TW202305131A - 用於治療或預防超氧歧化酶１－（ＳＯＤ１－）相關的神經退化疾病的超氧歧化酶１（ＳＯＤ１）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 - Google Patents

用於治療或預防超氧歧化酶１－（ＳＯＤ１－）相關的神經退化疾病的超氧歧化酶１（ＳＯＤ１）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本揭露係關於靶向SOD1基因的雙股核糖核酸(dsRNAi)劑及組成物，以及使用該dsRNAi劑及組成物抑制SOD1基因表現的方法及治療患有SOD1-相關神經退化性疾病或病症之個體的方法，疾病或病症例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)以及唐氏症(DS)。

Description

用於治療或預防超氧歧化酶1-(SOD1-)相關的神經退化疾病的超氧歧化酶1(SOD1)iRNA組成物及其使用方法
本揭露係關於靶向SOD1基因的雙股核糖核酸(dsRNAi)劑及組成物，以及使用該dsRNAi劑及組成物抑制SOD1基因表現的方法及治療患有SOD1-相關神經退化性疾病或病症之個體的方法，疾病或病症例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)以及唐氏症(DS)。
相關申請
本申請案主張2021年2月12日提出申請的美國臨時案第63/148,991號及2021年10月21日提出申請的美國臨時申請案第63/270,176號的優先權。前述申請之各者的全部內容已參照方式併入本文。
序列表
本申請案含有序列表，該序列表以ASCII格式電子式遞交且其全體內容以參照方式併入本文。該ASCII複本創製於2022年2月8日，命名為121301_12720_SL.txt且為365,213個位元大小。
過氧化物歧化酶1(SOD1)，亦已知為銅/鋅過氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)，係廣泛表現的抗氧化酵素，其將細胞代謝產生的過氧化物自由基代謝為分子氧及過氧化氫，並在保護細胞免於氧化壓力中扮演重要的角色(McCord JM and Fridovich I.(1969)J Bio Chem.244：6049-6055；Rosen DR(1993)Nature.364：362；Trist B,et al.(2020)Angew Chem Int Ed Engl.Accepted Author Manuscript)。人類SOD1基因位於染色體21q22.11且其產生16kDa的蛋白質，通常形成32kDa的同源二聚體。在哺乳動物細胞中，SOD1廣泛分佈於細胞溶質、細胞核、溶酶體、過氧化物酶體及粒線體的膜間隙(IMS)(Fukai T and Ushio-Fukai M.(2011)Antioxid Redox Signal.15(6)：1583-1606；Zhang S,et al.(2015)Free Radic Biol Med.85：33-44；Huai J and Zhang Z.(2019)Front.Neurol.10：527)。SOD1的高細胞溶質豐度使其與其他兩種也參與代謝過氧化自由基的哺乳動物過氧化物歧化酶區分開來：粒線體四聚體錳過氧化物歧化酶(SOD2)及細胞外四聚體銅/鋅過氧化物歧化酶(SOD3)。然而，SOD1的活性約佔哺乳動物細胞中總SOD活性的50至80%(Mindola P,et al.(2016)Front.Physiol.7：594)。
每一SOD1次單位的結構由β-桶核心(β-barrel core)及邊緣的七個環組成，它們藉由分子內雙硫鍵、一個保持銅離子及鋅離子的雙核 金屬結合位點連接在一起，其負責SOD1的催化活性，以及整體氫鍵連結(Huai J and Zhang Z.(2019)Front.Neurol.10：527)。先前研究顯示，SOD1的穩定性、結構及功能受其轉譯後修飾、金屬離子結合及雙硫鍵狀態的控制。金屬輔因子的丟失及/或雙硫鍵的破壞，通常與SOD1基因的突變有關，可導致SOD1蛋白質的致病錯誤折疊、聚集及/或功能障礙(Huai J and Zhang Z.(2019)Front.Neurol.10：527)。
在SOD1基因的編碼區及非編碼區記錄了大約200個突變。突變體SOD1蛋白質容易發生折疊錯誤，這會損害保護性抗氧化功能，並導致異常分子交互作用的形成(例如，在多個折疊錯誤的SOD1單元(聚集)之間以及在錯誤折疊的SOD1與其他細胞成分之間)，因而經由失去功能的作用(例如，抗氧化活性降低、受損的核轉位及啟動子結合受損，以及SOD1氧化還原信號傳導中斷)及增加功能的作用(例如，神經毒性)促成病理(Trist B,et al.(2020)Angew Chem Int Ed Engl.Accepted Author Manuscript)。SOD1與許多不同疾病的病理發展有關，包括例如心臟衰竭、癌症(例如肺腺癌、非小細胞肺癌及乳腺癌)、糖尿病、肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿滋海默症(AD)、帕金森氏症及唐氏症(DS)(Banks CJ and Anderson JL.(2019)Redox Biol.26：101270；Trist B,et al.(2020)Angew Chem Int Ed Engl.Accepted Author Manuscript)。在神經退化性疾病的相關內容下，SOD1與神經元及周圍神經膠質細胞中破壞性路徑的啟動及/或加速有關，包括：蛋白酶體功能的破壞、微管及微絲的降解、內質網壓力及氧化還原失調。更具體地說，突變體SOD1與家族性肌萎縮側索硬化症(fALS)有關，其中各種SOD1突變可以增加SOD1聚集的傾向，這被認 為會誘導運動神經元死亡。除此之外，野生型SOD1摺疊錯誤與功能障礙涉及散發性ALS(aALS)中脊髓運動神經元的死亡、帕金森氏症中黑質緻密部(SNc)多巴胺神經元的死亡，以及阿滋海默症中額葉皮層及海馬內神經元的死亡(Trist B,et al.(2020)Angew Chem Int Ed Engl.Accepted Author Manuscript)。除此之外，SOD1涉及加劇其他有害細胞病理的神經死亡，包括阿滋海默症中的Aβ斑塊形成及帕金森氏症中的α-突觸核蛋白沉積。
目前尚無針對過氧化物歧化酶1相關神經退化性疾病的有效治療方法，任何可用的治療方法都係舒緩的。因此，仍然需要一種能夠利用細胞自身的RNAi機制選擇性地及有效地沉默SOD1基因的劑，該劑具有高生物活性及體內穩定性，並且能夠有效地抑制標靶SOD1基因的表現。
本揭露提供RNAi劑組成物，其影響RNA誘導的沉默複合物(RISC)媒介的過氧化物歧化酶1(SOD1)基因的RNA轉錄物的裂解。SOD1基因可以在細胞內，例如，個體內的細胞，個體例如人類。本揭露還提供使用本揭露的RNAi劑組成物的方法用於抑制SOD1基因表現及/或用於治療從抑制或降低SOD1基因表現中受益的個體，例如，個體患有或易患SOD1-相關的神經退化性疾病，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿滋海默症(AD)、帕金森氏病(PD)及唐氏症(DS)。
因此，在一方面，本發明提供了一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑或其藥學上可接受的鹽，其包含形成雙股區的正義股(sense strand)及反義股(antisense strand)形成雙股區，其中
a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3'(SEQ ID NO：11)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3'(SEQ ID NO：12)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-膦酸乙烯酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC、dG及dT係2'-去氧C、G及T；及Cf及Uf係2'-去氧-2'-氟(2'-F)C及U；
b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2’-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過4個鹼基， 其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)、S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC係2'-去氧C；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；((Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)；S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；
e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；((Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(G2p)係鳥苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)差異不超過4個鹼基， 其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)；S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af、Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；(Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)、S-易構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dC及dT係2'-去氧A、G及T；及Af及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及U；
i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg (C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、GfUf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；或
j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過4個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
在一實施態樣中，
a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；
b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)、S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g及c係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G及C；dA係2'-去氧A；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；
e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(G2p)係鳥苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af、Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C及U；
g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及U；
i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；或
j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過3個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'- OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
在一實施態樣中，
a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC、dC、dG及dT係2'-去氧C、G及T；及Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)G及U；
b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過2個鹼基， 其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC係2'-去氧C；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；
e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2’-O-十六基-尿苷-3’-磷酸酯；(G2p)係鳥苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)差異不超過2個鹼基， 其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C及U；
g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、及U；
h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及U；
i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過2個鹼基， 其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；or
j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過2個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
在一實施態樣中，
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b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過1個鹼基， 反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過1個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過1個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
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h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg (Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過1個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及U；
i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過1個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；或
j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過1個鹼基，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
在一實施態樣中，
a)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC、dG及dT係2'-去氧C、G及T；及Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；
b)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
c)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC係2'-去氧C；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
d)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID 20 NO：18)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；
e)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(G2p)係鳥苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
f)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af、Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C及U；
g)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u 係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
h)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及U；
i)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；或
j)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
在一實施態樣中，
a)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)組成，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC、dG及dT係2'-去氧C、G及T；及Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)C及U；
b)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)組成，反義股的核苷酸序列包由苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)組成，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA及dT係2'-去氧A及T；及Af及Cf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及C；
c)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)組成，反義股的核苷酸序列由苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)組成，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA),S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dC係2'-去氧C；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
d)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)組成，反義股的核苷酸 序列由核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)組成，其中VP係係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係10胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；
e)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)組成，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(G2p)係鳥苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA係2'-去氧A；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
f)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)組成，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；(Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af、Cf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C及U；
g)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)組成，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十 六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U；
h)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)組成，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)，S-異構物；；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dA、dG及dT係2'-去氧A、G及T；及Af及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A及U；
i)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)組成，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、G及U；或
j)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)組成，其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；(Chd)係2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；(C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；s係硫代磷酸酯鏈結；a、g、 c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；dT係2'-去氧T；及Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
在一實施態樣中，dsRNA劑係鈉鹽形式。
在一方面，本發明提供一雙股核糖核酸(dsRNA)劑用於抑制過氧化物歧化酶1(SOD1)表現，其中，該dsRNA劑包含形成雙股區域的正義股及反義股，其中，該正義股包含至少15個連續核苷酸(contiguous nucleotides)，例如15、16、17、18、19、20或21個，該連續核苷酸為SEQ ID NO：1的核苷酸序列201至223、204至226、207至229、216至238、219至241、328至350、333至355、336至358、372至394或373至395中之視需要一個，該反義股包含從SEQ ID NO：2對應核苷酸序列而得之至少15個連續核苷酸(contiguous nucleotides)，例如15、16、17、18、19、20、21、22及23個，其中，(i)該dsRNA劑包含至少一修飾核酸、(ii)該雙股區域係長度15至30核苷酸對及(iii)正義股或反義股接合一個或多個親脂部分。
在一實施態樣中，正義股包含至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20或21個，該連續核苷酸為SEQ ID NO：1的核苷酸序列207至229、219至241、328至350、336至358中之視需要一個，反義股包含從SEQ ID NO：2對應核苷酸序列而得之至少15個連續核苷酸(contiguous nucleotides)，例如15、16、17、18、19、20、21、22及23個。
在另一實施態樣中，該正義股包含至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20或21個，該連續核苷酸為SEQ ID NO：1之 核苷酸序列207至229、328至350、336至358中的視需要一個，該反義股包含從SEQ ID NO：2對應核苷酸序列而得之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22及23個。
在一實施態樣中，該正義股包含至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20或21個，該連續核苷酸為SEQ ID NO：1的核苷酸序列336至358中之視需要一個，該反義股包含從SEQ ID NO：2對應核苷酸序列而得之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22及23個。
在另一實施態樣中，該反義股包含從由AD-1395762、AD-1395756、AD-1395731、AD-1395743、AD-1395771、AD-1395738、AD-1395718、AD-1395760、AD-1395764或AD-1395724所成群組選擇之雙鏈體之任一反義股核甘酸之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個。
在一實施態樣中，反義股包含從由AD-1395762、AD-1395756、AD-1395731及AD-1395743所成群組選擇之雙鏈體之任一反義股核甘酸之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個
在一實施態樣中，反義股包含從由AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731所成群組選擇之雙鏈體之任一反義股核甘酸之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個。
在另一實施態樣中，反義股包含從雙鏈體AD-1395762之反義股核甘酸之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個。
在一實施態樣中，該正義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸都包含修飾。
在一實施態樣中，至少一修飾核苷酸選自以下群組：去氧-核苷酸、3’-末端去氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、2’-5’-連結核糖核苷酸(3’-RNA)、鎖核苷酸、未鎖核苷酸、結構受限的核苷酸、限制性乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、2’-C-烯丙基修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾核苷酸、2'-O-烷基修飾核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含核苷酸的非天然鹼基、四氫吡喃修飾的核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基團的核苷酸、包含5'磷酸鹽或5'磷酸鹽模擬物的核苷酸、包含膦酸乙烯酯的核苷酸、乙二醇核酸(GNA)、乙二醇核酸S-異構物(S-GNA)、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸的核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'磷酸的核苷酸、包含2'-去氧鳥苷-3'-磷酸鹽的核苷酸以及與膽固醇衍生物及十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸；及其視需要組合。
在一實實施態樣中，該修飾核苷酸選自以下所成群組：2'-去氧-2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、3’-末端去氧胸苷核苷酸(dT)、鎖核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯以及包含核苷酸的非天然鹼基所組成。
在另一實施態樣中，該核苷酸上的修飾分別選自以下群組，該群組由2’-去氧、2’-O-甲基、3’-RNA、GNA、S-GNA以及2'-去氧-2'-氟修飾組成。
在一實施態樣中，該dsRNA劑復包含至少一硫代磷酸酯核苷酸鏈結。
在一實施態樣中，該dsRNA劑包含6至8個磷酸酯核苷酸鏈結。
在一實施態樣中，至少一股包含至少一核苷酸的3'突出。
在另一實施態樣中，該至少一股包含2個核苷酸的3'突出。
在一實施態樣中，該雙股區域長度係17至23個核苷酸對。
在另一實施態樣中，該雙股區域長度係19至21個核苷酸對。
在一實施態樣中，該雙股區域長度係21至23個核苷酸對。
在一實施態樣中，每股具有19至30個核苷酸。
在一實施態樣中，該一個或多個親脂部分接合至少一股的一個或多個內部位置。
在一實施態樣中，一親脂部分接合一選自下述所成群組之內部位置：正義股的位置4至8及13至18，以及反義股的位置6至10及15至18所組成，從每股的5'端起算。
在一實施態樣中，該內部位置選自下述所成群組：正義股的位置5、6、7、15及17所組成，從該股的5'端起算。
在另一實施態樣中，該內部位置選自下述所成群組：反義股的位置15及17，從該股的5'端起算。
在一實施態樣中，該內部位置選自下述所成群組：正義股的位置6及7。
在一實施態樣中，該親脂部分係脂肪族、脂環族或多脂環族化合物。
在一實施態樣中，該親脂部分含有飽和或不飽和的C4至C30烴鏈，以及選自下述所成群組之視需要的官能基：羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮化物及炔烴。
在一實施態樣中，該親脂部分含有飽和或不飽和的C6至C18烴鏈。
在一實施態樣中，該親脂部分含有飽和或不飽和的C16烴鏈。
在一實施態樣中，該飽和或不飽和C16烴鏈接合於正義股的位置6或7，從正義股的5'-端起算。
在一實施態樣中，該dsRNA劑復包含於反義股5'端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。
在一實施態樣中，該磷酸酯模擬物係5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
在另一實施態樣中，該磷酸酯模擬物係5'-E-乙烯基膦酸酯(VP)。
在一實施態樣中，該雙鏈體反義股5'-端位置1的鹼基對係AU鹼基對。
在一實施態樣中，該正義股共有21個核苷酸及反義股共有23個核苷酸。
本發明亦提供細胞及醫藥組成物，該醫藥組成物包含藥學上可接受的稀釋劑，該稀釋劑包含本文公開的dsRNA藥劑。
在一方面，本發明提供了一種抑制細胞中SOD1基因表現的方法。該方法包括使細胞與本發明dsRNA劑或醫藥組成物接觸；將步驟(a)中產生的細胞維持足夠的時間，使SOD1基因的mRNA轉錄物降解，因此抑制該細胞中SOD1基因表現。
在一實施態樣中，該細胞係在人類個體內。
在一實施態樣中，該個體符合SOD1-相關神經退化性疾病的至少一個診斷標準或已被診斷患有SOD1-相關神經退化性疾病。
在一實施態樣中，該SOD1-相關的神經退化性疾病選自下述所成群組：肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
在一方面，本發明提供了一種治療經診斷患有與SOD1-相關之神經退化性疾病個體的方法，該方法包括向該個體給藥本發明dsRNA劑或醫藥組成物的治療有效量，從而治療個體。
在一實施態樣中，治療包括改善疾病的至少一種徵兆或症狀。
在另一實施態樣中，治療包括預防疾病的惡化。
在一實施態樣中，該SOD1-相關的神經退化性疾病選自下述所成群組：肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)所組成。
在另一方面，本發明提供了一種在符合至少一SOD1-相關神經退化性疾病診斷標準之個體預防SOD1-相關神經退化性疾病進展的方法，SOD1-相關該方法包括向個體給藥dsRNA劑或本發明的醫藥組成物的 治療有效量，因此防止符合SOD1-相關神經退化性疾病的至少一診斷標準之個體之SOD1-相關神經退化性疾病的進展SOD1-相關。
在一實施態樣中，該個體係人類。
在一實施態樣中，該個體已被診斷出患有與SOD1-相關的神經退化性疾病。
在一實施態樣中，該SOD1-相關的神經退化性疾病選自下述所成群組：萎縮側索硬化症(ALS)、阿滋海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)所組成。
在一實施態樣中，該dsRNA劑藉由鞘內或腦室內給藥於個體。
在一方面，本揭露提供用於抑制過氧化物歧化酶1(SOD1)基因表現的雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中，該RNAi劑包含正義股及反義股，其中反義股包括互補區域，該互補區域包含與表2至7、12、13及18至20中任一反義股序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個差異差異。在部分實施例中，反義股包含互補區，該互補區域包含與表2至7、12、13及18至20中所列之任一反義股序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)之至少19個連續核苷酸，例如，19、20、21、22或23個差異差異。在部分實施例中，反義股包含互補區，該互補區域包含表2至7、12、13及18至20中所列之任一反義股序列之至少19個連續核苷酸，例如，19、20、21、22或23個，其為。在某些實施例中，比對(比較)序列之間的胸腺嘧啶對尿嘧啶(thymine-to- uracil)或尿嘧啶對胸腺嘧啶(uracil-to-thymine)的差異不計為比對(比較)序列之間不同的核苷酸。
在一些實施態樣中，該正義股或反義股接合一個或多個親脂部分。
在一些實施態樣中，該劑包括接合至一個或多個內部核苷酸位置的一個或多個親脂部分，視需要地藉由接頭(linker)或載體(carrier)綴合。
在其他實施態樣中，該劑復包含靶向肝組織之標靶配體，例如一個或多個GalNAc衍生物，視需要地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。
在又其他實施態樣中，該劑復包含接合一或多個內部核甘酸位置的一個或多個親脂性部分，視需要地藉由接頭或載體，以及包含靶向肝組織之標靶配體，例如一個或多個GalNAc衍生物，視需要地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。
本揭露的另一方面提供了用於抑制過氧化物歧化酶1(SOD1)基因表現的雙股RNAi劑(dsRNA)，其中該dsRNA劑包括正義股及反義股，其中該正義股包括與表2至7、12、13及18至20中任一正義股序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個；其中該反義股包括與表2至7、12、13及18至20中呈現的任一反義股序列差異不超過3個核苷酸，例如，差異3、2、或1個核苷酸之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個。在一些實施態樣 中，該正義股包括表2至7、12、13及18至20中呈現的任一正義股序列之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20、或21個；其中該反義股包括表2至7、12、13及18至20中呈現的任一反義股序列之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20、21、22或23個。在某些實施態樣中，該正義股包括表2至7、12、13及18至20中呈現的任一正義股序列之至少19個連續核苷酸，例如，19、20、或21個；其中該反義股包括表2至7、12、13及18至20中呈現的任一反義股序列之至少19個連續核苷酸，例如，19、20、21、22或23個。
在一些實施態樣中，該劑包括接合至一個或多個內部核苷酸位置的一個或多個親脂部分，視需要地藉由接頭或載體。
在其他實施態樣中，該劑復包含靶向肝臟組織之標靶配體，例如，一個或多個GalNAc衍生物，視需要地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。
在又其他實施態樣中，該劑復包含接合至一個或多個內部核苷酸位置的一個或多個親脂性部分，視需要地藉由接頭或載體及包含靶向肝臟組織之標靶配體，例如一個或多個GalNAc衍生物，視需要地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。
本揭露的另一方面提供了用於抑制過氧化物歧化酶1(SOD1)基因表現的雙股RNAi劑，其中該dsRNA劑包括正義股及反義股，其中該正義股包括至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NOs：1、3、5、7或9中任一核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)，或核苷酸序列對於SEQ ID NO：1、3、5、7或9中任一完整核苷酸 序列具有至少90%核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性，，其中尿嘧啶取代SEQ ID NO：1、3、5、7或9的任何胸腺嘧啶(當比較對比的序列)不計為導致與SEQ ID NO：1、3、5、7或9的任何一個核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)的差異，或核苷酸序列對於SEQ ID NO：1、3、5、7或9中任一完整核苷酸序列，具有至少90%核苷酸序列一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性；以及其中，該該反義股包括至少15個連續核苷酸，其與SEQ ID NOs：2、4、6、8或10中任一核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)，或核苷酸序列對於SEQ ID NOs：2、4、6、8或10中任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列同一性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性，，其中尿嘧啶取代SEQ ID NO：2、4、6、8或10的任何胸腺嘧啶(當比較對比的序列)不計為導致與SEQ ID NO：2、4、6、8或10的任何一個核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)的差異，或核苷酸序列對於SEQ ID Nos：2、4、6、8或10中任一完整核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%同一性，其中正義股及反義股之至少一者包括接合至一個或多個內部核苷酸位置的一個或多個親脂部分，視需要地選擇藉由接頭或載體。
在一實施態樣中，靶向SOD1的雙股RNAi劑包含正義股，該正義股包含與表2至7、12、13及18至20中雙鏈體正義股核苷酸序列 的核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20或21個。
在一實施態樣中，靶向SOD1的雙股RNAi劑包含反義股，該反義股包含與表2至7、12、13及18至20中所列之任一雙鏈體反義股序列差異不超過3個核苷酸(例如，差異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個連續核苷酸，例如，15、16、17、18、19、20或21個，其。
在一些實施態樣中，該劑復包含靶向肝臟組織的靶向配體，例如一個或多個GalNAc衍生物，視需要選擇地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。
視需要地，雙股RNAi劑包括至少一個修飾的核苷酸。
在某些實施態樣中，藉由logKow測量之親脂部分的親脂性超過0。
在一些實施態樣中，藉由雙股RNAi劑的血漿蛋白結合檢測中的未結合分液所測量的雙股RNAi劑的疏水性超過0.2。在相關實施態樣中，血漿蛋白結合檢測係使用人血清白蛋白的電泳遷移檢測。
在某些實施態樣中，正義股的實質上所有核甘酸都係修飾的核苷酸。視需要地，正義股的所有核苷酸都係修飾的核苷酸。
在一些實施態樣中，反義股的實質上所有核苷酸都係修飾的核苷酸。視需要地，反義股的所有核苷酸都係修飾的核苷酸。
視需要地，正義股的所有核苷酸及反義股的所有核苷酸都係修飾的核苷酸。
在一實施態樣中，至少一修飾的核苷酸係去氧核苷酸、3'-末端去氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧修飾核苷酸、鎖核苷酸、未鎖核苷酸、構型受限的核苷酸、受限的乙基核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、2'-C-烷基修飾的核苷酸、2'-羥基-修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾的核苷酸、2'-O-烷基修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含非天然鹼基的核苷酸、四氫吡喃修飾的核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基團的核苷酸、包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物的核苷酸、包含膦酸乙烯酯的核苷酸、包含腺苷的核苷酸-乙二醇核酸(GNA)，一種核苷酸包含胸苷-乙二醇核酸(GNA)S-異構物、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸的核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'磷酸的核苷酸、包含2'-去氧鳥苷-3'-磷酸的核苷酸、末端核苷酸連接膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團。
在相關的實施態樣中，該修飾的核苷酸係2'-去氧-2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧修飾核苷酸、3'-末端去氧胸苷核苷酸(dT)、鎖核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基修飾核苷酸，2'-烷基修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯或包含非天然鹼基的核苷酸。
在一實施態樣中，修飾的核苷酸包括3’-末端去氧胸苷核苷酸(dT)的短序列。
在另一實施態樣中，該核苷酸的修飾係2'-O-甲基、2'氟及GNA修飾。
在一另外實施態樣中，該雙股RNAi劑包括至少一硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。視需要地，雙股RNAi劑包括6至8個(例如，6、7或8個)硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。
在某些實施態樣中，互補區域的長度係至少為17個核苷酸。視需要地，互補區域的長度為19至23個核苷酸。視需要地，互補區的長度為19個核苷酸。
在一實施態樣中，每一股的長度不超過30個核苷酸。
在另外的實施態樣中，至少一股包括至少1個核苷酸的3'突出。視需要地，至少一股包括至少2個核苷酸的3'突出。
在某些實施態樣中，雙股RNAi劑復包括親脂性配體，例如C16配體，經由單價或支鏈二價或三價接頭接合正義股的3'端。在某些實施態樣中，雙股RNAi劑復包括親脂性配體，例如C16配體，例如經由單價或支鏈二價或三價接頭接合內部核苷酸位置。
在某些實施態樣中，該配體係C16配體。在一實施態樣中，該配體接合正義股或反義股中的核苷酸或修飾核苷酸的2'-位。例如，C16配體可接合如以下結構：
Figure 111105127-A0202-12-0037-1
其中*表示表示與相鄰核苷酸的鍵，以及B係核鹼基或核鹼基類似物，視需要地其中B係腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在另一實施態樣中，該劑復包含靶向肝臟組織的靶向配體，例如一個或多個GalNAc衍生物，視需要地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。在某些實施態樣中，表3、5、7、13及18至20中任一修飾股接合於靶向肝臟組織之標靶配體。在某些實施態樣中，標靶配體係L96配體，例如一個或多個GalNAc衍生物，視需要地藉由接頭或載體接合至雙股RNAi劑。在某些實施態樣中，L96配體綴合至一股之端。在某些實施態樣中，L96配體接合至正義股的3'端。
在又其他實施態樣中，該劑復包含親脂性配體，例如C16配體，接合內部核苷酸位置，經由單價或支鏈二價或三價接頭，以及靶向肝臟組織之標靶配體，例如，一個或多個GNAc衍生物經由單價或支鏈二價或三價接頭接合正義股的3’端。
在又其他實施態樣中，該劑復包含親脂性配體，例如C16配體，經由單價或支鏈二價或三價接頭接合正義股的3’端，以及靶向肝臟組織之標靶配體，例如，一個或多個GNAc衍生物經由單價或支鏈二價或三價接頭接合正義股的3’端。
在另一實施態樣中，與SOD1互補的區域包括表2至7、12、13及18至20之任一者之任一反義序列。
在另外實施態樣中，與SOD1互補的區域係表2至7、12、13及18至20之任一者之任一反義序列者。在一些實施態樣中，內部核苷酸位置包括除了距離股之各端的末端兩個位置之外的所有位置。
在一相關實施態樣中，內部位置包括從股的各端的末端三個位置之外的所有位置。視需要地，內部位置不包括正義股的裂解位點區域。
在一些實施態樣中，從正義股的5'端起算，內部位置不包括位置9至12。在某些實施態樣中，正義股長度為21個核苷酸。
在其他實施態樣中，從正義股的3'端起算，內部位置不包括位置11至13。視需要地，內部位置不包括反義股的裂解位點區域。在某些實施態樣案中，正義股長度為21個核苷酸。
在一些實施態樣中，從反義股的5'端起算，內部位置不包括位置12至14。在某些實施態樣中，反義股長度為23個核苷酸。
在另一實施態樣中，內部位置不包括從3'端起算正義股的位置11至13，以及從5'端起算反義股的位置12至14。在某些實施態樣中，正義股的長度為21個核苷酸及反義股的長度為23個核苷酸。
在另外實施態樣中，起一個或多個親脂部分接合以下內部位置中的一個或多個：正義股的位置4至8及13至18，以及反義股的位置6至10及15至18，從各股的5’-端起算。視需要地，一個或多個親脂部分接合以下內部位置中的一個或多個：正義股的位置5、6、7、15及17，以及反義股上的位置15及17，從各股的5'端起算。在某些實施態樣中，正義股的長度為21個核苷酸，反義股的長度為23個核苷酸。
在某些實施態樣中，親脂部分係脂肪族、脂環族或多脂環族化合物。任選地，親脂性部分係脂質、膽固醇、視黃酸、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己醇、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1、3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉荳蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩惡嗪。
在一些實施態樣中，該親脂部分含有飽和或不飽和的C4至C30烴鏈及視需要的官能基團，其選自羥基、胺、羧酸、磺酸鹽、磷酸鹽、硫醇、疊氮化物或炔烴。
在某些實施態樣中，該親脂部分含有飽和或不飽和的C6至C18烴鏈。視需要地，親脂部分包含飽和或不飽和的C16烴鏈。在一相關的實施態樣中，親脂性部分藉由載體接合，該載體替換內部位置的一個或多個核苷酸。在某些實施實施態樣中，該載體係環狀基團，其為吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊基、噁唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠嗪壬基、或十氫萘；或者係根據絲胺醇骨架或二乙醇胺骨架的無環部分。
在一些實施態樣中，該親脂部分藉由接頭與雙股RNAi劑接合，該接頭含有醚、硫醚、脲、碳酸酯、胺、醯胺、馬來醯亞胺-硫醚、二硫化物、磷酸二酯、磺醯胺鏈結、鍵擊反應產物或胺基甲酸酯。
在一實施態樣中，該親脂部分接合於核鹼基、糖部分或核苷間鏈結。
在另一實施態樣中，雙股RNAi劑復包括位於反義股5'端的磷酸酯或磷酸酯模擬物。視需要地，磷酸酯模擬物係5'-乙烯基膦酸酯(VP)。當磷酸酯模擬物係5'-乙烯基膦酸酯(VP)時，5'-末端核苷酸可能具有以下結構，
Figure 111105127-A0202-12-0041-2
其中，X係O或S；
R係氫、羥基、氟或C1至20烷氧基(例如甲氧基或正十六烷氧基)；
R5’係=C(H)-P(O)(OH)2及在E或Z方向之C5'碳及R5'之間的雙鍵(例如，E方向)；及
B係核鹼基或修飾的核鹼基，其中該B係腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在某些實施態樣中，該雙股RNAi劑復包括靶向受體的標靶配體，該受體媒介到CNS組織的運送，例如，親水性配體。在某些實施態樣中，該靶配體係C16配體。
在一些實施態樣中，該雙股RNAi劑復包括靶向腦組織的標靶配體，例如，紋狀體。
在一些實施態樣中，該雙股RNAi劑復包括靶向肝臟組織或細胞類型的標靶配體，例如，肝細胞。
在一實施態樣中，親脂性部分或標靶配體藉由生物可裂解(bio-clevable)接頭接合，該接頭係DNA、RNA、雙硫鍵、醯胺、半乳糖胺、葡糖胺、葡萄糖、半乳糖、甘露糖的官能化單糖或寡糖、或其組合。
在一相關的實施態樣中，正義股的3'末端藉由端帽(end cap)保護，該端帽係具有胺的環狀基團，環狀基團係吡咯烷基、吡唑啉基、吡 唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1,3]二氧雜環戊基、噁唑烷基，異噁唑烷基、嗎啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠嗪壬基、四氫呋喃基或十氫萘基。
在一實施態樣中，該RNAi劑包括至少一修飾的核苷酸，該至少一修飾的核苷酸係2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、包括二醇核酸(GNA)的核苷酸或包括乙烯基膦酸酯的核苷酸。視需要地，該RNAi劑包括以下修飾各者中之至少一種：2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、包含二醇核酸(GNA)的核苷酸及包含膦酸乙烯酯的核苷酸。
在另一實施態樣中，該RNAi劑包括修飾核苷酸的模式，如表2至7、12、13及18至20中所提供，其中2'-C16、2'-O-甲基、GNA、硫代磷酸酯及2'-氟的位置修飾，與所展示的RNAi劑的個別核苷酸鹼基序列無關。
本公開的另一方面提供了用於抑制SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包括與反義股互補的正義股，其中該反義股包括與編碼SOD1的mRNA的部分互補的區域，其中每股長約14至約30個核苷酸，其中雙股RNAi劑由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p'、q及q'各自獨立地為0-6；
每一Na及Na'獨立地代表寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列包括0至25個修飾或未修飾的核苷酸或其組合，每一序列包括至少兩個不同修飾的核苷酸；
每一Nb及Nb'獨立地代表寡核苷酸序列，該寡核苷酸序列包括0-10個修飾或未修飾或其組合的核苷酸；
np、np'、nq及nq'中的每一個可能存在或可能不存在，獨立地代表突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸的三個相同修飾的模體；
Nb的修飾不同於對Y的修飾，Nb'的修飾不同於Y'的修飾；及
其中，正義股接合於至少一配體。
在一實施態樣中，i係0；j係0；i係1；j係1；i及j都係0；或者i及j都係1。
在另一實施態樣中，k係0；l係0；k係1；l係1；k及l都係0；或者k及l都係1。
在某些實施態樣中，XXX與X'X'X'互補，YYY與Y'Y'Y'互補，ZZZ與Z'Z'Z'互補。
在另一實施態樣中，YYY模體出現在正義股的裂解位點處或附近。
在另外實施態樣中，Y'Y'Y'模體出現在正義股5'端起的位置11、12及13。視需要地，Y'係2'-O-甲基。
在一些實施態樣中，式(III)由式(IIIa)表示：
正義：5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反義：3' np' -Na'-Y'Y'Y'-Na' -nq' 5' (IIIa)。
在另外實施態樣中，式(III)由式(IIIb)表示：
正義：5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反義：3' np' -Na' -Y'Y'Y'-Nb' -Z'Z'Z'-Na' -nq' 5' (IIIb)
其中，每一Nb及Nb'獨立地代表包括1至5個修飾核苷酸的寡核苷酸列。
在一另外實施態樣中，式(III)由式(IIIc)表示：
正義：5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
反義：3' np' -Na' -X'X'X'-Nb' -Y'Y'Y'-Na' -nq' 5' (IIIc)
其中，每一Nb及Nb'獨立地代表包括1至5個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
在部分實施態樣中，式(III)由式(IIId)表示：
正義：5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
反義：3' np' -Na' -X'X'X'-Nb' -Y'Y'Y'-Nb' -Z'Z'Z'-Na' -nq' 5' (IIId)
其中，每一Nb及Nb'獨立地代表包括1至5個修飾核苷酸的寡核苷酸序列及每個Na及Na'獨立地代表包括2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
在另一實施態樣中，雙股區的長度為15至30個核苷酸對。視需要地，雙股區的長度為17至23個核苷酸對。
在某些實施態樣中，雙股區的長度為17至25個核苷酸對。視需要地，雙股區的長度為23至27個核苷酸對。
在一些實施態樣中，雙股區的長度為19至21個核苷酸對。視需要地雙股區的長度為21至23個核苷酸對。
在某些實施態樣中，每一股獨立地具有15至30個核苷酸。視需要地，每一股獨立地具有19至30個核苷酸。視需要地，每一股獨立地具有19至23個核苷酸。
在某些實施態樣中，雙股區的長度為19至21個核苷酸對並且每一股具有19至23個核苷酸。
在另一實施態樣中，RNAi劑之核苷酸上的修飾係LNA、二醇核酸(GNA)、己糖醇核酸(HNA)、環己烯核酸(CeNA)、2’-甲氧基乙基、2’-O-烷基，2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基、2’-氟、2’-去氧或2'-羥基及其組合。視需要地，核苷酸的修飾包括2'-O-甲基、2'-氟或GNA，及其組合。在相關實施態樣中，該核苷酸的修飾係2’-O-甲基或2’-氟修飾。
在一實施態樣中，RNAi劑包括配體，該配體係或包括一個或多個經由二價或三價支股接頭連接的親脂性部分，例如C16。
在其他實施態樣中，該劑復包含靶向肝臟組織的標靶配體，例如一個或多個GalNAc衍生物。
在其他實施態樣中，該劑復包含經由單價或支鏈二價或三價接頭接合正義股的3'端的親脂性配體，例如C16配體，及靶向肝臟組織之標靶配體，例如，一個或多個GalNAc衍生物經由單價或支股二價或三價接頭接合正義股的3'端。
在某些實施態樣中，配體附接到正義股的3’端。
在一些實施態樣中，RNAi劑復包括至少一硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。在相關實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的3'-末端。視需要地，該股係反義股。在另一個實施態樣中，該股係正義股。在相關的實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦 酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的5'末端。視需要地，該股係反義股。在另一實施態樣中，該股係正義股。
在另一實施態樣中，該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結係位於一股的5'-及3'-末端。視需要地，該股係反義股。在另一實施態樣中，該股係正義股。
在另外的實施態樣中，在該RNAi劑雙鏈體的反義股之5’-末端的1位的鹼基對為A：U鹼基對。
在某些實施態樣中，Y核苷酸含有2’-氟之修飾。
在一些實施態樣中，Y核苷酸含有2’-O-甲基之修飾。
在某些實施態樣中，p'>0。視需要地，p'=2。
在一些實施態樣中，q'=0、p=0、q=0及p'突出核苷酸與標靶mRNA互補。
在某些實施態樣中，q'=0、p=0、q=0及p'突出核苷酸與標靶mRNA不互補。
在一實施態樣中，RNAi劑的正義股有總共21個核苷酸及反義股有總共23個核苷酸。
在另一實施態樣中，至少一np'藉由該硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接。視需要地，所有np'藉由該硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接。
在某些實施態樣中，本公開的SOD1 RNAi劑係表2至7、12、13及18至20中列出的其中之一。在一些實施態樣中，正義股的所有核苷酸及反義股的所有核苷酸都包括修飾。
本揭露的另一方面提供了用於抑制細胞中SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包括與與反義股互補的正義股，其中 該反義股包括與編碼SOD1的mRNA的一部分互補的區域，其中每一股長度約14至約30個核苷酸，其中雙股RNAi劑由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p'、q及q'各自獨立地為0至6；
每一Na及Na'獨立地代表包括0至25個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列，每一序列包括至少兩個不同修飾的核苷酸；
每一Nb及Nb'獨立地代表包括0至10個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列；
每一np、np'、nq及nq'中的每一個可存在或可不存在，獨立地代表突出核苷酸；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸之三個相同修飾的一個模體，其中該修飾係2’-O-甲基或2’-氟修飾；
在Nb的修飾不同於在Y的修飾，在Nb'的修飾不同於在Y'的修飾；及
其中正義股接合至少一種配體，視需要地其中配體係一個或多個親脂性配體，例如C16配體，或一個或多個GalNAc衍生物。
本揭露的另外一方面提供用於抑制細胞中SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包括與反義股互補的正義股，其中該 反義股包括與編碼SOD1的mRNA的一部分互補的區域，其中每一股的長度為約14至約30個核苷酸，其中雙股RNAi劑由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
每一np、nq及nq'中的各者可存在或可不存在，獨立地代表突出核苷酸；
p、q及q'各自獨立地為0至6；
np'>0且至少一np'藉由該硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接；
每一Na及Na'獨立地代表包括0至25個修飾或未修飾的核苷酸序列或其組合的核苷酸序列，該每一序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每一Nb及Nb'獨立地代表包括0至10個修飾或未修飾寡核苷酸序列或其組合的核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸的三個相同修飾的一個模體，其中該修飾係2’-O-甲基、二醇核酸(GNA)或2’-氟；
在Nb的修飾不同於在Y的修飾，在Nb'的修飾不同於在Y'的修飾；及
其中，正義股接合至少一配體接合，視需要地其中配體係一個或多個親脂性配體，例如C16，或一個或多個GalNAc衍生物。
本揭露的另一方面提供了用於抑制細胞中SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包括與與反義股互補的正義股，該反義股包括與編碼SOD1的mRNA的一部分互補(SEQ ID NO：1，或對於SEQ ID NO：1的完整核苷酸序列具有至少90%一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列)的區域，其中每一股的長度為約14至約30個核苷酸，其中雙股RNAi劑由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
每一np、nq及nq'中的各者可存在或可不存在，獨立地代表突出核苷酸；
p、q及q'各自獨立地為0至6；
np'>0且至少一np'藉由該硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接；
每一Na及Na'獨立地代表包括0至25個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列，該每一序列包括至少兩個不同修飾的核苷酸；
每一Nb及Nb'獨立地代表包括0至10個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸的三個相同修飾的一模體，其中該修飾係2’-O-甲基或2’-氟修飾；
在Nb的修飾不同於在Y的修飾，在Nb'的修飾不同於在Y'的修飾；及
其中，正義股接合至少一配體，視需要地其中配體係一個或多個親脂性配體，例如C16，或一個或多個GalNAc衍生物。
本揭露的另外方面提供了用於抑制細胞中SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包括與與反義股互補的正義股，該反義股包括與編碼SOD1的mRNA的一部分互補(SEQ ID NO：1，或對於SEQ ID NO：1的完整核苷酸序列具有至少90%一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列)的區域，其中每一股的長度為約14至約30個核苷酸，其中雙股RNAi劑由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-(X'X'X')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(Z'Z'Z')l-Na '-nq ' 5' (III)
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
每一np、nq及nq'中的各者可存在或可不存在，獨立地代表突出核苷酸；
p、q及q'各自獨立地為0至6；
np'>0且至少一np'藉由該硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接；
每一Na及Na'獨立地代表包括0至25個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列，該每一序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每一Nb及Nb'獨立地代表包括0至10個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列；
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'、Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸的三個相同修飾的一個模體，其中該修飾係2’-O-甲基或2’-氟；
在Nb的修飾不同於在Y的修飾，在Nb'的修飾不同於在Y'的修飾；
其中，正義股包括至少一個硫代磷酸酯鏈結；及
其中，正義股接合至少一配體，視需要地其中配體係一個或多個親脂性配體，例如C16，或一個或多個GalNAc衍生物。
本揭露的另一方面提供了用於抑制細胞中SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中該雙股RNAi劑包括與與反義股互補的正義股，該反義股包括與編碼SOD1的mRNA的一部分互補(SEQ ID NO：1，或對於SEQ ID NO：1的完整核苷酸序列具有至少90%一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列)的區域，其中每一股的長度為約14至約30個核苷酸，其中雙股RNAi劑由式(III)表示：
正義：5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
反義：3' np '-Na '-Y'Y'Y'-Na '-nq ' 5' (IIIa)
其中：
每一np、nq及nq'中的各者可存在或可不存在，獨立地代表突出核苷酸；
p、q及q'各自獨立地為0至6；
np'>0且至少一np'藉由該硫代磷酸酯鏈結與相鄰核苷酸連接；
每一Na及Na'獨立地代表包括0至25個修飾或未修飾或其組合的核苷酸序列，該每一序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
YYY及Y'Y'Y'各自獨立代表三個連續核苷酸的三個相同修飾的一個模體，其中該修飾為2’-O-甲基或2’-氟；
其中，正義股包括至少一個硫代磷酸酯鏈結；及
其中，正義股接合至少一配體，視需要地其中配體係一個或多個親脂性配體，例如C16，或一個或多個GalNAc衍生物。
本揭露的另一方面提供了用於抑制SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中靶向SOD1的雙股RNAi劑包括形成雙股區域的正義股及反義股，其中該正義股包括至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20或21個，其與以下核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如差異3、2、1或0個核苷酸)：SEQ ID NO：1、3、5、7及9，或與SEQ ID NO：1、3、5、7或9完整的核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列；該反義股包括至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個，其與以下核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如差異3、2、1或0個核苷酸)，SEQ ID NO：2、4、6、8及10，或與SEQ ID NO：2、4、6、8及10完整的核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列；其中在SEQ ID NO：1至6中提供的任一核苷酸序列中，用尿嘧啶取代任何胸腺嘧啶，(當比較比對序列時)不計為導致與SEQ ID NO：1-6中提供的核苷酸序列任一序列不超過3個核苷酸的差異，其中該正義股的實質上所有核苷酸都包括修飾，該修飾係2'-O-甲基、GNA或2'-氟修飾，其中該正義股在5'-末端包括兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中該反義股的實質上 所有核苷酸都包括選自下述所成群組的修飾：2'-O-甲基修飾及2'-氟修飾，其中反義股在5'-末端包括兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結及在3'-末端的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，並且其中正義股接合至一個或多個親脂性配體，例如C16，視需要地，復包含肝臟靶向配體，例如包含一個或多個GalNAc衍生物的配體。
本揭露的另一方面提供了用於抑制SOD1基因表現的雙股RNAi劑，其中靶向SOD1的雙股RNAi劑包括形成雙股區域的正義股及反義股，其中該正義股包括至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20或21個，該正義股與以下核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如差異3、2、1或0個核苷酸)：SEQ ID NO：1、3、5、7及9，或與SEQ ID NO：1、3、5、7或9的完整的核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列；及該反義股包括至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個。該反義股與以下核苷酸序列差異不超過3個核苷酸(例如差異3、2、1或0個核苷酸)：SEQ ID NO：2、4、6、8及10，或與SEQ ID NO：2、4、6、8及10完整的核苷酸序列具有至少90%核苷酸序列一致性，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的核苷酸序列，其中在SEQ ID NO：1至10中提供的任一核苷酸序列中，用尿嘧啶取代任何胸腺嘧啶，(當比較比對序列時)不計為導致與SEQ ID NO：1-6中提供的核苷酸序列任一序列不超過3個核苷酸的差異；其中該正義股包括至少一個3'-末端去氧胸苷核苷酸(dT)，並且其中該反義股包括至少一個3'-末端去氧胸苷核苷酸(dT)。
在一實施態樣中，該正義股的所有核苷酸及反義股的所有核苷酸都係修飾的核苷酸。
在另一個實施態樣中，每一股具有19至30個核苷酸。
在某些實施態樣中，該RNAi劑的反義股在5’區域或其前驅物的前9個核苷酸位置包括雙鏈體的至少一個熱去穩定(thermally destabilizing)修飾。視需要地，雙鏈體的熱去穩定化修飾係以下一個或多個：
Figure 111105127-A0202-12-0054-3
其中，B係核鹼基。
本揭露的另一方面提供含有本公開的雙股RNAi劑的細胞。
本揭露的另外方面提供了用於抑制SOD1基因表現的醫藥組成物，其包括本揭露的雙股RNAi劑。
在一實施態樣中，該雙股RNAi劑在非緩衝溶液中給藥。視需要地，該非緩衝溶液係鹽水或水。
在另一實施態樣中，該雙股RNAi劑與緩衝溶液一起給藥。視需要地，該緩衝溶液包括乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽或其任何組合。在另一個實施態樣中，緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。
本揭露的另一方面提供了一種醫藥組成物，其包括本揭露的雙股RNAi劑及脂質製劑。
在一實施態樣中，該脂質製劑包括脂質奈米顆粒(LNP)。
本揭露的另外方面提供了抑制細胞中SOD1基因表現的方法，該方法包括：(a)使細胞與本揭露的雙股RNAi劑或本揭露的醫藥組成物接觸；(b)將步驟(a)中產生的細胞維持足夠長的時間，以獲得SOD1基因的mRNA轉錄物降解，因此抑制細胞中SOD1基因表現。
在一實施態樣中，細胞在個體內。視需要地，個體係人。
在某些實施態樣中，個體係恆河猴、食蟹猴(也稱為食蟹獼猴)、小鼠、犬或大鼠。
在某些實施態樣中，人個體患有與SOD1-相關的神經退化性疾病，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
在某些實施態樣中，該方法復涉及向個體給藥另外的治療劑或療法。示例的額外療法及治療包括例如，鎮靜劑、抗抑鬱藥、可那氮平、丙戊酸鈉、鴉片製劑、抗癲癇藥、膽鹼酯酶抑制劑、美金剛、苯二氮卓類、左旋多巴、COMT抑制劑(例如托卡彭(tolcapone)及恩他卡彭(entacapone))、多巴胺激動劑(例如溴麥角隱亭(bromocriptine)、培高利得(pergolide)、普拉克所(pramipexole)、羅品尼羅(ropinirole)、皮貝地爾(piribedil)、卡麥角林(cabergoline)、阿樸嗎啡(apomorphine)及利修利得(lisuride))、MAO-B抑制劑(例如，沙分醯胺(safinamide)、西列及林(selegiline)及拉沙及林(rasagiline))、金剛烷胺、抗膽鹼能藥、莫達菲尼 (modafinil)、吡嗎色林(pimavanserin)、多西平(doxepin)、拉沙及林、抗精神病藥、非典型抗精神病藥(例如胺磺必利(amisulpride))、奧氮平(olanzapine)、利培酮(risperidone)及氯氮平(clozapine))、利魯唑(riluzole)、依達拉奉(edaravone)、深部腦刺激、非侵入性通氣(NIV)、侵入性通氣物理治療、職能治療、言語治療、飲食改變及吞嚥技術餵管、PEG管、益生菌及心理治療。
在某些實施態樣中，該雙股RNAi劑以約0.01mg/kg至約50mg/kg的劑量給藥。
在一些實施態樣中，該雙股RNAi劑藉由鞘內給藥於個體。
在一實施態樣中，該方法降低腦(例如紋狀體)或脊柱組織中SOD1基因的表現。視需要地，該腦或脊柱組織係紋狀體、額葉皮層、顳葉皮層、小腦、海馬、頸椎、腰椎或胸椎。
在一實施態樣中，該方法降低了眼睛(有或沒有晶狀體)、心臟、腎臟、肝臟、肺及/或肌肉組織或細胞中SOD1基因的表現。
在一些實施態樣中，該雙股RNAi劑皮下給藥於個體。
在一些實施態樣中，該雙股RNAi劑藉由腦室內給藥於個體。
在一些實施態樣中，該雙股RNAi劑鞘內給藥於個體。
在一實施態樣中，該方法降低肝臟中SOD1基因的表現。
在其他實施態樣中，該方法降低肝臟及腦中SOD1基因的表現。
本揭露的另一方面提供了抑制個體中SOD1表現的方法，該方法包括：向個體給藥本揭露的雙股RNAi劑或本揭露的醫藥組成物的治療有效量，因此抑制SOD1在個體中的表現。
本揭露的另一方面提供了用於治療或預防個體的病症或SOD1-相關的神經退化性疾病或病症的方法，該方法包括向個體給藥本揭露的雙股RNAi劑或本揭露的醫藥組成物的治療有效量，因此治療或預防個體的SOD1-相關的神經退化性疾病或病症。
在某些實施態樣中，SOD1-相關的神經退化性疾病或病症選自由肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)所組成群組。
本揭露的另一方面提供了用於實施本揭露方法的套組，該套組包括：a)本揭露的雙股RNAi劑，及b)使用說明，及c)視需要地，用於給藥雙股RNAi劑在個體的裝置。
本揭露的另一方面提供了用於抑制SOD1基因表現的雙股核糖核酸(RNAi)劑，其中該RNAi劑具有正義股及反義股，並且其中該反義股包括互補性區域，該互補性區域包括與來自表2至7、12、13及18至20的任一反義股核鹼序列差異不超過3個核苷酸(即差異3、2、1或0個核苷酸)之至少15個連續核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個，例如，至少15個，例如15、16、17、18、19、20、21、22或23個核苷酸(即，差異3、2、1或0個核苷酸)，至少19個，例如19、20、21、22或23個核苷酸(即，差異3、2、1或0個核苷酸)。在一實施態樣中，RNAi劑包括一個或多個以下修飾：2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修 飾的核苷酸、2'-C-烷基修飾的核苷酸、包含二醇的核苷酸核酸(GNA)、硫代磷酸酯(PS)及乙烯基膦酸酯(VP)。視需要地，RNAi劑包括以下修飾中的至少一種：2'-O-甲基修飾的核苷酸、2'-氟修飾的核苷酸、2'-C-烷基修飾的核苷酸、包含二醇的核苷酸核酸(GNA)、硫代磷酸酯及乙烯基膦酸酯(VP)。
在另一實施態樣中，該RNAi劑包括四個或更多個PS修飾，視需要的六至十個PS修飾，視需要的八個PS修飾。
在另外的實施態樣中，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股都具有5'-末端及3'-末端，且該RNAi劑包括八個PS修飾，其位於RNAi劑的每一正義股及反義股各自的3'及5'末端的倒數第二個及最後一個核苷酸間鏈結。
在另一實施態樣中，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股包括5'-末端及3'-末端，並且RNAi劑僅包括一個包括GNA的核苷酸。視需要地，包括GNA的核苷酸位於反義股之從反義股的5'-末端的第七個核鹼基殘基。
在另外的實施態樣中，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股包括5'-末端及3'-末端，並且RNAi劑包括一到四個2'-C-烷基修飾的核苷酸。視需要地，該2'-C-烷基修飾的核苷酸係2'-C16-修飾的核苷酸。視需要地，RNAi劑包括單個2'-C-烷基，例如C16-修飾的核苷酸。視需要地，該單個2'-C-烷基，例如，C16-修飾的核苷酸位於正義股之從正義股的5'-末端的第六個核鹼基位置。
在另一實施態樣中，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股包括5'-末端及3'-末端，並且RNAi劑包括兩個或更多個2'-氟修飾的核苷酸。視需要地，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股包括包括兩個或更多個2'-氟修飾的核苷酸。視需要地，該2'-氟修飾的核苷酸位於正義股之從正義股的5'-末端的核鹼基位置7、9、10及11以及反義股之從反義股的5'-末端的核鹼基位置2、14及16。
在另外的實施態樣中，，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股包括5'-末端及3'-末端，並且RNAi劑包括一個或多個VP修飾。視需要地該RNAi劑在反義股的5'末端包括單一VP修飾。
在另一實施態樣中，該RNAi劑的每一正義股及每一反義股包括5'-末端及3'-末端，並且RNAi劑包括兩個或更多個2'-O-甲基修飾的核苷酸。視需要地，該RNAi劑在未被2'-氟、2'-C-烷基或二醇核酸(GNA)修飾的所有核鹼基位置包括2'-O-甲基修飾的核苷酸。視需要地，兩個或更多個2'-O-甲基修飾核苷酸位於正義股之從正義股的5'末端開始位置1、2、3、4、5、8、12、13、14、15、16、17、18、19，20及21，在反義股之從反義股的5'-末端開始位置1、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、15、17、18、19、20、21、22及23。
在另一實施態樣中，該RNAi劑係其藥學上可接受的鹽。本文中每種RNAi劑的「藥學上可接受的鹽」包括但不限於鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鉀鹽、銨鹽、鎂鹽、其混合物。所屬技術領域中具有通常知識者將理解，當提供作為聚陽離子鹽時，該RNAi劑在視需要修飾的磷酸二酯骨架的每一游離酸基及/或任何其他酸性修飾(例如，5'-末端膦酸酯基團)中具有 一陽離子。例如，長度為「n」個核苷酸的寡核苷酸包含n-1個視需要修飾的磷酸酯，因此長度為21nt的寡核苷酸可以作為提供具有多達20個陽離子(例如，20個鈉陽離子)的鹽。類似地，具有長度為21nt的正義股及長度為23nt的反義股的RNAi劑可以作為提供具有多達42個陽離子(例如，42個鈉陽離子)的鹽。在前述實例中，當該RNAi劑也包括5'-末端磷酸酯或5'-末端乙烯基膦酸酯基團時，RNAi劑可以作為提供具有多達44個陽離子(例如，44個鈉陽離子)的鹽。
在另一實施態樣中，提供了反義寡核苷酸，其係列於表3、5、7、13、18及20任一者的任一反義核苷酸序列，但缺少3'-末端核苷酸(3'N-1 AS)，或其藥學上可接受的鹽(參見例如圖5)。在另一實施態樣中，提供了包含反義股的dsRNA雙鏈體，該反義股具有核苷酸序列係列於表3、5、7、13、18及20任一者的任一反義核苷酸序列，但缺少3'-末端核苷酸(3'N-1 AS)，以及與該反義寡核苷酸實質上互補的正義股，或其藥學上可接受的鹽。在另一實施態樣中，提供了dsRNA雙鏈體，其包含列於表3、5、7、13、18或20任一者的任一雙鏈體，其中反義核苷酸序列被缺少3'-末端核苷酸(3'N-1 AS)的反義寡核苷酸序列取代’，或其藥學上可接受的鹽。
在一實施態樣中，提供了反義寡核苷酸，其具有SEQ ID NO.1369至1378(參見表23)中任一核苷酸序列，或其藥學上可接受的鹽。在一實施態樣中，提供了反義寡核苷酸，其具有SEQ ID NO.1369的核苷酸序列，或其藥學上可接受的鹽。在一實施態樣中，提供了反義寡核苷酸，其具有SEQ ID NO.1370的核苷酸序列，或其藥學上可接受的鹽。在一實 施態樣中，提供了反義寡核苷酸，其具有SEQ ID NO.1371的核苷酸序列，或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施態樣中，提供了包含反義股的dsRNA雙鏈體，該反義股具有SEQ ID NO.1369的核苷酸序列，以及與反義寡核苷酸實質上互補的正義股，或其藥學上可接受的鹽。在另一實施態樣中，提供了包含反義股的dsRNA雙鏈體，該反義股具有SEQ ID NO.1370的核苷酸序列，以及與反義寡核苷酸實質上互補的正義股，或其藥學上可接受的鹽。在另一實施態樣中，提供了包含反義股的dsRNA雙鏈體，該反義股具有SEQ ID NO.1371的核苷酸序列，以及與反義寡核苷酸實質上互補的正義股，或其藥學上可接受的鹽。
在另一實施態樣中，提供了dsRNA雙鏈體，其包含具有SEQ ID NO.1369的核苷酸序列的反義股，以及具有SEQ ID NO.11序列的正義股、或其藥學上可接受的鹽。在另一實施態樣中，提供了dsRNA雙鏈體，其包含具有SEQ ID NO.1370的核苷酸序列的反義股，以及具有SEQ ID NO.1371的核苷酸序列的正義股，或其藥學上可接受的鹽。在另一實施態樣中，提供了dsRNA雙鏈體，其包含具有SEQ ID NO.1371的核苷酸序列的反義股，以及具有SEQ ID NO.15的核苷酸序列的正義股，或其藥學上可接受的鹽。
本發明藉由以下詳細敘述及圖式進一步說明。
圖1係表示接受皮下單次給藥3mg/kg劑量之指定的dsRNA雙鏈體之小鼠的人類SOD1 mRNA濃度圖。人類SOD1 mRNA濃度以相對於用PBS處理檢測到的濃度顯示。
圖2係表示小鼠接受單次25μg、50μg、100μg、150μg、200μg或300μg劑量之AD-401824或人工腦脊隨液(aCSF)的腦室注射(ICV)後，大腦及脊髓指定區域的人類SOD1 mRNA濃度圖。
圖3A係表示在用藥後第14天，單次50nM、10nM、1nM或0.1nM劑量指定的雙鏈體對BE(2)c細胞中hSOD1 mRNA表現的效果圖。
圖3B係表示在用藥後第14天，單次0.9mg、鞘內給藥劑量的指定雙鏈體對G93A大鼠腰、胸和頸脊髓區域hSOD1 mRNA表現的效果圖。
圖4A係表示在給藥大鼠單劑量指定的雙鏈體後，在頸、胸或腰脊髓中該雙鏈體濃度圖。
圖4B係表示其表示在給藥大鼠單劑量定的雙鏈體後，在大腦皮層或腦幹中該雙鏈體濃度圖。
圖4C係表示在給藥大鼠單劑量指定的雙鏈體後，在頸、胸或腰脊髓中該雙鏈體保留時間表。
圖5係表示在給藥大鼠單劑量指定的雙鏈體後，大腦皮質及腰脊髓中的代謝物分析表。圖5按出現順序分別呈現了SEQ ID NOS 1366、1366、1366、1366-1367、1367、1367至1368及1368。
圖6係表示雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731的組織接觸及代謝物分析的總結表。
圖7係表示研究操作評估了本發明雙鏈體對非人類靈長類中SOD1 mRNA及蛋白質表現的效果表。
圖8A係表示對於非人類靈長類之單次70mg鞘內給藥劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731，被分類為“不良接觸”(24小時CSF樣本中的雙鏈體濃度<1,000ng/mL)、“良好接觸”(24小時CSF樣本中的雙鏈體濃度>3,000ng/mL)，或“部分接觸”(24小時CSF樣本中的雙鏈體濃度1,000至3,000ng/mL)的數量表。
圖8B係表示非人靈長類接受鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在用藥後第31天及第85天，個體腰脊髓(L3)、胸脊髓(T1-T5)、頸脊髓(C7)、額葉皮層(FC)、腦幹(BS)或橋腦樣本中SOD1 mRNA濃度圖。
圖8C係表示非人靈長類接受鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在用藥後第85天，個體腰脊髓(L3)、胸脊髓(T1-T5)、頸脊髓(C7)、額葉皮層(FC)、腦幹(BS)或腦橋樣本中SOD1 mRNA的濃度圖。圖8C按出現順序分別呈現了SEQ ID NOS 1281、1284、71及1366至1368。
圖9A係表示非人靈長類接受鞘內給予單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在用藥後第0、8、14、29、57及85天，個體CSF樣品中的SOD1蛋白質濃度圖。
圖9A係表示非人靈長類接受鞘內給予單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在用藥後第0、8、14、29、57及85天，個體CSF樣品中的SOD1蛋白質濃度。
圖9B係表示非人靈長類接受鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在用藥後第85天(上圖)，個體CSF樣本中的SOD1蛋白質濃度圖；及接受鞘內注射單次70mg劑量的本發明雙鏈體後，在用藥後第85天延長至第141天，三個體的CSF樣本中的SOD1蛋白質濃度圖。
圖9C係表示非人靈長類接受鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在用藥後第85天，個體前額葉、胸脊髓(T9-12)及CSF樣品中的SOD1蛋白質濃度圖。
圖10係表示鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在前額葉皮層樣本及胸脊髓(T9-12)樣本中，觀察到減少的mRNA濃度及減少的的蛋白質濃度減低相關於NHP為高度且顯著相關的圖。
圖11A係表示鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在前額葉、腦幹、腦橋、頸脊髓(SC_C5-C6)、頸脊髓(SC_C7)、胸脊髓(SC_T1-T5)、胸脊髓(SC_T9-T12)及腰脊髓及臍帶(SC_L3)組織中，剩餘mRNA相對於siRNA暴露的圖。
圖11B係表示鞘內給藥單次70mg劑量指定的雙鏈體後，在前額葉皮層及胸脊髓(SC_T0-T12)樣本中，mRNA及蛋白質減少對於siRNA接觸量之間存在很強的相關性圖。
圖12A至12H係堆疊條形圖，其表示PCH或Be(2)C細胞中表14及15的每一雙鏈體的體外SOD1敲弱，如映射到NM_000454.4， 從位置199至225開始之具有標靶序列的雙鏈體(圖12A，PCH；圖12B，Be(2)C)；位置319至337(圖12C，PCH；圖12D，Be(2)C)；位置364-382(圖12E，PCH；圖12F，Be(2)C)；及位置516-540(圖12G，PCH；圖12H，Be(2)C)。
圖13係表示藉由鞘內給藥後第31天及第85天，在NHP的腎臟及肝臟中，指定的dsRNA劑的藥物動力學效果實質上不存在的圖。
本揭露提供了RNAi組成物，其影響RNA誘導之沉默複合物(RISC)媒介之SOD1基因RNA轉錄物的裂解。該SOD1基因可以在細胞內，例如個體，例如人類。本揭露還提供了方法，其使用本揭露的RNAi組成物來抑制SOD1基因表現或用於治療患有疾病個體，因而從抑制或降低SOD1基因表現中受益，例如SOD1-相關神經退化性疾病，例如，肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
本揭露的RNAi劑包括具有長度約30個核苷酸或更短區域的RNA股(反義股)，例如長度為15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、 21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23、或21至22個核苷酸，該區域實質上互補於SOD1基因的mRNA轉錄物的至少一部分。在某些實施態樣中，本揭露的RNAi劑包括RNA股(反義股)，其具有長度為約21至23個核苷酸的區域，該區域與實質上互補於SOD1基因的mRNA轉錄物的至少一部分。
在某些實施態樣中，本揭露的RNAi劑包括RNA股(反義股)，其可以包括更長的長度，例如多達66個核苷酸，例如36至66、26至36、25至36、31至60、22至43、27至53個，其中具有至少19個連續核苷酸的區域，該區域與實質上互補於SOD1基因的mRNA轉錄物的至少一部分。這些具有較長反義股的RNAi劑適合包括長度為20至60個核苷酸的第二條RNA股(正義股)，其中該正義股及反義股形成18至30個連續核苷酸的雙鏈體。
這些RNAi劑的使用在哺乳動物中，可使SOD1基因的mRNA把標降解。因此，包括這些RNAi劑的方法及組成物，可用於治療個體，該個體將受益於SOD1蛋白質濃度或活性降低，例如患有SOD1-相關神經退化性疾病，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)的個體)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
以下詳細描述揭露如何製備及使用含有RNAi劑的組成物來抑制SOD1基因表現，以及用於治療患者的組成物及方法，該患者將從抑制或減少基因表現中受益。
I.定義
為了可以更容易地理解本揭露，首先定義某些術語。此外，應當注意，每當列舉數值或參數的範圍時，在所列舉的值中間的值及範圍也旨在成為本揭露的一部分。
冠詞“一(a、an)”在本文中用於指代冠詞的語法中的一個或多於一個(即，至少一個)。舉例來說，“一個元素”係指一個元素或多於一個元素，例如，多個元素。
術語“包括”在本文中用於表示片語“包括但不限於”，並且可以與該片語互換使用。
術語“或”在本文中用於表示術語“及/或”，並且可以與該術語互換使用，除非上下文另有明確說明。
本文使用的術語“約(about)”係指在所屬技術領域的典型接受範圍內。例如，“約”可以理解為與平均值差異約2個標準差。在某些實施態樣中，“約”係指±10%。在某些實施態樣中，“約”係指±5%。當約出現在一系列數字或範圍之前時，應理解“約”可以修飾系列或範圍中的每個數字。
在一數字或一系列數字之前的術語“至少(at least)”、“不少於(no less than)”或“或更多(or more)”被理解為包括與術語“至少”相鄰的數字，以及所有後續的數字或整數被合理地包括在內，從上下文中可以清楚地看出。例如，核酸分子中的核苷酸數目必須係整數。例如，“21個核苷酸分子的核酸的至少18個核苷酸”係指18、19、20或21個核苷酸具有所述性質。當至少出現在一系列數字或範圍之前時，可以理解“至少”可以修飾系列或範圍中的每個數字。
如本文所用，從上下文邏輯來看，“不超過(no more than)”或“或小於(or less)”被理解為與該片語相鄰的值及邏輯上較低的數值或整數到零。例如，具有“不超過2個核苷酸”的突出端的雙鏈體具有2、1或0個核苷酸突出。當在一系列數字或範圍之前出現“不超過”時，可以理解為“不超過”可以修飾該系列或範圍中的每個數字。如本文所用，範圍包括上限及下限。
如本文所用，檢測方法可以包括確定分析物的存在量低於該方法的檢測濃度。
在指定的標靶點與正義股或反義股的核苷酸序列發生衝突時，指定的序列優先。
在化學結構及化學名稱之間發生衝突時，則化學結構優先。
如本文所用，與術語“SOD1”互換使用的術語“過氧化物歧化酶1”係指眾所周知的基因及多胜肽，在所屬技術領域中也稱為過氧化物歧化酶[Cu-Zn]、Cu/Zn過氧化物歧化酶、附睾分泌蛋白Li 44，EC 1.15.1.1及吲哚酚氧化酶A。術語“SOD1”包括人類SOD1，其胺基酸及核苷酸序列可以在例如GenBank登錄號NM_000454.4(GI：48762945；SEQ ID NO：1)；小鼠SOD1，其胺基酸及核苷酸序列可以在例如GenBank登錄號NM_011434.1(GI：45597446；SEQ ID NO：3)中找到；Macaca fascicular係(食蟹獼猴，也稱為食蟹猴)SOD1，其胺基酸及核苷酸序列可參見例如GenBank登錄號NM_001285406.1(GI：549432988；SEQ ID NO：5)；犬SOD1，其胺基酸及核苷酸序列可以在例如GenBank登錄號NM_001003035.1(GI：50978673；SEQ ID NO：7)中找到；及大鼠SOD1， 其胺基酸及核苷酸序列可以在例如GenBank登錄號NM_017050.1(GI：8394327；SEQ ID NO：9)中找到。
SOD1 mRNA序列的其它例子可以輕易獲得，例如GenBank、UniProt、OMIM及Macaca基因組項目網站。
示例性的SOD1核苷酸序列也可以在SEQ ID NO：1至10中找到。SEQ ID NO：2、4、6、8及10分別係SEQ ID NO：1、3、5、7及9的反向互補序列。
提供了更多有關SOD1的訊息，例如在www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6647的NCBI基因數據庫中。
自提交本申請之日起，前述GenBank登錄號及基因數據庫號中的的所有內容藉由引用併入本文。
如本文所用，術語“過氧化物歧化酶1”及“SOD1”也指SOD1基因的天然存在的DNA序列變異。SOD1基因內的許多序列變異已被鑑定並且可以在例如NCBI dbSNP及UniProt中找到(參見例如www.ncbi.nlm.nih.gov/snp？LinkName=gene_snp&from_uid=6647，自提交本申請之日起藉由引用將其併入本文。
如本文所用，“標靶序列”係指在SOD1基因轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列的連續部分，包括作為初級轉錄產物的RNA加工產物的mRNA。在一實施態樣中，序列的標靶部分將至少足夠長，以用作在SOD1基因轉錄期間形成的mRNA分子的核苷酸序列部分處或附近的RNAi引導的裂解的受質。在一實施態樣中，標靶序列在SOD1基因的蛋白質編碼區內。在另一實施態樣中，標靶序列在SOD1基因的3'UTR內。
標靶序列可以係約9至36個核苷酸長度，例如約15至30個核苷酸長度。例如，標靶序列可以來自約15至30個核苷酸、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21,15至20,15至19,15至18,15至17,18至30,18至29,18至28,18至27,18至26,18至25,18至24,18至23,18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20,20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸長度。在一些實施態樣中，標靶序列的長度為約19至約30個核苷酸。在其他實施態樣中，標靶序列的長度為約19至約25個核苷酸。在其他實施態樣中，標靶序列的長度為約19至約23個核苷酸。在一些實施態樣中，標靶序列的長度為約21至約23個核苷酸。上述範圍及長度中間的範圍及長度也被認為係本發明的一部分。
如本文所用，術語“包含序列的股”係指寡核苷酸，其包含核苷酸股，該核苷酸股由使用標準核苷酸命名法所指的序列描述。
“G”、“C”、“A”、“T”及“U”通常分別代表含有鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷及尿嘧啶作為鹼基的核苷酸，未修飾的核苷酸。然而，應當理解，術語“核糖核苷酸”或“核苷酸”也可以指修飾的核苷酸，如下文進一步詳述，或取代替代部分(參見例如表1)。所屬技術領域中具有通常知識者非常清楚，鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷及尿嘧啶可以被其他部分替換，而不會實質上改變包含帶有該替換部分之寡核苷酸的鹼基配對特性， 該寡核苷酸包含帶有該替換部分的核苷酸。例如，但不限於，一核苷酸可以與包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸鹼基配對，該核苷酸包含肌苷作為其鹼基。因此，包含尿嘧啶、鳥嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以被包含例如肌苷的核苷酸替換，在本揭露中的特徵的dsRNA的核苷酸序列中。在另一個例子中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤及胞嘧啶可以分別用鳥嘌呤及尿嘧啶取代，與標靶mRNA形成G-U Wobble鹼基配對。包含此類替換部分的序列適用於特徵化於本揭露的組成物及方法。
術語“iRNA”、“RNAi劑”、“iRNA劑”、“RNA干擾劑”，在本文中彼此可互換使用，係指劑，該劑包含RNA如本文所定義的術語RNA，並且介導RNA轉錄物的標靶裂解，藉由RNA誘導的沉默複合物(RISC)途徑。RNA干擾(RNAi)係指引導mRNA序列特異性降解的過程。RNAi調節，例如，抑制SOD1在細胞中的表現，例如，個體的細胞，例如哺乳動物個體。
在一實施態樣中，本揭露的RNAi劑包括單股RNAi，該單股RNAi與標靶RNA序列相互作用以引導標靶RNA的裂解，例如SOD1標靶mRNA序列。不希望受理論束縛，據信引入細胞的長雙股RNA被被稱為Dicer的第III型核酸內切酶分解成雙股短干擾RNA(siRNA)，該siRNA包含正義股及反義股(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係一種類核糖核酸酶的行III酵素(ribonuclease-III-like enzyme)，將這些dsRNA加工成19至23個鹼基對的短干擾RNAs，該RNAs具有特徵性的兩個鹼基3'突出端(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。這些siRNA稍後將加入RNA誘導的沉默雙鏈體(RISC)中，其中一個或 多個解旋酶解開siRNA雙鏈體，使互補反義股引導靶標識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。在與適當的標靶mRNA結合後，該RISC內的一個或多個核酸內切酶裂解該標靶以誘導沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。因此，一方面，本揭露內容與單股RNA(ssRNA)(siRNA雙鏈體的反義股)有關，該在細胞內產生的該ssRNA促進RISC雙鏈體的形成，以影響標標靶基因的沉默，即SOD1基因。因此，術語“siRNA”如本文所使用，復係指如上所述的RNAi。
在另一實施態樣中，該RNAi劑可以係單股RNA，該單股RNA被引入細胞或生物體以抑制標靶mRNA。該單股RNAi劑結合於RISC核酸內切酶Argonaute 2，然後裂解標靶mRNA。該單股siRNA通常為15至30個核苷酸，並經過化學修飾。單股RNA的設計及測試如美國專利號8,101,348及Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中所描述，該專利與文獻的全部內容藉由引用併入本文。本文所述的任何反義核苷酸序列可用作如本文所述的單股siRNA或藉由Lima et al.,(2012)Cell 150：883-894中所述的方法進行化學修飾。
在另一實施態樣中，用於本揭露的組成物及方法的“RNAi劑”係雙股RNA，並且該RNAi劑在本文中被稱為“雙股RNAi劑”、“雙股RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA劑”或“dsRNA”。該術語“dsRNA”係指核糖核酸分子的複合物，其具有包含兩條反平行(anti-parallel)，並且實質上互補的核酸股的複合結構，視為相對於標靶RNA呈現“正義”及“反義”方向，例如SOD1基因。在本揭露的一些實施態樣中，雙股RNA(dsRNA)藉由 本文稱為轉錄後基因沉默機制，去觸發標靶RNA的降解，例如mRNA，該機制如本文使用為RNA干擾或RNAi。
一般而言，該dsRNA分子可以包括核糖核苷酸，但如本文詳細描述的，該dsRNA的每一股或雙股也可以包括一個或多個非核糖核苷酸，例如去氧核糖核苷酸、修飾的核苷酸。此外，如在本說明書中使用的，“RNAi劑”可包括具有化學修飾的核糖核苷酸；RNAi劑可包括在多個核苷酸的實質性修飾。
如本文所用，術語“修飾的核苷酸”係指核苷酸，其獨立地具有修飾的糖部分、修飾的核苷酸間鏈結或修飾的核鹼基。因此，術語修飾的核苷酸包括對核苷酸間鏈結、糖部分或核鹼基，例如，前述物質的官能基團或原子，進行取代、加成或去除。適用於本揭露劑的修飾包括本文揭露的修飾或所屬領域已知之所有類型的修飾。出於本說明書及請求範圍的目的，如在siRNA類型分子中使用，任何此類修飾都含括在“RNAi劑”中。
在本揭露的某些實施態樣中，如果存在於RNAi劑中，去氧核苷酸的納入，其被認為係天然存在的核苷酸形式，則可以被認為係構成修飾的核苷酸。
雙鏈體區域可為允許經由RISC途徑特異性降解所需靶RNA的任何長度，並且可以係約9至36個鹼基對的長度，例如約15至30個鹼基對的長度，例如長度約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36個鹼基對，例如長度約15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15 至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對。上述範圍及長度中間的範圍及長度也被認為係本發明的一部分。
形成雙鏈體結構的雙股可能係一較大RNA分子的不同部分，或者它們可能係單獨的RNA分子。當雙股係較大分子的一部分，因此在形成雙鏈體結構的一股的3'-末端及另一股的5'-末端之間，藉由不間斷的核苷酸股連接，該連接RNA股被稱為“髮夾環”。該髮夾環可以包含至少一未配對的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以包含至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少20個、至少23個或更多個未配對的核苷酸或不指向dsRNA標靶位點的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係10個或更少的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係8個或更少的未配對核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係4至10個未配對的核苷酸。在一些實施態樣中，該髮夾環可以係4至8個核苷酸。
在某些實施態樣中，雙股寡聚化合物的二股可以連接在一起。該雙股可在兩端或僅在一端相互連接。在一端連接係指第一股的5'-末端連接到第二股的3'-末端或第一股的3'-末端連接到第二股的5'-末端。當兩股 在兩端相互連接時，第一股的5'-末端連接到第二股的3'-末端，並且第一股的3'-末端連接到第二股的5'-末端。兩股可以藉由寡核苷酸接頭連接在一起，包括但不限於(N)n；其中，N係獨立地修飾的或未修飾的核苷酸，並且n係3至23。在一些實施態樣中，n係3至10，例如3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施態樣中，寡核苷酸接頭係選自由GNRA、(G)4、(U)4及(dT)4所組成群組，其中，N係修飾的或未修飾的核苷酸，並且R係修飾的或未修飾的嘌呤核苷酸。接頭中的部分核苷酸可包含在與接頭中其他核苷酸的鹼基對相互作用。該兩股也可以藉由非核苷接頭連接在一起，例如本文所述的接頭。所屬技術領域中具有通常知識者將理解本文描述的任何寡核苷酸化學修飾或變化可用於該寡核苷酸接頭。
髮夾及啞鈴型寡聚化合物將具有等於或至少14、15、15、16、17、18、19、29、21、22、23、24或25個核苷酸對的雙鏈體區域。該雙鏈體區域的長度可以等於或小於200、100或50。在一些實施態樣中，該雙鏈體區域的長度範圍係15至30、17到23、19到23及19到21個核苷酸對。
髮夾寡聚化合物可具有一股突出或末端未配對區域，在一些實施態樣中的3'端；並且在一些實施態樣中的髮夾的反義側。在一些實施態樣中，突出長度為1至4個，更通常為2至3個核苷酸。可誘導RNA干擾的髮夾寡聚化合物在本文中也稱為“shRNA”。
當dsRNA的兩條實質上互補的股由個別RNA分子組成時，這些分子不需要但可以共價連接。當該兩股藉由形成雙鏈體結構的一股的3'-端及相應另一股的5'-端之間的不間斷核苷酸鏈以外的方式共價連接時， 連接結構稱為“接頭。”該RNA股可具有相同或不同數量的核苷酸。鹼基對的最大數量係dsRNA最短股中的核苷酸數量減去雙鏈體中存在的任何突出。除了雙鏈體結構之外，RNAi可包含一個或多個核苷酸突出。
在一實施態樣中，本發明的RNAi劑係dsRNA，其每股長度為24至30個核苷酸，其與標靶RNA序列相互作用，例如SOD1標靶mRNA序列，以引導標靶RNA的裂解。不希望受理論束縛，引入細胞的長雙股RNA被稱為Dicer的第III型核酸內切酶分解成siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係一類第III型核糖核酸酶，可將dsRNA加工成19至23個鹼基對的短干擾RNAs，該RNAs具有特徵的兩個鹼基3'突出端(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。然後將siRNA整合到RNA誘導的沉默雙鏈體(RISC)中，其中一個或多個解旋酶解開siRNA雙鏈體，使互補反義股能夠引導靶標識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。在結合於適當的標靶mRNA後，RISC內的一個或多個核酸內切酶裂解標靶以誘導沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。
在一實施態樣中，本發明的RNAi劑係dsRNA劑，其每股包含19至23個核苷酸，其與SOD1 RNA序列相互作用以引導標靶RNA的裂解。不希望受理論束縛，引入細胞的長雙股RNA被稱為Dicer的第III型核酸內切酶分解成siRNA(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15：485)。Dicer係一類第III型核糖核酸酶，可將dsRNA加工成19至23個鹼基對的短干擾RNAs，該RNAs具有特徵的兩個鹼基3'突出(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409：363)。然後將siRNA整合到RNA誘導的沉默雙鏈體 (RISC)中，其中一個或多個解旋酶解開siRNA雙鏈體，使互補反義股能夠引導靶標識別(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107：309)。在結合於適當的標靶mRNA後，RISC內的一個或多個核酸內切酶裂解標靶以誘導沉默(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15：188)。在一實施態樣中，本發明的RNAi劑係24至30個核苷酸的dsRNA，其與SOD1的RNA序列相互作用以引導標靶RNA的裂解。
如本文所用，術語“核苷酸突出(nucleotide overhang)”係指從RNAi劑(例如，dsRNA)的雙股結構突出的至少一未配對核苷酸。例如，當dsRNA一股的3'-端超出另一股的5'-端時，或反之亦然，則存在核苷酸突出。dsRNA可以包含至少一核苷酸的突出；或者，突出可包含至少兩個核苷酸、至少三個核苷酸、至少四個核苷酸、至少五個核苷酸或更多。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物，或由核苷酸/核苷類似物組成，包括去氧核苷酸/核苷。突出可以在正義股、反義股或其任何組合。此外，突出的核苷酸可以存在於dsRNA的反義股或正義股的5'-端、3'-端或兩端。
在一實施態樣中，dsRNA的反義股在3'-端或5'-端具有1至10個核苷酸的突出，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在一實施態樣中，dsRNA的正義股在3'-端或5'-端具有1至10個核苷酸的突出，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在另一實施態樣中，在突出中的一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸取代。
在某些實施態樣中，dsRNA的反義股在3'-端或5'-端突出具有1至10個核苷酸，例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10個，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在一實施態樣中，dsRNA 的正義股在3'-端或5'-端具有1至10個核苷酸的突出，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在另一實施態樣中，突出中的一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸取代。
在某些實施態樣中，正義股或反義股的突出可包括長於10個核苷酸的延伸長度，例如長度為1至30個、2至30個、10至30個或10至15個核。在某些實施態樣中，延伸的突出位於雙鏈體的正義股上。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體正義股的3'端。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體的正義股的5'端。在某些實施態樣中，延伸的突出位於雙鏈體的反義股。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體的反義股的3'端。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體的反義股的5'端。在某些實施態樣中，突出中的一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸替換。在某些實施態樣中，突出包括自我互補部分，使得突出端能夠在生理條件下形成穩定的髮夾結構。
在某些實施態樣中，至少一股的至少一端延伸超出雙股體標靶區域，包括其中一股包括熱力學上穩定的四環結構的結構(也參見例如美國專利號8,513,207及8,927,705及WO2010033225，其全部內容藉由引用併入本文)。這樣的結構可以包括單股延伸(在分子的一側或兩側)以及雙股延伸。
在某些實施態樣中，正義股的3'端及反義股的5'端藉由多核苷酸序列連接，其包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸或兩者，其中視需要地該多核苷酸序列包含四環序列。在某些實施態樣中，正義股的長度為25至35個核苷酸。
四環可包含核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、修飾的核苷酸及其組合。通常，四環具有4到5個核苷酸。在一些實施態樣中，該環包含如GAAA所示的序列。在一些實施態樣中，環(GAAA)中的至少一核苷酸包含核苷酸修飾。在一些實施態樣中，修飾的核苷酸包含2'-修飾。在一些實施態樣中，該2'-修飾係選自由2'-胺基乙基、2'-氟、2'-氧-甲基、2'-氧-甲氧基乙基、2'-胺基二乙氧基甲醇、2'-adem及2'-去氧-2'-氟-d-阿拉伯核酸所組成群組。在一些實施態樣中，環的所有核苷酸都被修飾。在一些實施態樣中，GAAA序列中的G包含2'-OH。在一些實施態樣中，GAAA序列中的每一核苷酸包含2'-O-甲基修飾。在一些實施態樣中，GAAA序列中的每一A包含2'-OH，並且GAAA序列中的G包含2'-O-甲基修飾。在較的實施態樣中，在一些實施態樣中，GAAA序列中的每一A包含2'-O-甲氧基乙基(MOE)修飾，並且GAAA序列中的G包含2'-O-甲基修飾；或GAAA序列中的每個A包含2'-adem修飾，GAAA序列中的G包含2'-O-甲基修飾。參見例如PCT公開號WO 2020/206350，其全部內容藉由引用併入本文。
示例性的2'adem修飾核苷酸如下所示：
Figure 111105127-A0202-12-0079-4
在dsRNA的一實施態樣中，至少一股包含至少一核苷酸的3'突出。在另一個實施態樣中，至少一股包含至少2個核苷酸的3'突出，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個。在其他實施態樣中，RNAi劑的至少一股包含至少一核苷酸的5'突出。在某些實施態樣中，至少一股包含至少2個核苷酸的5'突出，例如2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、14或15個。在其他實施態樣中，RNAi劑的一股的3'端及5'端都包含至少1個核苷酸的突出。
在一實施態樣中，dsRNA的反義股在3'-端或5'-端具有1至10個核苷酸突出，例如0至3、1至3、2至4、2至5、4至10、5至10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個。在一實施態樣中，dsRNA的正義股在3'-端或5’-端具有1至10個核苷酸突出，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。在另一實施態樣中，突出中的一個或多個核苷酸被核苷硫代磷酸取代。
在某些實施態樣中，正義股或反義股或兩者的突出延伸長度可包括長於10個核苷酸，例如1至30個核苷酸、2至30個核苷酸、10至30個核苷酸或10至15個核苷酸。在某些實施態樣中，延伸的突出位於雙鏈體的正義股。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體正義股的3'端。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體的正義股的5'端。在某些實施態樣中，延伸的突出位於雙鏈體的反義股。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體的反義股的3'端。在某些實施態樣中，延伸的突出存在於雙鏈體的反義股的5'端。在某些實施態樣中，突出中的一個或多個 核苷酸被核苷硫代磷酸替換。在某些實施態樣中，突出包括自我互補部分，使得突出能夠在生理條件下形成穩定的髮夾結構。
如本文所用，關於dsRNA的術語“鈍端(blunt o rblunt ended)”係指在dsRNA的給定末端不存在未配對的核苷酸或核苷酸類似物，即，沒有核苷酸突出。dsRNA的一端或兩端可以係鈍的。如果dsRNA的兩端都係鈍端的，則稱dsRNA係鈍端。需要明確的係，“鈍端”dsRNA係兩端鈍端的dsRNA，即沒有核苷酸突出在分子的任一端。大多數情況下，該分子在其整個長度上都係雙股的。
術語“反義股”或“引導股”係指RNAi劑的股，例如dsRNA，其包括與標靶序列，例如SOD1 mRNA實質上互補的區域。
如本文所用，術語“互補區”係指反義股上序列，其實質上與序列互補，例如標靶序列，例如SOD1核苷酸序列，如本文定義。在互補區域與標靶序列不完全互補的情況下，錯配可以在分子的內部或末端區域。通常，最能容忍的錯配位於末端區域，例如RNAi劑5'-或3'-末端的5、4、3或2個核苷酸內。
在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑包括反義股中的核苷酸錯配。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑的反義股包括不超過4個與標靶mRNA的錯配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與標靶mRNA的錯配。在一些實施態樣中，本發明的反義股雙股RNA劑包括不超過4個與正義股的錯配，例如，反義股包括4、3、2、1或0個與正義股的錯配。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑包括正義股中的核苷酸錯配。在一些實施態樣中，本發明的雙股RNA劑的正義股包括不超過4個 與反義股的錯配，例如，正義股包括4、3、2、1或0個與反義股的錯配。在一些實施態樣中，核苷酸錯配例如在距iRNA的3'-末端5、4、3個核苷酸內。在另一實施態樣中，核苷酸錯配例如在iRNA劑的3'-末端核苷酸中。在一些實施例中，錯配不在種子區域中。
因此，如本文所述的RNAi劑可包含一個或多個與標靶序列的錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過3個錯配(即，3、2、1或0個)。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過2個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過1個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含0個錯配。在某些實施態樣中，若RNAi劑的反義股包含與標靶序列的錯配，則錯配視需要地限制在互補區域的5'-或3'-末端的最後5個核苷酸內。例如，在這樣的實施態樣中，對於23個核苷酸的RNAi劑，與SOD1基因區域互補的該股通常在中央13個核苷酸內，不包含任何錯配。本文所述的方法或所屬技術領域已知的方法，可用於確定含有與標靶序列錯配的RNAi劑係否有效抑制SOD1基因的表現。考慮具有錯配的RNAi劑在抑制SOD1基因表現方面的功效很重要，特別係如果SOD1基因中的特定互補區域在群體中已知具有多態性序列變異。
如本文所用，術語“正義股”或“過客股”係指RNAi劑的股，其包括與本文定義的反義股區域實質上互補的區域。
如本文所用，“實質上所有的核苷酸都被修飾”係大程度的但不係完全修飾，可包括不超過5、4、3、2或1個未修飾的核苷酸。
如本文所用，術語“裂解區”係指緊鄰裂解位點的區域。裂解位點係標靶發生裂解的位點。在一些實施態樣中，裂解區域在裂解位點的任一端且緊鄰裂解位點包含三個鹼基。在一些實施態樣中，裂解區在裂解位點的任一端且緊鄰裂解位點包含兩個鹼基。在一些實施態樣中，裂解位點特異性地出現在由反義股的核苷酸10及11結合的位點，並且裂解區域包含核苷酸11、12及13。
如本文所用，除非另有說明，如所屬技術領域之通常知識者理解的，術語“互補”當用於描述第一核苷酸序列與第二核苷酸序列相關時，係指寡核苷酸或多核苷酸的能力，在某些條件下，其包含第一核苷酸序列與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交並形成雙鏈體結構。此類條件可以係例如“嚴格條件”，其中嚴格條件可以包括：400mM NaCl、40mM PIPES pH 6.4、1mM EDTA、50℃或70℃維持12至16小時，然後洗滌(參見例如，“Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)。其他可以應用的條件，例如可以在生物體內遇到的生理相關條件。根據雜交核苷酸的最終應用，技術人員將能夠確定測試兩個序列的互補性之最適合的一組條件。
RNAi劑內的互補序列，例如本文所述的dsRNA內，包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交，在一個或兩個核苷酸序列的整個長度上形成鹼基配對。這樣的序列在本文中可以被稱為彼此“完全互補”。然而，在本文中當第一序列被稱為相對於第二序列“實質上互補”時，這兩個序列可以係完全互補的， 或者它們可以形成一個或多個，但通常不超過5、4、3或2個錯配鹼基對，在雜交最多30個鹼基對的雙鏈體時，同時保留在與其最終應用的最相關的條件下雜交的能力，例如體外或體內基因表現的抑制。然而，當兩個寡核苷酸被設計成在雜交時形成一個或多個單股突出時，就互補性的決定而言，此類突出不應被視為錯配。例如，包含一長度為21個核苷酸的寡核苷酸及另一個長度為23個核苷酸的dsRNA，其中較長的寡核苷酸包含與較短的寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，出於本文所述的目的，仍可稱為“完全互補”。
如本文所用，“互補”序列還可以包括(或完全由)非Watson-Crick鹼基對或由非天然及修飾的核苷酸形成的鹼基對形成，只要上述關於它們雜交能力的要求得到滿足。此類非Watson-Crick鹼基對包括但不限於G：U Wobble或Hoogsteen鹼基配對。
本文中的術語“互補”、“完全互補”及“實質上互補”可用於dsRNA的正義股及反義股之間，或兩個寡核苷酸或多核苷酸之間的鹼基配對，例如RNAi劑的反義股及標靶序列，如從使用它們的上下文中所理解的。
如本文所用，與訊息RNA(mRNA)的至少一部分“實質上互補”的多核苷酸係指該多核苷酸與感興趣的mRNA的連續部分實質上互補(例如，編碼SOD1的mRNA)。例如，如果該多核苷酸序列實質上互補於編碼SOD1的mRNA的非間斷部分，則該多核苷酸與至少一部分SOD1mRNA互補。
因此，在一些實施態樣中，本文揭露的反義股多核苷酸完全互補於標靶SOD1序列。
在其他實施態樣中，本文揭露的反義股多核苷酸實質上互補於標靶SOD1序列，並且包含一連續核苷酸序列，其全長與對於SOD1的SEQ ID NOs：1、3、5、7或9的核苷酸序列的等效區域至少約80%互補，或SEQ ID NOs：1、3、5、7或9的片段，例如約85%、約90%或約95%互補。
在其他實施態樣中，本文揭露的反義多核苷酸與標靶SOD1序列實質上互補，並且包含一連續核苷酸序列，其全長與表2至7、12、13及18至20任一者的任一正義股核苷酸序列，或表2至7、12、13及18至20任一者的任一正義股核苷酸序列的片段，至少約80%互補，例如約85%、約90%，或約95%。
在一實施態樣中，本揭露的RNAi劑包括與反義多核苷酸實質上互補的正義股，反過來說，該反義多核苷酸與靶SOD1序列相同，並且其中正義股多核苷酸包含一連續核苷酸序列，其全長與SEQ ID NOs：2、4、6、8或10的核苷酸序列的等效區域，或SEQ ID NOs：2、4、6、8或10中任一片段，至少約80%互補，例如約85%、約90%或約95%。
在一些實施態樣中，本發明的iRNA包括與反義多核苷酸實質上互補的正義股，反過來說，該反義多核苷酸與標靶SOD1序列互補，並且其中正義股多核苷酸包含一連續核苷酸序列，其全長與表2至7、12、13及18至20任一者的任一表中的任何一反義股核苷酸序列或表2至7、 12、13及18至20任一者的任一反義股核苷酸序列的片段，至少約80%互補，例如約85%、約90%或約95%。
在一些實施態樣中，雙股iRNA劑的雙股區長度等於或至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29、30個或更多個核苷酸對。
在一些實施態樣中，雙股iRNA劑的反義股長度等於或至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸對。
在一些實施態樣中，雙股iRNA劑的正義股長度等於或至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、23、24、25、26、27、28、29或30個核苷酸對。
在一實施態樣中，雙股iRNA劑的正義股及反義股長度各自獨立地為15至30個核苷酸。
在一實施態樣中，雙股iRNA劑的正義股及反義股長度各自獨立地為19至25或19至30個核苷酸。
在一實施態樣中，雙股iRNA劑的正義股及反義股長度各自獨立地為21至23個核苷酸。
在一實施態樣中，iRNA劑的正義股長度為21個核苷酸，反義股長度為23個核苷酸，其中該兩股形成21個連續鹼基對的雙股區，該鹼基對在3'端具有2個核苷酸長的突出。
在本發明的一方面，用於本發明的方法及組成物的劑係一藉由反義抑制機制而抑制標靶mRNA的單股反義核酸分子。該單股反義RNA 分子與標靶mRNA的序列互補。單股反義寡核苷酸可以藉由與mRNA鹼基配對及物理阻礙轉譯機制，以化學計量方式抑制轉譯，參見Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1：347-355。該單股反義RNA分子的長度可為約15至約30個核苷酸，並且具有與標靶序列互補的序列。例如，該單股反義RNA分子可以包含來自本文描述的任何一種反義序列，至少約15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸的序列。
在一實施態樣中，SOD1基因表現之抑制的至少一部分係藉由SOD1 mRNA的量的減少來評估的，SOD1 mRNA可以在轉錄SOD1基因的第一細胞或細胞組中分離或檢測到，該第一細胞或細胞組其中已經被處理以抑制SOD1基因的表現，例如與第二細胞或細胞組相比，該第二細胞或細胞組實質上相同於第一細胞或細胞組，但其未經過處理(對照細胞)。抑制程度可以表示為：
Figure 111105127-A0202-12-0087-5
在一實施態樣中，藉由在實施例1中的雙螢光素酶方法檢測表現的抑制，其中RNAi劑為10nM。
如本文所用，術語“使細胞與RNAi劑接觸”，例如dsRNA，包括使其藉由任何可能的方式接觸細胞。使細胞與RNAi劑接觸包括使細胞在活體外與RNAi劑接觸，或使細胞在活體內與RNAi劑接觸。該接觸可以直接或間接進行。因此，例如，RNAi劑可以藉由施行該方法的個體， 使其與細胞物理接觸，或者，可以將RNAi劑置於允許或導致，其隨後將與細胞接觸的環境中。
例如，可以藉由將細胞與RNAi劑一起培育，完成活體外接觸細胞。例如，可以藉由將RNAi劑注射到細胞中或細胞所在的組織附近，或藉由將RNAi劑注射到另一區域，例如中樞神經系統(CNS)，視需要地由鞘內、腦室內或其他注射，或血流或皮下空間，如此劑隨後到達待接觸細胞所在的組織。例如，RNAi劑可以包含或偶聯至配體，例如，如下所述及進一步詳述的親脂性部分或部分，例如PCT公開號WO 2019/217459，其藉由引用併入本文，該公開指導或以其他方式，將RNAi劑穩定在感興趣的位點，例如CNS。在一些實施態樣中，該RNAi劑可以包含或偶聯至配體，例如，一個或多個如下所述的GalNAc衍生物，其引導或以其他方式將RNAi劑穩定在感興趣的位點，例如肝臟。在其他實施態樣中，RNAi劑可以包含或偶聯至一個或多個親脂部分及一個或多個GalNAc衍生物。活體外及活體內接觸方法的組合也係可能的。例如，細胞也可以在活體外與RNAi劑接觸，並隨後移植到個體內。
在一實施態樣中，使細胞與RNAi劑接觸包括藉由促進或影響細胞的攝取或吸收來“引入(introducing)”或“傳送RNAi劑到細胞中(delivering the RNAi agent into the cell)”。RNAi劑的吸收或攝取的發生可以藉由獨立擴散或主動的細胞過程，或藉由輔助劑或裝置。將RNAi劑引入細胞可以係活體外或活體內的。例如，對於活體內引入，RNAi劑可被注射到組織部位或全身給藥。活體外引入細胞包括所屬技術領域已知的 方法，例如電穿孔及脂轉染。進一步方法在下文中所述或在所屬技術領域中係已知的。
術語“親脂性(lipophile)”或“親脂性部分(lipophilic moiety)”廣義上係指對脂質具有親及性的任何化合物或化學部分。特性化親脂部分的親脂性的一方法係藉由辛醇-水分配係數(partition coefficient)logKow，其中Kow係化學物質在辛醇相中的濃度，與其在平衡時兩相系統之水相中的濃度之比。該辛醇-水分配係數係一物質的實驗室測量特性。然而，它也可以藉由使用根據化學結構成分的係數來預測，這些係數係使用第一原理或經驗方法計算的(例如參見Tetko et al.,J.Chem.Inf.Comput.Sci.41：1407-21(2001)，其全部內容藉由引用併入本文)。它提供了物質傾向於非水或油性環境，而不係水之趨勢的熱力學測量(即其親水/親油平衡)。原則上，當化學物質的logKow超過0時，其具有親油性。通常，親油部分的logKow超過1、超過1.5、超過2、超過3、超過4、超過5或超過10。例如，6-胺基己醇的logKow預期約為0.7。使用相同的方法，膽固醇N-(己-6-醇)胺基甲酸酯的logKow估計為10.7。
分子的親脂性可以根據其攜帶的官能基而改變。例如，在親脂部分的末端加入羥基或胺基，可以增加或降低親脂部分的分配係數值(例如，logKow)。
或者，與一個或多個親脂部分接合(conjugate)的雙股RNAi劑，其疏水性可以藉由其蛋白質結合特性來測量。例如，在某些實施態樣中，在雙股RNAi劑的血漿蛋白結合檢測中，其中未結合部分可被確定與 雙股RNAi劑的相對疏水性呈正相關，然後其可與雙股RNAi劑的沈默活性正相關。
在一實施態樣中，該血漿蛋白結合檢測係使用人類血清白蛋白的電泳遷移率變動檢測(EMSA)。該結合檢測的示例性方案在例如PCT公開號WO 2019/217459中有詳細說明。雙股RNAi劑的疏水性藉由結合檢測中未結合的siRNA的分數測量，超過0.15、超過0.2、超過0.25、超過0.3、超過0.35、超過0.4、超過0.45或超過0.5，用於增強siRNA的活體內運送。
因此，將親脂部分接合到雙股RNAi劑的內部位置為增強的siRNA活體內運送，提供了最佳疏水性。
術語“脂質奈米顆粒(lipid nanoparticle)”或“LNP”係包含脂質層的囊泡，該脂質層中包含封裝藥物活性分子，例如核酸分子，例如RNAi劑或RNAi劑從其轉錄的質體。LNPs在例如美國專利號6,858,225、6,815,432、8,158,601及8,058,069中有所描述，其全部內容藉由引用併入本文。
如本文所用，“個體”係動物，例如哺乳動物，包括靈長類動物(例如人類、非人類靈長類動物，例如猴子及黑猩猩)或非靈長類動物(例如大鼠或小鼠)。在一期望的實施態樣中，個體係人類，例如正在治療或評估疾病、病症或病狀的人類，上述問題將受益於SOD1表現降低；處於疾病、紊亂或狀況風險中的人，這些疾病、障礙或狀況將受益於SOD1表現的降低；患有可從SOD1表現減少中受益的疾病、病症或狀況的人；或正在治療將受益於如本文所述的SOD1表現降低的疾病、病症或病狀的人。
如本文所用，術語“治療(treating or treatment)”係指有益的或期望的結果，包括但不限於與SOD1基因表現及SOD1蛋白產物有關的一個或多個體徵或症狀，例如SOD1-相關的神經退化性疾病，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)，在患有該神經退化性疾病的個體中，在神經元死亡增加的區域中SOD1的表現、沉積及/或活性降低。“治療”亦可意指相較於無治療所期望的存活為延長的存活。
在個體、疾病指標或症狀中，術語“較低”在關於SOD1濃度的上下文中，係指該濃度在統計學上顯著降低。降低可以係例如至少10%、15%、20%、25%、30%、%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。在某些實施態樣中，降低至少為20%。在某些實施態樣中，疾病指標例如蛋白質或基因，其表現濃度降低至少50%。在個體SOD1濃度的相關上下文中，“較低”適合地係指濃度下降到對於沒有該病症的個體而言，可以接受的正常範圍內。在某些實施態樣中，“較低”係減少，該減少係指指患有疾病的個體的指標或症狀相對於該濃度在個體正常可接受的濃度範圍內，例如，體重降低的程度，其指肥胖個體與體重在正常可接受範圍內的個體的不同。
如本文所用，當“預防(prevention或preventing)”被提及用於將受益於SOD1基因表現減少或SOD1蛋白產生減少的疾病、病症或病症時，係指個體將出現減少與此類疾病、病症或病狀相關的症狀的可能性，例如與SOD1-相關的神經退化性疾病的症狀。疾病、異常或病狀的未形成，或與此類疾病、病症或病狀相關的症狀的發展減少，例如神經發炎(例如， 該疾病或障礙在臨床上接受的規模內減少至少約10%)，或延遲症狀的表現被認為係有效的預防措施(例如，數天、數週、數月或數年)。
如本文所用，術語“SOD1-相關的神經退化性疾病”或“SOD1-相關的神經退化性異常”被理解為任何將受益於SOD1的表現或活性降低的疾病或異常。此類SOD1神經退化性疾病的特性在於SOD1蛋白錯誤折疊，例如大腦區域中SOD1沉積增加，該區域在此類疾病中與神經元細胞死亡有關(參考例如，Trist B,et al.(2020)Angew Chem Int Ed Engl.Accepted Author Manuscript)，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
在一實施態樣中，SOD1-相關的神經退化性疾病係“肌萎縮側索硬化(ALS)”，也稱為盧賈里格(Lou Gehrig)氏病。
肌萎縮側索硬化症(ALS)係一種進行性疾病，會影響脊髓及大腦中的運動神經元。在ALS中，運動神經元會隨著時間而死亡(萎縮)，導致肌肉無力、肌肉質量下降及無法控制運動。
SOD1基因突變導致約20%的遺傳性家族性肌萎縮側索硬化(fALS)病例及高達約5%的散發性ALS(sALS)病例。所產生的突變，包括例如胺基酸取代、插入、缺失及/或遺傳多態性，使SOD1的蛋白質結構不穩定，導致其錯誤折疊，而自我組裝成具神經毒性的寡聚物及聚集體，該過程在受影響個體中，助長了特徵性運動神經元退化。
患有散發性ALS的人通常在50歲後期或60歲早期時，首先出現該疾病的特徵。散發性及家族性ALS具有相似的病理及臨床特徵。
ALS的最初症狀包括肌肉抽搐、痙攣、僵硬或虛弱。受影響的個體可能會出現口齒不清(構音障礙)，後期出現咀嚼或吞嚥困難(吞嚥困難)。許多患有ALS的人出現營養不良，由於吞嚥困難導致食物攝入減少以及長期患病導致身體能量需求(新陳代謝)增加。隨著疾病惡化，肌肉變得更弱，隨著肌肉組織萎縮，手臂及腿開始看起來更薄。ALS患者最終會失去肌肉力量及行走能力。受影響的人最終會成為輪椅依賴，並且越來越需要個人護理及其他日常生活活動的幫助。隨著時間的過去，肌肉無力會導致受影響的人失去他們的手及手臂的使用能力。呼吸變得困難，因為呼吸系統的肌肉變弱了。大多數患ALS的人在首次出現ALS的體徵及症狀後，2至10年內死於呼吸衰竭；然而，疾病的惡化在受影響的個體之間差異很大。
已經發現SOD1的累積出現在突變SOD1基因轉殖小鼠屍檢及人類ALS患者組織的運動神經元、脊髓及相關細胞中。更進一步，已顯示SOD1基因轉殖小鼠，一種所屬技術領域公認的ALS模型，該小鼠所表現之突變的SOD1形式，與內源性小鼠蛋白相似或升高的濃度，已經顯示因而概括了ALS表型。這些小鼠出現嚴重的運動神經元退化，其導致後肢及前肢惡性麻痺及死亡，如在ALS人類患者中所見。這些小鼠還表現出在人類患者的屍撿組織中發現的病理學現象，例如SOD1細胞質內含物、神經膠質增生、麩胺酸鹽興奮性毒性、粒線體液泡化及軸突運輸中斷(Mina M,et al.(2018)J Transl Neurosci.3：9)。
在一實施態樣中，SOD1-相關的神經退化性疾病係“阿茲海默症(AD)”。AD係一慢性神經退化性疾病，通常開始緩慢，並隨著時間逐 漸惡化。最常見的初期症狀係難以記住最近發生的事情。隨著疾病的惡化，症狀可能包括語言問題、迷失方向(包括容易迷路)、情緒波動、失去動力、無法自我照顧及行為問題。隨著人的病情變糟，他們往往會退出家庭及社會。漸漸地，身體機能喪失，最終導致死亡。
神經病理學上，AD的特徵係大腦皮層及某些皮層下區域的神經元及突觸喪失。該損失導致受影響區域的嚴重萎縮，包括顳葉及頂葉的退化，以及額葉皮層及扣帶回的部分退化。腦幹核中也存在變性，如藍斑。使用MRI及PET的研究記錄了AD患者，從輕度認知障礙發展為阿茲海默症時，特定大腦區域尺寸的減少，並與來自健康老年人的類似圖像進行比較。
在受AD所苦之人的大腦中，澱粉樣蛋白斑塊及神經原纖維纏結藉由顯微鏡清晰可見。在神經元外及神經元周圍，斑塊係密集的、主要係不溶性的β-澱粉樣胜肽及細胞物質的沉積物。纏結(神經原纖維纏結)係微管相關蛋白tau的聚集體，該聚集體已經過度磷酸化並在細胞本身內累積。儘管許多老年人會因衰老而出現一些斑塊及纏結，但AD患者的大腦在特定的大腦區域(如顳葉)有更多的斑塊及纏結。路易氏體在AD患者的大腦中並不罕見。
具有AD之個體的屍檢及活體內檢查也顯示，自由基損傷產物在中樞神經系統及周邊組織中堆積。此外，已在AD大腦中鑑定出SOD1聚集體，並且我們發現它與澱粉樣蛋白老年斑塊及神經原纖維纏結有關(Choi J,et al.(2005)JBC.280：11648-11655)。
在一實施態樣中，SOD1-相關的神經退化性疾病係“帕金森氏症(PD)”。帕金森氏症係一種神經系統進行性疾病。該疾病影響大腦的多個區域，尤其係稱為黑質的區域，該區域控制平衡及運動。PD導致基底神經節內的多巴胺能神經元丟失。
帕金森氏症的首發症狀通常係肢體的發抖或顫抖(震顫)，尤其當身體處於休息狀態時。通常，震顫於身體的一側開始，通常在一手。震顫也會影響手臂、腿、腳及臉部。帕金森氏症的其他特徵性症狀包括四肢及軀幹的僵硬或堅硬、移動緩慢(運動遲緩)或無法移動(運動不能)，以及不平衡及協調受損(姿勢不穩)。隨著時間，這些症狀會慢慢惡化。
帕金森氏症也會影響情緒及思維能力(認知)。一些受影響的人會出現精神疾病，例如抑鬱及視幻覺。患有帕金森氏症的人患癡呆症的風險也會增加，該癡呆症係智力功能下降，包括判斷力及記憶力。
先前研究顯示，PD患者大腦的總SOD1蛋白質濃度顯著增加(Choi J,et al.(2005)JBC.280：11648-11655)。此外，已在PD患者大腦路易氏體中檢測到SOD1的沉澱(Nishiyama L,et al.(1995)Acta Neuropathologica,89：471-474)。
在一實施態樣中，SOD1-相關的神經退化性疾病係“唐氏症(DS)”唐氏症(DS)係因為人類21號染色體(Hsa21)三體性，及由於劑量導致的，部分編碼基因子集的表現增加。DS患者表現出不同的形態特性，例如，身高矮、肥胖及雙側內眥皺襞(俗稱蒙古褶)。此外，隨著年齡，肌肉張力減退及神經退行性變可能會在生命中出現。該綜合徵與智力低下、先天性心臟病、免疫系統疾病、消化問題、內分泌系統缺陷及不同的生化異 常有關。來自活體內、活體外及動物模型研究的證據顯示，氧化壓力包含在DS中。因此，已經提出，在這些個體中所觀察到的氧化壓力增加，主要係由SOD1的過度活性引起的，SOD1係一在HSA21(21q22.1)上編碼的酵素。DS患者也出現增加的SOD1濃度，似乎增加的脂質過氧化及DNA氧化損傷，以及增加的麩胱甘肽過氧化酶活性(Campos C and Casado A.(2015)Indian J Med Res.142(2)：113-119)。
如本文所用，“治療有效量(Therapeutically effective amount)”意在包括RNAi劑的量，當給予患有SOD1-相關神經退化性疾病的個體時，該RNAi劑的量足以影響疾病治療(例如，藉由減少、改善，或維持現有疾病或一個或多個疾病症狀)。因RNAi劑、該劑的給藥方式、疾病及其嚴重程度以及病史、年齡、體重、家族史、基因構成、先前或伴隨治療的類型(如果有的話)，及待治療對象的其他個體特徵，“治療有效量”可能改變。
如本文所用，“預防有效量”旨在包括RNAi劑的量，當給予患有SOD1-相關神經退化性疾病的個體時，該RNAi劑的量足以預防或改善疾病或一個或多個症狀。改善疾病包括減緩疾病的進程或降低後期發展疾病的嚴重程度。“因RNAi藥物、藥物的給藥方式、疾病風險程度以及病史、年齡、體重、家族史、基因構成、先前或伴隨治療的類型、及待治療患者的任何及其他個人特徵，“預防有效量”可能改變。
“治療有效量”或“預防有效量”還包括RNAi劑的量，該RNAi劑的量在合理收益/風險比下，對於任何治療生產生一些期望的局部或全身 效應。在本揭露的方法中，所使用的RNAi劑可以足夠的劑量給藥，以產生適用於該治療的合理益處/風險比。
本文使用的術語“藥學上可接受的”係指在合理的醫學判斷範圍內，適用於接觸人類個體及動物個體組織的那些化合物(包括鹽)、材料、組成物或劑型，而沒有過度毒性、刺激、過敏反應或其他問題或併發症，其具有合理的收益/風險比。
如本文所用，術語“藥學上可接受的載體”係指藥學上可接受的材料、組成物或載體，例如液體或固體填充劑、稀釋劑、賦形劑、製造助劑(例如潤滑劑、滑石鎂、硬脂酸鈣或硬脂酸鋅，或硬脂酸)或溶劑包封材料，該藥學上可接受的載體包含將主題化合物從一個器官或身體的一部分攜帶或運輸到另一器官或身體的一部分。每一載體必須係“可接受的”，意即與製劑的其他成分相容並且對治療個體無害。可以用作藥學上可接受的載體之材料的一些例子包括：(1)醣類，如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)澱粉，例如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素、醋酸纖維素；(4)黃著膠粉；(5)麥芽；(6)明膠；(7)潤滑劑，如鎂鹽、十二烷基硫酸鈉、滑石粉等；(8)可可脂、栓劑蠟等賦形劑；(9)油類，如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油、大豆油；(10)二醇類，例如丙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、聚乙二醇等；(12)油酸乙酯、月桂酸乙酯等酯類；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，如氫氧化鎂、氫氧化鋁；(15)海藻酸；(16)無致熱原水；(17)等滲透壓鹽水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)pH緩衝溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯或聚酐；(22)填 充劑，例如多肽及胺基酸(23)血清成分，例如血清白蛋白、HDL及LDL；及(22)藥物製劑中使用之其他的無毒相容物質。
如本文所用，術語“樣本”包括從個體分離的類似體液、細胞或組織的集合，以及存在於個體內的體液、細胞或組織。生物體液的例子包括血液、血清及漿液、血漿、腦脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。組織樣本可包括來自組織、器官或局部區域的樣本。例如，樣本可以來自特定器官、器官的一部分或這些器官內的體液或細胞。在某些實施態樣中，樣本可以源自大腦(例如，全腦或某些腦段，例如紋狀體，或大腦中某些類型的細胞，例如，神經元及神經膠質細胞(星形膠質細胞、少突膠質細胞、小膠質細胞)細胞))。在其他實施態樣中，“源自個體的樣本”係指源自個體的肝組織(或其子組分)。在一些實施態樣中，“源自個體的樣本”係指從個體抽取的血液或源自其的血漿或血清。在進一步的實施態樣中，“源自個體的樣本”係指源自個體的腦組織(或其子組分)或視網膜組織(或其子組分)。
II.本揭露的RNAi劑
本文描述了抑制SOD1基因表現的RNAi劑。在一實施態樣中，RNAi劑包括雙股核糖核酸(dsRNA)分子，用於抑制細胞中SOD1基因的表現，例如個體內的細胞，例如哺乳動物，例如具有SOD1-相關神經退化性疾病的人，例如，肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。該dsRNA包括具有互補區的反義股，該區域與在SOD1基因表現中形成的mRNA的至少一部分互補。互補區的長度約為15至30個核苷酸或更短。在與表現SOD1基因的細胞接觸後，該RNAi劑抑制SOD1基因(例如，人類基因、靈長類動物基因、非靈長類動物基因) 的表現至少50%，如藉由例如PCR或根據分支DNA(bDNA)的方法，或藉由根據蛋白質的方法，例如藉由免疫螢光分析，使用例如西方印跡或流式細胞儀技術。在適合的實施態樣中，如實施例1中的Dual-Glo螢光素酶檢測法所檢測的，抑制表現至少50%，其中siRNA濃度為10nM。
dsRNA包括互補的RNA兩股，在使用dsRNA的條件下，它們該兩股形成雙股體結構。dsRNA的一股(反義股)包括互補區，該互補區與標靶序列實質上互補，並且通常完全互補的。該標靶序列可以來源於SOD1基因表現過程中所形成的mRNA序列。另一股(正義股)包括互補區，在合適條件下，該互補區使兩股結合雜交並形成雙鏈體結構。如本文別處所述及所屬技術領域已知，dsRNA的互補序列也可以被包含作為單個核酸分子的自身互補區，而不係在個別寡核苷酸。
通常，雙鏈體結構的長度為15至30個鹼基對，例如長度為15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個鹼基對。在某些較佳實施態樣中，雙鏈體結構的長度為18至25個鹼基對，例如18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至25、19至24、 19至23、19至22、19至21、19至20、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至25、21至24、21至23、21至22、22至25、22至24、22至23、23至25、23至24或24至25個鹼基對長度，例如，19至21個鹼基對長度。上述範圍及長度中間的範圍及長度也被認為係本揭露的一部分。
類似地，與標靶序列互補的區域長度為15至30個核苷酸，例如15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22個核苷酸，例如長度為19至23個核苷酸或長度為21至23個核苷酸。上述範圍及長度中間的範圍及長度也被認為係本公開的一部分。
在一些實施態樣中，dsRNA長度為15至23個核苷酸、25至30個核苷酸、20至30個核苷酸或19至30個核苷酸。一般來說，該dsRNA的長度足以作為Dicer酶的受質。例如，如所屬技術領域眾所周知，長於約21至23個核苷酸的dsRNA可用作Dicer的受質。正如通常知識者也將認識到的，裂解的標靶RNA區域通常係較大RNA分子的一部分，通常係mRNA分子。在相關的情況下，mRNA靶標的“部分”係mRNA靶標的連 續序列，其長度足以使其成為RNAi引導的裂解(即藉由RISC途徑的裂解)的受質。
所屬技術領域之通常知識者也將認識到雙鏈體區域係dsRNA的主要功能部分，例如約15至36個鹼基對的雙鏈體區域，例如15至36、15至35、15至34、15至33、15至32、15至31、15至30、15至29、15至28、15至27、15至26、15至25、15至24、15至23、15至22、15至21、15至20、15至19、15至18、15至17、18至30、18至29、18至28、18至27、18至26、18至25、18至24、18至23、18至22、18至21、18至-20、19至30、19至29、19至28、19至27、19至26、19至25、19至24、19至23、19至22、19至21、19至20、20至30、20至29、20至28、20至27、20至26、20至25、20至24、20至23、20至22、20至21、21至30、21至29、21至28、21至27、21至26、21至25、21至24、21至23或21至22鹼基對，例如19至21鹼基對。因此，在一實施態樣中，就其被加工成功能性雙鏈體而言，例如15至30個鹼基對，該功能性雙鏈體靶向用於裂解的所需RNA，其具有大於30個鹼基對的雙鏈體區域的RNA分子或RNA分子複合物係dsRNA。因此，具有通常知識者將認識到，在一實施態樣中，miRNA係dsRNA。在另一實施態樣中，dsRNA不係天然存在的miRNA。在另一實施態樣中，對靶向SOD1表現有用的RNAi劑不係在標靶細胞中，藉由裂解較大的dsRNA產生。
如本文所述，dsRNA可復包括一個或多個單股核苷酸突出，例如1、2、3或4個核苷酸。核苷酸突出可包含核苷酸/核苷類似物，或由 其組成，包括去氧核苷酸/核苷。突出端可以在正義股、反義股或其任何組合。此外，突出的核苷酸可以存在於dsRNA的反義股或正義股的5'-端、3'-端或兩端。在某些實施例中，更長、延長的突出係可能的。
dsRNA可以藉由所屬技術領域已知的標準方法合成，如下文進一步討論，例如藉由使用自動化DNA合成儀，例如可購自例如Biosearch,Applied Biosystems,Inc。
本發明的iRNA化合物可以使用兩步程序製備。首先，單獨製備雙鏈RNA分子的各股。然後，對組件股進行低溫黏合(anneal)。siRNA化合物的個股可以使用溶液相或固相有機合成或兩者來製備。有機合成提供的優點係可以容易地製備包含非天然或修飾核苷酸的寡核苷酸鏈。本發明的單股寡核苷酸可以使用溶液相或固相有機合成或兩者來製備。
生產siRNA可以藉由多種方法，例如批量。示例性方法包括：有機合成及RNA裂解，例如活體外裂解。
製備siRNA可以藉由分別合成單股RNA分子，或雙鏈RNA分子的每個相應股，然後可以將組成股低溫黏合。
大型生物反應器，例如來自Pharmacia Biotec AB(Uppsala Sweden)的OligoPilot II，可用於為給定的siRNA，生產大量特定的RNA鏈。OligoPilotII反應器藉由僅使用1.5molar過量的亞磷醯胺核苷酸，即可有效地偶聯核苷酸。為了製造RNA鏈，使用了核糖核苷酸亞醯胺。單體添加的標準循環可用於合成siRNA的21至23個核苷酸鏈。通常，兩條互補股分別產生，然後低溫黏合，例如，在從固體支持物釋放及脫保護之後。
有機合成可用於產生離散的siRNA種類。可以精確指定物種與SOD1基因的互補性。例如，該物種可以與包括多態性(例如單核苷酸多態性)的區域互補。此外，多態性的位置可以被精確定義。在一些實施態樣中，多態性位於內部區域，例如來自末端之一或兩者的至少4、5、7或9個核苷酸。
在一實施態樣中，產生的RNA被仔細純化以去除末端siRNA，該RNA在體外被裂解成siRNA，例如，使用根據Dicer或類似的根據RNAse III的活性。例如，該dsiRNA可以在來自果蠅(Drosophila)的體外提取物中培育，或使用純化的成分，例如純化的RNAse或RISC複合物(RNA誘導的沉默複合物)。參考例如Ketting et al.Genes Dev 2001 Oct 15；15(20)：2654-9 and Hammond Science 2001 Aug 10；293(5532)：1146-50。
dsiRNA裂解通常產生多種siRNA種類，每一種都係源自dsiRNA分子的特定21至23nt片段。例如，siRNA，其包含與源自dsiRNA分子的重疊區域及相鄰區域互補的序列。
不管合成方法如何，siRNA製劑都可以在適合配製的溶液(例如，水溶液或有機溶液)中製備。例如，該siRNA製劑可以在純雙蒸水中沉澱及再溶解，然後凍乾。然後可以將所得乾燥的siRNA重新懸浮在預期適合配製過程的溶液中。
在一方面，本揭露的dsRNA包括至少兩個核苷酸序列，正義序列及反義序列。SOD1的正義股序列可以選自表2至7、12、13及18至20任一者提供的序列群組，並且正義股的反義股的相應核苷酸序列可以選 自表2至7、12、13及18至20任一者提供的序列群組。在這方面，兩個序列之一與兩個序列中的另一互補，其中一序列與在SOD1基因表現中產生的mRNA序列實質上互補。因此，在這個方面，dsRNA將包括兩個寡核苷酸，其中一寡核苷酸被描述正義股(過客股)，為表2至7、12、13及18至20中任一個，並且第二個寡核苷酸被描述了為SOD1的表2至7、12、13及18至20中任一表中的正義股的相應反義股(引導股)。
在一實施態樣中，dsRNA的實質上互補的序列被包含在單獨的寡核苷酸。在另一實施態樣中，dsRNA的實質上互補的序列被包含在單個寡核苷酸。
應當理解，儘管本文提供的序列被描述為修飾或接合的序列，但本揭露的RNAi劑的RNA，例如本公開的dsRNA，可包含表2至7、12、13及18至20任一者所列出的任一序列，該序列未修飾、未接合、或修飾或接合，不同於其中所述。一個或多個親脂性配體或一個或多個GalNAc配體可以包括在本申請中提供的RNAi劑的任何位置。
具有通常知識者熟知具有約20至23個鹼基對的複合結構的dsRNA，例如21個鹼基對，該dsRNA在誘導RNA干擾方面特別有效(Elbashir et al.,(2001)EMBO J.,20：6877-6888)。然而，其他人發現較短或較長的RNA雙鏈體結構也可能係有效的(Chu and Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim et al.(2005)Nat Biotech 23：222-226)。在上述實施態樣中，由於本文提供的寡核苷酸序列的性質，本文所述的dsRNA可以包括至少一長度為最少21個核苷酸的股。可以合理地預期，與上述dsRNA相比，較短的雙鏈體在一端或兩端僅減去幾個核苷酸可能同樣有效。因此， 具有至少15、16、17、18、19、20或更多個連續核苷酸的序列的dsRNA，其源自本文提供的序列之一，並且它們抑制SOD1基因表現的能力對包含完整序列的dsRNA差異不超過10、15、20、25或30%的抑制，使用具有Cos7及10nM濃度的RNA劑的體外檢測及PCR檢測，如本文實施例中提供，以上被預期在本揭露的範圍內。
此外，本文所述的RNA鑑定了SOD1轉錄物中易受RISC介導的裂解的位點。因此，本公開進一步描述了在該位點靶向的RNAi劑。如本文所用，如果RNAi劑促進轉錄物在特定位點內任何位置的裂解，則稱RNAi劑靶向於RNA轉錄物的特定位點。該RNAi劑通常包括至少約15個連續核苷酸，適合至少19個核苷酸，來自本文提供的序列之一，其偶聯於取自與SOD1基因中所選序列相鄰的區域的額外核苷酸序列。
如本文所述，RNAi劑可包含與標靶序列的一個或多個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過3個錯配(即，3、2、1或0個錯配)。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過2個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含不超過1個錯配。在一實施態樣中，如本文所述的RNAi劑包含0個錯配。在某些實施態樣中，如果RNAi劑的反義股包含與標靶序列的錯配，則錯配視需要地限制在互補區域的5'-或3'-末端的最後5個核苷酸內。例如，在這樣的實施態樣中，對於23個核苷酸的RNAi劑，與SOD1基因區域互補的鏈，其通常在中央13個核苷酸內不包含任何錯配。本文所述的方法或所屬技術領域已知的方法，其可用於確定含有與標靶序列錯配的RNAi劑係否有效抑制SOD1基因的表現。考慮具有錯配的RNAi劑在抑制SOD1基因表現方面的功效很 重要，特別係如果已知SOD1基因中的特定互補區域在群體中具有多態性序列變異。
III.本揭露之修飾的RNAi劑
在一實施態樣中，本揭露內容的RNAi劑的RNA，例如dsRNA，該RNA係未經修飾的，並且不包含例如化學修飾或接合，該化學修飾或接合係所屬技術領域已知的及在本文描述中。在適合的實施態樣中，本公開的RNAi劑的RNA被化學修飾以增強穩定性或其他有益特性，例如dsRNA。在本揭露的某些實施態樣中，實質上本揭露的RNAi劑的所有核苷酸都被修飾。在本揭露的其他實施態樣中，本揭露的RNAi劑的所有核苷酸都被修飾。在本揭露的RNAi劑其中“實質上所有的核苷酸都被修飾”的很大程度上，但不係完全地被修飾，並且可以包括不超過5、4、3、2或1個未修飾的核苷酸。在本揭露的其他實施態樣中，本揭露的RNAi劑可以包括不超過5、4、3、2或1個修飾的核苷酸。
本揭露內容中的核酸可以藉由所屬技術領域充分建立的方法合成或修飾，例如在以下書中描述的那些“Current protocols in nucleus chemistry”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USA，其藉由引用併入本文。修飾包括例如末端修飾，例如5'-端修飾(磷酸化、接合、反向鏈結)或3'-端修飾(接合、DNA核苷酸、反向鏈結等)；鹼基修飾，例如，用穩定鹼基替代、去穩定鹼基替代，或與擴展的伴侶庫進行鹼基對的鹼基替換，去除鹼基(無鹼基核苷酸)或接合鹼基；糖修飾(例如，在2'-位置或4'-位置)或糖的替代；或骨架修飾，包括修飾或替換磷酸二酯鏈結。用於本文所述實施態樣的RNAi劑的實施態樣，其包括 但不限於含有修飾的骨架或不含天然核苷間鏈結的RNAs。具有修飾骨架的RNA尤其包括那些在骨架中沒有磷原子的RNAs。出於本說明書的目的，並且如所屬技術領域中有時提到的，在其核苷間骨架中不具有磷原子的修飾的RNA，其也可以被認為係寡核苷。在一些實施態樣中，修飾的RNAi劑在其核苷間骨架中將具有磷原子。
修飾的RNA骨架包括，例如、硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3'-伸烷基膦酸酯和手性膦酸酯、亞膦酸酯、胺基磷酸酯包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯及具有正常3'-5'鏈結的硼酸磷酸酯、其等的2'-5'連接類似物，以及其中相鄰的核苷單元對以3'-5'連接到5'-3'或2'-5'到5'-2'。還包括各種鹽，例如鈉鹽、混合鹽和游離酸形式
教導製備上述含磷鏈結結的代表性美國專利包括但不限於美國專利號3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；及美國專利RE39464，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
其中不包括磷原子的修飾RNA骨架具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鏈結、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鏈結、或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鏈結所形成。這些包括具有N-嗎啉基鏈結結(部分由核苷的糖部分形成)者；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸及碸骨架；甲乙醯基及硫代甲乙醯基骨架；亞甲基甲乙醯及硫甲乙醯骨架；含有烯烴的骨架；胺基磺酸酯骨架；亞甲基亞胺基及亞甲基聯胺基骨架；磺酸酯及磺胺骨架；醯胺骨架；及其他具有混合的N、O、S及CH2成分者。
上述寡核苷的教導製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利號；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；及5,677,439，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
在其他實施態樣中，合適的RNA模擬物被考慮用於RNAi劑中，其中核苷酸單元的糖及核苷間鏈結，即骨架，都被新基團取代。鹼基單位被維持用於與合適的核酸標靶化合物雜交。一這樣的寡聚化合物被稱為肽核酸(PNA)，如RNA模擬物，其已被證明具有優異雜交特性。在PNA化合物中，RNA的糖骨架被含有醯胺的骨架取代，特別係胺乙基甘胺酸骨架。核鹼基被保留，並直接或間接結合到主鏈醯胺部分的氮雜原子上。PNA化合物之教導製備的代表性美國專利包括但不限於美國專利號5,539,082；5,714,331；5,719,262，每一全部內容在此藉由引用併入本文。適用於本揭 露的RNAi劑的額外PNA化合物，被描述於例如Nielsen et al.,Science,1991,254,1497-1500。
本揭露中的一些實施態樣包括具有硫代磷酸酯骨架的RNA及具有雜原子骨架的寡核苷，特別係-CH2--NH--CH2-、-CH2--N(CH3)--O--CH2-[已知作為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI骨架]、--CH2--O--N(CH3)--CH2--、--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--及上述美國專利5489677的--N(CH3)--CH2--CH2-及上述美國專利5,602,240的醯胺骨架。在一些實施態樣中，本文所述的RNA具有上述參考資料US5,034,506的嗎啉骨架結構。原生磷酸二酯骨架可以O-P(O)(OH)-OCH2-表示。
修飾的RNA也可以包含一個或多個取代的糖部分。RNAi劑，例如，dsRNA，在本文中的特徵可以在2'-位置包括以下之一：OH；F；；0-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可以係取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基及炔基。示例性合適的修飾包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2及O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n及m為1至約10。在其他實施態樣中，dsRNAs在其2'位置包括以下之一：C1至C10低級烷基、取代的低級烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、取代的甲矽烷基、RNA裂解基團、報告基團(reporter group)、嵌入劑、用於改善RNAi劑的藥物動力學性質的基團、或用於改善RNAi劑的藥效學性質的基團，以及具有類似性質的其他 取代基。在一些實施態樣中，修飾包括2'甲氧基乙氧基(2'-O--CH2CH2OCH3，也稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78：486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一示例性修飾係2'-二甲胺基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基團，也稱為2'-DMAOE，如下文實施例中所述，及2'-二甲胺基乙氧基乙氧基(在所屬技術領域中也稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2。進一步的示例性修飾包括：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-去氧核苷酸(這三個家族中的R及S異構物)；2'-烷氧基烷基；及2'-NMA(N-甲基乙醯胺)。
其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH3)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2)、2'-O-十六烷基及2'-氟(2'-F)。也可以在RNAi劑的RNA上的其他位置進行類似的修飾，特別係3'末端核苷酸或2'-5'連接的dsRNA之糖的3'位置及5'末端核苷酸的5'位置。RNAi劑也可以具有糖模擬物，例如環丁基部分來代替呋喃戊糖。此類修飾之糖結構之教導製備的代表性美國專利包括但不限於；4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；及5,700,920，其中某些係與本申請為共同擁有的。前述各者的全部內容在此藉由引用併入本文。
本揭露的RNAi劑還可以包括核鹼基(在所屬技術領域中通常簡稱為“鹼基”)修飾或取代。如本文所用，“未修飾”或“天然”核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿 嘧啶(U)。修飾的核鹼基包括其他合成的及天然的核鹼基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-胺基腺嘌呤、6-甲基以及腺嘌呤及鳥嘌呤的其他烷基衍生物、2-丙基及腺嘌呤及鳥嘌呤的其他烷基衍生物、2-硫氧嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶及2-硫胞嘧啶、5-鹵尿嘧啶及胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶及胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-鹵代、8-胺基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羥基及其他8-取代的腺嘌呤及鳥嘌呤、5-鹵代，特別係5-溴、5-三氟甲基及其他5-取代的尿嘧啶及胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤及7-甲基腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤及8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤及7-達氮雜腺嘌呤以及3-脫氮鳥嘌呤及3-脫氮雜腺嘌呤。其他核鹼基包括在美國專利No.3687808中揭露的那些，在修飾Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley-VCH,2008中公開的那些；在The Conc係e Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858-859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990中公開的那些；在Sanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289-302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRC Press,1993中公開的那些。這些核鹼基中之部分特別可用於增加本揭露內容中特徵之寡聚化合物的結合親及力非常有幫助。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶及N-2、N-6及0-6取代的嘌呤，包括2-胺基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶及5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已顯示可提高核酸雙鏈體的穩定性0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276-278)並且係示例性鹼基取代，甚至更特別係當與2'-O-甲氧基乙基糖修飾結合時。
上述某些修飾的核鹼基的教導製備以及其他修飾的核鹼基的代表性美國專利包括但不限於上述美國專利號；；3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；及7,495,088，其全部內容在此藉由引用併入本文。
本揭露的RNAi劑還可被修飾以包含一個或多個雙環糖部分。該“雙環糖”係由兩個碳(無論係相鄰的還係不相鄰的)橋接形成的環修飾的呋喃糖基環。“雙環核苷”(“BNA”)係具有糖部分的核苷，該糖部分包含藉由橋接糖環的兩個碳(無論係相鄰的或係不相鄰的)而形成的環，因此形成雙環系統。在某些實施態樣中，該橋連接糖環的4'-碳及2'-碳，視需要地藉由2'-無環氧原子。因此，在一些實施態樣中，本揭露的劑可包括一個或多個鎖核酸(L NA)。該鎖核酸係具有修飾核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含連接2'及4'碳的額外橋接。換言之，該LNA係包含雙環糖部分的核苷酸，該雙環糖部分包含4'-CH2-O-2'橋。該結構有效地將核糖“鎖”在3'-內結構構型中。已顯示添加鎖核酸到siRNA可提高血清中siRNA的穩定性，並減少脫靶效應(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic Acids Research 33(1)：439-447；Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3)：833-843； Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12)：3185-3193)。本揭露的多核苷酸使用之雙環核苷的實例包括但不限於在4'及2'核糖基環原子之間包含橋的核苷。在某些實施態樣中，本公開的反義多核苷酸劑包括一個或多個包含4'至2'橋的雙環核苷。
鎖核苷可以由結構表示(省略立體化學)，
Figure 111105127-A0202-12-0113-6
其中，B係核鹼基或修飾的核鹼基，L係將2'-碳連接到核糖環的4'-碳的連接基團。此類4'至2'橋連雙環核苷的實施例包括但不限於4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(也稱為“受約束的乙基(constrained ethyl)”或“cEt”)及4'-CH(CH2OCH3)-O-2'(及其類似物；參見例如，美國專利第7,399,845號)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'(及其類似物；參見例如美國專利號8,278,283)；4'-CH2-N(OCH3)-2'(及其類似物；參見例如美國專利號8,278,425)；4'-CH2-ON(CH3)-2'(參見，例如，美國專利公開號2004/0171570)；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R係H、C1至C12烷基，或氮保護基團(參見例如，美國專利號7,427,672；Greene's Protective Groups in Organic Synthes係，Fourth Edition,2006,eds.John Wiley & Sons,Inc.)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(參見例如，Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118-134)；及4'-CH2-C(=CH2)-2'(及其類似物；參見例如，美國專利號8,278,426)。前述每一全部內容在此藉由引用併入本文。
鎖核酸核苷酸教示製備的其他代表性美國專利及美國專利公開包括但不限於以下：美國專利號66,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；美國2008/0039618；及US2009/0012281，每一全部內容藉由引用併入本文。
任何前述雙環核苷可以被製備具有一個或多個立體化學糖構型的，包括例如α-L-呋喃核糖及β-D-呋喃核糖(參見WO 99/14226)。
本揭露的RNAi劑也可以被修飾以包括一個或多個受限的乙基核苷酸。如本文所用，“受約束的乙基核苷酸”或“cEt”係包含雙環糖部分的鎖核酸，該雙環糖部分包含4'-CH(CH3)-O-2'橋(即前述結構中的L)。在一實施態樣中，受約束的乙基核苷酸處於本文稱為“S-cEt”的S構形。
本揭露的RNAi劑還可以包括一個或多個“構型受限核苷酸(CRN)”。CRN係核苷酸類似物，其具有連接核糖的C2'及C4'碳或核糖的C3及-C5'碳的接頭。CRN將核糖環鎖為穩定的構型，並增加與mRNA的雜交親和力。接頭的長度足以將氧置於最佳位置，以實現穩定性及親和力，因此減少核糖環褶皺。
教示部分上述CRN製備的代表性出版物包括但不限於US 2013/0190383；及WO 2013/036868，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
在一些實施態樣中，本揭露的RNAi劑包含一個或多個單體，該單體係UNA(未鎖核酸)核苷酸。UNA係未鎖的無環核酸，其中糖的任一 鍵已被去除，形成未鎖的“糖”殘基。在一實施例中，UNA還包括C1'-C4'之間的鍵已被去除的單體(即C1'及C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)。在另一實施例中，糖的C2'-C3'鍵(即C2'及C3'碳之間的共價碳-碳鍵)已被去除(參照Nuc.Acids Symp.Series,52,133-134(2008)and Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,2009,10,1039，在此藉由引用併入)。
教示UNA製備的代表性美國公開包括但不限於US8,314,227；及美國專利公開號2013/0096289；2013/0011922；及2011/0313020，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
對RNA分子末端的潛在穩定修飾可以包括N-(乙醯胺基己醯基)-4-羥基脯胺酸(Hyp-C6-NHAc)、N-(己醯基-4-羥基脯胺酸(Hyp-C6)、N-(乙醯基-4-羥基脯胺酸)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-去氧胸苷(醚)、N-(胺基己醯基)-4-羥脯胺酸(Hyp-C6-胺基)、2-二十二烷醯基-尿苷-3'-磷酸鹽、倒置2'-去氧修飾的核糖核苷酸、例如倒置的dT(idT)、倒置的dA(idA)及倒置的無鹼基2'-去氧核糖核苷酸(iAb)等。該修飾的揭露可以在WO 2011/005861中找到。
在一實施例中，寡核苷酸的3'或5'末端係連接到倒置的2'-去氧-修飾的核糖核苷酸，例如倒置的dT(idT)、倒置的dA(idA)或倒置的無鹼基2'-去氧-核糖核苷酸(iAb)。在一具體的實施例中，倒置的2'-去氧-修飾的核糖核苷酸連接到寡核苷酸的3'端，例如本文描述的正義股的3'-端，其中連接係藉由3'-3'磷酸二酯鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯鏈結。
在另一實施例中，該正義股的3'-端藉由3'-3'-硫代磷酸酯鏈結與反向無鹼基核糖核苷酸(iAb)連接。在另一實施例中，該正義股的3'-末端藉由3'-3'-硫代磷酸酯鏈結與反向dA(idA)連接。
在一具體的實施例中，該倒置的2'-去氧修飾的核糖核苷酸連接到寡核苷酸的3'端，例如本文描述的正義股的3'-端，其中連接係藉由3'-3'磷酸二酯鏈結或3'-3'-硫代磷酸酯鏈結。
在另一實施例中，該正義股的3'-末端核苷酸係反向dA(idA)，並藉由3'-3'-鏈結結(例如，3'-3'-硫代磷酸酯鏈結)連接到前面的核苷酸。
本揭露的RNAi劑的其他修飾包括5'磷酸鹽或5'磷酸鹽模擬物，例如RNAi劑反義股上的5'-末端磷酸鹽或磷酸鹽模擬物。合適的磷酸鹽模擬物揭露於例如US 2012/0157511中，其全部內容藉由引用併入本文。
A.本揭露的包含模體的修飾RNAi劑
在本揭露的某些方面，本揭露的雙股RNAi劑包括具有化學修飾的劑，例如在WO 2013/075035中公開的，其全部內容藉由引用併入本文。如本文及WO 2013/075035中所示，藉由將三個連續核苷酸上三個相同修飾的一個或多個模體引入RNAi劑的正義股或反義股，特別係在裂解位點處或附近，可以獲得優異的結果。在一些實施態樣中，RNAi劑的正義股及反義股可以另外被完全修飾。這些模體的引入會中斷有義或反義股的修飾模式(如果存在)。RNAi劑可以視需要地與親脂性配體例如C16配體接合，例如在正義股上。RNAi劑可以被用(S)-乙二醇核酸(GNA)修飾視需要地修飾，例如在反義股的一個或多個殘基上。
因此，本揭露提供了能夠在活體內抑制標標靶基因(即，SOD1基因)表現的雙股RNAi劑。該RNAi劑包含正義股及反義股。該RNAi劑的每股長度可以係15至30個核苷酸。例如，該每股可以係16至30個核苷酸長度、17至30個核苷酸長度、25至30個核苷酸長度、27至30個核苷酸長度、17至23個核苷酸長度、17至21個核苷酸長度、17至19個核 苷酸長度，19至25個核苷酸長度，19至23個核苷酸長度，19至21個核苷酸長度，21至25個核苷酸長度，或21至23個核苷酸長度。在某些實施態樣中，該每股的長度為19至23個核苷酸。
正義股及反義股通常形成複合雙鏈RNA(dsRNA)，在本文也稱為“RNAi劑”。該RNAi劑的雙鏈體區域長度可以係15至30個核苷酸對。例如，雙鏈體區域可以係長度為16至30個核苷酸對、長度為17至30個核苷酸對、長度為27至30個核苷酸對、長度為17至23個核苷酸對、長度為17至21個核苷酸對、長度為17至19個核苷酸對、長度19至25個核苷酸對、長度19至23個核苷酸對、長度19至21個核苷酸對、長度21至25個核苷酸對或長度21-23個核苷酸對。在另一實施例中，雙鏈體區域長度選自為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26及27個核苷酸。在適合的實施態樣中，雙鏈體區域的長度為19至21個核苷酸對。
在一實施態樣中，RNAi試劑可以在一條或兩條鏈的3'-端、5'-端或兩端包含一個或多個突出區域或加帽基團。突出可為1-6個核苷酸長度，例如2個6個核苷酸長度、1-5個核苷酸長度、2-5個核苷酸長度、1-4個核苷酸長度、2-4個核苷酸長度、1-3個核苷酸長度、2-3核苷酸長度或1-2核苷酸長度。在較佳的實施態樣中，核苷酸突出區域的長度為2個核苷酸。突出可為一股比另一股長的結果，或者是兩條相同長度的股交錯的結果。突出可以與標靶mRNA形成錯配，或者它可以與被靶向的基因序列互補，或者可為另一個序列。第一股及第二股也可以連接，例如，藉由額外的鹼基形成髮夾，或藉由其他非鹼基接頭。
在一實施態樣中，RNAi劑的突出端區域中的核苷酸可以各自獨立地係修飾的或未修飾的核苷酸，包括但不限於2'-糖修飾的，例如2-F、2'-O-甲基、胸苷(T)、及其任意組合。
例如，TT可以係任一股之任一端的突出序列。突出可以與標靶mRNA形成錯配，或它可與被靶向的基因序列互補，或者可為另一序列。
在RNAi劑的正義股、反義股或兩股的5'-或3'-突出可被磷酸化。在一些實施態樣中，突出區域包含兩個核苷酸，在該兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯，其中該兩個核苷酸可以相同或不同。在一個實施態樣中，突出存在於正義股、反義股或兩股的3'端。在一實施態樣中，該3'-突出存在於反義股。在一實施態樣中，該3'-突出存在於正義股。
RNAi劑可能只包含一突出，該RNAi劑可以增強RNAi的干擾活性，而不影響其整體穩定性。例如，單股突出可以位於正義股的3'-末端，或者在反義股的3'-末端。該RNAi也可能有一鈍端，該鈍端位於反義股的5'端(或正義股的3'端)，反之亦然。通常，RNAi的反義股在3'端有一核苷酸突出，而5'端係鈍的。雖然不希望受限於理論，但該反義股5'端的不對稱平端及反義股的3'端的突出有利於引導股裝載到RISC過程中。
在一實施態樣中，RNAi劑係長度19個核苷酸的雙鈍端，其中正義股在來自5'端的位置7、8、9處的三個連續核苷酸，其包含三個2'-F修飾的至少一模體。反義股在距離5'末端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含至少一個由三個2'-O-甲基修飾組成的模體。
在另一實施態樣中，該RNAi劑係長度20個核苷酸的雙鈍端，其中正義股在來自5'端的位置8、9、10處的三個連續核苷酸上，包含 三個2'-F修飾的至少一模體。反義股在距離5'端的位置11、12、13處的三個連續核苷酸，包含至少一個由三個2'-O-甲基修飾組成的模體。
在又一實施態樣中，該RNAi劑係長度21個核苷酸的雙鈍端，其中正義股在來自5'端的位置9、10、11處的三個連續核苷酸，包含三個2'-F修飾的至少一模體。反義股在距離5'端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含至少一個由三個2'-O-甲基修飾組成的模體。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含21個核苷酸的正義股及23個核苷酸的反義股，其中該正義股在來自5'端的位置9、10、11處的三個連續核苷酸，包含三個2'-F修飾的至少一模體；反義股距離5'端的位置11、12、13的三個連續核苷酸，包含至少一個由三個2'-O-甲基修飾組成的模體，其中RNAi劑的一端係鈍端，而另一端包含一2個核苷酸突出。適合地，2個核苷酸突出位於反義股的3'端。當2個核苷酸突出位於反義股的3'端時，末端三個核苷酸之間可能存在兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中三個核苷酸中的兩個係突出核苷酸，第三個核苷酸係突出核苷酸旁邊的配對核苷酸。在一實施態樣中，RNAi劑在正義股的5'端及反義股的5'端的末端三個核苷酸之間，其另外具有兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結。在一實施態樣中，RNAi劑的正義股及反義股中的每一核苷酸，包括作為模體序列一部分的核苷酸，都係修飾的核苷酸。在一實施態樣中，每個殘基獨立地被2'-O-甲基或2'-氟修飾，例如在替代模體序列中。視需要地，RNAi劑復包含配體(例如，親脂性配體，視需要地C16配體)。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含正義股及反義股，其中正義股長度為25至30個核苷酸，其中從5'末端核苷酸(位置1)開始，第一股的位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；反義股長度為36至66個核苷酸殘基，從3'末端核苷酸開始，在與正義股1至23位配對的位置，包含 至少8個核糖核苷酸以形成雙鏈體；其中至少反義股的3'末端核苷酸與正義股不成對，並且多達6個連續的3'末端核苷酸與正義股不成對，因此形成1至6個核苷酸的3'單股突出；其中反義股的5'末端包含10至30個不與正義股配對的連續核苷酸，因此形成10至30個核苷酸的單股5'突出；其中，當正義股及反義股對齊以獲得最大互補性時，至少正義股5'末端及3'末端核苷酸與反義股的核苷酸鹼基配對，因此在正義股及反義股之間形成實質上雙鏈體區域；反義股係沿至少19個反義股長度的核糖核苷酸與標靶RNA充分互補，在雙股核酸被引入到哺乳動物細胞時，其降地低標靶基因表現；並且其中正義股在三個連續的核苷酸，其包含至少一個由三個2'-F修飾組成的模體，其中至少一模體出現在裂解位點處或附近。反義股在裂解位點處或附近的三個連續核苷酸，其包含至少一個由三個2'-O-甲基修飾組成的模體。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含正義股及反義股，其中RNAi劑包含長度為至少25且至多29個核苷酸的第一股，及長度為至多30個核苷酸的第二股及至少從5'端開始的第位置11、12、13處三個連續核苷酸上的三個2'-O-甲基修飾的一模體序列；其中第一股的3'端及第二股的5'端形成鈍端，並且第二股在其3'端比第一股長1至4個核苷酸，其中在長度至少25個核苷酸雙鏈體區域區域，並且當RNAi劑被引入哺乳動物細胞時，第二股沿自身長度的至少19個核苷酸與標靶mRNA充分互補，以降低標把基因表現，並且RNAi劑的dicer裂解優先導致包含第二股3'末端的siRNA，因此降低哺乳動物中標標靶基因的表現。視需要地，該RNAi劑復包含配體。
在一實施態樣中，該RNAi劑的正義股在三個連續核苷酸上，含有三個相同修飾的至少一模體，其中模體之一出現在正義股的裂解位點處。
在一實施態樣中，該RNAi劑的反義股還可以在三個連續的核苷酸，包含有三個相同修飾的至少一模體序列，其中模體序列之一出現在反義股的裂解位點處或附近。
雙鏈體區域長度為17至23核苷酸的RNAi劑，反義股的裂解位點通常在5'端的位置10、11及12處附近。因此，三個相同修飾的模體序列可能出現在位置9、10、11處；10、11、12處；11、12、13處；12、13、14處；或從反義股5'端的第一核苷酸起算，反義股的位置13、14、15處，或從雙鏈體區域內從5'端開始的第1個配對核苷酸起算。反義股中的裂解位點也可能根據RNAi的雙鏈體區域從5'端開始的長度而變化。
RNAi劑的正義股可以在股的裂解位點處的三個連續核苷酸，包含三個相同修飾的至少一個模體；並且反義股可以在鏈的裂解位點處或附近的三個連續核苷酸上，具有三個相同修飾的至少一個模體序列。當正義股及反義股形成dsRNA雙鏈體時，正義股及反義股可以排列成正義股之三個核苷酸的一個模體，及反義股三個核苷酸的一個模體，並具有至少一核苷酸重疊，即正義股中模體的三個核苷酸中的至少一核苷酸與反義股中模體的三個核苷酸中的至少一核苷酸形成鹼基對。或者，至少兩個核苷酸可重疊，或者所有三個核苷酸都可重疊。
在一實施態樣中，RNAi劑的正義股可以在三個連續核苷酸，包含一個以上的具有三個相同修飾的模體。第一個模體可出現在鏈的裂解位點處或附近，而其他模體可以係翼修飾。本文中的術語“翼修飾(wing modification)”係指出現在股的另一部分的模體，該模體與在相同鏈的裂解位點處或附近的模體分離。該翼修飾與第一模體相鄰或被至少一個或多個核苷酸隔開。當該模體彼此直接相鄰時，模體的化學性質彼此不同，並且當模體被一個或多個核苷酸隔開時，其化學性質可以相同或不同。可能存在兩個或更多個翼修飾。例如，當存在兩個翼修飾時，每個翼修飾可以發生在相對於位於或靠近裂解位點的第一模體的一端，或在前導模體的任一側。
與正義股相同，RNAi劑的反義股可以在三個連續的核苷酸，包含一個以上具有三個相同修飾的模體，其中至少一個模體出現在股的裂解位點處或附近。該反義股還可以包含一個或多個翼修飾，該翼修飾與可能存在於正義股的翼修飾相似的方式排列。
在一實施態樣中，RNAi劑的正義股或反義股的翼修飾通常不包括股的3'-端、5'-端或兩端的第一個或前兩個末端核苷酸。
在另一實施態樣中，RNAi劑的正義股或反義股上的翼修飾通常不包括股的3'-端、5'-端或兩端的雙鏈體區域內的第一個或前兩個配對的核苷酸。
當該RNAi劑的正義股及反義股分別含有至少一翼修飾時，該翼修飾可以落在雙鏈體區域的同一端，並且具有1個、2個或3個核苷酸的重疊。
當該RNAi劑的正義股及反義股各自包含至少兩個側翼修飾時，正義股及反義股可以這樣排列，使得來自一股的兩個修飾落到雙鏈體區域的一端，該兩個修飾具有一個、兩個或三個核苷酸的重疊；來自一股的兩個修飾落在雙鏈體區域的另一端，該兩個修飾具有一個、兩個或三個 核苷酸的重疊；兩個修飾一股落在前導模體的每一側，在雙鏈體區域有一個、兩個或三個核苷酸的重疊。
在一實施態樣中，RNAi劑包含與標靶、雙鏈體內或其組合的錯配。該錯配可能發生在突出區域或雙鏈體區域。鹼基對可以根據它們促進解離或熔化的傾向(例如，根據特定配對的結合或解離自由能，最簡單的方法係在單個配對的基礎上檢查這些配對，儘管下一個相鄰鹼基對或類似的分析也可以使用)。在促進解離方面：A：U優於G：C；G：U優於G：C；並且I：C優於G：C(I=肌苷)。錯配，例如非規範或規範配對以外的(如本文別處所述)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；包括通用鹼基的配對優於規範配對。
在一實施態樣中，該RNAi劑包含反義股在5'端的雙鏈體區域內的前1、2、3、4或5個鹼基對中的至少一個，該複數鹼基對獨立地選自以下群組：A：U、G：U、I：C及錯配對，例如非規範或規範配對以外或包括通用鹼基的配對，以促進反義股在雙鏈體5'端的解離。
在一實施態樣中，在雙鏈體區域內從反義股的5'端開始的第1位的核苷酸，該核甘酸係選自由A、dA、dU、U及dT組成的群組。或者，從反義股的5'端開始的雙鏈體區域內的前1、2或3個鹼基對中的至少一個係AU鹼基對。例如，從反義股5'端開始的雙鏈體區域內的第一個鹼基對係AU鹼基對。
在另一實施態樣中，正義股3'端的核苷酸係去氧胸苷(dT)。在另一實施態樣中，反義股3'-端的核苷酸係去氧胸苷(dT)。在一實施態樣中，有一個短序列的去氧胸苷核苷酸，例如，在有義或反義股的3'-末端有兩個dT核苷酸。
在一實施態樣中，正義股序列可以由式(I)表示：
5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(ZZZ)j-Na-nq 3' (I)
其中：
i及j各自獨立地為0或1；
p及q各自獨立地為0至6；
每個Na獨立地代表包含0至25個修飾核苷酸的寡核苷酸序列，每個序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每個Nb獨立地代表包含0至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
每個np及nq獨立地代表一突出核苷酸；
其中Nb及Y不具有相同的修飾；及
XXX、YYY及ZZZ各自獨立地代表三個連續核苷酸之三個相同修飾的一模體。適合的YYY係所有2'-F修飾的核苷酸。
在一實施態樣中，Na或Nb包括交替模式的修飾。
在一實施態樣中，YYY模體序列出現在正義股的裂解位點處或附近。例如，當RNAi劑具有長度為17至23個核苷酸的雙鏈體區域時，YYY模體可以出現在正義股-的裂解位點或其附近(例如：可以出現在位置6、7、8、7、8、9、8、9、10、9、10、11、10、11、12或11、12、13)，從第一核苷酸起算，從5'端開始；或視需要地，從雙鏈體區域內的第一對核苷酸起算，從5'端開始。
在一實施態樣中，i係1，並且j係0，或者i係0，並且j係 1，或者i及j都為1。因此，正義股可以由以下式表示：
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Ib)；
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic)；或
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id)。
當正義股由式(Ib)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
每一Na可以獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當正義股由式(Ic)表示時，Nb表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na可以獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當正義股由式(Id)表示時，每個Nb獨立地表示包含0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。適合地，Nb係0、1、2、3、4、5或6。每個Na可以獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y及Z中的每一個可以彼此相同或不同。
在其他實施例中，i為0，j為0，正義股可由下式表示：5' np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
當正義股由式(Ia)表示時，每個Na可以獨立地表示包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
在一實施態樣中，RNAi的反義股序列可以由式(II)表示：
5' nq’-Na '-(Z’Z'Z')k-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-(X'X'X')l-N' a-np ' 3' (II)
其中：
k及l各自獨立地為0或1；
p'及q'各自獨立地為0至6；
每個Na'獨立地代表包含0至25個修飾核苷酸的寡核苷酸序列，每個序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每個Nb'獨立地代表包含0至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
每個np'及nq'獨立地代表一突出核苷酸；
其中Nb'及Y'不具有相同的修飾；及
X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸之三個相同修飾的一模體。
在一實施態樣中，Na'或Nb'包括交替模式的修飾。
Y'Y'Y'模體出現在反義股的裂解位點處或附近。例如，當RNAi劑具有17至23個核苷酸長度的雙鏈體區域時，Y'Y'Y'模體可以出現在位置9、10、11；10、11、12；以及11、12、13；12、13、14；或反義股的13、14、15，從5'端開始，從第一核苷酸起數；或視需要地，從雙鏈體區域內的第一對核苷酸起數，從5'端開始。適合地，Y'Y'Y'模體出現在位置11、12、13。
在一實施態樣中，Y'Y'Y'模體都為2'-OMe修飾的核苷酸。
在一實施態樣中，k為1且l為0，或k為0且l為1，或k及l均為1。
因此，反義股可以用以下式表示：
5' nq’-Na '-Z'Z'Z'-Nb '-Y'Y'Y'-Na '-np’3' (IIb)；
5' nq’-Na '-Y'Y'Y'-Nb '-X'X'X'-np’3' (IIc)；或
5' nq’-Na '-Z'Z'Z'-Nb '-Y'Y'Y'-Nb '-X'X'X'-Na '-np’3' (IId)。
當反義股由式(IIb)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na'獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股示由式(IIc)表示時，Nb'表示包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na'獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當反義股由式(IId)表示時，每個Nb'獨立地代表包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2或0的寡核苷酸序列修飾的核苷酸。每個Na'獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。適合地，Nb為0、1、2、3、4、5或6。
在其他實施態樣中，k為0且l為0且反義股可由下式表示：
5' np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3' (Ia)。
當反義股由式(IIa)表示時，每個Na'獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
X'、Y'及Z'中的每一個可以彼此相同或不同。
正義股及反義股的每一核苷酸可以獨立被以下基團修飾：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羥基或2'-氟。例如，正義股及反義股的每個核苷酸都獨立地被2'-O-甲基或2'-氟修飾。每個X、Y、Z、X'、Y'及Z'特別可以代表2'-O-甲基修飾或2'-氟修飾。
在一實施態樣中，當雙鏈體區域為21 nt時，該RNAi劑的正義股可以包含出現在股的第9、10及11位的YYY模體序列，從5'端的第一個核苷酸起算，或視需要地，從雙鏈體區域內的第一對核苷酸起數，從5'-端開始；Y代表2'-F修飾。正義股可以另外包含XXX模體序列或ZZZ模體作為複合區域另一端的翼修飾；XXX及ZZZ各自獨立地代表2'-OMe修飾或2'-F修飾。
在一實施態樣中，反義股可以包含在股的第11、12、13位出現的Y'Y'Y'模體，從5'端的第一核苷酸開始計數，或視需要地，從第一對開始計數雙鏈體區域內的核苷酸，從5'-端開始；Y'代表2'-O-甲基修飾。反義股可以在雙鏈體區域的另一端額外包含X'X'X'模體或Z'Z'Z'模體作為翼修飾；X'X'X'及Z'Z'Z'各自獨立地表示2'-OMe修飾或2'-F修飾。
由上述式(Ia)、(Ib)、(Ic)及(Id)中任一表示的正義股與由式(IIa)、(IIb)、(IIb)、(IIc)及(IId)中任一個表示的反義股個別形成雙鏈體。
因此，用於本揭露方法的RNAi劑可包含正義股及反義股，每股具有14至30個核苷酸，RNAi雙鏈體由式(III)表示：
正義：5' np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反義：3' np’-Na’-(X’X'X')k-Nb’-Y'Y'Y'-Nb’-(Z'Z'Z')l-Na’-nq’5'
其中：
i、j、k及l各自獨立地為0或1；
p、p'、q及q'各自獨立地為0至6；
每個Na及Na'獨立地代表包含0至25個修飾核苷酸的寡核苷酸序列，每個序列包含至少兩個不同修飾的核苷酸；
每個Nb及Nb'獨立地代表包含0至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列；
其中
np'、np、nq'及nq中的每一個可能存在或可能不存在，獨立地代表突出核苷酸；及
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'及Z'Z'Z'各自獨立地代表三個連續核苷酸之三個相同修飾的一模體。
在一實施態樣中，i為0且j為0；或i為1，j為0；或i為0，j為1；或者i及j都為0；或者i及j都為1。在另一實施態樣中，k係0並且l係0；或k為1，l為0；k為0，l為1；或者k及l都為0；或者k及l都為1。
形成RNAi雙鏈體的正義股及反義股的示例性組合包括下式：
5' np-Na-Y Y Y-Na-nq 3' 3' np’-Na’-Y'Y'Y'-Na’nq’5' (IIIa)
5' np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3' np’-Na’-Y'Y'Y'-Nb’-Z'Z'Z'-Na’nq’5' (IIIb)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3' 3' np’-Na’-X'X'X'-Nb’-Y'Y'Y'-Na’-nq’5' (IIIc)
5' np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3' 3' np’-Na’-X'X'X'-Nb’-Y'Y'Y'-Nb’-Z'Z'Z'-Na-nq’5' (IIId)
當該RNAi劑由式(IIIa)表示時，每個Na獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當該RNAi劑由式(IIIb)表示時，每個Nb獨立地代表包含1至10、1至7、1至5或1至4個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。每個Na獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當該RNAi劑以式(IIIc)表示時，每個Nb、Nb'獨立地代表包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2的寡核苷酸序列或0個修飾的核苷酸。每個Na獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。
當該RNAi劑以式(IIId)表示時，每個Nb、Nb'獨立地代表包含0至10、0至7、0至10、0至7、0至5、0至4、0至2的寡核苷酸序列或0個修飾的核苷酸。每個Na、Na'獨立地代表包含2至20、2至15或2至10個修飾核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na'、Nb及Nb'中的每一個獨立地包含交替模式的修改。
在一實施態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾係2’-O-甲基或2‘-氟修飾。在另一實施態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾，並且np'>0，並且至少一np'連接到相鄰的核苷酸a藉由硫代磷酸酯鏈結。在又一實施態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2‘-O-甲基或2’-氟修飾，np'>0，並且至少一個np'與相鄰核苷酸連接藉由硫代磷酸酯鏈結，正義股與一個或多個藉由二價或三價支鏈接頭(如下所述)連接的C16(或相關)部分接合。在另一實施態樣中，當該RNAi劑由式(IIId)表示時，Na修飾為2’-O-甲基或2’-氟修飾，np'>0，並且至少一np'藉由硫代磷酸酯鏈結，正義股包含至少一硫代磷酸酯鏈結，並且正義股接合至一個或多個親脂性部分，例如C16(或相關)部分，視需要地藉由二價或三價支鏈接頭連接。
在一實施態樣中，當該RNAi劑由式(IIIa)表示時，Na修飾係2’-O-甲基或2’-氟修飾，np'>0，並且至少一個np'藉由硫代磷酸酯鏈結，正義股包含至少一硫代磷酸酯鏈結，並且正義股接合至一個或多個親脂性部分，例如藉由二價或三價支鏈接頭連接的C16(或相關)部分。
在一實施態樣中，該RNAi劑係含有至少兩個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示的雙鏈體的多聚體，其中該雙鏈體藉由接頭連接。接頭可以係可裂解的或不可裂解的。視需要地，多聚體還包含配體。每個雙鏈體可以靶向相同的基因或兩個不同的基因；或者每個雙鏈體可以在兩個不同的靶點靶向相同的基因。
在一實施態樣中，該RNAi劑係含有三個、四個、五個、六個或更多個由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示的雙鏈體的多聚體，其中該雙鏈體係藉由接頭連接的。接頭可以係可裂解的或不可裂解的。視需要地，多聚體還包含配體。每個雙鏈體可以靶向相同的基因或兩個不同的基因；或者每個雙鏈體可以在兩個不同的靶點靶向相同的基因。
在一實施態樣中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)及(IIId)表示的兩種RNAi劑在5'端相互連接，並且3'端中的一個或兩個視需要地與配體接合。每種劑都可以靶向相同的基因或兩種不同的基因；或者每一劑可以在兩個不同的靶點靶向相同的基因。
各種出版物描述了可用於本揭露方法的多聚體RNAi劑。這樣的公開出版物包括WO2007/091269、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520；US 7858769，每一全部內容在此藉由引用併入本文。
在某些實施態樣中，本揭露的組成物及方法包括如本文所述的RNAi劑的膦酸乙烯酯(VP)修飾。在示例性實施態樣中，本揭露的含有5'-膦酸乙烯酯修飾的核苷酸具有以下結構：
Figure 111105127-A0202-12-0132-7
其中X係O或S；
R為氫、羥基、氟或C1-20烷氧基(例如甲氧基或正十六烷氧基)；
R5'為=C(H)-P(O)(OH)2並且C5'碳及R5'之間的雙鍵在E或Z方向(例如E方向)；及
B為核鹼基或修飾的核鹼基，視需要地其中B係腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在一實施態樣中，R5'係=C(H)-P(O)(OH)2，並且C5'碳及R5'之間的雙鍵係E取向的。在另一實施態樣中，R係甲氧基並且R5'係=C(H)-P(O)(OH)2並且C5'碳及R5'之間的雙鍵係E取向。在另一實施態樣中，X係S，R係甲氧基，並且R5'係=C(H)-P(O)(OH)2並且C5'碳及R5'之間的雙鍵係E取向的。
本公開的膦酸乙烯酯可以連接至本公開的dsRNA的反義股或正義股。在某些適合的實施態樣中，本公開的膦酸乙烯酯連接至dsRNA的反義股，視需要地在dsRNA的反義股的5'端。
本揭露的組成物及方法也考慮了磷酸乙烯酯修飾。示例性的磷酸乙烯酯結構包括前述結構，其中R5'係=C(H)-OP(O)(OH)2並且C5'碳及R5'之間的雙鍵在E或Z方向(例如，E方向)。
E.熱去穩定化修飾
在某些實施態樣中，可以藉由在反義股的種子區域中帶入熱去穩定化修飾來優化dsRNA分子的RNA干擾。如本文所用，“種子區”係 指在參考股的5'末端的位置2至9。例如，可在反義股的種子區域中帶入熱去穩定化修飾，以減少或抑制脫標靶基因沉默。
術語“熱去穩定化修飾(thermally destabilizing modification)”包括以下這樣的修飾，該修飾將導致具有比沒有這種修飾的dsRNA的總解鏈溫度(Tm)更低的Tm的dsRNA。例如，熱去穩定化修飾可以將dsRNA的Tm降低1至4℃，例如1、2、3或4攝氏度。並且，術語“熱去穩定化核苷酸”係指含有一個或多個熱去穩定化修飾的核苷酸。
已經發現，具有反義股的dsRNA在反義股的前9個核苷酸位置(從5'端計算)內包含至少一雙鏈體的熱去穩定化修飾，其具有降低的脫標靶基因沉默活性。因此，在一些實施態樣中，反義股在反義股的5'區域的前9個核苷酸位置內包含至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)雙鏈體的熱去穩定化修飾。在一些實施態樣中，雙鏈體的一個或多個熱去穩定化修飾位於反義股5'端的2至9位，或適合4至8位。在一些進一步的實施態樣中，雙鏈體的熱去穩定化修飾位於反義股5'端的6、7或8位。在一些進一步的實施態樣中，雙鏈體的熱去穩定化修飾位於反義股5'端的位置7處。在一些實施態樣中，雙鏈體的熱去穩定化修飾位於反義股5'端的2、3、4、5或9位置。
熱去穩定化修飾可以包括但不限於無鹼基修飾；與相反股中的相反核苷酸錯配；及糖修飾，例如2'-去氧修飾、無環核苷酸，例如未鎖核酸(UNA)或乙二醇核酸(GNA)；及2'-5'-連接的核糖核苷酸(“3'-RNA”)。
示例性的無鹼基修飾包括但不限於以下內容：
Figure 111105127-A0202-12-0134-8
其中R=H、Me、Et或OMe；R'=H、Me、Et或OMe；R”=H、Me、Et或OMe
Figure 111105127-A0202-12-0134-9
其中B係修飾的或未修飾的核鹼基。
示例性的糖修飾包括但不限於以下：
Figure 111105127-A0202-12-0134-10
其中B係修飾的或未修飾的核鹼基。
在一些實施態樣中，雙鏈體的熱去穩定化修飾選自一群組，該群組由以下組成：
Figure 111105127-A0202-12-0135-11
其中B係修飾或未修飾的核鹼基，每個結構上的星號代表R、S或外消旋體(racemic)。
在一些實施態樣中，雙鏈體的熱去穩定化修飾選自一群組，該群組由以下組成：
Figure 111105127-A0202-12-0135-12
其中B係修飾或未修飾的核鹼基，星號代表R、S或外消旋體(例如S)。
術語“無環核苷酸(acyclic核苷酸)”係指具有無環核糖的任何核苷酸，例如，其中核糖碳之間的任何鏈結(例如，C1'-C2'、C2'-C3'、C3'-C4'、C4'-O4'或C1'-O4')係不存在或核糖碳或氧中的至少一個(例如C1'、C2'、C3'、C4'或O4')獨立地或組合地不存在於核苷酸中.在一些實施態樣中，無環核苷酸係
Figure 111105127-A0202-12-0136-13
、
Figure 111105127-A0202-12-0136-14
、
Figure 111105127-A0202-12-0136-15
、
Figure 111105127-A0202-12-0136-16
或
Figure 111105127-A0202-12-0136-17
，其中B係修飾的或未修飾的核鹼基，R1及R2獨立地係H、鹵素、OR3或烷基；R3係H、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)。術語“UNA”係指未鎖的無環核酸，其中糖的任何鍵已被去除，形成未鎖的“糖”殘基。在一實例方案中，UNA還包括單體，其在C1'-C4'之間的鍵被去除(即C1'及C4'碳之間的共價碳-氧-碳鍵)。在另一實施例中，糖的C2'-C3'鍵(即C2'及C3'碳之間的共價碳-碳鍵)被去除(參見Mikhailov et.al.,Tetrahedron Letters,26(17)：2059(1985)；and Fluiter et al.,Mol.Biosyst.,10：1039(2009，其全文藉由引用方式併入本文)。無環衍生物在不影響Watson-Crick配對的情況下提供了更大的骨架靈活性。無環核苷酸可以藉由2'-5'或3'-5'鍵連接。
術語“GNA”係指乙二醇核酸，它係一種類似於DNA或RNA的聚合物，但其“骨架”的組成不同，其藉由磷酸二酯鍵連接的重複甘油單元組成：
Figure 111105127-A0202-12-0136-18
雙鏈體的熱去穩定化修飾可以係熱去穩定核苷酸與dsRNA雙鏈體中相反股中的相反核苷酸之間的錯配(即非互補鹼基對)。示例性錯 配鹼基對包括G：G、G：A、G：U、G：T、A：A、A：C、C：C、C：U、C：T、U：U、T：T、U：T或其組合。所屬技術領域已知的其他錯配鹼基配對也適用於本發明。錯配可以發生在核苷酸之間，如天然存在的核苷酸或修飾的核苷酸，即錯配鹼基配對可以發生在來自各個核苷酸的核鹼基之間，而與該核苷酸的核糖的修飾無關。在某些實施態樣中，dsRNA分子在錯配配對中包含至少一核鹼基，其係2'-去氧核鹼基；例如，2'-去氧核鹼基位於正義股。
在一些實施態樣中，正義股的種子區域中的雙鏈體的熱去穩定修飾包括與標靶mRNA的互補鹼基的Watson-Crick氫鍵合受損的核苷酸，例如修飾的核鹼基：
Figure 111105127-A0202-12-0137-19
無鹼基核苷酸、無環核苷酸修飾(包括UNA及GNA)及錯配修飾的更多實施例已在WO 2011/133876中詳細描述，其藉由引用全部併入本文。
熱去穩定修飾還可以包括通用鹼基，其與相對鹼基形成氫鍵的能力降低或消除，以及磷酸修飾。
在一些實施態樣中，雙鏈體的熱去穩定化修飾包括具有非規範鹼基的核苷酸，例如但不限於具有受損或完全消除與相反鏈中的鹼基形 成氫鍵的能力的核鹼基修飾。如WO 2010/0011895中所述，已經評估了這些核鹼基修飾對dsRNA雙鏈體的中心區域的去穩定化，該文獻藉由引用整體併入本文。示例性的核鹼基修飾係：
Figure 111105127-A0202-12-0138-20
在一些實施態樣中，反義股種子區域中雙鏈體的熱去穩定修飾包括與標靶mRNA上的鹼基互補的一個或多個α-核苷酸，例如：
Figure 111105127-A0202-12-0138-21
其中R係H、OH、OCH3、F、NH2、NHMe、NMe2或O-烷基。
與天然磷酸二酯鏈結相比，已知會降低dsRNA雙鏈體的熱穩定性的示例性磷酸修飾係：
Figure 111105127-A0202-12-0138-22
R基團的烷基可以係C1至C6烷基。R基團的具體烷基包括但不限於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、戊基及己基。
如所屬技術領域中具有通常知識者將認識到的，鑑於核鹼基的功能作用係定義本公開的RNAi劑的特異性，而核鹼基修飾可以如本文所述的各種方式進行，例如，將去穩定化修飾引入到本揭露的RNAi劑，例如，為了相對於脫靶效應，增強中靶效應的目的，本揭露內容的RNAi劑之可用的修飾範圍以及通常存在於本公開內容的RNAi劑，兩者修飾範圍對於非核鹼基修飾而言往往要大得多，例如對於非核鹼基修飾。修飾糖基或多核糖核苷酸的磷酸骨架。此類修飾在本揭露的其他部分中進行了更詳細的描述，並且明確考慮了本揭露的RNAi劑，其具有天然核鹼基或如上文或本文其他地方所述的修飾的核鹼基。
除了包含熱去穩定修飾的反義股之外，dsRNA還可以包含一個或多個穩定修飾。例如，dsRNA可以包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)穩定化修飾。沒有限制，穩定化修飾都可以存在於一股中。在一些實施態樣中，正義股及反義股都包含至少兩個穩定化修飾。穩定化修飾可以發生在正義股或反義股的任何核苷酸。例如，穩定化修飾可以發生在正義股或反義股的每個核苷酸；每個穩定化修飾都可以在正義股或反義股以交替模式發生；或正義股或反義股包含交替模式的穩定化修飾。正義股的穩定化修飾的交替模式可以與反義股上的穩定化修飾的交替模式相同或不同，並且正義股的穩定化修飾的交替模式可以相對於反義股的穩定化修飾的交替模式有偏移。
在一些實施態樣中，該反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)穩定化修飾。沒有限制，該反義股中的穩定修飾可以存在於任何位置。在一些實施態樣中，該反義包含在從5'-端開始的位置2、6、8、9、14及16處的穩定化修飾。在一些其他實施態樣中，該反義包括在從5'-端開始的位置2、6、14 及16處的穩定化修飾。在又一些其他實施態樣中，該反義包括在從5'端開始的位置2、14及16處的穩定化修飾。
在一些實施態樣中，反義股包含至少一個與去穩定化修飾相鄰的穩定化修飾。例如，穩定化修飾可以係去穩定化修飾的5'-端或3'-端的核苷酸，即在從去穩定化修飾的位置開始的-1或+1位。在一些實施態樣中，該反義股在去穩定化修飾的5'-端及3'-端中的每一處包含穩定化修飾，即從去穩定化修飾的位置開始的位置-1及+1。
在一些實施態樣中，反義股在去穩定化修飾的3'端包含至少兩個穩定化修飾，即在去穩定化修飾位置的+1及+2位。
在一些實施態樣中，正義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)穩定化修飾。沒有限制，正義股中的穩定修飾可以存在於任何位置。在一些實施態樣中，正義股在從5'-端開始的位置7、10及11處包含穩定化修飾。在一些其他實施態樣中，正義股在從5'-端開始的位置7、9、10及11處包含穩定化修飾。在一些實施態樣中，正義股包含在與反義股的位置11、12及15相反或互補的位置處的穩定化修飾，從反義股的5'端開始計數。在一些其他實施態樣中，正義股包含在與反義股的位置11、12、13及15相反或互補的位置處的穩定化修飾，從反義股的5'端開始計數。在一些實施態樣中，正義股包含兩個、三個或四個穩定修飾的塊。
在一些實施態樣中，正義股不包含在相反處的穩定化修飾或互補於反義股中雙鏈體的熱去穩定化修飾。
示例性的熱穩定修飾包括但不限於2'-氟修飾。其他熱穩定改性包括但不限於LNA。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA包含至少四個(例如，四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)2'-氟核苷酸。沒有限制，2'-氟核苷酸都可以存在於一股中。在一些實施態樣中，該正義股及反義股都包含至少兩個2'-氟核苷酸。該2'-氟修飾可以發生在正義股或反義股的任何核苷酸。例如，該2'-氟修飾可以發生在正義股或反義股的每個核苷酸；每個2'-氟修飾可以在正義股或反義股以交替模式發生；或正義股或反義股包含交替模式的兩個2'-氟修飾。正義股2'-氟修飾的交替模式可以與反義股相同或不同，並且正義股2'-氟修飾的交替模式可以相對於反義股的2'-氟修飾。
在一些實施態樣中，反義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)2'-氟核苷酸。沒有限制，該反義股中的2'-氟修飾可以存在於任何位置。在一些實施態樣中，該反義物在距離5'-端的位置2、6、8、9、14及16處包含2'-氟核苷酸。在一些其他實施態樣中，該反義物在距離5'-端的位置2、6、14及16處包含2'-氟核苷酸。在其他一些實施態樣中，該反義物在距離5'-端的位置2、14及16處包含2'-氟核苷酸。
在一些實施態樣中，該反義股包含至少一個與去穩定化修飾相鄰的2'-氟核苷酸。例如，2'-氟核苷酸可以係去穩定化修飾的5'-端或3'-端的核苷酸，即在去穩定化修飾位置的-1或+1位。在一些實施態樣中，該反義股在去穩定化修飾的5'-端及3'-端中的每一個處包含2'-氟核苷酸，即從去穩定化修飾的位置開始的位置-1及+1。
在一些實施態樣中，該反義股在去穩定化修飾的3'端，即在去穩定化修飾位置的+1及+2位包含至少兩個2'-氟核苷酸。
在一些實施態樣中，該正義股包含至少兩個(例如，兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或更多個)2'-氟核苷酸。沒有限制，該正義股中的2'-氟修飾可以存在於任何位置。在一些實施態樣中，該反義物在距離5'-端的第7、10及11位包含2'-氟核苷酸。在一些其他實施態樣中，該正義股在距離5'-端的第7、9、10及11位包含2'-氟核苷酸。在一些實施態樣中，該正義股在與反義股的位置11、12及15相對或互補的位置處包含2'-氟核苷酸，從反義股的5'-末端起數。在一些其他實施態樣中，該正義股在與反義股的第11、12、13及15位相對或互補的位置處包含2'-氟核苷酸，從反義股的5'-末端起數。在一些實施態樣中，該正義股包含兩個、三個或四個2'-氟核苷酸的塊。
在一些實施態樣中，該正義股在與反義股中雙鏈體的熱去穩定化修飾相反或互補的位置不包含2'-氟核苷酸。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子包含21個核苷酸(nt)的正義股及23個核苷酸(nt)的反義股，其中該反義股包含至少一種熱去穩定核苷酸，其中該至少一種熱去穩定核苷酸發生在反義股的種子區(即，在反義股5'端的2至9位)，其中dsRNA的一端係鈍端，而另一端包含2nt突出，並且其中dsRNA視需要地還具有以下特徵中的至少一種(例如，一種、兩種、三種、四種、五種、六種或全部七種)：(i)反義包括2、3、4、5或6個2'-氟修改；(ii)反義包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配體接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA在反義股的5'端包含一鈍端。適合地，2 nt突出位於反義的3'端。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子包含正義股及反義股，其中：該正義股的長度為25至30個核苷酸殘基，其中從5'末端核苷酸(位置1)開始，正義股的位置1至23包含至少8個核糖核苷酸；反義股長度為36至66個核苷酸殘基，從3'末端核苷酸開始，至少有8個核糖核苷酸在與正義股的1至23位形成配對，形成雙鏈體；其中反義股的至少3'端核苷酸與正義股成對，並且多達6個連續的3'端核苷酸與正義股不成對，因此形成1至6個核苷酸的3'單股突出；其中反義股的5'末端包含10至30個與正義股不成對的連續核苷酸，因此形成10至30個核苷酸的單股5'突出；其中，當正義股及反義股對齊以獲得最大互補性時，至少正義股5'末端及3'末端核苷酸與反義股的核苷酸鹼基配對，因此在正義股及反義股之間形成實質上複合的區域；當將所述雙股核酸引入哺乳動物細胞中時，反義股沿至少19個反義股長度的核糖核苷酸與標靶RNA充分互補，以降低標靶基因表現；並且其中反義股含有至少一熱去穩定化核苷酸，其中至少一種熱去穩定核苷酸在反義股的種子區域中(即在反義股5'端的2至9位)。例如，熱去穩定化核苷酸出現在與正義股的5'端的位置14至17相反或互補的位置之間，並且其中dsRNA視需要地復具有至少一個(例如，一個、兩個、三個、四個，五個、六個或全部七個)以下特徵：(i)反義包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配體接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA包含長度為12至30個核苷酸對的雙鏈體區域。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子包含正義股及反義股，其中該dsRNA分子包含一個長度為至少25個且至多29個核苷酸的 正義股，及一個長度為至多30個核苷酸的反義股，該正義股包含在從5'端開始的位置11處易受酵素降解的修飾核苷酸，其中該正義股的3'端及反義股的5'端形成鈍端，並且該反義股係3'末端比正義股長1至4個核苷酸，其中長度至少為25個核苷酸的雙鏈體區域，並且當該dsRNA分子引入哺乳動物細胞時，反義股與沿著反義股長度的至少19個核苷酸的標靶mRNA充分互補，以降低標靶基因表現，及其中該dsRNA的dicer裂解優先產生包含該反義股的前述3'端的siRNA，因此降低標靶基因在哺乳動物中的表現，其中反義股含有至少一熱不穩定化核苷酸，其中至少一熱不穩定核苷酸係位於反義股的種子區(即在反義股5'端的位置2至9處)，並且其中dsRNA視需要地還具有以下特徵中的至少一種(例如，一種、兩種、三種、四種、五種、六種或全部七種)：(i)反義包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配體接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA具有長度為12至29個核苷酸對的雙鏈體區域。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的正義股及反義股中的每個核苷酸可以被修飾。每個核苷酸可以藉由相同或不同的修飾進行修飾，該修飾可以包括非連接磷酸氧中的一種或兩種非連接磷酸氧或一個或多個連接磷酸氧的一個或多個改變；核糖成分的改變，例如核糖上2’羥基的改變；用“去磷酸化”接頭大規模替換磷酸鹽部分；天然鹼基的修飾或替換；以及核糖-磷酸骨架的替換或修飾。
由於核酸係次單元的聚合物，許多修飾發生在核酸內重複的位置，例如鹼基或磷酸部分的修飾，或磷酸部分的非連接O。在某些情況 下，修飾將發生在核酸中的所有主題位置，但在許多情況下不會。例如，修飾可能僅發生在3'或5'末端位置，可能僅發生在末端區域，例如末端核苷酸的位置或一股的最後2、3、4、5或10個核苷酸。修飾可能發生在雙股區域、單股區域或兩者中。修飾可能僅發生在RNA的雙股區域，也可能僅發生在RNA的單股區域。例如，非連接O位置的硫代磷酸酯修飾可能僅發生在一個或兩個末端，可能僅發生在末端區域，例如末端核苷酸的位置或一股最後2、3、4、5或10個核苷酸，或可能出現在雙股及單股區域，特別係在末端。該5'末端或末端可以被磷酸化。
以下係可能的，例如，提高穩定性，在突出包括特定鹼基，或在單股突出(例如在5'或3'突出、或在兩者中)包括修飾的核苷酸或核苷酸替代物。例如，可能需要在突出包括嘌呤核苷酸。在一些實施態樣中，3'或5'突出中的所有或一些鹼基可以被修飾，例如用本文所述的修飾。修飾可以包括，例如，在核糖的2'位置使用所屬技術領域已知的修飾，例如，使用去氧核糖核苷酸，2'-去氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修飾而不係核鹼基的核糖，以及磷酸基團的修飾，例如硫代磷酸酯修飾。突出不需要與目標序列同源。
在一些實施態樣中，正義股及反義股的每個殘基獨立地被以下修飾：LNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-去氧或2'-氟。該股可以包含一種以上的修飾。在一些實施態樣中，正義股及反義股的每個殘基獨立地被2'-O-甲基或2'-氟修飾。應當理解，這些修飾係額外於反義股中存在的雙鏈體的至少一熱去穩定化修飾。
在正義股及反義股通常存在至少兩種不同的修飾。該兩種修飾可以係2'-去氧、2'-O-甲基或2'-氟修飾、無環核苷酸或其他。在一些實 施態樣中，正義股及反義股各自包含兩種不同修飾的核苷酸，該修飾選自2'-O-甲基或2'-去氧。在一些實施態樣中，正義股及反義股的每個殘基獨立地被以下修飾：2'-O-甲基核苷酸、2'-去氧核苷酸、2'-去氧-2'-氟核苷酸、2'-O-N-甲基乙醯胺(2'-O-NMA)核苷酸、2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基(2'-O-DMAEOE)核苷酸、2'-O-胺基丙基(2'-O-AP)核苷酸或2'-ara-F核苷酸。同樣，應理解這些修飾係額外於反義股中存在的雙鏈體的至少一種熱去穩定化修飾。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子包含交替模式的修飾。如本文所用，術語“交替模體”或“交替模式”係指具有一個或多個修飾的模體，每個修飾發生在一股的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每一個其他核苷酸為一組或每三個核苷酸為一組，或類似的模式。例如，如果A、B及C各自代表對核苷酸的一修飾，則交替模體可以係“ABABABABABAB……”、“AABBAABBAABB……”、“AABAABAABAAB……”、“AAABAAABAAAB……”、“AAABBBAAABBB……”或“ABCABCABCABC……”等。
交替模體中包含的修飾類型可以相同或不同。例如，如果A、B、C、D各自代表核苷酸的一修飾，則交替模式意即每隔一核苷酸的修飾可能係相同的，但可以選擇正義股或反義股中的每一個可以被選自從交替模體內的多種修飾的可能性，例如“ABABABAB……”、“ACACAC……”、“BDBDBD……”或“CDCCDD……”等。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子包含正義股上交替模體的修飾模式，其相對於反義股交替模體的修飾模式係移位的。該移位可以使得正義股的修飾核苷酸組對應於反義股的不同修飾核苷酸組，反之亦然。例如，當正義股與dsRNA雙鏈體內的反義股配對時，正義股中交替 模體可以從鏈的5'-3'開始以“ABABAB”開頭，而反義股中的交替模體可以“BABABA”在來自複合區域內股的3'-5'。作為另一個例子，正義股中的交替模體可以從雙鏈體區域內股的5'-3'開始的“AABBAABB”開始，反義股中的交替模體可以從雙鏈體區域內股的3'-5'開始的“BBAABBAA”開始，因此正義股及反義股之間的修飾模式完全或部分移位。
在一特定的實施例中，正義股中的交替模體係來自該鏈的5'3'的“ABABAB”，其中每個A係未修飾的核糖核苷酸，每個B係2'-O甲基修飾的核苷酸。
在一具體實施例中，有意股中的交替模體係來自該股的5' 3'的“ABABAB”，其中每個A係2'-去氧-2'-氟修飾的核苷酸，並且每個B係2'-O甲基修飾的核苷酸。
在另一具體實例中，反義股中的交替模體係來自該股的3'-5'的“BABABA”，其中每個A係2'-去氧-2'-氟修飾的核苷酸，並且每個B係2'-O甲基修飾的核苷酸。
在一特定實施例中，有意股中的交替模體係從該股的5' 3'開始的“ABABAB”，反義股中的交替模體係從鏈的3'-5'開始的“BABABA”，其中每個A係一個未修飾的核糖核苷酸，每個B係一個2'-O甲基修飾的核苷酸。
在一具體實施例中，有意股中的交替模體係從該股的5' 3'開始的“ABABAB”，而反義股中的交替模體係從該股的3'-5'開始的“BABAB”，其中每個A係一'-去氧-2'-氟修飾的核苷酸，每個B係一2'-O甲基修飾的核苷酸。
本揭露的dsRNA分子可復包含至少一硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。該硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾可以 發生在正義股或反義股的任何核苷酸上或在股的任何位置。例如，核苷酸間連接修飾可能發生在正義股或反義股的每個核苷酸；每個核苷酸間連接修飾可以在正義股或反義股以交替模式發生；或正義股或反義股包含交替模式的兩個核苷酸間鏈結合修飾。正義股的核苷酸間鏈結修飾的交替模式可以與反義股相同或不同，並且正義股之核苷酸間鏈結修飾的交替模式，其模式可以相對於在反義股核苷酸間鏈結修飾的交替模式具有偏移。
在一些實施態樣中，dsRNA分子在突出區域包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾。例如，突出區域包含兩個核苷酸，在這兩個核苷酸之間具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結。也可以進行核苷酸間連接修飾，以將突出核苷酸與雙鏈體區域內的末端配對核苷酸連接。例如，至少2、3、4個或所有突出核苷酸，期可藉由硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結連接，並且視需要地，可以存在額外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結將突出核苷酸與相鄰的配對核苷酸連接。突出核苷酸。例如，末端三個核苷酸之間可能存在至少兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中三個核苷酸中的兩個係突出核苷酸，第三個係與突出核苷酸相鄰的配對核苷酸。適合地，這些末端三個核苷酸可以在反義股的3'端。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的正義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12隔開的2至10個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的1至10個區塊，其中該硫代磷酸酯或膦酸甲酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該正義股與反義股成對，該反義股包含硫代磷酸酯、膦酸甲酯及磷酸核苷酸間鏈結或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18個磷酸核苷 酸間鏈結隔開的兩個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及甲基膦酸酯的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16個磷酸核苷酸間鏈結個開的三個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個磷酸核苷酸間鏈結個開的四個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12個磷酸核苷酸間鏈結隔開的五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個磷酸核苷酸間鏈結個開的六個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5、6、7或8個磷酸核苷酸間鏈結個開的七個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含由1、2、3、4、5或6個磷酸核苷酸間鏈結個開的八個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，dsRNA分子的反義股包含九個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結的兩個區塊，藉由1、2、3或4個磷酸核苷酸間鏈結，其中硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結之一位於寡核苷酸序列中的任何位置，並且該反義股與包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯及磷酸 酯核苷酸間鏈結的視需要組合的正義股或包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯或磷酸酯鏈結的反義股形成配對。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股或反義股之末端位置1至10個核苷酸內的一個或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾。例如，至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可藉由有義或反義股的一端或兩端的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結連接。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在每條正義股或反義股的雙鏈體的內部區域的1至10個內的一個或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾。例如，至少核苷酸2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸可以藉由硫代磷酸甲酯磷酸酯核苷酸間鏈結，在雙鏈體區域的從5'端計算的位置8至16連接；dsRNA分子可以視需要地在末端位置的1至10復包含一個或多個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的一至五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及在正義股的位置18至23內的1至5個硫代磷酸酯或甲基膦酸甲酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)，以及在反義股的位置1及2一至五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾以及位置18至23內的一至五個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及在正義股的位置18至23內(從5'-端計數)的一個硫代磷酸酯或甲基膦酸核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾， 及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及在位置18至23內(從5'-端計數)的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內(從5'-端計數)的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內(從5'-端計數)的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內(從5'-端計數)的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內 (從5'-端計數)的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，並且在反義股的位置1或2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)，以及在反義股的位置1及2的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾以及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23位內的一個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1至5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23位內的一個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1-5內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置18至23內的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)，以及反義股的在位置 1及2的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，在位置18至23內的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'端起數)，及的位置20及21的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置21的一個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'端起數)，及位置21的一硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結合修飾，及位置20及21的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾，及位置21及22的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端起數)，並且在反義股的位置11的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，及位置20的一個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施例中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，及位置21的一硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，及位置21及22的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾，以及位置22及23的兩 個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，及位置21的一個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子復包含在正義股的位置1的一個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾，以及位置21的一個硫代磷酸酯核苷酸間連接修飾(從5'-端計數)，並且在反義股的位置1及2的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾，及位置23及23的兩個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結修飾(從5'-端計數)。
在一些實施態樣中，本揭露的化合物包含骨架掌性中心的模式。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少5個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少6個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少7個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少8個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少9個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少10個Sp構型的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少11個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少12個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少13個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少14個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少15個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少16個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共 同模式在Sp構型中包含至少17個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少18個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Sp構型中包含至少19個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過8個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過7個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過6個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過5個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過4個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過3個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過2個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式在Rp構型中包含不超過1個核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過8個非掌性的核苷酸間鏈結(作為非限制性實例，磷酸二酯)。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過7個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過6個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過5個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過4個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過3個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過2個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含不超過1個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少10個Sp構型的核苷酸間鏈結， 以及不超過8個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少11個Sp構型的核苷酸間鏈結，以及不超過7個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少12個Sp構型的核苷酸間鏈結，以及不超過6個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少13個Sp構型的核苷酸間鏈結，以及不超過6個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少14個Sp構型的核苷酸間鏈結，以及不超過5個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，骨架掌性中心的共同模式包含至少15個Sp構型的核苷酸間鏈結，以及不超過4個非掌性的核苷酸間鏈結。在一些實施態樣中，Sp構型中的核苷酸間鏈結視需要地係連續的或不連續的。在一些實施態樣中，Rp構型中的核苷酸間鏈結視需要地係連續的或不連續的。在一些實施態樣中，非掌性的核苷酸間鏈結視需要地係連續的或不連續的。
在一些實施態樣中，本揭露的化合物包含為立體化學區塊的區塊。在一些實施態樣中，區塊係Rp區塊，因為該區塊的每個核苷酸間鏈結係Rp。在一些實施態樣中，5'-區塊係Rp區塊。在一些實施態樣中，3'-區塊係Rp區塊。在一些實施態樣中，區塊係Sp區塊，因為區塊的每個核苷酸間鏈結係Sp。在一些實施態樣中，5'-區塊係Sp區塊。在一些實施態樣中，3'-區塊係Sp區塊。在一些實施態樣中，提供的寡核苷酸包含Rp及Sp區塊。在一些實施態樣中，所提供的寡核苷酸包含一個或多個Rp但不包含Sp區塊。在一些實施態樣中，所提供的寡核苷酸包含一個或多個Sp但不包含Rp區塊。在一些實施態樣中，所提供的寡核苷酸包含一個或多個PO區塊，其中每個核苷酸間鏈結合為天然磷酸鏈結。
在一些實施態樣中，本揭露的化合物包含作為Sp區塊的5'-區塊，其中每個糖部分包含2'-F修飾。在一些實施態樣中，該5'-區塊係Sp區塊，其中每個核苷酸間鏈結係修飾的核苷酸間鏈結，並且每個糖部分包含2'-F修飾。在一些實施態樣中，該5'-區塊係Sp區塊，其中每個核苷酸間鏈結係硫代磷酸酯鏈結，並且每個糖部分包含2'-F修飾。在一些實施態樣中，該5'-區塊包含4個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，該5'-區塊包含5個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，該5'-區塊包含6個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，該5'-區塊包含7個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，3'-區塊係Sp區塊，其中每個糖部分包含2'-F修飾。在一些實施態樣中，該3'-區塊係Sp區塊，其中每個核苷酸間鏈結係修飾的核苷酸間鏈結，並且每個糖部分包含2'-F修飾。在一些實施態樣中，該3'-區塊係Sp區塊，其中每個核苷酸間鏈結係硫代磷酸酯鏈結，並且每個糖部分包含2'-F修飾。在一些實施態樣中，該3'-區塊包含4個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，3'-區塊包含5個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，3'-區塊包含6個或更多個核苷單元。在一些實施態樣中，3'-區塊包含7個或更多個核苷單元。
在一些實施態樣中，本揭露的化合物在一區域中包含一類型的核苷，或寡核苷酸之後接特定類型的核苷酸間鏈結，例如天然磷酸鏈結、修飾的核苷酸間鏈結、Rp掌性核苷酸間鏈結、Sp掌性核苷酸間鏈結等.在一些實施例中，A之後係Sp。在一些實施例中，A之後係Rp。在一些實施態樣中，A之後係天然磷酸鏈結(PO)。在一些實施例中，U之後係Sp。在一些實施例中，U之後係Rp。在一些實施態樣中，U之後係天然磷酸鏈結(PO)。在一些實施例中，C之後係Sp。在一些實施例中，C之後係Rp。在一些實施態樣中，C之後係天然磷酸鏈結(PO)。在一些實施例中，G之後 係Sp。在一些實施例中，G之後係Rp。在一些實施態樣中，G之後係天然磷酸鏈結(PO)。在一些實施例中，C及U之後係Sp。在一些實施例中，C及U之後係Rp。在一些實施態樣中，C及U之後係天然磷酸鏈結(PO)。在一些實施例中，A及G之後係Sp。在一些實施例中，A及G之後係Rp。
在一些實施態樣中，反義股在核苷酸位置21及22之間以及核苷酸位置22及23之間包含硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中反義股含有位於反義股種子區的雙鏈體的至少一種熱去穩定化修飾(即，在反義股的5'-末端的位置2-9)，並且其中dsRNA視需要地還具有至少一種(例如，一、二、三、四、五、六、七或全部八種)(i)反義包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義包含3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配體接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對的雙鏈體區域；(viii)dsRNA在反義股的5'-端具有鈍端。在一些實施態樣中，反義股在核苷酸位置1及2之間、核苷酸位置2及3之間、核苷酸位置21及22之間、核苷酸位置22及23之間包含硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中反義股含有位於反義股種子區的雙鏈體的至少一種熱去穩定化修飾(即，在反義股的5'-端的位置2-9)，並且其中dsRNA視需要地還具有至少一種(例如，一、二、三、四、五、六、七或全部八種)(i)反義包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)正義股與配體接合；(iii)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(iv)正義股包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(v)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vi)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對的雙鏈體區域；(vii)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對的雙鏈體區域；以及(viii)dsRNA在反義股的5'-端具有鈍端。
在一些實施態樣中，正義股在核苷酸位置1及2之間以及核苷酸位置2及3之間包含硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中反義股含有位於反義股種子區的雙鏈體的至少一種熱不穩定修飾(即，在反義股的5'-末端的位置2至9)，並且其中dsRNA視需要地還具有至少一種(例如，一、二、三、四、五、六、七或全部八種)(i)反義包含2、3、4、5或6個2'-氟修飾；(ii)反義包含1、2、3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(iii)正義股與配體接合；(iv)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(v)正義股包含3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(vi)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vii)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對的雙鏈體區域；(viii)dsRNA在反義股的5'-端具有鈍端。
在一些實施態樣中，正義股包含在核苷酸位置1及2之間以及位置2及3之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，反義股包括在核苷酸位置1及2之間、在核苷酸位置2及3之間、在核苷酸位置21及22之間、以及在核苷酸位置22及23之間的硫代磷酸酯核苷酸間鏈結，其中反義股含有位於反義股的種子區(即，在反義股5'-端的位置2至9處的雙鏈體的至少一熱去穩定修飾)，並且其中該dsRNA視需要地還具有以下特徵中的至少一種(例如，一種、兩種、三種、四種、五種、六種或全部七種)：(i)該反義包括2、3、4，5或6個2'-氟修飾；(ii)正義股與配體接合；(iii)正義股包含2、3、4或5個2'-氟修飾；(iv)正義股包含3、4或5個硫代磷酸酯核苷酸間鏈結；(v)dsRNA包含至少四個2'-氟修飾；(vi)dsRNA包含長度為12至40個核苷酸對的雙鏈體區域；(vii)dsRNA在反義股的5'-端具有鈍端。
在一些實施態樣中，本揭露內容的dsRNA分子包含與標靶、複合內或其組合的錯配。錯配可能發生在突出區域或複合區域。鹼基對可 以根據它們促進解離或熔化的傾向進行排名(例如，根據特定配對的結合或解離自由能，最簡單的方法係根據單個配對檢查鹼基對，儘管下一個相鄰鹼基對或類似的分析也可以使用)。在促進解離方面：A：U優於G：C；G：U優於G：C；並且I：C優於G：C(I=肌苷)。錯配，例如非規範或非規範配對(如本文別處所述)優於規範(A：T、A：U、G：C)配對；包括通用鹼基的配對優於規範配對。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子包含來自反義股5-'端的雙鏈體區域內的前1、2、3、4或5個鹼基對中的至少一個，該鹼基對可獨立地選自以下群組：A：U、G：U、I：C及錯配對，例如，非規範或非規範配對或包含通用鹼基的配對，以促進反義股在雙鏈體5'端的解離。
在一些實施態樣中，在雙鏈體區域內從反義股中的5'-端開始的第1位的核苷酸選自由A、dA、dU、U及dT組成的群組。或者，從反義股的5'-端開始的雙鏈體區域內的前1、2或3個鹼基對中的至少一個係AU鹼基對。例如，從反義股5'端開始的雙鏈體區域內的第一個鹼基對係AU鹼基對。
已經被發現在單股或雙股的任何位置，引入4'-修飾或5'-修飾的核苷酸到磷酸二酯(PO)、硫代磷酸酯(PS)或二硫代磷酸酯(PS2)鏈結的3'-端，可以對核苷酸間鏈結產生空間效應，因此保護或穩定它免受核酸酶的影響。
在一些實施態樣中，在單股或雙股siRNA的任何位置的二核苷酸的3'-端引入5'-修飾的核苷酸。例如，可以在單股或雙股siRNA的任何位置的二核苷酸的3'-端引入5'-烷基化核苷。核糖5'-的烷基可以係外 消旋或掌性純(chirally pure)的R或S異構物。示例性的5'-烷基化核苷係5'-甲基核苷。5'-甲基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。
在一些實施態樣中，4'-修飾的核苷被引入到單股或雙股siRNA的任何位置的二核苷酸的3'-端。例如，可以在單股或雙股siRNA的任何位置的二核苷酸的3'-末端引入4'-烷基化核苷。核糖4'-的烷基可以係外消旋或掌性純的R或S異構物。示例性的4'-烷基化核苷係4'-甲基核苷。4'-甲基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。或者，可以在單股或雙股siRNA的任何位置的二核苷酸的3'-端引入4'-O-烷基化核苷。核糖的4'-O-烷基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。示例性的4'-O-烷基化核苷係4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。
在一些實施態樣中，在dsRNA的正義股或反義股的任何位置引入5'-烷基化核苷，並且此類修飾保持或提高dsRNA的效力。5'-烷基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。示例性的5'-烷基化核苷係5'-甲基核苷。5'-甲基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。
在一些實施態樣中，在dsRNA的正義股或反義股上的任何位置引入4'-烷基化核苷，並且此類修飾保持或提高dsRNA的效力。4'-烷基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。示例性的4'-烷基化核苷係4'-甲基核苷。4'-甲基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。
在一些實施態樣中，4'-O-烷基化核苷被引入dsRNA的正義股或反義股上的任何位置，並且該修飾保持或提高了dsRNA的效力。5'-烷基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。示例性的4'-O-烷基化核苷係4'-O-甲基核苷。4'-O-甲基可以係外消旋的或掌性純的R或S異構物。
在一些實施態樣中，本揭露的dsRNA分子可以包含2'至5'鏈結(具有2'-H、2'-OH及2'-OMe，並且具有P=O或P=S)。例如，2'至5'鏈結修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制正義股與反義股的結合，或可用於正義股的5'端以避免RISC活化正義股。
在另一實施態樣中，本揭露的dsRNA分子可包含L糖(例如，L核糖、具有2'-H、2'-OH及2'-OMe的L-阿拉伯糖)。例如，該L糖修飾可用於促進核酸酶抗性或抑制正義股與反義股的結合，或可用於正義股的5'端以避免RISC活化正義股。
各種公開出版物描述了多聚體siRNA，該多聚體siRNA可以與本揭露dsRNA一起使用。該公開出版物包括WO2007/091269、US 7858769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887及WO2011/031520，以上在此全部併入。
如在以下更詳細描述的，包含一個或多個與RNAi劑接合的碳水化合物部分的RNAi劑，其可以優化RNAi劑的一個或多個特性。在許多情況下，碳水化合物部分將連接到RNAi劑的修飾亞基。例如，dsRNA劑的一個或多個核糖核苷酸亞基的核糖可以被另一部分替換，例如，連接有碳水化合物配體的非碳水化合物(適合環狀)載體。核糖核苷酸次單位本文中稱為核糖替換修飾亞基(RRMS)，其中次單位的核糖已被如此替換。環狀載體可以係碳環系統，即所有環原子都係碳原子，或雜環系統，即一個或多個環原子可以係雜原子，例如氮、氧、硫。環狀載體可以係單環系統，或者可以包含兩個或更多個環，例如熔合環。環狀載體可以係完全飽及的環系統，或者它可以包含一個或多個雙鍵。
配體可以藉由載體連接至多核苷酸。載體包括(i)至少一“骨架連接點”，適合兩個“骨架連接點”及(ii)至少一“繫鏈連接點”。如本文所 用，“骨架連接點”係指官能團，例如羥基，或通常係鍵結，其可用於，並且適合於將該載體摻入到骨架中，例如，核糖核酸的磷酸鹽或修飾的磷酸鹽，例如含硫的骨架。在一些實施態樣中，“綁定連接點(tethering attachment point)”(TAP)係指連接選定部分的環狀載體組成環原子，例如碳原子或雜原子(不同於提供骨架連接點的原子)。該還原子連接選定的部分。該部可以為例如碳水化合物，例如單糖、二糖、三糖、四糖、寡糖及多醣。視需要地，選定的部分藉由插入的繫鏈連接至環狀載體。因此，環狀載體通常將包括官能團，例如胺基，或通常提供鍵，該鍵適合於結合或繫鏈另一化學實體，例如配體到組成環。
RNAi劑可以藉由載體與配體接合，其中載體可以係環狀基團或非環狀基團；適合地，該環狀基團選自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1，3]二氧雜環戊烷、噁唑烷基、異噁唑烷基、嗎啉基、噻唑烷基、異噻唑烷基、喹喔啉基、噠嗪壬基、四氫呋喃基及十氫化萘基；適合地，無環基團選自絲胺醇骨架或二乙醇胺骨架。
在某些具體實施態樣中，用於本揭露的方法的RNAi劑係選自表2至7、12、13及18至20中任一表所列的劑。這些劑可復包含配體，例如一個或多個親脂部分、一個或多個GalNAc衍生物，或一個或多個親脂部分及一個或多個GalNAc衍生物兩者。
IV.與配體接合的iRNA
本發明的iRNA的RNA的另一修飾包含將化學地連結到iRNA一個或多個配體、部分或接合物，該配體、部分或接合物增強iRNA的活性、細胞分佈或細胞攝取，例如進入細胞。此類部分包括但不限於脂質部分，例如膽固醇部分(Letsinger et al.,Proc.Natl.Acid.Sci.USA, 1989,86：6553-6556),cholic acid(Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1994,4：1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306-309；Manoharan et al.,Biorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765-2770)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533-538),an aliphatic chain,e.g.,dodecandiol or undecyl residues(Sauson-Behmoaras et al.,EMBO J,1991,10：1111-1118；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327-330；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49-54)、磷脂，例如二十六烷基-外消旋甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸鹽(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777-3783)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides &核苷酸s,1995,14：969-973)或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651-3654)、棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229-237)或或十八胺或己胺基-羰氧基膽固醇部分(Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923-937)。
在某些實施態樣中，配體改變它所進入的iRNA劑的分佈、靶向或壽命。在一些實施態樣中，配體提供對選定標靶的增強親及力，例如分子、細胞或細胞類型、隔間，例如細胞或器官隔間、組織、器官或身體區域，例如，與沒有這種配體的物種。典型的配體不會參與複合的核酸中的複合配對。
配體可以包括天然存在的物質，例如蛋白質(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚醣、支鏈澱粉、甲殼素、幾丁聚醣、菊粉、環糊精或透明質酸)；或脂質。配體 也可以係重組或合成分子，例如合成聚合物，例如合成聚胺基酸。聚胺基酸的實施例包括聚胺基酸係聚賴胺酸(PLL)、聚L-天冬胺酸、聚L-麩胺酸、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙醇酸)共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物、N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚胺酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-異丙基丙烯醯胺聚合物、或聚磷嗪。多胺的實施例包括：聚乙烯亞胺、聚賴胺酸(PLL)、精胺、亞精胺、多胺、擬肽-多胺、擬肽多胺、樹枝狀多胺、精胺酸、脒、魚精蛋白、陽離子脂質、陽離子卟啉、多胺的四級鹽或α螺旋胜肽。
配體還可包括結合特定細胞類型如腎細胞的靶向基團，例如細胞或組織靶向劑，例如凝集素、糖蛋白、脂質或蛋白質，例如抗體。靶向基團可以係促甲狀腺素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖、多價岩藻糖、糖基化聚胺基酸、多價半乳糖、轉鐵蛋白、雙膦酸鹽、聚麩胺酸鹽、聚天門冬胺酸鹽、脂質、膽固醇、類固醇、膽汁酸、葉酸、維生素B12、生物素或RGD胜肽或RGD胜肽模擬物。在某些實施態樣中，配體係多價半乳糖，例如N-乙醯基-半乳糖胺。
配體的其他實例包括染料、嵌入劑(例如吖啶)、交聯劑(例如補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多環芳烴(例如吩嗪、二氫吩嗪)、人工核酸內切酶(例如EDTA)、親脂性分子，例如膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉荳蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽酸、二甲氧基三苯甲基或吩惡嗪)及胜肽接合物(例如，觸角肽、Tat胜肽)、烷化劑、磷酸鹽、胺基、巰基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷 基、取代烷基、放射性標記標記、酵素、半抗原(例如生物素)、轉運/吸收促進劑(例如阿司匹林、維生素E、葉酸酸)，合成核糖核酸酶(例如，咪唑，雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑偶聯物、四氮雜大環的Eu3+配合物、二硝基苯基、HRP或AP。
配體可以係蛋白質，例如糖蛋白，或胜肽，例如對共配體具有特定親及力的分子，或抗體，例如結合特定細胞類型例如癌細胞、內皮細胞或骨的抗體細胞。配體還可能包括賀爾蒙及賀爾蒙受體。它們還可以包括非肽類物質，例如脂質、凝集素、碳水化合物、維生素、輔因子、多價乳糖、多價半乳糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺多價甘露糖或多價岩藻糖。配體可以係例如脂多醣、p38 MAP激酶的激活劑或NF-κB的活化劑。
配體可以係一物質，例如藥物，它可以增加iRNA劑的攝取進入細胞，例如藉由破壞細胞的細胞骨架(cytoskeleton)，例如藉由破壞細胞的微管、微絲或中間絲。該藥物可以係例如分類群、長春新鹼、長春鹼、細胞鬆弛素、諾考達唑、海綿毒素(japlakinolide)、紅海海綿蛋白A、鬼筆環肽(phalloidin)、海洋苔蘚素(swinholide)A、吲達諾欣(indanocine)、或邁爾素(myoservin)。
在一些實施態樣中，經與本文所述iRNA附接之配體作用為藥物動力學調節劑(PK調節劑)。PK調節劑包括親脂性物質、膽汁酸、類固醇、磷脂類似物、胜肽、蛋白質結合劑、PEG、維生素等。示例性PK調節劑包括但不限於膽固醇、脂肪酸、膽酸、石膽酸、二烷基甘油酯、二醯基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、維生素E、生物素等。還已知包含許多硫代磷酸酯鏈結的寡核苷酸與血清蛋白結合，因此短寡核苷酸，例如約5個鹼基、10個鹼基、15個鹼基或20個鹼基的寡核苷酸，該寡核苷 酸在骨架中包含多個硫代磷酸酯鏈結的鹼基，其也適用作為配體於本發明(例如作為PK調節配體)。此外，結合血清成分(例如血清蛋白)的適體(aptamers)也適合用作本文所述實施態樣中的PK調節配體。
本發明的與配體接合的iRNA可以藉由使用具有突出反應性官能團的寡核苷酸合成，例如衍生自交聯分子到寡核苷酸的那些(如下所述)。這種反應性寡核苷酸可以直接與市售配體、合成的帶有多種保護基團的配體或具有與其交聯的連接部分的配體反應。
用於本發明接合物的寡核苷酸可以藉由眾所周知的固相合成技術方便且常規地製備。用於這種合成的設備由幾個供應商出售，包括例如Applied Biosystems®(Foster City,CA)。可以附加地或替代地使用所屬技術領域中已知的用於此類合成的任何其他方式。還已知使用類似的技術來製備其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯及烷基化衍生物。
在本發明的與配體接合的寡核苷酸及帶有序列特異性連接的核苷的配體分子中，該寡核苷酸及寡核苷可以利用標準核苷酸或核苷前驅物，或已經帶有連接部分、已經帶有配體分子的配體-核苷酸或核苷-接合物前驅物，或帶有非核苷配體的結構區塊。
當使用已經帶有連接部分的核苷酸-接合物前驅物時，序列特異性連接的核苷的合成通常完成，然後配體分子與連接部分反應以形成配體-接合的寡核苷酸。在一些實施態樣中，本發明的寡核苷酸或連接的核苷藉由自動化合成儀使用衍生自配體-核苷接合物的亞磷醯胺，以及可商業購買取得及常規用於寡核苷酸合成的標準亞磷醯胺及非標準亞磷醯胺合成。
A.脂質接合物
在某些實施態樣中，配體或接合物係脂質或根據脂質的分子。這種脂質或根據脂質的分子通常可以結合血清蛋白，例如人血清白蛋白 (HSA)。HSA結合的配體允許將接合物分佈到標靶組織，例如身體的非腎目標組織。例如，標靶組織可以係肝臟，包括肝臟的實質細胞。其他可以結合HSA的分子也可以用作配體。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂質或根據脂質的配體可以(a)增加對接合物降解的抗性，(b)增加靶向或轉運到標靶細胞或細胞膜中，或(c)可以用於調節與血清蛋白的結合，例如血清蛋白。例如HSA。
脂質系配體可用於調節，例如控制(例如抑制)接合物與標靶組織的結合。例如，與HSA結合更強的脂質或脂質系配體，該脂質或配體將不太可能以腎臟為目標，因此不太可能從體內清除。與HSA結合較弱的脂質或脂質系配體可用於將接合物靶向腎臟。
在某些實施態樣中，脂質系配體結合了HSA。例如，配體可以足夠的親和力結合HSA，因此增強接合物在非腎臟組織中的分佈。然而，親和力通常不會強到無法逆轉HSA配體結合。
在某些實施態樣中，脂質系配體微弱地結合或根本不結合HSA，因此增強了接合物在腎臟的分佈。靶向腎細胞的其他部分也可用於替代或補充脂質系配體。
在另一方面，配體係一部分，例如維生素，該部分被標靶細胞攝取，例如增殖細胞。這些特別適用於治療以不希望發現細胞增殖為特徵的疾病，例如惡性或非惡性類型的疾病，例如癌細胞。示例性維生素包括維生素A、E及K。其他示例性維生素包括B族維生素，例如葉酸、B12、核黃素、生物素、吡哆醛或癌細胞吸收的其他維生素或營養素。還包括HSA及低密度脂蛋白(LDL)。
B.細胞滲透劑
在另一方面，配體係細胞滲透劑，例如螺旋細胞滲透劑。在某些實施態樣中，劑係雙性的。示例性劑係胜肽，例如tat或觸角足突變肽(antennopedia)。如果劑係胜肽，該劑可以被修飾，包括胜肽模擬物、轉化體、非胜肽或假胜肽鏈結，以及使用D-胺基酸。螺旋劑通常係α-螺旋劑並且可以具有親脂相及疏脂相。
配體可以係胜肽或胜肽模擬物。該胜肽模擬物(本文也稱為寡胜肽模擬物)係能夠折疊成所定義的三維結構，該結構類似於天然胜肽。胜肽及胜肽模擬物與iRNA劑的連接可以影響iRNA的藥物動力學分佈，例如藉由增強細胞辨認及吸收。該胜肽或胜肽模擬部分可以係約5至50個胺基酸長，例如，約5、10、15、20、25、30、35、40、45或50個胺基酸長。
胜肽或胜肽模擬物可以係例如細胞滲透肽、陽離子胜肽、兩性胜肽或疏水胜肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe組成)。胜肽部分可以係樹狀胜肽、限制胜肽或交聯胜肽。在另一選項中，該胜肽部分可以包括疏水膜轉位序列(MTS)。示例性的含有MTS的疏水性胜肽係具有胺基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：31)的RFGF。含有疏水MTS的RFGF類似物(例如胺基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：32))也可以係靶向部分。胜肽部分可以係“運送”胜肽，該部分可以攜帶包括胜肽、寡核苷酸及蛋白質在內的大極性分子，穿過細胞膜。例如，已經發現來自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：33))及果蠅觸角蛋白(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：34))的序列能夠用作“運送”胜肽。胜肽或胜肽模擬物可以由DNA的隨機序列編碼，例如從噬菌體展示資料庫或單珠單化合物(OBOC)組合資料庫中鑑定的胜肽(Lam et al.,Nature,354：82-84,1991)。通常，藉由進入的單體單元與dsRNA劑連接 的胜肽或胜肽模擬物係細胞靶向胜肽，例如精胺酸-甘胺酸-天門冬胺酸(RGD)-胜肽或RGD模擬物。胜肽部分的長度範圍可以從約5個胺基酸到約40個胺基酸。胜肽部分可以具有結構修飾，例如增加穩定性或直接構形特性。可以使用以下描述的任何結構修改。
用於本發明的組成物及方法的RGD胜肽可以係線性的或環狀的，並且可以被修飾，例如糖基化或甲基化，以促進靶向特定組織。含RGD的胜肽及胜肽模擬物可能包括D-胺基酸以及合成的RGD模擬物。除了RGD，還可以使用其他靶向整合素配體的部分。該配體的適合接合物靶向PECAM-1或VEGF。
RGD胜肽部分可用於靶向特定細胞類型，例如腫瘤細胞，例如內皮腫瘤細胞或乳腺癌腫瘤細胞(Zitzmann et al.,Cancer Res.,62：5139-43,2002)。RGD胜肽可以促進dsRNA劑靶向多種其他組織的腫瘤，包括肺、腎、脾或肝(Aoki et al.,Cancer Gene Therapy 8：783-787,2001)。通常，RGD胜肽將促進iRNA劑靶向腎臟。RGD胜肽可以係線性的或環狀的，並且可以被修飾，例如糖基化或甲基化以促進靶向特定組織。例如，糖基化的RGD胜肽可以將iRNA劑運送至表現αVß3的腫瘤細胞(Haubner et al.,Jour.Nucl.Med.,42：326-336,2001)。
“細胞滲透胜肽”能夠滲透細胞，例如微生物細胞，例如細菌或真菌細胞，或哺乳動物細胞，例如人類細胞。微生物細胞滲透胜肽可以係例如α-螺旋線性胜肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫鏈結的胜肽(例如，α-防禦素、β-防禦素或細菌素)，或僅含有一個或兩個主要胺基酸的胜肽(例如PR-39或吲哚青素(indolicidin))。細胞滲透胜肽還可以包括核定位信號(NLS)。例如，細胞滲透胜肽可以係二分雙性胜肽，例如MPG，其 衍生自HIV-1 gp41的融合胜肽結構域及SV40大T抗原的NLS(Simeoni et al.,Nucl.Acids Res.31：2717-2724,2003)。
C.碳次化合物接合物
在本發明的組成物及方法的一些實施態樣中，iRNA復包含碳水化合物。碳水化合物接合的iRNA有利於核酸的活體內運送，以及適用於活體內治療用途的組成物，如本文所述。如本文所用，“碳水化合物”係指本身為碳水化合物的化合物，其由一個或多個具有至少6個碳原子(可以係直鏈、支鍊或環狀)的單糖單元與氧、氮或硫原子組成與每個碳原子鏈結合；或具有作為其一部分的碳水化合物部分的化合物，該碳水化合物部分由一個或多個單醣單元組成，每個單醣單元具有至少六個碳原子(可以係直鏈的、支鏈的或環狀的)，氧、氮或硫原子與每個碳原子鏈結合.代表性碳水化合物包括醣類(含有約4、5、6、7、8或9個單醣單元的單糖、二糖、三糖及寡糖)及多醣，例如澱粉、肝醣、纖維素及多醣膠。特定的單糖包括C5及以上的糖(例如，C5、C6、C7或C8)；二醣及三醣包括具有兩個或三個單糖單元(例如C5、C6、C7或C8)。
在某些實施態樣中，碳水化合物接合物包含單醣。
在某些實施態樣中，單醣係N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)。包含一個或多個N-乙醯半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc接合物描述於例如US 8106022中，其全部內容藉由引用併入本文。在一些實施態樣中，GalNAc接合物用作將iRNA靶向特定細胞的配體。在一些實施態樣中，GalNAc接合物將iRNA靶向肝細胞，例如，藉由充當肝臟細胞(例如，肝細胞)的去唾液酸糖蛋白受體的配體。
在一些實施態樣中，碳水化合物接合物包含一個或多個GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以藉由接頭連接，例如二價或三價支鏈 接頭。在一些實施態樣中，GalNAc接合物於正義股的3'端接合。在一些實施態樣中，GalNAc接合物藉由接頭(例如本文所述的接頭)與iRNA劑(例如，正義股的3'端)接合。在一些實施態樣中，GalNAc接合物於正義股的5'端接合。在一些實施態樣中，GalNAc接合物藉由接頭例如本文所述的接頭接合至iRNA劑(例如，與正義股的5'端)。
在本發明的某些實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由單價接頭與本發明的iRNA劑連接。在一些實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由二價接頭與本發明的iRNA劑連接。在本發明的其它實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由三價接頭連接至本發明的iRNA劑。在本發明的其他實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由四價接頭與本發明的iRNA劑連接。
在某些實施態樣中，本發明的雙鏈RNAi劑包含與iRNA劑連接的GalNAc或GalNAc衍生物。在某些實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含多個(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，每個獨立地藉由多個單價接頭連接至雙股RNAi劑的多個核苷酸。
在一些實施態樣中，例如，當本發明的iRNA劑的雙股係藉由一股的3'-端及相對另一股的5'-端之間的不間斷核苷酸鏈連接的一較大分子的一部分，而形成包含多個未配對核苷酸之髮夾環的股，該髮夾環內的每一未配對核苷酸可獨立地包含藉由單價接頭連接的GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環也可以由雙股的一股中的延伸突出形成。
在一些實施態樣中，例如，當本發明的iRNA劑的兩股係藉由一股的3'-端及相對另一股的5'-端之間的不間斷核苷酸鏈連接的一較大分子的一部分，而形成包含多個未配對核苷酸之髮夾環的股，該髮夾環內 的每個未配對核苷酸可獨立地包含藉由單價接頭連接的GalNAc或GalNAc衍生物。髮夾環也可以由雙股的一股中的延伸突出形成。
在一些實施態樣中，GalNAc接合物係
Figure 111105127-A0202-12-0174-23
在一些實施態樣中，RNAi劑藉由如下方案所示的接頭連接至碳水化合物接合物，其中X係O或S
Figure 111105127-A0202-12-0174-24
在一些實施態樣中，RNAi劑接合至L96，如表1中定義及如下所示：
Figure 111105127-A0202-12-0174-25
在某些實施態樣中，用於本發明的組成物及方法的碳水化合物接合物選自由以下組成的群組：
Figure 111105127-A0202-12-0175-26
Figure 111105127-A0202-12-0175-27
Figure 111105127-A0202-12-0175-28
Figure 111105127-A0202-12-0175-29
Figure 111105127-A0202-12-0175-30
Figure 111105127-A0202-12-0176-31
Figure 111105127-A0202-12-0176-32
Figure 111105127-A0202-12-0176-33
Figure 111105127-A0202-12-0176-34
Figure 111105127-A0202-12-0176-35
Figure 111105127-A0202-12-0177-36
Figure 111105127-A0202-12-0177-37
Figure 111105127-A0202-12-0177-38
Figure 111105127-A0202-12-0177-39
Figure 111105127-A0202-12-0177-40
Figure 111105127-A0202-12-0177-41
Figure 111105127-A0202-12-0178-197
Figure 111105127-A0202-12-0178-198
Figure 111105127-A0202-12-0178-199
Figure 111105127-A0202-12-0178-200
Figure 111105127-A0202-12-0178-201
Figure 111105127-A0202-12-0178-202
Figure 111105127-A0202-12-0179-203
，其中Y係O或S且n係3至6(式XXIV)；
Figure 111105127-A0202-12-0179-204
，其中Y係O或S且n係3至6(式XXV)；
Figure 111105127-A0202-12-0179-205
Figure 111105127-A0202-12-0179-206
，其中X係O或S(式XXVII)；
Figure 111105127-A0202-12-0180-207
Figure 111105127-A0202-12-0180-208
Figure 111105127-A0202-12-0181-209
Figure 111105127-A0202-12-0181-210
在某些實施態樣中，用於本發明的組成物及方法的碳水化合物接合物係單糖。在某些實施態樣中，單糖係N-乙醯半乳糖胺，例如
Figure 111105127-A0202-12-0182-211
用於本文所述實施態樣的另一代表性碳水化合物接合物包括但不限於
Figure 111105127-A0202-12-0182-212
當X或Y之一係寡核苷酸時，另一個係氫。
在一些實施態樣中，合適的配體係WO2019/055633中揭露的配體，其全部內容藉由引用併入本文。在一實施態樣中，配體包含以下結構：
Figure 111105127-A0202-12-0182-213
在某些實施態樣中，本揭露的RNAi劑可以包括GalNAc配體，即使目前預計此類GalNAc配體對於本揭露的適合的鞘內/腦室內/CNS運送途徑的價值有限。
在本發明的某些實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由單價接頭與本發明的iRNA劑連接。在一些實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由二價接頭與本發明的iRNA劑連接。在本發明的其它實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由三價接頭連接至本發明的iRNA劑。在本發明的其他實施態樣中，GalNAc或GalNAc衍生物藉由四價接頭與本發明的iRNA劑連接。
在某些實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含與iRNA劑連接的一種GalNAc或GalNAc衍生物，例如dsRNA劑的有義鏈的5'端，或本文所述的雙重靶向RNAi劑一條或兩條有義鏈的5'端。在某些實施態樣中，本發明的雙股RNAi劑包含多個(例如，2、3、4、5或6)個GalNAc或GalNAc衍生物，其獨立地藉由多個單價接頭連接於雙股RNAi劑的多個核苷酸。
在一些實施態樣中，例如，當本發明的iRNA劑的兩股係藉由一股的3'-端及相對另一股的5'-端之間的不間斷核苷酸鏈連接的一較大分子的一部分，而形成包含多個未配對核苷酸之髮夾環的股，該髮夾環內的每個未配對核苷酸可獨立地包含藉由單價接頭連接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些實施態樣中，碳水化合物接合物還包含一個或多個如上所述的額外配體，例如但不限於PK調節劑或細胞滲透胜肽。
適用於本發明使用的其他碳水化合物接合物及接頭包括在WO 2014/179620及WO 2014/179627中描述的那些，它們各自的全部內容藉由引用併入本文。
D.接頭
在一些實施態樣中，本文所述的接合物或配體可以藉由多種可裂解或不可裂解的接頭與iRNA寡核苷酸連接。
術語“接頭”或“連接基團”係指連接化合物的兩個部分的有機部分，例如共價連接化合物的兩個部分。接頭通常包含直接鏈結結或原子如氧或硫、單元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子鏈，例如但不限於，取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、雜芳基烷基、雜芳基烯基、雜芳基炔基、雜環基烷基、雜環基烯基、雜環基炔基、芳基、雜芳基、雜環基、環烷基、環烯基、烷芳基烷基、烷芳基烯基、烷芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基雜芳基烷基、烷基雜芳基烯基、烷基雜芳基炔基、烯基雜芳基烷基、烯基雜芳基烯基、烯基雜芳基炔基、炔基雜芳基烷基、炔基雜芳基烯基、炔基雜芳基炔基、烷基雜環基烷基、烷基雜環基烯基、烷基雜環基炔基、烷基雜環基烷基、烯基雜環基烯基、烯基雜環基炔基、炔基雜環基烷基、炔基雜環基烯基、炔基雜環基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基雜芳基、烯基雜芳基、炔基雜芳基，其中一個或多個亞甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的雜環；其中R8係氫、醯基、脂肪族或 取代的脂肪族。在某些實施態樣中，接頭在約1至24個原子、2至24、3至24、4至24、5至24、6至24、6至18、7至18、8至18個原子、7至17、8至17、6至16、7至16或8至16個原子。
可裂解的連接基團係在細胞外足夠穩定的連接基團，但在進入標靶細胞時被裂解，以釋放接頭連接在一起的兩個部分。在一適合的實施態樣中，可裂解的連接基團被裂解至少約10次、20次、30次、40次、50次、60次、70次、80次、90次或更多，或至少約100次，在標靶細胞中或在第一參考條件下(例如，可以選擇模擬或代表細胞內條件)比在個體的血液中或在第二參考條件下(例如，可以選擇模擬或代表在血液或血清中發現的情況)。
可裂解的連接基團易受裂解劑的影響，例如pH、氧化還原電位或降解分子的存在。通常，裂解劑在細胞內比在血清或血液中，更普遍或以更高的濃度或活性存在。此類降解劑的實施例包括：選擇特定受質或不具有受質特異性的氧化還原劑，包括例如，存在於細胞中的氧化酶或還原酶或還原劑如硫醇，它們可以藉由以下方式降解氧化還原可裂解的連接基團：減少；酯酶；可產生酸性環境的內體或劑，例如導致pH為5或更低的那些；可以藉由充當一般酸、胜肽酶(可以係受質特異性的)及磷酸酶，而水解或降解酸可裂解的連接基團。
可裂解的連接基團，例如二硫鏈結可能對pH敏感。人血清的pH值為7.4，而細胞內的平均pH值略低，範圍約為7.1至7.3。內體的pH值更高，在5.5至6.0的範圍內，溶酶體的pH值甚至更酸，約為5.0。 一些接頭將具有可裂解的連接基團，該連接基團在適合的pH下被裂解，因此從細胞內的配體釋放陽離子脂質，或釋放到所需的細胞隔間中。
接頭可以包括可裂解連接基團，該基團可被特定酵素裂解。併入接頭中的該可裂解連接基團的類型的可能取決於要靶向的細胞。例如，以肝臟為目標的配體可以藉由包括酯基的接頭連接至陽離子脂質。肝臟細胞富含酯酶，因此與不富含酯酶的細胞類型相比，肝臟細胞中的接頭將被更有效地裂解。其他富含酯酶的細胞類型包括肺細胞、腎皮質細胞及睾丸細胞。
當所靶向的細胞類型富含胜肽酶，例如肝臟細胞及滑膜細胞，可使用含有胜肽鍵的接頭。
一般而言，可裂解連接基團的適用性可以藉由藉由測試降解劑(或條件)裂解候選連接基團的能力來評估。測試候選可裂解連接基團，其在血液中或與其他非目標組織接觸時，抵抗裂解的能力也係所需的。因此，可以確定第一種及第二種情況之間對裂解的相對易感性，其中第一種被選擇為指示靶細胞中的裂解，第二種被選擇為指示在其他組織或生物流體中的裂解，例如，血液或血清。評估可以在無細胞系統、細胞、細胞培養、器官或組織培養或整個動物中進行。在無細胞或培養條件下進行初步評估，並藉由對整個動物的進一步評估來確認係可能有用的。在合適的實施態樣中，有用的候選化合物在細胞中以至少約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100倍的速度被裂解(或在所選擇模擬細胞內條件的活體外條件下)如與血液或血清相比(或在選擇模擬細胞外條件的活體外條件下)。
i.氧化還原可裂解連接基團
在某些實施態樣中，可裂解連接基團係在還原或氧化時可裂解的氧化還原可裂解連接基團。該該可還原裂解的連接基團的一個實施例係雙硫鍵連接基團(-S-S-)。為了確定候選可裂解連接基團係否係合適的“可還原裂解連接基團”，或者例如係否適合與特定iRNA部分及特定靶向要劑一起使用，可以參考本文所述的方法。例如，候選物可以藉由與二硫蘇糖醇(DTT)或其他還原劑一起培育來評估，藉由使用所屬技術領域已知的劑，以上方法模擬在細胞(例如標靶細胞)中觀察到的裂解速率。候選物還可以在所選擇條件下評估，該選擇條件模擬了血液或血清條件。在一情況，候選化合物在血液中最多裂解約10%。在其他實施態樣中，有用的候選化合物在細胞中以至少約2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或約100倍的速度降解(或在所選擇的模擬活體外細胞內條件下)如與血液相比(或在所選擇的模擬活體外細胞外條件下)。候選化合物的裂解速率可以在所選擇的模擬細胞內介質的條件下，使用標準酵素動力學檢測來確定，並與所選擇的模擬細胞外介質的條件進行比較。
ii.磷酸鹽系可裂解連接基團
在某些實施態樣中，可裂解接頭包含根據磷酸鹽的可裂解連接基團。該根據磷酸酯的可裂解連接基團係由被可降解或水解磷酸酯基團的劑所裂解。細胞中可裂解磷酸鹽基團之劑的實施例為酵素，例如細胞中的磷酸酶。根據磷酸酯的連接基團的實施例係-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、 -O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk在每次出現時可以獨立地為C1至C20烷基、C1至C20鹵烷基、C6至C10芳基，或C7至C12芳烷基。示例性實施態樣包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-及-O-P(S)(H)-S-。在某些實施態樣中，根據磷酸酯的連接基團係-O-P(O)(OH)-O-。這些候選可以使用與上述類似的方式進行評估。
iii.酸可裂解的連接基團
在某些實施態樣中，可裂解接頭包含酸可裂解連接基團。該酸可裂解的連接基團係在酸性條件下被裂解的連接基團。在合適的實施態樣中，酸可裂解的連接基團在約6.5或更低(例如，約6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的pH的酸性環境中被裂解，或藉由可充當一般酸的酵素，如劑如來裂解。在細胞中，特定低pH的胞器，例如內體及溶酶體，可為酸可裂解連接基團提供裂解環境。酸可裂解連接基團的實例包括但不限於腙、酯及胺基酸酯。酸可裂解基團可具有通式-C=NN-、C(O)O或-OC(O)。合適的實施態樣係當與酯的氧(烷氧基)連接的碳係芳基團、取代的烷基團或第三烷基團如二甲基戊基或第三丁基時。這些候選者可以使用與上述類似的方式進行評估。
iv.酯可裂解連接基團
在某些實施態樣中，可裂解接頭包含酯可裂解連接基團。該酯可裂解連接基團被細胞中酵素如酯酶及醯胺酶所裂解。酯可裂解連接基 團的實施例包括但不限於亞(伸)烷基、亞(伸)烯基及亞炔(伸)基的酯。酯可裂解的連接基團具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。這些候選者可以使用與上述類似的方式進行評估。
v.胜肽可裂解連接基團
在又一實施態樣中，可裂解接頭包含胜肽系可裂解連接基團。該胜肽系可裂解連接基團被細胞中的酵素如肽酶及蛋白酶所裂解。該胜肽系可裂解連接基團係在胺基酸之間形成的胜肽鍵以產生寡肽(例如二胜肽、三胜肽等)及多胜肽。胜肽系可裂解基團不包括醯胺基團(-C(O)NH-)。醯胺基團可以在任何亞(伸)烷基、亞(伸)烯基或亞(伸)炔基之間形成。胜肽鏈結係胺基酸之間形成的一種特殊類型的醯胺鏈結，可產生肽及蛋白質。該胜肽系可裂解基團通常限於在產生胜肽及蛋白質的胺基酸之間形成的肽鏈結(即醯胺鏈結)，並且不包括整個醯胺官能團。胜肽系可裂解連接基團具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA及RB係兩個相鄰胺基酸的R基團。這些候選者可以使用與上述類似的方式進行評估。
在一些實施態樣中，本發明的iRNA藉由接頭與碳水化合物接合。具有本發明的組成物及方法的接頭的iRNA碳水化合物接合物的非限制性實例包括但不限於，
Figure 111105127-A0202-12-0189-214
Figure 111105127-A0202-12-0190-215
Figure 111105127-A0202-12-0190-216
Figure 111105127-A0202-12-0190-217
Figure 111105127-A0202-12-0190-218
Figure 111105127-A0202-12-0190-219
 (式XLII)、
Figure 111105127-A0202-12-0191-220
Figure 111105127-A0202-12-0191-221
(式XLIV)，當X或Y之一係寡核苷酸時，另一係氫。
在本發明的組成物及方法的某些實施態樣中，配體系藉由二價或三價支鏈接頭連接的一個或多個“GalNAc”(N-乙醯半乳糖胺)衍生物。
在某些實施態樣中，本發明的dsRNA接合至選自式(XLV)-(XLVI)群組中任一所示結構的二價或三價分支接頭：
Figure 111105127-A0202-12-0191-222
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B及q5C於每次出現時獨立表示0至20，其中，該重複單元可係相同或相異；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C於每次出現時獨立地不存在或係CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C於每次出現時係獨立為不存在或係伸烷基、經取代之伸烷基(其中，一個或多個亞甲基可藉由O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)=C(R”)、C≡C或C(O)之一者或多者中斷或封端)；
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C於每次出現時獨立地不存在或係NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH=N-O、
Figure 111105127-A0202-12-0192-223
、
Figure 111105127-A0202-12-0192-224
、
Figure 111105127-A0202-12-0192-225
、
Figure 111105127-A0202-12-0192-226
、
Figure 111105127-A0202-12-0192-227
或雜環基；L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B及L5C係表示配體，亦即，於每次出現時係各自獨立為單糖(如GalNAc)、二醣、三醣、四醣、寡醣、或多醣；且Ra係H或胺基酸側鏈。三價複合GalNAc衍生物係尤其可與RNAi劑合用，以用於抑制標靶基因之表現，例如式(XLIX)之彼等：
式XLIX
Figure 111105127-A0202-12-0193-228
式
其中L5A、L5B及L5C代表單糖，例如GalNAc衍生物。
接合GalNAc衍生物的合適的二價及三價支鏈接頭基團的實施例包括但不限於以上如式II、VII、XI、X及XIII所述的結構。
教示製備RNA接合物的代表性美國專利包括但不限於以下：美國專利號4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717,5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241,5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；及8,106,022，其各者之全部內容在此藉由引用併入本文。
對給定化合物中的所有位置進行統一修飾係沒有必要，事實上可以將不止一種上述修飾放入到單個化合物中，甚至可以摻入iRNA內的單一核苷中。本發明還包括作為嵌合化合物的iRNA化合物。
在本發明的內文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合體”係iRNA化合物，合適的dsRNA劑，其包含兩個或更多個化學上不同的區域，每個區域由至少一單體單元組成，即，以dsRNA化合物為例的核苷酸。這些iRNA通常包含至少一區域，其中RNA被修飾，以賦予iRNA增加的對核酸酶降解的抗性、增加的細胞攝取或增加的對標靶核酸的結合親及力。iRNA的另一區域可以作為能夠裂解RNA：DNA或RNA：RNA雜合體之酵素的受質。例如，RNase H係一細胞內切核酸酶，該RNase H裂解RNA：DNA雙鏈體的RNA鏈。因此，RNase H的活化導致RNA標靶的裂解，因此大大提高了iRNA抑制基因表現的效率。因此，當使用嵌合dsRNA時，相較於與相同標靶區域雜交的硫代磷酸酯去氧dsRNA，可比較的結果通常可以藉由較短的iRNA獲得。RNA標靶的裂解可以藉由凝膠電泳進行常規檢測，如果需要，可以藉由所屬技術領域已知的相關核酸雜交技術進行檢測。
在某些情況下，iRNA的RNA可以被非配體基團修飾。許多非配體分子已與iRNA接合以增強iRNA的活性、細胞分佈或細胞攝取，並且執行此類接合的操作過程可在科學文獻中獲得。此類非配體部分包括脂質部分，例如膽固醇(Kubo,T.et al.,Biochem.Biophys.Res.Comm.,2007,365(1)：54-61；；Letsinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86：6553)、膽酸(Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994,4： 1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660：306；；Manoharan et al.,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3：2765)、硫代膽固醇(Oberhauser et al.,Nucl.Acids Res.,1992,20：533)、脂肪鏈，例如十二烷二醇或十一烷基殘基(Saison-Behmoaras et al.,EMBO J.,1991,10：111；；Kabanov et al.,FEBS Lett.,1990,259：327；；Svinarchuk et al.,Biochimie,1993,75：49)、磷脂，例如二十六烷基-外消旋甘油或三乙基銨1,2-二-O-十六烷基-外消旋甘油-3-H-膦酸鹽(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651；；Shea et al.,Nucl.Acids Res.,1990,18：3777)、多胺或聚乙二醇鏈(Manoharan et al.,Nucleosides & Nucleotides,1995,14：969)、或金剛烷乙酸(Manoharan et al.,Tetrahedron Lett.,1995,36：3651)、棕櫚基部分(Mishra et al.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264：229)、或十八烷基胺或己胺基-羰基-氧基膽固醇部分Crooke et al.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277：923)。以上列出了教示製備此類RNA接合物的代表性美國專利。典型的接合方案包括在序列的一個或多個位置合成帶有胺基接頭的RNA。然後使用合適的偶聯劑或活化劑使胺基與被接合的分子反應。接合反應可以在RNA仍與固相支持物結合的情況下進行，也可以在RNA裂解後在溶液相中進行。藉由HPLC純化RNA接合物通常會得到純的接合物。
V. SOD1敲低的活體內測試
已生成SOD1-相關神經退化性疾病的小鼠模型，並可進一步用於證明本文提供的該RNAi劑的活體內功效。
該模型可以表現，例如，過度表現，例如，人類過氧化物歧化酶1(SOD1)，在某些情況下包含ALS相關突變(例如，G93A、G37R、G86R、G85R、L84V、G127X、H46R、D90A、L126Z、A4V、或A4V/SOD1WT突變)(參見例如)Mina M,et al.(2018)J Transl Neurosci.3：9)。此外，這樣的模型可以包含例如人類澱粉樣前驅物蛋白質(APP)的組成型或誘導型表達，例如過度表現，在一些情況下包括致病突變(例如瑞典突變(KM670/671NL))、組成型或誘導型表現例如，人類早老素1(PS1)的過度表現，在某些情況下包含致病突變(例如，dE9突變)(參照例如Garcia-Alloza,M et al(2006)Neurobiol Dis 24(3)：516-24)，及/或1N4R人類tau蛋白質的組成型或誘導型表達，例如過度表現，在某些情況下包含致病突變(例如P301S突變)(Wu,T et al(2019)Cell Rep 28(8)：2111-2123)、過氧化物歧化酶1(SOD1)基因轉殖小鼠(參照例如Aziza(2018)In Vivo 32(983)、帕金森氏症(例如MPTP)及/或β-突觸核蛋白基因轉殖小鼠的小鼠毒素模型(Blesa and Przedborski(2014)Front Neurosci 8：155)。
VI.本揭露的RNAi劑的運送
將本揭露的RNAi劑運送至細胞，例如個體內的細胞，例如人類個體(例如，有需要的個體，例如患有SOD1-相關的神經退化性疾病，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)的個體，可以藉由多種不同的方式實現。例如，可以在活體外或活體內，將細胞與本揭露的RNAi劑接觸。活體內運送還可以藉由向個體給藥包含RNAi劑，例如dsRNA的組成物來直接進行。或者，活體內運送 可以藉由給藥一個或多個載體來間接進行，該載體係編碼及引導RNAi劑的表現。這些替代方案將在以下進一步討論。
一般而言，任何運送核酸分子的方法(活體外或活體內)都可以調整而與本揭露的RNAi劑一起使用(參照例如，Akhtar S.and Julian RL.,(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144 and WO94/02595，其全部內容藉由引用併入本文)。對於活體內運送，運送RNAi劑要考慮的因素包括，例如，所運送劑的生物穩定性、非特異性作用的防止、以及運送的劑在標靶組織中的累積。RNAi劑的非特異性作用可以藉由局部給藥來最小化，例如藉由直接注射或植入組織或局部給藥製劑。對治療部位的局部給藥使該劑的局部濃度最大化並限製了劑暴露於全身組織，否則該全身組織會被該劑或可降解劑的那些傷害，並允許給藥較低總劑量的RNAi劑。幾項研究顯示，當局部給藥RNAi劑時，基因產物的成功敲低。例如，在食蟹猴眼睛內藉由玻璃活體內注射運送VEGF dsRNA(Tolentino,MJ.et al.,(2004)Retina 24：132-138)，並且小鼠視網膜下注射(Reich,SJ.et al.(2003)Mol.Vis.9：210-216)均顯示在年齡相關性黃斑部變性的實驗模型中，防止新血管形成。此外，在小鼠中直接腫瘤內注射dsRNA可減少腫瘤體積(Pille,J.et al.(2005)Mol.Ther.11：267-274)，並可以延長帶有腫瘤的小鼠的存活率(Kim,WJ.et al.,(2006)Mol.Ther.14：343-350；Li,S.et al.,(2007)Mol.Ther.15：515-523)。RNA干擾也顯示藉由直接注射，而局部運送至CNS的成功(Dorn,G.et al.,(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan,PH.et al.(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura,H.et a.l(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina,GT.,et al.(2004)Neuroscience 129：521-528；Thakker,ER.,et al.(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya,Y.,et al.(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)，並藉由鼻內給藥進入肺部(Howard,KA.et al.,(2006)Mol.Ther.14：476-484；Zhang,X.et al.,(2004)J.Biol.Chem.279：10677-10684；Bitko,V.et al.,(2005)Nat.Med.11：50-55)。為了系統性地給藥RNAi劑以治療疾病，該RNA可以被修飾，或者使用藥物運送系統；這兩種方法都可以防止活體內核酸內切酶及核酸外切酶對dsRNA的快速降解。該RNA或藥物載體的修飾還可以允許將RNAi劑靶向標靶組織並避免不希望的脫靶效應(例如，不希望受理論束縛，如本文所述的GNA使用，已確定會使dsRNA的種子區域不穩定，產生相較於脫靶效應，例如dsRNA對中靶之有效性的偏好增強，因為此類脫靶效應被此類種子區域不穩定顯著削弱)。RNAi劑可以藉由與膽固醇等親脂基團的化學接合進行修飾，以增強細胞攝取並防止降解。例如，一種針對與親脂性膽固醇部分結合的ApoB的RNAi劑被注射到小鼠全身體內，導致肝臟及空腸中的apoB mRNA被敲低(Soutschek,J.et al.,(2004)Nature 432：173-178)。在前列腺癌小鼠模型中，該RNAi劑與適體的接合已被證明可抑制腫瘤生長並介導腫瘤消退(McNamara,JO.et al.,(2006)Nat.Biotechnol.24：1005-1015)。在一替代實施態樣中，RNAi劑可以藉由使用藥物運送系統來運送，如納米顆粒、樹枝狀聚合物、聚合物、脂質體或陽離子運送系統運送。帶正電荷的陽離子運送系統促進分子RNAi劑(帶負電荷)的結合，並且還增強帶負電荷的細胞膜上的相互作用，以允許細胞有效攝取RNAi劑。陽離子脂質、樹枝狀大分子或聚合物可以與RNAi劑結合，或誘導形成囊泡或微胞(參照例 如，Kim SH.et al.,(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)該囊泡或微胞包裹著RNAi劑。當全身給藥時，該囊泡或微胞的形成進一步防止了RNAi劑的降解。製備及給藥陽離子-RNAi劑複合物的方法在所屬技術領域之通常知識的的能力範圍內(參照例如，Sorensen,DR.,et al.(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma,UN.et al.,(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300：Arnold,AS et al.(2007)J.Hypertens.25：197-205，以上藉由引用將其全部併入本文)。可用於全身輸送RNAi劑的一些藥物輸送系統的非限制性實施例包括DOTAP(Sorensen,DR.,et al(2003),supra；Verma,UN.et al.,(2003),supra)、Oligofectamine，“固體核酸脂質顆粒”(Zimmermann,TS.et al.,(2006)Nature 441：111-114)、心磷脂(Chien,PY.et al.,(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal,A.et al.,(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亞胺(Bonnet ME.et al.,(2008)Pharm.Res.Aug 16 Epub ahead of print；Aigner,A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)胜肽(Liu,S.(2006)Mol.Pharm.3：472-487)、及聚醯胺(Tomalia,DA.et al.,(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo,H.et al.,(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。在一些實施態樣中，RNAi劑與環糊精形成複合物用於全身給藥。RNAi劑及環糊精的給藥方法及醫藥組成物可見於美國專利號7,427,605，該專利藉由引用整體併入本文。
本揭露內容的某些方面與降低細胞中SOD1標靶基因表現的方法有關，包括使該細胞與本揭露的雙股RNAi劑接觸。在一實施態樣中， 細胞係肝的細胞，視需要地係肝細胞。在一實施態樣中，細胞係肝外細胞，視需要地係CNS細胞。
本揭露的另一方面與降低個人中SOD1標靶基因表現的方法有關，包括向個體給藥本揭露的雙股RNAi劑。
本公開內容的另一方面與治療患有SOD1-相關神經退化性疾病之個體的方法有關，包括向個體給藥本揭露的雙股RNAi劑的治療有效量，因此治療個體。示例性CNS病症可以藉由本揭露的方法治療，包括肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
在一實施態樣中，該雙股RNAi劑係皮下給藥的。
在一實施態樣中，該雙股RNAi劑藉由心室內給藥來給藥。
在一實施態樣中，該雙股RNAi劑係鞘內給藥的。在一實施態樣中，雙股RNAi劑藉由腦室內給藥。藉由鞘內或腦室內給藥雙鏈RNAi劑，該方法可以在腦(例如紋狀體)或脊柱組織(例如皮層、小腦、頸椎、腰椎及胸椎降低SOD1標靶基因。
為了便於說明，本節中的配方、組成物及方法主要係針對修飾的siRNA化合物進行大量討論。然而，可以理解這些配方、組成物及方法可以與其他siRNA化合物一起操作，例如未修飾的siRNA化合物，並且這種操作在本揭露內。包含RNAi劑的組成物可以藉由多種途徑運送至個體。示例性途徑包括鞘內、皮下、靜脈內、心室內(也稱為腦室內)、腹膜內、玻璃體內、局部、直腸、肛門、陰道及眼部。
本揭露的RNAi劑可以納入適合給藥的醫藥組成物中。這樣的組成物通常包括一個或多個RNAi劑及藥學上可接受的載體。如本文所 用，術語“藥學上可接受的載體”旨在包括與藥物給藥相容的任何及所有溶劑、分散介質、塗層、抗菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延遲劑等。將此類介質及劑用於藥物活性物質在所屬技術領域中係眾所周知的。除非任何常規介質或劑與活性化合物不相容，否則考慮其在組成物中的用途。補充的活性化合物也可以摻入組成物中。
本揭露的醫藥組成物可以多種方式給藥，這取決於係否需要局部或全身治療以及取決於待治療的區域。給藥可以係局部的(包括眼用的、陰道的、直腸的、經皮的)、口服的或腸胃外的。腸胃外給藥包括靜脈滴注、皮下、腹膜內或肌肉內注射，或鞘內或心室內給藥。
選擇給藥途徑及部位以增強靶向性。例如，為了靶向肌肉細胞，藉由肌肉注射到感興趣的肌肉中將係一個合乎邏輯的選擇。可以藉由給藥粉末或氣溶膠形式的RNAi劑來靶向肺細胞。血管內皮細胞可以藉由在球囊導管塗覆RNAi劑以機械引入RNA。
用於局部給藥的製劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體和粉末。傳統的醫藥載體、水性、粉末或油性基質、增稠劑等可能是必要的或合乎需要的。經塗覆的避孕套、手套等也可能有用。
用於口服給藥的組成物包括粉末或顆粒、懸浮液或水溶液、糖漿、酏劑或非水介質、片劑、膠囊、錠劑或錠劑。在片劑的情況下，可以使用的載體包括乳糖、檸檬酸鈉及磷酸鹽。片劑中常用的崩解劑有澱粉等各種崩解劑，硬脂酸鎂、十二烷基硫酸鈉、滑石粉等潤滑劑。對於膠囊形式的口服給藥，有用的稀釋劑係乳糖及高分子量聚乙二醇。當口服使用 需要水懸浮液時，核酸組成物可以與乳化劑及懸浮劑組合。如果需要，可以添加某些甜味劑或調味劑。
用於鞘內或心室內給藥的組成物可以包括無菌水溶液，其也可以含有緩沖劑、稀釋劑及其他合適的添加劑。
用於腸胃外給藥的製劑可以包括無菌水溶液，其也可以含有緩沖劑、稀釋劑及其他合適的添加劑。心室內的注射可以藉由心室內的導管來促進，例如，連接到儲存器上。對於靜脈內使用，可以控制溶質的總濃度使製劑等滲。
在一實施態樣中，siRNA化合物(例如雙股siRNA化合物或ssiRNA化合物)組成物的給藥係腸胃外的，例如靜脈內(例如，作為推注或作為可擴散灌注)、皮內、腹膜內、肌內、鞘內、心室內、顱內、皮下、經粘膜、口腔、舌下、內窺鏡、直腸、口腔、陰道、局部、尿道或眼部。可以由該個體或其他人(例如醫療保健提供者)提供給藥。藥物可以按計量劑量或在分配計量劑量的分配器中提供。下文將更詳細地討論所選定的運送模式。
鞘內給藥
在一實施態樣中，雙股RNAi劑藉由鞘內注射(即，注射到浸泡腦及脊髓組織的脊髓液中)輸送。將該RNAi劑鞘內注射到脊髓液中可以作為快速推注或藉由可植入皮下的微型泵進行，因此將siRNA定期及持續地輸送到脊髓液中。脊髓液從產生它的脈絡叢循環到脊髓及背根神經節周圍，隨後向上經過小腦及皮層到達蛛網膜顆粒，在那裡液體可以離開中樞 神經系統，即，根據注射的化合物的大小、穩定性及溶解度，鞘內輸送的分子可以藉由整個CNS擊中目標。
在一實施態樣中，鞘內給藥係藉由泵進行的。該泵可以係手術植入的滲透泵。在一實施態樣中，滲透泵被植入椎管的蛛網膜下腔以促進鞘內給藥。
在一些實施態樣中，鞘內給藥係藉由用於藥物的鞘內輸送系統，該系統包括包含一定體積的劑的儲器，以及被配置為輸送包含在儲器中的劑的一部分的泵。關於這種鞘內輸送系統的更多細節可見於WO 2015/116658，該文獻藉由引用整體併入。
鞘內住射的RNAi劑的劑量可能因不同靶基因而異，該使用的適當劑量可能必須針對每個標靶基因單獨確定。通常，該劑量為10μg至2mg，較佳50μg至1500μg，更佳100μg至1000μg。
編碼本揭露RNAi劑的載體
標靶SOD1基因的RNAi劑可以從插入DNA或RNA載體的轉錄單位去表達(參照例如，Couture,A,et al.,TIG.(1996),12：5-10；WO 00/22113、WO 00/22114及US 6,054,299)。取決於所使用的特定結構體及標靶組織或細胞類型，表現較佳係持續的(數月或更長時間)。這些轉殖基因可以被引入作為線性結構、環狀質體或病毒載體，它們可以係整合或非整合載體。該轉殖基因可以被結構化使其作為染色體外質體而遺傳(Gassmann,et al.,(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1292)。
RNAi劑的單股或多股可以從表現載體的啟動子被轉錄。當兩個別股被表現而產生，例如dsRNA，可以將兩個單獨的表現載體共同引入 (例如，藉由轉染或感染)到標靶細胞中。或者，dsRNA的每條個別股都可以由位於同一表現質體的啟動子被轉錄。在一實施態樣中，dsRNA表現為藉由接頭多核苷酸序列連接的反向重複多核苷酸，使得dsRNA具有莖及環結構。
RNAi劑表現載體通常為DNA質體或病毒載體。表現載體與真核細胞相容的，較佳與脊椎動物細胞相容的那些，可用於產生重組構造用於表達如本文所述的RNAi劑。RNAi劑表現載體的運送可以係全身性的，例如藉由靜脈內或肌肉內給藥，藉由給藥至從患者外植(ex-planted)的標靶細胞，然後再引入患者，或藉由允許引入所需標靶細胞的任何其他方式。
可用於本文所述的方法及組成物的病毒載體系統包括但不限於(a)腺病毒載體；(b)反轉錄病毒載體，包括但不限於慢病毒載體、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺相關病毒載體；(d)單純皰疹病毒載體；(e)SV 40向量；(f)多瘤病毒載體；(g)乳頭狀瘤病毒載體；(h)小核糖核酸病毒載體；(i)痘病毒載體，例如正痘病毒，例如牛痘病毒載體或禽痘病毒，例如金絲雀痘或雞痘；(j)輔助依賴性或無膽腺病毒。複製缺陷病毒也可能係有利的。不同的載體會或不會被整合到細胞的基因組中。如果需要，該構造可以包括用於轉染的病毒序列。或者，可以將構造併入能夠進行附加型複制(episomal replication)的載體，例如EPV及EBV載體。用於RNAi劑重組表現的構造通常需要調節元件，例如啟動子、增強子等，以確保RNAi劑在靶細胞中的表達。對於載體及構造要考慮的其他方面係所屬技術領域已知的。
VII.本發明的醫藥組成物
本揭露還包括醫藥組成物及製劑，其包含本揭露的RNAi劑。在一實施態樣中，本文提供了醫藥組成物，其包含如本文所述的RNAi劑的及藥學上可接受的載體。含有RNAi劑的醫藥組成物可用於治療與SOD1的表現或活性相關的疾病或病症，例如SOD1-相關的神經退化性疾病，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
此類醫藥組成物係根據輸送方式配製的。一實施例係配製用於藉由腸胃外輸送，例如藉由靜脈內(IV)、肌內(IM)或皮下(subQ)運送進行全身給藥的組成物。另一實施例係配製用於直接輸送到CNS中的組成物，例如藉由鞘內或心室內的注射途徑，視需要地藉由輸注到腦(例如紋狀體)中，例如藉由連續泵輸注。
在一些實施態樣中，本發明的醫藥組成物係無熱原的或非熱原的。
本揭露的醫藥組成物已足量的劑量給藥，足以抑制SOD1基因表現。一般而言，本揭露的RNAi劑的合適劑量將係約0.001至約200.0mg範圍內，約每月一次至約每年一次，通常約每季一次(即約每三個月一次)的固定劑量)至約每年一次，通常為約1至50mg範圍內的固定劑量，約每月一次至約每年一次，通常約每季一次至約每年一次。
在初始治療方案(例如，負荷劑量)之後，可以以較低頻率進行治療。
通常知識者將理解某些因素會影響有效治療個體所需的劑量及時間，包括但不限於疾病或病症的嚴重程度、先前的治療、個體的通常健康或年齡，以及存在的其他疾病.此外，用治療有效量的組成物治療個體可以包括單一治療或一系列治療。
小鼠遺傳學的進步已經產生了許多用於研究各種SOD1-相關的神經退化性疾病的小鼠模型，該相關疾病將受益於SOD1表現的減少。此類模型可用於RNAi劑的活體內測試，以及用於確定治療有效劑量。合適的小鼠模型在所屬技術領域中係已知的，並且包括例如本文別處描述的小鼠模型。
本揭露的醫藥組成物可以多種方式給藥，這取決於係否需要局部或全身治療以及取決於待治療的區域。給藥可以係局部的(例如，藉由透皮貼劑)、表皮及透皮、口服或腸胃外。腸胃外給藥包括靜脈內、動脈內、皮下、腹膜內或肌肉內註射或輸注；皮下，例如，藉由植入裝置；或顱內，例如，藉由實質內、鞘內或心室內給藥。
RNAi劑可以靶向特定組織的方式輸送，例如肝臟、CNS(例如，大腦的神經元、神經膠質或血管組織)，或肝臟及CNS兩者。
用於局部給藥的醫藥組成物及製劑可以包括透皮貼劑、軟膏、洗劑、乳膏、凝膠、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體及粉末。常規藥物載體、水性、粉末或油性基質、增稠劑等可能係必要的或合乎需要的。帶塗層的保險套、手套等也可能有用。合適的局部製劑包括其中本公開中的RNAi劑與局部輸送劑例如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑及界面活性劑混合的那些。合適的脂質及脂質體包括中性(例如二油醯磷脂醯 DOPE乙醇胺、二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼DMPC、二硬脂醯磷脂醯膽鹼)陰性(例如二肉荳蔻醯磷脂醯甘油DMPG)及陽離子型(例如二油醯四甲基胺基丙基DOTAP及二油醯磷脂醯乙醇胺DOTMA)。本揭露特徵的RNAi劑可以封裝在脂質體中或可以與其形成複合物，特別係與陽離子脂質體形成複合物。或者，RNAi劑可以與脂質複合，特別係與陽離子脂質複合。合適的脂肪酸及酯包括但不限於花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油精、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或C1-20烷基酯(例如肉荳蔻酸異丙酯IPM)、甘油單酯、甘油二酯或其藥學上可接受的鹽。US 6,747,014中詳細描述了局部製劑，該專利藉由引用併入本文。
A.包含膜分子組裝體的RNAi劑製劑
可配製用於本公開的組成物及方法的RNAi劑以用於在膜分子組裝體中輸送，例如脂質體或微胞。如本文所用，術語“脂質體(liposome)”係指由排列在至少一雙層(例如，一個雙層或多個雙層)中的雙性脂質組成的囊泡。脂質體包括具有由親脂性材料形成的膜及水性內部的單層及多層囊泡。水性部分含有RNAi劑組成物。親脂性材料將水性內部與水性外部隔離，其通常不包括RNAi劑組成物，儘管在一些實施例中可能。脂質體可用於將活性成分轉移及輸送至作用部位。因為脂質體膜在結構上類似於生物膜，所以當脂質體應用於組織時，脂質體雙層與細胞膜的雙層融合。隨著脂質體及細胞融合的進行，包括RNAi劑的內部水性內容物被輸送到細胞中，其中RNAi劑可以專一地結合標靶RNA並可以介導 RNAi。在某些情況下，脂質體也被專一地靶向，例如，將RNAi劑引導至特定細胞類型。
含有RNAi劑的脂質體可以藉由多種方法製備。在一實施例中，將脂質體的脂質組分溶解在去污劑中，因此與脂質組分形成微胞。例如，脂質組分可以係雙性陽離子脂質或脂質接合物。去污劑可以具有高臨界微胞濃度並且可以係非離子的。示例性去污劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡糖苷、去氧膽酸鹽及月桂醯肌胺酸。然後將RNAi劑製劑添加到包含脂質成分的微胞中。脂質上的陽離子基團與RNAi劑相互作用，並在RNAi劑周圍凝聚形成脂質體。冷凝後，例如藉由透析除去去污劑，以產生RNAi劑的脂質體製劑。
若必要，可在縮合反應過程中，例如藉由受控添加而加入有助於縮合之載劑化合物。舉例而言，該載劑化合物可係除核酸之外的聚合物(例如，精胺或精三胺)。亦可調節pH以輔助縮合。
生產穩定之聚核苷酸輸送媒介物之方法，該方法將聚核苷酸/陽離子脂質錯合物作為遞送媒介物之結構性成分而併入，進一步揭示於例如WO 96/37194中，其整體內容藉由引用而併入本文。脂質體製劑亦可包括下列中揭示之示例性方法的一個或多個態樣：Felgner,P.L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 8：7413-7417,1987；美國專利號4,897,355；美國專利號5,171,678；Bangham,et al.M.Mol.Biol.23：238,1965；Olson,et al.Biochim.Biophys.Acta 557：9,1979；Szoka,et al.Proc.Natl.Acad.Sci.75：4194,1978；Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984；Kim,et al.Biochim.Biophys.Acta 728：339,1983；以及Fukunaga, et al.Endocrinol.115：757,1984。常用之製備其尺寸適合用作遞送媒介物之脂質聚集體的技術包括超音波處理及凍融加押出(參見，例如，Mayer,et al.Biochim.Biophys.Acta 858：161,1986)。當一致性地小(50至200nm)且相對均勻之聚集體係所欲者時，可使用微流體化(Mayhew,et al.Biochim.Biophys.Acta 775：169,1984)。此等方法可容易地適用於將RNAi劑製劑封裝入脂質體中。
脂質體分為兩大類。陽離子脂質體係帶正電荷的脂質體，它與帶負電荷的核酸分子相互作用形成穩定的複合物。帶正電荷的核酸/脂質體複合物與帶負電荷的細胞表面結合併被內化。由於內體中的酸性pH值，脂質體破裂，將其內容物釋放到細胞質中(Wang et al.(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.,147：980-985)。
對pH敏感或帶負電荷的脂質體包埋(entrap)核酸而不係與其複合。由於核酸及脂質都帶類似電荷，所以會發生排斥而不係複合物形成。然而，一些核酸被截留在這些脂質體的水性內部。pH敏感脂質體已用於將編碼胸苷激酶基因的核酸輸送至培養中的細胞單層。在標靶細胞中檢測到外源基因的表達(Zhou et al.(1992)Journal of Controlled Release,19：269-274)。
一種主要類型的脂質體組成物包括除天然衍生的磷脂醯膽鹼之外的磷脂。例如，中性脂質體組成物可以由二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)或二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組成物通常由二肉荳蔻醯磷脂醯甘油形成，而陰離子融合脂質體主要由二油醯磷脂醯乙 醇胺(DOPE)形成。另一類型的脂質體組成物由磷脂醯膽鹼(PC)例如大豆PC及蛋PC形成。另一種類型由磷脂或磷脂醯膽鹼或膽固醇的混合物形成。
在體外及體內將脂質體引入細胞的其他方法的例子包括美國專利號5,283,185；美國專利號5,171,678；WO 94/00569；WO 93/24640；WO 91/16024；FFelgner,(1994)J.Biol.Chem.269：2550；Nabel,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.90：11307；Nabel,(1992)Human Gene Ther.3：649；Gershon,(1993)Biochem.32：7143；and Strauss,(1992)EMBO J.11：417。
非離子脂質體系統也被檢查以確定它們在將藥物輸送至皮膚中的效用，特別係包含非離子界面活性劑及膽固醇的系統。使用包含NovasomeTM I(二月桂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)及NovasomeTM II(二硬脂酸甘油酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)的非離子脂質體製劑將環孢菌素A輸送到小鼠皮膚的真皮中.結果顯示，這種非離子脂質體系統可有效促進環孢菌素A累積到皮膚的不同層中(Hu et al.,(1994)S.T.P.Pharma.Sci.,4(6)：466)。
脂質體還包括“空間穩定的(sterically stabilized)”脂質體，如本文所用，該術語指包含一個或多個特殊脂質的脂質體，當摻入脂質體時，相對於缺乏此類特殊脂質的脂質體，其產生循環壽命延長。空間穩定的脂質體的實施例係其中脂質體的形成囊泡的脂質部分的一部分(A)包含一個或多個醣脂，例如單唾液酸神經節苷脂GM1，或(B)用一個或多個親水聚合物衍生的那些脂質體，例如聚乙二醇(PEG)部分。儘管不希望受任何特定理論的束縛，但本領域認為，至少對於含有神經節苷脂、鞘磷脂或PEG衍生 脂質的空間穩定化脂質體，這些空間穩定化脂質體的循環半衰期延長來自減少攝取到網狀內皮系統(RES)細胞(Allen et al.,(1987)FEBS Letters,223：42；Wu et al.,(1993)Cancer Research,53：3765)。
包含一個或多個醣脂的各種脂質體係所屬技術領域已知的。Papahadjopoulos et al.(Ann.N.Y.Acad.Sci.,(1987),507：64)發現了單唾液酸神經節苷脂GM1、硫酸半乳糖腦苷脂及磷脂醯肌醇改善脂質體的血液半衰期的能力。這些發現由以下研究闡述：Gabizon et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1988),85,：6949)。美國專利號4,837,028及WO 88/04924，兩者皆頒予Allen等人，揭露了包含(1)鞘磷脂及(2)神經節苷脂GM1或半乳糖腦苷脂硫酸酯的脂質體。美國專利號5,543,152(Webb et al.)揭露了包含鞘磷脂的脂質體。包含1,2-sn-二肉荳蔻醯磷脂醯膽鹼的脂質體揭露於WO 97/13499(Lim et al)。
在一實施態樣中，使用陽離子脂質體。陽離子脂質體具有能夠與細胞膜融合的優點。非陽離子脂質體在活體內被巨噬細胞吸收，可用於將RNAi劑輸送至巨噬細胞，雖然不能有效地與細胞膜融合。
脂質體的其他優點包括：從天然磷脂獲得的脂質體具有生物相容性及可生物降解性；脂質體可以包入多種水溶性及脂溶性藥物；脂質體可以保護封裝在其內部隔室中的RNAi劑免於代謝及降解(Rosoff,in "Pharmaceutical Dosage Forms," Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,volume 1,p.245)。脂質體製劑製備中的重要考慮因素係脂質表面電荷、囊泡大小及脂質體的水體積。
一種帶正電荷的合成陽離子脂質，N-[1-(2,3-二油醯基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化銨(DOTMA)可用於形成與核酸自發相互作用形成脂質的小脂質體，該小脂質體與核酸同步互動形成脂核酸複合物，該複合物能夠與組織培養細胞的細胞膜的帶負電荷的脂質融合，導致RNAi劑的輸送(參照例如，Felgner,P.L.et al.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8：7413-7417及美國專利號4,897,355描述了DOTMA及其與DNA的使用)。
DOTMA類似物1,2-雙(油醯氧基)-3-(三甲基胺)丙烷(DOTAP)可與磷脂組合使用以形成DNA複合囊泡。LipofectinTM Bethesda Research Laboratories,Gaithersburg,Md.)係一有效劑，用於將高陰離子核酸輸送到活組織培養細胞中，這些細胞包含帶正電荷的DOTMA脂質體，這些脂質體自發地與帶負電荷的多核苷酸相互作用形成複合物。當使用足夠多的帶正電荷的脂質體時，所得複合物上的淨電荷也是正電荷。以這種方式製備的帶正電荷的複合物會自發地附著在帶負電荷的細胞表面上，與細胞膜融合，並有效地將功能性核酸輸送到例如組織培養細胞中。另一種市售陽離子脂質，1,2-雙(油醯氧基)-3,3-(三甲基胺)丙烷(“DOTAP”)(Boehringer Mannheim,Indianapolis,Indiana)與DOTMA的不同之處在於油醯基部分藉由酯連接，而不是醚鏈結。
其他報導的陽離子脂質化合物包括已與多種部分接合的那些化合物，包括例如已與兩種類型的脂質中的一種接合的羧基精胺，並且包括諸如5-羧基精甘胺酸二辛油醯胺(“DOGS”)(TransfectamTM的化合物， Promega,Madison,Wisconsin)及二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺5-羧基精胺醯胺(“DPPES”)(參見例如美國專利號5,171,678)。
另一種陽離子脂質接合物包括脂質與膽固醇(“DC-Chol”)的衍生，其已與DOPE組合配製成脂質體(Gao,X.and Huang,L.,(1991)Biochim.Biophys.Res.Commun.179：280)。據報導，藉由將多聚賴胺酸與DOPE結合製成的脂多聚賴胺酸在血清存在下對轉染有效((Zhou,X.et al.,(1991)Biochim.Biophys.Acta 1065：8)。對於某些細胞株，據說這些含有接合陽離子脂質的脂質體表現出比含有DOTMA的組成物更低的毒性並提供更有效的轉染。其他可購買的陽離子脂質產品包括DMRIE及DMRIE-HP(Vical,La Jolla,California)及Lipofectamine(DOSPA)(Life Technology,Inc.,Gaithersburg,Maryland)。適用於輸送寡核苷酸的其他陽離子脂質描述於WO 98/39359及WO 96/37194中。
脂質體製劑特別適用於局部給藥，與其他製劑相比，脂質體具有幾個優點。這些優點包括減少與所給藥藥物的高全身吸收相關的副作用、增加所給藥藥物在所需標靶處的累積，以及將RNAi劑給藥到皮膚中的能力。在一些實施態樣中，脂質體用於將RNAi劑輸送至表皮細胞並且還用於增強RNAi劑進入真皮組織，例如進入皮膚。例如，脂質體可以局部應用。已記載了將配製為脂質體的藥物局部輸送至皮膚(參見例如Weiner et al.,(1992)Journal of Drug Targeting,vol.2,405-410 and du Plessis et al.,(1992)Antiviral Research,18：259-265；Mannino,R.J.and Fould-Fogerite,S.,(1998)Biotechniques 6：682-690；Itani,T.et al.,(1987)Gene 56：267-276；Nicolau,C.et al.(1987)Meth.Enzymol.149： 157-176；Straubinger,R.M.and Papahadjopoulos,D.(1983)Meth.Enzymol.101：512-527；Wang,C.Y.及Huang,L.,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7851-7855)。
還檢查了非離子脂質體系統以確定它們在將藥物輸送至皮膚中的效用，特別是包含非離子界面活性劑及膽固醇的系統。包含Novasome I(甘油二月桂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)及Novasome II(甘油二硬脂酸酯/膽固醇/聚氧乙烯-10-硬脂醚)的非離子脂質體製劑用於將藥物輸送到小鼠皮膚的真皮中。此類具有RNAi劑的製劑可用於治療皮膚病。
包含RNAi劑的脂質體可以被高度變形。這種可變形性可以使脂質體能夠穿透小於脂質體平均半徑的孔。例如，轉移體是一種可變形的脂質體。轉移體可以藉由向標準脂質體組成物中添加表面邊緣活化劑(通常是界面活性劑)來製備。可以例如藉由感染皮下輸送包括RNAi劑的傳遞體，以便將RNAi劑輸送至皮膚中的角質形成細胞。為了穿過完整的哺乳動物皮膚，脂質囊泡必須在合適的透皮梯度的影響下藉由一系列細孔，該細孔直徑小於50nm。此外，由於脂質特性，這些轉移體可以自我優化(適應毛孔的形狀，例如皮膚中的毛孔)、自我修復，並且可以經常到達其目標而不會碎裂，並且通常可以自我加載。
適用於本揭露的其他製劑描述於PCT公開號WO 2008/042973中。
轉移體是另一形式的脂質體，是高度可變形的脂質聚集體，是藥物輸送載體的有吸引力的候選者。轉移體可以被描述為脂滴，其高度可變形，以至於它們很容易穿過比液滴小的孔。轉移體可適應其使用環境， 例如，它們是自我優化的(適應皮膚毛孔的形狀)、自我修復、經常在不破碎的情況下達到其目標，並且通常是自我加載的。為了製造轉移體，可以將表面邊緣活化劑(通常是界面活性劑)添加到標準脂質體組成物中。轉移體已被用於將血清白蛋白輸送到皮膚。已證明轉移體介導的血清白蛋白輸送與皮下注射含有血清白蛋白的溶液一樣有效。
界面活性劑在諸如本文所述的那些製劑中得到廣泛應用，特別係在乳液(包括微乳液)及脂質體中。對許多不同類型的界面活性劑(天然的及合成的)的特性進行分類及排序的最常用方法係使用親水/親油平衡(HLB)。親水基團(也稱為“頭部”)的性質為對進行分類配方中所使用的不同界面活性劑，提供了最有用的方法(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
如果界面活性劑分子未離子化，則歸類為非離子界面活性劑。非離子界面活性劑在藥物及化妝品中得到廣泛應用，並且可在很寬的pH值範圍內使用。一般來說，它們的HLB值範圍從2到大約18，這取決於它們的結構。非離子界面活性劑包括非離子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯、聚甘油酯、脫水山梨糖醇酯、蔗糖酯及乙氧基化酯。非離子鏈烷醇醯胺及醚，如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇及乙氧基化/丙氧基化區塊聚合物也包括在這一類中。聚氧乙烯界面活性劑是非離子界面活性劑類別中最受歡迎的成員。
如果界面活性劑分子在溶解或分散在水中時帶有負電荷，則該界面活性劑被歸類為陰離子界面活性劑。陰離子界面活性劑包括羧酸鹽如皂、醯基乳酸鹽、胺基酸的醯胺、硫酸酯如烷基硫酸鹽及乙氧基化烷基 硫酸鹽、磺酸鹽如烷基苯磺酸鹽、醯基羥乙基磺酸鹽、醯基牛磺酸鹽及磺基琥珀酸鹽，以及磷酸鹽。陰離子界面活性劑類別中最重要的成員是烷基硫酸鹽及皂類。
如果界面活性劑分子在溶解或分散在水中時帶有正電荷，則該界面活性劑被歸類為陽離子界面活性劑。陽離子界面活性劑包括四級銨鹽及乙氧基化胺。四級銨鹽是此類中最常用的成員。
如果界面活性劑分子具有攜帶正電荷或負電荷的能力，則該界面活性劑被歸類為兩性的。兩性界面活性劑包括丙烯酸衍生物、取代的烷基醯胺、N-烷基甜菜鹼及磷脂。
在藥物產品、製劑及乳液中的界面活性劑的使用已經被審查(Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,p.285)。
用於本揭露的方法的RNAi劑也可以作為微胞製劑提供。“微胞(Micelles)”在本文中被定義為一種特定類型的分子組裝體，其中雙性分子排列成球形結構，使得分子的所有疏水部分都向內定向，而使親水部分與周圍的水相接觸。如果環境是疏水的，則存在相反的排列。
適合藉由透皮膜輸送的混合微胞製劑可以藉由混合siRNA組成物、鹼金屬C8至C22烷基硫酸鹽及微胞形成化合物的水溶液來製備。示例性的微胞形成化合物包括卵磷脂、透明質酸、透明質酸的藥學上可接受的鹽、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黃瓜提取物、油酸、亞油酸、亞麻酸、單油精、單油酸酯、單月桂酸酯、琉璃苣油、月見草油、薄荷醇、三羥基氧代膽鹼基甘胺酸及其藥學上可接受的鹽、甘油、聚甘油、賴胺酸、聚 賴胺酸、三油精、聚氧乙烯醚及其類似物、聚多卡醇烷基醚及其類似物、鵝去氧膽酸鹽、去氧膽酸鹽及其混合物。微胞形成化合物可以在添加鹼金屬烷基硫酸鹽的同時或之後添加。混合微胞將藉由實質上任何種類的成分混合形成，但劇烈混合以提供更小尺寸的微胞。
在一方法中，製備第一微胞組成物，其包含siRNA組成物及至少鹼金屬烷基硫酸鹽。然後將第一微胞組成物與至少三種微胞形成化合物混合以形成混合微胞組成物。在另一方法中，藉由混合siRNA組成物、鹼金屬烷基硫酸鹽及至少一種形成微胞的化合物，然後加入剩餘的形成微胞的化合物，劇烈混合來製備微胞組成物。
可以將苯酚或間甲酚添加到混合微胞組成物中以穩定製劑並防止細菌生長。或者，苯酚或間甲酚可以與微胞形成成分一起添加。在形成混合微胞組成物之後，也可以加入等滲劑如甘油。
為了以噴霧劑的形式輸送膠束製劑，可以將製劑放入氣溶膠分配器中並且在分配器中裝入推進劑。處於壓力下的推進劑在分配器中呈液體形式。調整成分的比例以使水相及推進劑相合而為一，即存在一相。如果有兩個階段，則必須在分配一部分內容物之前搖動分配器，例如藉由計量閥。劑的分配劑量從計量閥以精細的噴霧推進。
推進劑可包括含氫氯氟烴、含氫氟烴、二甲醚及二乙醚。在某些實施例中，可以使用HFA 134a(1,1,1,2四氟乙烷)。
基本成分的具體濃度可以藉由相對簡單的實驗來確定。為了藉由口腔吸收，通常需要增加例如至少兩倍或三倍的藉由注射或藉由胃腸道給藥的劑量。
脂質顆粒
RNAi劑，例如本揭露中的dsRNA，可以完全包封在脂質製劑中，例如LNP，或其他核酸-脂質顆粒。
如本文所用，術語“LNP”係指穩定的核酸-脂質顆粒。LNPs通常包含陽離子脂質、非陽離子脂質及防止顆粒聚集的脂質(例如，PEG-脂質接合物)。LNPs對全身應用非常有用，因為它們在靜脈內(i.v.)注射後表現出延長的循環生命週期，並在遠端部位(例如，與給藥部位物理分離的部位)積累。LNP包括“pSPLP”，其包括如WO 00/03683中所述的包封的縮合劑-核酸複合物。本公開的顆粒通常具有約50nm至約150nm、更通常約60nm至約130nm、更通常約70nm至約110nm、最通常約70nm至約90nm的平均直徑，並且實質上無毒。此外，當核酸存在於本揭露的核酸-脂質顆粒中時，核酸在水溶液中對核酸酶的降解具有抗性。核酸-脂質顆粒及其製備方法公開於例如美國專利號5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美國專利公開號2010/0324120及WO 96/40964。
在一實施態樣中，脂質與藥物的比率(質量/質量比率)(例如，脂質與dsRNA的比率)將在約1：1至約50：1、約1：1至約25：1的範圍內，約3：1至約15：1，約4：1至約10：1，約5：1至約9：1，或約6：1至約9：1。上述範圍的中間範圍也被認為是本公開的一部分。
本領域已經描述了用於輸送RNAi劑的某些特定LNP製劑，包括例如描述於例如WO 2008/042973中的“LNP01”製劑，其藉由引用併入本文。
下表中確定了另外的示例性脂質-dsRNA製劑。
Figure 111105127-A0202-12-0219-229
Figure 111105127-A0202-12-0220-230
Figure 111105127-A0202-12-0221-231
 DSPC：二硬脂醯磷脂醯膽鹼 DPPC：二棕櫚醯磷脂醯膽鹼 PEG-DMG：PEG-二肉荳蔻醯甘油(C14-PEG，或PEG-C14)(平均莫耳重量為2000的PEG) PEG-DSG：PEG-二苯乙烯基甘油(C18-PEG或PEG-C18)(平均莫耳重量為2000的PEG) PEG-cDMA：PEG-胺基甲醯基-1,2-二肉癸醯基氧基丙胺(PEG平均莫耳重量為2000)
包含SNALP(1,2-二亞油醯氧基-N,N-二甲基胺基丙烷(DLinDMA))的製劑於WO 2009/127060中描述，其藉由引用併入本文。
包含XTC的製劑於WO 2010/088537中描述，其全部內容藉由引用併入本文。
包含MC3的製劑於例如美國專利公開號2010/0324120中描述，其全部內容藉由引用併入本文。
包含ALNY-100的製劑於WO 2010/054406中描述，其全部內容藉由引用併入本文。
包含C12-200的製劑於WO 2010/129709中描述，其全部內容藉由引用併入本文。
用於口服給藥的組成物及製劑包括粉末或顆粒、微粒、納米顆粒、懸浮液，或在水或非水介質中的溶液、膠囊、凝膠膠囊、香囊、片劑或小片劑。增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是合乎需要的。在一些實施態樣中，口服製劑是那些，其中本揭露特徵的dsRNA與一個或多個滲透促進劑界面活性劑及螯合劑聯合給藥。合適的界面活性劑包括脂肪酸或其酯或鹽、膽汁酸或其鹽。合適的膽汁酸/鹽包括鵝去氧膽酸(CDCA)及熊去氧膽酸(UDCA)、膽酸、去氫膽酸、去氧膽酸、葡萄糖膽酸、乙醇酸、甘胺去氧膽酸、牛磺膽酸、牛磺去氧膽酸、牛磺-24,25-二氫鈉-夫西地及糖二氫夫西酸鈉。合適的脂肪酸包括花生四烯酸、十一烷酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、單油精、二月桂酸甘油酯、1-單癸酸甘油酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼或甘油單酯、甘油二酯或其藥學上可接受的鹽(例如鈉)。在一些實施態樣中，使用滲透促進劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽酸/鹽的組合。一種示例性的組合是月桂酸、癸酸及UDCA的鈉鹽。其他滲透促進劑包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本揭露中的特徵DsRNA可以包括噴霧乾燥顆粒的顆粒形式口服輸送，或複合以形成微米或納米顆粒。DsRNA複合劑包括聚胺基酸；聚亞胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷、聚氰基丙烯酸烷基酯； 陽離子明膠、白蛋白、澱粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(PEG)及澱粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；DEAE衍生的聚亞胺、花粉、纖維素及澱粉。合適的複合劑包括幾丁聚醣、N-三甲基殼聚醣、聚-L-離胺酸、聚組胺酸、聚鳥胺酸、聚精胺、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基胺基甲基乙烯P(TDAE)、聚胺基苯乙烯(例如對胺基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸異丁酯)、聚(異己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-甲基丙烯酸酯、DEAE-丙烯酸己酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-白蛋白及DEAE-葡聚醣、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(D,L-乳酸)、聚(DL-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、藻酸鹽及聚乙二醇(PEG)。對於dsRNA的口服製劑及其製備在美國專利號6,887,906、美國專利2003/0027780及美國專利號6,747,014中有詳細描述，每一都以引用的方式併入本文。
對於腸胃外、腦實質內(腦內)、鞘內、心室內或肝內給藥的組成物及製劑可以包括無菌水溶液，其中也可以含有緩沖劑、稀釋劑及其他合適的添加劑，例如但不限於滲透促進劑、載體化合物及其他藥學上可接受的載體或賦形劑。
本揭露的醫藥組成物包括但不限於溶液、乳液及含有脂質體的製劑。這些組成物可由多種組分產生，包括但不限於預製液體、自乳化固體及自乳化半固體。特別較佳的是在治療SOD-1相關疾病或病症時靶向大腦的製劑。
本揭露的醫藥製劑，其可以方便地以單位劑型存在的，並且可以根據製藥工業中眾所周知的常規技術來製備。這種技術包括使活性成分與藥物載體或賦形劑結合的步驟。通常，製劑製備係藉由將活性成分與 液體載體或細碎的固體載體或兩者，均勻且緊密地結合，然後，如果需要，使產品成型。
本揭露的組成物可以被配製成許多可能劑型中的任一種，例如但不限於片劑、膠囊、凝膠膠囊、液體糖漿、軟凝膠、栓劑及灌腸劑。本揭露的組成物還可以配製成在水性、非水性或混合介質中的懸浮液。水性懸浮液可以復包含增加懸浮液黏度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚醣。懸浮液也可以含有穩定劑。
其他配方
i.乳液
本揭露的組成物可以製備及配製為乳液。乳液通常是一液體以液滴的形式分散在另一液體中的非均質系統，該液滴直徑通常超過0.1μm(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,PopovichNG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Volume 1,p.245；Block in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 2,p.335；Higuchi et al.,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.301)。乳液通常是雙相體系，其包含相互緊密混合及 分散的兩種不混溶的液相。通常，乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)類型。當水相被精細分割成微小液滴並分散到大量油相中時，所得組成物稱為油包水(w/o)乳液。或者，當油相被細分為微小液滴並分散到本體水相中時，所得組成物稱為水包油(o/w)乳液。除了分散相及可以作為溶液存在於水相、油相中或本身作為單獨相的活性藥物之外，乳劑還可以包含其他組分。根據需要，乳化劑、穩定劑、染料及抗氧化劑等藥用賦形劑也可以存在於乳劑中。藥用乳劑也可以是由多於兩個相組成的多重乳劑，例如在油包水(o/w/o)及油包水的情況下。水(w/o/w)乳液。這種複雜的配方通常提供簡單的二元乳液所沒有的某些優點。多重乳液其中o/w乳液的單個油滴包圍小水滴，其構成w/o/w乳液。同樣，封閉在油性連續相中之穩定之水珠中的的油滴系統提供了o/w/o乳液。
乳液的特點是熱力學的穩定性很小或沒有。通常，乳液的分散相或不連續相很好地分散到外相或連續相中，並藉由乳化劑或製劑的黏度的手段保持這種形式。乳液的任一相可以是半固體或固體，如乳液型軟膏基質及乳膏的情況。穩定乳液的其他方法意謂乳化劑的使用，其可摻入乳液的任一相中。乳化劑大致可分為四類：合成界面活性劑、天然乳化劑、吸收基質及精細分散的固體(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
合成界面活性劑也稱為界面活性劑，其已被發現在乳液的配方中具有廣泛的適用性，並在文獻中進行了回顧(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1988,volume 1,p.199)。界面活性劑通常是兩性的，並且包含親水部分及疏水部分。界面活性劑的親水性與疏水性之比被稱為親水/親油平衡(hydrophile/lipophile balance,HLB)，它是在製劑製備過程中對界面活性劑進行分類及選擇的重要工具。界面活性劑可根據親水基團的性質分為不同的類別：非離子、陰離子、陽離子及兩性(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY Rieger,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.285)。
用於乳液配方的天然乳化劑包括羊毛脂、蜂蠟、磷脂、卵磷脂及阿拉伯膠。吸收性基質具有親水性，因此它們可以吸收水以形成w/o乳液，同時保持其半固體稠度，例如無水羊毛脂及親水性凡士林。細碎的固體也被用作良好的乳化劑，尤其是與界面活性劑結合使用，及用於黏性製劑中。這些包括極性無機固體，例如重金屬氫氧化物，非膨脹黏土，例 如膨潤土、水輝石、鋰蒙脫石、高嶺土、蒙脫石、膠體矽酸鋁及膠體矽酸鎂鋁、顏料及非極性固體，例如碳或三硬脂酸甘油酯。
乳液配方中還包含大量非乳化材料，它們有助於乳液的性能。這些包括脂肪、油、蠟、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、保濕劑、親水膠體、防腐劑及抗氧化劑(Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。
親水的膠體或親水膠體包括天然存在的樹膠及合成聚合物，例如多醣(例如，阿拉伯膠、瓊脂、海藻酸、角叉菜膠、瓜爾膠、刺梧桐樹膠及黃蓍膠)、纖維素衍生物(例如，羧甲基纖維素及羧丙基纖維素)及合成的聚合物(例如，卡波姆、纖維素醚及羧基乙烯基聚合物)。它們在水中分散或溶脹形成膠體溶液，藉由在分散相液滴周圍形成強力界面膜，並增加外相的黏度來穩定乳液。
由於乳液通常含有多種成分，例如碳水化合物、蛋白質、甾醇及磷脂，它們可以很容易地支持微生物的生長，因此這些配方通常會加入防腐劑。乳液配方中常用的防腐劑包括對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、四級銨鹽、氯化苯銨、對羥基苯甲酸酯及硼酸。抗氧化劑通常也添加到乳液配方中以防止配方變質。使用的抗氧化劑可以是自由基清除劑，例如生育酚、沒食子酸烷基酯、丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯，或還原 劑例如抗壞血酸及焦亞硫酸鈉，以及抗氧化劑增效劑例如檸檬酸、酒石酸及卵磷脂。
在文獻中回顧了藉由皮膚病學、口服及非腸道途徑應用乳液製劑及其製造方法(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。因為易於配製，以及從吸收及生物利用度的角度來看的功效，因此用於口服輸送的乳液製劑已被非常廣泛地使用(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Idson,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.199)。礦物油基瀉藥、油溶性維生素及高脂肪營養製劑是通常作為o/w乳劑口服給藥的物質。
ii.微乳液
在本揭露的一實施態樣中，RNAi劑及核酸的組成物被配製成微乳液。微乳液可以定義為水、油及雙性物的系統，它是單一光學均向及熱力學穩定的液體溶液(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245)。通常，微乳液是以下這樣製備的系統，首先將油分散在界面活性劑水溶液中，然後加入足量的第四組分，通常是中等鍊長的醇以形成透明系統。因此，微乳液也被描述為兩種不混溶液體的熱力學穩定、均向透明分散體，由表面活性分子的界面膜穩定(Leung and Shah,in：Controlled Release of Drugs：Polymers and Aggregate Systems,Rosoff,M.,Ed.,1989,VCH Publishers,New York,pages 185-215)。微乳液通常藉由包括油、水、界面活性劑、助界面活性劑及電解質在內的三到五種組分的組合來製備。微乳液是油包水(w/o)或水包油(o/w)型，取決於所用油及界面活性劑的性質，以及微乳液的結構及界面活性劑分子的極性頭及烴尾的幾何堆積(Schott,in Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1985,p.271)。
利用相圖的現象學方法已經被廣泛研究，並且對所屬技術領域中具有通常知識者來說，已經產生了關於如何配製微乳液的全面知識(參照例如，Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,Allen,LV.,Popovich NG.,and Ansel HC.,2004,Lippincott Williams & Wilkins(8th ed.),New York,NY；Rosoff,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.245；Block,in Pharmaceutical Dosage Forms,Lieberman,Rieger and Banker(Eds.),1988,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,volume 1,p.335)。與傳統乳液相比，微乳液具有將水不溶性藥物溶解在自發形成的熱力學穩定液滴製劑中的優勢。
用於製備微乳液的界面活性劑包括但不限於離子界面活性劑、非離子界面活性劑、Brij 96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油單月桂酸酯(ML310)、四甘油單油酸酯(MO310)、六甘油單油酸酯(PO310)、六甘油五油酸酯(PO500)、十甘油單癸酸酯(MCA750)、十甘油單油酸酯(MO750)、十甘油倍半油酸酯(SO750)、十甘油十油酸酯(DAO750)，單獨或與助界面活性劑組合使用。助界面活性劑(cosurfactant)，通常是短鏈醇，如乙醇、1-丙醇及1-丁醇，藉由滲透到界面活性劑膜中來增加界面流動性，因此由於界面活性劑分子之間產生空隙空間而產生無序膜。然而，微乳液可以在不使用輔助表面活性劑的情況下而製備，並且無醇自乳化微乳液體系在所屬技術領域係已知的。水相通常可以是，但不限於，水、藥物水溶液、甘油、PEG300、PEG400、聚甘油、丙二醇及乙二醇的衍生物。油相可包括但不限於諸如Captex 300、Captex 355、Capmul MCM、脂肪酸酯、中鏈(C8至C12)單、二及三甘油酯、聚氧乙基化甘油脂肪酸酯、脂肪醇、聚乙二醇化甘油酯、飽和聚乙二醇化C8-C10甘油酯、植物油及矽油。
從藥物溶解及加強藥物吸收的角度來看，微乳液係特別令人感興趣。已經提出以脂質為基礎的微乳液(o/w及w/o)來提高藥物的口服生物利用率，並包括胜肽(參照例如，美國專利號6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research, 1994,11,1385-1390；Ritschel,Meth.Find.Exp.Clin.Pharmacol.,1993,13,205)。微乳液提供以下優點：改善藥物溶解性、保護藥物免於酵素水解、由於表面活性劑引起的膜流動性及滲透性改變而可能增強藥物吸收、易於製備、與固體劑型相比易於口服給藥、改善臨床效力及降低毒性(參照例如，美國專利號6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；Constantinides et al.,Pharmaceutical Research,1994,11,1385；Ho et al.,J.Pharm.Sci.,1996,85,138-143)。當它們的組分在環境溫度下混合在一起時，微乳液通常會自發形成。這可能特別有利，當在配製耐熱藥物、胜肽或RNAi劑時。在化妝品及藥物應用中，微乳液對於活性成分的透皮輸送方面也是有效的。預期本揭露的微乳液組成物及製劑將從胃腸道促進RNAi劑及核酸的全身吸收，以及改善RNAi劑及核酸的局部細胞攝取。
本揭露的微乳液還可以包含額外的組分及添加劑，例如脫水山梨糖醇單硬脂酸酯(Grill 3)、Labrasol及滲透促進劑，以改善製劑的性質並增強本揭露的RNAi劑及核酸的吸收。在本揭露的微乳液中使用的滲透促進劑可以分類為屬於五個大類之一：表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑及非螯合非表面活性劑(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。每一個案例已經在以上討論。
iii 微粒子
本揭露的RNAi劑可以加入到顆粒，例如到微粒中。微粒可以藉由噴霧乾燥生產，但也可以藉由其他方法生產，包括凍乾、蒸發、流化床乾燥、真空乾燥或這些技術的組合。
iv.穿透增強劑
在一實施態樣中，本揭露使用各種滲透增強劑來影響核酸的有效運送，特別是RNAi劑向動物皮膚的效運送。大多數藥物以離子化及非離子化形式存在於溶液中。然而，通常只有脂溶性或親脂性藥物容易穿過細胞膜。已經發現，如果要穿過的膜係用滲透促進劑處理，即使是非親脂性藥物也可以穿過細胞膜。除了幫助非親脂性藥物擴散穿過細胞膜外，滲透促進劑還增強了親脂性藥物的滲透性。
滲透促進劑可分為五類之一，即表面活性劑、脂肪酸、膽鹽、螯合劑及非螯合非表面活性劑(參照例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)。上述每一類滲透增強劑在下文更詳細地描述。
界面活性劑(或“界面-活化劑”)是化學實體，當溶解在水溶液中時，其降低溶液的表面張力或水溶液與另一液體之間的界面張力，因此增強使RNAi劑藉由黏膜。除了膽鹽及脂肪酸之外，這些滲透促進劑包括，例如，月桂基硫酸鈉、聚氧乙烯-9-月桂基醚及聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚)(參照例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92)；及全氟化學乳液，例如FC-43。Takahashi et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1988,40,252)。
用作滲透促進劑的各種脂肪酸及其衍生物包括例如，油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉荳蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸、三癸酸、單油精(1-單油醯基-消旋甘油)、二月桂酸甘油酯、辛酸、 花生四烯酸、甘油1-單癸酸酯、1-十二烷基氮雜環庚烷-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、其C1-20烷基酯(例如甲基、異丙基及t-丁基)及其甘油單酯及甘油二酯(即油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉荳蔻酸酯、棕櫚酸酯、硬脂酸酯、亞油酸酯等。)(參照例如，Touitou,E.,et al.Enhancement in Drug Delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,p.92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；El Hariri et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1992,44,651-654)。
膽汁的生理作用包括促進脂質及脂溶性維生素的分散及吸收(參照例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Brunton,Chapter 38 in：Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,9th Ed.,Hardman et al.Eds.,McGraw-Hill,New York,1996,pp.934-935)。各種天然膽鹽及其合成衍生物可作為滲透促進劑。因此，術語“膽鹽”包括任何天然存在的膽汁成分以及它們的任何合成衍生物。合適的膽鹽包括，例如，膽酸(或其藥學上可接受的鈉鹽，膽酸鈉)、脫氫膽酸(脫氫膽酸或脫氫膽酸鈉)、去氧膽酸(去氧膽酸或去氧膽酸鈉)、甘膽酸(甘膽酸(glucholic acid)或甘膽酸鈉)、糖膽酸(糖膽酸(glycholic acid)或糖膽酸鈉)、糖去氧膽酸(糖去氧膽酸(glycodeoxycholic acid)或糖去氧膽酸鈉)、牛磺膽酸(牛磺膽酸(taurocholic acid)或牛磺膽酸鈉)、牛磺去氧膽酸(牛磺去氧膽酸(taurodeoxycholic acid)或牛磺去氧膽酸鈉)、鵝去氧膽酸(鵝去氧膽酸(chenodeoxycholic acid)或鵝去氧膽酸鈉)、熊去氧膽酸(UDCA)、牛磺- 24,25-二氫夫西酸鈉(STDHF)、二氫夫西酸鈉及聚氧乙烯-9-月桂基醚(POE)(參照例如，Malmsten,M.Surfactants and polymers in drug delivery,Informa Health Care,New York,NY,2002；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Swinyard,Chapter 39 In：Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Gennaro,ed.,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990,pages 782-783；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Yamamoto et al.,J.Pharm.Exp.Ther.,1992,263,25；Yamashita et al.,J.Pharm.Sci.,1990,79,579-583)。
與本揭露結合使用的螯合劑可以定義為藉由與溶液形成複合物從溶液中去除金屬離子的化合物，其結果係增強了藉由黏膜吸收RNAi劑。關於它們在本揭露中作為滲透促進劑的用途，螯合劑具有還用作DNase抑制劑的額外優勢，因為大多數特性化的DNA核酸酶需要二價金屬離子進行催化，因此被螯合劑抑制(Jarrett,J.Chromatogr.,1993,618,315-339)。合適的螯合劑包括但不限於乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、檸檬酸、水楊酸鹽(例如水楊酸鈉、5-甲氧基水楊酸鹽及高香草酸鹽)、膠原蛋白的N-醯基衍生物、laureth-9及β的N-胺基醯基衍生物-二酮(烯胺)(參照例如，Katdare,A.et al.,Excipient development for pharmaceutical,biotechnology,and drug delivery,CRC Press,Danvers,MA,2006；Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92；Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33；Buur et al.,J.Control Rel.,1990,14,43-51)。
如本文所用，非螯合非表面活性劑滲透增強化合物可定義為表現出作為螯合劑或表面活性劑的不顯著活性，但仍增強藉由消化道黏膜吸收RNAi劑的的化合物(參照例如，Muranishi,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1990,7,1-33)。這類滲透促進劑包括，例如，不飽及環狀脲、1-烷基-及1-烯基氮雜環烷酮衍生物(Lee et al.,Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems,1991,page 92)；及非類固醇型抗發炎藥，例如雙氯芬酸鈉、吲哚美酒辛及丁二苯吡唑二酮(Yamashita et al.,J.Pharm.Pharmacol.,1987,39,621-626)。
在細胞等級增強RNAi劑攝取的劑可添加到本揭露的醫藥及其他組成物中。例如，陽離子脂質，例如lipofectin(Junichi et al，美國專利號5,705,188)，陰離子甘油衍生物及聚陽離子分子，例如聚離胺酸(WO 97/30731)，也已知能增強細胞攝取dsRNA。
其他劑可被用於增強所給藥核酸的滲透，包括二醇類如乙二醇及丙二醇、吡咯類如2-吡咯、氮酮類及萜類，如檸檬烯及薄荷酮。
vi.賦形劑
與載體化合物相反，“藥物載體”或“賦形劑”係藥學上可接受的溶劑、懸浮劑或任何其他藥理學惰性載體，用於將一個或多個核酸輸送至動物。賦形劑可以係液體或固體，並且在結合於核酸及給定醫藥組成物的其他組分時，可根據計劃的給藥方式選擇賦形劑，以提供所需的體積及稠度等。典型的藥物載體包括但不限於黏合劑(例如預膠化玉米澱粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素等)；填充劑(例如乳糖及其他醣類、微晶纖維素、果膠、明膠、硫酸鈣、乙基纖維素、聚丙烯酸酯或磷酸氫鈣等)； 潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石粉、二氧化矽、膠體二氧化矽、硬脂酸、金屬硬脂酸鹽、氫化植物油、玉米澱粉、聚乙二醇、苯甲酸鈉、乙酸鈉等)；崩解劑(例如澱粉、羥基乙酸澱粉鈉等)；及潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉等)。
適用於非腸道給藥的藥學上可接受的有機或無機賦形，其不與核酸發生有害反應劑，也可用於配製本揭露的組成物。合適的藥學上可接受的載體包括但不限於水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
用於局部給藥核酸製劑可以包括無菌及非無菌水溶液、在普通溶劑的非水溶液，如醇，或在液體或固體油基中的核酸溶液。該溶液還可以包含緩沖劑、稀釋劑及其他合適的添加劑。可使用適用於非腸道給藥之不會與核酸發生有害反應的藥學上可接受的有機或無機賦形劑。
合適的藥學上可接受的賦形劑包括但不限於水、鹽溶液、醇、聚乙二醇、明膠、乳糖、直鏈澱粉、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等。
vii.其他組分
本揭露的組成物可以額外包含在醫藥組成物中，常規使用的在其領域確立使用濃度的其他輔助組分。因此，例如，組成物可以包含額外的、相容的藥學活性物質，例如止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或抗炎劑，或者可以包含對於本揭露組成物之物理配製各種劑型有用的額外材料，例如染料、調味劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、增稠劑及穩定劑。然而，在添加時這些材料不應過度干擾揭露開組成物組分的生物活性。製劑可以滅 菌，如果需要，可以與助劑混合，例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤濕劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、調味劑或芳香物質等，它們不會與製劑的核酸有害地相互作用。
水性懸浮液可包含增加懸浮液黏度的物質，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚醣。懸浮液也可以含有穩定劑。
在一些實施態樣中，本揭露的醫藥組成物包括(a)一個或多個RNAi劑及(b)一個或多個藉由非RNAi機制發揮作用並且可用於治療SOD1-相關的神經退化性疾病的劑。此類藥物的實施例包括但不限於SSRI、文拉法辛(venlafaxine)、安非他酮及非典型抗精神病藥。
此類化合物的毒性及治療功效可以藉由細胞培養物或實驗動物中的標準醫藥程序來確定，例如，用於確定LD50(對50%的人群致死的劑量)及ED50(對50%的人群治療的有效劑量)。毒性及治療作用之間的劑量比是治療指數，其可表示為比值LD50/ED50。表現出高治療指數的化合物為較佳。
從細胞培養試驗及動物研究中獲得的數據，其可用於製定用於人類的一系列劑量。本揭露中本文特徵的組成物的劑量通常在循環濃度範圍內，其中包括ED50，其毒性很小或沒有毒性。根據所用劑型及所用給藥途徑，劑量可在該範圍內變化。對於在本揭露之特徵方法中使用的任何化合物，治療有效劑量可以最初從細胞培養試驗來估計。在動物模型中可以配製劑量以達到化合物的循環血漿濃度範圍，或在適當時，達到標靶序列的多胜肽產物的循環血漿濃度範圍(例如達到降低的多胜肽濃度)，包括IC50(即，在細胞培養物中檢測的達到最大半數抑制症狀的測試化合物的濃 度)。此類訊息可用於更準確地確定人體的有用劑量。例如，可以藉由高效液相層析，測量血漿中的濃度。
除了它們的給藥，如上所述，本揭露中特徵的RNAi劑可以與其他治療藉由核苷酸重複表現介導病理之過程的其他已知藥物一起給藥。在任何情況下，給藥醫師可根據使用所屬技術領域已知的或本文描述的標準功效測量觀察到的結果，而調整RNAi劑給藥的量及時間。
VIII.套組
在某些方面，本揭露提供了包括合適容器的套組，該容器含有siRNA化合物的醫藥製劑，例如雙股siRNA化合物或siRNA化合物(例如前驅物，例如更大的siRNA化合物，其可以被處理為siRNA化合物或編碼siRNA化合物的DNA，例如雙股siRNA化合物，或siRNA化合物，或其前驅物)。在某些實施態樣中，醫藥製劑的各別組分可以在一容器中提供。或者，分別在兩個或多個容器中提供醫藥製劑的成分係所需的，例如，用於siRNA化合物製劑的一個容器，及用於載體化合物的至少另一個容器。該套組可以多種不同的配置進行包裝，例如一個或多個容器裝在單一盒子中。不同的組分可以被組合，例如，根據套組提供的說明。可以根據本文所述的方法組合組分，例如以製備及給藥醫藥組成物。該套組還可以包括輸送裝置。
IX.抑制SOD1表現的方法
本揭露還提供了抑制細胞中SOD1基因表現的方法。該方法包括使細胞與RNAi劑接觸，例如，雙股RNAi劑在細胞中以有效劑量抑制細胞中SOD1表達的量，因此抑制細胞中SOD1的表現。在本揭露的某 些實施態樣中，在CNS(例如，腦)細胞中SOD1被優先抑制。在本公開的其他實施態樣中，SOD1優先在肝臟(例如，肝細胞)中受到抑制。在本揭露的某些實施態樣中，在CNS(例如，腦)細胞及肝臟(例如，肝細胞)細胞中，SOD1受到抑制。
使細胞與RNAi劑(例如雙股RNAi劑)接觸，可以在活體外或活體內進行。使活體內細胞與RNAi劑接觸包括使個體(例如人類個體)內的細胞或細胞群與RNAi劑接觸。也可為接觸細胞的活體外及活體內方法的組合。
如上所述，接觸細胞可以是直接的或間接的。此外，可以藉由靶向配體實現接觸細胞，包括本文所述或所述技術領域已知的任何配體。在一些實施態樣中，靶向配體係碳水化合物部分，例如GalNAc配體，或將RNAi要劑引導至感興趣位點的任何其他配體。
如本文所用，術語“抑制(inhibiting)”可與“減少(reducing)”、“沉默(silencing)”、“下調(downregulating)”、“壓抑(suppressing)”及其他類似術語互換使用，並且包括任何濃度的抑制。在某些實施態樣中，抑制濃度(例如，本揭露的RNAi劑)可以在細胞培養條件下評估，例如，其中細胞培養中的細胞以接近於10nM或更小、1nM或更小等能濃度，藉由LipofectamineTM介導的轉染。所給予RNAi劑的敲低可以藉由比較細胞培養物的處理前濃度與處理後濃度來確定，視需要地還可以與同時用亂序或其他形式的對照RNAi劑處理的細胞進行比較。細胞培養的敲低，例如較佳50%或更多的敲落可以由此被鑑定為顯示已經發生“抑制”或“減少”、“下調”或“抑制”等。靶向mRNA或編碼的蛋白質濃度係明確地被考慮的(以及 因此由本揭露的RNAi劑引起的“抑制”程度等)，其還可以在活體內系統中評估本公開的RNAi劑，在如所屬技術領域所述的適當控制的條件下。
“SOD1基因表現的抑制”包括任何濃度的SOD1基因抑制，例如SOD1基因表現的至少部分抑制，例如抑制至少20%。在某些實施態樣中，抑制為至少30%、至少40%，較佳至少50%、至少約60%、至少70%、至少約80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%；或低於檢測方法的可檢測濃度。在較佳的方法中，使用實施例1中提供的螢光素酶檢測法，抑制係在10nM濃度的siRNA下測量。
SOD1基因的表現可以根據與其相關的任何變量的濃度來評估，例如，SOD1 mRNA濃度或SOD1蛋白濃度，或例如，神經炎症濃度，例如，小膠質細胞及星形膠質細胞活化，及與神經元細胞死亡相關的大腦區域中的SOD1累積。
抑制可以藉由一個或多個的相對於對照濃度的絕對下降或相對下降而評估。對照濃度可以為所屬技術領域中使用的任何類型的對照濃度，例如給藥前基線濃度，或從未經處理或用對照處理的類似個體、細胞或樣品確定的濃度(例如，僅緩衝區對照組或非活性藥物對照組)。
在本公開的方法的一些實施態樣中，SOD1基因的表現被抑制至少20%、30%、40%，較佳至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、或95%，或低於檢測的可檢測濃度。在某些實施態樣中，該方法包括臨床相關的SOD1表達抑制，例如如用降低SOD1表達的劑治療受試者後的臨床相關結果所證明的那樣。
SOD1基因表現的抑制可以藉由由第一個細胞或細胞群表達的mRNA的量而表現出來(例如，此類細胞可能存在於來自個體的樣品中)，其中SOD1基因被轉錄，並且已經被處理(例如，藉由使細胞與本揭露RNAi劑接觸，或藉由將本揭露的RNAi劑給藥於受試者，該受試者身上存在細胞)，因此與第二細胞或細胞組相比，SOD1基因的表現受到抑制，該第二細胞或細胞組與未經過如此處理的第一細胞或細胞組實質上相同(未用RNAi劑或未用靶向目的基因的RNAi劑處理的對照細胞)。抑制程度可以表示為：
Figure 111105127-A0202-12-0241-232
在其他實施態樣中，SOD1基因表現的抑制可以根據與SOD1基因表現(例如SOD1蛋白表現)功能相關參數的降低來評估。無論來自表達結構的內源性或異源性，SOD1基因沉默可以在任何表現SOD1的細胞中確定，並且藉由所屬技術領域已知的任何檢測方法。
SOD1蛋白質表現的抑制可以藉由細胞或細胞群表現的SOD1蛋白質濃度的降低來顯示出來(例如，來自個體的樣品中表現的蛋白質濃度)。如上所述，對於mRNA抑制的評估，經過處理的細胞或細胞組中蛋白質表現濃度的抑制可以類似地表示為對照細胞或細胞組中蛋白質濃度的百分比。
可用於評估SOD1基因表現抑制的對照細胞或細胞組包括尚未與本揭露RNAi劑接觸的細胞或細胞組。例如，在接受RNAi劑治療前個體(例如人或動物受試者)的對照細胞或細胞組。
由細胞或細胞群表現的SOD1 mRNA濃度可以藉由使用所屬技術領域領域已知任何用於評估mRNA表現的方法來確定。在一實施態樣中，樣品中SOD1的表現濃度係藉由檢測轉錄的多核苷酸或其部分來確定，例如SOD1基因的mRNA。藉由使用RNA提取技術從細胞中提取RNA，包括例如使用酸性苯酚/異硫氰酸胍提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA製備套組(Qiagen®)或PAXgene(PreAnalytix,Switzerland)。利用核糖核酸雜交的典型檢測形式包括核連續檢測、RT-PCR、RNase保護檢測、北方墨點法、原位雜交及微陣列分析。可使用WO2012/177906中描述的方法檢測循環SOD1 mRNA，其全部內容藉由引用併入本文。
在一些實施態樣中，SOD1的表現濃度係使用核酸探針確定。如本文所用，術語“探針”係指能夠選擇性結合特定SOD1核酸或蛋白質或其片段的任何分子。探針可以由所屬技術術領域中具有通常知識者合成，或衍生自適當的生物製劑。探針可專門設計用於標記。可用作探針的分子的實施例包括但不限於RNA、DNA、蛋白質、抗體及有機分子。
分離的mRNA可用於雜交或擴增檢測，包括但不限於Southern或Northern分析、聚合酶鏈式反應(PCR)分析及探針陣列。一檢測mRNA濃度的方法包括將分離的mRNA與核酸分子(探針)接觸，該核酸分子(探針)可與SOD1 mRNA雜交。在一實施態樣中，將mRNA固定在 固體表面並與探針接觸，例如藉由在瓊脂糖凝膠運行分離的mRNA並將mRNA從凝膠轉移到膜，例如硝酸纖維素膜。在另一實施態樣中，探針被固定在固體表面並且mRNA與探針接觸，例如在基因芯片陣列中。熟練的技術人員可以容易地採用已知的mRNA檢測方法來確定SOD1 mRNA濃度。
確定樣品中SOD1表現濃度的另一方法包括樣品中例如mRNA的核酸擴增或逆轉錄酶(以製備cDNA)過程，例如，藉由RT-PCR(所述的實驗實施態樣在以下文件詳述，Mullis,1987，美國專利號4,683,202)、連接酶鏈反應(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193)，自我持續序列複製(Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、轉錄擴增系統(Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-Beta Replicase(Lizardi et al.(1988)Bio/Technology 6：1197)、滾環複製(Lizardiet al.，美國專利號5,854,033)或任何其他核酸擴增方法，然後使用所屬技術領域中通常知識者熟知的擴增分子檢測技術。如果核酸分子以非常低的數量存在，這些檢測方案對於檢測核酸分子特別有用。在本揭露的特定方面，SOD1的表現濃度係藉由定量螢光RT-PCR(即TaqManTM系統)、Dual-Glo®螢光素酶檢測或藉由其他領域公認的用於測量SOD1表現或mRNA濃度的方法來確定。
SOD1 mRNA的表現濃度可以藉由使用膜點墨(例如用於雜交分析，例如北方點墨、南方點墨、點墨等)或微孔、樣品管、凝膠、珠子或纖維(或任何包括結合的核酸的固體支持物)。參見美國專利號5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195及5,445,934，這些專利藉 由引用併入本文。SOD1表現濃度的檢測還可以包括在溶液中使用核酸探針。
在一些實施態樣中，使用分支DNA(bDNA)檢測或實時PCR(qPCR)評估mRNA表現濃度。該PCR方法的使用在本文呈現的實施例中進行描述及舉例說明。此類方法也可用於檢測SOD1核酸。
SOD1蛋白質表現濃度可以藉由使用所屬技術領域已知的用於測量蛋白質濃度的任何方法來確定。這樣的方法包括，例如，電泳、毛細管電泳、高效液相層析(HPLC)、薄層層析(TLC)、超擴散層析、流體或凝膠沉澱反應、吸收光譜、比色檢測、分光光度檢測、流式細胞術、免疫擴散(單或雙)、免疫電泳、蛋白質印跡、放射免疫檢測(RIA)、酶聯免疫吸附檢測(ELISA)、免疫螢光檢測、電化學發光檢測等。此類檢測也可用於檢測顯示SOD1蛋白質存在或複製的蛋白質。
在一些實施態樣中，本揭露的方法在治療SOD1-相關疾病中的功效藉由SOD1 mRNA濃度的降低來評估(例如，藉由評估CSF樣品的SOD1濃度、藉由腦活檢或其他方式)。
在一些實施態樣中，本揭露方法在治療SOD1-相關疾病的功效藉由SOD1 mRNA濃度的降低來評估(例如，藉由評估肝臟樣本的SOD1濃度、藉由活檢或其他方式)。
在本揭露方法的一些實施態樣中，該RNAi劑被給藥於個體，使RNAi劑輸送至各體內的特定位點。SOD1表現的抑制可以藉由測量來自個體體內特定位點的樣本(例如CNS細胞)中SOD1 mRNA或SOD1蛋白質的濃度或濃度變化來評估。在某些實施態樣中，該方法包括臨床相關 的SOD1表現抑制，例如用減少SOD1表現的劑治療受試者後，臨床相關結果所證明的那樣。
如本文所用，術語偵測或檢測分析物的濃度應理解為表示執行步驟以確定材料例如蛋白質、RNA是否存在。如本文所用，偵測或檢測的方法包括偵測或檢測低於所用方法的可偵測濃度的分析物濃度。
X.治療或預防SOD1-相關神經退化性疾病的方法
本發明還提供了一種使用本揭露RNAi劑或含有本揭露RNAi劑的組成物來降低或抑制細胞中SOD1表現的方法。該方法包括使細胞與本揭露dsRNA接觸，並將細胞維持足夠的時間以獲得SOD1基因的mRNA轉錄物的降解，因此抑制細胞中SOD1基因表現。基因表現的降低可以藉由本領域已知的任何方法評估。例如，SOD1表現的降低可以藉由使用具有通常知識者的常規的方法，來確定SOD1的mRNA表現濃度，例如北方點墨法、qRT-PCR；藉由使用所屬技術領域中通常知識者的常規方法，例如西方點墨法、免疫學技術，來確定SOD1的蛋白質濃度。
在本揭露的方法中，可以在活體外或活體內接觸細胞，即細胞可以在個體內。
適合使用本揭露方法進行治療的細胞可以為任何表現SOD1基因的細胞。適用於本揭露方法的細胞可以為哺乳動物細胞，例如靈長類動物細胞(例如人類細胞或非人類靈長類動物細胞，例如猴細胞或黑猩猩細胞)，非靈長類細胞(例如大鼠細胞或小鼠細胞。在一個實施態樣中，細胞為人類細胞，例如人類CNS細胞。在一實施態樣中，細胞為人類細胞，例如 人類肝細胞。在一實施態樣中，細胞為人類細胞，例如人類CNS細胞及人類肝細胞。
在細胞中SOD1表現被抑制至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99或約100%，即達低於可檢測濃度。在較佳的實施態樣中，SOD1表現被抑制至少50%。
本揭露的活體內方法可以包括向個體給藥含有RNAi劑的組成物，其中該RNAi劑包括一核苷酸序列，其與待治療哺乳動物的SOD1基因的RNA轉錄物的至少一部分互補。當待治療的生物係哺乳動物，例如人時，可以藉由所屬技術領域已知的任何方式給藥該組成物，包括但不限於口服、腹膜內或腸胃外途徑，包括顱內(例如，心室內(也稱為如腦室內)、腦實質內及鞘內)、靜脈內、肌肉內、皮下、經皮、直腸及局部(包括口腔及舌下)給藥。在某些實施態樣中，組成物藉由靜脈輸注或注射給藥。在某些實施態樣中，組成物藉由皮下注射給藥。在某些實施態樣中，組成物藉由鞘內注射給藥。在某些實施態樣中，組成物藉由腦室內注射給藥。
在一些實施態樣中，給藥係藉由持續注射(depot injection)。持續注射可能會在較長時間內以一致的方式釋放RNAi劑。因此，持續注射可以減少獲得所需效果所需的給藥頻率，例如，所需的SOD1抑制或治療或預防效果。持續注射還可以提供更一致的血清濃度。持續注射可包括皮下注射或肌內註射。在較佳實施態樣中，持續注射係皮下注射。
在一些實施態樣中，給藥係藉由泵進行的。泵可以為外部泵或手術植入的泵。在某些實施態樣中，該泵係皮下植入的滲透泵。在其他實施例中，該泵是輸液泵。該輸液泵可用於顱內、靜脈內、皮下、動脈或 硬膜外輸液。在較佳實施例中，該輸液泵係皮下輸液泵。在其他實施態樣中，泵係外科植入的泵，其將RNAi劑輸送至CNS。
給藥方式可以根據是否需要局部或全身治療及根據需要治療的區域來選擇。視需要擇給藥途徑及部位以增強靶向性。
在一方面，本揭露還提供了用於抑制哺乳動物中SOD1基因表現的方法，該方法包括向哺乳動物給藥包含靶向該動物細胞中SOD1基因之dsRNA的組成物，並將該哺乳動物維持足夠的時間以獲得SOD1基因之mRNA轉錄物的降解，因此在細胞中抑制SOD1基因表現。該基因表現的降低可以藉由如本文所述的所屬技術領域已知的任何方法及其他方法而評估，例如qRT-PCR。蛋白質產生的減少可以藉由如本文所述的所屬技術領域已知的任何方法及其他方法而評估，例如ELISA。在一實施態樣中，CNS活檢樣品或腦脊髓液(CSF)樣本係做為監測SOD1基因或蛋白質表現(或替代物)減少的組織材料。
本揭露復提供了對有需要之個體的治療方法。本揭露治療方法包括對個體給藥本揭露的RNAi劑，例如對受益於SOD1表現抑制的個體，給藥治療有效量的靶向SOD1基因的RNAi劑，或包含靶向SOD1基因的RNAi劑的醫藥組成物。
此外，本揭露提供了預防、治療或抑制SOD1-相關神經退行性疾病或病症進展的方法，例如肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
該方法包括向個體給藥治療有效量的任何RNAi劑，例如dsRNA劑，或本文提供的醫藥組成物，因此預防、治療或抑制個體SOD1-相關的神經退行性疾病或病症的進展。
本揭露的RNAi劑可以作為“游離RNAi劑”給藥。在不存在醫藥組成物的情況下，給藥該游離的RNAi劑。純RNAi劑可以在合適的緩衝溶液中。該緩衝溶液可包含乙酸鹽、檸檬酸鹽、醇溶蛋白、碳酸鹽或磷酸鹽，或任何組合。在一實施態樣中，緩衝溶液係磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)。含有RNAi劑的緩衝溶液pH及滲透壓係可以被調整，以使其適合給藥於個體。
或者，本揭露的RNAi劑可以作為醫藥組成物給藥，例如dsRNA脂質體製劑。
從SOD1基因表現的減少或抑制中受益的個體為那些患有SOD1-相關神經退行性疾病的個體。
本揭露復提供了使用RNAi劑或其醫藥組成物的方法與其他藥物或其他治療方法，例如用於治療將受益於SOD1表現的降低或抑制的個體，例如患有SOD1-相關的神經退行性疾病的個體，例如已知藥物或已知治療方法，例如目前用於治療這些疾病的那些。例如，在某些實施態樣中，靶向SOD1的RNAi劑與(例如)治療本文其他地方所述或本領域已知的SOD1-相關神經退行性疾病的劑組合給藥。例如，適用於治療將受益於SOD1表現減少的個體的其他劑及治療，例如患有SOD1-相關神經退行性疾病的個體，可包括目前用於治療SOD1症狀的劑。該RNAi劑及另外的治療劑可以同時或以相同的組合給藥，例如鞘內給藥，或者另外的治療劑 可以作為單獨組成物的一部分或分開的，或藉由所屬技術領域已知的或在此描述的另一方法給藥。該RNAi劑及另外的治療劑可以同時或以相同的組合給藥，或者另外的治療劑可以作為單獨組成物的一部分或分開，或藉由所屬技術領域已知的或本文描述的另一方法給藥。
示例性的附加療法及治療包括例如鎖靜劑、抗抑鬱藥、氯硝西泮、丙戊酸鈉、鴉片製劑、抗癲癇藥、膽鹼酯酶抑制劑、美金剛、苯二氮卓類、左旋多巴、COMT抑制劑(例如托卡朋(tolcapone)及恩他卡朋(entacapone))、多巴胺促效劑(例如，溴隱亭(bromocriptine)、培高利得(pergolide)、普拉克所(pramipexole)、洛匹尼羅(ropinirole)、吡貝地爾(piribedil)、卡麥角林(cabergoline)、阿樸嗎啡(apomorphine)及利舒脲(lisuride))、MAO-B抑制劑(例如，沙分醯胺(safinamide)、昔來及利(selegiline)及拉沙及利(rasagiline))、金剛烷胺、抗膽鹼能藥、莫達菲尼(modafinil)、吡莫凡色林(pimavanserin)、度司平(doxepin)、拉沙及利(rasagline)、抗精神病藥、非典型抗精神病藥(例如，阿米舒吡利(amisulpride))、奧蘭紮平(olanzapine)、利斯培利酮(risperidone)及可洛紮平(clozapine)、利魯唑(riluzole)、依達拉封(edaravone)、深部腦刺激、非侵入通氣(NIV)、侵入通氣物理治療、職業治療、言語治療、飲食改變及吞嚥技術餵管、PEG管、益生菌及心理治療。
在一實施方案中，該方法包括給藥本文特徵的組成物使得標靶SOD1基因的表現降低至少一個月。在較佳的實施方案中，表現降低至少2個月或6個月。
較佳地，可用於本文特徵的方法及組成物的RNAi劑特異性地靶向標靶SOD1基因的RNA(原生的或經加工的)。抑制這些基因表現的組成物及方法可以如本文所述製備及實施使用RNAi劑。
根據本揭露的方法給藥dsRNA可導致具有SOD1-相關神經退行性疾病患者之此類疾病或病症的嚴重性、體徵、症狀或標記降低。在本文中，“降低”係指這種水平的統計學顯著或臨床顯著降低。例如，降低可以是至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或約100%。
可以評估治療或預防疾病的功效，例如藉由測量疾病惡化、疾病緩解、症狀嚴重程度、疼痛減輕、生活質量、維持治療效果所需的藥物劑量、疾病標記濃度，或任何適用於正在治療或預防的給定疾病的其他可測量參數。藉由測量這些參數中的任何一個或參數的任何組合來監測治療或預防的功效，以上完全在所屬技術領域中具有通常知識者的能力範圍內。例如，可以藉由例如定期監測個體的認知、學習或記憶來評估SOD1-相關神經退行性疾病的治療效果。後期讀數與初始讀數的比較為醫生提供治療是否有效的指示。藉由測量這些參數中的任何一個或參數的任何組合，監測治療或預防的功效完全在所屬技術領域中具有通常知識者的能力範圍內。與給藥靶向SOD1或其醫藥組成物的RNAi劑有關，“有效對抗(effective against)”SOD1-相關的神經退行性疾病表示以臨床上適當的方式給藥，其產生至少有統計學意義的部分患者產生有益效果，例如症狀的改善、治愈、疾病的減少、壽命的延長、生活品質的改善，或熟悉治療SOD1-相關神經退行性疾病的醫生普遍認為是正面的及其相關原因的其他效果。
當疾病狀態的一個或多個參數在統計學上有顯著改善，或者沒有惡化或出現原本預期的症狀時，治療或預防效果是明顯的。例如，疾病的可測量參數中至少10%，較佳至少20%、30%、40%、50%或更多的有利變化可以表示有效治療效果。還可以使用所屬技術領域已知之給定疾病的實驗動物模型來判斷給定RNAi劑藥物或該藥物製劑的功效。當使用實驗動物模型時，當觀察到標記或症狀在統計學上顯著降低時，就證明了治療的有效性。
或者，可以藉由在診斷領域中具有通常知識者，根據臨床接受的疾病嚴重程度分級量而確定之疾病嚴重程度的降低來測量功效。任何積極變化導致代表使用如本文所述的RNAi劑或RNAi劑製劑進行的充分治療，例如使用適當量表測量的疾病嚴重程度減輕。
可以向個體給藥治療量的dsRNA，例如約0.01mg/kg至約200mg/kg。
RNAi劑可以定期，在一段時間內，藉由鞘內、心室內或藉由靜脈內輸注給藥。在某些實施方案中，在初始治療方案之後，可以以較低頻率給藥治療。RNAi劑的給藥可以減少SOD1濃度，例如在患者的細胞、組織、血液、CSF樣品或其他隔室中，至少20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%，或至少約99%或更多。在一較佳的實施方案中，給藥RNAi劑可以降低例如患者的細胞、組織、血液、CSF樣本或其他隔室中的SOD1濃度至少50%。
在給予全劑量的RNAi劑之前，可以給予患者較小的劑量，例如5%的輸注反應，並監測副作用，例如過敏反應。在另一實施例中，可以監測患者之不需要的免疫刺激作用，例如細胞因子濃度增加(例如，TNF-α或INF-α)。
或者，可以皮下給藥RNAi劑，即藉由皮下注射。
一次或多次注射可用於向個體輸送所需的RNAi劑，例如每月劑量。注射可以在一段時間內重複。可以定期重複給藥。在某些實施方案中，在初始治療方案之後，可以較低頻率給藥治療。重複劑量治療可包括定期給藥治療量的RNAi劑，例如每月一次，或延長至每季一次、每年兩次、每年一次。在某些實施方案中，大約每月一次至大約每季一次給藥RNAi劑(即，大約每三個月一次)。
除非另有定義，本文使用的所有技術及科學術語與本發明所屬技術領域中通常知識者通常理解的含義相同。儘管與本文所述的方法及材料相似或等效的方法及材料，可用於本發明特徵的RNAi劑及方法的實踐或測試，合適的方法及材料在下文描述。本文提及的所有出版物、專利申請、專利及其他參考文獻藉由引用整體併入。在衝突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。此外，材料、方法及示例僅是說明性的而不是限制性的。
隨此提交了一份非正式的序列表，並組成了提交時的說明書的一部分。
實施例
實施例1. RNAi劑設計、合成、選擇及活體外評估
本實施例描述了SOD1 RNAi要劑的設計、合成、選擇及活體外評估方法。
劑來源
在本文未具體給出劑來源的情況下，該劑可以從分子生物學劑的任何供應商處，以用於分子生物學的品質/純度標準獲得。
生物資訊學
針對以下基因的siRNAs：人類過氧化物歧化酶1(SOD1)基因(人類：NCBI refseqID NM_000454.4；NCBI GeneID：6647)、小鼠SOD1基因(refseqID NM_011434.1；NCBI GeneID：20655)或食蟹猴SOD1基因(refseqID NM_001285406.1；NCBI GeneID：102118687)係使用自定義R及Python腳本設計的。該人類NM_000454.4 REFSEQ mRNA的長度為981個鹼基；小鼠NM_011434.1 REFSEQ mRNA的長度為661個鹼基；食蟹猴SOD1 NM_001285406.1 REFSEQ mRNA長度為465個鹼基。
未修飾的SOD1正義股及反義股核苷酸序列的詳細列表顯示在表2、4及6中。修飾的SOD1正義股及反義股核苷酸序列的詳細列表顯示在表3、5及7中。
應當理解，在整個申請中，不帶小數的複合名稱等同於引用帶小數的複合名稱。例如，AD-266859等同於AD-266859.1。
siRNA合成
簡而言之，使用Mermade 192合成儀(BioAutomation)以1μmol規模合成siRNA序列，其中亞磷醯胺化學在固體支持物上。固體支持物是控制的孔玻璃(500-1000Å)，其中載有訂制的GalNAc配體(3'- GalNAc偶聯物)、通用固體支持物(AM Chemicals)或第一個感興趣的核苷酸。輔助合成劑及標準2-氰乙基亞磷醯胺單體(2'-去氧-2'-氟、2'-O-甲基、RNA、DNA)購自Thermo-Fisher(Milwaukee,WI)、Hongene(China)、或Chemgenes(Wilmington,MA,USA)。其他亞磷醯胺單體從商業供應商處採購、內部製備或使用來自各種CMO的訂制合成採購。在乙腈或乙腈：DMF(9：1)中製備濃度為100mM的亞磷醯胺，並使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，0.25M溶在乙腈中)以400秒的反應時間偶聯。使用100mM的3-((二甲胺基-亞甲基)胺基)-3H-1,2,4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，獲自Chemgenes(Wilmington,MA,USA))在無水溶液中生成硫代磷酸酯鏈結乙腈/吡啶(9：1v/v)。氧化時間為5分鐘。合成所有序列，最後去除DMT組(“DMT-Off”)。
固相合成完成後，在室溫，用300μL甲胺(40%水溶液)在96孔板中處理固相支持的寡核糖核苷酸約2小時，以從固相支持物上裂解並隨後去除所有額外的鹼基。不穩定的保護基團。對於包含用第三丁基二甲基甲矽烷基(TBDMS)基團保護的任何天然核糖核苷酸鏈結(2'-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙胺三氫氟酸)進行第二次去保護步驟。向甲胺水溶液中的每種寡核苷酸溶液中加入200μL二甲亞碸(DMSO)及300μL TEA.3HF，並將該溶液在60℃培育約30分鐘。培育後，使該板達到室溫，並藉由添加1mL的9：1乙腈：乙醇或1：1乙醇：異丙醇來沉澱粗寡核苷酸。然後將該板在4℃離心45分鐘，並在多通道移液器的幫助下，小心傾析上清液。將寡核苷酸沉澱重新懸浮於20mM NaOAc中，隨後在配備自動進樣器、UV檢測器、電導率計及餾分收集器的安捷倫LC系統上使用 HiTrap尺寸排阻管柱(5mL，GE Healthcare)去鹽。將去鹽樣品收集在96孔板中，然後藉由LC-MS及UV光譜分析分別確認身份及量化材料的數量。
在Tecan液體處理機器人進行多個單股的複合。將正義及反易單股以等莫耳比，在96孔板中的1x PBS中混合至終濃度為10μM，將該孔板密封，在100℃培育10分鐘，然後在2至3小時的時間內緩慢恢復至室溫。確認每個雙鏈體的濃度及身份，然後用於活體外篩選檢測。
細胞培養及轉染
細胞轉染係藉由將4.9μL Opti-MEM附加每孔0.1μL RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad CA.cat # 13778-150)添加到每孔5μL siRNA雙鏈體中，每個siRNA雙鏈體重複4次，到384孔板，並在室溫陪育15分鐘。然後將含有約5 x103個細胞的40μL媒體添加到siRNA混合物中。在RNA純化之前將細胞培養24小時。在初代小鼠肝細胞(PMH)或初代食蟹猴肝細胞(PCH)中以10nM及0.1nM進行實驗。
使用DYNABEADS mRNA分離套組分離總RNA
使用DYNABEADs(Invitrogen,cat#61012)在BioTek-EL406平台上使用自動化操作手冊分離RNA。簡而言之，將70μL裂解/結合緩衝液及10μL含有3μL磁珠的裂解緩衝液添加到帶有細胞的孔板中。將該孔板在電磁振盪器在室溫培育10分鐘，然後捕獲磁珠並去除上清液。然後用150μL洗滌緩衝液A洗滌珠子結合的RNA 2次，用洗滌緩衝液B洗滌一次。然後用150μL洗脫緩衝液洗滌珠子，重新捕獲並去除上清液。
使用ABI高容量cDNA逆轉錄套組(Applied Biosystems,Foster City,CA,Cat #4368813)合成cDNA
將10μL的主要混合容液添加到前述分離的RNA中，其中包含1μL 10X緩衝液、0.4μL 25X dNTP、1μL 10x隨機引子、0.5μL反轉錄酶、0.5μL RNase抑制劑及6.6μL H2O的預混合液。將孔板密封、混合併在電磁振盪器上在室溫下培育10分鐘，然後在37℃孵育2小時。
實時PCR
將2μL cDNA添加到含有主要混合容液的384孔板中(Roche cat # 04887301001)，其中包含0.5μL人類或小鼠GAPDH TaqMan探針(ThermoFisher cat 4352934E或4351309)及0.5μL合適的SOD1探針(市售，例如，來自Thermo Fisher)、5μL Lightcycler 480探針的主要混合容液(Roche cat # 04887301001)。實時PCR在LightCycler480實時PCR系統(Roche)中進行。用N=4測試每一雙鏈體，並將數據相對用非靶向對照siRNA轉染的細胞而標準化。為了計算相對倍數變化，使用△△Ct方法分析實時數據，並將其對非靶向對照siRNA轉染的細胞進行的檢測而標準化。
表2及表3中雙鏈體的初代食蟹猴肝細胞(PCH)中的單劑量篩選結果呈現在表8中；表2及表3中雙鏈體的初代小鼠肝細胞(PMH)中的單劑量篩選結果呈現在表9中；表4及5中雙鏈體的初代食蟹猴肝細胞(PCH)中的單劑量篩選結果呈現在表10中；表6及表7中雙鏈體的初代食蟹猴肝細胞(PCH)中的單劑量篩選結果呈現在表11中。
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實施例2.額外dsRNA雙鏈體的設計、合成及活體外篩選
根據實施例1中提供的結果，使用所屬技術領域已知的及前文實施例1中描述的方法去設計、合成及製備在靶向SOD1 mRNA中已識別熱點的額外siRNA。
額外未修飾的SOD1正義及反義股核苷酸序列的詳細列表顯示在表12中。修飾的SOD1正義及反義股核苷酸序列的詳細列表顯示在表13中。
藉由轉染進行額外劑的單劑量篩選。在初代食蟹猴肝細胞(PCH)或神經母細胞瘤Be(2)C細胞中以50mM、10nM、1nM及0.1nM進行實驗。
總RNA分離係使用DYNABEADS進行。簡而言之，將細胞裂解在每孔含有3μL珠子的10μl裂解/結合緩衝液中，並在靜電振盪器混合10分鐘。使用磁性板支架在Biotek EL406自動執行洗滌步驟。珠子在緩衝液A中洗滌一次(在3μL中)，在緩衝液B中洗滌一次，在緩衝液E中洗滌兩次，中間有抽吸步驟。在最終抽吸後，向每個孔中加入完整的12μL RT混合物，如下所述。
對於cDNA合成，每孔加入1.5μl 10X緩衝液、0.6μl 10X dNTP、1.5μl隨機引子、0.75μl反轉錄酶、0.75μl RNase抑制劑及9.9μl H2O的主要混合液。將孔板密封，在靜電振盪器攪拌10分鐘，然後在37℃培育2小時。此後，將孔板在80℃攪拌8分鐘。
如上所述進行RT-qPCR，並如上所述計算相對倍數變化。
PCH細胞中的轉染檢測結果顯示在表14中，BE(2)C細胞中的轉染檢測結果顯示在表15中，並在圖12A至12H中顯示為堆疊條形圖(映射到NM_00454.6)。
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實施例3.小鼠活體內評估
從上述研究中辨認出感興趣的雙鏈體，其在活體內進行了進一步評估。特別是，在給藥前第14天野生型小鼠(C57BL/6)藉由眼窩靜脈(retro-orbital)給藥2 x 1010編碼人類SOD1的腺相關病毒8(AAV8)載體的病毒顆粒進行轉導。
在第0天，每組三隻小鼠皮下給藥單次3mg/kg劑量的感興趣的劑或PBS對照。表16提供了處理組，表18提供了感興趣的雙鏈體的正義股及反義股的修飾及未修飾核苷酸序列。在給藥後第7天犧牲動物， 進行眼窩靜脈採血。在給藥後第7天收集肝樣本，並在液態氮中急速冷凍。藉由RT-QPCR方法提取及分析組織mRNA。
將人類SOD1 mRNA濃度與管家(對照)基因GAPDH進行比較。然後將這些值標準化為PBS載體對照組的平均值。數據以基線值的百分比表示，並表示為平均值加上標準偏差。列於表17及圖1中的結果顯示，所測試的示例性雙鏈體劑有效地降低了體內人SOD1訊息RNA濃度。
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實施例4.在G93A-SOD1轉基因小鼠中靶向SOD1的RNAi劑的體內評估
為了證明單次腦室內注射(ICV)dsRNA藥物同樣抑制了大腦及脊髓中治療相關區域之SOD1的表現，藉由ICV注射，雄性G93A-SOD1基因轉殖小鼠接受了單次5μl AD-401824或5μl人工CSF(aCSF)對照(每組n=3)，其中含有25μg、50μg、100μg、150μg、200μg或300μg劑量，在第0天使用Hamilton注射器及有角度的30G針頭。在順反子人類SOD1啟動子的控制下，G93A-SOD1小鼠表現具有G93A突變的人類SOD1。該基因的突變與家族性肌萎縮側索硬化症(ALS或Lou Gehrig病)有關。SOD1-G93A小鼠表現出類似於人類肌萎縮側索硬化症的表型。他們在幾週內出現一個或多個肢體癱瘓(參見例如，Henriques,et al.(2010)PLoS One 5(11)：e15445)。
在用藥後第14天，犧牲動物並收集腦樣本(右半球、左半球、小腦及腦幹)及脊髓樣本並在液態氮中快速冷凍。從組織中提取mRNA並藉由RT-QPCR方法進行分析。
圖2中描述的結果顯示，單次ICV注射50至300ug dsRNA劑，其以劑量依賴性方式提供一致且穩健地敲低CNS中SOD1。結果還顯示，150至300ug之間的單劑量dsRNA劑，其可將SOD1 mRNA敲低至所有組織類型中的最低濃度。
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Figure 111105127-A0202-12-0330-315
Figure 111105127-A0202-12-0331-316
實施例5.在G93A-SOD1基因轉殖大鼠中靶向SOD1的RNAi劑的活體內評估
根據上述活體外及活體內研究，選擇三個雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731用於進一步分析(參見例如表21)。圖3A總結了在活體外觀察到的這三個雙鏈體的影響，證明所有三個雙鏈體在用藥後第14天，所有測劑量(50nM、10nM、1nM及0.1nM)在BE(2)c細胞中，其減少了人類SOD1(hSOD)mRNA表現超過90%。
進一步評估這三個雙鏈體在G93A大鼠中的體內活性。這種過度表現突變hSOD1G93A基因的基因轉殖大鼠模型再現了在ALS患者中觀察到的病理及症狀，例如，在幾週內出現一個或多個肢體癱瘓(參見例如，Matsumoto A,et al.(2006)J Neurosc Res 83：119-133)。
簡而言之，雄性G93A-SOD1大鼠接受單次5μl的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731或5μl人工CSF(aCSF)對照(每組n=3)，其中含有0.9mg，在第0天注射係藉由使用Hamilton注射器及30G斜針進行鞘內注射。在用藥後第14天，犧牲動物並收集組織樣本，包括腰、胸部及頸脊髓，並快速冷凍。從組織中提取mRNA並藉由RT-QPCR方法進行分析。
結果如圖3B所示，顯示在用藥後第14天，在單次0.9mg鞘內給藥雙鏈體後，所有三個雙鏈體在G93A大鼠的脊髓所有三個區域(腰、胸以及頸)中都將目標SOD1(hSOD1)mRNA表現降低了90%以上。
實施例6.靶向SOD1的RNAi劑的臨床前評估
代謝物鑑定(MetID)用於確定在給藥每個雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731後，所形成的代謝物及代謝物的量，以及在經過處裡的野生型大鼠的大腦及脊柱中，親代雙鏈體暴露的百分比(曲線下面積)。
給藥後4至1344小時收集的合併大鼠大腦皮層及給藥後4至1344小時收集的合併腰脊髓，兩者藉由LC-HRMS進行代謝物鑑定(參見例如，Liu et al.,Bioanalysis(2019)11(21),1967-1981中的方法)。
這些研究的結果如圖4至5所示。
圖4A及4B顯示所有三個雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731在大鼠脊柱(頸部、胸及腰部；圖4A)及大腦(大腦皮層及腦幹；圖4B)中具有相似的暴露量。
圖4C顯示所有三個雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731在大鼠脊柱(頸部、胸及腰部；圖4A)及大腦(大腦皮層及腦幹；圖4B)中具有相似的保留量。
此外，已確定這三個雙鏈體中每一個的半衰期(t1/2)都很長(>20天)，並且即使考慮到潛在的動物間給藥變異性，t1/2也具有可比性。
圖5顯示所有三個雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731在大腦及脊柱中都具有相似的代謝物譜，並且缺少3'-末端核苷酸(3'N-1 AS)的反義股是主要活性代謝物。
圖6是總結雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731的組織暴露量及代謝物分析的表格。表23顯示了本文所述的某些雙鏈體的示例性觀察到或預測的3'N-1 AS代謝物的核苷酸序列。
Figure 111105127-A0202-12-0334-317
實施例7.非人類靈長類動物(NHP)中RNAi劑的活體內評估
在非人靈長類動物(NHP)的活體內也評估了雙鏈體AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731的作用。
如圖7所示，在第0天，對於非人類靈長類動物鞘內給藥單次70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731，體積為2mL；或單次120mg劑量的AD-1395731，體積為2mL；或2mL人工腦脊液(aCSF)。在用藥後第31天、第85天或第169天犧牲動物，收集組織樣品並如上所述量化SOD1 mRNA的濃度。
由於動物劑量的差異(圖8A)，每個雙鏈體的相對效力尚不清楚。然而，藉由去除24小時CSF中藥物暴露濃度低於1500ng/ml(被認為是次優劑量)的樣品，數據顯示單次鞘內給藥70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756、或AD-1395731導致各種CNS組織中SOD1 mRNA的減少，並且各種CNS組織中SOD1 mRNA的減少是持久的，並維持到用藥後第85天(圖8B)。值得注意的是，如圖8C所示，單次鞘內給藥70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731在月藥後第85天，使頸脊髓中的SOD1 mRNA降低75%；在用藥後第85天在皮質降低60%(圖8C)。
此外，如圖9A至9C所示，單次鞘內給藥70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731導致CSF樣品中的SOD1蛋白減少60%，直至用藥後第85天，在研究中延伸的三隻動物中，單次鞘內給藥70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731導致CSF樣本中的SOD1蛋白減少60%，直至用藥後第141天。
如圖10所示，在前額葉皮層樣本及胸脊髓樣本中所觀察到的mRNA濃度及蛋白質濃度的降低與在NHP中高度且顯著相關。圖13顯示在鞘內給藥三種測試雙鏈體後第31天及第85天，腎臟及肝臟中的SOD1沒有顯著降低。此外，雙鏈體對腎臟及肝臟的最小影響沒有顯著差異。
圖11A顯示了一組圖，其顯示在鞘內給藥單次70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731後，所檢查的組織中剩餘的mRNA與siRNA暴露的關係。數據分析表明，在單次鞘內給藥70mg劑量的AD-1395762、AD-1395756或AD-1395731後，在前額葉皮層及胸脊髓樣本中，mRNA及蛋白質減少與siRNA暴露量之間存在很強的相關性(圖11B)。

Claims (57)

  1. 一種雙股核糖核酸(dsRNA)劑或其藥學上可接受的鹽，其包含形成雙股區的正義股及反義股，其中
    a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3'(SEQ ID NO：11)差異不超過4個鹼基，且反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3'(SEQ ID NO：12)差異不超過4個鹼基；
    b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3'(SEQ ID NO：13)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3'(SEQ ID NO：14)差異不超過4個鹼基；
    c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5'-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過4個鹼基；
    d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過4個鹼基；
    e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過4個鹼基；
    f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)差異不超過4個鹼基；
    g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過4個鹼基；
    h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過4個鹼基；
    i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過4個鹼基；或
    j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過4個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過4個鹼基，
    其中，
    其中VP係5'-乙烯基膦酸酯；
    (Ahd)係2'-O-十六基-腺苷-3'-磷酸酯；
    (Chd)is 2'-O-十六基-胞苷-3'-磷酸酯；
    (Uhd)係2'-O-十六基-尿苷-3'-磷酸酯；
    (Agn)係腺苷-二醇核酸(GNA)，S-異購物；
    (Tgn)係胸苷-二醇核酸(GNA)，S-異購物；
    (C2p)係胞苷-2’-磷酸酯；
    (G2p)is鳥苷-2’-磷酸酯；
    s係硫代磷酸酯鏈結；
    a、g、c及u係2'-O-甲基(2'-OMe)A、G、C及U；
    dA、dC、dG以及dT為2'-去氧A、C、G以及T；以及
    Af、Cf、Gf及Uf係2'-去氧-2’-氟(2’-F)A、C、G及U。
  2. 如請求項1所述的dsRNA劑或其藥學上可接受的鹽，其中
    a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)差異不超過3個鹼基；
    b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過3個鹼基；
    c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過3個鹼基；
    d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過3個鹼基：
    e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過3個鹼基；
    f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)差異不超過3個鹼基；
    g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過3個鹼基；
    h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過3個鹼基；
    i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過3個鹼基；或
    j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過3個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過3個鹼基。
  3. 如請求項1所述的dsRNA劑或其藥學上可接受的鹽，其中
    a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’- VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)差異不超過2個鹼基；
    b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過2個鹼基；
    c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過2個鹼基；
    d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過2個鹼基；
    e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過2個鹼基；
    f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過2個鹼基， 反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)，差異不超過2個鹼基；
    g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過2個鹼基；
    h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過2個鹼基；
    i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過2個鹼基；或
    j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過2個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過2個鹼基。
  4. 如請求項1所述的dsRNA劑或其藥學上可接受的鹽，其中
    a)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)差異不超過1個鹼基， 反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)差異不超過1個鹼基；
    b)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)差異不超過1個鹼基；
    c)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)差異不超過1個鹼基；
    d)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)差異不超過1個鹼基；
    e)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)差異不超過1個鹼基；
    f)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)差異不超過1個鹼基， 反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)差異不超過1個鹼基；
    g)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)差異不超過1個鹼基；
    h)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)差異不超過1個鹼基；
    i)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)差異不超過1個鹼基；或
    j)正義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)差異不超過1個鹼基，反義股的核苷酸序列與核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)差異不超過1個鹼基。
  5. 如請求項1所述的dsRNA劑或其藥學上可接受的鹽，其中
    a)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)，反義股的核苷酸序列 包含核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)；
    b)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)；
    c)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)；
    d)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID 20 NO：18)；
    e)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)；
    f)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)；
    g)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)；
    h)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)；
    i)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)；或
    j)正義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)，反義股的核苷酸序列包含核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)。
  6. 如請求項1所述的dsRNA劑或其藥學上可接受的鹽，其中
    a)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-csascuu(Uhd)aaUfCfCfucuauccasgsa-3’(SEQ ID NO：11)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusdCsugdGadTagagdGaUfuaaagugsasg-3’(SEQ ID NO：12)組成；
    b)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-csasggu(Chd)cuCfAfCfuuuaauccsusa-3’(SEQ ID NO：13)組成，反義股的核苷酸序列包由苷酸序列5’-VPusdAsggdAudTaaagdTgAfggaccugscsg-3’(SEQ ID NO：14)組成；
    c)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-ususcgag(Chd)aGfAfAfggaaaguasasa-3’(SEQ ID NO：15)組成，反義股的核苷酸序列由苷酸序列5’-VPusUfsuadCu(Tgn)uccuucUfgCfucgaasasu-3’(SEQ ID NO：16)組成；
    d)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-gsasaag(Uhd)aaUfGfGfaccagugasasa-3’(SEQ ID NO：17)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusUfsucdAc(Tgn)gguccaUfuAfcuuucscsu-3’(SEQ ID NO：18)組成；
    e)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asgsga(Uhd)gaaGfAfGfaggcaugususa-3’(SEQ ID NO：19)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusAfsacdAu(G2p)ccucucUfuCfauccususu-3’(SEQ ID NO：20)組成；
    f)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asasgga(Ahd)agUfAfAfuggaccagsusa-3’(SEQ ID NO：21)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusdAscudGg(Tgn)ccaudTaCfuuuccuuscsu-3’(SEQ ID NO：22)組成；
    g)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asuscaa(Uhd)uuCfGfAfgcagaaggsasa-3’(SEQ ID NO：23)組成，反義股的核苷酸 序列由核苷酸序列5’-VPusUfsccdTu(C2p)ugcucgAfaAfuugausgsg-3’(SEQ ID NO：24)組成；
    h)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-cscsuca(Chd)uuUfAfAfuccucuauscsa-3’(SEQ ID NO：25)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusdGsaudAg(Agn)ggaudTaAfagugaggsasc-3’(SEQ ID NO：26)組成；
    i)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asasgga(Uhd)gaAfGfAfgaggcaugsusa-3’(SEQ ID NO：27)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusAfscadTg(C2p)cucucuUfcAfuccuususg-3’(SEQ ID NO：28)組成；或
    j)正義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-asasuuu(Chd)gaGfCfAfgaaggaaasgsa-3’(SEQ ID NO：29)組成，反義股的核苷酸序列由核苷酸序列5’-VPusCfsuudTc(C2p)uucugcUfcGfaaauusgsg-3’(SEQ ID NO：30)組成。
  7. 如請求項1至6中任一項所述的dsRNA劑或其藥學上可接受的鹽，其為鈉鹽，
  8. 一用於抑制過氧化物歧化酶1(SOD1)表現的雙股核糖核酸(dsRNA)劑，其中
    該dsRNA劑包含形成雙股區域的正義股及反義股，其中，該正義股包含SEQ ID NO：1的核苷酸201至223、204至226、207至229、216至238、219至241、328至350、333至355、336至358、372至394或373 至395之任一核苷酸序列之至少15個連續核苷酸，以及該反義股包含自SEQ ID NO：2之對應核苷酸序列之至少15個連續核苷酸，其中，
    (i)該dsRNA劑包含至少一個修飾核酸、
    (ii)該雙股區域係長度15至30核苷酸對，及
    (iii)正義股或反義股接合至一個或多個親脂部分。
  9. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該正義股包含自SEQ ID NO：1的核苷酸207至229、219至241、328至350、336至358中之任一核苷酸序列之至少15個連續核苷酸，以及該反義股包含自SEQ ID NO：2之對應核苷酸序列之至少15個連續核苷酸。
  10. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該正義股包含自SEQ ID NO：1的核苷酸207至229、328至350、336至358之任一核苷酸序列之至少15個連續核苷酸，以及該反義股包含自SEQ ID NO：2之對應核苷酸序列之至少15個連續核苷酸。
  11. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該正義股包含自SEQ ID NO：1的核苷酸336至358之任一核苷酸序列之至少15個連續核苷酸，以及該反義股包含自SEQ ID NO：2之對應核苷酸序列之至少15個連續核苷酸。
  12. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該反義股包含選自下述所成群組之雙鏈體的任一反義股核苷酸序列之至少15個連續核甘酸：AD-1395762、AD-1395756、AD-1395731、AD-1395743、AD-1395771、AD-1395738、AD-1395718、AD-1395760、AD-1395764或AD-1395724組成。
  13. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該反義股包含選自下述所成群組之雙鏈體的任一反義股核苷酸序列之至少15個連續核甘酸：AD-1395762、AD-1395756、AD-1395731及AD-1395743組成。
  14. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該反義股包含選自下述所成群組之雙鏈體的任一反義股核苷酸序列之至少15個連續核甘酸：AD-1395762、AD-1395756及AD-1395731組成。
  15. 如請求項8所述的dsRNA劑，其中該反義股包含選自雙鏈體AD-1395762之反義股核苷酸序列之至少15個連續核甘酸。
  16. 如請求項8至15中任一項所述的dsRNA劑，其中該正義股的所有核苷酸及該反義股的所有核苷酸都包含修飾
  17. 如請求項8至15中任一項所述的dsRNA劑，其中至少一個修飾核苷酸選自以下所成群組：去氧-核苷酸，3’-端去氧胸苷(dT)核苷酸、2'-O-甲基修飾核苷酸、2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、2’-5’-連結核糖核苷酸(3’-RNA)、鎖核苷酸、未鎖核苷酸、結構受限的核苷酸、限制性乙基核苷酸、去鹼基核苷酸、2’-胺基-修飾核苷酸、2'-O-烯丙基修飾的核苷酸、2’-C-烯丙基修飾的核苷酸、2'-甲氧基乙基修飾核苷酸、2'-O-烷基修飾核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含核苷酸的非天然鹼基、四氫吡喃修飾的核苷酸、1,5-脫水己糖醇修飾的核苷酸、環己烯基修飾的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基團的核苷酸、包含5'-甲基膦酸酯基團的核苷酸、包含5'磷酸鹽或5'磷酸鹽模擬物的核苷酸、包含膦酸乙烯酯的核苷酸、乙二醇核酸(GNA)、乙二醇核酸S-異構物(S-GNA)、包含2-羥甲基-四氫呋喃-5-磷酸的核苷酸、包含2'-去氧胸苷-3'磷酸的核苷酸、包含 2'-去氧鳥苷-3'-磷酸鹽的核苷酸以及與膽固醇衍生物及十二烷酸雙癸醯胺基團連接的末端核苷酸；及其視需要組合
  18. 如請求項17所述的dsRNA劑，其中該修飾核苷酸選自以下所成群組：2'-去氧-2'-氟修飾核苷酸、2'-去氧-修飾核苷酸、3’-端去氧胸苷核苷酸(dT)、鎖核苷酸、無鹼基核苷酸、2'-胺基修飾的核苷酸、2'-烷基修飾的核苷酸、N-嗎啉基核苷酸、胺基磷酸酯以及包含核苷酸的非天然鹼基。
  19. 如請求項17所述的dsRNA劑，其中該核苷酸的修飾分別選自以下所成群組：2’-去氧、2’-O-甲基、3’-RNA、GNA、S-GNA以及2'-去氧-2'-氟修飾。
  20. 如請求項8至19中任一項所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑復包含至少一硫代磷酸酯核苷酸鏈結。
  21. 如請求項20所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑包含6至8個磷酸酯核苷酸鏈結。
  22. 如請求項8至21中任一項所述的dsRNA劑，其中至少一股包含至少一核苷酸的3'突出。
  23. 如請求項22所述的dsRNA劑，其中該至少一股包含一至少兩核苷酸的3'突出。
  24. 如請求項8至23中任一項所述的dsRNA劑，其中該雙股區域長度係17至23個核苷酸對。
  25. 如請求項24所述的dsRNA劑，其中該雙股區域長度係19至21個核苷酸對。
  26. 如請求項24所述的dsRNA劑，其中該雙股區域長度係21至23個核苷酸對。
  27. 如請求項8至26中任一項所述的dsRNA劑，其中每股具有19至30個核苷酸。
  28. 如請求項8至27中任一項所述的dsRNA劑，其中該一個或多個親脂部分係接合至少一股的一個或多個內部位置。
  29. 如請求項28所述的dsRNA劑，其中一親脂部分係接合選自下述所成群組之內部位置：正義股的位置4至8及13至18，以及反義股的位置6至10及15至18所組成，從每股的5'端計數。
  30. 如請求項29所述的dsRNA劑，其中該內部位置選自下述所成群組：正義股的位置5、6、7、15及17，從股的5'端計數。
  31. 如請求項29所述的dsRNA劑，其中該內部位置選自下述所成群組：反義股的位置15及17，從股的5'端計數。
  32. 如請求項29所述的dsRNA劑，其中該內部位置選自由正義股位置6及7所成群組。
  33. 如請求項28至32中任一項所述的dsRNA劑，其中該親脂部分係脂肪族、脂環族或多脂環族化合物。
  34. 如請求項33所述的dsRNA劑，其中該親脂部分包含飽和或不飽和的C4至C30烴鏈，以及選自下述所成群組之視需要官能：羥基、胺、羧酸、磺酸酯、磷酸酯、硫醇、疊氮化物及炔烴。
  35. 如請求項33所述的dsRNA劑，其中該親脂部分包含飽和或不飽和的C6至C18烴鏈。
  36. 如請求項33所述的dsRNA劑，其中該親脂部分包含飽和或不飽和的C16烴鏈。
  37. 如請求項33所述的dsRNA劑，其中該飽和或不飽和C16烴鏈係接合於正義股的位置6或第7，從正義股的5'端計數。
  38. 如請求項8至37中任一項所述的dsRNA劑，其中該dsRNA劑復包含於反義股5'-端的磷酸鹽或磷酸鹽模擬物
  39. 如請求項38所述的dsRNA劑，其中該磷酸酯模擬物係5'-乙烯基膦酸酯(VP)。
  40. 如請求項38所述的dsRNA劑，該磷酸酯模擬物係5'-E-乙烯基膦酸酯(VP)。
  41. 如請求項8至40中任一項所述的dsRNA劑，其中該雙鏈體反義股5'-端位置1的鹼基對係AU鹼基對。
  42. 如請求項8至41中任一項所述的dsRNA劑，其中該正義股共有21個核苷酸，反義股共有23個核苷酸。
  43. 一種細胞，其包含如請求項8至41中任一所述的dsRNA劑。
  44. 一種醫藥組成物，其包含如請求項8至41中任一所述的dsRNA劑以及藥學上可接受的稀釋劑。
  45. 一種抑制細胞中SOD1基因表現的方法。該方法包含：
    a)使細胞與如請求項1至41中任一項所述的dsRNA劑接觸，或與如請求項44所述的醫藥組成物接觸；及
    b)將步驟(a)中產生的細胞維持足夠的時間，使SOD1基因的mRNA轉錄物降解，因此抑制該細胞中SOD1基因表現。
  46. 如請求項45所述的方法，其中該細胞係在人類個體內。
  47. 如請求項46所述的方法，其中該個體符合SOD1-相關神經退化性疾病的至少一個診斷標准或已被診斷患有SOD1-相關神經退化性疾病。
  48. 如請求項47所述的方法，其中該SOD1-相關的神經退化性疾病選自下述所成群組：肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
  49. 一種治療診斷患有與SOD1-相關之神經退化性疾病個體的方法，該方法包括向該個體給藥治療有效量之如請求項1至41中任一所述的dsRNA劑或如請求項44所述的醫藥組成物，因此治療個體。
  50. 如請求項49所述的方法，其中治療包括改善疾病的至少一種徵兆或症狀。
  51. 如請求項49所述的方法，其中治療包括預防疾病的惡化。
  52. 如請求項49所述的方法，其中該SOD1-相關的神經退化性疾病選自下述所成群組：肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿茲海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
  53. 一種在個體預防SOD1-相關神經退化性疾病發展的方法，該個體符合至少一SOD1-相關神經退化性疾病診斷標準，該方法包括向個體給藥治療有效量之如請求項1至42所述之dsRNA劑或如請求項44所述之醫藥組成物，從而防止個體之SOD1-相關神經退化性疾病的發展。
  54. 如請求項49至53項中任一項所述的方法，其中該個體係人類。
  55. 如請求項54所述的方法，其中該個體已被診斷出患有與SOD1-相關的神經退化性疾病。
  56. 如請求項55所述的方法，其中該SOD1-相關的神經退化性疾病選自下述所成群組：肌萎縮側索硬化症(ALS)、阿滋海默症(AD)、帕金森氏症(PD)及唐氏症(DS)。
  57. 如請求項49至56中任一項所述的方法，其中該dsRNA劑藉由鞘內或腦室內給藥於個體。
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