KR20230030690A

KR20230030690A - 코로나바이러스감염증-19의 치료에 사용하기 위한 SARS-CoV-2 번역 조절 저해 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드

Info

Publication number: KR20230030690A
Application number: KR1020210112234A
Authority: KR
Inventors: 김도연; 김석준; 박주리; 장희령; 장지윤; 안준학; 박희도; 박만성; 김윤기; 백대현
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2021-08-25
Filing date: 2021-08-25
Publication date: 2023-03-07
Also published as: WO2023027267A1

Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2 번역 조절 저해 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 SARS-CoV-2 유전자의 리더서열 내의 TIS-L을 표적화하는 경우, SARS-CoV-2의 유전자 발현 전반을 교란하여, 바이러스의 증식 및 감염성을 크게 낮추어 효과적으로 COVID-19를 치료할 수 있다.

Description

코로나바이러스감염증-19의 치료에 사용하기 위한 SARS-CoV-2 번역 조절 저해 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드{Antisense oligonucleotides disrupting SARS-CoV-2 translational regulation for use in Coronavirus Disease-19 treatment}

본 발명은 SARS-CoV-2 번역 조절 저해 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.

코로나바이러스는 단일가닥 양성 RNA를 게놈으로 가지고 있는 외피가 있는 바이러스로 1937년 처음 발견된 이후 사람을 포함하여 다양한 동물에게서 분리되었다. 코로나바이러스는 4개의 그룹으로 나눌 수 있다. 이중 알파-코로나바이러스(Alpha-coronavirus)와 베타-코로나바이러스(Beta-coronavirus)는 주로 포유류에 감염되고, 감마코로나바이러스(Gamma-coronavirus)와 델타-코로나바이러스(Delta-coronavirus)는 조류에 감염되지만 최근 돼지에서 델타-코로나바이러스(Delta-coronavirus)의 감염이 확인된 사례가 있다. 코로나바이러스는 이종 간 감염이 이루어질 수 있다. 대표적인 사례로서 2003년에 전세계적으로 유행한 중증급성호흡기증후군을 일으키는 사스(SARS) 코로나바이러스와 2015년에 국내에 전파되어 확산된 메르스(MERS) 코로나바이러스를 들 수 있으며, 이들 바이러스 모두 박쥐에서 유래된 것으로 알려져 있다. 박쥐는 포유동물 중 비행능력이 있어 광범위한 지역에 서식할 수 있으며, 동굴 등 협소한 공간에서 다수의 개체가 집단으로 생활하는 특성으로 인하여 한 개체가 바이러스에 감염될 경우 집단으로 감염이 전달되고 비행을 통한 광범위한 지역으로의 이동을 통하여 다른 동물에 감염을 확산시킬 수 있다. 또한 박쥐는 다른 포유류와 달리 체온이 높아 바이러스에 대한 저항력이 있어 코로나바이러스 숙주인 박쥐는 영향을 받지 않고 지속적인 감염을 전파할 수 있다.

한편, 중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(SARS-CoV-2)는 베타 코로나 바이러스로 다른 6개의 인간에 전염성이 있는 코로나 바이러스(229E, OC43, HKU1, SARS-CoV 및 MERS-CoV)와 같은 패밀리로 분류된다. 인간에게 병원성이 있는 것으로 알려진 인간 코로나 바이러스(HCoV)229E, OC43, NL63 및 HKU1은 비교적 경미한 호흡기 질환을 유발하는 반면에, HCoV SARS-CoV, MERS-CoV 및 SARS-COV-2는 2002년, 2012년 및 2019년에 치명적인 질병과 함께 심각한 발명을 유발하였다. 이의 결과, 특히, SARS-CoV-2는 전례없는 규모의 전염병을 일으켰고, 유엔이 최근 팬데믹을 선언하였고, 세계적으로 사회와 경제에 막대한 영향을 주었다.

코로나-19 바이러스는 전사를 위한 주형으로 사용되는 30kb의 단일-가닥 포지티브 센스(positive sense) RNA 유전체가 들어있는 단백질 껍질(capsid)을 외막(envelope)이 둘러싸고 있고 표면에는 막 당단백질(membrane glycoprotein) 형태인 스파이크 단백질(spike protein)들이 돌기처럼 돌출된 구조를 가지며, 이 중 스파이크 단백질은 못처럼 튀어나온 숙주에 존재하는 수용체 표면에 결합하여 숙주세포의 안으로 침투하는 역할을 하여 숙주를 바이러스에 감염시키는 중요한 역할을 수행한다. 스파이크 단백질은 기능적으로 숙주세포의 수용체와 결합하는 S1 서브유닛(subunit)과 막에 융합하는 S2 서브유닛으로 나뉘며 S1 서브유닛에는 숙주세포의 ACE2 (Angiotensin converting enzyme 2) 수용체에 결합하는 RBD(Receptor binding domain)가 존재한다. RNA 유전체는 5` 말단에 2/3은 pp1a(polyprotein 1a) 및 pp1ab를 코딩하는 ORF 1a 및 1b로 구성되어 있고, 이는 16개의 비-구조적 단백질로 번역 후의 과정을 거친다. 나머지 유전체는 구조 및 부속적인 단백질을 코딩하는데, 그 구성은 코로나 바이러스에 따라 상이하다. 최근 연구에 따르면, SARS-CoV-2의 전체 유전체 구조는 ORF1a, 1b, 구조 단백질, 스파이크(S), 외피(E), 막(M), 뉴클레오캡시드(N), 3a, 6, 7a, 7b, 8 및 10를 포함한다. ORF1a 및 1b는 gRNA에서 직접 번역되지만 나머지 ORF는 sgRNA로부터 번역된다. sgRNA는 모두 5`말단이 캡핑되고 3`말단이 폴리아데닐화된 양성가닥 RNA의 중첩된 말단을 갖고 있다. SARS-CoV-2 바이러스의 유전자의 5` 말단은 3` 말단에 TRS-L(transcription regulatory sequence-leader)을 포함하는 리더서열(leader sequence)이 있다. TRS는 각 ORF(TRS-body; TRS-B)의 상류에 위치하며, 6-nt 코어 서열은 모든 TRS에 동일하다. 각 ORF의 5` 말단은 ORF1a, 1b에 의하여 암호화되는 RNA 의존성 RNA 중합효소 복합체에 의한 불연속적 전사를 통하여 리더 서열과 융합된다. 바이러스 유전체 복제 및 전사는 바이러스 단백질에 의하여 수행되는 반면, 번역 과정은 숙주의 단백질에 의하여 수행된다. 따라서, 바이러스 및 인간 번역체의 역학을 관찰하는 것은 인간의 COVID-19 병원성의 분자 메카니즘을 이해하는데 매우 중요하고, 이를 이용하여 신약을 개발할 수 있다.

한편, 현재 코로나바이러스감염증-19 (COVID-19)의 치료는 대부분 기존 약물의 재창출을 통하여 신약을 개발하고 있다. 이는 질병의 원인 바이러스인 SARS-CoV-2의 유전자 조절 및 질병 유발 기작에 대한 이해의 부족에 기인한다. 효과적인 COVID-19 치료를 위해서는 해당 바이러스의 증식과 숙주 감염에 필수적인 단계를 파악하고, 이를 억제하는 것이 중요하다. 이에 본 연구진은 SARS-CoV-2의 유전체 구조 및 유전자의 발현양상을 확인하여 번역 조절 인자 (Translation initiation site located in the leader sequence; TIS-L)를 동정하였고, TIS-L의 기능을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide; ASO)를 투여하면 SARS-CoV-2의 유전자 발현 전반을 교란하여, 바이러스의 증식 및 감염성을 크게 낮추어 효과적으로 COVID-19를 치료할 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 SARS-CoV-2 번역 조절 저해 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제공함에 있다.

따라서, 본 발명은 SARS-CoV-2 바이러스의 5` UTR 영역의 리더서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 포함하되, 상기 리더서열 내의 번역시작서열과 상보적인 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

상기 5` UTR 영역의 리더서열은 서열번호 1로 표시될 수 있다.

상기 번역시작서열은 CUG 서열일 수 있다.

상기 리더서열의 일부는 서열번호 1로 표시되는 리더서열의 5` 말단으로부터 40bp에서 80bp 서열일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 18nt 내지 50nt일 수 있고, 바람직하게는 18 내지 22nt일 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드는 5`UTR 영역내의 CUG 서열과 상보적인 서열을 포함할 수 있으며, SARS-CoV-2 바이러스의 번역을 억제하여 이를 이용하여, SARS-CoV-2의 번역을 저해한다.

또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 TRS-L 서열과 상보적인 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 코로나-19 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 SARS-CoV-2 유전자의 리더서열 내의 TIS-L을 표적화하는 경우, SARS-CoV-2의 유전자 발현 전반을 교란하여, 바이러스의 증식 및 감염성을 크게 낮추어 효과적으로 COVID-19를 치료할 수 있다.

첨부된 도면은 해당 기술 분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 기술적 사상이 이에 한정되는 것은 아니다.
도 1은, SARS-CoV-2 바이러스 유전체의 구조를 나타낸 도이다.
도 2는, SARS-CoV-2 바이러스 mRNA들의 5` 말단 구조를 나타낸 도이다.
도 3은, ASO(Antisense oligonucleotides)를 이용한 표적 RNA의 기능 및 발현을 조절하는 방법을 나타낸 도이다.
도 4는, SARS-CoV-2 번역 조절 인자인 TIS-L(anslation initiation site located in the leader sequence)을 표적하는 ASO를 나타낸 도이다.
도 5는, SARS-CoV-2 바이러스 번역 조절 인자를 표적하는 ASO를 이용한 COVID-19의 치료방법을 제시한 도이다.
도 6은, SARS-CoV-2 유전체 상의 RPF-seq 리드 분포와 (위), TIS-L 부위의 리드의 밀집 (아래)을 나타낸 도이다.
도 7a는, TIS-L에 위치한 RPF-seq 리드들이 기원한 SARS-CoV-2 gRNA 또는 sgRNA의 비율을 나타낸 도이다.
도 7b는, TIS-L의 RPF-seq 번역 신호와, 각 SARS-CoV-2 ORF 번역 신호를 비교한 도이다.
도 8a는, SARS-CoV-2는 gRNA 또는 sgRNA의 5`영역의 구조를 나타낸 도이다.
도 8b는, ORF S에 대한 TIS-L과의 번역개시 신호를 비교한 도이다.
도 8c는, ORF7a에 대한 TIS-L과의 번역개시 신호를 비교한 도이다.
도 9는, luciferase reporter assay를 이용하여 TIS-L의 번역 효율 조절 기능을 확인한 도이다.

본 발명은 SARS-Cov-2 바이러스 유전자의 5` UTR 영역의 리더서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 포함하되, 상기 리더서열 내의 번역시작서열과 상보적인 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서는 SARS-CoV-2 5` 리더서열의 CUG를 포함하는 번역개시 자리를 도출하여, 상기 부위를 조절하여 SARS-CoV-2의 증식을 교란시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 번역개시 자리를 TIS-L(translation initiation site located in the leader)로 명명하였다. 상기 TIS-L은 SARS-CoV-2 바이러스 유전체의 59번째에 위치한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 TIS-L을 표적화할 수 있는 안티센스올리고뉴클레오티드(ASO)일 수 있다. 바람직하게는 TIS-L 서열을 표적화하는 서열 및 TRS-L 서열을 표적화하는 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "안티센스올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 화합물"은 다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 가령, RNA 올리고뉴클레오티드이면, 이는 RNA-RNA 상호작용에 의해 다른 RNA 표적에 결합하고 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능을 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다. 이러한 정의에는 치료적 관점, 진단적 관점, 또는 다른 관점에 서 유용한 임의의 외래 RNA 또는 DNA 분자가 포함되는 것으로 의도된다. 이런 분자에는 예로써, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자, 간섭 RNA (RNAi), 마이크로 RNA, 미끼 RNA 분자, siRNA, 효소 RNA, 치료 편집 RNA 및 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (external guide sequence, EGS) 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.

본 발명의 맥락에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"에는 또한, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴 클레오시드, 이들의 치환된 및 알파-아노머 (alpha-anomeric) 형태, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금된 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등을 비롯한 자연 및/또는 변형된 단량체 또는 연쇄의 선형 또는 원형 올리고머가 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 단량체-단량체 상호작용의 규칙적인 패턴, 예를 들면, Watson-Crick 유형의 염기 대합 (base pairing), Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 유형의 염기 대합 등에 의해, 표적 폴리뉴클 레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 "키메라"일 수 있다, 다시 말하면, 서로 다른 영역으로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "키메라" 화합물은 2개 이상의 화학적 영역, 예를 들면, DNA 영역(들), RNA 영역(들), PNA 영역(들) 등을 보유하는 올리고뉴클레오티드일 수 있다.

올리고뉴클레오티드는 단량체가 고유 DNA에서처럼 연속적으로 연결되거나, 또는 스페이서를 통해 연결될 때, 연결될 수 있는 영역으로 구성될 수 있다. 이들 스페이서는 이들 영역 간에 공유 "가교"를 구성하고 바람직한 경우에, 대략 100개의 탄소 원자를 초과하지 않는 길이를 갖도록 의도된다. 이들 스페이서는 예로써, 양 또는 음 전하를 보유하고, 특정한 핵산 결합 특성 (삽입물, 그루브 접합제 (groove binder), 독소, 형광단 등)을 갖고, 친유성이고, 예로써 알파-나선 (alpha-helix)을 유도하는 알라닌 보유 펩티드와 같은 특수한 이차 구조를 유도하는 상이한 기능기 (functionality)를 보유할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "표적 핵산"은 DNA, 이런 DNA로부터 전사된 RNA (premRNA 및 mRNA 포함), 그리고 비-코딩 서열, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 코딩하는, 이런 RNA로부터 유래된 cDNA를 포괄한다. 올리고머 화합물의 표적 핵산과의 특이적인 혼성화는 상기 핵산의 정상적인 기능을 간섭한다. 표적 핵산에 특이적으로 혼성 화되는 화합물에 의한 상기 표적 핵산의 기능의 이러한 조정은 일반적으로, "안티센스"로 지칭된다. 간섭되는 DNA의 기능에는 예로써, 복제 및 전사가 포함된다.

RNA 간섭 "RNAi"는 "표적" 핵산 서열에 서열-특이적 상동성 (homology)을 갖는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 매개된다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 매개자 (mediator)는 5-25개 뉴클레오티드 "작은 간섭" RNA 이중 나선 (siRNA)이다. 이들 siRNA는 Dicer로 알려져 있는 RNase 효소에 의한 dsRNA의 가공으로부터 유래된다. siRNA 이중나선 산물은 RISC (RNA Induced Silencing Complex)로 명명된 다중-단백질 siRNA 복합체 내로 동원된다. 특정 이론에 한정됨 없이, RISC는 이후, 표적 핵산 (적절하게는 mRNA)로 안내되는 것으로 생각되고, 여기서 siRNA 이중나선은 서열-특이적 방식으로 상호작용하여 촉매 방식으로 절단을 매개한다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 작은 간섭 RNA는 당분야에 널리 공지되고 당업자에게 익숙한 절차에 따라서 합성되고 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 작은 간섭 RNA는 적절하게는, 대략 1개 내지 대략 50개의 뉴클레오티드(nt)를 포함한다. 무제한적 구체예의 실례에서, siRNA는 대략 5개 내지 대략 40nt, 대략 5개 내지 대략 30개 nt, 대략 10개 내지 대략 30개 nt, 대략 15개 내지 대략 25개 nt, 또는 대략 20-25개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

용어 "뉴클레오티드"에는 자연 발생 뉴클레오티드 및 비-자연 발생 뉴클레오티드가 포함된다. 이전에 "비-자연 발생" 인 것으로 간주되었던 다양한 뉴클레오티드가 차후에, 자연에서 발견되고 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 "뉴클레오티드"에는 공지된 퓨린과 피리미딘 헤테로환-보유 분자뿐만 아니라 이들의 헤테로환상 유사체 및 호변체 (tautomer) 역시 포함된다. 다른 유형의 뉴클레오티드의 예시적인 실례는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 잔틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자잔틴, 7-데아자구아닌, N4, N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-히드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신, 그리고 Benner et al., U.S. Pat No. 5,432,272에서 설명된 "비-자연 발생" 뉴클레오티드를 보유하는 분자이다. 용어 "뉴클레오티드"에는 이들 실시예 모두, 그리고 이들의 유사체 및 호변체가 포함될 수 있다. 특히 흥미로운 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 그리고 우라실을 보유하는 것들인데, 이 들은 인간에서 치료적 및 진단적 적용에 관하여 자연 발생 뉴클레오티드로서 간주된다. 뉴클레오티드는 예로써, Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)에서 설명된 바와 같은 자연 2'-데옥시 및 2'-히드록실 당, 그리고 이들의 유사체를 포함한다.

뉴클레오티드와 관련하여 "유사체"에는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 보유하는 합성 뉴클레오티드가 포함된다 (예로써, Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulme J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17- 18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3`-C-linked [3.2.0] bicycloarabinonucleosides에 의해 전반적으로 기술됨). 이런 유사체에는 결합 특성, 예를 들면, 이중나선 또는 삼중나선 안정성, 특이성 등을 증강시키도록 설계된 합성 뉴클레오티드가 포함된다.

본 명세서에서, "상보성"은 1개 또는 2개의 올리고머 가닥에서 2개의 뉴클레오티드 간에 정확한 대합의 능력을 지칭한다. 가령, 안티센스 화합물의 일정한 위치에서 핵염기 (nucleobase)가 표적 핵산의 일정한 위치에서 핵염기와 수소 결합을 형성할 수 있고, 상기 표적 핵산이 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이면, 상기 올리 고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에 수소 결합의 위치는 상보성 위치인 것으로 간주된다. 올리고머 화합물 및 추가의 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자 내에서 충분한 숫자의 상보성 위치가 서로에 수소 결합될 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 서로에 상보성이다. 따라서 "특이적으로 혼성화가능" 및 "상보성"은 올리고머 화합물 및 표적 핵산 사이에 안정되고 특정한 결합이 발생할 만큼 충분한 숫자의 뉴클레오티드 에 걸쳐 충분한 정도의 정확한 대합 또는 상보성을 지시하는데 이용되는 용어이다.

당해분야에서, 올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되기 위하여, 표적 핵산의 서열에 100% 상보성일 필요가 없다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 개재성 또는 인접 분절 (segment)이 혼성화 현상에 관련되지 않도록 하나 이상의 분절에 걸쳐 혼성화될 수 있다 (가령, 루프 (loop) 구조, 미스매치 (mismatch) 또는 헤어핀 (hairpin) 구조). 본 발명의 올리고머 화합물은 그들이 표적화되는 표적 핵산 서열 내에 표적 영역에 최 소한 대략 70%, 또는 최소한 대략 75%, 또는 최소한 대략 80%, 또는 최소한 대략 85%, 또는 최소한 대략 90% 또는 최소한 대략 95%, 또는 최소한 대략 99% 서열 상보성을 포함한다. 가령, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오티드 중에서 18개가 표적 영역에 상보성이고, 따라서 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 실례에서, 나머지 비-상보성 뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드와 함께 군집되거나, 또는 상보성 뉴클레오티드가 군데군데 산재될 수 있고, 그리고 서로에 또는 상보성 뉴클레오티드에 인접할 필요가 없다. 따라서 표적 핵산과 완전 상보성의 두 영역이 측면에서 접하는 4개의 비-상보성 뉴클레오티드를 보유하는 18개 뉴클레오티드 길이를 갖는 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8% 전체 상보성을 가질 것이고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속할 것이다. 안티센스 화합물의 표적 핵산의 영역과의 상보성 비율은 당분야에 공지된 BLAST (basic local alignment search tools) 프로그램 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일과적으로 결정될 수 있다. 상동성, 서열 동일성 또는 상보성 비율은 예로써, 디폴트 설정을 이용한 Gap 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정될 수 있고, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489의 알고리즘을 이용한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 임의의 화학적 또는 천연 변형이 될 수 있다. 화학적 및 천연 변형은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 변형에는 예를 들어 표적 가닥 과의 결합을 증가시키도록 (즉, 그들의 용융 온도를 증가시키도록), 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티 드-표적 복합체의 확인을 보조하도록, 세포 침투를 증가시키도록, 뉴클레아제, 및 올리고뉴클레오티드의 구조 또는 활성을 분해하거나 방해하는 다른 효소에 대해 안정화시키도록, 표적에 서열 특이적으로 결합할 때 중단 방식(종결 사건)을 제공하도록, 올리고뉴클레오티드의 약동학 성질을 개선시키도록 설계된 변형이 포함된다. 변형에는 예를 들어 (a) 말단 변형, 예를 들어 5' 말단 변형 (인산화 탈인산화, 접합, 역위 연결 등), 3' 말단 변형 (접합, DNA 뉴클레오티드, 역위 연결 등), (b) 염기 변형, 예를 들어 변형된 염기, 안정화 염기, 탈안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기 쌍을 형성하는 염기, 또는 접합된 염기로의 교체, (c) 당 변형 (예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치에서) 또는 당 교체, 뿐만 아니라 (d) 뉴클레오시드간 연결 변형, 예컨대 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 교체가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이러한 변형이 번역을 방해하는 (즉, 예를 들어 시험관내 번역 검정에서, 변형이 없는 것에 비해 번역에서 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 그보다 많은 감소를 초래하는) 정도까지는 본원에 기재된 방법 및 조성물에 대해 변형이 최적이 아닐 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결의 비제한적인 예에는 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 다른 알 킬 포스포네이트, 예컨대 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 예컨대 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알 킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르 및 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 뉴클레 오시드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3'로 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 반전된 극성을 갖는 것들이 포함된다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리산 형태 또한 포함된다. 일부 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 단일-가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드는 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100개 또는 100개 초과의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고, 갭 세그먼트를 갖는다. 일부 실시양태에서, 갭 세그먼트는 변형된 올리고뉴클레오티드, 예컨대 단일-가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드의 중심 또는 중심 근처에 위치하는 데옥시뉴클레오시드로 이루어진 하나 이상의 연결된 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에 서, 갭 세그먼트는 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, 2-20, 2-30, 2-40 2-50, 10-20, 10-30, 10-40 또는 10-50개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 이루어진다. 5' 윙 세그먼트는 변형된 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에서부터 갭 세그먼트의 5'-말단에 있는 첫번째 핵산 이전의 핵산까지 연결된 핵산 (예를 들어, 뉴클레오시드)에 상응한다. 3' 윙 세그먼트는 갭 세그먼트의 3' 말단에 있는 마지막 핵산 이후부터 변형된 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 있는 마지막 핵산까지 연결된 핵산 (예를 들어, 뉴클레오시드)에 상응한다. 갭 세그먼트는 5' 윙 세그먼트와 3' 윙 세그먼트 사이에 위치한다. 일부 실시양태에서, 5' 윙 세그먼트의 적어 도 1개의 뉴클레오시드 및/또는 3' 윙 세그먼트의 적어도 1개의 뉴클레오시드는 변형된 뉴클레오시드를 포함한 다. 일부 실시양태에서, 갭 세그먼트 내부의 뉴클레오시드간 연결 및 갭 세그먼트를 3' 윙 세그먼트 및/또는 5' 윙 세그먼트에 연결하는 연결은 모두 포스포로티오에이트 연결 (*)이다. 일부 실시양태에서, 5' 및 3' 윙 세그먼트 둘다의 나머지 뉴클레오시드를 연결하는 뉴클레오시드간 연결은 포스포디에스테르 연결이다. 일부 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드에 있는 뉴클레오시드는 2' O-메틸 기로 변형된다. 변형된 올리고뉴 클레오시드에 있는 뉴클레오시드는 또한 본원에 기재된 임의의 다른 변형으로 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-60, 10-70, 10-80, 10-90, 10-100개 또는 100개 초과의 연결된 뉴클레오시드로 이루어지고 이의 제약상 허용되는 염을 갖는다. 그 안에 인 원자를 함유하지 않는 변형된 뉴클레오시드간 연결은 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연 결, 혼합된 헤테로원자, 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 뉴클레오시드간 연결을 갖는다. 이들에는 모르폴리노 연결을 갖는 것 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 술피드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파 메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH2 성분 부분을 갖는 다른 것이 포함된다. 치환된 당 모이어티에는 2' 위치에서 다음 중 하나가 포함되나 이로 제한되지 않는다: H (데옥시리보스); OH (리보스); F; 0-, S-, 또는 N-알킬; 0-, S- 또는 N-알케닐; 0-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬- O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환된 또는 비치환된 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C1O 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 화학적으로 또는 천연적으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 당의 2' 위치에서 변형된 적어도 1개의 뉴 클레오티드, 가장 바람직하게는 2'-O-알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오로-변형된 뉴클레오티드 또는 말단 캡을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, RNA 변형에는 피리미딘의 리보스 상에서 2'-플루오로, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형, 무염기성 잔기, 또는 RNA의 3' 말단에서의 역위 염기가 포함된다. 본 발명에 따라 유용한 올리고뉴클레오티드는 단일 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 적어도 2개의 변형된 뉴클레오시드, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어 도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20개 이상, 올리고뉴클레오티드의 전체 길이까지 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 또는 핵염기는 천연 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오시드는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 이노신, 크산틴, 히 포크산틴, 누불라린, 이소구아니신, 투베르시딘, 2-(할로)아데닌, 2-(알킬)아데닌, 2-(프로필)아데닌, 2 (아미 노)아데닌, 2-(아미노알킬)아데닌, 2 (아미노프로필)아데닌, 2 (메틸티오) N6 (이소펜테닐)아데닌, 6 (알킬)아 데닌, 6 (메틸)아데닌, 7 (데아자)아데닌, 8 (알케닐)아데닌, 8-(알킬)아데닌, 8 (알키닐)아데닌, 8 (아미노)아 데닌, 8-(할로)아데닌, 8-(히드록실)아데닌, 8 (티오알킬) 아데닌, 8-(티올)아데닌, N6-(이소펜틸)아데닌, N6 (메틸)아데닌, N6, N6 (디메틸)아데닌, 2-(알킬)구아닌, 2 (프로필)구아닌, 6-(알킬)구아닌, 6 (메틸)구아닌, 7 (알킬)구아닌, 7 (메틸)구아닌, 7 (데아자)구아닌, 8 (알킬)구아닌, 8-(알케닐)구아닌, 8 (알키닐)구아닌, 8- (아미노)구아닌, 8 (할로)구아닌, 8-(히드록실)구아닌, 8 (티오알킬)구아닌, 8-(티올)구아닌, N (메틸)구아닌, 2-(티오)시토신, 3 (데아자) 5 (아자)시토신, 3-(알킬)시토신, 3 (메틸)시토신, 5-(알킬)시토신, 5-(알키닐)시 토신, 5 (할로)시토신, 5 (메틸)시토신, 5 (프로피닐)시토신, 5 (프로피닐)시토신, 5 (트리플루오로메틸)시토신, 6-(아조)시토신, N4 (아세틸)시토신, 3 (3 아미노-3 카르복시프로필)우라실, 2-(티 오)우라실, 5 (메틸) 2 (티오)우라실, 5 (메틸아미노메틸)-2 (티오)우라실, 4-(티오)우라실, 5 (메틸) 4 (티 오)우라실, 5 (메틸아미노메틸)-4 (티오)우라실, 5 (메틸) 2,4 (디티오)우라실, 5 (메틸아미노메틸)-2,4 (디티 오)우라실, 5 (2-아미노프로필)우라실, 5-(알킬)우라실, 5-(알키닐)우라실, 5-(알릴아미노)우라실, 5 (아미노알 릴)우라실, 5 (아미노알킬)우라실, 5 (구아니디늄알킬)우라실, 5 (1,3-디아졸-1-알킬)우라실, 5-(시아노알킬)우 라실, 5-(디알킬아미노알킬)우라실, 5 (디메틸아미노알킬)우라실, 5-(할로)우라실, 5-(메톡시)우라실, 우라실-5 옥시아세트산, 5(메톡시카르보닐메틸)-2-(티오)우라실, 5 (메톡시카르보닐-메틸)우라실, 5(프로피닐)우라실, 5 (프로피닐)우라실, 5 (트리플루오로메틸)우라실, 6 (아조)우라실, 디히드로우라실, N3 (메틸)우라실, 5-우라 실 (즉, 슈도우라실), 2 (티오)슈도우라실, 4 (티오)슈도우라실, 2,4-(디티오)슈도우라실, 5-(알킬)슈도우라실, 5-(메틸)슈도우라실, 5-(알킬)-2-(티오)슈도우라실, 5-(메틸)-2-(티오)슈도우라실, 5-(알킬)-4 (티오)슈도우라 실, 5-(메틸)-4 (티오)슈도우라실, 5-(알킬)-2,4 (디티오)슈도우라실, 5-(메틸)-2,4 (디티오)슈도우라실, 1 치 환된 슈도우라실, 1 치환된 2(티오)-슈도우라실, 1 치환된 4 (티오)슈도우라실, 1 치환된 2,4-(디티오)슈도우라 실, 1 (아미노카르보닐에틸레닐)-슈도우라실, 1 (아미노카르보닐에틸레닐)-2(티오)-슈도우라실, 1 (아미노카르 보닐에틸레닐)-4 (티오)슈도우라실, 1 아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노 카르보닐에틸레닐)-슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노-카르보닐에틸레닐)-2(티오)-슈도우라실, 1(아미노알킬아미 노카르보닐에틸레닐)-4 (티오)슈도우라실, 1 (아미노알킬아미노카르보닐에틸레닐)-2,4-(디티오)슈도우라실, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜 티아진-1-일, 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7- 치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-치환된 1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-치환된 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬히드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7- (아미노알킬히드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹사진-1-일, 7-(아미노알킬히드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥 소)-펜티아진-1-일, 7-(아미노알킬히드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬히 드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-페녹사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬히드록시)-1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-페녹 사진-1-일, 7-(구아니디늄알킬-히드록시)-1,3-(디아자)-2-(옥소)-펜티아진-1-일, 7-(구아니디늄알킬히드록시)- 1-(아자)-2-(티오)-3-(아자)-펜티아진-1-일, 1,3,5-(트리아자)-2,6-(디옥사)-나프탈렌, 이노신, 크산틴, 히포크 산틴, 누불라린, 투베르시딘, 이소구아니신, 이노시닐, 2-아자-이노시닐, 7-데아자-이노시닐, 니트로이미다졸릴, 니트로피라졸릴, 니트로벤즈이미다졸릴, 니트로인다졸릴, 아미노인돌릴, 피롤로피리미디닐, 3-(메틸)이소카르보스티릴릴, 5-(메틸)이소카르보스티릴릴, 3-(메틸)-7-(프로피닐)이소카르보스티릴릴, 7-(아자)인돌릴, 6-(메틸)-7-(아자)인돌릴, 이미다조피리디닐, 9-(메틸)-이미다조피리디닐, 피롤로피리지닐, 이 소카르보스티릴릴, 7-(프로피닐)이소카르보스티릴릴, 프로피닐-7-(아자)인돌릴, 2,4,5-(트리메틸)페닐, 4-(메틸)인돌릴, 4,6-(디메틸)인돌릴, 페닐, 나프탈레닐, 안트라세닐, 페난트라세닐, 피레닐, 스틸베닐, 테트라 세닐, 펜타세닐, 디플루오로톨릴, 4-(플루오로)-6-(메틸)벤즈이미다졸, 4-(메틸)벤즈이미다졸, 6-(아조)티민, 2-피리디논, 5 니트로인돌, 3 니트로피롤, 6-(아자)피리미딘, 2 (아미노)퓨린, 2,6-(디아미노) 퓨린, 5 치환된 피리미딘, N2-치환된 퓨린, N6-치환된 퓨린, 06-치환된 퓨린, 치환된 1,2,4-트리아졸, 피롤로-피리미딘-2-온-3- 일, 6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 파라-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 오르토-치환된-6-페닐 -피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 비스-오르토-치환된-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 파라-(아미노알킬히드록 시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 오르토-(아미노알킬히드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 비스 -오르토-(아미노알킬히드록시)-6-페닐-피롤로-피리미딘-2-온-3-일, 피리도피리미딘-3-일, 2-옥소-7-아미노-피리-도피리미딘-3-일, 2-옥소-피리도피리미딘-3-일, 또는 이들의 임의의 O-알킬화 또는 N-알킬화 유도체를 포함한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기 기재된 2가지 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 복합 구조로 형성될 수 있다. 이러한 화합물은 관련 기술분야에서 하이브리드 또는 혼합된 백본 또는 키메라 또는 갭머(gapmer)로도 지칭되었다. 특히, 갭머는 적어도 3개의 구별되는 부 분을 갖는 올리고뉴클레오티드이며, 여기서 부분 중 2개는 유사하고, 즉, 하나 이상의 백본 변형을 포함하고, 구별되는 (즉, 백본 변형에 포함되지 않는) 영역을 둘러싼다. 올리고뉴클레오티드는 하나 또는 양쪽 말단에, 즉, 3' 및/또는 5' 말단에 분자 종을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분자 종은 천연 발생 또는 비-천연 발생 뉴클레오티드가 아닌 임의의 화합물을 지칭한다. 분자 종에는 스페이서, 지질, 스테롤, 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티, 콜산, 티오에테르, 예를 들 어 헥실-S-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 쇄, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들 어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아 민 또는 폴리에틸렌 글리콜 쇄, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르 보닐-옥시콜레스테롤 모이어티, 스테아릴, C16 알킬 쇄, 담즙산, 콜산, 타우로콜산, 데옥시콜레이트, 올레일 리 토콜산, 올레오일 콜렌산, 당지질, 인지질, 스핑고지질, 이소프레노이드, 예컨대 스테로이드, 비타민, 예컨대 비타민 E, 포화 지방산, 불포화 지방산, 지방산 에스테르, 예컨대 트리글리세리드, 피렌, 포르피린, 텍사피린, 아다만탄, 아크리딘, 비오틴, 코우마린, 플루오레세인, 로다민, 텍사스-레드, 디곡시게닌, 디메톡시트리틸, t부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 시아닌 염료 (예를 들어, Cy3 또는 Cy576), 획스트 33258 염료, 프소랄렌, 또는 이부프로펜이 포함되나 이로 제한되지 않는다. [0153] 분자 종은 올리고뉴클레오티드의 다양한 위치에서 부착될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 분자 종은 올리고 뉴클레오티드의 2'-말단, 3'-말단 또는 5'-말단에 연결될 수 있으며, 여기서 이는 3'- 또는 5'- 엑소뉴클레아제에 대한 올리고머의 안정성을 개선시키기 위한 목적으로도 작용한다. 대안적으로, 이는 내부 뉴클레오티드 또는 분지 상의 뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 분자 종은 뉴클레오티드의 2'-위치에 부착될 수 있다. 분자 종 은 뉴클레오티드의 헤테로시클릭 염기에도 연결될 수 있다. 분자 종은 링커 모이어티에 의해 올리고뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 임의적으로, 링커 모이어티는 비-뉴클 레오티드성 링커 모이어티이다. 비-뉴클레오티드성 링커는 예를 들어 무염기성 잔기 (디스페이서), 올리고에틸 렌글리콜, 예컨대 트리에틸렌글리콜 또는 헥사에틸렌글리콜, 또는 알칸-디올, 예컨대 부탄디올이다. 스페이서 단위는 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로디티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결된다. 링커 단위는 분자에 하나만 있을 수 있거나 또는 예를 들어 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포 네이트 또는 아미드 연결을 통해 여러번 도입될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 (뉴클레오티드를 분자 종에 연결하는 링커와는 별개로) 비-뉴클레오티드성 링 커, 특히 무염기성 링커 (디스페이서), 트리에틸렌 글리콜 단위 또는 헥사에틸렌 글리콜 단위를 또한 함유할 수 있다. 추가로 바람직한 링커는 알킬아미노 링커, 예컨대 C3, C6, C12 아미노링커, 및 또한 알킬티올 링커, 예컨대 C3 또는 C6 티올 링커이다.

일 측면에서, 본 발명은 SARS-Cov-2 바이러스 유전자의 5` UTR 영역의 리더서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 포함하되, 상기 리더서열 내의 번역시작서열과 상보적인 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드를 포함하는 코로나-19 바이러스 감염증(신종 코로나바이러스 감염증, COVID-19)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 코로나-19 바이러스 감염증의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어 "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 코로나-19 바이러스 감염증 및 이로 인한 합병증의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 코로나-19 바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는데 유효한 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack PublishingCo.에 기술되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 코로나-19 바이러스 감염증의 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack PublishingCompany, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 경구형 또는 주사 제형이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 개체 또는 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 상기 코로나-19 바이러스 감염증이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 박쥐, 낙타, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, "검체"란 이로부터 분리한 비말, 가래, 전혈, 혈장, 혈청, 뇨 또는 타액일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[실험 방법]

세포주 및 바이러스

세포주 및 Virus Calu-3 (KCLB Cat # 30055), Caco-2 (KCLB Cat # 30037.1) 및 Vero 세포 (KCLB Cat # 10081)는 한국 세포주 은행 (한국 서울)에서 구입하였다. SARS-CoV-2(BetaCoV/Korea/KCDC03/2020,NCCP no.43326)는 질병관리본부 (대한민국 오송)에서 구입하였다. 세포는 적절한 배지 (Calu-3 및 Vero 세포: Dulbecco 's Modified Eagle)에서 배양하였다. 배지(DMEM; Gibco, Waltham, MA, USA); Caco-2 세포: 10% 소태아 혈청 (FBS; Serana, Pessin, 독일) 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신(Gibco)이 첨가된 EMEM(Lonza, Basel, Seitzerland, Essential Medium Eagle BSS), 10 % 소 태아 혈청(FBS; Serana, Pessin, Germany)는 37도에서 5% CO2 인큐베이터에서 보관하였다. SARS-CoV-2(BetaCoV/Korea/KCDC03/2020; GISAID 수탁 ID: EPI_ISL_407193)는 Vero 세포에서 증식되었고 바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 결정하였다.

플라크 어세이

Vero세포를 6-웰 접시에 접종하고, SARS-CoV-2로 감염된 상청액을 1 시간 동안 접종하였다. 다음으로, 바이러스 접종물을 제거하고, 세포를 0.2% 아가로스(Oxoid)를 포함하는 DMEM-F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)overlay medium(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)으로 덮어, 3 일 후, 세포를 크리스탈 바이올렛(Georgia Chemicals Inc.)으로 염색하였다.

플라스미드 구축

루시페라제 분석에 이용된 플라스미드를 생성하기 위하여, ORFS, 7a에 대한 서브게놈 mRNA의 5`UTR 서열(CUG 또는 CCG 돌연변이)에 해당하는 DNA 단편을 시험관 내에서 합성하였고, 이를 pRL CMV(Promega)의 상류에 삽입하였다. 모든 구성은 DNA 서열분석을 통하여 확인하였다.

DNA 트랜스펙션

Calu-3 세포는 Lipofectamine 2000 (Life Technologies)을 사용하여 상기에서 기술하고 있는 리포터 플라스미드로 일시적으로 형질 감염시켰다. 일시적인 형질감염은 제조업체의 지침에 따라 수행하였고, 12 시간 후, 세포를 MOI 10에서 SARS-CoV-2로 감염시킨 후, 36시간 동안 배양하였다. 이 후, 배양된 세포를 수확하고 200μL의 차가운 PBS에 재현 탁시켰다. 재현탁된 샘플을 각각 RNA 추출 또는 루시퍼라제 분석에 적용하였다. 이중 루시퍼라제 분석 키트를 사용하여 RLuc 및 FLuc 활성을 분석하였다.

숙주 및 바이러스 유전자의 발현 수준의 정량화

RPF-seq, QTI-seq 및 mRNA-seq 데이터를 이용하여 인간 유전자 발현을 정량화하기 위하여, 각 유전자에 대하여 백만개의 매핑된 리드 (RPKM)당 엑손 킬로베이스 당 리드 수를 계산하였다. 모든 바이러스 mRNA는 5 '리더 서열로 시작하고 SARS-CoV-2 게놈의 70 번째 nt 위치에서 전사 조절 서열 리더 (TRS-L)까지 동일한 서열을 포함하기 때문에, TRS-L의 다운 스트림 시퀀스를 조사하여 전사체를 동정할 수 있다.

본 발명자들은 5 '말단이 SARS-CoV-2 게놈의 5'말단에 매핑된 mRNA-seq 리드를 수집하였고, gRNA 및 각 sgRNA의 백만개의 매핑된 리드(RPM) 당 리드의 수를 계산하였다.

ORF 10의 경우, TRS-B가 ORF의 상류에 존재하지 않으므로, TRS-L 및 TRS-B 사이의 접합에 의하여 sgRNA가 생성되지 않는다. 따라서, 5 '말단과 업스트림의 ORF N의 3'말단 사이의 영역에서 접합이 발생한 리드를 측정하여 ORF 10 sgRNA 발현 수준을 추정하였다. 각각의 지정된 ORF 및 이의 15nt 다운 스트림 위치 사이의 RPF-seq 및 QTI-seq RPM을 확보하여 SARS-CoV-2 유전자의 RPF 발현 수준을 측정하였다. 분석에 따르면, SARS-CoV-2 ORF의 5'말단으로부터 15nts 이상의 다운 스트림으로 매핑된 리드 위치의 예상되는 3-nt 프레임주기의 명확한 패턴이 나타나지 않았다. 따라서 이러한 리드는 RPF 발현 수준을 측정할 때 폐기하였다. RPF-seq 또는 QTI-seq 리드의 13 번째 위치를 사용하여 리드의 유전체 내의 위치를 결정하였으며, 이는 리보솜의 P-site의 위치에 해당한다. ORF 1b의 RPF 발현 수준은 ORF 1a의 발현 수준에 ORF 1a와 1b 사이의 PRF 효율을 곱하여 추정하였다. 3'UTR에 대한 RPF 발현 수준은 3'UTR의 5 '말단과 15nt 다운 스트림 위치 사이의 RPF-seq 및 QTI-seq RPM을 구하여 계산하였고, 이를 음성 대조군으로 사용하였다. 바이러스 유전자에 대한 번역 효율(TE)은 1을 pseudo-count로 사용하여 RPF-seq RPM을 mRNA-seq RPM으로 나눈 값으로 계산하였다. ORF 7b의 TE를 계산할 때 ORF 7b의 번역은 주로 ORF 7a sgRNA에서 리보솜의 leaky scanning에 의해 이루어지기 때문에 ORF 7b의 번역이 ORF 7b sgRNA의 mRNA 발현 수준이 아닌 ORF 7a sgRNA의 mRNA 발현 수준으로 나누었다. 정식 ORF 10 sgRNA는 명확하게 정의되지 않았으며 번역의 자세한 메커니즘이 밝혀지지 않았다. 따라서, N sgRNA에서 리보솜의 leaky scanning이 ORF10의 번역으로 이어질 수 있으므로 ORF 10의 TE를 RPF 발현 수준을 비정규 ORF10 sgRNA의 mRNA 발현 수준으로 나눈 값으로 계산하였다.

[실시예 1] SARS-CoV-2 바이러스에서 번역조절과 관련 있는 TIS-L 부위 도출

인간 및 원숭이 세포주에 SARS-CoV-2 바이러스를 감염시킨 후, 숙주 및 바이러스 유전체의 반응을 측정한 다중 오믹스 데이터를 생산, 분석하였다. 이들 중, mRNA의 정보를 토대로 단백질을 생산하는 번역 과정의 양상을 측정한 RPF-seq(ribosome-protected fragment sequencing) 데이터를 분석한 결과, SARS-CoV-2 5` leader 비번역 지역의 한 부위에서 전체 바이러스 리드 중 22%가 밀집된 강력한 번역 신호를 감지하였다(도 6 참조). 해당 부위는 염기서열 CUG에 해당하며, 이는 비표준적 번역 개시 코돈들 중 가장 효율이 좋다고 알려져 있다. 본 연구진은 해당 부위를 리더(leader) 지역에 위치한 번역 개시 자리 (translation initiation site located in the leader; TIS-L)라고 명명하였다.

[실시예 2] TIS-L의 SARS-CoV-2 유전자의 mRNA의 번역개시 역할 확인

TIS-L의 리드들을 분석한 결과, 전체 95% 이상이 sgRNA에서 유래했음을 확인했으며(도 7a), 이는 TIS-L이 gRNA 뿐 아니라 모든 SARS-CoV-2 mRNA에서 활발하게 번역 개시 활동을 하고 있음을 의미한다.

또한, TIS-L의 번역 개시 신호의 강도는 이미 동정된 SARS-CoV-2 유전자들의 강도에 필적했으며, 현재 COVID-19 치료제 및 백신의 주 표적인 spike 단백질 정보를 담은 ORF S와 같은 경우에는 TIS-L에서 시작되는 번역 개시가 더 활발함을 확인하였다(도 7b).

TIS-L은 각 바이러스 mRNA 내 ORF의 5`지역에 upstream ORF (uORF)를 만들게 된다 (도 8a). Downstream의 ORF와의 겹침 여부, 3-nt 번역 주기 (frame)의 일치 여부에 따라, TIS-L에 의한 uORF는 downstream ORF의 단백질 번역 효율을 증가 혹은 감소시킬 수 있다. 예를 들면, ORF S의 경우 TIS-L에서 시작하는 ORF와 frame이 일치하기 때문에 TIS-L에서의 번역 개시가 spike protein 발현을 향상시키는 효과를 가져온다(도 8b). 반면, ORF 7a의 경우 TIS-L에서 시작하는 ORF와 frame이 일치하지 않으면서 겹치기 때문에, TIS-L이 upstream에서 번역 신호를 소진하여 ORF 7a의 발현을 억제한다(도 8c).

즉, TIS-L의 조절이 바이러스이 번역과정을 교란시킬 수 있음을 확인하였다.

[실시예 3] TIS-L의 유무에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 유전자의 발현량 변화 확인

5'비번역 지역의 TIS-L에 의해 실제로 downstream ORF의 발현량에 변화가 있는지를 luciferase reporter assay를 이용하여 확인하였다.

이의 결과, TIS-L의 유무에 따라 유전자의 발현량에 유의미한 변화가 있음을 확인하였다(도 9). 이의 결과, TIS-L이 SARS-CoV-2 유전자들의 발현 양상에 막대한 영향을 미치고 있음을 뒷받침하며, 따라서 TIS-L의 기능 저해가 SARS-CoV-2 유전자 발현 양상 전반을 교란하고, 나아가 바이러스 증식의 억제를 유도할 수 있음을 내포한다.

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Korea University Research and Business Foundation Seoul National University R&DB Foundation <120> Antisense oligonucleotides disrupting SARS-CoV-2 translational regulation for use in Coronavirus Disease-19 treatment <130> DP210200 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 80 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR leader sequence of SARS-CoV-2 <400> 1 auuaaagguu uauaccuucc cagguaacaa accaaccaac uuucgaucuc uuguagaucu 60 guucucuaaa cgaacuuuaa 80 <210> 2 <211> 6 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> transcription regulatory sequence-leader <400> 2 acgaac 6

Claims

SARS-Cov-2 바이러스의 유전자 내 5` UTR 영역의 리더서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 포함하되, 상기 리더서열 내의 번역시작서열과 상보적인 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 리더서열은 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 번역시작서열은 CUG인 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 상기 서열번호 1로 표시되는 서열의 5` 말단으로부터 40bp에서 80bp의 서열의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 18nt 내지 50nt인 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제5항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드의 길이는 20nt인 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 리더서열 내의 CUG 서열과 상보적인 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 SARS-CoV-2 바이러스의 번역과정을 조절하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드.
제7항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2로 표시되는 TRS-L 서열과 상보적인 서열을 추가로 포함하는, 올리고뉴클레오티드.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 코로나-19 바이러스의 예방 또는 치료용 조성물.