KR20120095397A - Ｈｂｖ 안티센스 억제제 - Google Patents

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KR20120095397A
KR20120095397A KR1020127012684A KR20127012684A KR20120095397A KR 20120095397 A KR20120095397 A KR 20120095397A KR 1020127012684 A KR1020127012684 A KR 1020127012684A KR 20127012684 A KR20127012684 A KR 20127012684A KR 20120095397 A KR20120095397 A KR 20120095397A
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Abstract

B형 간염 바이러스 감염의 조절에 유용한, 그리고 인간을 포함하는 동물에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 B형 간염 바이러스-관련 병태의 치료에 유용한 안티센스 올리고머. 더욱 특히, 동물에서 HBV의 치료를 위한 변형된 뉴클레오티드를 지닌 안티센스 올리고머, 더욱 특히 동물에서 HBV의 치료를 위한, 그리고 더욱 특히 인간에서 HBV의 치료를 위한, 잠금 핵산 (LNA)으로도 알려진, 2'O-4'C-메틸렌-가교된 당 또는 다른 2'O-4'C 가교된 당을 지닌 뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 올리고머.

Description

ＨＢＶ 안티센스 억제제 {HBV ANTISENSE INHIBITORS}
본 발명은 유전자 발현을 조절함으로써 질환을 치료하는 데에 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 인간을 포함하는 동물에서 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 B형 간염 바이러스-관련 병태(conditions)의 치료를 위한 안티센스 올리고머에 관한 것이다. 더욱 특히 본 발명의 구체예들은 동물에서 HBV의 치료를 위한 변형된 뉴클레오시드를 지닌 안티센스 올리고머에 관한 것이며, 더욱 특히 동물에서 HBV의 치료를 위한, 그리고 더욱 특히 인간에서 HBV의 치료를 위한, 잠금 핵산 (LNA)으로도 알려진, 2'O-4'C-메틸렌-가교된 당을 지닌 뉴클레오시드, 및 본원에서 추가로 설명되는 다른 가교된(bridged) 당을 지닌 뉴클레오시드를 포함하는 안티센스 올리고머에 관한 것이다.
B형 간염(Hepatitis B)은 혈액 및 혈액 생산물들과 같이 오염된 물질, 오염된 주사 바늘에 의해 비경구적으로, 성적으로(sexually), 그리고 감염된 또는 보균자 산모로부터 그의 자식에게 수직으로 전염되는 바이러스성 질환이다. 상기 질환이 일반적인 세계의 지역에서 어린 나이의 직 감염은 감염된 개인들의 높은 비율이 B형 간염 만성 보균자가 되도록 하는 결과를 초래한다. 연간 약 4 백만 명의 급성 감염자, 연간 1 백만 명의 사망자 및 350-400 백만 명의 만성 보균자를 포함하여, 2 십억 명보다 많은 사람들이 전세계적으로 감염된 것으로 세계보건기구(World Health Organization)에 의해 추산된다. 약 25%의 보균자가 만성 간염, 경화증 또는 간암으로 사망하며, 거의 75%의 만성 보균자가 아시아인이다. B형 간염 바이러스는 담배 다음으로 두 번째로 심각한 발암물질로서, 모든 1차 간암의 60% 내지 80%를 일으킨다. HBV는 HIV보다 100배는 더 전염성이 강하다.
B형 간염 바이러스 감염은, 신속하게 복제하는 임의의 감염원들과 같이 HBV의 일부 하위개체군이 현재의 치료 요법에 저항성을 갖도록 돕는 계속적인 돌연변이가 있기 때문에, 계속적인 의학 문제이다. 현재, B형 간염 바이러스 감염으로 고통받는 사람에서 체내에서 바이러스에 대한 혈청전환을 일으키거나 치료 전의 기준치 수에 비해 항원의 90% 감소를 가져오는, HBV 감염으로 감염된 인간을 치료하기 위한 효과적인 치료제가 없다. 현재 만성 HBV 감염 미국 간 학회 (AASLD) 및 유럽 간 학회 (EASL)에 의해 권장되는 만성 HBV 감염의 치료제는 인터페론 알파 (INFα), 페그 인터페론 알파-2a (Peg-IFN2a), 엔테카비르, 및 테노포비어를 포함한다. 하지만, 전형적인 인터페론 치료제는 48-주이며 심각하고 불편한 부작용을 초래하고, 치료제를 중단한 후 24주에 HBeAg 혈청전환이 단지 27-36% 범위이다. HBsAg의 혈청전환은 훨씬 더 낮고 - 치료 중단 직후에 단지 3%만 관찰되었고, 5년 후에 12% 이상으로의 증가를 수반하였다.
뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 치료제 엔테카비르 및 테노포비어는 바이러스 하중(viral load)을 감소시키는 데에는 성공적이지만, HBeAg 혈청전환율 및 HBsAg 소실율은 IFNα 치료제를 사용하여 얻은 수치보다 훨씬 낮다. 라미부딘 (3TC), 텔비부딘 (LdT) 및 아데포비어를 포함하는 다른 유사한 치료제들이 또한 사용되지만, 뉴클레오시드/뉴클레오티드 치료제의 경우 일반적으로 저항성의 출현이 치료 효능을 제한한다.
따라서, 당업계에는 새로운 항-바이러스 치료제를 발견하고 개발할 필요성이 있다. 더욱 특히, HBeAg 및 HBsAg 혈청전환율을 증가시킬 수 있는 새로운 항-HBV 치료제에 대한 요구가 있다. 이러한 혈청 마커들은 HBV 감염의 면역학적 조절을 보여주며, 개선된 예후 즉, 간 질환 및 경화증으로의 진행의 예방, 간 부전의 예방, 간세포암 (HCC)의 예방, 간 질환-관련 이식의 예방, 및 사망의 예방을 야기한다.
최근의 임상 연구는 HBeAg에서의 혈청전환과 감소 (Fried 등 (2008) Hepatology 47:428) 및 HBsAg에서의 감소 (Moucari 등 (2009) Hepatology 49:1151) 사이의 상관관계를 발견하였다. 항원의 높은 수준이 면역학적 내성을 유도하는 것으로 생각되기 때문에, 항원 수준의 감소는 HBV 감염의 면역학적 조절을 가능하게 할 수 있다. HBV에 대한 현재의 뉴클레오시드 치료제는 HBV의 혈청 수준에 있어서 현저한 감소가 가능하지만 HBeAg 및 HBsAg 수준에는 영향이 거의 없다. 안티센스 치료제는 항원의 전사물을 직접적으로 표적화할 수 있고, 이로 인해 혈청 HBeAg 및 HBsAg 수준을 감소시킬 수 있다는 점에서 뉴클레오시드 치료제와는 다르다. HBV 감염에 따라 생산되는 다수의, 중복되는 전사물들로 인해, 단일 안티센스 올리고머는 또한 HBeAg 및 HBsAg 둘뿐만 아니라 HBV DNA를 감소시킬 수 있는 기회도 있다.
안티센스 치료제는 유전적 장애 또는 감염의 치료 형태이다. 특정 유전자의 유전적 서열이 특정 질환의 원인이 되는 것으로 알려지면, 그 유전자가 본래의 포유류 유전자, 암유전자(oncogene), 또는 전염성 있는 개체로부터의 유전자, 예컨대 유전자 세균 종(bacterial species)으로부터의 유전자, 진균(fungus)으로부터의 유전자, 기생충(parasite)으로부터의 유전자 또는 바이러스로부터의 유전자이든 아니든, 그 유전자에 의해 생산된 전령 RNA (mRNA)에 결합하여 이를 불활성화시켜 효과적으로 그 유전자를 "턴오프(turn off)" 시킬 핵산 (DNA, RNA 또는 화학적 유사체)의 가닥을 합성하는 것이 가능하다. 이는 mRNA가 번역될 수 있기 위해서는 단일 가닥이어야 하기 때문이다. 대안적으로, 상기 가닥은 전-mRNA 상의 스플라이싱 자리에 결합하도록 표적화될 것이며 mRNA[1]의 엑손 함량(content)를 변형시킬 것이다.
만약 동일한 서열 (DNA에서 T가 RNA에서 U인 것을 제외하고)을 지닌 RNA 버전이 단백질로 번역되거나 번역될 수 있으면 DNA 단일 가닥 서열은 보통 센스 가닥 (또는 양성 (+) 센스 가닥)으로 불리며, 상보적인 가닥은 안티센스 가닥 (또는 음성 (-) 센스 가닥)으로 불린다.
DNA 이중 가닥 내의 일부 영역은 유전자를 코딩하며, 이들은 보통 조절 서열, 스플라이싱 자리, 비코딩 인트론 및 다른 영역과 함께, 발현되거나 번역되는 단백질 내 아미노산의 순서를 명시하는 지도이다. 세포가 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 발현하기 위해서는, DNA의 한 가닥이 RNA의 상보적인 가닥의 합성을 위한 주형으로 쓰인다. 주형 DNA 가닥은 전사 가닥이라 불리며, 이의 서열은 mRNA 전사물에 안티센스, 또는 상보적이며, 본래의 이중-가닥 DNA의 센스 서열과 동일한 서열을 갖는다. DNA는 이중-가닥이기 때문에, 안티센스 서열에 상보적인 가닥은 비-전사 가닥 또는 센스 가닥이라 불리며, mRNA 전사물과 동일한 서열을 갖는다 (DNA 서열에서 T 핵염기가 RNA 서열에서 U 핵염기로 치환되는 것을 제외하고).
DNA로부터 전사된 RNA에 상보적인 핵산은, 이의 염기 서열이 유전자의 전령 RNA (mRNA) - "센스" 서열 - 에 상보적이기 때문에 "안티센스" 올리고뉴클레오티드로 불린다. 따라서, 5'-AAGGTC-3'의 센스 서열을 갖는 코딩 DNA 영역은 5'-AAGGUC-3'의 센스 서열을 갖는 mRNA를 생산하도록 전사될 것이며, 따라서 그러한 센스 서열에 대한 안티센스 올리고머는 그것이 RNA 핵염기를 포함한다면 3'-UUCCAG-5'의 서열을 가질 것이고, 또는 안티센스 올리고머가 DNA 핵염기를 포함한다면 3'-TTCCAG-5'의 서열을 가질 것이다.
현재, 안티센스 치료제의 주요한 초점은 표적화된 단백질의 발현 또는 번역에 책임 있는 특정한 "센스" (5'에서 3' 방향) DNA 또는 mRNA 서열에 상보적이 되도록 합성된 대략 20개의 뉴클레오티드/뉴클레오시드 길이의 올리고머 또는 올리고뉴클레오티드의 사용과 관련 있다.
일단 세포 내로 도입되면, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 왓슨-크릭 결합을 통해 그의 상응하는 mRNA 서열과 혼성화하여 이형이중가닥(heteroduplex)을 형성한다. 일단 이중가닥이 형성되면, 결합된 mRNA의 서열에 의해 코딩되는 단백질의 번역이 억제된다. 올리고뉴클레오티드/mRNA 이중가닥이 이후의 번역을 방해할 수 있는 몇몇 메커니즘들이 있다. 몇몇 상이한 안티센스 제제들에 대하여 가장 널리 받아들여지는 설명은 이형이중가닥에서 유비쿼터스 효소 RNase(RNA 분해효소) H에 의한 mRNA의 분해와 관련된다. RNase H는 이형이중가닥에 끌려가 결합된 mRNA를 절단하는 반면, 올리고뉴클레오티드 서열은 온전하게 남겨두어 올리고뉴클레오티드가 상응하는 mRNA 서열을 찾아 결합하는 것을 계속하게 한다. RNase H 활성과 따로 또는 함께 발생할 수 있는 안티센스 치료제를 통한 번역 억제의 몇몇 다른 인정되는 설명은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 번역하는 리보솜 복합체의 능력을 망가뜨리는 적절한 리보솜 조립체의 차단, RNA 스플라이싱의 차단 및/또는 mRNA의 적절한 수출(exportation)의 방해를 포함한다.
번역을 제한함으로써 유전자 발현을 조절하기 위해 개체에 의해 사용되는 확실히 독립된 방법은 유전자 간섭으로 알려져 있으며, 이는 표적 유전자를 "침묵"시키는 짧은 RNA 서열의 배치와 관련 있다. 이러한 짧은 RNA 서열은 짧은 간섭 RNA 또는 siRNA로 알려져 있다. RNA 간섭은 표적화된 유전자, 즉 특정 단백질을 생산하기 위한 청사진이 꺼질 수 있는 아주 오래된 유전적 과정이다.
다이서(Dicer)로 알려진 효소가 RNA 간섭에 핵심적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 다이서는 보통 3' 말단에 2-염기 돌출부를 지니는, 이중-가닥 RNA 분자를 인식하여 이들을 약 20-25개의 뉴클레오티드 길이의 짧은 dsRNA로 자르는 리보뉴클레아제이다. 다이서에 의해 만들어진 작은 dsRNA 단편들은 이후 이들이 이들의 표적 mRNA 서열에 결합하여 유전자를 턴오프 하는 세포 내의 목적지로 dsRNA 분자를 안내하는 거대 다중단백질 복합체로 흡수된다. 이러한 복합체는 RNA-유도된 침묵 복합체 (RISC)로 알려져 있다. RISC는 촉매 성분인 아고너트(argonaute)를 가지며, 이는 만약 mRNA가 siRNA 안내 가닥의 서열에 상보적인 서열을 갖는다면 전령 RNA (mRNA)를 분해할 수 있는 엔도뉴클레아제이다. 따라서 다이서, RISC 및 siRNA 유전자 침묵 시스템은 게놈 재배열, 줄기세포 분화, 뇌 발달 및 바이러스 방어를 포함하는 많은 핵심적인 생물학적 사건들에 있어 필요한 단계이다.
흥미롭게도, 작은 dsRNA - siRNA - 의 크기는 이들의 기능의 결정 요인인 것으로 밝혀졌다. 만약 dsRNA가 너무 크거나 너무 작다면, 이들은 RISC 복합체로 흡수되지 못하며 따라서 유전자 침묵은 발생하지 않는다.
안티센스 올리고머는 siRNA와는 여러 측면에서 다르며, 가장 중요하게는, 안티센스 올리고머는 단일-가닥이다. 이들은 또한 합성한 것이며, 전형적으로 포스페이트 백본에 따라, 그리고 종종 핵염기(nucleobase)의 선택 위치에서 변형된다.
안티센스 치료제 분야에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오시드의 핵산 분자로의 도입, 특히 리보핵산 분자(RNA)로의 도입은, 외생적으로 전달되는 천연 RNA 또는 DNA 분자의 타고난 생체 내(in vivo) 안정성과 생물학적 이용가능성의 잠재적인 한계를 극복하는 데에 강력한 수단을 제공한다. 예를 들어, 화학적으로 변형된 핵산 분자는 혈청에서 보다 긴 반감기를 갖는 경향이 있기 때문에, 화학적으로 변형된 핵산 분자의 이용은 정해진 치료적 효과를 위한 특정 핵산 분자의 보다 낮은 용량을 가능하게 할 수 있다. 더욱이, 특정한 화학적 변형은 특정한 세포 또는 조직을 표적화하고/거나 핵산 분자의 세포 흡수를 향상시킴으로써 핵산 분자의 생물학적 이용가능성을 향상시킬 수 있다. 그러므로, 화학적으로 변형된 핵산 분자의 활성이 천연 핵산 분자에 비해 감소된다 하더라도, 예를 들어 모든 RNA 핵산 분자에 비교할 때, 향상된 안정성 및/또는 분자의 전달로 인해 변형된 핵산 분자의 전체적인 활성은 천연 분자보다 클 수 있다.
잠금 핵산 (LNA)이라 불리는 한 가지 유용한 화학적 변형은 2'O-4'C-알킬렌 브릿지, 여기서 알킬렌 브릿지는 C1 -6 알킬렌 브릿지, 더욱 구체적으로는 2'O-4'C-메틸렌 브릿지를 하나 이상의 RNA 또는 DNA 뉴클레오시드 잔기에 도입한다. LNA가 안티센스 RNA 또는 DNA 올리고머로 편입(incorporated)되면 이들은 안티센스 RNA 또는 DNA 분자의 안정성을 대단히 증가시키고, 따라서 일단 숙주 세포에 의해 흡수되면 안티센스 RNA 또는 DNA의 생물학적 이용가능성을 대단히 증가시키는 것으로 나타났다. 안티센스 올리고머의 안정성 및 생물학적 이용가능성을 증가시키기 위하여 안티센스 RNA 또는 DNA 올리고머로 도입될 수 있는 다른 유용한 화학적 변형은 각각의 RNA 또는 DNA 뉴클레오티드 사이에 자연적으로 발생하는 포스포에스테르결합을 대신하여 대체된 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포트리에스테르 결합을 포함한다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 구체예에서, 본원에서 참조로 통합되는 DNA 서열 CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC (서열번호 1); AGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG (서열번호 2); TGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCAT (서열번호 3); CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTT (서열번호 4); CAAGGTATGTTGCCCGT (서열번호 5); TGTATTCCCATCCCATC (서열번호 6); CCTATGGGAGTGGGCCTCAG (서열번호 7); TGGCTCAGTTTACTAGTGC (서열번호 8); GGGCTTTCCCCCACTGT (서열번호 9); TCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCT (서열번호 10); CGCACCTCTCTTTACGCGG (서열번호 11); GGAGTGTGGATTCGCAC (서열번호 12); 또는 GAAGAAGAACTCCCTCGCCT (서열번호 13)에 상응하는 RNA 전사물에 필수적으로 상보적인 본 발명에 따른 RNA 또는 DNA 올리고머, RNA 또는 DNA 올리고머, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 에스테르 (여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 다수의 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함함); 및 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 두 번째 구체예에서, 본원에서 참조로 통합되는 DNA 서열 GAGAGAAGTCCACCAC (서열번호 14); TGAGAGAAGTCCACCA (서열번호 15); GAGGCATAGCAGCAGG (서열번호 16); TGAGGCATAGCAGCAG (서열번호 17); GATGAGGCATAGCAGC (서열번호 18); GATGGGATGGGAATAC (서열번호 19); GGCCCACTCCCATAGG (서열번호 20); AGGCCCACTCCCATAG (서열번호 21); 또는 CTGAGGCCCACTCCCA (서열번호 22)에 상응하는 RNA 전사물에 필수적으로 상보적인 본 발명에 따른 RNA 또는 DNA 올리고머, RNA 또는 DNA 올리고머, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 에스테르 (여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 다수의 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함함); 및 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
한 구체예는 B형 간염 바이러스 DNA 및 HBV 항원의 양을 감소시키는 데에 사용하기 위한 안티센스 올리고머 또는 이의 염, 용매화물, 수화물 또는 에스테르를 제공하며, 여기서 안티센스 올리고머는 10개 내지 26개의 뉴클레오시드 길이의 인접한 서열이며 화학식 1로 나타낸 서열을 갖는다:
5'-LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-Nl-P-LNAr-P-LNAq-3' (화학식 1)
여기서, LNA는 잠금 핵산이고; P는 화학식 (1)의 서열의 5'에서 3' 방향으로 LNA와 인접한 N 사이, 또는 N과 인접한 N 사이, 또는 N과 인접한 LNA 사이, 또는 LNA와 인접한 LNA 사이의, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, H-포스포네이트 또는 알킬포스포네이트 결합으로부터 선택되는 인터뉴클레오시드(internucleoside) 결합이며; 여기서 N은 G, C, A, T, U 또는 Z 뉴클레오시드 단위로부터 선택되고; n 및 r 및 p 및 q는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3으로부터 선택되는 정수이며; l 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 22의 정수이고; 여기서 Z는 이노신, N7-메틸이노신, N7-메틸 구아니딘, 5-메틸 우리딘, 5-메틸-시티딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로티미딘, 크산토신, 디하이드로우리딘, 슈도우리딘, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 7-메틸-7-데아자구아노신, 7-에틸-7-데아자구아노신, N4-메틸시티딘, N4-에틸시티딘으로부터 선택된다.
특정한 구체예는 설명된 안티센스 올리고머에 있어서, 올리고머의 뉴클레오시드 단위 중 4개 이상이 LNA 단위일 수 있는 안티센스 올리고머를 제공한다. 일부 구체예에서, LNA는 2'-O-알킬-4'C 결합을 갖는 잠금 핵산 단위이고, 여기서 알킬은 치환되거나 비치환된 C1 -6 알킬일 수 있다. 추가의 구체예에서, 인접한 뉴클레오시드 서열의 뉴클레오시드 단위들 사이에 존재하는 인터뉴클레오시드 결합 중 2개 이상이 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합이다. 일부 관련된 구체예에서, 안티센스 올리고머의 인접한 뉴클레오시드 서열의 뉴클레오시드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합일 수 있다.
일부 특정한 구체예에서, n, p, r 및 q는 각각 독립적으로 1 또는 2이고, l 및 m은 각각 독립적으로 2, 3, 4, 5 또는 6이며, 또한 일부 특정한 구체예에서, n, p, r 및 q는 각각 독립적으로 1이고, l 및 m은 각가 독립적으로 6이다. 다른 특정한 구체예에서, 서열이 서열번호 14, 16, 16 또는 20 중 어느 하나일 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 제공된다.
특정한 구체예에서, 앞서 설명된 안티센스 올리고머는 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적일 수 있고, B형 간염 바이러스는 인간 B형 간염 바이러스일 수 있으며, 세포 또는 개체는 인간일 수 있다. 관련된 특정한 구체예에서, B형 간염 바이러스는 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것일 수 있다: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
특정한 구체예에서, 앞서 설명된 안티센스 올리고머는 필수적으로 서열번호 14 내지 22 중 어느 하나인 서열을 가질 수 있으며, B형 간염 바이러스는 인간 B형 간염 바이러스일 수 있고, 세포 또는 개체는 인간일 수 있다. 관련된 특정한 구체예에서, B형 간염 바이러스는 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것일 수 있다: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
특정한 구체예는 유효량의 앞서 설명된 임의의 핵산 안티센스 올리고머, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 에스테르, 및 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 포유류에서 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제학적 포뮬레이션을 제공한다. 그러한 약제학적 포뮬레이션의 안티센스 올리고머는 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적일 수 있거나, 필수적으로 서열번호 14 내지 22 중 어느 하나인 서열을 가질 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예는 B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태를 치료하기 위하여 치료적으로 유효량의 앞서 설명된 임의의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태의 치료 방법을 제공한다. 관련된 구체예에서, 포유류는 인간이고, B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태는 인간 B형 간염 바이러스로부터의 B형 간염 바이러스 감염이다. 더욱 특히, 인간 B형 간염 바이러스는 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것일 수 있다: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
관련된 구체예는 앞서 설명한 바와 같이, 치료적으로 유효량의 앞서 설명된 임의의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 포유류에서 B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태의 치료 방법을 제공하며, 여기서 인간 B형 간염 바이러스-관련 병태는 황달, 간암, 간 염증, 간 섬유증, 간 경화증, 간 부전, 광범위 간세포 염증성 질환, 혈구탐식 증후군 또는 혈청 간염일 수 있다.
관련된 구체예에서, 방법은 안티센스 올리고머를 추가의 치료제와 함께 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 안티센스 올리고머 및 추가의 치료제는 단일 포뮬레이션으로 함께 투여되거나 상이한 포뮬레이션으로 각각 투여되고, 여기서 핵산 올리고머 및 제 2 치료제의 투여는 동시에 또는 연속하여 행해진다.
다른 관련된 구체예에서, 추가의 치료제는 HBV 제제, HCV 제제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비-스테로이드성 항-염증성 (NSAID) 제제, 항진균제, 항기생충제, 항-구토제, 항-설사제 또는 면역억제제일 수 있다.
특정한 관련된 구체예에서, 추가의 HBV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된), 리바비린; HBV RNA 복제 억제제; 제 2 안티센스 올리고머; HBV 치료적 백신; HBV 예방용 백신; 라미부딘 (3TC); 엔테카비르 (ETV); 테노포비어 디이소프록실 푸마레이트 (TDF); 텔비부딘 (LdT); 아데포비어; 또는 HBV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)일 수 있다.
다른 특정한 관련된 구체예에서, 추가의 HCV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된); 리바비린; HCV RNA 복제 억제제 (예컨대, 바이로파마(ViroPharma)의 VP50406 시리즈); HCV 안티센스 제제; HCV 치료적 백신; HCV 프로테아제 억제제; HCV 헬리카제 억제제; 또는 HCV 단일클론 또는 다중클론 항체 치료제일 수 있다.
또 다른 구체예는 치료 전의 포유류에서의 HBV DNA의 양 및 HBV 항원의 양에 비해 B형 간염 바이러스 감염 및 B형 간염 항원을 감소시키기 위하여 치료적으로 유효량의 앞서 설명된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스로 감염된 포유류에서 HBV DNA의 양 및 HBV 항원의 양을 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 포유류는 인간일 수 있고, B형 간염 바이러스는 인간 B형 간염 바이러스일 수 있다. 더욱 특히, 인간 B형 간염 바이러스는 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것일 수 있다: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
특정한 구체예에서, 치료 전의 포유류에서의 HBV DNA의 양 및 HBV 항원의 양에 비해 B형 간염 바이러스 감염 및 B형 간염 항원을 감소시키기 위하여 치료적으로 유효량의 앞서 설명된 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스로 감염된 포유류에서 HBV DNA의 양 및 HBV 항원의 양을 감소시키는 방법에 있어서, DNA의 양이 안티센스 올리고머의 투여 전의 양에 비해 90%로 감소되는 방법이 제공된다. 관련된 방법에서, HBV 항원은 HBsAg일 수 있거나 HBeAg일 수 있으며, 더욱 특히, HBV 항원의 양이 충분히 감소되어, 상업적 ELISA 시스템의 현재 이용가능한 검출 한계에 의해 측정했을 때, HBeAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 HBeAg 부재 및 혈청 HBeAb 존재로 정의되고 또는 HBsAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 HBsAg 부재로 정의되는 혈청전환을 야기할 수 있다.
더욱 특정한 구체예에서, 앞서 설명된 방법은 안티센스 올리고머를 추가의 치료제와 함께 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 안티센스 올리고머 및 추가의 치료제는 단일 포뮬레이션으로 함께 투여되거나 상이한 포뮬레이션으로 각각 투여되고, 여기서 핵산 올리고머 및 제 2 치료제의 투여는 동시에 또는 연속하여 행해진다. 특정한 관련된 구체예에서, 추가의 치료제는 HBV 제제, HCV 제제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비-스테로이드성 항-염증성 (NSAID) 제제, 항진균제, 항기생충제, 항-구토제, 항-설사제 및 면역억제제일 수 있다. 더욱 특정한 관련된 구체예에서, 추가의 HBV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된), 리바비린; HBV RNA 복제 억제제; 제 2 안티센스 올리고머; HBV 치료적 백신; HBV 예방용 백신; 라미부딘 (3TC); 엔테카비르; 테노포비어; 텔비부딘 (LdT); 아데포비어; 또는 HBV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)일 수 있으며, 추가의 HCV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된); 리바비린; HCV RNA 복제 억제제 (예컨대, 바이로파마의 VP50406 시리즈); HCV 안티센스 제제; HCV 치료적 백신; HCV 프로테아제 억제제; HCV 헬리카제 억제제; 또는 HCV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)일 수 있다.
또 다른 구체예는 치료적으로 유효량의 앞서 설명된 약제학적 조성물을 B형 간염으로 감염된 포유류에 투여하는 단계; 포유류의 혈청 샘플 내 HBeAg 및 HBeAb의 존재를 관찰하는 단계, 또는 포유류의 혈청 샘플 내 HBsAg의 존재를 관찰하는 단계를 포함하는 HBV로 감염된 포유류에서 B형 간염 바이러스의 혈청전환을 촉진하는 방법에 있어서, 상업적 ELISA 시스템의 현재의 검출 한계에 의해 측정했을 때, HBeAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 샘플 내 HBeAg의 부재 및 HBeAb의 존재, 또는 HBsAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 샘플 내 HBsAg의 부재가 포유류에서 혈청전환의 표지인 방법을 제공한다.
본원에서 설명된 안티센스 올리고머의 투여를 포함하고, 약제학적 포뮬레이션 내에 존재하거나 단순히 희석제 내에 존재하고 단독 또는 조합으로 투여되는 안티센스 올리고머의 투여를 포함하는, B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태의 치료 방법, B형 간염 바이러스로 감염된 포유류에서 HBV DNA의 양 및 HBV 항원의 양을 감소시키는 방법, 또는 HBV로 감염된 포유류에서 B형 간염 바이러스의 혈청전환을 촉진하는 방법을 제공하는 본원에서 설명된 구체예들 중 어느 것에 있어서, 투여는 경구, 볼점막, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피 또는 기관내 투여일 수 있다.
본 발명의 앞서 말한 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 더욱 쉽게 이해될 것이다.
도 1은 HBV 감염의 자연사(natural history)의 다이아그램이다.
도 2는 HBeAg 양성으로 간주되는 대상성(Compensated) 질환을 지닌 HBV 환자에 대한 다이아그램이다.
도 3은 HBeAg 음성으로 간주되는 대상성 질환을 지닌 HBV 환자에 대한 다이아그램이다.
도 4는 프리코어 및 코어 단백질, RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (역전사효소 활성), X 단백질, 및 거대, 중간 및 작은 S 단백질을 포함하는 HBV 게놈에 의해 인코딩되는 주요 전사물들 뿐만 아니라 폴리-A 꼬리, 전사물의 상대적인 길이, 및 거대, 중간 및 작은 S 단백질 전사물의 중복을 보여주는 HBV 전사의 개략도이다. HBV DNA의 양성 및 음성 가닥들이 또한 나타나 있다.
도 5는 HBV 게놈 영역으로 표시한 HBV의 다중 유전자형으로부터의 게놈 DNA의 서열들간 동일성 비율(percent identity)을 비교한 전산 생물학 분석을 보여준다.
도 6은 확인된 다양한 HBV 지리적 유전자형의 표이다.
정의. 본 상세한 설명 및 첨부된 청구항들에 사용된 다음의 용어들은, 문맥이 다르게 필요로 하지 않는 한, 명시된 의미를 가질 것이다:
본원에서 사용된 용어 "유효량"은 예를 들어, 연구자 또는 임상의가 찾고자 하는 조직, 시스템, 동물 또는 인간의 생물학적인 또는 의학적인 반응을 끌어낼 수 있는, 핵산 올리고머를 포함하는 의약 또는 의약 물질, 또는 약제학적 제제의 양을 의미한다. 또한, 용어 "치료적으로 유효량"은 그러한 양을 받지 못한 상응하는 대상체에 비교하여 질환, 장애 또는 부작용의 개선된 치료, 치유, 예방, 또는 개선, 또는 질환 또는 장애의 진행 속도의 감소를 초래하는 임의의 양을 의미한다. 이 용어는 또한 그 범위 내에 정상적인 생리적 기능을 향상시키는 데에 효과적인 양을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "필수적으로 상보적인"은 안티센스 올리고머 서열이 표준 왓슨-크릭 염기 쌍 A-T, A-U 및 G-C를 이용하여 그의 표적 센스 서열에 완전히 상보적인 서열을 갖는 것을 의미한다. 또한, 용어 "필수적으로 상보적인"은 이에 제한되는 것은 아니지만, G:U, I:U, I:A, I:C, X:A, X:C, R:C, R:T, R:U, m7I:U, m7I-A, m7I:C, m7G:U, m7G:C, m5U:A, 5-FU:A, 5-FT:A, m5C:G, D:A, Ψ:A, 및 Ψ:C를 포함하는 비-표준 왓슨-크릭 염기 쌍을 이용하여 그의 표적 센스 서열에 완전히 상보적인 안티센스 올리고머 서열을 포함한다. 본원에서 사용된 G는 구아노신이고, I는 이노신이며, A는 아데노신이고, C는 시티딘이며, U는 우리딘이고, T는 티미딘이며, X는 크산토신이고, R은 리바비린이며, m7G는 N7-메틸구아노신이고, m7I는 N7-메틸이노신이며, 5FU는 5-플루오로우리딘이고, 5FT는 5-플루오로티미딘이며, D는 디하이드로우리딘이고, m5U는 5-메틸우리딘이며, m5C는 5-메틸시티딘이고, Ψ는 슈도우리딘이다.
용어 "필수적으로 상보적인"은 또한 DNA 또는 RNA 표적 핵산 서열에서 자연적으로 발생하는 핵염기에 대해 슈도-상보성(pseudo-complementarity)을 보이는 서열 내에 하나 이상의 합성 핵염기를 갖는 안티센스 올리고머를 포함한다. 천연 핵산 서열과의 슈도-상보성을 초래하는 핵염기의 예들은 2-아미노아데닌 또는 2-아미노아데노신 (nA), 2-티오티민 또는 2-티오티미딘 (sT), 7-알킬-7-데아자구아닌 또는 7-알킬-7 데아자구아노신 (7al-7daG) 및 N4-알킬시토신 또는 N4-알킬시티딘 (N4-alC; 알킬 = 메틸 또는 에틸인 경우)을 포함한다. 비-왓슨-크릭 염기 쌍 nA:T 및 A:sT는 C를 지니는 7-알킬-7-데아자구아닌 (7al-7daG:C) 및 G를 지니는 N4-알킬시토신 (N4-alC:G)과 같이 안정한 염기 쌍이다. 4개의 합성 핵염기 nA, sT, 7al-7daG 및 N4-alC 모두가 특정한 ASO로 편입되면, 생성되는 ASO 서열은 대체로 2차 구조로부터 벗어나 슈도-상보적인 표적 핵산에 결합할 것이다. 본 발명의 구체예에서, 하나 이상의 합성 핵염기가 ASO 서열에 존재하여, ASO와 표적 핵산 서열 사이에 하나 이상의 비-왓슨-크릭 "슈도-상보적인" 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하나 이상의 슈도-상보적인 염기를 가짐으로써 이에 의해 표적 핵산 서열 상의 핵염기와 하나 이상의 슈도 염기 쌍을 형성하는 ASO는 표적 핵산 서열에 필수적으로 상보적인 것으로 간주될 것으로 이해된다.
구문 "필수적으로 서열번호 X의 서열을 갖는 올리고뉴클레오시드"와 함께 사용되는 경우에서와 같은, 용어 "필수적으로(essentially)"는, 씌여진 바와 같이, 서열번호 X에 상보적인 서열과 염기-쌍을 형성할 수 있지만 DNA 또는 RNA 표적 핵산 서열에서 자연적으로 발생하는 핵염기에 대해 슈도-상보성을 보이는 서열 내에 하나 이상의 합성 핵염기를 함유할 수 있는 임의의 서열을 의미하는 것으로 본원에서 사용된다. 천연 핵산 서열과의 슈도-상보성을 초래하는 핵염기의 예들은 2-아미노아데닌 또는 2-아미노아데노신 (nA), 2-티오티민 또는 2-티오티미딘 (sT), 7-알킬-7-데아자구아닌 또는 7-알킬-7 데아자구아노신 (7al-7daG) 및 N4-알킬시토신 또는 N4-알킬시티딘 (N4-alC; 알킬 = 메틸 또는 에틸인 경우)을 포함한다. 비-왓슨-크릭 염기 쌍 nA:T 및 A:sT는 C를 지니는 7-알킬-7-데아자구아닌 (7al-7daG:C) 및 G를 지니는 N4-알킬시토신 (N4-alC:G)과 같이 안정한 염기 쌍이다. 4개의 합성 핵염기 nA, sT, 7al-7daG 및 N4-alC 모두가 특정한 ASO로 편입되면, 생성되는 ASO 서열은 대체로 2차 구조로부터 벗어나 슈도-상보적인 표적 핵산에 결합할 것이다. 본 발명의 구체예에서, 하나 이상의 합성 핵염기가 ASO 서열에 존재하여, ASO와 표적 핵산 서열 사이에 하나 이상의 비-왓슨-크릭 "슈도-상보적인" 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하나 이상의 슈도-상보적인 염기를 가짐으로써 이에 의해 표적 핵산 서열 상의 핵염기와 하나 이상의 슈도 염기 쌍을 형성하는 ASO는, 씌여진 바와 같이, 특정한 표적 핵산 서열로 향하는 서열번호 X의 서열을 필수적으로 갖는 것으로 간주될 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 용어 "핵산 올리고머"는 2개 이상 및 100개 이하의 100 연속적으로-연결된 공유결합된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단위를 포함하는 핵산 분자를 의미한다. 각각의 개별적인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 단위는 리보오스 또는 데옥시리보오스 당을 포함할 수 있으며, 따라서 이 올리고머는 리보오스와 데옥시리보오스 당의 조합을 포함할 수 있다. 올리고머가 통상적인 포스포에스테르결합을 포함하도록 핵산 올리고머 내의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드가 결합될 수 있으며, 또는 대안적으로 올리고머는 하나 이상의 포스포트리에스테르 결합, 포스포네이트 결합, 알킬포스포네이트 결합, 포스포로티오에이트 결합 또는 포스포로디티오에이트 결합을 포함할 수 있다. 또한 핵산 올리고머는 2'O-4'C 결합된 뉴클레오시드를 포함하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있으며, 또한, 또는 대안적으로 핵산 올리고머는 2'-O-알킬 변형, 예컨대 2'-O-메틸 변형, 2'-O-에틸 변형 또는 다른 2'-변형을 포함하여 2'-위치에 다른 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 LNA (잠금 핵산)는 뉴클레오시드 당 단위의 2'- 및 4'-위치 사이에, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기에 도시된 바와 같이 A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA , (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA, (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA 및 (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA를 포함하는 화학적 연결(link)을 갖는 핵산 모노머를 포함한다 (즉, 올리고뉴클레오티드의 5'- 에서 3'- 으로의 방향성으로부터 일반적으로 받아들여지는 명칭 부여에 따라 기술된다면, 핵산 모노머의 푸라노오스 당은 2'O-4'C 연결 또는 4'C-2'O 연결을 갖는다).
Figure pct00001
본원에서 사용된 LNA 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 당의 4' 및 2' 위치 사이에 1개 이상의 브릿지를 갖는 화합물을 포함하고, 여기서 각각의 브릿지는 독립적으로 -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- 및 -N(R1)- 로부터 독립적으로 선택되는 1개 또는 2 내지 4개의 연결기를 포함하며; 여기서: x는 0, 1 또는 2이고; n은 1, 2, 3 또는 4이며; 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식(alicyclic) 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1) 이고; 각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
LNA의 정의 안에 포함되는 구체적인 4'C-2'O 브릿지의 예들은 -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- 또는 -C(R1R2)-O-N(R1)- 브릿지를 포함한다. LNA의 정의 안에 포함되는 다른 브릿지는 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' 및 4'-CH2-N(R1)-O-2'- 브릿지이며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
또한 본 발명에 따른 LNA의 정의 안에 포함되는 LNA는 그 안에서 리보실 당 고리의 2'-하이드록실기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 결합됨으로써 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') 결합을 형성하여 바이시클릭 당 잔기를 형성하는 LNA이다. 결합은 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 가교시키는 메틸렌기 (-CH2-)일 수 있으며, 이 경우 용어 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA가 바이시클릭 잔기에 대하여 사용될 수 있고; 이 위치에서 에틸렌기의 경우에는, 용어 에틸렌옥시 (4'-CH2CH2-O-2') LNA가 사용된다. 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA의 이성질체인 알파-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2')가 또한 본원에서 사용된 LNA의 의미 안에 포함된다.
본원에서 사용된 용어 "2'-O-알킬-4'C 결합은 잠금 핵산 (LNA)에서의 2'-O-4'-C (또는 올리고뉴클레오티드의 5'- 에서 3'- 으로의 방향성으로부터 일반적으로 받아들여지는 명칭 부여에 따라 기술된다면, 4'C-2'O) 화학적 결합 또는 브릿지를 지칭한다. 알킬 결합은 치환된 또는 비-치환된 알킬일 수 있으며, 여기서 본원에서 사용된 "알킬"은 -[C(R1)(R2)]n-을 의미하고, 여기서 n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이며; 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H)이고, 각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
본원에서 사용된 용어 "HBV"는 인간 B형 간염 바이러스를 포함하는 포유류 B형 간염 바이러스를 의미한다. 이 용어는 B형 간염 바이러스, 특히 인간 B형 간염 바이러스의 지리적 유전자형 뿐만 아니라, B형 간염 바이러스의 지리적 유전자형의 변이주도 포함한다.
본원에서 사용된 "B형 간염-관련 병태" 또는 "HBV-관련 병태"는 임의의 질환, 생물학적 병태, 의학적 병태, 또는 악화되는 B형 간염 감염이거나, B형 간염 감염에 의해 유발되거나, B형 간염 감염에 관한 것이거나, B형 간염 감염과 관련되거나, 또는 B형 간염 감염에서 유래된 사건, 노출, 또는 병을 의미한다. 용어 B형 간염-관련 병태는 B형 간염 바이러스 항원, B형 간염 바이러스의 존재에 대한 양성 테스트, 또는 B형 간염 바이러스 항원에 특이적인 항체의 존재에 대한 양성 테스트와 연관된 경우의 황달, 간암, 간 염증, 간 섬유증, 간 경화증, 간 부전, 광범위 간세포 염증성 질환, 혈구탐식 증후군, 혈청 간염, HBV 바이러스혈증 및 다음 중 어느 것 또는 전부를 포함할 수 있는 증상을 갖는 병태를 포함한다: 감기-유사 질병, 쇠약, 통증, 두통, 열, 식욕 부진, 설사, 황달, 오심과 구토, 신체의 간 주위의 통증, 흙색변 또는 회색변, 전신 가려움 및 흑색뇨.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)는 비용매화된 형태 및 용매화된 형태로 모두 존재할 수 있다. 용어 '용매화물'은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 용매 분자, 예를 들어, 에탄올을 포함하는 분자 복합체를 나타내는 것으로 본원에서 사용된다. 용어 '수화물'은 상기 용매가 물일 때 사용된다. 약제학적으로 허용되는 용매화물은 수화물 및 결정화의 용매가 동위원소 치환될 수 있는 다른 용매화물, 예컨대, D2O, d6-아세톤, d6-DMSO를 포함한다.
본 발명의 청구된 화합물의 범위 안에 포함되는 화합물들은, 이성질현상 중 한 가지 이상의 유형을 나타내는 화합물을 포함하는, 화학식 (I)의 화합물의 모든 입체이성질체, 기하 이성질체 및 호변이형, 및 이들 중 하나 이상의 혼합물이다.
본 발명의 ASO는 프로드러그로서 투여될 수 있다. 따라서, 그들 스스로는 약간의 약리 활성을 갖거나 갖지 않을 수 있는 본원에서 설명된 ASO의 특정한 유도체들은, 체내로 또는 신체 상에 투여될 때, 예컨대, 가수분해 절단에 의해, 원하는 활성을 갖는 서열번호 1 내지 13에 필수적으로 상보적인 ASO로 전환될 수 있다. 그러한 유도체들이 '프로드러그'라 지칭된다.
특정한 안티센스 핵산 올리고머의 성질에 따라, 표적 세포 내에서 표적 바이러스 전사물, 바이러스 게놈 양 또는 하중(load)의 바람직한 감소를 초래할 수 있는 임의의 편리한 수단을 이용하여 ASO가 숙주로 투여될 수 있다. 따라서, 안티센스 올리고머는 치료적 투여를 위한 다양한 포뮬레이션으로 편입될 수 있다. 더욱 특히, 본 발명의 안티센스 올리고머는 적절한, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 조합함으로써 약제학적 조성물로 포뮬레이션 될 수 있으며, 고체, 반-고체, 액체 또는 기체 형태의 제제, 예컨대 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 연고제, 액제, 좌제, 주사제, 흡입제 및 에어로졸로 포뮬레이션될 수 있다. 그러한 것으로서, 안티센스 올리고머의 투여는 경구, 볼점막, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피, 기관내 등의 투여를 포함하는 다양한 방법으로 달성될 수 있다.
약제학적 제형에서, ASO는 단독으로 또는 다른 약제학적으로 유효한 제제와의 조합 뿐만 아니라 적절한 연합(association)으로 투여될 수 있다. 다음의 방법 및 부형제는 단지 예시적인 것이며 절대 제한적인 것이 아니다. 본원에서 설명된 ASO는 통상적인 약제학적 담체, 부형제 등 (예컨대, 만니톨, 락토오스, 녹말, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탤컴(talcum), 셀룰로오스, 소듐 크로스카멜로오스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등)과 조합하여 투여될 수 있다. 요구된다면, 약제학적 조성물은 또한 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대 습윤제, 유화제, 가용화제, pH 완충제 등 (예컨대, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 아세테이트, 트리에탄올아민 올리에이트 등)을 함유할 수 있다.
경구 제제의 경우, ASO는 단독으로 사용될 수 있거나 적절한 첨가제와 조합하여 정제, 산제, 과립제 또는 캡슐제를 만들도록 사용될 수 있으며, 예를 들어, 통상적인 첨가제, 예컨대, 락토오스, 만니톨, 옥수수 녹말 또는 감자 녹말; 바인더, 예컨대, 결정질 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 아카시아, 옥수수 녹말 또는 젤라틴; 붕해제(disintegrator), 예컨대, 옥수수 녹말, 감자 녹말 또는 소듐 카복시메틸셀룰로오스; 윤활제, 예컨대, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트; 및 요구된다면 희석제, 완충제, 보습제, 방부제 및 향미제와 조합하여 사용될 수 있다.
ASO는 이들을 수용성 또는 비수용성 용매, 예컨대 식물성 또는 다른 유사한 오일, 합성 지방족 산(aliphatic acid) 글리세리드, 고(higher) 지방족 산 또는 프로필렌 글리콜의 에스테르에 용해시키거나, 현탁시키거나 또는 유화시킴으로써 포뮬레이션될 수 있으며; 그리고 요구된다면 통상적인 첨가제, 예컨대 가용화제, 등장화제, 현탁제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 함께 포뮬레이션될 수 있다. 액체의 약제학적으로 관리가능한 조성물은, 예를 들어, 하나 이상의 ASO와 임의적인 약제학적 애쥬번트를 담체 (예컨대, 물, 염분(saline), 수용성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등) 내에 용해시키거나 분산시키는 등에 의해 액제 또는 현탁액을 형성함으로써 제조될 수 있다. 주사용은 통상적인 형태인 액체 액제 또는 현탁액으로, 에멀전으로, 또는 주사에 앞서 액체에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 그러한 비경구 조성물에 함유된 ASO의 비율은 ASO의 활성 및 대상체의 요구 뿐만 아니라, 그들의 특이적인 특성에 매우 의존적이다. 하지만, 액제 내에 0.01% 내지 10%의 유효 성분 비율이 적용될 수 있으며, 만약 조성물이 나중에 상기 비율로 희석될 고체라면 더욱 높아질 것이다. 특정한 구체예에서, 조성물은 약 0.2 내지 2%의 활성 제제 ASO를 액제 내에 포함할 것이다.
ASO 제제는 에어로졸 포뮬레이션으로 이용되어 흡입을 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 ASO는 압축된 허용되는 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등으로 포뮬레이션될 수 있다. 흡입을 통한 전달을 위하여, ASO는 액체 액제, 현탁액, 에어로졸 분사제 또는 드라이 산제로 포뮬레이션될 수 있으며, 투여를 위해 적합한 디스펜서에 적재될 수 있다. 몇몇 유형의 약제학적 흡입 장치들이 있다 - 분무기 흡입기, 정량 흡입기 (MDI) 및 드라이 산제 흡입기 (DPI). 분무기 장치는 치료제 (액체 형태로 포뮬레이션된)가 환자의 기도로 전달되는 미스트(mist)로 분무되도록 하는 고속의 공기 흐름을 만든다. MDI는 전형적으로 압축 가스로 포장된 포뮬레이션이다. 작동 시에, 장치는 압축 가스에 의해 측정된 양의 치료제를 방출하고, 따라서 믿을 만한 정해진 양의 제제의 투여 방법을 제공한다. DPI는 장치에 의한 호흡 동안 환자의 흡기성 공기-흐름 중에 분산될 수 있는 자유 유동성 산제(free flowing powder)의 형태로 치료제를 제공한다. 자유 유동성 산제를 얻기 위하여, 치료제는 부형제, 예컨대 락토오스로 포뮬레이션 된다. 측정된 양의 치료제는 캡슐제 형태로 저장되며, 각각의 작동에 의해 제공된다.
또한, ASO 제제는 다양한 염기를 혼합함으로써, 예컨대 염기 또는 수용성 염기를 유화시킴으로써, 좌제로 만들어질 수 있다. 본 발명의 ASO는 좌제를 통해 직장으로 투여될 수 있다. 좌제는 운반체, 예컨대 코코아 버터, 카보왁스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함할 수 있으며, 체온에서는 녹지만 실온에서는 굳어진다.
일반적으로, 제공된 ASO 제제는 유사한 유용성을 제공하는 ASO 제제에 대한 임의의 용인되는 투여 방식에 의해 치료적 유효량으로 투여될 것이다. 안티센스 올리고머, 즉, 유효 성분의 실제의 양은 다양한 인자, 예컨대 치료될 질환의 중증도, 대상체의 나이 및 상대적인 건강, 사용되는 ASO의 효능, 투여의 경로와 형태 및 다른 인자들에 의존할 것이다. 약제학적 조성물은 하루에 한 번 이상, 예컨대 하루에 한 번 또는 두 번 투여될 수 있다. 특정한 구체예에서, ASO 약제학적 포뮬레이션은 바이러스 하중을 감소시키는 것, 바이러스 항원을 감소시키는 것, 혈청전환을 일으키는 것, 대상체의 면역 반응을 강화시키는 것 및/또는 HBV DNA 수준을 감소시키는 것 및 알라닌 알라닌라아제(ALT) 수준을 정상화시키는 것을 포함하여, 효과적으로 HBV 감염을 치료하기 위하여, 필요에 따라 일주일에 한 번 또는 두 번씩 24주, 36주, 또는 48 주 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다.
경구 또는 직장 투여를 위한 단위 제형, 예컨대 시럽, 엘릭시르(elixir) 및 현탁액이 제공될 수 있으며, 여기서 각각의 투여량 단위, 예를 들어, 찻숟가락으로 하나, 큰숟가락으로 하나, 정제 또는 좌제는 하나 이상의 억제제를 함유하는 미리 정해진 양의 조성물을 함유한다. 유사하게, 주사 또는 정맥내 투여를 위한 단위 제형은 살균수, 생리식염수 또는 또 다른 약제학적으로 허용되는 담체 내의 액제로서 억제제(들)를 조성물 내에 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단위 제형"은 인간 및 동물 대상체에서 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 별개인 단위를 지칭하며, 미리 정해진 양의 본 발명의 화합물을 함유하는 각각의 단위는 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 운반체와 연합하여 원하는 효과를 낳는데 충분한 양으로 계산되었다. 본 발명의 신규한 단위 제형의 사양(specification)은 사용된 특정한 화합물과 달성하고자 하는 효과, 및 숙주 내에서 각각의 화합물과 관련된 약력학에 의존한다.
약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 운반체, 애쥬번트, 담체 또는 희석제는 일반인이 쉽게 이용 가능하다. 또한, 약제학적으로 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절 및 완충제, 긴장성(tonicity) 조절제, 안정화제, 습윤제 등도 일반인이 쉽게 이용 가능하다.
투여량 수준은 특정한 ASO 제제의 기능, 전달 운반체의 특성 등에 따라 달라질 수 있다는 것을 당업자들은 쉽게 인식할 것이다. 주어진 ASO에 대한 바람직한 투여량은 다양한 수단에 의하여 당업들이 쉽게 결정할 수 있다.
본원에서 설명된 ASO 치료제의 투여를 위한 전달 방법의 예들 뿐만 아니라 약제학적 포뮬레이션, 용매화물, 수화물, 염 및 에스테르의 세부 사항들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며 문헌에 설명되어 있다.
유효량의 ASO 억제성 제제는 ASO 제제를 표적 세포로 도입하기 위한 임의의 편리한 프로토콜을 이용하여 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 방법들은 제제의 사용, 예컨대 리포펙타민, 폴리양이온 아민(polycationic amine), 예컨대 스페르민, 스페르미딘 등의 사용 뿐만 아니라, 당업계에서 이용 가능한 표준 프로토콜에 따른 전기천공법, 미세주입법, 리포좀 엔캡슐화 등과 관련된 방법들을 포함한다. 어떤 경우에는 ASO의 표적 세포로의 흡수에 외생성 제제가 필요하지 않다. 유효량의 ASO 제제의 포유류 세포로의 도입은 HBV 하중의 감소, 감소된 HBV DNA, 정상화된 ALT 활성, 혈청전환, 치유 및 개선된 면역 반응을 초래하는 HBV 표적 유전자(들) 발현의 조절, 즉 감소를 야기한다.
결국, 포뮬레이션 및 투여량의 선택은 다양한 인자들, 예컨대 의약 투여 방식 및 의약 물질의 생물학적 이용가능성에 의존한다.
본 발명의 방법은 임의의 포유류 세포에 작용할 것이며, 여기서 관심 있는 대표적인 포유류 세포는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 다음의 세포를 포함한다: 유제류(ungulates) 또는 고창증(hooved) 동물, 예컨대, 소, 염소, 돼지, 양 등; 설치류, 예컨대, 햄스터, 마우스, 랫트 등; 토끼목 포유동물(lagomorph), 예컨대, 래빗; 영장류, 예컨대, 원숭이, 개코원숭이, 인간 등; 기타 같은 종류의 것.
ASO 조성물은 치료적 또는 예방용 제제이면서 대상 화합물과는 상이한 다른 항바이러스 제제와 유리하게 결합되고/거나 함께 사용되고/거나 교대로 사용될 수 있다. 조성물은 또한 본 발명의 화합물에 민감한 바이러스 감염과 흔히 연관된 병태를 치료하는 제제, 예컨대 항-HCV 제제 또는 면역억제제와 유리하게 결합되고/거나 함께 사용될 수 있다. 특정한 구체예에서, 대상 조성물과 결합된 투여는 그러한 제제의 효능을 향상시킨다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 다른 항바이러스 제제와 결합되거나 함께 투여될 때, 특정한 구체예에서, 단독으로 사용될 때 예상되는 양보다 적은 투여량 또는 병용 요법에서 계산된 양보다 적은 투여량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 ASO 및 ASO 조성물은 또한, 저-용량 시클로포스파미드, 티모스티뮬린, 비타민제 및 영양제 (예컨대, 비타민 A, C, E, 베타-카로틴, 아연, 셀레늄, 글루타치온, 코엔자임 Q-10 및 에키나시아를 포함하는 항산화제) 및 항원의 다량체 제시(multimeric presentation)와 애쥬번트를 결합하는 백신 포뮬레이션을 포함하는 백신, 예컨대, 면역자극 복합체 (ISCOM)를 포함하는, 신체의 면역 시스템을 향상시키는 제제와 함께 사용될 수 있다.
당업자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 투여는 치료될 질환 상태의 중증도 및 반응성, 및 수일 내지 수개월간 또는 치유가 되거나 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속되는 치료의 과정에 의존한다. 최적의 투여 일정은 환자의 체내에의 ASO 활성 제제 축적으로부터 계산될 수 있다. 최적의 투여량은 개개의 올리고뉴클레오티드의 상대적인 효능에 의존하여 달라질 수 있다. 일반적으로 이는 생체 외(in vitro) 및 생체 내 동물 모델에서 효과적인 것으로 관찰된 EC50을 기반으로 추산될 수 있다. 일반적으로, 투여량은 체중 1kg당 0.01 μg 내지 1 g 이며, 매일, 매주, 매월 또는 매년 마다 한 번 이상, 또는 매 2년 내지 10년 마다 한 번씩 제공될 수 있거나, 또는 수시간에서 최대 수개월 동안의 지속적인 주입에 의해 제공될 수 있다. 투여의 반복률은 측정된 체액 또는 조직 내 의약의 잔류 시간 및 농도를 기반으로 추산될 수 있다. 성공적인 치료 후에, 질환 상태의 재발을 막기 위해 환자로 하여금 유지 요법을 받도록 하는 것이 바람직할 수 있다. 더욱 특히, 치료의 과정은 약 0.01 μg/kg 체중 내지 약 1 g/kg 체중의 투여량으로 피하 주사로 1주일에 한 번 투여되며 대략 48주 동안 지속될 것이다.
본 발명의 구체예는 본 발명의 하나 이상의 안티센스 올리고머를 유효 성분으로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 희석제를 포함하고 임의적으로 약제학적 담체를 포함하는 것으로 이해되어야 하며, 또한 약제학적 조성물은 임의적으로 추가의 화합물, 예컨대 화학요법 화합물, 항-염증성 화합물, 항바이러스 화합물, 진통제, NSAID, 마취제, 항생제, 항진균 화합물, 항기생충 화합물 및/또는 면역-조절 화합물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 "있는 그대로" 사용될 수 있거나 다양한 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 본원에서-확인된 올리고뉴클레오티드의 원하는 생물학적인 활성을 유지하고 최소의 원하지 않는 독성 효과를 나타내는 염을 지칭한다. 그러한 염의 비제한적인 예들은 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소듐, 칼륨 등과 같은 금속 양이온으로 형성되거나, 암모니아, N,N-디벤질에틸렌-디아민, D-글루코사민, 테트라에틸암모늄 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 양이온으로 형성된 염기 부가 염 및 유기 아미노산으로 형성될 수 있다.
본 발명의 특정한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 프로-드러그의 형태일 수 있다. 자연형에서 보통 포스포에스테르 백본에 의해 연결된 개개의 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 pH 7에서 대부분 탈양성자화된 포스페이트 산소와 함께 존재하며, 따라서 음전하 분자이다. 세포막은 자연에서 친유성이기 때문에, 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수는 보통 중성 또는 친유성 등가물에 비해 감소된다. 한 가지 해결책은 프로-드러그 접근법을 사용하는 것이다 (예컨대, Crooke, R. M. (1998) in Crooke, S. T. Antisense research and Application. Springer-Verlag, Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140을 참고하라).
약제학적으로 허용되는 결합제 및 애쥬번트는 또한 포뮬레이션된 의약의 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 액제, 에멀전 및 리포좀-함유 포뮬레이션을 포함한다. 이러한 조성물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 미리 형성된 액체, 자가-유화 고체 및 자가-유화 반고체를 포함하는 다양한 성분들로부터 생성될 수 있다. ASO 조성물의 조직으로의 전달은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 양이온성 리포좀, 시클로덱스트린, 포피린 유도체, 분지쇄 덴드리머, 폴리에틸렌이민 폴리머, 나노입자 및 미소구체를 포함하는 담체-매개 전달에 의해 향상될 수 있다 (Dass, C R. J Pharm Pharmacol 2002; 54(1):3-27). 편리하게는 단위 제형으로 존재할 수 있는 본 발명의 약제학적 포뮬레이션은 제약 산업 분야에 잘 알려진 통상적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술은 유효 성분을 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)와 연합(association)시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 포뮬레이션은 유효 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분할된 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하게 직접적으로 연합시킴으로써, 그리고 이후 필요하다면 생성물을 성형함으로써(shaping) 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 임의의 많은 가능한 제형들, 예컨대, 이에 제한되는 것은 아니지만, 정제, 캡슐제, 겔 캡슐제, 액체 시럽, 소프트 겔 및 좌제로 포뮬레이션될 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 수용성, 비-수용성 또는 혼합 매질에 현탁액으로서 포뮬레이션될 수 있다. 수용성 현탁액은 예를 들어, 소듐 카복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 추가로 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 활성 의약 물질, 예를 들어, 아스피린, 이부프로펜, 설파제, 항당뇨병제, 항균제 또는 항생제, 및 항암 의약 물질에 컨주게이션될 수 있다. 또한, 본 발명의 ASO 서열은 HIV, HCV 등과 같은 다른 바이러스 감염을 치료하는 데에 유용한 의약 물질 뿐만 아니라 암, 염증, 통증, 세균, 진균 및/또는 기생충 감염, 알코올 중독, 물질 남용, 당뇨병을 치료하는 데에 유용한 의약 물질과 함께 또는 따로 연계된 병용 요법으로 투여될 수 있다.
B형 간염 바이러스 감염의 2가지 일반형이 있다: 급성 및 만성. HBV 감염을 경험했던 대상체는 또한 회복되어 비-증상 보균자가 될 수 있다. 급성 B형 간염은 B형 간염 바이러스에 노출된 개인이 바이러스 감염의 징후 및 증상을 발생시키기 시작할 때 발생한다. 잠복기라 불리는 이러한 시기는 평균 90일이지만, 45일 정도로 짧거나 6개월 정도로 길 수도 있다. 대부분의 사람들의 경우, 이러한 감염은 경증에서 중증의 불편을 야기할 것이지만, 바이러스와 싸우는 데에 성공한 신체의 면역 반응으로 인해 저절로 없어질 것이다. 하지만, 몇몇 사람들, 특히 약화된(compromised) 면역 시스템을 가진 사람들, 예컨대 AIDS로 고통받는 사람들, 화학요법을 받는 사람들, 면역억제제 의약을 복용하는 사람들 또는 스테로이드를 복용하는 사람들은, 급성 HBV 감염의 결과로 아주 심각한 문제를 가지며, 더 나아가 전격성 간 부전과 같은 더욱 심각한 병태를 갖는다.
만성 B형 간염은 개인이 초기에는 급성 감염으로 고통받지만 이후 감염과 싸워 물리질 수 없을 때 발생한다. 질환이 만성이 될지 완전히 해결될지 여부는 대개 감염된 개인의 나이에 의존한다. 출생시 감염된 유아의 약 90%는 만성 질환으로 진행한다. 하지만, 개인의 나이에 따라 만성 감염의 위험은 감소하여 20%-50%의 어린이 및 10% 미만의 청소년(older children) 또는 성인이 급성에서 만성 감염으로 진행할 것이다. 본 발명의 ASO 조성물이 HBV-관련 병태, 예컨대 염증, 섬유증, 경화증, 간암, 혈청 간염 등을 또한 치료할 수 있지만, 만성 HBV 감염이 본 발명의 구체예에 있어서 1차적인 치료 목표이다.
도 1, HBV 감염의 자연사의 요약에 나타난 바와 같이, 만약 환자가 유아기 동안 HBV에 걸린다면, 그 아이가 면역 내성으로 발전하고 병태가 만성 간염으로 진행될 가능성이 95% 있으며; 반면 만약 환자가 성인으로서 HBV에 걸린다면, 병태가 만성이 될 가능성은 단지 5%이다.
만성 HBV 감염에는 4개의 기(phase)가 있다. 첫 번째 기는 높은 HBV DNA 및 정상 알라닌 아미노트랜스퍼라아제 (ALT) 수준과 함께 최소의 섬유증 및 간의 염증이 나타나는 면역 관용기(immune tolerant phase)이다. 두 번째 기는 조직학 상에서 간의 활성 염증을 관찰할 수 있는 면역 제거기(immune clearance phase)이며, 이는 ALT 활성의 변동 수준 및 HBV DNA의 변동 수준을 또한 포함할 수 있다. 감염된 대상체가 조직학 상에서 경증 간염 및 최소의 섬유증을 나타낼 수 있는 세 번째 불활성 보균자 상태기(inactive carrier state phase)가 이어질 수 있다. HBV의 재활성화로 불리는 네 번째도 또한 보고되었다. 이러한 마지막 기는 B형 간염 e 항원 (HBeAg) 음성 및 항-HBeAg 양성에도 불구하고 생검에 의해 관찰되는 간의 활성 염증으로 특징지어진다.
만성 HBV 질환에는 몇 가지 유형이 있다. HBeAg 양성 또는 "야생형" HBV 감염으로 알려진 첫 번째는, 항-HBeAg 음성으로 특징지어지며 HBV DNA > 20,000 IU/mL (> 105 카피/mL)의 양을 나타낸다. HBeAg 음성 또는 "돌연변이 코어" HBV 감염으로 알려진 두 번째는, 항-HBeAg 양성으로 특징지어지며 HBV DNA >2,000 IU/mL (> 104 카피/mL)를 나타낸다. 이러한 두 가지 유형의 만성 HBV 감염 및 역사적으로 권장되는 치료적 접근법은 도 2 및 도 3에 나타나 있다.
도 2는 HBeAg 양성 또는 "야생형" HBV 감염을 나타내는 환자의 카테고리 및 역사적으로 권장되는 치료법을 보여준다. 왼쪽은, HBV DNA 수준이 증가하지 않음을 보증하기 위하여 관찰하는 것 외에는 치료가 권장되지 않는, 20,000 IU/mL (<105 카피/mL) 미만의 HBV 바이러스 DNA 수준을 갖는 환자들이다. 오른쪽은, ≥ 20,000 IU/mL의 HBV 바이러스 DNA 수준을 갖는 환자들이다. 이러한 환자들의 경우, 정상 알라닌 트랜스퍼라아제 (ALT) 활성을 지닌 환자들은 매 3-12개월 마다 ALT 활성에 있어서의 임의의 변화에 대하여 관찰되며, 나이에 따라, 생검을 고려한다. 비록 실제로 현재의 HBV 치료제를 이용하여 20-30% 미만의 환자가 혈청전환을 달성하지만, 높은 ALT 활성을 나타내는 환자들은 혈청전환으로 치료된다. 현재 권장되는 HBV 치료제는 1차 선택으로서 엔테카비르 (ETV) 및 테노포비어 디소프록실 푸마레이트 (TDF) 및 페그-인터페론을 포함한다.
도 3은 HBeAg 음성 또는 "돌연변이 코어" HBV 감염을 나타내는 환자의 카테고리 및 역사적으로 권장되는 치료법을 보여준다. 왼쪽은, HBV DNA 수준이 증가하지 않음을 보증하기 위하여 관찰하는 것 외에는 치료가 권장되지 않는, 2,000 IU/mL (<104 카피/mL) 미만의 HBV 바이러스 DNA 수준을 갖는 환자들이다. 오른쪽은, ≥ 2,000 IU/mL의 HBV 바이러스 DNA 수준을 갖는 환자들이다. 이러한 환자들의 경우, 정상 알라닌 트랜스퍼라아제 (ALT) 활성을 지닌 환자들은 ALT 활성에 있어서의 임의의 변화에 대하여 관찰되며, 생검을 고려한다. 높은 ALT 활성을 나타내는 환자들은, 가능하다면 1차 선택으로서 엔테카비르 (ETV) 및 테노포비어 디소프록실 푸마레이트 (TDF) 및 페그-인터페론을 포함하는 현재의 권장되는 HBV 치료제를 사용하여, HBsAg 혈청전환으로 치료된다.
만성적으로 감염된 환자가 약하거나 감지할 수 없는 CTL 반응을 보이는 반면, 급성 HBV 감염으로 고통받는 환자는 바이러스 항원에 대하여 활발한, 다중클론의, 다중특이적인 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 보인다. 간염은 약한 HBV-특이적 면역 반응이 HBV-감염된 간세포를 파괴하기에 충분히 강하게 활성화될 때 발생한다. T 세포 저반응성(hyporesponsiveness) 또는 내성에 책임 있는 메커니즘에 관해서는 알려진 바가 거의 없지만, 다음의 메커니즘들과 관련 있을 것이라고 생각된다: 음성 선택 (신생아); 면역학적 무지(immunological ignorance); 말초 무반응(peripheral anergy) 또는 공동-자극 분자, 예컨대 조절 T 세포 (Tregs)의 결핍; 고갈 (PD-1의 상향-조절). 이러한 제안된 모든 메커니즘에 있어서 공통되는 인자는 환자 내에 지속되는 높은 수준의 항원이다.
HBV 항원 HBeAg는 분비된, 비-미립자 형태의 HBV 코어 단백질이다. HBV 항원 HBeAg 및 HBcAg는 1차 아미노산 서열을 공유하며, 따라서 T 세포 수준에서 교차반응성을 보인다. 연구들은 이들이 만성 감염의 확립에 필요할 것이라고 제안하였지만, HBeAg는 바이러스 조립체 또는 복제에 필요하지 않다.
WHeAg-음성 돌연변이에 의한 어린 우드척(woodchuck)의 감염은 훨씬 낮은 비율의 만성 WHV 감염을 초래하는 반면 (Cote 등 (2000) Hepatology 31:190), HBeAg-음성 돌연변이에 의한 신생아 감염은 보통 만성 HBV 감염보다는 전격성 급성 감염을 초래한다 (Terezawa 등 (1991) Pediatr. Res. 29:5). HBeAg는 아마 결손 또는 클론 무반응을 통해 코어 특이적인 T 세포를 불활성화시킴으로써 내성원(toleragen)으로서 기능할 수 있다 (Milich 등 (1998) J. Immunol. 160:8102). 항바이러스 요법 및 HBeAg 혈청전환에 있어서, HBV 바이러스 하중 및 항원의 감소와, T 세포에 의한, 활성화된 T 세포의 음성 조절자인 억제성 수용체 예정된 죽음-1 (PD-1; PDCD1로도 알려짐)의 발현의 감소 사이에는 양의 상관관계가 있다 (Evans 등 (2008) Hepatology 48:759).
HBV 표면 항원 또는 HBsAg는 감염성 HBV 바이러스 입자의 엔벨로프 단백질이지만, 또한 HBV 바이러스 입자보다 1000배 높은 혈청 수준을 지닌 비-감염성 입자로서 분비된다. 감염된 사람 또는 동물에서 HBsAg의 혈청 수준은 1000 μg/mL 만큼 높을 수 있다 (Kann 및 Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 9th ed. 745). 급성 HBV 감염에서, 혈청에서 HBsAg의 반감기 또는 혈청 t½은 8.3 일이다 (Chulanov 등 (2003) J. Med. Virol. 69: 313). 골수 수지상 세포에 의한 HBsAg의 내재화는 공동-자극 분자 (즉 B7)의 상향-조절을 억제하고 T 세포 자극 수용능력을 억제하며 (den Brouw 등 (2008) Immunology 126:280), 만성적으로 감염된 환자로부터의 수지상 세포는 또한 HBsAg의 존재 하에서 공동-자극 분자의 발현, IL-12의 분비 및 T 세포 자극의 결손을 보인다 (Zheng 등 (2004) J. Viral 간염 11:217).
CHB 환자로부터의 HBsAg 특이적인 CD8 세포는 변형된 테트라머 결합을 보인다. 이러한 CD8 세포는 무반응성(anergic)은 아니지만 부분적인 내성 또는 무지를 부여하는 TCR 위상(topology)을 가질 수 있다 (Reignat 등 (2002) J. Exp. Med. 195:1089). 게다가, 페그-IFNα2a 치료 중에 24주 째에 혈청 HBsAg > 1 log 의 감소는 지속적인 바이러스학적인 반응 (SVR - 치료 1년 후에 PCR에 의해 검출 불가능한 HBV DNA로 정의됨)에 대하여 높은 예측값 (92%)을 갖는다 (Moucari 등 (2009) Hepatology 49:1151).
중복되는 전염 경로로 인해, 특히 HBV가 풍토병인 아시아 같은 영역에서 많은 사람들이 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 간염 C 바이러스 (HCV) 모두에 노출되어 왔으며, 보다 적은 비율이 두 가지 바이러스에 의해 만성적으로 감염되었다. 추정치는 HCV 감염된 사람의 최대 10%가 HBV도 가지며, 아마도 HBV에 감염된 사람의 20%가 HCV에 공동감염된 것으로 보고 있다. 하지만, B형 간염 또는 HBV-HCV 공동감염된 개인에서 B형 간염의 치료는 잘 연구되어 있지 않다.
HCV 및 HBV가 서로의 복제를 억제하는 것으로 보인다는 사실로 인해 치료가 복잡해진다 (비록 모든 연구가 이러한 상호작용을 관찰한 것은 아니지만). 따라서, HBV를 완전히 억제하는 치료는 잠재적으로 HCV가 다시 나타나도록 허용하거나, 또는 그 반대일 수도 있다.
따라서, 본 발명의 ASO 화합물은 HBV 및 HCV 모두에 감염된 환자를 치료하는 데에 유리하게 사용될 수 있다. 간염 C (HCV)에 대한 예시적인 치료 선택은 인터페론, 예컨대, 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1을 포함한다. 덜 빈번한 인터페론 투여가 페그 인터페론 (약동학적 프로파일을 유의적으로 향상시키는 폴리에틸렌 글리콜 잔기에 부착된 인터페론)을 사용하여 달성될 수 있다. 인터페론 알파-2b (페길화된 및 비페길화된) 및 리바비린을 이용한 병용 요법이 또한 일부 환자 개체군에 효과적인 것으로 나타났다. 현재 개발 중인 다른 제제들은 HCV RNA 복제 억제제 (예컨대, 바이로파마의 VP50406 시리즈), HCV 안티센스 제제, HCV 치료적 백신, HCV 프로테아제 억제제, HCV 헬리카제 억제제 및 HCV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)를 포함한다.
본 발명의 구체예는 HBV 및 HCV로 감염된 대상체를 치료하기 위한 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적인 ASO 화합물을 제공하며, 여기서 ASO 화합물은 HCV 제제와 함께 투여된다. HCV 제제는 ASO 화합물과 동일한 의약 포뮬레이션으로 투여될 수 있거나 독립된 포뮬레이션으로 투여될 수 있다. 더욱이, HCV 화합물은 ASO HBV 화합물과 동시에 투여될 수 있거나, HBV ASO 화합물과 HCV 제제 각각의 투여량이 시간적으로 환자의 신체 내에서 중복되도록 따로 투여될 수 있다. 관련된 구체예에서, HCV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된); 리바비린; HCV RNA 복제 억제제 (예컨대, 바이로파마의 VP50406 시리즈); HCV 안티센스 제제; HCV 치료적 백신; HCV 프로테아제 억제제; HCV 헬리카제 억제제; 및 HCV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)로부터 선택될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 HBV ASO 화합물은 제 2 HBV 치료제와 함께 HBV로 감염된 환자에게 투여될 수 있으며, 여기서 제 2 HBV 치료제는 HBV ASO 화합물과 동일한 의약 포뮬레이션으로 투여될 수 있거나 독립된 포뮬레이션으로 투여될 수 있다. 제 2 HBV 치료제는 ASO HBV 화합물과 동시에 투여될 수 있거나, HBV ASO 화합물과 HBV 치료제 각각의 투여량이 시간적으로 환자의 신체 내에서 중복되도록 따로 투여될 수 있다. 관련된 구체예에서, HBV 치료제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된), 리바비린; HBV RNA 복제 억제제; 제 2 HBV 안티센스 화합물; HBV 치료적 백신; HBV 예방용 백신; 라미부딘 (3TC); 엔테카비르; 테노포비어; 텔비부딘 (LdT); 아데포비어; 및 HBV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)로부터 선택될 수 있다.
도 4는 프리코어 및 코어 단백질, RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 (역전사효소 활성), X 단백질, 및 거대, 중간 및 작은 S 단백질을 포함하는 HBV 게놈에 의해 인코딩되는 주요 전사물들 뿐만 아니라 폴리-A 꼬리, 전사물의 상대적인 길이, 및 거대, 중간 및 작은 S 단백질 전사물의 중복을 보여주는 HBV 전사의 개략도이다. HBV DNA의 양성 및 음성 가닥들이 또한 나타나 있다.
도 5는 HBV 게놈 영역으로 표시한 HBV의 다중 유전자형으로부터의 게놈 DNA의 서열들간 동일성 비율(percent 동일성)을 비교한 전산 생물학 분석을 보여준다. 도 5에서 보여질 수 있는 바와 같이, 서열들간 100% 동일성인 다중 영역들이, 특히 폴리머라제와 거대, 중간 및 작은 S 단백질 전사된 영역에 대하여 확인되었다.
도 6은 다양한 지리적 HBV 유전자형의 표이다. 표에서 보여질 수 있는 바와 같이, 카테고리화된 8가지 상이한 지리적 HBV 유전자형이 있으며, 이들은 이들의 게놈 DNA에 있어서 대략 8%까지 상이하다. 이들의 지리적 분포가 달라지는 것 외에도, HBV 유전자형은 또한 임상적 히스토리 및 인터페론 치료제에 대한 이들의 반응에 있어서도 상이할 수 있다.
확장된 전산 생물학 분석을 사용하여, 도 5에 예시된 것과 유사하게, ~2300 서열들이 분석되었고, 놀랍게도 다양한 유전자형에 걸쳐 >95% 동일성을 지닌 13개의 서열을 확인하였다. 이러한 분석은 유전자형을 넘어 다중 전사 산물과 HBV 게놈의 영역간 >95% 동일성을 보존하고 있는 서열을 각각 표적으로 하는 개개의 안티센스 올리고머 서열의 설계를 가능하게 하였다. 따라서, 본 발명자들은 놀랍게도 그리고 뜻밖에도 개개의 ASO 서열로 다중 전사 산물을 셧다운할 수 있는 방법을 확인하였으며, 모든 지리적 HBV 유전자형에 걸쳐 증가된 활성을 가질 것이다. 이러한 접근법은 약제학적 조성물이 활성 화합물로서 단일 ASO 서열을 포함하도록 허용하며, 이러한 조성물은, HBV DNA 및 HBV 항원 HBeAg 및 HBsAg의 존재에 의해 입증되는 바와 같이, 현존하는 HBV 치료제에 비해 현저히 증가된 효능을 가질 것이고, 저항성을 발달시키는 HBV 균주의 능력을 심각하게 제한할 것이며, 90% 이상 감소된 바이러스 하중을 초래할 것이다. 따라서 본 발명의 약제학적 조성물은 만성 HBV 감염으로 고통받는 환자에게 완전한 혈청전환을 제공하여 결국 만성 HBV 감염의 완전한 치유를 야기할 수 있는 개선된 치료적 치료를 제공할 것이다. 이러한 접근법은 또한 HBV-관련 간 병태, 예컨대 경화증, 간세포 암종 (HCC), 및 섬유증 및 염증을 감소시켜, 보다 적은 간 이식의 요구를 초래하고 간 질환으로부터의 사망을 예방하는 것을 도울 것이다.
또한, 바이러스 하중의 상당히 개선된 감소를 너머, 본 발명의 ASO는 다른 이점들을 제공할 것이다. HBeAg는 면역억제적 역할을 할 것으로 생각되며, HBsAg는 T 세포 고갈에 기여하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 ASO를 이용한 치료는 HBeAg 및 HBsAg 수준을 감소시켜 면역 시스템이 감염을 더욱 잘 조절하도록 함으로써 환자의 면역 반응을 강화시킬 것이다. 간에서의 HBV 항원 제시의 감소는 HBV 감염의 갑작스런 발병(flare-up)의 정도를 최소화하도록 도울 것이며, 면역 시스템 회복의 결과, 이들 모두가 만성 HBV 감염의 완전한 치유의 가능성을 증가시킬 것으로도 예상된다.
표적 세포에서 B형 간염 바이러스 게놈 양을 감소시키기 위한 방법 및 조성물이 제공된다. 대상 방법에서, 표적 세포에서 바이러스 게놈의 양을 감소시키기에 충분한 방식으로, 예컨대, 안티센스 RNA 억제성 제제를 표적 세포에 도입함으로써, 임의의 몇몇 특이적인 HBV 표적 단백질의 발현이 억제된다. 또한 대상 방법을 실행하는 데에 사용하기 위한 약제학적 조성물이 제공된다. 대상 발명의 구체예는 바이러스 매개성 질환 병태, 예컨대, HBV 매개성 질환 병태로 고통받는 대상체의 치료를 포함하는 다양한 응용 분야에의 용도를 발견한다. 그러한 병태는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 섬유증 및 간의 염증, 간 경화증 및 간세포암 (간암)을 포함한다.
본 발명의 구체예는 인간을 포함하는 포유류에서 HBV 감염의 치료를 위한 안티센스 올리고머 (ASOs)를 제공하며, 여기서 ASO는 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적이고, 바이러스 하중 또는 항원 수준을 40% 이상까지, 더욱 바람직하게는 50% 이상까지, 더욱 더 바람직하게는 60% 이상까지, 더욱 더 바람직하게는 70% 이상까지, 더욱 바람직하게는 80% 까지, 가장 바람직하게는 90% 까지 감소시키는 데에 효과적이다. ASO는 잠금 핵산 (LNA) 단위를 포함하여 2개 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있으며, 여기서 LNA 단위는 2'O-알킬-4'C 결합을 가져, 변형된 LNA 뉴클레오시드가 ASO 서열로 편입되는 ASO 내의 위치에 바이시클릭 당을 생성한다.
본 발명의 안티센스 올리고머는, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 인접한 핵산 서열의 일부를 형성하는 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 LNA, 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트를 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 안티센스 올리고머의 서열은 인접한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 서열로 구성된다.
본원에서 사용된 용어 "안티센스"는 핵산 올리고뉴클레오티드 서열이, 5'-말단에서 3'-말단으로 봤을 때, DNA의 센스 가닥에 필수적으로 상보적인 서열을 포함하는 것을 의미한다 - 즉, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 코딩 가닥으로도 알려진 DNA의 센스 가닥과 같이 5'- 에서 3'- 으로 반대의 서열 방향을 가지며, 따라서 안티센스 올리고머는 주어진 DNA 코딩 영역 또는 유전자의 센스 가닥에 필수적으로 상보적이다.
본 발명의 문맥 내에서 용어 "올리고머"와 상호교환적으로 사용되는 용어 "올리고뉴클레오티드" (또는 간단히 "올리고")는 2개 이상의 뉴클레오티드의 공유 결합에 의해 형성되는 분자를 지칭한다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 문맥에 사용될 때 (또한 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로도 지칭됨), 용어 "올리고뉴클레오티드"는, 한 구체예에서, 예를 들어 10개 내지 26개의 뉴클레오티드를 가질 수 있으며, 더욱 특히 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 12개 내지 20개의 뉴클레오티드, 또는 더욱 특히, 14개 내지 18개의 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
용어 "뉴클레오티드"는 3가지 성분, 즉 피리미딘 및 퓨린 염기를 포함하며 가끔 핵염기로 지칭되는 헤테로시클릭 질소성 염기, 5탄당 (리보오스 또는 데옥시리보오스), 및 포스포릴기 (포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포네이트, 등)를 지닌 분자를 지칭한다. 예들은, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA 뉴클레오티드, 예컨대 데옥시아데노신-5'-모노포스페이트 (dAMP), 데옥시구아노신-5'-디포스페이트 (dGDP), 데옥실티미딘-5'-트리포스페이트 (dTTP) 및 데옥시시티딘-5'-트리포스페이트 (dCTP), 및 RNA 뉴클레오티드, 예컨대 아데닌-5'-모노포스페이트 (AMP), 시티딘-5'-디포스페이트 (CDP), 이노신-5'-모노포스페이트 (IMP), 우리딘-5'-트리포스페이트 (UTP) 및 구아노신-5'-트리포스페이트 (GTP)를 포함한다.
본원에서 사용된 뉴클레오티드는 포스페이트 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포네이트, H-포스포네이트, 또는 알킬포스포네이트 유사체를 포함한다. 일부 양태에서, 용어 핵염기는 자연적으로 발생하거나 비-자연적으로 발생할 수 있는 뉴클레오티드를 지칭하는 데에 사용될 수 있다는 것을 인식하여야 하며--이런 점에서 용어 핵염기 및 뉴클레오티드는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 핵염기는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 그 중에서도 구아닌, 시토신, 티민, 아데닌, 우라실, 크산틴, 하이포크산틴, 5,6-디하이드로우라실, 5-플루오로우라실, 5-플루오로티민, N7-메틸구아닌, N7-메틸이노신, 5-메틸시토신 및 5-메틸우라실을 포함한다.
본원에서 제공된 올리고머 화합물은 변형된 당 잔기를 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 모노머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드의 푸라노실 당 고리는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 치환기의 부가, 잠금 핵산 (LNA)을 형성하기 위한 2개의 비-같은자리(non-geminal) 고리 원자들의 가교를 포함하는 많은 방법으로 변형될 수 있다.
특정한 구체예에서, 올리고머 화합물은 LNA인하나 이상의 모노머를 포함한다. 특정한 그러한 구체예에서, LNA는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 하기에 도시된 바와 같이 (A) α-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA, (B) β-D-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA, (C) 에틸렌옥시 (4'-(CH2)2-O-2') LNA, (D) 아미노옥시 (4'-CH2-O-N(R)-2') LNA 및 (E) 옥시아미노 (4'-CH2-N(R)-O-2') LNA를 포함한다.
Figure pct00002
특정한 구체예에서, LNA 화합물은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 당의 4' 및 2' 위치 사이에 1개 이상의 브릿지를 갖는 화합물을 포함하고, 여기서 각각의 브릿지는 독립적으로 -[C(R1)(R2)]n-, -C(R1)=C(R2)-, -C(R1)=N-, -C(=NR1)-, -C(=O)-, -C(=S)-, -O-, -Si(R1)2-, -S(=O)x- 및 -N(R1)- 로부터 독립적으로 선택되는 1개 또는 2 내지 4개의 연결기를 포함하며;
여기서:
x는 0, 1 또는 2이고;
n은 1, 2, 3 또는 4이며;
각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H, 보호기, 하이드록실, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, C5-C7 지환식(alicyclic) 라디칼, 치환된 C5-C7 지환식 라디칼, 할로겐, OJ1, NJ1J2, SJ1, N3, COOJ1, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, CN, 설포닐 (S(=O)2-J1), 또는 설폭실 (S(=O)-J1) 이고;
각각의 J1 및 J2는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 치환된 C1-C12 알킬, C2-C12 알케닐, 치환된 C2-C12 알케닐, C2-C12 알키닐, 치환된 C2-C12 알키닐, C5-C20 아릴, 치환된 C5-C20 아릴, 아실 (C(=O)-H), 치환된 아실, 헤테로사이클 라디칼, 치환된 헤테로사이클 라디칼, C1-C12 아미노알킬, 치환된 C1-C12 아미노알킬 또는 보호기이다.
한 구체예에서, LNA 화합물의 각각의 브릿지는, 독립적으로, -[C(R1)(R2)]n-, -[C(R1)(R2)]n-O-, -C(R1R2)-N(R1)-O- 또는 -C(R1R2)-O-N(R1)-이다. 또 다른 구체예에서, 각각의 상기 브릿지는, 독립적으로, 4'-CH2-2', 4'-(CH2)2-2', 4'-(CH2)3-2', 4'-CH2-O-2', 4'-(CH2)2-O-2', 4'-CH2-O-N(R1)-2' 및 4'-CH2-N(R1)-O-2'-이며, 여기서 각각의 R1은 독립적으로 H, 보호기 또는 C1-C12 알킬이다.
몇몇 LNA들이 제조되었으며 과학 문헌 뿐만 아니라 특허 문헌에 기재되어 있다 (예를 들어, 다음을 참조하라: 그들 전체로서 본원에서 참조로 통합되는 발행된 미국 특허 번호 7,053,207; 6,268,490; 6,770,748; 6,794,499; 7,034,133; 6,525,191; 7,696,345; 7,569,575; 7,314,923; 7,217,805; 및 7,084,125).
또한 본원에서는 그 안에서 리보실 당 고리의 2'-하이드록실기가 당 고리의 4' 탄소 원자에 결합됨으로써 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') 결합을 형성하여 바이시클릭 당 잔기를 형성하는 LNA가 제공된다 (Elayadi 등, Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch 등, Chem. Biol., 2001, 8 1-7; 및 Orum 등, Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243 에서 검토됨; 또한 미국 특허: 6,670,461을 참조하라). 결합은 2' 산소 원자와 4' 탄소 원자를 가교시키는 메틸렌기 (-CH2-)일 수 있으며, 이 경우 용어 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA가 바이시클릭 잔기에 대하여 사용될 수 있고; 이 위치에서 에틸렌기의 경우에는, 용어 에틸렌옥시 (4'-CH2CH2-O-2') LNA가 사용된다 (Singh 등, Chem. Commun., 1998, 4, 455-456: Morita 등, Bioorganic Medicinal Chemistry, 2003, 11, 2211-2226). 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA 및 다른 바이시클릭 당 유사체는 상보적인 DNA 및 RNA와 함께 매우 높은 이중가닥 열적 안정성 (Tm = +3 내지 +10 ℃), 3'-핵산말단(exonucleolytic) 분해에 대한 안정성 및 우수한 용해도 특성을 보인다. LNA를 포함하는 효력있는 그리고 비독성인 안티센스 올리고뉴클레오티드가 기술되어 있다 (Wahlestedt 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638).
또한 논의되었던 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA의 이성질체는 3'-엑소뉴클레아제에 대하여 우수한 안정성을 갖는 것으로 나타난 알파-L-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA이다. 알파-L- 메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA는 안티센스 갭머(gapmer) 및 효력있는 안티센스 활성을 나타낸 키메라로 편입되었다 (Frieden 등, Nucleic Acids Research, 2003, 21, 6365-6372).
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA 모노머 아데닌, 시토신, 구아닌, 5-메틸-시토신, 티민 및 우라실의 올리고머화와 함께 이들의 합성 및 제조, 및 핵산 인식 특성이 기술되어 있다 (Koshkin 등, Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630). LNA 및 이의 제조는 또한 본원에서 참조로 통합되는 WO 98/39352 및 WO 99/14226에 기술되어 있다.
메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA, 포스포로티오에이트-메틸렌옥시 (4'-CH2-O-2') LNA 및 2'-티오-LNA의 유사체들이 또한 제조되었다 (Kumar 등, Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222). 올리고데옥시리보뉴클레오티드 이중가닥을 핵산 폴리머라제의 기질로서 포함하는 잠금 뉴클레오시드 유사체의 제조가 또한 기술되어 있다 (Wengel 등, WO 99/14226). 또한, 2'-아미노-LNA의 합성, 신규한 형태학적으로 제한된 고-친화성 올리고뉴클레오티드 유사체가 당업계에 공지되어 있다 (Singh 등, J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039). 또한, 2'-아미노- 및 2'-메틸아미노-LNA가 제조되었으며 이들의 상보적인 RNA 및 DNA 가닥과의 이중가닥의 열적 안정성이 이전에 보고된 바 있다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고머는 2개 이상의 LNA 모노머를 포함할 것이며, 더욱 특히 안티센스 올리고머는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 LNA 모노머를 포함할 것이다. 하기에 설명되는 바와 같이, 인접한 뉴클레오티드 서열은 LNA 및 DNA 단위들로 구성될 수 있거나 (결합기, 예컨대 포스포로티오에이트 결합을 포함함), LNA 및 다른 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체들로 구성될 수 있다. 일부 구체예에서, 인접한 뉴클레오티드 서열은 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 DNA 뉴클레오티드, LNA 단위와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 뉴클레오티드의 나머지를 포함할 수 있다.
특정한 구체예는 서열로 편입된 LNA 뉴클레오티드와 함께 10 내지 100개의 뉴클레오티드 길이의 ASO를 제공한다. 특정한 구체예는 5'- 에서 3'- 방향으로 연속적으로, 4개의 LNA 뉴클레오티드, 8개의 비-LNA 갭 뉴클레오티드 (nt), 4개의 LNA 뉴클레오티드에 상응하는 4-8-4 패턴을 갖는 ASO를 제공한다. 따라서, 4LNA-8nt-4LNA 모티프는 8개의 연속적으로 연결된 2'-데옥시뉴클레오티드를 갖는 중심 뉴클레오티드 (nt) 갭 분절을 포함한다. 4LNA-8nt-4LNA 16-머 ASO 내의 nt 갭 분절은 날개 분절에 의해 양쪽 측면 (5' 및 3')에 배치되어 있다. 각각의 ASO 내의 각각의 날개 분절은 4개의 연속적으로 연결된 뉴클레오티드를 갖는다. 각각의 ASO 내의 각각의 날개 분절의 각각의 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 당 변형을 갖는다. 비록 본 발명의 일부 ASO 상의 일부 인터뉴클레오티드 결합이 포스포에스테르결합을 포함하는, 포스포로티오에이트 외의 결합일 것으로 예상되었지만, 각각의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 각각의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 (P=S) 결합이다. 제공된 ASO의 LNA 모티프가 4LNA-8nt-4LNA에서부터 보다 길거나 짧은 전체 뉴클레오티드 서열의 LNA-nt-LNA 모티프의 다른 조합들을 포함하는 다른 모티프까지로 달라질 수 있음이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 특정한 구체예는 다양한 다른 "날개-갭-날개" 패턴의 ASO를 제공한다. "날개-갭-날개" 패턴은 흔히 "X-Y-Z"로 기술되며, 여기서 "X"는 5' 날개 영역의 길이를 나타내고, "Y"는 갭 영역의 길이를 나타내며, "Z"는 3' 날개 영역의 길이를 나타낸다. 일부 구체예에서 X 및 Z는 동일하며, 다른 구체예에서는 이들은 상이하다. 특정한 구체예에서, X 및 Z는 독립적으로 1 내지 5개의 뉴클레오시드 길이이다. 특정한 구체예에서, Y는 8 내지 12개의 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명의 ASO는 또한 10-머, 11-머, 12-머, 13-머, 14-머, 15-머, 16-머, 17-머, 18-머, 19-머, 또는 20-머 (즉, 각각 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개의 뉴클레오티드를 갖는 올리고머) 또는 그 이상, 최대 100개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 다른 특정한 구체예는 전술한 바와 같이 다른 가능한 대안적인 패턴 내의 서열로 편입된 LNA를 지니는 10개 내지 최대 100개의 뉴클레오티드 길이의 ASO를 제공한다. 다른 특정한 구체예에서, 본원에서 설명된 5'-LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-Nl-P-LNAr-P-LNAq-3' (화학식 1)의 일반 화학식이 전체 길이 10개 내지 20개의 뉴클레오티드인 특정한 ASO 범위 내에서 가능하도록 주어진 서열 내에 하나 이상의 LNA-nt-LNA 모티프가 있을 수 있다.
특정한 구체예에서, 안티센스 올리고머 서열 내의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, H-포스포네이트 또는 알킬포스포네이트 결합으로부터 선택된다. 추가의 특정한 구체예에서, 모든 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 결합이다.
더욱 특정한 구체예에서, 안티센스 올리고머 서열 내의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포에스테르결합 및 포스포로티오에이트 결합으로부터 선택된다.
더욱 특정한 구체예에서, 안티센스 올리고머는 2개 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 특히 2개 이상의 잠금 핵산 (LNA) 단위를 포함하며, 여기서 LNA 단위는 2'O-알킬-4'C 결합을 갖는다.
특정한 구체예는 ASO가 하기 화학식 1로 설명되는 서열을 포함하도록, ASO의 3'-말단 및 5'-말단 쪽에 위치한 2개 이상의 LNA 단위를 포함하는 안티센스 올리고머를 제공하며, 더욱 특히 ASO는 ASO의 3'-말단 및 5'-말단 쪽에 위치한 3개 이상의 LNA 단위를 포함하고, 더욱 특히 ASO는 4개 이상의 LNA 단위를 포함하며, 그리고 더욱 특히 4개 이상의 LNA 단위가 ASO는 ASO의 3'-말단 및 5'-말단 쪽에 위치한다:
5'-LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-Nl-P-LNAr-P-LNAq-3' (화학식 1)
여기서,
LNA는 2'-O-Me-4'C 결합을 갖는 잠금 핵산 단위이고;
P는 P는 화학식 (1)의 서열의 5'에서 3' 방향으로 LNA와 인접한 N 사이, 또는 N과 인접한 N 사이, 또는 N과 인접한 LNA 사이, 또는 LNA와 인접한 LNA 사이의, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, H-포스포네이트, 또는 알킬포스포네이트 결합으로부터 선택되며; 여기서
N은 G, C, A, T, U 또는 X 뉴클레오티드 단위로부터 선택되고;
n 및 r 및 p 및 q는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3으로부터 선택되는 정수이며;
l 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 22의 정수이고;
여기서 X는 이노신, N7-메틸이노신, N7-메틸 구아니딘, 5-메틸 우리딘, 5-메틸-티미딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로티미딘으로부터 선택된다.
관련된 특정한 구체예에서, 안티센스 올리고머는 6개 이상의 포스포로티오에이트 결합을 포함한다. 또 다른 관련된 특정한 구체예에서, 안티센스 올리고머는 모든 포스포로티오에이트 결합을 포함한다.
또 다른 구체예에서, HBV 감염을 치료하고 인간을 포함하는 포유류에서 혈청전환을 촉진하기 위하여 효과적인 양의 본 발명의 안티센스 올리고머를 투여하는 단계를 포함하는 인간을 포함하는 포유류에서 HBV 감염의 치료 방법이 제공되며, 상기 안티센스 올리고머는 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적이다. 효과적인 양은 0.01 mg/kg 체중 내지 대략 100 mg/kg 체중의 범위일 수 있으며, 의사에 의해 지시된 바에 따라 매주 1회 또는 2회씩, 24주, 36주 또는 48주, 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 치료의 효능은 바이러스 하중 또는 다른 감염의 증거들의 정량을 이용하여, 예컨대 HBeAg, HBsAg, HBV DNA 수준, ALT 활성 수준, 혈청 HBV 수준 등의 측정을 통해, 이로 인해 치료 용량, 치료 빈도 및 치료 길이의 조절을 허용함으로써 측정될 수 있다.
실시예
올리고머의 제조
LNA 모노머 및 올리고뉴클레오티드 합성은, 두 문헌 모두 본원에서 참조로 통합되는 WO2007/112754에 언급된 방법론 및 US20090143326으로 발행된 미국 특허 출원에 설명된 방법론을 포함하여, 공개된 특허 출원 및 문헌에 기술된 바와 같이 제조된다. LNA ASO는 또한 본원에서 설명된 바와 같이, 예를 들어, 엑시콘(Exiqon)으로부터 구매될 수 있다.
LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 (인간 HBV 게놈의 서열번호 1 내지 13을 표적으로 하는)를 이용한 생체 외 세포의 치료는 본원에서 참조로 통합되는 WO2007/112754에 언급된 방법론을 이용하여, 또한 본원에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 생체 외 및 생체 내 모델 모두에서 RNA 특이적인 실시간 정량 PCR에 의한 HBV 감염의 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제 분석이 또한 본원에서 참조로 통합되는 WO2007/112754에 언급된 방법론을 이용하여, 또한 본원에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 또한, 10개 내지 100개의 뉴클레오티드 길이의 본 발명의 안티센스 올리고머를 이용한 생체 내 실험, (인간 HBV 게놈의 서열번호 1 내지 13를 겨냥함), HBV 발현 표적화 및 이후의 분석이, 예를 들어, 모두 본원에서 참조로 통합되는 WO2007/112754, 또는 J. Virol (1998) vol. 71, pp 2630-2637; 또는 Yonsei Medical Journal (1995), col. 36, pp. 527-533에 기술된 방법을 이용하여 수행될 수 있다. HBV의 우드척 모델이 또한 개발되었으며, 여기서 우드척(마르모토 모낙스: Marmoto monax)은 인간 HBV 감염의 많은 측면의 모델이 되는 만성 또는 급성 감염을 초래하는 우드척 간염 바이러스 (WHV)로 감염될 수 있다 [본원에서 참조로 통합되는, Menne S 및 Cote PJ (2007) World J Gastroenterol 13, 104-124 및 Menne S 등 (2002) Intervirology 45, 237-250]. Menne 및 Cote 및 Menne 등에 의해 기술된 우드척 모델이 만성 감염을 시험하고 블랏 서던 혼성화(blot Southern hybridization)를 이용하여 혈청 내 바이러스 DNA를 측정하며 ELISA에 의해 혈청 내 바이러스 항원을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
생물학적인 활성
(A) 인간 B형 간염 결과
실시예 1: HepG2 2.2.15 세포에서 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 B형 간염 바이러스 발현의 안티센스 억제
잠금 핵산 올리고뉴클레오티드를 엑시콘으로부터 구입하였다. 테스트된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 각각 4LNA-8nt-4LNA 모티프를 지니고 각각 8개의 연속적으로 연결된 2'-데옥시뉴클레오티드를 갖는 중심 뉴클레오티드 (nt) 갭 분절을 포함하는 전체 길이 16개의 뉴클레오티드였다. 각각의 16-머 ASO 내의 nt 갭 분절은 날개 분절에 의해 양쪽 측면 (5' 및 3')에 배치되어 있다. 각각의 ASO 내의 각각의 날개 분절은 4개의 연속적으로 연결된 뉴클레오티드를 갖는다. 각각의 ASO 내의 각각의 날개 분절의 각각의 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 당 변형을 갖는다. 비록 본 발명의 일부 ASO 상의 일부 인터뉴클레오티드 결합이 포스포에스테르결합을 포함하는, 포스포로티오에이트 외의 결합일 것으로 예상되었지만, 각각의 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 각각의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 (P=S) 결합이다. 제공된 ASO의 LNA 모티프가 4LNA-8nt-4LNA에서부터 보다 길거나 짧은 전체 뉴클레오티드 서열의 LNA-nt-LNA 모티프의 다른 조합들을 포함하는 본원에서 기술된 다른 모티프까지로 달라질 수 있음이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. HBsAg, HBeAg 및 HBV DNA의 수준을 측정함으로써 결정되는, 인간 간모세포종 세포주 HepG2.2.15에서 B형 간염 바이러스 발현을 억제하는 16-머 LNA ASO의 능력을 평가하였다.
모든 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합을 함유하고, 16개의 뉴클레오티드 길이였으며, 말단에 4개의 뉴클레오티드 및 3'-말단에 4개의 뉴클레오티드의 LNA를 포함하는 4-8-4 모티프의 잠금 핵산을 함유하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 서열들을 (서열번호 14 내지 23로서 본원에서 참조로 통합됨) 표 1에 나타내었다.
표 1. 안티센스 올리고뉴클레오티드
명칭 서열 HBV 표적 서열 수납 U95551 IC50 값 (nM) 0.6 nM에서 HBV DNA 억제
HBsAg HBeAg cytotox
RH1 (서열번호 14) GAGAGAAGTCCACCAC nt 258-273 1.31 1.35 23.6 34%
RH2 (서열번호 15) TGAGAGAAGTCCACCA nt 259-274 1.06 0.97 8.7 -21%
RH3 (서열번호 16) GAGGCATAGCAGCAGG nt 414-429 1.10 1.16 39.3 26%
RH4 (서열번호 17) TGAGGCATAGCAGCAG nt 415-430 1.04 0.97 19.9 34%
RH5 (서열번호 18) GATGAGGCATAGCAGC nt 417-432 0.92 0.88 9.8 26%
RH6 (서열번호 19) GATGGGATGGGAATAC nt 602-617 1.46 0.62 14.3 30%
RH7 (서열번호 20) GGCCCACTCCCATAGG nt 639-654 0.90 0.49 22.4 40%
RH8 (서열번호 21) AGGCCCACTCCCATAG nt 640-655 1.84 1.27 9.0 -40%
RH9 (서열번호 22) CTGAGGCCCACTCCCA nt 643-658 1.13 0.91 8.1 22%
대조군 (서열번호 23) GTGTAACACGTCTATA 5.04 5.77 17.8 -51%
HBV 유전자의 헤드-투-테일(head-to-tail) 다이머(dimmer)를 지닌 플라스미드로 안정되게 형질감염된 인간 간모세포종 세포주 HepG2 2.2.15 세포의 단층을 RPMI (인비트로젠(Invitrogen) #22400-089), 10% FBS, 겐타마이신 (10 μg/ml), 37 ℃, 5% CO2 에서 성장시키고, 융합 시에 1:3으로 나누었다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 원액을 살균수에서 제조하고, 형질감염을 위하여 4.25 μM의 농도로 희석하였다. 10 μL의 올리고뉴클레오티드를 130 μL의 Opti-Mem (인비트로젠)과 혼합하였다. 100 μL의 올리고뉴클레오티드 혼합물을 100 μL 리포펙타민 2000 (인비트로젠)과 혼합하고 20 분간 실온에서 배양하였다. 70 μL를 140 μL의 Opti-Mem으로 희석함으로써 연속 희석을 수행하였다. 50 μL의 희석된 혼합물을 96-웰 플레이트에 첨가하였고, 100 μL의 HepG2 2.2.15 세포를 2.8 X 105/mL 농도로 첨가하였다. 형질감염된 세포를 37 ℃, 5% CO2 에서, 2일 째에 배지를 교환하여 4일간 배양하였다. 4일 째에 분비된 HBsAg, HBeAg 및 HBV DNA의 평가를 위하여 상청액을 제거하였고, 제조자의 지시에 따라 CellTiter-Glo (프로메가: Promega)를 이용하여 남아있는 세포 단층 상에서 세포 생존도를 측정하였다. 제조자의 지시에 따라 Abazyme HBV s Ag 키트 (카탈로그 # EL10018)를 이용하여 HBsAg 수준을 측정하였다. 제조자의 지시에 따라 BioChain HBV e Ag 키트 (카탈로그 #KO31006096)를 이용하여 HBeAg 수준을 측정하였다.
상청액 내 HBV DNA의 분석을 위하여, 제조자의 지시에 따라 QiaAmp 96 DNA 혈액 키트 (퀴아젠: Qiagen)를 이용하여 50 μL의 상청액으로부터 DNA를 추출하였다. 5 μL의 DNA를 프라이머와 설명된 조건들을 이용한 TaqMan 분석에 사용하였다 [Thimme R 등 (2003) J. Virol. 77, 68-76]. HBV DNA의 플라스미드 클론의 알려진 양에 기초한 표준 곡선을 사용하여 배지 내에 분비된 HBV 게놈 당량(equivalent)을 계산하였다.
올리고뉴클레오티드의 부재 하에 형질감염 절차를 거친 세포로부터의 값을 이용하여 세포 생존의 억제, HBV DNA 및 분비된 항원을 정상화시켰다. 비선형 회귀에 의해 데이터를 분석하였고 GraphPad Prism5를 이용하여 데이터를 로그(억제제) 대 반응 곡선으로 맞추었다.
안티센스 올리고머를 이용한 HepG2 2.2.15 세포의 치료 결과가 표 1에 나타나 있다. HBV 서열에 대하여 유도된 모든 안티센스 올리고머들은 대조군 올리고머의 효능보다 큰 효능을 갖는 HBsAg 및 HBeAg의 생산 및 분비를 억제하였다. 대조군 올리고머도 또한 항원의 생산 및 분비를 억제하였지만, 항원 억제와 세포독성의 IC50 값 사이에는 단지 3배의 차이만 있었기 때문에, 이는 세포독성 때문일 수 있다. HBV 서열에 대하여 유도된 안티센스 올리고머들은 항원 억제와 세포독성의 IC50 값 사이에 보다 큰 배수 차이를 가졌다. 안티센스 올리고머 RH1, RH3, RH4 및 RH7은 가장 큰 배수 차이를 가졌으며, 분비된 HBV DNA의 일관된 억제를 또한 보였다. HBV DNA의 억제는 50% 넘게 증가하지 않았으며, 따라서 IC50 값은 계산하지 않았다. 표 1에 나타난 것은, 어떠한 올리고머에 대해서도 세포독성이 관찰되지 않았고 HBsAg 및 HBeAg의 억제에 대한 IC50 값에 가까운 농도인 0.6 nM 올리고머 농도에서 HBV DNA의 % 억제이다.
실시예 2: HepAD38 ( Tet - HBV ) 세포에서 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 B형 간염 바이러스 또는 SV40 T 항원 발현의 안티센스 억제
HBV를 표적으로 하는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를, 서열번호 4로 인용된 DNA 서열 및 유전자은행(GENBANK) 수납 번호 U95551.1에 상보적인, 본원에서 서열번호 16으로 편입된 서열 GAGGCATAGCAGCAGG (서열번호 16)로 디자인하였다. LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 4-8-4 LNA 모티프를 지닌 전체 길이 16개의 뉴클레오티드이고, 여기서 ASO는 8개의 연속적으로 연결된 2'-데옥시뉴클레오티드를 갖는 중심 갭 분절을 갖는다. 갭 분절은 날개 분절에 의해 양쪽 측면 (5' 및 3')에 배치되어 있다. 각각의 날개 분절은 4개의 연속적으로 연결된 뉴클레오티드를 갖는다. 각각의 날개 분절의 각각의 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA) 당 변형을 갖는다. LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드 전체에 걸쳐 각각의 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 (P=S) 결합이다. LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다. HepAD38 세포에서 HBV mRNA를 감소시키는 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가하였다.
전기천공법을 이용하여, 대략 24시간 동안, 741 nM, 2,222 nM, 6,667 nM 및 20,000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 HepAD38 세포를 형질감염시켰다. RNA를 세포로부터 분리하였고, 정량 실시간 PCR을 이용해 HBV mRNA 수준을 측정하였다. RIBOGREEN에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 HBV mRNA 수준을 조정하였다. 프라이머 프로브 세트 RTS3372 (본원에서 서열번호 24로 디자인된 정방향 서열 ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT; 본원에서 서열번호 25로 디자인된 역방향 서열 CGACGCGGCGATTGAG, 본원에서 서열번호 26으로 디자인된 프로브 서열 AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG)를 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 데이터는 표 2에 나타나 있으며, 비처리 세포에 비교한 mRNA 수준의 퍼센트 억제로 표시하였다. LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HBV mRNA 수준을 용량-의존적 방식으로 감소시켰다.
LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 또한 동일한 조건에서 프라이머 프로브 세트 RTS3373MGB (본원에서 서열번호 27로 디자인된 정방향 서열 CCGACCTTGAGGCATACTTCA; 본원에서 서열번호 28로 디자인된 역방향 서열 AATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACA, 본원에서 서열번호 29로 디자인된 프로브 서열 TTAAAGACTGGGAGGAGTTG)를 사용하여 테스트하였다. 결과는 표 3에 비처리 대조군 세포에 상대적인 HBV의 퍼센트 억제로서 나타나 있다. 표 3에 예시된 바와 같이, LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HBV mRNA 수준을 용량-의존적인 방식으로 감소시켰다.
Figure pct00003
Figure pct00004
실시예 3: THT1 세포 발현에서 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용한 B형 간염 바이러스 또는 SV40 T 항원 발현의 안티센스 억제
HepG2 2.2.15 세포로도 알려진 THT1 세포에서 HBV mRNA를 감소시키는 실시예 3에서 설명된 LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드의 능력을 평가하였다. 전기천공법을 이용하여, 대략 24시간 동안, 741 nM, 2,222 nM, 6,667 nM 및 20,000 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이러한 세포들을 형질감염시켰다. RNA를 세포로부터 분리하였고, 정량 실시간 PCR에 의해 HBV mRNA 수준을 측정하였다. RIBOGREEN에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 HBV mRNA 수준을 조정하였다. 데이터는 표 4에 나타나 있으며, 비처리 세포에 비교한 mRNA 수준의 퍼센트 억제로 표시하였다. 표 4에 나타난 바와 같이, LNA 안티센스 올리고뉴클레오티드는 HBV mRNA 수준을 용량-의존적 방식으로 감소시켰다.
Figure pct00005
(B) 동물 모델에서 안티센스 올리고머의 평가
실시예 4: 트랜스제닉 마우스에서 HBV 하중을 감소시키는 ASO 유효성의 평가
HBV 트랜스제닉 마우스 계통 1.3.32 (공식 명칭, Tg[HBV 1.3 genome]Chi32)가 동물 모델에서 HBV 하중을 감소시키는 안티센스 올리고머 유효성을 평가하는 데에 사용된다. 트랜스제닉 마우스는 세포병리학의 어떠한 증거도 없이 간과 신장에서 HBV를 높은 수준으로 복제한다. 계통 1.3.32는 C57BL/6 모균주에 대한 반복적인 여교배(backcrossing)에 의해 확대되며 이후 한 세대를 B10D2 마우스와 교배시켜 기술되는 모든 분석법에 사용될 F1 잡종을 생산한다. 마우스는 나이 (6 내지 10주), 성별 (수컷), 및 혈청 내 B형 간염 표면 항원 (HBsAg)의 수준 (Abbott Laboratories (Abbott Park, IL)로부터 상업적으로 이용가능한 키트를 이용해 측정됨)에 따라 짝지어진다.
(A) HBV 트랜스제닉 마우스는 HBV DNA 올리고머로 정맥내 또는 피하 투여에 의해 7일 내지 21일 동안 처리하고, 이후 희생시킨다. 이후 HBV DNA 및 RNA 수준의 감소의 분석을 위하여 마우스의 간을 분석한다. 서던 블랏 방법 또는 실시간 QPCR을 사용하여 DNA 수준을 측정하며, 노던 블랏 방법 또는 실시간 QPCR 방법을 사용하여 HBV RNA 전사물 수준을 측정한다. HBeAg 및 HBsAg에 대한 상업적으로 이용가능한 ELISA 키트를 사용하여 HBeAg 및 HBsAg의 생산 수준의 분석을 위하여 마우스 혈청을 또한 분석한다.
DNA를 다음 절차에 따라 서던 블랏으로 분석하고 32P-표지된 HBV DNA 프로브로 탐색한다. HBV-감염된 간세포로부터의 DNA를 추출하고, 아가로스 겔에서 전기영동에 의해 분리하고, 당업자에게 일반적인 방법론을 이용하여 니트로셀룰로오스 필터 상으로 옮긴다. 32P-틈 번역된-HBV DNA 프로브를 사용한다. 바이러스 대조군에서, 2, 6, 8, 10, 14, 18 및 20일 째에 간을 수집하였다. 의약 처리군에서, 8, 14 및 20일 째에 간을 수집하였다. 간 샘플들을 용해 버퍼를 함유하는 미세원심분리기 튜브에서 잘 맞는 막자로 간다. 5 내지 10분간 실온에서 배양한 후에, 보관을 위해 튜브를 액체 질소에서 스냅-동결(snap-frozen)시킨다. 페놀/클로로폼 추출 및 에탄올 침전을 이용해 DNA를 정제한다. 전이유전자(transgene) 내부를 자르지 않은 Hind III로 잘린 간 DNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분별하고, 이후 알칼린 전이(transfer) 방법을 이용한 니트로셀룰로오스 또는 다른 적절한 막과의 서던 블랏 혼성화를 위해 처리한다.
RNA를 다음 절차에 따라 노던 블랏으로 분석하고 32P-표지된 HBV DNA 프로브로 탐색한다. RNA 추출을 위해 제조자의 프로토콜에 따라 Trizol 시약을 사용하여 간 샘플을 처리한다. 간단하게, 조직 샘플들은 50 내지 100 mg의 조직 당 1 ml의 TRIZOL 시약 내에서 유리-테플론 또는 파워 균질기 (예컨대 Polytron, Tekmar's TISSUEMIZER)를 사용하여 균질화된다. 균질화된 샘플을 5분간 실온에서 배양한 후에 세포 잔해를 제거하기 위해 원심분리한다. 상청액을 새로운 튜브로 옮긴다. 1 ml의 TRIZOL 시약 당 0.2 ml의 클로로폼을 첨가한다. 샘플 튜브를 단단히 씌운다(cap). 샘플을 힘차게 15초 동안 볼텍싱하고, 이들을 실온에서 2 내지 3분간 배양한다. 샘플을 단지 12,000 x g 으로 15분간 2 내지 8℃에서 원심분리한다. 내부 층을 흩뜨리지 않고 조심스럽게 상부의 수층(aqueous phase)을 새 튜브로 옮긴다. 수층의 부피를 측정한다 (수층의 부피는 균질화에 사용된 TRIZOL 시약 부피의 약 60% 이다). 이소프로필 알코올과 혼합함으로써 수층으로부터 RNA를 침전시킨다. 초기 균질화에 사용된 1 ml의 TRIZOL 시약 당 0.5 ml의 이소프로필 알코올을 사용한다. 샘플을 15 내지 30℃에서 10분간 배양하고 단지 12,000 x g 으로 10분간 2 내지 4℃에서 원심분리한다. 보통 원심분리 전에는 보이지 않는 RNA 침전물은 튜브의 측면 및 바닥에 겔-유사 펠렛을 형성한다. 상청액을 완전히 제거한다. RNA 펠렛을 초기 균질화에 사용된 1 ml의 TRIZOL 시약 당 최소한 1 ml의 75% 에탄올을 첨가한 75% 에탄올로 1회 세척한다. 볼텍싱으로 샘플을 혼합하고 단지 7,500 x g 으로 5분간 2 내지 8 ℃에서 원심분리한다. 상기 세척 과정을 1회 반복한다. 모든 남은 에탄올을 제거한다. RNA 펠렛을 5 내지 10분간 대기-건조 또는 진공 건조시킨다. 피펫 팁을 통해 용액을 몇차례 통과시킴으로써 RNA를 DEPC-처리된 물에 용해시킨다. RNA를 포름알데히드 아가로스 겔에 용해시키고 니트로셀룰로오스 또는 다른 적절한 막으로 옮긴다. 32P-틈 번역된-HBV DNA 프로브를 HBV 전사물을 검출하는 데에 사용한다.
테스트된 의약은 0 (활성 없음) 에서부터 ++++ (높은 활성)까지의 척도로 점수화하였다.
실시예 5: WHV 로 감염된 우드척을 이용한 안티센스 올리고머의 평가.
우드척 (Marmoto monax)은 인간 HBV 감염의 많은 측면의 모델이 되는 만성 또는 급성 감염을 초래하는 우드척 간염 바이러스 (WHV)로 감염될 수 있다 [Menne S 및 Cote PJ (2007) World J Gastroenterol 13, 104-124]. 만성 감염은 WHV7P1로의 신생아 감염에 의해 확립될 수 있다. 혈청 내 바이러스 DNA는 도트 블랏 서던 혼성화에 의해 측정될 수 있으며, 혈청 내 바이러스 항원은 ELISA에 의해 측정될 수 있다 [Menne S 등 (2002) Intervirology 45, 237-250].
WHV의 DNA 서열은 HBV와는 상이하며, 따라서 안티센스 올리고머는 WHV에 최적화될 필요가 있을 것이다. 이러한 목적을 위하여 siRNA의 평가를 위해 이전에 사용되었던 생체 외 시스템이 존재한다 [Meng Z 등 (2009) Virology 384, 88-96].
WHV로 만성적으로 감염된 우드척은 정맥내 또는 피하 투여에 의해 안티센스 올리고머로 처리된다. 투여 요법(dosing regimen)은 우드척에서 안티센스 올리고머의 간내 반감기의 앞선 측정에 의존할 것이지만, 매주 1회 또는 2회일 것이다. 치료 기간은 ≥ 6개월간일 것이다. 바이러스 DNA, 바이러스 항원, 및 바이러스 항원에 대한 항쳉의 혈청 수준은 치료 동안 및 3개월 이상의 후속-치료 동안 정기적으로 측정될 것이다. 후속 관찰기간(follow-up period) 전반에 걸친 지속적인 바이러스 DNA 및 바이러스 항원의 감소는 양성의 결과를 나타낸다. WHV로 만성적으로 감염된 우드척의 효력있는 뉴클레오시드 유사체에 의한 장기적인 치료는 치료 중단 1 내지 2개월 내에 바이러스 재발을 초래한다. 바이러스 항원의 손실 및 항원에 대한 항체의 발생으로 정의되는 WHV DNA 및 혈청전환의 감소는 또한 양성의 치료 결과를 나타낸다.
HBV 감염된 환자의 테스트를 목적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 화합물들은, 하기에 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적이다. 이러한 서열들은 도 6에 열거된 HBV 인간 지리적 유전자형 A 내지 H의 95% 초과에 걸쳐 보존된다.
C형 간염 바이러스 (HCV)의 치료를 위해 LNA 안티센스 올리고머를 이용하여 수행된, 전신성 부작용이 관찰되지 않은 (공개되지 않은 결과) 유사한 치료법에 근거할 때, 인간에 대한 치료 요법은 전형적으로 48 주이며, 이는 페그-IFN (48주 동안 매주 SC 주사)에 사용된 것과 유사하지만 INF-유사 전신성 부작용이 없는 것으로 예상된다. 예상되는 결과는 HBV DNA 및 혈청 항원의 감소, HBeAg 양성 환자에서 페그-IFN을 이용한 치료에서 보여진 것보다 큰 HBeAg 혈청전환, 및 감지할 수 없는 HBV DNA 및/또는 HBeAg 음성 환자에서 페스-IFN을 이용한 치료에서 보여진 것보다 큰 HBsAg 혈청전환을 포함한다.
앞서 설명된 본 발명의 구체예들은 단지 예시적인 것으로 의도되며; 다양한 변이 및 변형이 당업자들에게 명백할 것이다. 모든 그러한 변이 및 변형들은 임의의 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Hamatake, Robert K. <120> HBV ANTISENSE INHIBITORS <130> PR63959WO <150> 61/252380 <151> 2009-10-16 <160> 29 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 1 cctgctggtg gctccagttc 20 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 2 agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg gg 42 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 3 tggatgtgtc tgcggcgttt tatcat 26 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 4 catcctgctg ctatgcctca tcttctt 27 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 5 caaggtatgt tgcccgt 17 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 6 tgtattccca tcccatc 17 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 7 cctatgggag tgggcctcag 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 8 tggctcagtt tactagtgc 19 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 9 gggctttccc ccactgt 17 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 10 tcctctgccg atccatactg cggaactcct 30 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 11 cgcacctctc tttacgcgg 19 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 12 ggagtgtgga ttcgcac 17 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Hepatitis B virus <400> 13 gaagaagaac tccctcgcct 20 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 14 gagagaagtc caccac 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 15 tgagagaagt ccacca 16 <210> 16 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 16 gaggcatagc agcagg 16 <210> 17 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 17 tgaggcatag cagcag 16 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 18 gatgaggcat agcagc 16 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 19 gatgggatgg gaatac 16 <210> 20 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 20 ggcccactcc catagg 16 <210> 21 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 21 aggcccactc ccatag 16 <210> 22 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 22 ctgaggccca ctccca 16 <210> 23 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense oligonucleotide <400> 23 gtgtaacacg tctata 16 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 atcctatcaa cacttccgga aact 24 <210> 25 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cgacgcggcg attgag 16 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 26 aagaactccc tcgcctcgca gacg 24 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ccgaccttga ggcatacttc a 21 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 aatttatgcc tacagcctcc tagtaca 27 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 29 ttaaagactg ggaggagttg 20

Claims (37)

  1. 포유류 세포 또는 개체에서 B형 간염 바이러스 DNA 및 HBV 항원의 양을 감소시키는 데에 사용하기 위한 안티센스 올리고머 또는 이의 염, 용매화물, 수화물 또는 에스테르로서, 여기서 안티센스 올리고머는 10개 내지 26개의 뉴클레오시드 길이의 인접한 서열이며 화학식 1로 나타낸 서열을 포함한다:
    5'-LNAn-P-LNAp-P-Nm-P-Nl-P-LNAr-P-LNAq-3' (화학식 1)
    여기서,
    LNA는 잠금 핵산이고;
    P는 화학식 (1)의 서열의 5'에서 3' 방향으로 LNA와 인접한 N 사이, 또는 N과 인접한 N 사이, 또는 N과 인접한 LNA 사이, 또는 LNA와 인접한 LNA 사이의, 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, H-포스포네이트 또는 알킬포스포네이트 결합으로부터 선택되는 인터뉴클레오시드(internucleoside) 결합이며; 여기서
    N은 G, C, A, T, U 또는 Z 뉴클레오시드 단위로부터 선택되고;
    n 및 r 및 p 및 q는 각각 독립적으로 1, 2 또는 3으로부터 선택되는 정수이며;
    l 및 m은 각각 독립적으로 1 내지 22의 정수이고;
    여기서 Z는 이노신, N7-메틸이노신, N7-메틸 구아니딘, 5-메틸 우리딘, 5-메틸-시티딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로티미딘, 크산토신, 디하이드로우리딘, 슈도우리딘, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 7-메틸-7-데아자구아노신, 7-에틸-7-데아자구아노신, N4-메틸시티딘, N4-에틸시티딘으로부터 선택된다.
  2. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    올리고머의 뉴클레오시드 단위 중 4개 이상이 LNA 단위이고, 여기서 인접한 뉴클레오시드 서열의 뉴클레오시드 단위들 사이에 존재하는 인터뉴클레오시드 결합 P 중 2개 이상이 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합이며, LNA는 2'-O-알킬-4'C 결합을 갖는 잠금 핵산 단위이고, 여기서 알킬은 치환되거나 비치환된 C1 -6 알킬인 안티센스 올리고머.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    인접한 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 단위들 사이에 존재하는 모든 인터뉴클레오티드(internucleotide) 결합이 포스포로티오에이트 인터뉴클레오티드 결합인 안티센스 올리고머.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고머가 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 올리고머.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고머가 서열번호 14 내지 22 중 어느 하나의 서열을 필수적으로 포함하는 안티센스 올리고머.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고머가 서열번호 1 내지 13 중 어느 하나에 필수적으로 상보적인 서열을 포함하고, 여기서 B형 간염 바이러스가 인간 B형 간염 바이러스이며, 세포 또는 개체가 인간인 안티센스 올리고머.
  7. 제5항에 있어서,
    n, p, r 및 q가 각각 독립적으로 1 또는 2이고, l 및 m이 각각 독립적으로 2, 3, 4, 5 또는 6인 안티센스 올리고머.
  8. 제7항에 있어서,
    n, p, r 및 q가 각각 독립적으로 1이고, l 및 m이 각각 독립적으로 6인 안티센스 올리고머.
  9. 제5항, 제7항 또는 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열이 추가로 서열번호 14, 16, 16 또는 20 중 어느 하나로부터 선택되는 안티센스 올리고뉴클레오티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV 항원이 HBsAg인 안티센스 올리고머.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV 항원이 HBeAg인 안티센스 올리고머.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    B형 간염 바이러스가 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것으로부터 선택되는 안티센스 올리고머: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
  13. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 핵산 올리고머, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 에스테르, 및 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 포유류에서 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제학적 포뮬레이션.
  14. 유효량의 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 핵산 올리고머, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물, 수화물 또는 에스테르, 및 약제학적으로 허용되는 희석제를 포함하는 포유류에서 B형 간염 바이러스를 치료하기 위한 약제학적 포뮬레이션.
  15. 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 제1항 내지 제14항에 따른 포유류에서 B형 간염 바이러스 감염을 치료하기 위한 약제학적 포뮬레이션.
  16. B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태를 치료하기 위하여 치료적으로 유효량의 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태를 지닌 포유류의 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    포유류가 인간이고, B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태가 인간 B형 간염 바이러스로부터의 B형 간염 바이러스 감염인 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    인간 B형 간염 바이러스가 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것으로부터 선택되는 B형 간염 바이러스 감염을 지닌 포유류의 치료 방법: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유류는 인간이고, 여기서 B형 간염 바이러스 감염 또는 B형 간염 바이러스-관련 병태는 인간 B형 간염 바이러스-관련 병태인 방법.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    인간 B형 간염 바이러스-관련 병태는 다음 중 어느 것으로부터 선택되는 방법: 황달, 간암, 간 염증, 간 섬유증, 간 경화증, 간 부전, 광범위 간세포 염증성 질환(diffuse hepatocellular inflammatory disease), 혈구탐식 증후군(hemophagocytic syndrome) 또는 혈청 간염.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    안티센스 올리고머를 추가의 치료제와 함께 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 안티센스 올리고머 및 추가의 치료제는 단일 포뮬레이션으로 함께 투여되거나 상이한 포뮬레이션으로 각각 투여되고, 여기서 핵산 올리고머 및 제 2 치료제의 투여는 동시에 또는 연속하여 행해지는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    추가의 치료제는 HBV 제제, HCV 제제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비-스테로이드성 항-염증성 (NSAID) 제제, 항진균제, 항기생충제, 항-구토제, 항-설사제 및 면역억제제로부터 선택되는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    추가의 HBV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된), 리바비린; HBV RNA 복제 억제제; 제 2 안티센스 올리고머; HBV 치료적 백신; HBV 예방용 백신; 라미부딘 (3TC); 엔테카비르; 테노포비어; 텔비부딘 (LdT); 아데포비어; 및 HBV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)로부터 선택되는 방법.
  24. 제22항에 있어서,
    추가의 HCV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된); 리바비린; HCV RNA 복제 억제제; HCV 안티센스 제제; HCV 치료적 백신; HCV 프로테아제 억제제; HCV 헬리카제(helicase) 억제제; 및 HCV 단일클론 또는 다중클론 항체 치료제로부터 선택되는 방법.
  25. 치료 전의 포유류에서의 HBV DNA의 양 및/또는 HBV 항원의 존재에 비해 B형 간염 바이러스 감염 및 B형 간염 항원을 감소시키기 위하여 치료적으로 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 유효량의 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스로 감염된 포유류에서 HBV DNA의 양 및/또는 HBV 항원의 존재를 감소시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    포유류는 인간이고, 여기서 B형 간염 바이러스는 인간 B형 간염 바이러스인 방법.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    인간 B형 간염 바이러스가 다음의 인간 지리적 유전자형들 중 어느 것으로부터 선택되는 방법: A (북서 유럽, 북아메리카, 중앙아메리카); B (인도네시아, 중국, 베트남); C (동아시아, 한국, 중국, 일본, 폴리네시아, 베트남); D (지중해 지역, 중동, 인도); E (아프리카); F (아메리카 원주민, 폴리네시아); G (미국, 프랑스); 또는 H (중앙아메리카).
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA의 양이 안티센스 올리고머의 투여 전의 양에 비해 90%로 감소되는 방법.
  29. 제25항에 있어서,
    HBV 항원이 HBsAg인 방법.
  30. 제25항 또는 제26항에 있어서,
    HBV 항원이 HBeAg인 방법.
  31. 제25항 내지 제27항 또는 제29항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV 항원의 존재가 충분히 감소되어, 현재 이용가능한 상업적 ELISA 시스템의 검출 한계에 의해 측정했을 때, HBeAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 HBeAg 부재 및 혈청 HBeAb 존재로 정의되거나 HBsAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 HBsAg 부재로 정의되는 혈청전환을 야기하는 방법.
  32. 제25항에 있어서,
    안티센스 올리고머를 추가의 치료제와 함께 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 안티센스 올리고머 및 추가의 치료제는 단일 포뮬레이션으로 함께 투여되거나 상이한 포뮬레이션으로 각각 투여되고, 여기서 핵산 올리고머 및 제 2 치료제의 투여는 동시에 또는 연속하여 행해지는 방법.
  33. 제28항에 있어서,
    추가의 치료제는 HBV 제제, HCV 제제, 화학요법제, 항생제, 진통제, 비-스테로이드성 항-염증성 (NSAID) 제제, 항진균 제제, 항기생충제, 항-구토제, 항-설사제 및 면역억제제로부터 선택되는 방법.
  34. 제29항에 있어서,
    추가의 HBV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된), 리바비린; HBV RNA 복제 억제제; 제 2 안티센스 올리고머; HBV 치료적 백신; HBV 예방용 백신; 라미부딘 (3TC); 엔테카비르; 테노포비어; 텔비부딘 (LdT); 아데포비어; 및 HBV 항체 치료제 (단일클론 또는 다중클론)로부터 선택되는 방법.
  35. 제29항에 있어서,
    추가의 HCV 제제는 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2a, 및 인터페론 알파콘-1 (페길화된 및 비페길화된); 리바비린; HCV RNA 복제 억제제; HCV 안티센스 제제; HCV 치료적 백신; HCV 프로테아제 억제제; HCV 헬리카제(helicase) 억제제; 및 HCV 단일클론 또는 다중클론 항체 치료제로부터 선택되는 방법.
  36. 치료적으로 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 B형 간염 바이러스로 감염된 포유류에 투여하는 단계;
    포유류의 혈청 샘플 내 HBeAg 및 HBeAb의 존재를 관찰하는 단계; 또는
    포유류의 혈청 샘플 내 HBsAg의 존재를 관찰하는 단계를 포함하는 B형 간염 바이러스로 감염된 포유류에서 혈청전환을 촉진하는 방법에 있어서,
    현재 이용가능한 상업적 ELISA 시스템의 검출 한계에 의해 측정했을 때, HBeAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 샘플 내 HBeAg의 부재 및 HBeAb의 존재, 또는 HBsAg를 혈청전환의 결정 요인으로 관찰하는 경우 혈청 샘플 내 HBsAg의 부재가 포유류에서 혈청전환의 표지인 방법.
  37. 제16항, 제25항 또는 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    투여는 경구, 볼점막, 직장, 비경구, 복강내, 피내, 경피 또는 기관내 투여로부터 선택되는 방법.
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