CN113481204A - 一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用 - Google Patents

一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体为特异性结合NTRK1蛋白的核酸适配体。优选所述核酸适配体的序列包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中的至少一种。本发明提供的核酸适配体或其截断核酸适配体、核酸适配体衍生物可以高度特异性结合NTRK1蛋白，是一种新型的靶向小分子，与抗体相比具有分子量小、灵敏度高、稳定性好、易于合成与改造等优点，本发明通过磁珠SELEX技术筛选出第一个可与NTRK1蛋白结合的核酸适配体，为人类慢性疼痛的治疗提供一种新型的潜在靶向药物。

Description

一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学与分析化学领域，尤其涉及一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用。
背景技术
慢性疼痛是指持续一个月以上的疼痛，也有人把慢性疼痛比喻为一种不死的癌症，目前，中国至少有一亿以上的慢性疼痛患者。NTRK1基因属于神经生长因子受体家族，编码单个跨膜受体酪氨酸激酶蛋白TrkA。神经生长因子(NGF)是它主要的高亲和力配体，TrkA与二聚体NGF配体结合后二聚，自身磷酸化并激活下游信号传导，从而调节细胞分化和存活。TrkA在各种组织和器官中都有表达，例如周围神经系统，中枢神经系统，消化道，肾上腺皮质等。NGF-TrkA途径信号传导诱导伤害感受器致敏被认为是慢性疼痛的关键机制。目前NGF/TrkA抑制剂大致分为三类：(1)药物捕获NGF；(2)抑制NGF和TrkA结合的药物；(3)直接抑制TrkA酶活性的药物。虽然已经报道了多种TrkA激酶抑制剂对疼痛状况的临床前评估，但很少有关于NGF/TrkA抑制剂用于疼痛相关疾病的临床经验的报道，然而靶向该途径的药物治疗仍然是治疗慢性疼痛病症的一种有前景的策略。
核酸适配体是单链核酸分子(ssDNA或RNA)，可以形成一定的三维结构识别特定的靶标。核酸适配体，也被称为“化学抗体”，具有较高的特异性和亲和力，与传统抗体相比，它具有分子量小，空间限制少，结合表位多；易于合成，成本低，批次间差异小；免疫原性低；易于修饰和编辑等优势，通常是在体外利用指数富集的配体系统进化技术(Systematicevolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体已被广泛应用于各个领域，包括体外诊断、生物传感技术、生物标志物的检测和分析，用作治疗性药物或形成适配体-药物结合物。
治疗性适配体可用作激动剂、拮抗剂和抑制剂或用作靶向载体，临床试验中的许多核酸适配体是拮抗的或抑制性的。目前国内外未见有关于NTRK1蛋白核酸适配体的报道。
发明内容
本发明拟申请NTRK1蛋白的首个核酸适配体，以期通过核算适配体作为拮抗剂来阻断TrkA受体蛋白与NGF的结合，为治疗慢性疼痛提供新的思路。
因此，本发明首先提供一种蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体为特异性结合NTRK1蛋白的核酸适配体。
在一种具体的实施方式中，所述核酸适配体通过文库反筛、文库正筛、单链文库制备、荧光定量PCR监测各轮筛选文库富集程度、多轮筛选及高通量测序中的一个或多个步骤制备得到。
在一种具体的实施方式中，所述核酸适配体包括10～200个核苷酸，优选包括30～80个核苷酸。
在一种具体的实施方式中，所述核酸适配体的序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：
1)如SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列；
SEQ ID No.1为：
5'-CGCATAGCAGTGGTCAAGGGTCTCTTTCGTTACAGAAAAGTCTGCCTATGCG-3'，
SEQ ID No.2为：
5'-CGCATAGCTTTTCGGGGGCCTGCTCGGGATTGCGGATACGATGCCCTATGCG-3'，
2)与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；
3)将SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列删除、增加或替换一个或多个碱基，所得的具有相同或类似功能的DNA序列；
4)由SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列。
本发明还提供如上任意一项所述核酸适配体的衍生物，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列进行包括氨基化、磷酸化、羧基化、硫代修饰、巯基修饰、2-甲氧基修饰、3'端倒置dT/dG修饰、甲基/去甲基化、或同位素化的修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的衍生物。
本发明还提供如上任意一项所述核酸适配体的衍生物，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列连接信号分子或活性分子或功能基团而得到具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
在一种具体的实施方式中，所述信号分子或活性分子或功能基团包括荧光或淬灭基团、放射性物质、治疗性物质、蛋白、抗体、siRNA、纳米发光材料、生物素、地高辛和胆固醇中的一种或多种。
本发明还提供如上任意一项所述核酸适配体的衍生物，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列改造的肽核酸。
本发明还提供如上任意一项所述核酸适配体或任意一项所述核酸适配体的衍生物的应用，所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在特异性识别NTRK1蛋白或检测NTRK1蛋白中的应用，或者所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测NTRK1蛋白的试剂盒或检测NTRK1蛋白的分子探针中的应用。
本发明还提供如上任意一项所述核酸适配体或任意一项所述核酸适配体的衍生物的应用，所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在治疗或辅助治疗慢性疼痛中的应用。
具体地，本发明采用磁珠SELEX筛选方法，经过六轮筛选得到特异性结合NTRK1蛋白的核酸适配体，将其分别命名为Apt-TRK-1和Apt-TRK-2，并通过两种经济适用的检测方法：酶联核酸适体吸附法(ELASA)和磁珠荧光定量PCR法测得筛到的核酸适配体与NTRK1蛋白的亲和力常数KD，均达到nM级别。
Apt-TRK-1的序列如SEQ ID No.1所示，其序列为：
SEQ ID No.1：
5'-CGCATAGCAGTGGTCAAGGGTCTCTTTCGTTACAGAAAAGTCTGCCTATGCG-3'，
Apt-TRK-2的序列如SEQ ID No.2所示，其序列为：
SEQ ID No.2：
5'-CGCATAGCTTTTCGGGGGCCTGCTCGGGATTGCGGATACGATGCCCTATGCG-3'。
本发明提供的核酸适配体或其截断核酸适配体、核酸适配体衍生物可以高度特异性结合NTRK1蛋白，是一种新型的靶向小分子，与抗体相比具有分子量小、灵敏度高、稳定性好、易于合成与改造等优点，本发明通过磁珠SELEX技术筛选出第一个可与NTRK1蛋白结合的核酸适配体，为人类慢性疼痛的治疗提供一种新型的潜在靶向药物。
附图说明
图1为磁珠SELEX筛选中核酸适配体富集情况的荧光定量PCR实验结果。
图2为本发明核酸适配体Apt-TRK-1和Apt-TRK-2的二级结构预测图，其中图2A和图2B分别为Apt-TRK-1和Apt-TRK-2的二级结构预测图。
图3为核酸适配体Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白结合情况的斑点印记(DotBlot)实验图。
图4为ELASA法分别测定核酸适配体Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白结合的KD值，其中图4A和图4B分别为Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白结合的KD值。
图5为荧光定量PCR法分别测定核酸适配体Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白结合的KD值，其中图5A和图5B分别为Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白结合的KD值。
图6为流式细胞术检测Apt-TRK-2与NTRK1阳性细胞的特异性结合情况，其中空白组为未处理的细胞组。
具体实施方式
以下提供具体实施例以详细的阐述本发明技术方案，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下进行的类似替换和改进，这些改动也被视为本发明的保护范围。
以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；实施例中所用的材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可从市场上购买。
下述实施例中的实验材料来源如下：蛋白筛选试剂盒(主要包括：初始文库序列：5'-TTCAGCACTCCACGCATAGC-N(36)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'、羧基磁珠、荧光定量PCRMix、普通PCR Mix、ePCR微液滴生成油、微量核酸透析膜等等)购自昂普拓迈生物科技有限公司，NTRK1蛋白购自北京义翘神州生物技术有限公司，His蛋白购自上海生工生物工程有限公司，硝酸纤维素膜NC膜购自PALL，HRP-Streptavidin、TMB显色液、TMB显色终止液购自上海碧云天生物技术有限公司，ECL发光试剂盒购自Affinity Biosciences，乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)购自Sigma-Aldrich。
实施例1：NTRK1特异性核酸适配体的筛选
1、文库反筛
1.1取25ug His蛋白与50ul经0.4M EDC和0.1M NHS活化的羧基磁珠室温孵育60min，使其偶联至羧基磁珠上；加入100ul 1M乙醇胺，室温摇床孵育10min，淬灭未反应的活化羧酸基团，磁力架吸附磁珠，去上清，用适量DPBS清洗3遍，待用。
1.2将1OD(约1.4nmol)的初始文库溶于280ul DPBS中，95℃加热10min，冰水中冷却5min，再置于室温5min后，加入1.1制备好的His蛋白偶联磁珠中，室温孵育1h，磁力架吸附磁珠，收集上清记为NTRK1-pool-1。
1.3用适量DPBS清洗磁珠4遍，向磁珠中加入200ul DPBS重悬，沸水浴煮10min，收集上清记为Elution-NTRK1。
2、文库正筛
2.1取20ug NTRK1蛋白与50ul经EDC和NHS活化的羧基磁珠室温孵育60min，使其偶联至羧基磁珠上；加入100ul 1M乙醇胺，室温摇床孵育10min，磁力架吸附磁珠，去上清，用适量DPBS清洗3遍，待用。
2.2将1.2中收集的上清液NTRK1-pool-1加入2.1制备好的NTRK1蛋白偶联磁珠中，室温孵育1h，用适量DPBS清洗磁珠4遍，向磁珠中加入200ul DPBS重悬，沸水浴10min，磁力架吸附磁珠，收集上清记为Elution+NTRK1。
3、单链文库(ssDNA)制备
3.1将2.2收集的Elution+NTRK1与2ml PCR mix混匀，再加入8mL ePCR微液滴生成油，通过乳液PCR进行扩增，PCR扩增的引物序列如下：上游引物序列：5'-FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC-3'；下游引物序列：5'-A(20)-spacer18-TTCACGGTAGCACGCATAGG-3'，扩增后的产物加入2倍体积正丁醇，7500g离心10分钟，吸除上层的清澈液体，收集下层浓缩的PCR产物。
3.2将收集的乳液PCR产物经12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FAM标记的ssDNA，通过蓝光透射仪切胶回收ssDNA，并将回收的ssDNA用3.5KD的微量核酸透析膜于4℃透析过夜得到次级文库。
4、荧光定量PCR监测各轮筛选文库富集程度
4.1取0.2mL PCR八联管，每孔加入28ul荧光定量PCR Mix，再分别加入2ulElution-NTRK1和Elution+NTRK1，进行荧光定量PCR检测，反应程序如下：95℃2min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，30个循环。
4.2根据每轮荧光定量PCR的循环数和标准曲线可以得到每轮正筛和反筛结合的ssDNA摩尔数，再分别计算其与投入的文库摩尔数即得正筛和反筛的文库富集率。
5、多轮筛选及高通量测序
5.1重复1.1-3.2的筛选步骤，每次筛选均以上一轮3.2得到的次级文库作为初始文库，并在筛选过程中逐渐降低投入的ssDNA量、缩短文库与靶蛋白的孵育时间来增加筛选压力。
5.2经过6轮筛选，荧光定量PCR结果显示第5轮的ssDNA文库已明显富集，远高于第4轮和第6轮(如图1所示)，故将第2、4、5、6轮的ssDNA进行PCR扩增，扩增产物纯化后送上海生工生物进行高通量测序，通过对测序结果的丰度、同源性分析、二级结构预测以及序列优化，最终确定了2条DNA序列与NTRK1蛋白具有较高的亲和力，分别命名为：Apt-TRK-1和Apt-TRK-2。
Apt-TRK-1的序列如SEQ ID No.1所示，其二级结构示意图如图2A所示。
SEQ ID No.1：
5'-CGCATAGCAGTGGTCAAGGGTCTCTTTCGTTACAGAAAAGTCTGCCTATGCG-3'；
Apt-TRK-2的序列如SEQ ID No.2所示，其二级结构示意图如图2B所示。
SEQ ID No.2：
5'-CGCATAGCTTTTCGGGGGCCTGCTCGGGATTGCGGATACGATGCCCTATGCG-3'。
实施例2：斑点印记实验(Dot Blot)检测Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白结合情况
斑点印记实验采用Smart Blotter真空转印仪(Wealtec，Smart Blotter SB-10)来进行实验操作，预切好滤纸和硝酸纤维素膜(NC膜)，将NC膜用转印缓冲液浸润后放在滤纸上，再把NC膜和滤纸放在支撑板上，并确保上面没有气泡，轻轻合上顶盖，同时插入并关闭两侧的翻转挡块，再把Smart Blotter系统组装到吸气泵上，将1ug NTRK1蛋白分次点样到加样孔内，用等量的BSA作为对照蛋白，打开吸气泵抽气，等待所有蛋白溶液通过膜，5min后关闭吸气泵，取出膜，用3％BSA加0.1％Tween-20室温封闭1h，PBST洗3次，将500nM生物素修饰的Apt-TRK-1和Apt-TRK-2以及生物素修饰的随机文库序列95℃变复性后与膜上蛋白室温孵育2h，PBST洗3次，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(HRP-Streptavidin)室温孵育30min，PBST洗3次，加入ECL发光液，通过化学发光成像仪拍照。结果如图3所示，Apt-TRK-1和Apt-TRK-2均与NTRK1蛋白有明显结合而不与BSA对照蛋白结合，对照随机文库与NTRK1蛋白和BSA蛋白都不结合，Dot Blot实验说明Apt-TRK-1和Apt-TRK-2均可与NTRK1蛋白特异性结合。
实施例3：Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白亲和力的测定
为了检测筛选的核酸适配体与NTRK1蛋白的亲和力，我们分别使用酶联核酸适体吸附法(ELASA)和磁珠荧光定量PCR法来测定其平和解离常数KD。
1.ELASA测定Apt-TRK-1和Apt-TRK-2的结合亲和力
在96孔酶标板中，每孔加入100ng NTRK1蛋白，4℃温和旋转包被过夜，吸弃上清液，PBST洗3次，用3％BSA+100ug/mL鲑鱼精DNA封闭2h，吸除封闭液，PBST洗3次，加入不同浓度(500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.2nM、15.6nM、7.8nM、3.9nM)95℃变复性的生物素标记Apt-NTRK1-1和Apt-NTRK1-2，每孔重复3次，同时加入PBS作为空白对照，室温孵育1h，吸弃上清液，PBST洗4次，每孔加入100ul HRP-Streptavidin(1：5000)，轻轻摇晃15分钟，吸除酶偶联溶液，PBST洗3次，每孔加100μL恢复至室温的TMB显色液，轻轻摇晃3-10分钟，每孔加入100μL TMB显色终止液，酶标仪测量450nm处的吸光度。根据测定的吸光值，通过GraphPadPrism software 8.0进行曲线拟合，用公式Y＝Bmax*X/(Kd+X)进行Kd值的计算。如图4所示，Apt-TRK-1与NTRK1蛋白的结合值KD为20.9±4.4nM，Apt-TRK-2与NTRK1蛋白的结合KD值为15.9±0.3nM，均在纳摩尔级别，表明Apt-TRK-1和Apt-TRK-2与NTRK1蛋白具有较高的亲和力。
2.磁珠定量PCR测定Apt-TRK-1和Apt-TRK-2的结合亲和力
取750nM NTRK1蛋白与10ul经0.4M EDC和0.1M NHS活化的羧基磁珠室温孵育60min，使其偶联至羧基磁珠上，磁力架吸附磁珠，用适量DPBS清洗磁珠4遍，分别加入150ul不同浓度(250nM、125nM、62.5nM、31.2nM、15.6nM、7.8nM、3.9nM)95℃变复性的Apt-NTRK1-1和Apt-NTRK1-2，室温孵育1h，用适量DPBS清洗4遍，向磁珠中加入100ul DPBS沸水浴10min，磁力架吸附磁珠，收集上清，通过定量PCR测定不同浓度核酸适配体结合的摩尔数，Kd值的计算方法同上述ELASA法。如图5所示，Apt-TRK-1与NTRK1蛋白的结合值KD为44.46±5.98nM，Apt-TRK-2与NTRK1蛋白的结合KD值为30.71±1.86nM，与ELASA法测定的结果相差不大，都在纳摩尔级别。
实施例4：Apt-TRK-2与表达NTRK1蛋白的细胞亲和力测定
通过流式细胞术验证NTRK1阳性细胞与Apt-TRK-2的结合能力，我们选择NTRK1阳性细胞U87(人神经胶质瘤细胞)和NTRK1阴性细胞L-O2(人正常肝细胞)作为实验细胞。将两组细胞传代至6孔板，待细胞贴壁且密度达到80％左右，胰酶消化细胞，用适量PBS清洗3次，分别加入500nM FAM标记的Apt-NTRK1-2结合缓冲液DPBS，以FAM标记的随机文库作为对照组，4℃避光孵育30min，1000rpm离心5min，去除上清，用适量PBS清洗3次，加入400μL DPBS重悬后进行流式细胞仪(Beckman Coulter，CytoFLEX)分析。结果如图6所示，NTRK1阳性细胞U87加入FAM标记的Apt-NTRK1-2后平均荧光强度明显高于其他组，而NTRK1阴性细胞L-O2则无明显变化。
以上所述实施例仅为本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内，根据本发明的技术方案及发明构思进行的等同替换或修改，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>湖南赛奥维生物技术有限公司
<120>一种蛋白的核酸适配体、其衍生物及其应用
<130> 2021
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
CGCATAGCAGTGGTCAAGGGTCTCTTTCGTTACAGAAAAGTCTGCCTATGCG 52
<210> 2
<211> 52
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
CGCATAGCTTTTCGGGGGCCTGCTCGGGATTGCGGATACGATGCCCTATGCG 52

Claims (10)

1.一种蛋白的核酸适配体，所述核酸适配体为特异性结合NTRK1蛋白的核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体通过磁珠SELEX技术筛选得到，优选所述核酸适配体通过文库反筛、文库正筛、单链文库制备、荧光定量PCR监测各轮筛选文库富集程度、多轮筛选及高通量测序中的一个或多个步骤制备得到。
3.根据权利要求1所述的蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体包括10～200个核苷酸，优选包括30～80个核苷酸。
4.根据权利要求1所述的蛋白的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列包含以下核苷酸序列中的至少一种：
1)如SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列；
SEQ ID No.1为：
5'-CGCATAGCAGTGGTCAAGGGTCTCTTTCGTTACAGAAAAGTCTGCCTATGCG-3'，
SEQ ID No.2为：
5'-CGCATAGCTTTTCGGGGGCCTGCTCGGGATTGCGGATACGATGCCCTATGCG-3'，
2)与SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列具有60％以上同源性的DNA序列；
3)将SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列删除、增加或替换一个或多个碱基，所得的具有相同或类似功能的DNA序列；
4)由SEQ ID No.1-2所示的任意一个DNA序列转录的RNA序列。
5.一种如权利要求1～4中任意一项所述核酸适配体的衍生物，其特征在于，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列进行包括氨基化、磷酸化、羧基化、硫代修饰、巯基修饰、2-甲氧基修饰、3'端倒置dT/dG修饰、甲基/去甲基化、或同位素化的修饰，得到与所述核酸适配体具有相同功能的衍生物。
6.一种如权利要求1～4中任意一项所述核酸适配体的衍生物，其特征在于，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列连接信号分子或活性分子或功能基团而得到具有相同功能的核酸适配体的衍生物。
7.根据权利要求6所述的衍生物，其特征在于，所述信号分子或活性分子或功能基团包括荧光或淬灭基团、放射性物质、治疗性物质、蛋白、抗体、siRNA、纳米发光材料、生物素、地高辛和胆固醇中的一种或多种。
8.一种如权利要求1～4中任意一项所述核酸适配体的衍生物，其特征在于，所述衍生物为将所述核酸适配体的核苷酸序列改造的肽核酸。
9.一种如权利要求1～4中任意一项所述核酸适配体或如权利要求5～8中任意一项所述核酸适配体的衍生物的应用，其特征在于，所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在特异性识别NTRK1蛋白或检测NTRK1蛋白中的应用，或者所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在制备检测NTRK1蛋白的试剂盒或检测NTRK1蛋白的分子探针中的应用。
10.一种如权利要求1～4中任意一项所述核酸适配体或如权利要求5～8中任意一项所述核酸适配体的衍生物的应用，其特征在于，所述核酸适配体或核酸适配体衍生物在治疗或辅助治疗慢性疼痛中的应用。
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