CN113866428A - 一种MxA和SAA在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂 - Google Patents
一种MxA和SAA在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113866428A CN113866428A CN202111208572.5A CN202111208572A CN113866428A CN 113866428 A CN113866428 A CN 113866428A CN 202111208572 A CN202111208572 A CN 202111208572A CN 113866428 A CN113866428 A CN 113866428A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mxa
- saa
- influenza
- diagnostic reagent
- diagnostic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 title claims abstract description 62
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 28
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 58
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 16
- 206010022004 Influenza like illness Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims abstract description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 12
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 11
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 10
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 claims description 10
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 239000012502 diagnostic product Substances 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 235000010378 sodium ascorbate Nutrition 0.000 claims description 7
- PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M sodium ascorbate Substances [Na+].OC[C@@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RKJRWTFHSA-M 0.000 claims description 7
- 229960005055 sodium ascorbate Drugs 0.000 claims description 7
- PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M sodium-L-ascorbate Chemical compound [Na+].OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1[O-] PPASLZSBLFJQEF-RXSVEWSESA-M 0.000 claims description 7
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 6
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- 239000000470 constituent Substances 0.000 claims description 3
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 3
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 3
- 239000008236 heating water Substances 0.000 claims description 3
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 claims description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 17
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 abstract description 12
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 2
- 208000010370 Adenoviridae Infections Diseases 0.000 abstract 1
- 206010060931 Adenovirus infection Diseases 0.000 abstract 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 abstract 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 abstract 1
- 206010061603 Respiratory syncytial virus infection Diseases 0.000 abstract 1
- 208000011589 adenoviridae infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 abstract 1
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 abstract 1
- 208000037798 influenza B Diseases 0.000 abstract 1
- 208000030925 respiratory syncytial virus infectious disease Diseases 0.000 abstract 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 7
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 7
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 7
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 241000712431 Influenza A virus Species 0.000 description 2
- 241000713196 Influenza B virus Species 0.000 description 2
- 241000713297 Influenza C virus Species 0.000 description 2
- 102000002227 Interferon Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010014726 Interferon Type I Proteins 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 206010000060 Abdominal distension Diseases 0.000 description 1
- 206010048998 Acute phase reaction Diseases 0.000 description 1
- 102000004201 Ceramidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000751 Ceramidases Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 102000006421 Myxovirus Resistance Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010083736 Myxovirus Resistance Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 102000054727 Serum Amyloid A Human genes 0.000 description 1
- 108700028909 Serum Amyloid A Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960003971 influenza vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000036558 skin tension Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂盒，采用免疫荧光法监测流感样症状患者包括甲或乙丙型流感、副流感病毒1、2、3及腺病毒、呼吸道合胞病毒感染。本试剂盒可以有效消除诊断中假阳结果，特异性和灵敏度高，操作简单，已经临床验证，适合临床进一步推广，不仅提高了儿童流感的诊断灵敏性，而且在检测MxA同时，检测了非特异性炎症因子SAA。该试剂盒具备了能区分细菌感染或者病毒感染的优势。
Description
技术领域
本发明属于医用生物诊断技术领域，尤其适用于MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感的二联检诊断试剂。
背景技术
流感是由于流感病毒所引起的一种常见的感染性疾病，由于流感病毒表面神经酰胺酶以及血凝素容易发生变异，即使接种了流感疫苗人群也可能发生新型流感病毒感染，目前儿童病毒性流感检查手段存在标本要求高、敏感度低以及监测时间长等问题，当实验室诊断结果未出报告时多根据患者症状、体征以及白细胞计数等参数参考是否存在病毒性流感，发生漏诊以及误诊的概率较高。因此寻求精准而简便的诊断指标对于是否为病毒性流感的诊断具有重要临床意义。
目前在常规诊断中缺少可用于诊断病毒感染的特异性生物学标志物，病毒感染过程中会发生分泌Ⅰ型干扰素(IFNs)的细胞反应，Ⅰ型IFNs参与天然免疫反应，具有免疫调节、抗细胞增殖和抗病毒的作用，尽管有时被用作病毒的生物学标志物，但Ⅰ型IFNs在体液中的半衰期较短，没有显示出良好的诊断效能。
目前在常规诊断中缺少可用于诊断病毒感染的特异性生物学标志物。病毒感染过程中会发生分泌Ⅰ型干扰素(IFNs)的细胞反应。Ⅰ型IFNs参与天然免疫反应，具有免疫调节、抗细胞增殖和抗病毒的作用。尽管有时被用作病毒的生物学标志物，但Ⅰ型IFNs在体液中的半衰期较短，没有显示出良好的诊断效能。Ⅰ型IFNs的抗病毒活性多来自一些蛋白质，通过产生黏病毒耐药蛋白A(MxA)进行介导。MxA在流感病毒感染中首次描述为抗病毒蛋白，随后发现其对多种RNA病毒及一些DNA病毒均具有广谱的抗病毒活性。MxA可以用作临床病毒感染的标志物。
血清淀粉样蛋白A(SAA) 是一种非特异性急性时相反应蛋白，其作为炎症标志物的临床价值近年来得到广泛关注。SAA 水平变化对于感染性疾病的早期诊断、危险评估、疗效观察及预后评价都具有重要临床价值。除了在细菌感染中升高外，SAA 在病毒感染中亦显著升高，根据其升高的程度或与其他指标联合运用，可以提示细菌性或病毒性感染，从而弥补了目前常用炎症标志物不能提示病毒感染的不足。
为此，我们提出一种新型MxA与SAA二联胶体金快速诊断试剂盒的制备方法以解决上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型MxA与SAA二联胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂的应用，所述儿童有流感样症状。
所述诊断试剂通过检测个体样品中的MxA和SAA含量，并与正常水平相比较，当个体样品中的MxA和SAA含量超过正常水平时，诊断为儿童病毒性流感。
一种诊断儿童个体是否属于病毒性流感的产品，所述儿童有流感样症状。该诊断产品中含有诊断试剂，该诊断试剂同时包含有MxA和SAA的结合抗体或结合抗体或片段，并通过该结合抗体或片段来与个体样品中的MxA和SAA相结合，以检测个体样品中的MxA和SAA含量而进行诊断。
一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂的应用、方法及产品，
所述诊断试剂通过其构成和（或）组分组成，使用诊断试剂或包含使用检测装置，采用的方法包括但不限于：胶体金法、电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法进行MxA和SAA的检测。
所述个体样品为取自个体的全血、血清、血浆或鼻拭子。
所述病毒性流感包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒导致的流感。
所述MxA的正常水平临界值为20ng/mL，SAA的正常水平临界值为10mg/L。
优选的，所述使用诊断试剂系一种用于甄别儿童病毒性流感和非流感的包含MxA和SAA二联检试纸条，所述二联检试纸条为胶体金检测试纸条，该试纸条所检测的样品中MxA的浓度大于等于20ng/mL时，MxA检测线显示阳性结果，其所检测的样品中SAA的浓度大于等于10mg/L时，SAA检测线显示阳性结果。
一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂的制备方法：
所述胶体金检测试纸条所使用的胶体金颗粒通过以下方法制备：水加热搅拌至沸腾，加入抗坏血酸钠和枸橼酸三钠继续加热至沸腾，再加入四氯金酸，继续加热反应后处理得到胶体金颗粒；
所述抗坏血酸钠的添加量为0.1 mol/L，所述枸橼酸三钠的添加量可选为0.5wt%，所述四氯金酸的添加量可选为1wt%，加入四氯金酸后，继续加热的时间优选为15分钟。
优选的，所述体金检测试纸条所使用的MxA单克隆抗体通过以下方法制备：(1) 通过离子交换色谱法纯化淋巴细胞中MxA混合物获得MxA抗原。（2）MxA抗原预处理，取适量抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注射器抽吸乳化成油包水状态免疫小鼠（3）三次免疫后，细胞融合以及亚克隆培养处理获得MxA单克隆抗体。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本试剂盒更适用于儿童流感诊断，试剂盒可以有效消除诊断中假阳结果，该试剂盒的特异性和灵敏度高，而且操作简单，适合临床进一步推广，不仅提高了儿童流感的诊断灵敏性，而且在检测MxA同时，检测了非特异性炎症因子SAA，该试剂盒又具备了能区分细菌感染或者病毒感染的优势，弥补了目前常用炎症标志物不能提示病毒感染的不足。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明中，一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂的应用， 所述诊断试剂通过检测个体样品中的MxA和SAA含量，并与正常水平相比较，当个体样品中的MxA和SAA含量超过正常水平时，诊断为儿童病毒性流感。
一种诊断儿童个体是否属于病毒性流感的产品，所述儿童有流感症状。该诊断产品中含有诊断试剂，该诊断试剂同时包含有MxA和SAA的结合抗体或结合抗体或片段，并通过该结合抗体或片段来与个体样品中的MxA和SAA相结合，以检测个体样品中的MxA和SAA含量而进行诊断。
一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂的应用、方法及产品：
所述诊断试剂通过其构成和（或）组分组成，使用诊断试剂或包含使用检测装置，采用的方法包括但不限于：胶体金法、电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法进行MxA和SAA的检测，优选胶体金法；
所述个体样品为取自个体的全血、血清、血浆或鼻拭子；
所述病毒性流感包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒导致的流感；
所述MxA的正常水平临界值为20ng/mL，SAA的正常水平临界值为10mg/L；
优选的，所述使用诊断试剂系一种用于甄别儿童病毒性流感和非流感的包含MxA和SAA二联检试纸条，所述二联检试纸条为胶体金检测试纸条，该试纸条所检测的样品中MxA的浓度大于等于20ng/mL时，MxA检测线显示阳性结果，其所检测的样品中SAA的浓度大于等于10mg/L时，SAA检测线显示阳性结果。
一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂的制备方法：
所述胶体金检测试纸条所使用的胶体金颗粒通过以下方法制备：水加热搅拌至沸腾，加入抗坏血酸钠和枸橼酸三钠继续加热至沸腾，再加入四氯金酸，继续加热反应后处理得到胶体金颗粒；
所述抗坏血酸钠的添加量为0.1 mol/L，所述枸橼酸三钠的添加量可选为0.5wt%，所述四氯金酸的添加量可选为1wt%，加入四氯金酸后，继续加热的时间优选为15分钟；
优选的，所述体金检测试纸条所使用的MxA单克隆抗体通过以下方法制备：(1) 通过离子交换色谱法纯化淋巴细胞中MxA混合物获得MxA抗原。（2）MxA抗原预处理，取适量抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注射器抽吸乳化成油包水状态免疫小鼠（3）三次免疫后，细胞融合以及亚克隆培养处理获得MxA单克隆抗体。
实施例2
本发明中，一种新型MxA与SAA二联胶体金快速诊断试剂盒的制备方法，包括MxA的纯化、MxA单克隆抗体的制备以及MxA/SAA，MxA，SAA与CRP快速检测试剂盒开发。
一、MxA的纯化
按照实验室的操作流程，通过离子交换色谱法纯化淋巴细胞提取的MxA和MXB混合物，我们使用的是Amersham Biosciences公司的Pharmacia MonoQ5/50离子交换柱，洗脱液梯度为0.15到0.3mol/L NaCl以及50 mmol/L sodium acetate。纯化的MxA进一步确认通过串联质谱测序以及western-blot验证。
二、MxA单克隆抗体的制备
抗原预处理，取适量抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注射器抽吸乳化成油包水状态即可免疫小鼠；
免疫处理，首免之后一周进行二免，用不完全佐剂代替完全佐剂，其余同上；第三次免疫：二免之后两周进行三免，用不完全佐剂代替完全佐剂，其余同上；加强免疫；
小鼠血清效价检测，小鼠三免后一周，小鼠经断尾采血分离血清，采用间接 ELISA法测定血清效价，选择血清效价大于10000 的小鼠用于细胞融合；
第一次细胞融合，骨髓瘤细胞制备。从液氮罐中取出 SP2/0 细胞冻存管，迅速解冻。1200r，2min离心，弃上清，用完全培养液 10ml重悬 SP2/0 细胞，并加入细胞培养皿中，置于37℃，5%的 CO2培养箱中培养；
免疫脾细胞制备，融合当天，取加强免疫小鼠摘除眼球取血，离心，取上清做阳性对照；颈椎脱臼法处死后浸泡于75%的酒精中5min；转至超净工作台，无菌取出脾脏，置于200目铜网上研磨，制备脾细胞悬液并收集于50ml离心管内；1200rpm，离心5min，弃上清，重悬于DMEM中，放于37℃培养箱备用；
第二次细胞融合，将脾细胞与骨髓瘤细胞按比例混合于50ml离心管中，将细胞悬浮液加于铺有饲养层细胞的96 孔细胞培养板，每孔100ul，置 37℃，5% CO2培养箱内培养；
阳性杂交瘤细胞克隆化，因在筛选中得到的阳性孔可能含有多个杂交瘤克隆,因此孔中含有的不是单克隆抗体，为了得到由同一杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进行亚克隆；
腹水制备，腹水采集，对腹部明显膨大，以手触摸时皮肤有紧张感的小鼠，即可用12号针头采集腹水，针头刺入腹腔后，一般即有腹水喷出，若没有腹水流出，可轻旋针头，操作时要有耐心，一般可连续采集3-4次，通常每只小鼠可采3-5ml腹水，将腹水离心（2000rpm离心5min），吸去最上层的脂肪组织，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，将上清冻存于-20℃冰箱。
三、MxA/SAA，MxA，SAA，以及CRP快速检测试剂盒开发
抗体筛选处理，将制备的抗体按照MxA/SAA的工艺要求分别包被和标记，然后将包被和标记的抗体两两配对检测一定浓度的抗原溶液和空白，检测抗原溶液产生阳性信号与空白溶液信号比值最大即为最优的配对抗体，SAA以及CRP抗体配对购买自菲鹏生物工程公司，按照各自的工艺要求进行包被和标记；
胶体金标记工艺优化，调整抗体的用量，调整各个步骤中反应时间，调整样品垫，结合物垫，复溶液的成分，最终筛选出最优的标记参数，工艺进一步优化了胶体金反应条件，生产的金颗粒稳定、均一、批间差小，反应物的添加顺序很重要，如果少量柠檬酸三钠加入到大量氯金酸中，需要很长时间柠檬酸三纳才能分散均一，其间反应器中将出现浓度明显高低不等的小区域，这种情况将使得反应速率不一，进而导致晶核形成速度不一，因此，胶体金的质量就差，相反，如果氯金酸快速加入到柠檬酸三钠溶液中，形成浓度不均小区域的机率就很小，工艺中按照如下描述的上样顺序进行反应：超纯水搅拌至沸腾，先加入0.1%总体积抗坏血酸钠及0.5%枸橼酸三钠，继续加热至沸腾，再加入1%总体积四氯金酸，继续加热15分钟，另外反应物浓度低，则产率低，因此，要实现高产率，就要提高反应物浓度，但是反应物浓度过高，往往可能出现目标产物产率不够而副产物大量产生的现象。反应物浓度不够会使得金颗粒大小不对或形状不规则，我们采用的金颗粒制备方法中反应物浓度为最优化，制备出的金颗粒稳定、均一，胶体一旦形成，无论再延长反应时间，金的粒径都不再变化；
包被工艺优化，调整包被浓度，调整包被液成分，调整烘干条件，最终筛选出最优的包被参数；
试剂盒性能指标调试，通过调整工艺，使试剂盒的灵敏度特异性，阳性符合率，阴性符合率等符合要求；
批量试生产，对工艺进行放大，试产三批试剂盒；
通过测试156例健康儿童，获得MxA， SAA， CRP正常值参考区间。其中MxA cutoff值为20ng/ml，SAA cutoff值为10mg/l，CRP cutoff值为10mg/l。
表一MxA（cutoff 20ng/ml)用于诊断流感
表二 CRP（cutoff 10mg/l) 用于诊断流感
表三 SAA（cutoff 10mg/l)用于诊断流感
表四 MxA/SAA二联用于诊断流感
值得说明的是：从实验结果可以看出，CRP无法区分正常儿童与流感儿童，MxA以及SAA可以用于诊断流感，但是单独使用，均出现漏诊，MxA/SAA二联用于诊断流感效果最佳。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (12)
1.一种MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感和非流感的诊断试剂中的应用；所述儿童个体有流感样症状；所述诊断试剂通过检测个体样品中的MxA和SAA含量，并与正常水平相比较，当个体样品中的MxA和SAA含量超过正常水平时，诊断为儿童病毒性流感。
2.MxA和SAA或其结合抗体或片段在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂中的应用，或MxA和SAA作为联合生物标志物在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂中的应用，所述诊断试剂通过检测个体样品中的MxA和SAA的含量，并与正常水平进行比较，以诊断儿童病毒性流感。
3.一种诊断儿童个体是否属于病毒性流感、或是否由病毒引发的流感的方法，所述方法包括使用诊断试剂或使用包含检测装置并使用诊断试剂以检测个体样品中MxA和SAA含量的步骤。
4.一种判断儿童个体是否属于病毒性流感或由病毒引发的流感，或是否患有病毒性流感的二联检诊断产品，该诊断产品中含有诊断试剂，该诊断试剂同时包含有MxA和SAA的结合抗体或结合抗体或片段，并通过该结合抗体或片段来与个体样品中的MxA和SAA相结合，以检测个体样品中的MxA和SAA含量而进行诊断。
5.根据权利要求1-2所述的应用、或权利要求3所述的方法、或权利要求4所述的诊断产品，特征在于，所述诊断试剂通过其构成和（或）组分组成，使用诊断试剂或包含使用检测装置，采用的方法包括但不限于：胶体金法、电泳法、免疫荧光法、直接竞争法、间接竞争法、ELISA法、RIA法、流式细胞仪法或免疫层析法进行MxA和SAA的检测，优选胶体金法。
6.根据权利要求1-2所述的应用、或权利要求3所述的方法、或权利要求4所述的诊断产品，所述个体样品为取自个体的全血、血清、血浆或鼻拭子。
7.根据权利要求1-2所述的应用、权利要求3所述的方法、或权利要求4所述的产品，所述病毒性流感包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒导致的流感。
8.根据权利要求1-2所述的应用、权利要求3所述的方法、或权利要求4所述的产品，MxA的正常水平临界值为20ng/mL，SAA的正常水平临界值为10mg/L。
9.根据权利要求1-2所述的应用、或权利要求3所述的方法、或权利要求4所述的诊断产品，或权利要求8所述的正常水平临界值，所述使用诊断试剂系一种用于甄别儿童病毒性流感和非流感的包含MxA和SAA二联检试纸条，所述二联检试纸条为胶体金检测试纸条；该试纸条所检测的样品中MxA的浓度大于等于20ng/mL时，MxA检测线显示阳性结果，其所检测的样品中SAA的浓度大于等于10mg/L时，SAA检测线显示阳性结果。
10.权利要求5或6所述MxA和SAA检测产品的制备方法，所述胶体金检测试纸条所使用的胶体金颗粒通过以下方法制备：水加热搅拌至沸腾，加入抗坏血酸钠和枸橼酸三钠继续加热至沸腾，再加入四氯金酸，继续加热反应后处理得到胶体金颗粒。
11.如权利要求10所述的制备方法，所述抗坏血酸钠的添加量为0.1 mol/L，所述枸橼酸三钠的添加量可选为0.5wt%，所述四氯金酸的添加量可选为1wt%；加入四氯金酸后，继续加热的时间优选为15分钟。
12.如权利要求8所述的制备方法，所述胶体金检测试纸条所使用的MxA单克隆抗体通过以下方法制备：
（1）通过离子交换色谱法纯化淋巴细胞中MxA混合物获得MxA抗原；
（2）MxA抗原预处理，取适量抗原与等体积弗式完全佐剂混合，用注射器抽吸乳化成油包水状态免疫小鼠（3）三次免疫后，细胞融合以及亚克隆培养处理获得MxA单克隆抗体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111208572.5A CN113866428B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种MxA和SAA在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111208572.5A CN113866428B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种MxA和SAA在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113866428A true CN113866428A (zh) | 2021-12-31 |
| CN113866428B CN113866428B (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=78999890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111208572.5A Active CN113866428B (zh) | 2021-10-18 | 2021-10-18 | 一种MxA和SAA在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113866428B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114805586A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-29 | 天津华科泰生物技术有限公司 | 抗MxA单克隆抗体组合物及其应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111624345A (zh) * | 2014-12-11 | 2020-09-04 | 米密德诊断学有限公司 | 用于诊断多种感染的标记组合及其使用方法 |
| CN111892653A (zh) * | 2019-07-03 | 2020-11-06 | 长春恒晓生物科技有限责任公司 | 制备粘病毒抗性蛋白1抗体及建立检测mx1方法 |
| CN111965347A (zh) * | 2019-05-19 | 2020-11-20 | 王哲 | 基于流体控制的侧向层析检测装置和试剂盒 |
| CN112326962A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-02-05 | 山西康健恩生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法 |
-
2021
- 2021-10-18 CN CN202111208572.5A patent/CN113866428B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111624345A (zh) * | 2014-12-11 | 2020-09-04 | 米密德诊断学有限公司 | 用于诊断多种感染的标记组合及其使用方法 |
| CN111965347A (zh) * | 2019-05-19 | 2020-11-20 | 王哲 | 基于流体控制的侧向层析检测装置和试剂盒 |
| CN111892653A (zh) * | 2019-07-03 | 2020-11-06 | 长春恒晓生物科技有限责任公司 | 制备粘病毒抗性蛋白1抗体及建立检测mx1方法 |
| CN112326962A (zh) * | 2020-11-03 | 2021-02-05 | 山西康健恩生物科技有限公司 | 一种新型冠状病毒抗原胶体金快速诊断试剂盒及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ALMUT H. VOLLMER等: "Serum amyloid A (SAA) is an early biomarker of influenza virus disease in BALB/c,C57BL/2, Swiss-Webster, and DBA.2 mice", ANTIVIRAL RESEARCH * |
| MOTOKAZU NAKABAYASHI等: "MxA-Based Recognition of Viral Illness in Febrile Children by a Whole Blood Assay", PEDIATRIC RESEARCH * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114805586A (zh) * | 2022-04-14 | 2022-07-29 | 天津华科泰生物技术有限公司 | 抗MxA单克隆抗体组合物及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113866428B (zh) | 2023-07-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111925436B (zh) | 非洲猪瘟病毒p30蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN113912710B (zh) | 抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体及其应用 | |
| CN105675873B (zh) | 一种检测试剂盒及其应用 | |
| CN113866428B (zh) | 一种MxA和SAA在制备甄别儿童病毒性流感的诊断试剂 | |
| CN111999496A (zh) | 一种SARS-CoV-2抗原抗体联合检测的试剂盒及其制备方法 | |
| CN102183653A (zh) | 一种微小隐孢子虫免疫胶体金检测试纸条及其制备方法 | |
| CN106771181A (zh) | 一种禽流感h7n9血凝素ha抗原检测 elisa 试剂盒及检测方法 | |
| CN113092755A (zh) | 一种夹心法检测布鲁氏菌抗原的胶体金检测试纸条 | |
| CN111044728B (zh) | 用于快速检测腺病毒的IgM抗体胶体金试纸条及其制备方法 | |
| CN109580945B (zh) | 检测口蹄疫o型广西株抗原的酶联免疫试剂盒及其应用 | |
| CN109111507B (zh) | 病毒重组糖蛋白及其真核细胞高效表达方法与应用 | |
| CN103499685A (zh) | 人泌尿系统病原菌感染临床诊断的免疫荧光诊断试剂及其制备和应用方法 | |
| CN116925218A (zh) | 小热休克蛋白hspb1的抗体、抗体组合物、杂交瘤细胞株及其应用 | |
| JP2007145775A (ja) | ノロウイルスｇｉの高感度検出方法 | |
| CN1557838A (zh) | Sars冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤和含此抗体的检测试剂及其用途 | |
| CN111187349A (zh) | 单克隆抗体的制备方法 | |
| CN104749371B (zh) | 人肾母细胞瘤过度表达基因编码蛋白酶联免疫试剂盒 | |
| CN110726837A (zh) | 用于片形吸虫病诊断的elisa检测试剂盒及其应用 | |
| CN115166239A (zh) | 牛布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 | |
| CN110824163A (zh) | 一种同时检测鹿布病和结核病胶体金试纸条及试剂卡 | |
| CN114295829B (zh) | 新型冠状病毒抗原和总抗体联合检测试剂盒及检测方法 | |
| CN115838421A (zh) | 靶向乙型流感病毒核蛋白的抗体及其应用 | |
| CN115166238A (zh) | 羊布鲁氏菌病初筛和确诊一体化抗体检测试纸条 | |
| Wei et al. | Establishment and application of a gold nanoparticle-based immunochromatographic test strip for the detection of avian leukosis virus P27 antigen in egg white samples | |
| CN110981969A (zh) | 一种alv-k的elisa试剂盒及其检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Liu Chaofeng Inventor after: Yang Diexuan Inventor before: Yang Diexuan |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information |