KR20110097915A - ＵｓｉＲＮＡ 복합체 - Google Patents

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KR20110097915A
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마이클 브이. 템플린
나렌드라 케이. 바이쉬
베리 에이. 폴리스키
마이클 이. 휴스톤
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마리나 바이오테크, 인크.
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Publication date
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Abstract

본 발명에서는 RNA 복합체의 패신저 가닥(또는 센스 가닥)에서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(nucleomonomer)를 포함하는 이중-가닥 RNA 복합체를 제시한다. 본 발명의 RNA 복합체는 치료 적용, 진단 적용 또는 연구 적용에 유용하다. RNA 복합체는 안티센스 가닥 및 연속 또는 불연속 패신저 가닥("센스 가닥")을 포함하는 유전자 발현을 조절할 수 있는 짧은 간섭 RNA 복합체(siRNA 이중나선)를 포함한다. 게다가, 본 발명의 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 3'-말단에, 5'-말단에, 3'-말단과 5'-말단 둘 모두에 배치될 수 있다.

Description

ＵｓｉＲＮＡ 복합체{UsiRNA Complexes}
본 발명의 기술분야
본 발명은 RNA 복합체의 패신저 가닥(passenger strand)에서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(nucleomonomer)를 포함하는 이중-가닥 RNA 복합체에 관계한다. 본 발명의 RNA 복합체는 치료 적용, 진단 적용 또는 연구 적용에 유용하다. 이들 복합체는 안티센스 가닥 및 연속 또는 불연속 패신저 가닥("센스 가닥")을 포함하는 유전자 발현을 하향-조절할 수 있는 짧은 간섭 RNA 복합체(siRNA 이중나선)를 포함한다. 이들 가닥 중에서 적어도 하나는 3'-말단에, 5'-말단에, 3'-말단과 5'-말단 둘 모두에, 및/또는 내부에 배치될 수 있는 본 발명의 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다.
서열 목록
본 출원은 2009년 11월 27일에 만들어지고 ASCII 파일로서 EFS-Web을 통해 함께 제출된 98,574 바이트 크기의 서열 목록 08-19PCT.txt를 포함하고, 이는 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
배경기술
RNA 간섭(RNAi)은 표적 유전자의 발현을 침묵시키는 수단을 제공하다. 이는 유전적 경로와 생화학적 경로, 그리고 개별 유전자와 유전자 산물의 기능을 연구하기 위한 방법을 기본적인 연구에 제공한다. 결과적으로, RNAi는 제약 산업에서 표적 확인(target validation)을 위한 중요한 도구가 되고 있고, 그리고 비정상적인 발현이 질병 상태 또는 이상과 연관되는 유전자에 대한 RNA 간섭을 매개할 수 있는 RNA 복합체에 기초된 약물을 개발하는 목적으로 상당한 투자가 이루어졌다.
하지만, RNAi 치료제로서 기능하는 RNA 복합체의 능력은 서열 특이성(sequence specificity) 또는 "부정확-표적(off-target)" 효과, 효능, 뉴클레아제 안정성(nuclease stability), 그리고 비-특이적 사이토킨 유도(non-specific cytokine induction)와 같은 문제점에 의해 제한된다.
본 발명에서는 RNAi에서 RNA 복합체와 연관된 부작용을 최소화하거나 제거하면서 RNA 복합체의 RNAi 활성을 개선하기 위한 화합물, 조성물, 방법 및 용도를 제시한다. 특히, 본 발명에서는 개선된 효능과 뉴클레아제 안정성, 그리고 감소된 또는 제거된 "부정확-표적" 효과 및/또는 사이토킨 유도를 갖는 RNA 복합체를 제조하고 이용하기 위한 신규한 화합물과 조성물을 제시한다.
간단한 요약
본 발명에서는 RNA-인도된 유전자 조절 또는 유전자 분석, 특히 RNA 간섭에 관련하여 이용되는 RNA 가닥 내로 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 단량체가 통합된 RNA 복합체를 제시한다. 따라서 본 발명의 목적은 전형적으로 이용되는 RNA 복합체와 비교하여 감소된 부정확-표적 효과를 갖는 RNA 복합체를 제시한다. 다른 목적은 감소된 인터페론 반응을 갖는 RNA 복합체를 제시하는 것이다. 또 다른 목적은 세포 배양액에서 또는 생체내에서 효소 분해(enzymatic degradation)에 대한 안정성에 관하여 개선된 특징을 갖는 RNA 복합체를 제시하는 것이다. 또 다른 목적은 변형되지 않은 RNA 복합체에 비하여, 세포 배양액에서 또는 생체내에서 강화된 유전자 조절 기능, 예를 들면, 유전자 침묵 효과를 나타내는 RNA 복합체를 제시하는 것이다. 또 다른 목적은 특정 장기 또는 조직으로 표적되고, 그리고 세포 막을 침투할 수 있는 RNA 복합체를 제시하는 것이다. 본 발명에서는 또한, 올리고뉴클레오티드 내로 히드록시메틸 치환된 단량체의 통합에 적합한 단량체 및 이들의 합성 방법을 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 센스 가닥의 5'-말단에서 마지막 3개의 위치 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유된다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 핵산은 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 안티센스 가닥의 위치 5, 6, 7과 8 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 안티센스 가닥의 이들 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링(numbering)된다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 핵산은 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 19개 또는 20개 염기쌍의 이중-가닥 영역을 보유한다.
다른 측면에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각, 21개 또는 22개 핵단량체 길이를 갖는다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 평활 말단(blunt end) 또는 3'-말단 오버행(overhang)을 보유한다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 12, 34, 56, 78, 100, 124, 또는 147의 임의의 15개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다. 관련된 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 12, 34, 56, 78, 100, 124, 또는 147의 임의의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 위치 및 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 위치가 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유된다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치가 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 센스 가닥의 위치 21, 22와 23 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 센스 가닥의 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 안티센스 가닥의 위치 18, 19, 20, 21과 22 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 센스 가닥의 이들 위치는 안티센스 가닥의 3'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링된다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 169, 185, 201, 217, 또는 233의 임의의 15개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
관련된 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 169, 185, 201, 217, 또는 233의 임의의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
다른 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 2'-3'-seco-핵단량체이다.
다른 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 단량체 D, F, G, H, I, 또는 J에서 선택된다:
Figure pct00001
여기서
R은 수소, 알킬 기, 콜레스테롤 유도체, 형광단, 폴리아민, 지방산, 아미노산, 당류와 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고, 그리고
염기는 임의의 퓨린, 피리미딘, 또는 이들의 유도체 또는 유사체이다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 2'-플루오르-DNA 단량체, LNA 단량체, PNA 단량체, HNA 단량체, ANA 단량체, FANA 단량체, CeNA 단량체, ENA 단량체, DNA 단량체, 그리고 INA 단량체로 구성된 군에서 선택되고 뉴클레오티드 유사체를 더욱 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 세포 내에서 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 핵산을 제조하는 단계, 그리고 세포를 상기 핵산으로 처리하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 인간에서 질환을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 질환은 류머티스성 관절염을 비롯한 염증 질환, 과콜레스테롤혈증을 비롯한 물질대사 질환, 간 질환, 뇌염, 뼈 골절, 심장 질환, 간염과 인플루엔자를 비롯한 바이러스 질환, 그리고 암에서 선택되고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 핵산을 제조하는 단계, 그리고 상기 핵산을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 류머티스성 관절염을 비롯한 염증 질환, 과콜레스테롤혈증을 비롯한 물질대사 질환, 간 질환, 뇌염, 뼈 골절, 심장 질환, 간염과 인플루엔자를 비롯한 바이러스 질환, 그리고 암을 비롯한 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 핵산의 용도를 제시한다.
도면의 간단한 설명
도 1: RNA 복합체 내에 통합되는 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 상이한 체계의 실례가 도시된다. 단량체 A는 비교 목적으로 도시되고, 그리고 리보오스 뼈대를 갖는 자연 RNA 단량체이다. 본 발명의 RNA 복합체 내에 포함되는 단량체 B-E의 특징은 이들이 히드록시메틸 기("유리 히드록시메틸 기")인 치환기를 포함한다는 것이다. 유리 히드록시메틸 기는 예로써, 환상 리보오스 뼈대의 C4' 원자 또는 비환상 리보오스-기초된 뼈대의 C1' 원자에서 부착된다. 본 발명의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 인 원자에 각각 부착된 다른 산소 원자를 보유하고, 따라서 뉴클레오티드간 연쇄의 형성에 참여한다(도 1 참조). 본 발명의 RNA 복합체의 히드록시메틸 치환된 핵단량체 중에서 하나 이상이 RNA 가닥의 3'- 또는 5'-말단에 배치되는 경우에, 이들 다른 산소 원자 중에서 하나 이상이 히드록시 기의 일부일 수 있다. 본 발명의 RNA 복합체의 히드록시메틸 치환된 핵단량체 중에서 하나가 이들 RNA 가닥의 3'-말단 및/또는 5'-말단에 배치될 때, 이러한 단량체의 히드록실 기는 임의의 말단 배치된 자연 RNA 단량체의 경우에서처럼 인산화될 수 있다. 본 발명의 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 핵염기, 예를 들면, 우라실, 티민, 시토신, 5-메틸시토신, 아데닌, 구아닌 또는 임의의 다른 공지된 자연 또는 합성 핵염기 또는 핵염기 유사체(도 1에서 "염기"로 표시됨)가 부착된다.
도 2: 히드록시메틸 치환된 단량체의 유도체화된, 기능화된, 그리고 접합된 변이체가 도시된다. 실례로써, 히드록시메틸 치환된 2', 3'-seco- 단량체 D의 유도체화된, 기능화된, 그리고 접합된 변이체가 도시된다(도 1 참조). 단량체 F는 에테르 연쇄를 통해 연결된 R 기를 보유한다. 단량체 G는 티오에테르 연쇄를 통해 연결된 R 기를 보유한다. 단량체 H는 아미드 연쇄를 통해 연결된 R 기를 보유한다. 단량체 I는 아미노 연쇄를 통해 연결된 R 기를 보유한다. 단량체 J는 피페라지노 단위를 통해 연결된 R 기를 보유한다. 본 발명의 RNA 복합체 내로 1개 또는 여러 개의 이런 단량체의 통합에 의해, 이들 RNA 복합체의 특성이 조절될 수 있다. 예로써, 증가된 생물안정성(생물안정성), 증가된 RNA 표적화 능력 또는 특정한 전달 특성이 도입될 수 있고, 그리고 검출 목적으로 형광 기가 부착될 수 있다.
도 3: 올리고뉴클레오티드 또는 RNA 복합체의 단량체일 수 있는 2개의 히드록시메틸 치환된 단량체(단량체 C와 단량체 D)의 구조.
상세한 설명
본 발명의 한 측면에서 기술된 일정한 특징은 본 발명의 다른 측면에도 적용된다. 가령, RNA 복합체에 관하여 기술된 특징은 올리고뉴클레오티드, 그리고 적절한 경우에, RNA 이중나선에도 적용될 수 있다.
siRNA 이중나선 또는 단일 가닥 RNA의 형태에서 RNA 복합체는 세포 내에서 표적 핵산의 다양한 변형을 매개할 수 있다. 이러한 과정에서, 복합체의 안티센스 가닥은 가이드로서 기능하는데, 그 이유는 이러한 안티센스 가닥이 안티센스 가닥에 상보적인 서열의 스트레치(stretch)를 보유하는 표적 핵산에 혼성화될 수 있다. 표적 핵산의 표적화에 앞서, 안티센스 가닥은 종종, 표적 핵산에서 기능할 수 있는 RNA 인도된 단백질 복합체(RNA guided protein complex, RGPC) 내로 통합된다. RNA 인도된 단백질 복합체의 한 가지 실례는 RNA 유도된 침묵 복합체(RNA Induced Silencing Complex, RISC)이다. 다른 이와 같은 RGPC가 존재하고, 그리고 본 발명의 RNA 복합체는 이들 다른 RGPC와 함께, 또는 임의의 RGPC와의 상호작용 없이 이용될 때에도 유익할 것으로 생각된다.
본 발명의 한 가지 목적은 생물학적 배지(혈청, 생체내, 세포 배양액) 내에서 핵산 분해(nucleolytic degradation)로부터 RNA 복합체를 안정화시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이중 가닥 RNA 복합체의 유전자 침묵 효과를 향상시키는 것이다. 이러한 개선은 예로써, 고유의 변형되지 않은 RNA 복합체에 비하여 증가된 효능, 감소된 부정확-표적 효과, 감소된 면역 자극, 보관 동안 증가된 안정성, 생물학적 배지, 예를 들면, 혈청 등에서 증가된 안정성, 증가된 작용 기간, 그리고 개선된 약동학적 특성에 관계한다.
본 발명의 또 다른 목적은 단일 가닥 RNA 올리고뉴클레오티드의 유전자 침묵 효과를 향상시키는 것이다. 이러한 개선은 예로써, 고유의 변형되지 않은 RNA 복합체에 비하여 증가된 효능, 감소된 부정확-표적 효과, 감소된 면역 자극, 보관 동안 증가된 안정성, 생물학적 배지, 예를 들면, 혈청 등에서 증가된 안정성, 증가된 작용 기간, 그리고 개선된 약동학적 특성에 관계한다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 배지 내에서 RNA 복합체의 충분한 안정성을 담보하는 것이다. 따라서 변형되지 않은 RNA 복합체에 비하여, 세포 배양액에서 또는 생체내에서 강화된 유전자 조절 기능, 예를 들면, 유전자 침묵 효과를 나타내는 RNA 복합체를 제공하는 것이 목적이다.
본 발명의 RNA 복합체의 RNA 가닥은 자연 RNA 뉴클레오티드, 유전자 침묵 활성과 양립하는 것으로 알려져 있는 RNA 변형[Nawrot and Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925], 그리고 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함할 수 있다(도 1). 포스포디에스테르 연쇄가 개별 단량체를 연결할 수 있지만, 당업자에게 공지된 변형된 연쇄, 예를 들면, 포스포로티오에이트 연쇄 및 기타 연쇄[Nawrot and Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925]가 대용될 수도 있다.
본 명세서에 기술된 RNA 복합체는 안티센스 가닥(안티센스 가닥은 본 명세서에서 가이드 가닥으로 지칭된다)과 패신저 가닥(패신저 가닥은 본 명세서에서 센스 가닥으로 지칭된다), 단일 가닥 RNA 분자(가령, 안티센스 RNA), 기능성 RNA(fRNA), 또는 비-코딩 RNA(ncRNA), 예를 들면, 작은 일시적 RNA(stRNA), microRNA(miRNA), 작은 핵 RNA(snRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 작은 핵소체 RNA(snRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 전이 RNA(tRNA), 그리고 이들의 선구체 RNA로 구성되는 siRNA 이중나선을 함께 구성하는 2개의 가닥을 포함할 수 있고, microRNA 모방 분자인 RNAa 분자 역시, 예로써 microRNA를 표적으로 하는데 유용한 단일 가닥 안티센스 분자에서처럼, 본 발명의 RNA 복합체로서 간주된다.
본 발명의 구체예에서, RNA 복합체는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다(도 1 참조). 이에 의하여, 이와 같은 한 가지 실례는 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 더욱 바람직하게는, 단량체 D-J로 구성된 군에서 선택되는 비환상 단량체이다. 따라서 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 관하여 첫 번째 측면에서 기술된 구체예는 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 관련된 다른 구체예에 적용될 것이다.
본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함하는 RNA 복합체는 단일 가닥 RNA 구조체이다.
본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함하는 RNA 복합체는 단일 가닥 안티센스 분자로서 기능함으로써 유전자 발현을 저해할 수 있는 단일 가닥 RNA 구조체이다
본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함하는 RNA 복합체는 microRNA를 기능적으로 모방하는 단일 가닥 RNA 구조체이다.
본 발명의 한 가지 바람직한 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함하는 RNA 복합체는 siRNA 구조체이다.
따라서 한 구체예에서, siRNA 구조체의 안티센스 가닥은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다.
다른 구체예에서, siRNA 구조체의 패신저 가닥은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다.
또 다른 구체예에서, siRNA 구조체의 끊어진(nicked) 패신저 가닥의 첫 번째와 두 번째 RNA 분자는 각각, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 센스 가닥의 5'-말단에서 마지막 3개의 위치 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유된다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 핵산은 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 안티센스 가닥의 위치 5, 6, 7과 8 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 안티센스 가닥의 이들 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링(numbering)된다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 핵산은 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 19개 또는 20개 염기쌍의 이중-가닥 영역을 보유한다.
다른 측면에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각, 21개 또는 22개 핵단량체 길이를 갖는다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 평활 말단(blunt end) 또는 3'-말단 오버행(overhang)을 보유한다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 12, 34, 56, 78, 100, 124, 또는 147의 임의의 15개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
관련된 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 12, 34, 56, 78, 100, 124, 또는 147의 임의의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 위치 및 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 위치가 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유된다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치가 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 센스 가닥의 위치 21, 22와 23 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 센스 가닥의 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링된다.
한 측면에서, 본 발명에서는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하는 핵산을 제시하고, 여기서 안티센스 가닥의 위치 18, 19, 20, 21과 22 중에서 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 센스 가닥의 이들 위치는 안티센스 가닥의 3'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링된다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중에서 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더욱 포함한다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 169, 185, 201, 217, 또는 233의 임의의 15개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
관련된 측면에서, 안티센스 가닥은 SEQ ID NO: 169, 185, 201, 217, 또는 233의 임의의 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개 연속 핵단량체의 영역을 보유한다.
다른 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 2'-3'-seco-핵단량체이다.
다른 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 단량체 D, F, G, H, I, 또는 J에서 선택된다:
Figure pct00002

여기서
R은 수소, 알킬 기, 콜레스테롤 유도체, 형광단, 폴리아민, 지방산, 아미노산, 당류와 폴리펩티드로 구성된 군에서 선택되고, 그리고
염기는 임의의 퓨린, 피리미딘, 또는 이들의 유도체 또는 유사체이다.
다른 측면에서, 상기 핵산은 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 2'-플루오르-DNA 단량체, LNA 단량체, PNA 단량체, HNA 단량체, ANA 단량체, FANA 단량체, CeNA 단량체, ENA 단량체, DNA 단량체, 그리고 INA 단량체로 구성된 군에서 선택되고 뉴클레오티드 유사체를 더욱 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 세포 내에서 유전자의 발현을 감소시키는 방법을 제시하고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 핵산을 제조하는 단계, 그리고 세포를 상기 핵산으로 처리하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 인간에서 질환을 치료하는 방법을 제시하고, 상기 질환은 류머티스성 관절염을 비롯한 염증 질환, 과콜레스테롤혈증을 비롯한 물질대사 질환, 간 질환, 뇌염, 뼈 골절, 심장 질환, 간염과 인플루엔자를 비롯한 바이러스 질환, 그리고 암에서 선택되고, 상기 방법은 본 명세서에서 기술된 바와 같은 핵산을 제조하는 단계, 그리고 상기 핵산을 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 류머티스성 관절염을 비롯한 염증 질환, 과콜레스테롤혈증을 비롯한 물질대사 질환, 간 질환, 뇌염, 뼈 골절, 심장 질환, 간염과 인플루엔자를 비롯한 바이러스 질환, 그리고 암을 비롯한 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같은 핵산의 용도를 제시한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 유전자의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 제시하고, 상기 dsRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하고, 그리고 여기서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 센스 가닥의 위치 1 또는 2 중에서 하나 이상에 존재한다.
단지 실례의 목적으로, 센스 가닥의 이들 위치는 아래와 같이 기술될 수 있다: X는 핵단량체(뉴클레오시드 또는 히드록시메틸 치환된 핵단량체)를 표시하고 숫자는 가닥 내에서 핵단량체의 위치를 표시한다. RISC 길이 RNA 복합체의 경우에, n은 5 내지 14(또는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14)일 수 있고, 그리고 Dicer 길이 RNA 복합체의 경우에, n은 15 내지 30(또는 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30)일 수 있다. 센스 가닥 내에서 핵단량체의 위치를 결정하기 위한 동일한 절차가 안티센스 가닥에 적용될 수 있다.
5' X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xn 3'
이러한 실례에서, 핵단량체 X1은 위치 1을 점유하고, X2는 위치 2를 점유한다.
관련된 측면에서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 핵단량체 및 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 핵단량체는 히드록시메틸 치환된 핵단량체이다.
단지 실례의 목적으로, 각각의 센스 가닥과 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 위치는 아래와 같이 표시될 수 있다: X는 핵단량체(뉴클레오시드 또는 히드록시메틸 치환된 핵단량체)를 표시하고 n은 위치를 표시한다. RISC 길이 RNA 복합체의 경우에, n은 13 내지 22(또는 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22)일 수 있고, 그리고 Dicer 길이 RNA 복합체의 경우에, n은 23 내지 38(또는 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 36, 37 또는 38)일 수 있다.
5' Xn-X(n+1)-X(n+2) 3'
이러한 실례에서, 마지막 핵단량체는 위치 X(n+2)로 표시되고, 마지막 핵단량체에 차위는 위치 X(n+1)로 표시되고, 그리고 가닥(센스 가닥 또는 안티센스 가닥 인지에 상관없이)의 3'-말단의 마지막 2개의 핵단량체는 X(n+1)과 X(n+2)로 표시된다.
관련된 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7 또는 8 중에서 하나 이상에 존재한다.
관련된 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 7에 존재한다.
관련된 측면에서, 이중-가닥 영역은 19개 또는 20개 염기쌍을 보유한다.
관련된 측면에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각각, 21개 또는 22개 핵단량체를 포함한다.
관련된 측면에서, dsRNA는 3'-말단 오버행을 보유한다.
관련된 측면에서, dsRNA는 평활 말단을 보유한다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 유전자의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 제시하고, 상기 dsRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 핵단량체 및 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 핵단량체는 히드록시메틸 치환된 핵단량체이다.
다른 측면에서, 본 발명에서는 유전자의 발현을 하향조절하는 이중-가닥 RNA(dsRNA)를 제시하고, 상기 dsRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하고, 그리고 여기서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 Dicer 효소에 의한 dsRNA의 처리를 저해하는 센스 가닥의 위치 중에서 하나 이상에 존재한다.
관련된 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 센스 가닥의 위치 21, 22 또는 23 중에서 하나 이상에 존재한다.
관련된 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 안티센스 가닥의 3'-말단으로부터 계산되는 안티센스 가닥의 위치 18, 19, 20, 21 또는 22 중에서 하나 이상에 존재한다.
본 발명의 한 측면에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 총수는 10개이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)의 총수는 각각, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개이다.
다른 측면에서, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 히드록시메틸 치환된 핵단량체이다.
본 발명의 한 측면에서, 안티센스 가닥 내에서 모든 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및/또는 8에 존재하고, 여기서 이들 위치는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계산된다. 더욱 바람직하게는, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계산된 위치 2, 3, 4, 5, 6, 및/또는 7에, 또는 microRNA의 소위 시드 영역(seed region)에 상응하게 존재한다. 다른 측면에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계산된 위치 4, 5, 6, 7 및/또는 8에 존재한다. 다른 측면에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계산된 위치 6, 7 및/또는 8에 존재한다. 다른 측면에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 RNA와 비교하여 RNA의 microRNA 활성을 감소시키는 안티센스 가닥 내에 위치에 존재한다. 따라서 전술한 영역 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 존재는 안티센스 가닥이 microRNA로서 기능하는 것을 예방하고, 이는 안티센스 가닥이 siRNA로서 기능하도록 의도될 때 부정확-표적 효과를 감소시킨다.
바람직한 구체예에서, 적어도 하나의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16 중에서 임의의 하나에 존재하고, 여기서 이들 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 더욱 바람직하게는, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16 중에서 임의의 하나에 존재하고, 여기서 이들 위치는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계산된다. 다른 구체예에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16 모두에 존재한다. 한 구체예에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16에만 존재하고 안티센스 가닥의 나머지 부분에는 존재하지 않는다.
더욱 바람직하게는, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 안티센스 가닥의 5' 말단으로부터 계산된 위치 9, 10, 및/또는 11에 존재하고, 그리고 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드의 나머지 부분에는 존재하지 않는다. 다른 측면에서, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 RNA와 비교하여 RNA의 microRNA 활성을 강화시키는 안티센스 가닥 내에 위치에 존재한다. 전술한 영역 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 존재는 안티센스 가닥이 microRNA로서 기능하도록 유도한다, 다시 말하면, siRNA 효과가 최소화되고 microRNA 효과가 더욱 높아지도록 담보한다.
유사하게, 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 총수는 10개이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 총수는 각각, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥의 모든 뉴클레오티드는 히드록시메틸 치환된 핵단량체이다.
특정 측면에서, dsRNA의 센스(패신저 가닥)는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다. 특정 측면에서, dsRNA의 센스(패신저 가닥)는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다. 특정 측면에서, dsRNA의 전체 센스(패신저 가닥)는 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다.
특정 측면에서, 센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및/또는 8에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 1, 2, 3, 및/또는 4에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 1, 2 및/또는 3에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 7 및/또는 8에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 RNA와 비교하여 RNA의 센스 가닥의 RNAi 활성을 감소시키는 RNA의 센스 가닥 내에 위치에 존재한다.
특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 및/또는 11에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다.
특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및/또는 32에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 특정 측면에서, 센스 가닥 내에 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및/또는 10에 존재하고, 여기서 이들 위치는 센스 가닥의 3'-말단으로부터 계산된다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 안티센스 가닥과 패신저 가닥 둘 모두 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)를 포함한다.
한 측면에서, 본 발명에서는 표적 핵산의 핵산 변형을 매개할 수 있는 RNA 복합체를 제시한다. 이런 RNA 복합체는 예로써, siRNA, microRNA 또는 microRNA 선구체(프리-microRNA)일 수 있다.
본 발명의 siRNA 복합체의 RNA 복합체는 안티센스 가닥 및 이러한 안티센스 가닥에 혼성화되는 패신저 가닥을 포함하는 중심 이중 가닥 영역을 포함한다.
본 명세서에서 언급되는 표적 핵산은 상기 복합체의 안티센스 가닥에 유의미한 상보성(complementarity)을 갖는 핵산이다. 바람직하게는, 상보성은 여러 뉴클레오티드의 스트레치 상에서 완전하다.
따라서 한 구체예에서, 상보성은 25개 뉴클레오티드의 스트레치 상에서 완전하다.
다른 구체예에서, 상보성은 각각, 24개 뉴클레오티드, 23개 뉴클레오티드, 22개 뉴클레오티드, 21개 뉴클레오티드, 20개 뉴클레오티드, 19개 뉴클레오티드, 18개 뉴클레오티드, 17개 뉴클레오티드, 16개 뉴클레오티드, 15개 뉴클레오티드, 14개 뉴클레오티드, 13개 뉴클레오티드, 12개 뉴클레오티드, 11개 뉴클레오티드, 10개 뉴클레오티드, 9개 뉴클레오티드, 8개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드 또는 6개 뉴클레오티드의 스트레치 상에서 완전하다.
한 구체예에서, 상보성 스트레치는 1개 미스매치(mismatch)를 포함한다. 다른 구체예에서, 상보성 스트레치는 각각, 2개 미스매치, 3개 미스매치 또는 4개 미스매치를 포함한다. 1의 미스매치는 염기쌍이 형성될 수 없는, 예를 들면, G가 A에 면하고 있는 상보성 스트레치 내에 한 영역이다. 더욱 많은 미스매치가 존재할 때, 이들은 서로 인접하거나, 또는 상보성 스트레치의 상이한 영역 내에서 이격될 수 있다.
본 발명의 siRNA 복합체의 RNA 복합체는 바람직한 구체예에서, 중심 이중-가닥 영역을 포함하고, 이는 실질적으로 이중-가닥 영역이다. 이러한 RNA 복합체 내에서 단일-가닥 영역은 주로, 상기 복합체의 오버행에 관련된다.
따라서 한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 이중-가닥 영역은 1개 미스매치를 포함한다. 다른 구체예에서, 이중-가닥 영역은 각각, 2개 미스매치, 3개 미스매치와 4개 미스매치를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "표적 핵산"은 안티센스 가닥에 의해 인도된 조절, 예를 들면, 표적화된 절단 또는 입체 차단(steric blockage)에 종속되는 임의의 RNA/DNA를 포함한다. 표적 RNA/DNA는 예로써, 게놈 DNA, 게놈 바이러스 RNA, mRNA, 프리-mRNA, 또는 비-코딩 RNA일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "연결된"은 2가지 화학적 존재(가령, RNA 및 히드록시메틸 치환된 핵단량체) 사이에 직접적으로, 또는 예로써, 링커(linker)를 통해 2가지 화학적 존재 사이에 간접적으로 공유 연쇄를 포괄한다.
본 명세서에서, 용어 "오버행"(가령, 3'-말단 오버행 또는 3' 오버행)은 모든 뉴클레오티드, 비-뉴클레오티드(가령, 히드록시메틸 치환된 핵단량체), 또는 뉴클레오티드와 비-뉴클레오티드의 조합을 포함할 수 있는 RNA 복합체의 짝이 없는 영역을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "핵단량체"는 (2) 두 번째 모이어티에 공유 연결된 (1) 염기를 포함하는 모이어티를 의미한다. 핵단량체는 연결되어, 서열 특이적 방식으로 표적, 또는 핵산 내에 상보성 염기 서열에 결합하는 올리고머(oligomer)를 형성할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "히드록시메틸 치환된 핵단량체", "히드록시메틸 핵단량체", "히드록시메틸 단량체", "비환상 핵단량체", "비환상 단량체", "비환상 히드록시메틸 치환된 핵단량체"는 동의어로서 이용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "RISC 길이" 또는 "RISC 길이 RNA 복합체"는 25개 미만 염기쌍을 보유하는 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "Dicer 길이" 또는 "Dicer 길이 RNA 복합체"는 25개 또는 그 이상 염기쌍, 일반적으로 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 핵산 분자를 의미한다.
본 발명의 선호되는 표적 핵산은 mRNA이다. 따라서 한 구체예에서, RNA 복합체에 의해 매개되는 핵산 변형은 RNA 간섭(RNAi)이다. 바람직한 구체예에서, RNAi는 mRNA의 분해를 매개한다. 다른 바람직한 구체예에서, RNAi는 mRNA의 번역 저해를 매개한다. 다른 구체예에서, RNAi는 mRNA의 번역 저해와 분해 둘 모두를 매개한다.
다른 바람직한 구체예에서, 표적 핵산은 비-코딩 RNA, 예를 들면, tRNA, miRNA, snRNA, snoRNA, OSU(매우 작은 RNA) 또는 rRNA이다.
또 다른 구체예에서, 표적 핵산은 게놈 DNA이다. 이런 구체예에서, 선호되는 핵산 변형은 DNA 메틸화와 DNA 결실을 포함한다.
본 발명의 RNA 복합체의 크기는 본 발명의 하나 이상의 목적을 여전히 달성하면서 변할 수 있다. 이는 예로써, 특정한 목적이 감소된 부정확-표적 효과인 경우에 적용된다.
따라서 본 발명의 siRNA 복합체의 중심 이중-가닥 영역은 10개 염기쌍, 11개 염기쌍, 12개 염기쌍, 13개 염기쌍, 14개 염기쌍, 15개 염기쌍, 16개 염기쌍, 17개 염기쌍, 18개 염기쌍, 19개 염기쌍, 20개 염기쌍, 21개 염기쌍, 22개 염기쌍, 23개 염기쌍, 24개 염기쌍, 25개 염기쌍, 26개 염기쌍, 27개 염기쌍, 28개 염기쌍, 29개 염기쌍, 30개 염기쌍, 35개 염기쌍, 40개 염기쌍, 42개 염기쌍, 45개 염기쌍, 50개 염기쌍, 55개 염기쌍, 60개 염기쌍 또는 62개 염기쌍의 군에서 선택되는 다수의 염기쌍을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 15개 내지 40개 염기쌍을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 18개 내지 22개 염기쌍 또는 25개 내지 30개 염기쌍을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 40개 염기쌍보다 훨씬 길지만, 일부 세포에서, 더욱 긴 이중 가닥 RNA 복합체의 도입은 인터페론 의존성 비-특이적 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이런 구체예에서, 상기 복합체는 RGPC과의 맞물림(engaging)에 앞서 더욱 짧은 이중-가닥 RNA 복합체로 가공되는 것으로 고려된다. RNase III 유사 효소, 예를 들면, DICER은 가공을 실행할 수 있다. Dicer은 또한, 40개 염기쌍보다 짧은 이중 가닥 RNA를 가공하고, 그리고 이런 RNA 복합체(Dicer 기질로 지칭됨)는 가공 없이도 RISC에 들어가는 siRNA에 비하여 다양한 이점을 갖는다. 따라서 한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 Dicer 기질이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 단일 가닥이고 이중 가닥 영역을 보유하지 않는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 단일 가닥이지만 하나 이상의 이중 가닥 영역을 보유하도록 접힘된다. 이런 구체예는 microRNA 및 이들의 기능을 모방하는데 유용하다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 10개 염기쌍보다 짧고, 따라서 1개 내지 9개 염기쌍을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, RNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 2개 이상의 RNA 가닥으로 구성된다.
본 발명의 한 구체예에서, RNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 3개의 RNA 가닥으로 구성된다.
본 발명의 다른 구체예에서, RNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역은 4개 또는 그 이상의 RNA 가닥으로 구성된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체는 오버행을 포함한다. 본 명세서에 오버행은 이중-가닥 영역의 뒤에 오는 짧은 단일-가닥 영역을 지칭한다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 안티센스 가닥은 3'-오버행을 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥은 3'-오버행을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 안티센스 가닥은 5'-오버행을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥은 5'-오버행을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 안티센스 가닥과 패신저 가닥 둘 모두 3'-오버행을 포함한다.
본 발명의 siRNA 복합체의 오버행은 상기 복합체의 기본적인 기능을 간섭하지 않으면서 다양한 길이를 가질 수 있다. 따라서 한 구체예에서, 이들 오버행은 1개 뉴클레오티드, 2개 뉴클레오티드, 3개 뉴클레오티드, 4개 뉴클레오티드, 5개 뉴클레오티드, 6개 뉴클레오티드, 7개 뉴클레오티드와 8개 뉴클레오티드, 및/또는 1개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 2개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 3개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 4개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 5개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 6개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 7개 히드록시메틸 치환된 핵단량체와 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 그리고 이들의 조합의 길이를 갖는 오버행의 군에서 선택된다.
본 발명의 RNA 복합체의 가장 선호되는 오버행은 각각, 1, 2와 3개 뉴클레오티드 또는 핵단량체의 길이를 갖는 오버행이다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체의 안티센스 가닥의 오버행은 패신저 가닥의 오버행과 동일한 길이를 갖는다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체의 안티센스 가닥의 오버행은 패신저 가닥의 오버행과 동일한 길이를 갖지 않는다.
본 발명의 RNA 복합체의 또 다른 구체예에서, 상기 RNA 복합체는 적어도 하나의 평활 말단을 포함한다. "평활 말단"은 이중-가닥 핵산의 말단을 지칭하고, 이는 임의의 돌출 뉴클레오티드를 보유하지 않는다, 다시 말하면, 이중-가닥 핵산의 양쪽 가닥이 동일한 위치에서 종결된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 양쪽 말단이 평활 말단이다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 적어도 하나의 평활 말단을 보유하고, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 이러한 평활 말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, dsRNA는 2개의 평활 말단을 보유하고, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 각 평활 말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 평활 말단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8개 또는 그 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 평활 말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 평활 말단은 2개의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 평활 말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 포스포로티오에이트 연쇄로, RNA 복합체의 평활 말단에 연결된다.
특정 측면에서, 공유 연쇄는 포스포로티오에이트 연쇄이다.
명료하게 하기 위하여, RNA 복합체의 평활-말단 및 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 연쇄 사이에 상관관계를 이해하기 위하여 아래의 구조가 이용될 수 있다(X는 임의의 뉴클레오시드이다; H는 히드록시메틸 치환된 핵단량체이다; n은 13 내지 38이다; 그리고 m은 각 경우에 독립적으로, 0 내지 8이다). 센스 가닥의 X는 안티센스 가닥의 X와 염기쌍을 형성하고, 따라서 평활 말단을 보유하는 이중나선 영역을 형성한다.
하기 RNA 복합체에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)(H)는 센스 가닥의 3'-말단, 또는 안티센스 가닥의 3'-말단, 또는 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단 둘 모두에, 또는 센스 가닥의 5'-말단, 또는 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단 둘 모두에, 또는 센스 가닥의 3'-말단과 센스 가닥의 5'-말단, 또는 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단, 또는 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 연결(가령, 포스포디에스테르 연쇄, 또는 본 명세서에서 기술되거나 당업자에게 공지된 임의의 다른 연쇄)될 수 있다. 더욱 상세한 구체예는 하기에 제공된다.
5' (H)m-X-(X)n-X-(H)m 3' 센스 가닥
3' (H)m-X-(X)n-X-(H)m 5' 안티센스 가닥
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 안티센스 가닥의 5'-말단과 3'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 안티센스 가닥의 5'-말단과 3'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 5'-말단과 3'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 5'-말단과 3'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)는 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다. 특정 측면에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 히드록시메틸 치환된 핵단량체(들)가 센스 가닥의 5'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단은 하나 이상의 비환상 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단은 하나 이상의 비환상 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 하나 이상의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 하나 이상의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 하나 이상의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 하나 이상의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 적어도 2개의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 1, 2, 및/또는 3개의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 적어도 하나의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 센스 가닥은 이러한 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 1, 2, 및/또는 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 2개의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 1, 2, 3, 및/또는 4개의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 2개 또는 그 이상의 비환상 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단과 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 적어도 하나의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 센스 가닥의 5'-말단에 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 이러한 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 센스 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥 내에 비환상 핵단량체가 없는 동일한 dsRNA(즉, 뉴클레오티드 사이에 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 관찰되지 않는 dsRNA의 안티센스 가닥)와 비교하여 dsRNA의 microRNA 활성을 감소시키는 안티센스 가닥 내에 위치에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 첫 번째 불연속 패신저 가닥과 두 번째 불연속 패신저 가닥을 포함하는 불연속 가닥(불연속 패신저 가닥)이고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 불연속 패신저 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 불연속 패신저 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 첫 번째 불연속 패신저 가닥과 두 번째 불연속 패신저 가닥을 포함하는 불연속 가닥(불연속 패신저 가닥)이고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 불연속 패신저 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 불연속 패신저 가닥의 5'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 센스와 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 첫 번째 불연속 패신저 가닥과 두 번째 불연속 패신저 가닥을 포함하는 불연속 가닥(불연속 패신저 가닥)이고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 불연속 패신저 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 불연속 패신저 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 불연속 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 불연속 센스 가닥(불연속 패신저 가닥)은 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥을 포함하고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 불연속 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 불연속 센스 가닥(불연속 패신저 가닥)은 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥을 포함하고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 불연속 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 불연속 센스 가닥(불연속 패신저 가닥)은 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥을 포함하고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 첫 번째 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 본 발명의 평활-말단 dsRNA는 불연속 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 불연속 센스 가닥(불연속 패신저 가닥)은 첫 번째 가닥과 두 번째 가닥을 포함하고, 여기서 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고 비환상 핵단량체가 이러한 dsRNA의 안티센스 가닥의 3'-말단에 공유 연결되고, 그리고 여기서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 이러한 dsRNA의 두 번째 가닥의 5'-말단에 공유 연결된다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 대략 25개 내지 대략 30개 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 대략 25개 내지 대략 30개 핵단량체를 포함하고, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 및/또는 26에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 대략 25개 내지 대략 30개 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 대략 25개 내지 대략 30개 핵단량체를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 6, 7, 8, 9, 10, 11, 및/또는 12에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 대략 25개 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 대략 27개 핵단량체를 포함하고, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 21 및/또는 22에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 대략 25개 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 대략 27개 핵단량체를 포함하고, 여기서 안티센스 가닥은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 위치 6 및/또는 7에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
본 명세서에 기술된 임의의 측면에서, RNA 복합체는 2'-O-메틸 핵단량체를 포함한다. 관련된 측면에서, RNA 복합체는 0개 내지 12개 2'-O-메틸 핵단량체(들)(또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 2'-O-메틸 핵단량체(들))를 포함한다. 관련된 측면에서, RNA 복합체의 패신저 가닥은 0개 내지 12개 2'-O-메틸 핵단량체(들)(또는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 2'-O-메틸 핵단량체(들))를 포함한다. 관련된 측면에서, RNA 복합체의 가이드 가닥은 0개 내지 6개 2'-O-메틸 핵단량체(들)(또는 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 2'-O-메틸 핵단량체(들))를 포함한다. 특정 측면에서, 히드록시메틸 치환된 단량체는 2'-O-메틸 핵단량체이다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 여기서 이러한 RNA 복합체는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 톨-유사 수용체 3(Toll-like receptor 3, TLR3)에 대한 더욱 낮은 친화성을 갖는다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 여기서 톨-유사 수용체 3(TLR3)에 대한 이러한 dsRNA의 친화성은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 감소된다.
특정 측면에서, 본 발명의 RNA 복합체는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 여기서 이러한 RNA 복합체는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 톨-유사 수용체 3(TLR3)을 활성화시키는 능력이 감소된다.
특정 측면에서, 본 발명에서는 dsRNA에 의한 톨-유사 수용체 3(TLR3)의 활성화를 감소시키는 방법을 제시하고, 이들 방법은 TLR3을 활성화시키는 dsRNA를 확인하는 단계, dsRNA를 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체로 변형하는 단계, 그리고 TLR3 활성화 및/또는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체로 dsRNA의 변형이 하나 이상의 비환상 핵단량체가 없는 동일한 dsRNA에 비하여 TLR3의 활성화를 감소시키는 지를 결정하기 위한 유전자 발현 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명에서는 dsRNA에 의한 MDA-5 유전자의 활성화를 감소시키는 방법을 제시하고, 이들 방법은 MDA-5를 활성화시키는 dsRNA를 확인하는 단계, dsRNA를 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체로 변형하는 단계, 그리고 MDA-5 활성화 및/또는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체로 dsRNA의 변형이 하나 이상의 비환상 핵단량체가 없는 동일한 dsRNA에 비하여 MDA-5의 활성화를 감소시키는 지를 결정하기 위한 유전자 발현 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명에서는 dsRNA에 의한 RIG-I 유전자의 활성화를 감소시키는 방법을 제시하고, 이들 방법은 RIG-I를 활성화시키는 dsRNA를 확인하는 단계, dsRNA를 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체로 변형하는 단계, 그리고 RIG-I 활성화 및/또는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체로 dsRNA의 변형이 하나 이상의 비환상 핵단량체가 없는 동일한 dsRNA에 비하여 RIG-I의 활성화를 감소시키는 지를 결정하기 위한 유전자 발현 분석을 수행하는 단계를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명에서는 세포를 비환상 핵단량체와 접촉시킴으로써 세포 내에서 예로써, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10과 TLR11을 비롯한 하나 이상의 톨-유사 수용체(TLR) 경로를 저해하거나 감소시키기 위한 방법을 제시하고, 이에 의하여 하나 이상의 TLR 경로가 저해되거나 감소된다. 특정 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 서로 연결되거나(가령, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35개, 또는 그 이상), 또는 핵산(가령, DNA, RNA, DNA/RNA 하이브리드) 내로 통합된다. 특정 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 동질성 집단(즉, 퓨린 또는 피리미딘을 포함하고)이거나, 또는 이질성 집단(즉, 퓨린과 피리미딘 둘 모두 포함)이다. 특정 측면에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 TLR 길항제이다. 특정 측면에서, 비환상 핵단량체는 TLR에 결합한다. 특정 측면에서, 세포 내에서 하나 이상의 TLR 경로를 저해하거나 감소시키는 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 단량체 C, D, E, F, G, H, I 또는 J일 수 있다. 특정 측면에서, 세포 내에서 하나 이상의 TLR 경로를 저해하거나 감소시키는 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 단량체 D, F, G, H, I 또는 J일 수 있다. 특정 측면에서, 세포 내에서 하나 이상의 TLR 경로를 저해하거나 감소시키는 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 단량체 D일 수 있다.
본 발명의 선호되는 RNA 복합체는 더욱 긴 이중 가닥 RNA 복합체의 DICER 가공의 산물에 전반적인 구조에서 유사하다. 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 앞서 언급된 바와 같은 Dicer 기질이다.
본 발명의 다른 바람직한 RNA 복합체는 중심 이중-가닥 영역이 18-22개 염기쌍을 포함하고, 그리고 여기서 안티센스 가닥과 패신저 가닥이 각각, 1-3개 뉴클레오티드의 3'-오버행을 포함하는 복합체이다.
본 발명의 RNA 복합체의 안티센스 가닥은 복합체의 기능을 간섭하지 않으면서, 다양한 길이를 가질 수 있다. 따라서 바람직한 구체예에서, 안티센스 가닥은 각각, 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22-mer, 23-mer, 24-mer, 25-mer, 26-mer, 27-mer, 28-mer, 29-mer, 30-mer, 31-mer, 32-mer, 33-mer, 34-mer, 35-mer, 36-mer, 37-mer, 38-mer, 39-mer, 40-mer, 41-mer, 42-mer, 43-mer, 44-mer, 45-mer, 46-mer, 47-mer, 48-mer, 49-mer, 50-mer, 51-mer, 52-mer, 53-mer, 54-mer, 55-mer, 56-mer, 57-mer, 58-mer, 59-mer, 60-mer, 61-mer 또는 62-mer이다. 예로써, 19-mer은 뉴클레오티드 또는 히드록시메틸 치환된 핵단량체, 또는 이들의 조합일 수 있는 19개 단량체의 안티센스 가닥인 것으로 이해된다.
다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체의 안티센스 가닥은 아래의 안티센스 가닥 군에서 선택된다: 15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22-mer과 23-mer.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥은 불연속적이다. 본 발명의 siRNA 복합체의 한 구체예에서, 패신저 가닥은 여러 독립된 RNA 분자를 포함한다. RNA 분자의 총수는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개일 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥의 개별 RNA 분자의 길이는 4개 단량체를 초과한다. 다른 구체예에서, 패신저 가닥의 개별 RNA 분자의 길이는 각각, 5개 단량체, 6개 단량체, 7개 단량체, 8개 단량체, 9개 단량체, 10개 단량체, 11개 단량체와 12개 단량체를 초과한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥의 개별 RNA 분자의 길이는 각각, 5개 단량체, 6개 단량체, 7개 단량체, 8개 단량체, 9개 단량체, 10개 단량체, 11개 단량체와 12개 단량체 미만이다.
본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 불연속 패신저 가닥은 첫 번째와 두 번째 RNA-분자를 포함하고, 이들은 서로 합쳐 불연속 패신저 가닥을 형성하고, 여기서 첫 번째 RNA 분자는 안티센스 가닥의 하류 부분에 혼성화되고, 그리고 두 번째 RNA 분자는 안티센스 가닥의 상류 부분에 혼성화된다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 안티센스 가닥은 불연속적이다. 안티센스 가닥의 선호되는 불연속(discontinuity)은 패신저 가닥의 선호되는 불연속과 동일하다.
본 발명의 siRNA 복합체의 가닥 중에서 하나의 불연속은 끊어짐(nick)일 수 있다. 끊어짐은 하나의 상실 포스포디에스테르 결합에 의해 유발되는 이중-가닥 핵산의 한쪽 가닥에서 불연속으로 이해되지만, 이러한 이중-가닥 핵산은 뉴클레오티드가 상실되지 않는다. 따라서 끊어짐 맞은편의 염기는 이러한 끊어진 가닥에서 염기에 여전히 혼성화될 것이다.
본 발명의 siRNA 복합체의 가닥 중에서 하나의 다른 불연속은 대안적 끊어짐(alternative nick)인데, 이는 포스포디에스테르 결합 이외에, 당-인산염 골격(sugar-phosphate backbone) 내에서 하나의 상실 결합(missing bond), 또는 하나 이상의 상실 결합에 의해 유발되는 이중-가닥 핵산의 한쪽 가닥에서 불연속으로 이해되지만, 이러한 이중-가닥 핵산은 핵염기가 상실되지 않는다. 따라서 끊어짐 맞은편의 염기는 이러한 끊어진 가닥에서 염기에 여전히 혼성화될 수 있다.
본 발명의 RNA 복합체의 RNA 가닥이 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 또는 핵염기가 이중-가닥 핵산 내에서 상실되는 불연속을 갖는 것으로 기술될 수 있을 때, 지명(nomination)으로서 갭(gap)이 이용된다.
바람직하게는, RNA 복합체의 5'-말단은 인산화되거나, 또는 인산화가 가능하다. 인산화가 가능하다는 것은 예로써, 5'-히드록시 기가 인산화되는 것을 예방하는 직접적인 접합에 의해, 또는 5'-히드록시 기의 인근에서 다른 기에 다른 접합에 의해 5'-히드록시 기가 차단되지 않는다는 것을 의미한다.
따라서 본 발명의 바람직한 구체예에서, RNA 복합체의 RNA 분자(들)는 5'-말단 인산염 및 3'-히드록시 기를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 두 번째 RNA 분자는 5'-말단 인산염 및 3'-히드록시 기를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 안티센스 가닥은 5'-말단 인산염 및 3'-히드록시 기를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에서, RNA 복합체는 바람직하게는, 히드록시메틸 치환된 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 히드록시메틸 치환된 뉴클레오티드 이외의 이런 뉴클레오티드 유사체는 하기에서 "대안적으로 변형된 뉴클레오티드"로 명명된다.
대안적으로 변형된 뉴클레오티드의 이용이 여러 이유로 선호된다. 이들은 예로써, 본 발명의 siRNA 복합체의 중심 이중 가닥 영역의 융해 온도(melting temperature)를 증가시키는데 이용될 수 있다.
안티센스 가닥과 표적 핵산 사이에 형성된 이중 가닥 구조의 융해 온도를 증가시키기 위하여, 대안적으로 변형된 뉴클레오티드의 이용이 선호된다.
따라서 한 구체예에서, 안티센스 가닥은 대안적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥은 대안적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥의 첫 번째와 두 번째 RNA 분자는 각각, 대안적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 한 구체예에서, RNA 복합체 내에서 대안적으로 변형된 뉴클레오티드의 총수는 10개이다. 본 발명의 다른 구체예에서, RNA 복합체 내에서 뉴클레오티드 유사체의 총수는 각각, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개이다. 본 발명의 한 구체예에서, 안티센스 가닥 내에서 대안적으로 변형된 뉴클레오티드의 총수는 10개이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 안티센스 가닥 내에서 뉴클레오티드 유사체의 총수는 각각, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개이다. 다른 구체예에서, 안티센스 가닥의 모든 뉴클레오티드는 대안적으로 변형된 뉴클레오티드, 또는 대안적으로 변형된 뉴클레오티드와 히드록시메틸-치환된 뉴클레오티드의 조합이다.
유사하게, 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥 내에 뉴클레오티드 유사체의 총수는 10개이다. 본 발명의 다른 구체예에서, 패신저 가닥 내에서 뉴클레오티드 유사체의 총수는 각각, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 패신저 가닥의 모든 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체, 또는 대안적으로 변형된 뉴클레오티드와 히드록시메틸-치환된 뉴클레오티드의 조합이다.
한 구체예에서, 본 발명의 siRNA 복합체의 안티센스 가닥과 센스 가닥은 대안적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
한 구체예에서, RNA 복합체의 대안적으로 변형된 뉴클레오티드는 동일하다, 다시 말하면, 이들은 예로써, 모두 LNA 또는 모두 2'-O-Me-RNA이다. 다른 구체예에서, 다양한 상이한 대안적으로 변형된 뉴클레오티드가 동일한 RNA 복합체에 이용된다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 포스포로티오에이트 연쇄를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 자연 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 연쇄의 혼합물을 포함하다.
본 발명의 바람직한 뉴클레오티드 유사체는 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 2'-플루오르-DNA 단량체, LNA 단량체, HNA 단량체, ANA 단량체, FANA 단량체, DNA 단량체, PNA 단량체와 INA 단량체의 군에서 선택되는 뉴클레오티드 유사체이지만, 다른 단량체 역시 이용될 수 있다[Nawrot and Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925].
한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 접합 기(conjugating group)에 의해 기능화된다. 접합 기는 본 발명의 RNA 복합체의 성질을 변화시키거나, 확장화거나, 또는 개선하는 당업자에게 공지된 기이다. 이런 기는 세포 분포, 장기 분포, 조직 분포, 이중나선 융해 온도, 표적 친화성, 생물안정성(biostability), 혼성화(hybridization)의 신호전달 등을 조절하는데 유용할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 접합된 기와 히드록시메틸 치환기의 메틸렌 기 사이에 에테르 연쇄에 의해 기능화된다. 도 2(단량체 F)를 참조한다.
한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 본 발명의 RNA 복합체 내로 통합에 앞서 티오에테르 기능기로 전환된다. 도 2(단량체 G)를 참조한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 본 발명의 RNA 복합체 내로 통합에 앞서 메르캅토메틸 기능기로 전환된다. 도 2(단량체 G, R = H)를 참조한다. 이러한 메르캅토 기능기는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, RNA 합성 동안 예로써, 아세틸 유도체로서 적절하게 보호된다.
한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 본 발명의 RNA 복합체 내로 통합에 앞서 아민 기능기로 전환된다. 도 2(단량체 I, R = H)를 참조한다. 이러한 아민 기능기는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, RNA 합성 동안 예로써, 트리플루오르아세틸 또는 Fmoc 유도체로서 적절하게 보호된다.
한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 아미드-연결된 접합 기의 부착을 위한 손잡이로서 기능한다. 이는 예로써, 앞서 기술된 바와 같이 히드록시메틸 치환기의 히드록실 단위의 아민 단위로의 전환, 그리고 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 아미드 결합 형성에 의한 예로써, 접합 기로 아미노 기의 더욱 유도체화를 수반한다. 이는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, RNA 합성 이전에 또는 RNA 합성 이후에 진행될 수 있다(도 2, 단량체 H)
한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 히드록시메틸 치환기는 아미드-연결된 접합 기의 부착을 위한 손잡이로서 기능한다. 이는 예로써, 앞서 기술된 바와 같이 히드록시메틸 치환기의 히드록실 단위의 아민 단위로의 전환, 그리고 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 아민 결합 형성에 의한 예로써, 접합 기로 아미노 기의 더욱 유도체화를 수반한다. 이는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, RNA 합성 이전에 또는 RNA 합성 이후에 진행될 수 있다(도 2, 단량체 I).
다른 구체예에서, 접합에 이용되는 아민 기는 아미노 기, 피페라지노 기 또는 디아미노 알킬 기이다. 이런 단량체는 아민-유도체화된 단량체로 불린다. 이들 기 각각은 더욱 유도체화되거나 접합될 수 있다(도 2, 단량체 J).
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 고유 RNA 복합체에 비하여 감소된 부정확-표적 효과를 갖는다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 안티센스 가닥 내에 본 발명의 적어도 하나의 히드록시메틸-치환된 단량체를 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 본 발명의 적어도 하나의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 소위 시드 영역, 다시 말하면, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 1-12 중에서 적어도 한 곳 내에 또는 주변에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 적어도 하나의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 2-10 중에서 적어도 한 곳에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 1개의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 3-8 중에서 한 곳에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 1개의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 7 또는 8 중에서 한 곳에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 1개의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 7에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 1개의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 9-16에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 1개의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 9-11에 통합된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 1개의 히드록시메틸-치환된 단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 no. 9-10에 통합된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 고유 RNA 복합체에 비하여 감소된 면역 반응을 발생시킨다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 고유 RNA 복합체에 비하여 연장된 효과를 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 고유 RNA 복합체에 비하여 증가된 효과를 갖는다. 따라서 바람직한 구체예에서, RNA 복합체는 예로써, 표적 mRNA의 더욱 효과적인 분해에 의해, 또는 표적 mRNA의 더욱 효과적인 번역 저해에 의해 고유 RNA 복합체보다 훨씬 효과적으로 RNAi를 매개한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 인간 또는 동물의 특정 장기 또는 조직에 효과적으로 전달된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 세포 막을 효과적으로 침투할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 자연 RNA 복합체보다 훨씬 효과적으로 세포 막을 침투할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 인체 내에서 RNA 복합체의 보존을 증가시키는 혈장 단백질에 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 표적 핵산의 발현을 하향 조절하는 평활 말단 이중-가닥 RNA(dsRNA)일 수 있고, 이러한 dsRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 19개 내지 24개 염기쌍의 이중-가닥 영역, 그리고 상기 dsRNA의 적어도 하나의 평활 말단에 연결된 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 관련된 구체예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 독립적으로, 19개 핵단량체를 포함한다. 다른 관련된 구체예에서, 센스 가닥은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 1, 2, 3, 4, 및/또는 5에 존재한다. 관련된 구체예에서, 안티센스 가닥은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 관련된 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 4, 5, 6, 7, 8, 9 및/또는 10에 존재한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 표적 핵산의 발현을 하향 조절하는 평활 말단 이중-가닥 RNA(dsRNA)일 수 있고, 이러한 dsRNA는 센스 가닥과 안티센스 가닥, 25개 내지 30개 염기쌍으로부터 이중-가닥 영역, 그리고 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 1개의 3'-말단 오버행을 포함한다. 관련된 구체예에서, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 독립적으로, 25개 내지 35개 핵단량체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 센스 가닥은 25개 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 27개 핵단량체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 센스 가닥은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 Dicer 효소에 의한 dsRNA의 절단을 감소시키거나 예방한다. 관련된 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 dsRNA의 Dicer 절단 부위에 접한다. 다른 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 및/또는 32에 존재한다. 관련된 구체예에서, 안티센스 가닥은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 관련된 구체예에서, 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 및/또는 17에 존재한다. 관련된 구체예에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 2'-3'-seco-핵단량체이다.
본 명세서에서, 용어 "이중기능성 RNA 복합체" 또는 "이중기능성 dsRNA"는 센스 가닥과 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥과 안티센스 가닥이 각각, 동일한 표적 RNA의 상이한 영역(즉, 첫 번째 영역과 두 번째 영역)에 상보성이거나, 또는 각각, 적어도 2개의 상이한 표적 RNA의 영역에 상보성인 RNA 복합체를 의미한다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 2개의 평활-말단, 그리고 가이드 가닥과 패신저 가닥 각각의 5'-말단으로부터 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 이중기능성 RNA 복합체일 수 있다.
한 구체예에서, 이중기능성 RNA 복합체는 2개의 평활-말단, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 센스 가닥은 표적 RNA의 첫 번째 영역에 상보성이고, 그리고 안티센스 영역은 표적 RNA의 두 번째 영역에 상보성이고, 여기서 첫 번째 영역과 두 번째 영역은 표적 RNA의 비-중복 영역이다. 관련된 구체예에서, 표적 RNA의 첫 번째와 두 번째 영역은 부분적으로 중복된다.
한 구체예에서, 이중기능성 RNA 복합체는 2개의 평활-말단, 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하고, 여기서 센스 가닥은 센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 안티센스 가닥은 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 위치 5, 6, 7, 및/또는 8에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하고, 그리고 여기서 센스 가닥은 첫 번째 표적 RNA의 첫 번째 영역에 상보성이고, 그리고 안티센스 영역은 두 번째 표적 RNA의 두 번째 영역에 상보성이고, 여기서 첫 번째 표적 RNA 및 두 번째 표적 RNA는 상이한 표적 RNA이거나, 또는 95% 미만의 상동성, 또는 90% 상동성, 또는 85% 상동성, 또는 80% 상동성, 또는 75% 상동성, 또는 70% 상동성, 또는 65% 상동성, 또는 60% 상동성, 또는 55% 상동성, 또는 50% 상동성을 갖는다. 관련된 구체예에서, 첫 번째와 두 번째 표적 RNA는 동일한 세포 경로에 존재한다.
RNA 복합체를 제조하는 방법
본 발명의 다른 측면은 본 발명의 2개 가닥 RNA 복합체를 제조하는 방법이고, 상기 방법은 중심 이중 가닥 영역을 포함하는 RNA 복합체가 형성되는 조건 하에, 안티센스 가닥을 패신저 가닥과 함께 항온처리하는 단계를 포함하고, 상기 RNA 복합체는 상응하는 세포 RNA의 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 표적 mRNA의 발현을 조절하는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 RNA 복합체를 제조하는 방법이고, 상기 방법은 각각, 15개 내지 40개 핵단량체를 포함하는 적어도 2개의 핵산 가닥을 합성하는 단계; 이중-가닥 영역을 보유하는 평활-말단 RNA 복합체를 형성하는데 적합한 조건 하에 이들 합성된 핵산 가닥을 결합시키는 단계를 포함하고; 그리고 여기서 각 가닥의 3'-말단은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 표적 mRNA의 발현을 조절하는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 RNA 복합체를 제조하는 방법이고, 상기 방법은 각각, 18개 내지 30개 핵단량체를 포함하는 적어도 2개의 핵산 가닥을 합성하는 단계; 이중-가닥 영역을 보유하는 평활-말단 RNA 복합체를 형성하는데 적합한 조건 하에 이들 합성된 핵산 가닥을 결합시키는 단계를 포함하고; 그리고 여기서 각 가닥의 3'-말단은 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
이러한 측면의 대안적 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 본 발명의 RNA 이중나선(10번째 측면)에 의해 치환된다.
본 발명의 또 다른 측면은 세포 또는 생물체 내에서 표적 핵산의 핵산 변형을 매개하는 방법이고, 상기 방법은 표적 핵산의 변형이 일어날 수 있고, 따라서 표적 핵산의 변형을 매개할 수 있는 조건 하에, 세포 또는 생물체를 본 발명의 RNA 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 표적 핵산의 핵산 변형을 매개하는 방법은 시험관내에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 표적 핵산의 핵산 변형을 매개하는 방법은 생체내에서, 다시 말하면, 동물, 인간 또는 비-인간 동물에서 수행된다. 바람직한 구체예에서, 표적 핵산의 핵산 변형을 매개하는 방법은 세포 배양액에서 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 분리된 세포에서 수행된다.
바람직한 구체예에서, 상기 방법의 핵산 변형은 RNA 간섭, 바람직하게는 표적 mRNA의 분해 또는 표적 mRNA의 번역 저해, 또는 조절 비-코딩 RNA(가령, microRNA)의 저해이다.
다른 구체예에서, 핵산 변형은 DNA 메틸화이다.
이러한 측면의 대안적 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드(9번째 측면) 또는 본 발명의 RNA 이중나선(10번째 측면)에 의해 치환된다.
본 발명의 4번째 측면은 유전자 기능을 조사하는 방법에 관계한다. 본 발명의 다른 측면은 세포 또는 생물체 내에서 유전자의 기능을 조사하는 방법이고, 상기 방법은 유전자에 상응하는 본 발명의 RNA 복합체를 세포 또는 생물체 내로 도입하여 시험 세포 또는 시험 생물체를 생산하는 단계, 표적 핵산의 변형이 일어날 수 있는 조건 하에 시험 세포 또는 시험 생물체를 유지시키는 단계, 그리고 단계 b에서 생산된 시험 세포 또는 생물체의 표현형(phenotype)을 관찰하는 단계, 그리고 선택적으로, 관찰된 표현형을 적절한 대조 세포 또는 대조 생물체의 표현형과 비교하여 상기 유전자의 기능에 관한 정보를 제공하는 단계를 포함한다. 본 발명의 RNA 복합체는 첨부된 실시예에서 개설된 바와 같이, 예로써 형질감염(transfection)을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 생물체 또는 세포의 표현형은 예로써, 단백질 수준을 평가하기 위한 프로테오믹스를 이용하여, 또는 RNA 수준을 평가하기 위한 마이크로어레이를 이용하여 관찰될 수 있다. 또한, 더욱 정의된 표현형, 예를 들면, 한 가지 특정 유전자의 발현이 이용될 수 있다. 유전자의 기능에 관하여 획득된 정보는 유전자 산물이 특정 질환에 관련하여 치료적 개입(therapeutic intervention)에 적합한 표적인 지를 결정하는데 이용될 수 있다. 따라서 일정한 유전자 산물이 예로써, 암의 특정 아형에서 영향을 받는 것으로 알려져 있는 일정한 생화학 경로에서 기능하는 것으로 증명되면, 이러한 유전자 산물은 암의 전술한 아형의 치료를 위한 치료적 개입에 적합한 표적일 수도 있다. 세포 또는 생물체 내에서 유전자의 기능을 조사하는 방법의 바람직한 구체예에서, 이들 방법의 핵산 변형은 RNA 간섭, 바람직하게는 표적 mRNA의 분해 또는 표적 RNA의 번역 저해이다.
다른 구체예에서, 핵산 변형은 DNA 메틸화이다.
세포 또는 생물체 내에서 유전자의 기능을 조사하는 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 세포 배양액에서, 시험관내에서 또는 생체내에서 수행된다.
또 다른 구체예에서, 상기 방법은 분리된 세포에서 수행된다.
이러한 측면의 대안적 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드(9번째 측면) 또는 본 발명의 RNA 이중나선(10번째 측면)에 의해 치환된다.
본 발명의 5번째 측면에서, 약물을 평가하는 방법이 제시된다. 본 발명의 다른 측면은 약물이 유전자 산물에 작용하는 지를 평가하는 방법이고, 상기 방법은 유전자에 상응하는 본 발명의 RNA 복합체를 세포 또는 생물체 내로 도입하여 시험 세포 또는 시험 생물체를 생산하는 단계, 표적 핵산의 변형이 일어나는 조건 하에 시험 세포 또는 시험 생물체를 유지시키는 단계, 약물을 시험 세포 또는 시험 생물체 내로 도입하는 단계, 시험 세포 또는 생물체의 표현형(phenotype)을 관찰하는 단계, 그리고 선택적으로, 관찰된 표현형을 적절한 대조 세포 또는 대조 생물체의 표현형과 비교하여 상기 약물이 유전자 산물에 작용하는 지에 관한 정보를 제공하는 단계를 포함한다.
약제가 유전자 또는 유전자 산물에 작용하는 지를 평가하는 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 방법의 핵산 변형은 RNA 간섭, 바람직하게는 표적 RNA의 분해 또는 표적 RNA의 번역 저해이다. 다른 구체예에서, 핵산 변형은 DNA 메틸화이다.
약제가 유전자 산물에 작용하는 지를 평가하는 방법의 바람직한 구체예에서, 상기 방법은 세포 배양액에서, 시험관내에서 또는 생체내에서 수행된다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 분리된 세포에서 수행된다. 이러한 측면의 대안적 구체예에서, RNA 복합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드(9번째 측면) 또는 본 발명의 RNA 이중나선(10번째 측면)에 의해 치환된다.
본 발명의 6번째 측면에서, 제약학적 조성물이 제시된다. 본 발명의 또 다른 측면은 RNA 복합체 및 제약학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 어쥬번트이다. 본 발명의 RNA 복합체가 특정 유전자와 유전자 산물을 표적으로 하도록 설계될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. RNA 복합체는 단백질이 아닌 DNA 서열 또는 RNA 서열을 표적으로 할 것으로 이해된다. 하지만, 이의 mRNA 또는 비-코딩 RNA가 예로써, RNA 분해 또는 번역 저해에 의해 변형되면, 유전자 산물, 예를 들면, 단백질의 수준이 간접적인 영향을 받을 수 있다. 이러한 단백질을 인코딩하는 유전자의 발현 역시 예로써, DNA 메틸화로 인하여 영향을 받을 수 있다.
이러한 측면의 대안적 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드(9번째 측면) 또는 본 발명의 RNA 이중나선(10번째 측면)에 의해 치환된다.
본 발명의 7번째 측면에서, 약제의 용도가 제시된다. 따라서 다른 측면은 약제로서 이용을 위한 본 발명의 RNA 복합체이다. 일단 치료 표적이 확인되면, 당업자는 표적의 수준과 활성에 영향을 주는 RNA 복합체를 설계할 수 있는데, 그 이유는 RNA 복합체의 특이성이 배타적으로, 안티센스 가닥의 서열에 의존하기 때문이다. 연속 패신저 가닥을 보유하는 고유 RNA 복합체의 경우에, 가이드 서열로서 기능하는 패신저 가닥으로 인하여 부정확-표적 효과의 문제점이 여전하다.
이러한 측면의 대안적 구체예에서, 본 발명의 RNA 복합체는 본 발명의 올리고뉴클레오티드(9번째 측면) 또는 본 발명의 RNA 이중나선(10번째 측면)에 의해 치환된다.
본 발명의 8번째 측면에서, 단량체가 제시된다. 본 발명의 한 측면은 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 통합에 적합한 단량체, 그리고 용이하게 가용한 출발 물질로부터 이들의 제조 방법이다. 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 티민-1-일 유도체가 DNA 가닥 내로 통합되었고, 그리고 자동화된 DNA/RNA 합성을 위한 이들의 포스포라미디트 빌딩 블록(phosphoramidite building block)의 제조 절차가 기존 문헌[K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]에서 보고되었다.
가장 빈번하게, 본 발명의 RNA 복합체는 당업자에게 공지된 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 제조될 것이다. 본 발명의 RNA 복합체 내로 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 통합은 a) 자동화 RNA 합성 장치에서 RNA 합성, b) RNA 워크-업, c) RNA 정제 및 d) RNA 분리를 위한 표준 방법을 따른다[F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991]. 히드록시메틸 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드(= RNA 가닥) 및 RNA 복합체는 RNA 합성을 위한 표준 기술을 이용하여, 포스포라미디트 유도체에 의해 합성될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 포스포라미디트 유도체의 제조 방법은 리보뉴클레오시드, 예를 들면, 염기 아데닌, 구아닌, 시토신과 5-메틸시토신에 대하여 염기 보호 기, 예를 들면, 벤조일, 이소부티릴, 아세틸, 페녹시아세틸, tert-부틸페녹시아세틸, 또는 당업자에게 공지된 기타 표준 염기 보호 기를 내포하는 리보뉴클레오시드의 O5'-DMT 보호된 유도체로부터 시작된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 2', 3'-절단된 탄소-탄소 결합을 갖는 단량체 D와 E(리보뉴클레오시드 명명법)의 통합에 적합한 단량체 빌딩 블록을 제조하는 방법을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 2',3'-절단된 탄소-탄소 결합을 갖고, 또한 히드록시 기 이외에 예로써, 2'-탄소 원자에서 기능기 또는 기를 보유하는 F-J(리보뉴클레오시드 명명법)와 같은 단량체의 통합에 적합한 단량체 빌딩 블록을 제조하는 방법을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 단량체 D의 포스포라미디트 유도체의 제조 방법은 핵심 단계 중에서, 2',3'-글리콜 절단, 생성 중간물질의 환원, 선택성 O2'-보호 및 O3'-포스피틸화(phosphitylation)를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 2', 3'-글리콜 절단은 시약으로 예로써, 과요오드산나트륨으로 산화성 절단(oxidative cleavage)을 이용하여 수행된다.
다른 바람직한 구체예에서, 과요오드산나트륨 절단후 중간물질의 상응하는 디올로의 환원은 예로써, 수소화붕소나트륨에 의해 달성된다.
본 발명의 RNA 복합체 내로 단량체 D(리보뉴클레오시드 명명법)의 통합을 위하여, 2'-히드록시 기를 보호하는 것이 필요하다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 이는 벤조일화에 의해 달성된다. 보호의 선택성, 다시 말하면, O3'-벤조일화에 상대적인 O2'-벤조일화의 양을 최적화하기 위하여, 1 당량 보다 약간 많은 양의 벤조일화 시약(벤조일 염화물 또는 예로써, 벤조일 무수물)을 이용하는 것이 유익할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 벤조일화는 실온 미만에서 수행된다. 다른 유용한 구체예에서, 벤조일화는 0℃ 미만 또는 심지어 -50℃ 미만에서 수행된다.
다른 바람직한 구체예에서, O2'-보호는 아세틸화에 의해, 또는 유기 합성의 분야의 당업자에게 공지된 아실화 시약을 이용한 아실화를 수행함으로써 달성된다.
다른 바람직한 구체예에서, O2'-보호는 실릴화 시약을 이용한 실릴화 및 유기 합성 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행된다. 바람직한 실릴화 보호 기는 tert-부틸디메틸실릴 또는 트리이소프로필옥시메틸이다.
차후 포스피틸화 반응은 바람직한 구체예에서, 소위 "PCl" 시약 [PCl(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)] 또는 소위 "비스-아미디트" 시약 [P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2]을 이용하여 수행된다.
단량체 D의 포스포라미디트 유도체의 제조 방법의 바람직한 구체예에서, 출발 물질은 리보뉴클레오시드, 예를 들면, 염기 아데닌, 구아닌, 시토신과 5-메틸시토신에 대하여 염기 보호 기, 예를 들면, 벤조일, 이소부티릴, 아세틸, 페녹시아세틸, tert-부틸페녹시아세틸 또는 당업자에게 공지된 기타 표준 염기 보호 기를 내포하는 리보뉴클레오시드의 O5'-DMT 보호된 유도체이다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 단량체 E의 포스포라미디트 유도체의 제조 방법은 핵심 단계 중에서, 2',3'-글리콜 절단, 생성 중간물질의 환원, 선택성 O3'-보호 및 O2'-포스피틸화를 포함한다. O3'-보호는 예로써, 실릴화 또는 아실화에 의해, 또는 먼저 O2'-벤조일화, 이후 O3'-실릴화, 그 다음 O2'-탈벤조일화와 같은 조합에 의해 수행될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 다른 보호 기 역시 적용될 수 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 2',3'-절단된 탄소-탄소 결합을 갖고, 또한 히드록시 기 이외에 2'-탄소 원자에서 기능기를 보유하는 F-J(리보뉴클레오시드 명명법)와 같은 단량체의 통합에 적합한 단량체 빌딩 블록을 제조하는 방법은 리보뉴클레오시드(가령, O5'-DMT 보호된 리보뉴클레오시드)로부터 시작되는 핵심 단계 중에서, 2',3'-글리콜 절단, 생성 중간물질의 환원, 선택성 O3'-보호, 2'-히드록시 기의 전환, O3'-탈보호 및 O3'-포스피틸화를 포함한다. O3'-보호는 예로써, 실릴화 또는 아실화에 의해, 또는 둘 모두의 조합, 예를 들면, 먼저 O2'-벤조일화, 이후 O3'-실릴화, 그 다음 O2'-탈벤조일화에 의해 수행될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 다른 보호 기 역시 적용될 수 있다. 2'-히드록시 기의 다른 기, 예를 들면, 아미노, 아실화된 아미노, 알킬화된 아미노, 디알킬화된 아미노, 카르바모일화된 아미노, 피페라지노, 아실화된 피페라지노, 알킬화된 피페라지노, 카르바모일화된 피페라지노, 메르캅토, 아실화된 메르캅토, 알킬화된 메르캅토, 디설피드, 아실화된 히드록시, 알킬화된 히드록시, 카르바모일화된 히드록시 등, 또는 이들 기의 치환된 및/또는 보호된 유도체로의 전환은 유기 합성 분야의 당업자에게 공지된 방법과 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 이런 방법과 절차는 2'-히드록시 기의 활성화된 유도체에서 치환 반응, 또는 아실화 또는 카르바모일화 반응을 포함한다. 이런 방법과 절차는 또한, O2'-알킬화 반응, 그리고 다른 C2' 부착된 기, 예를 들면, 아미노 또는 메르캅토의 포함후 알킬화 반응을 포함한다. 또 다른 가능성은 예로써, 구핵 시약(nucleophile)과의 반응에 의해 더욱 변형될 수 있는 알데히드 기능기를 제공하거나, 또는 카르복시 기능기의 활성화된 유도체, 예를 들면, 활성 에스테르로의 전환후 예로써, 구핵 시약(nucleophile)과의 반응에 의해 더욱 변형될 수 있는 카르복시 기능기를 제공하기 위한 2'-히드록시 기의 산화이다.
본 발명의 다른 구체예에서, F-J와 같은 단량체의 통합에 적합하지만, O2' 원자가 포스피틸화되고 3'-히드록시 기가 다른 기로 전환되어 C3' 원자가 히드록시 기 이외의 기능기에 연결되도록 "전도된"(가령, 단량체 D와 E는 "전도된" 것으로 간주될 수 있다) 단량체 빌딩 블록을 제조하는 방법은 리보뉴클레오시드(가령, O5'-DMT 보호된 리보뉴클레오시드)로부터 시작되는 핵심 단계 중에서, 2',3'-글리콜 절단, 생성 중간물질의 환원, 선택성 O2'-보호, 3'-히드록시 기의 전환, O2'-탈보호 및 O2'-포스피틸화를 포함한다. O2'-보호는 예로써, 실릴화 또는 아실화에 의해, 또는 둘 모두의 조합에 의해 수행될 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 다른 보호 기 역시 적용될 수 있다. 3'-히드록시 기의 다른 기, 예를 들면, 아미노, 아실화된 아미노, 알킬화된 아미노, 디알킬화된 아미노, 카르바모일화된 아미노, 피페라지노, 아실화된 피페라지노, 알킬화된 피페라지노, 카르바모일화된 피페라지노, 메르캅토, 아실화된 메르캅토, 알킬화된 메르캅토, 디설피드, 아실화된 히드록시, 알킬화된 히드록시, 카르바모일화된 히드록시 등, 또는 이들 기의 치환된 및/또는 보호된 유도체로의 전환은 유기 합성 분야의 당업자에게 공지된 방법과 절차를 이용하여 수행될 수 있다. 이런 방법과 절차는 3'-히드록시 기의 활성화된 유도체에서 치환 반응, 또는 아실화 또는 카르바모일화 반응을 포함한다. 이런 방법과 절차는 또한, O3'-알킬화 반응, 그리고 다른 C3' 부착된 기, 예를 들면, 아미노 또는 메르캅토의 포함후 알킬화 반응을 포함한다. 또 다른 가능성은 예로써, 구핵 시약(nucleophile)과의 반응에 의해 더욱 변형될 수 있는 알데히드 기능기를 제공하거나, 또는 카르복시 기능기의 활성화된 유도체, 예를 들면, 활성 에스테르로의 전환후 예로써, 구핵 시약(nucleophile)과의 반응에 의해 더욱 변형될 수 있는 카르복시 기능기를 제공하기 위한 3'-히드록시 기의 산화이다.
한 구체예에서, 2'-C-피페라지노 유도체는 2'-히드록시 기의 이탈 기(가령, 메실레이트 유도체)로의 전환, 그 이후에 상당한 과량의 피페라진과의 반응에 의해 제조된다. 이는 예로써, 구조 아미디트 J의 포스포라미디트의 합성을 향한 첫 번째 단계로서 수행될 수 있다(하기 도면 참조).
또 다른 구체예에서, 본 발명은 자연 핵염기와 상이한 C1' 원자에서 기 또는 기능기를 보유하는 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체(리보뉴클레오시드 명명법)의 통합에 적합한 단량체 빌딩 블록을 제조하는 방법을 포함한다. 보호 기를 내포할 수 있는 이런 기 또는 기능기에는 예로써, 피렌, 페릴렌, 형광단, 수소, 알킬, 반응성 기, 그리고 자연 핵염기 이외의 헤테로환이 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 포스포라미디트 유도체 대신에 H-포스포네이트 유도체로서 구성되는 본 발명의 히드록시메틸 치환된 단량체의 통합에 적합한 단량체 빌딩 블록을 제조하는 방법을 포함한다.
포스포라미디트(=아미디트) 빌딩 블록(DMT = 4,4'-디메톡시트리틸; 염기 = 자연 핵염기; CEtO = 시아노에톡시)에 관하여, 본 발명의 일부 바람직한 구체예의 구조의 실례가 하기에 도시된다:
Figure pct00003
R = 알킬, 콜레스테릴 유도체, 형광단, 폴리아민, 지방산, 아미노산, 당류 또는 폴리펩티드 등.
본 발명의 9번째 측면에서, 비환상 올리고뉴클레오티드를 포함하는 올리고뉴클레오티드가 제시된다. 본 발명의 9번째 측면은 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다. 상세한 설명 및 실시예로부터 명백하게 확인되는 바와 같이, 이런 올리고뉴클레오티드는 다양한 용도와 이점을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 2'-3'-seco-핵단량체이다. 놀랍게도, 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 RNAi 기구(machinery)의 기질 세포 효소(substrate cellular enzyme)인 것으로 밝혀졌고, 그리고 일부 경우에, 이들 올리고뉴클레오티드는 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 동일한 올리고뉴클레오티드보다 훨씬 우수한 기질이다.
바람직하게는, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 단량체 E, F, G, H, I 또는 J로 구성된 군에서 선택된다(도 1 참조). 당업자가 인지하는 바와 같이, G, F, H, I와 J 모두, 단량체 D의 합성 선구체로부터 만들어질 수 있다. 도 2에서 지시된 바와 같이, 이들 비환상 단량체는 접합 기, 예를 들면, 콜레스테롤 유도체, 알킬, 형광단, 폴리아민, 아미노산, 당류, 올리고뉴클레오티드 및/또는 폴리펩티드를 보유하는 유도체로 변환될 수 있다. 이런 접합 기는 예로써, 올리고뉴클레오티드가 세포, 장기 또는 생물체 내에서 표적 mRNA의 활성을 조절하는데 이용될 때, 더욱 우수한 생물안정성 및/또는 생물분포에 유용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 길이는 바람직하게는, 10개 내지 40개 핵단량체이다. 18개 내지 30개 핵단량체의 길이가 더욱 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 5개 미만의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 다른 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 아닌 5개 핵단량체마다 단지 1개 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다. 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 아닌 8개 핵단량체마다 단지 1개 비환상 단량체가 더욱 바람직하다. 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 숫자가 너무 많으면, 상보성 핵산에 대한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 결합 친화성이 약화된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 1개 내지 5개 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 올리고뉴클레오티드의 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및/또는 8, 그리고 더욱 바람직하게는, 위치 2, 3, 4, 5, 6, 및/또는 7에 존재한다. 이들 위치는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 계산된다. 이들 영역 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 올리고뉴클레오티드가 microRNA로서 기능하는 것을 감소시키거나 예방하는데, 그 이유는 이들 위치가 microRNA의 소위 시드 영역에 상응하기 때문이다. 이는 예로써, 올리고뉴클레오티드가 siRNA의 가이드 가닥으로서 기능하도록 의도되는 경우에 적합하다.
바람직한 구체예에서, 안티센스 가닥 내에서 모든 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 및/또는 16에 존재하고, 여기서 이들 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산된다. 더욱 바람직하게는, 안티센스 가닥 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 위치 9, 10, 및/또는 11에 존재한다. 따라서 전술한 영역 내에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 존재는 안티센스 가닥이 microRNA로서 기능하도록 유도할 것이다, 다시 말하면, siRNA 효과가 최소화되고 microRNA 효과가 더욱 높아지도록 담보할 것이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 8개 이상의 연속 DNA 단량체의 DNA 서열을 포함하지 않는다. 6개 정도의 연속 DNA 단량체가 더욱 바람직하고, 그리고 4개 정도의 연속 DNA 단량체가 가장 바람직하다. 연속 DNA 단량체는 전형적으로, 상보성 RNA에 결합될 때 올리고뉴클레오티드가 RNase H를 활성화시킬 수 있도록 하고, 이는 상기 RNA의 분해를 유발한다. 본 발명의 일부 구체예에서, 이는 바람직하지 않다. 따라서 진전된 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 DNA 단량체를 전혀 포함하지 않는다.
다른 구체예에서, RNase H 활성화가 바람직하고, 그리고 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는, 4개 이상의 연속 DNA 단량체, 더욱 바람직하게는, 6개 이상의 DNA 단량체, 가장 바람직하게는, 8개 이상의 DNA 단량체를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 50% 이상의 RNA 단량체를 포함한다. 높은 정도의 RNA 단량체는 예로써, 세포 효소, 예를 들면, RISC에 대한 기질 또는 가이드(또는 보조-인자)로서 기능함으로써 RNA-상호작용 단백질과의 상호작용을 촉진할 것이다.
다른 구체예에서, 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드의 단량체 중에서 80% 이상이 RNA 단량체이다. 또 다른 구체예에서, 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드의 단량체 중에서 90% 이상이 RNA 단량체이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한, 핵단량체 유사체를 포함할 수 있다. 이와 같은 한 가지 구체예에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체 및 RNA 단량체는 전체 핵단량체의 80% 이상을 구성한다. 다른 구체예에서, 비환상 단량체 및 RNA 단량체는 전체 핵단량체의 90% 이상을 구성한다.
올리고뉴클레오티드가 핵단량체 유사체를 포함할 때, 이들은 바람직하게는, 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 2'-플루오르-DNA 단량체, LNA 단량체, PNA 단량체, HNA 단량체, ANA 단량체, FANA 단량체, CeNA 단량체, ENA 단량체, DNA 단량체 및 INA 단량체로 구성된 군에서 선택된다. 뉴클레오티드 유사체는 전형적으로, 결합 친화성을 조절하고, 생물안정성을 증가시키고, 그리고 일반적으로, 올리고뉴클레오티드에 더욱 약물-유사한 성질을 제공하기 위하여 이용된다.
한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 LNA 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 히드록시메틸 치환된 핵단량체는 전형적으로, 상보성 핵산과 염기쌍을 이루는 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 융해 온도(즉, 결합 친화성)를 감소시키고, 그리고 LNA 핵단량체는 융해 온도에서 이러한 감소를 상쇄시키는데 이용될 수 있다. 즉, 한 구체예에서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 총수는 LNA 핵단량체의 총수와 일치한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단지 비환상 단량체 및 RNA 단량체만을 포함한다.
다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단지 히드록시메틸 치환된 핵단량체, RNA 단량체, 그리고 LNA 뉴클레오티드 유사체만을 포함한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연쇄, 보라노포스페이트 연쇄, 에틸포스포네이트 연쇄, 포스포라미데이트 연쇄 및 포스포르트리에스테르 연쇄로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 연쇄(들)를 포함한다. 포스포로티오에이트 연쇄 및/또는 보라노포스페이트 연쇄가 가장 바람직하다. 이들 연쇄는 올리고뉴클레오티드의 생물안정성을 개선하고, 또한 올리고뉴클레오티드의 생물분포에 대한 긍정적인 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전술한 뉴클레오티드간 연쇄 중에서 50% 이상, 그리고 더욱 바람직하게는 75% 이상을 포함한다. 한 구체예에서, 모든 뉴클레오티드간 연쇄는 전술한 유형이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상보성 올리고뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지 않는다, 다시 말하면, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥이다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이러한 올리고뉴클레오티드에 상보성인 표적 mRNA의 RISC 의존성 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있다. 당업자는 RISC를 RNA 유도된 침묵 복합체로서 인식하고, 그리고 이러한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드가 RISC에 대한 가이드 서열로서 기능하고, 따라서 RISC를 RNA 올리고뉴클레오티드, 전형적으로 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 부분적인 또는 완전한 상보성을 갖는 mRNA로 인도할 것임을 이해할 것이다. 올리고뉴클레오티드가 RISC를 부분적인 상보성의 mRNA 표적으로 인도할 때, 이러한 올리고뉴클레오티드는 microRNA 모방체로 간주될 수 있고, 그리고 올리고뉴클레오티드가 RISC를 완전한 상보성의 mRNA 표적으로 인도할 때, 이는 단일 또는 이중 가닥 siRNA로서 간주될 수 있다.
RISC 의존성은 RISC 성분을 인코딩하는 mRNA에 대한 siRNA를 이용하여 RISC의 성분을 적중(knock out)하고, 그리고 적중 세포주 내에서 올리고뉴클레오티드의 활성을 평가함으로써 세포주에서 평가될 수 있다. 이런 실험은 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
본 발명의 10번째 측면에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 RNA 이중나선이 제시된다. 본 발명의 10번째 측면은 본 발명에 따른 첫 번째 올리고뉴클레오티드 및 두 번째 올리고뉴클레오티드를 포함하는 RNA 이중나선이다. 바람직한 구체예에서, RNA 이중나선의 두 번째 올리고뉴클레오티드 역시 본 발명의 올리고뉴클레오티드이다. 첫 번째 측면에서 본 발명의 RNA 복합체에 관하여 기술된 구체예는 10번째 측면의 RNA 이중나선에도 적용가능하다.
바람직하게는, 본 발명의 RNA 이중나선은 15개 내지 40개 염기쌍을 포함하고, 그리고 바람직한 구체예에서, 18개 염기쌍, 19개 염기쌍, 20개 염기쌍, 21개 염기쌍, 22개 염기쌍과 23개 염기쌍의 군에서 선택되는 다수의 염기쌍을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 25개 내지 30개 염기쌍, 더욱 바람직하게는, 26개 내지 28개, 그리고 가장 바람직하게는, 27개 염기쌍을 포함한다. 이런 RNA 이중나선은 dicer 기질 RNA로 지칭될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 오버행을 포함한다. 다른 구체예에서, RNA 이중나선은 2개의 오버행을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 첫 번째 올리고뉴클레오티드가 3'-오버행을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 두 번째 올리고뉴클레오티드가 3'-오버행을 포함한다. 바람직하게는, 오버행의 길이는 1개 내지 8개 뉴클레오티드이고, 그리고 더욱 바람직하게는, 오버행의 길이는 1개 뉴클레오티드, 2개 뉴클레오티드와 3개 뉴클레오티드의 길이를 갖는 오버행으로 구성된 군에서 선택된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 적어도 하나 평활 말단을 포함한다. 다른 구체예에서, RNA 이중나선은 양쪽 말단에서 평활 말단이다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 18-22개 염기쌍의 이중-가닥 영역을 포함하고, 여기서 첫 번째 올리고뉴클레오티드와 두 번째 올리고뉴클레오티드는 각각, 1-3개 뉴클레오티드의 3'-오버행을 포함한다. 이런 RNA 이중나선은 정규 siRNA(짧은 간섭 RNA)로서 간주될 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선의 한쪽 가닥은 첫 번째 측면에서 상세하게 기술된 바와 같이 불연속적이다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 이러한 RNA 이중나선의 첫 번째 또는 두 번째 올리고뉴클레오티드에 상보성인 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있다. 다시 말하면, 상기 RNA 이중나선은 예로써, siRNA, microRNA 또는 프리-microRNA로서 기능할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 비환상 단량체 대신에 RNA 단량체를 포함하는 동일한 RNA 이중나선에 비하여 감소된 부정확-표적 효과를 유도하면서 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 특히, 비환상 단량체가 siRNA 이중나선의 가이드(안티센스) 가닥 내에서 위치 5-10에 배치될 때, 감소된 부정확-표적 효과를 유도하면서 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있고, 여기서 상기 위치는 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 계산된다.
다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 특히, 비환상 단량체가 siRNA 이중나선의 가이드(안티센스) 가닥 내에서 위치 6-8에 배치될 때, 감소된 부정확-표적 효과를 유도하면서 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있다. 다른 구체예에서, 가이드 가닥 내에서 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 RNA 이중나선은 microRNA-유형 효과를 유도하는 가이드 가닥의 능력이 감소한다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 비환상 단량체 대신에 RNA 단량체를 포함하는 동일한 RNA 이중나선에 비하여 증가된 효능으로, RNA 표적화, 예를 들면, 유전자 침묵 또는 RNA 간섭을 매개할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 비환상 단량체 대신에 RNA 단량체를 포함하는 동일한 RNA 이중나선에 비하여 연장된 효능으로, 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있다.
한 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있고, 여기서 이러한 RNA 이중나선은 비환상 단량체 대신에 RNA 단량체를 포함하는 동일한 RNA 이중나선에 비하여 개선된 생물안정성을 갖는다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 RNA 이중나선은 표적 mRNA의 번역 억제 또는 분해를 매개할 수 있고, 여기서 이러한 RNA 이중나선은 비환상 단량체 대신에 RNA 단량체를 포함하는 동일한 RNA 이중나선에 비하여 감소된 면역 자극을 갖는다.
본 발명의 RNA 복합체는 다양한 유전자로 표적화될 수 있다. 표적으로서 적합한 인간 유전자의 실례에는 특히, TNF, FLT1, VEGF 계통, ERBB 계통, PDGFR 계통, BCR-ABL, 그리고 MAPK 계통이 포함된다. 표적으로서 적합한 인간 유전자 및 이들의 핵산 서열의 실례에는 PCT/US08/55333, PCT/US08/55339, PCT/US08/55340, PCT/US08/55341, PCT/US08/55350, PCT/US08/55353, PCT/US08/55356, PCT/US08/55357, PCT/US08/55360, PCT/US08/55362, PCT/US08/55365, PCT/US08/55366, PCT/US08/55369, PCT/US08/55370, PCT/US08/55371, PCT/US08/55372, PCT/US08/55373, PCT/US08/55374, PCT/US08/55375, PCT/US08/55376, PCT/US08/55377, PCT/US08/55378, PCT/US08/55380, PCT/US08/55381, PCT/US08/55382, PCT/US08/55383, PCT/US08/55385, PCT/US08/55386, PCT/US08/55505, PCT/US08/55511, PCT/US08/55515, PCT/US08/55516, PCT/US08/55519, PCT/US08/55524, PCT/US08/55526, PCT/US08/55527, PCT/US08/55532, PCT/US08/55533, PCT/US08/55542, PCT/US08/55548, PCT/US08/55550, PCT/US08/55551, PCT/US08/55554, PCT/US08/55556, PCT/US08/55560, PCT/US08/55563, PCT/US08/55597, PCT/US08/55599, PCT/US08/55601, PCT/US08/55603, PCT/US08/55604, PCT/US08/55606, PCT/US08/55608, PCT/US08/55611, PCT/US08/55612, PCT/US08/55615, PCT/US08/55618, PCT/US08/55622, PCT/US08/55625, PCT/US08/55627, PCT/US08/55631, PCT/US08/55635, PCT/US08/55644, PCT/US08/55649, PCT/US08/55651, PCT/US08/55662, PCT/US08/55672, PCT/US08/55676, PCT/US08/55678, PCT/US08/55695, PCT/US08/55697, PCT/US08/55698, PCT/US08/55701, PCT/US08/55704, PCT/US08/55708, PCT/US08/55709, 그리고 PCT/US08/55711에서 개시된 것들이 포함되고, 이들 모두 본 발명에 참조로서 편입된다.
실시예
실시예 1
본 발명의 RNA 복합체의 합성
본 발명의 RNA 복합체의 히드록시메틸 치환된 단량체의 자동화된 DNA/RNA 합성을 위한 포스포라미디트 빌딩 블록의 제조 절차는 기존 문헌[티민 유도체; K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]에서 보고되었다.
본 발명의 RNA 복합체 내로 이들 히드록시메틸 치환된 단량체의 통합은 a) 자동화 RNA 합성 장치에서 RNA 합성, b) RNA 워크-업, c) RNA 정제 및 d) RNA 분리를 위한 표준 방법을 따른다[F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991]. 이는 히드록시메틸 치환된 RNA 올리고뉴클레오티드(= RNA 가닥) 및 RNA 복합체가 RNA 합성을 위한 표준 기술에 의해, 공지된 포스포라미디트 유도체를 이용하여 합성될 수 있음을 증명한다.
LNA는 하나 이상의 2'-O,4'-C-메틸렌-연결된 리보뉴클레오티드(LNA 뉴클레오티드)를 포함하는 올리고뉴클레오티드이다[M. Petersen and J. Wengel, Trends Biotechnol. 2003, 21, 74-81]. LNA-변형된 siRNA는 하나 이상의 LNA 단량체를 포함하는 siRNA 구조체이다. 상업적으로 가용한 LNA 포스포라미디트의 이용으로, 본 발명의 RNA 복합체 내로 LNA 뉴클레오티드를 통합하는데 공지된 방법이 이용되었다[Pfundheller, Sorensen, Lomholt, Johansen, Koch and Wengel, J. "Locked Nucleic Acid Synthesis", Methods Mol. Biol. 2004, vol. 288 (Oligonucleotide Synthesis), 127-145., P. Herdewijn, Ed., Humana Press Inc.].
히드록시메틸 치환된 siRNA("히드록시메틸 치환된 작은 간섭 RNA)는 하나 이상의 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 포함하는 siRNA 구조체이다(히드록시메틸 치환된 핵단량체의 구조에 대하여 도 1을 참조한다). 예시된 단량체는 하기에 도시된다:
Figure pct00004
단량체 C(C, T) 단량체 D(X)
아래의 실시예에서는 히드록시메틸 치환된 RNA 복합체의 설계를 예시하고, 그리고 본 명세에서 명시되지 않은 다른 RNA 구조체의 설계에 제한을 두지 않는다. 따라서 예로써, 평활 말단 siRNA 이중나선, 본 명세서에서 예시된 것들보다 더욱 짧은 또는 더욱 긴 siRNA 이중나선, 단일 가닥 안티센스 RNA 분자(RNA 복합체), 그리고 안티센스 가닥 및 불연속적 패신저 가닥("패신저 가닥"은 또한, "센스 가닥"으로 불릴 수 있다)을 포함하는 RNA 복합체가 예시된다.
아데닌, 구아닌, 시토신과 우라실의 전형적인 포스포라미디트 유도체의 제조 절차는 특허 출원 번호 PCT/US2008/064417, 실시예 11에서 개시되고, 이의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다.
실시예 2
RNA 복합체 내에서 히드록시메틸 핵단량체 치환 패턴
RNA 복합체 내에서 특정 위치에 히드록시메틸 핵단량체(가령, 단량체 D)의 통합은 유전자 침묵 활성, 사이토킨 유도, 가닥 활성, "부정확-표적" 효과, RNA 복합체의 열 안정성, 그리고 Dicer 기질 RNA 복합체의 경우에, RNA 복합체의 Dicer 가공에 영향을 준다.
RISC RNA 복합체와 Dicer RNA 복합체 내에서 히드록시메틸 핵단량체의 전형적인 치환 패턴이 하기에 제공된다. RNA 복합체(이중-가닥 RNA)의 각 가닥의 핵단량체의 총수는 일련의 X' 또는 H'로 표시된다(즉, 서열 독립적). 각각의 "X"는 독립적으로, 그리고 각 경우에, 임의의 뉴클레오시드(가령, 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민, 또는 이들의 임의의 유사체 또는 유도체)일 수 있고, 반면 각각의 "H"는 독립적으로, 그리고 각 경우에, 비-뉴클레오티드 히드록시메틸 핵단량체(가령, 임의의 핵염기를 포함하는 단량체 D)일 수 있다. 각 경우에, 센스 가닥과 안티센스 가닥은 각 가닥 사이에 염기 짝짓기(base paring)로 인하여 어닐링(annealing)되어 이중 가닥 영역을 형성한다. 이들 다이어그램의 목적은 서열과 무관하게, 히드록시메틸 핵단량체를 포함하는 RNA 복합체의 치환 패턴을 보여주는 것이다.
RISC RNA 복합체의 히드록시메틸 핵단량체 치환 패턴
하기 각 RNA 복합체에서, 센스와 안티센스 가닥은 뉴클레오시드 또는 비-뉴클레오티드 히드록시메틸 핵단량체(가령, 단량체 D)를 포함하는 각각 21개 핵단량체 길이를 갖는다(센스 가닥이 22개 핵단량체 길이를 갖는 모티프 # P-1과 P-1/G7 제외). 각각의 복합체는 "모티프 #" 및 히드록시메틸 핵단량체(들)의 위치로 확인되거나, 또는 "H"가 제공된다. 각각의 가닥 내에서 각 "H"의 위치는 히드록시메틸 핵단량체(들)가 위치하는 가닥의 5'-말단으로부터 계산에 의해 결정된다. 본 명세서에서 기술된 임의의 RNA 복합체에서, 위치 -1(마이너스 1) 또는 위치 1은 히드록시메틸 핵단량체가 상기 가닥의 3'-최고 핵단량체(또는 상기 가닥의 3'-말단에서 마지막 핵단량체)라는 것을 지시한다. 하기 RISC 길이 RNA 복합체에서, 센스 또는 안티센스 가닥의 위치 21과 22는 이들 핵단량체가 상기 가닥의 5'-말단으로부터 계산된 상기 가닥의 마지막 2개의 위치를 점유한다는 것을 지시한다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007

Dicer RNA 복합체의 히드록시메틸 핵단량체 치환 패턴
하기 각 RNA 복합체에서, 센스는 25개 핵단량체 길이를 갖고, 그리고 안티센스 가닥은 27개 핵단량체 길이를 가지며(25/27-mer), 뉴클레오시드 또는 비-뉴클레오티드 히드록시메틸 핵단량체(가령, 단량체 D)를 포함한다. 각각의 복합체는 "모티프 #" 및 히드록시메틸 핵단량체(들)의 위치로 확인되거나, 또는 "H"가 제공된다. 각각의 가닥 내에서 각 "H"의 위치는 히드록시메틸 핵단량체(들)가 위치하는 가닥의 5'-말단으로부터 계산에 의해 결정된다.
모티프 10을 보유하는 RNA 복합체는 1개의 평활-말단 및 25개 염기쌍 이중나선 영역을 보유하고, 여기서 2개의 비-뉴클레오티드 히드록시메틸 핵단량체가 안티센스 가닥의 5'-말단에 부착되고(또는 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 안티센스 가닥 내에서 위치 26과 27에서; 이들 히드록시메틸 핵단량체는 상기 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 상기 가닥의 마지막 2개 위치를 점유한다), 그리고 1개의 비-뉴클레오티드 히드록시메틸 핵단량체가 센스 가닥의 3'-말단에 부착된다(또는 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 센스 가닥 내에 위치 25에서; 상기 히드록시메틸 핵단량체는 상기 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 상기 가닥의 마지막 위치를 점유한다).
Figure pct00008

실시예 3
RISC 길이 RNA 복합체 내에서 히드록시메틸 핵단량체 치환의 위치 특이적 효과
상기 실시예에 제공된 치환 패턴(모티프)은 상이한 서열 특이적 RISC 길이 RNA 복합체에 적용되었다. 이들 RNA 복합체는 하기 표 1-7에 제공된다. 하기 표의 서열 내에서 히드록시메틸 치환된 단량체(들)는 "unaH"로 확인되고, 여기서 H는 핵염기의 한 문자 코드(one letter code)이다(가령, "unaC"는 시토신이 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함한다는 것을 지시한다).
[표 1]
인플루엔자 PB2 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00009

[표 2]
인플루엔자 PA 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00010

[표 3]
인플루엔자 NP 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00011

[표 4]
SOS1 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00012

[표 5]
ApoB 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00013

[표 6]
ApoB 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00014

[표 7]
ICAM-1 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00015

RISC 길이 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성
히드록시메틸 단량체(가령, 단량체 D)를 포함하는 RISC 길이 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성(또는 "적중 활성")이 조사되었다.
간단히 말하면, HeLa 세포에서 형질감염을 위하여, 다중웰 평판이 10% 소 태아 혈청을 보유하는 DMEM에서 대략 5,000개 HeLa 세포/웰로 접종되고, 그리고 37℃ / 5% CO2에서 하룻밤동안 배양되었다. HeLa 세포 배지는 형질감염 직전에 혈청-없는 DMEM으로 교체되었다. 표적 유전자의 대략 1,000개 염기쌍 삽입물(insert)을 포함하는 psiCHECK™-2 벡터, 그리고 혈청-없는 DMEM에서 희석된 RNA 복합체(2.5 nM에서 분석된 MAPK14 RNA 복합체를 제외하고, 앞서 확인된 모든 RNA 복합체에 대하여 25 nM, 2.5 nM, 그리고 0.25 nM)는 제조업체의 지시에 따라, 희석된 Lipofectamine 2000TM(LF2K) 형질감염 시약과 혼합되고, 이후 실온에서 20분 동안 배양되었다. 전형적인 형질감염 혼합 제조물은 93 ㎕의 Opti-MEM, 3 ㎕의 RNA 복합체, 표적을 포함하는 4 ㎕의 psiCHECK™-2 플라스미드, 그리고 100 ㎕의 희석된 LF2K(즉, 98.6 ㎕ Opti-MEM을 포함하는 1.4 ㎕의 LF2K)를 포함한다. RNA 복합체 용액과 함께 LF2K/ psiCHECK™-2-[표적유전자 삽입물]이 HeLa 세포에 첨가되고, 이후 37℃, 5% CO2에서 4.5 시간동안 배양되었다. 공동-형질감염(대략 22시간)후, 세포는 트립신처리되고, 그리고 ㎖당 105개 세포의 농도로 10% FBS를 포함하는 항생제-없는 DMEM에서 현탁되었다.
RNA 복합체 및 psiCHECK™-2 벡터로 형질감염된 HeLa 세포는 먼저 진탕하면서 10분 동안 Dual-GloTM 루시페라아제 시약(Promega, Madison, WI)을 첨가하고, 그리고 이후 VICTOR3™ 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer)에서 발광 신호(luminescent signal)를 정량함으로써 개똥벌레와 레닐라(Renilla) 루시페라아제 리포터 활성에 대하여 분석되었다. 개똥벌레 발광을 측정한 이후, 동시적으로 개똥벌레 반응을 진정시키고 레닐라(Renilla) 루시페라아제 반응을 시작시키기 위하여 Stop & Glo® 시약(Promega, Madison, WI)이 진탕과 함께 10분 동안 첨가되고, 이는 이후, VICTOR3™ 1420 Multilabel Counter(PerkinElmer)에서 정량되었다. 각 RISC 길이 RNA 복합체에 대한 유전자 침묵 활성은 하기 표에서 제시된다. 모든 시료는 동일한 실험에서 작업된 개별 dsRNA QNeg(Qiagen) 음성 대조 시료에 표준화되었다. 즉, Qneg 값은 95% 신뢰 구간(confidence interval, CI)에서 100% 활성(즉, 적중 없음)으로 설정되었다.
간단히 말하면, HepG2 세포에서 형질감염(ApoB3410 RNA 복합체)을 위하여, 다중웰 평판은 10% 소 태아 혈청을 보유하는 DMEM에서 대략 15,000개 세포/웰로 접종되었다. 형질감염 혼합물은 OptiMEM에서 RNAiMAX와 결합된 RNA 복합체(ApoB3410 RNA 복합체)(0.05 nM, 0.5 nM 또는 5 nM RNA 농도)를 포함하였다. 형질감염 혼합물은 도말된 HepG2 세포(75 ㎕의 총 부피)와 함께 24시간 동안 배양되었다. RNA는 이들 형질감염된 세포로부터 수확되고, 그리고 ApoB와 음성 대조 GAPDH RNA에 대한 발현의 수준을 결정하기 위하여 qRT-PCR이 수행되었다. 하기 표에서는 Qneg 음성 대조 siRNA와 비교하여 형질감염된 HepG2 세포에서 ApoB 메시지의 적중 비율을 요약한다.
하기 표 8-14에서 더욱 낮은 비율은 표적 RNA의 더욱 높은 적중을 지시한다(100%는 적중 없음을 지시한다). 하기 표 14(ApoB3410 RNA 복합체)에서 더욱 높은 비율은 표적 RNA의 더욱 높은 적중을 지시한다(0%는 적중 없음을 지시한다).
[표 8]
인플루엔자 PB2 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00016

[표 9]
인플루엔자 PA 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00017

[표 10]
인플루엔자 NP 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00018

[표 11]
SOS1 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00019

[표 12]
ApoB 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00020

[표 13]
ICAM-1 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00021

[표 14]
ApoB 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체
Figure pct00022

RISC 길이 RNA 복합체에 대하여 상기 표 8-14에서 제시된 유전자 침묵 활성은 상이한 서열과 유전자 표적을 보유하는 복수 siRNA에 적용된 모티프 22, 31, 32, 그리고 G7의 히드록시메틸 핵단량체 치환 패턴이 전반적으로, 히드록시메틸 핵단량체 단량체가 없는 점을 제외하고 동일한 서열을 보유하는 RNA 복합체에 비하여 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성을 유지시키고 및/또는 향상시킨다는 것을 지시한다. 게다가, ICAM-1 유전자를 표적으로 하는 RNA 복합체에서 모티프 P-1, P1, P2, 그리고 P3의 히드록시메틸 핵단량체 치환 패턴은 전반적으로, 히드록시메틸 핵단량체 단량체가 없는 점을 제외하고 동일한 서열을 보유하는 RNA 복합체에 비하여 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성을 유지시키고 및/또는 향상시켰다.
RISC 길이 RNA 복합체의 가닥 특이적 활성
히드록시메틸 단량체(가령, 단량체 D)를 포함하는 RISC 길이 RNA 복합체의 가닥 특이적 침묵 활성(또는 "적중 활성")이 조사되었다.
SOS1, 그리고 ICAM-1 특이적 RISC 길이 RNA 복합체는 그들의 상응하는 "역방향" psiCHECK™-2 벡터 플라스미드에 대하여 조사되었다(즉, 플라스미드 발현된 RNA는 안티센스 가닥 대신에 센스 가닥에 상보성이고, 따라서 RNA 복합체의 각 가닥의 역할이 반대로 된다). "역방향" 플라스미드의 경우에, "센스" 가닥이 RISC 기초된 유전자 침묵 활성을 위한 가이드 가닥으로서 기능하고, 그리고 "안티센스" 가닥이 패신저 가닥으로서 기능한다. 명료하게 하기 위하여, "정방향" psiCHECK™-2 벡터 플라스미드의 경우에, 안티센스 가닥이 RISC 기초된 유전자 침묵 활성을 위한 가이드 가닥으로서 기능하고, 그리고 센스 가닥이 패신저 가닥으로서 기능한다. "정방향"과 "역방향" 벡터 플라스미드 둘 모두에 대한 RNA 복합체의 침묵 활성을 비교함으로써, RNA 복합체의 안티센스와 센스 가닥의 침묵 활성이 결정될 수 있다.
이러한 실례에서, "정방향" 플라스미드에 대한 ICAM-1 RNA 복합체의 가이드 가닥(RNA 복합체의 안티센스 가닥)의 침묵 활성은 표 13에 제시되고, 그리고 "역방향" 플라스미드에 대한 ICAM-1RNA 복합체의 패신저 가닥(RNA 복합체의 센스 가닥)의 침묵 활성(표 15 참조)과 비교되었다. SOS1 특이적 RISC 길이 RNA 복합체에 대하여, "정방향" 플라스미드에 대한 가이드 가닥의 침묵 활성은 표 11에 제시되고, 그리고 표 16에 제시된 패신저 가닥("역방향 플라스미드")의 침묵 활성과 비교되었다.
[표 15]
ICAM-1 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체(역방향 플라스미드)
Figure pct00023

표 13("정방향" 플라스미드에 대한 ICAM-1 RNA 복합체)과 표 15("역방향" 플라스미드에 대한 ICAM-1 RNA 복합체)의 결과를 비교함으로써, 가닥 특이적 RNAi 활성에 대한 히드록시메틸 핵단량체의 위치 특이적 효과가 관찰된다. 가령, 역방향 플라스미드 실험에서 RISC 길이 ICAM1:1383 RNA 복합체 대(對) ICAM1:1383-변형되지 않음의 모티프 (P-1), (P1), (P2)와 (P3)의 상대적 침묵 활성(25 nM RNA에서)(표 15; 각각 79%, 86%, 99%, 그리고 91% 대(對) 57% 유전자 침묵 활성)을 정방향 플라스미드 실험에서 동일한 모티프(표 13; 각각 53%, 55%, 60%, 그리고 81% 대(對) 87% 유전자 침묵 활성)에 비교한다. 또한, 정방향 플라스미드 실험에서 RISC 길이 ICAM1:1383 RNA 복합체 대(對) ICAM1:1383-변형되지 않음의 모티프(G2)의 상대적 침묵 활성(25 nM RNA에서)(표 13; 각각 105% 대(對) 87%)을 역방향 플라스미드 실험에서 동일한 모티프(표 15; 각각 61% 대(對) 57% 유전자 침묵 활성)에 비교한다. 각 경우에, 가이드 가닥으로서 기능하는 RNA 복합체의 가닥은 상기 가닥의 5' 말단으로부터 위치 -1, 1, 2와 3에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 통합되면, 표적에 대한 RNAi 활성이 감소하거나 나타나지 않는다.
[표 16]
SOS1 유전자를 표적으로 하는 RISC 길이 RNA 복합체(역방향 플라스미드)
Figure pct00024

표 11("정방향" 플라스미드에 대한 SOS1:364 RNA 복합체)과 표 16("역방향" 플라스미드에 대한 SOS1:364 RNA 복합체)의 결과를 비교함으로써, 가닥 특이적 RNAi 활성에 대한 히드록시메틸 핵단량체의 위치 특이적 효과가 관찰된다. 가령, 역방향 플라스미드 실험에서 RISC 길이 SOS1:364 RNA 복합체 대(對) SOS1:364-변형되지 않음의 모티프 (24)와 (27)의 상대적 침묵 활성(2.5 nM RNA에서)(표 16; 각각 45.8%와 10.5% 대(對) 5.5% 유전자 침묵 활성)을 정방향 플라스미드 실험에서 동일한 모티프(24와 27 대(對) 변형되지 않음)(표 11; 각각 27%와 86.5% 대(對) 59.1% 유전자 침묵 활성)에 비교한다. 각 경우에, 가이드 가닥으로서 기능하는 RNA 복합체의 가닥은 상기 가닥의 5' 말단으로부터 위치 2에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 통합되면, 표적에 대한 RNAi 활성이 감소하거나 나타나지 않는다.
이런 이유로, 히드록시메틸 핵단량체(가령, 센스 또는 패신저 가닥)를 포함하는 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 가닥의 위치 -1, 1, 2, 및/또는 3(특히 위치 2)에서 또는 이들 위치 주변에 히드록시메틸 치환된 핵단량체를 배치하면, RNA 복합체 내에서 상기 가닥의 침묵 활성이 감소하거나 제거된다(즉, 패신저 가닥 또는 비-표적화 가닥의 바람직하지 않은 RNAi 활성으로 인하여 발생할 수 있는 임의의 잠재적인 "부정확-표적" 효과가 감소하거나 제거된다).
게다가, 이들 결과는 RNA 복합체의 한쪽 가닥 내에서 위치 -1, 1, 2, 및/또는 3 중에서 하나 이상에 하나 이상의 히드록시메틸 핵단량체를 도입하면, 상기 가닥의 RNAi 활성이 감소하거나 제거되는 반면, 다른 가닥은 RNAi 활성에 대하여 여전히 고도로 능동적이라는 것을 증명한다.
RISC 길이 RNA 복합체의 "부정확-표적"
RNAi는 표적 유전자의 발현을 파괴하는데 이용되는 강력한 기술이긴 하지만, 이러한 방법의 바람직하지 않은 결과는 RNAi가 비-표적 유전자의 발현에도 영향을 줄 수 있다는 점이다(소위 "부정확-표적" 효과).
히드록시메틸 핵단량체를 포함하는, 그리고 포함하지 않는 RNA 복합체의 "부정확-표적" 효과의 정도가 조사되었다. 이러한 연구에서, ApoB:3410 RNA 복합체가 패신저 가닥의 "부정확-표적" 활성을 결정하는데 이용되었다. 변형되지 않은 ApoB:3410 RISC 길이 RNA 복합체는 모티프 (P-1/G7)를 보유하는 동일한 서열과 비교되었다.
간단히 말하면, HepG2 세포는 본 명세서에서 앞서 기술된 프로토콜과 방법에 따라 배양되었다. 제조업체의 프로토콜에 따라, GENECHIP Human Genome U133 Plus 2.0 마이크로어레이(AFFYMETRIX)로 마이크로어레이 분석이 수행되었다. "부정확-표적" 유전자 효과는 유전자 발현 수준에서 2-배 또는 그 이상의 변화(상향 또는 하향)가 관찰될 때 계산되었다.
획득된 결과는 "부정확-표적" 효과에서 10배 이상의 감소를 증명한다. 변형되지 않은 ApoB:3410 RISC 길이 RNA 복합체의 경우에, 389개 유전자의 발현 수준이 2-배 또는 그 이상 변하는 반면, 모티프 (P-1/G7)를 보유하는 ApoB:3410 RISC 길이 RNA 복합체의 경우에, 단지 35개 유전자만 발현 수준이 2-배 또는 그 이상 변하였다. 양쪽 경우에서, ApoB 표적 메시지는 대략 95% 감소하였다.
RISC 길이 RNA 복합체의 생체내 유전자 침묵
히드록시메틸 핵단량체를 포함하는, 그리고 포함하지 않는 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성이 생체내에서 조사되었다. 이러한 연구에서, ApoB가 표적이었다. RNA 복합체는 각각, 0.5 ㎎/㎏(일일 30 nmol/㎏), 1 ㎎/㎏(또는 일일 60 nmol/㎏), 그리고 2 ㎎/㎏(또는 일일 120 nmol/㎏)에서 50:28:20:2의 mol% 비율로 DILA2 아미노산 화합물(또는 (E)-아미노((4-(헥사데실아미노)-3-(옥타데스-9-엔아미도)-4-옥소부틸)아미노)메탄이미늄), CHEMS(콜레스테롤 헤미숙시네이트), 그리고 DMPE-PEG2K(2kDa PEG를 포함하는 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)을 포함하는 제제(formulation)에 담겨 Balb/C 생쥐에 정맥내 투여되었다. 군당 5마리 생쥐가 존재하였다; 각 군은 200 ㎕/1회분(dose)의 부피로 투약되었다.
앞서 기술된 RNA 복합체 ApoB:10169와 ApoB:10169(31), 그리고 하기 RNA 복합체가 이러한 연구 동안 투여되었다. 하기 서열 내에서 뉴클레오티드를 선행하는 "m"은 상기 뉴클레오시드에 2'-O-메틸 변형의 존재를 지시한다.
DX4227 (ApoB):
5'- GGAAUCmUmUAmUAmUmUmUGAUCmCAsA -3' 21-mer 센스 가닥 (SEQ ID NO: 157)
5'- mUmUGGAUmCAAAmUAmUAAGAmUUCmCsmCsU -3' 21-mer 안티센스 가닥 (SEQ ID NO: 158)
DX3838 (G1498; 음성 대조 RNA 복합체):
5'- mGmGAUCUUAUUUCUUCGGAGACAAdTdG 25-mer 센스 가닥 (SEQ ID NO: 159)
5'- mCmAUUGUCUCCGAAGAAAUAAGAUCCUU 27-mer 안티센스 가닥 (SEQ ID NO: 160)
각 생쥐 군에 대한 ApoB mRNA의 감소 비율 및 혈청 콜레스테롤 수준에서 상응하는 감소 비율은 하기 표에 제시된다(하기 표 16에서 각각의 RNA 복합체 식별자 열은 5마리 생쥐의 군에 대한 ApoB mRNA 수준 및 혈청 콜레스테롤 수준에서 평균 감소 비율을 나타낸다). ApoB mRNA에서 감소 비율은 PBS 단독 대조에 상대적이다.
[표 17]
생쥐에서 ApoB mRNA와 혈청 콜레스테롤 수준의 감소
Figure pct00025

표 16에서 데이터는 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 위치하는 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 센스와 안티센스 가닥 각각의 위치 20과 21에서 히드록시메틸 치환된 핵단량체(단량체 D)를 포함하는 RISC 길이 RNA 복합체(또는 19개 염기쌍 이중나선 영역, 그리고 센스 가닥과 안티센스 가닥 각각의 3'-말단에 부착된 2개의 비-뉴클레오티드 히드록시메틸 핵단량체를 포함하는 평활-말단 구조체)가 PBS 단독에 비하여 생체내에서 ApoB mRNA 수준을 95% 감소시킨다는 것을 증명한다. TT를 그 대신에 포함하는 3'-말단 오버행을 보유하는 동일한 RNA 복합체는 ApoB mRNA 수준을 80% 감소시켰다. 게다가, 이들 생쥐는 체중에서 유의한 변화를 보이지 않았고, 그리고 명백한 독성이 관찰되지 않았는데, 이는 히드록시메틸 치환된 핵단량체(단량체 D)를 포함하는 RNA 복합체가 안전하고 효과적인 치료제로서 이용될 수 있음을 지시한다. 요약하면, 이들 결과는 RNA 복합체 내에서 비환상 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 통합이 생체내에서 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성을 강화시킨다는 것을 지시한다.
실시예 4
Dicer 길이 RNA 복합체 내에서 히드록시메틸 핵단량체 치환의 위치 특이적 효과
상기 실시예 2에 제공된 치환 패턴(모티프)은 상이한 서열 특이적 Dicer 길이 RNA 복합체에 적용되었다. 이들 RNA 복합체는 하기 표 18-22에 제공된다. 하기 표의 서열 내에서 히드록시메틸 치환된 단량체(들)는 "unaH"로 확인되고, 여기서 H는 핵염기의 한 문자 코드(one letter code)이다(가령, "unaC"는 시토신이 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함한다는 것을 지시한다).
[표 18]
인플루엔자 PB2 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00026

[표 19]
인플루엔자 PA 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00027

[표 20]
인플루엔자 NP 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00028

[표 21]
SOS1 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00029

[표 22]
ApoB 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00030

Dicer 길이 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성
히드록시메틸 단량체(가령, 단량체 D)를 포함하는 Dicer 길이 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성(또는 "적중 활성")이 조사되었다.
형질감염은 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같이 HeLa 세포에서 수행되고, 그리고 이중-루시페라아제 리포터 활성은 본 명세서에서 앞서 기술된 바와 같이, 각각의 Dicer 길이 RNA 복합체에 대한 유전자 침묵 활성을 결정하는데 이용되었다. Dicer 길이 RNA 복합체에 대한 유전자 침묵 활성은 하기 표 22-25에서 제시된다. 모든 시료는 동일한 실험에서 작업된 개별 dsRNA QNeg(Qiagen) 음성 대조 시료에 표준화되었다. 즉, Qneg 값은 95% 신뢰 구간(confidence interval, CI)에서 100% 활성(즉, 적중 없음)으로 설정되었다.
[표 23]
인플루엔자 PB2 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00031

[표 24]
인플루엔자 PA 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00032

[표 25]
인플루엔자 NP 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00033

[표 26]
SOS1 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00034

[표 27]
ApoB 유전자를 표적으로 하는 Dicer 길이 RNA 복합체
Figure pct00035

Dicer 길이 RNA 복합체에 대하여 상기 표 22-25에서 제시된 유전자 침묵 활성은 상이한 서열과 유전자 표적을 보유하는 복수 siRNA에 적용된 모티프 3, 7, 9 그리고 10의 히드록시메틸 핵단량체 치환 패턴이 전반적으로, 히드록시메틸 핵단량체 단량체가 없는 점을 제외하고 동일한 서열을 보유하는 RNA 복합체에 비하여 RNA 복합체의 유전자 침묵 활성을 유지시키고 및/또는 향상시킨다는 것을 지시한다.
Dicer 길이 RNA 복합체의 사이토킨 유도
히드록시메틸 단량체(가령, 단량체 D)를 포함하는 Dicer 길이 RNA 복합체의 사이토킨 유도가 조사되었다.
간단히 말하면, 인간 말초혈 단핵 세포(human peripheral blood mononuclear cell, PBMC)는 모아진 인간 혈액으로부터 Ficoll 농도구배(gradient)에 의해 분리되었다. 세포는 10% FBS, 1X NEAA, 그리고 1X Glutamax를 포함하는 IMDM 배지에서 배양되었다. PBMC는 100 ㎕ 성장 배지에서 웰(well)당 320,000개 세포로 도말되었다. PBMC는 OptiMEM에서 100 nM의 상기 표에서 RNA 복합체 중에서 한 가지 및 0.25 ㎕ RNAiMAX(최종 형질감염 배지는 대략 120 ㎕이었다)의 혼합물로 4시간 동안 형질감염되었다. 각 형질감염은 삼중으로 수행되었다. 4시간의 형질감염후, 성장 배지가 250 ㎕의 최종 부피로 각 웰에 첨가되었다. 형질감염된 세포는 상층액을 수집하기에 앞서 24시간 동안 배양되었다. 세포와 세포 잔해는 원심분리에 의해 제거되고, 그리고 투명해진 상층액은 사이토킨 유도의 분석 때까지 -20℃에서 동결되었다. 수집된 상층액 내에서 인간 IFN-α의 수준은 ELISA(PBL Biomedical 인간 IFN 알파 키트; Cat. #4100-2; 제조업체 프로토콜이 수행되었다)에 의해 측정되었다. 인간 IFN-α의 수준은 전반적인 면역 반응을 지시하는데 이용되었다. Dicer 길이 RNA 복합체로 형질감염된 인간 PBMC에서 인간 IFN-α 수준은 하기 표 28과 29에 제시된다.
[표 28]
인간 PBMC 세포에서 평균 IFN-α 수준
Figure pct00036

[표 29]
인간 PBMC 세포에서 평균 IFN-α 수준
Figure pct00037

5개의 상이한 유전자를 표적으로 하는 5개의 상이한 Dicer 길이 RNA 복합체에 적용된 모티프 2, 3, 4, 8, 그리고 10은 히드록시메틸 치환된 단량체가 없는 점을 제외하고 동일한 RNA 복합체에 비하여 사이토킨 유도를 감소시키고 및/또는 제거하였다.
이러한 ELISA 분석의 결과는 임의의 Dicer 길이 RNA 복합체의 양쪽 dicer 절단 부위(가령, 변형 모티프 2)에 접하는 히드록시메틸 치환된 단량체가 인간 PBMC에서 인간 IFN-α 생산을 유도하지 않는다는 것을 증명한다(RNA 복합체의 변형되지 않은 형태와 비교하여). Dicer 길이 RNA 복합체의 센스 가닥의 위치 21과 22, 또는 센스 가닥의 위치 2와 6(센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는)에서 히드록시메틸 치환된 단량체의 도입은 히드록시메틸 치환된 단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 인간 IFN-α 발현을 제거하거나 감소시킨다. Dicer 길이 RNA 복합체의 안티센스 가닥의 위치 6과 7, 또는 안티센스 가닥의 위치 8에서 히드록시메틸 치환된 단량체의 도입은 히드록시메틸 치환된 단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 인간 IFN-α 발현을 제거하거나 감소시킨다. Dicer 길이 RNA 복합체의 센스 가닥의 위치 25, 그리고 안티센스 가닥의 위치 26과 27에서 히드록시메틸 치환된 단량체의 도입은 히드록시메틸 치환된 단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 인간 IFN-α 발현을 제거하거나 감소시킨다. 또한, Dicer 길이 RNA 복합체의 센스 가닥의 위치 21과 22, 그리고 안티센스 가닥의 위치 6과 7에서 히드록시메틸 치환된 단량체의 도입은 히드록시메틸 치환된 단량체가 없는 동일한 RNA 복합체에 비하여 인간 IFN-α 발현을 제거하거나 감소시킨다.
사이토킨 반응, 그리고 RNA 복합체를 "엄폐"하거나, 또는 사이토킨 유도를 제거하거나 감소시키는 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 능력을 더욱 조사하기 위하여, TLR3(톨-유사 수용체 3), MDA5(IFIH1), 그리고 RIG-I(레티노산-유도성 유전자 1) 활성화가 조사되었다.
TLR3은 선천성 면역계(innate immune system)의 패턴 인식 수용체의 톨-유사 수용체 계통의 구성원이다. 이는 예로써, RNA 바이러스로부터 이중-가닥 RNA를 인식한다. TLR3은 dsRNA를 인식하고 NF-κB를 활성화시켜 I형 인터페론(사이토킨)의 생산을 증가시키고, 이는 차후에, 항바이러스 방어(antiviral defense)를 증가시키도록 다른 세포에게 신호한다.
MDA-5와 RIG-I 역시 이중-가닥 RNA를 인식하고 바이러스, 예를 들면, RNA 바이러스 감염에 대한 "센서"로서 기능한다.
간단히 말하면, 인간 배꼽 내피 세포(HUVEC)는 48 웰 평판 내에서, 2% 혈청 및 성장 보충물(EGM-2 BULLETKIT; Cambrex Bio Science)을 포함하는 EGM-2 성장 배지에서 웰당 45,000개 세포로 도말되었다. 대략 24시간 동안 이들 세포를 배양한 이후, HUVEC은 50 nM의 RNA 복합체 중에서 한 가지(FluA1:2242 25/27, G3789 D-siRNA 또는 FluA1:2242 25/27-10)과 RNAiMAX의 혼합물, 양성 대조 폴리 I:C 또는 RNAiMAX 단독(RNA 없음)로 4시간 동안 형질감염되었다. 각 형질감염은 삼중으로 수행되었다. 4시간의 형질감염후, 200 ㎕ EGM-2 성장 배지가 각 웰에 첨가되었다. 형질감염된 세포는 용해와 상층액 수집에 앞서 24시간 동안 배양되었다. TLR3, MDA-5와 RIG-I의 수준은 제조업체 프로토콜(AFFYMETRIX)에 따라 QUANTIGENE 분석에 의해 측정되었다. TLR3, MDA-5와 RIG-I 발현의 수준은 하기 표 30에 제시된다. 모든 수준은 PPIA 발현 수준에 표준화된다.
[표 30]
TLR3, MDA-5와 RIG-I에 대한 mRNA 발현 수준에서 배수적 변화
Figure pct00038

상기 표 30에서 제시된 발현 수준은 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 없는 Dicer 길이 RNA 복합체(FluA1:2242 25/27, G3789 변형되지 않음)가 RNAiMAX 단독을 초과하고, 그리고 양성 대조 폴리 I:C에 필적하는 TLR3, MDA-5와 RIG-I 발현 수준을 유도한다는 것을 지시한다. 대조적으로, 히드록시메틸 치환된 핵단량체(모티프 10)를 포함하는 동일한 Dicer 길이 RNA 복합체는 TLR3, MDA-5 또는 RIG-I 발현 수준을 유도하지 않는다. 따라서 히드록시메틸 치환된 핵단량체의 전략적인 배치는 이중-가닥 RNA에 대한 면역 반응의 활성화를 뒷받침하는 세포 수용체로부터 Dicer 길이 RNA 복합체를 "엄폐"할 수 있다.
Dicer 효소에 의한 Dicer 길이 RNA 복합체의 가공
Dicer 효소에 의한, 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함하는 Dicer 길이 RNA 복합체의 가공이 조사되었다.
변형되지 않거나, 또는 변형 모티프 2, 3, 또는 4(변형 모티프 설명을 위하여 실시예 2를 참조한다)를 포함하는 Dicer 길이 RNA 복합체 G3789, G8282, G1498, SOS1과 ApoB는 시험관내에서 Dicer 효소와 함께 항온처리되고, HPLC에 의해 정제되고, 그리고 Dicer 효소에 의한 가공의 양을 결정하기 위하여 LC-MS에 의해 분석되었다.
간단히 말하면, 변형되지 않은, 그리고 변형된 RNA 복합체는 완충액에서 적절한 비율의 센스와 안티센스 가닥을 혼합함으로써 40 μM에서 제조되고, 1분 동안 95℃로 가열되고, 이후 실온으로 천천히 냉각되었다. RNA 복합체는 37℃에서 24시간 동안 Dicer 효소에 종속되었다. 24시간 배양 기간후, 시료는 600 ㎖의 물을 포함하는 부동 투석 막(floating dialysis membrane)으로 1시간 동안 탈염되었다. 시료는 이후, HPLC 바이알에 적하되고 LC-MS 상에 주입되었다. HPLC 파라미터는 아래와 같았다: 0.2 ㎖/분(minute)의 유속, XTerra® 칼럼 MS C18 2.5 ㎛, 2.1 x 50 mm, 칼럼 온도 65℃, 이동상(mobile phase) A: 100 mM HFIP, 7 mM TEA, pH 8.1; 이동상 B: 100% 메탄올, 임의의 프리칼럼 부피(precolumn volume) 없이 40분에 걸쳐 농도구배 2-14 %, 그리고 15 ㎕의 주입 부피(injection volume). LC-MS 파라미터는 아래와 같았다: 음성 이온 형식(negative ion mode), 모세관 3.0 kV, 원뿔 40 V, desolv. 온도 300℃, desolv. 유속(N2) 600 ℓ/시간, 공급원 온도 90℃, 1.5초에 걸쳐 포착(acquisition) 300-1950 m/z. 질량 스펙트럼 데이터는 Micromass®(Waters®)에 의해 작성된 MaxEnt®(최대 엔트로피) 소프트웨어를 이용하여 디컨볼루션(deconvolution) 되었다.
5개의 상이한 유전자를 표적으로 하는 5개의 상이한 Dicer 길이 RNA 복합체에 적용된 모티프 2, 3과 4는 Dicer 효소에 의한 가공을 예방한다.
이러한 데이터는 히드록시메틸 치환된 단량체가 센스와 안티센스 가닥 둘 모두에, 또는 한쪽 가닥(센스 또는 안티센스 가닥)에 존재하는 지에 상관없이, Dicer 효소가 Dicer 절단 부위에 접하는 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함하는 Dicer 길이 RNA 복합체를 가공하지 못한다는 것을 증명한다. 변형되지 않은 RNA 복합체는 Dicer 효소에 의해 절단되었다. 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함하는 조사된 모든 변형된 Dicer 길이 RNA 복합체는 유전자 침묵 활성(상기 참조)을 유지하였는데, 이는 비록 이들 RNA 복합체가 Dicer 효소에 의해 가공되진 않지만, RNAi 활성에 대하여 여전히 능동적이고 표적 유전자 발현을 감소시킨다는 것을 지시한다.
따라서 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 센스 가닥의 위치 21과 22(모티프 3)에서 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함하는 Dicer 길이 RNA 복합체는 Dicer 효소에 의해 가공되지 않는다. 게다가, 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 안티센스 가닥의 위치 6과 7에서 히드록시메틸 치환된 단량체(모티프 4)를 포함하는 RNA 복합체는 Dicer 효소에 의해 가공되지 않는다. 센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 센스 가닥의 위치 21과 22에서 히드록시메틸 치환된 단량체, 그리고 안티센스 가닥의 5'-말단으로부터 계산되는 안티센스 가닥의 위치 6과 7에서 히드록시메틸 치환된 단량체를 포함하는 RNA 복합체는 Dicer 효소에 의해 가공되지 않는다(모티프 2).
SEQUENCE LISTING <110> MDRNA, INC. <120> USIRNA COMPLEXES <130> 08-19PCT <140> <141> <150> 61/252,085 <151> 2009-10-15 <150> 61/119,624 <151> 2008-12-03 <160> 240 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 cgggacucua gcauacuuat t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> source <223> /note="Description of Combined DNA/RNA Molecule: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (18)..(18) <223> Hydroxymethyl substituted-uracil <400> 2 cgggacucua gcauacuuat t 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> 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Claims (23)

  1. 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하며, 센스 가닥의 5'-말단에서 마지막 3개의 위치 중 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것인 핵산.
  2. 제1항에 있어서, 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더 포함하는 핵산.
  3. 제1항에 있어서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더 포함하는 핵산.
  4. 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 15개 내지 24개의 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하며, 안티센스 가닥의 위치 5, 6, 7 및 8 중 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 안티센스 가닥의 위치는 안티센스 가닥의 5'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링(numbering)되는 것인 핵산.
  5. 제4항에 있어서, 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더 포함하는 핵산.
  6. 제4항에 있어서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더 포함하는 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 이중-가닥 영역이 19개 또는 20개 염기쌍을 보유하는 것인 핵산.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 각각 21개 또는 22개 핵단량체 길이를 갖는 것인 핵산.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 평활 말단(blunt end) 또는 3'-말단 오버행(overhang)을 보유하는 것인 핵산.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 12, 34, 56, 78, 100, 124, 또는 147의 임의의 15개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15개 연속 핵단량체의 영역을 보유하는 것인 핵산.
  11. 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하며, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 위치 및 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 위치가 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것인 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치가 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것인 핵산.
  13. 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하며, 센스 가닥의 위치 21, 22 및 23 중 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 센스 가닥의 위치는 센스 가닥의 5'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링되는 것인 핵산.
  14. 센스 가닥과 안티센스 가닥, 그리고 25개 내지 40개 염기쌍을 보유하는 이중-가닥 영역을 포함하며, 안티센스 가닥의 위치 18, 19, 20, 21 및 22 중 하나 이상이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되고, 여기서 센스 가닥의 위치는 안티센스 가닥의 3'-말단에서 위치 1에서부터 넘버링되는 것인 핵산.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 안티센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더 포함하는 핵산.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 센스 가닥의 3'-말단의 마지막 2개의 위치 중 한쪽 또는 양쪽이 동일하거나 상이한 히드록시메틸 치환된 핵단량체에 의해 점유되는 것을 더 포함하는 핵산.
  17. 제11항, 제13항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안티센스 가닥이 SEQ ID NO: 169, 185, 201, 217, 또는 233의 임의의 15개 연속 핵단량체에 상응하는 적어도 15개 연속 핵단량체의 영역을 보유하는 것인 핵산.
  18. 제1항 내지 제6항 및 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 2'-3'-seco-핵단량체인 핵산.
  19. 제1항 내지 제6항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록시메틸 치환된 핵단량체가 하기 단량체 D, F, G, H, I, 또는 J에서 선택되는 것인 핵산:
    Figure pct00039


    여기서
    R은 수소, 알킬 기, 콜레스테롤 유도체, 형광단, 폴리아민, 지방산, 아미노산, 당류 및 폴리펩티드로 이루어진 군에서 선택되고,
    염기는 임의의 퓨린, 피리미딘, 또는 이들의 유도체 또는 유사체이다.
  20. 제1항 내지 제6항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2'-O-알킬-RNA 단량체, 2'-아미노-DNA 단량체, 2'-플루오르-DNA 단량체, LNA 단량체, PNA 단량체, HNA 단량체, ANA 단량체, FANA 단량체, CeNA 단량체, ENA 단량체, DNA 단량체, 및 INA 단량체로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 유사체를 더 포함하는 핵산.
  21. 제1항 내지 제6항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 제조하는 단계 및 세포를 상기 핵산으로 처리하는 단계를 포함하는, 세포 내에서 유전자의 발현을 감소시키는 방법.
  22. 제1항 내지 제6항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 제조하는 단계 및 상기 핵산을 인간에게 투여하는 단계를 포함하는, 인간에서 류머티스성 관절염을 비롯한 염증 질환, 과콜레스테롤혈증을 비롯한 물질대사 질환, 간 질환, 뇌염, 뼈 골절, 심장 질환, 간염 및 인플루엔자를 비롯한 바이러스 질환, 및 암에서 선택된 질환을 치료하는 방법.
  23. 류머티스성 관절염을 비롯한 염증 질환, 과콜레스테롤혈증을 비롯한 물질대사 질환, 간 질환, 뇌염, 뼈 골절, 심장 질환, 간염 및 인플루엔자를 비롯한 바이러스 질환, 및 암을 포함하는 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 제1항 내지 제6항 및 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.

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