CN111778254B

CN111778254B - 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用

Info

Publication number: CN111778254B
Application number: CN202010746211.5A
Authority: CN
Inventors: 董长贵; 张佩琢; 胡荣宽; 杜永华; 张紫楠; 李琴; 杜宏
Original assignee: Suzhou Genepharma Co ltd; Shanghai Genepharma Co Ltd
Current assignee: Shanghai Genepharma Co Ltd
Priority date: 2020-04-03
Filing date: 2020-04-03
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2040-04-03
Also published as: CN111748557B; CN111139241A; CN111139241B; CN111778254A; CN111748557A; CN111876419B; CN111876419A

Abstract

本发明公开了抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用。本发明要求保护一种siRNA含有正义链和反义链，所述siRNA为21‑si‑P14‑19，且所述正义链或所述反义链的部分核苷酸为2'‑O‑甲基核糖核苷酸，部分磷酸酯基为硫代磷酸酯基。本发明提供了全新的siRNA及其组合物，能够有效预防和/或治疗新型冠状病毒。

Description

抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用

本发明是申请日为2020年4月3日、申请号为202010256865.X、发明名称为抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及抑制新型冠状病毒基因表达的小干扰核酸以及该小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的药物组合物中的应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(CoronaVirusDisease2019，COVID-19)是一种急性感染性肺炎，研究人员发现其病原体是由一种先前未在人类中发现的新型β冠状病毒引起的，该病毒随后被世界卫生组织(WHO)命名为COVID-19。COVID-19患者初始症状多为发热、乏力和干咳，并逐渐出现呼吸困难等严重表现。多数患者预后良好，部分严重病例可出现急性呼吸窘迫综合征和脓毒症休克，甚至死亡。截至2020年3月1日，COVID-19已经感染了88000多人，造成近3000人死亡。全球的科学家和临床医生正在迅速开展工作，以抗击由新型冠状病毒引起的呼吸道疾病COVID-19，但是目前仍然缺乏针对COVID-19病毒的有效抗病毒药物，当前治疗还是隔离治疗、对症支持治疗为主。因此，开发有效预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的siRNA及其药物产品成为迫切需要解决的的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种靶向新型冠状病毒基因的siRNA及其在制备新型冠状病毒肺炎药物中的应用。

新型冠状病毒(COVID-19)与SARS-CoV和MERS-CoV病毒类似，COVID-19(2019-nCoV)的基因组也分为非结构基因和结构基因两个部分。其中约占COVID-19全基因组总长度三分之二的非结构基因含有两段编码蛋白质的序列，称为ORF1a和ORF1b。而紧随其后的结构基因区域则编码S蛋白、orf3a蛋白、E蛋白、M蛋白、orf6蛋白、orf7a蛋白、orf8蛋白、N蛋白等结构蛋白。

本发明提供了一种siRNA分子，该siRNA含有互补的正义链和反义链，所述正义链含有如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ IDNO：10所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：57所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：58所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：59所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：60所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：69所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：70所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：123所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ IDNO：124所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：131所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：132所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：145所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：146所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：171所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：172所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：177所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：178所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQ ID NO：185所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：186所示的核苷酸序列；或者，所述正义链含有如SEQID NO：197所示的核苷酸序列，所述反义链含有如SEQ ID NO：198所示的核苷酸序列；

其中，

正义链5’-AGGGAUUGUACAGAAAGUGUG-3’(SEQ ID NO：5)，

反义链5’-CACUUUCUGUACAAUCCCUUU-3’(SEQ ID NO：6)；

正义链5’-GGUGAUUGUGAAGAAGAAGAG-3’(SEQ ID NO：9)，

反义链5’-CUUCUUCUUCACAAUCACCUU-3’(SEQ ID NO：10)；

正义链5’-AAUCCAUCAUUGCCUACACUA-3’(SEQ ID NO：57)，

反义链5’-CAUAGUGUAGGCAAUGAUGGA-3’(SEQ ID NO：58)；

正义链5’-AAACCGUGCUUUAACUGGAAU-3’(SEQ ID NO：59)，

反义链5’-CUAUUCCAGUUAAAGCACGGU-3’(SEQ ID NO：60)；

正义链5’-AAUGGCACACACUGGUUUGUA-3’(SEQ ID NO：69)，

反义链5’-GUUACAAACCAGUGUGUGCCA-3’(SEQ ID NO：70)；

正义链5’-CAAGGCCAAACUGUCACUAAG-3’(SEQ ID NO：123)，

反义链5’-UAGUGACAGUUUGGCCUUGUU-3’(SEQ ID NO：124)；

正义链5’-GGCUGAUGAAACUCAAGCCUU-3’(SEQ ID NO：131)，

反义链5’-GGCUUGAGUUUCAUCAGCCUU-3’(SEQIDNO：132)；

正义链5’-UCAGCACCUUUAAUUGAAUUG-3’(SEQ ID NO：145)，

反义链5’-AUUCAAUUAAAGGUGCUGAUU-3’(SEQ ID NO：146)；

正义链5’-CUUCCUCAAGGAACAACAUUG-3’(SEQ ID NO：171)，

反义链5’-AUGUUGUUCCUUGAGGAAGUU-3’(SEQ ID NO：172)；

正义链5’-GAGUGUGUUAGAGGUACAACA-3’(SEQ ID NO：177)，

反义链5’-UUGUACCUCUAACACACUCUU-3’(SEQ ID NO：178)；

正义链5’-CUGACUUGCUUUAGCACUCAA-3’(SEQ ID NO：185)，

反义链5’-GAGUGCUAAAGCAAGUCAGUU-3’(SEQ ID NO：186)；

正义链5’-CUUGCUGUUGUUGUUUGUAAC-3’(SEQ ID NO：197)，

反义链5’-UACAAACAACAACAGCAAGUU-3’(SEQ ID NO：198)。

优选地，所述siRNA相互互补的正义链和反义链中至少一条单链删除或增加一个或几个核苷酸，从而得到与所述siRNA具有相同功能的siRNA衍生物。

优选地，所述siRNA相互互补的所述正义链和所述反义链中至少一条单链的磷酸-糖骨架中的至少一部分为硫代磷酸酯骨架；

或者，相互互补的所述正义链和所述反义链中至少一条单链的至少一部分核苷酸进行核苷酸取代或修饰；

或者，相互互补的所述正义链和所述反义链中至少一条单链连接信号分子和/或活性分子和/或功能基团。

优选地，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：5核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：6核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：9核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：10核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：57核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：58核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：59核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：60核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：69核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：70核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：123核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：124核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：131核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：132核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：145核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：146核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：171核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：172核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：177核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：178核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：185核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：186核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

或者，所述siRNA的正义链SEQ ID NO：197核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：198核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸。

优选地，所述siRNA的正义链和/或反义链的核苷酸序列第1、2、3位核苷酸之间磷酸酯基和第19、20、21位核苷酸之间磷酸酯基均为硫代磷酸酯基。

优选地，所述siRNA的正义链的5’末端进行胆固醇修饰。

本发明还提供上述siRNA在制备预防和/或治疗病毒性肺炎的药物中的应用。

优选地，所述病毒性肺炎为新型冠状病毒肺炎COVID-19。

本发明还提供一种试剂盒，所述试剂盒包含上述siRNA，所述试剂盒具有治疗新型冠状病毒COVID-19的功能。

本发明提供了靶向新型冠状病毒基因的非修饰的siRNA序列和修饰的siRNA序列，通过实验证明，本发明修饰的siRNA对新型冠状病毒基因具有明显的抑制效果，为临床上治疗新型冠状病毒肺炎奠定了基础，具有重大的临床意义和推广价值。

附图说明

图1为本发明实施例3中双荧光素酶报告基因质粒GP-miRGLO质粒的图谱；

图2为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-NS-964、21si-NS-1989和21si-NS-2139的siRNA与对应的编号为P17的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图3为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-NS-2588、21si-NS-2798和21si-NS-2915的siRNA与对应的编号为P18的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图4为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-NS-5890、21si-NS-6010、21si-NS-6015和21si-NS-6201的siRNA与对应的编号为P19的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图5为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-NS-17211、21si-NS-17400和21si-NS-17447的siRNA与对应的编号为P20的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图6为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-NS-19760、21si-NS-19831和21si-NS-19897的siRNA与对应的编号为P21的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图7为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-SP-88、21si-SP-241、21si-SP-337和21si-SP-450的siRNA与对应的编号为P22的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图8为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-SP-1027、21si-SP-1060、21si-SP-1493、21si-SP-1547、21si-SP-1816和21si-SP-1932的siRNA与对应的编号为P23的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图9为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-SP-2128、21si-SP-2069、21si-SP-2289、21si-SP-2301和21si-SP-2643的siRNA与对应的编号为P24的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图10为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-SP-2956、21si-SP-3051、21si-SP-3292、21si-SP-3387和21si-SP-3584的siRNA与对应的编号为P25的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图11为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-P3-50、21si-P3-223、21si-P3-592、21si-P3-735、21si-P3-209、21si-P3-244、21si-P3-528、21si-P3-704、21si-P3-725和21si-P3-744的siRNA与对应的编号为P34的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图12为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-HY8-152、21si-HY8-160、21si-HY8-7、21si-HY8-22和21si-HY8-119的siRNA与对应的编号为P30的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图13为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-P8-30、21si-P8-62、21si-P8-95、21si-P8-98、21si-P8-269和21si-P8-164的siRNA与对应的编号为P33的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图14为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-P10b-203、21si-P10b-256、21si-P10b-275、21si-P10b-80、21si-P10b-103、21si-P10b-158、21si-P10b-27、21si-P10b-38和21si-P10b-95的siRNA与对应的编号为P29的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图15为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-EP-20、21si-EP-83、21si-EP-96和21si-EP-124的siRNA与对应的编号为P26的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图16为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-MP-237、21si-MP-13、21si-MP-42、21si-MP-249、21si-MP-484、21si-MP-501、21si-MP-56、21si-MP-220、21si-MP-410和21si-MP-61的siRNA与对应的编号为P27的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图17为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-P13-163、21si-P13-199和21si-P13-213的siRNA与对应的编号为P31的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图18为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-P14-8、21si-P14-19和21si-P14-82的siRNA与对应的编号为P32的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图；

图19为本发明实施例4中编号为mimicsNC、21si-NP-173、21si-NP-209、21si-NP-223、21si-NP-229、21si-NP-249、21si-NP-448、21si-NP-460、21si-NP-468、21si-NP-479、21si-NP-698、21si-NP-722、21si-NP-745、21si-NP-781、21si-NP-796、21si-NP-1123和21si-NP-1162的siRNA与对应的编号为P28的报告质粒进行双荧光素酶检测实验的结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述非限制性实施例可以使本领域的技术人员更好的理解本发明。

任何熟悉本领域的技术人员在本发明的纰漏范围内，根据本发明的技术方案及构思进行替换或改变均属于本发明的保护范畴。

下述实施例中所使用的293T细胞系购自中科院典藏细胞库。

实施例1

小干扰核酸的合成

选择序列相对保守的新型冠状病毒(COVID-19)基因组(Genebank登记号MN988668.1)(SEQIDNO：227)为模板。分别针对COVID-19基因的保守区，选取21bp的核苷酸序列，设计小干扰核酸(siRNA)。

本实施例中设计的siRNA经上海吉玛制药技术有限公司进行合成，上述合成的siRNA序列如表1所示。

表1

如表1所示，本实施例还设置了正义链核苷酸序列如SEQIDNO：207所示，反义链核苷酸序列如SEQIDNO：208所示的siRNA，编号为M-mimicsNC为与新型冠状病毒(COVID-19)基因无对应靶位点的无关序列，作为阴性对照。

实施例2

修饰的小干扰核酸的合成

通过对表1中序列正义链和反义链进行化学修饰后得到如表2中所示的经修饰的siRNA，即正义链第1、2、3、19、20、21位碱基的核苷酸残基中戊糖基团的2’羟基均被甲氧基修饰，所述正义链第1、2、3位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基,所述正义链第19、20、21位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基；反义链第1、2、3、19、20、21位碱基的核苷酸残基中戊糖基团的2’羟基均被甲氧基修饰，所述反义链第1、2、3位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基,所述反义链第19、20、21位碱基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基；本实施例中设计的siRNA经上海吉玛制药技术有限公司进行合成，合成时在siRNA的正义链5’末端链接胆固醇进行修饰。

表2

其中m代表左侧的核苷酸残基中戊糖基团为2’-甲氧基核糖基，s代表其左右两侧的脱氧核糖核苷酸残基之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。

实施例3

双荧光素酶报告基因质粒构建

本实施例使用的双荧光素酶报告基因质粒是GP-miRGLO质粒(该空载体的序列如其说明书所示)，购自Promega公司，其图谱信息图1所示。在GP-miRGLO质粒中插入一段新型冠状病毒(COVID-19)基因组序列来制备如表3所示的双荧光素酶报告基因质粒。

表3

实施例4

细胞转染

1.293T细胞在10cm培养皿中培养至80-90％融合时，倾去培养液，用2mlPBS洗涤细胞两次。

2.加入2mlTrypsin-EDTAsolution,混匀后，37℃放置1分钟。

3.小心吸去胰酶溶液，加入2ml含10％FBS的DMEM培养液，吹打使细胞形成单细胞悬液。

4.血球计数板计数，将细胞稀释至1×10⁶细胞/ml。按5×10⁵细胞/孔的浓度接种12孔板，混匀后于37℃5％CO₂培养24小时。

5.每1OD₂₆₀ siRNA用120μlDEPC-H₂O溶解，终浓度约为20μM。

6.在1.5mlEP管中加入100μl无血清DMEM，加入7ulsiRNA，再加入对应的双荧光报告载体1.2ug，混匀；取另一1.5mlEP管，加入100μl无血清DMEM，加入4μlLipofectamine2000，混匀，室温放置5分钟后将两管混合，室温放置20分钟。

分组按照质粒与siRNA分子的对应关系进行，具体对应情况如表2所示。

每组做3复孔，取均值，检测时间点24/48h，做一次。

吸去12孔板中的培养液，将转染混合物逐滴加入12孔板中，混匀后，在培养箱中温育5小时。

7.吸弃转染液，加入500ul含10％FBS的DMEM培养液。37℃5％CO₂继续培养24、48小时，分别收样。

双荧光素酶系统检测

使用Dual-Luciferase报告基因检测系统试剂盒(promega)检测双荧光素酶(具体使用方法见说明书)。

试剂准备：

1、制备被动裂解缓冲液1×PLB：将1倍体积的5XpassiveLysisBuffer(PLB)加到4倍体积的蒸馏水中。混合均匀。4℃储存待用。

2、LARⅡ:用LuciferaseAssayBufferⅡ溶解冻干粉LuciferaseAssaySubstrate。储存于-20℃待用。

3、配制

试剂(现用现配)：按本次实验所需用量，取一定量的

加入到相应量的

Buffer中，配种成终浓度为1×浓度，待用。

检测步骤：

1.倾去12孔板中的培养液，用500ulPBS洗涤细胞两次。

2.将1×PLB300ul加入到培养孔中。细胞被动裂解：在室温轻缓晃动培养板15分钟，把裂解液转移到检测试板中。每孔100ul，实验设计3复孔。

3.打开TecanM1000酶标仪，预热，选择双荧光素酶检测系统。

4.每孔加入10ul的LARII试剂，选择1-2秒延迟，5-10读数，酶标仪上检测萤火虫荧光素酶活性。

5.取出测试板，每孔加入

试剂，选择1-2秒延迟，5-10读数，酶标仪上检测海肾荧光素酶活性。

6.结果统计与分析。

双荧光素酶检测结果如图2-图19所示，结果表明，编号为21-si-SP-2069、21-si-SP-2289、21-si-SP-3292、21-si-P3-244、21-si-P8-62、21-si-P8-164、21-si-P10B-158、21-si-P14-19、21-si-NP-722、21-si-NP-1123、21-si-NS-2139和21-si-NS-2798的siRNA能够有效的抑制新型冠状病毒基因的表达。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本发明欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本发明中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

序列表

<110> 苏州吉玛基因股份有限公司

上海吉玛制药技术有限公司

<120> 抑制新型冠状病毒的小干扰核酸及组合物和应用

<160> 435

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 209

<211> 1500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 209

tggggaatgt ccaaattttg tatttccctt aaattccata atcaagacta ttcaaccaag 60

ggttgaaaag aaaaagcttg atggctttat gggtagaatt cgatctgtct atccagttgc 120

gtcaccaaat gaatgcaacc aaatgtgcct ttcaactctc atgaagtgtg atcattgtgg 180

tgaaacttca tggcagacgg gcgattttgt taaagccact tgcgaatttt gtggcactga 240

gaatttgact aaagaaggtg ccactacttg tggttactta ccccaaaatg ctgttgttaa 300

aatttattgt ccagcatgtc acaattcaga agtaggacct gagcatagtc ttgccgaata 360

ccataatgaa tctggcttga aaaccattct tcgtaagggt ggtcgcacta ttgcctttgg 420

aggctgtgtg ttctcttatg ttggttgcca taacaagtgt gcctattggg ttccacgtgc 480

tagcgctaac ataggttgta accatacagg tgttgttgga gaaggttccg aaggtcttaa 540

tgacaacctt cttgaaatac tccaaaaaga gaaagtcaac atcaatattg ttggtgactt 600

taaacttaat gaagagatcg ccattatttt ggcatctttt tctgcttcca caagtgcttt 660

tgtggaaact gtgaaaggtt tggattataa agcattcaaa caaattgttg aatcctgtgg 720

taattttaaa gttacaaaag gaaaagctaa aaaaggtgcc tggaatattg gtgaacagaa 780

atcaatactg agtcctcttt atgcatttgc atcagaggct gctcgtgttg tacgatcaat 840

tttctcccgc actcttgaaa ctgctcaaaa ttctgtgcgt gttttacaga aggccgctat 900

aacaatacta gatggaattt cacagtattc actgagactc attgatgcta tgatgttcac 960

atctgatttg gctactaaca atctagttgt aatggcctac attacaggtg gtgttgttca 1020

gttgacttcg cagtggctaa ctaacatctt tggcactgtt tatgaaaaac tcaaacccgt 1080

ccttgattgg cttgaagaga agtttaagga aggtgtagag tttcttagag acggttggga 1140

aattgttaaa tttatctcaa cctgtgcttg tgaaattgtc ggtggacaaa ttgtcacctg 1200

tgcaaaggaa attaaggaga gtgttcagac attctttaag cttgtaaata aatttttggc 1260

tttgtgtgct gactctatca ttattggtgg agctaaactt aaagccttga atttaggtga 1320

aacatttgtc acgcactcaa agggattgta cagaaagtgt gttaaatcca gagaagaaac 1380

tggcctactc atgcctctaa aagccccaaa agaaattatc ttcttagagg gagaaacact 1440

tcccacagaa gtgttaacag aggaagttgt cttgaaaact ggtgatttac aaccattaga 1500

<210> 210

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 210

aaggttacaa gagtgtgaat atcacttttg aacttgatga aaggattgat aaagtactta 60

atgagaagtg ctctgcctat acagttgaac tcggtacaga agtaaatgag ttcgcctgtg 120

ttgtggcaga tgctgtcata aaaactttgc aaccagtatc tgaattactt acaccactgg 180

gcattgattt agatgagtgg agtatggcta catactactt atttgatgag tctggtgagt 240

ttaaattggc ttcacatatg tattgttctt tctaccctcc agatgaggat gaagaagaag 300

gtgattgtga agaagaagag tttgagccat caactcaata tgagtatggt actgaagatg 360

attaccaagg taaacctttg gaatttggtg ccacttctgc tgctcttcaa cctgaagaag 420

agcaagaaga agattggtta gatgatgata gtcaacaaac tgttggtcaa caagacggca 480

gtgaggacaa tcagacaact 500

<210> 211

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 211

atatcaaatt tgctgatgat ttaaaccagt taactggtta taagaaacct gcttcaagag 60

agcttaaagt tacatttttc cctgacttaa atggtgatgt ggtggctatt gattataaac 120

actacacacc ctcttttaag aaaggagcta aattgttaca taaacctatt gtttggcatg 180

ttaacaatgc aactaataaa gccacgtata aaccaaatac ctggtgtata cgttgtcttt 240

ggagcacaaa accagttgaa acatcaaatt cgtttgatgt actgaagtca gaggacgcgc 300

agggaatgga taatcttgcc tgcgaagatc taaaaccagt ctctgaagaa gtagtggaaa 360

atcctaccat acagaaagac gttcttgagt gtaatgtgaa aactaccgaa gttgtaggag 420

acattatact taaaccagca aataatagtt taaaaattac agaagaggtt ggccacacag 480

atctaatggc tgcttatgta 500

<210> 212

<211> 500

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 212

caatggccac aaattatgat ttgagtgttg tcaatgccag attacgtgct aagcactatg 60

tgtacattgg cgaccctgct caattacctg caccacgcac attgctaact aagggcacac 120

tagaaccaga atatttcaat tcagtgtgta gacttatgaa aactataggt ccagacatgt 180

tcctcggaac ttgtcggcgt tgtcctgctg aaattgttga cactgtgagt gctttggttt 240

atgataataa gcttaaagca cataaagaca aatcagctca atgctttaaa atgttttata 300

agggtgttat cacgcatgat gtttcatctg caattaacag gccacaaata ggcgtggtaa 360

gagaattcct tacacgtaac cctgcttgga gaaaagctgt ctttatttca ccttataatt 420

cacagaatgc tgtagcctca aagattttgg gactaccaac tcaaactgtt gattcatcac 480

agggctcaga atatgactat 500

<210> 213

<211> 440

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 213

tactgtgatc tgggactaca aaagagatgc tccagcacat atatctacta ttggtgtttg 60

ttctatgact gacatagcca agaaaccaac tgaaacgatt tgtgcaccac tcactgtctt 120

ttttgatggt agagttgatg gtcaagtaga cttatttaga aatgcccgta atggtgttct 180

tattacagaa ggtagtgtta aaggtttaca accatctgta ggtcccaaac aagctagtct 240

taatggagtc acattaattg gagaagccgt aaaaacacag ttcaattatt ataagaaagt 300

tgatggtgtt gtccaacaat tacctgaaac ttactttact cagagtagaa atttacaaga 360

atttaaaccc aggagtcaaa tggaaattga tttcttagaa ttagctatgg atgaattcat 420

tgaacggtat aaattagaag 440

<210> 214

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 214

atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60

agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120

aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180

aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240

aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300

ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360

aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420

ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480

tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540

ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600

tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660

tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720

ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780

ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840

gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900

tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960

<210> 215

<211> 940

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 215

caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 60

gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 120

tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 180

ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 240

gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 300

tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 360

cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 420

ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 480

aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 540

aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 600

ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 660

ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 720

cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 780

acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 840

ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 900

cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc 940

<210> 216

<211> 960

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 216

gtgtttattc tacaggttct aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg 60

aacatgtcaa caactcatat gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt 120

atcagactca gactaattct cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg 180

cctacactat gtcacttggt gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca 240

tacccacaaa ttttactatt agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga 300

catcagtaga ttgtacaatg tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt 360

tgcaatatgg cagtttttgt acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac 420

aagacaaaaa cacccaagaa gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa 480

ttaaagattt tggtggtttt aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca 540

agaggtcatt tattgaagat ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca 600

tcaaacaata tggtgattgc cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa 660

agtttaacgg ccttactgtt ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca 720

cttctgcact gttagcgggt acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat 780

tacaaatacc atttgctatg caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga 840

atgttctcta tgagaaccaa aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa 900

ttcaagactc actttcttcc acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc 960

<210> 217

<211> 962

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 217

aaaatgcaca agctttaaac acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt 60

caagtgtttt aaatgatatc ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg 120

ataggttgat cacaggcaga cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta 180

gagctgcaga aatcagagct tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac 240

ttggacaatc aaaaagagtt gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc 300

agtcagcacc tcatggtgta gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga 360

acttcacaac tgctcctgcc atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg 420

tctttgtttc aaatggcaca cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa 480

tcattactac agacaacaca tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca 540

acaacacagt ttatgatcct ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata 600

aatattttaa gaatcataca tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg 660

cttcagttgt aaacattcaa aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa 720

atgaatctct catcgatctc caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat 780

ggtacatttg gctaggtttt atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc 840

tttgctgtat gaccagttgc tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct 900

gcaaatttga tgaagacgac tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat 960

aa 962

<210> 218

<211> 228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 218

atgtactcat tcgtttcgga agagacaggt acgttaatag ttaatagcgt acttcttttt 60

cttgctttcg tggtattctt gctagttaca ctagccatcc ttactgcgct tcgattgtgt 120

gcgtactgct gcaatattgt taacgtgagt cttgtaaaac cttcttttta cgtttactct 180

cgtgttaaaa atctgaattc ttctagagtt cctgatcttc tggtctaa 228

<210> 219

<211> 669

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 219

atggcagatt ccaacggtac tattaccgtt gaagagctta aaaagctcct tgaacaatgg 60

aacctagtaa taggtttcct attccttaca tggatttgtc ttctacaatt tgcctatgcc 120

aacaggaata ggtttttgta tataattaag ttaattttcc tctggctgtt atggccagta 180

actttagctt gttttgtgct tgctgctgtt tacagaataa attggatcac cggtggaatt 240

gctatcgcaa tggcttgtct tgtaggcttg atgtggctca gctacttcat tgcttctttc 300

agactgtttg cgcgtacgcg ttccatgtgg tcattcaatc cagaaactaa cattcttctc 360

aacgtgccac tccatggcac tattctgacc agaccgcttc tagaaagtga actcgtaatc 420

ggagctgtga tccttcgtgg acatcttcgt attgctggac accatctagg acgctgtgac 480

atcaaggacc tgcctaaaga aatcactgtt gctacatcac gaacgctttc ttattacaaa 540

ttgggagctt cgcagcgtgt agcaggtgac tcaggttttg ctgcatacag tcgctacagg 600

attggcaact ataaattaaa cacagaccat tccagtagca gtgacaatat tgctttgctt 660

gtacagtaa 669

<210> 220

<211> 1069

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 220

taaattccct cgaggacaag gcgttccaat taacaccaat agcagtccag atgaccaaat 60

tggctactac cgaagagcta ccagacgaat tcgtggtggt gacggtaaaa tgaaagatct 120

cagtccaaga tggtatttct actacctagg aactgggcca gaagctggac ttccctatgg 180

tgctaacaaa gacggcatca tatgggttgc aactgaggga gccttgaata caccaaaaga 240

tcacattggc acccgcaatc ctgctaacaa tgctgcaatc gtgctacaac ttcctcaagg 300

aacaacattg ccaaaaggct tctacgcaga agggagcaga ggcggcagtc aagcctcttc 360

tcgttcctca tcacgtagtc gcaacagttc aagaaattca actccaggca gcagtagggg 420

aacttctcct gctagaatgg ctggcaatgg cggtgatgct gctcttgctt tgctgctgct 480

tgacagattg aaccagcttg agagcaaaat gtctggtaaa ggccaacaac aacaaggcca 540

aactgtcact aagaaatctg ctgctgaggc ttctaagaag cctcggcaaa aacgtactgc 600

cactaaagca tacaatgtaa cacaagcttt cggcagacgt ggtccagaac aaacccaagg 660

aaattttggg gaccaggaac taatcagaca aggaactgat tacaaacatt ggccgcaaat 720

tgcacaattt gcccccagcg cttcagcgtt cttcggaatg tcgcgcattg gcatggaagt 780

cacaccttcg ggaacgtggt tgacctacac agctgccatc aaattggatg acaaagatcc 840

aaatttcaaa gatcaagtca ttttgctgaa taagcatatt gacgcataca aaacattccc 900

accaacagag cctaaaaagg acaaaaagaa gaaggctgat gaaactcaag ccttaccgca 960

gagacagaag aaacagcaaa ctgtgactct tcttcctgct gcagatttgg atgatttctc 1020

caaacaattg caacaatcca tgagcagtgc tgactcaact caggcctaa 1069

<210> 221

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 221

atgaaatttc ttgttttctt aggaatcatc acaactgtag ctgcatttca ccaagaatgt 60

agtttacagt catgtactca acatcaacca tatgtagttg atgacccgtg tcctattcac 120

ttctattcta aatggtatat tagagtagga gctagaaaat cagcaccttt aattgaattg 180

tgcgtggatg aggctggttc taaatcaccc attcagtaca tcgatatcgg taattataca 240

gtttcctgtt taccttttac aattaattgc caggaaccta aattgggtag tcttgtagtg 300

cgttgttcgt tctatgaaga ctttttagag tatcatgacg ttcgtgttgt tttagatttc 360

atctaa 366

<210> 222

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 222

atgtttcatc tcgttgactt tcaggttact atagcagaga tattactaat tattatgagg 60

acttttaaag tttccatttg gaatcttgat tacatcataa acctcataat taaaaattta 120

tctaagtcac taactgagaa taaatattct caattagatg aagagcaacc aatggagatt 180

gattaa 186

<210> 223

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 223

atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc tcagattcaa 60

ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt cggccccaag 120

gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc aaggaagacc 180

ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca gatgaccaaa 240

ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa atga 294

<210> 224

<211> 222

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 224

atgctgcaat cgtgctacaa cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag 60

aagggagcag aggcggcagt caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt 120

caagaaattc aactccaggc agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg 180

gcggtgatgc tgctcttgct ttgctgctgc ttgacagatt ga 222

<210> 225

<211> 368

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 225

atgaaaatta ttcttttctt ggcactgata acactcgcta cttgtgagct ttatcactac 60

caagagtgtg ttagaggtac aacagtactt ttaaaagaac cttgctcttc tggaacatac 120

gagggcaatt caccatttca tcctctagct gataacaaat ttgcactgac ttgctttagc 180

actcaatttg cttttgcttg tcctgacggc gtaaaacacg tctatcagtt acgtgccaga 240

tcagtttcac ctaaactgtt catcagacaa gaggaagttc aagaacttta ctctccaatt 300

tttcttattg ttgcggcaat agtgtttata acactttgct tcacactcaa aagaaagaca 360

gaatgatt 368

<210> 226

<211> 828

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 226

atggatttgt ttatgagaat cttcacaatt ggaactgtaa ctttgaagca aggtgaaatc 60

aaggatgcta ctccttcaga ttttgttcgc gctactgcaa cgataccgat acaagcctca 120

ctccctttcg gatggcttat tgttggcgtt gcacttcttg ctgtttttca gagcgcttcc 180

aaaatcataa ccctcaaaaa gagatggcaa ctagcactct ccaagggtgt tcactttgtt 240

tgcaacttgc tgttgttgtt tgtaacagtt tactcacacc ttttgctcgt tgctgctggc 300

cttgaagccc cttttctcta tctttatgct ttagtctact tcttgcagag tataaacttt 360

gtaagaataa taatgaggct ttggctttgc tggaaatgcc gttccaaaaa cccattactt 420

tatgatgcca actattttct ttgctggcat actaattgtt acgactattg tataccttac 480

aatagtgtaa cttcttcaat tgtcattact tcaggtgatg gcacaacaag tcctatttct 540

gaacatgact accagattgg tggttatact gaaaaatggg aatctggagt aaaagactgt 600

gttgtattac acagttactt cacttcagac tattaccagc tgtactcaac tcaattgagt 660

acagacactg gtgttgaaca tgttaccttc ttcatctaca ataaaattgt tgatgagcct 720

gaagaacatg tccaaattca cacaatcgac ggttcatccg gagttgttaa tccagtaatg 780

gaaccaattt atgatgaacc gacgacgact actagcgtgc ctttgtaa 828

Claims

1.一种siRNA，该siRNA由正义链和反义链组成，其特征在于，所述正义链为如SEQ IDNO：171所示的核苷酸序列，所述反义链为如SEQ ID NO：172所示的核苷酸序列；

其中，

正义链5’-CUUCCUCAAGGAACAACAUUG-3’(SEQ ID NO：171)，

反义链5’-AUGUUGUUCCUUGAGGAAGUU-3’(SEQ ID NO：172)；

所述siRNA的正义链SEQ ID NO：171核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸，所述siRNA的反义链SEQ ID NO：172核苷酸序列的第1、2、3、19、20、21位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸；

所述siRNA的正义链和/或反义链的核苷酸序列第1、2、3位核苷酸之间磷酸酯基和第19、20、21位核苷酸之间磷酸酯基均为硫代磷酸酯基；

所述siRNA的正义链的5’末端进行胆固醇修饰。

2.权利要求1所述的siRNA在制备预防和/或治疗COVID-19的药物中的应用。

3.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的siRNA，所述试剂盒具有治疗COVID-19的功能。