股與標靶mRNA雜交，隨後由RISC裂解。以此方式，中斷個別mRNA之轉譯。RISC可隨後進一步裂解mRNA。遞送技術例如揭示於其他地方([29]，以引用之方式併入本文中)。習此相關技藝者依據GPR84之不同mRNA同型物之公開利用性，即可依例行方式發現siRNA之合適序列。
shRNA係可用於經由RNA干擾(RNAi)來靜默靶基因表現之具有緊密髮夾圈之人工RNA分子。shRNA可例如藉助於質體或經由病毒或細菌載體遞送至細胞。shRNA係有利的RNAi介體，因為其具有相當低的降解及轉化速率。各別質粒包含適合表現shRNA之啟動子，如聚合酶III啟動子，諸如U6及H1，或聚合酶II啟動子。一旦質體或載體已整合至宿主基因組中之後，shRNA即於細胞核中轉錄。產物模仿pri-微RNA (pri-miRNA)且藉由Drosha處理。所得pre-shRNA藉由輸出蛋白(Exportin)5自細胞核送出。此產物隨後藉由Dicer處理且裝載於RNA誘導靜默複合物(RISC)中，其後依siRNA之相同方式進行靜默。習此相關技藝者依據GPR84之不同mRNA同型物之公開利用性，即可依例行方式發現shRNA之合適序列。
第一核酸分子可以係CRISPR Cas系統之引導RNA (31 )，該引導RNA包含能夠與GPR84基因之基因組股雜交之標靶特異性crRNA (「小干擾CRISPR RNA」) (或第一核酸分子可單獨為crRNA)。引導RNA/crRNA能夠將Cas酶(其為核酸內切酶)引導至GPR84基因，其中Cas酶進行序列特異性股破壞。藉由產生一或多種雙股破壞，GPR84基因因此可經沉默。為使用該用於GPR84之活體內基因靜默之系統，需要專用遞送技術，其包含例如論述於其他地方之遞送媒介，諸如脂質奈米粒子(32 )。基於GPR84之基因組序列之公眾可用性，發現包含於引導RNA中之crRNA之適合序列對於熟練人員而言係慣例問題。
在另一實施例中，該第一核酸分子亦可為CRISPR Cpf1系統之引導RNA (33 )，該引導RNA包含標靶特異性crRNA (「小干擾CRISPR RNA」)。類似於CRISPR/Cas，引導RNA能夠將Cpf1酶(核酸內切酶)引導至GPR84基因。關於技術考慮，例如用於活體內應用之遞送及發現第一核酸分子之適合序列，如同CRISPR/Cas之相似態樣適用。
CRISPR技術之其他實施例目前處於研發中，具有不同核酸內切酶。然而，全部此等方法均使用與靶序列雜交之標靶特異性RNA (如CRISPR Cas中之引導RNA或crRNA)。在全部此等情況中，標靶特異性RNA在本文所論述之較佳實施例之含義中稱為第一核酸分子。關於技術考慮，例如用於活體內應用之遞送及發現第一核酸分子之適合序列，如同CRISPR Cas之相似態樣適用。
微RNA (簡稱為miRNA)係發現於植物、動物及一些病毒中之非編碼小RNA分子(含有約22個核苷酸)，其在RNA靜默及基因表現之轉錄後調節中起作用。
在一個實施例中，拮抗劑或抑制劑係適體。適體係對預定標靶具有特異性結合特性之寡核苷酸。其經由稱為SELEX (「指數富集配位體之系統進化」)之組合製程獲自含有達至1015 種不同序列之隨機合成程式庫。適體特性由其3D形狀決定，該形狀由分子內摺疊產生，該分子內摺疊由其一級序列驅動。適體3D結構經由氫鍵鍵合、靜電及堆疊相互作用極其適用於其同源標靶之識別。適體一般展示高親和力(對於小分子約微莫耳(µM)及對於蛋白質皮莫耳(pM)之Kd )。
例如在以引用之方式併入本文中之34中給出針對產生標靶特異性適體之技術清單之概述。適體亦可遞送至胞內空間中，如35中所揭示(以引用之方式併入本文中)。
基於不同GPR84同型物之胺基酸序列之公眾可用性，發現能夠例如藉由與其活性中心結合充當GPR84之拮抗劑之適合適體因此對於熟練人員而言係慣例問題。
在另一尤其較佳之實施例中，拮抗劑或抑制劑係小分子。較佳地，該小分子係有機分子，且/或該小分子之分子量為小於≤ 550 DA，較佳地≤ 500 DA，更佳地≤ 450 DA。
較佳地，由抗體、適體或小分子抑制或拮抗之GPR84蛋白包含Uniprot中參考編號Q9NQS5所揭示之AA序列，較佳係根據SEQ ID NO: 1。
在本發明之一較佳實施例中，拮抗劑或抑制劑將促效劑誘導之GPR84活化降低或抑制至少20%，更佳地至少50%、又更佳地至少75%。熟練人員可自相關文獻中輕易獲取測定該抑制或降低之適合分析。在一個實施例中，正使用下文中本文所提及之cAMP釋放分析測定該抑制或降低。
根據本發明之一個實施例，拮抗劑或抑制劑抑制促效劑誘導之GPR84活化，較佳地 · 對摁貝素所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地9.4 nM或更小，及/或 · 對2-OH癸酸所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM，較佳地10 µM或更小，更佳地16 nM或更小。
較佳地，在GPR84 cAMP釋放分析中測定摁貝素誘導之GPR84活化及/或2-OH癸酸誘導之GPR84活化。
藉由潛在抑制劑對促效劑誘導之GPR84活化之抑制可例如根據以下原則在cAMP釋放分析中測試： GPR84活性抑制細胞中之cAMP產生。GPR84之抑制因此導致細胞中之cAMP含量增加。然而，在藉由測定對cAMP含量之影響來測試物質之抑制潛能時，需確定所觀測到之影響係GPR84特異性的而非總體cAMP誘導作用。較佳之選擇為調查物質(潛在抑制劑)是否逆轉GPR84促效劑之抑制作用。藉由GPR84進行之Galphai信號傳導之促效劑抑制膜腺苷醯環化酶誘導之細胞cAMP產生。在GPR84促效劑存在下添加GPR84抑制劑(或GPR84拮抗劑)導致膜腺苷醯環化酶誘導之cAMP產生之(重新)增加。因此，對GPR84之拮抗作用導致細胞中之cAMP含量增加。潛在抑制劑之拮抗作用較佳藉由其在GPR84促效劑及膜腺苷醯環化酶活化劑，諸如毛喉素存在下暴露來測試。亦可利用經由膜腺苷醯環化酶活化非特異性地提高cAMP含量之任何其他化合物或物質。可添加防止cAMP退化之一或多種化合物以確保此第二信使之足夠積累。此類化合物包括磷酸二酯酶抑制劑，例如3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)。
熟練人員將承認隨著評估對促效GPR84誘導之作用，GPR84特異性抑制經測定，見上文。為進一步強化GPR84特異性，可使用過度表現GPR84之細胞，例如但不限於「cAMP HunterTM CHO-K1 GPR84 Gi 細胞 」(DiscoverX；編號95-0158C2)。
藉由測定與如上文所概述之潛在GPR84抑制劑接觸之細胞中的cAMP含量且使其與適當對照比較，有可能確定拮抗作用。相比於對照，cAMP含量之增加表明GPR84拮抗作用且使化合物稱為抑制劑。較佳地，相比於無潛在抑制劑之適當對照，物質稱為GPR84之抑制劑(若其提高與潛在抑制劑接觸之細胞之cAMP含量)，GPR84之促效劑，膜腺苷醯環化酶誘導之cAMP產生之活化劑，及抑制至少20%之磷酸二酯酶抑制劑。
熟練人員能夠使用常見技能偵測細胞中之cAMP含量(content/levels)。常見技術可例如採用競爭性分析。原則上，使可偵測示蹤劑與cAMP黏合劑在應測定cAMP含量之樣品存在下接觸，其中可偵測示蹤劑與cAMP競爭性地與cAMP黏合劑結合。競爭性分析經建構以便允許例如藉由使用用於螢光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer；FRET)分析之相容染料偵測與cAMP黏合劑結合之示蹤劑之相對量。在樣品存在下，包含於樣品中之cAMP與示蹤劑競爭與cAMP黏合劑結合。若樣品係細胞，則可使細胞在應用於分析之前經受溶解以便釋放胞內cAMP含量。與cAMP黏合劑結合之示蹤劑之偵測量與樣品中之cAMP含量成反比。換言之，與cAMP黏合劑結合之示蹤劑之強烈信號表明樣品中之低cAMP含量，且反之亦然-與cAMP黏合劑結合之示蹤劑之較弱信號表明樣品中的較高cAMP含量。最大信號在不存在cAMP下獲得。細胞內cAMP含量之降低可因此藉由在競爭性分析中比較相比於陰性對照及/或在添加該潛在抑制劑之前，在添加測試抑制劑之後細胞中之cAMP含量來測定。在暴露於潛在抑制劑之樣品中偵測到更多與cAMP黏合劑結合之cAMP表明該潛在抑制劑對GPR84之抑制(拮抗)作用。相比於競爭性分析中之對照，對於用潛在抑制劑處理之樣品而言競爭性分析中之較弱信號因此表明潛在抑制劑對GPR84之抑制作用。
實際cAMP量之定量可例如藉助於基於經螢光染料標記之cAMP示蹤劑(例如cAMP-d2，(Cisbio；cAMP femto 2套組；編號62AM5PEJ …))及cAMP黏合劑，諸如經標記之抗cAMP抗體，例如經Eu穴狀合物標記之抗cAMP抗體(Cisbio；cAMP femto 2套組；編號62AM5PEJ)之競爭分析實現。在細胞溶解後，任何細胞cAMP均呈現對示蹤劑與抗體結合之競爭。若使用用於示蹤劑及cAMP黏合劑之相容螢光染料，則此類信號可例如使用FRET來量測。視染料而定，使用如熟練人員顯而易見之不同發射及激發波長。對於d2/Eu穴狀化合物之組合，例如見上文，在337 nm下激發之後使用適當的高通量螢光(HTRF)讀取器(例如RubiStar；Berthold Industries)量測665 nm及620 nm下之FRET誘導之發射。鑒於偵測系統之競爭性質，促效劑處理導致較低之cAMP含量且增強HTRF信號。在毛喉素、促效劑及拮抗劑存在下HTRF信號之任何減弱均指示藉由GPR84進行之抑制性Galphai信號傳導之消除，且因此實現對GPR84之抑制作用。
偵測物質抑制之例示性程序可如下進行：
1. 製備分析備用之冷凍細胞 為了冷凍細胞(cAMP HunterTM CHO-K1 GPR84 Gi細胞；DiscoverX；編號95-0158C2)之復蘇，自液氮儲存取出一個小瓶且在37℃下之水浴中快速解凍大約1至3分鐘。之後立即藉由傾析將細胞謹慎轉移至含有15 ml預溫熱全細胞培養基(HAM's F12；10 % FCS；無選擇標記物)之50 ml法爾康管(Falcon Tube)中。使用輕微渦流輔助其再懸浮。在下一步驟中，經由持續5分鐘之低g離心(Hereaus Multifuge 4 KR；400 rpm；rcf = 44g)立即收集細胞以避免過度壓縮細胞小球。使用輕微傾析脫離培養基。最後藉由將細胞小球謹慎地再懸浮於5 ml最終分析培養基(HAM's F12；10 % FCS；無選擇標記物)來實現分析準備。在最終步驟中，測定細胞存活率及實際細胞數目(Omni Life Science；Casy Cell Counter/Analyzer)，之後校正待接種之最終細胞數目之體積，亦即2500個細胞/µl。細胞接種藉助於多注式吸液管或適當的大容量試劑分配器實現。
2. 激動作用之測試(384孔型式)： 將2 µl分析備用之冷凍細胞直接接種於非無菌384孔板(Greiner；白色；編號784075；5000個細胞/孔)之孔中。之後立即添加2 µl 2 ×促效劑/2 × EC80毛喉素(最終濃度= 8 µM，西格瑪；編號F6886)溶液，該溶液在分析培養基(HAM's F12；10 % FCS；2 mM麩醯胺酸；無選擇標記物)中製備。在60分鐘培育時間之後，添加2 µl如所提供之cAMP-d2示蹤劑(Cisbio；cAMP femto 2套組；編號62AM5PEJ)，之後分別添加2 µl細胞溶解緩衝液(根據製造商說明書製備之偵測試劑)中所含有之抗cAMP抗體。全部添加均使用多注式吸液管(ThermoFisher/Thermo Scientific:E1-ClipTipTM；編號4671010)或大容量試劑分配器(ThermoFisher Scientific: Multidrop Combi)進行。在60分鐘後使用適當的HTRF讀取器(BMG Labtech: Pherastar)測定時間分解FRET (TR-FRET)信號。
3. 拮抗作用之測試(384孔型式)： 在第一步驟中，將1 µl預定測試範圍中之4 ×拮抗劑溶液(在分析培養基中製備；HAM's F12；10 % FCS；2 mM麩醯胺酸；無選擇標記物)添加至非無菌384孔板(Greiner；白色；編號784075；之後立即將2 µl分析備用之冷凍細胞直接接種至板(5000個細胞/孔)中)之孔中。細胞在潛在抑制劑(拮抗劑)存在下培育30分鐘，之後亦添加在分析培養基中製備之1 µl 4 ×促效劑EC80 (最終濃度：摁貝素=6.00*10-6 M，6-正辛基胺基尿嘧啶=1.34*10-7 M)/4 × EC80毛喉素(最終濃度=8 µM)。在培育60分鐘之後，添加2 µl cAMP-d2示蹤劑，之後添加2 µl細胞溶解緩衝液(根據製造商說明書製備之偵測試劑)中含有之抗cAMP抗體。全部添加均使用多注式吸液管(ThermoFisher/Thermo Scientific:E1-ClipTipTM；編號4671010)或大容量試劑分配器(ThermoFisher Scientific: Multidrop Combi)進行。在60分鐘後使用適當的HTRF讀取器(BMG Labtech: Pherastar)測定時間分解FRET (TR-FRET)信號。
在本發明之一個實施例中，根據本發明之拮抗劑或抑制劑係選自包含以下之清單之群組中的一者之成員： · 二氫吡啶并異喹啉酮 · 二氫嘧啶并異喹啉酮。
較佳地，該拮抗劑或抑制劑係US2016244442 A1、WO2016169911 A1、US2016039807 A1及/或WO2015197550 A1中之任一者中所揭示之二氫吡啶并異喹啉酮中的一者，其內容以引用之方式併入本文中。同樣較佳地，該拮抗劑或抑制劑係WO2014095798 A1中所揭示之二氫嘧啶并異喹啉酮中之一者，其內容以引用之方式併入本文中。在一尤其較佳實施例中，該拮抗劑或抑制劑係以下中之一者：
在本發明之一個實施例中，子宮內膜異位之特徵在於 · 相比於正位子宮內膜，異位病變中之中鏈游離脂肪酸(MCFFA)之含量增加 · 相比於取自對照患者之單核球及/或巨噬細胞，取自子宮內膜異位患者之單核球及/或巨噬細胞中之GPR84之表現增加 · 相比於取自對照患者之單核球及/或巨噬細胞，取自子宮內膜異位患者之單核球及/或巨噬細胞中之GPR84陽性細胞之比例較高。
其中，術語MCFFA涵蓋較佳地C9 -C14 脂肪酸，較佳地癸酸及/或肉豆蔻酸，而術語ACOT較佳地涵蓋ACOT4及ACOT9。
本發明進一步提供將婦科病狀表徵為子宮內膜異位之方法，該方法提供以下步驟： a) 自患者之異位子宮內膜病變採取樣品(塗片、活檢、刮擦)， b) 測定及/或量化彼樣品中中鏈游離脂肪酸(MCFFA)之存在或不存在，及 c) 比較所獲得參數中之至少一者與(i)獲自對照患者或同一患者之正位子宮內膜或(ii)取自適合文獻或資料庫之各別(對照)參數， 其中相比於對照MCFFA之增加之存在歸因於子宮內膜異位之存在。
另外，本發明提供將婦科病狀表徵為子宮內膜異位之方法，該方法提供以下步驟： a) 自包含單核球及/或巨噬細胞之患者採取樣品，較佳血液樣品， b) 測定及/或量化包含於彼樣品中之單核球及/或巨噬細胞中之GPR84的表現， c) 比較所獲得之參數與(i)獲自健康患者之單核球及/或巨噬細胞或(ii)取自適合文獻或資料庫之各別(對照)參數， 其中相比於對照單核球及/或巨噬細胞中之GPR84之增加表現歸因於子宮內膜異位之存在。
另外，本發明提供將婦科病狀表徵為子宮內膜異位之方法，該方法提供以下步驟： a) 自包含單核球及/或巨噬細胞之患者採取樣品，較佳血液樣品， b) 測定及/或量化包含於彼樣品中之單核球及/或巨噬細胞中之GPR84陽性細胞的百分率， c) 比較所獲得之參數與(i)獲自包含於健康患者之彼樣品中或(ii)取自適合文獻或資料庫之各別(對照)參數。
在以上全部三種情況中，若所獲得之參數不同於對照，則婦科病狀稱為子宮內膜異位。較佳地，在以下情況下婦科病狀稱為子宮內膜異位：測定相比於針對MCFFA所測定之對照參數增加之含量；或相比於單核球及/或巨噬細胞中之GPR84之對照參數增加之表現，或相比於包含於彼樣品中之單核球及/或巨噬細胞中之GPR84陽性細胞的對照參數增加之百分率。在另一實施例中，所確定之MCFAA之存在指示婦科病狀。在此情況下，參數認定或指示為婦科的，可向患者投與本發明之抑制劑或拮抗劑。
較佳地，大於3.4 µM，更佳地大於4.0 µM、甚至更佳的大於4.5 µM、又更佳的大於5.0 µM之MCFFA濃度歸因於子宮內膜異位或病變。
根據本發明另一個態樣，提供(用於製造藥劑之)上文所揭示之拮抗劑或抑制劑之用途，其用於治療經診斷患有子宮內膜異位、患有子宮內膜異位或處於罹患子宮內膜異位風險下之人類或動物個體中或用於預防此類病狀。此外，提供包含根據上文揭示內容之拮抗劑或抑制劑之醫藥組合物。此外，提供根據上文揭示內容之醫藥組合物與一或多種其他治療活性化合物之組合。
此外，提供一種用於治療或預防與不期望之GPR84表現相關之子宮內膜異位的方法，該方法包含向有需要之個體投與有效量之根據上文揭示內容所提供之醫藥組合物或組合。
根據本發明另一個實施例，在弗氏完全佐劑之投藥之後，拮抗劑或抑制劑在活體內發炎腳掌模型中表明疼痛減輕特性。
根據本發明另一個態樣，提供一種鑑別用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者之化合物的方法，該方法包括在GPR84 cAMP釋放分析中，依據其等是否抑制以下各項，來篩選一或多種測試化合物： · 對摁貝素所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地9.4 nM或更小之；及/或 · 對2-OH癸酸所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地16 nM或更小；及/或 · 對6-正辛基胺基尿嘧啶所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地20 nM或更小。
在一個實施例中，若化合物抑制摁貝素所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地9.4 nM或更小，及/或對該2-OH癸酸誘導之GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，最佳地16 nM或更小時，則視為其適用於該治療及/或預防。
根據本發明另一個態樣，提供一種鑑別用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者之化合物的方法，在該方法中評估測試化合物對以下各者之抑制作用： a) 受GPR84配位體或GPR84促效劑刺激之反應，或 b) 未受刺激之GPR84活性。 較佳地，對該反應或活性展現抑制作用之化合物視為適合於該用途及/或治療。根據本發明又一其他態樣，提供一種鑑別用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者中之子宮內膜異位的化合物之方法，其中拮抗劑或抑制劑可藉由包含以下步驟之方法鑑別： a1) 使測試化合物與GPR84多肽接觸，及 b1) 偵測該測試化合物與該GPR84多肽之結合； 或 a2) 測定GPR84多肽在測試化合物之某一濃度下或沒有該測試化合物存在下之活性，及 b2) 測定該多肽在該測試化合物之不同濃度下之活性； 或 a3) 測定GPR84多肽在測試化合物之某一濃度下之活性，及 b3) 測定GPR84多肽在已知為GPR84多肽之調節因子之化合物的存在下之活性。
此等及其他實施例尤其適用於在多種藥物篩選技術中之任一者中藉由使用GPR84或其結合片段篩選療法化合物。因為GPR84係G蛋白偶聯受體，所以可能使用此項技術中常用之方法中之任一者鑑別GPR84配位體。舉例而言，諸如GPR84之G蛋白偶聯受體之活性可使用多種適當的功能分析中之任一者量測，其中受體活化導致某種第二信使系統，諸如腺苷酸環化酶、鳥苷醯環化酶、鈣移動或肌醇磷脂水解之含量發生可觀測變化。
可替代地，此類測試中所用之多肽或片段在溶液中游離，黏附至固體撐體，承載於細胞表面上或定位在胞內。一種藥物篩選方法利用真核或原核宿主細胞，其利用表現多肽或片段之重組核酸穩定轉化。在競爭性結合分析中針對此類轉化細胞篩選藥物。呈存活或固定形式之此類細胞用於標準結合分析。
例如量測GPR84與試劑之間的複合物形成。可替代地，吾人可檢驗由所測試試劑引起之GPR84與配位體之間的複合物形成之減少。
因此，本發明提供篩選影響GPR84信號轉導之藥物候選物、藥物、或任何其他試劑之方法。此項技術中熟知之此等方法包含使此類試劑與GPR84多肽或其片段接觸及分析(i)試劑與GPR84多肽或片段之間的複合物之存在，或(ii)GPR84多肽或片段與細胞之間的複合物之存在。在此類競爭性結合分析中，通常標記GPR84多肽或片段。在適合之培育之後，使游離GPR84多肽或片段與呈結合形式存在之彼者分離，且游離或未經錯合之標籤之量係特定試劑與GPR84結合或干擾GPR84試劑複合物之能力的量測。
藥物篩選之另一技術提供具有與GPR84多肽之適合結合親和力之化合物的高通量篩選。簡言之，在固體基板，諸如塑針或某種其他表面上合成大量不同小肽測試化合物。使肽測試化合物與GPR84多肽反應且洗滌。隨後藉由此項技術中熟知之方法偵測結合GPR84多肽。亦將經純化之GPR84直接塗佈於板上以用於前述藥物篩選技術。另外，使用非中和抗體捕獲肽且將其固定於固體撐體上。
另一技術係如在上文本文進一步描述之cAMP釋放及在實例之實驗中如高通量篩網。
本發明亦涵蓋使用競爭性藥物篩選分析，其中能夠結合GPR84之中和抗體與測試化合物特異性地競爭與GPR84多肽或其片段結合。以此方式，使用抗體偵測與GPR84共有一或多種抗原決定子之任何肽之存在。
根據本發明另一個態樣，提供一種鑑別用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者的化合物之方法，該方法包含以下步驟： a) 提供使用正位或異位子宮內膜之子宮內膜切片分析， b) 在存在或不存在測試化合物下用GPR84促效劑處理切片，及 c) 測定測試化合物是否減少GPR84促效劑誘導之細胞介素、生長因子及/或趨化細胞素表現及/或分泌。
在一較佳實施例中，在步驟c)中降低之表現及分泌歸因於適用於治療及/或預防中之該用途的化合物。
該等細胞介素、生長因子及趨化激素包括但不限於IL-1β以及TNFα。此方法之實例展示於實驗部分中。該等促效劑包括中鏈脂肪酸，較佳地完全飽和中鏈脂肪酸，更佳地癸酸。
根據本發明另一個態樣，提供一種鑑別用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者中之子宮內膜異位的化合物之方法，該方法包含以下步驟： a) 提供人類腹膜單核細胞或GPR84表現單核球細胞株，諸如THP1或U937之製備 b) 用測試化合物處理細胞，及 c) 測定測試化合物是否降低誘導外周血單核細胞之趨化性之趨化激素，較佳IL-1β及TNFα的釋放。
在一較佳實施例中，誘導趨化性之趨化激素，較佳IL-1β及TNFα之該釋放之降低歸因於適用於治療及/或預防中之該用途的化合物。
GPR84表現單核球細胞株，諸如THP1或U937為熟習此項技術者已知[參見4及9，其以引用之方式併入本文中]。
較佳地，在步驟b)中，量測指示GPR84多肽之活性之信使分子的釋放或表現之抑制。較佳地，該方法係US2015330968A1中所揭示之方法中之一者，US2015330968A1之內容以引用之方式併入本文中。較佳地，該測試化合物選自由以下組成之群：癸酸、十一酸、十二酸、2,5-二羥基-3-十一基-2,5-環己二烯-1,4-二酮(摁貝素)、二十-5,8,11,14-四烯酸、5S,6R-二羥基-二十-7,9,11,14-四烯酸、二吲哚基甲烷及吲哚-3-甲醇。較佳地，該信使分子係環狀AMP (cAMP)。
實例 雖然已在圖式及前述描述中詳細地說明及描述了本發明，但此類說明及描述應被視為說明性或例示性的，而非限定性的；本發明不限於所揭示實施例。所揭示之實施例之其他變體可由熟習此項技術者自圖式、揭示內容和所附申請專利範圍的研究中藉由實踐所主張之發明而理解並實現。任何參考符號均不應視為限制範疇。
本文所揭示之全部胺基酸序列均自N端至C端展示；本文所揭示之全部核酸序列均展示5'-＞3'。
實驗 活體外分析 1 ： GPR84 配位體及拮抗劑特徵
GPR84促效劑之劑量反應實驗在384孔板型式中使用cAMP HunterTM CHO-K1 GPR84 Gi細胞系統(DiscoverX) (用DMF12 HAM，9% FBS；300 ug/ml潮黴素；800 ug/ml遺傳黴素；2mM Glut；1% Pen/Strep培養之PathHunter® CHO-K1 hGPR84 β-抑制蛋白細胞株)進行。在接種之前測定細胞存活率及數目(Omni Life Science；Casy細胞計數器/分析儀)且促效劑處理繼之以60分鐘培育時間以在高通量BMG Labtech Pherastar儀器上使用時差式FRET (TR-FRET)測定cAMP含量。對於拮抗劑劑量反應，在添加如表1中所描述之促效劑之前將細胞在拮抗劑存在下培育30分鐘。在60分鐘培育之後，藉由如上文所述之TR-FRET測定cAMP含量。使用GraphPad Prism擬合資料。
資料概述於表1中：表 1 ： n.a.：不適用
活體外分析 1 ： GPR84 配位體相關之子宮內膜炎症分析 將作為子宮內膜異位病變之替代物之人類正位子宮內膜組織活檢體切成小切片，用HBSS緩衝液[ThermoFischer，14175095]洗滌且在補充有5% FCS之DMEM/F12培養基[ThermoFischer，11320-033]中培育3小時。培養基經移除且用補充有GPR84促效劑(癸酸)及GPR84拮抗劑CMPD139之組合之DMEM/F12，2% CCS (活性炭剝離)置換。在21小時之後，根據供應商之說明書用Bio-Plex平台定量上清液中之細胞介素。使用GraphPad軟體(La Jolla，USA)分析資料。
在此環境中，GPR84配位體意外地提高先前確定與子宮內膜異位相關之若干促炎細胞介素及生長因子之含量。此等介體包括IL1β及TNFα。相比於單獨使用GPR84之促效劑之處理，使用10-5 M下之拮抗劑CMPD 139與癸酸組合作為促效劑之處理降低全部所量測之細胞介素及生長因子。結果展示於表2中。因此，GPR84之活化有助於與子宮內膜異位相關之炎症且拮抗劑能夠減少炎症。表 2 ：
活體外分析 2 ： 自 PBMC 之 GPR84 配位體相關之 IL β 及 TNF α 釋放 藉由Ficoll-Paque Plus (Biochrom)密度梯度離心使PBMC與全血分離。簡言之，使PBMC在250 g下離心30秒且在37℃下在5% CO2 環境中於具有10%加熱不活化FBS、L-麩醯胺酸(10 g/L)、青黴素(100 IU/mL)及鏈黴素(100 ng/mL)之RPMI 1640培養基[Gibco，目錄號 11875093]中再懸浮及培養。細胞用LPS (100 ng/ml，Sigma-Aldrich)刺激24小時且用GPR84促效劑6-正辛基胺基尿嘧啶及拮抗劑CMPD 139處理4 h。藉由ELISA (Mesoscale Discovery，Germany)分析IL-1β及TNFα濃度。CMPD139降低GPR84提高之IL-1β及TNFα含量，如表3中所展示。表 3 ：
腹膜組織之免疫組織化學 經福爾馬林(3.7%)固定、鏈烷烴嵌入之組織之橫截面去石蠟、水合及使用自動Leica多功能染色機(Leica Multistainer)及封片機(Leica ST5020+CV 5030，Leica Microsystems，Germany)H&E[蘇木精及曙紅染液]染色。
為偵測GPR84表現細胞及CD68表現細胞，抗GPR84-IgG (A91742，兔多株，Sigma-Aldrich，Germany)及抗CD68-IgG (KP1，小鼠單株，Abcam，Germany)分別用作初級抗體。應用Dako Envision+ System-HRP (Dako，USA)及GBI永久紅(GBI，USA)基質溶液研發特異性染色。載片另外用H&E反向染色。圖1係此類載片之顯微照片。
子宮內膜異位之異位病變中之GPR84表現的免疫組織化學。異位腹膜病變富集於浸潤骨髓細胞(CD68)且與GPR84共同染色。
子宮內膜異位患者相對於對照之腹腔中之 GPR84 陽性細胞的測定 來自腹膜液體之單核細胞(n = 3/組)藉由ficoll密度梯度離心收集且在-80℃下冷凍。為量測GPR84表現，使細胞在冰上解凍30 min且用PBS洗滌。細胞隨後根據製造商之說明用可固定活性染料eFluor® 780 (Fixable Viability Dye eFluor® 780)(eBioscience，目錄號65-0865)染色，之後用1%固定緩衝液(BioLegend，目錄號420801)固定。Fc受體藉由20%人類血清及5 µL/100 µL人類TruStain FcX Fc受體阻斷血清(Human TruStain FcX Fc Receptor Blocking serum)(BioLegend，目錄號422301)阻斷，且用補充有1% BSA及0.1%皂素之PBS使細胞具滲透性。具滲透性之細胞隨後與GPR84抗體(Bioss，目錄號bs-15353R)及兔IgG同型對照(Bioss，目錄號bs-0295P-PE)一起在冰上培育1小時。在染色之後，細胞經洗滌兩次且在流式細胞儀(BD LSRFORTESSA；BD Bioscience)上採集。
流式細胞量測術分析展示相對於對照患者，子宮內膜異位患者中之巨噬細胞中之GPR84的較高表現水準(圖2)。
子宮內膜組織中之 MCFA 之測定 使用與質譜(GC/MS)偵測(Agilent 7890 GC/5975 MSD)耦接之氣相色譜以其對應甲酯衍生物形式測定正位(子宮內膜)及異位(病變)子宮內膜組織中之單獨游離中鏈脂肪酸(MCFA；癸酸及肉豆蔻酸)之含量。樣品用甲醇HCl溶液處理延長之時段以使游離脂肪酸完全轉化為其甲酯。記錄具有四種特徵離子之選擇性離子監測(Selected Ion Monitoring；SIM)模式中之層析圖以定量單獨的甲酯衍生物。與正位子宮內膜(對照)相比，子宮內膜病變(病變)中之癸酸及肉豆蔻酸含量較高。統計學分析；未配對t檢驗，顯著差異(P ＜ 0.05)。表 4 ： MCFA 之濃度
CFA 疼痛模型中之 CMPD139 之作用 在動態承重(dynamic weight-bearing；DWB)模型中在弗氏完全佐劑(CFA)之投藥之後(24 h)，在發炎腳掌中量測活體內CMPD139對發炎性疼痛之功效[10]。使用預防性環境研究在炎症之小鼠CFA模型中，在重複口服及皮下投藥(3次)之後，使用CMPD139之重複預防性治療對疼痛之作用。在注射CFA前2 h及在第0天後續6-8h投與GPR84拮抗劑CMPD139 (90或30 mg/kg，p.o.+s.c.，3次劑量)。在施用CFA 24 h之後，在DWB測試前2 h給予CMPD139之第三次劑量。用單因素方差分析進行統計分析，之後使用GraphPad PRISM軟體針對媒劑對照組進行Bonferroni多重比較測試，*p＜0.05。表 5 ：
參考文獻 在本說明書中參考以下文章。為實現本發明之目的，其內容以引用之方式併入本文中。 1. M. Hickey, K. Ballard, C. Farquhar, Endometriosis.BMJ 348 , g1752 (2014). 2. J. A. Sampson, Peritoneal endometriosis due to the menstrual dissemination of endometrial tissue into the peritoneal cavity.Am J Obstet Gynecol 14 , 422-469 (1927). 3. C. H. Syrop, J. Halme, Peritoneal fluid environment and infertility.Fertil Steril 48 , 1-9 (1987). 4. S. H. Ahn, S. P. Monsanto, C. Miller, S. S. Singh, R. Thomas, C. Tayade, Pathophysiology and Immune Dysfunction in Endometriosis.Biomed Res Int 2015 , 795976 (2015). 5. D. P. Braun, H. Gebel, R. House, N. Rana, N. P. Dmowski, Spontaneous and induced synthesis of cytokines by peripheral blood monocytes in patients with endometriosis.Fertil Steril 65 , 1125-1129 (1996). 6. H. N. Ho, M. Y. Wu, Y. S. Yang, Peritoneal cellular immunity and endometriosis.Am J Reprod Immunol 38 , 400-412 (1997). 7. J. Wieseler-Frank, S. F. Maier, L. R. 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SEQ ID NO 1 - G 蛋白偶聯受體 84
圖1：GPR84表現細胞及CD68表現細胞之偵測。圖1展示GPR84表現細胞及CD68表現細胞之顯微照片。抗GPR84-IgG及抗CD68-IgG分別用作初級抗體。 圖2：子宮內膜異位患者相對於對照之腹腔中之GPR84陽性細胞的測定。圖2展示流式細胞量測術研究之結果。為量測GPR84表現，來自腹膜流體細胞之單核細胞經解凍且隨後染色，之後固定。Fc受體經阻斷，使細胞具滲透性且與GPR84抗體一起在冰上培育1小時。在染色之後，細胞經洗滌且在流式細胞儀上獲取。使對照組(黑條)與子宮內膜異位組(灰條)比較且分析展示子宮內膜異位患者相比於對照患者之巨噬細胞中之GPR84的較高之表現水準。

Claims (18)

  1. 一種G蛋白偶聯受體84 (G protein-coupled receptor 84；GPR84)之拮抗劑或抑制劑，其用於治療及/或預防 患有子宮內膜異位， 處於罹患子宮內膜異位風險下，及/或 經診斷患有子宮內膜異位 之患者中之子宮內膜異位。
  2. 如請求項1之拮抗劑或抑制劑，其係特異性結合於GPR84之抗體，較佳係單株抗體，或係其抗原結合片段或衍生物。
  3. 如請求項1之拮抗劑或抑制劑，其係核酸抑制劑。
  4. 如請求項3之拮抗劑或抑制劑，其包含至少特異性結合於編碼GPR84蛋白之聚核苷酸之子序列段之核酸分子。
  5. 如請求項3或4之拮抗劑或抑制劑，其中該聚核苷酸編碼GPR84蛋白，該GPR84蛋白包含Uniprot中參考編號Q9NQS5所揭示之AA序列，較佳係根據SEQ ID NO: 1。
  6. 如請求項3之拮抗劑或抑制劑，其係適體。
  7. 如請求項1之拮抗劑或抑制劑，其係小分子。
  8. 如前述請求項中任一項之拮抗劑或抑制劑，其中受該抗體、該適體或該小分子抑制或拮抗之該GPR84蛋白包含Uniprot中參考編號Q9NQS5所揭示之AA序列，較佳係根據SEQ ID NO: 1。
  9. 如前述請求項中任一項之拮抗劑或抑制劑，其抑制 摁貝素所誘導GPR84活化作用，IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地9.4 nM或更小，及/或 2-OH癸酸所誘導GPR84活化作用，IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地16 nM或更小，及/或 6-正辛基胺基尿嘧啶所誘導GPR84活化作用，IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地20 nM或更小， 如GPR84 cAMP釋放分析中所測定。
  10. 如請求項1及請求項7至9中任一項之拮抗劑或抑制劑，其係選自包含以下清單之群組中的一者之成員： 二氫吡啶并異喹啉酮 二氫嘧啶并異喹啉酮。
  11. 如前述請求項中任一項之拮抗劑，其中該子宮內膜異位之特徵在於 相比於正位子宮內膜，在異位病變中出現中鏈游離脂肪酸(medium chain free fatty acids；MCFFA)及/或醯基-CoA硫酯酶(ACOT)及/或脂肪酸合成酶(FASN)；及/或 相比於取自對照患者之巨噬細胞，取自子宮內膜異位患者之巨噬細胞中GPR84表現增加；及/或 相比於取自對照患者之單核球及/或巨噬細胞，取自子宮內膜異位患者之單核球及/或巨噬細胞中GPR84陽性細胞之比例較高。
  12. 如前述請求項中任一項所使用之拮抗劑，其中該治療係治療子宮內膜異位相關之發炎性疼痛。
  13. 一種如前述請求項中任一項之拮抗劑或抑制劑(用於製造藥劑)的用途，其用於治療經診斷患有子宮內膜異位、患有子宮內膜異位或處於罹患子宮內膜異位風險下之人類或動物個體中或用於預防此類病狀。
  14. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至12中任一項之拮抗劑或抑制劑。
  15. 一種如請求項14之醫藥組合物與一或多種其他治療活性化合物之組合。
  16. 一種治療或預防與不期望之GPR84表現相關之子宮內膜異位之方法，其包含向有此需要之個體投與有效量的如請求項14之醫藥組合物或如請求項15之組合。
  17. 一種鑑別用於治療及/或預防患有子宮內膜異位、處於罹患子宮內膜異位風險下及/或經診斷患有子宮內膜異位之患者中之子宮內膜異位的化合物之方法，該方法包括在GPR84 cAMP釋放分析中，依據其是否抑制以下各者，來篩選一或多種測試化合物： 對摁貝素所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地9.4 nM或更小，及/或 對2-OH癸酸所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地16 nM或更小，及/或 對6-正辛基胺基尿嘧啶所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，較佳地10 µM或更小，更佳地20 nM或更小。
  18. 如請求項17之方法，其中若化合物抑制摁貝素所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，最佳地9.4 nM或更小，及/或對2-OH癸酸所誘導GPR84活化作用之IC50 值為5 mM或更小，最佳地16 nM或更小，則視為其適用於該治療及/或預防。
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Schröder‐Heurich et al. Downregulation of miR‐1270 mediates endothelial progenitor cell function in preeclampsia: Role for ATM in the Src/VE‐cadherin axis
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Li et al. miR-339-3p promotes AT1-AA-induced vascular inflammation by upregulating NFATc3 protein expression in vascular smooth muscle cells: miR-339-3p aggravates vascular inflammation
Tian et al. Antisense oligonucleotides targeting alternative splicing of Nrcam exon 10 suppress neurite outgrowth of ganglion sensory neurons in vitro