CN115955972A - 载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法 - Google Patents

载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115955972A
CN115955972A CN202180045301.4A CN202180045301A CN115955972A CN 115955972 A CN115955972 A CN 115955972A CN 202180045301 A CN202180045301 A CN 202180045301A CN 115955972 A CN115955972 A CN 115955972A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nucleotides
dsrna agent
antisense strand
strand
nucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180045301.4A
Other languages
English (en)
Inventor
B·L·博斯特威克
彭海燕
J·D·马克辛尼克
A·卡斯托雷诺
M·K·施莱格尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of CN115955972A publication Critical patent/CN115955972A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10Type of nucleic acid
    • C12N2310/14Type of nucleic acid interfering N.A.
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/31Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315Phosphorothioates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/3212'-O-R Modification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/32Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/3222'-R Modification
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/34Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/344Position-specific modifications, e.g. on every purine, at the 3'-end
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/351Conjugate
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/351Conjugate
    • C12N2310/3515Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/352Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521Methyl
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/35Nature of the modification
    • C12N2310/353Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533Halogen
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/31Combination therapy
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/34Allele or polymorphism specific uses
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00Applications; Uses
    • C12N2320/30Special therapeutic applications
    • C12N2320/35Special therapeutic applications based on a specific dosage / administration regimen

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本公开涉及靶向APOE基因的双链核糖核酸(dsRNAi)剂和组合物,以及使用此类dsRNAi剂和组合物抑制APOE基因表达的方法和治疗患有APOE相关神经退行性疾病或病症(例如阿尔茨海默病和帕金森病)的受试者的方法。

Description

载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法
相关申请
本申请要求于2020年4月27日提交的美国临时申请第63/015,867号的优先权权益,其全部内容通过引用并入本文。
序列表
本申请包含已以ASCII格式提交的电子版序列表,并且其全部内容通过引用并入本文。该ASCII拷贝创建于2021年4月20日,名为121301_11220_SL.txt,大小为200,944字节。
背景技术
载脂蛋白E(apolipoprotein E)基因编码载脂蛋白E(APOE)蛋白,其为一种在18氨基酸信号肽的裂解后包含299个氨基酸的糖蛋白。APOE有三个常见的亚型(APOE2、APOE3和APOE4),由三个相应的等位基因编码。三个APOE亚型ApoEε2(APOE2)、ApoEε3(APOE3)、ApoEε4(APOE4)彼此之间仅在氨基酸位置112和158上有所不同;APOE2具有Cys112和Cys158,APOE3具有Cys112和Arg158,而APOE4具有Arg112和Arg158。APOE广泛表达,但其主要是在肝脏肝细胞中进行外周表达并且主要是在神经胶质细胞中进行在中枢神经系统(CNS)中的表达。
在外周,APOE在脂质稳态中发挥作用。这些脂蛋白颗粒不能穿过血脑屏障;研究表明,由星形胶质细胞和小胶质细胞释放的含apoE的颗粒是脑apoE的主要来源(Bjorkhem I,et al.(1998)J Lipid Research 39(8):1594–1600;Pitas RE,et al.(1987)BiochimicaBiophysica Acta.13;917(1):148–161;Krasemann S,et al.(2017)Immunity.47(3):566–581.e9.doi:10.1016/j.immuni.2017.08.008)。在脑中,APOE调节多种途径,包括脂质转运、突触完整性和可塑性、葡萄糖代谢、神经炎症和脑血管完整性。例如,一旦APOE从细胞中分泌出来,多种转运蛋白(例如,ATB结合cssestte转运蛋白)将胆固醇和磷脂转移到新生的APOE中以形成脂蛋白颗粒,APOE随后通过结合APOE受体(例如LDL受体(LDLR)家族成员)而将脂蛋白颗粒分布到神经元中。此外,已经观察到肝移植后受体的血清APOE表型完全转变为供体的表型,而脑脊液(CSF)ApoE表型则没有。此外,星形胶质细胞在高密度脂蛋白(HDL)样颗粒中产生APOE,该APOE具有与其他来源的APOE不同的性质(参见,例如Morikawa,etal.,Neurobiol Dis..Jun-Jul 2005;19(1-2):66-76).Therefore,the APOE in CSFcannot be derived from the plasma pool and therefore must be synthe)。因此,CSF中的APOE不能从血浆池中获得,因此必须在局部合成(Linton MF,et al.(1991)J ClinInvest.88(1):270–281.doi:10.1172/JCI115288)。
APOE基因的多态性与多种蛋白病相关。APOE多态性和疾病之间的最确定的联系是APOE基因型和阿尔茨海默病(AD)之间的联系,其已被证明是迟发性阿尔茨海默病(其症状在65岁以后出现)的主要风险决定因素。此外,Haltzman实验室最近的研究表明ε4等位基因的存在显著加速了疾病的进展(p=0.02),与非携带者相比,携带一个ε4等位基因使进展率增加了14%,携带两个ε4等位基因使进展率增加了23%(Holtzman,et al.(2017)Nature549:523)。AD是老年个体痴呆的主要原因,其病理特征包括细胞外淀粉样蛋白β(Aβ)聚集物沉积为淀粉样斑块和细胞内过度磷酸化的tau聚集物作为神经纤维缠结,以及神经元损失和神经胶质活化。由于迟发性AD患者占总AD人群的95%或更多,正在进行各种努力来阐明APOE在AD中的作用。
更具体地,已经表明具有一个APOE4拷贝的受试者患AD的风险增加了超过3倍,具有两个APOE4拷贝的受试者患AD的风险增加了超过12倍,而两个APOE2拷贝保护受试者免于患上AD(Reiman EM,et al.(2020)Nature Communications 11(1);667)。此外,已经报道了三个敲除了APOE基因的人类病例,并且这些受试者在医院就诊时(40岁至60岁)均未经历痴呆(Ghiselli,et al.(1981)Science 214(4526):1239;Mak,et al.(2014)JAMA Neurol71:1228;and Lohse,et al.(1992)J Lipid Res.(11):1583)。在三个病例中的一个(40岁男性)中,MRI和脑脊液(CSF)生物标志物测试显示没有神经变性的迹象,且具有完整的大脑结构和正常范围的Tau和p-Tau水平。此外,最近的一项案例研究表明,ApoE3中的Christchurch突变可能对早老素1驱动的痴呆有保护作用,这一点通过PET获得的保留的认知功能和有限的tau蛋白病得到证实。Christchurch突变的存在导致ApoE3结合HSPG和LDL受体的功能丧失,并且患者患有高脂蛋白血症III型但并未患有心血管疾病(Arboleda-Velasquez,et al.(2019)Nature Medicien 25:1680)。
在ApoE诱导型淀粉样蛋白小鼠模型中也已经证明,ApoE4表达的增加加速了淀粉样蛋白积累和神经突营养不良(Liu,et al.(2017)Neuron 96:1024)和Huynh,et al.(Neuron(2017)96:1013),并且APOE4的反义抑制对转基因淀粉样前体蛋白(APP)/早老素1(PS1-21)小鼠具有保护作用。此外,已经表明在tau蛋白病小鼠模型中删除ApoE4对神经退行性变具有保护作用(Holtzman,et al.(2017)Nature 549:523),并且在源自表达APOE4但使APOE无效的诱导多能干细胞的人神经元中重新引入APOE4表达导致APOE4的毒性作用增强(Wang,et al.(2018)Nat Medicine 24:647)。此外,已经表明将APOE4的表达限制在小鼠的肝脏中仍可对认知能力产生影响,且可损害血脑屏障以及增加神经炎症(alzforum.org/news/research-news/apoe-has-hand-Alzheimer’ss-beyond-av-beyond-brain)。
目前,对于患有APOE相关神经退行性疾病(如AD)的受试者,没有治愈方法或预防性治疗方法,而支持性和症状管理是治疗的主要方法。因此,本领域需要用于治疗患有神经退行性疾病或具有患神经退行性疾病风险的受试者的组合物和方法。
发明内容
本公开提供了RNAi剂组合物,其引起由RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的载脂蛋白E(APOE)基因RNA转录本的裂解。APOE基因可以位于细胞内,例如受试者(如人)体内的细胞内。本公开还提供了使用本公开的RNAi剂组合物来抑制APOE基因的表达或治疗将受益于抑制或减少APOE基因(例如致病性APOE等位基因,即APOE4)的表达的受试者的方法,所述受试者是例如患有APOE相关神经退行性疾病(例如淀粉样蛋白-β介导的疾病或tau介导的疾病)或易患有APOE相关神经退行性疾病的受试者。具体地,本文的RNAi剂组合物能够影响CNS内独特的星形胶质细胞的APOE表达,以用于治疗APOE相关的神经退行性疾病。
因此,在一个方面,本公开提供了一种双链核糖核酸(RNAi)剂,其用于抑制载脂蛋白E(APOE)基因的表达,其中所述RNAi剂包含有义链和反义链,其中所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含与表2至表5和表7至表10中任一表中所列的任一反义序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表2至表5和表7至表10中任一表中所列的任一反义序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表7和表8中任一表中所列的任一反义序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表9和表10中任一表中所列的任一反义序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含与表2至表5和表7至表10中任一表中所列的任一反义序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少19个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表7和表8中任一表中所列的任一反义序列的至少19个连续核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表9和表10中任一表中所列的任一反义序列的至少19个连续核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表2至表5和表7至表10中任一表中所列的任一反义序列的至少19个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含包括表7和表8中任一表中所列的任一反义序列的至少19个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含表9和表10中任一表中所列的任一反义序列的至少19个连续核苷酸。在某些实施方案中,对齐(比较)的序列之间的胸腺嘧啶相对于尿嘧啶或尿嘧啶相对于胸腺嘧啶的差异不被视为对齐(比较)的序列之间的核苷酸差异。
在一些实施方案中,所述剂包含一个或多个亲脂性部分,所述亲脂性部分任选地通过接头或载体缀合至一个或多个内部核苷酸位置。
在其他实施方案中,所述剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体例如一个或多个GalNAc衍生物,所述靶向配体任选地通过接头或载体与双链RNAi剂缀合。
在其他实施方案中,所述剂还包含一个或多个亲脂性部分,以及靶向肝脏组织的靶向配体例如一个或多个GalNAc衍生物,所述亲脂性部分任选地通过接头或载体缀合至一个或多个内部核苷酸位置,所述靶向配体任选地通过接头或载体与双链RNAi剂缀合。
在某些实施方案中,所述双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,所述双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制载脂蛋白E(APOE)基因表达,其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链,其中所述有义链包含与表2至表5和表7至表10中所示的任一有义链序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸;并且其中所述反义链包含与表2至表5和表7至表10中所示的任一反义链核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述有义链包含表2至表5和表7至表10中所示的任一有义链序列的至少15个连续核苷酸;并且其中所述反义链包含表2至表5和表7至表10中所示的任一反义链核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述有义链包含表7和表8中所示的任一有义链序列的至少15个连续核苷酸;并且其中所述反义链包含表7和表8中所示的任一反义链核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所述有义链包含表9和表10中所示的任一有义链序列的至少15个连续核苷酸;并且其中所述反义链包含表9和表10中所示的任一反义链核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。在某些实施方案中,所示有义链包含表2至表5和表7至表10中所示的任一有义链序列的至少19个连续核苷酸(即,相异3、2、1或0个核苷酸);并且其中所述反义链包含表2至表5和表7至表10中所示的任一反义链核苷酸序列的至少19个连续核苷酸(即,与表2至表5和表7至表10中所示的任一反义链核苷酸序列相异3、2、1或0个核苷酸)。在某些实施方案中,所述有义链包含表7和表8中所示的任一有义链序列的至少19个连续核苷酸(即,相异3、2、1或0个核苷酸);并且其中所述反义链包含表7和表8中所示的任一反义链核苷酸序列的至少19个连续核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)。在某些实施方案中,所述有义链包含表9和表10中所示的任一有义链序列的至少19个连续核苷酸(即,相异3、2、1或0个核苷酸);并且其中所述反义链包含表9和表10中所示的任一反义链核苷酸序列的至少19个连续核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)。
在一些实施方案中,所述剂包含一个或多个亲脂性部分,所述亲脂性部分任选地通过接头或载体缀合至一个或多个内部核苷酸位置。
在其他实施方案中,所述剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体例如一个或多个GalNAc衍生物,所述靶向配体任选地通过接头或载体与双链RNAi剂缀合。
在其他实施方案中,所述剂还包含一个或多个亲脂性部分以及靶向肝脏组织的靶向配体(例如一个或多个GalNAc衍生物),所述亲脂性部分任选地通过接头或载体缀合至一个或多个内部核苷酸位置,所述靶向配体任选地通过接头或载体与双链RNAi剂缀合。
在某些实施方案中,所述双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,所述双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制载脂蛋白E(APOE)基因表达,其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链,其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性)的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,其中用尿嘧啶替换SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的任意胸腺嘧啶(当比较对齐的序列时)不被视为导致与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的任一核苷酸序列或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性)的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的差异;并且其中所述反义链包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的任一完整核苷酸序列具有至少90%的核苷酸序列一致性(例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99或100%的一致性)的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,其中用尿嘧啶替换SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10中的任意胸腺嘧啶(当比较对齐序列时)不被视为导致与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQID NO:10的任一核苷酸序列或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的差异,其中所述有义链和所述反义链中的至少一条包含一个或多个亲脂性部分,所述亲脂性部分任选地通过接头或载体缀合至一个或多个内部核苷酸位置。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与表2至表5和表7至表10中的双链体的有义链核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与表7和表8中的双链体的有义链核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与表9和表10中的双链体的有义链核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含反义链,所述反义链包含与表2至表5和表7至表10之一中的任一双链体的反义核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含反义链,所述反义链包含与表7和表8之一的双链体的反义核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含反义链,所述反义链包含与表9和表10之一的双链体的反义核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与SEQID NO:1的核苷酸50-113、59-97、59-90、107-177、107-153、124-153、198-240、203-240、209-240、283-378、283-312、307-378、322-369、330-357、394-419、568-600、568-594、841-879、900-926、997-1055、1002-1044、1014-1044、1019-1044、1120-1166、1130-1166、1130-1155中的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸;并且所述反义链包含来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与SEQID NO:1的核苷酸59-90、330-357、568-594、1019-1044、1130-1155中的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,并且所述反义链包含来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与SEQID NO:1的核苷酸57-79、62-84、75-97、86-108、207-229、213-235、218-240、898-920、1128-1150、637-659中的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,并且所述反义链包含来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在另一实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含有义链,所述有义链包含与SEQID NO:1的核苷酸57-79、62-84、207-229、1128-1150中的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,并且反义链包含来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含反义链,所述反义链包含与双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,所述双链体选自由以下组成的组:AD-1204704、AD-1204705、AD-1204705、AD-1204706AD-1204707、AD-1204708、AD-1204709、AD-1204710、AD-1204711、AD-1204712和AD-1204713。
在一个实施方案中,靶向APOE的双链RNAi剂包含反义链,所述反义链包含与双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)至少15个连续核苷酸,所述双链体选自由以下组成的组:AD-1204704、AD-1204705、AD-1204708和AD-1204712。
在一些实施方案中,所述剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体例如一个或多个GalNAc衍生物,所述靶向配体任选地通过接头或载体与所述双链RNAi剂缀合。
在本发明的某些实施方案中,所述双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,所述双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
任选地,所述双链RNAi剂包含至少一个经修饰的核苷酸。
在某些实施方案中,通过logKow测量的亲脂性部分的亲脂性超过0。
在一些实施方案中,通过双链RNAi剂的血浆蛋白结合试验中的未结合分数(unbound fraction)测量出的双链RNAi剂的疏水性超过0.2。在一个相关实施方案中,血浆蛋白结合试验是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变动试验。
在某些实施方案中,所述有义链的基本所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。任选地,所述有义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
在一些实施方案中,所述反义链的基本所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。任选地,所述反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
任选地,所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,经修饰的核苷酸中的至少一个选自以下的组:脱氧核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧修饰核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象限制核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2'-O-烯丙基修饰核苷酸、2'-C-烷基修饰核苷酸、2'-羟基修饰核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰核苷酸、环己烯基修饰核苷酸、包含5′-硫代磷酸基团的核苷酸、包含5′-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5'磷酸的核苷酸或包含5'磷酸模拟物的核苷酸、包含乙烯基膦酸酯的核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体的核苷酸、包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸的核苷酸、包含2'-脱氧胸苷-3'磷酸的核苷酸、包含2′-脱氧鸟苷-3'-磷酸的核苷酸或与胆固醇衍生物或十二酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
在一个相关实施方案中,经修饰的核苷酸是2'-脱氧-2'-氟基修饰核苷酸、2′-脱氧-修饰核苷酸、3′-末端脱氧-胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2′-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯或包含非天然碱基的核苷酸。
在一个实施方案中,经修饰的核苷酸包含3′-末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
在另一实施方案中,核苷酸上的修饰是2'-O-甲基修饰、2'-氟基修饰和GNA修饰。
在另一实施方案中,所述双链RNAi剂包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。任选地,所述双链RNAi剂包含6至8个(例如6、7或8个)硫代磷酸酯核苷酸间键。
在某些实施方案中,所述互补性区域的长度至少为17个核苷酸。任选地,所述互补性区域长度为19至23个核苷酸。任选地,所述互补性区域长度为19个核苷酸。
在一个实施方案中,每条链的长度为不超过30个核苷酸。
在另一实施方案中,至少一条链包含至少1个核苷酸的3'突出。任选地,至少一条链包含至少2个核苷酸的3′突出。
在某些实施方案中,所述双链RNAi剂还包含亲脂性配体例如C16配体,其通过单价或分支的二价或三价接头缀合至有义链的3'端。在某些实施方案中,所述双链RNAi剂还包含亲脂性配体例如C16配体,其例如通过单价或分支的二价或三价接头缀合至内部核苷酸位置。
在一个实施方案中,所述配体是
Figure BDA0004014902130000111
其中B是核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物,任选地,其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在其他实施方案中,所述剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体例如一个或多个GalNAc衍生物,其任选地通过接头或载体与双链RNAi剂缀合。
在其他实施方案中,所述剂还包含亲脂性配体(例如C16配体),以及靶向肝脏组织的靶向配体(例如一个或多个GalNAc衍生物),所述亲脂性配体是例如通过单价或分支的二价或三价接头缀合至内部核苷酸位置,所述靶向配体通过单价或分支的二价或三价接头缀合至有义链的3'端。
在另一实施方案中,APOE的互补性区域包含表2至表5和表7至表10中的任一表中的任一反义序列。在某些实施方案中,APOE的互补性区域包含表7和表8中的任一表中的任一反义序列。在某些实施方案中,APOE的互补性区域包含表9和表10中的任一表的任一反义序列。
在另一实施方案中,APOE的互补性区域是表2至表5和表7至表10中任一表中任一反义序列的区域。在某些实施方案中,APOE的互补性区域是表7和表8中的任一表中任一反义序列的区域。在一些实施方案中,内部核苷酸位置包括除了从链的每端起的末端两个位置之外的所有位置。在某些实施方案中,APOE的互补性区域是表9和表10中的任一表中任一反义序列的区域。在一些实施方案中,内部核苷酸位置包括除了从链的每端起的末端两个位置之外的所有位置。
在一个相关实施方案中,内部位置包括除了从链的每端起的末端三个位置之外的所有位置。任选地,内部位置不包括有义链的裂解位点区域。
在一些实施方案中,内部位置不包括从有义链的5'端起计数的位置9至12。在某些实施方案中,有义链长度为21个核苷酸。
在其他实施方案中,内部位置不包括从有义链的3'端起计数的位置11至13。任选地,内部位置不包括反义链的裂解位点区域。在某些实施方案中,有义链长度为21个核苷酸。
在一些实施方案中,内部位置不包括从反义链的5'端起计数的位置12至14。在某些实施方案中,反义链的长度为23个核苷酸。
在另一实施方案中,内部位置不包括从有义链的3'端起计数的位置11至13和从反义链的5'端起计数的位置12至14。在某些实施方案中,有义链长度为21个核苷酸,反义链长度为23个核苷酸。
在另一实施方案中,一个或多个亲脂性部分缀合至一个或多个以下内部位置:从每条链的5′端起计数的有义链上的位置4至8和位置13至18以及反义链上的位置6至10和位置15至18。任选地,一个或多个亲脂性部分缀合至一个或多个以下内部位置:从每条链的5′端起计数的有义链上的位置5、6、7、15和17以及反义链上的位置15和17。在某些实施方案中,有义链长度为21个核苷酸,反义链长度为23个核苷酸。
在某些实施方案中,亲脂性部分是脂肪族化合物、脂环族化合物或多脂环族化合物。任选地,亲脂性部分是脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪。
在一些实施方案中,亲脂性部分包含饱和C4-C30烃链或不饱和C4-C30烃链,和选自以下的任选官能团:羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸、硫醇、叠氮化物和炔烃。
在某些实施方案中,亲脂性部分包含饱和C6-C18烃链或不饱和C6-C18烃链。任选地,亲脂性部分包含饱和C16烃链或不饱和C16烃链。在一个相关实施方案中,亲脂性部分通过替换一个或多个内部位置的一个或多个核苷酸的载体缀合。在某些实施方案中,载体是选自由以下环状基团:吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基(piperazinyl)、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基(oxazolidinyl)、异噁唑烷基(isoxazolidinyl)、吗啉基、噻唑烷基(thiazolidinyl)、异噻唑烷基、喹喔啉基(quinoxalinyl)、哒嗪壬基(pyridazinonyl)、四氢呋喃基及十氢萘基;或者载体是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的非环状部分。
在一些实施方案中,亲脂性部分通过含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与双链RNAi剂缀合。
在一个实施方案中,亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键(internucleosidiclinkage)缀合。
在另一实施方案中,双链RNAi剂还包含在反义链的5'端的磷酸或磷酸模拟物。任选地,磷酸模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在某些实施方案中,双链RNAi剂还包含靶向介导向CNS组织的递送的受体的靶向配体,例如亲水性配体。在某些实施方案中,靶向配体是C16配体。
在一些实施方案中,双链RNAi剂还包含靶向脑组织(例如纹状体)的靶向配体。
在一些实施方案中,双链RNAi剂还包含靶向肝脏组织(例如肝细胞)的靶向配体。
在一个实施方案中,亲脂性部分或靶向配体通过生物可裂解的接头缀合,所述生物可裂解的接头是DNA,RNA,二硫化物,酰胺,半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的功能化单糖或寡糖,或其组合。
在一个相关实施方案中,有义链的3'端被端帽保护,所述端帽是具有胺的环状基团,所述环状基团是吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基及十氢萘基。
在一个实施方案中,RNAi剂包含至少一种经修饰的核苷酸,所述经修饰的核苷酸为2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、包含二醇核酸(GNA)的核苷酸或包含乙烯基膦酸酯的核苷酸。任选地,RNAi剂包含下列每种修饰中的至少一个:2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、包含二醇核酸(GNA)的核苷酸和包含乙烯基膦酸酯的核苷酸。
在另一实施方案中,RNAi剂包含如下表2至表5和表7至表10中所提供的经修饰的核苷酸的模式,其中2'-C16修饰、2'-O-甲基修饰、GNA修饰、硫代磷酸酯修饰和2'-氟基修饰的位置与示出的RNAi剂的单个核苷酸碱基序列无关。在一个实施方案中,RNAi剂包含如下表7和表8中所提供的经修饰的核苷酸的模式,其中2'-C16修饰、2'-O-甲基修饰、GNA修饰、硫代磷酸酯修饰和2'-氟基修饰的位置与示出的RNAi剂的单个核苷酸碱基序列无关。在一个实施方案中,RNAi剂包含如下表9和表10中所提供的经修饰的核苷酸的模式,其中2'-C16修饰、2'-O-甲基修饰、GNA修饰、硫代磷酸酯修饰和2′-氟基修饰的位置与示出的RNAi剂的单个核苷酸碱基序列无关。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因表达,其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码APOE的mRNA的一部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述双链RNAi剂由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5' (III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p'、q和q'各自独立地为0至6;
每个Na和Na′独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb与Nb′独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列;
每个np'、np、nq'和nq可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,并且Nb′上的修饰不同于Y'上的修饰;并且
其中所述有义链与至少一个配体缀合。
在一个实施方案中,i是0;j是0;i是1;j是1;i和j均是0;或者i和j均是1。
在另一实施方案中,k是0;l是0;k是1;l是1;k和l均是0;或者k和l均是1。
在某些实施方案中,XXX与X'X'X'互补,YYY与Y'Y'Y'互补,并且ZZZ与Z'Z'Z'互补。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
在另一实施方案中,YYY基序出现在有义链的裂解位点处或其附近。
在另一实施方案中,Y'Y'Y'基序出现在反义链的从5'端起的位置11、12和13。任选地,Y′是2'-O-甲基。
在一些实施方案中,式(III)由式(IIIa)表示:
有义链:5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5' (IIIa)。
在另一实施方案中,式(III)由式(IIIb)表示:
有义链:5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5' (IIIb)
其中每个Nb和Nb'独立地表示包含1至5个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在另一实施方案中,式(III)由式(IIIc)表示:
有义链:5'np-Na–X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5' (IIIc)
其中每个Nb和Nb'独立地表示包含1至5个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在某些实施方案中,式(III)由式(IIId)表示:
有义链:5'np-Na–X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-Z′Z′Z′-Na′-nq′5' (IIId)
其中每个Nb和Nb'独立地表示包含1至5个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,每个Na和Na'独立地表示包含2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在另一实施方案中,双链区域的长度为15至30个核苷酸对。任选地,双链区域长度为17至23个核苷酸对。
在某些实施方案中,双链区域长度为17至25个核苷酸对。任选地,双链区域的长度为23至27个核苷酸对。
在一些实施方案中,双链区域长度为19至21个核苷酸对。任选地,双链区域的长度为21至23个核苷酸对。
在某些实施方案中,每条链具有15至30个核苷酸。任选地,每条链具有19至30个核苷酸。任选地,每条链具有19至23个核苷酸。
在某些实施方案中,双链区域的长度为19至21个核苷酸对,并且每条链具有19至23个核苷酸。
在另一实施方案中,RNAi剂的核苷酸上的修饰是LNA、二醇核酸(GNA)、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-烷基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-氟基、2'-脱氧或2'-羟基、及其组合。任选地,核苷酸上的修饰包括2'-O-甲基、2'-氟基或GNA、及其组合。在一个相关实施方案中,核苷酸上的修饰是2′-O-甲基或2'-氟基修饰。
在一个实施方案中,RNAi剂包含配体,所述配体是一个或多个通过二价或三价分支接头附接的亲脂性部分(例如C16)或包含一个或多个通过二价或三价分支接头连接的亲脂性部分(例如C16)。
在其他实施方案中,所述剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体,例如一个或多个GalNAc衍生物。
在其他实施方案中,所述剂还包含通过单价或分支的二价或三价接头与有义链3'端缀合的亲脂性配体例如C16配体,以及通过单价或分支的二价或三价接头与有义链3'端缀合的靶向肝脏组织的靶向配体例如一个或多个GalNAc衍生物。
在某些实施方案中,所述配体附接到有义链的3'端。
在一些实施方案中,RNAi剂还包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键。在一个相关实施方案中,硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键位于一条链的3'末端。任选地,所述链是反义链。在另一实施方案中,所述链是有义链。在一个相关实施方案中,硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端。任选地,所述链是反义链。在另一实施方案中,所述链是有义链。
在另一实施方案中,硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键位于一条链的5'末端和3'末端两端。任选地,所述链是反义链。在另一实施方案中,所述链是有义链。
在另一实施方案中,位于RNAi剂双链体的反义链的5'端的位置1的碱基对是A:U碱基对。
在某些实施方案中,Y核苷酸包含2'-氟基修饰。
在一些实施方案中,Y'核苷酸包含2'-O-甲基修饰。
在某些实施方案中,p'>0。任选地,p'=2。
在一些实施方案中,q'=0,p=0,q=0,并且p'突出核苷酸与靶mRNA互补。
在某些实施方案中,q'=0,p=0,q=0,并且p'突出核苷酸与靶mRNA不互补。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链总共有21个核苷酸,反义链总共有23个核苷酸。
在另一实施方案中,至少一个nP'通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。任选地,所有的nP'均通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。
在某些实施方案中,本公开的APOE RNAi剂是表2至表5和表7至表10中列出的那些剂之一。在某些实施方案中,本发明的APOE RNAi剂是表7和表8中所列出的那些剂之一。在一些实施方案中,有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸均包含修饰。在某些实施方案中,本公开的APOE RNAi剂是表9和表10中所列出的那些剂之一。在一些实施方案中,有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸均包含修饰。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因在细胞中的表达,其中所述双链RNAi剂包含与反义链互补的有义链,其中所述反义链包含与编码APOE基因的mRNA的一部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述双链RNAi剂由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5' (III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p'、q和q'各自独立地为0至6;
每个Na和Na'独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb和Nb'独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列;
每个np'、np、nq'和nq可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;
XXX、YYY、ZZZ、X'X′X′、Y′Y'Y'和Z'Z'Z′各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,并且其中所述修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,并且Nb′上的修饰不同于Y'上的修饰;并且
其中所述有义链与至少一个配体缀合,任选地,其中所述配体是一个或多个亲脂性配体例如C16配体,和/或一个或多个GalNAc衍生物。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因在细胞中的表达,其中所述双链RNAi剂包括与反义链互补的有义链,其中所述反义链包括与编码APOE的mRNA的一部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述双链RNAi剂由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义链:3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5' (III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
每个np、nq和nq′可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;
p、q和q'各自独立地为0至6;
np'>0,并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
每个Na和Na'独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb和Nb'独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基修饰、二醇核酸(GNA)修饰或2′-氟基修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰;并且
其中所述有义链与至少一个配体缀合,任选地,其中所述配体是一个或多个亲脂性配体例如C16配体,和/或一个或多个GalNAc衍生物。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因在细胞中的表达,其中所述双链RNAi剂包括与反义链互补的有义链,其中所述反义链包括与编码APOE(SEQ ID NO:1,或与SEQ ID NO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性的核苷酸序列)的mRNA的一部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述双链RNAi剂由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5' (III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
每个np、nq和nq'可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;
p、q和q'各自独立地为0至6;
np'>0,并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
每个Na和Na'独立地表示0至25个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb和Nb'独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X′X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z′Z′各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基修饰或2'-氟基修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰;并且
其中所述有义链与至少一个配体缀合,任选地,其中所述配体是一个或多个亲脂性配体例如C16配体,和/或一个或多个GalNAc衍生物。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因在细胞中的表达,其中所述双链RNAi剂包括与反义链互补的有义链,其中所述反义链包括与编码APOE(SEQ ID NO:1,或与SEQ ID NO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性的核苷酸序列)的mRNA的一部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述双链RNAi剂由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义链:3′np′-Na′-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(Z′Z′Z′)l-Na′-nq′5' (III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
每个np、nq和nq'可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;
p、q和q'各自独立地为0至6;
np'>0,并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
每个Na和Na'独立地表示0至25个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb和Nb'独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列;
XXX、YYY、ZZZ、X'X′X′、Y′Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,并且其中所述修饰是2′-O-甲基修饰或2'-氟基修饰;
Nb上的修饰不同于Y上的修饰,并且Nb′上的修饰不同于Y′上的修饰;
其中所述有义链包含至少一个硫代磷酸酯键;并且
其中所述有义链与至少一个配体缀合,任选地,其中所述配体是一个或多个亲脂性配体例如C16配体,和/或一个或多个GalNAc衍生物。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因在细胞中的表达,其中所述双链RNAi剂包括与反义链互补的有义链,其中所述反义链包括与编码APOE(SEQ ID NO:1,或与SEQ ID NO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性的核苷酸序列)的mRNA的一部分互补的区域,其中每条链的长度为约14至约30个核苷酸,其中所述双链RNAi剂由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na′-Y′Y′Y′-Na′-nq′5′ (IIIa)
其中:
每个np、nq和nq'可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;
p、q和q'各自独立地为0至6;
np'>0,并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接;
每个Na和Na′独立地表示0至25个经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸或其组合的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
YYY和Y'Y'Y'各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,并且其中所述修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰;
其中所述有义链包含至少一个硫代磷酸酯键;并且
其中所述有义链与至少一个配体缀合,任选地,其中所述配体是一个或多个亲脂性配体例如C16配体,和/或一个或多个GalNAc衍生物。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因的表达,其中靶向APOE的双链RNAi剂包括形成双链区域的有义链和反义链,其中所述有义链包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,并且所述反义链包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQID NO:10的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的任一完整核苷酸序列具有至少90%的核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99或100%的一致性的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸;其中用尿嘧啶替换SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所提供的序列中的任意胸腺嘧啶(当比较对齐序列时)不被视为导致与SEQ ID NO:1至SEQID NO:10所提供的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的差异,其中所述有义链的基本所有核苷酸都包含一个修饰(2'-O-甲基修饰、GNA修饰或2'-氟基修饰),其中所述有义链包含在5′-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键,其中所述反义链的基本所有核苷酸都包含选自由2'-O-甲基修饰和2'-氟基修饰组成的组的一个修饰,其中所述反义链包含在5'-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键以及在3'-末端的两个硫代磷酸酯核苷酸间键,并且其中所述有义链与一个或多个亲脂性配体(例如C16配体)缀合,任选地,所述有义链还包含肝脏靶向配体,例如包含一个或多个GalNAc衍生物的配体。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
本公开的另一方面提供了一种双链RNAi剂,其用于抑制APOE基因的表达,其中靶向APOE的双链RNAi剂包含形成双链区域的有义链和反义链,其中所述有义链包含与SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:9的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,并且所述反义链包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQID NO:10的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸或与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10的任一完整核苷酸序列具有至少90%的核苷酸序列一致性例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99或100%的一致性的核苷酸序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,其中用尿嘧啶替换SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所提供的序列中的任意胸腺嘧啶(当比较对齐序列时)不被视为导致与SEQ ID NO:1至SEQID NO:10所提供的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的差异;其中所述有义链包含至少一个3'-末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT),并且其中所述反义链包含至少一个3'-末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
在一个实施方案中,有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸都是经修饰的核苷酸。
在另一实施方案中,每条链具有19至30个核苷酸。
在某些实施方案中,RNAi剂的反义链包含位于5′区域的前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热不稳定修饰或其前体。任选地,双链体的热不稳定修饰是以下一种或多种:
Figure BDA0004014902130000251
其中B是核碱基。
本公开的另一方面提供了一种细胞,其包含本公开的双链RNAi剂。
本公开的另一方面提供了一种药物组合物,其用于抑制APOE基因的表达,所述药物组合物包含本公开的双链RNAi剂。
在一个实施方案中,所述双链RNAi剂在非缓冲溶液中施用。任选地,所述非缓冲溶液是盐水或水。
在另一实施方案中,双链RNAi剂与缓冲溶液一起施用。任选地,所述缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任意组合。在另一实施方案中,所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
本公开的另一方面提供了一种药物组合物,其包含本公开的双链RNAi剂和脂质制剂。
在一个实施方案中,所述脂质制剂包含脂质纳米颗粒(LNP)。
本公开的另一方面提供了抑制APOE基因在细胞中的表达的方法,所述方法包括:(a)使细胞与本公开的双链RNAi剂或本公开的药物组合物接触;和(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足够长的时间以获得APOE基因的mRNA转录本的降解,从而抑制APOE基因在所述细胞中的表达。
在一个实施方案中,所述细胞在受试者体内。任选地,所述受试者是人。
在某些实施方案中,所述受试者是猕猴、食蟹猴、小鼠或大鼠。
在某些实施方案中,人类受试者患有APOE相关的神经退行性疾病,例如淀粉样蛋白-β介导的疾病(如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病),或tau介导的疾病(如原发性tau蛋白病,如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)、原发性年龄相关tau蛋白病(PART)),或继发性tau蛋白病(如AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆)。
在某些实施方案中,所述方法还包括向受试者施用另外的治疗剂,例如胆碱酯酶抑制剂和/或美金刚(memantine)。
在某些实施方案中,双链RNAi剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用。
在一些实施方案中,将双链RNAi剂鞘内施用于受试者。
在一个实施方案中,所述方法降低了APOE基因在脑(例如纹状体)或脊柱组织中的表达。任选地,所述脑或脊柱组织是纹状体、皮层、小脑、颈椎、腰椎或胸椎。
在一些实施方案中,将双链RNAi剂皮下施用于受试者。
在一个实施方案中,所述方法降低了APOE基因在肝脏中的表达。
在其他实施方案中,所述方法降低APOE基因在肝脏和脑中的表达。
本公开的另一方面提供了抑制APOE在受试者中的表达的方法,所述方法包括:向所述受试者施用治疗有效量的本公开的双链RNAi剂或本公开的药物组合物,从而抑制APOE在所述受试者中的表达。
本公开的另一方面提供了一种用于在受试者中治疗或预防病症或APOE相关神经退行性疾病或病症的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的双链RNAi剂或本公开的药物组合物,从而在所述受试者中治疗或预防APOE相关神经退行性疾病或病症。
在某些实施方案中,APOE相关神经退行性疾病是淀粉样蛋白-β介导的疾病,例如选自由阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病组成的组的淀粉样蛋白-β介导的疾病。
在某些实施方案中,APOE相关神经退行性疾病是tau介导的疾病,例如原发性tau蛋白病或继发性tau蛋白病。
在某些实施方案中,原发性tau蛋白病选自由以下组成的组:额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART)。
在某些实施方案中,继发性tau蛋白病选自由以下组成的组:AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
本公开的另一方面提供了一种试剂盒,其用于实施本公开方法,所述试剂盒包括:a)本公开的双链RNAi剂,和b)使用说明书,和c)任选地,用于将双链RNAi剂施用于受试者的装置。
本公开的另一方面提供了一种双链核糖核酸(RNAi)剂,其用于抑制APOE基因的表达,其中所述RNAi剂具有有义链和反义链,并且其中所述反义链包含互补性区域,所述互补性区域包含与表2至表5和表7至表10中的任一反义链核酸碱基序列相异不超过3个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)的至少15个连续核苷酸,例如至少15个核苷酸(即相异3、2、1或0个核苷酸)、至少19个核苷酸(即,相异3、2、1或0个核苷酸)。在一个实施方案中,所述RNAi剂包含一个或多个的以下修饰:2'-O-甲基修饰核苷酸,2'-氟基修饰核苷酸,2'-C-烷基修饰核苷酸,包含二醇核酸(GNA)、硫代磷酸酯(PS)和乙烯基膦酸酯(VP)的核苷酸。任选地,所述RNAi剂包含至少一个的以下每种修饰:2'-O-甲基修饰核苷酸,2'-氟基修饰核苷酸,2'-C-烷基修饰核苷酸、包含二醇核酸(GNA)、硫代磷酸酯和乙烯基膦酸酯(VP)的核苷酸。
在某些实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,双链RNAi剂抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2和APOE3的表达,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过约10%。
在另一实施方案中,RNAi剂包含四个或更多个PS修饰,任选地包含六至十个PS修饰,任选地包含八个PS修饰。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个都具有5'末端和3′末端,并且RNAi剂包含位于自RNAi剂的每条有义链和每条反义链的各自的3′末端和5'末端起的倒数第二个和最后一个核苷酸间键的8个PS修饰。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个均包含5'末端和3'末端,并且RNAi剂仅包含一个包含GNA的核苷酸。任选地,包含GNA的核苷酸位于反义链上的从反义链5'末端起的第七个核碱基残基处。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个均包含5'末端和3'末端,并且RNAi剂包含1至4个2'-C-烷基修饰的核苷酸。任选地,2'-C-烷基修饰的核苷酸是2'-C16修饰的核苷酸。任选地,RNAi剂包含单个2'-C-烷基例如C16修饰的核苷酸。任选地,单个2'-C-烷基例如C16修饰的核苷酸位于有义链上的从有义链5′-末端起的第六个核碱基位置。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个均包含5'末端和3'末端,并且RNAi剂包含两个或更多个2'-氟基修饰的核苷酸。任选地,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个均包含两个或更多个2'-氟基修饰的核苷酸。任选地,2'-氟基修饰的核苷酸位于有义链上的从有义链5'-末端起的核碱基位置7、9、10和11,以及反义链上的从反义链5′-末端起的核碱基位置2、14和16。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个均包含5′末端和3'末端,并且RNAi剂包含一个或多个VP修饰。任选地,RNAi剂包含在反义链的5'末端的单个VP修饰。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每一个均包含5'末端和3′末端,并且RNAi剂包含两个或多个2′-O-甲基修饰的核苷酸。任选地,RNAi剂在所有未被2'-氟基、2'-C-烷基或二醇核酸(GNA)修饰的核碱基位置包含2'-O-甲基修饰的核苷酸。任选地,两个或更多个2'-O-甲基修饰的核苷酸位于有义链上的自有义链5′-末端起的位置1、2、3、4、5、8、12、13、14、15、16、17、18、19、20和21,以及反义链上的自反义链5′-末端起的位置1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21、22和23。
在一方面,本发明提供了抑制APOE基因在星形胶质细胞中表达的方法。所述方法包括使星形胶质细胞与本发明的dsRNA剂或药物组合物接触;并将所产生的星形胶质细胞维持足够长的时间以获得APOE基因的mRNA转录本的降解,从而抑制APOE基因在星形胶质细胞中的表达。
在某些实施方案中,所述细胞在受试者体内,例如在人类受试者体内。
在一些实施方案中,接触星形胶质细胞是通过鞘内施用药物组合物来进行的。
在某些实施方案中,dsRNA剂的反义链包含与双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,所述双链体选自由AD-1204704、AD-1204705、AD-1204708和AD-1204712组成的组。
附图说明
图1A是描绘了通过脑室内注射(ICV)施用单次300μg剂量的所示双链体或人工CSF(aCSF)对照的纯合人源化APOE敲入小鼠的大脑右半球(BRH)中的剩余APOE mRNA百分比(给药后第14天)的图。
图1B是描绘了通过脑室内注射(ICV)施用单次300μg剂量的所示双链体或人工CSF(aCSF)对照的纯合人源化APOE敲入小鼠的肝脏中的剩余APOE mRNA百分比(给药后第14天)的图。
图2是描绘了剂AD-1204704、AD-1204705、AD-1204705、AD-1204706、AD-1204707、AD-1204708、AD-1204709、AD-1204710、AD-1204711、AD-1204712和AD-1204713的体外活性和所述剂的体内活性的相互关系的图。
具体实施方式
本公开提供了RNAi组合物,其引起由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的基因RNA转录本的裂解。APOE基因可以在细胞内,例如受试者(如人)体内的细胞内。本公开还提供了使用本公开的RNAi组合物来抑制APOE基因的表达或治疗患有将受益于抑制或减少APOE基因(例如致病性APOE等位基因,即APOE4)的表达的疾病的受试者的方法,所述疾病是例如APOE相关的神经退行性疾病,例如淀粉样蛋白-β介导的疾病或tau介导的疾病。
本公开的RNAi剂包含RNA链(反义链),其具有长度为约30个核苷酸或更少核苷酸的区域,例如15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个核苷酸的区域,所述区域与APOE基因的mRNA转录本的至少一部分是基本互补的。在某些实施方案中,本公开的RNAi剂包含具有长度为约21至23个核苷酸的区域的RNA链(反义链),其中所述区域与APOE基因的mRNA转录本的至少一部分是基本互补的。
在某些实施方案中,本公开的RNAi剂包含一条RNA链(反义链),其可以包含更长的长度例如多达66个核苷酸(如36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53个核苷酸)的长度,具有与APOE基因的mRNA转录本的至少一部分是基本互补的至少19个连续核苷酸的区域。此类具有较长反义链的RNAi剂优选包含长度为20至60个核苷酸的第二RNA链(有义链),其中所述有义链和所述反义链形成18至30个连续核苷酸的双链体。
使用这些RNAi剂能够靶向降解哺乳动物中APOE基因的mRNA。因此,包含这些RNAi剂的方法和组合物可用于治疗将受益于APOE蛋白水平或活性降低的受试者,例如患有APOE相关神经退行性疾病(例如淀粉样蛋白-β介导的疾病或tau介导的疾病)的受试者。
以下详细描述公开了如何制备和使用含有RNAi剂的组合物以抑制APOE基因的表达,以及用于治疗患有将受益于基因表达的抑制或减少的疾病和病症的受试者的组合物和方法。
I.定义
为了更容易地理解本公开,首先定义某些术语。此外,应当注意,每当列举参数的值或值的范围时,其意图是介于所列举的值的中间的值和范围也旨在成为本公开的一部分。
冠词“a”和“an”在本文中用于指代冠词的语法对象中的一个或多于一个(即,至少一个)。举例来说,“要素”是指一个要素或多于一个要素,例如,多个要素。
术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”,并且可与短语“包括但不限于”互换使用。除非上下文另有明确说明,术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
术语“约”在本文中用于表示在本领域的典型公差范围内。例如,“约”可以理解为与平均值相差约2个标准差。在某些实施方案中,约是指±10%。在某些实施方案中,约是指±5%。当约出现在一系列数字或范围之前时,应当理解,“约”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
在数字或一系列数字之前的术语“至少”“不少于”或“或多于”被理解为包括与术语“至少”相邻的数字,以及在逻辑上可包括的所有后续数字或整数,如从上下文中可以清楚看出的。例如,核酸分子中的核苷酸数必须是整数。例如,“21个核苷酸的核酸分子的至少18个核苷酸”是指18、19、20或21个核苷酸具有指定的性质。当至少出现在一系列数字或范围之前时,应当理解,“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文所用,“不超过”或“小于”被理解为从上下文来看符合逻辑的与短语相邻的值和在逻辑上较小的值或整数,到零为止。例如,具有“不超过2个核苷酸”的突出的双链体具有2、1或0个核苷酸突出。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时,应当理解,“不超过”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文所用,检测方法可以包括确定存在的分析物的量低于该方法的检测水平。
在指定的靶位点和有义链或反义链的核苷酸序列之间存在矛盾的情况下,以所指定的序列优先。
如果化学结构和化学名称之间存在矛盾的情况下,以化学结构优先。
术语“APOE”或“APOE”,也被称为“载脂蛋白E”、“阿尔茨海默病2”、“LPG”和“LDLCQ5”,是指众所周知的编码蛋白质APOE的基因。APOE在全身合成,其主要在肝脏中合成,作为脂质转运蛋白发挥作用,是低密度脂蛋白(LDL)受体的主要配体。APOE已被证明在胆固醇代谢和心血管疾病中发挥作用,最近,它已成为阿尔茨海默病的主要风险因素,并与其他神经退行性疾病的病理学相关。
APOE的核苷酸和氨基酸序列可见于例如GenBank登录号NM_000041.4(人APOE,SEQID NO:1,反向互补,SEQ ID NO:2);GenBank登录号NM_001270681.1(大鼠APOE,SEQ ID NO:3;反向互补,SEQ ID NO:4);GenBank登录号NM_001305843.1(小鼠APOE,SEQ ID NO:5,反向互补,SEQ ID NO:6);GenBank登录号XM_028839202.1(猕猴APOE,SEQ ID NO:7,反向互补,SEQ ID NO:8);和GenBank登录号XM_005589554.2(食蟹猴APOE,SEQ ID NO:9;反向互补,SEQ ID NO:10)。
APOE序列的其他实例可见于公开数据库例如GenBank、OMIM和UniProt。有关APOE的更多信息可见于例如www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/348。
如本文所用,术语“APOE”也指APOE基因的变异,包括在SNP数据库例如ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/?term=APOE[gene]中提供的人APOE的变异。
人APOE基因含有两个单核苷酸多态性,导致了三种最常见的变体,APOE2(也被称为APOE*ε2或ε2;Cys112、Cys158)、APOE3(也被称APOE*ε3或ε3;Cys112,Arg158)和APOE4(也被称为APOE*ε4或ε4(Arg112,Arg158)。GenBank登录号NM_000041.4(人APOE,SEQ ID NO:1,反向互补,SEQ ID NO:2)是APOE*ε3(APOE3)变体的核苷酸序列;APOE*ε2(APOE2)变体在SEQID NO:1的核苷酸595C>T处有一个单核苷酸改变,APOE*ε4(APOE4)变体在SEQ ID NO:1的核苷酸457T>C处有一个单核苷酸改变。
应当理解,除非本文另外说明,术语“APOE”、“ApoE”或类似的术语,是指三种APOE变体或等位基因中的任何一种或多种。例如,如本文所用,术语“APOE基因”指APOE2等位基因、APOE3等位基因和/或APOE4等位基因,而术语“APOE4等位基因”或类似的术语仅指APOE4等位基因。
如本文所用,“靶序列”是指在APOE基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分,包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。在一个实施方案中,序列的靶部分将至少足够长以在APOE基因转录过程中形成的mRNA分子的核苷酸序列部分或其附近用作RNAi引导裂解的底物。
靶序列的长度为约15-30个核苷酸。例如,靶序列的长度可以是约15至30个核苷酸、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个核苷酸。在某些实施方案中,靶序列长度为19至23个核苷酸,任选地,靶序列长度为21至23个核苷酸。介于上文列举的范围及长度之间的范围及长度也被认为是本公开的一部分。
如本文所用,术语“包含序列的链”是指包含核苷酸链的寡核苷酸,通过参照使用标准核苷酸命名法的序列来描述。
在经修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸的上下文中,“G”、“C”、“A”、“T”及“U”通常各自分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而,应当理解,术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸,如下文进一步详述的,或代理替换部分(surrogate replacement moiety)(参见,例如表1)。技术人员熟知,鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶及尿嘧啶可以被其他部分替换而基本上不改变包含带有此替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于,包含肌苷作为其碱基的核苷酸可与含有腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤的核苷酸进行碱基配对。因此,本公开表征的dsRNA的核苷酸序列中的含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可被替换为含有例如肌苷的核苷酸。在另一实例中,寡核苷酸中任意位置的腺嘌呤及胞嘧啶可分别被替换为鸟嘌呤及尿嘧啶,以与靶mRNA形成G-U摇摆(Wobble)碱基配对。含有此类替换部分的序列适用于本公开表征的组合物及方法。
如本文中可互换使用的,术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”是指含有如本文中术语所定义的RNA的剂,其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录本的靶向裂解。RNA干扰(RNAi)是引导mRNA的序列特异性降解的过程。RNAi调节例如抑制APOE在细胞中例如受试者(例如哺乳动物受试者)体内的细胞中的表达。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂包括单链RNAi,其与靶RNA序列(例如APOE靶mRNA序列)相互作用,以引导该靶RNA的裂解。不希望受理论束缚,据信,被引入细胞内的长双链RNA通过被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成包含有义链和反义链的双链短干扰RNA(siRNA)(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer,一种核糖核酸酶III样酶,其将这些dsRNA加工成19至23个碱基对的短干扰RNA,该短干扰RNA具有特征性的二碱基3'突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。然后将这些siRNA整合到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中,在其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体,使得互补的反义链能够引导靶向识别(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。在与合适的靶mRNA结合后,RISC内的一种或多种核酸内切酶裂解靶标以诱导沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。因此,在一个方面,本公开涉及一种在细胞内产生的单链RNA(ssRNA)(siRNA双链体的反义链),其促进RISC复合物的形成以有效沉默靶基因,即APOE基因。因此,术语“siRNA”在本文中也用于指代如上所述的RNAi。
在另一实施方案中,RNAi剂可以是被引入细胞或生物体以抑制靶mRNA的单链RNA。单链RNAi剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合,然后后者裂解靶mRNA。单链siRNA通常为15至30个核苷酸且经化学修饰。单链RNA的设计及测试描述于美国专利第8,101,348号及Lima et al.,(2012)Cell 150:883-894中,这些文献各自的全部内容通过引用而并入本文。本文中描述的任意反义核苷酸序列可用作本文所述单链siRNA或通过由Lima et al.,(2012)Cell 150:883-894中描述的方法进行化学修饰后再使用。
在另一实施方案中,用于本公开的组合物和方法中的“RNAi剂”是双链RNA,并且在本文中被称为“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合体,具有包含两条反向平行且基本互补的核酸链的双链体结构,这两条核酸链是指具有相对于靶RNA(即APOE基因)的“有义”定向及“反义”定向。在本公开的一些实施方案中,双链RNA(dsRNA)通过转录后基因沉默机制(在本文中被称为RNA干扰或RNAi)触发靶RNA(例如mRNA)的降解。
通常,dsRNA分子可以包括核糖核苷酸,但是如本文所详细描述的,每条链或两条链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸,例如脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸。此外,本说明书中使用的“RNAi剂”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸;RNAi剂可以包括在多个核苷酸上的大量修饰。如本文所用,术语“经修饰的核苷酸”是指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键或经修饰的核碱基的核苷酸。因此,术语“经修饰的核苷酸”包括核苷酸间键、糖部分或核碱基的例如官能基或原子的替换、添加或移除。适用于本发明的剂中的修饰包括本文公开或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求书的目的,用于siRNA型分子中的任何此类修饰都包括在“RNAi剂”中。
在本公开的某些实施方案中,将脱氧核苷酸(其被认为是核苷酸的天然存在形式)(如果存在)包含在RNAi剂中可以被认为构成了经修饰的核苷酸。
双链体区域可以是允许所需的靶RNA通过RISC途径特异性降解的任意长度,并且长度可以为约15至36个碱基对,例如,约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对的长度,例如约15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个碱基对的长度。在某些实施方案中,双体链区域长度为19至21个碱基对,例如长度为21个碱基对。介于上文列举的范围及长度的间的范围及长度亦被认为是本公开的一部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分,或者它们可以是分别的RNA分子。当两条链是一个较大分子的一部分并因此而通过在一条链的3'端与相对的另一条链的5'端的之间的不间断核苷酸链相连接形成双链体结构时,则该连接RNA链被称为“发夹环”。发夹环可包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施方案中,发夹环可包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸或不针对dsRNA的靶位点的核苷酸。在一些实施方案中,发夹环可以是10个或更少个核苷酸。在一些实施方案中,发夹环可以是8个或更少个未配对的核苷酸。在一些实施方案中,发夹环可以是4至10个未配对的核苷酸。在一些实施方案中,发夹环可以是4至8个核苷酸。
当dsRNA的两条基本互补的链是由分别的RNA分子构成时,这些分子不必是共价连接的,但可以是共价连接的。在某些实施方案中,当两条链通过一条链的3'端与相对的另一条链的5'端之间的未中断核苷酸链来形成双链体结构以外的方式进行共价连接时,则该连接结构被称为“接头”(尽管注意到本文其他地方定义的某些其他结构也可被称为“接头”)。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸数减去双链体中存在的任何突出的数目。除了双链体结构外,RNAi可包含一个或多个核苷酸突出。在RNAi剂的一个实施方案中,至少一条链包含至少一个核苷酸的3'突出。在另一实施方案中,至少一条链包含至少2个核苷酸的3'突出,例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的3'突出。在其他实施方案中,RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5'突出。在某些实施方案中,至少一条链包含至少2个核苷酸的5′突出,例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的5′突出。在其他实施方案中,RNAi剂一条链的3'端和5'端都包含至少1个核苷酸的突出。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂是dsRNA,其每条链独立地包含19至23个核苷酸,所述dsRNA与靶RNA序列例如APOE靶mRNA序列相互作用,以引导该靶RNA的裂解。
如本文所用,术语“核苷酸突出”是指从RNAi剂(例如dsRNA)的双链体结构凸出的至少一个未配对的核苷酸。例如,当dsRNA的一条链的3'端延伸到超过另一条链的5′端时,或当dsRNA的一条链的3'端延伸到不超过另一条链的5'端时,则存在核苷酸突出。dsRNA可包含至少一个核苷酸的突出;或者该突出可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷类似物或由核苷酸/核苷类似物组成,该核苷酸/核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。一个或多个突出可位于有义链、反义链或其任意组合上。此外,突出的一个或多个核苷酸可存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端。
在一个实施方案中,dsRNA的反义链在3'-端或5′-端具有1至10个核苷酸的突出,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出。在一个实施方案中,dsRNA的有义链在3'-端或5'-端具有1至10个核苷酸的突出,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出。在另一实施方案中,该突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸替代。
在某些实施方案中,dsRNA的反义链在3'-端或5′-端具有1-10个核苷酸的突出,例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10个核苷酸的突出,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出。在一个实施方案中,dsRNA的有义链在3′-端或5'-端具有1至10个核苷酸的突出,例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出。在另一实施方案中,该突出中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸替代。
在某些实施方案中,位于有义链或反义链上的突出可以包括大于10个核苷酸的延伸长度,例如,1至30个核苷酸、2至30个核苷酸、10至30个核苷酸或10至15个核苷酸的长度。在某些实施方案中,延伸的突出位于双链体的有义链上。在某些实施方案中,延伸的突出存在于双链体的有义链的3'端。在某些实施方案中,延伸的突出存在于双链体的有义链的5'端。在某些实施方案中,延伸的突出位于双链体的反义链上。在某些实施方案中,延伸的突出存在于双链体的反义链的3'端。在某些实施方案中,延伸的突出存在于双链体的反义链的5'端。在某些实施方案中,突出中的一个或多个核苷酸被替换为核苷硫代磷酸。在某些实施方案中,突出包括自我互补的部分,使得该突出能够形成在生理学条件下稳定的发夹结构。
如本文所用,术语“钝的”或“钝端的”在涉及dsRNA时,是指在dsRNA的给定末端没有未配对的核苷酸或核苷酸类似物,即,没有核苷酸突出。dsRNA的一端或两端可以是钝的。当dsRNA的两端都是钝的时,则称该dsRNA为钝端的。为了清楚起见,“钝端的”dsRNA是两端都是钝的dsRNA,即分子的任一端都没有核苷酸突出。大多数情况下,此类分子将于其整个长度上都是双链的。
术语“反义链”或“引导链”是指RNAi剂(例如dsRNA)的链,其包括与靶序列(例如APOE mRNA)基本互补的区域。
如本文所用,术语“互补性区域”指反义链上的与序列如本文所定义的靶序列(例如APOE核苷酸序列)基本互补的区域。如果互补性区域与靶标序列不完全互补,则错配可存在于分子的内部区域或末端区域。通常,最耐受的错配存在于末端区域内,如在RNAi剂的5′-末端或3'-末端的5、4、3或2个核苷酸内。
本文所用,术语“有义链”或“过客链”是指RNAi剂的包括与本文定义的反义链区域基本互补的区域的链。
如本文所用,术语“裂解区域”是指紧邻裂解位点的区域。裂解位点是靶标上发生裂解的位点。在一些实施方案中,裂解区域包含位于裂解位点任一端且紧邻该裂解位点的三个碱基。在一些实施方案中,裂解区域包含位于裂解位点任一端且紧邻该裂解位点的两个碱基。在一些实施方案中,裂解位点特异性地出现在反义链的核苷酸10和11所结合的位点,且裂解区域包含核苷酸11、12及13。
如本文所用,除非另有说明,当术语“互补”被用来描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的关系时,正如技术人员所理解的那样,其是指包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。
如本文所述的RNAi剂如dsRNA内的互补序列包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。在本文中,此类序列可被称为彼此是“完全互补的”。然而,在本文中,如果第一序列相对于第二序列被称为是“基本互补的”,则这两个序列可以是完全互补的,或在杂交形成多达30个碱基对的双链体时,它们可形成一个或多个但通常不超过5、4、3或2个错配的碱基对,同时保留在最适于其最终应用(例如通过RISC途径抑制基因的表达)的条件下杂交的能力。然而,如果两个寡核苷酸被设计为在杂交时形成一个或多个单链突出,则就确定互补性而言,此类突出不应被视为错配。例如,包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸的dsRNA,其中较长的核苷酸包含一个与较短的核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列,出于本文所述目的,其仍可被称为是“完全互补的”。
如本文所用,“互补的”序列也可包括非Watson-Crick碱基对或由非天然核苷酸及经修饰的核苷酸形成的碱基对,或完全由非Watson-Crick碱基对或由非天然核苷酸及经修饰的核苷酸形成的碱基对形成,只要满足上述关于它们的杂交能力的要求。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U摇摆或Hoogsteen碱基配对。
在本文中,术语“互补的”、“完全互补的”及“基本互补的”可用于两个寡核苷酸或多核苷酸之间的碱基匹配,例如dsRNA的有义链与反义链之间或RNAi剂的反义链与靶序列之间的碱基匹配,如可从其使用的上下文中将理解的。
如本文所用,与信使RNA(mRNA)的“至少一部分是基本互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如,编码APOE的mRNA)的连续部分基本互补的多核苷酸。例如,如果多核苷酸与APOE mRNA的不间断部分是基本互补的,则该多核苷酸与编码APOE的mRNA的至少一部分是互补的。
因此,在一些实施方案中,本文公开的反义链多核苷酸与靶APOE序列是完全互补的。在其他实施方案中,本文公开的反义链多核苷酸与靶APOE序列是基本互补的,并包含连续核苷酸序列,该连续核苷酸序列在其全长上与用于APOE的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列或用于APOE的SEQ ID NO:1、SEQID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的片段的等同区域是至少约80%互补的(例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补的)。
在其他实施方案中,本文公开的反义多核苷酸与靶APOE序列是基本互补的,并且包含连续核苷酸序列,该连续核苷酸序列在其全长上与用于APOE的表2至表5和表7至表10中的任一表中的任一有义链核苷酸序列或用于APOE的表2至表5和表7至表10中的任一表中的任一有义链核苷酸序列的片段是至少约80%互补的(例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补的)。
在一个实施方案中,本发明的RNAi剂包括与反义多核苷酸基本互补的有义链,所述反义多核苷酸又与靶APOE序列相同,并且其中有义链多核苷酸包含连续核苷酸序列,该连续核苷酸序列在其全长上与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的核苷酸序列或SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的任一片段的等同区域是至少约80%互补的(例如约85%、约86%、约87%、约88%、约89%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%互补的)。
在一个实施方案中,对APOE基因表达的至少部分抑制是通过第一细胞或细胞群(在其中APOE基因被转录,并且其已经被处理使得APOE基因的表达被抑制)中分离或检测到的APOE mRNA的量相对于基本上与第一细胞或细胞群相同但未经如是处理的第二细胞或细胞群(对照细胞)的减少来评估的。抑制程度可以表示为:
Figure BDA0004014902130000411
本文所用的短语“使细胞与RNAi剂接触”,例如dsRNA,包括通过任意可能的方式与细胞接触。使细胞与RNAi剂接触包括使细胞与RNAi剂在体外接触或使细胞与RNAi剂在体内接触。接触可直接或间接地完成。因此,例如,RNAi剂可通过方法实施人使其与细胞进行物理接触,或者,可将RNAi剂置于将允许或导致其随后与细胞接触的条件下。
体外与细胞接触的完成可以通过例如将细胞与RNAi剂一起孵育来完成。体内与细胞接触的完成可以通过例如将RNAi剂注射至细胞所在的组织内或邻近该组织处,或通过将RNAi剂注射至另一区域例如中枢神经系统(CNS)(任选地通过鞘内注射、玻璃体内注射或其他注射),或注射至血流或皮下空间,从而使得该iRNA剂将随后到达待接触的细胞所在的组织。例如,RNAi剂可包含配体或与配体偶联,所述配体是例如如下所述以及在例如PCT/US2019/031170(其通过引用并入本文)中进一步详述的一个亲脂性部分或多个亲脂性部分,其在感兴趣的部位例如CNS引导或稳定RNAi剂。在一些实施方案中,RNAi剂可包含配体或与配体偶联,所述配体是例如如下所述的一个或多个GalNAc衍生物,其在感兴趣的部位例如肝脏引导或稳定RNAi剂。在其他实施方案中,RNAi剂可以包含一个或多个亲脂性部分和一个或多个GalNAc衍生物或与一个或多个亲脂性部分和一个或多个GalNAc衍生物偶联。体外接触方法与体内接触方法的组合也是可以的。例如,细胞可在体外与RNAi剂接触,并随后移植到受试者体内。
在一个实施方案中,使细胞与RNAi剂接触包括:通过促进或引起摄取或吸收入细胞内而“将RNAi剂引入”或“将RNAi剂递送至细胞内”。RNAi剂的吸收或摄取可通过无辅助的扩散或主动的细胞过程发生,或通过辅助剂或辅助装置发生。将RNAi剂引入细胞可以是体外的或体内的。例如,对于体内引入,可将RNAi剂注射到组织部位或将其全身性施用。体外引入细胞包括本领域中已知的方法,如电穿孔及脂质转染。更多方法描述于下文中或在本领域中是已知的。
术语“亲脂物”或“亲脂部分”泛指对脂质具有亲和力的任何化合物或化学部分。一种表征亲脂性部分的亲脂性的方法是通过辛醇-水分配系数logKow,其中Kow是平衡时的两相系统中的化学品在辛醇相中的浓度与其在水相中的浓度的比值。辛醇-水分配系数是物质的实验室测量性质。然而,它也可以通过使用第一原理或经验方法计算出的属于化学物质结构成分的系数来预测(参见,例如,Tetko et al.,J.Chem.Inf.Comput.Sci.41:1407-21(2001),其全部内容通过引用并入本文)。它提供了物质倾向于选择非水性或油性环境而不是水的热力学量度(即它的亲水/亲脂性平衡)。原则上,当化学物质的logKow值超过0时,它就是亲脂性的。通常,亲脂性部分具有超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10的logKow。例如,6-氨基己醇的logKow预计约为0.7。使用相同的方法,胆甾醇N-(己-6-醇)氨基甲酸酯的logKow预计为10.7。
分子的亲脂性可以根据它所携带的官能团而变化。例如,在亲脂性部分的末端添加羟基或胺基可以增加或降低亲脂性部分的分配系数(例如logKow)值。
或者,与一个或多个亲脂性部分缀合的双链RNAi剂的疏水性可以通过其蛋白质结合特性来测量。例如,在某些实施方案中,双链RNAi剂的血浆蛋白结合试验中的未结合分数可以被确定为与双链RNAi剂的相对疏水性是正相关的,然后其可以与双链RNAi剂的沉默活性是正相关的。
在一个实施方案中,所测定的血浆蛋白结合试验是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变动试验(EMSA)。这种结合试验的示例性方案在例如PCT/US2019/031170中进行了详细说明。通过结合试验中未结合的dsRNA的分数所测量的双链RNAi剂的疏水性超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5,以用于增强dsRNA的体内递送。
因此,将亲脂性部分缀合至双链RNAi剂的内部位置为增强siRNA的体内递送提供了最佳的疏水性。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包含脂质层的囊泡,所述脂质层封装有药物活性分子,例如核酸分子,例如RNAi剂或转录RNAi剂的质粒。LNP描述于例如美国专利第6,858,225号、第6,815,432号、第8,158,601号和第8,058,069号,这些专利的全部内容通过引用并入本文。
如本文所用,“受试者”是动物例如哺乳动物,包括灵长类动物(例如人、非人灵长类动物例如猴和黑猩猩),或非灵长类动物(例如大鼠或小鼠)。在一个优选的实施方案中,受试者是人,例如如本文所述因将受益于APOE表达减少的疾病、病症或病状正接受治疗或正被评估的人;处于将受益于APOE表达减少的疾病、病症或病状的风险中的人;患有将受益于APOE表达减少的疾病、病症或病状的人;或因将受益于如本文所述的APOE表达减少的疾病、病症或病状而正在接受治疗的人。
如本文所用,术语“治疗/处理(treating)”或“治疗/处理(treatment)”是指有益的或期望的结果,包括但不限于缓解或改善与APOE基因表达或APOE蛋白产生相关的一个或多个体征或症状,例如APOE相关的神经退行性疾病,例如淀粉样蛋白-β介导的疾病如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病,或tau介导的疾病如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、慢性创伤性脑病(CTE)、额颞痴呆(FTD、FTDP-17)、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)、原发性年龄相关tau蛋白病(PART)和球状胶质tau蛋白病(GGT),或继发性tau蛋白病例如AD、克雅氏病、唐氏综合征、家族性英国痴呆和拳击性痴呆。“治疗”也可以指与未治疗时的预期生存期相比,延长生存期。
在受试者的APOE水平或疾病标志物或症状的上下文中,术语“较低”是指该水平在统计学上的显著降低。降低可以是,例如,至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在某些实施方案中,降低是至少20%。在某些实施方案中,疾病标志物例如蛋白质或基因表达水平的降低是至少50%。在受试者的APOE水平的上下文中,“较低”优选低到对于未患病症的个体而言正常范围内可接受的水平。在某些实施方案中,“较低”是指降低患有疾病的受试者的标志物或症状水平与个体正常范围内可接受的水平之间的差异,例如,降低肥胖个体与具有正常范围内可接受的体重的个体之间的体重水平之间的差异。如本文所用,降低可指降低或主要降低具有核苷酸重复扩增的APOE基因的mRNA水平。
如本文所用,当用于涉及将受益于APOE基因表达的降低或APOE蛋白产生的减少的疾病、病症或其病状时,“预防”或“防止”是指受试者将出现与此类疾病、病症或病状相关的症状(例如APOE相关神经退行性疾病的症状)的可能性的减少。未发展成疾病、病症或病状,或症状发展减缓或与这种疾病、病症或病状相关的症状的减少(例如,在该疾病或病症的临床可接受的级别上减少至少约10%),或症状延迟(例如,延迟数天、数周、数月或数年)的表现被认为是有效的预防。
如本文所用,术语“APOE相关神经退行性疾病”或“APOE相关神经退行性病症”被理解为将受益于APOE的表达和/或活性降低的任何疾病或病症。示例性的APOE相关神经变性疾病包括淀粉样蛋白-β介导的疾病例如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病,以及tau介导的疾病例如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART),以及继发性tau蛋白病例如AD、克雅氏病、唐氏综合征、家族性英国痴呆。
如本文所用,术语“淀粉样蛋白-β介导的疾病”是由淀粉样蛋白-β的细胞外积聚所引起的病症,其导致脑组织中淀粉样蛋白斑块的形成。示例性的淀粉样蛋白-β介导的疾病包括阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病(CAA)。
如本文所用,术语“tau介导的疾病”是由tau蛋白聚集成神经原纤维缠结所引起的疾病。tau蛋白过度磷酸化形成缠结,导致蛋白从微管和聚集体中分离出来。tau蛋白病可分为“原发性tau蛋白病”和“继发性tau蛋白病”,原发性tau蛋白病的病理主要是由tau蛋白聚集引起的,继发性tau蛋白病则是由另一种因素引起的(例如,阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白-β斑块),并且tau蛋白病的存在会使该疾病恶化。原发性tau蛋白病的实例包括额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART)。继发性tau蛋白病的实例包括AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
APOE多态性与多种tau蛋白病相关。在具有MAPT突变的额颞痴呆(FTD)患者中,APOE4等位基因被发现会加速神经变性并降低发病年龄(Koriath,C.et al.(2019)Alzheimers Dement 11:277-280)。此外,在低暴露于重复性头部撞击的足球运动员的尸检大脑中(Verscaj,C.etal.(2017)Neurology 88(16)Supplement S9.001)和拳击手的大脑中(ordan,B.D.et al.(1997)JAMA 278(2):136-140),APOE4的存在与更严重的慢性创伤性脑病(CTE)相关。APOE4等位基因的存在还与克雅氏病(CJD)的风险增加相关,而APOE3等位基因的存在与预防克雅氏病(CJD)的易感性相关(Wei,Y.et al.(2013)J ClinicalNeuroscience 21(3):390-394)。
此外,Shi等人描述了,在FTD的P301S小鼠模型中,当存在APOE4时,tau水平、脑萎缩和神经炎症与存在APOE2、APOE3或APOE敲除时相比显著增加(Shi et al.,(2017)Nature549:523–527)。在另一项使用表达具有P301L突变的人tau(其发现于伴有帕金森综合征的FTD)的小鼠模型的研究中,过度磷酸化的tau、tau聚集、行为异常在APOE2背景下发生恶化(Zhao,N.et al.,(2018)Nat Commun 9:4388)。Zhao等人进一步确定了APOEε2/ε2基因型与在进行性核上性麻痹(PSP)和皮质基底节变性确诊病例中的tau蛋白病的风险之间的关联,表明APOE2可能在存在淀粉样病变时具有保护作用,APOE2与在不存在淀粉样病变时的tau病变的严重程度的增加有关。
“阿尔茨海默病”(“AD”)是一种慢性神经退行性疾病,通常开始缓慢,并随着时间的推移逐渐恶化。最常见的早期症状是难以记住最近发生的事情。随着疾病的发展,症状可包括语言问题、定向障碍(包括容易迷路)、情绪波动、缺乏动力、不能自理和行为问题。随着人们状况的衰退,他们往往会退出家庭和社会。身体机能逐渐丧失,最终导致死亡。
在神经病理学上,AD的特征在于大脑皮层和某些皮层下区域中神经元和突触的损失。这种损失导致受影响区域的严重萎缩,包括颞叶和顶叶以及部分额叶皮质以及扣带回的退化。退化也存在于脑干核如蓝斑中。使用MRI和PET的研究已记录了AD患者特定脑区的大小随着他们从轻度认知障碍发展为阿尔茨海默病而减小,并与来自健康老年人的类似图像进行了比较。
在那些AD患者的大脑中,可以通过显微镜清楚地看到淀粉样斑块和神经原纤维缠结两者。斑块是致密的,大多是在神经元外部和周围的β-淀粉样肽和细胞物质的不可溶性沉积物。缠结(神经原纤维缠结)是已经过度磷酸化并在细胞自身内积聚的微管相关蛋白tau的聚集物。虽然许多老年个体由于衰老而出现一些斑块和缠结,但AD患者的大脑在特定的大脑区域(如颞叶)有更多的斑块和缠结。路易体在AD患者的大脑中并不少见。
美国国家神经与交流障碍和中风研究所(NINCDS)和阿尔茨海默病及相关病症协会(ADRDA,现称阿尔茨海默病协会)于1984年制定了最常用的NINCDS-ADRDA阿尔茨海默病诊断标准,并于2007年进行了广泛更新。这些标准要求通过神经心理学测试来证实认知障碍和疑似痴呆综合征的存在以对可能的AD或可证实的AD进行临床诊断。确诊需要组织病理学确认,包括脑组织的显微镜检查。诊断标准和明确的组织病理学确认之间已显示出良好的统计可靠性和有效性。在AD中,八个智力领域最常受损——记忆、语言、感知技能、注意力、运动技能、定向、解决问题能力和执行功能能力。这些领域等同于在美国精神病学协会出版的《精神障碍诊断和统计手册》(DSM-IV-TR)中列出的NINCDS-ADRDA阿尔茨海默病标准。
目前,可用于治疗AD患者的药物包括胆碱酯酶抑制剂和美金刚。这些药物可以通过治疗与例如记忆、思维和语言相关的症状来改善患者的生活质量,然而,它们不能改变疾病的进展或衰退的速度。
AD的病因尚不清楚,但如上所述,APOE4的存在已被证明是在65岁后出现症状的迟发性阿尔茨海默病(AD)的主要风险决定因素,并且在淀粉样蛋白-β-介导的疾病(AD)和tau-介导的疾病的非人动物模型中的大量研究已证明,抑制APOE例如APOE4对淀粉样蛋白斑块的形成和认知能力具有有益的作用。
“唐氏综合征”(“DS”),也被称为21三体,是由于21号染色体的第三个拷贝的全部存在或部分存在而导致的遗传病症。DS是一种与智力障碍、特征性面部外观、婴儿期肌张力弱相关的终身性病状,患有DS的人通常会经历认知能力的逐渐下降。第三条21号染色体携带额外的淀粉样前体蛋白(APP)基因,过量的淀粉样蛋白的产生导致淀粉样β斑块的累积,并因此将早发性阿尔茨海默病(AD)的风险增加了超过50%。另一个在DS中复制三倍的基因是DYRK1A,其影响tau的选择性剪接,引发tau的异常过度磷酸化,并促进神经原纤维变性(Hartley D.et al.(2016)Alzheimers Dement 11(6):700-709)。患有AD的DS个体具有与普通AD患者相似的神经病理学改变,包括淀粉样斑块、tau神经原纤维缠结、氧化损伤和神经元损失。淀粉样蛋白和tau的水平被发现在DS个体的脑脊液中升高(Lee,N.C.et al.(2017)Neurology and Therapy 6:69-81)。
“脑淀粉样血管病”(“CAA”)是一种血管病,其中淀粉样斑块沉积在小到中型血管壁和脑的某些区域。该淀粉样斑块破坏脑细胞,并损害大脑的各个部分。此外,血管中的淀粉样沉积物替代了赋予血管弹性的肌肉和弹性纤维,导致它们变得易于破裂。CAA可能导致痴呆、颅内出血和短暂的神经系统事件。CAA被认为是阿尔茨海默病的形态学特征之一。淀粉样β前体蛋白(APP)基因的突变是遗传性CAA的最常见原因(Desimone C.V.et al.(2017)J Am Coll Cardiol 70(9):1173-1182)。
“额颞痴呆”(“FTD”),包括皮克病、进行性核上性麻痹(PSP)和皮质基底节变性(CBD)等疾病。FTD是年龄小于65岁的患者中常见的痴呆类型,包括一组以行为、执行功能或语言的进行性衰退为特征的神经退行性疾病。在FTD中,大脑额叶和颞叶的神经细胞损失,因此FTD也被称为额颞叶变性(FTLD)。在FTD的几种亚型(包括皮克病、进行性核上性麻痹(PSP)和皮质基底节变性(CBD))中发现了微管相关蛋白tau(MAPT)基因的突变和tau的累积。
“皮克病”的特征是明显的额叶、颞叶和扣带回的刀刃状萎缩,其中顶叶保存较好。
“皮质基底节变性”(“CBD”)的特征是背侧前额叶皮质、补充运动区、peri-Rolandic皮质和皮质下核的细胞的显著缺失。
“进行性核上性麻痹”(“PSP”)与额叶凸面萎缩有关;在苍白球、丘脑底核和脑干核的水平上的皮质下萎缩是严重的(Olney,N.T.etal.(2017)Neurol Clin 35(2):339-374)。
“球状胶质tau蛋白病”(“GGT”)是一种罕见的额颞叶变性(FLD),其在含有4-重复tau亚型的星形胶质细胞和少突胶质细胞中具有广泛分布的球状内含物。这些病例与一系列与潜在tau病变和神经变性的严重性和分布有关的临床表现相关(Ahmed,Z.et al.(2013)Acta Neuropathol 126(4):537-544)。
“伴有帕金森综合征的额颞痴呆”(“FTDP”)是一种不太常见的FTD,其也会影响运动。17号染色体被发现与FTDP(FTDP-17)相关,并且在许多具有家族性FTDP-17的亲属中发现了在17号染色体上的微管相关蛋白tau(MAPT)的突变。FTDP-17由于MAPT突变开始于25至65岁之间,外显率接近100%。症状包括在许多个体中发展的执行功能障碍和改变的个性和行为伴有失语症和帕金森综合征(Boeve,B.F.et al.(2008)Arch Neurol 65(4):460-464)。
“慢性创伤性脑病”(“CTE”)是一种在许多运动员尤其是足球运动员中发现的由重复性轻度创伤性脑损伤导致的衰弱性神经退行性疾病。CTE的神经病理学特征包括在脑沟和血管周围区域的磷酸化tau的累积、小胶质细胞的增生和星形胶质细胞的增生;该疾病可以从早期的一些tau沉积进展到晚期的全脑萎缩。经过多年,CTE可以从轻度症状(例如短期记忆缺陷和轻度攻击性)进展到高级语言缺陷和精神病症状(包括妄想症和帕金森症)(Fesharaki-Zadeh,A.(2019)Front Neurol 10:713)。
“拳击性痴呆”是CTE的一种形式,涉及由于拳击对头部的重复打击而导致的认知和运动功能的严重损伤(Castellani.R.J et al.(2017)J Alzheimers Dis 60(4):1209-1221)。
“嗜银颗粒病”(“AGD”)是一种高发的偶发性tau蛋白病,其在几项研究中是仅次于阿尔茨海默病的第二常见的神经退行性疾病。AGD是一种迟发性神经退行性疾病,其特征在于神经元突起中被称为嗜银颗粒(AG)的小梭形或逗号形的银染色阳性病变。磷酸化tau蛋白是AG的主要成分。最常见的AGD表现为缓慢进行性、遗忘性和轻度的认知障碍,并伴有高发的神经精神症状。由于缺乏显著的临床特征,AGD通常仅在死后根据三种病理学特征进行诊断:AG、少突胶质细胞卷曲体和神经元缠结(Rodriguez,R.D.et al.(2015)DementNeuropsychol 9(1):2-8)。
“原发性年龄相关tau蛋白病”(“PART”)是一种在认知功能正常或认知功能仅轻度受损的老年个体死后大脑中常见的病理学现象。PART大脑具有难以与阿尔茨海默病区分的tau神经原纤维缠结,但没有淀粉样β斑块(Crary,J.F.et al.(2014)Acta Neuropathol128(6):755-66)。
“克雅氏病”(“CJD”)属于一个被称为传染性海绵状脑病(TSE)或朊病毒疾病的人类和动物疾病家族。朊病毒——来源于“蛋白质”和“传染性”——导致了人类的CJD和动物的TSE。海绵状是指被感染的大脑的特征性外观,当在显微镜下检查时,它们变得充满孔洞,直到类似海绵。CJD是一种罕见的、退化性和致命的大脑疾病,通常出现在晚年并且病程发展迅速。典型的症状出现在约60岁,并且约70%的人在一年内死亡。在疾病的早期阶段,人们可能会出现记忆力衰退、行为改变、缺乏协调和视觉障碍。随着病情的发展,精神恶化变得明显,并可能出现不自主运动、失明、四肢无力和昏迷。除了朊病毒斑块,在CJD患者的几个大脑区域中也观察到了tau病变,并且具有广泛分布的tau病变的患者的脑脊液也具有升高的总tau蛋白(Kovacs,G.G et al.(2017)Brain Pathol 3:332-344)。
“家族性英国痴呆”(“FBD”)是一种脑淀粉样血管病,其首次记录于一个大型英国家系的受影响成员中,其临床表现包括痴呆、痉挛性四肢轻瘫和小脑共济失调。FBD是由BRI2基因突变引起的。FBD的淀粉样斑块由淀粉样蛋白-Bri构成,并且在受淀粉样蛋白-Bri病变影响的区域发现了tau阳性神经原纤维缠结。FBD中tau的免疫印迹与阿尔茨海默病中tau的模式相似(Holton J.L.et al.(2001)Am J Patho 2:515-526)。
本文所用的“治疗有效量”旨在当将RNAi剂施用给患有APOE相关神经退行性疾病的受试者时,足以有效治疗该疾病的RNAi剂的量(例如,通过减轻、改善或维持现有疾病或疾病的一个或多个症状)。“治疗有效量”可以根据RNAi剂、剂的施用方式、疾病及其严重程度和待治疗的受试者的病史、年龄、体重、家族病史、遗传构成、既往治疗或伴随治疗的类型(如果有)、以及其他个体特征而变化。
如本文所用,“预防有效量”旨在包括当将RNAi剂施用给患有APOE相关神经退行性疾病的受试者时,足以预防或缓解该疾病或该疾病的一个或多个症状的RNAi剂的量。缓解疾病包括减缓该疾病的进程或减轻后发疾病的严重程度。“预防有效量”可根据RNAi剂、剂的施用方式、疾病的风险程度和待治疗的受试者的病史、年龄、体重、家族病史、遗传构成、既往治疗或伴随治疗的类型(如果有)、以及其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理效益/风险比率产生一些期望的局部效果或全身效果的RNAi剂的量。本公开方法中使用的RNAi剂可以以足以产生适用于这种治疗的合理效益/风险比率的量来施用。
如本文所用,短语“药学上可接受的”是指,在合理的医学判断范围内,那些适用于与人类受试者和动物受试者的组织接触而无过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症即符合合理效益/风险比率的化合物、材料、组合物或剂型。
如本文所用,短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒介物(vehicle),如液体填充剂或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如,润滑剂、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、或硬脂酸)、或溶剂封装材料,涉及将受试化合物从一个器官或身体的一部分携带或运送至另一器官或身体的另一部分。就与制剂的其他成分兼容且不损害被治疗的受试者而言,每种载体必须是“可接受的”。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括:(1)糖类,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;(2)淀粉,如玉米淀粉和马铃薯淀粉;(3)纤维素及其衍生物,如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素;(4)粉状黄蓍胶;(5)麦芽;(6)明胶;(7)润滑剂,如硫酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉;(8)赋形剂,如可可脂和栓剂蜡;(9)油类,例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油;(10)二元醇,例如丙二醇;(11)多元醇,如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇;(12)酯类,如油酸乙酯和月桂酸乙酯;(13)琼脂;(14)缓冲剂,如氢氧化镁和氢氧化铝;(15)海藻酸;(16)无热原的水;(17)等渗盐水;(18)林格氏溶液;(19)乙醇;(20)pH缓冲溶液;(21)聚酯、聚碳酸酯或聚酸酐;(22)填充剂,例如多肽和氨基酸(23)血清成分,例如血清白蛋白、HDL和LDL;以及(22)药物制剂中使用的其他无毒相容物质。
如本文所用,术语“样本”包括从受试者分离出的相似的体液、细胞或组织,以及存在于受试者体内的体液、细胞或组织的集合。生物体液的实例包括血液、血清及浆膜液、血浆、脑脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。组织样本可包括源自组织、器官或局部区域的样本。例如,样本可源自特定的器官、器官的一部分、或那些器官内的体液或细胞。在某些实施方案中,样本可以源自脑(例如,全脑或脑的某些部分例如纹状体,或脑中的某些类型的细胞例如神经元和神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞))。在其他实施方案中,“源自受试者的样本”指源自受试者的肝组织(或其亚组分)。在一些实施方案中,“源自受试者的样本”是指从受试者抽取的血液或源自受试者的血浆或血清。在其他实施方案中,“源自受试者的样本”是指源自受试者的脑组织(或其亚组分)或视网膜组织(或其亚组分)。
II.本公开的RNAi剂
本文描述了抑制APOE基因表达的RNAi剂。在一些实施方案中,本文提供的RNAi剂抑制APOE2等位基因、APOE3等位基因和APOE4等位基因的表达。在其他实施方案中,本文提供的RNAi剂抑制APOE4等位基因的表达,例如RNAi剂基本上不抑制APOE2等位基因或APOE3等位基因的表达,例如APOE2和/或APOE3表达被抑制不超过约10%。在一个实施方案中,RNAi剂包含双链核糖核酸(dsRNA)分子,其用于抑制APOE基因在细胞中的表达,所述细胞是例如受试者体内的细胞,例如哺乳动物体内的细胞,例如患有APOE相关神经退行性疾病的人体内的细胞,所述神经退行性疾病是例如淀粉样蛋白-β介导的疾病例如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病,以及tau介导的疾病例如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART),或继发性tau蛋白病例如AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。dsRNA包括具有互补性区域的反义链,该互补性区域与APOE基因表达中形成的mRNA的至少一部分是互补的,该互补性区域的长度为约15至30个核苷酸或更少。当与表达APOE基因的细胞接触时,RNAi剂将APOE基因(例如,人类基因、灵长类动物基因、非灵长类动物基因)的表达抑制了至少50%,如通过例如基于PCR或分支DNA(bDNA)的方法所测定的,或通过基于蛋白质的方法例如通过免疫荧光分析,使用例如蛋白质印迹或流式细胞术所测定的。在一个实施方案中,使用下文实施例1中提供的双荧光素酶分析方法,在10nM浓度的siRNA下,在人成神经细胞瘤BE(2)-C细胞中分析敲除水平。
dsRNA包括两条互补的RNA链,这两条RNA链在将使用该dsRNA的条件下杂交以形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本互补且通常是完全互补的互补性区域。靶序列可以来源于APOE基因表达过程中形成的mRNA序列。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域,使得两条链在合适的条件下结合时杂交并形成双链体结构。如本文其他地方所述和本领域已知的,dsRNA的互补序列也可以作为单个核酸分子的自身互补性区域而不是在分别的寡核苷酸上而被包含。
通常,双链体结构的长度为15至30个碱基对,例如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个碱基对。在某些优选的实施方案中,双链体结构的长度为18至25个碱基对,例如长度为18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25个碱基对,例如,长度为19至21个碱基对。介于上文列举的范围和长度之间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
类似地,与靶序列互补的互补性区域的长度为15至30个核苷酸,例如长度为15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22个核苷酸,例如,长度为19至23个核苷酸或长度为21至23个核苷酸。介于上文列举的范围及长度之间的范围及长度也被认为是本公开的一部分。
在一些实施方案中,dsRNA的长度为15至23个核苷酸,或25至30个核苷酸。通常,dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如,如本领域中众所周知的,长度大于约21至23个核苷酸的dsRNA可以用作Dicer的底物。本领域技术人员还应认识到,靶向裂解的RNA区域通常是较大RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。在相关的情况下,mRNA靶标的“一部分”是mRNA靶标的长度足以允许其成为RNAi引导的裂解(即通过RISC途径的裂解)的底物的连续序列。
本领域技术人员还应认识到,双链体区域是dsRNA的主要功能部分,例如,约15至36个碱基对的双链体区域,例如,15至36、15至35、15至34、15至33、15至32、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22个碱基对,例如19至21个碱基对的双链体区域。因此,在一个实施方案中,就其被加工为靶向所期望用于裂解的RNA的例如15至30个碱基对的功能性双链体而言,具有超过30个碱基对的双链体区域的RNA分子或RNA分子的复合体是dsRNA。因此,本领域普通技术人员将认识到,在一个实施方案中,miRNA是dsRNA。在另一实施方案中,dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一实施方案中,可用于靶向APOE表达的RNAi剂并非是在靶细胞内通过较大dsRNA的裂解生成的。
本文所述的dsRNA还可以包括一个或多个单链核苷酸突出,其具有例如1、2、3或4个核苷酸。核苷酸突出可以包含核苷酸/核苷类似物或由核苷酸/核苷类似物组成,其中该核苷酸/核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。所述一个或多个突出可位于有义链、反义链或其任何组合上。此外,突出的一个或多个核苷酸可存在于dsRNA的反义链或有义链的5′-端、3'-端或两端。
dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成。
在一方面,本公开的dsRNA包括至少两个核苷酸序列,有义序列和反义序列。针对APOE的有义链序列可选自表2至表5和表7至表10中的任一表中提供的序列的组,有义链的对应反义链的核苷酸序列可选自表2至表5和表7至表10中的任一表中的序列的组。在这方面,两个序列中的一个序列与这两个序列中的另一个序列是互补的,其中一个序列与APOE基因表达中产生的mRNA序列是基本互补的。因此,在这方面,dsRNA将包括两个寡核苷酸,其中一个寡核苷酸在表2至表5和表7至表10的任一表中被描述为有义链(过客链),而第二个寡核苷酸在表2至表5和表7至表10的任一表中被描述为针对APOE的有义链的对应反义链(引导链)。
在一个实施方案中,dsRNA的基本互补序列包含在分别的寡核苷酸上。在另一实施方案中,dsRNA的基本互补序列包含在单个寡核苷酸上。
应当理解,尽管表3、表5、表8和表10中的序列被描述为经修饰的或缀合的序列,并且表2、表4、表7和表9中的序列被描述为未修饰的序列,但是本公开的RNAi剂的RNA,例如本发明的dsRNA,可以包含表2至表5和表7至表10中的任一表中列出的任一未修饰的、未缀合的、或与其中所述不同的经修饰的或缀合的序列。一个或多个亲脂性配体和/或一个或多个GalNAc配体可以包括在本申请提供的RNAi剂的任何位置。
技术人员已知,具有约20至23个碱基对(如21个碱基对)的双链体结构的dsRNA被认为在诱导RNA干扰中特别有效(Elbashir et al.,(2001)EMBO J.,20:6877-6888)。然而,其他人已经发现,较短或较长的RNA双链体结构也可以是有效的(Chu and Rana(2007)RNA14:1714-1719;Kim et al.(2005)Nat Biotech 23:222-226)。在上述实施方案中,由于本文提供的寡核苷酸序列的性质,本文描述的dsRNA可以包括至少一条长度为最少21个核苷酸的链。可以合理地预期,与上述dsRNA相比,在一端或两端仅减去几个核苷酸的较短双链体同样有效。因此,具有源自本文提供的序列之一的至少15、16、17、18、19、20个或更多个连续核苷酸的序列、并且其在使用具有Cos7和10nM浓度的RNA剂的体外试验和本文实施例中提供的PCR试验中与包含完整序列的dsRNA相比的抑制APOE基因组表达的能力相差不超过10%、15%、20%、25%或30%的dsRNA,预期被包括在本公开的范围内。
此外,本文所述的RNA能识别APOE转录本中对RISC介导的裂解敏感的一个或多个位点。因此,本公开还描述了靶向这些位点的RNAi剂。如本文所用,如果RNAi剂促进在特定位点内任意处的转录本的裂解,则称该RNAi剂靶向该特定位点内。此类RNAi剂通常包括来自本文提供的序列之一的至少约15个连续核苷酸,优选至少19个核苷酸,该连续核苷酸与取自与APOE基因中所选序列相邻的区域的额其他核苷酸序列偶联。
本文所述的RNAi剂可以含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施方案中,本文所述的RNAi剂包含不超过3个错配(即3、2、1或0个错配)。在一个实施方案中,本文所述的RNAi剂包含不超过2个错配。在一个实施方案中,本文所述的RNAi剂包含不超过1个错配。在一个实施方案中,本文所述的RNAi剂包含0个错配。在某些实施方案中,如果RNAi剂的反义链含有与靶序列的错配,则可任选地将该错配限制在距互补性区域的5'端或3'端的最后5个核苷酸内。例如,在此类实施方案中,对于23个核苷酸的RNAi剂,与APOE基因区域互补的链通常在中心的13个核苷酸内不含任何错配。本文描述的方法或本领域已知的方法可用于确定含有与靶序列错配的RNAi剂是否能有效抑制APOE基因的表达。考虑具有错配的RNAi剂在抑制APOE基因表达中的功效是重要的,特别是如果已知APOE基因中特定的互补性区域在群体中具有多态性序列变异。
III.本公开的经修饰的RNAi剂
在一个实施方案中,本公开的RNAi剂的RNA,例如dsRNA,是未修饰的,并且不包括例如本领域已知的和本文描述的化学修饰或缀合。在优选的实施方案中,本公开的RNAi剂的RNA,例如dsRNA,经化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。在本公开的某些实施方案中,本公开的RNAi剂的基本上所有核苷酸都经修饰。在本公开的其他实施方案中,本公开的RNAi剂的所有核苷酸都经修饰。本公开的RNAi剂中“基本上所有的核苷酸都经修饰”是大部分核苷酸但不是全部核苷酸都经修饰,并且可以包括不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。在本公开的其他实施方案中,本公开的RNAi剂可以包括不超过5、4、3、2或1个经修饰的核苷酸。
本公开中的核酸可以通过本领域中已完善建立的方法来合成或修饰,例如在“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),JohnWiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA中所描述的那些方法,该文献通过引用并入本文。修饰包括:例如,末端修饰,例如,5'-端修饰(磷酸化、缀合、反向连接)或3'-端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等);碱基修饰,例如,用以下碱基进行替换:稳定碱基、去稳定碱基、或与扩展的配偶体库进行碱基配对的碱基、移除碱基(无碱基核苷酸)或缀合碱基;糖修饰(例如,在2'-位置或4'-位置)或糖替换;或主链修饰,包括磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本文所述实施方案的RNAi剂的具体实例包括但不限于含有经修饰主链或不含天然核苷间键的RNA。具有经修饰主链的RNA除此之外还包括那些在主链中不具有磷原子的RNA。出于本说明书的目的,且如本领域中有时提及的,在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可被认为是寡核苷酸。在一些实施方案中,经修饰的RNAi剂将在其核苷间主链中具有磷原子。
经修饰的RNA主链包括,例如,具有正常3'-5'键的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'-亚烷基磷酸酯和手性磷酸酯的甲基磷酸酯和其他烷基磷酸酯、亚膦酸酯、包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯的氨基磷酸酯、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯、以及硼磷酸酯,这些的2'-5'连接类似物,以及其中相邻的核苷单元对是以3'-5'连接至5′-3'或以2'-5′连接至5'-2'的具有反向极性的那些。也可包括各种盐(例如钠盐、混合盐)和游离酸形式。
教导制备上述含磷键的代表性美国专利包括但不限于美国专利第3,687,808号、第4,469,863号、第4,476,301号、第5,023,243号、第5,177,195号、第5,188,897号、第5,264,423号、第5,276,019号、第5,278,302号、第5,286,717号、第5,321,131号、第5,399,676号、第5,405,939号、第5,453,496号、第5,455,233号、第5,466,677号、第5,476,925号、第5,519,126号、第5,536,821号、第5,541,316号、第5,550,111号、第5,563,253号、第5,571,799号、第5,587,361号、第5,625,050号、第6,028,188号、第6,124,445号、第6,160,109号、第6,169,170号、第6,172,209号、第6,239,265号、第6,277,603号、第6,326,199号、第6,346,614号、第6,444,423号、第6,531,590号、第6,534,639号、第6,608,035号、第6,683,167号、第6,858,715号、第6,867,294号、第6,878,805号、第7,015,315号、第7,041,816号、第7,273,933号、第7,321,029号、以及美国专利RE39,464,每个专利的全部内容通过引用并入本文。
其中不包括磷原子的经修饰的RNA主链具有通过短链烷基或环烷基的核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基的核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环的核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉基键(部分地由核苷的糖部分形成)的那些主链;硅氧烷主链;硫化物、亚砜和砜主链;甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基主链;亚甲基甲乙酰基及硫代甲酰乙酰基主链;含有烯烃的主链;氨基磺酸酯主链;亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链;磺酸盐及磺酰胺主链;酰胺主链;以及具有混合了N、O、S和CH2组成成分的其他主链。
教导制备上述寡核苷酸的代表性美国专利包括但不限于,美国专利第5,034,506号、第5,166,315号、第5,185,444号、第5,214,134号、第5,216,141号、第5,235,033号、第5,64,562号、第5,264,564号、第5,405,938号、第5,434,257号、第5,466,677号、第5,470,967号、第5,489,677号、第5,541,307号、第5,561,225号、第5,596,086号、第5,602,240号、第5,608,046号、第5,610,289号、第5,618,704号、第5,623,070号、第5,663,312号、第5,633,360号、第5,677,437号、和第5,677,439号,每个专利的全部内容通过引用并入本文。
在其他实施方案中,预期将合适的RNA模拟物用于RNAi剂,其中核苷酸单位的糖和核苷间键即主链均被新基团所替换。碱基单元维持不变以便与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物被称为肽核酸(PNA),其中的RNA模拟物已经显示出具有优异杂交特性。在PNA化合物中,RNA的糖主链被替换为含有酰胺的主链,尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基得以保留,且直接或间接地结合至主链的酰胺部分的氮杂氮原子上。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利第5,539,082号、第5,714,331号、及第5,719,262号,每个专利的全部内容通过引用并入本文。适用于本公开的RNAi剂的其他PNA化合物描述于例如Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500中。
本公开中描述的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷,特别是上文引用的美国专利号第5,489,677号的--CH2--NH--CH2--、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[被称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--N(CH3)--CH2--CH2--,和上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施方案中,本文提出的RNA具有上文提及的美国专利号5,034,506的吗啉基主链结构。天然磷酸二酯主链可以表示为O-P(O)(OH)-OCH2-。
经修饰的RNA也可以包含一个或多个取代的糖部分。本文提出的RNAi剂,例如dsRNA,可以在2'-位置处包含以下之一:OH;F;O-烷基、S-烷基或N-烷基;O-烯基、S-烯基或N-烯基;O-炔基、S-炔基或N-炔基;或O-烷基-O-烷基,其中烷基、烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。合适的示例性修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2,其中n和m是1至约10。在其他实施方案中,dsRNA在2'位置处包含以下之一:C1至C10低碳数烷基、取代的低碳数烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷基芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA裂解基团、报告基团、嵌入剂、用于改善RNAi剂药代动力学特性的基团、或用于改善RNAi剂药效动力学特性的基团,以及其他具有类似特性的取代基团。在一些实施方案中,修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3,也称为2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504),即烷氧基-烷氧基基团。另一示例性修饰是2'-二甲基氨基氧基乙氧基,即O(CH2)2ON(CH3)2基团,也被称为2'-DMAOE,如下文实施例中所述,和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也被称为2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE),即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。更多的示例性修饰包括:5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-脱氧核苷酸(在这三个家族中的R异构体和S异构体);2'-烷氧基烷基;和2'-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他修饰包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)、2’-O-十六烷基和2′-氟基(2'-F)。也可以在RNAi剂的RNA上的其他位置进行类似的修饰,特别是3'末端核苷酸的糖的3'位置或2'-5'连接的dsRNA中以及5'末端核苷酸的5'位置。RNAi剂也可以具有替代呋喃戊糖基糖的糖模拟物如环丁基部分。教导制备此类经修饰的糖结构的代表性美国专利包括但不限于,美国专利第4,981,957号、第5,118,800号、第5,319,080号、第5,359,044号、第5,393,878号、第5,446,137号、第5,466,786号、第5,514,785号、第5,519,134号、第5,567,811号、第5,576,427号、第5,591,722号、第5,597,909号、第5,610,300号、第5,627,053号、第5,639,873号、第5,646,265号、第5,658,873号、第5,670,633号和第5,700,920号,其中某些为与本申请所共有的,前述每个专利的全部内容通过引用并入本文。
本发明的RNAi剂还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)的修饰或取代。如本文所用,“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基,例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C),5-羟甲基胞嘧啶,黄嘌呤,次黄嘌呤,2-氨基腺嘌呤,腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物,腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物,2-硫尿嘧啶,2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶,5-卤代尿嘧啶和5-卤代胞嘧啶,5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶,6-偶氮尿嘧啶,6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶,5-尿嘧啶(假尿嘧啶),4-硫脲嘧啶,8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基及其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤,5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶,7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤,8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤,7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。更多的核碱基包括在美国专利第3,687,808号中公开的那些、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中公开的那些、The Concise Encyclopedia Of PolymerScience And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些、Englisch et al.,(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30:613中公开的那些、以及Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNAResearch andApplications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993中公开的那些。这些核碱基中的某些对于增加本公开提出的寡聚化合物的结合亲和力尤其有用。这些核碱基包括5-取代的嘧啶,6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6及O-6取代的嘌呤,包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已经显示出将核酸双链体的稳定性提高0.6℃至1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNAResearch and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)并且是示例性的碱基取代,尤其是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰结合时尤甚。
教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于,上面提到的美国专利第3,687,808号、第4,845,205号、第5,130,30号、第5,134,066号、第5,175,273号、第5,367,066号、第5,432,272号、第5,457,187号、第5,459,255号、第5,484,908号、第5,502,177号、第5,525,711号、第5,552,540号、第5,587,469号、第5,594,121号、第5,596,091号、第5,614,617号、第5,681,941号、第5,750,692号、第6,015,886号、第6,147,200号、第6,166,197号、第6,222,025号、第6,235,887号、第6,380,368号、第6,528,640号、第6,639,062号、第6,617,438号、第7,045,610号、第7,427,672号、和第7,495,088号,每个专利的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中,本发明的RNAi剂也可以被修饰以包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是通过两个碳(无论是相邻的还是不相邻的)桥接形成的环修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷,该糖部分包含通过桥接糖环的两个碳(无论是相邻的还是不相邻的)形成的环,从而形成双环的环系统。在某些实施方案中,桥任选地通过2'-无环氧原子连接糖环的4'-碳和2'-碳。因此,在一些实施方案中,本公开的剂可以包括一个或多个锁核酸(LNA)。锁核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸,其中核糖部分包含连接2′碳和4'碳的额外的桥。换言之,LNA是包含双环糖部分的核苷酸,所述双环糖部分包含4'-CH2-O-2'桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3'-内向型结构构象中。已经显示向siRNA添加锁核酸可增加血清中siRNA的稳定性,并减少脱靶效应(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research33(1):439-447;Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843;Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包括但不限于在4'核糖基环原子和2'核糖基环原子之间包含桥的核苷。在某些实施方案中,本发明反义多核苷酸剂包括一个或多个包含4'至2'桥的双环核苷。
锁核苷可以用以下结构表示(省略立体化学),
Figure BDA0004014902130000621
其中B是核碱基或经修饰的核碱基,L是将核糖环的2'-碳连接到4'-碳上的连接基团。此类4'至2′桥接双环核苷的实例包括但不限于4'-(CH2)—O-2′(LNA);4′-(CH2)—S-2′;4′-(CH2)2—O-2′(ENA);4'-CH(CH3)—O-2'(也被称为“限制性乙基”或“cEt”)和4'-CH(CH2OCH3)—O-2'(及其类似物;参见,例如,美国专利第7,399,845号);4'-C(CH3)(CH3)—O-2'(及其类似物;参见例如美国专利第8,278,283号);4'-CH2—N(OCH3)-2′(及其类似物;参见例如美国专利第8,278,425号);4'-CH2—O—N(CH3)-2'(参见,例如,美国专利公开号2004/0171570);4'-CH2—N(R)—O-2′,其中R是H、C1-C12烷基或氮保护基团(参见例如美国专利第7,427,672号);4'-CH2—C(H)(CH3)-2'(参见例如Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134);和4'-CH2—C(=CH2)-2'(及其类似物;参见例如美国专利第8,278,426号)。前述各项的全部内容在此通过引用并入本文。
教导制备锁核酸核苷酸的其他代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下:美国专利第6,268,490号、第6,525,191号、第6,670,461号、第6,770,748号、第6,794,499号、第6,998,484号、第7,053,207号、第7,034,133号、第7,084,125号、第7,399,845号、第7,427,672号、第7,569,686号、第7,741,457号、第8,022,193号、第8,030,467号、第8,278,425号、第8,278,426号、第8,278,283号、US2008/0039618、及US 2009/0012281,前述各项的全部内容通过引用并入本文。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型(包括,例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(参见WO99/14226))的任何前述双环核苷。
本公开的RNAi剂也可以被修饰以包括一个或多个限制性乙基核苷酸。如本文所用,“限制性乙基核苷酸”或“cEt”是包含双环糖部分的锁核酸,该双环糖部分包含4′-CH(CH3)-O-2'桥。在一个实施方案中,限制性乙基核苷酸是S构象,在本文中被称为“S-cEt”。
本公开的RNAi剂也可以包括一个或多个“构象限制核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'碳和C4'碳或连接核糖的-C3'碳和-C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定的构象并增加了其与mRNA的杂交亲和力。接头的长度足以将氧置于最佳位置以获得稳定性和亲和力,从而减少核糖环的起皱(puckering)。
教导制备上述CRN的代表性专利公布包括但不限于US 2013/0190383和WO 2013/036868,其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中,本公开的RNAi剂包含一个或多个为UNA(未锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸,其中糖的任意键已被去除,形成未锁定的“糖”残基。在一实例中,UNA还包括已经去除其C1′-C4′键(即C1′和C4′碳之间的碳-氧-碳共价键)。在另一个实例中,糖的C2′-C3′键(即C2′和C3'碳之间的碳-碳共价键)已经被去除(参见Nuc.AcidsSymp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039,在此通过引用并入本文)。
教导制备UNA的代表性美国专利公布包括但不限于,US 8,314,227及美国专利公开号2013/0096289、2013/0011922、和2011/0313020,其各自的全部内容通过引用并入本文。
潜在的对RNA分子末端的稳定化修饰可包括N-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇(Hyp-NHAc)、胸腺嘧啶-2'-O-脱氧胸腺嘧啶(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-氨基)、2-二十二酰基-尿苷-3-磷酸、倒置碱基dT(idT)等。这种修饰的公开可见于WO 2011/005861。
本公开的RNAi剂的其他修饰包括5'磷酸或5'磷酸模拟物,例如RNAi剂反义链上的5'末端磷酸或磷酸模拟物。合适的磷酸模拟物公开于例如US 2012/0157511中,其全部内容通过引用并入本文。
A.本公开的包含基序的经修饰的RNAi剂
在本公开的某些方面,本公开的双链RNAi剂包括如例如WO2013/075035(其全部内容通过引用并入本文)中所公开的带有化学修饰的剂。如本文和WO 2013/075035中所示,通过将一个或多个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序引入RNAi剂的有义链或反义链,特别是裂解位点处或附近,可以获得优异的结果。在一些实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链可以以其他方式被完全修饰。这些基序的引入中断了有义链或反义链的修饰模式(如果存在)。RNAi剂可以任选地与亲脂性配体例如C16配体缀合,例如在有义链上。RNAi剂可以任选地用(S)-二醇核酸(GNA)修饰来修饰,例如在反义链的一个或多个残基上。得到的RNAi剂表现出优异的基因沉默活性。
因此,本公开提供了能够在体内抑制靶基因(即APOE基因)表达的双链RNAi剂。RNAi剂包含有义链和反义链。RNAi剂的每条链的长度可以为15至30个核苷酸。例如,每条链的长度可以为16至30个核苷酸、17至30个核苷酸、25至30个核苷酸、27至30个核苷酸、17至23个核苷酸、17至21个核苷酸、17至19个核苷酸、19至25个核苷酸、19至23个核苷酸、19至21个核苷酸、21至25个核苷酸或21至23个核苷酸。在某些实施方案中,每条链的长度为19至23个核苷酸。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”),在本文中也被称为“RNAi剂”。RNAi剂的双链体区域的长度可以是15至30个核苷酸对。例如,双链体区域的长度可以为16至30个核苷酸对、17至30个核苷酸对、27至30个核苷酸对、17至23个核苷酸对、17至21个核苷酸对、17至19个核苷酸对、19至25个核苷酸对、19至23个核苷酸对、19至21个核苷酸对、21至25个核苷酸对或21至23个核苷酸对。在另一实例中,双链体区域的长度选自15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸。在优选的实施方案中,双链体区域的长度为19至21个核苷酸对。
在一个实施方案中,RNAi剂可以在一条或两条链的3'-端、5'-端或两端含有一个或多个突出区域或封端基团。突出可独立地为1至6个核苷酸的长度,例如,2至6个核苷酸的长度、1至5个核苷酸的长度、2至5个核苷酸的长度、1至4个核苷酸的长度、2至4个核苷酸的长度、1至3个核苷酸的长度、2至3个核苷酸的长度、或1至2个核苷酸的长度。在优选的实施方案中,核苷酸突出区域长度为2个核苷酸。突出可以是一条链比另一条链长的结果,或是相同长度的两条链错开的结果。突出可与靶mRNA形成错配,或其可与被靶向的基因序列互补或可以是另一序列。第一条链与第二条链也可连接,例如通过额外的碱基以形成发夹,或通过其他非碱基接头。
在一个实施方案中,RNAi剂突出区域中的核苷酸可以各自独立地是经修饰的或未修饰的核苷酸,包括但不限于2'-糖修饰(例如2-F、2'-O-甲基)的胸苷(T)及其任意组合。
例如,TT可以是任一条链的任一端的突出序列。突出可以与靶mRNA形成错配,或者它可以与被靶向的基因序列互补,或者可以是另一序列。
RNAi剂的有义链、反义链或两条链上的5′-突出或3′-突出可以被磷酸化。在一些实施方案中,一个或多个突出区域包含两个核苷酸且在该两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯,其中,这两个核苷酸可以相同或不同。在一个实施方案中,突出存在于有义链、反义链或两条链的3′端。在一个实施方案中,该3′-突出存在于反义链中。在一个实施方案中,该3′-突出存在于有义链中。
RNAi剂可以仅包含单个突出,该突出可强化RNAi的干扰活性而不影响其整体稳定性。例如,单链突出可以位于有义链的3'末端,或者位于反义链的3'末端。RNAi也可以具有钝端,位于反义链的5'端(或有义链的3′端),反之亦然。通常,RNAi的反义链在3'端具有核苷酸突出,且5'端是钝端。尽管不希望受缚于理论,但反义链5'端的不对称钝端以及反义链的3′端突出有助于将引导链加载至RISC过程中。
在一个实施方案中,RNAi剂是长度为19个核苷酸的双端钝体(bluntmer),其中,有义链含有至少一个位于从5'端起的位置7、8、9的三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的基序。反义链含有至少一个位于从5'端起的位置11、12、13的三个连续核苷酸上的三个2′-O-甲基修饰的基序。
在另一实施方案中,RNAi剂是长度为20个核苷酸的双端钝体,其中,有义链含有至少一个位于从5'端起的位置8、9、10的三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的基序。反义链含有至少一个位于从5'端起的位置11、12、13的三个连续核苷酸上的三个2'-O-甲基修饰的基序。
在另一实施方案中,RNAi剂是长度为21个核苷酸的双端钝体,其中,有义链含有至少一个位于从5'端起的位置9、10、11的三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的基序。反义链含有至少一个位于从5'端起的位置11、12、13的三个连续核苷酸上的三个2'-O-甲基修饰的基序。
在一个实施方案中,RNAi剂包含21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链,其中有义链含有至少一个位于从5'端起的位置9、10、11的三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的基序;反义链含有至少一个位于从5′端起的位置11、12、13的三个连续核苷酸上的三个2'-O-甲基修饰的基序,其中,RNAi剂的一端是钝端而另一端包含具有2个核苷酸的突出。优选地,具有2个核苷酸的突出位于反义链的3'端。当具有2个核苷酸的突出位于反义链的3'端时,在末端三个核苷酸之间可能存在两个硫代硫酸酯核苷酸间键,其中三个核苷酸中的两个是突出核苷酸,且第三个核苷酸是紧邻突出核苷酸的配对核苷酸。在一个实施方案中,RNAi剂在有义链的5'端和反义链的5'端两者的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方案中,RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸,包括作为基序一部分的核苷酸,都是经修饰的核苷酸。在一个实施方案中,每个残基均独立地被2'-O-甲基或2′-氟基修饰,例如以交替基序的方式。任选地,RNAi剂还包含配体(例如,亲脂性配体,任选地,C16配体)。
在一个实施方案中,RNAi剂包含有义链和反义链,其中有义链长度为25至30个核苷酸残基,其中从5'末端核苷酸(位置1)开始,第一条链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸;反义链长度为36至66个核苷酸残基,且从3'末端核苷酸开始,与有义链的位置1至23配对以形成双链体的那些位置包含至少8个核糖核苷酸;其中,至少反义链的3′末端核苷酸未与有义链配对,且最多达6个连续的3'末端核苷酸未与有义链配对,从而形成具有1至6个核苷酸的3'单链突出;其中,反义链的5′末端包含未与有义链配对的10至30个连续核苷酸,从而形成具有10至30个核苷酸的单链5'突出;其中,当将有义链与反义链对齐以达到最大互补性时,至少有义链的5'末端核苷酸和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸进行碱基配对,从而在有义链与反义链之间形成基本上是双链体的区域;并且,反义链在沿着反义链的至少19个核苷酸的长度上与靶RNA是充分互补的,以在将双链核酸引入哺乳动物细胞内时降低靶基因的表达;以及,其中,有义链含有至少一个位于三个连续核苷酸上的三个2'-F修饰的基序,其中,至少一个基序出现在裂解位点或邻近该裂解位点处。反义链含有至少一个位于裂解位点或邻近该裂解位点处的三个连续核苷酸上的三个2'-O-甲基修饰的基序。
在一个实施方案中,RNAi剂包含有义链和反义链,其中RNAi剂包含长度为至少25个且至多29个核苷酸的第一条链和长度为至多30个核苷酸且具有至少一个位于从5′端起的位置11、12、13的三个连续核苷酸上的三个2'-O-甲基修饰的基序的第二条链;其中第一条链的3'端及第二条链的5'端形成钝端,且第二条链在其3'端比第一条链长1至4个核苷酸,其中,双链体区域的长度为至少25个核苷酸,且第二链在沿着第二链的至少19个核苷酸的长度上与靶mRNA是充分互补的,以在将RNAi剂引入哺乳动物细胞内时降低靶基因的表达,并且,其中,对RNAi剂的Dicer裂解优先产生包含第二条链的3'-端的siRNA,从而降低了哺乳动物体内的靶标基因的表达。任选地,RNAi剂还包含配体。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链包含至少一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,其中一个基序出现在有义链的裂解位点处。
在一个实施方案中,RNAi剂的反义链还可以包含至少一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,其中一个基序出现在反义链的裂解位点或邻近该裂解位点处。
对于具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域的RNAi剂,反义链的裂解位点通常位于从5′-端起的位置10、11、12附近。因此,具有三个相同修饰的基序可出现在反义链的位置9、10、11,位置10、11、12,位置11、12、13,位置12、13、14,或位置13、14、15,从反义链的5'-端的第一个核苷酸开始计数,或在双链体区域内从反义链的5'-端的第一个成对核苷酸开始计数。反义链的裂解位点也可根据RNAi从5′-端起的双链体区域的长度而改变。
RNAi剂的有义链可以包含至少一个位于该链的裂解位点处的三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序;且反义链可具有至少一个位于该链的裂解位点或邻近该裂解位点处的三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时,有义链和反义链可如此对齐,使得位于有义链上的一个三核苷酸基序与位于反义链上的一个三核苷酸基序具有至少一个核苷酸重叠,即,有义链中基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的三个核苷酸中的至少一个形成碱基配对。或者,至少两个核苷酸可重叠,或全部三个核苷酸可重叠。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链可以包含超过一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序。第一基序可出现在该链的裂解位点或邻近该裂解位点处,而其他基序可以是翼修饰。在本文中,术语“翼修饰(wing modification)”是指出现在该链的另一部分的与位于该链的裂解位点或邻近该裂解位点处的基序分隔开来的基序。翼修饰或与第一基序相邻或被至少一个或多个核苷酸与第一基序分隔开。当基序彼此紧邻时,则这些基序的化学性彼此截然不同;而当基序被一个或多个核苷酸分隔开时,则化学性质可相同或相异。可存在两个或多个翼修饰。例如,当存在两个翼修饰时,每个翼修饰可出现在相对于位于裂解位点或邻近该裂解位点处的第一基序的一端,或出现在主基序(lead motif)的任一侧。
像有义链一样,RNAi剂的反义链可以包含超过一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序,且至少一个基序出现在该链的裂解位点或邻近该裂解位点处。该反义链还可含有一个或多个翼修饰,该翼修饰的对齐方式类似于可以存在于有义链的翼修饰。
在一个实施方案中,RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包括位于该链的3′端、5'端或两端的第一个或前两个末端核苷酸。
在另一实施方案中,RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包括位于该链的3′-端、5'-端或两端的双链体区域内的第一个或前两个配对核苷酸。
当RNAi剂的有义链和反义链各自包含至少一个翼修饰时,该翼修饰可落在双链体区域的相同末端上,且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当RNAi剂的有义链和反义链各自包含至少两个翼修饰时,有义链和反义链可如此对齐,使得来自一条链的两个修饰各自落在双链体区域的一端上,且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠;使得来自一条链的两个修饰各自落在双链体区域的另一端上,且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠;使得一条链的两个修饰分别落在主基序的各端上,且在双链体区域内具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施方案中,RNAi剂包含与靶标的一个或多个错配、双链体中的一个或多个错配、或其组合。错配可出现在突出区域中或双链体区域中。可基于碱基对促进解离或解链的倾向性将碱基对排序(例如,根据特定配对的结合自由能或解离自由能,最简单的手段是基于各配对来检查该配对,尽管也可使用相邻分析或类似分析)。就促进解离而言:A:U优于G:C;G:U优于G:C;且I:C优于G:C(I=肌苷)。错配,例如非典型配对或除典型配对之外的配对(如在本文别处所述)优于典型的(A:T,A:U,G:C)配对;并且包含通用碱基的配对优于典型的配对。
在一个实施方案中,RNAi剂包含从反义链5'端起的双链体区域内的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个,所述碱基对独立地选自以下组成的组:A:U、G:U、I:C、以及错配的对例如非典型配对或除典型配对之外的配对或包括通用碱基的配对,以促进反义链在双链体5′端的解离。
在一个实施方案中,从反义链5'端起的位于双链体区域内的位置1的核苷酸选自由A、dA、dU、U和dT组成的组。或者,从反义链5'端起的位于双链体区域内的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如,从反义链5′端起的位于双链体区域内的第一个碱基对是AU碱基对。
在另一实施方案中,有义链3′端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷(dT)。在另一实施方案中,反义链3′端的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶核苷(dT)。在一个实施方案中,例如,在有义链或反义链的3'端上存在脱氧胸腺嘧啶核苷酸的短序列,例如,两个dT核苷酸。
在一个实施方案中,有义链序列可以由式(I)表示:
5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
其中:
i和j各自独立地为0或1;
p和q各自独立地为0至6;
每个Na独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列;
每个np与nq独立地表示突出核苷酸;
其中,Nb和Y不具有相同的修饰;并且
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序。优选地,YYY是全为2'-F修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,Na或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施方案中,YYY基序出现在有义链的裂解位点处或其附近。例如,当RNAi剂具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域时,YYY基序出现在有义链的裂解位点处(例如,可以出现在位置6、7、8;7、8、9;9、10、11;10、11、12;或11、12、13)或其附近,从5′端的第1个核苷酸开始计数;或者任选地,从5′端的双链体区域内的第1个配对核苷酸开始计数。
在一个实施方案中,i是1且j是0,或i是0且j是1,或i和j均是1。因此,有义链可以以下列式来表示:
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib);
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic);或者
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′ (Id)。
当有义链由式(Ib)表示时,Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
每个Na可独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链由(Ic)表示时,Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链由式(Id)表示时,每个Nb独立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地,Nb是0、1、2、3、4、5或6。每个Na可独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以是彼此相同的或不同的。
在其他实施方案中,i是0且j是0,且有义链可以由下式表示:
5'np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时,每个Na独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方案中,RNAi的反义链序列可以由式(II)表示:
5'nq'-Na′-(Z'Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3′ (II),
其中:
k和l各自独立地为0或1;
p'和q'各自独立地为0至6;
每个Na'独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb′独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列;
每个np'与nq'独立地表示突出核苷酸;
其中,Nb'和Y'不具有相同的修饰;并且
X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序。
在一个实施方案中,Na'或Nb'包含交替模式的修饰。
Y′Y′Y'基序出现于反义链的裂解位点处或其附近。例如,当RNAi剂具有长度为17至23个核苷酸的双链体区域时,Y'Y'Y'基序出现于该反义链的位置9、10、11;10、11、12;11、12、13;12、13、14;或13、14、15,从5′端的第1个核苷酸开始计数;或任选地,从5′端的双链体区域内的第一个配对核苷酸开始计数。优选地,Y'Y'Y'基序出现于位置11、12、13。
在一个实施方案中,Y'Y'Y'基序是全为2'-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施方案中,k是1且l是0,或k是0且l是1,或k和l均是1。
因此,反义链可以由下式表示:
5'nq'-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np'3' (IIb);
5'nq'-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np'3' (IIc);或者
5'nq'-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np'3′ (IId)。
当反义链由式(IIb)表示时,Nb'表示包含0至10个、0至7个、0至10个、0至7个、0至5个、0至4个、0至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IIc)表示时,Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IId)表示时,每个Nb'独立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na'独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地,Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方案中,k是0,l是0,反义链可以用下式表示:
5′np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3' (Ia)。
当反义链由式(IIa)表示时,每个Na'独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X′、Y'和Z'中的每一个可以是彼此相同的或不同的。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地通过LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2′-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2'-羟基或2'-氟基进行修饰。例如,有义链和反义链的每个核苷酸独立地通过2'-O-甲基或2'-氟基来修饰。具体地,每个X、Y、Z、X'、Y'和Z'可以表示2′-O-甲基修饰或2'-氟基修饰。
在一个实施方案中,当双链体区域为21nt时,RNAi剂的有义链可以包含出现在链的位置9、10和11的YYY基序,从5'端的第一个核苷酸开始计数,或者任选地,从5'端的双链体区域内的第一个配对核苷酸开始计数;Y代表2'-F修饰。有义链还可以含有XXX基序或ZZZ基序作为双链体区域相对端的翼修饰;XXX和ZZZ各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。
在一个实施方案中,反义链可以包含出现在链的位置11、12、13的Y'Y'Y'基序,从5'端的第一个核苷酸开始计数,或者任选地,从5'端的双链体区域内的第一个配对核苷酸开始计数;Y'表示2′-O-甲基修饰。反义链还可以含有X'X'X'基序或Z'Z'Z'基序作为双链体区域相对端的翼修饰;并且X'X'X'和Z'Z'Z'各自独立地表示2'-OMe修饰或2'-F修饰。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中任一个所表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中任一个所表示的反义链形成双链体。
因此,用于本公开方法的RNAi剂可包含有义链和反义链,每条链具有14至30个核苷酸,RNAi双链体由式(III)表示:
有义链:5'np-Na-(XXX)i-Nb-YYY-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3'
反义链:3'np′-Na'-(X′X′X′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb'-(Z′Z′Z′)l-N'a-nq'5′
(III)
其中:
i、j、k和l各自独立地为0或1;
p、p'、q和q'各自独立地为0至6;
每个Na和Na'独立地表示包含0至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列,每个序列包含至少两个经不同修饰的核苷酸;
每个Nb与Nb′独立地表示包含0至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列;
其中
每个np'、np、nq'和nq可存在或不存在,且独立地表示突出核苷酸;并且
XXX、YYY、ZZZ、X'X′X′、Y′Y′Y′和Z′Z'Z'各自独立地表示一个位于三个连续核苷酸上的三个相同修饰的基序。
在一个实施方案中,i是0且j是0;或i是1且j是0;或i是0且j是1;或i和j均是0;或i和j均是1。在另一实施方案中,k是0且l是0;或k是1且l是0;或k是0且l是1;或k和l均是0;或k和l均是1。
形成RNAi双链体的有义链与反义链的示例性组合包括下述各式:
5′np-Na-YYY-Na-nq 3'
3′np'-Na'-Y'Y'Y′-Na′-nq′5′
(IIIa)
5′np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3′
3′np′-Na′-Y′Y′Y′-Nb'-Z′Z′Z′-Na′-nq'5′
(IIIb)
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'
3'np′-Na′-X′X′X′-Nb′-Y′Y′Y′-Na'-nq′5′
(IIIc)
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np'-Na'-X′X′X′-Nb'-Y′Y′Y′-Nb'-Z′Z′Z′-Na-nq'5'
(IIId)
当RNAi剂由式(IIIa)表示时,每个Na独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIb)表示时,每个Nb独立地表示包含1至10、1至7、1至5或1至4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIc)表示时,每个Nb、Nb'独立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIId)表示时,每个Nb、Nb'独立地表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na'独立地表示包含2至20、2至15或2至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb和Nb'中的每一个独立地包含交替模式的修饰。
在一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰。在另一实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰,且np'>0,并且至少一个np'通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。在另一实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰,np′>0,且至少一个np′通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接,并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个C16(或相关的)部分缀合(如下所述)。在另一实施方案中,当RNAi剂由式(IIId)表示时,Na修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰,np′>0,且至少一个np′通过硫代磷酸酯键连接到相邻的核苷酸,并且有义链包含至少一个硫代磷酸酯键,并且有义链与任选地通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个亲脂性部分如C16(或相关的)部分缀合。
在一个实施方案中,当RNAi剂由式(IIIa)表示时,Na修饰是2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰,np′>0,且至少一个np′通过硫代磷酸酯键连接到相邻的核苷酸,有义链包含至少一个硫代磷酸酯键,并且有义链与通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个亲脂性部分如C16(或相关的)部分缀合。
在一个实施方案中,RNAi剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体,其中双链体通过接头连接。接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地,多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同的基因;或者每个双链体可以靶向同一基因的两个不同靶标位点。
在一个实施方案中,RNAi剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体,其中双链体通过接头连接。接头可以是可裂解的或不可裂解的。任选地,多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同基因或两个不同的基因;或者每个双链体可以靶向同一基因的两个不同靶标位点。
在一个实施方案中,由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两种RNAi剂在5′端和一个或两个3'端彼此连接,并且任选地与配体缀合。每个剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因;或者每个剂可以靶向同一基因的两个不同靶标位点。
多个出版物描述了可用于本公开方法的多聚体RNAi剂。此类出版物包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520;和US 7858769,每个出版物的全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中,本公开的组合物和方法包括对本文所述的RNAi剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性实施方案中,本公开的5'乙烯基膦酸酯修饰核苷酸具有以下结构:
Figure BDA0004014902130000761
其中X是O或S;
R是氢、羟基、氟基或C1-20烷氧基(例如,甲氧基或正十六烷氧基);
R5'是=C(H)-P(O)(OH)2,并且C5′碳和R5′之间的双键是在E取向或Z取向(例如E取向);以及
B是核碱基或经修饰的核碱基,任选地,其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本公开的乙烯基膦酸酯可以连接到本公开的dsRNA的反义链或有义链上。在某些实施方案中,本公开的乙烯基膦酸酯连接到dsRNA的反义链,任选地在dsRNA反义链的5'端。
还预期了将乙烯基磷酸酯修饰用于本公开的组合物和方法中。示例性的乙烯基磷酸酯结构包括前述结构,其中R5'是=C(H)-P(O)(OH)2,并且C5'碳和R5'之间的双键是E取向或Z取向(例如E取向)。
E.热不稳定修饰
在某些实施方案中,可以通过在反义链的种子区域(即反义链5'端的位置2至9)掺入热不稳定修饰(thermally destabilizing modification)来优化dsRNA分子的RNA干扰,以减少或抑制脱靶基因沉默。已经发现,具有在从反义链5'端计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个热不稳定修饰的反义链的dsRNA,具有降低的脱靶基因沉默活性。因此,在一些实施方案中,反义链在其5'区域的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个或更多个)热不稳定修饰。在一些实施方案中,双链体的一个或多个热不稳定修饰位于从反义链5'-端起的位置2至9,或优选为位置4至8。在一些其他实施方案中,双链体的热不稳定修饰位于从反义链5'-端起的位置6、7或8。在另一些其他实施方案中,双链体的热不稳定修饰位于从反义链5'-端起的位置7。术语“热不稳定修饰”包括会导致dsRNA的总体解链温度(Tm)比不具有此类修饰的dsRNA的Tm更低(优选地,Tm比不具有此类修饰的dsRNA的Tm低1度、2度、3度或4度)。在一些实施方案中,双链体的热不稳定修饰位于从反义链5'-端起的位置2、3、4、5或9。
热不稳定化修饰可以包括,但不限于:无碱基修饰;与相对链中的相对核苷酸的错配;以及糖修饰如2'-脱氧修饰或无环核苷酸如未锁核酸(UNA)或二醇核酸(GNA)。
示例性的无碱基修饰包括但不限于以下:
Figure BDA0004014902130000771
其中R=H、Me、Et或OMe;R'=H,Me,Et或OMe;R"=H、Me、Et或OMe
Figure BDA0004014902130000781
其中B是经修饰的或未修饰的核碱基。
示例性的糖修饰包括但不限于以下:
Figure BDA0004014902130000782
其中B是经修饰的或未修饰的核碱基。
在一些实施方案中,双链体的热不稳定修饰选自由以下所组成的组:
Figure BDA0004014902130000791
其中B是经修饰的或未修饰的核碱基,每个结构上的星号代表R、S或外消旋。
术语“无环核苷酸”指具有无环核糖的任何核苷酸,例如,其中核糖碳之间的任一键(例如,C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4′)是不存在的,或者核糖碳或核糖氧中的至少一个(例如,C1'、C2'、C3'、C4'或O4')独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施方案中,无环核苷酸是
Figure BDA0004014902130000792
Figure BDA0004014902130000793
其中B是经修饰的或未修饰的核碱基,R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基;以及R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)。术语“UNA”是指未锁定的无环核酸,其中糖的任一键已被去除,形成未锁定的“糖”残基。在一个实例中,UNA还包括C1′-C4′之间的键(即C1′碳和C4′碳之间的碳-氧-碳共价键)已被去除的单体。在另一实例中,糖的C2'-C3键(即C2'碳和C3'碳之间的碳-碳共价键)已被去除(参见Mikhailov et.al.,Tetrahedron Letters,26(17):2059(1985);和Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,10:1039(2009),其全部内容通过引用并入本文)。无环衍生物提供了更大的主链灵活性,而不影响Watson-Crick配对。无环核苷酸的连接可以通过2'-5'连接或3'-5'连接。
术语“GNA”是指二醇核酸,它是一种类似于DNA或RNA的聚合物,但其“主链”的组成不同,其主链由通过磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成:
Figure BDA0004014902130000801
双链体的热不稳定修饰可以是dsRNA双链体内热不稳定核苷酸和相对链上的相对核苷酸之间的错配(即非互补碱基对)。示例性的错配碱基对包括G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其他错配碱基配对也适用于本发明。错配可以发生在天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸之间,即错配碱基配对可以发生在来自各自核苷酸的核碱基之间,而不依赖于核苷酸的核糖上的修饰。在某些实施方案中,dsRNA分子在错配配对中含有至少一个核碱基,其为2'-脱氧核碱基;例如,在有义链中的2'-脱氧核碱基。
在一些实施方案中,反义链种子区域中双链体的热不稳定修饰包括与靶mRNA上的互补碱基的W-C H-结合受损的核苷酸,例如:
Figure BDA0004014902130000811
在WO 2011/133876中已详细描述了无碱基核苷酸、无环核苷酸修饰(包括UNA和GNA)和错配修饰的更多实例,该文献通过引用整体并入本文。
热不稳定修饰还可以包括与相对碱基形成氢键的能力降低或丧失的通用碱基,以及磷酸修饰。
在一些实施方案中,双链体的热不稳定修饰包括具有非典型碱基的核苷酸,例如但不限于与相对链中的碱基形成氢键的能力受损或完全丧失的核碱基修饰。如WO 2010/0011895中所述,已经评估了这些核碱基修饰对dsRNA双链体中心区域的去稳定作用,该文献通过引用整体并入本文。示例性的核碱基修饰是:
Figure BDA0004014902130000812
在一些实施方案中,反义链种子区域中双链体的热不稳定修饰包括与靶mRNA上的碱基互补的一个或多个α-核苷酸,例如:
Figure BDA0004014902130000821
其中R是H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
与天然磷酸二酯键相比,已知能降低dsRNA双链体热稳定性的示例性磷酸修饰是:
Figure BDA0004014902130000822
R基团的烷基可以是C1-C6烷基。R基团的具体烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基和己基。
如本领域技术人员将认识到的,考虑到核碱基的功能作用定义了本公开的RNAi剂的特异性,而核碱基修饰可以以本文所述的多种方式进行,例如,以将不稳定修饰引入本发明的RNAi剂,例如出于增强相对于脱靶(off-target)效应的中靶(on-target)效应的目的,对于非核碱基修饰,可用的且通常存在于本公开的RNAi剂上的修饰的范围往往大得多,例如对多核糖核苷酸的糖基或磷酸主链的修饰。此类修饰在本公开的其他部分有更详细的描述,并且明确地考虑用于本公开的RNAi剂,所述RNAi剂具有如上所述或如本文其他地方所述的天然核碱基或经修饰的核碱基。
除了包含热不稳定修饰的反义链之外,[00451]dsRNA还可以包含一个或多个稳定化修饰。例如,dsRNA可以包含至少两个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)的稳定化修饰。在没有限制的情况下,稳定化修饰可以全部存在于一条链中。在一些实施方案中,有义链和反义链都包含至少两个稳定化修饰。稳定化修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如,稳定化修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上;每个稳定化修饰可以在有义链或反义链上以交替模式出现;或者有义链或反义链包含交替模式的稳定化修饰。有义链上的稳定化修饰的交替模式可以与反义链上的相同或不同,并且有义链上的稳定化修饰的交替模式可以相对于反义链上的稳定化修饰的交替模式有偏移。
在一些实施方案中,反义链包含至少两个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。在没有限制的情况下,反义链中的稳定化修饰可以存在于任何位置。在一些实施方案中,反义链包含位于自5′端起的位置2、6、8、9、14和16的稳定化修饰。在一些其他实施方案中,反义链包含位于自5'端起的位置2、6、14和16的稳定化修饰。在一些其他的实施方案中,反义链包含位于自5'端起的位置2、14和16的稳定化修饰。
在一些实施方案中,反义链包含至少一个与去稳定化修饰相邻的稳定化修饰。例如,稳定化修饰可以是位于去稳定化修饰的5'端或3'端(即位于去稳定化修饰位置的-1或+1位置)的核苷酸。在一些实施方案中,反义链包含位于去稳定化修饰的5'端和3'端中的每端的(即位于去稳定化修饰位置的-1和+1位置)稳定化修饰。
在一些实施方案中,反义链在去稳定化修饰的3'端(即在去稳定化修饰位置的+1和+2位置)包含至少两个稳定化修饰。
在一些实施方案中,有义链包含至少两个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定化修饰。在没有限制的情况下,有义链中的稳定化修饰可以存在于任何位置。在一些实施方案中,有义链包含位于自5'端起的位置7、10和11的稳定化修饰。在一些其他实施方案中,有义链包含位于自5′端起的位置7、9、10和11的稳定化修饰。在一些实施方案中,有义链包含位于反义链的位置11、12和15(从反义链的5'端开始计数)的相对或互补位置的稳定化修饰。在一些其他实施方案中,有义链包含位于反义链的位置11、12、13和15(从反义链的5'端开始计数)的相对或互补位置的稳定化修饰。在一些实施方案中,有义链包含两个、三个或四个稳定化修饰的区段(block)。
在一些实施方案中,有义链在与反义链中的双链体的热不稳定修饰的相对或互补位置不包含稳定化修饰。
示例性的热稳定化修饰包括但不限于2'-氟基修饰。其他热稳定化修饰包括但不限于LNA。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA包含至少四个(例如,四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟基核苷酸。在没有限制的情况下,2'-氟基核苷酸可以全部存在于一条链中。在一些实施方案中,有义链和反义链均包含至少两个2'-氟基核苷酸。2′-氟基修饰可以发生在有义链或反义链的任何核苷酸上。例如,2'-氟基修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上;每个2′-氟基修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生;或者有义链或反义链包含交替模式的2'-氟基修饰。有义链上的2'-氟基修饰的交替模式可以与反义链相同或不同,并且有义链上的2'-氟基修饰的交替模式可以相对于反义链上的2′-氟基修饰的交替模式有偏移。
在一些实施方案中,反义链包含至少两个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2'-氟基核苷酸。在没有限制的情况下,反义链中的2'-氟基修饰可以存在于任何位置。在一些实施方案中,反义链包含位于从5'端起的位置2、6、8、9、14和16的2'-氟基核苷酸。在一些其他实施方案中,反义链包含位于从5'端起的位置2、6、14和16的2'-氟基核苷酸。在一些其他实施方案中,反义链包含位于从5'端起的位置2、14和16的2′-氟基核苷酸。
在一些实施方案中,反义链包含至少一个与去稳定化修饰相邻的2'-氟基核苷酸。例如,2'-氟基核苷酸可以是位于去稳定化修饰的5'端或3'端(即位于去稳定化修饰位置的-1或+1位置)的核苷酸。在一些实施方案中,反义链包含位于去稳定化修饰的5′端和3'端中的每端(即位于去稳定化修饰位置的-1和+1位置)的2′-氟基核苷酸。
在一些实施方案中,反义链在去稳定化修饰的3′端(即在去稳定化修饰位置的+1和+2位置)包含至少两个2′-氟基核苷酸。
在一些实施方案中,有义链包含至少两个(例如,两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2′-氟基核苷酸。在没有限制的情况下,有义链中的2′-氟基修饰可以存在于任何位置。在一些实施方案中,反义链包含位于从5′端起的位置7、10和11的2′-氟基核苷酸。在一些其他实施方案中,有义链包含位于从5′端起的位置7、9、10和11的2′-氟基核苷酸。在一些实施方案中,有义链包含位于与反义链的位置11、12和15(从反义链的5'端开始计数)的相对或互补的位置的2'-氟基核苷酸。在一些其他实施方案中,有义链包含位于反义链的位置11、12、13和15(从反义链的5'端开始计数)的相反或互补位置的2'-氟基核苷酸。在一些实施方案中,有义链包含两个、三个或四个2'-氟基核苷酸的区段。
在一些实施方案中,有义链在与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补位置不包含2'-氟基核苷酸。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链,其中反义链包含至少一个热不稳定核苷酸,其中所述至少一个热不稳定核苷酸出现在反义链的种子区域(即反义链5'端的位置2至9),其中dsRNA的一端是钝端,而另一端包含2nt的突出,并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2'-氟基修饰;(ii)反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(iii)有义链与配体缀合;(iv)有义链包含2、3、4或5个2'-氟基修饰;(v)有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(vi)dsRNA包含至少四个2'-氟基修饰;和(vii)dsRNA在反义链的5'端包含钝端。优选地,2nt的突出位于反义链的3'端。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子包含有义链和反义链,其中:有义链的长度为25至30个核苷酸残基,其中从5'末端核苷酸(位置1)开始,所述有义链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸;反义链的长度为36至66个核苷酸残基,从3'末端核苷酸开始,在与有义链的位置1至23配对以形成双链体的位置包含至少8个核糖核苷酸;其中至少反义链的3′末端核苷酸未与有义链配对,并且多达6个连续的3′末端核苷酸未与有义链配对,从而形成1至6个核苷酸的3'单链突出;其中,反义链的5′末端包含未与有义链配对的10至30个连续核苷酸,从而形成10至30个核苷酸的单链5'突出;其中,当将有义链与反义链对齐以达到最大互补性时,至少有义链的5'末端核苷酸和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸进行碱基配对,从而在有义链与反义链之间形成基本上是双链体的区域;并且,反义链在沿着反义链的至少19个核苷酸的长度上与靶RNA是充分互补的,以在将双链核酸引入哺乳动物细胞内时降低靶基因的表达;以及,其中,有义链含有至少一个热不稳定核苷酸,其中至少一个热不稳定核苷酸位于反义链的种子区域(即反义链5'端的位置2至9)。例如,热不稳定核苷酸出现在与有义链5′端的位置14至17相对或互补的位置之间,并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2'-氟基修饰;(ii)反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(iii)有义链与配体缀合;(iv)有义链包含2、3、4或5个2'-氟基修饰;(v)有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;和(vi)dsRNA包含至少四个2'-氟基修饰;和(vii)dsRNA包含长度为12至30个核苷酸对的双链体区域。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子包含有义链和反义链,其中所述dsRNA分子包含长度为至少25个且至多29个核苷酸的有义链和长度为至多30个核苷酸的反义链,其中有义链在从5'端起的位置11包含易被酶降解的经修饰的核苷酸,其中所述有义链的3'端和所述反义链的5'端形成钝端,并且所述反义链在其3'端比有义链长1至4个核苷酸,其中双链体区域的长度为至少25个核苷酸,且所述反义链在沿着所述反义链的至少19nt的长度上与靶RNA是充分互补的,以在将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞时降低靶基因的表达,并且,其中所述dsRNA的dicer裂解优先产生包含所述反义链的所述3'端的siRNA,从而降低哺乳动物中的靶基因的表达,其中反义链包含至少一个热不稳定核苷酸,其中至少一个热不稳定核苷酸位于反义链的种子区域(即在反义链5′端的位置2至9),并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2'-氟基修饰;(ii)反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(iii)有义链与配体缀合;(iv)有义链包含2、3、4或5个2′-氟基修饰;(v)有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;和(vi)dsRNA包含至少四个2′-氟基修饰;和(vii)dsRNA包含长度为12至29个核苷酸对的双链体区域。
在一些实施方案中,dsRNA分子的有义链和反义链中的每个核苷酸都可以被修饰。每个核苷酸可以使用相同或不同的修饰进行修饰,所述修饰可以包括:一个或两个非连接磷酸氧的一个或多个改变或一个或多个连接磷酸氧的一个或多个改变;核糖成分的改变,例如核糖上2'羟基的改变;用“脱磷酸”接头批量替换磷酸部分;天然碱基的修饰或替换;以及核糖-磷酸主链的替换或修饰。
由于核酸是亚单元的聚合物,许多修饰发生在核酸内的重复位置,例如碱基或磷酸部分或者磷酸部分的非连接O的修饰。在某些情况下,修饰将发生在核酸的所有目标位置,但在许多情况下不会。举例来说,修饰可仅发生在3'末端或5'末端位置,可仅发生在末端区域,例如,在末端核苷酸上的位置或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中的位置。修饰可以发生在双链区域、单链区域或两者中。修饰可以仅发生在RNA的双链区域,也可以仅发生在RNA的单链区域。例如,在非连接O位置的硫代磷酸修饰可仅发生在一个末端或两个末端,可仅发生在末端区域,例如,在末端核苷酸上的位置或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中的位置,或可发生在双链区域和单链区域,特别是在末端。一个或多个5'端可以被磷酸化。
例如,为了增强稳定性,可以在突出中包括特定的碱基,或在单链突出如5'突出或3'突出或两者中包括经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如,在突出中包括嘌呤核苷酸是可取的。在一些实施方案中,可以例如利用本文所述的修饰来对3'或5'突出中的全部或一些碱基进行修饰。修饰可包括,例如,在核糖的2'位置使用本领域中已知修饰的修饰,例如使用2'-脱氧-2'-氟基(2′-F)或2′-O-甲基修饰的脱氧核糖核苷酸来替代核碱基的核糖,以及使用磷酸基团的修饰如硫代磷酸修饰。突出无需与靶序列同源。
在一些实施方案中,有义链和反义链的每个残基独立地通过LNA、HNA、CeNA、2′-甲氧基乙基、2′-O-甲基、2'-O-烯丙基、2′-C-烯丙基、2′-脱氧或2′-氟基进行修饰。这些链可以包含一个以上的修饰。在一些实施方案中,有义链和反义链的每个残基独立地通过2′-O-甲基或2′-氟基来修饰。应当理解,这些修饰是在反义链中存在的双链体的至少一种热不稳定化修饰之外的修饰。
有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2'-脱氧修饰、2'-O-甲基修饰或2'-氟基修饰、无环核苷酸或其他。在一些实施方案中,有义链和反义链各自包含选自2'-O-甲基或2′-脱氧的两种经不同修饰的核苷酸。在一些实施方案中,有义链和反义链的每个残基独立地通过2'-O-甲基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、2-脱氧-2′-氟基核苷酸、2′-O-N-甲基乙酰胺基(2′-O-NMA)核苷酸、2'-O-二甲氨基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)核苷酸、2'-O-氨基丙基(2'-O-AP)核苷酸或2'-ara-F核苷酸进行修饰。同样,应当理解,这些修饰是在反义链中存在的双链体的至少一种热不稳定修饰之外的修饰。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子包含交替模式的修饰,特别是在B1、B2、B3、B1'、B2′、B3'、B4'区域。[00472]如本文所用,术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰的基序,每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个,或类似的模式。例如,如果A、B和C分别代表对核苷酸的一种类型的修饰,则交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAABAAB…”、“AAABAAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
交替基序中含有的修饰的类型可以相同或不同。例如,如果A、B、C、D分别代表核苷酸上的一种类型的修饰,则交替基序,即每隔一个核苷酸上的修饰,可以是相同的,但有义链或反义链可各自选自交替基序(例如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等)内的几种可能的修饰。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子包含有义链上的交替基序的修饰模式,其相对于反义链上的交替基序的修饰模式是偏移的。这种偏移可使得有义链的核苷酸的修饰基团与反义链的核苷酸的经不同修饰的基团相对应,反之亦然。例如,当有义链与反义链在dsRNA双链体中配对时,在双链体区域内,有义链的交替基序可从该链的5′至3′以“ABABAB”开始,且反义链的交替基序可从该链的3′至5′以“BABABA”开始。作为另一实例,在双链体区域内,有义链的交替基序可从该链的5′至3′以“AABBAABB”开始,且反义链的交替基序可从该链的3'至5'以“BBAABBAA”开始,因此有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分的偏移。
本公开的dsRNA分子还可以包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰可出现在有义链或反义链或两条链的链上任意位置的任意核苷酸上。例如,核苷酸间键修饰可出现在有义链或反义链的每一个核苷酸上;每个核苷酸间键修饰可以以交替模式出现在有义链或反义链上;或有义链或反义链可包含交替模式的两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可与反义链的相同或相异,且有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式相对于反义链的核苷酸间键修饰的交替模式可具有偏移。
在一些实施例中,dsRNA分子包含位于突出区域内的硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如,突出区域可含有两个核苷酸且在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基膦酸酯核苷酸间键。核苷酸间键修饰也可将突出核苷酸与双链体区域内的末端配对核苷酸连接起来。例如,至少2、3、4或全部突出核苷酸可通过硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基膦酸酯核苷酸间键而连接,且任选地,可存在连接突出核苷酸与紧邻该突出核苷酸的配对核苷酸的另外的硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基膦酸酯核苷酸间键。例如,在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代硫酸酯核苷酸间键,其中这三个核苷酸中的两个是突出核苷酸,且第三个核苷酸是紧邻该突出核苷酸的配对核苷酸。优选地,这些末端三个核苷酸可以位于反义链的3'端。
在一些实施方案中,dsRNA分子的有义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸核苷酸间键分开的2至10个硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键的1至10个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述有义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键或磷酸核苷酸间键的任何组合的反义链配对或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个磷酸核苷酸间键分开的两个硫代磷酸酯或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16个磷酸核苷酸间键分开的三个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个磷酸核苷酸间键分开的四个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个磷酸核苷酸间键分开的五个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个磷酸核苷酸间键分开的六个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含被1、2、3、4、5、6、7或8个磷酸核苷酸间键分开的七个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含由1、2、3、4、5或6个磷酸核苷酸间键分开的八个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施方案中,dsRNA分子的反义链包含被1、2、3或4个磷酸核苷酸间键分开的九个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键的两个区段,其中硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置,并且所述反义链与包含硫代磷酸酯核苷酸间键、甲基磷酸酯核苷酸间键和磷酸核苷酸间键的任何组合的有义链配对,或与包含硫代磷酸酯键或甲基磷酸酯键或磷酸键的反义链配对。
在一些实施例中,本公开的dsRNA分子还包含有义链或反义链的1至10个末端位置内的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰。例如,至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可以在有义链或反义链的一端或两端通过硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键连接。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在每个有义链或反义链的双链体的1至10个内部区域内的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰。例如,至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸可以在双链区的位置8至16(从有义链5'端起计数)通过硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键连接;dsRNA分子还可以任选地包含在1至10个末端位置内的一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方案中,本发明的dsRNA分子还包含在有义链的位置1至5内的1至5个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的1至5个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链的位置1至2和位置18至23内的1至5个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链的位置1和2的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含有义链位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)、以及在反义链位置1和2的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链的位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链的位置1和2的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18至23的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)、以及在反义链位置1和2的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置20和21的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本发明的dsRNA分子还包含在有义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21和22的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21和22的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置22和23的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5′端起计数)、以及在反义链位置1的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子还包含在有义链位置1的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)、以及在反义链位置1和2的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置23和23的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5'端起计数)。
在一些实施实施方案中,本公开的化合物包含主链手性中心的模式。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少5个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少6个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少7个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少8个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少9个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少10个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少11个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少12个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少13个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少14个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少15个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少16个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少17个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少18个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少19个为Sp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过8个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过7个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过6个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过5个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过4个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过3个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过2个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过1个为Rp构型的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过8个非手性的核苷酸间键(作为非限制性实例,磷酸二酯)。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过3个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过2个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含不超过1个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少10个为Sp构型的核苷酸间键和不超过8个非手性的核间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少11个为Sp构型的核苷酸间键和不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少12个为Sp构型的核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少13个为Sp构型的核苷酸间键以及不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少14个为Sp构型的核苷酸间键以及不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,主链手性中心的常见模式包含至少15个为Sp构型的核苷酸间键以及不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施方案中,为Sp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施方案中,为Rp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施方案中,非手性的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。
在一些实施方案中,本公开的化合物包含的区段是立体化学区段(block)。在一些实施方案中,区段是Rp区段,因为该区段的每个核苷酸间键是Rp。在一些实施方案中,5′-区段是Rp区段。在一些实施方案中,3′-区段是Rp区段。在一些实施方案中,区段是Sp区段,因为该区段的每个核苷酸间键是Sp。在一些实施方案中,5'-区段是Sp区段。在一些实施方案中,3'-区段是Sp区段。在一些实施方案中,所提供的寡核苷酸包含Rp区段和Sp区段两者。在一些实施方案中,所提供的寡核苷酸包含一个或多个Rp区段但不包含Sp区段。在一些实施方案中,所提供的寡核苷酸包含一个或多个Sp区段但不包含Rp区段。在一些实施方案中,所提供的寡核苷酸包含一个或多个PO区段,其中每个核苷酸间键为天然磷酸键。
在一些实施方案中,本公开化合物包含的5'-区段是Sp区段,其中每个糖部分包含2'-F修饰。在一些实施方案中,5'-区段是Sp区段,其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键,并且每个糖部分包含2'-F修饰。在一些实施方案中,5'-区段是Sp区段,其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键,并且每个糖部分包含2'-F修饰。在一些实施方案中,5'-区段包含4个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,5'-区段包含5个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,5'-区段包含6个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,5'-区段包含7个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,3'-区段是Sp区段,其中每个糖部分包含2'-F修饰。在一些实施方案中,3′-区段是Sp区段,其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键,并且每个糖部分包含2'-F修饰。在一些实施方案中,3'-区段是Sp区段,其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键,并且每个糖部分包含2'-F修饰。在一些实施方案中,3'-区段包含4个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,3'-区段包含5个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,3'-区段包含6个或更多个核苷单元。在一些实施方案中,3'-区段包含7个或更多个核苷单元。
在一些实施方案中,本公开的化合物包含在一个区域中的核苷类型或者寡核苷酸,之后是具体类型的核苷酸间键例如天然磷酸键、经修饰的核苷酸间键、Rp手性核苷酸间键、Sp手性核苷酸间键等。在一些实施方案中,A之后是Sp。在一些实施方案中,A之后是Rp。在一些实施方案中,A之后是天然磷酸键(PO)。在一些实施方案中,U之后是Sp。在一些实施方案中,U之后是Rp。在一些实施方案中,U之后是天然磷酸键(PO)。在一些实施方案中,C之后是Sp。在一些实施方案中,C之后是Rp。在一些实施方案中,C之后是天然磷酸键(PO)。在一些实施方案中,G之后是Sp。在一些实施方案中,G之后是Rp。在一些实施方案中,G之后是天然磷酸键(PO)。在一些实施方案中,C和U之后是Sp。在一些实施方案中,C和U之后是Rp。在一些实施方案中,C和U之后是天然磷酸键(PO)。在一些实施方案中,A和G之后是Sp。在一些实施方案中,A和G之后是Rp。
在一些实施方案中,反义链包含位于核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键,其中反义链包含位于反义链种子区域(即,反义链5'端的位置2至9)的双链体的至少一个热不稳定修饰,并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2'-氟基修饰;(ii)反义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(iii)有义链与配体缀合;(iv)有义链包含2、3、4或5个2'-氟基修饰;(v)有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(vi)dsRNA包含至少四个2'-氟基修饰;(vii)dsRNA包含长度为12至40个核苷酸对的双链体区域;和(viii)dsRNA在反义链的5'端具有钝端。
在一些实施方案中,反义链包含位于核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键,其中反义链包含位于反义链种子区域(即反义链5'端的位置2至9)的双链体的至少一个热不稳定修饰,并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2'-氟基修饰;(ii)有义链与配体缀合;(iii)有义链包含2、3、4或5个2'-氟基修饰;(iv)有义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(v)dsRNA包含至少四个2'-氟基修饰;(vi)dsRNA包含长度为12至40个核苷酸对的双链体区域;(vii)dsRNA包含长度为12至40个核苷酸对的双链体区域;和(viii)dsRNA在反义链的5'端具有钝端。
在一些实施方案中,有义链包含位于核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键,其中反义链包含位于反义链种子区域(即,反义链5′端的位置2至9)的双链体的至少一个热不稳定修饰,并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2'-氟基修饰;(ii)反义链包含1、2、3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(iii)有义链与配体缀合;(iv)有义链包含2、3、4或5个2'-氟基修饰;(v)有义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(vi)dsRNA包含至少四个2'-氟基修饰;(vii)dsRNA包含长度为12至40个核苷酸对的双链体区域;和(viii)dsRNA在反义链的5'端具有钝端。
在一些实施方案中,有义链包含位于核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键,反义链包含位于核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键,其中反义链包含位于反义链种子区域(即,反义链5'端的位置2至9)的双链体的至少一个热不稳定修饰,并且其中dsRNA任选地还具有至少一个(例如,一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)以下特征:(i)反义链包含2、3、4、5或6个2′-氟基修饰;(ii)有义链与配体缀合;(iii)有义链包含2、3、4或5个2′-氟基修饰;(iv)有义链包含3、4或5个硫代磷酸酯核苷酸间键;(v)dsRNA包含至少四个2'-氟基修饰;(vi)dsRNA包含长度为12至40个核苷酸对的双链体区域;和(vii)dsRNA在反义链的5'端具有钝端。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子一个或多个与靶标的错配、一个或多个双链体中的错配、或其组合。错配可出现在突出区域或双链体区域。可基于碱基对促进解离或解链的倾向性将碱基对排序(例如,根据特定配对的结合自由能或解离自由能,最简单的方法是在单个配对的基础上来检查该配对,尽管也可使用相邻分析或类似分析)。就促进解离而言:A:U优于G:C;G:U优于G:C;且I:C优于G:C(I=肌苷)。错配,例如非典型配对或除典型配对之外的配对(如在本文别处所述),优于典型的(A:T,A:U,G:C)配对;并且包含通用碱基的配对优于典型的配对。
在一些实施方案中,本公开的dsRNA分子包含从反义链5′端起的位于双链体区域内的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个,所述碱基对独立地选自以下组成的组:A:U、G:U、I:C、以及错配的配对,例如非典型配对或除典型配对之外的配对或包含通用碱基的配对,以促进反义链在双链体5'端的解离。
在一些实施方案中,从反义链5'端起的位于双链体区域内的位置1的核苷酸选自由A、dA、dU、U和dT组成的组。或者,从反义链5'端起的位于双链体区域内的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如,从反义链5′端起的位于双链体区域内的第一个碱基对是AU碱基对。
已经发现,在单链或双链寡核苷酸的任何位置的二核苷酸的磷酸二酯(PO)键、硫代磷酸酯(PS)键或二硫代磷酸酯(PS2)键的3'-端引入4′-修饰核苷酸或5′-修饰核苷酸,可以对核苷酸间键产生空间效应,从而保护或稳定其免受核酸酶的影响。
在一些实施方案中,在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3'端引入5'-修饰核苷。例如,可以在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3'端引入5'-烷基化核苷。核糖5'位置的烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的5'-烷基化核苷是5'-甲基核苷。5'-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中,在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3'端引入4'-修饰的核苷。例如,可以在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3'端引入4'-烷基化核苷。核糖4'位置的烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4'-烷基化核苷是4'-甲基核苷。4'-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。或者,可以在单链或双链siRNA的任何位置的二核苷酸的3'端引入4'-O-烷基化核苷。核糖的4'-O-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4'-O-烷基化核苷是4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中,在dsRNA的有义链或反义链的任何位置引入5'-烷基化核苷,并且这种修饰保持或提高了dsRNA的效力。5′-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的5'-烷基化核苷是5′-甲基核苷。5′-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中,在dsRNA的有义链或反义链的任何位置引入4'-烷基化核苷,并且这种修饰保持或提高了dsRNA的效力。4'-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4′-烷基化核苷是4′-甲基核苷。4′-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施方案中,在dsRNA的有义链或反义链的任何位置引入4'-O-烷基化核苷,并且这种修饰保持或提高了dsRNA的效力。5′-烷基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。示例性的4'-O-烷基化核苷是4′-O-甲基核苷。4′-O-甲基可以是外消旋的或手性纯的R或S异构体。
在一些实施例中,本公开的dsRNA分子可以包含2'-5′键(具有2'-H、2'-OH和2′-OMe,并且具有P=O或P=S)。例如,2'-5'键修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合,或可用于有义链的5'端以避免有义链被RISC激活。
在另一实施方案中,本公开的dsRNA分子可以包含L糖(例如,具有2'-H、2'-OH和2'-OMe的L-核糖、L-阿拉伯糖)。例如,这些L糖修饰可用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合,或可用于有义链的5'端以避免有义链被RISC激活。
多个出版物描述了可以与本公开的dsRNA一起使用的多聚体siRNA。此类出版物包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520,这些出版物的全部内容并入本文。
如下文更详细描述的,含有缀合到自身的一个或多个糖类部分的RNAi剂可优化该RNAi剂的一种或多种特性。在多种情形中,糖类部分将连接到RNAi剂的经修饰的亚单元上。例如,dsRNA剂的一个或多个核糖核苷酸亚单元的核糖可被替换为另一个部分,如其上连接有糖类配体的非糖类(优选环状的)载体。在本文中,其中亚单元的核糖已经被如此替换的核糖核苷酸亚单元被称为核糖替换修饰亚单元(RRMS)。环状载体可以是碳环环系统,即所有的环原子都是碳原子,或者是杂环环系统,即一个或多个环原子可以是杂原子,例如氮、氧、硫。环状载体可以是单环环系统,或可含有两个或更多个环,如稠环。环状载体可以是完全饱和的环系统,或其可含有一个或多个双键。
配体可以通过载体附接到多核苷酸上。载体包括:(i)至少一个“主链附接点”,优选两个“主链附接点”,和(ii)至少一个“连系附接点(tethering attachment point)”。如本文所用,“主链附接点”是指官能团如羟基或通常是可用于且适用于将载体并入核糖核酸的主链(如磷酸主链或经修饰的磷酸主链如含硫的主链)中的键。在一些实施方案中,“连系附接点”(TAP)是指连结选定部分的环状载体的构成环原子,例如,碳原子或杂原子(不同于提供主链附接点的原子)。该部分可以是例如糖类,如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。任选地,选定部分通过中间连系(intervening tether)而连接至环状载体。因此,环状载体通常将包括官能团例如氨基或通常提供键,其适用于将另一化学实体(如配体)并入或连系至构成环。
RNAi剂可以通过载体与配体缀合,其中载体可以是环状基团或非环状基团;优选地,环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基及十氢萘基;优选地,非环状基团选自丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
在某些具体实施方案中,用于本公开方法的RNAi剂是选自表2至表5和表7至表10中任一表所列剂的组的剂。这些剂还可包含配体,例如一个或多个亲脂性部分、一个或多个GalNAc衍生物、或一个或多个亲脂性部分和一个或多个GalNAc衍生物两者。
IV.与配体缀合的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及将增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取(例如进入细胞中)的一个或多个配体、部分或缀合物化学连接至iRNA上。此类部分包括但不限于脂质部分,例如胆固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556)、胆酸(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060)、硫醚例如beryl-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309;Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20:533-538)、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10:1111-1118;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327-330;Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75:49-54)、磷脂例如双-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸三乙铵(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654;Shea et al.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969-973)、或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)、棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237)、或十八烷基胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937)。
在某些实施方案中,配体改变了其所掺入的iRNA试剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方案中,配体提供了对于所选靶标更高的亲和性,所述靶标为例如分子,细胞或细胞类型,区室如细胞区室或器官区室,身体的组织、器官或区域,例如与没有此类配体的种类相比。典型的配体不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质,例如蛋白质(例如,人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白);糖类(例如葡聚糖、普鲁兰多糖、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸);或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子,例如合成的聚合物,例如合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括,聚氨基酸是聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物、或聚磷嗪(polyphosphazine)。聚胺的实例包括:聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、伪肽-聚胺、拟肽聚胺、树枝状聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。
配体还可以包括与具体细胞类型(例如神经胶质细胞)结合的靶向基团,如细胞靶向剂或组织靶向剂,如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质,如抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白糖类、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基葡萄糖胺、多价甘露糖、多价海藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、运铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸盐、聚天冬氨酸盐、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素、或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施方案中,配体是多价半乳糖,例如N-乙酰基-半乳糖胺。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基基团、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)、以及肽缀合物(例如,触角足肽、Tat肽)、烷基化剂、磷酸、氨基、巯基、PEG(例如,PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(如生物素)、转运促进剂/吸收促进剂(例如,阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成的核糖核酸酶(例如,咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+复合物)、二硝基苯基、HRP、或AP。
配体可以是蛋白质如糖蛋白、或肽,例如对共配体具有特异亲和性的分子、或抗体,例如结合特定细胞类型如脑细胞或神经胶质细胞的抗体。配体也可包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽类物质,例如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅助因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡萄糖胺、多价甘露糖、或多价海藻糖。配体可以是,例如,脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂、或NF-κB的激活剂。
配体可以是诸如药物的物质,其可例如通过破坏细胞的细胞骨架(如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝)来增加细胞对iRNA剂的摄取。该药物可以是,例如,紫杉醇(taxon)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、茉莉素(japlakinolide)、红海海绵素A(latrunculin A)、鬼笔环肽(phalloidin)、海绵抗菌素(swinholide A)、茚酮衍生物(indanocine)、或迈尔素(myoservin)。
在一些实施方案中,如本文所述的与iRNA连接的配体充当药物代谢动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。示例性的PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生(naproxen)、布洛芬(ibuprofen)、维生素E、生物素等。包含一些硫代硫酸酯键的寡核苷酸还已知与血清蛋白结合,因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸也可作为本发明的配体(例如,作为PK调节配体)。此外,在本文所述的实施方案中,结合血清组分(例如,血清蛋白)的适体也适用于作为PK调节配体而使用。
本发明的配体-缀合的iRNA可通过使用具有侧链反应性官能团的寡核苷酸来合成,如衍生自连接分子与寡核苷酸的附接(如下所述)。这一反应性寡核苷酸可直接与下列配体反应:可商购的配体、具有多种保护基团中的任一种的合成配体、或具有附接于其上的连接部分的配体。
本发明缀合物中使用的寡核苷酸可以通过公知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这种合成的设备可由多个供应商贩售,包括,例如Applied
Figure BDA0004014902130001051
(FosterCity,Calif.)。可额外地或替代地采用本领域中已知的用于这种合成的任何其他方法。使用类似技术来进行其他寡核苷酸如硫代磷酸酯及烷基化衍生物的制备也是已知的。
在本发明的配体-缀合的寡核苷酸和带有配体分子的序列特异性连接的核苷中,寡核苷酸和寡核苷可在合适DNA合成仪上使用下列物质组装:标准核苷酸或核苷前体、或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合前体、已经带有配体分子或非核苷配体结构单元的配体-核苷酸或核苷缀合前体。
当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合前体时,通常已完成序列特异性连接的核苷的合成,随后将配体分子与该连接部分反应以形成与配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方案中,本发明的寡核苷酸或连接的核苷是通过自动合成仪来合成,除了使用可商购且常规用于寡核苷酸合成中的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺以外,还使用了衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺。
A.脂质缀合物
在某些实施方案中,配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子通常可以与血清蛋白如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA与配体的结合允许缀合物分布于靶组织,如身体的非肾脏靶组织。例如,靶组织可以是肝脏,包括肝脏的实质细胞。可结合HSA的其他分子也可用作配体。例如,可使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可(a)增加对缀合物降解的抗性,(b)增加对靶细胞或细胞膜的靶向或递送,或(c)可用于调节与血清蛋白例如HSA的结合。
基于脂质的配体可用于调节例如控制(例如,抑制)缀合物与靶组织的结合。例如,与HSA更牢固结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能靶向肾脏,并因此更不可能从身体中被清除。与HSA结合较弱的脂质或基于脂质的配体可用来使缀合物靶向肾脏。
在某些实施方案中,基于脂质的配体结合HSA。例如,配体可以以足够的亲和力结合HSA,从而增强缀合物在非肾脏组织中的分布。然而,这种亲和力通常没有强到使HSA-配体的结合不可逆。
在某些实施方案中,基于脂质的配体与HSA结合较弱或根本不结合,从而增强了缀合物在肾脏中的分布。靶向肾细胞的其他部分也可以代替基于脂质的配体来施用或在除了基于脂质的配体之外使用。
在某些实施方案中,基于脂质的配体与HSA结合较弱或根本不结合,从而增强了缀合物在肾脏中的分布。靶向肾细胞的其他部分也可以代替基于脂质的配体来施用或在除了基于脂质的配体之外使用。
在另一方面,配体是被靶细胞(例如增殖细胞)摄取的部分,例如维生素。这些尤其适用于治疗以多余的细胞增殖(例如恶性或非恶性类型的,如癌细胞)为特征的病症。示例性维生素包括维生素A、维生素E和维生素K。其他示例性维生素包括B族维生素,如叶酸、维生素B12、核黄素、生物素、吡哆醛、或其他被癌细胞摄取的维生素或营养物质。HSA及低密度脂蛋白(LDL)也包括在内。
B.细胞渗透剂
在另一方面,配体是细胞渗透剂,例如螺旋细胞渗透剂。在某些实施方案中,该剂是两亲性的。示例性的剂是肽,例如tat或触角足(antennapedia)。如果该剂是肽,其可以是经修饰的,包括肽模拟物、反转异构体、非肽或伪肽键、以及D-氨基酸的使用。螺旋剂通常是α-螺旋剂,并且可以具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(本文中也被称为寡肽模拟物)是能折叠为类似于天然肽的所定义的三维结构的分子。肽及肽模拟物与iRNA剂的附接可例如通过增强细胞识别和吸收来影响iRNA的药物代谢动力学分布。肽或肽模拟物部分可以是约5至50个氨基酸的长度,例如,约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸的长度。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如,主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、限制性肽或交联肽。在另一替代方案中,肽部分可以包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性的含有疏水性MTS的肽是具有下述氨基酸序列的RFGF:AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:11)。含有疏水性MTS的RFGF类似物(例如,氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:12))也可以是靶向部分。肽部分可是“递送性”肽,其可携带包括肽、寡核苷酸、及蛋白质在内的极性大分子跨越细胞膜。例如,已经发现,来自HIVTat蛋白质的序列(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:13))和来自果蝇触角足蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:14))能发挥递送肽的功能。肽或肽模拟物可由随机DNA序列编码,例如从噬菌体显示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定出来的肽(Lam etal.,Nature,354:82-84,1991)。通常,通过合并的单体单元而与dsRNA剂连系在一起的肽或肽模拟物是细胞靶向肽,例如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以是约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可具有结构性修饰,例如以增加稳定性或引导构象特性。可使用下文所述的任意结构性修饰。
用于本发明的组合物和方法的RGD肽可以是线性的或环状的,并且可以经修饰例如糖基化或甲基化以促进对一个或多个具体组织的靶向。含有RGD的肽和肽模拟物可包括D-氨基酸,以及合成的RGD模拟物。除了RGD之外,还可使用靶向整合素配体的其他部分。该配体的优选缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可用于靶向特定的细胞类型,例如肿瘤细胞,如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进dsRNA剂靶向多种其他组织的肿瘤,包括肺、肾、脾或肝(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8:783-787,2001)。通常,RGD肽有助于iRNA剂靶向肾脏。RGD肽可以是线性的或环状的,并且可以经修饰例如糖基化或甲基化以促进其靶向具体组织。例如,糖基化RGD肽可以将iRNA剂递送至表达αvβ3的肿瘤细胞(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞例如微生物细胞例如细菌或真菌细胞,或哺乳动物细胞例如人类细胞。微生物细胞渗透肽可以是,例如,α-螺旋线性肽(例如,LL-37或CeropinP1)、含二硫键的肽(例如,α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽(bactenecin))、或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如,PR-39或吲哚西丁(indolicidin))。细胞渗透肽还可包括核定位信号(NLS)。例如,细胞渗透肽可以是双向两亲性肽如MPG,其衍生自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
C.糖类缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施方案中,iRNA还包含糖类。如本文所述,缀合有糖类的iRNA有利于核酸的体内递送,且组合物适用于体内治疗用途。如本文所用,“糖类”是指化合物,其本身由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元(其可以是线性的、分支的或环状的),以及与键连至每个碳原子的氧、氮或硫原子所组成的化合物;或是具有糖类部分作为其一部分的化合物,该糖类部分由一个或多个具有至少六个碳原子的单糖单元(其可以是线性的、分支的或环状的)与键连至每个碳原子的氧、氮或硫原子所组成。代表性糖类包括糖(单糖、二糖、三糖及含有约4、5、6、7、8、或9个单糖单元的寡糖),以及多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5和以上(如,C5、C6、C7或C8)糖;二糖和三糖,其包括具有两个或三个单糖单元(如,C5、C6、C7或C8)的糖。
在某些实施方案中,糖类缀合物包含单糖。
在某些实施方案中,单糖是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。包含一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物被描述于例如US 8,106,022中,其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中,GalNAc缀合物被用作将iRNA靶向具体细胞的配体。在一些实施方案中,GalNAc缀合物将iRNA靶向肝脏细胞,例如,通过用作肝脏细胞(例如,肝细胞)的去唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一些实施方案中,糖类缀合物包含一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头例如二价或三价分支接头来附接。在一些实施方案中,GalNAc缀合物缀合至有义链的3′端。在一些实施方案中,GalNAc缀合物通过接头例如本文所述的接头缀合至iRNA剂(例如,缀合至有义链的3'端)。在一些实施方案中,GalNAc缀合物缀合至有义链的5'端。在一些实施方案中,GalNAc缀合物通过接头例如本文所述的接头缀合至iRNA剂(例如,缀合至有义链的5′端)。
在本发明的某些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头附接至本发明的iRNA剂。在一些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头附接至本发明的iRNA剂。在本发明的又一些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头附接至本发明的iRNA剂。在本发明的其他实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头附接至本发明的iRNA剂。
在某些实施方案中,本发明的双链RNAi剂包含一个附接至iRNA剂的GalNAc或GalNAc衍生物。在某些实施方案中,本发明的双链RNAi剂包含多(例如,2、3、4、5或6)个GalNAc或GalNAc衍生物,每个GalNAc或GalNAc衍生物通过多个单价接头独立地附接至双链RNAi剂的多个核苷酸上。
在一些实施方案中,例如,当本发明的iRNA剂的两条链是一个较大分子的一部分且通过一条链的3′端与另一条链的5′端之间的不间断的核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环时,该发夹环内的每个未配对核苷酸可独立包含通过单价接头附接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可由双链体的一条链的延伸突出形成。
在一些实施方案中,例如,当本发明的iRNA剂的两条链是一个较大分子的一部分且通过一条链的3′端与另一条链的5′端之间的不间断的核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环时,该发夹环内的每个未配对核苷酸可独立地包含通过单价接头附接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可由双链体的一条链的延伸突出形成。
在一些实施方案中,GalNAc缀合物是
Figure BDA0004014902130001101
在一些实施方案中,如以下方案所示,RNAi剂通过接头附接至糖类缀合物上,其中X是O或S
Figure BDA0004014902130001102
在一些实施方案中,如下所示,RNAi剂与如表1所定义的L96缀合:
Figure BDA0004014902130001103
在某些实施方案中,用于本发明的组合物和方法的糖类缀合物选自由以下所组成的组:
Figure BDA0004014902130001111
Figure BDA0004014902130001121
Figure BDA0004014902130001131
Figure BDA0004014902130001141
Figure BDA0004014902130001151
Figure BDA0004014902130001152
Figure BDA0004014902130001153
其中,Y是O或S并且n是3至6(式XXIV);
Figure BDA0004014902130001154
其中,Y是O或S并且n是3至6(式XXV);
Figure BDA0004014902130001155
Figure BDA0004014902130001161
其中,X是O或S(式XXVII);
Figure BDA0004014902130001162
Figure BDA0004014902130001163
Figure BDA0004014902130001171
Figure BDA0004014902130001181
在某些实施方案中,用于本发明组合物和方法的糖类缀合物是单糖。在某些实施方案中,所述单糖是N-乙酰半乳糖胺,例如
Figure BDA0004014902130001182
用于本文所述实施方案的另一种代表性糖类缀合物包括,但不限于,
Figure BDA0004014902130001183
当X或Y中的一个是寡核苷酸时,另一个是氢。
在一些实施方案中,合适的配体是WO 2019/055633中公开的配体,其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方案中,配体包含以下结构:
Figure BDA0004014902130001191
在某些实施方案中,本发明的RNAi剂可包括GalNAc配体,即使目前预计此类GalNAc配体对于本公开优选的鞘内/CNS递送途径的价值有限。
在本发明的某些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA剂连接。在一些实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA剂连接。在本发明的其他实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA剂连接。在本发明的其他实施方案中,GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头与本发明的iRNA剂连接。
在某些实施方案中,本发明的双链RNAi剂包含一个与iRNA剂连接的GalNAc或GalNAc衍生物,例如,连接到dsRNA剂的有义链的5'端或双重靶向RNAi剂的一条或两条有义链的5′端,如本文所述。在某些实施方案中,本发明的双链RNAi剂包含多个(例如,2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物,每个衍生物独立地通过多个单价接头连接到双链RNAi剂的多个核苷酸上。
在一些实施方案中,例如,当本发明的iRNA剂的两条链是一个较大分子的一部分且通过一条链的3′端与对应的另一条链的5'端之间的不间断的核苷酸链连接而形成包含多个未配对核苷酸的发夹环,该发夹环内的每个未配对核苷酸可独立地包含通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些实施方案中,糖类缀合物还包含如上所述的一个或多个另外的配体,例如但不限于,PK调节剂或细胞渗透肽。
适用于本发明的其他糖类缀合物和接头包括在WO 2014/179620和WO 2014/179627中所描述的那些,其各自的全部内容通过引用并入本文。
D.接头
在一些实施方案中,本文所述的缀合物或配体可以通过多种接头连接到iRNA寡核苷酸上,所述接头可以是可裂解的或不可裂解的。
术语“接头(linker)”或“连接基团(linking group)”意指将化合物的两个部分连结的有机部分,例如,将化合物的两个部分共价连接的有机部分。接头通常包含直接键或原子如氧或硫,单元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链,例如但不限于,取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基、取代的或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂环基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基,其中一个或多个亚甲基可被如下基团所中断或终止:O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的杂芳基、或取代的或未取代的杂环基;其中R8是氢、酰基、脂肪族或取代的脂肪族。在某些实施方案中,接头是约1至24个原子、2至24个原子、3至24个原子、4至24个原子、5至24个原子、6至24个原子、6至18个原子、7至18个原子、8至18个原子、7至17个原子、8至17个原子、6至16个原子、7至16个原子、或8至16个原子。
可裂解的连接基团在细胞外足够稳定,但在进入靶细胞时被裂解以释放被接头保持在一起的两个部分。在优选实施方案中,在靶细胞中或在第一参考条件(其可以是例如经选择以模拟或呈现细胞内的条件)下,相比于在受试者血液中或在第二参考条件(其可以是例如经选择以模拟或呈现血液或血清中所见的条件)下,可裂解的连接基团被裂解的速度快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更高、或至少约100倍。
可裂解的连接基团易受裂解剂的影响,例如pH、氧化还原电位或可降解分子的存在。通常,与在血清或血液中相比,裂解剂在细胞内更普遍或以更高的水平或活性存在。此类降解剂的实例包括:氧化还原剂,其被选择用于特定底物或其不具有底物特异性,包括例如细胞中存在的氧化酶、还原酶或还原剂如硫醇,其可通过还原作用降解可经氧化还原裂解的连接基团;酯酶;可产生酸性环境的核内体或剂,例如导致pH为5或更低的那些;可通过作为通用的酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可裂解的连接基团的酶。
可裂解的连接基团如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH为7.4,而细胞内的平均pH略低,其范围约为7.1至7.3。核内体具有酸性更强的pH,其范围约为5.5至6.0;而溶酶体甚至具有酸性更强的pH,约为5.0。一些接头将具有可裂解的连接基团,该连接基团在优选的pH发生裂解,从而将阳离子脂质从细胞内的配体释放出来或将该阳离子脂质释放进所期望的细胞区室内。
接头可包括可通过特定酶裂解的可裂解的连接基团。并入接头的可裂解的连接基团的类型可取决于将作为靶标的细胞。例如,肝脏靶向配体可通过包括酯基的接头与阳离子脂质连接。肝脏细胞富含酯酶,因此与不富含酯酶的细胞类型相比,该接头在肝细胞中被更有效地裂解。其他富含酯酶的细胞类型包括肺细胞、肾皮质细胞和睾丸细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型如肝脏细胞和滑膜细胞时,可使用含有肽键的接头。
通常,可通过测试降解剂(或条件)裂解候选连接基团的能力来评估候选的可裂解连接基团的适用性。还期望测试候选可裂解连接基团在血液中或当与其他非靶组织接触时的抵抗裂解的能力。因此,可测定第一条件与第二条件间的裂解相对敏感性,其中,选择第一条件以指示靶细胞中的裂解,而选择第二条件以指示其他组织或生物液体如血液或血清中的裂解。评估可在无细胞系统中、细胞中、细胞培养物中、器官或组织培养物中、或在完整动物体内进行。在无细胞或培养条件进行初始评估,并通过在完整动物体内的进一步评估进行证实,可能是有用的。在优选实施方案中,有用的候选化合物在细胞内(或在被选用以模拟细胞内条件的体外条件下)的裂解速度比在血液或血清中(或在被选用以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。i.可氧化还原裂解的连接基团
在某些实施方案中,可裂解的连接基团是在还原或氧化时被裂解的可经氧化还原裂解的连接基团。可经还原裂解的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。可参见本文中所述的方法来确定候选可裂解连接基团是否是合适的“可还原裂解的连接基团”或例如是否适用于与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用。例如,可通过使用本领域中的已知试剂将二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂与候选物一起孵育来评估候选物,其模拟在细胞如靶细胞中将会观察到的裂解速率。候选物也可在被选用以模拟血液或血清条件的条件下进行评估。在一个实施方案中,候选化合物在血液中至多被裂解约10%。在其他实施方案中,有用的候选化合物在细胞内(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解速度比在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)快至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。可使用标准酶动力学分析在被选择以模拟细胞内介质的条件下测定候选化合物的裂解速率,并将其与在被选择以模拟细胞外介质的条件下所测定的候选化合物的裂解速率进行比较。
ii.基于磷酸的可裂解连接基团
在某些实施方案中,可裂解的接头包含基于磷酸的可裂解连接基团。基于磷酸的可裂解连接基团是被降解或水解磷酸基团的剂所裂解。在细胞内裂解磷酸基团的剂的实例是酶如细胞内的磷酸酶。基于磷酸的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S。示例性的实施方案是-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-,其中Rk每次出现时可以独立地是C1-C20烷基、C1-C20卤代烷基、C6-C10芳基、或C7-C12芳烷基。在某些实施方案中,基于磷酸的连接基团是-O-P(O)(OH)-O-。可使用与上述方法类似的方法来评估这些候选物。
iii.酸可裂解的连接基团
在某些实施方案中,可裂解的接头包含酸可裂解的连接基团。酸可裂解的链接基团是在酸性条件下被裂解的连接基团。在优选实施方案中,酸可裂解的连接基团在pH为约6.5或更低(例如,约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中被裂解,或被剂例如可用作广义酸的酶所裂解。在细胞中,具体的低pH细胞器如核内体和溶酶体,可为酸可裂解的连接基团提供裂解环境。酸可裂解的连接基团的实例包括但不限于腙类、酯类、及氨基酸的酯类。酸可裂解的链接基团可具有通式-C=NN-、C(O)O、或-OC(O)。一个优选的实施方案是附接至酯(烷氧基)的氧的碳是芳基基团、经取代的烷基基团、或叔烷基基团如二甲基戊基或叔丁基。这些候选物可使用与上述方法类似的方法来评估。iv.基于酯的可裂解连接基团
在某些实施方案中,可裂解的接头包含基于酯的可裂解的连接基团。基于酯的可裂解的连接基团通过细胞中的酶例如酯酶或酰胺酶而被裂解。基于酯的可裂解的连接基团的实例包括但不限于亚烷基基团、亚烯基基团和亚炔基基团的酯类。酯可裂解的连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。这些候选物可使用与上述方法类似的方法来评估。
v.基于肽的可裂解连接基团
在另一实施方案中,可裂解的接头包含基于肽的可裂解连接基团。基于肽的可裂解连接基团通过细胞中的酶例如肽酶和蛋白酶而被裂解。基于肽的可裂解基团为在氨基酸之间形成的肽键以获得寡肽(例如二肽、三肽等)和多肽。基于肽的可裂解基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可在任意亚烷、亚烯或亚炔之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以获得肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的裂解基团通常被限于产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键),而不包括完整酰胺官能团。基于肽的可裂解连接基团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-,其中RA与RB是两个相邻氨基酸的R基团。这些候选物可使用与上述方法类似的方法来评估。
在一些实施方案中,本发明的iRNA通过接头与糖类缀合。本发明的组合物和方法中具有接头的iRNA糖类缀合物的非限制性实例包括,但不限于,
Figure BDA0004014902130001241
Figure BDA0004014902130001251
Figure BDA0004014902130001261
(式XLIV);当X或Y中的一个是寡核苷酸时,另一个是氢。
在本发明组合物和方法的某些实施方案中,配体是通过二价或三价分支接头所附接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰半乳糖胺)衍生物。
在某些实施方案中,本发明的dsRNA缀合至选自式(XLV)至式(XLVI)中的任一者所示结构的组的二价或三价分支接头:
Figure BDA0004014902130001262
其中:
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出现时独立地表示0至20,并且其中的重复单元可以是相同的或不同的;
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出现时各自独立地表示:不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O;
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出现时独立地表示:不存在、亚烷基、取代的亚烷基,其中一个或多个亚甲基可被如下一个或多个基团所中断或终止:O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R')=C(R”)、C≡C或C(O);
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时独立地表示:不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure BDA0004014902130001271
Figure BDA0004014902130001272
或杂环基;
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体,即,每次出现时各自独立地表示单糖(如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖、或多糖;且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物与RNAi剂合用对于抑制靶基因的表达是特别有用的,例如式(XLIX)的那些:
Figure BDA0004014902130001273
其中L5A、L5B和L5C表示单糖,如GalNAc衍生物。
合适的缀合GalNAc衍生物的二价和三价分支接头基团的实例包括但不限于,上文列举的如式II、式VII、式XI、式X、和式XIII所示的结构。
教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包括但不限于,美国专利第4,828,979号、第4,948,882号、第5,218,105号、第5,525,465号、第5,541,313号、第5,545,730号、第5,552,538号、第5,578,717号、第5,580,731号、第5,591,584号、第5,109,124号、第5,118,802号、第5,138,045号、第5,414,077号、第5,486,603号、第5,512,439号、第5,578,718号、第5,608,046号、第4,587,044号、第4,605,735号、第4,667,025号、第4,762,779号、第4,789,737号、第4,824,941号、第4,835,263号、第4,876,335号、第4,904,582号、第4,958,013号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,082,830号、第5,112,963号、第5,214,136号、第5,245,022号、第5,254,469号、第5,258,506号、第5,262,536号、第5,272,250号、第5,292,873号、第5,317,098号、第5,371,241号、第5,391,723号、第5,416,203号、第5,451,463号、第5,510,475号、第5,512,667号、第5,514,785号、第5,565,552号、第5,567,810号、第5,574,142号、第5,585,481号、第5,587,371号、第5,595,726号、第5,597,696号、第5,599,923号、第5,599,928号、第5,688,941号、第6,294,664号、第6,320,017号、第6,576,752号、第6,783,931号、第6,900,297号、第7,037,646号、第8,106,022号,每个专利的全部内容通过引用并入本文。
给定化合物的所有位置不需要统一地进行修饰,且事实上,可将超过一种的前述修饰并入单个化合物中或甚至并入iRNA的单个核苷处。本发明还包括作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中,“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物,优选是dsRNA剂,其包含两个或多个化学上不同的区域,每个区域由至少一个单体单元构成,即,在dsRNA化合物的情形中,该单体单元是核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区域,其中RNA被修饰以赋予iRNA:对核酸酶降解的抗性增加、细胞摄取增加、或与靶标核酸的结合亲和力增加。iRNA的另一区域可用作能裂解RNA:DNA杂交体或RNA:RNA杂交体的酶的底物。例如,RNase H是细胞核酸内切酶,其裂解RNA:DNA双链体的RNA链。因此,RNase H的激活导致RNA靶标的裂解,从而极大地提升了iRNA抑制基因表达的效率。因此,当使用嵌合dsRNA时,使用较短的iRNA可获得与使用与相同靶标区域杂交的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相当的结果。RNA靶标的裂解可通过凝胶电泳进行常规检测,且如果需要,可将凝胶电泳与本领域中已知的相关核酸杂交技术联合使用进行常规检测。
在某些情况下,iRNA的RNA可通过非配体基团进行修饰。已经将大量非配体分子缀合至iRNA以提高iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取,且执行此类缀合的过程是可在科技文献中获得的。此类非配体部分已经包括脂质部分,如胆固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61;Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)、胆酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)、硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan etal.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306;Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)、巯基胆固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20:533)、脂族链例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10:111;Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259:327;Svinarchuk etal.,Biochimie,1993,75:49)、磷脂例如双-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸三乙铵(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651;Shea et al.,Nucl.AcidsRes.,1990,18:3777)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan et al.,Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)、或金刚烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)、棕榈基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)、或十八烷基胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。教导此类RNA缀合物的制备的代表性美国专利已在上文中列出。典型的缀合方案涉及在序列的一个或多个位置带有氨基接头的RNA的合成。随后使用合适的偶联剂或激活剂将氨基基团与待缀合的分子反应。缀合反应可使用仍与固相支撑物结合的RNA来进行,或在RNA裂解后的溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常会得到纯的缀合物。
V.APOE基因敲除的体内测试
已经生成了人类APOE敲入小鼠模型,包括表达一种或多种人APOE亚型(APOE2、APOE3和APOE4)的转基因小鼠(参见,例如Trommer,et al.(2005)Neuroreport 15:2655-2658),且可以用于证明本文所提供的RNAi剂的体内功效。
也已生成了APOE相关神经退行性疾病(例如阿尔茨海默病)的小鼠模型,并且其可进一步用于证明本文所提供的RNAi剂的体内功效。此类模型可以将人APOE的一种或多种亚型的转基因表达与例如人淀粉样前体蛋白(APP)的组成型表达或诱导型表达(例如过表达)相结合,所述模型在一些情况下包含致病突变(例如瑞典突变(KM670/671NL))、人早老素1(PS1)的组成型表达或诱导型表达(例如过表达),在一些情况下包含致病突变(例如L166P)突变(参见例如Huynh,et al.(2017)Neuron 96:1013-1023)、和/或1N4R人tau蛋白的组成型表达或诱导型表达(例如过表达),在一些情况下包含致病突变(例如,P301S突变)(Shi,et al.(2017)Nature 549:523–527)。
VI.本公开的RNAi剂的递送
将本公开的RNAi剂递送至细胞,例如受试者体内的细胞,例如人类受试者(例如有此需要的受试者,例如患有APOE相关神经退行性疾病的受试者,所述APOE相关神经退行性疾病是例如淀粉样蛋白-β介导的疾病例如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病,或tau介导的疾病例如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART),或继发性tau蛋白病例如AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆)体内的细胞,可以通过多种不同方式来实现。例如,可以通过将细胞与本公开的RNAi剂在体外或体内接触来实施递送。体内递送也可通过将包含RNAi剂(例如dsRNA)的组合物施用至受试者来直接实施。或者,体内递送可通过施用编码并引导RNAi剂的表达的一种或多种载体来间接实施。这些替代方案会在下文中进一步讨论。
通常,任何递送核酸分子的方法(体外或体内)都可以适用于与本公开的RNAi剂一起使用(参见例如Akhtar S.and Julian RL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144及WO94/02595,其全部内容通过引用整体并入本文)。对于体内递送,为了递送RNAi剂,需要考虑的因素包括,例如,所递送剂的生物稳定性、非特异性效应的预防以及所递送剂在靶组织中的积累。通过局部施用(例如通过直接注射或植入组织或局部施用制剂)可以最小化RNAi剂的非特异性作用。对治疗部位的局部施用使该剂的局部浓度最大化,限制了该剂与全身组织的接触,否则全身组织会被该剂损害或使该剂降解,并允许施用较低的RNAi剂总剂量。若干项研究表明,当局部施用RNAi剂时,成功地敲除了基因产物。例如,通过在食蟹猴中的玻璃体内注射(Tolentino,MJ.et al.,(2004)Retina 24:132-138)和在小鼠的中的视网膜下注射(Reich,SJ.et al.(2003)Mol.Vis.9:210-216)进行的VEGF dsRNA的眼内递送都显示出在年龄相关性黄斑变性的实验模型中能预防新血管的形成。此外,在小鼠中直接瘤内注射dsRNA减少了肿瘤体积(Pille,J.et al.(2005)Mol.Ther.11:267-274)并可以延长荷瘤小鼠的存活时间(Kim,WJ.et al.,(2006)Mol.Ther.14:343-350;Li,S.et al.,(2007)Mol.Ther.15:515-523)。通过直接注射来局部递送至CNS的RNA干扰(Dorn,G.et al.,(2004)Nucleic Acids 32:e49;Tan,PH.et al.(2005)Gene Ther.12:59-66;Makimura,H.et a.l(2002)BMC Neurosci.3:18;Shishkina,GT.,et al.(2004)Neuroscience 129:521-528;Thakker,ER.,et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275;Akaneya,Y.,et al.(2005)J.Neurophysiol.93:594-602)和通过鼻内施用递送至肺部的RNA干扰(Howard,KA.et al.,(2006)Mol.Ther.14:476-484;Zhang,X.et al.,(2004)J.Biol.Chem.279:10677-10684;Bitko,V.et al.,(2005)Nat.Med.11:50-55)也都已经显示成功。为了全身性施用RNAi剂以治疗疾病,可以修饰RNA或使用药物递送系统递送RNA;这两种方法都可以防止体内核酸内切酶和核酸外切酶对dsRNA的快速降解。RNA的修饰或药物载体也可允许将RNAi剂靶向到靶组织并避免不希望的脱靶效应(例如,不希望被理论束缚,如本文所述的GNA的使用已经被确认会使dsRNA的种子区域不稳定,导致这种dsRNA相对于脱靶效应的对命中靶标有效性的偏好增强,因为此类种子区域的不稳定会显著减弱这种脱靶效应)。RNAi剂可以通过与亲脂性基团如胆固醇的化学结合来进行修饰,以增强细胞摄取并防止降解。例如,将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的RNAi剂经全身性注射至小鼠体内,而导致肝脏和空肠中的apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432:173-178)。在小鼠前列腺癌模型中,RNAi剂与适体的结合已经显示出能抑制肿瘤生长和介导肿瘤消退(McNamara,JO.et al.,(2006)Nat.Biotechnol.24:1005-1015)。在另一实施方案中,RNAi剂可使用药物递送系统如纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体、或阳离子递送系统来进行递送。带正电荷的阳离子递送系统促进分子RNAi剂(带负电荷)的结合,并且还增强带在负电荷的细胞膜上的相互作用,以允许细胞有效摄取RNAi剂。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可以与RNAi剂结合或被诱导以形成封装有RNAi剂的囊泡或胶束(参见例如Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2):107-116)。当进行全身性施用时,囊泡或胶束的形成进一步防止了RNAi剂的降解。制备和施用阳离子-RNAi剂复合体的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327:761-766;Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9:1291-1300;Arnold,AS et al.(2007)J.Hypertens.25:197-205,其全部内容通过引用并入本文)。可用于RNAi剂的全身性递送的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen,DR.,etal(2003),同上;Verma,UN.et al.,(2003),同上)、Oligofectamine、“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441:111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12:321-328;Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16电子优先发布;Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)和聚酰胺-胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67;Yoo,H.etal.,(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方案中,RNAi剂与环糊精形成用于全身性施用的复合体。施用RNAi剂和环糊精的方法和RNAi剂和环糊精的药物组合物可见于美国专利第7,427,605号,其全部内容通过引用并入本文。
本公开的某些方面涉及减少APOE靶基因在细胞中表达的方法,所述方法包括使所述细胞与本公开的双链RNAi剂接触。在一个实施方案中,所述细胞是肝脏细胞(hepaticcell),任选地是肝细胞(hepatocyte)。在一个实施方案中,所述细胞是肝外细胞,任选地是CNS细胞。
本公开的另一方面涉及减少APOE靶基因在受试者中表达的方法,所述方法包括向受试者施用本公开的双链RNAi剂。
本公开的另一方面涉及治疗患有APOE相关神经退行性疾病的受试者的方法,所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的双链RNAi剂,从而治疗受试者。可通过本公开的方法治疗的示例性CNS病症包括淀粉样β-介导的疾病例如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病,以及tau-介导的疾病例如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART),以及继发性tau蛋白病例如AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。在一个实施方案中,双链RNAi剂是皮下施用的。
在一个实施方案中,双链RNAi剂是鞘内施用的。通过鞘内施用双链RNAi剂,所述方法可以减少APOE靶基因在脑(例如纹状体)或脊柱组织(例如皮质、小脑、颈椎、腰椎和胸椎)中的表达。
为了便于说明,本节中的制剂、组合物和方法主要针对经修饰的siRNA化合物进行讨论。。然而,可以理解的是,这些制剂、组合物和方法可以用其他siRNA化合物,例如未修饰的siRNA化合物来实施,并且这种实施在本公开的范围内。包含RNAi剂的组合物可以通过多种途径递送给受试者。示例性的途径包括:鞘内、静脉内、局部、直肠、肛门、阴道、鼻、肺和眼。
本发明的RNAi剂可以掺入到适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包括一种或多种RNAi剂和药学上可接受的载体。如本文所用,术语“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和剂用于药物活性物质的用途是本领域公知的。除非任何常规介质或剂与活性化合物不相容,其在组合物中的用途是可以预期的。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。
本发明的药物组合物可以以多种方式施用,这取决于是否需要局部或全身性治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼部、阴道、直肠、鼻内、透皮)、口服或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉滴注,皮下、腹膜内或肌肉注射,或鞘内或脑室内施用。
可以选择施用途径和施用部位以增强靶向性。例如,为了靶向肌肉细胞,对感兴趣的肌肉进行肌内注射将是合乎逻辑的选择。可以通过施用气雾剂形式的RNAi剂来靶向肺细胞。可以通过用RNAi剂涂覆球囊导管并机械地引入RNA来靶向血管内皮细胞。
用于局部施用的制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体,水性、粉末或油性基质,增稠剂等可能是必需的或可取的。涂层的安全套、手套等也可以是有用的。
用于口服施用的组合物包括粉末或颗粒、悬浮剂或水溶液、糖浆、酏剂或非水介质、片剂、胶囊、糖锭或锭剂。在片剂的情况下,可使用的载体包括乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。各种崩解剂如淀粉和润滑剂如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石粉通常被用于片剂中。对于胶囊形式的口服施用,有用的稀释剂是乳糖和高分子量聚乙二醇。当口服使用需要水性悬浮液时,核酸组合物可以与乳化剂和悬浮剂结合。如果需要,可以加入某些甜味剂或调味剂。
用于鞘内或脑室内施用的组合物可以包括无菌水溶液,其也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。
用于肠胃外施用的制剂可以包括无菌水溶液,其也可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。脑室内注射可以通过例如连接在储液器上的脑室导管来实现。对于静脉内使用,可以控制溶质的总浓度以使制剂等渗。
在一个实施方案中,siRNA化合物(例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物)、组合物的施用是肠胃外施用,例如静脉内(例如,作为弹丸式输注或作为可扩散的输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、脑室内、颅内、皮下、经粘膜、经颊、舌下、内窥镜、直肠、口服、阴道、局部、肺、鼻内、尿道或眼部施用。施用可以由该受试者或另一个人例如健康护理提供者来提供。药物可以按计量的剂量提供,也可以在提供计量剂量的分配器中提供。下文将更详细地讨论选定的递送模式。
鞘内施用。
在一个实施方案中,双链RNAi剂通过鞘内注射来递送(即,注射到让脑和脊髓组织沐浴其中的脊髓液中)。将RNAi剂鞘内注射到脊髓液中可以通过弹丸式输注或通过可植入皮下的微型泵进行,以将siRNA定期且持续的递送到脊髓液中。脊髓液的循环从产生脊髓液的脉络膜丛开始,沿着脊髓和背根神经节向下,然后向上经过小脑,越过皮质,到达蛛网膜颗粒,在此处,脊髓液可以离开中枢神经系统,即,根据注射化合物的大小、稳定性和溶解性,鞘内递送的分子可以击中遍布整个中枢神经系统的靶标。
在一些实施方案中,鞘内施用是通过泵进行的。该泵可以是外科植入的渗透泵。在一个实施方案中,该渗透泵被植入脊椎管的蛛网膜下腔,以便于鞘内施用。
在一些实施方案中,鞘内施用是通过用于药物的鞘内递送系统来进行的,该鞘内递送系统包括包含一定体积药剂的储器和配置为递送包含在该储器中的一部分药剂的泵。关于该鞘内递送系统的更多细节可见于WO 2015/116658,该文献的全部内容通过引用并入本文。
鞘内注射的RNAi剂的量可因靶基因的不同而不同,并且需要针对每个靶基因分别确定施用的适当剂量。通常,该量的范围为10μg至2mg,优选为50μg至1500μg,更优选为100μg至1000μg。
编码本公开的RNAi剂的载体
靶向APOE基因的RNAi剂可从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见,例如Couture,A,et al.,TIG.(1996),12:5-10、WO 00/22113、WO 00/22114以及US 6,054,299)。根据所使用的具体构建体和靶组织或细胞类型,表达优选是持续的(数月或更久)。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体而引入,其可以是整合载体或非整合载体。也可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒而遗传(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1292)。
RNAi剂的单个链或多个链可以从表达载体上的启动子转录。当要表达两条分别的链以产生例如dsRNA时,可以将两个分别的表达载体共导入(例如,通过转染或感染)靶细胞。或者,dsRNA的每条单独的链可以被位于同一表达质粒上的启动子转录。在一个实施方案中,将dsRNA表达为由接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸,使得dsRNA具有茎和环结构。
RNAi剂表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体,优选与脊椎动物细胞相容的那些表达载体,可用于产生重组构建体,以用于表达如本文所述的RNAi剂。RNAi剂表达载体的递送可以是全身性的,例如通过静脉内或肌肉内施用,通过施用于从患者体内取出的靶细胞,然后再将该靶细胞导入患者体内,或通过任何其他允许导入所需靶细胞的方式导入患者体内。
可用于本文所述方法和组合物的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体;(b)逆转录病毒载体,包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等;(c)腺相关病毒载体;(d)单纯疱疹病毒载体;(e)SV 40载体;(f)多瘤病毒载体;(g)乳头瘤病毒载体;(h)小核糖核酸病毒载体;(i)痘病毒载体,例如天花,例如牛痘病毒载体或禽类痘病毒如金丝雀痘或鸡痘病毒载体;以及(j)辅助依赖型腺病毒或裸腺病毒。复制缺陷型病毒也可能是有利的。不同的载体将并入或不并入细胞的基因组中。如果必要,构建体可包括用于转染的病毒序列。或者,可将构建体并入到能进行附加型复制(episomal replication)的载体如EPV载体和EBV载体中。用于RNAi剂的重组表达的构建体通常将会需要调控元件,例如启动子、增强子等,以确保RNAi剂在靶细胞中的表达。对于载体和构建体需考虑的其他方面是本领域中已知的。
VII.本发明的药物组合物
本公开还包括包含本公开的RNAi剂的药物组合物和制剂。在一个实施方案中,本文提供了包含如本文所述的RNAi剂和药学上可接受的载体的药物组合物。含有RNAi剂的药物组合物可用于治疗与APOE的表达或活性相关的疾病或病症,例如APOE相关的神经退行性疾病,例如淀粉样蛋白-β介导的疾病例如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病,tau介导的疾病例如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART),或继发性tau蛋白病如AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
这种药物组合物是根据递送方式来配制的。一个实例是配制用于通过肠胃外递送(例如通过静脉内(IV)、肌内(IM)或皮下(subQ)递送)全身性施用的组合物。另一个实例是配制用于直接递送至CNS的组合物,例如通过鞘内或玻璃体内注射途径,任选地通过输注至脑(例如纹状体),例如通过连续泵输注至脑。
在一些实施方案中,本发明的药物组合物是去热原的或无热原的。
本发明的药物组合物可以以足以抑制APOE基因表达的剂量施用。通常,本公开的RNAi剂的合适剂量将为每天约0.001至约200.0毫克每公斤受体体重的范围,通常为每天约1mg至50mg每公斤体重的范围。
重复剂量的给药方案可包括定期施用治疗量的RNAi剂,例如每月一次至每六个月一次。在某些实施方案中,约每季度一次(即约每三个月施用一次)至约每年两次施用RNAi剂。
在初始治疗方案(例如,速效剂量)之后,可以以较低的频率进行治疗。
在其他实施方案中,单剂量的药物组合物可以是长效的,使得后续剂量以不超过1、2、3或4个月或更多个月的间隔来施用。在本公开的一些实施方案中,每月施用一次单剂量的本公开的药物组合物。在本公开的其他实施方案中,每季度施用一次至每年施用两次单剂量的本公开的药物组合物。
本领域技术人员将会理解,某些因素会影响有效治疗受试者所需的剂量和时间,包括但不限于疾病或病症的严重程度、既往治疗、受试者的总体健康状况或年龄、以及目前患有的其他疾病。此外,使用治疗有效量的组合物对受试者的治疗可以包括单次治疗或一系列治疗。
小鼠遗传学的进展已经产生了许多小鼠模型,以用于研究将受益于APOE表达的减少的各种APOE相关的神经退行性疾病。此类模型可用于RNAi剂的体内测试,以及用于确定治疗有效剂量。合适的小鼠模型是本领域已知的,包括例如本文别的部分所述的小鼠模型。
根据是否需要局部治疗或全身性治疗以及待治疗的区域,本公开的药物组合物可以多种方式施用。施用可以是局部的(例如,通过透皮贴剂),肺的(例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂,包括通过雾化器);气管内、鼻内、表皮和透皮、口服或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注;皮下施用,例如通过植入装置;或颅内施用,例如通过脑实质内、鞘内或脑室内施用。
RNAi剂可以以靶向具体组织(例如肝脏、CNS(例如脑的神经元组织、神经胶质组织或血管组织),或肝脏和CNS两者)的方式递送。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规药物载体,水性、粉末或油性基质,增稠剂等可能是必需的或可取的。涂层的安全套、手套等也是有用的。合适的局部制剂包括那些其中本公开中所述的RNAi剂与局部递送剂如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的。合适的脂质和脂质体包括中性的(例如二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如二油酰四甲氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开中描述的RNAi剂可以被封装在脂质体内,或者可以与脂质体形成复合体,特别是与阳离子脂质体形成复合体。或者,RNAi剂可以与脂质复合,特别是与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单甘油油酸酯、二甘油月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如异丙基肉豆蔻酸酯IPM)、单甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。在US 6,747,014中有详细描述了局部制剂,该专利通过引用并入本文。
A.包含膜分子组件的RNAi剂制剂
用于本公开的组合物和方法中的RNAi剂可以被配制为在膜分子组件(例如脂质体或胶束(micelle))中递送。如本文所用,术语“脂质体”是指包含排列在至少一个双层(例如一个双层或多个双层)中的两亲性脂质的囊泡。脂质体包括具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层囊泡和多层囊泡。水性部分包含RNAi剂组合物。亲脂性材料将水性内部与水性外部隔开,水性外部通常不包含RNAi剂组合物,尽管在一些实施方案中,其可以包含RNAi剂组合物。脂质体可用于将活性成分转移和递送至作用部位。因为脂质体膜结构上类似于生物膜,当将脂质体应用于组织时,脂质体双层与细胞膜的双层发生融合。随着脂质体和细胞融合的进行,包含RNAi剂的内部水性内容物被递送到细胞中,在细胞中RNAi剂可以特异性结合靶RNA并可以介导RNAi。在一些情况下,脂质体也是特异性靶向的,例如,将RNAi剂引导至特定的细胞类型。
含有RNAi剂的脂质体可以通过多种方法来制备。在一个实例中,脂质体的脂质成分在去污剂中溶解,从而脂质成分形成胶束。例如,脂质成分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。去污剂可以具有高临界胶束浓度,并且可以是非离子的。示例性的去污剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将RNAi剂制品加入到包含脂质成分的胶束中。脂质上的阳离子基团与RNAi剂相互作用,并在RNAi剂周围缩合形成脂质体。缩合后,例如通过透析去除去污剂,以得到RNAi剂的脂质体制剂。
如果需要,可以在缩合反应过程中添加有助于缩合的载体化合物,例如通过受控的添加。例如,载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。pH值也可以调整以利于缩合。
用于产生稳定的引入多核苷酸/阳离子脂质复合体作为递送媒介物的结构成分的多核苷酸递送媒介物的方法在例如WO 96/37194中进一步进行了描述,该文献的全部内容通过引用并入本文。脂质体的形成也可以包括在以下文献中描述的示例性方法的一个或多个方面:Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417;UnitedStates Patent No.4,897,355;United States Patent No.5,171,678;Bangham et al.,(1965)M.Mol.Biol.23:238;Olson et al.,(1979)Biochim.Biophys.Acta557:9;Szoka etal.,(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75:4194;Mayhew et al.,(1984)Biochim.Biophys.Acta775:169;Kim et al.,(1983)Biochim.Biophys.Acta 728:339;以及Fukunaga et al.,(1984)Endocrinol.115:757.。用于制备用作递送媒介物的适当大小的脂质聚集体的常用技术包括超声处理和冻融加挤压(Mayer et al.,(1986)Biochim.Biophys.Acta858:161.。当需要一致小的(50nm至200nm)和相对均匀的聚集体时,可以使用微流化(Mayhew et al.,(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169。这些方法很容易适用于将RNAi剂制剂包装到脂质体中。
脂质体分为两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体,它与带负电荷的核酸分子相互作用形成稳定的复合体。带正电荷的核酸/脂质体复合体与带负电荷的细胞表面结合,并被内化到内体中。由于内体内的酸性pH,脂质体破裂,将其内容物释放到细胞质中(Wang et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147:980-985)。
pH敏感的脂质体或带负电荷的脂质体捕获核酸而不是与核酸复合。因为核酸和脂质都带相似的电荷,所以发生排斥而不形成复合体。然而,一些核酸被截留在这些脂质体的水性内部。pH敏感的脂质体已被用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养中的细胞单层。在靶细胞中检测外源基因的表达(Zhou et al.(1992)Journal of ControlledRelease,19:269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包括除天然来源的磷脂酰胆碱以外的磷脂。例如,中性脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成,而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)例如大豆PC和鸡蛋PC形成。另一种由磷脂或磷脂酰胆碱或胆固醇的混合物形成。
将脂质体引入体外和体内细胞的其他方法的实例包括美国专利号5,283,185;美国专利号5,171,678;WO 94/00569;WO 93/24640;WO 91/16024;Felgner,(1994)J.Biol.Chem.269:2550;Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307;Nabel,(1992)Human Gene Ther.3:649;Gershon,(1993)Biochem.32:7143;以及Strauss,(1992)EMBOJ.11:417。
还检测了非离子脂质体系统以确定其在将药物递送至皮肤中的效用,特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包含NovasomeTM I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTM II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将环孢菌素-A递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明这种非离子脂质体系统能有效促进环孢菌素A在皮肤的不同层的沉积(Hu et al.,(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6):466)。
脂质体还包括“空间稳定的”脂质体,如本文所用,该术语是指包含一种或多种特定脂质的脂质体,当该特定脂质被纳入脂质体时,其导致相对于缺乏这种特定脂质的脂质体的循环寿命延长。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体的囊泡形成脂质部分的一部分(A)包含一种或多种糖脂如单唾液酸神经节苷脂GM1,或(B)由一种或多种亲水聚合物如聚乙二醇(PEG)部分衍生化。虽然不希望被任何具体理论所束缚,但业内认为,至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生化的脂质的空间稳定的脂质体,这些空间稳定的脂质体的循环半衰期的延长是由于网状内皮系统(RES)的细胞摄取减少所致(Allen et al.,(1987)FEBSLetters,223:42;Wu et al.,(1993)Cancer Research,53:3765)。
包含一种或多种糖脂的多种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507:64)报道了单唾液酸神经节苷脂GM1、半乳糖脑苷脂硫酸盐和磷脂酰肌醇改善脂质体血液半衰期的能力。Gabizon等人对这些发现进行了阐述(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85,:6949)。Allen等人的美国专利第4,837,028号和WO 88/04924公开了包含(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或半乳糖脑苷脂硫酸酯的脂质体。美国专利第5,543,152号(Webb等人)公开了包含鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等人)公开了包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
在一个实施方案中,使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够融合到细胞膜上的优势。非阳离子脂质体虽然不能有效地与质膜融合,但能在体内被巨噬细胞吸收,并可用于将RNAi剂递送至巨噬细胞。
脂质体的其他优势包括:从天然磷脂获得的脂质体是生物相容的和可生物降解的;脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物;脂质体可以保护其内部隔室中封装的RNAi剂免于代谢和降解(Rosoff,in"Pharmaceutical Dosage Forms,"Lieberman,Rieger和Banker(Eds.),1988,volume 1,p.245)。在脂质体制剂的制备中,重要的考虑因素是脂质体的脂质表面电荷、囊泡大小和含水体积。
带正电荷的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成自发地与核酸相互作用以形成脂质-核酸复合体的小脂质体,该复合体能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合,从而递送RNAi剂(参见,例如,Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417,以及美国专利第4,897,355号中对DOTMA及其与DNA的应用的描述)。
DOTMA类似物1,2-二(油酰基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用,以形成DNA复合囊泡。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md)是有效的用于将高阴离子核酸递送至活组织培养细胞的剂,其包含自发地与带负电荷的多核苷酸发生相互作用以形成复合体的带正电荷的DOTMA脂质体。当使用足够的带正电荷的脂质体时,所得复合体上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电荷的复合体自发地附着到带负电荷的细胞表面,与质膜融合,并有效地将功能性核酸递送到例如组织培养细胞中。另一种市售的阳离子脂质1,2-二(油酰基氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)与DOTMA的不同之处在于油酰基部分通过酯而不是醚键连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包括已经与多个部分结合的那些,包括例如已经与两种类型的脂质之一缀合的羧基精胺,并且包括诸如5-羧基鲸蜡酰甘氨酸二辛酰基酰胺(5-carboxyspermylglycine dioctaoleoylamide,“DOGS”)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)和二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基鲸蜡酰酰胺(“DPPES”)(参见例如美国专利第5,171,678号)的化合物。
另一种阳离子脂质缀合物包括用胆固醇(“DC-Chol”)衍生化脂质,其已与DOPE组合配制成脂质体(参见,Gao,X和Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179:280)。据报道,通过将多聚赖氨酸与DOPE缀合而制备的脂多聚赖氨酸在血清存在下对转染是有效的(Zhou,X.et al.,(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065:8)。对于某些细胞系,据说这些含有缀合阳离子脂质的脂质体比含有DOTMA的组合物表现出了更低的毒性并提供了更有效的转染。其他市售阳离子脂质产品包括DMRIE和DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)和Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。在WO 98/39359和WO 96/37194中描述了适合用于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质。
脂质体制剂特别适合用于局部施用,与其他制剂相比,脂质体有几个优点。这些优点包括减少了与所施用药物的高全身吸收相关的副作用、增加了所施用药物在所需目标的累积、以及能够将RNAi剂施用到皮肤中的能力。在一些实施方式中,脂质体被用于将RNAi剂递送至表皮细胞,并且还被用于增强RNAi剂到真皮组织例如到皮肤的渗透。例如,脂质体可以局部应用。已有文献记载了将配制成脂质体的药物局部递送至皮肤(参见,例如Weineret al.,(1992)Journal of Drug Targeting,vol.2,405-410和du Plessis et al.,(1992)Antiviral Research,18:259-265;Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniques 6:682-690;Itani,T.et al.,(1987)Gene 56:267-276;Nicolau,C.et al.(1987)Meth.Enzymol.149:157-176;Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101:512-527;Wang,C.Y.and Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:7851-7855)。
还检测了非离子脂质体系统以确定其在将药物递送至皮肤中的效用,特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和Novasome II(甘油二硬脂酸酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂被用于将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。此类含有RNAi剂的制剂可用于治疗皮肤病症。
包含RNAi剂的脂质体可以被制成高度可变形的。这种可变形性能够使脂质体穿透小于脂质体平均半径的孔。例如,传递体是一种可变形的脂质体。传递体可以通过向标准脂质体组合物中加入表面边缘活化剂(通常是表面活性剂)来制备。可以例如通过感染的皮下递送来递送包含RNAi剂的传递体,以将RNAi剂递送至皮肤中的角质化细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤,在合适的透皮梯度的影响下,脂质囊泡必须穿过一系列的每个直径均小于50nm的细孔。此外,由于脂质特性,这些传递体可以自我优化(适应毛孔的形状,例如在皮肤中)、自我修复、以及可以经常到达它们的靶标而不破碎、以及经常自我装载。
适用于本公开的其他制剂描述于提交于2008年1月2日的美国临时申请第61/018,616号;提交于2008年1月2日的美国临时申请第61/018,611号;提交于2008年3月26日的美国临时申请第61/039,748号;提交于2008年4月22日的美国临时申请第61/047,087号,以及提交于2008年5月8日的美国临时申请第61/051,528号。提交于2007年10月3日的PCT申请号PCT/US2007/080331也描述了适用于本公开的制剂。
传递体是另一种类型的脂质体,是高度可变形的脂质聚集体,是药物递送载体的有吸引力的候选物。传递体可以被描述为高度可变形的脂滴,它们很容易穿过比液滴更小的孔。传递体可适应使用它们的环境,例如,它们是自我优化的(适应皮肤毛孔的形状)、自我修复的、经常到达它们的靶标而不破裂、以及经常是自我装载的。为了制备传递体,可以向标准脂质体组合物中加入表面边缘活化剂(通常是表面活性剂)。传递体已被用于将血清白蛋白递送至皮肤。已经证明传递体介导的血清白蛋白的递送与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂在诸如那些本文所述的制剂中有广泛的应用,特别是在乳液(包括微乳液)和脂质体中。对许多不同类型的表面活性剂(天然的和合成的)的性质进行分类和排序的最常见方法是使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也被称为“头”)的性质为对制剂中使用的不同表面活性剂进行分类提供了最有用的方法(Rieger,in PharmaceuticalDosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果表面活性剂分子没有离子化,它被归类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂广泛应用于药物和化妆品中,并且可以在很宽的pH值的范围中使用。通常,它们的HLB值的范围为2至约18,取决于它们的结构。非离子表面活性剂包括非离子酯,例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚,例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇以及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包括在这一类中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类中最受欢迎的成员。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有负电荷,则表面活性剂被归类为阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂包括羧酸酯如肥皂、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯、磺酸酯如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯,以及磷酸酯。阴离子表面活性剂类中最重要的成员是烷基硫酸酯和肥皂。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带正电荷,则表面活性剂被归类为阳离子表面活性剂。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是这一类中最常用的成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力,则表面活性剂被归类为两性表面活性剂。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
已经对表面活性剂在药物产品、制剂和乳液中的应用进行了综述(Rieger,inPharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用于本公开的方法的RNAi剂也可以以胶束制剂的形式提供。“胶束”在本文中被定义为一种特殊类型的分子组装体,其中两亲性分子以球形结构排列使得分子的所有疏水部分都指向内部,留下亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的,则存在相反的排列。
通过将siRNA组合物的水溶液、碱金属C8-C22烷基硫酸盐和胶束形成化合物混合,可以制备适于通过透皮膜递送的混合胶束制剂。示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油(evening of primrose oil)、薄荷醇、三羟基氧代胆酰基甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、及它们的混合物。可以在添加碱金属烷基硫酸盐的同时或之后添加胶束形成化合物。基本上任何种类的成分混合都会形成混合胶束,但剧烈混合是为了提供更小尺寸的胶束。
在一种方法中,制备包含siRNA组合物和至少碱金属烷基硫酸盐的第一胶束组合物。然后将第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合,形成混合的胶束组合物。在另一种方法中,通过将siRNA组合物、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成化合物混合,然后在剧烈混合下加入剩余的胶束形成化合物来制备胶束组合物。
可以将苯酚或间甲酚加入到混合的胶束组合物中,以稳定制剂并防止细菌生长。或者,苯酚或间甲酚可以与胶束形成成分一起加入。在混合的胶束组合物形成后,也可以加入等渗剂如甘油。
为了将胶束制剂以喷雾剂的形式递送,可以将该制剂放入气雾剂分配器中,并向该分配器中装入推进剂。处于压力下的推进剂在分配器中处于液态形式。调整各成分的比例,使水相和推进剂相成为一个相,即只有一个相。如果有两个相,在分配一部分内容物之前,必须摇动分配器,例如通过计量阀。药剂的分配剂量以细喷雾的形式从计量阀中喷出。
推进剂可以包括含氢的氯氟化碳、含氢的碳氟化合物、二甲醚和乙醚。在某些实施方案中,可以使用HFA 134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
必需成分的具体浓度可以通过相对简单的实验来确定。对于通过口腔的吸收,通常需要将通过注射或通过胃肠道给药的剂量增加例如至少两倍或三倍。
脂质颗粒
RNAi剂,例如本公开中的dsRNA,可以完全被封装在脂质制剂中,例如LNP或其他核酸-脂质颗粒中。
如本文所用,术语“LNP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP通常包含阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如,PEG-脂质缀合物)。LNP对于全身性应用极其有用,因为它们在静脉内(i.v.)注射后表现出了延长的循环寿命,并在远端部位(例如,与给药部位物理分离的部位)积累。LNP包括“pSPLP”,其包括如WO 00/03683中所述的封装的缩合剂-核酸复合体。本公开的颗粒通常具有约50nm至约150nm、更通常约60nm至约130nm、更通常约70nm至约110nm、最通常约70nm至约90nm的平均直径,并且是基本上无毒的。此外,当核酸存在于本公开的核酸-脂质颗粒中时,其在水溶液中能抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒及其制备方法公开于例如美国专利号5,976,567;5,981,501;6,534,484;6,586,410;6,815,432;美国专利公布号2010/0324120和WO 96/40964。
在一个实施方案中,脂质与药物的比例(质量/质量比)(例如,脂质与dsRNA的比例)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3∶:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围。上述范围的中间范围也被认为是本公开的一部分。
本领域中已经描述了用于递送RNAi剂的某些具体LNP制剂,包括例如在WO 2008/042973中描述的“LNP01”制剂,该文献通过引用并入本文。
下表列出了其他示例性脂质-dsRNA制剂。
Figure BDA0004014902130001471
Figure BDA0004014902130001481
Figure BDA0004014902130001491
DSPC:二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC:二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG:PEG-二双肉豆蔻酰甘油(C14-PEG,或PEG-C14)(平均摩尔质量为2000的PEG)
PEG-DSG:PEG-联苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(平均摩尔质量为2000的PEG)
PEG-cDMA:PEG-氨基甲酰-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙胺(平均摩尔质量为2000的PEG)
包含SNALP(1,2-二亚油烯基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))的制剂描述于WO 2009/127060中,该文献通过引用并入本文。
包含XTC的制剂描述于WO 2010/088537中,其全部内容通过引用并入本文。
包含MC3的制剂描述于例如美国专利公布号2010/0324120中,其全部内容通过引用并入本文。
包含ALNY-100的制剂描述于WO 2010/054406中,其全部内容通过引用并入本文。
包含C12-200的制剂描述于WO 2010/129709中,其全部内容通过引用并入本文。
用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒(granule)、微粒、纳米颗粒、水或非水介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小袋、片剂或微型片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可能是需要的。在一些实施方案中,口服制剂是其中将本公开所述的dsRNA与一种或多种渗透增强剂表面活性剂和螯合剂联合施用的那些制剂。合适的表面活性剂包括脂肪酸或其酯或其盐、胆汁酸或其盐。合适的胆汁酸/盐包括鹅去氧胆酸(CDCA)和熊去氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholic acid)、甘氨胆酸(glycholic acid)、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠和甘氨二氢夫西地酸钠。合适的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单甘油油酸酯、二甘油月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或单甘油酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如钠)。在一些实施方案中,使用渗透增强剂的组合,例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。一种示例性的组合是癸酸、UDCA和月桂酸的钠盐。其他渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本公开所述的dsRNA可以口服递送,以包括喷雾干燥颗粒在内的颗粒形式,或者复合形成微粒或纳米颗粒。dsRNA复合剂包括聚氨基酸;聚亚胺;聚丙烯酸酯;聚烷基丙烯酸酯、聚氧杂环丁烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷酯;阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉;聚氰基丙烯酸烷酯;DEAE衍生的聚亚胺、普鲁兰多糖(pollulan)、纤维素和淀粉。合适的络合剂包括壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫代二乙氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如P-氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-葡聚糖、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、藻酸盐和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂及其制备详细描述于美国专利6,887,906、U.S.2003/0027780和美国专利号6,747,014,这些专利均通过引用并入本文。
用于肠胃外、脑实质内(进入大脑)、鞘内、脑室内或肝内施用的组合物和制剂可以包括无菌水溶液,所述无菌水溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂,例如但不限于渗透增强剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本公开的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生,包括但不限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体。特别优选的是在治疗APP相关疾病或病症时靶向大脑的制剂。
本公开的药物制剂可以方便地以单位剂型存在,可以根据制药工业中公知的常规技术来制备。此类技术包括将活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常,通过将活性成分与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合在一起,然后,如果需要,对产品进行塑形来制备制剂。
本公开的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种,例如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软胶囊、栓剂和灌肠剂。本公开的组合物也可以配制成在水性介质、非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液还可以包含增加悬浮液粘度的物质,包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液也可以含有稳定剂。
其他制剂
i.乳液
本公开的组合物可被制备且配制为乳液。乳液通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散于另一种液体中的非均质系统(参见例如Ansel's PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY;Idson,in PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume 1,p.199;Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245;Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335;Higuchi et al.,in Remington′sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是包含两个彼此紧密混合和分散的不混溶液相的双相系统。通常,乳液可是油包水(w/o)型或水包油(o/w)型。当水相被细分为小液滴并分散于大体积油相中时,所得的组合物被称为油包水(w/o)乳液。或者,当油相被细分为小液滴并分散于大体积水相中时,所得组合物被称为水包油(o/w)乳液。除了含有分散相和可作为水相、油相或其本身作为独立相存在于溶液中的活性药物之外,乳液还可含有其他组分。根据需要,药物赋形剂如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可存在于乳液中。药物乳液也可以是包含超过两个相的复合乳液,例如,油包水包油(o/w/o)乳液和水包油包水(w/o/w)乳液。此类复配制剂往往提供了简单双相乳液所不具有的某些优点。复合乳液其中o/w乳液的各个油滴包封小水滴而构成w/o/w乳液。同样,油滴被包封在稳定存在于油性连续相中的水球内的系统提供了o/w/o乳液。
乳液的特征在于热力学稳定性小或不具备热力学稳定性。通常,乳液的分散相或不连续相很好地分散在外部相或连续相中,并通过乳化剂方式或制剂的黏度的方式来维持这种形式。乳液的任一相可以是半固体或固体,如乳液型软膏基质和霜剂。其他稳定乳液的方法需要使用可以掺入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂大致可分为四类:合成表面活性剂、天然乳化剂、吸收基质、和精细分散的固体(参见例如Ansel's Pharmaceutical DosageForms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY;Idson,in PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成表面活性剂,也被称为表面活性剂,已经广泛用于乳液制剂中且已经在文献中进行了综述(参见例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY;Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Riegerand Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285;Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。表面活性剂通常是两亲性的,且包含亲水性部分和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率已经被定义为亲水/亲脂平衡(HLB),且是在分类和制剂的制备中选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂基于亲水性基团的性质可分为不同的类别:非离子性、阴离子性、阳离子性和两亲性(参见例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
乳液制剂中使用的天然乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收基质具有亲水性,因此它们可以吸收水形成w/o乳液,同时保持其半固体的稠度,例如无水羊毛脂和亲水性凡士林。精细分散的固体也被用作优良的乳化剂,尤其是与表面活性剂组合使用和用于粘性制剂中。这些包括极性无机固体(例如重金属氢氧化物)、不溶胀的粘土(例如膨润土、绿坡缕石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、胶态硅酸铝和胶态硅酸镁铝)、色素和非极性固体(例如碳或甘油三硬脂酸酯)。
各种各样的非乳化材料也包括在乳液制剂中,并有助于乳液的特性。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,inPharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335;Idson,in Pharmaceutical DosageForms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
亲水胶体或水胶体包括天然存在的树胶和合成聚合物,例如多糖(例如阿拉伯胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔胶、刺梧桐树胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成聚合物(例如卡波姆、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。它们在水中分散或溶胀形成胶体溶液,通过在分散相液滴周围形成强的界面膜并通过增加外部相的粘度来稳定乳液。
由于乳液通常含有许多容易支持微生物的生长的成分,如糖类、蛋白质、甾醇和磷脂,因此这些制剂通常含有防腐剂。乳液制剂中常用的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。通常也将抗氧化剂添加到乳液制剂中以防止制剂变质。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂例如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯,或者还原剂例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠,以及抗氧化增效剂例如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
经由皮肤途径、口服途径和肠胃外途径的乳液制剂的应用及其制备方法已经在文献中进行了综述(参见例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY;Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Riegerand Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。用于口服递送的乳液制剂由于易于配制以及在吸收和生物利用度方面的功效而已经被广泛使用(参见例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY;Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245;Idson,inPharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。矿物油基泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂是通常作为o/w乳液口服施用的物质。
ii.微乳液
在本公开的一个实施方案中,RNAi剂和核酸的组合物被配制成微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统,其是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),NewYork,NY;Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。通常,微乳液是通过如下制备而得的系统:首先,将油分散于表面活性剂水溶液中,随后加入足量的第四组分(通常是中等链长的醇)以形成透明的系统。因此,微乳液也已经被描述为由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性的澄清分散液(Leung andShah,in:Controlled Release of Drugs:Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液通常由包括油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质的三至五种成分组合制备而成。微乳液是油包水(w/o)型还是水包油(o/w)型取决于所用的油和表面活性剂的性质,以及表面活性剂分子的极性头和烃尾的结构和几何堆积(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相图的现象学方法已被广泛研究,并为本领域技术人员提供了如何配制微乳液的全面知识(参见例如Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(8th ed.),New York,NY;Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Riegerand Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245;Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。与常规乳液相比,微乳液的优势在于将非水溶性药物溶解在自发形成的热力学稳定的液滴制剂中。
用于制备微乳液的表面活性剂包括但不限于单独使用的或与助表面活性剂组合使用的离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂、Brij96、聚氧乙烯油醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ML310)、四甘油单油酸酯(MO310)、六甘油单油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油单癸酸酯(MCA750)、十甘油单油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)。助表面活性剂通常是短链醇,例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇,其通过渗透到表面活性剂膜中并因此由于表面活性剂分子之间产生的空隙空间而产生无序膜来增加界面流动性。然而,微乳液可以在不使用助表面活性剂的情况下制备,并且无醇的自乳化微乳液系统是本领域已知的。水相通常可以是但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇、和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不限于以下物质,例如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单甘油酯、中链(C8-C12)二甘油酯和中链(C8-C12)三甘油酯、聚氧乙基化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和的聚乙二醇化的C8-C10甘油酯、植物油和硅油。
从药物溶解性和增强的药物吸收的角度来看,微乳液是特别令人感兴趣的。已经提出了基于脂类的微乳液(o/w和w/o)来提高包括肽在内的药物的口服生物利用度(参见例如美国专利号6,191,105;7,063,860;7,070,802;7,157,099;Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390;Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供了以下优势:改善的药物溶解性、保护药物免受酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变而可能增强的药物吸收、易于制备、比固体剂型更易于口服施用、改善临床效力和降低毒性(参见例如美国专利号6,191,105;7,063,860;7,070,802;7,157,099;Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385;Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。通常,当微乳液的组分在环境温度下混合在一起时,它们可以自发形成微乳液。当配制不耐热药物、肽或RNAi剂时,这可能是特别有利的。在化妆品和药物应用中,微乳液在活性成分的透皮递送中也是有效的。预期本公开的微乳液组合物和制剂将促进RNAi剂和核酸从胃肠道的全身性吸收增加,并且改善RNAi剂和核酸的局部细胞摄取。
本公开的微乳液还可以包含其他组分和添加剂,例如山梨醇酐单硬脂酸酯(Grill3)、酸甘油酯(Labrasol)和渗透增强剂,以改善制剂的性质并增强对本发明的RNAi剂和核酸的吸收。用于本公开的微乳液中的渗透增强剂可被分类为属于五大类——表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂中的一类(Lee et al.,CriticalReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上面已经对每一类进行了讨论。
iii.微粒
本公开的RNAi剂可以掺入颗粒例如微粒中。微粒可通过喷雾干燥来产生,但也可通过其他方法来产生,包括冷冻干燥、蒸发、流体床干燥、真空干燥、或这些技术的组合。
iv.渗透增强剂
在一个实施方案中,本公开使用多种渗透增强剂来实现核酸,特别是RNAi剂向动物皮肤的有效递送。大多数药物以离子化和非离子化的形式存在于溶液中。然而,通常只有脂溶性或亲脂性药物能轻易地跨越细胞膜。已经发现,如果用渗透增强剂处理待跨越的细胞膜,则即便是非亲脂性药物仍能够跨越该细胞膜。除了有助于非亲脂性药物跨越细胞膜扩散外,渗透增强剂还能提高亲脂性药物的渗透性。
渗透增强剂可被分类为属于下述五大类之一:即,表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂、和非螯合非表面活性剂(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002;Lee et al.,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。下面将更详细地描述上述各类渗透增强剂。
表面活性剂(或“表面活性剂”)是化学实体,当其溶解在水溶液中时,其降低溶液的表面张力或水溶液和另一种液体之间的界面张力,结果是增强RNAi剂通过粘膜的吸收。除了胆汁盐和脂肪酸之外,这些渗透增强剂包括例如月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚)(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002;Lee et al.,Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92);以及全氟化学乳液如FC-43。Takahashiet al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
充当渗透增强剂的多种脂肪酸及其衍生物包括,例如,油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯(1-单油酰基-外消旋-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、C1-20烷基酯(如甲基、异丙基和叔丁基),和它们的甘油单酯和甘油二酯(即,油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006;Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33;El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
胆汁的生理作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见,例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,NewYork,NY,2002;Brunton,Chapter 38in:Goodman&Gilman's The Pharmacological Basisof Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。多种天然胆汁盐及其合成衍生物能充当渗透增强剂。因此,术语“胆汁盐”包括胆汁中任何天然存在的成分以及它们的任何合成衍生物。合适的胆汁盐包括例如胆酸(或其药学上可接受的钠盐,胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅去氧胆酸(鹅去氧胆酸钠)、熊去氧胆酸(UDCA)、牛磺-24,25-二氢-夫西地酸钠(STDHF)、甘氨二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(参见例如Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa HealthCare,New York,NY,2002;Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems,1991,page 92;Swinyard,Chapter 39In:Remington's PharmaceuticalSciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33;Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25;Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
与本公开结合使用的螯合剂可被定义为通过与其形成复合体而从溶液中去除金属离子的化合物,结果是通过粘膜的RNAi剂的吸收得到增强。关于它们在本公开中作为渗透增强剂的用途,螯合剂还具有用作DNA酶抑制剂的额外优点,因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子来催化,因此会被螯合剂所抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。合适的螯合剂包括但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸盐(例如水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸盐和高香草酸盐)、胶原的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的N-氨基酰基衍生物(烯胺)(参见例如Katdare,A.et al.,Excipient development forpharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006;Leeet al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92;Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33;Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文所用,非螯合的非表面活性剂渗透增强化合物可被定义为显示出不显著的螯合剂或表面活性剂的活性,但仍然能增强RNAi剂通过消化道粘膜的吸收的化合物(参见,例如Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。这类渗透增强剂包括,例如不饱和环脲,1-烷基-烷酮衍生物和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92);以及非甾体抗炎剂如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
在细胞水平上增强RNAi剂摄取的剂也可以被加入到本公开的药物组合物和其他组合物中。例如,阳离子脂质如lipofectin(Junichi等人,美国专利号705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(WO 97/30731),也已知能增强dsRNA的细胞摄取。
可以使用其他剂来增强所施用核酸的渗透,包括乙二醇如乙烯乙二醇和丙烯乙二醇、吡咯如2-吡咯、氮酮和萜烯如柠檬烯和薄荷酮。
vi.赋形剂
与载体化合物相比,“药物载体”或“赋形剂”是用于将一种或多种核酸递送至动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或其他药理学上惰性的媒介物。赋形剂可以是液体或固体,且可根据所考虑的计划施用方式来选择,当与核酸和给定药物组合物的其他组分结合时,以提供所期望的体积、黏度等。典型的药物载体包括但不限于粘合剂(例如预胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等);填充剂(例如,乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙等);润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、二氧化硅、二氧化硅胶体、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等);崩解剂(例如,淀粉、淀粉羟乙酸钠等);和湿润剂(例如十二烷基硫酸钠等)。
也可以使用不与核酸发生有害反应的适于非肠胃外施用的药学上可接受的有机赋形剂或无机赋形剂来配制本公开的组合物。合适的药学上可接受的载体包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于核酸的局部施用的制剂可以包括无菌水溶液和非无菌水溶液,在普通溶剂如醇中的非水溶液,或在液体油基或固体油基中的核酸的溶液。溶液还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用不与核酸发生有害反应的适于非肠胃外施用的药学上可接受的有机赋形剂或无机赋形剂。
合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本公开的组合物可以另外含有常见于药物组合物中的其他辅助组分,其用量为它们在本领域中确定的水平。因此,例如,组合物可含有另外的、可相容的、药学活性材料,例如,止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂,或可含有可用于在物理上配制本发明的组合物的各种剂型的其他材料如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而,当加入这类材料时,不应过度干扰本发明的组合物的组分的生物活性。可以对制剂进行灭菌,且如果需要还可以与不与该制剂的核酸发生有害反应的佐剂如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂、调味剂或芳香物质等混合。
水性悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质,包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。悬浮液也可以含有稳定剂。
在一些实施方案中,本公开中描述的药物组合物包含(a)一种或多种RNAi剂和(b)一种或多种剂,其通过非iRNA机制发挥作用且可用于治疗APOE相关神经退行性疾病病症。这些药物的实例包括但不限于SSRI、文拉法辛(venlafaxine)、安非他酮和非典型抗精神病药。
此类化合物的毒性和治疗功效可通过标准药学过程在细胞培养物或实验动物中测定,例如测定LD50(对50%群体的致死剂量)和ED50(对50%群体的治疗有效剂量)。毒性与治疗效果间的剂量比是治疗指数,且其可表示为LD50/ED50之比。优选显现出高治疗指数的化合物。
从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于配制用于人类的剂量范围。本文中本公开的组合物的剂量通常在包括具有低毒性或无毒性的ED50的循环浓度范围。剂量可根据所采用的剂型和所使用的施用途径而在此范围内变化。对于在本公开中描述的方法中使用的任何化合物,首先可从细胞培养分析中估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量,以取得化合物的循环血浆浓度范围或,当适当时,取得靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如,实现降低的多肽浓度),该范围包括如在细胞培养物中所测定的IC50(即,实现对症状的半最大抑制时的测试化合物的浓度)。此类信息可用来更准确地确定可用于人体的剂量。例如,可通过高效液相层析测量血浆中的水平。
除了如上所述的RNAi剂的施用之外,本公开中描述的RNAi剂也可以与其他已知的有效治疗由核苷酸重复表达介导的病理过程的剂组合施用。在任何情况下,给药医生可基于本领域中已知或本文所述的标准疗效测量方法所观察到的结果来调节RNAi剂施用的量和时机。
VIII.试剂盒
在某些方面,本公开提供了包括合适容器的试剂盒,所述容器包含siRNA化合物例如双链siRNA化合物或siRNA化合物(例如前体,例如可以加工成siRNA化合物的较大的siRNA化合物,或编码siRNA化合物的DNA,例如双链siRNA化合物或siRNA化合物,或其前体)的药物制剂。在某些实施方案中,药物制剂的单个组分可以在一个容器中提供。或者,可能需要在两个或多个容器中分别提供药物制剂的组分,例如一个用于siRNA化合物制剂的容器,以及至少另一个用于载体化合物的容器。试剂盒可包装成多种不同配置,例如单个盒子中的一个或多个容器。不同组分可组合,例如,根据试剂盒提供的使用说明书进行组合。可根据本文所述方法将组分进行组合,例如以制备并施用一种药物组合物。试剂盒还可包括递送装置。
IX.抑制APOE表达的方法
本公开还提供了抑制APOE基因在细胞中表达的方法。所述方法包括使细胞与有效抑制APOE在细胞中的表达的量的RNAi剂(例如双链RNAi剂)接触,从而抑制APOE在细胞中的表达。在本公开的某些实施方案中,APOE优先在CNS(例如,脑)细胞中被抑制。在本公开的其他实施方案中,APOE优先在肝脏(例如肝细胞)中被抑制。在本公开的某些实施方案中,APOE在CNS(例如,脑)细胞和肝脏(例如,肝细胞)细胞中均被抑制。
在一些实施方案中,APOE2的表达被抑制。在一些实施方案中,APOE3的表达被抑制。在一些实施方案中,APOE4的表达被抑制。在一些实施方案中,APOE2和APOE3的表达被抑制。在一些实施方案中,APOE2、APOE3和APOE4的表达被抑制。在一些实施方案中,APOE4的表达被抑制,而APOE2和APOE3的表达基本上不被抑制,例如APOE2和APOE3的表达被抑制不超过10%。
细胞与RNAi剂如双链RNAi剂的接触可以在体外或体内完成。使细胞与RNAi剂在体内接触包括使受试者例如人类受试者体内的细胞或细胞群与RNAi剂接触。体外接触细胞的方法与体内接触细胞的方法的组合也是可以的。
如上所述,与细胞的接触可以是直接的或间接的。此外,与细胞的接触可通过靶向配体来实现,所述靶向配体包括本文所述或本领域中已知的任何配体。在一些实施方案中,靶向配体是糖类部分,例如GalNAc配体,或将RNAi剂引导至感兴趣的位点的任何其他配体。
如本文所用,术语“抑制”与“减轻”、“沉默”、“下调”、“阻抑”和其他类似术语可互换使用,且包括任何水平的抑制。在某些实施方案中,抑制水平例如对于本公开的RNAi剂的抑制水平,可以在细胞培养条件下进行评估,例如其中细胞培养物中的细胞以接近10nM或更小、1nM或更小等的细胞浓度通过LipofectamineTM介导的转染进行转染。给定RNAi剂的敲低可以通过比较细胞培养物的处理前水平与细胞培养物的处理后水平来确定,任选地还与用混杂的或其他形式的对照RNAi剂平行处理的细胞进行比较。细胞培养物中的敲低(例如,优选50%或更高)可因此被鉴定为已经发生“抑制”或“减轻”、“下调”或“阻抑”等的指标。明确预期了在本领域所述的适当控制的条件下,对本公开的RNAi试剂的靶mRNA或编码的蛋白质水平(以及由本发明的RNAi剂引起的“抑制”的程度等)的评估也可以在体内系统中进行。
如本文所用,短语“抑制APOE基因的表达”或“抑制APOE的表达”包括抑制任何APOE基因(例如小鼠APOE基因、大鼠APOE基因、猴APOE基因或人APOE基因)以及编码APOE蛋白的APOE基因的变体或突变体的表达。因此,在经基因操纵的细胞、细胞群或生物体的语境中,APOE基因可以是野生型APOE基因、突变的APOE基因或转基因APOE基因。
“抑制APOE基因的表达”包括对APOE基因的任何水平的抑制,例如至少部分阻抑APOE基因的表达,例如抑制了至少20%。在某些实施方案中,抑制了至少30%、至少40%、优选至少50%、至少约60%、至少70%、至少约80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%;或者抑制到低于测定法的检测水平。
可以基于与APOE基因表达相关的任何变量的水平来评估APOE基因的表达,所述变量的水平是例如APOE mRNA水平或APOE蛋白水平,或者例如淀粉样蛋白或tau蛋白沉积的水平。
可以通过与对照水平相比的这些变量中的一个或多个的绝对或相对水平的降低来评估抑制作用。对照水平可以是本领域中使用的任何类型的对照水平,例如给药前的基线水平、或从未处理或经对照(例如,仅含缓冲剂的对照或非活性剂的对照)处理的类似受试者、细胞或样本中测得的水平。
在本公开方法的一些实施方案中,APOE基因的表达被抑制至少20%、30%、40%,优选至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%,或者被抑制至低于测定法的检测水平。在某些实施方案中,所述方法包括APOE表达的临床相关抑制,例如在用降低APOE表达的剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的。
APOE基因表达的抑制可以通过第一细胞或细胞群(此类细胞可存在于例如来源于受试者的样本中)所表达的mRNA量的降低来提现,在该第一细胞或细胞群中,APOE基因被转录并且已经被处理过(例如,通过使一个或多个细胞与本发明的RNAi剂接触,或通过将本发明的RNAi剂施用至细胞所在或曾所在的受试者中),使得与基本上与第一细胞或细胞群相同但未经如此处理的第二细胞或细胞群(未经iRNA处理或未经靶向感兴趣基因的iRNA处理的对照细胞)相比,APOE基因的表达被抑制。抑制程度可以表示为:
Figure BDA0004014902130001641
在其他实施方案中,APOE基因表达的抑制可以根据与APOE基因表达(例如APOE蛋白表达)功能性关联的参数的降低来评估。APOE基因沉默可以通过本领域已知的任何测定法在任何表达APOE(无论内源的APOE或来自表达构建体的APOE)的细胞中确定。
APOE蛋白表达的抑制可以通过细胞或细胞群表达的APOE蛋白水平(例如,来自受试者的样本中表达的蛋白水平)的降低而体现。如上所述,为了评估mRNA抑制,经处理的细胞或细胞群中蛋白质表达水平的抑制可类似地表现为相对于对照细胞或细胞群中蛋白质水平的百分比。
可用于评估APOE基因表达抑制的对照细胞或对照细胞群包括尚未与本发明的RNAi剂接触的细胞或细胞群。例如,对照细胞或对照细胞群可源自使用RNAi剂治疗受试者之前的个体受试者(例如,人或动物受试者)。
由细胞或细胞群所表达的APOE mRNA的水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定。在一个实施方案中,通过检测转录的多核苷酸或其部分,例如APOE基因的mRNA,来确定样本中APOE的表达水平。可以使用RNA提取技术,包括例如使用酸性苯酚/异硫氰酸胍提取(RNA zol B;Biogenesis)、RNeasyTM RNA制备试剂盒
Figure BDA0004014902130001642
或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland),从细胞中提取RNA。采用核糖核酸杂交的通用分析形式包括核连缀分析、RT-PCR、RNase保护分析、northern印迹法、原位杂交和微阵列分析。可以使用WO2012/177906中描述的方法检测循环的APOE mRNA,其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中,使用核酸探针确定APOE的表达水平。如本文所用,术语“探针”指能够选择性结合具体APOE核酸或蛋白质或其片段的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成,或源于合适的生物制品。探针可以被特别设计成被标记的。可以用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
经分离的mRNA可用于杂交或扩增分析,包括但不限于Southern或northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。一种用于测定mRNA水平的方法包括将经分离的mRNA与能可与APOE mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方案中,例如通过将分离的mRNA从凝胶转移到膜如硝酸纤维素膜上,从而将mRNA固定在固体表面上并与探针接触。在替代实施方案中,在
Figure BDA0004014902130001651
基因芯片阵列中,将探针固定在固体表面并使mRNA与该探针接触。、技术人员可以容易地调整已知的mRNA检测方法以用于确定APOE mRNA的水平。
用于确定样本中APOE表达水平的替代方法涉及例如样本中的mRNA的核酸扩增或反转录酶(以制备cDNA)的过程,该过程是例如通过RT-PCR(Mullis于1987年在美国专利4,683,202中记载的实验性实施方案)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自主序列复制(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6:1197)、滚环式复制(Lizardi et al.,美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法,随后使用本领域技术人员熟知的技术检测所扩增的分子。如果核酸分子以非常低的数量存在,则这些检测方案对于核酸分子的检测特别有用。在本公开的具体方面,APOE的表达水平通过定量荧光RT-PCR(即,TaqManTM系统)、通过Dual-
Figure BDA0004014902130001652
荧光素酶分析或通过本领域公认的用于测量APOE表达或mRNA水平的方法来确定。
可以使用膜印迹(例如杂交分析中所用的,例如Southern印迹、northern印迹、斑点印迹等)或微孔、样本管、凝胶、珠或纤维(或包含经结合的核酸的任何固体支持物)来监测APOE mRNA的表达水平。参见美国专利第5,770,722号、第5,874,219号、第5,744,305号、第5,677,195号和第5,445,934号,这些专利通过引用并入本文。APOE表达水平的测定也可以包括使用溶液中的核酸探针。
在一些实施方案中,使用分支DNA(bDNA)分析或实时PCR(qPCR)来评估mRNA表达水平。在本文给出的实施例中描述并举例说明了这种PCR方法的使用。这种方法也可用于APOE核酸的检测。
APOE蛋白表达的水平可以使用本领域已知的用于测量蛋白水平的任何方法来确定。此类方法包括,例如,电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、液体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱分析、比色分析、分光光度分析、流式细胞术、免疫扩散(单次或二次)、免疫电泳、蛋白印迹、放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、免疫荧光分析、电化学发光分析等。此类分析也可用于指示APOE蛋白存在或复制的蛋白的检测。
在一些实施方案中,通过APOE mRNA水平的降低来评估本公开方法在APOE相关疾病的治疗中的效力(例如,通过评估CSF样本中的APOE水平、通过脑活组织检查或其他方式)。
在一些实施方案中,通过APOE mRNA水平的降低来评估本公开方法在APOE相关疾病的治疗中的效力(例如,通过评估肝脏样本中的APOE水平、通过活组织检查或其他方式)。
在本公开方法的一些实施方案中,将RNAi剂施用于受试者,从而将RNAi剂递送至受试者体内的具体部位。APOE表达的抑制可通过测量样本中的APOE mRNA或APOE蛋白的水平或水平变化来评估,所述样本来自受试者体内的具体部位,如CNS细胞。在某些实施方案中,所述方法包括APOE表达的临床相关抑制,例如用降低APOE表达的剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的。
如本文所用,术语“检测或确定分析物的水平”被理解为是指执行该步骤以确定物质例如蛋白质、RNA的存在与否。如本文所用,检测或确定的方法包括检测或确定低于所使用方法的检测水平的分析物水平。
X.治疗或预防APOE相关神经退行性疾病的方法
本公开还提供了使用本公开的RNAi剂或包含本公开的RNAi剂的组合物来减少或抑制APOE在细胞中的表达的方法。所述方法包括使所述细胞与本公开的dsRNA接触,并将所述细胞维持足够长的时间以获得APOE基因的mRNA转录本的降解,从而抑制APOE基因在细胞中的表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法来评估。例如,可以通过使用对于本领域普通技术人员常规的方法例如northern印迹、qRT-PCR来测定APOE的mRNA表达水平从而测定APOE表达的减少;通过对于本领域普通技术人员常规的方法如蛋白质印迹、免疫学技术来确定APOE的蛋白质水平从而测定APOE表达的减少。
在本公开的方法中,可以在体外或体内接触细胞,即细胞可以在受试者体内。
适用于本公开的方法进行治疗的细胞可以是表达APOE基因的任何细胞。适用本公开的方法的细胞可以是哺乳动物细胞,例如灵长类动物细胞(例如人类细胞或非人类灵长类动物细胞,例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类动物细胞(例如大鼠细胞或小鼠细胞)。在一个实施方案中,所述细胞是人类细胞,例如人类CNS细胞。在一个实施方案中,所述细胞是人类细胞,例如人类肝脏细胞。在一个实施方案中,所述细胞是人类细胞,例如人类CNS细胞和人类肝脏细胞。
APOE在细胞中的表达被抑制了至少约30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或约100%,即被抑制到低于检测水平。在优选的实施方案中,APOE表达被抑制了至少50%。
本公开的体内方法可以包括向受试者施用含有RNAi剂的组合物,其中该RNAi剂包括与待处理哺乳动物的APOE基因的RNA转录本的至少一部分互补的核苷酸序列。当待治疗的生物体是哺乳动物如人时,组合物可以通过本领域已知的任何方式施用,包括但不限于口服、腹膜内或胃肠外途径,包括颅内(例如,脑室内、实质内和鞘内)、静脉内、肌肉内、玻璃体内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、鼻内、直肠和局部(包括颊腔和舌下)施用。在某些实施方案中,组合物通过静脉输注或注射施用。在某些实施方案中,组合物通过皮下注射施用。在某些实施方案中,组合物通过鞘内注射施用。
在一些实施方案中,施用是通过积存注射(depot injection)进行的。积存注射可以在延长的时间内以一致的方式释放RNAi剂。因此,积存注射可以减少为获得期望效果(例如,期望的APOE抑制或治疗或预防效果)所需的给药频率。积存注射也可以提供更一致的血清浓度。积存注射可以包括皮下注射或肌肉注射。在优选的实施方案中,积存注射是皮下注射。
在一些实施方案中,通过泵进行施用。所述泵可以是外部泵或外科植入泵。在某些实施方案中,所述泵是皮下植入的渗透泵。在其他实施方案中,所述泵是输液泵。输液泵可用于颅内输注、静脉内输注、皮下输注、动脉输注或硬膜外输注。在优选实施方案中,所述输液泵是皮下输液泵。在其他实施方案中,所述泵是外科植入的泵,其将RNAi剂递送至CNS。
可以根据是需要局部治疗还是全身性治疗以及待治疗的区域来选择施用方式。可以选择施用途径和施用部位以增强靶向性。
在一方面,本公开还提供了抑制APOE基因在哺乳动物中表达的方法。所述方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物细胞中APOE基因的dsRNA的组合物,并将哺乳动物维持足够长的时间以获得APOE基因的mRNA转录本的降解,从而抑制APOE基因在细胞中的表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法和本文所述的方法例如qRT-PCR来评估。蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法和本文所述的例如ELISA的方法来评估。在一个实施方案中,将CNS活组织检查样本或脑脊液(CSF)样本用作组织材料以监测APOE基因或蛋白质表达(或其替代物)的减少。
本公开还提供了对有需要的受试者进行治疗的方法。本公开的治疗方法包括将本公开的RNAi剂以治疗有效量的靶向APOE基因的RNAi剂或包含靶向APOE基因的RNAi剂的药物组合物施用给受试者,例如将受益于APOE表达抑制的受试者。
此外,本公开提供了预防、治疗或抑制APOE相关神经退行性疾病或病症的进展的方法,所述疾病或病症是例如淀粉样蛋白β-介导的疾病例如阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样蛋白血管病,或tau介导的疾病例如原发性tau蛋白病例如额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART),或继发性tau蛋白病如阿尔茨海默病、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
所述方法包括向受试者施用治疗有效量的任何RNAi剂例如dsRNA剂、或本文提供的药物组合物,从而预防、治疗或抑制受试者中APOE相关神经退行性疾病或病症的进展。
本公开的RNAi剂可以作为“游离RNAi剂”施用。游离RNAi剂是在没有药物组合物的情况下施用的。裸RNAi剂可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可包含醋酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐、或磷酸盐、或其任何组合。在一个实施方案中,缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可调节含有iRNA的缓冲溶液的pH和渗透压,使得其适用于施用给受试者。
或者,本公开的RNAi剂可以作为药物组合物例如dsRNA脂质体制剂施用。
将受益于APOE基因表达的减少或抑制的受试者是那些患有APOE相关神经退行性疾病的受试者。
本公开还提供了使用RNAi剂或其药物组合物的方法,例如用于治疗将受益于APOE表达的减少或抑制的受试者,例如患有APOE相关神经退行性疾病的受试者,并与其他药物或其他治疗方法(例如,与已知药物或已知治疗方法例如目前用于治疗这些疾病的那些方法)组合。例如,在某些实施方案中,靶向APOE的RNAi剂与例如如本文别处所述或本领域已知的用于治疗APOE相关神经退行性疾病的剂组合施用。例如,适用于治疗将受益于APOE表达减少的受试者(例如患有APOE相关神经退行性疾病的受试者)的其他剂可包括目前用于治疗APOE症状的剂。RNAi剂和另外的治疗剂可以同时施用或以同一组合的形式施用,例如通过鞘内施用,或者另外的治疗剂可以作为分别的组合物的一部分或在分别的时间施用,或者通过本领域已知或本文描述的其他方法施用。
在一个实施方案中,所述方法包括施用本文描述的组合物,使得靶APOE基因的表达降低至少一个月。在优选的实施方案中,表达减低至少2个月、3个月或6个月。
优选地,可用于本文描述的方法和组合物的RNAi剂特异性靶向靶APOE基因的RNA(初级RNA或加工RNA)。使用RNAi剂抑制这些基因表达的组合物和方法可以如本文所述来制备和实施。
根据本公开的方法施用dsRNA可导致患有APOE相关神经退行性疾病的患者中的这种疾病或病症的严重性、体征、症状或标志物的降低。本文中的“降低”是指这种水平的统计学上显著的降低或临床上显著的降低。该降低可以是例如至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或约100%。
可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物的水平或任何正在治疗或针对性预防的给定疾病的其他可测量参数来评估疾病的治疗或预防的效力。本领域技术人员完全有能力通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的效力。例如,可以通过例如定期监测受试者的认知、学习和/或记忆来评估APOE相关神经退行性疾病的治疗效果。后期读数与初始读数的比较为医生提供了治疗是否有效的指示。本领域技术人员完全有能力通过测量这些参数中的任何一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的效力。关于靶向APOE的RNAi剂或其药物组合物的施用,“有效对抗”APOE相关的神经退行性疾病是指以临床上适当的方式的施用对至少一部分统计学上显著的患者产生有益效果,例如症状改善、治愈、疾病减轻、寿命延长、生活质量改善,或其他被熟悉治疗APOE相关的神经退行性疾病和相关病因的医生通常认为是积极的效果。
当疾病状态的一个或多个参数有统计学上的显著改善时,或者当没有恶化或发展出预期的症状时,治疗或预防的效果是明显的。例如,疾病的可测量参数中的至少10%,优选至少20%、30%、40%、50%或更多的有利变化,可以指示有效治疗。也可以使用本领域已知的给定疾病的实验动物模型来判断给定RNAi剂药物或该药物制剂的效力。当使用实验动物模型时,当观察到标志物或症状的统计学显著减少时,证明了治疗的效力。
或者,可以通过如诊断领域的技术人员基于临床上可接受的疾病严重程度分级标准所确定的疾病严重程度的降低来测量效力。使用合适的量表测量的任何导致例如疾病严重程度减轻的积极变化,代表使用如本文所述的RNAi剂或RNAi剂制剂的充分治疗。
可以向受试者施用治疗量的dsRNA,例如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
RNAi剂可以在一段时间内定期通过玻璃体内注射或静脉内输注进行鞘内施用。在某些实施方案中,在初始治疗方案之后,可以较不频繁的方式进行治疗。施用RNAi剂可将例如在患者的细胞、组织、血液、CSF样本或其他隔室中的APOE水平降低至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或至少约99%或更多。在优选实施方案中,施用RNAi剂可以将例如在患者的细胞、组织、血液、CSF样本或其他隔室中的APOE水平降低至少50%。
在施用全剂量的RNAi剂之前,可以给患者施用一个较小的剂量,例如5%的输注反应,并监测副作用,例如过敏反应。在另一实例中,可以监测患者的不希望的免疫刺激效应,例如细胞因子(例如,TNF-α或INF-α)水平的增加。
或者,RNAi剂可以通过皮下施用,即通过皮下注射施用。一次或多次注射可用于向受试者递送所需的例如月剂量的RNAi剂。可以在一段时间内重复注射。可以定期重复施用。在某些实施方案中,在初始治疗方案之后,可以较不频繁地进行治疗。重复给药方案可以包括定期施用治疗量的RNAi剂,例如每月一次或延长至每季度一次、每年两次、每年一次。在某些实施方案中,约每月施用一次至约每季度施用一次(即约每三个月施用一次)RNAi剂。
除非另有定义,本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管可使用与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料来实施或测试本发明提出的RNAi剂和方法,但下文描述了合适的方法和材料。本文引用的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献的全部内容均通过引用并入本文。在矛盾的情况下,以本说明书(包括定义)为准。此外,材料、方法和实例仅是说明性的,而不是限制性的在此提交了非正式的序列表,并构成所提交说明书的一部分。
实施例
实施例1.RNAi剂的设计、合成、选择和体外评价
本实施例描述了用于APOE RNAi剂的设计、合成、选择和体外评价的方法。
试剂来源
若本文中未具体给出试剂的来源,则可从任何分子生物学试剂供应商处获得此类试剂,其质量/纯度标准符合分子生物学应用。
生物信息学
使用定制的R和Python脚本设计了一组靶向人载脂蛋白E(APOE;人NCBI refseqIDNM_000041.4;NCBI GeneID:348)的siRNA。人NM_000041REFSEQ mRNA版本4的长度为1166个核苷酸。
使用本领域已知的常规方法制备APOE的单链和双链。未修饰的APOE有义链和反义链序列的详细列表如表2和表4中所示,经修饰的APOE有义链和反义链序列的详细列表如表4和表5中所示。
表2中的靶向致病性APOE4等位基因的那些剂的未修饰的APOE有义链和反义链序列的详细列表提供于表7中,表3中的靶向致病性APOE4等位基因的那些剂的经修饰的APOE有义链和反义链序列的详细列表提供于表8中。
siRNA合成
使用本领域已知的常规方法合成siRNA并退火。简而言之,使用Mermade 192合成仪(BioAutomation),在固相支持物上通过亚膦酰胺化学合成法,以1μmol的规模合成siRNA序列。固相支持物是负载有定制GalNAc配体(3'-GalNAc缀合物)、通用固相支持物(AMbiochemical)或感兴趣的第一核苷酸的受控多孔玻璃
Figure BDA0004014902130001731
辅助合成试剂和标准品2-氰乙基亚磷酰胺单体(2'-脱氧-2'-氟基、2'-O-甲基、RNA、DNA)获自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI),Hongene(中国),或Chemgenes(Wilmington,MA,USA)。额外的亚磷酰胺单体获自商业供应商处、内部制备、或使用定制合成从各种CMO获得。在乙腈或9:1的乙腈:DMF中制备浓度为100mM的亚磷酰胺,并使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT,0.25M,在乙腈中)偶联,反应时间为400秒。使用100mM 3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT,获自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))溶液,在无水乙腈/吡啶(9:1v/v)中产生硫代磷酸酯键。氧化反应时间为5分钟。所有序列的合成都具有最后的移除DMT基团(“DMT去除”)。
完成固相合成后,将固体支撑的寡核苷酸用300μL的甲胺(40%的水溶液)于室温在96孔板中处理约2小时,以从固相支持物上裂解,随后去除所有其他碱不稳定的保护基团。对于含有被叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护的任何天然核糖核苷酸键(2'-OH)的序列,使用TEA.3HF(三乙胺三氢氟酸盐)进行第二次去保护步骤。向在甲胺水溶液中的每种寡核苷酸溶液中加入200μL二甲基亚砜(DMSO)和300μL TEA.3HF,并将该溶液在60℃孵育约30分钟。孵育结束后,使板达到室温,并通过加入1mL9:1的乙腈∶乙醇或1:1的乙醇∶异丙醇沉淀粗制寡核苷酸。然后将板在4℃离心45分钟,并在多通道移液器的辅助下小心地倾倒出上清液。将寡核苷酸沉淀物重悬于20mM NaOAc中,随后在配备有自动进样器、UV检测器、导电计和馏分收集器的Agilent LC系统上,使用HiTrap尺寸排阻柱(5mL,GE Healthcare)脱盐。将经脱盐的样本收集于96孔板中,然后分别通过LC-MS和UV分光光度计分析以证实材料的身份并定量。
在Tecan液体处理机器人上进行单链的双链体化。在96孔板中,将有义单链和反义单链以等摩尔比混合以达到在1×PBS中为10μM的最终浓度,将板密封,在100℃孵育10分钟,之后令其在2至3小时的时间段内缓慢恢复至室温。证实了每种双链体的浓度和身份,然后将其用于体外筛选分析中。
细胞培养和转染
通过如下转染细胞:在96孔板的每一单孔中,将每孔4.9μL的Opti-MEM加上0.1μL的RNAiMAX(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)加入5μL的siRNA双链体中,每种siRNA双链体重复四次,并于室温孵育15分钟。然后将含有约1.5×104个细胞的40μL的培养基加入到siRNA混合物中。在RNA纯化之前,将细胞孵育24小时。于10nM进行实验。转染实验是在使用EMEM(ATCC,目录号30-2003)在人肝癌Hep3B细胞(ATCC HB-8064)中进行的。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒进行的总RNA分离
使用DYNABEAD(Invitrogen,cat#61012),在Bio Tek-EL406平台上使用自动化方案分离RNA。简而言之,将70μL的裂解/结合缓冲液和10μL的包含3μL磁珠的裂解缓冲液加入到含有细胞的平板中。将板在电磁振荡器上于室温孵育10分钟,然后捕获磁珠并去除上清液。然后将结合在磁珠上的RNA用150μL洗涤缓冲液A洗涤两次,用洗涤缓冲液B洗涤一次。然后将磁珠用150μL洗脱缓冲液洗涤,重新捕获并去除上清液。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat#4368813)的cDNA合成
在每个反应中,将含有1μL 10×缓冲液、0.4μL25×dNTP、1μL 10×随机引物、0.5μL逆转录酶、0.5μL RNase抑制剂和6.6μL的H2O的10μL的主混合液加入到上述分离的RNA中。将板密封、混合,然后在电磁振荡器上于室温孵育10分钟,然后在37℃孵育2小时。
实时PCR
在384孔板(Roche cat#04887301001)的每孔中,将2μL的cDNA加入到含有0.5μL人或小鼠GAPDH TaqMan探针(ThermoFisher cat 4352934E或4351309)和0.5μL的合适的APOE探针(市售的,例如来自Thermo Fisher)和5μL Lightcycler 480探针主混合物(RocheCat#04887301001)的主混合物中。实时PCR是在LightCycler480实时PCR系统(Roche)中进行的。测试每个双链体(N=4),并将该数据归一化为用非靶向对照siRNA转染的细胞。为了计算相对倍数变化,使用ΔΔCt方法分析实时数据,并将该数据归一化为用非靶向对照siRNA转染的细胞进行的测定。
用表5中的剂在Hep3B细胞中进行的单剂量筛选的结果提供于表6中。
表1.核酸序列表示法中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解,当这些单体存在于寡核苷酸中时,其是通过5′-3'-磷酸二酯键相互连接的;并且应当理解,当核苷酸含有2'-氟基修饰时,氟基取代了亲代核苷酸中该位置的羟基(即,它是2'-脱氧-2'-氟基核苷酸)。
Figure BDA0004014902130001751
Figure BDA0004014902130001761
Figure BDA0004014902130001771
Figure BDA0004014902130001781
Figure BDA0004014902130001791
Figure BDA0004014902130001801
Figure BDA0004014902130001811
Figure BDA0004014902130001821
Figure BDA0004014902130001831
Figure BDA0004014902130001841
Figure BDA0004014902130001851
Figure BDA0004014902130001861
Figure BDA0004014902130001871
Figure BDA0004014902130001881
Figure BDA0004014902130001891
Figure BDA0004014902130001901
Figure BDA0004014902130001911
Figure BDA0004014902130001921
Figure BDA0004014902130001931
Figure BDA0004014902130001941
Figure BDA0004014902130001951
Figure BDA0004014902130001961
Figure BDA0004014902130001971
Figure BDA0004014902130001981
Figure BDA0004014902130001991
Figure BDA0004014902130002001
Figure BDA0004014902130002011
Figure BDA0004014902130002021
Figure BDA0004014902130002031
Figure BDA0004014902130002041
Figure BDA0004014902130002051
表6. 10nM体外筛选数据
Figure BDA0004014902130002061
Figure BDA0004014902130002071
Figure BDA0004014902130002081
Figure BDA0004014902130002091
实施例2.转基因小鼠中的体内评估
本实施例描述了用于在阿尔茨海默病的APPPS1-21转基因小鼠模型中体内评估APOE RNAi剂的方法。这些小鼠过表达具有瑞典突变(KM670/671NL)的人淀粉样前体蛋白(APP)cDNA和具有L166P突变的突变体PS1。这些小鼠中的内源性ApoE基因被人APOE3等位基因或人APOE4等位基因所替换(Huynh,et al.(2017)Neuron 96:1013-1023)。
对实施例1中设计和分析的所选dsRNA剂降低APOE在这些动物的脑和肝脏中的表达(例如APOE2、APOE3和APOE4表达)水平的能力进行了评估。
简而言之,对同窝出生的小鼠进行单剂量的感兴趣的dsRNA剂或安慰剂的鞘内施用或皮下施用。施用两周后,处死动物,收集血液和组织样本,包括大脑皮层、脊髓、肝脏、脾脏和颈淋巴结。
为了确定施用靶向APOE的dsRNA剂对APOE mRNA水平的影响,通过qRT-PCR测定了皮层和肝脏样本中的mRNA水平。
如Huynh等人所述,还评估了在该小鼠模型中施用靶向APOE的剂对阿尔茨海默病病理学的影响(同上)。
在出生时和8周龄时对同窝出生的小鼠鞘内施用或皮下施用了两剂感兴趣的dsRNA剂或安慰剂。在16周龄时,处死动物,收集血液和组织样本,包括大脑皮层、脊髓、肝脏、脾脏和颈淋巴结,并对其进行适当处理。
评估了dsRNA剂对Aβ斑块沉积、Aβ的累积、总体神经炎性营养不良(neuriticdystrophy)、斑块大小和斑块分布的影响。简而言之,为了进行组织样本的免疫荧光分析,在固定并随后在蔗糖中浸泡至少24小时后,使用切片机收集从额叶皮质到尾侧海马(右半球)的连续冠状切片。用X34染料对来自每个大脑右半球的包含海马的三个切片进行染色以可视化纤维斑块,或者用市售的抗淀粉样蛋白-β抗体(例如82E1)和相应荧光标记的第二抗体进行染色。为了进行分析,用共焦显微镜以20倍放大率扫描染色的切片。捕获包含斑块簇的随机窗口,跨越所有切片的z平面中的相同厚度。使用合适的软件,在相同的阈值下量化标志物的体积。每个数据点表示一只动物的三个独立组织切片的平均值。
实施例3.人源化APOE小鼠中的体内评估
使用标准技术,通过用包括外显子2、3和4(和一些3'UTR序列)的人APOE4基因序列替换小鼠Apoe基因的外显子2、3和大部分外显子4来产生用于本研究的人源化ApoE4敲入小鼠(购自Jax;库存#027894)。
为了评估感兴趣的双链体的体内效力,在第0天,通过使用25μl Hamilton注射器和定制角度的3.5mm的针向右脑室进行脑室内注射(ICV),对9至12周龄的雄性和雌性的氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉的纯合人源化APOE基因敲入小鼠施用单次300μg剂量的AD-1204704、AD-1204705、AD-1204705、AD-1204706AD-1204707、AD-1204708、AD-1204709、AD-1204710、AD-1204711、AD-1204712、或AD-1204713、或人工CSF(aCSF)对照。
表9提供了本实施例中所用剂的未修饰的APOE有义链和反义链序列的详细列表,并且表10提供了本实施例中所用剂的经修饰的APOE有义链和反义链序列的详细列表。
在给药后第14天,处死动物,收集大脑的两个半球和肝脏,并在液氮中速冻。从组织中提取mRNA并通过RT-QPCR方法进行分析。
图1A和图1B提高了该分析的结果,并且证明了单次300μg剂量的AD-1204704、AD-1204705、AD-1204708或AD-1204712有效地敲低了APOE在大脑中的表达(图1A),而对外周APOE表达的影响较小(图1B)。
图2描述了体外药物活性与体内药物活性的关联。具体地,在Hep3B细胞中表现出大于80%的敲低的45个双链体(在10nM)中,在该体外筛选中鉴定出的前4个双链体显示出最佳的体内活性(圈出的剂,即AD-1204704、AD-1204705、AD-1204708或AD-1204712)。
Figure BDA0004014902130002111
Figure BDA0004014902130002121
序列表
<110> 阿尔尼拉姆医药品有限公司
B•L•博斯特威克
彭海燕
J•D•马克辛尼克
A•卡斯托雷诺
M•K•施莱格尔
<120> 载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法
<130> 121301-11220
<140>
<141>
<150> 63/015,867
<151> 2020-04-27
<160> 739
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1166
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 1
ctactcagcc ccagcggagg tgaaggacgt ccttccccag gagccgactg gccaatcaca 60
ggcaggaaga tgaaggttct gtgggctgcg ttgctggtca cattcctggc aggatgccag 120
gccaaggtgg agcaagcggt ggagacagag ccggagcccg agctgcgcca gcagaccgag 180
tggcagagcg gccagcgctg ggaactggca ctgggtcgct tttgggatta cctgcgctgg 240
gtgcagacac tgtctgagca ggtgcaggag gagctgctca gctcccaggt cacccaggaa 300
ctgagggcgc tgatggacga gaccatgaag gagttgaagg cctacaaatc ggaactggag 360
gaacaactga ccccggtggc ggaggagacg cgggcacggc tgtccaagga gctgcaggcg 420
gcgcaggccc ggctgggcgc ggacatggag gacgtgtgcg gccgcctggt gcagtaccgc 480
ggcgaggtgc aggccatgct cggccagagc accgaggagc tgcgggtgcg cctcgcctcc 540
cacctgcgca agctgcgtaa gcggctcctc cgcgatgccg atgacctgca gaagcgcctg 600
gcagtgtacc aggccggggc ccgcgagggc gccgagcgcg gcctcagcgc catccgcgag 660
cgcctggggc ccctggtgga acagggccgc gtgcgggccg ccactgtggg ctccctggcc 720
ggccagccgc tacaggagcg ggcccaggcc tggggcgagc ggctgcgcgc gcggatggag 780
gagatgggca gccggacccg cgaccgcctg gacgaggtga aggagcaggt ggcggaggtg 840
cgcgccaagc tggaggagca ggcccagcag atacgcctgc aggccgaggc cttccaggcc 900
cgcctcaaga gctggttcga gcccctggtg gaagacatgc agcgccagtg ggccgggctg 960
gtggagaagg tgcaggctgc cgtgggcacc agcgccgccc ctgtgcccag cgacaatcac 1020
tgaacgccga agcctgcagc catgcgaccc cacgccaccc cgtgcctcct gcctccgcgc 1080
agcctgcagc gggagaccct gtccccgccc cagccgtcct cctggggtgg accctagttt 1140
aataaagatt caccaagttt cacgca 1166
<210> 2
<211> 1166
<212> DNA
<213> 人类(Homo sapiens)
<400> 2
tgcgtgaaac ttggtgaatc tttattaaac tagggtccac cccaggagga cggctggggc 60
ggggacaggg tctcccgctg caggctgcgc ggaggcagga ggcacggggt ggcgtggggt 120
cgcatggctg caggcttcgg cgttcagtga ttgtcgctgg gcacaggggc ggcgctggtg 180
cccacggcag cctgcacctt ctccaccagc ccggcccact ggcgctgcat gtcttccacc 240
aggggctcga accagctctt gaggcgggcc tggaaggcct cggcctgcag gcgtatctgc 300
tgggcctgct cctccagctt ggcgcgcacc tccgccacct gctccttcac ctcgtccagg 360
cggtcgcggg tccggctgcc catctcctcc atccgcgcgc gcagccgctc gccccaggcc 420
tgggcccgct cctgtagcgg ctggccggcc agggagccca cagtggcggc ccgcacgcgg 480
ccctgttcca ccaggggccc caggcgctcg cggatggcgc tgaggccgcg ctcggcgccc 540
tcgcgggccc cggcctggta cactgccagg cgcttctgca ggtcatcggc atcgcggagg 600
agccgcttac gcagcttgcg caggtgggag gcgaggcgca cccgcagctc ctcggtgctc 660
tggccgagca tggcctgcac ctcgccgcgg tactgcacca ggcggccgca cacgtcctcc 720
atgtccgcgc ccagccgggc ctgcgccgcc tgcagctcct tggacagccg tgcccgcgtc 780
tcctccgcca ccggggtcag ttgttcctcc agttccgatt tgtaggcctt caactccttc 840
atggtctcgt ccatcagcgc cctcagttcc tgggtgacct gggagctgag cagctcctcc 900
tgcacctgct cagacagtgt ctgcacccag cgcaggtaat cccaaaagcg acccagtgcc 960
agttcccagc gctggccgct ctgccactcg gtctgctggc gcagctcggg ctccggctct 1020
gtctccaccg cttgctccac cttggcctgg catcctgcca ggaatgtgac cagcaacgca 1080
gcccacagaa ccttcatctt cctgcctgtg attggccagt cggctcctgg ggaaggacgt 1140
ccttcacctc cgctggggct gagtag 1166
<210> 3
<211> 1212
<212> DNA
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 3
ataattggac aggtctggga tccggtcccc tgctcagacc ccggaggcta aggagttgtt 60
tcggaaggag ctggtaagac aagcttgggc tggcgattca cccagggggc ttgactggcc 120
aatcacaact gggaagatga aggctctgtg ggccctgctg ttggtcccat tgctgacagg 180
atgcctggcc gagggagagc tggaggtgac agatcagctc ccagggcaaa gcgaccaacc 240
ctgggagcag gccctgaacc gcttctggga ttacctgcgc tgggtgcaga cgctttctga 300
ccaggtccag gaagagctgc agagctccca agtcacacag gaactgacgg tactgatgga 360
ggacactatg acggaagtaa aggcatacaa aaaggagctg gaggaacagc tgggcccagt 420
ggcggaggag acacgggcca ggctggctaa agaggtgcag gcggcacagg cccgtctggg 480
agctgacatg gaggatctac gcaaccgact cgggcagtac cgcaacgagg taaacaccat 540
gctgggccag agcacagagg agctgcggtc gcgcctctcc acacacctgc gcaagatgcg 600
caagcgcctg atgcgggatg cggatgatct gcagaagcgc ctggcggtgt acaaggccgg 660
ggcacaggag ggcgccgagc gcggtgtgag tgctatccgt gagcgcctgg ggccactggt 720
ggagcagggt cgtcagcgca cagccaacct aggcgctggc gccgcccagc ccctgcgcga 780
tcgcgcccag gctttgagtg accgcatccg agggcggctg gaggaagtgg gcaaccaggc 840
ccgagaccgc ctagaggagg tgcgtgagca gatggaggag gtgcgctcca agatggagga 900
gcagacccag cagatacgcc tgcaggccga gatcttccag gcccgcatca agggctggtt 960
cgagccgcta gtggaagaca tgcagcgcca gtgggcaaac ctaatggaga agatacaggc 1020
ctctgtggct accaactcca ttgcctccac cacagtgccc ctggagaatc aatgatcatc 1080
cctcacctac gccctgccgc aacatccatg accagccagg tggccctgtc ccaagcacca 1140
ctctggccct ctggtggccc ttgcttaata aagattctcc aagcaaaaaa aaaaaaaaaa 1200
aaaaaaaaaa aa 1212
<210> 4
<211> 1212
<212> DNA
<213> 大鼠(Rattus norvegicus)
<400> 4
tttttttttt tttttttttt ttttttttgc ttggagaatc tttattaagc aagggccacc 60
agagggccag agtggtgctt gggacagggc cacctggctg gtcatggatg ttgcggcagg 120
gcgtaggtga gggatgatca ttgattctcc aggggcactg tggtggaggc aatggagttg 180
gtagccacag aggcctgtat cttctccatt aggtttgccc actggcgctg catgtcttcc 240
actagcggct cgaaccagcc cttgatgcgg gcctggaaga tctcggcctg caggcgtatc 300
tgctgggtct gctcctccat cttggagcgc acctcctcca tctgctcacg cacctcctct 360
aggcggtctc gggcctggtt gcccacttcc tccagccgcc ctcggatgcg gtcactcaaa 420
gcctgggcgc gatcgcgcag gggctgggcg gcgccagcgc ctaggttggc tgtgcgctga 480
cgaccctgct ccaccagtgg ccccaggcgc tcacggatag cactcacacc gcgctcggcg 540
ccctcctgtg ccccggcctt gtacaccgcc aggcgcttct gcagatcatc cgcatcccgc 600
atcaggcgct tgcgcatctt gcgcaggtgt gtggagaggc gcgaccgcag ctcctctgtg 660
ctctggccca gcatggtgtt tacctcgttg cggtactgcc cgagtcggtt gcgtagatcc 720
tccatgtcag ctcccagacg ggcctgtgcc gcctgcacct ctttagccag cctggcccgt 780
gtctcctccg ccactgggcc cagctgttcc tccagctcct ttttgtatgc ctttacttcc 840
gtcatagtgt cctccatcag taccgtcagt tcctgtgtga cttgggagct ctgcagctct 900
tcctggacct ggtcagaaag cgtctgcacc cagcgcaggt aatcccagaa gcggttcagg 960
gcctgctccc agggttggtc gctttgccct gggagctgat ctgtcacctc cagctctccc 1020
tcggccaggc atcctgtcag caatgggacc aacagcaggg cccacagagc cttcatcttc 1080
ccagttgtga ttggccagtc aagccccctg ggtgaatcgc cagcccaagc ttgtcttacc 1140
agctccttcc gaaacaactc cttagcctcc ggggtctgag caggggaccg gatcccagac 1200
ctgtccaatt at 1212
<210> 5
<211> 1358
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 5
tttcctctgc cctgctgtga agggggagag aacaacccgc ctcgtgacag ggggctggca 60
cagcccgccc tagccctgag gagggggcgg gacaggggga gtcctataat tggaccggtc 120
tgggatccga tcccctgctc agaccctgga ggctaaggac ttgtttcgga aggagctgga 180
gagggagctg gaatttttgg cagcggatcc accccggggt gccgagatag cgaactcggc 240
aaggggagac tggccaatca caattgcgaa gatgaaggct ctgtgggccg tgctgttggt 300
cacattgctg acaggatgcc tagccgaggg agagccggag gtgacagatc agctcgagtg 360
gcaaagcaac caaccctggg agcaggccct gaaccgcttc tgggattacc tgcgctgggt 420
gcagacgctg tctgaccagg tccaggaaga gctgcagagc tcccaagtca cacaagaact 480
gacggcactg atggaggaca ctatgacgga agtaaaggct tacaaaaagg agctggagga 540
acagctgggt ccagtggcgg aggagacacg ggccaggctg ggcaaagagg tgcaggcggc 600
acaggcccga ctcggagccg acatggagga tctacgcaac cgactcgggc agtaccgcaa 660
cgaggtgcac accatgctgg gccagagcac agaggagata cgggcgcggc tctccacaca 720
cctgcgcaag atgcgcaagc gcttgatgcg ggatgccgag gatctgcaga agcgcctagc 780
tgtgtacaag gcaggggcac gcgagggcgc cgagcgcggt gtgagtgcca tccgtgagcg 840
cctggggcct ctggtggagc aaggtcgcca gcgcactgcc aacctaggcg ctggggccgc 900
ccagcctctg cgcgatcgcg cccaggcttt tggtgaccgc atccgagggc ggctggagga 960
agtgggcaac caggcccgtg accgcctaga ggaggtgcgt gagcacatgg aggaggtgcg 1020
ctccaagatg gaggaacaga cccagcaaat acgcctgcag gcggagatct tccaggcccg 1080
cctcaagggc tggttcgagc caatagtgga agacatgcat cgccagtggg caaacctgat 1140
ggagaagata caggcctctg tggctaccaa ccccatcatc accccagtgg cccaggagaa 1200
tcaatgagta tccttctcct gtcctgcaac aacatccata tccagccagg tggccctgtc 1260
tcaagcacct ctctggccct ctggtggccc ttgcttaata aagattctcc gagcacattc 1320
tgagtctctg tgagtgattc caaaaaaaaa aaaaaaaa 1358
<210> 6
<211> 1358
<212> DNA
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 6
tttttttttt tttttttgga atcactcaca gagactcaga atgtgctcgg agaatcttta 60
ttaagcaagg gccaccagag ggccagagag gtgcttgaga cagggccacc tggctggata 120
tggatgttgt tgcaggacag gagaaggata ctcattgatt ctcctgggcc actggggtga 180
tgatggggtt ggtagccaca gaggcctgta tcttctccat caggtttgcc cactggcgat 240
gcatgtcttc cactattggc tcgaaccagc ccttgaggcg ggcctggaag atctccgcct 300
gcaggcgtat ttgctgggtc tgttcctcca tcttggagcg cacctcctcc atgtgctcac 360
gcacctcctc taggcggtca cgggcctggt tgcccacttc ctccagccgc cctcggatgc 420
ggtcaccaaa agcctgggcg cgatcgcgca gaggctgggc ggccccagcg cctaggttgg 480
cagtgcgctg gcgaccttgc tccaccagag gccccaggcg ctcacggatg gcactcacac 540
cgcgctcggc gccctcgcgt gcccctgcct tgtacacagc taggcgcttc tgcagatcct 600
cggcatcccg catcaagcgc ttgcgcatct tgcgcaggtg tgtggagagc cgcgcccgta 660
tctcctctgt gctctggccc agcatggtgt gcacctcgtt gcggtactgc ccgagtcggt 720
tgcgtagatc ctccatgtcg gctccgagtc gggcctgtgc cgcctgcacc tctttgccca 780
gcctggcccg tgtctcctcc gccactggac ccagctgttc ctccagctcc tttttgtaag 840
cctttacttc cgtcatagtg tcctccatca gtgccgtcag ttcttgtgtg acttgggagc 900
tctgcagctc ttcctggacc tggtcagaca gcgtctgcac ccagcgcagg taatcccaga 960
agcggttcag ggcctgctcc cagggttggt tgctttgcca ctcgagctga tctgtcacct 1020
ccggctctcc ctcggctagg catcctgtca gcaatgtgac caacagcacg gcccacagag 1080
ccttcatctt cgcaattgtg attggccagt ctccccttgc cgagttcgct atctcggcac 1140
cccggggtgg atccgctgcc aaaaattcca gctccctctc cagctccttc cgaaacaagt 1200
ccttagcctc cagggtctga gcaggggatc ggatcccaga ccggtccaat tataggactc 1260
cccctgtccc gccccctcct cagggctagg gcgggctgtg ccagccccct gtcacgaggc 1320
gggttgttct ctcccccttc acagcagggc agaggaaa 1358
<210> 7
<211> 1179
<212> DNA
<213> 猕猴(Macaca mulatta)
<400> 7
atgagctcag gggcctctag aaagtgtagc tgggacctcg ggaagccctg gcctccagac 60
tggccaatca caggcaggaa gatgaaggtt ctgtgggctg cgttgctggt cacattcctg 120
gcaggatgcc aggccaaggt ggagcaaccg gtggagccag agacggaacc cgagcttcgc 180
cagcaggctg aggggcagag cggccagccc tgggagctgg cactgggtcg cttttgggat 240
tacctgcgct gggtgcagac actgtctgag caggtgcagg aggagctgct cagcccccag 300
gtcacccagg aactgacgac gctgatggat gagaccatga aggagttgaa ggcctacaaa 360
tcggaactgg aggaacagct gagcccggtg gcggaggaga cgcgggcacg gctgtccaag 420
gagctacagg cggcgcaggc ccggctgggt gccgacatgg aggacgtgcg cagccgcctg 480
gtgcagtacc gcagcgaggt gcaggccatg ctgggccaga gtaccgagga gctgcgggcg 540
cgcctcgcct cccacctgcg caagctgcgc aagcggctcc tccgcgatgc tgatgacctg 600
cagaagcgcc tggcagtgta tcaggccggg gcccgcgagg gcgccgagcg cggggtcagc 660
gccatccgcg agcgcctggg acccctggtg gagcagggcc gcgtgcgggc cgccactgtg 720
ggctccctgg ccagccagcc gcttcaggag cgggcccagg ccttgggtga gcggcttcgc 780
gcacggatgg aggagatggg cagccggacc cgcgaccgcc tggacgaggt gaaggagcag 840
gtggcggagg tgcgcgccaa gctggaggaa caggcccagc agataagcct gcaggccgag 900
gccttccagg cccgcctcaa gagctggttc gagcccctgg tggaagatat gcagcgccag 960
tgggctgggc tggtggagaa ggtgcaggct gccgtgggcg ccagcaccgc ccctgtgccc 1020
agcgacaatc actgaacgcc caggcctaca gccatgcgac ccgactccac cccatgcctc 1080
ctctctccgc tcagcctgca gcgggagacc ctgtccccac cccagccgtc ctccaggggt 1140
gggccctagt ttaataaaga ttcgccaagt ttcaccgca 1179
<210> 8
<211> 1179
<212> DNA
<213> 猕猴(Macaca mulatta)
<400> 8
tgcggtgaaa cttggcgaat ctttattaaa ctagggccca cccctggagg acggctgggg 60
tggggacagg gtctcccgct gcaggctgag cggagagagg aggcatgggg tggagtcggg 120
tcgcatggct gtaggcctgg gcgttcagtg attgtcgctg ggcacagggg cggtgctggc 180
gcccacggca gcctgcacct tctccaccag cccagcccac tggcgctgca tatcttccac 240
caggggctcg aaccagctct tgaggcgggc ctggaaggcc tcggcctgca ggcttatctg 300
ctgggcctgt tcctccagct tggcgcgcac ctccgccacc tgctccttca cctcgtccag 360
gcggtcgcgg gtccggctgc ccatctcctc catccgtgcg cgaagccgct cacccaaggc 420
ctgggcccgc tcctgaagcg gctggctggc cagggagccc acagtggcgg cccgcacgcg 480
gccctgctcc accaggggtc ccaggcgctc gcggatggcg ctgaccccgc gctcggcgcc 540
ctcgcgggcc ccggcctgat acactgccag gcgcttctgc aggtcatcag catcgcggag 600
gagccgcttg cgcagcttgc gcaggtggga ggcgaggcgc gcccgcagct cctcggtact 660
ctggcccagc atggcctgca cctcgctgcg gtactgcacc aggcggctgc gcacgtcctc 720
catgtcggca cccagccggg cctgcgccgc ctgtagctcc ttggacagcc gtgcccgcgt 780
ctcctccgcc accgggctca gctgttcctc cagttccgat ttgtaggcct tcaactcctt 840
catggtctca tccatcagcg tcgtcagttc ctgggtgacc tgggggctga gcagctcctc 900
ctgcacctgc tcagacagtg tctgcaccca gcgcaggtaa tcccaaaagc gacccagtgc 960
cagctcccag ggctggccgc tctgcccctc agcctgctgg cgaagctcgg gttccgtctc 1020
tggctccacc ggttgctcca ccttggcctg gcatcctgcc aggaatgtga ccagcaacgc 1080
agcccacaga accttcatct tcctgcctgt gattggccag tctggaggcc agggcttccc 1140
gaggtcccag ctacactttc tagaggcccc tgagctcat 1179
<210> 9
<211> 1179
<212> DNA
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 9
atgagctcag gcgcctctag aaagtgtagc tgggacctcg ggaagccctg gcctccagac 60
tggccaatca caggcaggaa gatgaaggtt ctgtgggctg cgttgctggt cacattcctg 120
gcaggatgcc aggccaaggt ggagcaaccg gtggagccag agacggaacc cgagcttcgc 180
cagcaggctg aggggcagag cggccagccc tgggagctgg cactgggtcg cttttgggat 240
tacctgcgct gggtgcagac actgtctgag caggtgcagg aggagctgct cagcccccag 300
gtcacccagg aactgacgac gctgatggat gagaccatga aggagttgaa ggcctacaaa 360
tcggaactgg aggaacagct gagcccggtg gcggaggaga cgcgggcacg gctgtccaag 420
gagctgcagg cggcgcaggc ccggctgggt gccgacatgg aggacgtgcg cagccgcctg 480
gtgcagtacc gcagcgaggt gcaggccatg ctgggccaga gtaccgagga gctgcgggcg 540
cgcctcgcct cccacctgcg caagctgcgc aagcggctcc tccgcgatgc tgatgacctg 600
cagaagcgcc tggcagtgta tcaggccggg gcccgcgagg gcgccgagcg cggggtcagc 660
gccatccgcg agcgcctggg acccctggtg gagcagggcc gcgtgcgggc cgccactgtg 720
ggctccctgg ccagccagcc gcttcaggag cgggcccagg ccttgggtga gcggcttcgc 780
gcacggatgg aggagatggg cagccggacc cgcgaccgcc tggacgaggt gaaggagcag 840
gtggcggagg tgcgcgccaa gctggaggaa caggcccagc agataagcct gcaggccgag 900
gccttccagg cccgcctcaa gagctggttc gagcccctcg tggaagatat gcagcgccag 960
tgggctgggc tggtggagaa ggtgcaggct gccgtgggcg ccagcaccgc ccctgtgccc 1020
agcgacaatc actgaacgcc caggcctaca gccatgcgac ccgactccac cccatgcctc 1080
ctctctccgc tcagcctgca gcgggagacc ctgtccccgc cccagccgtc ctccaggggt 1140
gggccctagt ttaataaaga ttcgccaagt ttcaccgca 1179
<210> 10
<211> 1179
<212> DNA
<213> 食蟹猴(Macaca fascicularis)
<400> 10
tgcggtgaaa cttggcgaat ctttattaaa ctagggccca cccctggagg acggctgggg 60
cggggacagg gtctcccgct gcaggctgag cggagagagg aggcatgggg tggagtcggg 120
tcgcatggct gtaggcctgg gcgttcagtg attgtcgctg ggcacagggg cggtgctggc 180
gcccacggca gcctgcacct tctccaccag cccagcccac tggcgctgca tatcttccac 240
gaggggctcg aaccagctct tgaggcgggc ctggaaggcc tcggcctgca ggcttatctg 300
ctgggcctgt tcctccagct tggcgcgcac ctccgccacc tgctccttca cctcgtccag 360
gcggtcgcgg gtccggctgc ccatctcctc catccgtgcg cgaagccgct cacccaaggc 420
ctgggcccgc tcctgaagcg gctggctggc cagggagccc acagtggcgg cccgcacgcg 480
gccctgctcc accaggggtc ccaggcgctc gcggatggcg ctgaccccgc gctcggcgcc 540
ctcgcgggcc ccggcctgat acactgccag gcgcttctgc aggtcatcag catcgcggag 600
gagccgcttg cgcagcttgc gcaggtggga ggcgaggcgc gcccgcagct cctcggtact 660
ctggcccagc atggcctgca cctcgctgcg gtactgcacc aggcggctgc gcacgtcctc 720
catgtcggca cccagccggg cctgcgccgc ctgcagctcc ttggacagcc gtgcccgcgt 780
ctcctccgcc accgggctca gctgttcctc cagttccgat ttgtaggcct tcaactcctt 840
catggtctca tccatcagcg tcgtcagttc ctgggtgacc tgggggctga gcagctcctc 900
ctgcacctgc tcagacagtg tctgcaccca gcgcaggtaa tcccaaaagc gacccagtgc 960
cagctcccag ggctggccgc tctgcccctc agcctgctgg cgaagctcgg gttccgtctc 1020
tggctccacc ggttgctcca ccttggcctg gcatcctgcc aggaatgtga ccagcaacgc 1080
agcccacaga accttcatct tcctgcctgt gattggccag tctggaggcc agggcttccc 1140
gaggtcccag ctacactttc tagaggcgcc tgagctcat 1179
<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:RFGF肽(/note="Description of Unknown:
RFGF peptide")
<400> 11
Ala Ala Val Ala Leu Leu Pro Ala Val Leu Leu Ala Leu Leu Ala Pro
1               5                   10                  15
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:RFGF模拟肽(/note="Description of Unknown:
RFGF analogue peptide")
<400> 12
Ala Ala Leu Leu Pro Val Leu Leu Ala Ala Pro
1               5                   10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus)
<400> 13
Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln
1               5                   10
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> 果蝇(Drosophila sp.)
<400> 14
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1               5                   10                  15
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 15
ggccaaucac aggcaggaag u 21
<210> 16
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 16
caggcaggaa gaugaagguu u 21
<210> 17
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 17
aggaagauga agguucugug u 21
<210> 18
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 18
augaagguuc ugugggcugc u 21
<210> 19
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 19
uucugugggc ugcguugcug u 21
<210> 20
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 20
ugggcugcgu ugcuggucac u 21
<210> 21
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 21
gcguugcugg ucacauuccu u 21
<210> 22
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 22
gcuggucaca uuccuggcag u 21
<210> 23
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 23
ucacauuccu ggcaggaugc u 21
<210> 24
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 24
uggcaggaug ccaggccaag u 21
<210> 25
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 25
caggccaagg uggagcaagc u 21
<210> 26
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 26
aagguggagc aagcggugga u 21
<210> 27
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 27
caagcggugg agacagagcc u 21
<210> 28
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 28
gguggagaca gagccggagc u 21
<210> 29
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 29
cccgagcugc gccagcagac u 21
<210> 30
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 30
gcugcgccag cagaccgagu u 21
<210> 31
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 31
ccagcagacc gaguggcaga u 21
<210> 32
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 32
cagcgcuggg aacuggcacu u 21
<210> 33
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 33
cugggaacug gcacuggguc u 21
<210> 34
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 34
aacuggcacu gggucgcuuu u 21
<210> 35
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 35
cacugggucg cuuuugggau u 21
<210> 36
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 36
gucgcuuuug ggauuaccug u 21
<210> 37
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 37
uuuugggauu accugcgcug u 21
<210> 38
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 38
cugcgcuggg ugcagacacu u 21
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 39
ugggugcaga cacugucuga u 21
<210> 40
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 40
cagacacugu cugagcaggu u 21
<210> 41
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 41
caggaggagc ugcucagcuc u 21
<210> 42
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 42
cugcucagcu cccaggucac u 21
<210> 43
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 43
ucccagguca cccaggaacu u 21
<210> 44
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 44
acccaggaac ugagggcgcu u 21
<210> 45
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 45
ugagggcgcu gauggacgag u 21
<210> 46
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 46
gcgcugaugg acgagaccau u 21
<210> 47
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 47
gacgagacca ugaaggaguu u 21
<210> 48
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 48
accaugaagg aguugaaggc u 21
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 49
ggaguugaag gccuacaaau u 21
<210> 50
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 50
aaggccuaca aaucggaacu u 21
<210> 51
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 51
acaaaucgga acuggaggaa u 21
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 52
ucggaacugg aggaacaacu u 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 53
gaggaacaac ugaccccggu u 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 54
cgcgggcacg gcuguccaag u 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 55
gcacggcugu ccaaggagcu u 21
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 56
gcuguccaag gagcugcagg u 21
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 57
gcccggcugg gcgcggacau u 21
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 58
cugggcgcgg acauggagga u 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 59
cgcggacaug gaggacgugc u 21
<210> 60
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 60
gcggacaugg aggacgugug u 21
<210> 61
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 61
gcggacaugg aggacgugcg u 21
<210> 62
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 62
cggacaugga ggacgugcgc u 21
<210> 63
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 63
ggacauggag gacgugcgcg u 21
<210> 64
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 64
gacauggagg acgugcgcgg u 21
<210> 65
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 65
acauggagga cgugcgcggc u 21
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 66
cauggaggac gugcgcggcc u 21
<210> 67
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 67
auggaggacg ugcgcggccg u 21
<210> 68
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 68
uggaggacgu gcgcggccgc u 21
<210> 69
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 69
ggaggacgug cgcggccgcc u 21
<210> 70
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 70
gaggacgugc gcggccgccu u 21
<210> 71
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 71
aggacgugcg cggccgccug u 21
<210> 72
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 72
ggacgugcgc ggccgccugg u 21
<210> 73
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 73
gacgugcgcg gccgccuggu u 21
<210> 74
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 74
acgugcgcgg ccgccuggug u 21
<210> 75
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 75
cgugcgcggc cgccuggugc u 21
<210> 76
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 76
gugcgcggcc gccuggugca u 21
<210> 77
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 77
gcggccgccu ggugcaguac u 21
<210> 78
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 78
cgccuggugc aguaccgcgg u 21
<210> 79
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 79
gaggugcagg ccaugcucgg u 21
<210> 80
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 80
gccaugcucg gccagagcac u 21
<210> 81
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 81
ggccagagca ccgaggagcu u 21
<210> 82
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 82
gcugcgggug cgccucgccu u 21
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 83
gugcgccucg ccucccaccu u 21
<210> 84
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 84
cgccucccac cugcgcaagc u 21
<210> 85
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 85
cccaccugcg caagcugcgu u 21
<210> 86
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 86
cugcgcaagc ugcguaagcg u 21
<210> 87
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 87
aagcugcgua agcggcuccu u 21
<210> 88
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 88
guaagcggcu ccuccgcgau u 21
<210> 89
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 89
ggcuccuccg cgaugccgau u 21
<210> 90
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 90
cuccgcgaug ccgaugaccu u 21
<210> 91
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 91
gaugccgaug accugcagaa u 21
<210> 92
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 92
gaugaccugc agaagcgccu u 21
<210> 93
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 93
cugcagaagc gccuggcagu u 21
<210> 94
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 94
aagcgccugg caguguacca u 21
<210> 95
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 95
cuggcagugu accaggccgg u 21
<210> 96
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 96
gagcgcggcc ucagcgccau u 21
<210> 97
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 97
cggccucagc gccauccgcg u 21
<210> 98
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 98
agcgccaucc gcgagcgccu u 21
<210> 99
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 99
uggggccccu gguggaacag u 21
<210> 100
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 100
ccccuggugg aacagggccg u 21
<210> 101
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 101
cgcgugcggg ccgccacugu u 21
<210> 102
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 102
gccgccacug ugggcucccu u 21
<210> 103
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 103
ccuggccggc cagccgcuac u 21
<210> 104
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 104
ggccagccgc uacaggagcg u 21
<210> 105
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 105
gccgcuacag gagcgggccc u 21
<210> 106
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 106
gcgcggaugg aggagauggg u 21
<210> 107
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 107
cgcgaccgcc uggacgaggu u 21
<210> 108
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 108
gccuggacga ggugaaggag u 21
<210> 109
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 109
gacgagguga aggagcaggu u 21
<210> 110
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 110
ggaggugcgc gccaagcugg u 21
<210> 111
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 111
cgcgccaagc uggaggagca u 21
<210> 112
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 112
caggcccagc agauacgccu u 21
<210> 113
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 113
ccagcagaua cgccugcagg u 21
<210> 114
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 114
cgccugcagg ccgaggccuu u 21
<210> 115
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 115
gcaggccgag gccuuccagg u 21
<210> 116
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 116
ccgaggccuu ccaggcccgc u 21
<210> 117
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 117
gccuuccagg cccgccucaa u 21
<210> 118
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 118
ccaggcccgc cucaagagcu u 21
<210> 119
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 119
ccgccucaag agcugguucg u 21
<210> 120
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 120
caagagcugg uucgagcccc u 21
<210> 121
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 121
agccccuggu ggaagacaug u 21
<210> 122
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 122
cugguggaag acaugcagcg u 21
<210> 123
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 123
ggaagacaug cagcgccagu u 21
<210> 124
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 124
gccgggcugg uggagaaggu u 21
<210> 125
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 125
gcugguggag aaggugcagg u 21
<210> 126
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 126
accagcgccg ccccugugcc u 21
<210> 127
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 127
gccccugugc ccagcgacaa u 21
<210> 128
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 128
ugugcccagc gacaaucacu u 21
<210> 129
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 129
cagcgacaau cacugaacgc u 21
<210> 130
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 130
caaucacuga acgccgaagc u 21
<210> 131
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 131
acugaacgcc gaagccugca u 21
<210> 132
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 132
acgccgaagc cugcagccau u 21
<210> 133
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 133
gaagccugca gccaugcgac u 21
<210> 134
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 134
ugcagccaug cgaccccacg u 21
<210> 135
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 135
gcgaccccac gccaccccgu u 21
<210> 136
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 136
cccacgccac cccgugccuc u 21
<210> 137
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 137
ccaccccgug ccuccugccu u 21
<210> 138
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 138
cgugccuccu gccuccgcgc u 21
<210> 139
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 139
cuccugccuc cgcgcagccu u 21
<210> 140
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 140
gccuccgcgc agccugcagc u 21
<210> 141
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 141
ccuguccccg ccccagccgu u 21
<210> 142
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 142
cccgccccag ccguccuccu u 21
<210> 143
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 143
cccagccguc cuccuggggu u 21
<210> 144
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 144
uccuggggug gacccuaguu u 21
<210> 145
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 145
ggguggaccc uaguuuaaua u 21
<210> 146
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 146
gacccuaguu uaauaaagau u 21
<210> 147
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 147
uaguuuaaua aagauucacc u 21
<210> 148
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 148
uaauaaagau ucaccaaguu u 21
<210> 149
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 149
agauucacca aguuucacgc u 21
<210> 150
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 150
acuuccugcc ugugauuggc cag 23
<210> 151
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 151
aaaccuucau cuuccugccu gug 23
<210> 152
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 152
acacagaacc uucaucuucc ugc 23
<210> 153
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 153
agcagcccac agaaccuuca ucu 23
<210> 154
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 154
acagcaacgc agcccacaga acc 23
<210> 155
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 155
agugaccagc aacgcagccc aca 23
<210> 156
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 156
aaggaaugug accagcaacg cag 23
<210> 157
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 157
acugccagga augugaccag caa 23
<210> 158
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 158
agcauccugc caggaaugug acc 23
<210> 159
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 159
acuuggccug gcauccugcc agg 23
<210> 160
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 160
agcuugcucc accuuggccu ggc 23
<210> 161
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 161
auccaccgcu ugcuccaccu ugg 23
<210> 162
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 162
aggcucuguc uccaccgcuu gcu 23
<210> 163
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 163
agcuccggcu cugucuccac cgc 23
<210> 164
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 164
agucugcugg cgcagcucgg gcu 23
<210> 165
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 165
aacucggucu gcuggcgcag cuc 23
<210> 166
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 166
aucugccacu cggucugcug gcg 23
<210> 167
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 167
aagugccagu ucccagcgcu ggc 23
<210> 168
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 168
agacccagug ccaguuccca gcg 23
<210> 169
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 169
aaaagcgacc cagugccagu ucc 23
<210> 170
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 170
aaucccaaaa gcgacccagu gcc 23
<210> 171
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 171
acagguaauc ccaaaagcga ccc 23
<210> 172
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 172
acagcgcagg uaaucccaaa agc 23
<210> 173
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 173
aagugucugc acccagcgca ggu 23
<210> 174
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 174
aucagacagu gucugcaccc agc 23
<210> 175
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 175
aaccugcuca gacagugucu gca 23
<210> 176
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 176
agagcugagc agcuccuccu gca 23
<210> 177
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 177
agugaccugg gagcugagca gcu 23
<210> 178
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 178
aaguuccugg gugaccuggg agc 23
<210> 179
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 179
aagcgcccuc aguuccuggg uga 23
<210> 180
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 180
acucguccau cagcgcccuc agu 23
<210> 181
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 181
aauggucucg uccaucagcg ccc 23
<210> 182
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 182
aaacuccuuc auggucucgu cca 23
<210> 183
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 183
agccuucaac uccuucaugg ucu 23
<210> 184
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 184
aauuuguagg ccuucaacuc cuu 23
<210> 185
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 185
aaguuccgau uuguaggccu uca 23
<210> 186
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 186
auuccuccag uuccgauuug uag 23
<210> 187
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 187
aaguuguucc uccaguuccg auu 23
<210> 188
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 188
aaccgggguc aguuguuccu cca 23
<210> 189
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 189
acuuggacag ccgugcccgc guc 23
<210> 190
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 190
aagcuccuug gacagccgug ccc 23
<210> 191
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 191
accugcagcu ccuuggacag ccg 23
<210> 192
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 192
aauguccgcg cccagccggg ccu 23
<210> 193
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 193
auccuccaug uccgcgccca gcc 23
<210> 194
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 194
agcacguccu ccauguccgc gcc 23
<210> 195
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 195
acacacgucc uccauguccg cgc 23
<210> 196
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 196
acgcacgucc uccauguccg cgc 23
<210> 197
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 197
agcgcacguc cuccaugucc gcg 23
<210> 198
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 198
acgcgcacgu ccuccauguc cgc 23
<210> 199
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 199
accgcgcacg uccuccaugu ccg 23
<210> 200
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 200
agccgcgcac guccuccaug ucc 23
<210> 201
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 201
aggccgcgca cguccuccau guc 23
<210> 202
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 202
acggccgcgc acguccucca ugu 23
<210> 203
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 203
agcggccgcg cacguccucc aug 23
<210> 204
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 204
aggcggccgc gcacguccuc cau 23
<210> 205
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 205
aaggcggccg cgcacguccu cca 23
<210> 206
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 206
acaggcggcc gcgcacgucc ucc 23
<210> 207
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 207
accaggcggc cgcgcacguc cuc 23
<210> 208
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 208
aaccaggcgg ccgcgcacgu ccu 23
<210> 209
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 209
acaccaggcg gccgcgcacg ucc 23
<210> 210
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 210
agcaccaggc ggccgcgcac guc 23
<210> 211
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 211
augcaccagg cggccgcgca cgu 23
<210> 212
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 212
aguacugcac caggcggccg cac 23
<210> 213
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 213
accgcgguac ugcaccaggc ggc 23
<210> 214
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 214
accgagcaug gccugcaccu cgc 23
<210> 215
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 215
agugcucugg ccgagcaugg ccu 23
<210> 216
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 216
aagcuccucg gugcucuggc cga 23
<210> 217
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 217
aaggcgaggc gcacccgcag cuc 23
<210> 218
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 218
aaggugggag gcgaggcgca ccc 23
<210> 219
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 219
agcuugcgca ggugggaggc gag 23
<210> 220
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 220
aacgcagcuu gcgcaggugg gag 23
<210> 221
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 221
acgcuuacgc agcuugcgca ggu 23
<210> 222
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 222
aaggagccgc uuacgcagcu ugc 23
<210> 223
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 223
aaucgcggag gagccgcuua cgc 23
<210> 224
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 224
aaucggcauc gcggaggagc cgc 23
<210> 225
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 225
aaggucaucg gcaucgcgga gga 23
<210> 226
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 226
auucugcagg ucaucggcau cgc 23
<210> 227
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 227
aaggcgcuuc ugcaggucau cgg 23
<210> 228
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 228
aacugccagg cgcuucugca ggu 23
<210> 229
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 229
augguacacu gccaggcgcu ucu 23
<210> 230
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 230
accggccugg uacacugcca ggc 23
<210> 231
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 231
aauggcgcug aggccgcgcu cgg 23
<210> 232
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 232
acgcggaugg cgcugaggcc gcg 23
<210> 233
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 233
aaggcgcucg cggauggcgc uga 23
<210> 234
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 234
acuguuccac caggggcccc agg 23
<210> 235
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 235
acggcccugu uccaccaggg gcc 23
<210> 236
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 236
aacaguggcg gcccgcacgc ggc 23
<210> 237
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 237
aagggagccc acaguggcgg ccc 23
<210> 238
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 238
aguagcggcu ggccggccag gga 23
<210> 239
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 239
acgcuccugu agcggcuggc cgg 23
<210> 240
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 240
agggcccgcu ccuguagcgg cug 23
<210> 241
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 241
acccaucucc uccauccgcg cgc 23
<210> 242
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 242
aaccucgucc aggcggucgc ggg 23
<210> 243
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 243
acuccuucac cucguccagg cgg 23
<210> 244
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 244
aaccugcucc uucaccucgu cca 23
<210> 245
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 245
accagcuugg cgcgcaccuc cgc 23
<210> 246
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 246
augcuccucc agcuuggcgc gca 23
<210> 247
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 247
aaggcguauc ugcugggccu gcu 23
<210> 248
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 248
accugcaggc guaucugcug ggc 23
<210> 249
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 249
aaaggccucg gccugcaggc gua 23
<210> 250
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 250
accuggaagg ccucggccug cag 23
<210> 251
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 251
agcgggccug gaaggccucg gcc 23
<210> 252
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 252
auugaggcgg gccuggaagg ccu 23
<210> 253
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 253
aagcucuuga ggcgggccug gaa 23
<210> 254
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 254
acgaaccagc ucuugaggcg ggc 23
<210> 255
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 255
aggggcucga accagcucuu gag 23
<210> 256
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 256
acaugucuuc caccaggggc ucg 23
<210> 257
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 257
acgcugcaug ucuuccacca ggg 23
<210> 258
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 258
aacuggcgcu gcaugucuuc cac 23
<210> 259
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 259
aaccuucucc accagcccgg ccc 23
<210> 260
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 260
accugcaccu ucuccaccag ccc 23
<210> 261
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 261
aggcacaggg gcggcgcugg ugc 23
<210> 262
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 262
auugucgcug ggcacagggg cgg 23
<210> 263
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 263
aagugauugu cgcugggcac agg 23
<210> 264
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 264
agcguucagu gauugucgcu ggg 23
<210> 265
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 265
agcuucggcg uucagugauu guc 23
<210> 266
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 266
augcaggcuu cggcguucag uga 23
<210> 267
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 267
aauggcugca ggcuucggcg uuc 23
<210> 268
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 268
agucgcaugg cugcaggcuu cgg 23
<210> 269
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 269
acgugggguc gcauggcugc agg 23
<210> 270
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 270
aacggggugg cguggggucg cau 23
<210> 271
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 271
agaggcacgg gguggcgugg ggu 23
<210> 272
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 272
aaggcaggag gcacggggug gcg 23
<210> 273
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 273
agcgcggagg caggaggcac ggg 23
<210> 274
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 274
aaggcugcgc ggaggcagga ggc 23
<210> 275
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 275
agcugcaggc ugcgcggagg cag 23
<210> 276
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 276
aacggcuggg gcggggacag ggu 23
<210> 277
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 277
aaggaggacg gcuggggcgg gga 23
<210> 278
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 278
aaccccagga ggacggcugg ggc 23
<210> 279
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 279
aaacuagggu ccaccccagg agg 23
<210> 280
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 280
auauuaaacu aggguccacc cca 23
<210> 281
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 281
aaucuuuauu aaacuagggu cca 23
<210> 282
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 282
aggugaaucu uuauuaaacu agg 23
<210> 283
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 283
aaacuuggug aaucuuuauu aaa 23
<210> 284
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 284
agcgugaaac uuggugaauc uuu 23
<210> 285
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 285
ggccaaucac aggcaggaag u 21
<210> 286
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 286
caggcaggaa gaugaagguu u 21
<210> 287
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 287
aggaagauga agguucugug u 21
<210> 288
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 288
augaagguuc ugugggcugc u 21
<210> 289
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 289
uucugugggc ugcguugcug u 21
<210> 290
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 290
ugggcugcgu ugcuggucac u 21
<210> 291
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 291
gcguugcugg ucacauuccu u 21
<210> 292
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 292
gcuggucaca uuccuggcag u 21
<210> 293
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 293
ucacauuccu ggcaggaugc u 21
<210> 294
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 294
uggcaggaug ccaggccaag u 21
<210> 295
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 295
caggccaagg uggagcaagc u 21
<210> 296
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 296
aagguggagc aagcggugga u 21
<210> 297
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 297
caagcggugg agacagagcc u 21
<210> 298
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 298
gguggagaca gagccggagc u 21
<210> 299
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 299
cccgagcugc gccagcagac u 21
<210> 300
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 300
gcugcgccag cagaccgagu u 21
<210> 301
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 301
ccagcagacc gaguggcaga u 21
<210> 302
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 302
cagcgcuggg aacuggcacu u 21
<210> 303
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 303
cugggaacug gcacuggguc u 21
<210> 304
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 304
aacuggcacu gggucgcuuu u 21
<210> 305
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 305
cacugggucg cuuuugggau u 21
<210> 306
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 306
gucgcuuuug ggauuaccug u 21
<210> 307
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 307
uuuugggauu accugcgcug u 21
<210> 308
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 308
cugcgcuggg ugcagacacu u 21
<210> 309
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 309
ugggugcaga cacugucuga u 21
<210> 310
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 310
cagacacugu cugagcaggu u 21
<210> 311
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 311
caggaggagc ugcucagcuc u 21
<210> 312
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 312
cugcucagcu cccaggucac u 21
<210> 313
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 313
ucccagguca cccaggaacu u 21
<210> 314
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 314
acccaggaac ugagggcgcu u 21
<210> 315
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 315
ugagggcgcu gauggacgag u 21
<210> 316
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 316
gcgcugaugg acgagaccau u 21
<210> 317
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 317
gacgagacca ugaaggaguu u 21
<210> 318
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 318
accaugaagg aguugaaggc u 21
<210> 319
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 319
ggaguugaag gccuacaaau u 21
<210> 320
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 320
aaggccuaca aaucggaacu u 21
<210> 321
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 321
acaaaucgga acuggaggaa u 21
<210> 322
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 322
ucggaacugg aggaacaacu u 21
<210> 323
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 323
gaggaacaac ugaccccggu u 21
<210> 324
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 324
cgcgggcacg gcuguccaag u 21
<210> 325
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 325
gcacggcugu ccaaggagcu u 21
<210> 326
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 326
gcuguccaag gagcugcagg u 21
<210> 327
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 327
gcccggcugg gcgcggacau u 21
<210> 328
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 328
cugggcgcgg acauggagga u 21
<210> 329
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 329
cgcggacaug gaggacgugc u 21
<210> 330
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 330
gcggacaugg aggacgugug u 21
<210> 331
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 331
gcggacaugg aggacgugcg u 21
<210> 332
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 332
cggacaugga ggacgugcgc u 21
<210> 333
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 333
ggacauggag gacgugcgcg u 21
<210> 334
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 334
gacauggagg acgugcgcgg u 21
<210> 335
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 335
acauggagga cgugcgcggc u 21
<210> 336
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 336
cauggaggac gugcgcggcc u 21
<210> 337
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 337
auggaggacg ugcgcggccg u 21
<210> 338
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 338
uggaggacgu gcgcggccgc u 21
<210> 339
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 339
ggaggacgug cgcggccgcc u 21
<210> 340
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 340
gaggacgugc gcggccgccu u 21
<210> 341
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 341
aggacgugcg cggccgccug u 21
<210> 342
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 342
ggacgugcgc ggccgccugg u 21
<210> 343
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 343
gacgugcgcg gccgccuggu u 21
<210> 344
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 344
acgugcgcgg ccgccuggug u 21
<210> 345
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 345
cgugcgcggc cgccuggugc u 21
<210> 346
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 346
gugcgcggcc gccuggugca u 21
<210> 347
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 347
gcggccgccu ggugcaguac u 21
<210> 348
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 348
cgccuggugc aguaccgcgg u 21
<210> 349
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 349
gaggugcagg ccaugcucgg u 21
<210> 350
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 350
gccaugcucg gccagagcac u 21
<210> 351
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 351
ggccagagca ccgaggagcu u 21
<210> 352
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 352
gcugcgggug cgccucgccu u 21
<210> 353
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 353
gugcgccucg ccucccaccu u 21
<210> 354
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 354
cgccucccac cugcgcaagc u 21
<210> 355
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 355
cccaccugcg caagcugcgu u 21
<210> 356
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 356
cugcgcaagc ugcguaagcg u 21
<210> 357
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 357
aagcugcgua agcggcuccu u 21
<210> 358
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 358
guaagcggcu ccuccgcgau u 21
<210> 359
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 359
ggcuccuccg cgaugccgau u 21
<210> 360
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 360
cuccgcgaug ccgaugaccu u 21
<210> 361
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 361
gaugccgaug accugcagaa u 21
<210> 362
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 362
gaugaccugc agaagcgccu u 21
<210> 363
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 363
cugcagaagc gccuggcagu u 21
<210> 364
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 364
aagcgccugg caguguacca u 21
<210> 365
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 365
cuggcagugu accaggccgg u 21
<210> 366
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 366
gagcgcggcc ucagcgccau u 21
<210> 367
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 367
cggccucagc gccauccgcg u 21
<210> 368
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 368
agcgccaucc gcgagcgccu u 21
<210> 369
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 369
uggggccccu gguggaacag u 21
<210> 370
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 370
ccccuggugg aacagggccg u 21
<210> 371
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 371
cgcgugcggg ccgccacugu u 21
<210> 372
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 372
gccgccacug ugggcucccu u 21
<210> 373
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 373
ccuggccggc cagccgcuac u 21
<210> 374
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 374
ggccagccgc uacaggagcg u 21
<210> 375
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 375
gccgcuacag gagcgggccc u 21
<210> 376
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 376
gcgcggaugg aggagauggg u 21
<210> 377
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 377
cgcgaccgcc uggacgaggu u 21
<210> 378
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 378
gccuggacga ggugaaggag u 21
<210> 379
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 379
gacgagguga aggagcaggu u 21
<210> 380
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 380
ggaggugcgc gccaagcugg u 21
<210> 381
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 381
cgcgccaagc uggaggagca u 21
<210> 382
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 382
caggcccagc agauacgccu u 21
<210> 383
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 383
ccagcagaua cgccugcagg u 21
<210> 384
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 384
cgccugcagg ccgaggccuu u 21
<210> 385
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 385
gcaggccgag gccuuccagg u 21
<210> 386
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 386
ccgaggccuu ccaggcccgc u 21
<210> 387
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 387
gccuuccagg cccgccucaa u 21
<210> 388
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 388
ccaggcccgc cucaagagcu u 21
<210> 389
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 389
ccgccucaag agcugguucg u 21
<210> 390
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 390
caagagcugg uucgagcccc u 21
<210> 391
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 391
agccccuggu ggaagacaug u 21
<210> 392
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 392
cugguggaag acaugcagcg u 21
<210> 393
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 393
ggaagacaug cagcgccagu u 21
<210> 394
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 394
gccgggcugg uggagaaggu u 21
<210> 395
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 395
gcugguggag aaggugcagg u 21
<210> 396
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 396
accagcgccg ccccugugcc u 21
<210> 397
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 397
gccccugugc ccagcgacaa u 21
<210> 398
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 398
ugugcccagc gacaaucacu u 21
<210> 399
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 399
cagcgacaau cacugaacgc u 21
<210> 400
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 400
caaucacuga acgccgaagc u 21
<210> 401
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 401
acugaacgcc gaagccugca u 21
<210> 402
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 402
acgccgaagc cugcagccau u 21
<210> 403
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 403
gaagccugca gccaugcgac u 21
<210> 404
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 404
ugcagccaug cgaccccacg u 21
<210> 405
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 405
gcgaccccac gccaccccgu u 21
<210> 406
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 406
cccacgccac cccgugccuc u 21
<210> 407
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 407
ccaccccgug ccuccugccu u 21
<210> 408
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 408
cgugccuccu gccuccgcgc u 21
<210> 409
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 409
cuccugccuc cgcgcagccu u 21
<210> 410
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 410
gccuccgcgc agccugcagc u 21
<210> 411
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 411
ccuguccccg ccccagccgu u 21
<210> 412
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 412
cccgccccag ccguccuccu u 21
<210> 413
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 413
cccagccguc cuccuggggu u 21
<210> 414
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 414
uccuggggug gacccuaguu u 21
<210> 415
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 415
ggguggaccc uaguuuaaua u 21
<210> 416
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 416
gacccuaguu uaauaaagau u 21
<210> 417
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 417
uaguuuaaua aagauucacc u 21
<210> 418
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 418
uaauaaagau ucaccaaguu u 21
<210> 419
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 419
agauucacca aguuucacgc u 21
<210> 420
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 420
acuuccugcc ugugauuggc cag 23
<210> 421
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 421
aaaccuucau cuuccugccu gug 23
<210> 422
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 422
acacagaacc uucaucuucc ugc 23
<210> 423
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 423
agcagcccac agaaccuuca ucu 23
<210> 424
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 424
acagcaacgc agcccacaga acc 23
<210> 425
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 425
agugaccagc aacgcagccc aca 23
<210> 426
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 426
aaggaaugug accagcaacg cag 23
<210> 427
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 427
acugccagga augugaccag caa 23
<210> 428
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 428
agcauccugc caggaaugug acc 23
<210> 429
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 429
acuuggccug gcauccugcc agg 23
<210> 430
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 430
agcuugcucc accuuggccu ggc 23
<210> 431
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 431
auccaccgcu ugcuccaccu ugg 23
<210> 432
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 432
aggcucuguc uccaccgcuu gcu 23
<210> 433
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 433
agcuccggcu cugucuccac cgc 23
<210> 434
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 434
agucugcugg cgcagcucgg gcu 23
<210> 435
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 435
aacucggucu gcuggcgcag cuc 23
<210> 436
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 436
aucugccacu cggucugcug gcg 23
<210> 437
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 437
aagugccagu ucccagcgcu ggc 23
<210> 438
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 438
agacccagug ccaguuccca gcg 23
<210> 439
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 439
aaaagcgacc cagugccagu ucc 23
<210> 440
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 440
aaucccaaaa gcgacccagu gcc 23
<210> 441
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 441
acagguaauc ccaaaagcga ccc 23
<210> 442
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 442
acagcgcagg uaaucccaaa agc 23
<210> 443
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 443
aagugucugc acccagcgca ggu 23
<210> 444
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 444
aucagacagu gucugcaccc agc 23
<210> 445
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 445
aaccugcuca gacagugucu gca 23
<210> 446
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 446
agagcugagc agcuccuccu gca 23
<210> 447
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 447
agugaccugg gagcugagca gcu 23
<210> 448
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 448
aaguuccugg gugaccuggg agc 23
<210> 449
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 449
aagcgcccuc aguuccuggg uga 23
<210> 450
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 450
acucguccau cagcgcccuc agu 23
<210> 451
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 451
aauggucucg uccaucagcg ccc 23
<210> 452
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 452
aaacuccuuc auggucucgu cca 23
<210> 453
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 453
agccuucaac uccuucaugg ucu 23
<210> 454
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 454
aauuuguagg ccuucaacuc cuu 23
<210> 455
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 455
aaguuccgau uuguaggccu uca 23
<210> 456
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 456
auuccuccag uuccgauuug uag 23
<210> 457
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 457
aaguuguucc uccaguuccg auu 23
<210> 458
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 458
aaccgggguc aguuguuccu cca 23
<210> 459
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 459
acuuggacag ccgugcccgc guc 23
<210> 460
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 460
aagcuccuug gacagccgug ccc 23
<210> 461
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 461
accugcagcu ccuuggacag ccg 23
<210> 462
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 462
aauguccgcg cccagccggg ccu 23
<210> 463
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 463
auccuccaug uccgcgccca gcc 23
<210> 464
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 464
agcacguccu ccauguccgc gcc 23
<210> 465
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 465
acacacgucc uccauguccg cgc 23
<210> 466
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 466
acgcacgucc uccauguccg cgc 23
<210> 467
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 467
agcgcacguc cuccaugucc gcg 23
<210> 468
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 468
acgcgcacgu ccuccauguc cgc 23
<210> 469
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 469
accgcgcacg uccuccaugu ccg 23
<210> 470
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 470
agccgcgcac guccuccaug ucc 23
<210> 471
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 471
aggccgcgca cguccuccau guc 23
<210> 472
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 472
acggccgcgc acguccucca ugu 23
<210> 473
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 473
agcggccgcg cacguccucc aug 23
<210> 474
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 474
aggcggccgc gcacguccuc cau 23
<210> 475
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 475
aaggcggccg cgcacguccu cca 23
<210> 476
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 476
acaggcggcc gcgcacgucc ucc 23
<210> 477
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 477
accaggcggc cgcgcacguc cuc 23
<210> 478
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 478
aaccaggcgg ccgcgcacgu ccu 23
<210> 479
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 479
acaccaggcg gccgcgcacg ucc 23
<210> 480
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 480
agcaccaggc ggccgcgcac guc 23
<210> 481
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 481
augcaccagg cggccgcgca cgu 23
<210> 482
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 482
aguacugcac caggcggccg cac 23
<210> 483
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 483
accgcgguac ugcaccaggc ggc 23
<210> 484
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 484
accgagcaug gccugcaccu cgc 23
<210> 485
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 485
agugcucugg ccgagcaugg ccu 23
<210> 486
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 486
aagcuccucg gugcucuggc cga 23
<210> 487
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 487
aaggcgaggc gcacccgcag cuc 23
<210> 488
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 488
aaggugggag gcgaggcgca ccc 23
<210> 489
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 489
agcuugcgca ggugggaggc gag 23
<210> 490
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 490
aacgcagcuu gcgcaggugg gag 23
<210> 491
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 491
acgcuuacgc agcuugcgca ggu 23
<210> 492
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 492
aaggagccgc uuacgcagcu ugc 23
<210> 493
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 493
aaucgcggag gagccgcuua cgc 23
<210> 494
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 494
aaucggcauc gcggaggagc cgc 23
<210> 495
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 495
aaggucaucg gcaucgcgga gga 23
<210> 496
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 496
auucugcagg ucaucggcau cgc 23
<210> 497
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 497
aaggcgcuuc ugcaggucau cgg 23
<210> 498
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 498
aacugccagg cgcuucugca ggu 23
<210> 499
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 499
augguacacu gccaggcgcu ucu 23
<210> 500
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 500
accggccugg uacacugcca ggc 23
<210> 501
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 501
aauggcgcug aggccgcgcu cgg 23
<210> 502
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 502
acgcggaugg cgcugaggcc gcg 23
<210> 503
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 503
aaggcgcucg cggauggcgc uga 23
<210> 504
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 504
acuguuccac caggggcccc agg 23
<210> 505
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 505
acggcccugu uccaccaggg gcc 23
<210> 506
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 506
aacaguggcg gcccgcacgc ggc 23
<210> 507
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 507
aagggagccc acaguggcgg ccc 23
<210> 508
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 508
aguagcggcu ggccggccag gga 23
<210> 509
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 509
acgcuccugu agcggcuggc cgg 23
<210> 510
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 510
agggcccgcu ccuguagcgg cug 23
<210> 511
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 511
acccaucucc uccauccgcg cgc 23
<210> 512
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 512
aaccucgucc aggcggucgc ggg 23
<210> 513
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 513
acuccuucac cucguccagg cgg 23
<210> 514
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 514
aaccugcucc uucaccucgu cca 23
<210> 515
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 515
accagcuugg cgcgcaccuc cgc 23
<210> 516
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 516
augcuccucc agcuuggcgc gca 23
<210> 517
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 517
aaggcguauc ugcugggccu gcu 23
<210> 518
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 518
accugcaggc guaucugcug ggc 23
<210> 519
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 519
aaaggccucg gccugcaggc gua 23
<210> 520
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 520
accuggaagg ccucggccug cag 23
<210> 521
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 521
agcgggccug gaaggccucg gcc 23
<210> 522
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 522
auugaggcgg gccuggaagg ccu 23
<210> 523
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 523
aagcucuuga ggcgggccug gaa 23
<210> 524
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 524
acgaaccagc ucuugaggcg ggc 23
<210> 525
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 525
aggggcucga accagcucuu gag 23
<210> 526
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 526
acaugucuuc caccaggggc ucg 23
<210> 527
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 527
acgcugcaug ucuuccacca ggg 23
<210> 528
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 528
aacuggcgcu gcaugucuuc cac 23
<210> 529
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 529
aaccuucucc accagcccgg ccc 23
<210> 530
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 530
accugcaccu ucuccaccag ccc 23
<210> 531
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 531
aggcacaggg gcggcgcugg ugc 23
<210> 532
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 532
auugucgcug ggcacagggg cgg 23
<210> 533
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 533
aagugauugu cgcugggcac agg 23
<210> 534
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 534
agcguucagu gauugucgcu ggg 23
<210> 535
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 535
agcuucggcg uucagugauu guc 23
<210> 536
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 536
augcaggcuu cggcguucag uga 23
<210> 537
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 537
aauggcugca ggcuucggcg uuc 23
<210> 538
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 538
agucgcaugg cugcaggcuu cgg 23
<210> 539
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 539
acgugggguc gcauggcugc agg 23
<210> 540
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 540
aacggggugg cguggggucg cau 23
<210> 541
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 541
agaggcacgg gguggcgugg ggu 23
<210> 542
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 542
aaggcaggag gcacggggug gcg 23
<210> 543
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 543
agcgcggagg caggaggcac ggg 23
<210> 544
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 544
aaggcugcgc ggaggcagga ggc 23
<210> 545
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 545
agcugcaggc ugcgcggagg cag 23
<210> 546
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 546
aacggcuggg gcggggacag ggu 23
<210> 547
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 547
aaggaggacg gcuggggcgg gga 23
<210> 548
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 548
aaccccagga ggacggcugg ggc 23
<210> 549
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 549
aaacuagggu ccaccccagg agg 23
<210> 550
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 550
auauuaaacu aggguccacc cca 23
<210> 551
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 551
aaucuuuauu aaacuagggu cca 23
<210> 552
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 552
aggugaaucu uuauuaaacu agg 23
<210> 553
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 553
aaacuuggug aaucuuuauu aaa 23
<210> 554
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 554
agcgugaaac uuggugaauc uuu 23
<210> 555
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 555
ctggccaatc acaggcagga aga 23
<210> 556
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 556
cacaggcagg aagatgaagg ttc 23
<210> 557
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 557
gcaggaagat gaaggttctg tgg 23
<210> 558
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 558
agatgaaggt tctgtgggct gcg 23
<210> 559
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 559
ggttctgtgg gctgcgttgc tgg 23
<210> 560
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 560
tgtgggctgc gttgctggtc aca 23
<210> 561
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 561
ctgcgttgct ggtcacattc ctg 23
<210> 562
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 562
ttgctggtca cattcctggc agg 23
<210> 563
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 563
ggtcacattc ctggcaggat gcc 23
<210> 564
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 564
cctggcagga tgccaggcca agg 23
<210> 565
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 565
gccaggccaa ggtggagcaa gcg 23
<210> 566
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 566
ccaaggtgga gcaagcggtg gag 23
<210> 567
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 567
agcaagcggt ggagacagag ccg 23
<210> 568
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 568
gcggtggaga cagagccgga gcc 23
<210> 569
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 569
agcccgagct gcgccagcag acc 23
<210> 570
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 570
gagctgcgcc agcagaccga gtg 23
<210> 571
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 571
cgccagcaga ccgagtggca gag 23
<210> 572
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 572
gccagcgctg ggaactggca ctg 23
<210> 573
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 573
cgctgggaac tggcactggg tcg 23
<210> 574
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 574
ggaactggca ctgggtcgct ttt 23
<210> 575
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 575
ggcactgggt cgcttttggg att 23
<210> 576
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 576
gggtcgcttt tgggattacc tgc 23
<210> 577
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 577
gcttttggga ttacctgcgc tgg 23
<210> 578
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 578
acctgcgctg ggtgcagaca ctg 23
<210> 579
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 579
gctgggtgca gacactgtct gag 23
<210> 580
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 580
tgcagacact gtctgagcag gtg 23
<210> 581
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 581
tgcaggagga gctgctcagc tcc 23
<210> 582
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 582
agctgctcag ctcccaggtc acc 23
<210> 583
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 583
gctcccaggt cacccaggaa ctg 23
<210> 584
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 584
tcacccagga actgagggcg ctg 23
<210> 585
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 585
actgagggcg ctgatggacg aga 23
<210> 586
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 586
gggcgctgat ggacgagacc atg 23
<210> 587
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 587
tggacgagac catgaaggag ttg 23
<210> 588
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 588
agaccatgaa ggagttgaag gcc 23
<210> 589
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 589
aaggagttga aggcctacaa atc 23
<210> 590
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 590
tgaaggccta caaatcggaa ctg 23
<210> 591
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 591
ctacaaatcg gaactggagg aac 23
<210> 592
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 592
aatcggaact ggaggaacaa ctg 23
<210> 593
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 593
tggaggaaca actgaccccg gtg 23
<210> 594
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 594
gacgcgggca cggctgtcca agg 23
<210> 595
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 595
gggcacggct gtccaaggag ctg 23
<210> 596
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 596
cggctgtcca aggagctgca ggc 23
<210> 597
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 597
aggcccggct gggcgcggac atg 23
<210> 598
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 598
ggctgggcgc ggacatggag gac 23
<210> 599
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 599
ggcgcggaca tggaggacgt gcg 23
<210> 600
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 600
gcgcggacat ggaggacgtg tgc 23
<210> 601
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 601
gcgcggacat ggaggacgtg cgc 23
<210> 602
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 602
cgcggacatg gaggacgtgc gcg 23
<210> 603
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 603
gcggacatgg aggacgtgcg cgg 23
<210> 604
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 604
cggacatgga ggacgtgcgc ggc 23
<210> 605
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 605
ggacatggag gacgtgcgcg gcc 23
<210> 606
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 606
gacatggagg acgtgcgcgg ccg 23
<210> 607
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 607
acatggagga cgtgcgcggc cgc 23
<210> 608
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 608
catggaggac gtgcgcggcc gcc 23
<210> 609
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 609
atggaggacg tgcgcggccg cct 23
<210> 610
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 610
tggaggacgt gcgcggccgc ctg 23
<210> 611
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 611
ggaggacgtg cgcggccgcc tgg 23
<210> 612
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 612
gaggacgtgc gcggccgcct ggt 23
<210> 613
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 613
aggacgtgcg cggccgcctg gtg 23
<210> 614
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 614
ggacgtgcgc ggccgcctgg tgc 23
<210> 615
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 615
gacgtgcgcg gccgcctggt gca 23
<210> 616
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 616
acgtgcgcgg ccgcctggtg cag 23
<210> 617
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 617
gtgcggccgc ctggtgcagt acc 23
<210> 618
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 618
gccgcctggt gcagtaccgc ggc 23
<210> 619
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 619
gcgaggtgca ggccatgctc ggc 23
<210> 620
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 620
aggccatgct cggccagagc acc 23
<210> 621
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 621
tcggccagag caccgaggag ctg 23
<210> 622
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 622
gagctgcggg tgcgcctcgc ctc 23
<210> 623
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 623
gggtgcgcct cgcctcccac ctg 23
<210> 624
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 624
ctcgcctccc acctgcgcaa gct 23
<210> 625
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 625
ctcccacctg cgcaagctgc gta 23
<210> 626
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 626
acctgcgcaa gctgcgtaag cgg 23
<210> 627
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 627
gcaagctgcg taagcggctc ctc 23
<210> 628
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 628
gcgtaagcgg ctcctccgcg atg 23
<210> 629
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 629
gcggctcctc cgcgatgccg atg 23
<210> 630
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 630
tcctccgcga tgccgatgac ctg 23
<210> 631
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 631
gcgatgccga tgacctgcag aag 23
<210> 632
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 632
ccgatgacct gcagaagcgc ctg 23
<210> 633
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 633
acctgcagaa gcgcctggca gtg 23
<210> 634
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 634
agaagcgcct ggcagtgtac cag 23
<210> 635
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 635
gcctggcagt gtaccaggcc ggg 23
<210> 636
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 636
ccgagcgcgg cctcagcgcc atc 23
<210> 637
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 637
cgcggcctca gcgccatccg cga 23
<210> 638
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 638
tcagcgccat ccgcgagcgc ctg 23
<210> 639
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 639
cctggggccc ctggtggaac agg 23
<210> 640
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 640
ggcccctggt ggaacagggc cgc 23
<210> 641
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 641
gccgcgtgcg ggccgccact gtg 23
<210> 642
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 642
gggccgccac tgtgggctcc ctg 23
<210> 643
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 643
tccctggccg gccagccgct aca 23
<210> 644
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 644
ccggccagcc gctacaggag cgg 23
<210> 645
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 645
cagccgctac aggagcgggc cca 23
<210> 646
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 646
gcgcgcggat ggaggagatg ggc 23
<210> 647
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 647
cccgcgaccg cctggacgag gtg 23
<210> 648
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 648
ccgcctggac gaggtgaagg agc 23
<210> 649
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 649
tggacgaggt gaaggagcag gtg 23
<210> 650
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 650
gcggaggtgc gcgccaagct gga 23
<210> 651
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 651
tgcgcgccaa gctggaggag cag 23
<210> 652
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 652
agcaggccca gcagatacgc ctg 23
<210> 653
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 653
gcccagcaga tacgcctgca ggc 23
<210> 654
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 654
tacgcctgca ggccgaggcc ttc 23
<210> 655
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 655
ctgcaggccg aggccttcca ggc 23
<210> 656
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 656
ggccgaggcc ttccaggccc gcc 23
<210> 657
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 657
aggccttcca ggcccgcctc aag 23
<210> 658
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 658
ttccaggccc gcctcaagag ctg 23
<210> 659
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 659
gcccgcctca agagctggtt cga 23
<210> 660
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 660
ctcaagagct ggttcgagcc cct 23
<210> 661
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 661
cgagcccctg gtggaagaca tgc 23
<210> 662
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 662
ccctggtgga agacatgcag cgc 23
<210> 663
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 663
gtggaagaca tgcagcgcca gtg 23
<210> 664
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 664
gggccgggct ggtggagaag gtg 23
<210> 665
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 665
gggctggtgg agaaggtgca ggc 23
<210> 666
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 666
gcaccagcgc cgcccctgtg ccc 23
<210> 667
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 667
ccgcccctgt gcccagcgac aat 23
<210> 668
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 668
cctgtgccca gcgacaatca ctg 23
<210> 669
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 669
cccagcgaca atcactgaac gcc 23
<210> 670
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 670
gacaatcact gaacgccgaa gcc 23
<210> 671
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 671
tcactgaacg ccgaagcctg cag 23
<210> 672
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 672
gaacgccgaa gcctgcagcc atg 23
<210> 673
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 673
ccgaagcctg cagccatgcg acc 23
<210> 674
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 674
cctgcagcca tgcgacccca cgc 23
<210> 675
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 675
atgcgacccc acgccacccc gtg 23
<210> 676
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 676
accccacgcc accccgtgcc tcc 23
<210> 677
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 677
cgccaccccg tgcctcctgc ctc 23
<210> 678
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 678
cccgtgcctc ctgcctccgc gca 23
<210> 679
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 679
gcctcctgcc tccgcgcagc ctg 23
<210> 680
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 680
ctgcctccgc gcagcctgca gcg 23
<210> 681
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 681
accctgtccc cgccccagcc gtc 23
<210> 682
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 682
tccccgcccc agccgtcctc ctg 23
<210> 683
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 683
gccccagccg tcctcctggg gtg 23
<210> 684
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 684
cctcctgggg tggaccctag ttt 23
<210> 685
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 685
tggggtggac cctagtttaa taa 23
<210> 686
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 686
tggaccctag tttaataaag att 23
<210> 687
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 687
cctagtttaa taaagattca cca 23
<210> 688
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 688
tttaataaag attcaccaag ttt 23
<210> 689
<211> 23
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 689
aaagattcac caagtttcac gca 23
<210> 690
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 690
caggcaggaa gaugaagguu a 21
<210> 691
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 691
aggaagauga agguucugug a 21
<210> 692
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 692
uucugugggc ugcguugcug a 21
<210> 693
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 693
gcguugcugg ucacauuccu a 21
<210> 694
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 694
cacugggucg cuuuugggau a 21
<210> 695
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 695
gucgcuuuug ggauuaccug a 21
<210> 696
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 696
uuuugggauu accugcgcug a 21
<210> 697
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 697
ccgccucaag agcugguucg a 21
<210> 698
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 698
gacccuaguu uaauaaagau a 21
<210> 699
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 699
cggccucagc gccauccgcg a 21
<210> 700
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 700
uaaccuucau cuuccugccu gug 23
<210> 701
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 701
ucacagaacc uucaucuucc ugc 23
<210> 702
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 702
ucagcaacgc agcccacaga acc 23
<210> 703
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 703
uaggaaugug accagcaacg cag 23
<210> 704
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 704
uaucccaaaa gcgacccagu gcc 23
<210> 705
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 705
ucagguaauc ccaaaagcga ccc 23
<210> 706
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 706
ucagcgcagg uaaucccaaa agc 23
<210> 707
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 707
ucgaaccagc ucuugaggcg ggc 23
<210> 708
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 708
uaucuuuauu aaacuagggu cca 23
<210> 709
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 709
ucgcggaugg cgcugaggcc gcg 23
<210> 710
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 710
caggcaggaa gaugaagguu a 21
<210> 711
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 711
aggaagauga agguucugug a 21
<210> 712
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 712
uucugugggc ugcguugcug a 21
<210> 713
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 713
gcguugcugg ucacauuccu a 21
<210> 714
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 714
cacugggucg cuuuugggau a 21
<210> 715
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 715
gucgcuuuug ggauuaccug a 21
<210> 716
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 716
uuuugggauu accugcgcug a 21
<210> 717
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 717
ccgccucaag agcugguucg a 21
<210> 718
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 718
gacccuaguu uaauaaagau a 21
<210> 719
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 719
cggccucagc gccauccgcg a 21
<210> 720
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 720
uaaccuucau cuuccugccu gug 23
<210> 721
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 721
ucacagaacc uucaucuucc ugc 23
<210> 722
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 722
ucagcaacgc agcccacaga acc 23
<210> 723
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 723
uaggaaugug accagcaacg cag 23
<210> 724
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 724
uaucccaaaa gcgacccagu gcc 23
<210> 725
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 725
ucagguaauc ccaaaagcga ccc 23
<210> 726
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 726
ucagcgcagg uaaucccaaa agc 23
<210> 727
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 727
ucgaaccagc ucuugaggcg ggc 23
<210> 728
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 728
uaucuuuauu aaacuagggu cca 23
<210> 729
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="人工序列描述:合成寡核苷酸"(/note="Description of ArtificialSequence: Synthetic: Synthetic
oligonucleotide")
<400> 729
ucgcggaugg cgcugaggcc gcg 23
<210> 730
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 730
cacaggcagg aagaugaagg uuc 23
<210> 731
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 731
gcaggaagau gaagguucug ugg 23
<210> 732
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 732
gguucugugg gcugcguugc ugg 23
<210> 733
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 733
cugcguugcu ggucacauuc cug 23
<210> 734
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 734
ggcacugggu cgcuuuuggg auu 23
<210> 735
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 735
gggucgcuuu ugggauuacc ugc 23
<210> 736
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 736
gcuuuuggga uuaccugcgc ugg 23
<210> 737
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 737
gcccgccuca agagcugguu cga 23
<210> 738
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 738
uggacccuag uuuaauaaag auu 23
<210> 739
<211> 23
<212> RNA
<213> 未知(Unknown)
<220>
<221> 来源(source)
<223> /注释="未知描述:靶序列"(/note="Description of Unknown:
Target sequence")
<400> 739
cgcggccuca gcgccauccg cga 23

Claims (123)

1.一种双链核糖核酸(dsRNA)剂,其用于抑制APOE的表达,其中所述dsRNA剂包含形成双链区域的有义链和反义链,其中所述有义链包含含有与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分或与与SEQ IDNO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列,并且所述反义链包含含有与SEQ IDNO:2的核苷酸序列的对应部分或与与SEQ IDNO:2的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少15个连续核苷酸的核苷酸序列,使得所述有义链与所述反义链中的所述至少15个连续核苷酸是互补的。
2.如权利要求1所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链,其中所述有义链包含含有与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分或与与SEQ ID NO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列,并且所述反义链包含含有与SEQ ID NO:2的核苷酸序列的对应部分或与与SEQID NO:2的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列,使得所述有义链与所述反义链中的所述至少17个连续核苷酸是互补的。
3.如权利要求1所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链,其中所述有义链包含含有与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分或与与SEQ ID NO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列,并且所述反义链包含含有与SEQ ID NO:2的核苷酸序列的对应部分或与与SEQID NO:2的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列,使得所述有义链与所述反义链中的所述至少19个连续核苷酸是互补的。
4.如权利要求1所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链,其中所述有义链包含含有与SEQ ID NO:1的核苷酸序列的一部分或与与SEQ ID NO:1的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列,并且所述反义链包含含有与SEQ ID NO:2的核苷酸序列的对应部分或与与SEQID NO:2的完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性的核苷酸序列具有0或1个错配的至少21个连续核苷酸的核苷酸序列,使得所述有义链与所述反义链中的所述至少21个连续核苷酸是互补的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链和/或所述反义链是选自由表2至表5和表7至表10中的任一表中的任一有义链和反义链组成的组的有义链和/或反义链。
6.如权利要求1-5中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸57-79、62-84、75-97、86-108、207-229、213-235、218-240、898-920、1128-1150、637-659中的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,并且所述反义链包含来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
7.如权利要求1-5中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链包含与SEQ ID NO:1的核苷酸57-79、62-84、207-229、1128-1150中的任一核苷酸序列相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,并且所述反义链包含来自SEQ ID NO:2的对应核苷酸序列的至少15个连续核苷酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的dsRNA剂,其中所述反义链包含与双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,所述双链体选自由以下组成的组:AD-1204704、AD-1204705、AD-1204705、AD-1204706、AD-1204707、AD-1204708、AD-1204709、AD-1204710、AD-1204711、AD-1204712和AD-1204713。
9.如权利要求1-8中任一项所述的dsRNA剂,其中所述反义链包含与双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,所述双链体选自由以下组成的组:AD-1204704、AD-1204705、AD-1204708和AD-1204712。
10.如权利要求1-9中任一项所述的dsRNA剂,其抑制APOE4的表达,但基本上不抑制APOE2的表达和APOE3的表达。
11.如权利要求10所述的dsRNA剂,其中所述有义链和/或所述反义链是选自由表7和表8中的任一表中的任一有义链和反义链组成的组的有义链和/或反义链。
12.如权利要求1-11中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链、所述反义链或所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。
13.如权利要求12所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分缀合至所述dsRNA剂的双链区域中的一个或多个位置。
14.如权利要求12或13所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分通过接头或载体缀合。
15.如权利要求12-14中任一项所述的dsRNA剂,其中通过logKow测量的所述亲脂部分的亲脂性超过0。
16.如权利要求1-15中任一项所述的dsRNA剂,其中通过所述双链RNAi剂的血浆蛋白结合试验中的未结合分数测量出的所述双链RNAi剂的疏水性超过0.2。
17.如权利要求16所述的dsRNA剂,其中所述血浆蛋白结合试验是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变动试验。
18.如权利要求1-17中任一项所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂包含至少一个经修饰的核苷酸。
19.如权利要求18所述的dsRNA剂,其中不超过5个所述有义链核苷酸和不超过5个所述反义链核苷酸是未修饰的核苷酸。
20.如权利要求18所述的dsRNA剂,其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸均包含修饰。
21.如权利要求18-20中任一项所述的dsRNA剂,其中所述经修饰的核苷酸中的至少一个选自以下的组:脱氧核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基修饰核苷酸、2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧修饰核苷酸、锁核苷酸、未锁核苷酸、构象限制核苷酸、限制性乙基核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2'-O-烯丙基修饰核苷酸、2'-C-烷基修饰核苷酸、2'-羟基修饰核苷酸、2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸、2'-O-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、四氢吡喃修饰核苷酸、1,5-脱水己糖醇修饰核苷酸、环己烯基修饰核苷酸、包含5'-硫代磷酸基团的核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基团的核苷酸、包含5'磷酸的核苷酸或包含5'磷酸模拟物的核苷酸、包含乙烯基膦酸酯的核苷酸、包含腺苷-二醇核酸(GNA)的核苷酸、包含胸苷-二醇核酸(GNA)S-异构体的核苷酸、包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸的核苷酸、包含2'-脱氧胸苷-3'磷酸的核苷酸、包含2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸的核苷酸或与胆固醇衍生物和十二酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸;及其组合。
22.如权利要求21所述的dsRNA剂,其中所述经修饰的核苷酸选自由以下所组成的组:2'-脱氧-2'-氟基修饰核苷酸、2'-脱氧修饰核苷酸、3'-末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁核苷酸、无碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2'-烷基修饰核苷酸、吗啉基核苷酸、氨基磷酸酯或包含非天然碱基的核苷酸。
23.如权利要求21所述的dsRNA剂,其中所述经修饰的核苷酸包含3'-末端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
24.如权利要求21所述的dsRNA剂,其中所述核苷酸上的修饰是2'-O-甲基修饰、GNA修饰和2'氟基修饰。
25.如权利要求21所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。
26.如权利要求25所述的dsRNA剂,其中所述dsRNA剂包含6至8个硫代磷酸酯核苷酸间键。
27.如权利要求1-26中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链的长度不超过30个核苷酸。
28.如权利要求1-27中任一项所述的dsRNA剂,其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3'突出。
29.如权利要求1-27中任一项所述的dsRNA剂,其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3'突出。
30.如权利要求1-29中任一项所述的dsRNA剂,其中所述双链区域的长度为15至30个核苷酸对。
31.如权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述双链区域的长度为17至23个核苷酸对。
32.如权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述双链区域的长度为17至25个核苷酸对。
33.如权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述双链区域的长度为23至27个核苷酸对。
34.如权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述双链区域的长度为19至21个核苷酸对。
35.如权利要求30所述的dsRNA剂,其中所述双链区域的长度为21至23个核苷酸对。
36.如权利要求1-35中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链具有19至30个核苷酸。
37.如权利要求1-35中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链具有19至23个核苷酸。
38.如权利要求1-35中任一项所述的dsRNA剂,其中每条链具有21至23个核苷酸。
39.如权利要求12-38中任一项所述的dsRNA剂,其中一个或多个亲脂性部分缀合至至少一条链上的一个或多个内部位置。
40.如权利要求39所述的dsRNA剂,其中所述一个或多个亲脂性部分通过接头或载体缀合至至少一条链上的一个或多个内部位置。
41.如权利要求40所述的dsRNA剂,其中所述内部位置包括除了从所述至少一条链的每端的末端两个位置之外的所有位置。
42.如权利要求40所述的dsRNA剂,其中所述内部位置包括除了从所述至少一条链的每端的末端三个位置之外的所有位置。
43.如权利要求40-42所述的dsRNA剂,其中所述内部位置不包括所述有义链的裂解位点区域。
44.如权利要求43所述的dsRNA剂,其中所述内部位置包括除了从所述有义链的5'端起计数的位置9至12之外的所有位置。
45.如权利要求43所述的dsRNA剂,其中所述内部位置包括除了从所述有义链的3'端起计数的位置11至13之外的所有位置。
46.如权利要求40-42所述的dsRNA剂,其中所述内部位置不包括所述反义链的裂解位点区域。
47.如权利要求46所述的dsRNA剂,其中所述内部位置包括除了从所述反义链的5'端起计数的位置12至14之外的所有位置。
48.如权利要求40-42中任一项所述的dsRNA剂,其中所述内部位置包括除了所述有义链上的从3'端起计数的位置11至13和所述反义链上的从5'端起计数的位置12至14之外的所有位置。
49.如权利要求12-48中任一项所述的dsRNA剂,其中所述一个或多个亲脂性部分缀合至一个或多个所述内部位置,所述内部位置选自由以下所组成的组:从每条链的5'端起计数的所述有义链上的位置4至8和位置13至18以及所述反义链上的位置6至10和位置15至18。
50.如权利要求49所述的dsRNA剂,其中所述一个或多个亲脂部分缀合至一个或多个所述内部位置,所述内部位置选自由以下所组成的组:从每条链的5'端起计数的所述有义链上的位置5、6、7、15和17以及所述反义链上的位置15和17。
51.如权利要求13所述的dsRNA剂,其中所述双链区域中的位置不包括所述有义链的裂解位点区域。
52.如权利要求12-51中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链的长度为21个核苷酸,所述反义链的长度为23个核苷酸,并且所述亲脂性部分缀合至所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2,或缀合至所述反义链的位置16。
53.如权利要求52所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分缀合至所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1或位置7。
54.如权利要求52所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分缀合至所述有义链的位置21、位置20或位置15。
55.如权利要求52所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分与缀合至所述有义链的位置20或位置15。
56.如权利要求52所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分缀合至所述反义链的位置16。
57.如权利要求12-56中任一项所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分是脂肪族化合物、脂环族化合物或多脂环族化合物。
58.如权利要求57所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分选自由以下所组成的组:脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基基团、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪。
59.如权利要求58所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分包含饱和C4-C30烃链或不饱和C4-C30烃链、和选自由以下所组成的组的任选的官能团:羟基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸、硫醇、叠氮化物和炔烃。
60.如权利要求59所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分包含饱和C6-C18烃链或不饱和C6-C18烃链。
61.如权利要求59所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分包含饱和C16烃链或不饱和C16烃链。
62.如权利要求61所述的dsRNA剂,其中所述饱和C16烃链或不饱和C16烃链缀合至从所述链的5'端起计数的位置6。
63.如权利要求12-60中任一项所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分通过替换所述一个或多个内部位置或所述双链区域中的一个或多个核苷酸的载体缀合。
64.如权利要求63所述的dsRNA剂,其中所述载体是选自由以下所组成的组的环状基团:吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基及十氢萘基;或者所述载体是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的非环状部分。
65.如权利要求12-60中任一项所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分通过含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应的产物或氨基甲酸酯的接头与所述双链iRNA剂缀合。
66.如权利要求12-65中任一项所述的双链iRNA剂,其中所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
67.如权利要求12-66中任一项所述的dsRNA剂,其中所述亲脂性部分或靶向配体通过生物可裂解的接头缀合,所述生物可裂解的接头选自由以下所组成的组:DNA,RNA,二硫化物,酰胺,半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的功能化单糖或寡糖,及其组合。
68.如权利要求12-67中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链的3'端被端帽保护,所述端帽是具有胺的环状基团,所述环状基团选自由以下所组成的组:吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪壬基、四氢呋喃基及十氢萘基。
69.如权利要求12-68中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含靶向肝脏组织的靶向配体。
70.如权利要求69所述的dsRNA剂,其中所述靶向配体是GalNAc缀合物。
71.如权利要求1-70中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含:
发生在所述反义链3'端的第一个核苷酸间键处的具有Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰,
发生在所述反义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型的连键磷原子的末端手性修饰,和
发生在所述有义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型或Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰。
72.如权利要求1-70中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含:
发生在所述反义链3'端的第一和第二个核苷酸间键处的具有Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰,
发生在所述反义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型的连键磷原子的末端手性修饰,和
发生在所述有义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型或Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰。
73.如权利要求1-70中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含:
发生在所述反义链3'端的第一、第二和第三个核苷酸间键处的具有Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰,
发生在所述反义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型的连键磷原子的末端手性修饰,和
发生在所述有义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型或Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰。
74.如权利要求1-70中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含:
发生在所述反义链3'端的第一和第二个核苷酸间键处的具有Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰,
发生在所述反义链3'端的第三个核苷酸间键处的具有Rp构型的连键磷原子的末端手性修饰,
发生在所述反义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型的连键磷原子的末端手性修饰,和
发生在所述有义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型或Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰。
75.如权利要求1-70中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA剂还包含:
发生在所述反义链3'端的第一个和第二个核苷酸间键处的具有Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰,
发生在所述反义链5'端的第一个和第二个核苷酸间键处的具有Rp构型的连键磷原子的末端手性修饰,和
发生在所述有义链5'端的第一个核苷酸间键处的具有Rp构型或Sp构型的连键磷原子的末端手性修饰。
76.如权利要求1-75中任一项所述的dsRNA剂,所述dsRNA还包含在所述反义链的5'端的磷酸或磷酸模拟物。
77.如权利要求76所述的dsRNA剂,其中所述磷酸模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
78.如权利要求1-77中任一项所述的dsRNA剂,其中所述双链体的反义链5'端的位置1的碱基对是AU碱基对。
79.如权利要求1-78中任一项所述的dsRNA剂,其中所述有义链总共有21个核苷酸,并且所述反义链总共有23个核苷酸。
80.一种细胞,其含有如权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂。
81.一种用于抑制编码APOE的基因表达的药物组合物,其包含权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂。
82.一种药物组合物,其包含如权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂和脂质制剂。
83.一种抑制APOE基因在细胞中的表达的方法,所述方法包括:
(a)使所述细胞与如权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求81或82所述的药物组合物接触;以及
(b)将步骤(a)中产生的所述细胞维持足够长的时间以获得所述APOE基因的mRNA转录本的降解,从而抑制所述APOE基因在所述细胞中的表达。
84.如权利要求83所述的方法,其中所述细胞在受试者体内。
85.如权利要求84所述的方法,其中所述受试者是人。
86.如权利要求83-85中任一项所述的方法,其中所述APOE的表达被抑制至少50%。
87.如权利要求85所述的方法,其中所述受试者符合APOE相关神经退行性疾病的至少一个诊断标准。
88.如权利要求85所述的方法,其中所述受试者经诊断患有APOE相关神经退行性疾病。
89.如权利要求88所述的方法,其中,所述APOE相关神经退行性疾病是淀粉样蛋白-β介导的疾病。
90.如权利要求89所述的方法,其中所述淀粉样蛋白-β介导的疾病选自由以下组成的组:阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征和脑淀粉样血管病。
91.如权利要求89所述的方法,其中所述APOE相关神经退行性疾病是tau介导的疾病。
92.如权利要求91所述的方法,其中所述tau介导的疾病是原发性tau蛋白病或继发性tau蛋白病。
93.如权利要求92所述的方法,其中所述原发性tau蛋白病选自由以下组成的组:额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART)。
94.如权利要求92所述的方法,其中所述继发性tau蛋白病选自由以下组成的组:AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
95.一种治疗经诊断患有APOE相关神经退行性疾病的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求81或82所述的药物组合物,从而治疗所述受试者。
96.如权利要求95所述的方法,其中所述受试者是人。
97.如权利要求95所述的方法,其中治疗包括改善所述疾病的至少一个体征或症状。
98.如权利要求96所述的方法,其中治疗包括预防所述疾病的进展。
99.如权利要求95所述的方法,其中所述受试者经诊断患有APOE相关神经退行性疾病。
100.如权利要求98所述的方法,其中所述APOE相关神经退行性疾病是淀粉样蛋白-β介导的疾病。
101.如权利要求100所述的方法,其中所述淀粉样蛋白-β介导的疾病选自由以下组成的组:阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病。
102.如权利要求98所述的方法,其中所述APOE相关神经退行性疾病是tau介导的疾病。
103.如权利要求102所述的方法,其中所述tau介导的疾病是原发性tau蛋白病或继发性tau蛋白病。
104.如权利要求103所述的方法,其中所述原发性tau蛋白病选自由以下组成的组:额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART)。
105.如权利要求103所述的方法,其中所述继发性tau蛋白病选自由以下组成的组:AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
106.一种预防受试者中的APOE相关神经退行性疾病进展的方法,所述受试者符合APOE相关神经退行性疾病的至少一个诊断标准,所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求81或82所述的药物组合物,从而预防所述符合APOE相关神经退行性疾病的至少一个诊断标准的受试者的APOE相关神经退行性疾病的进展。
107.如权利要求106所述的方法,其中所述受试者是人。
108.如权利要求106所述的方法,其中所述受试者经诊断患有APOE相关神经退行性疾病。
109.如权利要求106所述的方法,其中所述APOE相关神经退行性疾病是淀粉样蛋白-β介导的疾病。
110.如权利要求105所述的方法,其中所述淀粉样蛋白-β介导的疾病选自由以下组成的组:阿尔茨海默病、唐氏综合征和脑淀粉样血管病。
111.如权利要求106所述的方法,其中所述APOE相关神经退行性疾病是tau介导的疾病。
112.如权利要求111所述的方法,其中所述tau介导的疾病是原发性tau蛋白病或继发性tau蛋白病。
113.如权利要求112所述的方法,其中所述原发性tau蛋白病选自由以下组成的组:额颞痴呆(FTD)、进行性核上性麻痹(PSP)、皮质基底节变性(CBD)、皮克病(PiD)、球状胶质tau蛋白病(GGT)、伴有帕金森综合征的额颞痴呆(FTDP、FTDP-17)、慢性创伤性脑病(CTE)、拳击性痴呆、额颞叶变性(FTLD)、嗜银颗粒病(AGD)和原发性年龄相关tau蛋白病(PART)。
114.如权利要求112所述的方法,其中所述继发性tau蛋白病选自由以下组成的组:AD、克雅氏病、唐氏综合征和家族性英国痴呆。
115.如权利要求95-114中任一项所述的方法,其中所述dsRNA剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于所述受试者。
116.如权利要求95-115中任一项所述的方法,其中将所述dsRNA剂鞘内施用给所述受试者。
117.如权利要求95到116中任一项所述的方法,所述方法还包括测量APOE2、APOE3和APOE4蛋白质中的一个或多个的水平。
118.如权利要求95-117中任一项所述的方法,所述方法还包括向所述受试者施用适用于治疗或预防APOE相关神经退行性疾病的另外的剂。
119.一种抑制APOE基因在星形胶质细胞中表达的方法,所述方法包括:
(a)使所述星形胶质细胞与如权利要求1-79中任一项所述的dsRNA剂或如权利要求81或82所述的药物组合物接触;以及
(b)将步骤(a)中产生的所述星形胶质细胞维持足够长的时间以获得APOE基因的mRNA转录本的降解,从而抑制所述APOE基因在所述星形胶质细胞中的表达。
120.如权利要求119所述的方法,其中所述星形胶质细胞位于受试者体内。
121.如权利要求120所述的方法,其中所述受试者是人。
122.如权利要求119-121中任一项所述的方法,其中接触所述星形胶质细胞是通过鞘内施用所述药物组合物来进行的。
123.如权利要求119-122中任一项所述的方法,其中所述dsRNA剂的反义链包含与双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相异不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸,所述双链体选自由以下组成的组:AD-1204704、AD-1204705、AD-1204708和AD-1204712。
CN202180045301.4A 2020-04-27 2021-04-26 载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法 Pending CN115955972A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063015867P 2020-04-27 2020-04-27
US63/015,867 2020-04-27
PCT/US2021/029081 WO2021222065A1 (en) 2020-04-27 2021-04-26 Apolipoprotein e (apoe) irna agent compositions and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115955972A true CN115955972A (zh) 2023-04-11

Family

ID=75919437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180045301.4A Pending CN115955972A (zh) 2020-04-27 2021-04-26 载脂蛋白E(APOE)iRNA剂组合物及其使用方法

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230193268A1 (zh)
EP (1) EP4143319A1 (zh)
JP (1) JP2023523993A (zh)
KR (1) KR20230018377A (zh)
CN (1) CN115955972A (zh)
AU (1) AU2021263554A1 (zh)
BR (1) BR112022021813A2 (zh)
CA (1) CA3181400A1 (zh)
IL (1) IL297702A (zh)
MX (1) MX2022013525A (zh)
WO (1) WO2021222065A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023078883A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligonucleotides for modulating apolipoprotein e4 expression
WO2023141577A2 (en) * 2022-01-23 2023-07-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving health with apolipoprotein e (apoe) inhibitors

Family Cites Families (247)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
AU598946B2 (en) 1987-06-24 1990-07-05 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Nucleoside derivatives
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
WO1989009221A1 (en) 1988-03-25 1989-10-05 University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
CA2071510C (en) 1989-10-24 2004-07-06 Chris A. Buhr 2' modified oligonucleotides
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
CA2029273A1 (en) 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ES2116977T3 (es) 1990-05-11 1998-08-01 Microprobe Corp Soportes solidos para ensayos de hibridacion de acidos nucleicos y metodos para inmovilizar oligonucleotidos de modo covalente.
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
WO1992002258A1 (en) 1990-07-27 1992-02-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
HU217036B (hu) 1990-08-03 1999-11-29 Sanofi Eljárás génexpresszió gátlására alkalmas vegyületek előállítására
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
US5596086A (en) 1990-09-20 1997-01-21 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages having one nitrogen and two carbon atoms
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
KR930702373A (ko) 1990-11-08 1993-09-08 안토니 제이. 페이네 합성 올리고누클레오티드에 대한 다중 리포터(Reporter)그룹의 첨합
GB9100304D0 (en) 1991-01-08 1991-02-20 Ici Plc Compound
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
EP0538194B1 (de) 1991-10-17 1997-06-04 Novartis AG Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
EP1588761A3 (en) 1991-11-22 2005-11-23 Affymetrix, Inc. Method of forming arrays of polymers
US6235887B1 (en) 1991-11-26 2001-05-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation directed by oligonucleotides containing modified pyrimidines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US6277603B1 (en) 1991-12-24 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
DK0618925T4 (da) 1991-12-24 2012-07-09 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense-oligonukleotider
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
DE4203923A1 (de) 1992-02-11 1993-08-12 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von polycarboxylaten auf polysaccharid-basis
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
JP3285355B2 (ja) 1992-06-04 2002-05-27 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア invivo遺伝子治療のための方法及び組成物
JPH07508410A (ja) 1992-06-18 1995-09-21 ジェンファーム インターナショナル インコーポレイテッド 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP1251170A3 (en) 1992-07-17 2002-10-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of NF-kappaB dependent animal diseases
US6346614B1 (en) 1992-07-23 2002-02-12 Hybridon, Inc. Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
KR100283601B1 (ko) 1993-02-19 2001-03-02 아만 히데아키 글리세롤 유도체, 디바이스 및 의약 조성물
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
DK0691968T3 (da) 1993-03-30 1998-02-23 Sanofi Sa Acykliske nukleosid-analoge og oligonukleotidsekvenser indeholdende disse
WO1994022891A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US6191105B1 (en) 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US5955591A (en) 1993-05-12 1999-09-21 Imbach; Jean-Louis Phosphotriester oligonucleotides, amidites and method of preparation
US6015886A (en) 1993-05-24 2000-01-18 Chemgenes Corporation Oligonucleotide phosphate esters
US6294664B1 (en) 1993-07-29 2001-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of oligonucleotides
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
KR960705837A (ko) 1993-11-16 1996-11-08 라이오넬 엔. 사이몬 비포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기와 혼합된 비대칭적으로 순수한 포스포네이트 뉴클레오시드간 연결기를 갖는 합성 올리고머(Synthetic Oligomers Having Chirally Pure Phosphonate Internucleosidyl Linkages Mixed with Non-Phosphonate Internucleosidyl Linkages)
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5599922A (en) 1994-03-18 1997-02-04 Lynx Therapeutics, Inc. Oligonucleotide N3'-P5' phosphoramidates: hybridization and nuclease resistance properties
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US6054299A (en) 1994-04-29 2000-04-25 Conrad; Charles A. Stem-loop cloning vector and method
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US6608035B1 (en) 1994-10-25 2003-08-19 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US6166197A (en) 1995-03-06 2000-12-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having pyrimidine nucleotide (S) with 2'and 5 substitutions
US6222025B1 (en) 1995-03-06 2001-04-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of 2′-O-substituted pyrimidines and oligomeric compounds therefrom
EP0833613A1 (en) 1995-05-26 1998-04-08 Somatix Therapy Corporation Delivery vehicles comprising stable lipid/nucleic acid complexes
CA2222328C (en) 1995-06-07 2012-01-10 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5545531A (en) 1995-06-07 1996-08-13 Affymax Technologies N.V. Methods for making a device for concurrently processing multiple biological chip assays
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US5858397A (en) 1995-10-11 1999-01-12 University Of British Columbia Liposomal formulations of mitoxantrone
US6160109A (en) 1995-10-20 2000-12-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Preparation of phosphorothioate and boranophosphate oligomers
US5854033A (en) 1995-11-21 1998-12-29 Yale University Rolling circle replication reporter systems
US5858401A (en) 1996-01-22 1999-01-12 Sidmak Laboratories, Inc. Pharmaceutical composition for cyclosporines
US5994316A (en) 1996-02-21 1999-11-30 The Immune Response Corporation Method of preparing polynucleotide-carrier complexes for delivery to cells
US6444423B1 (en) 1996-06-07 2002-09-03 Molecular Dynamics, Inc. Nucleosides comprising polydentate ligands
US6576752B1 (en) 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6172209B1 (en) 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6034135A (en) 1997-03-06 2000-03-07 Promega Biosciences, Inc. Dimeric cationic lipids
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
DE69841002D1 (de) 1997-05-14 2009-09-03 Univ British Columbia Hochwirksame verkapselung von nukleinsäuren in lipidvesikeln
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6528640B1 (en) 1997-11-05 2003-03-04 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Synthetic ribonucleic acids with RNAse activity
US6617438B1 (en) 1997-11-05 2003-09-09 Sirna Therapeutics, Inc. Oligoribonucleotides with enzymatic activity
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US7273933B1 (en) 1998-02-26 2007-09-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for synthesis of oligonucleotides
US7045610B2 (en) 1998-04-03 2006-05-16 Epoch Biosciences, Inc. Modified oligonucleotides for mismatch discrimination
US6531590B1 (en) 1998-04-24 2003-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Processes for the synthesis of oligonucleotide compounds
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
EP1096921B1 (en) 1998-07-20 2003-04-16 Protiva Biotherapeutics Inc. Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
AU6298899A (en) 1998-10-09 2000-05-01 Ingene, Inc. Production of ssdna (in vivo)
WO2000022113A1 (en) 1998-10-09 2000-04-20 Ingene, Inc. ENZYMATIC SYNTHESIS OF ssDNA
US6465628B1 (en) 1999-02-04 2002-10-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligomeric compounds
WO2000050050A1 (en) 1999-02-23 2000-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Multiparticulate formulation
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
DE60033927T2 (de) 1999-05-04 2007-11-29 Santaris Pharma A/S L-ribo-lna analoge
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US6593466B1 (en) 1999-07-07 2003-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
AU2001227965A1 (en) 2000-01-21 2001-07-31 Geron Corporation 2'-arabino-fluorooligonucleotide n3'-p5'phosphoramidates: their synthesis and use
IT1318539B1 (it) 2000-05-26 2003-08-27 Italfarmaco Spa Composizioni farmaceutiche a rilascio prolungato per lasomministrazione parenterale di sostanze idrofile biologicamente
EP1334109B1 (en) 2000-10-04 2006-05-10 Santaris Pharma A/S Improved synthesis of purine locked nucleic acid analogues
US7063860B2 (en) 2001-08-13 2006-06-20 University Of Pittsburgh Application of lipid vehicles and use for drug delivery
EP1520022B1 (en) 2002-07-10 2015-07-22 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna-interference by single-stranded rna molecules
US6878805B2 (en) 2002-08-16 2005-04-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide-conjugated oligomeric compounds
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
AU2003290597A1 (en) 2002-11-05 2004-06-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
ES2382807T3 (es) 2003-08-28 2012-06-13 Takeshi Imanishi Nuevos ácidos nucleicos artificiales del tipo de enlace N-O con reticulación
EP1713915B1 (en) 2004-02-10 2009-12-16 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING MULTIFUNCTIONAL SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (MULTIFUNCTIONAL siNA)
TWI335352B (en) 2005-03-31 2011-01-01 Calando Pharmaceuticals Inc Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
WO2007091269A2 (en) 2006-02-08 2007-08-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. NOVEL TANDEM siRNAS
ES2564303T3 (es) 2006-04-07 2016-03-21 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compuestos de ARN inmunomodulador estabilizado (SIMRA) para TLR7 y TLR8
JP5441688B2 (ja) 2006-05-11 2014-03-12 アイシス ファーマシューティカルズ, インコーポレーテッド 5’修飾二環式核酸類似体
CN110066224A (zh) 2006-10-03 2019-07-30 阿尔尼拉姆医药品有限公司 含脂质的制品
US20100105134A1 (en) 2007-03-02 2010-04-29 Mdrna, Inc. Nucleic acid compounds for inhibiting gene expression and uses thereof
WO2008147824A2 (en) 2007-05-22 2008-12-04 Mdrna, Inc. Hydroxymethyl substituted rna oligonucleotides and rna complexes
EP2170917B1 (en) 2007-05-30 2012-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
US8278283B2 (en) 2007-07-05 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted or unsaturated bicyclic nucleic acid analogs
CN101795715A (zh) 2007-07-09 2010-08-04 艾德拉药物股份有限公司 稳定化免疫调控性rna(simra)化合物
EP4074344A1 (en) 2007-12-04 2022-10-19 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
PL2279254T3 (pl) 2008-04-15 2017-11-30 Protiva Biotherapeutics Inc. Nowe preparaty lipidowe do dostarczania kwasów nukleinowych
US20110223665A1 (en) 2008-07-25 2011-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ENHANCEMENT OF siRNA SILENCING ACTIVITY USING UNIVERSAL BASES OR MISMATCHES IN THE SENSE STRAND
EA037404B1 (ru) 2008-11-10 2021-03-24 Арбутус Биофарма Корпорэйшн Липиды и композиции для доставки лекарственных средств
EP2370577B1 (en) 2008-12-03 2019-08-28 Arcturus Therapeutics, Inc. Usirna complexes
CA3036963A1 (en) 2009-01-29 2010-08-05 Arbutus Biopharma Corporation Lipid formulations comprising cationic lipid and a targeting lipid comprising n-acetyl galactosamine for delivery of nucleic acid
NZ596186A (en) 2009-05-05 2014-03-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid compositions
US9200276B2 (en) 2009-06-01 2015-12-01 Halo-Bio Rnai Therapeutics, Inc. Polynucleotides for multivalent RNA interference, compositions and methods of use thereof
NZ712719A (en) 2009-06-10 2017-03-31 Arbutus Biopharma Corp Improved lipid formulation
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US8431544B1 (en) 2009-08-27 2013-04-30 Idera Pharmaceuticals, Inc. Compositions for inhibiting gene expression and uses thereof
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011139710A1 (en) 2010-04-26 2011-11-10 Marina Biotech, Inc. Nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers and uses thereof
US20140275211A1 (en) 2011-06-21 2014-09-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject
EP2753631A1 (en) 2011-09-07 2014-07-16 Marina Biotech, Inc. Synthesis and uses of nucleic acid compounds with conformationally restricted monomers
WO2013075035A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Alnylam Pharmaceuticals Rnai agents, compositions and methods of use thereof for treating transthyretin (ttr) associated diseases
WO2013181618A2 (en) * 2012-05-31 2013-12-05 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods to treat alzheimer's disease using apoe inhibitors
WO2014179625A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR MODULATING APOLIPOPROTEIN (a) EXPRESSION
EP3102253A1 (en) 2014-01-31 2016-12-14 University Hospitals Systems and methods for intrathecal delivery of a pharmaceutical agent
EP3681513A4 (en) 2017-09-14 2021-09-22 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. RNAI AGENTS AND COMPOSITIONS FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF ANGIOPOIETIN-LIKE 3 (ANGPTL3) AND METHOD OF USE
EP3714054A1 (en) * 2017-11-20 2020-09-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
WO2020060987A1 (en) * 2018-09-18 2020-03-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use
WO2020190768A1 (en) * 2019-03-15 2020-09-24 University Of Massachusetts Oligonucleotides for tissue specific apoe modulation

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230018377A (ko) 2023-02-07
MX2022013525A (es) 2023-01-24
US20230193268A1 (en) 2023-06-22
CA3181400A1 (en) 2021-11-04
WO2021222065A8 (en) 2021-12-09
JP2023523993A (ja) 2023-06-08
IL297702A (en) 2022-12-01
WO2021222065A1 (en) 2021-11-04
AU2021263554A1 (en) 2022-12-08
EP4143319A1 (en) 2023-03-08
BR112022021813A2 (pt) 2023-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11034957B2 (en) Amyloid precursor protein (APP) RNAi agent compositions and methods of use thereof
US20230193268A1 (en) APOLIPOPROTEIN E (APOE) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
TW202140509A (zh) 人類染色體9開讀框72(C9ORF72)iRNA劑組成物及其使用方法
US20230203486A1 (en) MICROTUBULE ASSOCIATED PROTEIN TAU (MAPT) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
CN114728018A (zh) 亨廷顿(HTT)iRNA药剂组合物及其使用方法
TW202328449A (zh) 微管相關蛋白TAU(MAPT)iRNA試劑組合物及其使用方法
TW202328453A (zh) 治療或預防以擴大的胞內體為特徵之疾病的APP iRNA組成物及其使用方法
TW202305131A (zh) 用於治療或預防超氧歧化酶1-(SOD1-)相關的神經退化疾病的超氧歧化酶1(SOD1)iRNA組成物及其使用方法
US20230126233A1 (en) LEUCINE-RICH REPEAT KINASE 2 (LRRK2) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
US20230056569A1 (en) Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
CN117561335A (zh) 富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)iRNA药剂组合物和其使用方法
CN118265786A (zh) 微管相关蛋白Tau(MAPT)iRNA药剂组合物和其使用方法
TW202305134A (zh) 杭丁頓蛋白(HTT)iRNA劑組成物及其使用方法
JP2024509783A (ja) プリオンタンパク質(prnp)irna組成物およびその使用方法
JP2024521907A (ja) ヒト9番染色体オープンリーディングフレーム72(C9ORF72)iRNA剤組成物及びその使用方法
CN118215735A (zh) 用于治疗或预防以扩大的核内体为特征的疾病的APP iRNA组合物及其使用方法
CN118176300A (zh) 亨廷顿(HTT)iRNA剂组合物及其使用方法
CN117120610A (zh) 用于治疗或预防超氧化物歧化酶1(SOD1)相关神经退行性疾病的超氧化物歧化酶1(SOD1)iRNA组合物以及其使用方法
WO2023154900A2 (en) Microtubule associated protein tau (mapt) irna agent compositions and methods of use thereof
EP4013870A1 (en) Small ribosomal protein subunit 25 (rps25) irna agent compositions and methods of use thereof
CN116583602A (zh) G蛋白偶联受体75(GPR75)iRNA组合物及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination