CN118176300A - 亨廷顿（HTT）iRNA剂组合物及其使用方法 - Google Patents

亨廷顿（HTT）iRNA剂组合物及其使用方法 Download PDF

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CN118176300A CN202280072633.6A CN202280072633A CN118176300A CN 118176300 A CN118176300 A CN 118176300A CN 202280072633 A CN202280072633 A CN 202280072633A CN 118176300 A CN118176300 A CN 118176300A
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W·坎特勒
J·D·麦金因克
M·K·施莱格尔
A·卡斯托雷诺
B·L·博斯特怀克
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Abstract

本公开涉及靶向亨廷顿蛋白(HTT)基因的双链核糖核酸(dsRNAi)剂和组合物，以及使用此类dsRNAi剂和组合物来抑制HTT基因表达的方法和治疗患有HTT相关疾病或病症例如亨廷顿病的受试者的方法。

Description

亨廷顿(HTT)iRNA剂组合物及其使用方法
相关申请
本申请要求2021年10月29日提交的美国临时申请No.63/273,200和2021年12月3日提交的美国临时申请No.63/285,550的优先权。上述申请通过引用并入本文。
发明背景
亨廷顿病是一种进行性神经变性疾病，其特征在于运动障碍、认知丧失和精神表现(Martin和Gusella(1986)N.Engl.J.Med.315:1267-1276)。它以常染色体显性遗传方式遗传，影响大多数欧洲血统人群中约1/10,000的个体(Harper,P.S.et al.,inHuntington's Disease,W.B.Saunders,Philadelphia,1991)。亨廷顿病的标志是一种独特的舞蹈性运动障碍，通常在四岁到五十岁之间微妙、隐秘地发病，并在10到20年的过程中逐渐恶化，直至死亡。有时，亨廷顿氏舞蹈症会在青少年中出现，通常表现为更严重的症状，包括僵硬和病程更快。亨廷顿病的青少年发病与该疾病等位基因的父系传播占优势有关。亨廷顿病的神经病理学也表现出独特的模式，神经元选择性丧失，在大脑的尾状核和壳核区域最为严重。
亨廷顿病已被证明是由称为IT15或亨廷顿蛋白(HTT)的基因的外显子1中的谷氨酰胺重复序列扩展引起的。尽管该基因广泛表达并且是正常发育所必需的，但亨廷顿病的病理仅限于大脑，其原因仍知之甚少。在患有HD(一种常染色体显性遗传疾病)的患者中，多聚谷氨酰胺重复序列的扩增导致编码扩展多聚谷氨酰胺重复序列的全长突变转录本，以及保留内含子1并编码扩展多聚谷氨酰胺重复序列的截短突变转录本。另一个等位基因产生野生型转录本。已经表明，尽管亨廷顿蛋白基因产物在患者和对照中以相似的水平表达，但诱导毒性的是聚谷氨酰胺重复序列的扩展以及全长突变转录物和截短的突变转录物的存在。
目前还没有针对亨廷顿病的有效治疗方法。抗精神病药物(例如氯丙嗪)或利血平可以抑制舞蹈动作和烦躁行为，通常只是部分抑制，直到出现嗜睡、低血压或帕金森病等不良反应。此外，尽管RNAi和亨廷顿病治疗领域取得了重大进展，但仍然需要一种能够利用细胞自身的RNAi机制选择性且有效地沉默HD基因的试剂，该试剂具有高生物活性和体内稳定性，并且可以有效抑制目标亨廷顿基因的表达。
发明内容
本公开提供了RNAi剂组合物，其影响突变型亨廷顿蛋白(HTT)基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。具体地，本发明的RNAi剂组合物靶向截短的突变体HTT基因中保留的内含子1，从而抑制编码扩展的聚谷氨酰胺重复序列的截短的突变体HTT转录物的表达，同时保留全长野生型HTT。HTT基因可以在细胞内，例如受试者(例如人)内的细胞。本公开还提供了使用本公开的RNAi剂组合物来抑制HTT基因的表达或用于治疗将从抑制或减少HTT基因的表达中受益的受试者，例如患有或易于患有HTT的受试者的方法。患有HTT相关疾病。
一方面，本发明提供了一种用于抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包含相对于突变的HTT mRNA中保留的内含子1的互补区，并且其中所述互补区包含与表2-3和5-6中任一项的反义核苷酸序列中的任一个相差不超过3个例如3、2、1或0个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
在一个实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含在其全长上与表2-3和5-6中任一项中的有义链的核苷酸序列中的任一个有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列，所述反义链包含在其全长上与表2-3和5-6中任一项中的反义链的核苷酸序列中的任一个有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列。
在一个实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含与表2-3和5-6中任一项中的有义链的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，所述反义链包含与表2-3和5-6中任一项中的反义链的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
在一个实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含与表2-3和5-6中任一项中的有义链的核苷酸序列中的任一个相差不超过2个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，所述反义链包含与表2-3和5-6中任一项中的反义链的核苷酸序列中的任一个相差不超过2个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸
在一个实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含与表2-3和5-6中任一项中的有义链的核苷酸序列中的任一个相差不超过1个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸，所述反义链包含与表2-3和5-6中任一项中的反义链的核苷酸序列中的任一个相差不超过1个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
在一个实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含或由以下组成：表2-3和5-6中任一项中的有义链的核苷酸序列中的任一个，所述反义链包含或由以下组成：表2-3和5-6中任一项中的反义链的核苷酸序列中的任一个。
在一个实施方式中，有义链包含与SEQ ID NO:11的核苷酸5790-5810、5791-5811、5924-5944、5925-5945、5998-6018、6063-6083、6064-6084、6194-6214、6195-6215或6211-6231的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸。
在一个实施方式中，有义链包含与AD-1640384、AD-1640458、AD-1640457、AD-1640461、AD-1640628、AD-1640629、AD-1640498、AD-1640651、AD-1640631、AD-1640497、AD-1640382或AD-1640467的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸。
在一个实施方式中，反义链包含与选自AD-1640384；AD-1640458；AD-1640457；AD-1640461；AD-1640628；AD-1640629；AD-1640498；AD-1640651；AD-1640631；AD-1640497；AD-1640382或AD-1640467的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
在一个实施方式中，反义链包含与选自AD-1640384；AD-1640458；AD-1640457；AD-1640628；AD-1640629；AD-1640498或AD-1640382的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
一方面，本发明提供了用于抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述有义链包含与SEQID NO:11的核苷酸5922-5944,6059-6106；6059-6084；6068-6092；6076-6106；6191-6231；6191-6215；6191-6214；6192-6215；6198-6231或6198-6224的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸。
另一方面，本发明提供了用于抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包含与选自以下的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721。
在一些实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中所述有义链包含与选自以下的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如，15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721，所述反义链包含与选自以下的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721。
在一些实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中所述有义链包含与选自以下的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个相差不超过2个核苷酸的至少15个，例如，15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721，所述反义链包含与选自以下的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过2个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721。
在一些实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中所述有义链包含与选自以下的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个相差不超过1个核苷酸的至少15个，例如，15、16、17、18、19、20或21个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721，所述反义链包含与选自以下的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过1个核苷酸的至少15个，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23个连续核苷酸：AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721。
在一些实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，其中所述有义链包含选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个的核苷酸序列，所述反义链包含选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个的核苷酸序列。
在一个实施方式中，dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含在其全长上与选自AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721的双链体的有义链的核苷酸序列中的任一个有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列，所述反义链包含在其全长上与选自AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721的双链体的反义链的核苷酸序列中的任一个有至少85％，例如85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％核苷酸序列同一性的连续核苷酸序列。
有义链、反义链或有义链和反义链两者可以缀合至一个或多个亲脂性部分。在一些实施方式中，亲脂性部分缀合至dsRNA剂的双链区中的一或多个内部位置，例如，一或多个亲脂性部分可缀合至反义链上的一或多个内部位置。在一些实施方式中，一个或多个亲脂性部分通过接头或载体缀合至至少一条链上的一个或多个内部位置。
在一些实施方式中，通过logKow测量的亲脂性部分的亲脂性超过0。
在一些实施方式中，通过dsRNA剂的血浆蛋白结合测定中的未结合部分测量的dsRNA剂的疏水性超过0.2。在一些实施方式中，血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变化测定。
在一些实施方式中，内部位置包含除了有义链或反义链每一端的末端两个位置之外的所有位置。在其他实施方式中，内部位置包含除了有义链或反义链每一端的末端三个位置之外的所有位置。
在一些实施方式中，内部位置不包含有义链的切割位点区域，例如内部位置包含除了位置9-12之外的所有位置，从有义链的5’端开始计数或者内部位置包含除位置11-13外的所有位置(从有义链的3’端开始计数)。
在一些实施方式中，内部位置不包含反义链的切割位点区域。在其他实施方式中，内部位置包含除位置12-14之外的所有位置，从反义链的5’端开始计数。在一些实施方式中，内部位置包含除了有义链上从3’端开始计数的位置11-13和反义链上从5’端开始计数的位置12-14之外的所有位置。
在一些实施方式中，一个或多个亲脂性部分缀合至选自有义链上的位置4-8和13-18以及位置6-10和15-的一个或多个内部位置。反义链上有18个，从每条链的5'端开始计数。
在一些实施方式中，一个或多个亲脂性部分缀合至选自有义链上的位置5、6、7、15和17以及位置15和17的一个或多个内部位置。在反义链上，从每条链的5'端开始计数。
在一些实施方式中，双链区中的位置不包含有义链的切割位点区域。
在一些实施方式中，有义链的长度为21个核苷酸，反义链的长度为23个核苷酸，并且亲脂性部分亲脂性部分与所述有义链的位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或者所述反义链的位置16缀合。
在其他实施方式中，有义链的长度为21个核苷酸，反义链的长度为23个核苷酸，并且亲脂性部分亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或者所述反义链的位置16缀。
在一些实施方式中，亲脂性部分是脂肪族、脂环族或多脂环族化合物。
在一些实施方式中，亲脂性部分选自脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩恶嗪。
在一些实施方式中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C4-C30烃链，和选自羟基、胺基、羧酸、磺酸盐、磷酸盐、硫醇、叠氮化物和炔烃的任选官能团。
在一些实施方式中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C6-C18烃链。
在一些实施方式中，亲脂性部分包含饱和或不饱和的C16烃链。在一些实施方式中，饱和或不饱和的C16烃链缀合至从链的5’端开始计数的位置6。
在一些实施方式中，亲脂性部分通过取代所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载体缀合。在一些实施方式中，载体是选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪基、四氢呋喃基和十氢化萘基的环状基团；或者是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的无环部分。
在一些实施方式中，亲脂性部分通过包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应产物或氨基甲酸酯的接头与所述dsRNA剂缀合。
在一些实施方式中，亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
在一些实施方式中，dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。在一些实施方式中，有义链核苷酸中不超过五个和反义链核苷酸中不超过五个是未修饰的核苷酸。在其他实施方式中，有义链的所有核苷酸和反义链的所有核苷酸都包含修饰。
在一些实施方式中，至少一个修饰的核苷酸选自脱氧核苷酸，3’端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸，2'-O-甲基修饰的核苷酸，2'-氟修饰的核苷酸，2'-脱氧修饰的核苷酸，2'-5'-连接核糖核苷酸(3'-RNA)，锁定核苷酸，解锁核苷酸，构象限制核苷酸，受限乙基核苷酸，脱碱基核苷酸，2'-氨基修饰的核苷酸，2'-O-烯丙基修饰的核苷酸，2'-C-烷基修饰的核苷酸，2'-羟基修饰的核苷酸，2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸，2'-O-烷基修饰的核苷酸，吗啉代核苷酸，氨基磷酸酯，包含非天然碱基的核苷酸，四氢吡喃修饰的核苷酸，1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸，环己烯基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸，包含5'-甲基膦酸酯基团的核苷酸，包含5'磷酸盐或5'磷酸盐模拟物的核苷酸，包含乙烯基膦酸酯的核苷酸，包含腺苷-二醇核酸(GNA)的核苷酸，二醇核酸S-异构体(S-GNA)，包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸的核苷酸，包含2'-脱氧胸苷-3'磷酸的核苷酸，包含2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸的核苷酸，和与胆固醇衍生物十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸，2`-磷酸胞苷，2`-磷酸鸟苷，2`-磷酸尿苷，2`-磷酸腺苷、2'-O-十六烷基-3'-磷酸腺苷，2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸，2'-O-十六烷基-鸟苷-3'-磷酸盐，和2'-O-十六烷基-尿苷-3'-磷酸盐，及其组合。
在其他实施方式中，修饰的核苷酸选自2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、3’端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
在一些实施方式中，至少一个修饰的核苷酸选自脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、二醇修饰的核苷酸(GNA)和乙烯基膦酸核苷酸，及其组合。
在一些实施方式中，核苷酸上的至少一种修饰是热不稳定核苷酸修饰。在一些实施方式中，热不稳定核苷酸修饰选自脱碱基修饰；与所述双链体中相反的核苷酸的错配；和不稳定糖修饰、2’-脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
在一些实施方式中，修饰的核苷酸包含3’端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
在一些实施方式中，核苷酸上的修饰是2'-O-甲基、GNA和2'氟修饰。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少一个，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个2’-氟核苷酸修饰。
在一些实施方式中，反义链包含至少一个，例如2、3、4、5或更多个2’-氟核苷酸修饰。
在一些实施方式中，反义链在从反义链的5’端开始计数的位置2、14和16处包含2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，反义链在从反义链的5’端开始计数的位置2、6、14和16处包含2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，反义链在从反义链的5’端开始计数的位置2、6、9、14和16处包含2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，其中反义链在从反义链的5’端开始计数的位置2、6、8、9、14和16处包含2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，反义链包含至少一个，例如2、3、4、5或更多个2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，所述有义链在从所述有义链的5’端开始计数的位置7、9和11处或从所述有义链的3’端开始计数的位置11、13和15处包含2'-氟核苷酸修饰。
在一些实施方式中，所述有义链在从所述有义链的5’端开始计数的位置7、9、10和11处或从所述有义链的3’端开始计数的位置11、12、13和15处包含2'-氟核苷酸修饰。
在一些实施方式中，所述有义链在从所述有义链的5’端开始计数的位置9、10和11处或从所述有义链的3’端开始计数的位置11、12和13处包含2'-氟核苷酸修饰。
在一些实施方式中，反义链包含至少一个，例如2、3、4、5、6、7或更多个DNA核苷酸。
在一些实施方式中，反义链包含在位置2、5、7和12处的DNA核苷酸，从反义链的5’端开始计数。
在一些实施方式中，反义链包含从反义链的5’端开始计数的位置2、5、7、12和14处的DNA核苷酸。
在一些实施方式中，反义链在位置2、5、7和12处是DNA核苷酸，并且在从反义链的5’端开始计数的位置14处是2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，反义链是从反义链的5’端开始计数的位置2、5、7、12、14和16处的DNA核苷酸。
在一些实施方式中，dsRNA包含至少一种热不稳定修饰。
在一些实施方式中，反义链包含至少一个热不稳定修饰。
在一些实施方式中，反义链在反义链的种子区(即，从5'-端算起的位置2-9)中包含至少一种热不稳定修饰。
在一些实施方式中，反义链至少在位置6、7或8之一处包含热不稳定修饰，从链的5’端开始计数。
在一些实施方式中，反义链在从链的5’端开始数的位置7处包含热不稳定修饰。
在一些实施方式中，热不稳定核苷酸修饰是脱碱基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、无环核苷酸(例如，解锁核酸(UNA)、二醇核酸(GNA)或(S)-二醇核酸(S-GNA))、2'-5'连接核苷酸(3'-RNA)、苏糖核苷酸(TNA)、2'gem Me/F核苷酸或与另一条链中相反的核苷酸的错配。
3’RNA：
TNA：
2’gem Me/F核苷酸：
在一些实施方式中，未另外限定的任何核苷酸包含2'-OMe核苷酸修饰。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，dsRNA剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方式中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的3’端。任选地，该链是反义链。在另一个实施方式中，该链是有义链。在相关实施方式中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5’端。任选地，该链是反义链。在另一个实施方式中，该链是有义链。在另一个实施方式中，硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键位于一条链的5'-和3’端。任选地，该链是反义链。在另一个实施方式中，该链是有义链。
在一些实施方式中，每条链的长度不超过30个核苷酸。
在一些实施方式中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端或至少2个核苷酸的3’突出端。
双链区的长度可以是15-30个核苷酸对；长度可以是17-23个核苷酸对；长度可以是17-25个核苷酸对；长度可以是23-27个核苷酸对；长度可以是19-21个核苷酸对；或长度可以是21-23个核苷酸对。
每条链可以是19-30个核苷酸；19-23个核苷酸；或21-23个核苷酸。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含靶向肝组织的靶向配体。在一些实施方式中，靶向配体是GalNAc缀合物。在其他实施方式中，dsRNA剂不包含靶向肝组织的靶向配体，例如GalNAc缀合物。
在某些实施方式中，双链RNAi剂还包含靶向配体，其靶向介导递送至CNS组织的受体，例如亲水性配体。
在某些实施方式中，靶向配体是C16配体。在一个实施方式中，配体是
其中B是核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含靶向配体，其靶向介导递送至CNS组织的受体，例如亲水性配体，例如C16配体，例如，
其中B是核苷酸碱基或核苷酸碱基类似物，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶并且不包含靶向肝组织的靶向配体，例如GalNAc缀合物。
在一些实施方式中，亲脂性部分或靶向配体通过选自以下的生物可裂解接头缀合：DNA，RNA，二硫键化物，酰胺，半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化单糖或寡糖，及其组合。
在一些实施方式中，有义链的3’端通过端帽保护，所述端帽是具有胺基的环状基团，所述环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪基、四氢呋喃基和十氢化萘基。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含发生在反义链3’端的第一核苷酸间键处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子。反义链的5’端的第一个核苷酸间键，具有Rp构型的连接磷原子，以及发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键，有Rp或Sp构型的连接磷原子。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含发生在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Sp构型的连接磷原子。在反义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，并且末端手性修饰，其发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含发生在反义链3’端的第一、第二和第三核苷酸间键处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；发生在反义链5'端的第一个核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子；和发生在所述有义链5'端的第一个核苷酸间键处的末端手性修饰，具有以Rp或Sp构型连接磷原子。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含发生在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；发生在反义链的3’端的第三个核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子；发生在所述反义链的5’端的第一个核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Rp构型中的连接磷原子；和发生在所述有义链5’端的第一个核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Rp或Sp构型中的连接磷原子。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含发生在反义链3’端的第一和第二核苷酸间键处的末端手性修饰，其具有Sp构型的连接磷原子；发生在反义链5’端的第一和第二核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Rp构型的连接磷原子；和发生在所述有义链5’端的第一核苷酸间键处的末端手性修饰，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
在一些实施方式中，dsRNA剂还包含在反义链的5’端处的磷酸盐或磷酸盐模拟物。在一些实施方式中，磷酸盐模拟物是5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一些实施方式中，双链体的反义链的5’端的位置1处的碱基对是AU碱基对。
在一些实施方式中，有义链具有总共21个核苷酸并且反义链具有总共23个核苷酸。
本发明进一步提供含有本发明的任何dsRNA剂的细胞和用于抑制编码HTT的基因的表达的药物组合物，其包含本发明的任何dsRNA剂。
在一个实施方式中，双链RNAi剂处于非缓冲溶液中。任选地，非缓冲溶液是盐水或水。在另一个实施方式中，双链RNAi剂在缓冲溶液中。任选地，缓冲溶液包括乙酸盐、柠檬酸盐、谷醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任意组合。在另一个实施方式中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。本公开的另一方面提供了药物组合物，其包含本公开的双链RNAi剂和脂质制剂。在一个实施方式中，脂质制剂包括脂质纳米颗粒(LNP)。
本公开的另一方面提供了抑制细胞中HTT基因表达的方法，该方法包括(a)使细胞与本公开的双链RNAi剂或其药物组合物接触。即时披露；(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以实现HTT基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中HTT基因的表达。
在一个实施方式中，细胞位于受试者体内。任选地，受试者是人类。
在某些实施方式中，受试者是恒河猴、食蟹猴、小鼠或大鼠。在某些实施方式中，HTT表达被RNAi剂抑制至少约50％。
在某些实施方式中，人类受试者已被诊断患有HTT相关疾病，例如亨廷顿病。
本公开的另一个方面提供了治疗诊断患有HTT相关疾病例如亨廷顿病的受试者的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的双链RNAi剂，或本公开的药物组合物，从而治疗受试者。
在一个实施方式中，治疗包括改善疾病的至少一种体征或症状。在另一个实施方式中，治疗包括预防疾病的进展。
在一些实施方式中，以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量向受试者施用dsRNA剂。
在一些实施方式中，将dsRNA剂鞘内施用于受试者。在一个实施方式中，该方法减少脑(例如纹状体)或脊柱组织中HTT基因的表达。任选地，脑或脊柱组织是纹状体、皮质、小脑、颈椎、腰椎或胸椎。
在一些实施方式中，该方法还包括测量从受试者获得的样品中的HTT水平。
本公开的另一个方面提供了抑制受试者中亨廷顿蛋白(HTT)表达的方法，该方法包括：向受试者施用治疗有效量的本公开的双链RNAi剂或药物组合物本公开的内容，从而抑制受试者中HTT的表达。
在一些实施方式中，该方法还包括向受试者施用适合于治疗或预防HTT相关病症的另外的剂。
本发明还提供了RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其包含本发明的任何dsRNA剂的反义链。
在一个实施方式中，dsRNA剂是其药学上可接受的盐。本文中每种dsRNA剂的“药学上可接受的盐”包括但不限于钠盐、钙盐、锂盐、钾盐、铵盐、镁盐、其混合物。本领域技术人员将理解，当以聚阳离子盐形式提供时，dsRNA剂具有任选修饰的磷酸二酯主链的每个游离酸基团和/或任何其他酸性修饰(例如，5’端膦酸酯基团)的一个阳离子。例如，长度为“n”个核苷酸的寡核苷酸含有n-1个任选修饰的磷酸二酯，使得长度为21nt的寡核苷酸可以作为具有最多20个阳离子(例如，20个钠阳离子)的盐提供。类似地，具有长度为21nt的有义链和长度为23nt的反义链的RNAi剂可以作为具有最多42个阳离子(例如，42个钠阳离子)的盐来提供。在前述实例中，当dsRNA剂还包括5’-端磷酸基团或5’端乙烯基膦酸酯基团时，dsRNA剂可以作为具有最多44个阳离子(例如，44个钠阳离子)的盐来提供。
具体实施方式
本公开提供RNAi组合物，其影响亨廷顿蛋白(HTT)基因的RNA转录物的RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导的切割。HTT基因可以在细胞内，例如受试者(例如人)内的细胞。使用这些iRNA可以靶向降解哺乳动物中相应基因(HTT基因)的mRNA。
本发明的iRNA被设计成靶向截短的突变体HTT基因中保留的内含子1，从而抑制编码扩展的聚谷氨酰胺重复序列的截短的突变体HTT转录物的表达，同时保留全长野生型HTT。不受理论的限制，据信前述性质和特定靶位点的组合或子组合，或这些iRNA中的特定修饰赋予本发明的iRNA改善的功效、稳定性、效力、耐久性和安全性。
因此，本公开还提供了使用本公开的RNAi组合物的方法，包括包含一种或多种，例如2种、3种或4种本发明的dsRNA剂的组合物，用于抑制HTT基因或用于治疗患有可受益于抑制或减少HTT基因表达的病症的受试者，例如HTT相关疾病，例如亨廷顿氏病(HD)。
本公开的RNAi剂包含具有长度为约30个核苷酸或更短，例如15-30,15-29,15-28,15-27,15-26,15-25,15-24,15-23,15-22,15-21,15-20,15-19,15-18,15-17,18-30,18-29,18-28,18-27,18-26,18-25,18-24,18-23,18-22,18-21,18-20,19-30,19-29,19-28,19-27,19-26,19-25,19-24,19-23,19-22,19-21,19-20,20-30,20-29,20-28,20-27,20-26,20-25,20-24,20-23,20-22,20-21,21-30,21-29,21-28,21-27,21-26,21-25,21-24,21-23,or 21-22个核苷酸的RNA链(反义链)，该区域与HTT基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。在某些实施方式中，本公开的RNAi剂包括具有长度为约21-23个核苷酸的区域的RNA链(反义链)，该区域与HTT基因的mRNA转录物的至少部分基本上互补。
该链可包含更长的长度，例如，至多66个核苷酸，例如，36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸的长度，具有至少19个连续核苷酸的区域，该区域与HTT基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。这些具有长度较长的反义链的RNAi剂任选地包含长度为20至60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，其中该有义链与反义链形成18至30个连续核苷酸的双链体。
这些RNAi剂的使用使得哺乳动物的HTT基因的mRNA的靶向降解成为可能。因此，包括这些RNAi剂的方法和组合物可用于治疗将会从HTT蛋白的水平或活性降低获益的受试者，如患有HTT相关疾病如亨廷顿氏病(HD)的受试者。
以下详细描述公开了如何制备和使用含有RNAi剂的组合物来抑制HTT基因的表达，以及用于治疗患有可受益于基因表达的抑制或减少的疾病和病症的受试者的组合物和方法。
定义
为了更容易理解本公开，首先定义某些术语。另外，应该注意的是，每当引用参数的值或值的范围时，意图是所引用的值中间的值和范围也旨在是本公开的一部分。
冠词“一个(a)”和“一种(an)”在本文中用于指代所述冠词的语法宾语中的一个或多于一个(即，至少一个)。举例来说，“要素”是指一个要素或多于一个要素，例如，多个要素。
术语“包含”在本文中用于意指短语“包含但不限于”，并且可与之互换使用。
除非上下文另外清楚地指出，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与之互换使用。
术语“约”在本文中用于意指在本领域的典型公差范围内。例如，“约”可以被理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施方式中，约意指±10％。在某些实施方式中，约意指±5％。当“约”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解“约”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
一个数或一系列数之前的术语“至少”、“不少于”或“或更多”应理解为包含与术语“至少”相邻的数，以及逻辑上可以包含的所有后续数或整数，如从上下文中可以清楚地看出的。例如，核酸分子中的核苷酸数量必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子中的至少18个核苷酸”意指18个、19个、20个或21个核苷酸具有所指示的特性。当“至少”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“至少”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，“不超过”或“或更少”被理解为与短语相邻的值和逻辑较低的值或整数，从上下文来看是逻辑的到零。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出端的双链体具有2个、1个或0个核苷酸突出端。当“不超过”出现在一系列数字或范围之前时，应当理解，“不超过”可以修饰所述系列或范围中的数字中的每个数字。
如本文所使用的，检测方法可以包含确定存在的分析物的量低于所述方法的检测水平。
在指示的靶位点与有义链或反义链的核苷酸序列之间发生冲突的情况下，指示的序列优先。
如果化学结构和化学名称之间存在冲突，则以化学结构为准。
术语“HTT”或“亨廷顿蛋白”，也称为“亨廷顿蛋白”、“亨廷顿病蛋白”、“IT15”、“HD”、HD蛋白、或“LOMARS”，是指众所周知的基因编码正常发育所需的广泛表达的蛋白质HTT和与亨廷顿病相关的疾病基因，亨廷顿病是一种神经退行性疾病，其特征是由亨廷顿基因中扩展的不稳定三核苷酸(CAG)重复引起的纹状体神经元损失，这转化为蛋白质产品中的聚谷氨酰胺重复。
HTT的示例性核苷酸和氨基酸序列可以在例如GenBank登录号NM_002111.8(智人HTT，SEQ ID NO:1，反向互补体，SEQ ID NO:6)中找到；GenBank登录号NM_010414.3(小家鼠HTT，SEQ ID NO:2；反向互补序列，SEQ ID NO:7)；GenBank登录号：NM_024357.3(褐家鼠HTT，SEQ ID NO：3，反向互补序列，SEQ ID NO：8)；GenBank登录号：XM_015449989.1(食蟹猴HTT，SEQ ID NO：4，反向互补序列，SEQ ID NO：9)；GenBank登录号：XM_028848247.1(猕猴HTT，SEQ ID NO：5，反向互补，SEQ ID NO：10)；
GenBank登录号:NG_009378.1(智人亨廷顿蛋白(HTT)，4号染色体上的RefSeqGene(LRG_763)，SEQ ID NO:11，反向互补序列，SEQ ID NO:12)；和基因库登录号：NC_000004.12(智人染色体4，GRCh38.p13初级组装)。
HTT序列的另外的例子可以在公开可用的数据库中找到，例如GenBank、OMIM和UniProt。
关于HTT的进一步信息可以例如在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3064处找到。
截至提交本申请之日，上述GenBank登录号和基因数据库号中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语HTT还指HTT基因的变体，包括SNP数据库中提供的变体。HTT基因内的许多序列变异已被鉴定，并且可以在例如NCBI dbSNP和UniProt中找到(参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/？LinkName＝gene_snp&from_uid＝3064，完整内容截至提交本申请之日，其内容通过引用并入本文。
如本文所使用的，“靶序列”是指在HTT基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包含作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA两者。在一个实施方式中，序列的靶部分至少足够长，以在HTT基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分处或附近用作RNAi定向切割的底物。
靶序列的长度为约15-30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以是15-30个核苷酸，15-29,15-28,15-27,15-26,15-25,15-24,15-23,15-22,15-21,15-20,15-19,15-18,15-17,18-30,18-29,18-28,18-27,18-26,18-25,18-24,18-23,18-22,18-21,18-20,19-30,19-29,19-28,19-27,19-26,19-25,19-24,19-23,19-22,19-21,19-20,20-30,20-29,20-28,20-27,20-26,20-25,20-24,20-23,20-22,20-21,21-30,21-29,21-28,21-27,21-26,21-25,21-24,21-23或21-22个核苷酸。在某些实施方式中，靶序列的长度为19-23个核苷酸，任选地长度为21-23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
如本文所使用的，术语“包含序列的链”指包含核苷酸的链的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸是通过使用标准核苷酸命名法指代的序列而描述的。
在经修饰的或未修饰的核苷酸的上下文中，“G”、“C”、“A”、“T”和“U”通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，可以理解的是，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指经修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或替代的替代部分(参见例如，表1)。本领域技术人员清楚地知道，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶可以被其它部分置换，而不会实质性改变包括含有此类替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如但不限于，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本公开特征的dsRNA的核苷酸序列中，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被含有例如肌苷的核苷酸置换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶都可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶置换，以与靶mRNA形成G-U摆动碱基配对。含有此类置换部分的序列适用于公开内容特征的组合物和方法。
如本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”和“RNA干扰剂”是指含有如本文所定义的RNA的剂，并且其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)通路介导RNA转录物的靶向切割。RNA干扰(RNAi)是一种指导mRNA的序列特异性降解的过程。RNAi调节，例如抑制细胞中HTT的表达，例如受试者(如哺乳动物受试者)体内的细胞。
在一个实施方式中，本公开的RNAi剂包含单链RNAi，其与靶RNA序列(例如，HTT靶mRNA序列)相互作用以引导靶RNA的切割。不希望受理论束缚，据信引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解为包含有义链和反义链的双链短干扰RNA(siRNA)(Sharp等，(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer，即核糖核酸酶-III样酶使用特性两个碱基3’突出端将此dsRNA加工成19个至23个碱基对短干扰RNA(Bernstein等，(2001)Nature 409:363)。然后将这些siRNA掺入到RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一种或多种解旋酶解开siRNA双链体，从而使互补的反义链能够指导靶识别(Nykanen等，(2001)Cell 107:309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(Elbashir等，(2001)Genes Dev.15:188)。因此，一方面本公开涉及在细胞内产生的单链RNA(ssRNA)(siRNA双链体的反义链)，并且其促进RISC复合物的形成以影响靶基因，即HTT基因的沉默。因此，术语“siRNA”在本文中也用于指如上文所描述的RNAi。
在另一个实施方式中，RNAi剂可以是单链RNA，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。单链RNAi剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，然后所述核酸内切酶切割靶mRNA。单链siRNA通常为15个至30个核苷酸，并且经过化学修饰。单链RNA的设计和测试在美国专利号8,101,348和Lima等，(2012)Cell 150:883-894中进行了描述，所述文献中每一个的全部内容通过引用并入本文。本文所描述的任何反义核苷酸序列可以作为本文所描述的单链siRNA使用，或通过Lima等，(2012)Cell 150:883-894中所描述的方法进行化学修饰。
在另一个实施方式中，用于本公开的组合物和方法的“RNAi剂”是双链RNA，并且在本文中称为“双链RNAi剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，具有双链体结构，所述双链体结构包含两条反平行且基本互补的核酸链，相对于靶RNA(即HTT基因)具有“有义”和“反义”取向。在本公开的一些实施方式中，双链RNA(dsRNA)通过本文中称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例如，mRNA)的降解。
通常，dsRNA分子可以包含核糖核苷酸，但如本文详细描述的，每条链或两条链也可以包含一种或多种非核糖核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸、经修饰的核苷酸。此外，如本说明中所使用的，“RNAi剂”可以包含具有化学修饰的核糖核苷酸；RNAi剂可以包含在多个核苷酸处的实质性修饰。
如本文所使用的，术语“经修饰的核苷酸”是指独立地具有经修饰的糖部分、经修饰的核苷酸间键或经修饰的核碱基的核苷酸。因此，术语经修饰的核苷酸涵盖对核苷间键、糖部分或核碱基的置换、添加或去除，例如官能团或原子。适用于本公开的剂的修饰包含本文所公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求的目的，如在siRNA类型分子中使用的，任何此类修饰都被“RNAi剂”涵盖。
在本公共内容的某些实施方式中，如果存在，则在RNAi剂内包含脱氧核苷酸可以认为构建修饰的核苷酸。
双链体区可以具有允许通过RISC通路特异性降解期望靶RNA的任何长度，并且长度范围可以是约15个至36个碱基对，例如，长度为约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对，如长度约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。在某些实施方式中，双链体区的长度为19-21个碱基对，例如长度为21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
形成双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或其可以是单独的RNA分子。如果这两条链是一个较大分子的一部分，它们可以在一条链的3’端和形成双链体结构的相应的另一条链的5’端之间通过不间断的核苷酸链连接，其中连接的RNA链被称为“发夹环”。发夹环可以包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以包含至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个未配对的核苷酸或不指向dsRNA的靶位点的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是10个或更少的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是8个或更少的未配对核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是4-10个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是4-8个核苷酸。
当dsRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子组成时，这些分子不需要但可以共价连接。在某些实施方式中，当两条链通过一条链的3’端和形成双链体结构的相应另一条链的5’端之间的不间断核苷酸链以外的方式共价连接时，连接结构是指称为“接头”(尽管注意到本文别处定义的某些其他结构也可称为“接头”)。RNA链可以具有相同或不同数量的核苷酸。最大碱基对数是dsRNA最短链中的核苷酸数减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构之外，RNAi还可包含一个或多个核苷酸突出端。在RNAi剂的一个实施方式中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。在另一个实施方式中，至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方式中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5'突出端。在某些实施方式中，至少一条链包含至少2个核苷酸的5’突出端，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸。在其他实施方式中，RNAi剂的一条链的3’和5’端均包含至少1个核苷酸的突出端。
在一个实施方式中，本公开的RNAi剂是dsRNA，其每条链独立地包含19-23个核苷酸，其与靶RNA序列(例如HTT靶mRNA序列)相互作用，以指导RNAi的切割。
如本文所使用的，术语“核苷酸突出端”指从RNAi剂(例如，dsRNA)的双链体结构凸出的至少一个未配对的核苷酸。例如，当dsRNA的一条链的3’端延伸超过另一条链的5’端，或与之相反，则存在核苷酸突出端。dsRNA可以包含至少一个核苷酸的突出端；或者，突出端可以包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多个。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物或由其组成，其中所述核苷酸/核苷酸类似物包含脱氧核苷酸/核苷。一个或多个突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5’端、3’端或者这两个末端。
在一个实施方式中，dsRNA的反义链具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，在3'端或5’端的突出端。在一个实施方式中，dsRNA的有义链具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，在3'端或5’端的突出端。在另一个实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
在某些实施方式中，dsRNA的反义链具有1-10个核苷酸，例如0-3、1-3、2-4、2-5、4-10、5-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，在3'端或5’端的突出端。在一个实施方式中，dsRNA的有义链在3’端具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸，在3'端或5’端的突出端。在另一个实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被硫代磷酸核苷取代。
在某些实施方式中，位于有义链或反义链的突出端可以包含长于10个核苷酸的延伸长度，例如，1-30个核苷酸、2-30个核苷酸、10-30个核苷酸或10-15个核苷酸的长度。在某些实施方式中，延伸的突出端位于双链体的有义链上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体有义链的3’端上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体有义链的5’端上。在某些实施方式中，延伸的突出端位于双链体的反义链上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体反义链的3’端上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体反义链的5’端上。在某些实施方式中，在突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。在某些实施方式中，突出端包含自身互补部分，以使得突出端能够形成在生理条件下稳定的发夹结构。
在某些实施方式中，至少一条链的至少一端延伸超过双链体靶向区域，包含其中一条链包含热力学稳定四环结构的结构(参见例如美国专利号8，513，207和8，927，705)以及WO2010033225，其全部内容通过引用并入本文)。此类结构可包含单链延伸(在分子的一侧或两侧)以及双链延伸。
在某些实施方式中，有义链的3’端和反义链的5’端通过包含核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两者的多核苷酸序列连接，任选地其中多核苷酸序列包含四环序列。在某些实施方式中，有义链的长度为25-35个核苷酸。
四环可含有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、修饰的核苷酸及其组合。通常，四环具有4至5个核苷酸。在一些实施方式中，环包含如GAAA所示的序列。在一些实施方式中，至少一个环核苷酸(GAAA)包含核苷酸修饰。在一些实施方式中，修饰的核苷酸包含2'-修饰。在一些实施方式中，2'-修饰是选自由2'-氨基乙基、2'-氟、2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-氨基二乙氧基甲醇、2'-氨基二乙氧基甲醇、2'-氨基二乙氧基甲醇组成的组的修饰。adem和2'-脱氧-2'-氟-β-d-阿拉伯核酸。在一些实施方式中，环的所有核苷酸都被修饰。在一些实施方式中，GAAA序列中的G包含2'-OH。在一些实施方式中，GAAA序列中的每个核苷酸包含2'-O-甲基修饰。在一些实施方式中，GAAA序列中的每个A包含2'-OH并且GAAA序列中的G包含2'-O-甲基修饰。在优选的实施方式中，在一些实施方式中，GAAA序列中的每个A包含2'-O-甲氧基乙基(MOE)修饰并且GAAA序列中的G包含2'-O-甲基修饰；或者GAAA序列中的每个A包含2'-adem修饰并且GAAA序列中的G包含2'-O-甲基修饰。参见例如PCT公开号WO 2020/206350，其全部内容通过引用并入本文。
示例性2’adem修饰的核苷酸如下所示：
如本文所使用的，术语“平的”或“平末端”指在dsRNA的给定末端是无未配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，无核苷酸的突出端。dsRNA的一个末端或两个末端可以是平的。如果dsRNA的两个末端是平的，该dsRNA称为平末端。为清楚起见，“平末端”dsRNA是两个末端均是平的dsRNA，即，在分子的任一末端无核苷酸突出端。最常见的此类分子将在其全长上是双链的。
术语“反义链”或“向导链”指RNAi剂的链，例如，dsRNA，其包含与靶序列(例如，HTTmRNA)基本上互补的区域。
如本文所使用的，术语“互补的区域”指反义链上的与本文中定义的序列，例如，靶序列，例如，HTT核苷酸序列基本上互补的区域。如果该互补的区域与靶序列不是完全互补，则错配可以存在于该分子的中间区域或末端区域。通常，最耐受的错配在末端区域中，例如，在RNAi剂的5’或3’端的5、4、3或2个核苷酸内。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂包含在反义链中的核苷酸错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂的反义链包含不超过4个与靶mRNA的错配，例如，反义链包含4、3、2、1或0个与靶mRNA的错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂的反义链包含不超过4个与有义链的错配，例如，反义链包含4、3、2、1或0个与有义链的错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂包含在有义链中的核苷酸错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂的有义链包含不超过4个与反义链的错配，例如，有义链包含4、3、2、1或0个与反义链的错配。在一些实施方式中，核苷酸错配在例如iRNA的从3’端的5、4、3个核苷酸内。在另一个实施方式中，核苷酸错配是例如在iRNA剂的3’端核苷酸内。在一些实施方式中，一个或多个错配不在种子区内。
因此，如本文所述的RNAi剂可以包含一个或多个与靶序列的错配。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂含有不超过3个错配(即，3、2、1或0个错配)。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂包含不超过2个错配。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂包含不超过1个错配。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂包含0个错配。在某些实施方式中，如果RNAi剂的反义链包含与靶序列的错配，则错配可以任选地被限定在从互补区的5’端或3’端计数的最末5个核苷酸内。例如，在此类实施方式中，对于23个核苷酸的RNAi剂，与HTT基因的区域互补的链通常不含位于中心13个核苷酸处的任何错配。本文中所述的方法或本领域公知的方法可以用于确定，含有与靶序列的错配的RNAi剂在抑制HTT基因的表达中是否有效。考虑具有错配的RNAi剂在抑制HTT基因的表达中的效应很重要，特别是如果HTT基因中的特定互补区是已知具有该群体内的多态性序列变异。
如本文所使用的，术语“有义链”或“随从链”指RNA剂的链，其包含与如本文中定义的术语的反义链的区域基本上互补的区域。
如本文所使用的，术语“切割区域”指位于紧邻切割位点处的区域。切割位点是该靶点上的切割出现处的位点。在一些实施方式中，切割区域包含位于切割位点任一端且紧邻该切割位点的三个碱基。在一些实施方式中，切割区域包含位于切割位点任一端且紧邻该切割位点的两个碱基。在一些实施方式中，切割位点特异性地出现在反义链的通过核苷酸10和11键连的位点，并且切割区域包含核苷酸11、12和13。
如本文所使用的并且除非明确排除，否则术语“互补”用于描述关于第二核苷酸序列的第一核苷酸序列时，指包含该第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含该第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员所理解的。
如本文中所述的RNAi剂，例如，dsRNA内的互补序列，包括包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的全长上的碱基配对。在本文中，此类序列可以称为彼此“完全互补”。然而，如果第一序列指与第二序列“基本上互补”，则当杂交形成多达30个碱基对的双链体时，两条序列可以完全互补，或者其可以形成一个或多个但通常不超过5、4、3或2个错配碱基对，同时保留在最适于其最终应用的条件下杂交的能力，如对通过RISC途径的基因表达的抑制。然而，如果两条寡核苷酸被设计为当杂交时形成一个或多个单链突出端，则在确定互补性方面，此类突出端不应被视为不匹配。例如，一种dsRNA，其包含一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸和另一个长度为23个核苷酸的寡核苷酸，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，出于本文所述的目的，仍可称为“完全互补”。
如本文所使用的，只要满足上述关于杂交能力的要求，“互补”序列还可以包含或完全由非Watson-Crick碱基对或由非天然和修饰核苷酸形成的碱基对形成。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogstein碱基配对。
本文中的术语“互补”，“完全互补”和“基本互补”可以用于dsRNA的有义链和反义链之间的碱基匹配，或者RNAi剂的反义链和靶序列之间的碱基匹配，这将从其的使用背景中理解。
如本文所使用的，与信使RNA(mRNA)的“至少一部分基本上互补”的多核苷酸指与目标mRNA(例如，编码HTT的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果该序列是与编码HTT的mRNA的非中断部分基本上互补的，则该多核苷酸与HTT mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施方式中，本文公开的反义链多核苷酸与靶HTT序列完全互补。在其他实施方式中，本文公开的反义多核苷酸与靶HTT序列基本上互补并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与SEQ ID NO:1-5和11中任一个，或者SEQ ID NO:1-5和11中任一个的片段的核苷酸序列的等效区至少80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
在其他实施方式中，本公开的反义多核苷酸与靶HTT序列基本上互补并且包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与表2-3和5-6中的任一个的任一有义链核苷酸序列或表2-3和5-6中的任一个中的任一有义链核苷酸序列的片段至少约80％互补，如85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一个实施方式中，本公开的RNAi剂包含有义链，该有义链与反义多核苷酸基本上互补，该反义多核苷酸继而与靶HTT序列相同，并且其中该有义链多核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与SEQ ID NO:6-10和12或SEQ ID NO:6-10和12中任一个的片段的核苷酸序列的等效区至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一些实施方式中，本文公开的反义多核苷酸与靶HTT序列的片段基本上互补，并且包含在其全长上与选自SEQ ID NO:11的核苷酸5922-5944,6059-6106；6059-6084；6068-6092；6076-6106；6191-6231；6191-6215；6191-6214；6192-6215；6198-6231或6198-6224的SEQ ID NO:11片段至少80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％，或者大约99％互补。
在一些实施方式中，本发明的iRNA包含有义链，该有义链与反义多核苷酸序列基本上互补，该反义多核苷酸继而与靶HTT序列互补，并且其中该有义多核苷酸包含连续核苷酸序列，该连续核苷酸序列在其全长上与表2-3和5-6中任一者中的任一反义链核苷酸序列或表2-3和5-6中任一者中的任一反义链核苷酸序列的片段至少约80％互补，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一些实施方式中，有义链和反义链选自双链体AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721中的任一个。
在一个实施方式中，对HTT基因的至少部分的抑制是通过HTT mRNA量的减少而评估的，该HTT mRNA是从第一细胞或细胞群中分离或检测，在该细胞或细胞群中，HTT基因被转录，并且该细胞或细胞群已被治疗，以使得与基本上与该第一细胞或细胞群相同但尚未经过这样治疗的第二细胞或细胞群(对照细胞)相比，HTT基因的表达被抑制。抑制程度可以下式表示：
如本文所使用的，短语“使细胞与RNAi剂接触”如dsRNA，包括通过任何可能方式使细胞接触。使细胞与RNAi剂接触包括使细胞在体外与RNAi剂接触或者使细胞与RNAi剂在体内接触。接触可以直接或间接进行。因此，例如，RNAi剂可以通过单独进行该方法而使其与细胞物理接触，或者替代地，可将RNAi剂置于将允许或导致其后续与细胞接触的情况。
例如，可通过使用RNAi剂孵育细胞而使细胞在体外接触RNAi剂。例如，可通过将TNAi剂注射至细胞所处的阻滞内或邻近该组织处，或者任选地通过鞘内、玻璃体内或其他注射将RNAi剂注射至另一区域例如中枢神经系统(CNS)或注射至血流或皮下空间内而使得该剂将会后续到达待接触的细胞所处的阻滞，从而让细胞在体内与RNAi剂接触。例如，RNAi剂可以含有或与配体偶联，例如下文所述且进一步在例如通过引用并入本文的PCT/US2019/031170中详细描述的一个或多个亲脂性部分，该部分将RNAi剂引导或以其他方式稳定在目标位点(例如，CNS)处。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞还可以在体外与RNAi剂接触，并随后移植入受试者中。
在一个实施方式中，将细胞与RNAi剂接触包括，通过促进或影响向细胞内的摄取或吸收而“将RNAi剂引入或递送至细胞内。RNAi剂的吸收或摄取可通过无辅助的扩散或活性细胞过程而进行，或通过辅助剂或装置而进行。将RNAi剂引入细胞内可以是体外或体内的。例如，对于体内引入，可以将RNAi剂注射至组织部位或全身施用。体外引入细胞内包括本领域中公知的方法，如电穿孔和脂质转染。在下文中描述了其他方法或者是本领域公知的。
术语“亲脂”或“亲脂性部分”广泛地指具有对于脂质的亲和性的任何化合物或化学部分。一种表征亲脂性部分的亲脂性的途径是通过辛醇-水分配系数logKow，其中Kow是两相系统在平衡时辛醇相中的化学品浓度与水相中化学品浓度的比率。辛醇-水分配系数是物质的实验室测量的性质。然而，其也可以通过使用第一原理或经验方法计算的归因于化学品结构组分的系数来预测(参见，例如，Tetko等，J.Chem.Inf.Comput.Sci.41:1407-21(2001)，其全部内容通过引用并入本文)。其提供物质倾向于优先进入非水性或油性环境而非水中的热力学指标(即，其亲水/亲脂平衡)。原则上，当化学物质的logKow超过0时，其具有亲脂特征。典型地，亲脂性部分具有超过1、超过1.5、超过2、超过3、超过4、超过5或超过10的logKow。例如，6-氨基己醇的logKow，例如，预测为是大约0.7。使用相同方法，胆固醇基N-(己烷-6-醇)氨基甲酸酯预测为10.7。
分子的亲脂性可根据其携带的官能团而改变。例如，添加羟基或氨基至亲脂性部分的末端可增加或降低该亲脂性部分的分配系数(例如，logKow)值。
或者，缀合至一个或多个亲脂性部分的双链RNAi剂的疏水性可通过其蛋白结合特征来测量。例如，在某些实施方式中，双链RNAi剂的血浆蛋白结合测定中的未结合部分可以被确定为与该双链RNAi剂的相对疏水性正相关，该相对疏水性则可与该双链RNAi剂的沉默活性正相关。
在一个实施方式中，所确定的血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白蛋白的电泳迁移率变化测定(EMSA)。该结合测定的示例性方案在例如PCT/US2019/031170中详细示例性说明。通过该结合测定中未结合的siRNA的部分测量的双链RNAi剂的疏水性超过0.15、超过0.2、超过0.25、超过0.3、超过0.35、超过0.4、超过0.45或超过0.5，用于增强的siRNAi的体内递送。
因此，将亲脂性部分缀合至双链RNAi剂的一个或多个内部位置提供最佳疏水性，以用于增强的siRNA的体内递送。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是囊泡，其包含脂质层，该脂质层包封药学活性分子，如核酸分子，例如，RNAi剂或RNAi剂从其转录的质粒。LNP描述在例如美国专利号6,858,225、6,815,432、8,158,601和8,058,069，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所使用的，“受试者”是动物，如哺乳动物，包括灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如，猴和黑猩猩)或者非灵长类动物(如大鼠或小鼠)。在一个优选实施方式中，受试者是人，如正在进行对将会获益于HTT表达减少的疾病、病症或病况的治疗或评估的人；处于将会获益于HTT表达减少的疾病、病症或病况的风险下的人；罹患将会获益于HTT表达减少的疾病、病症或病况的人；或者正在进行对将会获益于HTT表达减少的疾病、病症或病况的治疗的人，如本文所述的。在一些实施方式中，受试者是女性。在其他实施方式中，受试者是男性。在一个实施方式中，受试者是成年受试者。在一个实施方式中，受试者是儿童受试者。在另一个实施方式中，受试者是青少年受试者，即年龄低于20岁的受试者。
如本文所用，术语“治疗(treating/treatment)”是指有益的或期望的结果，包括但不限于减轻或改善与HTT基因表达或HTT蛋白产生相关的一种或多种体征或症状，例如，HTT相关疾病，如亨廷顿舞蹈病。“治疗”还可以意指与没有治疗的情况下的预期存活相比延长存活。
在受试者中的HTT水平或疾病标志物或症状的上下文中，术语“较低”是指这种水平的统计上显着的降低。该降低可以是例如至少10％、15％、20％、25％、30％、％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实例中，减少至少20％。在某些实施方式中，疾病标志物例如蛋白质或基因表达水平降低至少50％。“较低”在受试者中的HTT水平的上下文中优选地降低至对于没有这种疾病的个体来说被认为在正常范围内的水平。在某些实施方式中，“较低”是患有疾病的受试者的标志物或症状的水平与个体正常范围内接受的水平之间的差异的降低，例如，体重降低的水平肥胖个体和体重在正常范围内的个体。
如本文所用，“预防(prevention/preventing)”当用于指其疾病、病症或病症时，其将受益于HTT基因表达或HTT蛋白产生的减少，是指受试者出现与此类疾病、病症或病症相关的症状(例如，HTT相关疾病的症状)的可能性降低。未发展出疾病、病症或病症，或者与此类疾病、病症或病症相关的症状的发展减少(例如，按照该疾病或病症的临床可接受的标准，减少至少约10％))，或延迟出现症状(例如，延迟数天、数周、数月或数年)被认为是有效的预防。
如本文所用，术语“HTT相关疾病”或“HTT相关病症”应理解为将受益于HTT表达和/或活性降低的任何疾病或病症。示例性的HTT相关疾病包括亨廷顿舞蹈病。
“亨廷顿氏病”也称为HD、亨廷顿舞蹈病、大舞蹈病、慢性进行性舞蹈病和遗传性舞蹈病，是一种常染色体显性遗传病，其特征在于舞蹈样运动和进行性智力退化，通常开始于中年(35至35岁)50岁)。这种疾病对两性的影响相同。尾状核萎缩，小细胞群退化，神经递质γ-氨基丁酸(GABA)和P物质水平下降。这种变性导致CT扫描中出现典型的“棚车心室”。
HD的症状和体征是潜移默化地发展的。HD最明显的症状是身体运动异常(称为舞蹈症)和缺乏协调性，但它也会影响许多心理能力和性格的某些方面。这些身体症状通常在四十多岁时变得明显，但也可能发生在任何年龄。如果发病年龄低于20岁，则称为青少年HD。
痴呆或精神障碍，范围从冷漠和易怒到全面的双相或精神分裂样障碍，可以先于运动障碍或在其病程中发生。快感缺失或反社会行为可能是第一个行为表现。运动表现包括四肢的轻弹运动、轻快的步态、运动不持久(无法维持运动行为，例如伸出舌头)、面部表情、共济失调和肌张力障碍。
HD是由亨廷顿蛋白(HTT)基因中的三核苷酸重复扩增引起的，并且是几种聚谷氨酰胺扩增(或PolyQ扩增)疾病之一。这会产生突变亨廷顿蛋白(mHtt)的延伸形式，导致大脑特定区域的细胞死亡。
如本文所使用的，“治疗有效量”旨在包括RNAi剂的下述的量，当将该RNAi剂向患有HTT相关疾病的受试者施用时，其量足以有效治疗该疾病(例如，通过削弱、缓解或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)。“治疗有效量”可根据RNAi剂、该剂如何施用、疾病及其严重程度以及待治疗的受试者的病史、年龄、体重、家族病史、基因组成、此前治疗或伴随治疗的类型(如果存在的话)以及其他个体特征而改变。
如本文所使用的，“预防有效量”旨在包括RNAi剂的下述的量，当将该RNAi剂向患有HTT相关疾病的受试者施用时，其量足以预防或缓解该疾病或改疾病的一种或多种症状。缓解该疾病包括减缓该疾病的进程或减轻后来发展的疾病的严重程度。“预防有效量”可根据RNAi剂、该剂如何施用、疾病风险程度以及待治疗的患者的病史、年龄、体重、家族病史、基因组成、此前治疗或伴随治疗的类型(如果存在的话)以及其他个体特征而改变。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以可用于任何治疗的合理获益/风险比产生一些所需的局部或全身作用的RNAi剂的量。本公开的方法中采用的RNAi剂可以足以产生可用于此类治疗的合理获益/风险比的量施用。
在本文中，短语“药学上可接受的”用于指那些化合物(包括盐)、材料、组合物或剂型，其是处于适用于与人受试者和动物受试者的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症的所谓医疗判断的范围内，与合理获益/风险比相称。
如本文所使用的，短语“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或载体，如液体或固态填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如，润滑剂、滑石镁、硬脂酸钙或锌或者硬脂酸)或溶剂包封材料，其参与将受试化合物从一个器官或身体部分携带或运送至另一器官或身体部分。就与制剂的其他成分相容且不损害被治疗的受试者而盐，每个载体必须是“可接受的”。可作为药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：：(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素以及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，如可可脂和栓剂蜡类；(9)油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；(10)二醇，如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热源的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯或聚酸酐；(22)填充剂，如多肽和氨基酸；(23)血清组分，如血清白蛋白、HDL和LDL；以及(22)药物调配物中所用的其他无毒可相容物质。
如本文所使用的，术语“样品”包含从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及受试者体内存在的流体、细胞和组织。生物流体的实例包含血液、血清和浆膜流体、血浆、脑脊液、眼流体、淋巴、尿液、唾液等。组织样品可以包含来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以源自特定的器官、器官的一部分或这些器官内的液体或细胞。在某些实施方式中，样品可以源自脑(例如，整个脑或脑的某些部分，例如纹状体，或脑中的某些类型的细胞，例如神经元和神经胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞))。在一些实施方式中，“源自受试者的样品”指的是从受试者抽取的血液或源自其的血浆或血清。在另外的实例中，“源自受试者的样品”是指源自受试者的脑组织(或其亚组分)或视网膜组织(或其亚组分)。
I.本公开的RNAi剂
本文描述了抑制HTT基因表达的RNAi剂。在一个实施方式中，RNAi剂包含用于抑制细胞中HTT基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子，所述细胞例如受试者体内的细胞，例如哺乳动物，例如具有HTT相关基因的人。疾病，例如亨廷顿舞蹈病。dsRNA包含具有互补区的反义链，所述互补区与HTT基因表达中形成的mRNA的至少一部分互补。互补区的长度为约15-30个核苷酸或更短。当与表达HTT基因的细胞接触时，RNAi剂抑制HTT基因(例如，人类基因、灵长类基因、非灵长类基因)的表达至少50％，如通过例如基于PCR或分支DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法，例如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术。其中之一是使用双荧光素酶测定方法在Cos7细胞中测定敲低水平。
dsRNA包含两条RNA链，在该dsRNA将被使用的条件下，其互补并杂交以形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包含互补区，该互补区与靶序列基本上互补并且通常完全互补。靶序列可以是来源于在HTT基因表达过程中形成的mRNA序列。另一条链(有义链)包含一个区域，该区域与反义链互补，以使得当在适宜条件下组合时，两条链杂交并形成双链体结构。如本文中其他地方所描述的并且如本领域所公知的，dsRNA的互补序列也可以作为单个核酸分子的自身互补区而保护，与作为单独寡核苷酸相反。
通常，双链体结构是15至30个碱基对的长度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对的长度。在某些优选实施方式中，双链体结构是18至25个碱基对的长度，例如，18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-25、21-24、21-23、21-22、22-25、22-24、22-23、23-25、23-24或24-25个碱基对的长度，例如，19-21个碱基对的长度。上文引述的范围和长度之间的范围和长度也视为本公开的一部分。
类似地，与靶序列互补的区域是15至30个核苷酸的长度，例如，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸的长度，例如19-23个核苷酸的长度或21-23个核苷酸的长度。上文引述的范围和长度之间的范围和长度也视为本公开的一部分。
在一些实施方式中，双链体结构的长度为19至30个碱基对。类似地，与靶序列互补的区域的长度为19至30个核苷酸。
在一些实施方式中，dsRNA是15至23个核苷酸的长度、19至23个核苷酸的长度或者25至30个核苷酸的长度。在通常情况下，dsRNA是足够长以用作Dicer酶的底物。例如，本领域众所周知，长于约21-23个核苷酸的dsRNA可以作为Dicer的底物。正如普通技术人员也会认识到的那样，靶向切割的RNA区域通常是较大的RNA分子(通常是mRNA分子)的一部分。在相关的情况下，mRNA靶点的“部分”是足够长度的mRNA靶点的连续序列，以使其成为RNAi定向切割(即，通过RISC途径切割)的底物。
本领域技术人员还将认识到双链体区是dsRNA的主要功能性部分，例如，约15至36个碱基对，例如，15-36、15-35、15-34、15-33、15-32、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对，例如，19-21个碱基对的双链体区。因此，在一个实施方式中，就其被加工为例如15至30个碱基对的以用于切割的所需RNA为靶向的功能性双链体的程度而言，具有超过30个碱基对的RNA分子或RNA分子的复合物为dsRNA。因此，本领域普通技术人员将意识到，在一个实施方式中，miRNA是dsRNA。在另一个实施方式中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施方式中，可用于靶向HTT表达的RNAi剂并非通过较大dsRNA的切割而在靶细胞内生成。
如本文所述的dsRNA能够还包含一个或多个单链核苷酸突出端，例如，1、2、3或4个核苷酸。核苷酸突出端可以包含核苷酸/核苷类似物或由其组成，其中核苷酸/核苷类似物包括脱氧核苷酸/核苷。突出端可以是在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5’端、3’端或者两个末端。
dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成。本发明的RNAi化合物可以使用两步程序制备。首先，单独制备双链RNA分子的单个链。然而，将组分链退火。siRNA化合物的单链可以使用溶液相或固相有机合成或这两者制备。有机合成的优点是可以容易地制备包含非天然或修饰核苷酸的寡核苷酸链。类似地，本发明的单链寡核苷酸可以使用液相或固相有机合成或者这两者制备。
在一个方面中，本公开的dsRNA包含至少两个核苷酸序列，有义序列和反义序列。针对HTT的有义链的序列可以选自表2-3和5-6的任一个中提供的序列的组，以及有义链的反义链的相应核苷酸序列可以选自表2-3和5-6的任一个的序列的组。在这个方面中，两个序列中的一个序列与两个序列中的另一个序列互补，其中序列中的一个序列与在HTT基因表达中产生的mRNA序列基本上互补。因此，在这个方面，dsRNA将包含两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2-3和5-6的任一个中被描述为有义链(随从链)和第二个寡核苷酸在表2-3和5-6的任一个中被描述为有义链的对应反义链(向导链)。
在某些实施方式中，有义链或反义链选自双链体AD-1718647；AD-1718648；AD-1718649；AD-1718653；AD-1718654AD-1718655；AD-1718656；AD-1718660；AD-1718662；AD-1718663；AD-1718669；AD-1718670；AD-1718673；AD-1718674；AD-1718676；AD-1718677；AD-1718678；AD-1718679；AD-1718680；AD-1718682；AD-1718683；AD-1718702；AD-1718715；AD-1718717或AD-1718721中任一个的有义链或反义链。
在一个实施方式中，dsRNA的基本上互补的序列包含在分离的寡核苷酸上。在另一个实施方式中，dsRNA的基本上互补的序列包含在单一寡核苷酸上。
应当理解，虽然表2-3和5-6中的一些序列被描述为修饰的或缀合的序列，但是本公开的RNAi剂的RNA，例如本公开的dsRNA，可以包含表2-3和5-6中任一项中列出的任何一种序列，其是未修饰的、未缀合的、或不同于其中所述的修饰或缀合的。例如，虽然表3中所示的本发明剂的有义链缀合至C16和L96配体，但这些剂可以缀合至指导递送至肝脏的C6部分或L96配体，例如，GalNAc配体，如本文所述，但不是两者。亲脂性配体可以包含在本申请中提供的任何位置中。
本领域技术人员充分了解，具有约20个至23个碱基对(21个碱基对)的双链体结构的dsRNA已被誉为在诱导RNA干扰方面特别有效(Elbashir等，(2001)EMBO J.,20:6877-6888)。然而，其他人已经发现，较短或较长的RNA双链体结构也可以是有效的(Chu和Rana(2007)RNA 14:1714-1719；Kim等，(2005)Nat Biotech 23:222-226)。在上文所描述的实施方式中，由于本文提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述的dsRNA可以包含至少一条长度至少为21个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，较短的双链体在一端或两端仅减去几个核苷酸可以类似地有效。因此，具有来源于本文所提供的一个序列的至少15、16、17、18、19、20个或更多个连续核苷酸的序列并且其抑制HTT基因表达的能力与包含全序列的dsRNA相差不超过约10％、15％、20％、25％或30％的dsRNA，被认为在本发明的范围内，该抑制是使用体外测定用Cos7和10nM浓度的RNA剂和本文实施例中提供的PCR测定测得。
此外，本文所述的RNA鉴定了在HTT转录物中对RISC介导的切割敏感的一个或多个位点。因此，本公开进一步的特征在于靶向在该一个或多个位点内的RNAi剂。如本文所使用的，如果RNAi剂促进转录物在该特定位点内的任何位置的切割，则称RNAi剂靶向RNA转录物的特定位点。这种RNAi剂通常将包含来自本文提供的序列之一的至少约15个连续核苷酸，优选地至少19个核苷酸，该序列与从HTT基因中与所选序列相邻的区域获得的其他核苷酸序列偶联。
III.本公开的修饰的RNAi剂
在一个实施方式中，本公开的RNAi剂的RNA，例如dsRNA，是未修饰的，并且不包含例如本领域已知的和本文所描述的经修饰的核苷酸，例如化学修饰或缀合。在优选实施方式中，本公开的RNAi剂的RNA，例如dsRNA被化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。在本公开的某些实施方式中，本公开的RNAi剂的基本上所有核苷酸都是经修饰的。在本公开的其他实施方式中，本公开的RNAi剂的所有核苷酸都是经修饰的。其中“基本上所有核苷酸都是经修饰的”的本公开的RNAi剂在很大程度上但不是完全为经修饰的，并且可以包含不超过5个、4个、3个、2个或未修饰的核苷酸。在本公开的另外其他实施方式中，本公开的RNAi剂可以包含不超过5个、4个、3个、2个或1个经修饰的核苷酸。
本公开特征的核酸可以通过本领域公认的方法合成或修饰，例如“核酸化学中的当前实验方案(Current protocols in nucleic acid chemistry)”，Beaucage,S.L等人(编著)，John Wiley&Sons,Inc.,New York,NY,USA中描述的那些方法，所述方法特此通过引用并入本文。修饰包含例如端修饰，例如5’端修饰(磷酸化、缀合、反向连接等)、3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展的伙伴库碱基配对的碱基替换、去除碱基(脱碱基核苷酸)或缀合的碱基；糖修饰(例如，在2’位置或4’位置处)或糖的置换；或主链修饰，包含磷酸二酯键的修饰或置换。可用于本文所描述的实施方式的RNAi剂的具体实例包含但不限于含有经修饰的主链或不含天然核苷间键的RNA。除此之外，具有经修饰的主链的RNA包含在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的经修饰的RNA也可以被视为寡核苷。在一些实施方式中，经修饰的RNAi剂在其核苷间主链中将具有磷原子。
经修饰的RNA主链包含例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包含3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包含3’-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酸胺酯)、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯、以及具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯、这些酯的2’-5’连接类似物、以及具有反向极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位以3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’连接。也包含了各种盐、混合盐和游离酸形式。在本发明的一些实施方式中，本发明的dsRNA剂是游离酸形式。在本发明的其他实施方式中，本发明的dsRNA剂是盐形式。在一个实施方式中，本发明的dsRNA剂是钠盐形式。在某些实施方式中，当本发明的dsRNA剂呈钠盐形式时，钠离子存在于该剂中作为该剂中存在的基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子。其中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键均具有钠抗衡离子的剂包含不超过5、4、3、2或1个不具有钠抗衡离子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，当本发明的dsRNA剂呈钠盐形式时，钠离子存在于该剂中作为该剂中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子。
教导制备上述含磷键的代表性美国专利包含但不限于以下美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029和美国专利RE39464，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
其中不包含磷原子的经修饰的RNA主链具有由以下形成的主链：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包含具有吗啉代键的那些(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和其他具有混合的N、O、S和CH2组分部分的主链。
教导上述寡核苷酸的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在其他实施方式中，合适的RNA模拟物被考虑用于RNAi剂，其中核苷酸单元的糖和核苷间键，即主链被替代基团替代。维持核碱基单元以与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(即已示出具有极佳杂交特性的RNA模拟物)被称作肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺的主链替代，尤其是氨基乙基甘氨酸主链。核碱基被保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号5,539,082；5,714,331；以及5,719,262，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。适用于本公开的RNAi剂的另外的PNA化合物在例如Nielsen等，Science,1991,254,1497-1500中描述。
本公开特征的一些实施方式包含具有硫代磷酸酯主链的RNA和具有杂原子主链的寡核苷，特别是上文引用的美国专利号5,489,677的--CH2--NH--CH2-、--CH2--N(CH3)--O--CH2--[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2—和--N(CH3)--CH2--CH2—[其中天然磷酸二酯主链以--O--P--O--CH2—表示]，以及上文引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施方式中，本文特征的RNA具有上文引用的US 5,034,506的吗啉代主链结构。
经修饰的RNA还可以包含一个或多个经置换的糖部分。本文特征的RNAi剂，例如dsRNA可以在2’位置处包含以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是经置换的或未经置换的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性合适的修饰包含O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其他实施方式中，dsRNA在2’位置处包含以下之一：C1至C10烷基、经置换的烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、经置换的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入子、用于改善RNAi剂的药代动力学特性的基团、或用于改善RNAi剂的药效动力学特性的基团以及具有类似特性的其他置换基。在一些实施方式中，修饰包含2’-甲氧基乙氧基(2’-O--CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE(Martin等，Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一个示例性修饰是2’-二甲氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE，如下文实例中描述的，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-DMAEOE)，2’-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。另外的示例性修饰包含：5’-Me-2’-F核苷酸、5’-Me-2’-OMe核苷酸、5’-Me-2’-脱氧核苷酸(这三个家族中的R和S异构体两者)；2’-烷氧基烷基；以及2’-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其他修饰包含2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)、2’-O-十六烷基和2’-氟(2’-F)。类似修饰也可以在RNAi剂的RNA上的其他位置处进行，具体地，3’端核苷酸上的糖的3’位置处或2’-5’连接的dsRNA以及5’端核苷酸的5’位置中。RNAi剂还可以具有糖模拟物，如替代戊呋喃糖基糖的环丁基部分。教导此类经修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中某些与本申请共同拥有。上述各项的全部内容特此通过引用并入本文。
本公开的RNAi剂还可以包含核碱基(在本领域中通常被简称为“碱基”)修饰或置换。如本文所使用的，“未修饰的”或“天然”核碱基包含嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核碱基包含其他合成和天然核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羟基和其他8-置换的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤基，具体地5-溴、5-三氟甲基和其他5-置换的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的经修饰的核碱基包含美国专利号3,687,808中公开的那些，在Modified Nucleosides inBiochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编著，Wiley-VCH,2008中公开的那些；在The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页，Kroschwitz,J.L编著，John Wiley&Sons,1990中公开的那些；在Englisch等，(1991)Angewandte Chemie,International Edition,30:613中公开的那些，以及在Sanghvi,YS.,第15章，dsRNA Research and Applications,第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，CRC Press,1993中公开的那些。这些经修饰的核碱基中的某些核碱基对提高本公开特征的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包含5-置换的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6置换的嘌呤，包含2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经示出5-甲基胞嘧啶置换使核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.编著，dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)，并且是示例性碱基置换，甚至更具体地在与2’-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备某些上述经修饰的核碱基以及其他经修饰的核碱基的代表性美国专利包含但不限于上述美国专利号3,687,808,4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672以及7,495,088，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本公开的RNAi剂还可被修饰以包含一个或多个双环糖部分。“双环糖”是由两个碳(无论相邻或不相邻)桥接形成的环修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，所述糖部分包含通过桥接糖环的两个碳(无论相邻或不相邻)形成的环，从而形成双环系统。在某些实施方式中，桥任选地通过2’-无环氧原子连接糖环的4’-碳和2’-碳。因此，在一些实施方式中，本发明的剂可以包含一种或多种锁定核酸(LNA)。锁定核酸是具有经修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含连接2’和4’碳的额外桥。换句话说，LNA是包含双环糖部分的核苷酸，所述双环糖部分包含4'-CH2-O-2'桥。这种结构有效地将核糖“锁定”在3’-内结构构象中。向siRNA中添加锁定核酸已被证明可增加血清中的siRNA稳定性，并且减少脱靶效应(Elmen,J.等，(2005)Nucleic Acids Research33(1):439-447；Mook,OR.等，(2007)Mol Canc Ther 6(3):833-843；Grunweller,A.等，(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸的双环核苷的实例包括但不限于包括4’和2’核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施方式中，本发明的反义多核苷酸剂包含一种或多种包含4’至2’桥的双环核苷。
锁定核苷可以由以下结构表示(省略立体化学)，
其中B是核碱基或修饰的核碱基，L是将核糖环的2’-碳连接到4’-碳的连接基团。此类4’至2’桥接的双环核苷的实例包含但不限于4’-(CH2)—O-2’(LNA)；4’-(CH2)—S-2’；4’-(CH2)2—O-2’(ENA)；4’-CH(CH3)—O-2’(也称为“约束乙基”或“cEt”)和4’-CH(CH2OCH3)—O-2’(及其类似物；参见，例如，美国专利号7,399,845)；4’-C(CH3)(CH3)—O-2’(及其类似物；参见，例如，美国专利号8,278,283)；4’-CH2—N(OCH3)-2’(及其类似物；参见，例如，美国专利号8,278,425)；4’-CH2—O—N(CH3)-2’(参见，例如，美国专利公开号2004/0171570)；4’-CH2—N(R)—O-2’，其中R是H，C1-C12烷基或氮保护基团(参见，例如，美国专利号7,427,672)；4’-CH2—C(H)(CH3)-2’(参见，例如，Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；和4’-CH2—C(═CH2)-2’(及其类似物；参见，例如，美国专利号8,278,426)。上述各项的全部内容特此通过引用并入本文。
教导制备锁定核酸核苷酸的其他代表性美国专利和美国专利公开包含但不限于以下：美国专利号6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US2008/0039618号以及第US2009/0012281，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
可以制备具有一种或多种立体化学糖构型的任何前述双环核苷，包含例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
iRNA的RNA也可以被修饰以包含一个或多个约束乙基核苷酸。如本文所使用的，“约束乙基核苷酸”或“cEt”为包含含有4’-CH(CH3)-O-2’桥(即前述结构中的L)的双环糖部分的锁定核酸。在一个实施方式中，约束乙基核苷酸处于本文中称为“S-cEt”的S构象。
本发明的iRNA还可以包含一个或多个“构象限制性核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2’和C4’碳或核糖的C3’和C5’碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定的构象，并且增加对mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧放置在稳定性和亲和力的最佳位置，从而导致较少的核糖环褶皱。
教导上述某些CRN的制备的代表性出版物包含但不限于美国专利公布号2013/0190383；以及PCT公布WO 2013/036868，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本发明的iRNA包含一种或多种为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是未锁定的无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成未锁定的“糖”残基。在一个实施方式中，UNA还涵盖C1’-C4’之间的键已被去除的单体(即C1’与C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2’-C3’键(即C2’与C3’碳之间的共价碳-碳键)已被去除(参见Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)和Fluiter等，Mol.Biosyst.,2009,10,1039，特此通过引用并入)。
教导UNA的制备的代表性美国公开包含但不限于美国专利号US8,314,227；以及美国专利公开号2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
对RNA分子末端的潜在稳定修饰可以包含N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)，N-(己酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-C6)，N-(乙酰基-4-羟脯氨醇)(Hyp-NHAc)，胸苷-2’-O-脱氧胸苷(醚)，N-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(Hyp-C6-氨基)，2-二十二烷酰基-尿苷-3’-磷酸酯，反向2’-脱氧修饰的核糖核苷酸，例如反向dT(idT)、反向dA(idA)和反向脱碱基2’-脱氧核糖核苷酸(iAb)等。此修饰的公开可以在WO 2011/005861中找到。
在一个实施方式中，寡核苷酸的3'或5’端连接至反向2'-脱氧修饰核糖核苷酸，例如反向dT(idT)、反向dA(idA)或反向脱碱基2'-脱氧核糖核苷酸(iAb)。在一个具体实例中，反向2'-脱氧修饰的核糖核苷酸连接至寡核苷酸的3’端，例如本文所述的有义链的3'-端，其中该连接是经由3'-3'磷酸二酯键或3'-3'-硫代磷酸酯键。
在另一个实例中，有义链的3’端通过3'-3'-硫代磷酸酯键连接至反向脱碱基核糖核苷酸(iAb)。在另一个实例中，有义链的3’端通过3'-3'-硫代磷酸酯键连接至反向dA(idA)。
在一个具体实例中，反向2’-脱氧修饰核糖核苷酸连接至寡核苷酸的3’端，例如本文所述的有义链的3’端，其中通过3’-3’磷酸二酯键或3’-3’-硫代磷酸酯键连接。
在另一个实例中，有义链的3’端核苷酸是反向dA(idA)并且通过3’-3’-键(例如，3’-3’-硫代磷酸酯)与前面的核苷酸连接。
本发明的iRNA的核苷酸的其他修饰包含5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物，例如，iRNA的反义链上的5’端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸酯模拟物公开于例如美国专利公开号2012/0157511中，所述文献的全部内容通过引用并入本文。
A.包含本公开的基序的修饰的RNAi剂
在本公开的某些方面中，本公开的双链RNAi剂包含具有化学修饰的剂，如在例如WO 2013/075035中公开的，所述文献中的全部内容通过引用并入本文。如本文和WO 2013/075035所示，将在三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序引入RNAi剂的有义链或反义链，特别是在切割位点处或附近。在一些实施方式中，RNAi剂的有义链和反义链可以以其他方式被完全修饰。这些基序的引入中断了有义或反义链的修饰模式(如果存在的话)。RNAi剂可以任选地与亲脂性配体缀合，例如C16配体，例如在有义链上。RNAi剂可以任选地用(S)-二醇核酸(GNA)修饰来修饰，例如在反义链的一个或多个残基上。所得的RNAi剂可以呈现出改进的基因沉默活性。
因此，本公开提供了能够在体内抑制靶基因(即，HTT基因)的表达的双链RNAi剂。RNAi剂包含有义链和反义链。RNAi剂的每条链的长度可以是15-30个核苷酸。例如，每条链的长度可以是16-30个核苷酸、17-30个核苷酸、25-30个核苷酸、27-30个核苷酸、17-23个核苷酸、17-21个核苷酸、17 -19个核苷酸、19-25个核苷酸、19-23个核苷酸、19-21个核苷酸、21-25个核苷酸、或21-23个核苷酸。在某些实施方式中，每条链的长度为19-23个核苷酸。
因此，本公开提供了能够在体内抑制靶基因(即HTT基因)的表达的双链RNAi剂。RNAi剂包含有义链和反义链。RNAi剂的每条链可以是长度为15个至30个核苷酸。例如，每条链可以是长度为16个至30个核苷酸、长度为17个至30个核苷酸、长度为25个至30个核苷酸、长度为27个至30个核苷酸、长度为17个至23个核苷酸、长度为17个至21个核苷酸、长度为17个至19个核苷酸、长度为19个至25个核苷酸、长度为19个至23个核苷酸、长度为19个至21个核苷酸、长度为21个至25个核苷酸或长度为21个至23个核苷酸。在某些实施方式中，每条链的长度为19个至23个核苷酸。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，本文也称为“RNAi剂”RNAi剂的双链体区的长度可以是15个至30个核苷酸对。例如，双链体区可以是长度为16个至30个核苷酸对、长度为17个至30个核苷酸对、长度为27个至30个核苷酸对、长度为17个至23个核苷酸对、长度为17个至21个核苷酸对、长度为17个至19个核苷酸对、长度为19个25个核苷酸对、长度为19个至23个核苷酸对、长度为19个至21个核苷酸对、长度为21个至25个核苷酸对或长度为21个至23个核苷酸对。在另一个实例中，双链体区的长度选自15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个和27个核苷酸。在优选实施方式中，双链体区的长度为19个至21个核苷酸对。
在一个实施方式中，RNAi剂可以在一条或两条链的3’端、5’端或两端含有一个或多个突出端区或封端基团。突出端的长度可以为1个至6个核苷酸，例如长度为2个至6个核苷酸、长度为1个至5个核苷酸、长度为2个至5个核苷酸、长度为1个至4个核苷酸、长度为2个至4个核苷酸、长度为1个至3个核苷酸、长度为2个至3个核苷酸或长度为1个至2个核苷酸。在优选实施方式中，核苷酸突出端区的长度为2个核苷酸。突出端可以是一条链比另一条链长的结果，或是两条相同长度的链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。第一链和第二链也可以连接，例如通过另外的碱基形成发夹，或通过其他非碱基接头。
在一个实施方式中，RNAi剂的突出端区中的核苷酸可以各自独立地是经修饰的或未修饰的核苷酸，包含但不限于2’-糖修饰的，如2-F、2’-O-甲基、胸苷(T)以及其任何组合。
例如，TT可以是任一条链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配，或其可以与被靶向的基因序列互补，或可以是另一个序列。
RNAi剂的有义链、反义链或两条链上的5’或3’突出端可以被磷酸化。在一些实施方式中，突出端区含有在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中两个核苷酸可以是相同的或不同的。在一个实施方式中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3’端处。在一个实施方式中，这种3’突出端存在于反义链中。在一个实施方式中，这种3’突出端存在于有义链中。
RNAi剂可能只含有单个突出端，这可以增强RNAi的干扰活性，而不会影响其整体稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3’端处，或可替代地，位于反义链的3’端处。RNAi也可能具有平端，位于反义链的5’端(或有义链的3’端)处，反之亦然。通常，RNAi的反义链在3’端处有核苷酸突出端，并且5’端是平的。虽然不希望受理论的束缚，但反义链5’端的不对称平端和反义链3’端突出端有利于引导链装载到RISC过程中。
在一个实施方式中，RNAi剂是双平端的并且长度为19个核苷酸，其中所述有义链在从5’端开始的位置7、8和9处的三个连续核苷酸上含有三个2’-F修饰的至少一个基序。反义链在从5’端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在另一个实施方式中，RNAi剂是双平端的并且长度为20个核苷酸，其中所述有义链在从5’端开始的位置8、9和10处的三个连续核苷酸上含有三个2’-F修饰的至少一个基序。反义链在从5’端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在又另一个实施方式中，RNAi剂是双平端的并且长度为21个核苷酸，其中所述有义链在从5’端开始的位置9、10和11处的三个连续核苷酸上含有三个2’-F修饰的至少一个基序。反义链在从5’端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在一个实施方式中，RNAi剂包含21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中所述有义链在从5’端开始的位置9、10和11处的三个连续核苷酸上含有三个2’-F修饰的至少一个基序；所述反义链在从5’端开始的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上含有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序，其中所述RNAi剂的一端是平的，而另一端包含2个核苷酸的突出端。优选地，2个核苷酸的突出端可以在反义链的3’端。当2核苷酸突出端位于反义链的3’端处时，在反义链的末端三个3’核苷酸之间可能存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中所述三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施方式中，RNAi剂在有义链的5’端和反义链的5’端两者的末端三个核苷酸之间另外具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一个实施方式中，RNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包含为基序一部分的核苷酸，都是经修饰的核苷酸。在一个实施方式中，每个残基用2’-O-甲基或3’-氟独立地修饰，例如在交替基序中。任选地，RNAi剂还包含配体(例如，亲脂性配体，任选地C16配体)。
在一个实施方式中，RNAi剂包含有义链和反义链，其中所述有义链的长度为25个至30个核苷酸残基，其中从第一链的5’端核苷酸(位置1)位置1开始至位置23，包含至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36个至66个核苷酸残基，并且从3’端核苷酸开始，在与有义链的位置1至23配对以形成双链体的位置中包含至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3’端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续3’端核苷酸与有义链不配对，由此形成1个至6个核苷酸的3’单链突出端；其中反义链的5’端包含10个至30个与有义链不配对的连续核苷酸，由此形成10个至30个核苷酸单链5’突出端；其中当有义链和反义链比对以获得最大互补性时，至少有义链5’端和3’端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，由此在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞时减少靶基因表达；并且其中所述有义链含有在三个连续核苷酸上的三个2’-F修饰的至少一个基序，其中至少一个所述基序出现在切割位点处或附近。反义链在切割位点处或其附近的三个连续核苷酸上含有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序。
在一个实施方式中，RNAi剂包含有义链和反义链，其中所述RNAi剂包含长度为至少25个和最多29个核苷酸的第一链和长度为最多30个核苷酸的第二链，在从5’端起的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上具有三个2’-O-甲基修饰的至少一个基序；其中所述第一链的3’端和所述第二链的5’端形成平端，并且所述第二链在其3’端处比所述第一链长1个至4个核苷酸，其中所述双链体区的长度为至少25个核苷酸，并且所述第二链沿着所述第二链长度的至少19个核苷酸与靶mRNA充分互补，以在将所述RNAi剂引入哺乳动物细胞中时减少靶基因表达，并且其中所述RNAi剂的dicer切割优先地产生包含所述第二链的3’端的siRNA，由此减少所述靶基因在哺乳动物中的表达。任选地，RNAi剂还包含配体。
在一个实施方式中，RNAi剂的有义链含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在有义链中的切割位点处。
在一个实施方式中，RNAi剂的反义链也可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的至少一个基序，其中一个基序出现在反义链中的切割位点处或附近。
对于具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区的RNAi剂，反义链的切割位点通常在距离5’端的10、11和12位置附近。因此，三个相同修饰的基序可以出现在反义链的9、10和11位置；10、11和12位置；11、12和13位置；12、13和14位置；或13、14和15位置，计数从反义链的5’端的第1个核苷酸开始，或计数从反义链的5’端双链体区内的第1个配对核苷酸开始。反义链中的切割位点也可以根据RNAi的双链体区从5’端开始的长度而改变。
RNAi剂的有义链可以在链的切割位点处的三个连续核苷酸上含有三个相同修饰的至少一个基序；并且反义链可以在链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的至少一个基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链与反义链可以如此排列，使得有义链上的三个核苷酸的一个基序与反义链上的三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即有义链中的基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中基序的三个核苷酸中的至少一个形成碱基对。可替代地，至少两个核苷酸可以重叠，或所有三个核苷酸都可以重叠。
在一个实施方式中，RNAi剂的有义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个的基序。第一个基序可以出现在链的切割位点处或附近，并且其他基序可以是翼修饰。本文中的术语“翼修饰”是指出现在链的另一部分处的基序，所述部分在同一链的切割位点处或附近与基序分离。翼修饰要么与第一基序相邻，或被至少一个或多个核苷酸分开。当基序彼此紧邻时，则基序的化学性质彼此不同，并且当基序由一个或多个核苷酸分开时，化学性质可以相同或不同。可能存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以出现在相对于第一基序的一端，所述第一基序位于切割位点处或附近，或在前导基序的任一侧。
像有义链一样，RNAi剂的反义链可以含有在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的多于一个基序，其中至少一个基序出现在链的切割位点处或附近。此反义链还可以含有与可能存在于有义链上的翼修饰相似的排列的一个或多个翼修饰。
在一个实施方式中，RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3’端、5’端或两端处的第一个或前两个末端核苷酸。
在另一个实施方式中，RNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包含链的3’端、5’端或两端处双链体区内的第一个或前两个配对核苷酸。
当RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，翼修饰可以落在双链体区的同一端，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
当RNAi剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，有义链和反义链可以如此排列，使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区的另一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；两个修饰一条链落在前导基序的每一侧，在双链体区中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一个实施方式中，RNAi剂包含与靶点、在双链体内或其组合的错配。所述错配可能发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其他地方所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。
在一个实施方式中，RNAi剂在从反义链的5’端开始的双链体区内包含前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区独立地选自以下：A:U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5’端处反义链的解离。
在一个实施方式中，反义链中从5’端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自以下：A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5’端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5’端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。
在另一个实施方式中，有义链的3’端处的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在另一个实施方式中，反义链的3’端处的核苷酸是脱氧胸腺嘧啶(dT)。在一个实施方式中，存在脱氧胸腺嘧啶核苷酸的短序列，例如，在有义链或反义链的3’端上有两个dT核苷酸。
在一个实施方式中，有义链序列可以由式(I)表示：
5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3’(I)
其中：
i和j各自独立地为0或1；
p和q各自独立地为0-6；
每个Na独立地表示包含0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同修饰；和
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。优选地，YYY全部是2’-F修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，Na或Nb包含交替模式的修饰。
在一个实施方式中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12或11、12、13处)，计数从第1个核苷酸开始，从5’端开始；或任选地，计数从5’端开始，从双链体区内的第1配对核苷酸开始。
在一个实施方式中，i是1并且j是0，或者i是0并且j是1，或i和j两者都是1。因此，有义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’(Ib)；
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’(Ic)；或者
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’(Id)。
当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
每个Na可以独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包含0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Id)时每个Nb独立地表示包含0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb为0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
在其他实施方式中，i是0并且j是0，并且有义链可以由下式表示：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’(Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方式中，RNAi的反义链序列可以由式(Ie)表示：
5’nq’-Na’-(Z’Z’Z’)k-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-(X’X’X’)l-N’a-np’3’(II)
其中：
k和l各自独立地为0或1；
p’和q’各自独立地为0-6；
每个Na’独立地表示包含0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb’独立地表示包含0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np’和nq’独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb’和Y’不具有相同的修饰；
并且
X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方式中，Na’或Nb’包含交替模式的修饰。
Y’Y’Y’基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当RNAi剂具有长度为17个至23个核苷酸的双链体区时，Y’Y’Y’基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，计数从第1个核苷酸开始，从5’端开始；或任选地，计数从5’端开始，从双链体区内的第1配对核苷酸开始。优选地，Y’Y’Y’基序出现在位置11、12、13处。
在一个实施方式中，Y’Y’Y’基序全部是2’-OMe修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，k是1并且l是0，或k是0并且l是1，或k和l两者都是1。
因此，反义链可以由下式表示：
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Na’-np’3’(IIb)；
5’nq’-Na’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-np’3’(IIc)；或者
5’nq’-Na’-Z’Z’Z’-Nb’-Y’Y’Y’-Nb’-X’X’X’-Na’-np’3’(IId)。
当反义链表示由式(IIb)表示时，Nb’表示包含0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IIc)时，Nb’表示包含0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IId)时，每个Nb’独立地表示包含0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na’独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。优选地，Nb为0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方式中，k是0并且l是0，并且反义链可以由下式表示：
5’np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3’(Ia)。
当反义链表示为式(IIa)时，每个Na’独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X’、Y’和Z’中的每一个可以彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、UNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-羟基或2’-氟修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2’-O-甲基或2’-氟修饰。特别地，每个X、Y、Z、X’、Y’和Z’可以表示2’-O-甲基修饰或2’-氟修饰。
在一个实施方式中，当双链体区为21nt时，RNAi剂的有义链可以含有出现在链的9、10和11位置处的YYY基序，计数从5’端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5’端的双链体区内的第1配对核苷酸开始；并且Y表示2’-F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或ZZZ基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一个实施方式中，反义链可以含有出现在链的位置11、12、13处的Y’Y’Y’基序，计数从5’端的第1个核苷酸开始，或任选地，计数从5’端的双链体区内的第1配对核苷酸开始；并且Y’表示2’-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X’X’X’基序或Z’Z’Z’基序作为在双链体区的相对端处的翼修饰；并且X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链与分别由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此，用于本公开的方法中的RNAi剂可以包含有义链和反义链，每条链具有14个至30个核苷酸，RNAi双链体由式(III)表示：
有义：5’np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3’
反义：3’np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq ’5’
(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地为0或1；
p、p’、q和q’各自独立地为0-6；
每个Na和Na’独立地表示包含0个至25个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
每个可能存在或不存在的np’、np、nq’和nq独立地表示突出端核苷酸；并且
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’和Z’Z’Z’各自独立地表示在三个连续核苷酸上的三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方式中，i是0并且j是0；或i是1并且j是0；或i是0并且j是1；或i和j两者都是0；或i和j两者都是1。在另一个实施方式中，k是0并且l是0；或k是1并且l是0；k是0并且l是1；或k和l两者都是0；或k和l两者都是1。
形成RNAi双链体的有义链和反义链的示例性组合包含下式：
5’np-Na-YYY-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5’
(IIIa)
5’np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’
3’np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5’
(IIIb)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq3’
3’np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5’
(IIIc)
5’np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq3’
3’np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5’
(IIId)
当RNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包含1个至10个、1个至7个、1个至5个或1个至4个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂表示为式(IIIc)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经饰修的核苷酸的寡核苷酸序列。
当RNAi剂表示为式(IIId)时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0个至10个、0个至7个、0个至10个、0个至7个、0个至5个、0个至4个、0个至2个或0个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2个至20个、2个至15个或2个至10个经修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每一个独立地包含交替模式的修饰。
在一个实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰。在另一个实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，并且np’>0，并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接。在又另一个实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，并且np’>0，并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价支链接头(下文描述的)连接的一个或多个C16(或相关)部分缀合。在另一个实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，并且np’>0，并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链任选地与通过二价或三价支链接头连接的一个或多个亲脂性，例如C16(或相关)部分缀合。
在一个实施方式中，当RNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，并且np’>0，并且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价支链接头连接的一个或多个亲脂性，例如C16(或相关)部分缀合。
在一个实施方式中，RNAi剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在一个实施方式中，RNAi剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中所述双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每个双链体可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
在一个实施方式中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的两种RNAi剂在5’端处以及一个或两个3’处彼此连接，并且任选地与配体缀合。每种剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或每种剂可以靶向两个不同的靶位点处的相同的基因。
各种出版物描述了可以用于本公开的方法的多聚体RNAi剂。此类出版物包含WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520；以及US7858769，所述文献中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
在某些实施方式中，本公开的组合物和方法包含如本文所描述的RNAi剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性实施方式中，本公开的5’乙烯基膦酸修饰的核苷酸具有以下结构：
其中X是O或S；
[R是氢、羟基、氟或C1-20烷氧基(例如甲氧基或正十六烷氧基)；
R5’为＝C(H)-P(O)(OH)2并且C5’碳与R5’之间的双键处于E或Z取向(例如，E取向)；和
B是核碱基或修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在一个实施方式中，R5’是＝C(H)-P(O)(OH)2并且C5’碳和R5’之间的双键处于E取向。在另一个实施方式中，R是甲氧基并且R5'是＝C(H)-P(O)(OH)2并且C5'碳和R5'之间的双键处于E取向。在另一个实施方式中，X是S，R是甲氧基，并且R5'是＝C(H)-P(O)(OH)2并且C5'碳和R5'之间的双键处于E取向。
5’端含磷基团还包含5’-磷酸酯前药或5’-膦酸酯前药。
本公开的乙烯基膦酸可以与本公开的dsRNA的反义链或有义链连接。在某些实施方式中，本公开的乙烯基膦酸酯与dsRNA的反义链连接，任选地在dsRNA反义链的5’端处。
乙烯基膦酸酯修饰也设想用于本公开的组合物和方法。示例性乙烯基磷酸酯结构包含前述结构，其中R5’是＝C(H)-OP(O)(OH)2并且C5’碳和R5’之间的双键处于E或Z方向(例如，E方向)。
在其他实例中，5’端含磷基团是/>或其盐(例如，钠盐)，其中B是任选修饰的核碱基(例如，U)。
在其他实例中，5’-磷酸酯前药或5’-膦酸酯前药具有WO2022/147214中公开的结构，其通过引用并入本文。
Pmmds(((4SR,5SR)-3,3,5-三甲基-1,2-二硫戊-4-基)磷酸二酯)；
cPmmds(((4SR,5RS)-3,3,5-三甲基-1,2-二硫戊-4-基)磷酸二酯(顺式Pmmds))；
PdAr1s(((4SR,5RS)-5-苯基-3,3-二甲基-1,2-二硫戊-4-基)磷酸二酯)；
PdAr3s(((4SR,5RS)-5-(4-methyl苯基)-3,3-二甲基-1,2-二硫戊-4-基)磷酸二酯)；
PdAr5s(((4SR,5RS)-5-(4-甲氧基苯基)-3,3-二甲基-1,2-二硫戊-4-基)磷酸二酯)；
PdAr2sPdAr4s/>PdAr6s/>
Pmmd/PmmdsPmds/>Cymd/Cymds(/>X是O/S)；Ptmd/Ptmds(/>X是O/S),Pd/Pds(/>X是O/S)。/>
例如，包含以下列表的5’修饰磷酸前药的siRNA的活性通常与包含5’-VP的siRNA的活性相当：包含下列5’修饰磷酸前药的siRNA通常比含有5'-VP的siRNA具有更高的稳定性，并且比含有5'-VP的siRNA具有更好或相当的活性：
i.热不稳定修饰
在某些实施方式中，可以通过在反义链的种子区(即，在反义链5’端的位置2-9处或反义链5’端的位置2-8处)掺入热不稳定修饰来优化dsRNA分子的RNA干扰，以降低或抑制脱靶基因沉默。已经发现，具有反义链的dsRNA具有降低脱靶基因沉默活性的作用，所述反义链包含前9个核苷酸位置内的双链体的至少一个热不稳定修饰，从所述反义链的5’端开始计数。因此，在一些实施方式中，反义链在反义链的5’区的前9个核苷酸位置内包含至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个或更多个)双链体的热不稳定修饰。在一些实施方式中，双链体的一个或多个热不稳定修饰位于从反义链5’端起的位置2至9处，或优选地位置4至8处。在一些另外的实施方式中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5’端起的位置6、7或8处。在仍一些另外的实施方式中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5’端起的位置7处。术语“热不稳定修饰”包含将导致dsRNA的总熔融温度(Tm)低于没有此类修饰的dsRNA的Tm的修饰(优选地，Tm低于没有此类修饰的dsRNA的Tm一摄氏度、二摄氏度、三摄氏度或四摄氏度)。在一些实施方式中，双链体的热不稳定修饰位于从反义链的5’端起的位置2、3、4、5或9处。
热不稳定修饰可以包含但不限于脱碱基修饰；与相对链中的相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2’-脱氧修饰、无环核苷酸，例如，解锁核酸(UNA)、二醇核酸(GNA)和2’-5’-连接核糖核苷酸(“3’-RNA”)。
示例性的脱碱基修饰包含但不限于以下：
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其中R＝H、Me、Et或OMe；R’＝H、Me、Et或OMe；R”＝H、Me、Et或OMe
其中B是修饰的或未修饰的核碱基。
示例性的糖修饰包括但不限于以下：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基。
在一些实施方式中，双链体的热不稳定修饰选自以下：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基，并且每个结构上的星号表示R、S或外消旋。
在一些实施方式中，双链体的热不稳定修饰选自以下：
其中B是修饰的或未修饰的核碱基并且星号表示R、S或外消旋(例如S)。
术语“无环核苷酸”是指具有无环核糖糖的任何核苷酸，例如其中核糖碳之间的任何键(例如，C1’-C2’、C2’-C3’、C3’-C4’、C4’-O4’或C1’-O4’)不存在或核糖碳或氧中的至少一个(例如，C1’、C2’、C3’、C4’或O4’)独立地或组合地不存在于核苷酸中。在一些实施方式中，无环核苷酸是 其中B是修饰的或未修饰的核碱基，R1和R2独立地为H、卤素、OR3或烷基；并且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。术语“UNA”指未锁定的无环核酸，其中糖的任何键都已被去除，形成未锁定“糖”残基。在一个实施例中，UNA也涵盖C1’-C4’之间的键被去除的单体(即，C1’和C4’碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，糖的C2’-C3’键(即，C2’和C3’碳之间的共价碳-碳键)被去除(参见Mikhailov等，Tetrahedron Letters,26(17):2059(1985)；和Fluiter等，Mol.Biosyst.,10:1039(2009)，其全部内容通过引用在此并入)。无环衍生物在不影响Watson-Crick配对的情况下提供了更大的主链灵活性。无环核苷酸能够通过2’-5’或3’-5’键连接。
术语‘GNA’是指二醇核酸，所述二醇核酸是一种类似于DNA或RNA的聚合物，但其“主链”的组成不同，因为其由磷酸二酯键连接的重复甘油单元组成：
双链体的热不稳定修饰可以是热不稳定核苷酸与dsRNA双链体内相对链中的相对核苷酸之间的错配(即非互补碱基对)。示例性错配碱基对包含G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T、U:T或其组合。本领域已知的其他错配碱基配对也适用于本发明。错配可以发生在核苷酸(天然存在的核苷酸或经修饰的核苷酸)之间，即，错配碱基配对可以发生在来自相应的核苷酸的核碱基之间，而与核苷酸的核糖糖上的修饰无关。在某些实施方式中，dsRNA分子在错配配对中含有至少一个核碱基，所述核碱基为2’-脱氧核碱基；例如，2’-脱氧核碱基是在有义链中。
在一些实施方式中，反义链的种子区中的双链体的热不稳定修饰包含与靶mRNA上的互补碱基具有受损W-C H键合的核苷酸，如：
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在WO 2011/133876中详细描述了脱碱基核苷酸、无环核苷酸修饰(包含UNA和GNA)和错配修饰的更多实例，所述文献通过全文引用的方式并入本文。
热不稳定修饰还可以包含减少的或消除了与相对碱基形成氢键的能力的通用碱基和磷酸酯修饰。
在一些实施方式中，双链体的热不稳定修饰包含具有非规范碱基的核苷酸，如但不限于具有受损的或完全消除了与相对链中的碱基形成氢键的能力的核碱基修饰。已经评估了这些核碱基修饰对dsRNA双链体的中心区域的不稳定，如WO 2010/0011895中所描述的，所述文献通过全文引用的方式并入本文。示例性核碱基修饰是：
在一些实施方式中，反义链的种子区中的双链体的热不稳定修饰包含与靶mRNA上的碱基互补的一个或多个α-核苷酸，如：
其中R是H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
与天然磷酸二酯键相比，已知降低dsRNA双链体热稳定性的示例性磷酸酯修饰是：
R基团的烷基可以是C1-C6烷基。R基团的具体烷基包含但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、戊基和己基。
如本领域技术人员认识到的，鉴于核碱基的功能作用是定义本公开的RNAi剂的特异性，而核碱基修饰可以以如本文所描述的各种方式进行，例如将不稳定修饰引入本公开的RNAi剂中，例如为了相对于脱靶效应增强在靶效应，对于非核碱基修饰，例如对多核糖核苷酸的糖基或磷酸酯主链的修饰，本公开的RNAi剂上可用的和通常存在的修饰的范围往往要大得多。此类修饰在本公开的其他部分中进行了更详细的描述，并且明确考虑用于本公开的RNAi剂，其具有如上所述或本文其他地方所述的天然核碱基或经修饰的核碱基。
除了包含热不稳定修饰的反义链外，dsRNA还可以包含一个或多个稳定修饰。例如，dsRNA可以包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，所有稳定修饰都可以存在于一条链中。在一些实施方式中，有义链和反义链两者均包含至少两个稳定修饰。稳定修饰可以发生在所述有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，稳定修饰可以发生在所述有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个稳定修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链两者包含交替模式的稳定修饰。有义链上的稳定修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上稳定修饰的交替模式可以相对于反义链上稳定修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施方式中，反义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，反义链中的稳定修饰可以存在于任何位置处。在一些实施方式中，反义包含从5’端起的位置2、6、8、9、14和16处的稳定修饰。在一些其他实施方式中，反义包含从5’端起的位置2、6、14和16处的稳定修饰。在仍一些其他实施方式中，反义包含从5’端起的位置2、14和16处的稳定修饰。
在一些实施方式中，反义链包含与不稳定修饰相邻的至少一个稳定修饰。例如，稳定修饰可以是不稳定修饰的5’端或3’端处的核苷酸，即距离不稳定修饰的位置-1或+1的位置处。在一些实施方式中，反义链包含不稳定修饰的5’端和3’端中的每一个处的稳定修饰，即从距离不稳定修饰的位置-1和+1的位置。
在一些实施方式中，反义链包含不稳定修饰的3’端处的至少两个稳定修饰，即距离不稳定修饰的位置+1或+2的位置处。
在一些实施方式中，有义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)稳定修饰。不受限制地，有义链中的稳定修饰可以存在于任何位置处。在一些实施方式中，有义链包含从5’端起的位置7、10和11处的稳定修饰。在一些其他实施方式中，有义链包含从5’端起的位置7、9、10和11处的稳定修饰。在一些实施方式中，有义链包含从反义链的5’端开始计数，与反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的稳定修饰。在一些其他实施方式中，有义链包含从反义链的5’端开始计数，与反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的稳定修饰。在一些实施方式中，有义链包含两个、三个或四个稳定修饰的嵌段。
在一些实施方式中，有义链不包含与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补的位置中的稳定修饰。
示例性的热稳定修饰包含但不限于2’-氟修饰。其他热稳定修饰包含但不限于LNA。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA包含至少四个(例如，四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。不受限制地，所有2’-氟核苷酸都可以存在于一条链中。在一些实施方式中，有义链和反义链两者均包含至少两个2’-氟核苷酸。2’-氟修饰可以发生在所述有义链或反义链的任何核苷酸上。例如，2’-氟修饰可以发生在所述有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个2’-氟修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链两者包含交替模式的2’-氟修饰。有义链上的2’-氟修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上2’-氟修饰的交替模式可以相对于反义链上2’-氟修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施方式中，反义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。不受限制地，反义链中的2’-氟修饰可以存在于任何位置处。在一些实施方式中，反义包含从5’端起的位置2、6、8、9、14和16处的2’-氟核苷酸。在一些其他实施方式中，反义包含从5’端起的位置2、6、14和16处的2’-氟核苷酸。在仍一些其他实施方式中，反义包含从5’端起的位置2、14和16处的2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，反义链包含与不稳定修饰相邻的至少一个2’-氟核苷酸。例如，2’-氟核苷酸可以是不稳定修饰的5’端或3’端处的核苷酸，即距离不稳定修饰的位置-1或+1的位置处。在一些实施方式中，反义链包含不稳定修饰的5’端和3’端中的每一个处的2’-氟核苷酸，即从距离不稳定修饰的位置-1和+1的位置。
在一些实施方式中，反义链包含不稳定修饰的3’端处的至少两个2’-氟核苷酸，即距离不稳定修饰的位置+1或+2的位置处。
在一些实施方式中，有义链包含至少两个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)2’-氟核苷酸。不受限制地，有义链中的2’-氟修饰可以存在于任何位置处。在一些实施方式中，反义包含从5’端起的位置7、10和11处的2’-氟核苷酸。在一些其他实施方式中，有义链包含从5’端起的位置7、9、10和11处的2’-氟核苷酸。在一些实施方式中，有义链包含从反义链的5’端开始计数，与反义链的位置11、12和15相对或互补的位置处的2’-氟核苷酸。在一些其他实施方式中，有义链包含从反义链的5’端开始计数，与反义链的位置11、12、13和15相对或互补的位置处的2’-氟核苷酸。在一些实施方式中，有义链包含两个、三个或四个2’-氟核苷酸的嵌段。
在一些实施方式中，有义链不包含与反义链中的双链体的热不稳定修饰相对或互补的位置中的2’-氟核苷酸。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子包含21个核苷酸(nt)的有义链和23个核苷酸(nt)的反义链，其中所述反义链包含至少一个热不稳定核苷酸，其中所述至少一个热不稳定核苷酸出现在反义链的种子区(即，反义链的5’端的位置2至9处或反义链的5’端的位置2至8处)，其中所述dsRNA的一端是平端，而另一端包含2nt突出端，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述反义包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(v)所述有义链包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA包含所述反义链的5’端处的平端。优选地，2nt突出端位于反义的3’端处。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中所述有义链的长度为25个至30个核苷酸残基，其中从所述有义链的5’端核苷酸(位置1)位置1开始至位置23，包含至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36个至66个核苷酸残基，并且从3’端核苷酸开始，在与有义链的位置1至23配对以形成双链体的位置中的至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3’端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续3’端核苷酸与有义链不配对，由此形成1个至6个核苷酸的3’单链突出端；其中反义链的5’端包含10个至30个与有义链不配对的连续核苷酸，由此形成10个至30个核苷酸单链5’突出端；其中当有义链和反义链比对以获得最大互补性时，至少有义链5’端和3’端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，由此在有义链与反义链之间形成基本上双链的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以在将所述双链核酸引入哺乳动物细胞时减少靶基因表达；并且其中所述反义链含有至少一个热不稳定核苷酸，其中至少一个热不稳定核苷酸在所述反义链的种子区(即在所述反义链的5’端的位置2至9处或所述反义链的5’端的位置2至8处)中。例如，热不稳定核苷酸出现在与有义链的5’端的位置14至17相对或互补的位置之间，并且其中dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述反义包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(v)所述有义链包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA包含长度为12个至30个核苷酸对的双链体区。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子包含有义链和反义链，其中所述dsRNA分子包含长度为至少25个且最多29个核苷酸的有义链以及长度为最多30个核苷酸的反义链，其中所述有义链包含在从5’端起的位置11处易受酶降解的经修饰的核苷酸，其中所述有义链的3’端和所述反义链的5’端形成平端，并且所述反义链在其3’端处比所述有义链长1个至4个核苷酸，其中长度为至少25个核苷酸的双链体区和所述反义链与靶mRNA沿着所述反义链长度的至少19nt充分互补以在将所述dsRNA分子引入哺乳动物细胞时降低靶基因表达，并且其中所述dsRNA的dicer切割优先地产生包含所述反义链的所述3’端的siRNA，由此减少所述哺乳动物的所述靶基因的表达，其中所述反义链含有至少一个热不稳定核苷酸，其中所述至少一个热不稳定核苷酸在所述反义链的种子区(即在所述反义链的5’端的位置2至9处或所述反义链的5’端的位置2至8处)中，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述反义包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(v)所述有义链包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；以及(vi)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；以及(vii)所述dsRNA具有长度为12个至29个核苷酸对的双链体区。
在一些实施方式中，dsRNA分子的有义链和反义链中的每个核苷酸都可以是经修饰的。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包含一个或两个非连接磷酸酯氧或一个或多个连接磷酸酯氧的一种或多种改变；核糖的成分的改变，例如，核糖上的2’羟基的改变；用“去磷酸”接头大规模置换磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替换；以及核糖-磷酸酯主链的替换或修饰。
由于核酸是亚基的聚合物，许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基或磷酸酯部分的修饰，或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况下，修饰发生在核酸中的所有主体位置，但在许多情况下不会。例如，修饰可以仅发生在3’或5’端位置处，可以仅发生于末端区域中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中。修饰可以发生在双链区、单链区或两者中。修饰可以只发生在RNA的双链区中，或可以只发生于RNA的单链区中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端处，可以仅发生于末端区中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2个、3个、4个、5个或10个核苷酸中，或可以发生在双链和单链区中，特别是在末端处。一个或多个5’端可以被磷酸化。
例如，为增强稳定性，可能可以在突出端中包含特定的碱基，或在单链突出端中，例如在5’或3’突出端中或在两者中包含经修饰的核苷酸或核苷酸替代物。例如，在突出端中包含嘌呤核苷酸可以是期望的。在一些实施方式中，3’或5’突出端中的所有或一些碱基可以被修饰，例如，通过本文所描述的修饰。修饰可以包含，例如使用本领域已知的修饰在核糖糖的2’位置处的修饰，例如，用脱氧核糖核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)或2’-O-甲基修饰代替核碱基的核糖，以及磷酸酯基团的修饰，例如硫代磷酸酯修饰。突出端不需要与靶序列同源。
在一些实施方式中，有义链和反义链的每个残基独立地用锁定LNA、HNA、CeNA、2’-甲氧基乙基、2’-O-甲基、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-脱氧或2’-氟修饰。链可以含有多于一种修饰。在一些实施方式中，有义链和反义链的每个残基独立地用2’-O-甲基或2’-氟修饰。应理解，这些修饰是对反义链中存在的双链体的至少一个热不稳定修饰的补充。
在有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2’-脱氧、2’-O-甲基或2’-氟修饰、无环核苷酸或其他修饰。在一些实施方式中，有义链和反义链各自包含选自2’-O-甲基或2’-脱氧的两种不同修饰的核苷酸。在一些实施方式中，有义链和反义链的每个残基独立地用2’-O-甲基核苷酸、2’-O-脱氧核苷酸、2’-脱氧-2’-氟核苷酸、2’-O-N-甲基乙酰氨基(2’-O-NMA)核苷酸、2’-O-二甲基氨基乙氧基乙基(2’-O-DMAEOE)核苷酸、2’-O-氨基丙基(2’-O-AP)核苷酸或2’-ara-F核苷酸修饰。同样，应理解，这些修饰是对反义链中存在的双链体的至少一个热不稳定修饰的补充。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子包含交替模式的修饰，特别是在B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’、B4’区域中。如本文所使用的，术语“交替基序”或“交替模式”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自表示核苷酸的一种修饰类型，则交替基序可以是“ABABABABABAB…” 、 “AABBAABBAABB…” 、“AABAABAABAAB…” 、 “AAABAAABAAAB…” 、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
包含在交替基序中的修饰的类型可以是相同的或不同的。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种修饰类型，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰可以是相同的，但每个有义链或反义链可以选自交替基序内的若干种修饰可能性，如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子包含相对于反义链上的交替基序的修饰模式，有义链上交替基序的修饰模式发生了偏移。所述偏移可以使得有义链的核苷酸的经修饰的基团对应于反义链的核苷酸的不同经修饰的基团，并且反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5’到3’以“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区内从链的3’到5’以“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从链的5’到3’以“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序在双链体区内可以从链的3’到5’以“BBAABBAA”开始，因此在有义链与反义链之间存在修饰模式的完全或部分转移。
在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5’到3’的“ABABAB”，其中每个A是未修饰的核糖核苷酸并且每个B是2’-O甲基修饰的核苷酸。
在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5’到3’的“ABABAB”，其中每个A是2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸并且每个B是2’-O甲基修饰的核苷酸。
在另一个特定实例中，反义链中的交替基序是从链的3’到5’的“BABABA”，其中每个A是2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸并且每个B是2’-O甲基修饰的核苷酸。
在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5’到3’的“ABABAB”，并且反义链中的交替基序是从链的3’到5’的“BABABA”，其中每个A是未修饰的核糖核苷酸，每个B是2’-O甲基修饰的核苷酸。
在一个特定实例中，有义链中的交替基序是从链的5’到3’的“ABABAB”，并且反义链中的交替基序是从链的3’到5’的“BABABA”，其中每个A是2’-脱氧-2’-氟修饰的核苷酸，每个B是2’-O甲基修饰的核苷酸。
本公开的dsRNA分子可以还包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在链的任何位置中的有义链或反义链或两条链的任何核苷酸上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在所述有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或有义链或反义链以交替模式包含两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上核苷酸间键修饰的交替模式具有偏移。
在一些实施方式中，dsRNA分子包含突出端区中的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区包含两个核苷酸，所述两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰，以将突出端核苷酸与双链体区内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2个、3个、4个或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键，将突出端核苷酸与紧挨着突出端核苷酸的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可能存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。优选地，这些末端三个核苷酸可以位于反义链的3’端处。
在一些实施方式中，dsRNA分子的有义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个磷酸酯核苷酸间键分离的两个至十个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的1个至10个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述有义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的反义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个或18个磷酸酯核苷酸间键分离的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式例中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或16个磷酸酯核苷酸间键分离的三个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个磷酸酯核苷酸间键分离的四个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个磷酸酯核苷酸间键分离的五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个磷酸酯核苷酸间键分离的六个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个磷酸酯核苷酸间键分离的七个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个磷酸酯核苷酸间键分离的八个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，dsRNA分子的反义链包含由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个磷酸酯核苷酸间键分离的九个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键的两个嵌段，其中所述硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键中的一个位于寡核苷酸序列中的任何位置处，并且所述反义链与包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯和磷酸酯核苷酸间键的任何组合的有义链或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯键的反义链配对。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义或反义链的末端位置1至10内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过有义或反义链的一端或两端处的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含每个有义或反义链的双链体的内部区域的1个至10个核苷酸内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸可以通过从有义链的5’端开始计数的双链体区的位置8至16处的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接；dsRNA分子可以任选地还包含末端位置1个至10个核苷酸内的一个或多个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的一个至五个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个至五个(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5(从5’端开始计数)内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5(从5’端开始计数)内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1至5内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1或2处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18至23内的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置20和21处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21和22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21盒22处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置22和23处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及反义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子还包含有义链的位置1处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置21处的一个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)，以及位置1和2处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置23和23处反义链的两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从5’端开始计数)。
在一些实施方式中，本公开的化合物包含主链手性中心模式。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少5个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少6个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少7个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少8个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少9个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少10个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少11个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少12个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少13个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少14个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少15个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少16个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少17个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少18个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少19个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过8个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过7个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过6个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过5个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过4个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过3个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过2个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Rp构型的不超过1个核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过8个非手性的核苷酸间键(作为非限制性实例，磷酸二酯)。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过3个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过2个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含不超过1个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少10个核苷酸间键和不超过8个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少11个核苷酸间键和不超过7个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少12个核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少13个核苷酸间键和不超过6个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少14个核苷酸间键和不超过5个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，主链手性中心的常见模式包含呈Sp构型的至少15个核苷酸间键和不超过4个非手性的核苷酸间键。在一些实施方式中，呈Sp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施方式中，呈Rp构型的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。在一些实施方式中，非手性的核苷酸间键任选地是连续的或不连续的。
在一些实施方式中，本公开的化合物包含为立体化学嵌段的嵌段。在一些实施方式中，嵌段是Rp嵌段，因为所述嵌段的每个核苷酸间键是Rp。在一些实施方式中，5’-嵌段是Rp嵌段。在一些实施方式中，3’-嵌段是Rp嵌段。在一些实施方式中，嵌段是Sp嵌段，因为所述嵌段的每个核苷酸间键是Sp。在一些实施方式中，5’-嵌段是Sp嵌段。在一些实施方式中，3’-嵌段是Sp嵌段。在一些实施方式中，所提供的寡核苷酸包含Rp和Sp嵌段两者。在一些实施方式中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个Rp嵌段但不包含Sp嵌段。在一些实施方式中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个Sp嵌段但不包含Rp嵌段。在一些实施方式中，所提供的寡核苷酸包含一个或多个PO嵌段，其中天然磷酸酯键中的每个核苷酸间键。
在一些实施方式中，本公开的化合物包含为Sp嵌段的5’-嵌段，其中每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方式中，5”-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方式中，5’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方式中，5’-嵌段包含4个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，5’-嵌段包含5个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，5’-嵌段包含6个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，5’-嵌段包含7个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方式中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是经修饰的核苷酸间键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方式中，3’-嵌段是Sp嵌段，其中每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键，并且每个糖部分包含2’-F修饰。在一些实施方式中，3’-嵌段包含4个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，3’-嵌段包含5个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，3’-嵌段包含6个或更多个核苷单元。在一些实施方式中，3’-嵌段包含7个或更多个核苷单元。
在一些实施方式中，本公开的化合物在一个区域中包含一种类型的核苷，或寡核苷酸之后是特定类型的核苷酸间键，例如天然磷酸酯键、经修饰的核苷酸间键、Rp手性核苷酸间键、Sp手性核苷酸间键等。在一些实施方式中，A之后是Sp。在一些实施方式中，A之后是Rp。在一些实施方式中，A之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方式中，U之后是Sp。在一些实施方式中，U之后是Rp。在一些实施方式中，U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方式中，C之后是Sp。在一些实施方式中，C之后是Rp。在一些实施方式中，C之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方式中，G之后是Sp。在一些实施方式中，G之后是Rp。在一些实施方式中，G之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方式中，C和U之后是Sp。在一些实施方式中，C和U之后是Rp。在一些实施方式中，C和U之后是天然磷酸酯键(PO)。在一些实施方式中，A和G之后是Sp。在一些实施方式中，A和G之后是Rp。
在一些实施方式中，反义链包含核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5’端的位置2至9处或反义链的5’端的位置2至8处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述反义包含3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合；(iv)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(v)所述有义链包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)所述dsRNA包含长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(viii)所述dsRNA具有在所述反义链的5’端处的平端。
在一些实施方式中，反义链包含核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5’端的位置2至9处或反义链的5’端的位置2至8处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述有义链与配体缀合；(iii)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(iv)所述有义链包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)所述dsRNA包含长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；(vii)所述dsRNA包含长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(viii)所述dsRNA具有在所述反义链的5’端处的平端。
在一些实施方式中，有义链包含核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5’端的位置2至9处或反义链的5’端的位置2至8处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部八个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述反义包含1个、2个、3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(iii)所述有义链与配体缀合(iv)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(v)所述有义链包含3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(vi)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vii)所述dsRNA包含长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(viii)所述dsRNA具有在所述反义链的5’端处的平端。
在一些实施方式中，有义链包含核苷酸位置1与2之间以及核苷酸位置2与3之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，反义链包含核苷酸位置1与2之间、核苷酸位置2与3之间、核苷酸位置21与22之间以及核苷酸位置22与23之间的硫代磷酸酯核苷酸间键，其中反义链含有位于反义链的种子区(即反义链的5’端的位置2至9处或反义链的5’端的位置2至8处)中的双链体的至少一个热不稳定修饰，并且其中所述dsRNA任选地进一步具有以下特征中的至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个或全部七个)：(i)所述反义包含2个、3个、4个、5个或6个2’-氟修饰；(ii)所述有义链与配体缀合；(iii)所述有义链包含2个、3个、4个或5个2’-氟修饰；(iv)所述有义链包含3个、4个或5个硫代磷酸酯核苷酸间键；(v)所述dsRNA包含至少四个2’-氟修饰；(vi)所述dsRNA包含长度为12个至40个核苷酸对的双链体区；以及(vi)所述dsRNA具有在所述反义链的5’端处的平端。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子包含与靶点、在双链体内或其组合的错配。所述错配可以发生在突出端区或双链体区中。碱基对可以基于其促进解离或熔化的倾向进行排序(例如，根据特定配对的缔合或离解的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一个临近点或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或规范外配对(如本文其他地方所述)优于规范(A:T、A:U、G:C)配对；并且包含通用碱基的配对优于规范配对。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子在从反义链的5’端开始的双链体区内包含前1个、2个、3个、4个或5个碱基对中的至少一个，所述双链体区可以独立地选自以下的组：A:U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或规范外配对或包含通用碱基的配对，以促进双链体的5’端处反义链的解离。
在一些实施方式中，反义链中从5’端开始的双链体区内1位置处的核苷酸选自以下：A、dA、dU、U和dT。可替代地，从反义链的5’端开始的双链体区内的前1个、2个或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，从反义链5’端起的双链体区内的第一个碱基对是AU碱基对。
发现了在单链或双链寡核苷酸的任何位置，将4’-修饰的或5’-修饰的核苷酸引入二核苷酸的磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)键的3’端可以对核苷酸间键施加空间效应，并且从而保护或稳定其免受核酸酶的作用。
在一些实施方式中，在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3’端处引入5’-修饰的核苷酸。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3’端处引入5’-烷基化核苷酸。核糖糖的5’位置处的烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5’-烷基化核苷酸是5’-甲基核苷酸。5’-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施方式中，在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3’端处引入4’-修饰的核苷酸。例如，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3’端处引入4’-烷基化核苷酸。核糖糖的4’位置处的烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-烷基化核苷酸是4’-甲基核苷酸。4’-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。可替代地，可以在单链或双链siRNA的任何位置处的二核苷酸的3’端处引入4’-O-烷基化核苷酸。核糖糖的4’-O-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-O-烷基化核苷酸是4’-O-甲基核苷酸。4’-O-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施方式中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入5’-烷基化核苷酸，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。5’-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性5’-烷基化核苷酸是5’-甲基核苷酸。5’-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施方式中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入4’-烷基化核苷酸，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。4’-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-烷基化核苷酸是4’-甲基核苷酸。4’-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施方式中，在dsRNA的有义链或反义链上的任何位置处引入4’-O-烷基化核苷酸，并且此类修饰维持或提高dsRNA的效力。5’-烷基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。示例性4’-O-烷基化核苷酸是4’-O-甲基核苷酸。4’-O-甲基可以是外消旋或手性纯R或S异构体。
在一些实施方式中，本公开的dsRNA分子可以包含2’-5’键(具有2’-H、2’-OH和2’-OMe，并且具有P＝O或P＝S)。例如，2’-5’键修饰可以用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可以用于有义链的5’端以避免有义链被RISC激活。
在另一个实施方式中，本公开的dsRNA分子可以包含L糖(例如，具有2’-H、2’-OH和2’-OMe的L-核糖、L-阿拉伯糖)。例如，这些L糖修饰可以用于促进核酸酶抗性或抑制有义链与反义链的结合，或可以用于有义链的5’端以避免有义链被RISC激活。
各种出版物描述了多聚体siRNA，其都可以与本公开的dsRNA一起使用。此类出版物包含WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，所述出版物特此通过全文引用的方式并入。
如下文更详细描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与RNAi剂的缀合的RNAi剂可以改善RNAi剂的一个或多个特性。在许多情况下，碳水化合物部分与RNAi剂的经修饰的亚基连接。例如，dsRNA剂的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖糖可以被另一个部分替代，例如，与碳水化合物配体连接的非碳水化合物(优选地，环)载体。其中亚基的核糖糖已经被如此替代的核糖核苷酸亚基在本文中被称为核糖替代修饰亚基(RRMS)。环状载体可以是碳环系统，即所有环原子都是碳原子，或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载体可以是单环系统，或可以含有两个或多个环，例如稠环。环状载体可以是完全饱和的环系统，或其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载体与多核苷酸连接。载体包含(i)至少一个“主链连接点”，优选地两个“骨干连接点”以及(ii)至少一个“系链连接点”。如本文所使用的，“主链连接点”是指官能团，例如羟基，或通常是可用于并适合将载体结合到主链中的键，例如核糖核酸的磷酸酯或经修饰的磷酸酯(例如，含硫)骨架。在一些实施例中，“系链连接点”(TAP)是指连接所选部分的环状载体的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)。所述部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖和多糖。任选地，所选择的部分通过中间系链与环状载体连接。因此，环状载体可以包含官能团，例如氨基，或通常提供适合于另一个化学实体(例如，组成环的配体)的结合或系留的键。
RNAi剂可以通过载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或无环基团。优选地，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪基、四氢呋喃基和十氢化萘基。优选地，无环基团选自丝氨酸醇主链或二乙醇胺主链。
在某些特定实施方式中，用于本公开的方法中的RNAi剂是选自表2-5中的任一个表所列出的剂的组的剂。这些剂可以还包含配体。
IV.与配体缀合的iRNA
本发明的iRNA的RNA的另一种修饰涉及将一种或多种配体、部分或缀合物与iRNA化学连接，所述一种或多种配体、部分或缀合物增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取(例如，进入细胞)。此类部分包含但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA,1989,86:6553-6556)、胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4:1053-1060)、硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.,1992,20:533-538)、脂肪族链，例如，十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J,1991,10:1111-1118；Kabanov等，FEBS Lett.,1990,259:327-330；Svinarchuk等，Biochimie,1993,75:49-54)、磷脂，例如，二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.,1990,18:3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969-973)或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229-237)或十八胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923-937)。
在某些实施方式中，配体改变其掺入的iRNA剂的分布、靶向或寿命。在一些实施方式中，例如，与不存在此类配体的物种相比，配体为选定靶点(例如，分子、细胞或细胞类型)、区室(例如，细胞或器官区室、组织、器官或身体区)提供增强的亲和力。典型的配体不参与双链体核酸中的双链体配对。
配体可以包含天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，右旋糖酐、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组分子或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包含聚氨基酸，即聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪。多胺的实例包含：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、多胺、假肽-多胺、拟肽多胺、树枝状多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、多胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包含靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如与特定细胞类型(如肾细胞)结合的抗体。靶向基团可以是促甲状腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性剂蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化多氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸酯、聚谷氨酸酯、聚天冬氨酸酯、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施方式中，配体是多价半乳糖，例如，N-乙酰基-半乳糖胺。
配体的其他实例包含染料、嵌入剂(例如，吖啶)、交联剂(例如，补骨脂烯、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨斯卟啉、扩环卟啉)、多环芳香族烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如，EDTA)、亲脂性分子(例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)、肽缀合物(例如，触角足突变肽、Tat肽)、烷化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PEG(例如，PEG-40K)、mPEG、[mPEG]2、聚氨基、烷基、经置换的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如，生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环化合物的Eu(3+)络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质(例如，糖蛋白)或肽(例如，对共配体具有特异性亲和力的分子)或抗体(例如，与特定细胞类型，如癌细胞、内皮细胞或骨细胞结合的抗体)。配体还可以包含激素和激素受体。配体还可以包含非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是物质，例如药物，其可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝来增加iRNA剂摄取到细胞中。药物可以是例如紫杉醇、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑(nocodazole)、杰斯内酯(japlakinolide)、拉春库林A(latrunculin A)、毒伞素(phalloidin)、斯文赫利A(swinholide A)、印丹诺辛(indanocine)或麦司文(myoservin)。
在一些实施方式中，与如本文所描述的iRNA连接的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包含亲脂性物质、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、聚乙二醇(PEG)、维生素等。示例性PK调节剂包含但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素。还已知包含许多硫代磷酸酯键的与血清蛋白结合的寡核苷酸，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸(例如，具有约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸)也适于本发明作为配体(例如，作为PK调节配体)。另外，与血清组分(例如，血清蛋白)结合的适体也适于用作本文所描述的实施例中的PK调节配体。
本发明的配体缀合的iRNA可以通过使用具有侧反应功能的寡核苷酸来合成，如源自连接分子连接到寡核苷酸上的寡核苷酸(如下文所描述的)。这种反应性寡核苷酸可以直接与可商购获得的配体、合成的带有多种保护基团中的任一种的配体或具有与其连接的连接部分的配体反应。
本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于此类合成的设备由若干个供应商销售，例如，包含Applied(Foster City,Calif.)。可以另外或可替代地采用本领域已知的用于此类合成的任何其他方式。使用类似技术来制备其他寡核苷酸(如硫代磷酸酯和烷基化的衍生物)也是已知的。
在本发明的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接的核苷的配体分子中，寡核苷酸和寡核苷可以利用标准核苷酸或核苷前体或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体、已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷缀合物前体或带有构建块的非核苷配体组装在合适的DNA合成器上。
当使用已经带有连接部分的核苷酸缀合物前体时，通常完成序列特异性连接核苷的合成，并且然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成器合成，使用源自配体-核苷缀合物的磷脒以及可商购获得的和常规用于寡核苷酸合成的标准磷脒和非标准磷酰胺。
A.脂质缀合物
在某些实施方式中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。此类脂质或基于脂质的分子通常可以与血清蛋白，如人血清白蛋白(HSA)结合。HSA结合配体允许缀合物分布到靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝，包含肝的实质细胞。可以与HSA结合的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加对缀合物降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，或(c)可以用于调节与血清蛋白，例如HSA的结合。
基于脂质的配体可以用于调节，例如控制(例如，抑制)缀合物与靶组织的结合。例如，更强地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体较不可能被靶向到肾脏，并且因此较不可能从身体清除。较不强烈地与HSA结合的脂质或基于脂质的配体可以用于将缀合物靶向到肾脏。
在某些实施方式中，基于脂质的配体与HSA结合。例如，配体可以以足够的亲和力与HSA结合，从而增强缀合物在非肾组织中的分布。然而，亲和力通常不会强到HSA配体结合不能被逆转。
在某些实施方式中，基于脂质的配体与HSA微弱地结合或根本不结合，使得缀合物在肾脏中的分布增强。靶向到肾细胞的其他部分也可以代替基于脂质的配体或除其之外使用。
另一方面，配体是被靶细胞(例如，增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗以不期望的细胞增殖为特征的疾病特别有用，例如恶性或非恶性类型的疾病，例如癌细胞。示例性维生素包含维生素A、E和K。包含的其他示例性维生素是B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或被癌细胞摄取的其他维生素或营养素。还包含HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在某些实施方式中，剂为两亲性的。示例性剂为肽，如tat或触角足突变肽。如果剂为肽，那么其可以被修饰，包含肽基模拟物、反演体、非肽或假肽键和使用D-氨基酸。螺旋剂通常是α-螺旋剂，并且可以具有亲脂性和疏脂性相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的所定义三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的连接可能影响iRNA的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分的长度可以为约5个至50个氨基酸，例如约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树状体肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包含疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO:11)的RFGF。含疏水性MTS的RFGF类似物(例如，氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO:12))也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，所述肽可以携带包含肽、寡核苷酸和蛋白质在内的大极性分子穿过细胞膜。例如，来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO:13))和果蝇(Drosophila Antennapedia)触角足突变蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:14))的序列已被发现能够起到递送肽的作用。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等，Nature,354:82-84,1991)。通常，通过掺入的单体单元与dsRNA剂连接的肽或肽模拟物的实例是细胞靶向肽，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度可以在约5个氨基酸至约40个氨基酸的范围内。肽部分可以具有结构修饰，如增加稳定性或直接构象特性。可以使用下面描述的任何结构修饰。
用于本发明的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含有RGD的肽和肽二聚体可以包含D-氨基酸以及合成的RGD模拟物。除了RGD，还可以使用靶向整合素配体的其他部分。此配体的优选的缀合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD肽部分可以用于靶向特定细胞类型，例如肿瘤细胞，如内皮肿瘤细胞或乳腺癌肿瘤细胞(Zitzmann等，Cancer Res.,62:5139-43,2002)。RGD肽可以促进dsRNA剂靶向多种其他组织的肿瘤，包含肺、肾、脾或肝的肿瘤(Aoki等，Cancer Gene Therapy 8:783-787,2001)。通常，RGD肽促进iRNA剂靶向肾。RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。例如，糖基化RGD肽可以将iRNA剂递送到表达αVβ3的肿瘤细胞(Haubner等，Jour.Nucl.Med.,42:326-336,2001)。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)或哺乳动物细胞(如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或细菌素)或仅含有一个或两个主要氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚西丁)。细胞渗透肽还可以包含核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是二分两亲性肽，如MPG，其源自HIV-1gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等，Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
C.碳水化合物缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施方式中，iRNA还包含碳水化合物。碳水化合物缀合的iRNA对于核酸的体内递送以及适于如本文所描述的体内治疗用途的组合物而言是有利的。如本文所使用的，“碳水化合物”是指化合物，所述化合物是碳水化合物，所述碳水化合物本身由一个或多个单糖单元构成，所述单糖单元具有至少6个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合；或是具有碳水化合物部分作为其部分的化合物，所述碳水化合物部分由一个或多个单糖单元构成，每个单糖单元具有至少六个碳原子(可以是直链、支链或环状)，其中氧、氮或硫原子与每个碳原子结合。代表性碳水化合物包含糖(单糖、二糖、三糖和含有约4个、5个、6个、7个、8个或9个单糖单元的寡糖)和多糖如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。特定单糖包含C5及以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包含具有两个或三个单糖单元(例如，C5、C6、C7或C8)的糖。
在某些实施方式中，碳水化合物缀合物包括单糖。
在某些实施方式中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)。包含一种或多种N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物在例如US 8,106,022中进行了描述，所述文献的完整内容特此通过引用的方式并入本文。在一些实施方式中，GalNAc缀合物用作将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施方式中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝细胞，例如通过充当肝细胞(例如，肝细胞)的脱唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物包含一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以通过接头连接，例如二价或三价支链接头。在一些实施方式中，GalNAc缀合物与有义链的3’端缀合。在一些实施方式中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA剂缀合(例如，与有义链的3’端)。在一些实施方式中，GalNAc缀合物与有义链的5’端缀合。在一些实施方式中，GalNAc缀合物通过接头，例如本文所描述的接头与iRNA剂缀合(例如，与有义链的5’端)。
在本发明的某些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA剂连接。在一些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA剂连接。在本发明的其他实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本公开的iRNA剂连接。在本发明的其他实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过四价接头与本发明的iRNA剂连接。
在某些实施方式中，本发明的双链RNAi剂包含与iRNA剂连接的一个GalNAc或GalNAc衍生物。在某些实施方式中，本发明的双链RNAi剂包含多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个所述衍生物通过多个单价接头独立地与双链RNAi剂的多个核苷酸连接。
在一些实施方式中，例如，当本公开的iRNA剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3’端和相应的另一条链的5’端之间的不间断核苷酸链连接，形成包含多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。
在一些实施方式中，例如，当本发明的iRNA剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3’端和相应的另一条链的5’端之间的不间断核苷酸链连接，形成包含多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。
在一些实施方式中，GalNAc缀合物是
在一些实施方式中，RNAi剂通过接头与碳水化合物缀合物连接，如以下示意图所示，其中X是O或S
在一些实施方式中，RNAi剂与如表1中定义的L96缀合，并且如下所示：
在某些实施方式中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物选自以下：
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其中Y是O或S和n是3-6(式XXIV)；
其中Y是O或S和n是3-6(式XXV)；
其中X是O或S(式XXVII)；/>
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在某些实施方式中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。在某些实施方式中，单糖是N-乙酰基半乳糖胺，如
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在一些实施方式中，如下图所示，RNAi剂通过接头与碳水化合物缀合物连接，其中X是O或S
在一些实施方式中，RNAi剂与如表1中定义的L96缀合，并且如下所示：
用于本文所描述的实施方式中的另一代表性碳水化合物缀合物包含但不限于：
当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施方式中，合适的配体是WO 2019/055633中公开的配体，所述文献的全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，配体包含以下结构：
在某些实施方式中，本公开的RNAi剂可以包含GalNAc配体，即使此类GalNAc配体目前预计对于本公开的优选鞘内/CNS递送途径具有有限的价值。
在本发明的某些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过单价接头与本发明的iRNA剂连接。在一些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过二价接头与本发明的iRNA剂连接。在本发明的其他实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物通过三价接头与本发明的iRNA剂连接。
在一个实施方式中，本发明的双链RNAi剂包含与iRNA剂连接的一个或多个GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可以通过有义链或反义链上的接头与任何核苷酸连接。GalNac可以与有义链的5’端、有义链的3’端、反义链的5’端或反义链的3’端连接。在一个实施方式中，GalNAc与有义链的3’端连接，例如通过三价接头。
在其他实施方式中，本发明的双链RNAi剂包含多个(例如，2个、3个、4个、5个或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，每个通过多个接头例如单价接头独立地与双链RNAi剂的多个核苷酸连接。
在一些实施方式中，例如，当本发明的iRNA剂的两条链是一个较大分子的一部分时，所述较大分子由一条链的3’端和相应的另一条链的5’端之间的不间断核苷酸链连接，形成包含多个未配对核苷酸的发夹环，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含通过单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物还包含一个或多个如上文所描述的另外的配体，如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。
适用于本发明的另外的碳水化合物缀合物和接头包含WO 2014/179620和WO2014/179627中所描述的那些，所述文献中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
D.接头
在一些实施方式中，本文所描述的缀合物或配体可以通过各种接头与iRNA寡核苷酸连接，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物两部分的有机部分，例如，共价连接化合物的两部分。接头通常包括直接键或原子，如氧或硫；单元，如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，如但不限于经置换的或未经置换的烷基、经置换的或未经置换的烯基、经置换的或未经置换的炔基、芳烷基、芳烯基、芳炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳烷基、烷基芳烯基、烷基芳炔基、烯基芳烷基、烯基芳烯基、烯基芳炔基、炔基芳烷基、炔基芳烯基、炔基芳炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，所述一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、经置换的或未经置换的芳基、经置换的或未经置换的杂芳基、经置换的或未经置换的杂环基；其中R8是氢、酰基、脂肪族或经置换的脂肪族。在某些实施方式中，接头是约1个至24个原子、2个至24个、3个至24个、4个至24个、5个至24个、6个至24个、6个至18个、7个至18个、8个至18个原子、7个至17个、8个至17个、6个至16个、7个至16个或8个至16个原子之间。
可切割连接基团是在细胞外部充分稳定的连接基团，但其在进入靶细胞之后切割以释放接头保持在一起的两个部分。在优选实施方式中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表细胞内条件)的切割是在受试者的血液中或在第二参考条件下(其可以例如被选择以模拟或代表在血液或血清中发现的条件)的切割速度的至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少约100倍。
可切割连接基团易受切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)影响。一般来说，切割剂在细胞内部比在血清或血液中更普遍，或以更高的水平或活性找到。此类降解剂的实例包含：针对特定底物选择的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包含例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，所述氧化或还原酶或还原剂可以通过还原降解氧化还原可切割连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的核内体或剂，例如产生pH为五或更低的那些核内体或剂；可以通过充当广义酸、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶来水解或降解酸可切割连接基团的酶。
可切割键基团，如二硫键可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而细胞内pH的平均值略低，范围为约7.1-7.3。核内体具有更酸性的pH，范围为5.5-6.0，并且溶酶体具有甚至更酸性的pH，为约5.0。一些接头具有可切割连接基团，所述连接基团在优选的pH下切割，由此从细胞内的配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的期望的区室中。
接头可以包含可由特定酶切割的可切割连接基团。并入到接头中的可切割连接基团的类型可以取决于所靶向的细胞。例如，肝脏靶向配体可以通过包含酯基的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，并且因此接头在肝细胞中比在非富含酯酶的细胞类型中更高效地切割。其他富含酯酶的细胞类型包含肺、肾皮质和睾丸中的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型，如肝细胞和滑膜细胞时，可以使用含有肽键的接头。
在通常情况下，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估候选可切割连接基团的适合性。还期望测试候选可切割连接基团抵抗在血液中或当与其他非靶组织接触时切割的能力。因此，可以确定第一条件与第二条件之间对切割的相对易感性，其中选择第一条件以指示靶细胞中的切割，并且选择第二条件以指示其他组织或生物流体，例如血液或血清中的切割。评估可以在无细胞系统、在细胞、在细胞培养物、在器官或组织培养物或在整只动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整只动物中进一步评估来确认可以是有用的。在优选实施方式中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的切割是在血液或血清中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。
氧化还原可切割连接基团
在某些实施方式中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。还原性可切割连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选可切割连接基团是否是合适的“还原性可切割连接基团”，或例如是否适合与特定iRNA部分和特定靶向剂一起使用，可以参考本文所描述的方法。例如，可以通过使用本领域已知的试剂与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起温育来评估候选物，这模拟将在细胞(例如，靶细胞)中观察到的切割速率。候选物还可以在被选择以模拟血液或血清条件的条件下评估。在一个中，候选化合物在血液中被切割至多约10％。在其他实施方式中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择以模拟细胞内条件的体外条件下)的降解是在血液中(或在被选择以模拟细胞外条件的体外条件下)的切割速度的至少约2倍、4倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或约100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在被选择以模拟细胞内介质的条件下确定并且与被选择以模拟细胞外介质的条件进行比较。
ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
在某些实施方式中，可切割接头包括基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的剂切割。细胞中使磷酸酯基团切割的剂的实例为细胞中的酶，如磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例为-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-。优选实施方式为-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-。优选实施方式是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评估这些候选物。
iii.酸可切割连接基团
在某些实施方式中，可切割接头包括酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下被切割的连接基团。在优选实施方式中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的酸性环境中或通过可以充当广义酸的剂(如酶)被切割。在细胞中，特定低pH细胞器，如核内体和溶酶体可以提供酸可切割连接基团的切割环境。酸可切割连接基团的实例包含但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可以具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。一个优选实施方式是与酯的氧连接的碳(烷氧基)为芳基、经置换的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评估这些候选物。
iv.基于酯的可切割连接基团
在某些实施方式中，可切割接头包括基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团通过细胞中的酶，如酯酶和酰胺酶切割。基于酯的可切割连接基团的实例包含但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评估这些候选物。
v.基于肽的可切割连接基团
在又另一个实施方式中，可切割接头包括基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团通过细胞中的酶，如肽酶和蛋白酶切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包含酰胺基(-C(O)NH-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在产生肽和蛋白质的氨基酸之间形成的肽键(即酰胺键)并且不包含整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式–NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB为两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与上文所描述的方法类似的方法来评估这些候选物。
在一些实施方式中，本发明的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。iRNA碳水化合物缀合物与本发明的组合物和方法的接头的非限制性实例包含但不限于：
/>
当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的组合物和方法的某些实施方式中，配体为通过二价或三价支链接头连接的一个或多个“GalNAc”(N-乙酰基半乳糖胺)衍生物。
在某些实施方式中，本发明的dsRNA与二价或三价支链接头缀合，所述二价或三价支链接头选自式(XLV)至(XLVI)中任一项所示的结构的组：
/>
其中：
其中q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出现时独立地表示0-20并且其中重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出现时各自独立地不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出现时独立地为不存在、亚烷基、经置换的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中的一个或多个中断或终止；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时各自独立地不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C表示配体；即每次出现时各自独立地为单糖(GlNAc)二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；并且Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合的GalNAc衍生物特别适用于与RNAi剂一起使用以抑制靶基因的表达，如式(XLIX)的表达：
式XLIX
式
其中L5A、L5B和L5C表示单糖，如GalNAc衍生物。
适合的缀合GalNAc衍生物的二价和三价支链接头基团的实例包含但不限于上文所提及的式II、式VII、式XI、式X和式XIII的结构。
教导RNA缀合物的制备的代表性美国专利包含但不限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；以及8,106,022，所述美国专利中的每一个的全部内容特此通过引用并入本文。
不需要均匀地修饰给定化合物中的所有位置，并且事实上，可以将上述修饰中的多于一个修饰并入单一化合物中或甚至iRNA内的单个核苷处。本发明还包含作为嵌合化合物的iRNA化合物。
在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，优选地dsRNA剂，其含有两个或更多个化学上不同的区，每个区由至少一个单体单元构成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外的区可以作为能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂交体的酶的底物。举例来说，RNase H是细胞核酸内切酶，所述细胞核酸内切酶切割RNA:DNA双链体的RNA链。因此，RNase H的激活使RNA靶点切割，由此大大增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交到同一靶点区的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，当使用嵌合dsRNA时，使用更短的iRNA通常可以获得相当的结果。可以通过凝胶电泳和必要时本领域已知的相关核酸杂交技术常规检测RNA靶标的切割。
在某些情况下，iRNA的RNA可以被非配体基团修饰。许多非配体分子已与iRNA缀合以增强iRNA的活性、细胞分布或细胞摄取，并且进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分已经包含脂质部分，如胆固醇(Kubo,T.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1):54-61；Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6553)，胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4:1053)，硫醚，例如，己基-S-三苯基甲硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660:306；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3:2765)，硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.,1992,20:533)，脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.,1991,10:111；Kabanov等，FEBS Lett.,1990,259:327；Svinarchuk等，Biochimie,1993,75:49)，磷脂，例如二-十六烷基-rac-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-rac-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651；Shea等，Nucl.Acids Res.,1990,18:3777)，多胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides,1995,14:969)或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.,1995,36:3651)，棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta,1995,1264:229)，或十八胺或己基氨基-羰基-羰基氧基胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277:923)。上面列出了教导制备此类RNA缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案涉及合成在序列的一个或多个位置处具有氨基接头的RNA。随后使用适当偶联试剂或激活试剂使氨基与所缀合的分子反应。缀合反应可以在RNA仍与固相载体结合的情况下或在RNA切割之后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常产生纯缀合物。
V.本公开的RNAi剂的递送
本公开的RNAi剂想细胞例如受试者如人受试者(例如，有此需要的受试者，如患有HTT相关病症例如亨廷顿氏病的受试者)体内的细胞的递送可通过大量不同途径实现。例如，可以通过将细胞与本公开的RNAi要剂在体外或体内接触而进行递送。体内递送还可以通过将包含RNAi剂如dsRNA的组合物向受试者施用而直接进行。可替代地，体内递送可以通过施用一种或多种编码和引导RNAi剂的表达的载体间接进行。下文将进一步讨论这些替代方案。
在通常情况下，任何递送核酸分子的方法(体外或体内)都可以适于与本公开的RNAi剂一起使用(参见，例如，Akhtar S.和Julian RL.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5):139-144以及WO94/02595和WO94/02595，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。对于体内递送，为递送RNAi剂需要考虑的因素包含例如，递送的剂的生物稳定性、非特异性效应的预防以及递送的剂在靶组织中的积累。可以通过局部施用，例如通过直接注射或植入到组织中或局部施用制剂来最小化RNAi剂的非特异性效应。对治疗位点的局部施用使剂的局部浓度最大化，限制剂暴露于全身组织，所述全身组织可能被剂伤害或可能降解剂，并允许施用较低的总剂量的RNAi剂。若干研究表明，当局部施用RNAi剂时，基因产物的成功敲低。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射(Tolentino,MJ.等，(2004)Retina 24:132-138)和在小鼠中通过视网膜下注射(Reich,SJ.等，(2003)Mol.Vis.9:210-216)眼内递送VEGF dsRNA两者均表明在年龄相关性黄斑变性的实验模型中预防新生血管形成。另外，在小鼠中直接瘤内注射dsRNA减小了肿瘤体积(Pille,J.等，(2005)Mol.Ther.11:267-274)，并且可以延长荷瘤小鼠的存活期(Kim,WJ.等，(2006)Mol.Ther.14:343-350；Li,S.等，(2007)Mol.Ther.15:515-523)。RNA干扰也显示出通过直接注射局部递送到CNS的成功(Dorn,G.等，(2004)Nucleic Acids 32:e49；Tan,PH.等，(2005)Gene Ther.12:59-66；Makimura,H.等，(2002)BMC Neurosci.3:18；Shishkina,GT.等，(2004)Neuroscience 129:521-528；Thakker,ER.,等，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101:17270-17275；Akaneya,Y.等，(2005)J.Neurophysiol.93:594-602)以及通过鼻内施用而递送至肺(Howard,KA.等，(2006)Mol.Ther.14:476-484；Zhang,X.等，(2004)J.Biol.Chem.279:10677-10684；Bitko,V.等，(2005)Nat.Med.11:50-55)。为了全身地施用RNAi剂以治疗疾病，可以修饰RNA或可替代地使用药物递送系统递送；这两种方法都用于防止dsRNA在体内被内切和外切核酸酶快速降解。RNA或药物载体的修饰也可以允许RNAi剂靶向靶组织，并且避免不期望的脱靶效应(例如，不希望受理论束缚，本文所描述的GNA的使用已被鉴定为使dsRNA的种子区不稳定，导致相对于脱靶效应，此类dsRNA对在靶有效性的偏好增强，因为此类脱靶效应因此类种子区不稳定而显著减弱)。RNAi剂可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)的化学缀合进行修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将针对与亲脂性胆固醇部分缀合的ApoB的RNAi剂全身注射到小鼠体内，并且引起肝脏和空肠两者中apoB mRNA的敲低(Soutschek,J.等，(2004)Nature 432:173-178)。在前列腺癌的小鼠模型中，RNAi剂与适体的缀合已被证明可以抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(McNamara,JO.等，(2006)Nat.Biotechnol.24:1005-1015)。在替代性实施方式中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)递送RNAi剂。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)分子RNAi剂的结合，并且还在带负电荷的细胞膜处增强相互作用以允许细胞高效地摄取RNAi剂。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与RNAi剂结合或被诱导以形成包裹RNAi剂的囊泡或胶束(参见，例如，Kim SH.等，(2008)Journal of Controlled Release 129(2):107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止RNAi剂的降解。用于制备和施用阳离子RNAi剂复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见，例如，Sorensen,DR.等，(2003)J.Mol.Biol327:761-766；Verma,UN.等，(2003)Clin.Cancer Res.9:1291-1300；Arnold,AS等，(2007)J.Hypertens.25:197-205，所述文献通过全文引用的方式并入本文)。可用于RNAi剂的全身递送的药物递送系统的一些非限制性实例包含DOTAP(Sorensen,DR.等，(2003)，同上；Verma,UN.等，(2003)同上)，Oligofectamine，“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann,TS.等(2006)Nature 441:111-114)，心磷脂(Chien,PY.等，(2005)Cancer Gene Ther.12:321-328；Pal,A.等，(2005)Int J.Oncol.26:1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet ME.等，(2008)Pharm.Res.Aug 16电子出版；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)，Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3:472-487)以及聚酰胺型胺(Tomalia,DA.等，(2007)Biochem.Soc.Trans.35:61-67；Yoo,H.等，(1999)Pharm.Res.16:1799-1804)。在一些实施方式中，RNAi剂与环糊精剂形成用于全身施用的复合物。施用方法以及RNAi剂和环糊精的药物组合物可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用整体并入本文。
本公开的某些方面涉及减少细胞中HTT靶基因表达的方法，包括使所述细胞与本公开的双链RNAi剂接触。在一个实施方式中，细胞是肝外细胞，任选地CNS细胞。
本公开的另一方面涉及一种减少受试者的HTT靶基因的表达的方法，包括向受试者施用本公开的双链RNAi剂。
本公开的另一方面涉及治疗患有CNS病症的受试者，包括向所述受试者施用治疗有效量的本公开的双链靶向HTT的RNAi剂，由此治疗所述受试者。可以通过本公开的方法治疗的示例性CNS病症包括亨廷顿氏病。
在一个实施方式中，双链RNAi剂是鞘内施用的。通过鞘内施用双链RNAi剂，所述方法可以降低HTT靶基因在以下中的表达：脑(例如，纹状体)或脊柱组织，例如皮质、小脑、颈椎、腰椎和胸椎。
为了便于阐述，本章节中的制剂、组合物和方法主要针对修饰的siRNA化合物进行讨论。然而可以理解，这些制剂、组合物和方法可以与其他siRNA化合物，例如，未修饰的siRNA化合物一起实践，并且此类实践在本公开范围内。包含RNAi剂的组合物可以通过多种途径向受试者递送。示例性途径包含：鞘内、静脉内、局部、直肠、肛门、阴道、鼻腔、肺部和眼部。
本公开的RNAi剂可以掺入适合施用的药物组合物中。此类组合物通常包含一种或多种RNAi剂和药学上可接受的载体。如本文所使用的，语言“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂以及吸附延迟剂等。将此类培养基和剂用于药物活性物质是本领域公知的。除了任何常规介质或剂与活性化合物不相容的情况之外，设想介质或剂在组合物中的使用。补充的活性化合物也可以并入所述组合物中。
取决于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本公开的药物组合物。施用可以是局部(包括眼科、阴道、直肠、鼻内、透皮)、鞘内、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉滴注、皮下、腹膜内或肌内注射，或鞘内或脑室内施用。
可以选择施用的通路和位点来增强靶向。例如，为靶向肌肉细胞，肌内注射至所灌注的肌肉将是合乎逻辑的选择。肺细胞可以通过施用气溶胶形式的RNAi剂来被靶向。可以通过用RNAi剂涂覆球囊导管并机械地引入RNA来靶向血管内皮细胞。
用于局部施用的制剂可以包含透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可能是有用的。
用于口服施用的组合物包含粉末或微粒、在水、糖浆、酏剂或非水性介质中的悬浮液或溶液、片剂、胶囊、含片或锭剂。在片剂的情况下，可以使用的载体包含乳糖、柠檬酸钠和磷酸盐。片剂中通常使用各种崩解剂，如淀粉，以及润滑剂，如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠和滑石。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂是乳糖和高分子量聚乙二醇。当口服需要水性悬浮液时，核酸组合物可以与乳化剂和悬浮剂组合。如果期望，可以添加某些甜味剂或调味剂。
用于鞘内或心室内施用的组合物可以包含还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂的无菌水溶液。
用于肠胃外施用的制剂可以包含还可以含有缓冲剂、稀释剂和其他合适的添加剂的无菌水溶液。心室内注射可以通过心室内导管来促进，例如，与储库连接。对于静脉内使用，可以控制溶质的总浓度以使制剂具有等渗性。
在一个实施方式中，siRNA化合物(例如，双链siRNA化合物或ssiRNA化合物)组合物的施用是肠胃外的，例如，静脉内(例如，作为推注或扩散输注)、皮内、腹膜内、肌内、鞘内、心室内、颅内、皮下、经粘膜、经颊、舌下、内窥镜、直肠、口腔、阴道、局部、肺部、鼻内、尿道或眼部。施用可以由受试者提供，也可以由另一个人提供，例如，医疗保健提供者。药物可以以测量剂量提供，或在递送计量的剂量的分配器中提供。下文将更详细地讨论选定的递送模式。
A.鞘内施用
在一个实施方式中，双链RNAi剂通过鞘内注射(即注射到浸泡脑和脊髓组织的脊髓液中)递送。将RNAi剂鞘内注射到脊髓液中可以以推注的方式进行，也可以通过植入皮肤下的微型泵进行，从而向脊髓液中提供siRNA的定期和持续递送。脊髓液从产生其的脉络丛开始循环，向下绕过脊髓和背根神经节，向上经过小脑和皮质到达蛛网膜颗粒，在那里流体可以离开CNS，这取决于注射的化合物的大小、稳定性和溶解度，鞘内递送的分子可以命中整个CNS的靶点。
在一些实施方式中，鞘内施用是通过泵进行的。所述泵可以是通过外科手术植入的渗透泵。在一个实施方式中，将渗透泵植入椎管的蛛网膜下腔以促进鞘内施用。
在一些实施方式中，鞘内施用是通过用于药物的鞘内递送系统进行的，所述鞘内递送系统包含含有一定体积剂的储器和被配置成递送所述储器中含有的剂的一部分的泵。关于这种鞘内递送系统的更多细节可以在WO 2015/116658中找到，所述文献通过全文引用的方式并入。
鞘内注射的RNAi剂的量可能在一个靶基因与另一个靶基因之间有差异，并且必须针对每个靶基因单独确定必须应用的适当量。通常，此量的范围为10μg至2mg，优选地50μg至1500μg，更优选地100μg至1000μg。
B.编码本公开的RNAi元剂的载体
靶向HTT基因的RNAi剂可以从插入DNA或RNA载体的转录单元表达(参见，例如，Couture,A等，TIG.(1996),12:5-10；WO 00/22113、WO 00/22114和US 6,054,299)。表达优选地是持续的(数月或更长时间)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:1292)。
RNAi剂的一条或多条单独的链可以从表达载体上的启动子转录。在要表达两条单独的链以产生例如dsRNA的情况下，可以将两个单独的表达载体共同引入(例如，通过转染或感染)到靶细胞中。可替代地，dsRNA的每个单独的链都可以通过启动子转录，这两个启动子都位于同一表达质粒上。在一个实施方式中，dsRNA被表达为通过接头多核苷酸序列连接的反向重复多核苷酸，使得dsRNA具有茎和环结构。
RNAi剂表达载体通常是DNA质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体，优选地与脊椎动物细胞相容的那些表达载体可以用于产生用于表达如本文所描述的RNAi剂的重组构建体。RNAi剂表达载体的递送可以是全身的，如通过静脉内或肌内施用，通过施用从患者体内移植的靶细胞，然后重新引入患者体内，或通过允许引入期望的靶细胞的任何其他方式。
可以与本文所描述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包含但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体、莫罗尼鼠白血病病毒等；(c)腺相关病毒载体；(d)单纯性疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，如正痘(例如，牛痘病毒载体)或禽痘(例如，金丝雀痘或禽痘)；以及(j)辅助依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷病毒也可能是有利的。不同的载体可以或可以不被并入到细胞的基因组中。如果期望，构建体可以包含用于转染的病毒序列。可替代地，构建体可以被并入能够附加型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。用于重组表达RNAi剂的构建体通常需要调节元件，例如启动子、增强子等，以确保RNAi剂在靶细胞中的表达。对于载体和构建体要考虑的其他方面是本领域已知的。
VI.本发明的组合物
本公开还包括组合物，包括包含本公开的RNAi剂的药物组合物和制剂。
在另一个实施方式中，本文提供了如本文所述的包含RNAi剂的药物组合物，或组合物，以及药学上可接受的载体。包含RNAi剂的药物组合物或组合物可用于治疗与HTT的表达或活性相关的疾病或病症，例如，亨廷顿氏病。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物是无菌的。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物是无热源或非热源的。
此类药物组合物基于递送模式调配。一个实例是调配用于通过肠胃外递送进行全身施用的组合物，例如通过静脉内(IV)、肌内(IM)或用于皮下(subQ)递送。另一个实例是调配用于直接递送到CNS中的组合物，例如，通过鞘内或玻璃体内注射途径，任选地通过输注到脑(例如，纹状体)中，如通过连续泵输注。
本公开的药物组合物可以足以抑制HTT基因表达的剂量施用。在通常情况下，本公开的RNAi的适宜剂量将在约0.001至约200.0mg每千克接受者体重每天的范围内，通常在约1至50mg每千克体重每天的范围内。
重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的RNAi剂，如每月至每六个月一次。在某些实施方式中，RNAi剂约每季度施用一次(即约每三个月施用一次)至约每年施用两次。
在初始治疗方案(例如，负荷剂量)之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。
在其他实施方式中，单剂量的药物组合物可以是持久的，使得随后的剂量以不超过1个月、2个月、3个月或4个月或更长的间隔施用。在本公开的一些实施方式中，单剂量的本公开的药物组合物每月施用一次。在本公开的其他实施方式中，单剂量的本公开的药物组合物每季度施用一次至每年施用两次。
本领域技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包含但不限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、所述受试者的总体健康或年龄以及存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的组合物对受试者进行的治疗可以包含单次治疗或系列治疗。
小鼠遗传学的进展已经产生了许多小鼠模型，用于研究以增大的神经元细胞内体为特征的APP相关的各种人类疾病，例如将受益于APPHTT表达的减少的HD。此类模型可用于RNAi剂的体内测试，以及用于确定治疗有效剂量。合适的小鼠啮齿动物模型是本领域已知的并且包括例如本文其他地方描述的小鼠模型，例如Cepeda等(ASN Neuro(2010)2(2):e00033)和Pouladi等(Nat Reviews(2013)14:708)。
取决于期望局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域，可以以许多方式施用本公开的药物组合物。施用可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)、肺部的(例如，通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包含通过雾化器)；气管内的、鼻内的、表皮和透皮的、口服的或肠胃外的。肠胃外施用包含静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；皮下(例如，通过植入的装置)；或颅内(例如，通过实质内、鞘内或脑室内施用)。
RNAi剂可以以靶向特定组织的方式递送，如CNS(例如，脑的神经元、神经胶质或血管组织)。
用于局部施用的药物组合物和制剂可以包含透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水性基质、粉末或油性基质、增稠剂等可以是必要的或期望的。带涂层的避孕套、手套等也可以是有用的。合适的局部制剂包含其中本公开特征的RNAi剂与局部递送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些制剂。合适的脂质和脂质体包含中性的(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、负性的(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子的(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开特征的RNAi剂可以被封装在脂质体中或可以与其形成复合物，具体地与阳离子脂质体。可替代地，RNAi剂可以与脂质复合，具体地与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包含但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如，肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂详细描述于US 6,747,014中，所述文献通过引用并入本文。
A.包含膜分子组装体的RNAi剂制剂
用于本公开的组合物和方法的RNAi剂可以被调配成以膜分子组装体(例如，脂质体或胶束)形式递送。如本文所使用的，术语“脂质体”是指由排列在至少一个双层中(例如，一个双层或多个双层)的两亲性脂质组成的囊泡。脂质体包含具有由亲脂性材料形成的膜和水性内部的单层和多层囊泡。水性部分含有RNAi剂组合物。亲脂性材料将水性内部与水性外部分离，所述水性外部通常不包含RNAi剂组合物，尽管在一些实施方式中其可以。脂质体可用于将活性成分转移和递送到作用位点。由于脂质体膜在结构上与生物膜相似，当脂质体应用于组织时，脂质体双层与细胞膜的双层融合。随着脂质体和细胞融合的进展，包含RNAi剂的内部水性内容物被递送到细胞中，其中RNAi剂可以与靶RNA特异性结合并可以介导RNAi。在一些实施例中，脂质体也被特异性靶向，例如将RNAi剂引导到特定的细胞类型。
含有RNAi剂的脂质体可以通过多种方法制备。在一个实施方式中，脂质体的脂质组分溶解在洗涤剂中，从而与脂质组分形成胶束。例如，脂质组分可以是两亲性阳离子脂质或脂质缀合物。洗涤剂可以具有高临界胶束浓度，并且可以是非离子的。示例性洗涤剂包含胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐和肌氨酸月桂酰酯。然后将RNAi剂制剂添加到包含脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与RNAi剂相互作用，并且在RNAi剂周围缩合以形成脂质体。缩合后，例如通过透析去除洗涤剂，以产生RNAi剂的脂质体制剂。
如果需要，可以在缩合反应期间，例如通过控制添加来添加有助于缩合的载体化合物。例如，载体化合物可以是除核酸以外的聚合物(例如，精胺或亚精胺)。也可以调节pH以利于缩合。
在例如WO 96/37194中进一步描述了用于产生稳定的多核苷酸递送媒剂的方法，所述媒剂合并了多核苷酸/阳离子脂质复合物作为递送媒剂的结构组分，所述文献的全部内容通过引用并入本文。脂质体形成也可以包含以下中描述的示例性方法的一个或多个方面：Felgner,P.L.等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；Bangham等，(1965)M.Mol.Biol.23:238；Olson等，(1979)Biochim.Biophys.Acta 557:9；Szoka等，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.75:4194；Mayhew等，(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169；Kim等，(1983)Biochim.Biophys.Acta 728:339；以及Fukunaga等，(1984)Endocrinol.115:757。用于制备用作递送媒剂的合适大小的脂质聚集体的常用技术包含超声处理和冻融加挤压(参见，例如，Mayer等，(1986)Biochim.Biophys.Acta 858:161)。当期望持续较小(50nm至200nm)且相对均匀的聚集体时，可以使用微流体化(Mayhew等，(1984)Biochim.Biophys.Acta 775:169)。这些方法很容易适用于将RNAi剂制剂包装到脂质体中。
脂质体分为两个广泛的类别。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用以形成稳定的复合物。带正电荷的核酸/脂质体复合物与带负电荷的细胞表面结合并且内化于核内体中。由于核内体中的酸性pH，脂质体破裂，从而将其内容物释放到细胞质中(Wang等，(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147:980-985)。
对pH敏感的或带负电荷的脂质体截留核酸而不是与其复合。由于核酸和脂质两者均带有类似的电荷，所以会出现排斥而非复合物形成。然而，一些核酸包埋于这些脂质体的水性内部内。对pH敏感的脂质体已被用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送到培养中的细胞单层。在靶细胞中检测到外源基因的表达(Zhou等，(1992)Journal of ControlledRelease,19:269-274)。
一种主要类型的脂质体组合物包含除天然来源的磷脂酰胆碱之外的磷脂。中性脂质体组合物例如可以由二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物通常由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物由磷脂酰胆碱(PC)形成，例如大豆PC和鸡蛋PC。另一种类型由磷脂或磷脂酰胆碱或胆固醇的混合物形成。
在体外和体内将脂质体引入细胞中的其他方法的实例包含美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；Felgner,(1994)J.Biol.Chem.269:2550；Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90:11307；Nabel,(1992)Human Gene Ther.3:649；Gershon,(1993)Biochem.32:7143；以及Strauss,(1992)EMBOJ.11:417。
还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包含NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和NovasomeTMII(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将环孢菌素A递送到小鼠皮肤的真皮中。结果表明，此类非离子脂质体系统在促进环孢菌素A沉积到皮肤的不同层中是有效的(Hu等，(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6):466)。
脂质体还包含“空间稳定的”脂质体，如本文所使用的，所述术语是指包含一种或多种特殊脂质的脂质体，当掺入脂质体中时，相对于缺乏此类特殊脂质的脂质体，所述脂质体导致提高的循环寿命。空间稳定的脂质体的实例是其中脂质体(A)的囊泡形成脂质部分的一部分包含一种或多种糖脂，如单唾液酸神经节苷脂GM1，或(B)用一种或多种亲水性聚合物衍生的脂质体，如聚乙二醇(PEG)部分。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，但本领域认为，至少对于含有神经节苷脂、鞘磷脂或PEG衍生的脂质的空间稳定的脂质体，这些空间稳定的脂质体的增强的循环半衰期源自减少进入网状内皮系统(RES)的细胞的摄取(Allen等，(1987)FEBS Letters,223；42；Wu等，(1993)Cancer Research,53:3765)。
包含一种或多种糖脂的各种脂质体是本领域已知的。Papahadjopoulos等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507:64)报道了单唾液酸神经节苷脂GM1、硫酸半乳糖脑苷酯和磷脂酰肌醇改善脂质体血液半衰期的能力。这些发现在以下中进行了阐述：Gabizon等人(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85:6949)。Allen等人的美国专利号4,837,028和WO88/04924两者中公开了脂质体，其包括(1)鞘磷脂和(2)神经节苷脂GM1或硫酸半乳糖脑苷酯。美国专利号5,543,152(Webb等)公开了包括鞘磷脂的脂质体。WO 97/13499(Lim等)中公开了包含1,2-sn-二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱的脂质体。
在一个实施方式中，使用阳离子脂质体。阳离子脂质体具有能够与细胞膜融合的优点。非阳离子脂质体尽管不能与质膜有效融合，但在体内被巨噬细胞吸收，并且可以用于向巨噬细胞递送RNAi剂。
脂质体的另外的优点包含：从天然磷脂中获得的脂质体具有生物相容性且可生物降解；脂质体可以掺入多种水溶性和脂溶性药物；脂质体可以保护其内部区室中封装的RNAi剂免受代谢和降解(Rosoff,"Pharmaceutical Dosage Forms,"Lieberman,Rieger和Banker(编辑)，1988，第1卷，p.245)。制备脂质体制剂的重要考虑因素是脂质表面电荷、囊泡大小和脂质体的水性体积。
带正电的合成阳离子脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，所述小脂质体与核酸自发相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致RNAi剂的递送(参见例如，Felgner,P.L.等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8:7413-7417，以及美国专利号4,897,355中关于DOTMA以及其与DNA的使用的描述)。
DOTMA类似物，1,2-双(油酰基氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(DOTAP)可以与磷脂组合使用，以形成DNA络合囊泡。LipofectinTM(Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)是一种用于将高阴离子核酸递送到活组织培养细胞中的有效剂，所述细胞包含带正电荷的DOTMA脂质体，所述脂质体与带负电荷的多核苷酸自发相互作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物上的净电荷也是正的。以这种方式制备的带正电荷的复合物自发地与带负电荷的细胞表面连接，与质膜融合，并且有效地将功能性核酸递送到例如组织培养细胞中。另一种可商购获得的阳离子脂质，1,2-双(油酰基氧基)-3,3-(三甲基氨)丙烷(“DOTAP”)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)与DOTMA的不同之处在于，油酰基部分通过酯而不是醚键连接。
其他报道的阳离子脂质化合物包含与多种部分缀合的那些，包含例如与两种类型的脂质之一缀合的羧精胺，并且包含如5-羧基精胺基甘氨酸二十八烷基酰胺(“DOGS”)(TransfectamTM,Promega,Madison,Wisconsin)和二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧基精酰基-酰胺(“DPPES”)等化合物(参见，例如，美国专利号5,171,678)。
另一种阳离子脂质缀合物包含脂质与胆固醇的衍生化(“DC-Chol”)，其已与DOPE组合调配成脂质体(参见，Gao,X.和Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179:280)。据报道，通过将聚赖氨酸与DOPE缀合制备的脂聚赖氨酸在血清存在下对转染有效(Zhou,X.等，(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065:8)。对于某些细胞系，这些含有缀合的阳离子脂质的脂质体据说表现出比所述含有DOTMA的组合物更低的毒性并提供更有效的转染。其他可商购获得的阳离子脂质产品包含DMRIE和DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)和Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。WO 98/39359和WO 96/37194中描述了适用于递送寡核苷酸的其他阳离子脂质。
脂质体制剂特别适合局部施用，其中脂质体呈现出超过其他制剂的若干个优点。此类优点包含减少了与施用的药物的高全身吸收相关的副作用，增加了施用的药物在期望的靶标的积聚，以及将RNAi剂施用到皮肤中的能力。在一些实施例中，脂质体用于将RNAi剂递送到表皮细胞，并且还用于增强RNAi剂向真皮组织中的渗透，例如到皮肤中。例如，脂质体可以局部应用。已经记录了将调配成脂质体的药物局部递送到皮肤(参见，例如，Weiner等，(1992)Journal of Drug Targeting,vol.2,405-410和du Plessis等，(1992)Antiviral Research,18:259-265；Mannino,R.J.和Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniques 6:682-690；Itani,T.等，(1987)Gene 56:267-276；Nicolau,C.等，(1987)Meth.Enzymol.149:157-176；Straubinger,R.M.和Papahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101:512-527；Wang,C.Y.和Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7851-7855)。
还对非离子脂质体系统进行了检查，以确定其在向皮肤递送药物中的效用，特别是包含非离子表面活性剂和胆固醇的系统。使用包含Novasome I(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)和Novasome II(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂基醚)的非离子脂质体制剂将药物递送到小鼠皮肤的真皮中。具有RNAi剂的此类制剂可用于治疗皮肤病学病症。
可以将包含RNAi剂的脂质体制成高度可变形的。这种变形能力可以使脂质体穿透小于脂质体平均半径的孔。例如，传递体是一种可变形脂质体。转移体可以通过将表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)添加到标准脂质体组合物中来制备。包括RNAi剂的传递体可以例如通过感染皮下递送，以便将RNAi剂递送至皮肤中的角质形成细胞。为了穿过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在合适的透皮梯度的影响下穿过一系列直径小于50nm的细孔。此外，由于脂质特性，这些转移体可以自我优化(适应毛孔的形状，例如皮肤中的毛孔的形状)、自我修复，并且经常可以达到目标而不破裂，并且通常可以自我加载。
适用于本公开的其他制剂在以下中进行了描述：于2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；于2008年1月2日提交的61/018,611；于2008年3月26日提交的61/039,748；于2008年4月22日提交的61/047,087和于2008年5月8日提交的61/051,528。于2007年10月3日提交的PCT申请号PCT/US2007/080331也描述了适用于本公开的制剂。
传递体，另一种类型的脂质体，是高度可变形的脂质聚集体，其是药物递送载体的有吸引力的候选者。传递体可以被描述为脂滴，其高度可变形，以至于它们能够轻松地穿透比脂滴小的孔。传递体能够适应其使用环境，例如，它们能够自我优化(适应皮肤毛孔的形状)、自我修复、经常达到目标而不破碎，并且经常自我加载。为了制备传递体，可以将表面边缘激活剂，通常是表面活性剂，添加到标准脂质体组合物中。传递体已用于将血清白蛋白递送至皮肤。转体介导的血清白蛋白递送已被证明与皮下注射含有血清白蛋白的溶液一样有效。
表面活性剂广泛应用于如本文所描述的制剂等制剂中，尤其是乳液(包含微乳液)和脂质体。对许多不同类型的表面活性剂(天然和合成两者)的特性进行分类和排序的最常见方式是通过使用亲水/亲脂平衡(HLB)。亲水基团(也称为“头”)的性质为制剂中使用的不同表面活性剂的分类提供了最有用的方法(Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果表面活性剂分子未离子化，则将其归类为非离子表面活性剂。非离子表面活性剂在药物和化妆品中有着广泛的应用，并且可用于多种pH值。通常，根据其结构，其HLB值的范围为2至约18。非离子表面活性剂包含非离子酯，如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脱水山梨醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。非离子烷醇酰胺和醚，如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物也包含在此类别中。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别中最受欢迎的成员。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有负电荷，则表面活性剂被分类为阴离子。阴离子表面活性剂包含羧酸酯，如皂类、酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯，如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，如烷基苯磺酸酯、酰基异硫辛酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯，以及磷酸酯。阴离子表面活性剂类别中最重要的成员是烷基硫酸酯和皂类。
如果表面活性剂分子在溶解或分散在水中时带有正电荷，则表面活性剂被分类为阳离子。阳离子表面活性剂包含季铵盐和乙氧基化胺。季铵盐是此类别化合物中使用最多的成员。
如果表面活性剂分子具有携带正电荷或负电荷的能力，则表面活性剂被归类为两性。两性表面活性剂包含丙烯酸衍生物、经置换的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
对表面活性剂在药物产品、制剂和乳液中的应用进行了综述(Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用于本公开的方法中的RNAi剂也可以作为胶束制剂提供。“胶束”在本文中被定义为特定类型的分子组装体，其中两亲性分子以球形结构排列，使得分子的所有疏水部分向内，使亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水的，则存在相反的排列。
适合通过透皮膜递送的混合胶束制剂可以通过混合siRNA组合物的水溶液、碱金属C8至C22烷基硫酸酯与胶束形成化合物来制备。示例性胶束形成化合物包含卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆酸基甘氨酸以及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚以及其类似物、聚多卡醇烷基醚以及其类似物、鹅脱氧胆酸酯、脱氧胆酸酯以及其混合物。胶束形成化合物可以在添加碱金属烷基硫酸酯的同时或之后添加。基本上任何种类的成分混合都会形成混合的胶束，但为了提供更小大小的胶束而剧烈混合。
在一种方法中，制备含有siRNA组合物和至少碱金属烷基硫酸酯的第一胶束组合物。然后将第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成混合的胶束组合物。在另一种方法中，通过将siRNA组合物、碱金属烷基硫酸酯和至少一种胶束形成化合物混合，然后在剧烈混合的情况下添加剩余的胶束形成化合物来制备胶束组合物。
苯酚或间甲酚可以添加到混合的胶束组合物中，以稳定制剂并防止细菌生长。可替代地，苯酚或间甲酚可以与胶束形成成分一起添加。在形成混合的胶束组合物之后，也可以添加等渗剂，如甘油。
为了将胶束制剂作为喷雾递送，可以将所述制剂放入气溶胶分配器中，并且在分配器中装入推进剂。处于压力下的推进剂在分配器中呈液体形式。调节成分的比率，使水相和推进剂相成为一个相，即有一个相。如果有两个相，则有必要在分配一部分内容物之前摇动分配器，例如通过计量阀。分配的剂量的剂以精细喷雾的形式从计量阀推进。
推进剂可以包含含氢氯氟烃、含氢氟碳化合物、二甲醚和二乙醚。在某些实施方式中，可以使用HFA134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
基本成分的具体浓度可以通过相对简单的实验来确定。为了通过口腔吸收，通常期望通过注射或通过胃肠道施用增加剂量，例如至少两倍或三倍。
B.脂质颗粒
RNAi剂，例如，本公开中的dsRNA可以完全封装在脂质制剂中，例如，LNP或其他核酸脂质颗粒中。
如本文所使用的，术语“LNP”是指稳定的核酸-脂质颗粒。LNP通常含有阳离子脂质、非阳离子脂质和防止颗粒聚集的脂质(例如，PEG-脂质缀合物)。LNP对于全身应用非常有用，因为其在静脉内(i.v.)注射后表现出延长的循环寿命并在远隔位点(例如，与施用位点物理分离的位点)累积。LNP包含“pSPLP”，其包含WO00/03683中所述的封装的缩合剂-核酸复合物。本公开的颗粒的平均直径通常为约50nm至约150nm、更通常地为约60nm至约130nm、更通常地为约70nm至约110nm、最通常地为约70nm至约90nm，并且基本上无毒。另外，核酸当存在于本公开的核酸-脂质颗粒中时在水溶液中抵抗核酸酶的降解。核酸-脂质颗粒以及其制备方法在例如以下中公开：美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国专利公开号2010/0324120和WO 96/40964。
在一个实施方式中，脂质与药物的比率(质量/质量比)(例如，脂质与dsRNA的比率)将在约1:1至约50:1、约1:1至约25:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1或约6:1至约9:1的范围内。上述范围中间的范围也被认为是本公开的一部分。
本领域已经描述了用于递送RNAi剂的某些特定LNP制剂，包含例如“LNP01”制剂，如例如在WO 2008/042973中描述的，所述文献特此通过引用并入。
在下表中鉴定了其他示例性脂质-dsRNA制剂。
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DSPC：二硬脂酰磷脂酰胆碱
DPPC：二棕榈酰磷脂酰胆碱
PEG-DMG：PEG-二肉桂酰基甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(PEG，平均分子量为2000)
PEG-DSG：PEG-二苯乙烯甘油(C18-PEG，或PEG-C18)(PEG，平均分子量为2000)
PEG-cDMA：PEG-氨基甲酰基-1,2-二肉豆蔻酰基氧基丙胺(PEG，平均分子量为2000)
SNALP(l,2-二亚油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA))，包含以上各项的制剂描述于WO 2009/127060中，所述文献特此通过引用并入。
包含XTC的制剂在WO 2010/088537中进行了描述，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。
例如，在美国专利公开号2010/0324120中描述了包含MC3的制剂，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。
包含ALNY-100的制剂在WO 2010/054406中进行了描述，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。
包含C12-200的制剂在WO 2010/129709中进行了描述，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。
用于口服施用的组合物和制剂包含粉末或颗粒、微粒、纳米颗粒、在水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、囊剂、片剂或微型片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。在一些实施方式中，口服制剂是其中本公开特征的dsRNA与一种或多种增渗剂表面活性剂和螯合剂一起施用的那些制剂。合适的表面活性剂包含脂肪酸或其酯或盐、胆汁酸或其盐。合适的胆汁酸/盐包含鹅脱氧胆酸(CDCA)和熊脱氧鹅脱氧胆酸(UDCA)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡胆酸、甘胆酸、甘脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺基-24,25-二氢-富西酸钠和甘二氢富西酸钠。合适的脂肪酸包含花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐(例如，钠)。在一些实施例中，使用增渗剂的组合，例如脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。示例性组合是月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的增渗剂包含聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡醚。本公开特征的dsRNA可以口服、以包含喷雾干燥颗粒的颗粒形式递送，或复合以形成微型或纳米颗粒。dsRNA络合剂包含聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚烷基丙烯酸酯、聚氧乙烷、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生的聚胺、支链淀粉、纤维素和淀粉。合适的络合剂包含壳聚糖、N-三甲基壳聚糖、聚-L-赖氨酸、聚组氨酸、聚鸟氨酸、聚精蛋白、鱼精蛋白、聚乙烯吡啶、聚硫二乙基氨基甲基乙烯P(TDAE)、聚氨基苯乙烯(例如，对氨基)、聚(甲基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异丁基氰基丙烯酸酯)、聚(异己基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-己基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酰胺、DEAE-白蛋白和DEAE-右旋糖酐、聚甲基丙烯酸酯、聚己基丙烯酸酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、藻酸酯和聚乙二醇(PEG)。dsRNA的口服制剂以及其制备在以下中详细描述：美国专利6,887,906、U.S.2003/0027780和美国专利号6,747,014，所述文献中的每一个通过引用并入本文。
用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内施用的组合物和制剂可以包含无菌水溶液，所述无菌水溶液也可以含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂，如但不限于增渗剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。
本公开的药物组合物包含但不限于溶液、乳液和含有脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包含但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。特别优选的是当治疗HTT相关的疾病或病症时制剂靶向脑。
本公开的药物制剂可以方便地以单位剂型存在，可以根据制药工业中众所周知的常规技术制备。此类技术包含使活性成分与药物载体或赋形剂缔合的步骤。一般而言，通过使活性成分与液体载体或精细固体载体或两者均匀充分地缔合并且然后在必要时使产物成形来制备所述制剂。
本公开的组合物可以调配成许多可能的剂型中的任一种，如但不限于片剂、胶囊、凝胶胶囊、液体糖浆、软凝胶、栓剂和灌肠剂。本公开的组合物也可以被调配成在水性、非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂。
其他制剂
乳剂
本公开的组合物可以制备并调配成乳液。乳液通常是一种液体以液滴的形式分散在另一种液体中的非均相系统，通常直径超过0.1μm(参见，例如，Ansel's PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199；Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.245；Block PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第2卷，p.335；Higuchi等，Remington's Pharmaceutical Sciences,MackPublishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是两相系统，包含两个相互紧密混合和分散的不混溶液相。通常，乳液可以是油包水(w/w)或水包油(w/w)类型。当水相被精细地分成微小的液滴并分散到本体油相中时，所得到的组合物被称为油包水(w/o)乳液。可替代地，当油相被精细地分成微小的液滴并分散到本体水相中时，所得到的组合物被称为水包油(o/w)乳液。除了分散相和活性药物之外，乳液还可以含有另外的组分，所述活性药物可以以溶液的形式存在于水相、油相中或其本身作为单独的相。药物赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是包含多于两相的多种乳液，例如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。此类复杂的制剂通常提供简单的二元乳液所没有的某些优点。其中o/w乳液的单个油滴包围小水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。类似地，包围在油状连续相中稳定的水滴中的油滴系统提供o/w/o乳液。
乳液的特征在于几乎没有或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散或不连续相很好地分散到外部或连续相中，并且通过乳化剂或制剂的粘度维持这种形式。乳液的任何一个相都可以是半固体或固体，如同乳液型软膏基质和乳膏的情况一样。稳定乳液的其他方法需要使用可以并入乳液任一相中的乳化剂。乳化剂可以大致分为四类：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收碱和精细分散的固体(参见，例如，Ansel's PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Idson,PharmaceuticalDosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编辑)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199)。
已发现合成表面活性剂(也称为表面活性剂)在乳液制剂中具有广泛的适用性，并且已在文献中进行了综述(参见，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编辑)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.285；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编辑)，Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988，第1卷，p.199)。表面活性剂通常是两亲性的，并且包含亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性的比率被称为亲水/亲脂平衡(HLB)，并且是在制剂的制备中对表面活性剂进行分类和选择的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的类别：非离子、阴离子、阳离子和两性(参见，例如，Ansel'sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY Rieger,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编辑)1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第8版，p.285)。
乳液制剂中使用的天然存在的乳化剂包含羊毛脂、蜂蜡、磷脂、卵磷脂和阿拉伯胶。吸收碱具有亲水特性，使得其可以吸收水形成w/o乳液，但仍保持其半固体稠度，如无水羊毛脂和亲水性矿脂。精细分散的固体也被用作良好的乳化剂，特别是与表面活性剂和粘性制剂组合使用。这些包含极性无机固体，如重金属氢氧化物，非溶胀粘土，如膨润土、凹凸棒石、锂蒙脱石、高岭土、蒙脱石、胶体硅酸铝和胶体硅酸镁铝，颜料和非极性固体，如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液制剂中还包含多种非乳化材料，并且有助于乳液的特性。这些包含脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酸酯、保湿剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.335；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199)。
亲水胶体或水胶体包含天然存在的树胶和合成聚合物，如多糖(例如，阿拉伯胶、琼脂、藻酸、角叉菜胶、瓜尔豆胶、卡拉亚胶和黄芪胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)以及合成聚合物(例如，碳聚合物、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些在水中分散或膨胀以形成胶体溶液，所述胶体溶液通过在分散相液滴周围形成强界面膜并通过增加外部相的粘度来稳定乳液。
由于乳液通常含有许多成分，如碳水化合物、蛋白质、甾醇和磷脂，所述成分可以很容易地支持微生物的生长，因此这些制剂通常掺入防腐剂。乳液制剂中包含的常用的防腐剂包含尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对羟基苯甲酸酯和硼酸。抗氧化剂通常也被添加到乳液制剂中，以防止制剂变质。所使用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，如生育酚、没食子酸烷基酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯，或还原剂，如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，以及抗氧化剂增效剂，如柠檬酸、酒石酸和卵磷脂。
乳液制剂通过皮肤、口服和肠胃外途径的应用以及其制造方法已经在文献中进行了综述(参见，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)New York,NY；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199)。用于口服递送的乳液制剂由于易于调配以及从吸收和生物利用度的角度来看的功效而被非常广泛地使用(参见，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,MarcelDekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.245；Idson,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.199)。矿物油基泻药、油溶性维生素和高脂肪营养制剂通常是作为o/w乳液口服施用的材料。
ii.微乳液
在本公开的一个实施方式中，RNAi剂和核酸的组合物被调配为微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一的光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编辑)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.245)。通常，微乳液是通过首先将油分散在表面活性剂水溶液中，并且然后添加足量的第四组分(通常是中链长醇)以形成透明系统而制备的系统。因此，微乳液也被描述为两种不混溶液体的热力学稳定、各向同性透明的分散体，所述两种不混溶液体通过表面活性分子的界面膜来稳定(Leung和Shah：ControlledRelease of Drugs:Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.编著，1989,VCHPublishers,New York，第185-215页)。微乳液通常通过三种至五种组分的组合制备，所述组分包含油、水、表面活性剂、助表面活性剂和电解质。微乳液是油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所用的油和表面活性剂的特性，以及表面活性剂分子的极性头和烃尾的结构和几何堆积(Schott,Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack PublishingCo.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相图的现象学方法已经得到了广泛的研究，并且为本领域技术人员提供了关于如何调配微乳液的全面知识(参见，例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.和Ansel HC.,2004,LippincottWilliams&Wilkins(第8版)，New York,NY；Rosoff,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.245；Block,Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger和Banker(编著)，1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.，第1卷，p.335)。与传统乳液相比，微乳液提供了将水不溶性药物溶解在自发形成的热力学稳定液滴制剂中的优点。
用于制备微乳液的表面活性剂包含但不限于离子表面活性剂、非离子表面活化剂、Brij 96、聚氧乙烯油醚、聚甘油脂肪酸酯、单月桂酸四甘油酯(ML310)、单油酸四甘油酯(MO310)、单油酸六甘油酯(PO310)、五油酸六甘油酯(PO500)、单癸酸十甘油酯(MCA750)、单油酸十甘油酯(MO750)、连续油酸十甘油酯(SO750)、十油酸十甘油酯(DAO750)，单独或与助表面活性剂组合。助表面活性剂，通常是短链醇，如乙醇、1-丙醇和1-丁醇，通过渗透到表面活性剂膜中，并且由于表面活性剂分子之间产生的空隙空间而产生无序膜，从而增加界面流动性。然而，可以在不使用助表面活性剂的情况下制备微乳液，并且本领域已知无醇自乳化微乳液系统。水相通常可以是但不限于水、药物的水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇和乙二醇的衍生物。油相可以包含但不限于材料，如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中链(C8-C12)单、二和三甘油酯、聚氧乙烯化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、饱和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油和硅酮油。
从药物增溶和增强药物吸收的角度来看，微乳液尤其引人关注。已经提出了基于脂质的微乳液(o/w和w/o两者)来提高包含肽在内的药物的口服生物利用度(参见，例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等，Pharmaceutical Research,1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液具有改善药物增溶、保护药物免受酶水解、由于表面活性剂诱导的膜流动性和渗透性的改变而可能增强药物吸收、易于制备、相对于固体剂型易于口服施用、提高临床效力以及降低的毒性等优点(参见，例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides等，PharmaceuticalResearch,1994,11,1385；Ho等，J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。当微乳液的组分在环境温度下聚集在一起时，通常可以自发形成微乳液。这在调配不耐热药物、肽或RNAi剂时尤其有利。微乳液在化妆品和药物应用两者中对活性组分的透皮递送也很有效。预期本公开的微乳液组合物和制剂将促进RNAi剂和核酸从胃肠道的增加的全身吸收，以及改善RNAi剂和核酸的局部细胞摄取。
本公开的微乳液还可以含有另外的组分和添加剂，如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol和增渗剂，以改善制剂的特性并增强本公开的RNAi剂和核酸的吸收。本公开的微乳液中使用的增渗剂可以分类为五大类之一——表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems,1991,p.92)。这些类别中的每一个都已经在上文进行了讨论。
iii.微颗粒
本公开的RNAi剂可以掺入到颗粒中，例如微颗粒中。微颗粒可以通过喷雾干燥生产，但也可以通过其它方法生产，包含冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。
v.增渗剂
在一个实施方式中，本公开使用各种增渗剂来实现核酸，特别是RNAi剂到动物皮肤的有效递送。大多数药物以电离和非电离两种形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲脂性药物容易穿过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理待穿过的膜，即使是非亲脂性药物也可以穿过细胞膜。除了有助于非亲脂性药物穿过细胞膜的扩散外，增渗剂还可以增强亲脂性药物的渗透性。
增渗剂可以分为五大类之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems,1991,p.92)。下面更详细地描述上述每一类增渗剂。
表面活性剂(或“表面活性剂”)是化学实体，当其溶解在水溶液中时，会降低溶液的表面张力或水溶液与另一种液体之间的界面张力，从而增强RNAi剂通过粘膜的吸收。除了胆汁盐和脂肪酸之外，这些增渗剂还包含例如，十二烷基硫酸钠、聚氧乙烯-9-十二烷基醚和聚氧乙烯-20-鲸蜡醚(参见，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；以及全氟化学乳液，如FC-43。Takahashi等，J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252。
作为增渗剂的各种脂肪酸以及其衍生物包含例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸、三癸酸、单油酸甘油酯(1-单油酰基-rac-甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、花生四烯酸、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚烷-2-酮，酰基肉碱、酰基胆碱、其C1-20烷基酯(例如，甲基、异丙基和叔丁基)以及其单甘油酯和二甘油酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见，例如，Touitou,E.等，Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；ElHariri等，J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
胆汁的生理作用包含促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,NewYork,NY,2002；Brunton，第38章，Goodman&Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics，第9版，Hardman等编著，McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。各种天然胆汁盐以及其合成衍生物作为增渗剂。因此，术语“胆汁盐”包含胆汁的任何天然存在的组分以及其任何合成衍生物。合适的胆汁盐包含例如，胆酸(或其药学上可接受的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡胆酸(葡胆酸钠)、甘胆酸(甘胆酸钠)、甘脱氧胆酸(甘脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(UDCA)、牛磺基-24,25-二氢-富西酸钠(STDHF)、甘二氢富西酸钠和聚氧乙烯-9-十二烷基醚(POE)(参见，例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drugdelivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92页，Swinyard，第39章，Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版，Gennaro编著，Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990，第782-783页；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug CarrierSystems,1990,7,1-33；Yamamoto等，J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita等，J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
如与本公开结合使用的螯合剂可以定义为通过与溶液形成复合物来从溶液中去除金属离子的化合物，其结果是增强了RNAi剂通过粘膜的吸收。关于其本公开中作为增渗剂的用途，螯合剂还具有作为DNase抑制剂的另外的优点，因为大多数表征的DNA核酸酶需要二价金属离子进行催化，并且因此被螯合剂抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。合适的螯合剂包含但不限于乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、柠檬酸、水杨酸酯(例如，水杨酸钠、5-甲氧基水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原蛋白的N-酰基衍生物、β-二酮(烯胺)的月桂醇聚醚-9和N-氨基酰基衍生物(参见，例如，Katdare,A.等，Excipient developmentfor pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92页；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur等，J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文所使用的，非螯合非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或表面活性剂表现出不显著的活性，但仍然增强RNAi剂通过消化道粘膜的吸收的化合物(参见，例如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。此类增渗剂包含例如，不饱和环脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(Lee等，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991，第92页)；和非甾体抗炎剂，如双氯芬酸钠、吲哚美辛和苯基丁氮酮(Yamashita等，J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
在细胞水平上增强RNAi剂的摄取的剂也可以添加到本公开的药物和其他组合物中。例如，阳离子脂质，如lipofectin(Junichi等，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，如聚赖氨酸(WO 97/30731)也已知可增强dsRNA的细胞摄取。
其他剂可以用于增强施用的核酸的渗透，包含二醇，如乙二醇和丙二醇，吡咯，如2-吡咯、氮酮和萜烯，如柠檬烯和薄荷酮。
vi.赋形剂
与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他用于将一种或多种核酸递送到动物的药理学惰性媒剂。赋形剂可以是液体的或固体的并且在考虑计划的施用方式的情况下被选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其他组分组合时提供期望的体积、一致性等。典型的药物载体包含但不限于结合剂(例如，预凝胶化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素等)；填充剂(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯、磷酸氢钙等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、硅石、胶体二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠等)；崩解剂(例如，淀粉、羟乙酸淀粉钠等)；以及润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠等)。
适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用于调配本公开的组合物。适合的药学上可接受的载体包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用于局部施用核酸的调配物可以包含无菌和非无菌水溶液、普通溶剂(如醇)中的非水溶液或核酸在液体或固体油基中的溶液。所述溶液还可以含有缓冲液、稀释剂和其他合适的添加剂。可以使用适于非肠胃外施用的不与核酸发生有害反应的药学上可接受的有机或无机赋形剂。
适合的药学上可接受的赋形剂包含但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他组分
本公开的组合物可以另外含有在药物组合物中常规存在的其它附属组分，处于其现有技术确定的使用水平。因此，例如，组合物可以含有另外的相容性药物活性材料，例如，止痒药、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有可用于物理调配本公开的组合物的各种剂型的另外的材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、不透明剂、增稠剂和稳定剂。然而，这种材料，在添加时，不应该不适当地干扰本公开的组合物的成分的生物活性。调配物可以进行灭菌，并且如果期望的话，可以与不与所述调配物的核酸有害地相互作用的助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色剂、调味剂或芳香物质等混合。
含水悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质包含例如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。悬浮液也可以含有稳定剂。
在一些实施方式中，本公开特征的药物组合物包括(a)一种或多种RNAi剂和(b)一种或多种通过非RNAi机制发挥作用并且可用于治疗HTT相关病症的药剂。此类剂的实例包括但不限于单胺抑制剂、利血平、抗惊厥药、抗精神病药和抗抑郁药。
此类化合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养或实验动物中的标准制药程序来确定，例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。在毒性作用和治疗作用之间的剂量比为治疗指数，并且其可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可以用于调配用于在人中使用的剂量范围。本公开中本文特征的组合物的剂量通常在包含ED50的循环浓度范围内，几乎没有或没有毒性。根据所采用的剂型和所利用的施用途径，剂量可以在此范围内变化。对于本公开特征的方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初根据细胞培养测定估计。可以在动物模型中调配剂量，以达到化合物的循环血浆浓度范围，或在适当的情况下，达到靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现多肽浓度的降低)，所述范围包含细胞培养中确定的IC50(即，达到症状的一半最大抑制的测试化合物的浓度)。可以使用此类信息来更精确地确定人体中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱法来测量血浆中的水平。
除了其施用之外，如上所述，本公开中特征的RNAi剂可以与其他已知剂组合施用，所述其他已知剂在治疗由核苷酸重复表达介导的病理过程中有效。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知或本文所描述的功效的标准测量观察到的结果来调节RNAi剂施用的量和时间。
VII.试剂盒
在某些方面中，本公开提供了试剂盒，所述试剂盒包含含有siRNA化合物(例如，双链siRNA化合物或ssiRNA化合物(例如，前体，例如可以加工成ssiRNA化合物的较大siRNA化合物，或编码siRNA化合物的DNA，例如双链siRNA化合物或ssiRNA化合物，或其前体))的药物制剂的合适容器。
此类试剂盒包括一种或多种dsRNA剂和使用说明，例如施用预防或治疗有效量的dsRNA剂的说明。dsRNA剂可以在小瓶或预填充注射器中。试剂盒可以任选地进一步包含用于施用dsRNA剂的工具(例如，注射装置，诸如预填充注射器)，或用于测量C3的抑制的工具(例如，用于测量HTT mRNA、HTT蛋白和/或HTT活性的抑制的装置)。此类用于测量HTT的抑制的装置可以包括用于从受试者获得样品的装置，例如CSF和/或血浆样品。本发明的试剂盒还可任选地包含用于确定治疗有效量或预防有效量的装置。
在某些实施方式中，药物制剂的各个组分可以提供在一个容器中，例如，小瓶或预装注射器。可替代地，可能期望在两个或更多个容器中单独提供药物制剂的组分，例如，一个容器用于siRNA化合物制剂，并且至少另一个用于载体化合物。试剂盒可以包装在许多不同的配置中，如单个盒子中的一个或多个容器。可以将不同的组分组合，例如，根据随试剂盒提供的说明书。这些组分可以根据本文所描述的方法进行组合，例如，以制备和施用药物组合物。试剂盒还可以包含递送装置。
VI.用于抑制APP表达的方法
本公开还提供了抑制细胞中HTT基因表达的方法。该方法包括使细胞与有效抑制细胞中HTT表达的量的RNAi剂(例如双链RNAi剂)或包含本发明的dsRNA剂的药物组合物接触，从而抑制细胞中HTT的表达。在本公开的某些实施方式中，HTT优先在CNS(例如，脑)细胞中被抑制。
使细胞与RNAi剂(例如，双链RNAi剂)接触可以在体外或在体内进行。使细胞在体内与RNAi剂接触包括使受试者(例如，人受试者)内的细胞或细胞群与RNAi剂接触。还可以是接触细胞的体外和体内方法的组合。
接触细胞可以是直接或间接的，如上文所讨论的。此外，接触细胞可以通过靶向配体实现，包括本文所述的或本领域公知的任何配体。在一些实施方式中，配体是碳水化合物部分，例如，GalNAc配体或将RNAi剂向目标位点引导的任何其他配体。
如本文所使用的，术语“抑制(inhibiting)”可以与“减少”、“沉默”、“下调”、“抑制(suppressing)”和其他类似术语互换使用，并且包含任何水平的抑制。在某些实施方式中，可以在细胞培养条件下评估抑制水平，例如，对于本公开的RNAi剂，例如，其中细胞培养中的细胞通过LipofectamineTM介导的转染以10nM或更低、1nM或更低等的细胞附近的浓度转染。给定RNAi剂的敲低可以通过比较细胞培养中预处理的水平与细胞培养中后处理的水平来确定，任选地还可以与用乱序或其他形式的对照RNAi剂平行处理的细胞进行比较。细胞培养中的敲低，例如任选地50％或更多可以由此被鉴定为已经发生的“抑制(inhibiting)”或“减少”、“下调”或“抑制(suppressing)”等的指示。明确设想，在本领域所描述的适当控制的条件下，也可以在本公开的RNAi剂的体内系统中评估靶向的mRNA或编码的蛋白水平(以及因此由本公开的RNAi剂引起的“抑制”程度等)。
如本文所使用的，短语“抑制HTT基因表达”或“抑制HTT表达”包括抑制编码HTT蛋白的任何HTT基因(诸如，例如，小鼠HTT基因、大鼠HTT基因、猴HTT基因或人HTT基因)以及HTT基因的变体或突变体的表达。因此，在基因操纵的细胞、细胞群或生物体的背景下，HTT基因可以是野生型HTT基因、突变体HTT基因或转基因HTT基因。
HTT基因的表达可以基于与HTT基因表达相关的任何变量的水平来评估，例如HTTmRNA水平或HTT蛋白水平，或者例如HTT扩增蛋白的水平。
抑制可以通过这些变量中的一个或多个的绝对水平或与对照水平相比的相对水平的降低来评估。对照水平可以是本领域中使用的任意类型的对照水平，例如给药前的基线水平或从未治疗或经对照(例如，仅含缓冲剂的对照或非活性)治疗的类似受试者、细胞或样品测得的水平。
在本公开的方法的一些实施方式中，HTT基因的表达抑制至少20％、30％、40％、优选地至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％或至低于测定的检测水平。在某些实施方式中，该测定包括对HTT的表达的临床相关抑制，例如，如通过在用剂治疗受试者以降低HTT的表达后的临床相关结局所表明的。
HTT基因的表达的抑制可以通过第一细胞或细胞组(例如，此类细胞可以存在于源自受试者的样品中)表达的mRNA的量的减少来表现，在所述细胞或细胞组中，HTT的基因被转录并且已经被处理(例如，通过使一个或多个细胞与本公开的RNAi剂接触，或通过向存在或曾经存在所述细胞的受试者施用本公开的RNAi剂)从而与基本上与第一细胞或细胞组相同但尚未如此处理的第二细胞或细胞组(未用RNAi剂处理或未用靶向所关注的基因的RNAi剂处理的对照细胞)相比，HTT基因的表达受到抑制。抑制程度可以用以下方式表示：
在其他实施方式中，HTT基因的表达的抑制可以根据与HTT基因表达功能性相关的参数的降低来评估，所述参数例如HTT蛋白表达。HTT基因沉默可以在任何表达HTT的细胞中确定，无论是内源性的还是来自表达构建体的异源性的，并且通过本领域已知的任何测定。
在其他实施方式中，HTT基因的表达的抑制可以根据与HTT基因表达功能性相关的参数的降低来评估，所述参数例如APP蛋白表达。HTT基因沉默可以在任何表达HTT的细胞中确定，无论是内源性的还是来自表达构建体的异源性的，并且通过本领域已知的任何测定。
HTT蛋白的表达的抑制可以通过细胞或一组细胞(例如，源自受试者的样品中表达的蛋白质水平)表达的HTT蛋白水平的降低来表现。如上文所解释的，为了评估mRNA抑制，处理的细胞或细胞组中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表达为对照细胞或细胞组中蛋白质水平的百分比。
可以用于评估HTT基因的表达抑制的对照细胞或细胞组包含尚未与本公开的RNAi剂接触的细胞或细胞组。例如，在用RNAi剂治疗受试者之前，对照细胞或细胞组可以源自个体受试者(例如，人或动物受试者)。
细胞或细胞组表达的HTT mRNA的水平可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定。在一个实施方式中，通过检测转录的多核苷酸或其部分，例如HTT基因的mRNA来确定样品中HTT的表达水平。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包含例如使用酸酚/异硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA制备试剂盒或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland)。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核运行测定、RT-PCR、RNase保护测定、northern印迹、原位杂交和微阵列分析。循环HTT mRNA可以使用WO2012/177906中描述的方法来检测，所述文献的全部内容特此通过引用并入本文。
在一些实施方式中，使用核酸探针确定HTT的表达水平。如本文所使用的，术语“探针”是指能够与特定HTT核酸或蛋白质或其片段选择性地结合的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或源自适当的生物制剂。探针可以专门设计成被标记。可以用作探针的分子的实例包含但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可以用于杂交或扩增测定，包括但不限于Southern分析或northern分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。一种用于确定mRNA水平的方法涉及将分离的mRNA与可以与HTT mRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方式中，mRNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在替代性实施方式中，探针固定在固体表面上，并且mRNA与探针接触，例如，在基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地将已知的mRNA检测方法用于确定HTT mRNA的水平。
用于确定样品中HTT的表达水平的替代性方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(Mullis,1987,美国专利号4,683,202中所述的实验实施方式)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自持序列复制(Guatelli等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等，(1988)Bio/Technology6:1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利号5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员众所周知的技术检测扩增的分子。如果此类核酸分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子特别有用。在本公开的特定方面，HTT的表达的水平通过定量荧光RT-PCR(即，TaqManTM系统)、通过荧光素酶测定或通过用于测量HTT表达或mRNA水平的其他领域公认的方法来确定。
HTT mRNA的表达水平可以使用膜印迹(如用于杂交分析，如northern、Southern、斑点等)或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或任何包括结合核酸的固相载体)来监测。参见美国专利号5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，所述美国专利通过引用并入本文。HTT表达水平的确定也可以包括在溶液中使用核酸探针。
在一些实施方式中，使用支链DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)来评估mRNA表达的水平。此PCR方法的使用在本文给出的实例中进行了描述和例示。此类方法也可以用于检测HTT核酸。
HTT蛋白表达水平可以使用本领域已知的任何用于测量蛋白质水平的方法来确定。此类方法包含，例如，电泳、毛细管电泳、高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、超扩散色谱法、流体或凝胶沉淀反应、吸收光谱法、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。此类测定也可以用于检测指示HTT蛋白的存在或复制的蛋白质。
在一些实施方式中，本公开的方法在治疗HTT相关疾病中的功效通过HTT mRNA水平的降低来评估(例如，通过评估CSF样品的HTT水平，通过脑活检，或其他方式)。
在一些实施方式中，本公开的方法在治疗HTT相关疾病中的功效通过HTT mRNA水平的降低来评估(例如，通过评估肝脏样品的HTT水平，通过活检，或其他方式)。
在本公开的方法的一些实施例中，将RNAi剂施用于受试者，使得RNAi剂被递送至受试者体内的特定位点。HTT表达的抑制可以使用测量源自受试者体内特定位点(例如CNS细胞)的样品中HTT mRNA或HTT蛋白的水平或水平变化来评估。在某些实施方式中，该方法包括临床相关的HTT表达抑制，例如HTT表达抑制，如用降低HTT表达的药剂治疗受试者后的临床相关结果所证明的，例如，尾状核萎缩的稳定或抑制(例如，通过体积MRI(vMRI)评估)，受试者脑脊液样本中神经丝轻链(Nfl)水平的稳定或降低，突变型HTT mRNA或裂解的突变型HTT蛋白的减少，例如，全长突变体HTT mRNA或蛋白和切割的突变体HTT mRNA或蛋白之一或两者，统一亨廷顿病评定量表(UHDRS)评分稳定或改善。
如本文所使用的，术语检测或确定分析物的水平被理解为执行步骤以确定是否存在材料(例如，蛋白质、RNA)。如本文所使用的，检测或确定的方法包含检测或确定低于所使用的方法的检测水平的分析物水平。
IX.治疗或预防HTT相关神经退行性疾病的方法
本公开还提供了使用本公开的RNAi剂降低或抑制细胞中的HTT表达的方法。该方法包括使细胞与本公开的dsRNA接触并保持细胞足以获得HTT基因的mRNA转录物降解的一段时间，从而抑制细胞中的HTT基因表达。可以通过本领域公知的任何方法评估基因表达的减少。例如，例如，HTT的表达的减少可以使用本领域普通技术人员常规的方法，通过确定HTT的mRNA表达水平来确定，例如northern印迹、qRT-PCR；通过使用本领域普通技术人员常规的方法，如western印迹、免疫技术确定HTT的蛋白质水平来确定。
在本公开的方法中，细胞可以在体外或体内接触，即细胞可以在受试者体内。
适用于使用本公开的方法进行处理的细胞可以是表达HTT基因的任何细胞。适用于本公开的方法的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类细胞(如人细胞或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类动物细胞(如大鼠细胞或小鼠细胞)。在一个实施方式中，细胞是人细胞，例如，人CNS细胞。
在细胞中HTT表达抑制至少约30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％，即至低于检测水平。在优选实施方式中，HTT表达抑制至少50％。
本公开的体内方法可以包含向受试者施用含有RNAi剂的组合物，其中所述RNAi剂包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与要治疗的哺乳动物的HTT基因的RNA转录物的至少一部分互补。当待治疗的生物体是如人等哺乳动物时，组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包含但不限于口服、腹膜内或肠胃外途径，包含颅内(例如，脑室内、脑实质内和鞘内)、静脉内、肌内、玻璃体内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、鼻内、直肠和局部(包含经颊和舌下)施用。在某些实施方式中，组合物通过静脉输注或注射施用。在某些实施方式中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施方式中，组合物通过鞘内注射施用。
在一些实施方式中，通过贮库注射进行施用。贮库注射可以在长时间段内以一致的方式释放RNAi剂。因此，贮库注射可以减少获得期望的效果(例如，APP的期望的抑制，或治疗或预防效果)所需的给药频率。贮库注射也可以提供更一致的血清浓度。贮库注射可以包含皮下注射或肌内注射。在优选实施方式中，贮库注射是皮下注射。
在一些实施方式中，通过泵进行施用。泵可以是外部泵或外科植入的泵。在某些实施方式中，泵是皮下植入的渗透泵。在其他实施方式中，泵是输注泵。输注泵可以用于颅内、静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选实施方式中，输注泵是皮下输注泵。在其他实施方式中，泵是外科手术植入的泵，所述外科手术植入的泵将RNAi剂递送到CNS。
可以基于是否期望局部或全身治疗以及基于待治疗的区域来选择施用模式。可以选择施用的通路和位点来增强靶向。
在一个方面中，本公开还提供了用于抑制哺乳动物的HTT基因的表达的方法。所述方法包括向哺乳动物施用包含靶向哺乳动物的细胞中的HTT基因的dsRNA的组合物，并保持哺乳动物足以获得HTT基因的mRNA转录物降解的一段时间，从而抑制细胞中的HTT基因表达。基因表达的减少可以通过本领域已知的任何方法和通过本文所描述的方法(例如，qRT-PCR)来评估。在一些实施方式中，dsRNA存在于组合物例如药物组合物中。
蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法和通过本文所描述的方法(例如，ELISA)来评估。在一个实施方式中，CNS活检样品或脑脊液(CSF)样品用作组织材料，用于监测HTT基因或蛋白质表达(或因此的替代物)的减少。
本公开进一步提供了治疗有需要的受试者的方法。本公开的治疗方法包含以治疗有效量的靶向HTT基因的RNAi剂或包含靶向HTT基因的RNAi剂的药物组合物向受试者(例如，将受益于HTT表达抑制的受试者)施用本公开的RNAi剂。
此外，本公开提供了预防、治疗或抑制受试者中HTT相关疾病或病症(例如亨廷顿病)的进展的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的任何RNAi剂(例如dsRNA剂)或本文提供的药物组合物，从而预防、治疗或抑制受试者中HTT相关疾病或病症的进展。
本公开的RNAi剂可以作为“游离RNAi剂”施用。在不存在药物组合物的情况下施用游离RNAi剂。裸露的RNAi剂可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施方式中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有RNAi剂的缓冲溶液的pH和渗透压，使得其适合向受试者施用。
可替代地，本公开的RNAi剂可以作为药物组合物，如dsRNA脂质体制剂施用。
将从HTT基因表达的降低或抑制中获益的受试者是患有HTT相关疾病的那些，例如亨廷顿病。
本公开进一步提供了RNAi剂或其药物组合物用于例如治疗将受益于HTT表达的减少或抑制的受试者(例如，患有HTT相关病症的受试者)的方法和用途，其与其他药物或其他治疗方法组合，例如，与已知药物或已知治疗方法组合，例如目前用于治疗这些病症的那些药物或治疗方法。例如，在某些实施方式中，靶向HTT的RNAi剂与例如本文其他地方描述的或本领域已知的用于治疗HTT相关病症的剂组合施用。例如，适用于治疗将受益于HTT表达减少的受试者(例如，患有HTT相关病症的受试者)的另外的剂可以包含目前用于治疗HTT相关病症的症状的剂。RNAi剂和另外的治疗剂可以同时或以相同的组合施用，例如鞘内，或另外的治疗剂可以作为单独的组合物的一部分或在单独的时间施用，或通过本领域已知或本文所描述的另一种方法施用。
示例性的另外的治疗剂包括例如单胺抑制剂，例如丁苯那嗪(Xenazine)，丁苯那嗪(Austedo)和利血平，抗惊厥药，例如丙戊酸(Depakote、Depakene、Depacon)和氯硝西泮(Klonopin)抗精神病药，例如利培酮(Risperdal)和氟哌啶醇(Haldol)，以及抗抑郁药，例如帕罗西汀(Paxil)。
在一个实施方式中，该方法包括施用本文特征的组合物以是的靶HTT基因的表达降低持续至少一个月。在某些实施方式中，表达降低持续至少2个月、3个月或6个月。
任选地，可用于本文特征的方法和组合物的RNAi剂特异性靶向靶HTT基因的RNA(初级或加工的)。使用RNAi剂抑制这些基因的表达的组合物和方法可以如本文所描述的制备和进行。
根据本公开的方法施用dsRNA可以导致患有HTT相关病症的患者的此类疾病或病症的严重程度、体征、症状或标志物的降低。在此上下文中，“减少”意指此类水平在统计学上显著或临床上显著减少。减少可以是例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％。
可以例如通过测量疾病进展、疾病缓解、症状严重程度、疼痛减轻、生活质量、维持治疗效果所需的药物剂量、疾病标志物水平或适用于正在治疗或以预防为目标的给定疾病的任何其他可测量参数来评估疾病的治疗或预防功效。通过测量此类参数中的任一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以通过例如对受试者的定期监测来评估HTT相关病症的治疗功效。后期读数与初始读数的比较为医师提供了治疗是否有效的指示。通过测量此类参数中的任一个或参数的任何组合来监测治疗或预防的功效完全在本领域技术人员的能力范围内。关于靶向HTT的RNAi剂或其药物组合物的施用，“有效对抗”HTT相关病症表明，以临床适当的方式施用对至少一部分具有统计学意义的患者产生有益效果，如症状的改善、治愈、疾病的减少、寿命的延长，生活质量的改善或熟悉治疗HTT相关病症和相关原因的医生通常认为是积极的其他效果。
当疾病状态的一个或多个参数有统计上显著的改善时，或由于没有恶化或出现预期的症状，治疗或预防效果是明显的。作为实例，疾病的可测量参数的至少10％的有利变化，并且优选地至少20％、30％、40％、50％或更多的有利变化可以指示有效的治疗。也可以使用本领域已知的给定疾病的实验动物模型来判断给定RNAi剂药物或该药物的制剂的功效。当使用实验动物模型时，当观察到标志物或症状在统计学上显著减少时，就证明了治疗的功效。
可替代地，功效可以通过由诊断领域的技术人员基于临床上可接受的疾病严重程度分级量表确定的疾病严重度的降低来测量。任何导致例如使用适当量表测量的疾病严重程度减轻的积极变化表示使用本文所描述的RNAi剂或RNAi剂调配物的充分治疗。
可以向受试者施用治疗量的dsRNA，如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
RNAi剂可以定期鞘内、通过玻璃体内注射或通过静脉内输注施用一段时间。在某些实施方式中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。RNAi剂的施用可以降低例如患者的细胞、组织、血液、CSF样品或其他区室中的HTT水平，至少20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或者至少约99％或更多。在一个优选实施方式中，RNAi剂的施用可以降低例如患者的细胞、组织、血液、CSF样品或其他区室中的HTT水平至少50％。
在施用全剂量的RNAi剂之前，可以向患者施用较小的剂量，如5％的输注反应，并且监测不良反应，如过敏反应。在另一个实例中，可以监测患者不期望的免疫刺激作用，如增加的细胞因子(例如，TNF-α或INF-α)水平。
可替代地，RNAi剂可以皮下施用，即通过皮下注射。一次或多次注射可以用于向受试者递送期望的，例如每月剂量的RNAi剂。注射可以在一个时间段内重复进行。可以定期重复施用。在某些实施方式中，在初始治疗方案之后，可以在不太频繁的基础上施用治疗。重复剂量方案可以包含定期施用治疗量的RNAi剂，如每月或延长到每季度一次、每年两次、每年一次。在某些实施方式中，RNAi剂约每月施用一次至约每季度施用一次(即约每三个月施用一次)。
除非另有定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似或等效于本文所描述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明特征的RNAi剂和方法，但下文描述了合适的方法和材料。本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。另外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
非正式的序列表随此提交，并形成所提交的说明书的一部分。
实施例
实施例1.RNAi剂设计、合成、选择和体外评价
本实施例描述了HTT RNAi剂的设计、合成、选择和体外评价的方法。
试剂来源
当本文没有具体给出试剂的来源时，此类试剂可以以分子生物学应用的质量/纯度标准从分子生物学试剂的任何供应商获得。
生物信息学
靶向人亨廷顿蛋白转录物的内含子1的siRNA(HTT；NCBI参考序列：NG_009378.1(智人亨廷顿蛋白(HTT)，染色体4上的RefSeqGene(LRG_763))；或NCBI参考序列：NC_000004.12(智人)染色体4，GRCh38.p13主装配))是使用自定义R和Python脚本设计的。
未修饰的HTT有义链和反义链核苷酸序列的详细列表显示在表2中。修饰的HTT有义链和反义链核苷酸序列的详细列表显示在表3中。
应当理解，在整个申请中，不带小数的双工名称等同于带小数的双工名称，其仅引用双工的批次号。例如，AD-564727相当于AD-564727.1。
细胞培养和转染
根据标准方法培养Cos7并用感兴趣的iRNA双链体转染。
简言之，通过将7.5μL Opti-MEM加0.1μL RNAiMAX/孔(Invitrogen,CarlsbadCA.cat#13778-150)添加至384孔板中单个孔中的2.5μL siRNA双链体来转染细胞。然后将细胞在室温下孵育15分钟。然后将含有约1.5x104个细胞的40μL培养基添加到siRNA混合物中。RNA纯化前将细胞孵育24小时。在A549细胞中以10nM进行单剂量实验。单剂量实验以10nM、3nM、1nM和0.1nM进行。
体外双荧光素酶和内源性筛选试验
通过每孔添加50μL siRNA双链体和75ng质粒以及100μL Opti-ME0.5μL/孔加入Lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad CA.cat#13778-150)，然后在室温下孵育15分钟。然后将混合物添加到重新悬浮在35μL新鲜完全培养基中的细胞中。转染的细胞在37℃、5％ CO2的气氛中孵育。单剂量实验以10nM或50nM进行。
siRNA和psiCHECK2质粒转染后二十四小时，测量了Firefly(转染对照)和Renilla(与包含NG_009378.1的核苷酸5001–6271的HTT靶序列融合)荧光素酶。首先，从细胞中除去培养基。然后通过向每个孔中添加相当于培养基体积的75μL荧光素酶试剂并混合来测量萤火虫荧光素酶活性。将混合物在室温下孵育30分钟，然后在Spectramax(Molecular Devices)上测量发光(500nm)以检测Firefly荧光素酶信号。通过向每个孔中添加75μL室温的/>Stop&/>Reagent来测量海肾荧光素酶活性，并将板孵育10-15分钟，然后再次测量发光以确定海肾荧光素酶信号。/>Stop&/>试剂可猝灭萤火虫荧光素酶信号并持续发光，以实现海肾荧光素酶反应。通过将每孔内的海肾(MUC5B)信号标准化为萤火虫(对照)信号来确定siRNA活性。然后相对于用相同载体转染但未用siRNA处理或用非靶向siRNA处理的细胞评估siRNA活性的大小。所有转染均以n＝4进行。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒分离总RNA
使用DYNABEAD(Invitrogen,cat#61012)在BioTek-EL406平台上使用自动化方案分离RNA。简而言之，将70μL裂解/结合缓冲液和10μL含有3μL磁珠的裂解缓冲液添加到含有细胞的板中。将板在电磁摇床上室温孵育10分钟，然后捕获磁珠并除去上清液。然后用150μL洗涤缓冲液A洗涤珠子结合的RNA 2次，用洗涤缓冲液B洗涤一次。然后用150μL洗脱缓冲液洗涤珠子，重新捕获并除去上清液。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat#4368813)
每个反应将10μL含有1μL 10X缓冲液、0.4μL 25X dNTP、1μL 10x随机引物、0.5μL逆转录酶、0.5μL RNase抑制剂和6.6μL H2O的主混合物添加到上面分离的RNA中。将板密封、混合并在电磁摇床上室温孵育10分钟，然后在37℃下孵育2小时。
实时荧光定量PCR
将两μL cDNA添加至含有0.5μL人或小鼠GAPDH TaqMan探针(ThermoFisher cat4352934E or 4351309)和0.5μL适当HTT探针(可商购获得，例如来自Thermo Fisher)和5μL的主混合物中。Lightcycler 480探针主混合物(Roche Cat#04887301001)位于384孔板(Roche Cat#04887301001)的每孔中。实时PCR在LightCycler480实时PCR系统(Roche)中进行。每个双链体均使用N＝4进行测试，并将数据标准化为用非靶向对照siRNA转染的细胞。为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析实时数据，并将其归一化为使用适当对照进行的测定。
表4中提供了试剂的双荧光素酶测定的结果。
表1.核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。应当理解，这些单体当存在于寡核苷酸中时，通过5'-3'-磷酸二酯键相互连接；并且应当理解，当核苷酸含有2'-氟修饰时，则氟取代母体核苷酸中该位置处的羟基(即，它是2'-脱氧-2'-氟核苷酸)。还应当理解，表中的核苷酸缩写当置于寡核苷酸的3'-末端位置时省略了3'-磷酸(即，它们是3'-OH)。
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Claims (117)

1.一种用于抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包含相对于突变的HTT mRNA中保留的内含子1的互补区，并且其中所述互补区包含与表2-3和5-6中任一项的反义核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
2.根据权利要求1所述的dsRNA剂，其中所述有义链包含与SEQ ID NO:11的核苷酸5790-5810、5791-5811、5924-5944、5925-5945、5998-6018、6063-6083、6064-6084、6194-6214、6195-6215或6211-6231的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
3.根据权利要求2所述的dsRNA剂，其中所述有义链包含与SEQ ID NO:11的核苷酸5790-5810、5791-5811、5924-5944、6064-6084或6194-6214的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含与选自以下的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸：AD-1640384、AD-1640458、AD-1640457、AD-1640461、AD-1640628、AD-1640629、AD-1640498、AD-1640651、AD-1640631、AD-1640497、AD-1640382或AD-1640467。
5.一种用于抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包含与SEQ ID NO:11的核苷酸5922-5944、6059-6106、6059-6084、6068-6092、6076-6106、6191-6231、6191-6215、6191-6214、6192-6215、6198-6231或6198-6224的核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
6.一种用于抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)表达的双链核糖核酸(dsRNA)剂，其中所述dsRNA包含形成双链区的有义链和反义链，其中所述反义链包含与选自以下的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸：AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-171872。
7.根据权利要求6所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含与选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-17187211的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包含与选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
8.根据权利要求6所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含与选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个相差不超过2个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包含与选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-171872的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过2个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
9.根据权利要求6所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含与选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-17187211的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个相差不超过1个核苷酸的至少15个连续核苷酸，所述反义链包含与选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个相差不超过1个核苷酸的至少15个连续核苷酸。
10.根据权利要求6所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含有义链和反义链，所述有义链包含选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的有义链核苷酸序列中的任一个的核苷酸序列，所述反义链包含选自AD-1718647、AD-1718648、AD-1718649、AD-1718653、AD-1718654AD-1718655、AD-1718656、AD-1718660、AD-1718662、AD-1718663、AD-1718669、AD-1718670、AD-1718673、AD-1718674、AD-1718676、AD-1718677、AD-1718678、AD-1718679、AD-1718680、AD-1718682、AD-1718683、AD-1718702、AD-1718715、AD-1718717或AD-1718721的双链体的反义链核苷酸序列中的任一个的核苷酸序列。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链、所述反义链或者所述有义链和所述反义链两者与一个或多个亲脂性部分缀合。
12.根据权利要求11所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分与所述dsRNA剂的所述双链区中的一个或多个内部位置缀合。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的dsRNA剂，其中所述一个或多个亲脂性部分与所述反义链上的一个或多个内部位置缀合。
14.根据权利要求11或权利要求12所述的dsRNA剂，其中所述一个或多个亲脂性部分通过接头或载体与至少一条链上的一个或多个内部位置缀合。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的dsRNA剂，其中通过logKow测量的所述亲脂性部分的亲脂性超过0。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的dsRNA剂，其中通过所述dsRNA剂的血浆蛋白结合测定中的未结合部分测量的所述dsRNA剂的疏水性超过0.2。
17.根据权利要求16所述的dsRNA剂，其中所述血浆蛋白结合测定是使用人血清白蛋白的电泳迁移率变化测定。
18.根据权利要求12-16中任一项所述的dsRNA剂，其中所述内部位置包含除了所述有义链或所述反义链的每一端的末端两个位置之外的所有位置。
19.根据权利要求18所述的dsRNA剂，其中所述内部位置包含除了所述有义链或所述反义链的每一端的末端三个位置之外的所有位置。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的dsRNA剂，其中所述内部位置不包含所述有义链的切割位点区域。
21.根据权利要求20所述的dsRNA剂，其中所述内部位置包含除了从所述有义链的5’端开始计数的位置9-12之外的所有位置。
22.根据权利要求20所述的dsRNA剂，其中所述内部位置包含除了从所述有义链的3’端开始计数的位置11-13之外的所有位置。
23.根据权利要求12-19中任一项所述的dsRNA剂，其中所述内部位置不包含所述反义链的切割位点区域。
24.根据权利要求23所述的dsRNA剂，其中所述内部位置包含除了从所述反义链的5’端开始计数的位置12-14之外的所有位置。
25.根据权利要求12-24中任一项所述的dsRNA剂，其中所述内部位置包含除了所述有义链上从3’端开始计数的位置11-13和所述反义链上从5’端开始计数的位置12-14之外的所有位置。
26.根据权利要求11-25中任一项所述的dsRNA剂，其中所述一个或多个亲脂性部分与选自从每条链的5’端开始计数的所述有义链上的位置4-8和13-18以及所述反义链上的位置6-10和15-18的所述内部位置中的一个或多个缀合。
27.根据权利要求26所述的dsRNA剂，其中所述一个或多个亲脂性部分与选自从每条链的5’端开始计数的所述有义链上的位置5、6、7、15和17以及所述反义链上的位置15和17的所述内部位置中的一个或多个缀合。
28.根据权利要求12所述的dsRNA剂，其中所述双链区中的所述位置不包含所述有义链的切割位点区域。
29.根据权利要求11-28中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的长度为21个核苷酸，所述反义链的长度为23个核苷酸，并且所述亲脂性部分与所述有义链的位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或者所述反义链的位置16缀合。
30.根据权利要求11-28中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的长度为21个核苷酸，所述反义链的长度为23个核苷酸，并且所述亲脂性部分与所述有义链的位置21、位置20、位置15、位置1、位置7、位置6或位置2或者所述反义链的位置16缀合。
31.根据权利要求11-30中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分是脂族、脂环族或多脂环族化合物。
32.根据权利要求31所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分选自脂质、胆固醇、视黄酸、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩恶嗪。
33.根据权利要求32所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分包含饱和或不饱和的C4-C30烃链，和选自羟基、胺基、羧酸、磺酸盐、磷酸盐、硫醇、叠氮化物和炔烃的任选官能团。
34.根据权利要求33所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分包含饱和或不饱和的C6-C18烃链。
35.根据权利要求34所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分包含饱和或不饱和的C16烃链。
36.根据权利要求35所述的dsRNA剂，其中所述饱和或不饱和的C16烃链与从所述链的5’端开始计数的位置6缀合。
37.根据权利要求11-36中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分通过取代所述内部位置或所述双链区中的一个或多个核苷酸的载体缀合。
38.根据权利要求37所述的dsRNA剂，其中所述载体是选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪基、四氢呋喃基和十氢化萘基的环状基团；或者是基于丝氨醇主链或二乙醇胺主链的无环部分。
39.根据权利要求11-38中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分通过包含醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、酰胺、马来酰亚胺硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺酰胺键、点击反应产物或氨基甲酸酯的接头与所述dsRNA剂缀合。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的双链iRNA剂，其中所述亲脂性部分与核碱基、糖部分或核苷间键缀合。
41.根据权利要求1-40中任一项所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含至少一个修饰的核苷酸。
42.根据权利要求41所述的dsRNA剂，其中所述有义链核苷酸中不超过五个和所述反义链中不超过五个核苷酸是未修饰的核苷酸。
43.根据权利要求41所述的dsRNA剂，其中所述有义链的所有核苷酸和所述反义链的所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的dsRNA剂，其中所述修饰的核苷酸中的至少一个选自脱氧核苷酸，3’端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸，2'-O-甲基修饰的核苷酸，2'-氟修饰的核苷酸，2'-脱氧修饰的核苷酸，2'-5'-连接核糖核苷酸(3'-RNA)，锁定核苷酸，解锁核苷酸，构象限制核苷酸，受限乙基核苷酸，脱碱基核苷酸，2'-氨基修饰的核苷酸，2'-O-烯丙基修饰的核苷酸，2'-C-烷基修饰的核苷酸，2'-羟基修饰的核苷酸，2'-甲氧基乙基修饰的核苷酸，2'-O-烷基修饰的核苷酸，吗啉代核苷酸，氨基磷酸酯，包含非天然碱基的核苷酸，四氢吡喃修饰的核苷酸，1,5-脱水己糖醇修饰的核苷酸，环己烯基修饰的核苷酸，包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸，包含5'-甲基膦酸酯基团的核苷酸，包含5'磷酸盐或5'磷酸盐模拟物的核苷酸，包含乙烯基膦酸酯的核苷酸，包含腺苷-二醇核酸(GNA)的核苷酸，二醇核酸S-异构体(S-GNA)，包含2-羟甲基-四氢呋喃-5-磷酸的核苷酸，包含2'-脱氧胸苷-3'磷酸的核苷酸，包含2'-脱氧鸟苷-3'-磷酸的核苷酸，和与胆固醇衍生物十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸，2`-磷酸胞苷，2`-磷酸鸟苷，2`-磷酸尿苷，2`-磷酸腺苷、2'-O-十六烷基-3'-磷酸腺苷，2'-O-十六烷基胞苷-3'-磷酸，2'-O-十六烷基-鸟苷-3'-磷酸盐，和2'-O-十六烷基-尿苷-3'-磷酸盐，及其组合。
45.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述修饰的核苷酸选自2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、3’端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)、锁定核苷酸、脱碱基核苷酸、2'-氨基修饰核苷酸、2'-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和包含非天然碱基的核苷酸。
46.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述修饰的核苷酸中的至少一个选自脱氧核苷酸、2'-O-甲基修饰的核苷酸、2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、二醇修饰的核苷酸(GNA)和乙烯基膦酸核苷酸，及其组合。
47.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述核苷酸上的所述修饰中的至少一个是热不稳定核苷酸修饰。
48.根据权利要求47所述的dsRNA，其中所述热不稳定核苷酸修饰选自脱碱基修饰；与所述双链体中相反的核苷酸的错配；和不稳定糖修饰、2’-脱氧修饰、无环核苷酸、解锁核酸(UNA)和甘油核酸(GNA)。
49.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述修饰的核苷酸包含3’端脱氧胸腺嘧啶核苷酸(dT)的短序列。
50.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述核苷酸上的所述修饰是2'-O-甲基、GNA和2'氟修饰。
51.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA包含至少一个2'-氟核苷酸修饰。
52.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含至少一个2'-氟核苷酸修饰。
53.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、14和16处包含2'-氟核苷酸修饰。
54.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、6、14和16处包含2'-氟核苷酸修饰。
55.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、6、9、14和16处包含2’-氟核苷酸修饰。
56.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、6、8、9、14和16处包含2’-氟核苷酸修饰。
57.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含至少一个2'-氟核苷酸修饰。
58.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述有义链在从所述有义链的5’端开始计数的位置7、9和11处或从所述有义链的3’端开始计数的位置11、13和15处包含2'-氟核苷酸修饰。
59.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述有义链在从所述有义链的5’端开始计数的位置7、9和11处或从所述有义链的3’端开始计数的位置11、12、13和15处包含2'-氟核苷酸修饰
60.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述有义链在从所述有义链的5’端开始计数的位置9、10和11处或从所述有义链的3’端开始计数的位置11、12和13处包含2'-氟核苷酸修饰。
61.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含至少一个DNA核苷酸修饰。
62.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、5、7和12处包含DNA核苷酸修饰。
63.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、5、7、12和14处包含DNA核苷酸修饰。
64.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、5、7和12处的DNA核苷酸修饰，和位置14处的2'-氟核苷酸。
65.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述反义链的5’端开始计数的位置2、5、7、12、14和16处的DNA核苷酸修饰。
66.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA包含至少一个热不稳定核苷酸修饰。
67.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链包含至少一个热不稳定核苷酸修饰。
68.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在所述反义链的种子区中包含至少一种热不稳定核苷酸修饰。
69.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链至少在从所述链的5’端开始计数的位置6、7或8之一处包含热不稳定核苷酸修饰。
70.根据权利要求44所述的dsRNA剂，其中所述反义链在从所述链的5’端开始计数的位置7处包含热不稳定核苷酸修饰。
71.根据权利要求44所述的dsRNA，其中所述热不稳定核苷酸修饰是脱碱基核苷酸、2'-脱氧核苷酸、无环核苷酸(例如，解锁核酸(UNA)、二醇核酸(GNA)或(S)-二醇核酸(S-GNA))、2'-5'连接核苷酸(3'-RNA)、苏糖核苷酸(TNA)、2'gem Me/F核苷酸或与另一条链中相反的核苷酸的错配。
3’RNA：
TNA：
2’gem Me/F核苷酸：
72.根据前述权利要求中任一项所述的dsRNA，其中未另外限定的任何核苷酸包含2'-OMe核苷酸修饰。
73.根据权利要求1-72中任一项所述的dsRNA剂，其还包含至少一个硫代磷酸酯核苷酸间键。
74.根据权利要求73所述的dsRNA剂，其中所述dsRNA剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的dsRNA剂，其中每条链的长度不超过30个核苷酸。
76.根据权利要求1-75中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一条链包含至少1个核苷酸的3’突出端。
77.根据权利要求1-75中任一项所述的dsRNA剂，其中至少一条链包含至少2个核苷酸的3’突出端。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为15-30个核苷酸对。
79.根据权利要求78所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为17-23个核苷酸对。
80.根据权利要求78所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为17-25个核苷酸对。
81.根据权利要求78所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为23-27个核苷酸对。
82.根据权利要求78所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为19-21个核苷酸对。
83.根据权利要求78所述的dsRNA剂，其中所述双链区的长度为21-23个核苷酸对。
84.根据权利要求1-83中任一项所述的dsRNA剂，其中每条链的长度为19-30个核苷酸。
85.根据权利要求1-83中任一项所述的dsRNA剂，其中每条链的长度为19-23个核苷酸。
86.根据权利要求1-83中任一项所述的dsRNA剂，其中每条链的长度为21-23个核苷酸。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的dsRNA剂，其还包含靶向肝组织的靶向配体。
88.根据权利要求87所述的dsRNA剂，其中所述靶向配体是GalNAc缀合物。
89.根据权利要求11-88中任一项所述的dsRNA剂，其中所述亲脂性部分或靶向配体通过选自以下的生物可裂解接头缀合：DNA，RNA，二硫键化物，酰胺，半乳糖胺、葡萄糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化单糖或寡糖，及其组合。
90.根据权利要求11-89中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链的3’端通过端帽保护，所述端帽是具有胺基的环状基团，所述环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧戊环基、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪基、四氢呋喃基和十氢化萘基。
91.根据权利要求1-90中任一项所述的dsRNA剂，其还包含
末端手性修饰，其发生在所述反义链的3’端的第一个核苷酸间键处，具有Sp构型的连接磷原子，
末端手性修饰，其发生在所述反义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，和
末端手性修饰，其发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp构型或Sp构型的连接磷原子。
92.根据权利要求1-90中任一项所述的dsRNA剂，其还包含
末端手性修饰，其发生在所述反义链的3’端的第一个和第二个核苷酸间键处，具有Sp构型的连接磷原子，
末端手性修饰，其发生在所述反义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，和
末端手性修饰，其发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
93.根据权利要求1-90中任一项所述的dsRNA剂，其还包含
末端手性修饰，其发生在所述反义链的3’端的第一、第二和第三个核苷酸间键处，具有Sp构型的连接磷原子，
末端手性修饰，其发生在所述反义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，和
末端手性修饰，其发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
94.根据权利要求1-90中任一项所述的dsRNA剂，其还包含
末端手性修饰，其发生在所述反义链的3’端的第一和第二个核苷酸间键处，具有Sp构型的连接磷原子，
末端手性修饰，其发生在所述反义链的3’端的第三个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，
末端手性修饰，其发生在所述反义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，和
末端手性修饰，其发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
95.根据权利要求1-90中任一项所述的dsRNA剂，其还包含
末端手性修饰，其发生在所述反义链的3’端的第一和第二个核苷酸间键处，具有Sp构型的连接磷原子，
末端手性修饰，其发生在所述反义链的5’端的第一和第二个核苷酸间键处，具有Rp构型的连接磷原子，以及
末端手性修饰，其发生在所述有义链的5’端的第一个核苷酸间键处，具有Rp或Sp构型的连接磷原子。
96.根据权利要求1-95中任一项所述的dsRNA剂，其还包含在所述反义链的5’端处的磷酸盐或磷酸盐模拟物。
97.根据权利要求96所述的dsRNA剂，其中所述磷酸盐模拟物是5’-乙烯基膦酸酯(VP)。
98.根据权利要求1-97中任一项所述的dsRNA剂，其中所述双链体的反义链的5’端的位置1处的碱基对是AU碱基对。
99.根据权利要求1-98中任一项所述的dsRNA剂，其中所述有义链具有总共21个核苷酸并且所述反义链具有总共23个核苷酸。
100.一种细胞，其包含根据权利要求1-99中任一项所述的dsRNA剂。
101.一种用于抑制编码HTT的基因表达的药物组合物，其包含根据权利要求1-99中任一项所述的dsRNA剂。
102.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-99中任一项所述的dsRNA剂和脂质制剂。
103.一种抑制细胞中亨廷顿蛋白(HTT)基因表达的方法，所述方法包括：
(a)使细胞与根据权利要求1-99中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求101或102所述的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以实现所述HTT基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制所述细胞中所述HTT基因的表达。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述细胞在受试者内。
105.根据权利要求104所述的方法，其中所述受试者是人。
106.根据权利要求103-105中任一项所述的方法，其中所述HTT的表达被抑制至少50％。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述受试者已被诊断患有HTT相关疾病。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述核苷酸重复扩增疾病是亨廷顿病。
109.一种治疗诊断患有HTT相关疾病的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1-99中任一项所述的dsRNA剂或根据权利要求101或102所述的药物组合物，从而治疗所述受试者。
110.根据权利要求109所述的方法，其中治疗包括改善所述疾病的至少一种体征或症状。
111.根据权利要求109所述的方法，其中治疗包括预防所述疾病的进展。
112.根据权利要求109-111中任一项的方法，其中所述HTT相关疾病是亨廷顿病。
113.根据权利要求109-112中任一项所述的方法，其中所述dsRNA剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量向所述受试者施用。
114.根据权利要求109-113中任一项所述的方法，其中所述dsRNA剂鞘内施用于所述受试者。
115.根据权利要求109-114中任一项所述的方法，其还包括测量从所述受试者获得的样品中的HTT水平。
116.根据权利要求109-115中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用适合于治疗或预防HTT相关病症的另外的剂。
117.一种RNA诱导的沉默复合物(RISC)，其包含权利要求1-99中任一项所述的dsRNA剂的反义链。
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