CN104673798A - UsiRNA复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了UsiRNA复合物，具体而言，本发明提供了双链RNA复合物，该双链RNA复合物的过客链(或有义链)中具有一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。本发明的RNA复合物可用于治疗用途、诊断用途或科研用途。RNA复合物包括能够调节基因表达的短干扰RNA复合物(siRNA)，该短干扰RNA复合物包含反义链和连续或不连续的过客链(“有义链”)。另外，本发明的一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体可位于3’端、5’端、3’端和5’端二者。

Description

UsiRNA复合物
本申请是申请号为200980148743.0，申请日为2009年12月3日，发明名称为“UsiRNA复合物”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及双链RNA复合物，该双链RNA复合物的过客链中具有一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。本发明的RNA复合物可用于治疗用途、诊断用途或科研用途。该复合物包括能够下调基因表达的短干扰RNA复合物(siRNA双链体)，该短干扰RNA复合物包含反义链和连续或不连续的过客链(“有义链”)。这些链中的至少一条具有一个或更多个本发明的羟甲基取代的核苷酸单体，所述羟甲基取代的核苷酸单体可位于3’端、5’端、3’端和5’端二者和/或位于内部。
序列表
本申请包括经EFS-Web随此提交的序列表，该序列表是于2009年11月27日生成的ASCII文件，名称为08-19PCT.txt，大小为98,574个字节，其完整内容由此通过引用并入本文。
背景技术
RNA干扰(RNAi)提供了一种使靶基因表达沉默的方法。它为基础研究提供了用于研究遗传和生物化学途径和个体基因以及基因产物功能的方法。因此，RNAi已成为制药业中靶验证的关键工具并且已经进行了大量投资，其目的在于基于能够介导针对其异常表达与疾病状态或状况有关的基因进行RNA干扰的RNA复合物，进行药物开发。
然而，RNA复合物作为RNAi治疗剂发挥作用的能力受到诸如序列特异性或“脱靶”效应、效力、核酶稳定性以及非特异性细胞因子诱导之类的问题的限制。
本发明提供了用于改进RNA复合物的RNAi活性同时减弱或消除RNAi中与RNA复合物相关的不利问题的化合物、组合物、方法以及用途。其中，本申请提供了新型化合物和组合物，其用于制备和使用具有改进的效力和核酶稳定性并且具有减弱或消除的“脱靶”效应和/或细胞因子诱导的RNA复合物。
发明内容
本发明提供了RNA复合物，所述RNA复合物具有并入RNA链中的一个或更多个羟甲基取代的单体以用于RNA指导的基因调节或基因分析，特别是RNA干扰。因此，本发明的一个目的是提供与通常使用的RNA复合物相比具有减弱的脱靶效应的RNA复合物。另一目的是提供具有减弱的干扰素反应的RNA复合物。又一目的是提供在针对在细胞培养中或体内的酶解稳定性方面具有改进的特性的RNA复合物。还一目的是提供在细胞培养中或体内相对于未修饰的RNA复合物表现出提高的基因调节功能(例如，基因沉默效应)的RNA复合物。还一目的是提供靶向特定器官或组织和能够穿透细胞膜的RNA复合物。本发明还提供了适于将羟甲基取代的单体并入寡核苷酸的单体及其合成方法。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至24个碱基对的双链区，其中所述有义链5’端的最后三个位置中的任一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
另一方面，所述核酸还包括有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
又一方面，所述核酸还包括反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至24个碱基对的双链区，反义链5、6、7以及8位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中反义链的位置从反义链5’端的1位开始计数。
另一方面，所述核酸还包括有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
又一方面，所述核酸还包括反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，所述核酸具有19或20个碱基对的双链区。
另一方面，所述有义链和所述反义链各自的长度为21或22个核苷酸单体。
另一方面，所述核酸具有平端或3’端悬端。
另一方面，所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:12、34、56、78、100、124或147的任何15个连续的核苷酸单体相对应。在一个相关的方面，所述反义链具有含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸单体的区域所述15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:12、34、56、78、100、124或147的任何15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续的核苷酸单体相对应。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链3’端的最后一个位置和所述有义链3’端的最后一个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
另一方面，所述反义链3’端的最后两个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述有义链的21、22以及23位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述有义链5’端的1位开始计数。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链的18、19、20、21以及22位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述反义链3’端的1位开始计数。
另一方面，所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:169、185、201、217或233的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
在一个相关的方面，所述反义链具有含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续核苷酸单体的区域，所述15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:169、185、201、217或233的任何15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续的核苷酸单体相对应。
另一方面，所述羟甲基取代的核苷酸单体为2’-3’-开环-核苷酸单体。
另一方面，所述羟甲基取代的核苷酸单体选自下述单体D、F、G、H、I或J：
其中，R选自氢、烷基、胆固醇衍生物、荧光团、多胺、脂肪酸、氨基酸、糖以及多肽，其中碱基为任何嘌呤、嘧啶或它们的衍生物或类似物。
另一方面，所述核酸还包括选自下述的核苷酸类似物：2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体以及INA单体。
一方面，本发明提供了一种降低细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备本文所述的核酸并使用所述核酸处理细胞。
一方面，本发明提供了一种治疗人类疾病的方法，所述疾病选自炎症性疾病，包括类风湿性关节炎；代谢性疾病，包括高胆固醇血症；肝脏疾病；脑炎；骨折；心脏病；病毒性疾病，包括肝炎和流感；以及癌症，所述方法包括制备本文所述的核酸并将所述核酸施用于所述人类。
一方面，本发明提供了本文所述的核酸在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病包括炎症性疾病，包括类风湿性关节炎；代谢性疾病，包括高胆固醇血症；肝脏疾病；脑炎；骨折；心脏病；病毒性疾病，包括肝炎和流感；以及癌症。
附图说明
图1显示了并入RNA复合物中的羟甲基取代的核苷酸单体的不同结构的实例。所显示的单体A用于对比，是具有核糖支架的天然RNA单体。包含在本发明的RNA复合物中的单体B-E的特性是它们含有为羟甲基的取代基(“自由羟甲基”)。自由羟甲基连接在例如环状核糖支架的C4’原子或基于非环状核糖的支架的C1’原子。本发明的羟甲基取代的单体含有各自连接于磷原子并由此参与核苷酸间连接键形成的其他氧原子(见图1)。在本发明的RNA复合物的一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于RNA链3’或5’端的情况时，这些其他氧原子中的一个或更多个可为羟基的一部分。在本发明的RNA复合物的羟甲基取代的核苷酸单体位于RNA链3’和/或5’端时，所述单体的羟基可被磷酸化，这如同可见于任何位于末端的天然RNA单体的情况。本发明的羟甲基取代的核苷酸单体连接了核碱基，如尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤或任何其他已知的天然或合成的核碱基或核碱基类似物(图1中被命名为“碱基”)。
图2显示了羟甲基取代的单体的衍生化、官能化以及共轭的变体。作为示例显示了羟甲基取代的2’,3’-开环-单体D(见图1)的衍生化、官能化以及共轭的变体。单体F含有经醚键连接的基团R。单体G含有经硫醚键连接的基团R。单体H含有经酰胺键连接的基团R。单体I含有经氨基键连接的基团R。单体J含有经哌嗪单元连接的基团R。通过将一个或几个这样的单体并入本发明的RNA复合物中，可调节RNA复合物的特性。例如，可增加生物稳定性、增加RNA靶向能力或引入特定的递送特性，以及可连接用于检测目的的荧光基团。
图3是两种羟甲基取代的单体(单体C和单体D)的结构，这两种单体可为寡核苷酸或RNA复合物的单体。
具体实施方式
本发明一个方面描述的具体特性还适用于本发明的其他方面。例如，在合适的情况下，所描述的关于RNA复合物的特性还可适用于寡核苷酸以及RNA双链体。
siRNA双链体形式或单链RNA形式的RNA复合物可介导细胞中靶核酸的多种修饰。在此过程中，复合物的反义链用作引导，原因是反义链可与具有与反义链互补的序列段的靶核酸杂交。
在靶向靶核酸之前，反义链常常被并入RNA引导的蛋白质复合物(RGPC)，该复合物可作用于靶核酸。RNA引导的蛋白质复合物的一个实例是RNA诱导的沉默复合物(RISC)。认为，存在其他这样的RGPC，当本发明的RNA复合物与这些其他RGPC一起使用或甚至不与任何RGPC相互作用时也是有利的。
本发明的一个目的是稳定生物基质中(血清、体内、细胞培养物中)易于发生核酸降解的RNA复合物。
本发明的另一个目的是改进双链RNA复合物的基因沉默效应。该改进可涉及例如效力增加、脱靶效应减弱、免疫刺激减弱、储存稳定性增加、在诸如血清等的生物基质中的稳定性增加、作用持续时间增加以及药物代谢动力学特性改进，这些均相对于未修饰的天然RNA复合物而言。
本发明的又一个目的是改进单链RNA寡核苷酸的基因沉默效应。该改进可涉及例如效力增加、脱靶效应减弱、免疫刺激减弱、储存稳定性增加、在诸如血清等的生物基质中的稳定性增加、作用持续时间增加以及药物代谢动力学改进，这些均相对于未修饰的天然RNA复合物而言。
本发明的另一个目的是确保RNA复合物在生物基质中的足够稳定性。由此，本发明的一个目的是提供在细胞培养物中或体内相对于未修饰的RNA复合物表现出基因调节功能(例如基因沉默效应)提高的RNA复合物。
本发明的RNA复合物的RNA链可包含天然RNA核苷酸、已知与基因沉默活性相容的RNA修饰(Nawrot和Sipa,Curr.Topics Med.Chem.2006,6,913-925)以及羟甲基取代的单体(图1)。磷酸二酯键可连接单个的单体，但也可替换使用诸如硫代磷酸酯和本领域技术人员已知的其他键(Nawrot和Sipa,Curr.Topics Med.Chem.2006,6,913-925)的修饰的键。
本发明公开的RNA复合物可包含一起构成由反义链(本文中反义链还被称为引导链)和过客链(本文中过客链还被称为有义链)组成的siRNA双链体的两条链，单链RNA分子(例如，反义RNA)，功能性RNA(fRNA)，或非编码RNA(ncRNA)，例如小时序RNA(stRNA)，微RNA(miRNA)，小核内RNA(snRNA)，短干扰RNA(siRNA)，小核仁RNA(snRNA)，核糖体RNA(rRNA)，转运RNA(tRNA)以及它们的前体RNA，RNAa分子，本发明中也把微RNA模拟分子看作是本发明的RNA复合物，因为其可用于例如靶向微RNA的单链反义分子。
在本发明的实施方式中，RNA复合物包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体(见图1)。下文给出的一个这样的实例是羟甲基取代的核苷酸单体，更优选是选自单体D-J的非环状单体。由此，关于羟甲基取代的核苷酸单体的第一方面描述的实施方式将适用于与羟甲基取代的核苷酸单体相关的其他实施方式。
在本发明的一种优选实施方式中，包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA复合物是单链RNA构建体。
在本发明的一种优选实施方式中，包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA复合物是能够通过发挥单链反义分子的作用而抑制基因表达的单链RNA构建体。
在本发明的一种优选实施方式中，包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA复合物是功能性模拟微RNA的单链RNA构建体。
在本发明的一种优选实施方式中，包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA复合物是siRNA构建体。
因此，在一种实施方式中，siRNA构建体的反义链包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。
在另一种实施方式中，siRNA构建体的过客链包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。
在又一种实施方式中，siRNA构建体的带缺口的过客链的第一和第二RNA分子各自包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至24个碱基对的双链区，其中所述有义链5’端的最后三个位置中的任一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
另一方面，所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
又一方面，所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有15至24个碱基对的双链区，其中所述反义链5、6、7以及8位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述反义链的位置从所述反义链5’端的1位开始计数。
另一方面，所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
又一方面，所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，所述核酸具有19或20个碱基对的双链区。
另一方面，所述有义链和所述反义链各自的长度为21或22个核苷酸单体。
另一方面，所述核酸具有平端或3’端悬端。
另一方面，所述反义链具有含至少15个连续的核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:12、34、56、78、100、124或147的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
在一个相关的方面，所述反义链具有含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸单体的区域，所述15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:12、34、56、78、100、124或147的任何15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个连续的核苷酸单体相对应。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链3’端的最后一个位置和所述有义链3’端的最后一个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
另一方面，所述反义链3’端的最后两个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述有义链的21、22以及23位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述有义链5’端的1位开始计数。
一方面，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链的18、19、20、21以及22位中的一个或更多个位置被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据，其中所述有义链的位置从所述反义链3’端的1位开始计数。
另一方面，所述核酸还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，所述核酸还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的羟甲基取代的核苷酸单体占据的核酸。
另一方面，所述反义链具有含至少15个连续的核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:169、185、201、217或233的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
在一个相关的方面，所述反义链具有含至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续核苷酸单体的区域，所述15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:169、185、201、217或233的任何15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个连续的核苷酸单体相对应。
另一方面，所述羟甲基取代的核苷酸单体为2'-3'-开环-核苷酸单体。
另一方面，所述羟甲基取代的核苷酸单体选自单体D、F、G、H、I或J。
其中，R选自氢、烷基、胆固醇衍生物、荧光团、多胺、脂肪酸、氨基酸、糖以及多肽，其中碱基为任何嘌呤、嘧啶或它们的衍生物或类似物。
另一方面，所述核酸还包括选自下述的核苷酸类似物：2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体以及INA单体。
一方面，本发明提供了一种降低细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备本文所述的核酸并使用所述核酸处理细胞。
一方面，本发明提供了一种治疗人类疾病的方法，所述疾病选自炎症性疾病，包括类风湿性关节炎；代谢性疾病，包括高胆固醇血症；肝脏疾病；脑炎；骨折；心脏病；病毒性疾病，包括肝炎和流感；以及癌症，所述方法包括制备本文所述的核酸并将所述核酸施用于所述人类。
一方面，本发明提供了本文所述的核酸在制备用于治疗疾病的药物中的用途，所述疾病包括炎症性疾病，包括类风湿性关节炎；代谢性疾病，包括高胆固醇血症；肝脏疾病；脑炎；骨折；心脏病；病毒性疾病，包括肝炎和流感；以及癌症。
一方面，本发明提供了一种下调基因表达的双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含有义链和反义链、具有15至24个碱基对的双链区，其中一个或多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从所述有义链5'端开始计数的所述有义链的1或2位中的一个或更多个位置。
仅出于举例的目的，所述有义链的位置可描述为下式，其中X表示核苷酸单体(核苷或羟甲基取代的核苷酸单体)，数字表示核苷酸单体在链中的位置。对于RISC长度的RNA复合物而言，n可为5至14(或5、6、7、8、9、10、11、12、13或14)，对于切丁酶(Dicer)长度的RNA复合物而言，n可为15至30(或15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)。用于确定有义链中核苷酸单体的位置的相同操作可适用于反义链。
5’   X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn    3’
在该实例中，核苷酸单体X1占据1位，X2占据2位。
在一个相关的方面，反义链3’端的最后两个核苷酸单体和有义链3’端的最后两个核苷酸单体为羟甲基取代的核苷酸单体。
仅出于举例的目的，有义链和反义链各自中的羟甲基取代的核苷酸单体的位置可表示为下式，其中X表示核苷酸单体(核苷或羟甲基取代的核苷酸单体)，n表示位置。对于RISC长度的RNA复合物而言，n可为13至22(或13、14、15、16、17、18、19、20、21或22)，对于切丁酶长度的RNA复合物而言，n可为23至38(或23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、36、37或38)。用于确定有义链中核苷酸单体的位置的相同操作可适用于反义链。
5’    Xn-X(n+1)-X(n+2)    3’
在该实例中，最后的核苷酸单体由X(n+2)位表示，与最后的核苷酸单体紧邻的核苷酸单体由X(n+1)位表示，链(无论是有义链还是反义链)3’端的最后两个核苷酸单体由X(n+1)和X(n+2)表示。
在一个相关的方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的5、6、7或8位。
在一个相关的方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的7位。
在一个相关的方面，所述双链区具有19或20个碱基对。
在一个相关的方面，所述有义链和反义链各自具有21或22个核苷酸单体。
在一个相关的方面，dsRNA具有3’端悬端。
在一个相关的方面，dsRNA具有平端。
另一方面，本发明提供了一种下调基因表达的双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含有义链和反义链、具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链3’端的最后两个核苷酸单体和所述有义链3’端的最后核苷酸单体为羟甲基取代的核苷酸单体。
另一方面，本发明提供了一种下调基因表达的双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含有义链和反义链、具有25至40个碱基对的双链区，其中一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于抑制切丁酶加工dsRNA的有义链的一个或更多个位置。
在一个相关的方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从有义链5’端开始计数的有义链的21、22或23位中的一个或更多个位置。
在一个相关的方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链3’端开始计数的反义链的18、19、20、21或22位中的一个或更多个位置。
在本发明的一方面，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体的数目为10。在本发明的其他实施方式中，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体的数目分别为9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在另一方面，反义链的所有核苷酸为羟甲基取代的核苷酸单体。
在本发明的一方面，反义链中的所有羟甲基取代的核苷酸单体均位于1、2、3、4、5、6、7和/或8位，其中所述位置从反义链5’端开始计数。甚至更优选地，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的2、3、4、5、6和/或7位，或对应于微RNA的所谓种子区(seed region)。另一方面，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的4、5、6、7和/或8位。另一方面，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的6、7和/或8位。另一方面，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于反义链中与不含羟甲基取代的核苷酸单体的相同RNA相比降低RNA的微RNA活性的位置。由此，存在于前述区域中羟甲基取代的核苷酸单体可防止反义链发挥微RNA的作用，这样降低了在意图将反义链用作siRNA时的脱靶效应。
在一种优选实施方式中，至少一个羟甲基取代的核苷酸单体位于9、10、11、12、13、14、15和/或16位的任何一个位置，其中所述位置从反义链5’端开始计数。甚至更优选的是羟甲基取代的核苷酸单体位于9、10、11、12、13、14、15和/或16位的任何一个位置，其中所述位置从反义链5’端开始计数。在另一种实施方式中，反义链中的羟甲基取代的核苷酸单体位于9、10、11、12、13、14、15和/或16位中的所有位置。在一种实施方式中，羟甲基取代的核苷酸单体仅位于9、10、11、12、13、14、15和/或16位的区域，不位于反义链的其余位置。
甚至更优选的是，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的9、10和/或11位，优选不位于寡核苷酸的其余位置。另一方面，反义链中的羟甲基取代的核苷酸单体位于反义链中与不含羟甲基取代的核苷酸单体相比提高RNA的微RNA活性的位置。存在于前述区域中的羟甲基取代的核苷酸单体可诱导反义链发挥微RNA的作用，即，确保siRNA效应最小并且微RNA效应高得多。
类似地，在本发明的另一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链中羟甲基取代的核苷酸单体的数目为10。在本发明的其他实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链中羟甲基取代的核苷酸单体的数目分别为9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在另一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链的所有核苷酸均为羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，dsRNA的有义链(过客链)包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在某些方面，dsRNA的有义链(过客链)包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个羟甲基取代的核苷酸单体。在某些方面，dsRNA的整个有义链(过客链)包含羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于1、2、3、4、5、6、7和/或8位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于1、2、3和/或4位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于1、2和/或3位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于5、6、7和/或8位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于7和/或8位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于RNA的有义链中与不含羟甲基取代的核苷酸单体的相同RNA相比减弱RNA有义链的RNAi活性的位置。
在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于9、10、11、12、13、14、15和/或16位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于9、10和/或11位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。
在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和/或32位，其中所述位置从有义链5’端开始计数。在某些方面，有义链中羟甲基取代的核苷酸单体位于1、2、3、4、5、6、7、8、9和/或10位，其中所述位置从有义链3’端开始计数。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的反义链和过客链均含有一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。
一方面，本发明提供了能够介导靶核酸的核酸修饰的RNA复合物。这样的RNA复合物可以是例如siRNA、微RNA或微RNA前体(前-微RNA)。
本发明的siRNA复合物的RNA复合物包含核心双链区，该双链区包含反义链和杂交于所述反义链的过客链。
本发明上下文中所提及的靶核酸是与复合物反义链具有显著的互补性的核酸。优选地，互补性在几个核苷酸的段中是完全的。
因此，在一种实施方式中，互补性在25个核苷酸的段中是完全的。
在其他实施方式中，互补性分别在24个核苷酸、23个核苷酸、22个核苷酸、21个核苷酸、20个核苷酸、19个核苷酸、18个核苷酸、17个核苷酸、16个核苷酸、15个核苷酸、14个核苷酸、13个核苷酸、12个核苷酸、11个核苷酸、10个核苷酸、9个核苷酸、8个核苷酸、7个核苷酸或6个核苷酸的段中是完全的。
在一种实施方式中，互补性段包括1个错配。在其他实施方式中，互补性段分别包括2个错配、3个错配或4个错配。1个错配是互补性段中不能形成碱基对的区域(例如当G对A时)。当存在更多错配时，它们可彼此相邻或它们可被置于互补性段的不同区域中。
在一种优选实施方式中，本发明siRNA复合物的RNA复合物包括核心双链区，该核心双链区基本上是双链区。RNA复合物中的单链区主要与复合物的悬端相关。
因此，在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的双链区包括1个错配。在其他实施方式中，双链区分别包括2个错配、3个错配和4个错配。
本文所用的术语“靶核酸”包括可受反义链引导的调节(例如靶向切割或空间位阻)的任何RNA/DNA。靶RNA/DNA可以是例如基因组DNA、基因组病毒RNA、mRNA、前mRNA或非编码RNA。
本文所用的术语“连接”包括两个化学实体(例如，RNA和羟甲基取代的核苷酸单体)之间直接的共价键或两个化学实体之间间接(例如，经连接子)的共价键。
本文所用的术语“悬端”(例如，3’端悬端或3’悬端)是指RNA复合物的非配对区，其可含有所有核苷酸、非核苷酸(例如羟甲基取代的核苷酸单体)或核苷酸和非核苷酸的组合。
本文所用的术语“核苷酸单体”是指包含与(2)第二部分(moiety)共价连接的(1)碱基的一个部分。核苷酸单体可被连接以形成以序列特异性方式结合核酸中的靶序列或互补碱基序列的寡聚物。
本文所用的术语“羟甲基取代的核苷酸单体”、“羟甲基核苷酸单体”、“羟甲基单体”、“无环核苷酸单体”、“无环单体”、“无环羟甲基取代的核苷酸单体”可在全文互换使用。
本文所用的术语“RISC长度”或“RISC长度的RNA复合物”是指具有少于25个碱基对的核酸分子。
本文所用的术语“切丁酶长度”或“切丁酶长度的RNA复合物”是指具有25个或更多碱基对、通常25至40个碱基对的核酸分子。
本发明优选的靶核酸是mRNA。因此，在一种实施方式中，RNA复合物介导的核酸修饰是RNA干扰(RNAi)。在一种优选实施方式中，RNAi介导mRNA的降解。在另一种优选实施方式中，RNAi介导mRNA的翻译抑制。在另一种实施方式中，RNAi介导mRNA的翻译抑制和降解。
在其他优选实施方式中，靶核酸是非编码RNA，例如tRNA、miRNA、snRNA、snoRNA、OSU(非常小RNA)或rRNA。
在又一种实施方式中，靶核酸是基因组DNA。在这种实施方式中，优选的核酸修饰包括DNA甲基化和DNA缺失。
可改变本发明RNA复合物的大小而仍实现本发明的一个或更多个目的。这适用于例如具体目的是减弱的脱靶效应的情况。
因此，本发明siRNA复合物的核心双链区可包括选自下组的许多碱基对：10个碱基对、11个碱基对、12个碱基对、13个碱基对、14个碱基对、15个碱基对、16个碱基对、17个碱基对、18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对、21个碱基对、22个碱基对、23个碱基对、24个碱基对和25个碱基对、26个碱基对、27个碱基对、28个碱基对、29个碱基对、30个碱基对、35个碱基对、40个碱基对、42个碱基对、45个碱基对、50个碱基对、55个碱基对、60个碱基对或62个碱基对。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的核心双链区包括15至40个碱基对。
在另一种优选实施方式中，本发明siRNA复合物的核心双链区包括18-22个碱基对或25至30个碱基对。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的核心双链区甚至长于40个碱基对，但已知在一些细胞中引入较长双链RNA复合物可诱导干扰素依赖性非特异性应答。在一种这样的实施方式中，预期复合物与RGPC接合之前被加工为较短的双链RNA复合物。诸如切丁酶之类的RNase III样酶可执行加工。切丁酶还加工短于40个碱基对的双链RNA，且这种RNA复合物(称为切丁酶底物)与不经加工进入RISC的siRNA相比具有多种益处。因此，在一种实施方式中，本发明的RNA复合物是切丁酶底物。
在另一种实施方式中，RNA复合物是单链，并且没有双链区。
在又一种实施方式中，RNA复合物是单链但折叠以使其含有一个或更多个双链区。这种实施方式可用于例如模拟微RNA及其功能。
在又一种实施方式中，本发明siRNA复合物的核心双链区短于10个碱基对且因此包括1到9个碱基对。
在本发明一种实施方式中，RNA复合物的核心双链区由多于两条RNA链构成。
在本发明一种实施方式中，RNA复合物的核心双链区由三条RNA链构成。
在本发明另一种实施方式中，RNA复合物的核心双链区由四条或更多RNA链构成。
在本发明一种优选实施方式中，本发明siRNA复合物包含悬端。本发明上下文中所用的悬端是指跟随双链区的短单链区。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的反义链包含3’悬端。
在另一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链包含3’悬端。
在又一种实施方式中，本发明siRNA复合物的反义链包含5’悬端。
在又一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链包括5’悬端。
在一种优选实施方式中，本发明siRNA复合物的反义链和过客链都包括3’悬端。
本发明siRNA复合物的悬端可具有不同长度，而不干扰复合物的基本功能。因此在一种实施方式中，悬端选自具有下述长度的悬端组：1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸和8个核苷酸和/或1个羟甲基取代的核苷酸单体、2个羟甲基取代的核苷酸单体、3个羟甲基取代的核苷酸单体、4个羟甲基取代的核苷酸单体、5个羟甲基取代的核苷酸单体、6个羟甲基取代的核苷酸单体、7个羟甲基取代的核苷酸单体和8个羟甲基取代的核苷酸单体，以及它们的组合。
本发明RNA复合物的最优选的悬端是长度分别为1、2和3个核苷酸或核苷酸单体的悬端。
在一种实施方式中，本发明RNA复合物的反义链的悬端具有与过客链悬端相同的长度。
在另一种实施方式中，本发明RNA复合物的反义链的悬端不具有与过客链悬端相同的长度。
在本发明RNA复合物的又一种实施方式中，RNA复合物包括至少一个平端。“平端”是指双链核酸不具有任何突出的核苷酸的末端，即双链核酸的两条链终止于相同位置。
在另一种实施方式中，本发明RNA复合物两个末端均是平端。
在某些方面，RNA复合物具有至少一个平端，该平端具有与其共价连接的一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在某些方面，dsRNA具有两个平端，该两个平端各自具有与其共价连接的一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在某些方面，平端具有与其共价连接的1、2、3、4、5、6、7、8或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在某些方面，平端具有与其共价连接的两个羟甲基取代的核苷酸单体。在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体以硫代磷酸酯键与RNA复合物的平端连接。
在某些方面，共价键是硫代磷酸酯键。
出于清楚的目的，下列结构可用于理解RNA复合物的平端和羟甲基取代的核苷酸单体(X是任何核苷，H是羟甲基取代的核苷酸单体，n是13至38，m每次出现独立地是0至8)的连接键之间的关系。有义链的X与反义链的X形成碱基对，由此形成具有平端的双链区。
在下文的RNA复合物中，羟甲基取代的核苷酸单体(H)可连接(例如，磷酸二酯键或本文所揭示或本领域普通技术人员已知的任何其他连接键)于有义链3’端、或反义链3’端、或有义链3’端和反义链3’端二者、或有义链5’端、或反义链5’端、或有义链5’端和反义链5’端二者、或有义链3’端和有义链5’端、或有义链3’端和反义链5’端、或有义链5’端和反义链3’端。更详细的实施方式提供于下文。
5’    (H)m-X-(X)n-X-(H)m 3’    有义链
3’      (H)m-X-(X)n-X-(H)m 5’    反义链
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与反义链5’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与反义链5’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与反义链3’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与反义链3’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与反义链5’端和3’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与反义链5’端和3’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链3’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链3’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端和3’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端和3’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端和反义链5’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端和反义链5’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链3’端和反义链5’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链3’端和反义链5’端共价连接。
在某些方面，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端和反义链3’端共价连接。在某些方面，1、2、3、4、5、6、7或8个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端和反义链3’端共价连接。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中有义链3’端和反义链3’端包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中有义链3’端和反义链3’端包含一个或更多个无环核苷酸单体，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中有义链3’端和反义链3’端包含一个或更多个无环核苷酸单体，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中一个或更多个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中一个或更多个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中一个或更多个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中一个或更多个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中至少两个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中至少两个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中至少两个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中1、2和/或3个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中至少一个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的1、2和/或3位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中两个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中1、2、3和/或4个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中两个或更多个无环核苷酸单体与有义链3’端和反义链3’端共价连接，其中至少一个羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中无环核苷酸单体与dsRNA有义链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与有义链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中无环核苷酸单体与dsRNA有义链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA有义链5’端共价连接，其中反义链在反义链中的与反义链(即，两个核苷酸之间没有羟甲基取代的核苷酸单体的dsRNA的反义链)中没有无环核苷酸单体的相同dsRNA相比降低dsRNA的微RNA活性的位置包含羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中有义链是包括第一不连续过客链和第二不连续过客链的不连续链(不连续过客链)，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第二不连续过客链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第一不连续过客链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和/或16位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中有义链是包括第一不连续过客链和第二不连续过客链的不连续链(不连续过客链)，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第一不连续过客链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第二不连续过客链5’端共价连接，其中反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和/或16位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含有义链和反义链，其中有义链是包括第一不连续过客链和第二不连续过客链的不连续链(不连续过客链)，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第一不连续过客链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第二不连续过客链5’端共价连接。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含不连续有义链和反义链，其中不连续有义链(不连续过客链)包括第一链和第二链，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第二链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第一链5’端共价连接。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含不连续有义链和反义链，其中不连续有义链(不连续过客链)包括第一链和第二链，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第一链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第二链5’端共价连接。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含不连续有义链和反义链，其中不连续有义链(不连续过客链)包括第一链和第二链，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第一链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第一链5’端共价连接。
在某些方面，本发明的平端dsRNA包含不连续有义链和反义链，其中不连续有义链(不连续过客链)包括第一链和第二链，其中无环核苷酸单体与dsRNA的第二链3’端共价连接，无环核苷酸单体与dsRNA的反义链3’端共价连接，其中羟甲基取代的核苷酸单体与dsRNA的第二链5’端共价连接。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含有义链和反义链，其中有义链包含约25至约30个核苷酸单体，反义链包含约25至约30个核苷酸单体，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和/或26位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含有义链和反义链，其中有义链包含约25至约30个核苷酸单体，反义链包含约25至约30个核苷酸单体，其中反义链包含位于从有义链5’端开始计数的6、7、8、9、10、11和/或12位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含有义链和反义链，其中有义链包含约25个核苷酸单体，反义链包含约27个核苷酸单体，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的21和/或22位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含有义链和反义链，其中有义链包含约25个核苷酸单体，反义链包含约27个核苷酸单体，其中反义链包含位于从有义链5’端开始计数的6和/或7位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在本发明的任何方面，RNA复合物包含2’-O-甲基核苷酸单体。在一个相关的方面，RNA复合物包含0至12个2’-O-甲基核苷酸单体(或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个2’-O-甲基核苷酸单体)。在一个相关的方面，RNA复合物的过客链包含0至12个2’-O-甲基核苷酸单体(或0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个2’-O-甲基核苷酸单体)。在一个相关的方面，RNA复合物的引导链包含0至6个2’-O-甲基核苷酸单体(或0、1、2、3、4、5或6个2’-O-甲基核苷酸单体)。在某些方面，羟甲基取代的单体是2’-O-甲基核苷酸单体。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体，其中与不含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的相同RNA复合物相比所述RNA复合物对于Toll样受体3(TLR3)的亲和力较小。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体，其中与不含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的相同RNA复合物相比该dsRNA对于Toll样受体3(TLR3)的亲和力较小。
在某些方面，本发明的RNA复合物包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体，其中与不含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的相同RNA复合物相比所述RNA复合物激活Toll样受体3(TLR3)的能力降低。
在某些方面，本发明提供了用于降低dsRNA对于Toll样受体3(TLR3)的激活的方法，所述方法包括鉴定激活TLR3的dsRNA，使用一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体修饰所述dsRNA，以及进行TLR3激活和/或基因表达测定，以确定使用一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体修饰dsRNA与不含一个或更多个无环核苷酸单体的相同dsRNA相比是否降低对于TLR3的激活。
在某些方面，本发明提供了用于降低dsRNA对于MDA-5基因的激活的方法，所述方法包括鉴定激活MDA-5的dsRNA，使用一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体修饰所述dsRNA，以及进行MDA-5激活和/或基因表达测定，以确定使用一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体修饰dsRNA与不含一个或更多个无环核苷酸单体的相同dsRNA相比是否降低对于MDA-5的激活。
在某些方面，本发明提供了用于降低dsRNA对于RIG-I基因的激活的方法，所述方法包括鉴定激活RIG-I的dsRNA，使用一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体修饰所述dsRNA，以及进行RIG-I激活和/或基因表达测定，以确定使用一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体修饰dsRNA与不含一个或更多个无环核苷酸单体的相同dsRNA相比是否降低对于RIG-I的激活。
在某些方面，本发明提供了用于抑制或减弱细胞中一种或多种toll样受体(TLR)途径的方法，所述toll样受体包括例如TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10以及TLR11，所述方法是通过使所述细胞与无环核苷酸单体接触由此抑制或减弱一种或多种TLR途径。在某些方面，羟甲基取代的核苷酸单体连接在一起(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或更多)或并入核酸(例如DNA、RNA、DNA/RNA杂交体)中。在某些方面，羟甲基取代的核苷酸单体是同质群(即，包含嘌呤或嘧啶)或是杂质群(即，包含嘌呤和嘧啶二者)。在某些方面，羟甲基取代的核苷酸单体是TLR拮抗剂。在某些方面，无环核苷酸单体与TLR结合。在某些方面，抑制或减弱细胞中一种或多种TLR途径的羟甲基取代的核苷酸单体可为单体C、D、E、F、G、H、I或J。在某些方面，抑制或减弱细胞中一种或多种TLR途径的羟甲基取代的核苷酸单体可为单体D、F、G、H、I或J。在某些方面，抑制或减弱细胞中一种或多种TLR途径的羟甲基取代的核苷酸单体可为单体D。
本发明的优选RNA复合物总体结构上类似于较长的双链RNA复合物的切丁酶加工产物。在另一种实施方式中，本发明的RNA复合物是上文提到的切丁酶底物。
本发明的其他优选的RNA复合物是其中核心双链区包括18-22个碱基对，且其中反义链和过客链各包括1-3个核苷酸的3'悬端的复合物。
本发明RNA复合物的反义链可具有不同长度，而不干扰复合物的功能。因此在优选实施方式中，反义链分别是8-mer、9-mer、10-mer、11-mer、12-mer、13-mer、14-mer、15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer、23-mer、24-mer、25-mer、26-mer、27-mer、28-mer、29-mer、30-mer、31-mer、32-mer、33-mer、34-mer、35-mer、36-mer、37-mer、38-mer、39-mer、40-mer、41-mer、42-mer、43-mer、44-mer、45-mer、46-mer、47-mer、48-mer、49-mer、50-mer、51-mer、52-mer、53-mer、54-mer、55-mer、56-mer、57-mer、58-mer、59-mer、60-mer、61-mer或62-mer。应理解，例如19-mer是19个单体的反义链，所述单体可为核苷酸或羟甲基取代的核苷酸单体或它们的组合。
在另一种优选实施方式中，RNA复合物的反义链选自下组反义链：15-mer、16-mer、17-mer、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer和23-mer。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链是不连续的。在本发明siRNA复合物的一种实施方式中，过客链包括几个分开的RNA分子。RNA分子的数目可为1、2、3、4、5或6。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物过客链的单独RNA分子的长度多于4个单体。在其他实施方式中，过客链的单独RNA分子的长度分别多于5个单体、6个单体、7个单体、8个单体、9个单体、10个单体、11个单体和12个单体。
在其他实施方式中，本发明siRNA复合物过客链的单独RNA分子的长度分别低于5个单体、6个单体、7个单体、8个单体、9个单体、10个单体、11个单体和12个单体。
在本发明一种实施方式中，本发明siRNA复合物的不连续过客链包括第一和第二RNA分子，它们一起形成不连续过客链，其中第一RNA分子杂交于反义链的下游部分，而第二RNA分子杂交于反义链的上游部分。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的反义链是不连续的。反义链的优选的不连续性与过客链的优选的不连续性相同。
本发明siRNA复合物的一条链的不连续性可以是切口(nick)。切口应理解为双链核酸的一条链中因缺少磷酸二酯键但双链核酸却没有缺少核苷酸而导致的不连续性。因此，与切口相对的碱基仍将杂交于带切口的链上的碱基。
本发明siRNA复合物的一条链的另一种不连续性是可选的切口，这理解为双链核酸的一条链中因糖-磷酸酯主链上缺少除了磷酸二酯键以外的一个键或更多个键但双链核酸却没有缺少核碱基而导致的不连续性。因此，与切口相对的碱基仍可与带切口的链上的碱基杂交。
当本发明RNA复合物的RNA链可被描述为具有其中双链核酸中缺少至少一个核苷酸或核苷或核碱基的不连续性时，则以缺口(gap)用作命名。
优选地，RNA复合物的5’端是磷酸化的或可用于磷酸化。可用于磷酸化是指5’羟基基团还没有例如通过直接共轭或通过与接近5’羟基基团的其他基团的其他共轭而被封闭，这种封闭将阻止5’-羟基基团被磷酸化。
因此，在本发明一种优选实施方式中，RNA复合物的RNA分子包括5’端磷酸酯和3’羟基基团。
在另一种实施方式中，本发明siRNA复合物的第二RNA分子包括5’端磷酸酯和3’羟基基团。
在又一种实施方式中，反义链包括5’端磷酸酯和3’羟基基团。
在本发明一些实施方式中，优选地，RNA复合物包括羟甲基取代的核苷酸以外的核苷酸类似物。这种羟甲基取代的核苷酸以外的核苷酸类似物以下称为“另外修饰的核苷酸”。
出于多种原因，另外修饰的核苷酸的使用可为有利的。它们可例如用于增加本发明siRNA复合物的核心双链区的解链温度。
另外修饰的核苷酸的使用可有利于增加反义链和靶核酸之间形成的双链结构的解链温度。
因此，在一种实施方式中，反义链包括另外修饰的核苷酸。在另一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链包括另外修饰的核苷酸。在又一种实施方式中，本发明siRNA复合物的过客链的第一和第二RNA分子各含有另外修饰的核苷酸。在本发明一种实施方式中，RNA复合物中另外修饰的核苷酸的数目是10。在本发明其他实施方式中，RNA复合物中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在本发明一种实施方式中，反义链中另外修饰的核苷酸的数目是10。在本发明其他实施方式中，反义链中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。在另一种实施方式中，反义链的所有核苷酸均是另外修饰的核苷酸或是另外修饰的核苷酸与羟甲基取代的核苷酸的组合。
类似地，在本发明另一种实施方式中，本发明siRNA复合物过客链中核苷酸类似物的数目是10。在本发明其他实施方式中，过客链中核苷酸类似物的数目分别是9、8、7、6、5、4、3、2或1。
在另一种实施方式中，本发明siRNA复合物过客链的所有核苷酸均是核苷酸类似物或是另外修饰的核苷酸与羟甲基取代的核苷酸的组合。
在一种实施方式中，本发明siRNA复合物的反义链和过客链都含有另外修饰的核苷酸。
在一种实施方式中，RNA复合物的另外修饰的核苷酸是相同的，即它们例如都是LNA或都是2’-O-Me-RNA。在另一种实施方式中，各种不同的另外修饰的核苷酸用于同一RNA复合物中。
在一种实施方式中，RNA复合物包括硫代磷酸酯键。
在另一种实施方式中，RNA复合物包括天然磷酸二酯键和硫代磷酸酯键的混合。
本发明的优选的核苷酸类似物是选自下组的核苷酸类似物：2’-O-烷基-RNA单体、2’-氨基-DNA单体、2’-氟-DNA单体、LNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、DNA单体、PNA单体和INA单体，但还可使用其他单体(Nawrot和Sipa,Curr.Topics Med.Chem.2006,6,913-925)。
在一种实施方式中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基被共轭基团官能化。共轭基团是本领域技术人员已知的改变、扩大或改善本发明RNA复合物的特性的基团。这种基团可用于调节细胞分布、器官分布、组织分布、双链体解链温度、靶亲和力、生物稳定性、杂交信号等。
在一种实施方式中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基被共轭的基团与羟甲基取代基的亚甲基基团之间的醚键官能化。参见图2(单体F)。
在一种实施方式中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为硫醚官能团。参见图2(单体G)。
在另一种实施方式中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为巯甲基官能团。参见图2(单体G，R＝H)。使用本领域技术人员已知的方法，该巯基官能团在RNA合成期间被适当地保护，例如作为其乙酰基衍生物。
在一种实施方式中，使用本领域技术人员已知的方法，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基在并入本发明RNA复合物之前转变为胺官能团。参见图2(单体I，R＝H)。使用本领域技术人员已知的方法，该胺官能团在RNA合成期间被适当地保护，例如作为其三氟乙酰基或Fmoc衍生物。
在一种实施方式中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄(handle)起作用以连接酰胺连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转变，例如如上所述的，以及使用本领域技术人员已知的方法通过例如形成酰胺键由共轭基团对该氨基基团进一步衍生化。这可使用本领域技术人员已知的方法，在RNA合成之前或RNA合成之后进行(图2，单体H)。
在一种实施方式中，本发明的羟甲基取代的单体的羟甲基取代基作为柄起作用以连接氨基连接的共轭基团。这包括羟甲基取代基的羟基单元向胺单元的转变，例如如上所述的，以及使用本领域技术人员已知的方法通过例如形成胺键由共轭基团对该氨基基团进一步衍生化。这可使用本领域技术人员已知的方法，在RNA合成之前或RNA合成之后进行(图2，单体I)。
在又一种实施方式中，用于共轭的胺基团是氨基基团、哌嗪基基团或二氨基烷基基团。这种单体称为胺衍生化的单体。这些基团各自可被进一步衍生化或共轭(图2，单体J)。
在一种实施方式中，与天然RNA复合物相比，本发明RNA复合物具有减少的脱靶效应。
在一种优选实施方式中，RNA复合物在反义链中具有至少一个本发明的羟甲基取代的单体。
在另一种优选实施方式中，RNA复合物具有至少一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入或围绕反义链的所谓种子区，即该单体位于从反义链5’端开始计数的第1-12号位置的至少一个位置。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有至少一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第2-10号中的至少一个位置。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第3-8号位置之一。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第7号或第8号位置之一。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第7号位置。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第9-16号位置中。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第9-11号位置中。在又一种优选实施方式中，RNA复合物具有一个本发明的羟甲基取代的单体，其并入从反义链5’端开始计数的第9-10号位置中。在另一种实施方式中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比产生减少的免疫应答。
在又一种实施方式中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比具有延长的效应。
在又一种实施方式中，本发明的RNA复合物与天然RNA复合物相比具有增加的效应。因此，在一种优选实施方式中，RNA复合物比天然RNA复合物更有效地介导RNAi，例如通过靶mRNA的更有效地降解或通过靶mRNA的更有效地翻译抑制。
在又一种实施方式中，本发明的RNA复合物有效地递送于人类或动物的特定器官或组织。
在又一种实施方式中，本发明的RNA复合物能够有效地穿过细胞膜。在又一种实施方式中，本发明的RNA复合物能够比天然RNA复合物更有效地穿过细胞膜。在一种实施方式中，本发明的RNA复合物能够结合血浆蛋白，这延长了RNA复合物在人体中的滞留。
在一种实施方式中，RNA复合物可为下调靶核酸表达的平端双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含有义链和反义链，19至24个碱基对的双链区，以及与所述dsRNA的至少一个平端连接的一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在一种相关的实施方式中，有义链和反义链独立地具有19个核苷酸单体。在另一种相关的实施方式中，有义链包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在又一种实施方式中，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从有义链5’端开始计数的1、2、3、4和/或5位。在一种相关的实施方式中，反义链包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在一种相关的实施方式中，一个或更多个羟甲基位于从反义链5’端开始计数的4、5、6、7、8、9和/或10位。
在另一种实施方式中，RNA复合物可为下调靶核酸表达的平端双链RNA(dsRNA)，所述dsRNA包含有义链和反义链，25至30个碱基对的双链区，以及一个包含羟甲基取代的核苷酸单体的3’端悬端。在一种相关的实施方式中，有义链和反义链独立地具有25至35个核苷酸单体。在又一种相关的实施方式中，有义链具有25个核苷酸单体，反义链具有27个核苷酸单体。在又一种实施方式中，有义链包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在另一种实施方式中，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体减弱或阻止切丁酶对dsRNA的裂解。在一种相关的实施方式中，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体侧邻dsRNA的切丁酶裂解位点。在另一种实施方式中，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从有义链5’端开始计数的19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和/或32位。在一种相关的实施方式中，反义链包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。在一种相关的实施方式中，一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体位于从反义链5’端开始计数的5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和/或17位。在一种相关的实施方式中，羟甲基取代的核苷酸单体是2’-3’-开环-核苷酸单体。
本文所用的术语“双功能RNA复合物”或“双功能dsRNA”是指具有有义链和反义链的RNA复合物，其中有义链和反义链各自与相关靶RNA的不同区域(即，第一区和第二区)互补，或各自与至少两种不同靶RNA的区域互补。
在一种实施方式中，RNA复合物可为双功能RNA复合物，该双功能RNA复合物具有两个平端和位于从引导链和过客链各自的5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体。
在一种实施方式中，双功能RNA复合物包含两个平端、有义链和反义链，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体，反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中有义链与靶RNA的第一区互补，反义链与靶RNA的第二区互补，其中第一区和第二区为靶RNA的非重叠区。在一种相关的实施方式中，靶RNA的第一区和第二区部分重叠。
在一种实施方式中，双功能RNA复合物包含两个平端，有义链和反义链，其中有义链包含位于从有义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体，反义链包含位于从反义链5’端开始计数的5、6、7和/或8位的羟甲基取代的核苷酸单体，其中有义链与第一靶RNA的第一区互补，反义链与第二靶RNA的第二区互补，其中第一靶RNA和第二靶RNA是不同的靶RNA，或具有小于95％的同源性、或90％的同源性、或85％的同源性、或80％的同源性、或75％的同源性、或70％的同源性、或65％的同源性、或60％的同源性、或55％的同源性、或50％的同源性。在一种相关的实施方式中，第一和第二靶RNA在相同的细胞途径中。
RNA复合物的制备方法
本发明的另一方面是一种制备本发明双链RNA复合物的方法，所述方法包括在其中形成包含核心双链区的RNA复合物的条件下温育反义链与过客链，所述RNA复合物能够介导相应细胞RNA的RNA干扰。
本发明的另一方面是一种制备调节靶mRNA表达的包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA复合物的方法，所述方法包括下述步骤：合成至少两条各自具有15至40个核苷酸单体的核酸链；在适于形成具有双链区的平端RNA复合物的条件下合并所合成的核酸链；其中各链3’端包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。
本发明的另一方面是一种制备调节靶mRNA表达的包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA复合物的方法，所述方法包括下述步骤：合成至少两条各自具有18至30个核苷酸单体的核酸链；在适于形成具有双链区的平端RNA复合物的条件下合并所合成的核酸链；其中各链3’端包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体。
在该方面的可选实施方式中，RNA复合物被本发明的RNA双链体代替(第十方面)。
本发明还一方面是一种介导细胞或生物体中靶核酸的核酸修饰的方法，所述方法包括在可发生靶核酸修饰的条件下使细胞或生物体与本发明的RNA复合物接触，由此介导靶核酸的修饰。
在优选实施方式中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在体外进行。在优选实施方式中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在体内进行，即在动物、在人类或在非人类动物中进行。在优选实施方式中，介导靶核酸的核酸修饰的方法在细胞培养物中进行。在还一种实施方式中，所述方法在分离的细胞进行。
在一种优选实施方式中，所述方法的核酸修饰是RNA干扰，优选靶mRNA的降解和靶mRNA的翻译抑制或调节性非编码RNA(例如，微RNA)的抑制。
在另一种实施方式中，核酸修饰是DNA甲基化。在该方面的可选实施方式中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸(第九方面)或本发明的RNA双链体(第十方面)代替。
本发明的第四方面是检查基因功能的方法。本发明的另一方面是检查细胞或生物体中基因功能的方法，所述方法包括下述步骤：将对应于所述基因的本发明的RNA复合物引入细胞或生物体，从而产生测试细胞或测试生物体；将测试细胞或测试生物体保持在可发生靶核酸修饰的条件下；以及观察测试细胞或生物体在步骤b中产生的表型并任选地将观察到的表型与合适的对照细胞或对照生物体的表型比较，从而提供关于基因功能的信息。本发明的RNA复合物可例如使用所附实施例中列出的转染而引入细胞。可观察生物体或细胞的表型，例如使用蛋白组学来评价蛋白水平或使用微阵列来评价RNA水平。还可使用更精细的表型，例如一种特定基因的表达。所获得的关于基因功能的信息可用于确定基因产物是否是与特定疾病相关的治疗干预的合适的靶。因此，如果证实某一基因产物在已知在例如具体亚型癌症中受影响的某一生化途径中起作用，那么该基因产物可能是用于治疗前述亚型癌症的治疗干预的合适的靶。
在一种检查细胞或生物体中基因功能的方法的优选实施方式中，该方法中的核酸修饰是RNA干扰，优选的是靶mRNA的降解或靶RNA的翻译抑制。
在另一种实施方式中，核酸修饰是DNA甲基化。
在检查细胞或生物体中基因功能的方法的优选实施方式中，该方法在细胞培养物中、体外或体内进行。
在又一种实施方式中，对分离的细胞实施该方法。
在该方面的可选实施方式中，RNA复合物被本发明的寡核苷酸(第九方面)或本发明的RNA双链体(第十方面)代替。
在本发明的第五方面中，提供了一种评价药物的方法。本发明的另一方面是评价一种药物是否作用于基因产物的方法，其包括以下步骤：将对应于所述基因的本发明的RNA复合物引入细胞或生物体，从而产生测试细胞或测试生物体；将测试细胞或测试生物体保持在发生靶核酸修饰的条件下；将药物引入测试细胞或测试生物体；观察测试细胞或生物体的表型，并任选地将观察到的表型与合适的对照细胞或对照生物体的表型比较，从而提供关于药物是否作用于基因产物的信息。
在一种评价药物是否作用于基因或基因产物的方法的优选实施方式中，该方法的核酸修饰是RNA干扰，优选的是靶RNA的降解或靶RNA的翻译抑制。在另一种实施方式中，核酸修饰的修饰是DNA甲基化。
在评价药物是否作用于基因产物的方法的优选实施方式中，所述方法在细胞培养物中、体外或体内进行。在又一种实施方式中，对分离的细胞实施所述方法。在该方面的可选实施方式中，RNA复合物被本发明的寡核苷酸(第九方面)或本发明的RNA双链体(第十方面)代替。
在本发明的第六方面中，提供了一种药物组合物。本发明的又一方面是RNA复合物和药学上可接受的稀释剂、载体或辅剂。对技术人员明显的是，本发明的RNA复合物可设计为靶向特定基因和基因产物。应理解的是，RNA复合物将靶向DNA序列或RNA序列而非蛋白质。然而，如果诸如蛋白质之类的基因产物的mRNA或非编码RNA被例如RNA降解或翻译抑制所修饰，则所述基因产物的水平可被间接影响。编码蛋白质的基因的表达也可受影响，例如因为DNA甲基化。
在该方面的可选实施方式中，该RNA复合物被本发明的寡核苷酸(第九方面)或本发明的RNA双链体(第十方面)代替。
在本发明的第七方面中，提供了一种药物的用途。因此，另一方面是用作药物的本发明的RNA复合物。一旦验证治疗靶，技术人员可设计影响靶水平和活性的RNA复合物，原因是RNA复合物的特异性仅存在于反义链序列中。对于具有连续过客链的天然RNA复合物，由于过客链作为引导序列起作用，因而仍存在脱靶效应的问题。
在该方面的可选实施方式中，RNA复合物被本发明的寡核苷酸(第九方面)或本发明的RNA双链体(第十方面)代替。
在本发明的第八方面中，提供了单体。本发明的一个方面是适于并入本发明的羟甲基取代的单体的单体和从易于获得的起始物料制备它们的方法。本发明的羟甲基取代的单体的胸腺嘧啶-1-基衍生物已被并入DNA链，且制备用于自动DNA/RNA合成的其亚磷酰胺结构单元的程序已被报道(K.D.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493；H.Thrane等人,Tetrahedron 1995,51,10389；P.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19)。
最通常地，本发明的RNA复合物将由本领域技术人员已知的自动寡核苷酸合成而制备。将本发明的羟甲基取代的单体并入本发明的RNA复合物遵循用于a)在自动RNA合成仪上的RNA合成、b)RNA整理(work-up)、c)RNA纯化和d)RNA分离的标准方法[F.Eckstein,Oligonucleotides and Analogues,IRL Press,Oxford University Press,1991]。可使用亚磷酰胺衍生物通过RNA合成的标准技术合成羟甲基取代的RNA寡核苷酸(＝RNA链)和RNA复合物。
在一种优选实施方式中，制备本发明的羟甲基取代的单体的亚磷酰胺衍生物的方法开始于核糖核苷，例如核糖核苷的O5’-DMT保护的衍生物，对于碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含有碱基保护基团，如例如，苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰基或本领域技术人员已知的其他标准碱基保护基团。
在一种优选实施方式中，本发明包括制备适于并入单体D和E的具有2’,3’-断开的碳-碳键(核糖核苷命名法)的单体结构单元的方法。
在其他优选实施方式中，本发明包括制备适于并入单体(如单体F-J)的具有2’,3’-断开的碳-碳键且另外在例如其2’-碳原子(核糖核苷命名法)携带羟基基团以外的官能团或基团的单体结构单元的方法。
在本发明的一种优选实施方式中，制备单体D的亚磷酰胺衍生物的方法的关键步骤中包括2’,3’-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O2’-保护和O3’-亚磷酰化。
在一种优选实施方式中，以例如高碘酸钠为试剂使用氧化裂解进行2’,3’-二醇裂解。
在另一种优选实施方式中，高碘酸钠裂解后中间产物的还原通过例如硼氢化钠被还原为相应的二醇。
为了将单体D并入本发明的RNA复合物，有必要保护2’-羟基基团(核糖核苷命名法)。在本发明的一种优选实施方式中，这通过苯甲酰化进行。为了优化保护的选择性，即O2’-苯甲酰化相对于O3’-苯甲酰化的量，仅使用略多于一当量的苯甲酰化试剂(苯甲酰氯或例如苯甲酸酐(benzoyl anhydride))是有益的。在一种优选实施方式中，苯甲酰化在室温以下进行。在另一种有用的实施方式中，苯甲酰化在0℃以下或甚至-50℃以下进行。
在另一种优选实施方式中，O2’-保护通过乙酰化或通过使用有机合成领域技术人员已知的酰化试剂进行酰化来完成。
在另一种优选实施方式中，O2’-保护通过使用有机合成领域技术人员已知的硅烷化试剂和方法进行硅烷化来完成。优选的硅烷化保护基团是叔丁基二甲基甲硅烷基或三异丙基氧甲基。
在一种优选实施方式中，随后的亚磷酰化反应使用所谓“PCl”试剂[PCl(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)]或所谓“双亚磷酰胺(bis-amidite)”试剂[P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2]进行。
在一种制备单体D的亚磷酰胺衍生物的方法的优选实施方式中，起始物料是核糖核苷，例如核糖核苷的O5’-DMT保护的衍生物，对于碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶含有碱基保护基团，如例如苯甲酰基、异丁酰基、乙酰基、苯氧乙酰基、叔丁基苯氧乙酰基或本领域技术人员已知的其他标准碱基保护基团。
在本发明的一种优选实施方式中，制备单体E亚磷酰胺衍生物的方法的关键步骤中包括2’,3’-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O3’-保护和O2’-亚磷酰化。O3’-保护可例如通过硅烷化或酰化进行，或通过组合如首先O2’-苯甲酰化、然后O3’-硅烷化、之后O2’-脱苯甲酰化进行。如本领域技术人员清楚的，还可应用其他保护基团。
在另外优选实施方式中，制备适于并入单体(如单体F-J)的具有2’,3’-断开的碳-碳键且另外在其2’-碳原子(核糖核苷命名法)携带羟基基团以外的官能团的单体结构单元的方法的关键步骤中包括开始于核糖核苷(例如O5’-DMT保护的核糖核苷)的2’,3’-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O3’-保护、2’-羟基基团的转化、O3’-脱保护和O3’-亚磷酰化。O3’-保护可例如通过硅烷化或酰化进行，或如首先O2’-苯甲酰化、然后O3’-硅烷化、之后O2’-脱苯甲酰化的组合进行。如本领域技术人员清楚的，还可应用其他保护基团。可使用有机合成领域技术人员已知的方法和程序将2’-羟基基团转化为另一基团，如氨基、酰化氨基、烷基化氨基、二烷基化氨基、氨甲酰化氨基、哌嗪基、酰化哌嗪基、烷基化哌嗪基、氨甲酰化哌嗪基、巯基、酰化巯基、烷基化巯基、二硫化物、酰化羟基、烷基化羟基、氨甲酰化羟基等，或这些基团取代和/或保护的衍生物。这种方法和程序包括对2’-羟基基团的活化衍生物的取代反应或酰化或氨甲酰化反应。这种方法和程序还包括O2’-烷基化反应和并入其他C2’连接基团(如氨基或巯基)后的烷基化反应。又一种可能性是2’-羟基基团氧化获得醛官能团，该醛官能团可通过例如与亲核试剂反应进一步修饰，或获得羧基官能团，该羧基官能团可在羧基官能团转化为活化的衍生物(如活化酯)后通过例如与亲核试剂反应进一步修饰。
在本发明另一种实施方式中，制备适于并入单体(如单体F-J)但为“倒置的”(如单体D和E可认为是“倒置的”)以使O2’原子被亚磷酰基化且3’-羟基基团转变为另一基团以使C3’原子连接于羟基基团以外的官能团的单体结构单元的方法，其关键步骤中包括开始于核糖核苷(例如O5’-DMT保护的核糖核苷)的2’,3’-二醇裂解、所得的中间产物的还原、选择性O2’-保护、3’-羟基基团的转化、O2’-脱保护和O2’-亚磷酰化。O2’-保护可例如通过硅烷化或酰化、或两者的组合来进行。如本领域技术人员清楚的，还可应用其他保护基团。可使用有机合成领域技术人员已知的方法和程序将3’-羟基基团转化为另一基团，如氨基、酰化氨基、烷基化氨基、二烷基化氨基、氨甲酰化氨基、哌嗪基、酰化哌嗪基、烷基化哌嗪基、氨甲酰化哌嗪基、巯基、酰化巯基、烷基化巯基、二硫化物、酰化羟基、烷基化羟基、氨甲酰化羟基等，或这些基团取代和/或保护的衍生物。这种方法和程序包括对3’-羟基基团的活化衍生物的取代反应或酰化或氨甲酰化反应。这种方法和程序还包括O3’-烷基化反应和并入其他C3’连接基团(如氨基或巯基)后的烷基化反应。又一种可能性是3’-羟基基团氧化获得醛官能团，该醛官能团可通过例如与亲核试剂反应进一步修饰，或获得羧基官能团，该羧基官能团可在羧基官能团转化为活化的衍生物(如活化酯)后通过例如与亲核试剂反应进一步修饰。
在一种实施方式中，通过将2’-羟基基团转化为离去基团(例如甲磺酸酯衍生物)、随后与大量过量哌嗪反应而制备2’-C-哌嗪基衍生物。这例如可作为朝向结构亚磷酰胺J的亚磷酰胺合成的步骤进行(参见下图)。
在又一种实施方式中，本发明包括制备适于并入本发明的羟甲基取代的单体、在C1’原子(核糖核苷命名法)携带不同于天然核碱基的基团或官能团的单体结构单元的方法。可含有保护基团的这种基团或官能团包括例如天然核碱基以外的芘、苝、荧光团、氢、烷基、反应性基团和杂环。
在又一种实施方式中，本发明包括制备适于并入本发明的羟甲基取代的单体的单体结构单元的方法，该单体结构单元被构造为H-膦酸酯衍生物而非亚磷酰胺衍生物。
以下显示本发明关于亚磷酰胺(＝amidite)结构单元的一些优选实施方式的结构实例(DMT＝4,4’-二甲氧基三苯甲基；碱基＝天然核碱基；CEtO＝氰基乙氧基)：
R＝烷基、胆固醇基衍生物、荧光团、多胺、脂肪酸、氨基酸、糖或多肽等。
在本发明的第九方面中，提供了一种包含无环寡核苷酸的寡核苷酸。本发明的第九方面是包含羟基取代的核苷酸单体的寡核苷酸。根据说明书和实施例部分显而易见的是，这种寡核苷酸具有多种用途和益处。
在一种优选实施方式中，该羟甲基取代的核苷酸单体是2’-3’-开环-核苷酸单体。已经惊讶地发现包含羟甲基取代的核苷酸单体的本发明的寡核苷酸是RNAi机制的细胞酶底物，且在一些情形中，这些寡核苷酸是甚至比不含羟甲基取代的核苷酸单体的相同寡核苷酸更好的底物。
优选地，该羟甲基取代的核苷酸单体选自单体E、F、G、H、I或J(参见图1)。如技术人员清楚的，G、F、H、I和J均可从单体D的合成性前体制备。如图2所示，无环的单体可转化为携带共轭基团的衍生物，所述共轭基团诸如胆固醇基衍生物、烷基、荧光团、多胺、氨基酸、糖、寡核苷酸和/或多肽等。当寡核苷酸用于调节细胞、器官或生物体中的靶mRNA的活性时，这种共轭基团对于例如更好的生物稳定性和/或生物分布可以是有用的。
寡核苷酸的长度优选10至40个核苷酸单体。甚至更优选18至30个核苷酸单体的长度。
在一种优选实施方式中，本发明的寡核苷酸包括少于5个羟甲基取代的核苷酸单体。在另一种优选实施方式中，所述寡核苷酸包括对每5个核苷酸单体(不同于羟甲基取代的核苷酸单体)不多于1个的羟甲基取代的核苷酸单体。甚至更优选的是每8个核苷酸单体(不同于羟甲基取代的核苷酸单体)不多于1个的无环的单体。如果羟甲基取代的核苷酸单体的数目太高，那么本发明的寡核苷酸对互补核酸的结合亲和力会受损。在另一种实施方式中，所述寡核苷酸包括1到5个羟甲基取代的核苷酸单体。
在一种优选实施方式中，羟甲基取代的核苷酸单体存在于寡核苷酸的1、2、3、4、5、6、7和/或8位，更优选存在于寡核苷酸的2、3、4、5、6和/或7位。所述位置从寡核苷酸的5’端开始计数。这些区域的羟甲基取代的核苷酸单体将减弱或阻止寡核苷酸发挥微RNA的作用，因为这些位置对应于微RNA的所谓种子区。例如当寡核苷酸意为作为siRNA引导链起作用时，这一点是相关的。
在一种优选实施方式中，反义链中所有羟甲基取代的核苷酸单体均存在于9、10、11、12、13、14、15和/或16位，其中所述位置从反义链的5’端开始计数。甚至更优选地，反义链中羟甲基取代的核苷酸单体存在于9、10和/或11位。因此，前述区域中羟甲基取代的核苷酸单体的存在将诱导反义链发挥微RNA的作用，即确保siRNA效应最小且微RNA效应高得多。
在一种优选实施方式中，所述寡核苷酸不包括多于8个连续的DNA单体的DNA序列。甚至更优选不多于6个连续的DNA单体，最优选不多于4个连续的DNA单体。连续的DNA单体通常使得寡核苷酸在结合于互补RNA时激活RNA酶H，这导致RNA降解。在本发明一些实施方式中，这是不期望的。因此在进一步实施方式中，所述寡核苷酸根本不含有任何DNA单体。
在其他实施方式中，RNA酶H激活是期望的且所述寡核苷酸优选包括多于4个连续的DNA单体，更优选多于6个DNA单体，最优选多于8个DNA单体。
在又一种实施方式中，所述寡核苷酸包括多于50％的RNA单体。高程度的RNA单体将促进与RNA-相互作用蛋白相互作用，例如通过作为细胞酶(例如RISC)的底物或导标(或辅因子)起作用。
在另一种实施方式中，优选的是，多于80％的寡核苷酸单体是RNA单体。在又一种实施方式中，优选的是，多于90％的寡核苷酸单体是RNA单体。
所述寡核苷酸还可包括核苷酸单体类似物。在一种这样的实施方式中，羟甲基取代的核苷酸单体和RNA单体构成所有核苷酸单体的多于80％。在另一种实施方式中，无环的单体和RNA单体构成所有核苷酸单体的多于90％。
当所述寡核苷酸包括核苷酸单体类似物时，该核苷酸单体类似物优选选自2’-O-烷基-RNA单体、2’-氨基-DNA单体、2’-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体和INA单体。核苷酸类似物通常用于调节结合亲和力、增加生物稳定性且通常给予寡核苷酸更多的药物样性质。
在一种实施方式中，所述寡核苷酸包括至少2个LNA核苷酸类似物。羟甲基取代的核苷酸单体通常减少本发明的寡核苷酸与互补核酸碱基配对的解链温度(即结合亲和力)，并且LNA核苷酸单体可用于抵消解链温度的这种减少。即在一种实施方式中，羟甲基取代的核苷酸单体的数目与LNA核苷酸单体的数目相同。
在一种优选实施方式中，所述寡核苷酸仅包括无环的单体和RNA单体。
在另一种优选实施方式中，所述寡核苷酸仅包括羟甲基取代的核苷酸单体、RNA单体和LNA核苷酸类似物。
在一种优选实施方式中，本发明的寡核苷酸包括选自硫代磷酸酯键、硼代磷酸酯键、乙基膦酸酯键、氨基磷酸酯键和磷酸三酯键中的一种或更多种键。最优选的是硫代磷酸酯键和/或硼代磷酸酯键。这些键改善寡核苷酸的生物稳定性并且还已显示对寡核苷酸的生物分布有积极影响。在一种优选实施方式中，所述寡核苷酸包括多于50％的前述核苷酸间连接键，甚至更优选多于75％。在一种实施方式中，所有核苷酸间连接键均是前述类型。
在一种优选实施方式中，本发明的寡核苷酸不与互补寡核苷酸碱基配对，即本发明的寡核苷酸是单链。
在又一种实施方式中，所述寡核苷酸能够介导与所述寡核苷酸互补的靶mRNA的RISC依赖性翻译阻遏或降解。技术人员可认识到RISC作为RNA诱导的沉默复合物，并理解在该实施方式中所述寡核苷酸将作为RISC的引导序列起作用并从而将RISC引导向RNA寡核苷酸，通常是对本发明的寡核苷酸具有部分或具有完全互补性的mRNA。当所述寡核苷酸将RISC引导至部分互补性的mRNA靶时，所述寡核苷酸可被视为微RNA模拟物，且当所述寡核苷酸将RISC引导至具有完全互补性的mRNA靶时，其可被视为单链或双链siRNA。
可通过使用针对编码RISC组件的mRNA的siRNA敲除RISC的组件并评价寡核苷酸在敲除细胞系中的活性，来在细胞系中评价RISC依赖性。这种实验是本领域技术人员熟知的。
在本发明的第十方面中，提供了一种包含本发明寡核苷酸的RNA双链体。本发明的第十方面是包含根据本发明的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的RNA双链体。在一种优选实施方式中，RNA双链体的第二寡核苷酸也是本发明的寡核苷酸。在第一方面中就本发明的RNA复合物描述的实施方式也适用于第十方面的RNA双链体。
优选地，本发明的RNA双链体包括15到40个数目的碱基对，且在一种优选实施方式中，包括选自下述数目的碱基对：18个碱基对、19个碱基对、20个碱基对、21个碱基对、22个碱基对和23个碱基对。
在又一种实施方式中，所述RNA双链体包括25到30个数目的碱基对，更优选地26到28个且最优选地27个碱基对。这种RNA双链体可被称为切丁酶底物RNA。
在一种优选实施方式中，本发明的RNA双链体包括悬端。在另一种实施方式中，RNA双链体包括两个悬端。在又一种实施方式中，第一寡核苷酸包括3’悬端。在又一种实施方式中，第二寡核苷酸包括3’悬端。优选地，悬端的长度为1至8个核苷酸，甚至更优选地，悬端的长度选自具有1个核苷酸、2个核苷酸和3个核苷酸的长度的悬端。
在另一种实施方式中，RNA双链体包括至少一个平端。在另一种实施方式中，RNA双链体两个末端均是平端。
在一种优选实施方式中，所述RNA双链体包括18-22个碱基对的双链区，其中第一寡核苷酸和第二寡核苷酸各包括1-3个核苷酸的3’悬端。这种RNA双链体可被认为是规范的siRNA(短干扰RNA)。
在一种实施方式中，所述RNA双链体的一条链是不连续的，如第一方面详述。
在一种实施方式中，所述RNA双链体能够介导与所述RNA双链体的第一或第二寡核苷酸互补的靶mRNA的翻译阻遏或降解。即RNA双链体可发挥例如siRNA、微RNA或前-微RNA的作用。
在一种实施方式中，与具有RNA单体而非无环的单体的相同RNA双链体相比，所述RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，同时诱导减少的脱靶效应。
在另一种实施方式中，当无环的单体特别位于siRNA双链体引导(反义)链的5-10位(其中所述位置从寡核苷酸5’端开始计数)时，所述RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，同时诱导减少的脱靶效应。
在另一种实施方式中，当无环的单体特别位于siRNA双链体的引导(反义)链的6-8位时，所述RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，同时诱导减少的脱靶效应。在另一种实施方式中，引导链中包含一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体的RNA双链体的引导链的诱导微RNA型效应的能力降低。
在一种实施方式中，所述RNA双链体能够介导RNA靶向，例如基因沉默或RNA干扰，与具有RNA单体而非无环的单体的相同RNA双链体相比具有增加的效力。
在一种实施方式中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，与具有RNA单体而非无环的单体的相同RNA双链体相比具有延长的效力。
在一种实施方式中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，其中RNA双链体与具有RNA单体而非无环单体的相同RNA双链体相比具有改善的生物稳定性。
在又一种实施方式中，RNA双链体能够介导靶mRNA的翻译阻遏或降解，其中RNA双链体与具有RNA单体而非无环的单体的相同RNA双链体相比具有减少的免疫刺激。
本发明的RNA复合物可靶向不同基因。适于作为靶的人类基因的实例尤其包括TNF、FLT1、VEGF家族、ERBB家族、PDGFR家族、BCR-ABL以及MAPK家族等。适于作为靶的人类基因及其核酸序列的实例包括下列文献中公开的那些：PCT/US08/55333、PCT/US08/55339、PCT/US08/55340、PCT/US08/55341、PCT/US08/55350、PCT/US08/55353、PCT/US08/55356、PCT/US08/55357、PCT/US08/55360、PCT/US08/55362、PCT/US08/55365、PCT/US08/55366、PCT/US08/55369、PCT/US08/55370、PCT/US08/55371、PCT/US08/55372、PCT/US08/55373、PCT/US08/55374、PCT/US08/55375、PCT/US08/55376、PCT/US08/55377、PCT/US08/55378、PCT/US08/55380、PCT/US08/55381、PCT/US08/55382、PCT/US08/55383、PCT/US08/55385、PCT/US08/55386、PCT/US08/55505、PCT/US08/55511、PCT/US08/55515、PCT/US08/55516、PCT/US08/55519、PCT/US08/55524、PCT/US08/55526、PCT/US08/55527、PCT/US08/55532、PCT/US08/55533、PCT/US08/55542、PCT/US08/55548、PCT/US08/55550、PCT/US08/55551、PCT/US08/55554、PCT/US08/55556、PCT/US08/55560、PCT/US08/55563、PCT/US08/55597、PCT/US08/55599、PCT/US08/55601、PCT/US08/55603、PCT/US08/55604、PCT/US08/55606、PCT/US08/55608、PCT/US08/55611、PCT/US08/55612、PCT/US08/55615、PCT/US08/55618、PCT/US08/55622、PCT/US08/55625、PCT/US08/55627、PCT/US08/55631、PCT/US08/55635、PCT/US08/55644、PCT/US08/55649、PCT/US08/55651、PCT/US08/55662、PCT/US08/55672、PCT/US08/55676、PCT/US08/55678、PCT/US08/55695、PCT/US08/55697、PCT/US08/55698、PCT/US08/55701、PCT/US08/55704、PCT/US08/55708、PCT/US08/55709以及PCT/US08/55711，这些文献均由此通过引用并入本文。
实施例
实施例1.本发明的RNA复合物的合成
用于自动DNA/RNA合成本发明的RNA复合物的羟甲基取代的单体的亚磷酰胺结构单元的制备程序已被报道[thymine derivatives；K.D.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,1493；H.Thrane等人,Tetrahedron 1995,51,10389；P.Nielsen等人,Bioorg.Med.Chem.1995,3,19]。
将这些羟甲基取代的单体向本发明RNA复合物的并入遵循用于a)在自动RNA合成仪上的RNA合成、b)RNA整理、c)RNA纯化和d)RNA分离的标准方法(F.Eckstein,Oligonucleotides and Analogues,IRL Press,Oxford University Press,1991)。这证实能够使用已知的亚磷酰胺衍生物、通过RNA合成标准技术合成羟甲基取代的RNA寡核苷酸(＝RNA链)和RNA复合物。
LNA是含有一个或更多个2’-O,4’-C-亚甲基-连接的核糖核苷酸(LNA核苷酸)的寡核苷酸(M.Petersen和J.Wengel,Trends Biotechnol.2003,21,74-81)。LNA-修饰的siRNA是含有一个或更多个LNA单体的siRNA构建体。通过使用可商购的LNA亚磷酰胺，已经使用已知方法将LNA核苷酸并入本发明的RNA复合物[Pfundheller,Lomholt,Johansen,Koch和Wengel,J."Locked Nucleic Acid Synthesis(锁核酸合成)",Methods Mol.Biol.2004,第288卷(Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)),127-145.,P.Herdewijn编辑,Humana Press Inc.]。
羟甲基取代的siRNA(“羟甲基取代的小干扰RNA)是含有一个或更多个羟甲基取代的核苷酸单体(参见图1的羟甲基取代的核苷酸单体的结构)的siRNA构建体。示例单体如下所示：
下列实施例描述了对于羟甲基取代的RNA复合物的设计，不限于本文未清楚地揭示的其他RNA构建体的设计。这些例如为平端的siRNA双链体、比本文示例的双链体短或长的siRNA双链体、单链反义RNA分子(RNA复合物)以及包含反义链和不连续过客链(“过客链”还可称为“有义链”)的RNA复合物。
腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶的示例亚磷酰胺衍生物的制备程序在专利申请序列号PCT/US2008/064417(实施例11)中公开，其内容通过引用完整并入本文。
实施例2.RNA复合物中羟甲基核苷酸单体取代模式
羟甲基核苷酸单体(例如单体D)并入RNA复合物中的特定位置影响基因沉默活性、细胞因子诱导、链活性、“脱靶”效应、RNA复合物的热稳定性，以及在切丁酶底物RNA复合物的情况下，影响RNA复合物的切丁酶加工。
下文提供了RISC RNA复合物和切丁酶RNA复合物中羟甲基核苷酸单体的示例取代模式。RNA复合物(双链RNA)的各链的核苷酸单体数目通过X串或H串来表示(即，具有序列独立性)。各“X”独立地和每次出现可为任何核苷(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶或其任何类似物或衍生物)，而各“H”独立地和每次出现可为非核苷酸羟甲基核苷酸单体(例如，具有任何核碱基的单体D)。在各情况下，有义链和反义链由于各链之间碱基配对而退火形成双链区。这些图解的目的是显示具有独立于序列的羟甲基核苷酸单体的RNA复合物的取代模式。
RISC RNA复合物的羟甲基核苷酸单体取代模式
对于下列各RNA复合物，有义链和反义链各自长度为21个核苷酸单体(除了其中有义链长度为22个核苷酸单体的基序#P-1和P-1/G7)，包括核苷或非核苷酸羟甲基核苷酸单体(例如，单体D)。各复合物使用“基序#”标示，并提供羟甲基核苷酸单体或“H”的位置。各链中各“H”的位置通过从其中定位有羟甲基核苷酸单体的链5’端开始计数。对于本文揭示的任何RNA复合物，-1位(负1)或1位表示羟甲基核苷酸单体是该链3’最末端的核苷酸单体(或该链3’端最后一个核苷酸单体)。对于下列RISC长度的RNA复合物，有义链或反义链的21位或22位表示核苷酸单体占据从该链5’端开始计数的最后两个位置。
切丁酶RNA复合物的羟甲基核苷酸单体取代模式
对于下列各RNA复合物，有义链长度为25个核苷酸单体，反义链长度为27个核苷酸单体(25/27-mer)，包括核苷或非核苷酸羟甲基核苷酸单体(例如，单体D)。各复合物使用“基序#”标示，并提供羟甲基核苷酸单体或“H”的位置。各链中的各“H”的位置通过从其中定位有羟甲基核苷酸单体的链5’端开始计数而确定。
具有基序10的RNA复合物具有一个平端和25个碱基对的双链区，该双链区具有与反义链的5’端连接的两个非核苷酸羟甲基核苷酸单体(或位于从反义链5’端开始计数的反义链的26和27位；羟甲基核苷酸单体占据从该链5’端开始计数的最后两个位置)，并具有与有义链3’端连接的一个非核苷酸羟甲基核苷酸单体(或位于从有义链5’端开始计数的有义链的25位，羟甲基核苷酸单体占据从该链5’端开始计数的最后一个位置)。
实施例3.RISC长度的RNA复合物中羟甲基核苷酸单体取代的位置特异性效应
上述实施例中所述的取代模式(基序)适用于不同的序列特异性的RISC长度的RNA复合物。这些RNA复合物在下文表1-7中提供。下表序列中的羟甲基取代的单体被标示为“unaH”，其中H是核碱基的单字母编码(例如，“unaC”表示胞嘧啶包含羟甲基取代的单体)。
表1：靶向流感病毒PB2基因的RISC长度的RNA复合物
表2：靶向流感病毒PA基因的RISC长度的RNA复合物
表3：靶向流感病毒NP基因的RISC长度的RNA复合物
表4：靶向SOS1基因的RISC长度的RNA复合物
表5：靶向ApoB基因的RISC长度的RNA复合物
表6：靶向ApoB基因的RISC长度的RNA复合物
表7：靶向ICAM-1基因的RISC长度的RNA复合物
RISC长度的RNA复合物的基因沉默活性
检测了包含羟甲基单体(例如，单体D)的RISC长度的RNA复合物的基因沉默活性(或“敲减活性”)。
简言之，对于在Hela细胞中的转染，以约5,000个HeLa细胞/孔接种在多孔板内具有10％胎牛血清的DMEM中，并在37℃/5％CO2下过夜温育。在转染之前，将Hela细胞培养基更换为无血清DMEM。根据制造商的说明书，将在无血清DMEM中稀释的含有靶基因的约1,000个碱基对插入物的psiCHECKTM-2载体和RNA复合物(对于上文确定的所有RNA复合物均25nM、2.5nM以及0.25nM，除了MAPK14RNA复合物在2.5nM测定)与稀释的Lipofectamine 2000TM(LF2K)转染试剂混合，然后在室温下温育20分钟。转染混合物制剂的实例包括93μL的Opti-MEM,3μL的RNA复合物，4μL含有靶的psiCHECKTM-2质粒，以及100μL稀释的LF2K(即，1.4μL LF2K与98.6μLOpti-MEM)。将LF2K/psiCHECKTM-2-[靶基因插入物]与RNA复合物溶液一起添加至Hela细胞，然后在37℃、5％CO2下温育4.5小时。在共转染(约22小时)之后，使用胰蛋白酶处理细胞，并以105个细胞/mL的浓度悬浮于含有10％FBS的无抗体的DMEM中。
通过下述步骤测定使用RNA复合物和psiCHECKTM-2载体转染的Hela细胞的萤火虫和海肾(Renilla)萤光素酶报告子活性，首先在振荡下添加Dual-GloTM萤光素酶试剂(Promega,Madison,WI)10分钟，然后在VICTOR3TM1420多标计数仪(PERKINELMER)上对发光信号进行定量。在检测萤火虫的萤光之后，在振荡下添加Stop&试剂(PROMEGA,Madison,WI)同时猝灭萤火虫萤光素酶反应并启动海肾萤光素酶反应，然后在VICTOR3TM1420多标计数仪(PerkinElmer)上对海肾萤光素酶反应进行定量。各RISC长度的RNA复合物的基因沉默活性示于下文表中。将所有样品均相对于在相同实验中运行的相应dsRNA QNeg(QIAGEN)阴性对照样品进行标准化。即，将Qneg值设定为100％活性(即，未敲减的)，使用95％可信区间(CI)。
简言之，对于HepG2细胞(ApoB3410RNA复合物)中的转染，以约15,000个细胞/孔接种在微孔板内具有10％胎牛血清的DMEM中。转染混合物包含RNA复合物(ApoB3410RNA复合物)与OptiMEM中的RNAiMAX(0.05nM,0.5nM或5nM RNA浓度)的组合。将转染混合物与铺板的HepG2细胞(总体积75μL)一起温育24小时。从转染的细胞收获RNA，并进行qRT-PCR以测定ApoB和阴性对照GAPDH RNA的表达水平。下文表格总结了转染的HepG2细胞相对于Qneg阴性对照siRNA的ApoB信使的敲除百分数。
对于下文表8-14，较低的百分数表示靶RNA的敲除较高(100％表示无敲除)。对于下文表14(ApoB3410RNA复合物)，较高的百分数表示敲除较高(0％表示无敲除)。
表8：靶向流感病毒PB2基因的RISC长度的RNA复合物
表9：靶向流感病毒PA基因的RISC长度的RNA复合物
表10：靶向流感病毒NP基因的RISC长度的RNA复合物
表11：靶向SOS1基因的RISC长度的RNA复合物
表12：靶向ApoB基因的RISC长度的RNA复合物
表13：靶向ICAM-1基因的RISC长度的RNA复合物
表14：靶向ApoB基因的RISC长度的RNA复合物
上文表8-14中显示RISC长度的RNA复合物的基因沉默活性表明应用于具有不同序列和基因靶的多个siRNA的基序22、31、32以及G7的羟甲基核苷酸单体取代模式相对于具有相同序列但不含羟甲基核苷酸单体的RNA复合物通常维持和/或改进了RNA复合物的基因沉默活性。另外，RNA复合物中针对ICAM-1基因的基序P-1、P1、P2以及P3的羟甲基核苷酸单体取代模式相对于具有相同序列但不含羟甲基核苷酸单体的RNA复合物通常维持和/或改进了RNA复合物的基因沉默活性。
RISC长度的RNA复合物的链特异性活性
检测包含羟甲基单体的RISC长度的RNA复合物的链特异性沉默活性(或“敲减活性”)。
针对其相应的“反向”psiCHECKTM-2载体质粒检测SOS1和ICAM-1特异性RISC长度的RNA复合物(即，质粒表达与有义链而非反义链互补的RNA，因此RNA复合物各条链的作用是相反的)。在“反向”质粒的情况下，“有义”链用作基于RISC的基因沉默活性的引导链，“反义”链用作过客链。出于清楚的目的，对于“正向”psiCHECKTM-2载体质粒，反义链充当基于RISC的基因沉默活性的引导链，有义链充当过客链。通过对于RNA复合物针对“正向”和“反向”载体质粒的沉默活性进行对比，可确定RNA复合物的反义链和有义链的沉默活性。
对于该实施例，表13中显示了ICAM-1RNA复合物的引导链(RNA复合物的反义链)针对“正向”质粒的沉默活性，并将其与ICAM-1RNA复合物的过客链(RNA复合物的有义链)针对“反向”质粒的沉默活性进行对比(见表15)。对于SOS1特异性RISC长度的RNA复合物，在表11中显示了引导链针对“正向”质粒的沉默活性，并将其与过客链的沉默活性进行对比(“反向质粒”)(示于表16)。
表15：靶向ICAM-1基因(反向质粒)的RISC长度的RNA复合物
通过将表13(ICAM-1RNA复合物针对“正向”质粒)和表15(ICAM-1RNA复合物针对“反向”质粒)的结果进行对比，观察到了羟甲基核苷酸单体对于链特异性RNAi活性的位置特异性作用。例如，将反向质粒实验中RISC长度的ICAM1:1383RNA复合物的(P-1)、(P1)、(P2)以及(P3)基序相对未修饰的ICAM1:1383(25nM RNA)的相关基因沉默活性(表15，分别79％、86％、99％以及91％与57％)与正向质粒实验中相同基序的相关基因沉默活性(表13，分别53％、55％、60％以及81％与87％的基因沉默活性)进行对比。另外，将正向质粒实验中RISC长度的ICAM1:1383RNA复合物的(G2)基序相对未修饰的ICAM1:1383(25nM RNA)的相关基因沉默活性(表13，分别105％对87％)与反向质粒实验中相同基序的相关基因沉默活性(表15，分别61％对57％的基因沉默活性)进行对比。在各情况下，当在从链5’端开始计数的-1、2、2以及3位并入羟甲基取代的核苷酸单体时，用作引导链的RNA复合物的链针对靶的RNAi活性降低或无针对靶的RNAi活性。
表16：靶向SOS1基因(反向质粒)的RISC长度的RNA复合物
通过将表11(SOS1:364RNA复合物针对“正向”质粒)和表16(SOS1:364RNA复合物针对“反向”质粒)的结果进行对比，观察到了羟甲基核苷酸单体对于链特异性RNAi活性的位置特异性作用。例如，将反向质粒实验中RISC长度的SOS1:364RNA复合物的基序(24)和(27)对未修饰的SOS1:364(在2.5nM RNA)的相关沉默活性(表16，分别45.8％和10.5％对5.5％基因沉默活性)与正向质粒实验中相同基序的相关沉默活性(24和27对未修饰的)(表11，分别27％和86.5％对59.1％的基因沉默活性)进行对比。在各情况下，当在从链5’端开始计数的2位并入羟甲基取代的核苷酸单体时，用作引导链的RNA复合物的链针对靶的RNAi活性降低或无针对靶的RNAi活性。
因此，将羟甲基取代的核苷酸单体置于包含羟甲基核苷酸单体的链(例如，有义链或过客链)的从5’端开始计数的-1、1、2和/或3位(特别是2位)或在这些位置周围减弱或消除了RNA复合物中该链的沉默活性(即，减弱或消除可因过客链或非靶向链的不想要的RNAi活性而出现的任何潜在的“脱靶”效应)。
另外，结果显示，尽管在RNA复合物的一条链中的-1、1、2和/或3位中的一个或更多个位置引入一个或更多个羟甲基核苷酸单体减弱或消除了该链的RNAi活性，但另一条链仍旧具有高的RNAi活性。
RISC长度的RNA复合物的“脱靶”效应
RNAi是一种用于破坏靶基因表达的有效技术，但该方法的不想要的结果是它还可影响非靶基因的表达(所谓的“脱靶”效应)。
检测了具有和不含羟甲基核苷酸单体的RNA复合物的“脱靶”效应的程度。在该研究中，ApoB:3410RNA复合物用于测定过客链的“脱靶”活性。将未修饰的ApoB:3410RISC长度的RNA复合物与具有基序(P-1/G7)的相同序列进行对比。
简言之，根据本文较早描述的方案和方法来培养HepG2细胞。根据制造商的方案使用GENECHIP人类基因组U133Plus 2.0微点阵(AFFYMETRIX)进行微点阵分析。当观察到基因表达水平改变2倍或更多(向上或向下)时，对“脱靶”基因效应进行计数。
结果显示“脱靶”效应减弱了大于10倍。对于未修饰的ApoB:3410RISC长度的RNA复合物，389个基因的表达水平改变两倍或更多，而对于具有基序(P-1/G7)的ApoB:3410RISC长度的RNA复合物，仅35个基因的表达水平改变2倍或更多。在这两种情况下，ApoB靶信使均减弱约95％。
RISC长度的RNA复合物的体内基因沉默
体内检测具有和不含羟甲基核苷酸单体的RNA复合物的基因沉默活性。在该研究中，ApoB是靶。在含有mol％比50:28:20:2的DILA2氨基酸化合物(或(E)-氨基((4-(十六烷基氨基)-3-(十八烷-9-烯氨基)-4-氧丁基)氨基)甲亚胺)、CHEMS(半琥珀酸胆固醇酯)以及DMPE-PEG2K(具有2kDa PEG的1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)的制剂中分别以0.5mg/kg(每天30nmol/kg)、1mg/kg(或每天60nmol/kg)以及2mg/kg(或每天120nmol/kg)对Balb/C小鼠进行RNA复合物静脉内给药，每组有5只小鼠，各组以200μL/剂的体积给药。
在该研究中，施用上文描述的RNA复合物ApoB:10169和ApoB:10169(31)以及下文描述的RNA复合物。下文序列中核苷酸前的“m”表示该核苷存在2’-O-甲基修饰。
DX4227(ApoB):
5’-GGAAUCmUmUAmUAmUmUmUGAUCmCAsA-3’21-mer有义链(SEQ ID NO:157)
5’-mUmUGGAUmCAAAmUAmUAAGAmUUCmCsmCsU-3’21-mer反义链(SEQ ID NO:158)
DX3838(G1498；阴性对照RNA复合物):
5’-mGmGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG 25-mer有义链(SEQ ID NO:159)
5’-mCmAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCUU 27-mer反义链(SEQ ID NO:160)
各组小鼠的ApoB mRNA减少百分数和血清胆固醇水平的相应减少百分数(下表16中的各RNA复合物标示物列表示了5只小鼠的组中ApoB mRNA水平和血清胆固醇水平减少的平均百分数)示于下表中。ApoB mRNA水平的减少百分数是相对于单独PBS对照而言。
表17.小鼠ApoB mRNA和血清胆固醇水平下降
表16中的数据显示具有位于从其中安置羟甲基取代的核苷酸单体的链5’端开始计数的有义链和反义链各自的20和21位的羟甲基取代的核苷酸单体(单体D)的RISC长度的RNA复合物(或具有19个碱基对双链区和与有义链和反义链各自的3’端连接的两个非核苷酸羟甲基核苷酸单体的平端构建体)与单独PBS相比在体内减弱ApoB mRNA水平达95％。而具有包含TT的3’端悬端的相同RNA复合物降低ApoB mRNA水平达80％。另外，小鼠体重显示无显著变化，并且未观察到可见的毒性，表明包含羟甲基取代的核苷酸单体(单体D)的RNA复合物可用作安全有效的治疗。总之，结果表明RNA复合物中并入无环羟甲基取代的核苷酸单体在体内提高RNA复合物的基因沉默活性。
实施例4.切丁酶长度的RNA复合物中羟甲基核苷酸单体取代的位置特异性效应
实施例2中表现的取代模式(基序)应用于不同的序列特异性切丁酶长度的RNA复合物。这些RNA复合物在下文表18-22中提供。下表序列中的羟甲基取代的单体被标记为“unaH”，其中H是核碱基的单字母编码(例如，“unaC”表示胞嘧啶包含羟甲基取代的单体)。
表18：靶向流感病毒PB2基因的切丁酶长度的RNA复合物
表19：靶向流感病毒PA基因的切丁酶长度的RNA复合物
表20：靶向流感病毒NP基因的切丁酶长度的RNA复合物
表21：靶向SOS1基因的切丁酶长度的RNA复合物
表22：靶向ApoB基因的切丁酶长度的RNA复合物
切丁酶长度的RNA复合物的基因沉默活性
检测了包含羟甲基单体(例如，单体D)的切丁酶长度的RNA复合物的基因沉默活性(或“敲减活性”)。
如本文前述在Hela细胞中进行转染，并如本文前述将双萤光素酶报告子活性用于测定各切丁酶长度的RNA复合物的基因沉默活性。切丁酶长度的RNA复合物的基因沉默活性示于下文表22-25中。将所有样品均相对于在相同实验中运行的各dsRNA QNeg(QIAGEN)阴性对照样品进行标准化。即，将Qneg值设定为100％活性(即，未敲减的)，使用95％可信区间(CI)。
表23：靶向流感病毒PB2基因的切丁酶长度的RNA复合物
表24：靶向流感病毒PA基因的切丁酶长度的RNA复合物
表25：靶向流感病毒NP基因的切丁酶长度的RNA复合物
表26：靶向SOS1基因的切丁酶长度的RNA复合物
表27：靶向ApoB基因的切丁酶长度的RNA复合物
上文表22-25中显示的切丁酶长度的RNA复合物的基因沉默活性表明应用于具有不同序列和基因靶的多个siRNA的基序3、7、9以及10的羟甲基核苷酸单体取代模式相对于具有相同序列但不含羟甲基核苷酸单体的RNA复合物通常维持和/或改进该RNA复合物的基因沉默活性。
切丁酶长度的RNA复合物的细胞因子诱导
检测包含羟甲基单体(例如，单体D)的切丁酶长度的RNA复合物的细胞因子诱导。
简言之，通过Ficoll梯度从汇集的人血液分离人外周血单核细胞(PBMC)。使用具有10％FBS、1X NEAA以及1X Glutamax的IMDM培养基培养细胞。以每孔100μL生长培养基中320,000个细胞来对PBMC进行铺板。使用具有100nM上文表格中的RNA复合物之一和OptiMEM中的0.25μL RNAiMAX的混合物(最终转染培养基为约120μL)转染PBMC 4小时。各转染一式三份进行。在转染4小时之后，将生长培养基添加至各孔达250μL的终体积。培养转染的细胞24小时，之后收集上清液。通过离心去除细胞和细胞碎片，在-20℃下冷冻澄清的上清液，直至测定细胞因子诱导。通过ELISA(PBLBiomedical人IFNα试剂盒，批号4100-2；遵照制造商的方案)检测收集的上清液中人IFN-α的水平。人IFN-α的水平用于表示一般的免疫反应。使用切丁酶长度的RNA复合物转染的人PBMC中的人IFN-α水平示于下文表28和29中。
表28：人PBMC细胞中的平均IFN-α水平
RNA复合物标示物(基序#) IFN-α的平均水平(pg/mL)
仅细胞(无RNA复合物) 0
RNAiMAX(无RNA复合物) 3.2
FluA1:2242 25/27(G3789) 229.3
FluA1:2242 25/27-2 0
FluA1:2242 25/27-3 0
FluA1:2242 25/27-4 0
FluA1:2242 25/27-7 180.7
FluA1:2242 25/27-8 0
FluA1:2242 25/27-9 241.5
FluA1:2242 25/27-10 2.6
FluA3:2089 25/27(G8282) 53.5
FluA3:2089 25/27-2 0
FluA3:2089 25/27-3 0
FluA3:2089 25/27-4 0
FluA3:2089 25/27-7 0
FluA3:2089 25/27-8 0
FluA3:2089 25/27-9 24.2
FluA3:2089 25/27-10 0
G1498DS(DX3030) 311.7
FluA5:1498 25/27-2 0
FluA5:1498 25/27-3 19.6
FluA5:1498 25/27-4 25.5
FluA5:1498 25/27-7 21
FluA5:1498 25/27-8 28.4
FluA5:1498 25/27-9 148.2
FluA5:1498 25/27-10 63.6
表29：人PBMC细胞中的平均IFN-α水平
RNA复合物标示物(基序#) IFN-α的平均水平(pg/mL)
仅细胞(无RNA复合物) 3.2
RNAiMAX(无RNA复合物) 8.5
SOS1:364 25/27 252.7
SOS1:364 25/27-2 0
SOS1:364 25/27-3 0
SOS1:364 25/27-4 0
SOS1:364 25/27-7 197
SOS1:364 25/27-8 0
SOS1:364 25/27-9 92.1
SOS1:364 25/27-10 6
DX3951:ApoB切丁酶 39.4
ApoB:10167 25/27-2 1
ApoB:10167 25/27-3 21.5
ApoB:10167 25/27-4 4
ApoB:10167 25/27-7 59.6
ApoB:10167 25/27-8 2.6
ApoB:10167 25/27-9 4.5
ApoB:10167 25/27-10 20.5
相对于不含羟甲基取代的单体的RNA复合物，应用于靶向五个不同基因的五个不同的切丁酶长度的复合物的基序2、3、4、8以及10减弱和/或消除了细胞因子诱导。
ELISA测定的结果显示任何切丁酶长度的RNA复合物的侧邻两个切丁酶裂解位点(例如，修饰基序2)的羟甲基取代的单体不诱导人PBMC中的人IFN-α产生(与RNA复合物的未修饰形式相比)。与不含羟甲基取代的单体的相同RNA复合物相比，在切丁酶长度的RNA复合物的有义链的21和22位和有义链的2和6位(从有义链5’端开始计数)上引入羟甲基取代的单体消除或减弱了人IFN-α表达。与不含羟甲基取代的单体的相同RNA复合物相比，在切丁酶长度的RNA复合物的反义链的6和7位或反义链的8位上引入羟甲基取代的单体消除或减弱了人IFN-α表达。与不含羟甲基取代的单体的相同RNA复合物相比，在切丁酶长度的RNA复合物的有义链的25位和反义链的26和27位上引入羟甲基取代的单体消除或减弱了人IFN-α表达。另外，与不含羟甲基取代的单体的相同RNA复合物相比，在切丁酶长度的RNA复合物的有义链的21和22位和反义链的6和7位上引入羟甲基取代的单体消除或减弱了人IFN-α表达。
为了进一步研究细胞因子应答和羟甲基取代的核苷酸单体“掩饰”RNA复合物或消除或减弱细胞因子诱导的能力，检测了TLR3(Toll样受体3)、MDA5(IFIH1)以及RIG-I(维甲酸可诱导的基因1)激活。
TLR3是先天免疫系统的模式识别受体的Toll样受体家族的成员之一。它识别双链RNA，例如来自RNA病毒的双链RNA。TLR3识别dsRNA并激活NF-κB以增加I型干扰素(细胞因子)的产生，然后将信号传导至其他细胞以增加其抗病毒防御。
MDA-5和RIG-I也识别双链RNA并发挥病毒(例如RNA病毒)感染的“感受器”的作用。
简言之，在48孔培养板的具有2％血清和生长添加剂(EGM-2BULLETKIT；CambrexBio Science)的EGM-2生长培养基中以每孔45,000个细胞对人脐带内皮细胞(HUVEC)进行铺板。温育细胞约24小时之后，使用50nM RNA复合物(FluA1:2242 25/27、G3789D-siRNA或FluA1:2242 25/27-10)之一和RNAiMAX的混合物转染HUVEC，阳性对照为单独的Poly I:C或RNAiMA(无RNA)。各转染一式三份进行。在转染4小时之后，将200μL EGM-2生长培养基添加至各孔。培养转染的细胞24小时，然后裂解并进行上清液收集。根据制造商的方案(AFFYMETRIX)，通过QUANTIGENE测定检测TLR3、MDA-5以及RIG-I的水平。TLR3、MDA-5以及RIG-I表达的水平示于下文表30中。将所有水平均相对PPIA表达水平标准化。
表30：TLR3、MDA-5以及RIG-I的mRNA表达水平的倍数变化
上表30中显示的表达水平表明不含羟甲基取代的核苷酸单体的切丁酶长度的RNA复合物(FluA1:2242 25/27,未修饰的G3789)诱导TLR3、MDA-5以及RIG-I表达水平高于单独使用RNAiMAX，并且与阳性对照Poly I:C相当。相比之下，具有羟甲基取代的核苷酸单体(基序10)的相同切丁酶长度的RNA复合物不诱导TLR3、MDA-5以及RIG-I表达水平。因此，对于羟甲基取代的核苷酸单体进行策略性定位可“掩饰”切丁酶长度的RNA复合物免于被支持激活对双链RNA的免疫应答的细胞受体识别。
切丁酶对切丁酶长度的RNA复合物的加工
检测了切丁酶对于包含羟甲基取代的单体的切丁酶长度的RNA复合物的加工。
在体外将未修饰的或含有修饰基序2、3或4(见实施例2对于修饰基序的描述)的切丁酶长度的RNA复合物G3789、G8282、G1498、SOS1以及ApoB与切丁酶一起温育，并通过HPLC纯化，以及通过LC-MS分析来测定切丁酶的加工量。
简言之，通过在缓冲液中混合合适比例的有义链和反义链，加热至95℃ 1分钟，然后使得缓慢冷却至室温，来制备未修饰和修饰的RNA复合物各40μM。在37℃使RNA复合物经受切丁酶作用24小时。在24小时温育阶段之后，使用带有600mL水的漂浮透析膜对样品进行脱盐1小时。然后将样品上样在HPLC瓶中，并注入LC-MS。HPLC参数如下：流速，0.2mL/分钟；柱MS C182.5μm，2.1×50mm,，柱温度65℃，流动相A：100mM HFIP,7mM TEA,pH 8.1；流动相B：100％甲醇，梯度2-14％，经40分钟无任何柱前体积，注射体积为15μL。LC-MS参数如下：阴离子模式，毛细管3.0kV，锥体40V，溶解温度300℃，溶解流速(N2)600L/小时，源温度90℃，300-1950m/z经1.5秒收集。使用所写的(最大熵)软件来分析质谱数据。
适用于靶向五个不同基因的五个不同的切丁酶长度的RNA复合物的基序2、3以及4阻止了切丁酶的加工。
数据显示切丁酶不加工在侧邻切丁酶切割位点具有羟甲基取代的单体的切丁酶长度的RNA复合物，不管羟甲基取代的单体位于有义链和反义链二者还是位于一条链(有义链或反义链)。未修饰的RNA复合物被切丁酶裂解。所检测的所有具有羟甲基取代的单体的修饰的切丁酶长度的RNA复合物均保留了基因沉默活性(见上文)，表明尽管RNA复合物未被切丁酶加工，但这些RNA复合物仍具有RNAi活性且减弱靶基因表达。
因此，具有位于从有义链5’端开始计数的有义链的21和22位(基序3)的羟甲基取代的单体的切丁酶长度的RNA复合物未被切丁酶加工。另外，包含位于从反义链5’端开始计数的反义链的6和7位(基序4)的羟甲基取代的单体的RNA复合物未被切丁酶加工。包含位于从有义链5’端开始计数的有义链的21和22位的羟甲基取代的单体和位于从反义链5’端开始计数的反义链的6和7位的羟甲基取代的单体的RNA复合物未被切丁酶加工(基序2)。

Claims (26)

1.一种寡聚物，所述寡聚物包含一个或更多个2’-3’-开环单体和一个或更多个核糖核酸单体，且寡聚物包含有义链和反义链以及具有15至24个碱基对的双链区，其中所述有义链5’端的三个位置中的任一个或更多个位置被相同或不同的2’-3’-开环单体占据。
2.根据权利要求1所述的寡聚物，其中所述寡聚物还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的2’-3’-开环单体占据的寡聚物。
3.根据权利要求1所述的寡聚物，其中所述寡聚物还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的2’-3’-开环单体占据的寡聚物。
4.一种寡聚物，所述寡聚物包含一个或更多个2’-3’开环单体和一个或更多个核糖核酸单体，且寡聚物包含有义链和反义链以及具有15至24个碱基对的双链区，其中所述反义链5、6、7以及8位中的一个或更多个位置被相同或不同的2’-3’-开环单体占据，其中所述反义链的位置从所述反义链5’端的1位开始计数。
5.根据权利要求4所述的寡聚物，其中所述寡聚物还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的2’-3’-开环单体占据的寡聚物。
6.根据权利要求4所述的寡聚物，其中所述寡聚物还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的2’-3’-开环单体占据的寡聚物。
7.根据权利要求1-6任何一项所述的寡聚物，其中所述双链区具有19或20个碱基对。
8.根据权利要求1-6任何一项所述的寡聚物，其中所述有义链和所述反义链各自的长度为21或22个核苷酸单体。
9.根据权利要求1-6任何一项所述的寡聚物，其中所述寡聚物具有平端或3’端悬端。
10.根据权利要求1-6任何一项所述的寡聚物，其中所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:12、34、56、78、100、124或147的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
11.一种寡聚物，所述寡聚物包含一个或更多个2’-3’-开环单体和一个或更多个核糖核酸单体，且寡聚物包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链3’端的最后一个位置和所述有义链3’端的最后一个位置被相同或不同的2’-3’-开环单体占据。
12.根据权利要求11所述的寡聚物，其中所述反义链3’端的最后两个位置被相同或不同的2’-3’-开环单体占据。
13.一种寡聚物，所述寡聚物包含一个或更多个2’-3’-开环单体和一个或更多个核糖核酸单体，且寡聚物包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述有义链的21、22以及23位中的一个或更多个位置被相同或不同的2’-3’-开环单体占据，其中所述有义链的位置从所述有义链5’端的1位开始计数。
14.一种寡聚物，所述寡聚物包含一个或更多个2’-3’-开环单体和一个或更多个核糖核酸单体，且寡聚物包含有义链和反义链以及具有25至40个碱基对的双链区，其中所述反义链的18、19、20、21以及22位中的一个或更多个位置被相同或不同的2’-3’-开环单体占据，其中所述有义链的位置从所述反义链3’端的1位开始计数。
15.根据权利要求13或14所述的寡聚物，所述寡聚物还包括所述反义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的2’-3’-开环单体占据的寡聚物。
16.根据权利要求13或14所述的寡聚物，所述寡聚物还包括所述有义链3’端的最后两个位置中的一个或两个被相同或不同的2’-3’-开环单体占据的寡聚物。
17.根据权利要求11、13或14所述的寡聚物，其中所述反义链具有含至少15个连续核苷酸单体的区域，所述15个连续核苷酸单体与SEQ ID NO:169、185、201、217或233的任何15个连续的核苷酸单体相对应。
18.根据权利要求1-6和11-14任一项所述的寡聚物，其中所述2’-3’-开环单体选自下述单体D、F、G、H、I或J：
其中，R选自氢、烷基、胆固醇衍生物、荧光团、多胺、脂肪酸、氨基酸、糖以及多肽，
其中碱基为任何嘌呤、嘧啶或它们的衍生物或类似物。
19.根据权利要求1-6和11-14任一项所述的寡聚物，所述寡聚物还包括选自下述的核苷酸类似物：2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体以及INA单体。
20.一种降低体外细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备权利要求1-6和11-14任一项所述的寡聚物并使用所述寡聚物处理细胞，其中所述寡聚物是siRNA或microRNA。
21.权利要求1-6和11-14任一项所述的寡聚物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
22.一种RNA复合物，其包含一起构成由反义链和过客链组成的siRNA双链体的两条链，单链RNA分子(例如，反义RNA)、功能性RNA(fRNA)、或非编码RNA(ncRNA)、例如小时序RNA(stRNA)、微RNA(miRNA)、小核内RNA(snRNA)、短干扰RNA(siRNA)、小核仁RNA(snRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA(tRNA)以及它们的前体RNA，RNAa分子，微RNA模拟分子，所述RNA复合物包含一个或更多个2’-3’-开环单体。
23.根据权利要求22所述的RNA复合物，其中所述2’-3’-开环单体选自下述单体D、F、G、H、I或J：
其中，R选自氢、烷基、胆固醇衍生物、荧光团、多胺、脂肪酸、氨基酸、糖以及多肽，
其中碱基为任何嘌呤、嘧啶或它们的衍生物或类似物。
24.根据权利要求22所述的RNA复合物，所述RNA复合物还包括选自下述的核苷酸类似物：2'-O-烷基-RNA单体、2'-氨基-DNA单体、2'-氟-DNA单体、LNA单体、PNA单体、HNA单体、ANA单体、FANA单体、CeNA单体、ENA单体、DNA单体以及INA单体。
25.一种降低体外细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备权利要求22所述的RNA复合物并使用所述RNA复合物处理细胞。
26.权利要求22所述的RNA复合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
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Families Citing this family (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110097915A (ko) * 2008-12-03 2011-08-31 마리나 바이오테크, 인크. ＵｓｉＲＮＡ 복합체
US20150025122A1 (en) 2009-10-12 2015-01-22 Larry J. Smith Methods and Compositions for Modulating Gene Expression Using Oligonucleotide Based Drugs Administered in vivo or in vitro
IL282401B (en) 2013-12-12 2022-08-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Complementary component irna compositions and methods for using them
WO2015106128A2 (en) * 2014-01-09 2015-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. MODIFIED RNAi AGENTS
CN113057959A (zh) 2014-02-11 2021-07-02 阿尔尼拉姆医药品有限公司 己酮糖激酶（KHK）iRNA组合物及其使用方法
JP6771387B2 (ja) 2014-03-25 2020-10-21 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 遺伝子サイレンシング用トランスサイレチン対立遺伝子選択的ｕｎａオリゴマー
CN106460025A (zh) * 2014-03-25 2017-02-22 阿克丘勒斯治疗公司 在基因沉默中具有降低的脱靶效应的una寡聚物
US9856475B2 (en) 2014-03-25 2018-01-02 Arcturus Therapeutics, Inc. Formulations for treating amyloidosis
WO2015175510A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating a serpinc1-associated disorder
JP6811094B2 (ja) 2014-05-22 2021-01-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用
EP3191591A1 (en) 2014-09-12 2017-07-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
KR20170075742A (ko) * 2014-10-02 2017-07-03 프로티바 바이오쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 B형 간염 바이러스 유전자 발현을 제거하는 조성물 및 방법
WO2016061487A1 (en) 2014-10-17 2016-04-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting aminolevulinic acid synthase-1 (alas1) and uses thereof
EP3904519A1 (en) 2014-10-30 2021-11-03 Genzyme Corporation Polynucleotide agents targeting serpinc1 (at3) and methods of use thereof
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
EP3221451A1 (en) 2014-11-17 2017-09-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
EP3256587A2 (en) 2015-02-13 2017-12-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
JP6830441B2 (ja) * 2015-04-01 2021-02-17 アークトゥラス・セラピューティクス・インコーポレイテッドＡｒｃｔｕｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 治療上のｕｎａオリゴマーおよびその使用
WO2016164746A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the lect2 gene
EP4365291A2 (en) 2015-06-12 2024-05-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
EP3310918B1 (en) 2015-06-18 2020-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting hydroxyacid oxidase (glycolate oxidase, hao1) and methods of use thereof
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
US10494632B2 (en) 2015-07-10 2019-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Insulin-like growth factor binding protein, acid labile subunit (IGFALS) compositions and methods of use thereof
US20170137821A1 (en) 2015-07-17 2017-05-18 Arcturus Therapeutics, Inc. Molecules and agents for treating hepatitis b virus
CN108136206B (zh) * 2015-07-17 2021-10-15 阿克丘勒斯治疗公司 抗乙型肝炎病毒的组合物和药剂及其用途
WO2017015671A1 (en) 2015-07-23 2017-01-26 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions for treating amyloidosis
CN108368507B (zh) 2015-09-02 2022-03-22 阿尔尼拉姆医药品有限公司 程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)的iRNA组合物及其使用方法
MA45295A (fr) 2016-04-19 2019-02-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composition d'arni de protéine de liaison de lipoprotéines haute densité (hdlbp/vigiline) et procédés pour les utiliser
US20190256845A1 (en) 2016-06-10 2019-08-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT C5 iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF FOR TREATING PAROXYSMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA (PNH)
TWI788312B (zh) 2016-11-23 2023-01-01 美商阿尼拉製藥公司 絲胺酸蛋白酶抑制因子Ａ１ ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
WO2018112320A1 (en) 2016-12-16 2018-06-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating or preventing ttr-associated diseases using transthyretin (ttr) irna compositions
US20200385719A1 (en) 2017-11-16 2020-12-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Kisspeptin 1 (kiss1) irna compositions and methods of use thereof
EP3728593A1 (en) 2017-12-18 2020-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. High mobility group box-1 (hmgb1) irna compositions and methods of use thereof
WO2019191780A1 (en) 2018-03-30 2019-10-03 Arcturus Therapeutics, Inc. Lipid particles for nucleic acid delivery
TW202016304A (zh) 2018-05-14 2020-05-01 美商阿尼拉製藥公司 血管收縮素原（ＡＧＴ）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
EP3833397A4 (en) 2018-08-08 2023-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS AND AGENTS AGAINST NON-ALCOHOLIC STEATOHEPATITIS
EP3833762A4 (en) 2018-08-09 2022-09-28 Verseau Therapeutics, Inc. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS FOR TARGETING CCR2 AND CSF1R AND THEIR USES
MX2021001056A (es) 2018-08-13 2021-04-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de agente de acido ribonucleico bicatenario (arnbc) de virus de la hepatitis b (vhb) y metodos de uso de las mismas.
US20210332367A1 (en) 2018-09-18 2021-10-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. KETOHEXOKINASE (KHK) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US10913951B2 (en) 2018-10-31 2021-02-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Silencing of HNF4A-P2 isoforms with siRNA to improve hepatocyte function in liver failure
US20220056455A1 (en) 2018-12-20 2022-02-24 Praxis Precision Medicines, Inc. Compositions and methods for the treatment of kcnt1 related disorders
WO2020150431A1 (en) 2019-01-16 2020-07-23 Genzyme Corporation Serpinc1 irna compositions and methods of use thereof
EP4007811A2 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carboxypeptidase b2 (cpb2) irna compositions and methods of use thereof
EP4007812A1 (en) 2019-08-01 2022-06-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serpin family f member 2 (serpinf2) irna compositions and methods of use thereof
EP4013870A1 (en) 2019-08-13 2022-06-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Small ribosomal protein subunit 25 (rps25) irna agent compositions and methods of use thereof
EP4045652A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Solute carrier family member irna compositions and methods of use thereof
WO2021081026A1 (en) 2019-10-22 2021-04-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof
EP4051795A1 (en) 2019-11-01 2022-09-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Huntingtin (htt) irna agent compositions and methods of use thereof
US20230056569A1 (en) 2019-11-22 2023-02-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
BR112022011417A2 (pt) 2019-12-13 2022-08-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições do agente de irna da fase de leitura aberta 72 do cromossomo humano 9 (c9orf72) e métodos de uso das mesmas
TW202138559A (zh) 2019-12-16 2021-10-16 美商阿尼拉製藥公司 含類ＰＡＴＡＴＩＮ磷脂酶結構域３（ＰＮＰＬＡ３）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
JP2023514190A (ja) 2020-02-10 2023-04-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ－ａ発現をサイレンシングするための組成物および方法
JP2023514336A (ja) 2020-02-18 2023-04-05 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）ｉＲＮＡ組成物およびその使用法
WO2021178607A1 (en) 2020-03-05 2021-09-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
JP2023516095A (ja) 2020-03-06 2023-04-17 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ケトヘキソキナーゼ（ＫＨＫ）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP4121534A1 (en) 2020-03-18 2023-01-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating subjects having a heterozygous alanine-glyoxylate aminotransferase gene (agxt) variant
EP4127168A1 (en) 2020-03-26 2023-02-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coronavirus irna compositions and methods of use thereof
KR20230008729A (ko) 2020-04-06 2023-01-16 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Myoc 발현을 사일런싱하기 위한 조성물 및 방법
WO2021207189A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for silencing scn9a expression
WO2021206917A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME 2 (ACE2) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2021206922A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
BR112022021813A2 (pt) 2020-04-27 2023-01-17 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de agente de apolipoproteína e (apoe) irna e métodos de uso das mesmas
IL297680A (en) 2020-04-30 2022-12-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc IRNA compounds complement factor b (cfb) and methods of using them
WO2021231679A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of gap junction protein beta 2 (gjb2)
WO2021231698A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate lyase (asl)
EP4150076A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
EP4150089A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of retinoschisin 1 (rs1)
WO2021231673A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of leucine rich repeat kinase 2 (lrrk2)
WO2021231685A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of transmembrane channel-like protein 1 (tmc1)
EP4150088A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of argininosuccinate synthetase (ass1)
EP4150090A1 (en) 2020-05-15 2023-03-22 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for the adar-mediated editing of otoferlin (otof)
US11408000B2 (en) 2020-06-03 2022-08-09 Triplet Therapeutics, Inc. Oligonucleotides for the treatment of nucleotide repeat expansion disorders associated with MSH3 activity
WO2021252557A1 (en) 2020-06-09 2021-12-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
EP4168546A1 (en) 2020-06-18 2023-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Xanthine dehydrogenase (xdh) irna compositions and methods of use thereof
TW202227102A (zh) 2020-09-22 2022-07-16 瑞典商阿斯特捷利康公司 治療脂肪肝病之方法
EP4217489A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
JP2023544413A (ja) 2020-10-05 2023-10-23 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｇタンパク質共役受容体７５（ＧＰＲ７５）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP4232582A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
MX2023005490A (es) 2020-11-13 2023-05-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones de acido ribonucleico de interferencia (arni) del factor de coagulacion v (f5) y sus metodos de uso.
WO2022125490A1 (en) 2020-12-08 2022-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Coagulation factor x (f10) irna compositions and methods of use thereof
WO2022150260A1 (en) 2021-01-05 2022-07-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. COMPLEMENT COMPONENT 9 (C9) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2022174000A2 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
CN117222739A (zh) 2021-02-25 2023-12-12 阿尔尼拉姆医药品有限公司 朊病毒蛋白(prnp)irna组合物和其使用方法
AU2022226098A1 (en) 2021-02-26 2023-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. KETOHEXOKINASE (KHK) iRNA COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2022187435A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiopoietin-like 3 (angptl3) irna compositions and methods of use thereof
WO2022192519A1 (en) 2021-03-12 2022-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
BR112023019981A2 (pt) 2021-03-29 2023-12-12 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições do agente irna de huntingtina (htt) e métodos de uso das mesmas
WO2022212153A1 (en) 2021-04-01 2022-10-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Proline dehydrogenase 2 (prodh2) irna compositions and methods of use thereof
BR112023022284A2 (pt) 2021-04-26 2023-12-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composições de irna de protease transmembrana, serina 6 (tmprss6) e métodos de uso da mesma
EP4330396A1 (en) 2021-04-29 2024-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Signal transducer and activator of transcription factor 6 (stat6) irna compositions and methods of use thereof
WO2022245583A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
WO2022246023A1 (en) 2021-05-20 2022-11-24 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
WO2022256283A2 (en) 2021-06-01 2022-12-08 Korro Bio, Inc. Methods for restoring protein function using adar
EP4347823A1 (en) 2021-06-02 2024-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Patatin-like phospholipase domain containing 3 (pnpla3) irna compositions and methods of use thereof
EP4347822A2 (en) 2021-06-04 2024-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Human chromosome 9 open reading frame 72 (c9orf72) irna agent compositions and methods of use thereof
AR126070A1 (es) 2021-06-08 2023-09-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para tratar o prevenir la enfermedad de stargardt y/o trastornos asociados con la proteína transportadora de retinol 4 (rbp4)
US20230194709A9 (en) 2021-06-29 2023-06-22 Seagate Technology Llc Range information detection using coherent pulse sets with selected waveform characteristics
EP4363574A1 (en) 2021-06-29 2024-05-08 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for adar-mediated editing
WO2023003805A1 (en) 2021-07-19 2023-01-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating subjects having or at risk of developing a non-primary hyperoxaluria disease or disorder
IL309905A (en) 2021-07-23 2024-03-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc IRNA compositions in β-catenin (CTNNB1) and methods of using them
WO2023009687A1 (en) 2021-07-29 2023-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coa reductase (hmgcr) irna compositions and methods of use thereof
KR20240042004A (ko) 2021-08-03 2024-04-01 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 트랜스티레틴(TTR) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
AU2022324003A1 (en) 2021-08-04 2024-02-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. iRNA COMPOSITIONS AND METHODS FOR SILENCING ANGIOTENSINOGEN (AGT)
KR20240045300A (ko) 2021-08-13 2024-04-05 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 인자 XII (F12) iRNA 조성물 및 이의 사용 방법
WO2023044370A2 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna compositions and methods for silencing complement component 3 (c3)
AU2022345881A1 (en) 2021-09-20 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Inhibin subunit beta e (inhbe) modulator compositions and methods of use thereof
CA3234835A1 (en) 2021-10-22 2023-04-27 Korro Bio, Inc. Methods and compositions for disrupting nrf2-keap1 protein interaction by adar mediated rna editing
WO2023076451A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement factor b (cfb) irna compositions and methods of use thereof
TW202334418A (zh) 2021-10-29 2023-09-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 杭丁頓（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法
WO2023122762A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Camp4 Therapeutics Corporation Modulation of gene transcription using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023240277A2 (en) 2022-06-10 2023-12-14 Camp4 Therapeutics Corporation Methods of modulating progranulin expression using antisense oligonucleotides targeting regulatory rnas
WO2024039776A2 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Universal non-targeting sirna compositions and methods of use thereof
WO2024059165A1 (en) 2022-09-15 2024-03-21 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 17b-hydroxysteroid dehydrogenase type 13 (hsd17b13) irna compositions and methods of use thereof

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003106477A1 (en) * 2002-06-01 2003-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds that include carbocyclic nucleosides and their use in gene modulation
WO2005032486A2 (en) * 2003-10-02 2005-04-14 Duke University A NOVEL SIRNA-BASED APPROACH TO TARGET THE HIF-α FACTOR FOR GENE THERAPY
WO2005059134A1 (en) * 2003-12-17 2005-06-30 Index Pharmaceuticals Ab COMPOUNDS AND METHODS FOR RNA INTERFERENCE OF THE p65 SUBUNIT OF NF-KAPPA-B

Family Cites Families (55)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4199574A (en) 1974-09-02 1980-04-22 Burroughs Wellcome Co. Methods and compositions for treating viral infections and guanine acyclic nucleosides
US4968686A (en) 1988-04-08 1990-11-06 The Regents Of The University Of Michigan Acyclic pyrrolo [2,3-d]pyrimidine analogs as antiviral agents
US5786359A (en) 1994-05-27 1998-07-28 The Scripps Research Institute N9 alkyl or aralkyl derivatives of 7, 8-disubstituted guanines
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
GB9505025D0 (en) 1995-03-13 1995-05-03 Medical Res Council Chemical compounds
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6069132A (en) 1996-08-14 2000-05-30 Revanker; Ganapathi R. Phosphazole compounds
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
US6037176A (en) 1999-06-25 2000-03-14 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of integrin beta 3 expression
GB9925459D0 (en) 1999-10-27 1999-12-29 Plant Bioscience Ltd Gene silencing
WO2002081628A2 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
US8273866B2 (en) 2002-02-20 2012-09-25 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (SINA)
WO2003070918A2 (en) 2002-02-20 2003-08-28 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Rna interference by modified short interfering nucleic acid
IL151928A0 (en) 2000-03-30 2003-04-10 Whitehead Biomedical Inst Rna sequence-specific mediators of rna interference
JP4095895B2 (ja) 2000-12-01 2008-06-04 マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォーデルング デル ヴィッセンシャフテン エー．ヴェー． Ｒｎａ干渉を媒介する短鎖ｒｎａ分子
US8546143B2 (en) 2001-01-09 2013-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of a target gene
CA2452458A1 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
BR0211111A (pt) 2001-07-12 2004-06-22 Univ Massachusetts Molécula de ácido nucleico isolada, vetor, célula hospedeira, transgene, precursor de rna engenheirado, animal transgênico não humano, e, método de induzir a interferência de ácido ribonucleico de um gene alvo em uma célula
CA2465129A1 (en) 2001-10-29 2003-05-08 Mcgill University Acyclic linker-containing oligonucleotides and uses thereof
US7388002B2 (en) 2001-11-14 2008-06-17 Biocryst Pharmaceuticals, Inc. Nucleosides, preparation thereof and use as inhibitors of RNA viral polymerases
US7897753B2 (en) 2002-02-20 2011-03-01 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of XIAP gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
AU2003290598A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
WO2004090108A2 (en) 2003-04-03 2004-10-21 Alnylam Pharmaceuticals Irna conjugates
CA2518475C (en) * 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
EP1608733B1 (en) 2003-04-02 2011-12-07 Dharmacon, Inc. Modified polynucleotides for use in rna interference
EP1620544B1 (en) 2003-04-17 2018-09-19 Alnylam Pharmaceuticals Inc. MODIFIED iRNA AGENTS
US8796436B2 (en) 2003-04-17 2014-08-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
EP3502252B1 (en) 2003-06-02 2023-04-05 University of Massachusetts Methods and compositions for controlling efficacy of rna silencing
US7750144B2 (en) 2003-06-02 2010-07-06 University Of Massachusetts Methods and compositions for enhancing the efficacy and specificity of RNA silencing
ES2905724T3 (es) 2003-06-13 2022-04-11 Alnylam Europe Ag Acido ribonucleico bicatenario con elevada eficacia en un organismo
EP2700720A3 (en) 2004-03-15 2015-01-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for optimizing cleavage of RNA by RNASE H
EP1742958B1 (en) 2004-03-15 2017-05-17 City of Hope Methods and compositions for the specific inhibition of gene expression by double-stranded rna
KR101147147B1 (ko) 2004-04-01 2012-05-25 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｒｎａ 간섭의 오프 타겟 효과 감소를 위한 변형된폴리뉴클레오타이드
EP3034510A1 (en) 2004-04-30 2016-06-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides comprising a c5-modified pyrimidine
JP2008501694A (ja) 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節の使用のために個別に修飾された鎖を有する二本鎖組成物
US7615618B2 (en) 2004-06-30 2009-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a non-phosphate backbone linkage
US7297786B2 (en) 2004-07-09 2007-11-20 University Of Iowa Research Foundation RNA interference in respiratory epitheial cells
US7579451B2 (en) 2004-07-21 2009-08-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a modified or non-natural nucleobase
US7632932B2 (en) 2004-08-04 2009-12-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
CA2619876A1 (en) 2005-08-17 2007-02-22 Sirna Therapeutics, Inc. Chemically modified short interfering nucleic acid molecules that mediate rna interference
US8101741B2 (en) 2005-11-02 2012-01-24 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
MX2009012568A (es) 2007-05-22 2009-12-08 Mdrna Inc Oligonucleotidos de acido ribonucleico sustituidos con hidroximetilo y complejos de acido ribonucleico.
ES2388590T3 (es) 2007-05-30 2012-10-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos con puente aminometileno N-sustituido.
ES2439591T3 (es) 2007-08-15 2014-01-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácido nucleico de tetrahidropirano
CN101849008A (zh) 2007-09-19 2010-09-29 应用生物系统有限公司 用于减少RNAi中的脱靶表型效应的siRNA的不依赖于序列的修饰形式和其稳定形式
US8247540B2 (en) 2007-12-06 2012-08-21 Alexander Deiters Caged nucleotides and oligonucleotides and their application
US8188060B2 (en) 2008-02-11 2012-05-29 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotides with enhanced functionality in gene regulation
US20110130440A1 (en) 2008-03-26 2011-06-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Non-natural ribonucleotides, and methods of use thereof
EP2321414B1 (en) 2008-07-25 2018-01-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Enhancement of sirna silencing activity using universal bases or mismatches in the sense strand
EP2350277A1 (en) 2008-10-23 2011-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for prevention or treatment of rsv infection using modified duplex rna molecules
KR20110097915A (ko) * 2008-12-03 2011-08-31 마리나 바이오테크, 인크. ＵｓｉＲＮＡ 복합체
WO2012177639A2 (en) 2011-06-22 2012-12-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Bioprocessing and bioproduction using avian cell lines

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003106477A1 (en) * 2002-06-01 2003-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds that include carbocyclic nucleosides and their use in gene modulation
WO2005032486A2 (en) * 2003-10-02 2005-04-14 Duke University A NOVEL SIRNA-BASED APPROACH TO TARGET THE HIF-α FACTOR FOR GENE THERAPY
WO2005059134A1 (en) * 2003-12-17 2005-06-30 Index Pharmaceuticals Ab COMPOUNDS AND METHODS FOR RNA INTERFERENCE OF THE p65 SUBUNIT OF NF-KAPPA-B

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
POUL NIELSEN ET AL.: "Synthesis and Evaluation of Oligodeoxynuceltides Containing Acyclic Nucleosides: Introduction of Three Novel Analogues and A Summary", 《BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY》 *
TROELS BUNDGAARD JENSEN ET AL.: "Unlocked nucleic acid (UNA) and UNA derivatives: Thermal denaturation studies", 《NUCLEIC ACIDS SERIES》 *

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