ES2651308T3

ES2651308T3 - Inhibidores antisentido de HBV

Info

Publication number: ES2651308T3
Application number: ES10824199.3T
Authority: ES
Inventors: Robert Hamatake
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2010-10-15
Publication date: 2018-01-25
Anticipated expiration: 2030-10-15
Also published as: EP2512491A4; JP2013507933A; IL219049A; WO2011047312A1; EP2512491B1; US8598334B2; ZA201202608B; IL219049A0; AU2010306639A1; BR112012008865A2; JP5892938B2; NZ598943A; KR20120095397A; US20120207709A1; AU2010306639B2; EA201290152A1; EP2512491A1; CN102762215A

Abstract

Un oligómero antisentido de virus de hepatitis B para usar en el tratamiento de infección por virus de hepatitis B y condiciones relacionadas con el virus de hepatitis B al reducir la cantidad de un ADN de virus de hepatitis B y antígeno HBV en una célula de mamífero o un organismo, en donde el oligómero antisentido del virus de hepatitis B comprende: a) esencialmente la secuencia de cualquiera de las SEQ ID NOs 14-22, o b) una secuencia que es esencialmente complementaria de cualquiera de las SEQ ID Nos 1-13; en donde al menos 4 de las unidades de nucleósido en el oligómero antisentido de virus de hepatitis B son unidades de LNA que tienen una ligación de 2'-O-alquil-4'-C en donde el alquilo es un alquilo C1-6 sustituido o no sustituido y en donde al menos dos de las ligaciones de internucleósido presentes entre las unidades de nucleósido de la secuencia de nucleósidos contiguos son ligaciones de internucleósido de fosforotioato; o una de sus sales, solvatos, hidratos o ésteres.

Description

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para la biopsia. Aquellos que tienen una elevada actividad de ALT se tratan para la seroconversión de HBsAg, si es posible, utilizándose la terapia actualmente recomendada para el HBV, lo que incluye entecavir (ETV) y tenofovir disoproxil fumarato (TDF) y peg–interferón, como opciones primarias.

Los pacientes que sufren de una infección aguda de HBV producen una respuesta vigorosa, policlonal, de linfocitos T citotóxico multiespecíficos a los antígenos virales, mientras que los pacientes crónicamente infectados tienen una respuesta CTL débil o indetectable. La hepatitis se presenta cuando se activa una débil inmune respuesta HBV– específica que es lo suficientemente fuerte para destruir los hepatocitos infectados por el HBV. Poco es lo que se sabe en cuanto al mecanismo responsable de la grado de hiperrespuesta o tolerancia de las células T, pero se piensa que podría implicar los siguientes mecanismos: selección negativa (neonatos); ignorancia inmunológica; anergia periférica o falta de moléculas coestimuladoras, por ejemplo de células T reguladoras (Tregs); agotamiento (regulación ascendente de PD–1). Un factor común para todos estos mecanismos sugeridos son los elevados niveles de antígeno persistentes en el paciente.

El HBeAg de antígeno de HBV es una forma secretada, sin partículas, de proteína de núcleo del HBV. Los antígenos HBeAg y HBeAg del HBV comparten secuencias de aminoácidos primarias, por lo que muestran una reactividad cruzada al nivel de las células T. El HBeAg no se requiere para el ensamble o replicación virales, si bien los estudios sugieren que podrían ser necesarios para el establecimiento de la infección crónica.

Las infección neonatal con el mutante HBeAg–negativo resulta frecuentemente en una infección aguda fulminante en lugar de una infección crónica de HBV (Terezawa et al (1991) Pediatr. Res. 29:5), mientras que la infección de jóvenes marmotas con mutante WHeAg–negativo resulta en un coeficiente mucho más bajo de infección crónica por HBV (Cote et al (2000) Hepathology 31:190). El HBeAg puede posiblemente funcionar como un toleragen mediante la desactivación de células T específicas para núcleo por intermedio de deleción o anergia clonal (Milich et al. (1998)

J. Immunol. 160:8102). Hay una correlación positiva entre la reducción de la carga viral de HBV y los antígenos y una disminución de la expresión, por las células T, de la muerte–1 programada del receptor inhibidor (PD–1; también conocido como PDCD1), un regulador negativo de células T activadas, al tener lugar la terapia antiviral y la seroconversión de HBeAg (Evans et al (2008) Hepathology 48:759).

El antígeno de superficie de HBV, o HBsAg, es la proteína de envuelta de las partículas virales de HBV pero también es secretado como una partícula no infecciosa con niveles de suero 1.000 veces más elevados que los de las partículas virales de HBV. Los niveles séricos de HBsAg en una persona o animal infectados pueden ser elevados, por ejemplo de 1.000 µg/mL (Kann and Gehrlich (1998) Topley & Wilson’s Microbiology and Microbial Infections, 9th ed. 745). En infecciones de HBV agudas, la semivida del HBsAg en el suero o suero ti2, es de 8,3 días (Chulanov et al (2003) J. Med. Virol. 69: 313). La internalización de HBsAg por las células dendríticas mieloides inhibe la regulación ascendente de las moléculas coestimuladoras (es decir, B7) e inhibe la capacidad estimuladora de las células T (den Brouw et al (2008) Immunology 126:280), y las células dendríticas de pacientes crónicamente infectados también muestran déficits en la expresión de las moléculas coestimuladoras, la secreción de IL–12 y la estimulación de las células T en la presencia de HBsAg (Zheng et al (2004) J. Viral Hepatitis 11:217).

Las células CD8 HBsAg específicas de pacientes con CHB muestran una unión alterada de los tetrámeros, Estas células CD8 no son anérgicas pero pueden tener una topología TCR que confiere una tolerancia parcial o ignorancia (Reignat et al (2002) J. Exp. Med. 195:1089). Además, la reducción en el HBsAg de suero g > 1 log a la semana 24 tiene un elevado valor predictivo (92%) para la respuesta virológica prolongada (SVR – definido como ADN de HBV no detectable por PCR 1 año después del tratamiento durante la terapia Peg–IFNa2a (Moucari et al (2009) Hepathology 49:1151).

Debido a la superposición de las vías de transmisión, muchas personas fueron expuestas tanto a virus de hepatitis B (HBV) como a virus de hepatitis C (HCV) y una menor proporción se infectan crónicamente con ambos virus, en especial en regiones tales como Asia, donde HBV es endémico. Las estimaciones sugieren que hasta el 10% de las personas con HCV también pueden tener HBV, mientras que quizás el 20% de las personas con HBV se coinfectan con HCV. Sin embargo, el tratamiento de hepatitis B o hepatitis B en individuos coinfectados con HBV–HCV no se ha estudiado bien.

El tratamiento es complicado por el hecho de que HCV y HBV parecen inhibir cada otra replicación (a pesar de que no todo lo estudiado observó esta interacción). En consecuencia, el tratamiento que suprime por completo el HBV podría permitir potencialmente que HCV vuelva a emerger, o viceversa.

En consecuencia, los compuestos ASO de la presente invención se pueden usar ventajosamente para tratar pacientes infectados tanto con HBV como con HCV. Las opciones de tratamiento de ejemplo para hepatitis C (HCV) incluyen interferones, por ejemplo, interferón alfa–2b, interferón alfa–2a e interferón alfacon–1. La dosis de interferón menos frecuente se puede lograr usando interferón pegilado (interferón unido con un resto de polietilenglicol que mejora significativamente su perfil farmacocinético). La terapia combinada con interferón alfa–2b (pegilado o no pegilado) y ribavirina también mostró ser eficaz para algunas poblaciones de pacientes. Otros agentes que actualmente se están desarrollando incluyen inhibidores de replicación de HCV ARN (por ejemplo, serie VP50406 de ViroPharma), agentes antisentido HCV, vacunas terapéuticas de HCV, inhibidores de HCV proteasa, inhibidores de HCV helicasa y terapia de anticuerpos HCV (monoclonal o policlonal).

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ejemplo, introduciendo un agente inhibidor de ARN antisentido en la célula diana. También se proporcionan composiciones farmacéuticas para usar en la práctica de los métodos diana. Las realizaciones de la presente invención se usan en una variedad de aplicaciones, incluyendo el tratamiento de sujetos que sufren de una condición patológica mediada por virus, por ejemplo, una condición patológica mediada por HBV. Estas condiciones incluyen, pero sin limitación, fibrosis e inflamación del hígado, cirrosis del hígado y cáncer hepatocelular (cáncer de hígado).

Las realizaciones de la presente invención proporcionan un oligómero antisentido (ASOs) para tratar infecciones por HBV en mamíferos, incluyendo humanos, en donde el ASO es esencialmente complementario de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1–13 y es eficaz en la reducción de la carga viral o niveles de antígeno en al menos el 40%, con mayor preferencia, en al menos el 50%, con mayor preferencia aún, en al menos el 60%, con mayor preferencia aún, en al menos el 70%, con mayor preferencia, el 80% y con máxima preferencia, en el 90%. El ASO puede comprender al menos dos nucleósidos modificados, incluyendo unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA), donde la unidad de LNA tiene una ligación de 2’O–alquil–4’C, dando como resultado un azúcar bicíclico en la posición de ASO donde el nucleósido de LNA modificado se incorpora en la secuencia de ASO.

El oligómero antisentido de la invención es un oligonucleótido monocatenario que comprende análogos de nucleósido, tales como LNA o análogos de nucleótido, como fosforotioatos, que forman parte de la secuencia de ácidos nucleicos contigua del oligonucleótido antisentido. La secuencia del oligómero antisentido consiste en una secuencia de nucleótidos o nucleósidos contigua.

El término “antisentido” como se usa en la presente significa que una secuencia de oligonucleótidos de ácido nucleico, cuando se mira desde el término 5’ hasta el término 3’, comprende una secuencia que es esencialmente complementaria de la cadena con sentido de ADN – es decir, el oligonucleótido antisentido tiene una orientación de secuencia opuesta, de 5’ a 3’, como la cadena con sentido de ADN, también conocida como la cadena codificante, de modo que el oligómero antisentido sea esencialmente complementario de la cadena con sentido de una región o gen codificante de ADN dados.

El término “oligonucleótido” (o simplemente “oligo”), que se usa indistintamente con la expresión “oligómero” se refiere, en el contexto de la presente invención, a una molécula formada por ligación covalente de dos o más nucleótidos. Cuando se usa en el contexto del oligonucleótido de la invención (también mencionado como oligonucleótido monocatenario), la expresión “oligonucleótido” puede ser, en una realización, por ejemplo de 10 a 26 nucleótidos, más en particular, un oligonucleótido de la invención puede tener de 12–20 nucleótidos o más en particular, de 14–18 nucleótidos.

El término 'nucleótido' se refiere a una molécula con tres componentes, a saber, una base nitrogenada heterocíclica, a veces mencionada como una nucleobase, incluyendo bases de pirimidina y de purina, un azúcar pentosa (ribosa o desoxirribosa) y un grupo fosoforilo (fosfato, fosforotioato, fosfonato, etc.). Los ejemplos incluyen, pero sin limitación nucleótidos de ADN tales como desoxiadenosina–5’–monofosfato (dAMP), desoxiguanosina–5’–difosfato (dGDP), desoxiltimidina–5’–trifosfato (dTTP) y desoxicitidina–5’– trifosfato (dCTP) y nucleótidos de ARN tales como adenina– 5’–monofosfato (AMP), citidina–5’–difosfato (CDP), inosina–5’–monofosfato (IMP), uridina–5’–trifosfato (UTP) y guanosina–5’–trifosfato (GTP).

Como se usa en la presente, el nucleótido incluye análogos de fosfato tales como análogos de fosforotioato, fosforoditioato, fosfonato, H–fosfonato o alquilfosfonato. Si se reconoce que, en algunos aspectos, la expresión nucleobase también se puede usar para referirse a un nucleótido que puede ser natural o no natural ––en este sentido, la expresión nucleobase y nucleótido se pueden usar indistintamente en la presente Las nucleobases incluyen, pero sin limitación, guanina, citosina, timina, adenina, uracilo, xantina, hipoxantina, 5,6–dihidrouracilo, 5– fluorouracilo, 5–fluorotimina, N7–metilguanina, N7–metilinosina, 5–metilcitosina y 5–metiluracilo, entre otros.

Los compuestos oligoméricos proporcionados en la presente pueden comprender uno o varios monómeros, incluyendo un nucleósido o nucleótido, que tiene un resto de azúcar modificado. Por ejemplo, el anillo de azúcar furanosilo de un nucleósido se puede modificar en una cantidad de formas incluyendo, pero sin limitación, adición de un grupo sustituyente, en puente de dos átomos de anillo no geminales para formar un Locked Nucleic Acid (LNA).

En determinadas realizaciones, los compuestos oligoméricos comprenden uno o varios monómeros que es un LNA. En tales realizaciones determinadas, LNAs incluyen, pero sin limitación, (A) a–L–Metilenoxi (4’–CHrO–2’) LNA, (B) (3–D–Metilenoxi (4’–CHrO–2’) LNA, (C) Etilenoxi (4’–(CH2)2–O–2’) LNA, (D) Aminooxi (4’–CH2–O–N(R)–2’) LNA y (E) Oxiamino (4’–CH2–N(R)–O–2’) LNA, como se describe a continuación.

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13 ó 14 nucleótidos de ADN, donde el resto de los nucleótidos comprende análogos de nucleósido, tales como unidades de LNA.

Determinadas realizaciones proporcionan ASOs de 10–100 nucleótidos de largo con nucleótidos de LNA incorporados en la secuencia. Determinadas realizaciones proporcionan ASOs que tienen un patrón de 4–8–4, correspondiente a cuatro nucleótidos de LNA, ocho nucleótidos no LNA gap (nt), cuatro nucleótidos de LNA, consecutivamente, de la dirección 5’ a 3’. Así, un motivo de 4LNA–8nt–4LNA comprende un segmento de brecha de nucleótido central (nt) con ocho 2’–desoxinucleótidos consecutivamente ligados. El segmento de brecha nt en un ASO 4LNA–8nt–4LNA 16–mero se flanquea en ambos lados (5’ y 3') por un segmento con alas. Cada segmento con alas en cada ASO tiene cuatro nucleótidos consecutivamente ligados. Cada nucleótido de cada segmento de alas en cada ASO tiene una modificación de azúcar de ácido nucleico bloqueado (LNA). Cada ligación de internucleótido a través de cada oligonucleótido antisentido de LNA es una ligación de fosforotioato (P=S), a pesar de que se prevé que algunas ligaciones de internucleótido en algunos ASOs de la invención puedan ser ligaciones distintas de un fosforotioato, incluyendo una ligación de fosfodiéster. También está dentro del alcance de la invención que el motivo de LNA de un ASO dado puede variar de 4LNA–8nt–4LNA, en otros motivos incluyendo otras combinaciones de motivos LNA–nt–LNA de una secuencia de nucleótidos totales más cortos o más largos. Determinadas realizaciones proporcionan ASOs de varios otros patrones de “ala–brecha–ala”. El patrón de “ala–brecha–ala” se describe con frecuencia como “X–Y–Z”, donde “X” representa el largo de la región de ala 5’, “Y” representa el largo de la región de brecha y “Z” representa el largo de la región de ala 3’. En algunas realizaciones, X y Z son iguales, en otras realizaciones, son diferentes. En ciertas realizaciones, X y Z son de modo independiente 1 a 5 nucleósidos de largo. En ciertas realizaciones, Y tiene 8 a 12 nucleótidos de largo. ASOs de la invención también pueden ser un 10–mero, 11–mero, 12–mero, 13–mero, 14–mero, 15–mero, 16–mero, 17–mero, 18–mero, 19–mero o 20–mero (es decir un oligómero que tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 nucleótidos, respectivamente) o más, hasta 100 nucleótidos de largo. Otras realizaciones particulares proporcionan ASOs de 10 a 100 nucleótidos de largo, con LNAs incorporados en la secuencia en otros posibles patrones alternantes como se describió con anterioridad. En otras realizaciones particulares, puede haber más de un motivo de LNA–nt–LNA en una secuencia dada, de modo tal que una fórmula general de 5’–LNAn–P–LNAp–P–Nm–P–NI–P–LNAr–P– LNAq–3’ (fórmula 1), como se describe en la presente, es posible dentro de un ASO particular de 10 a 20 nucleótidos en total de largo.

En una realización particular, las ligaciones de internucleótido en la secuencia antisentido de oligómero se seleccionan de una ligación de fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, H–fosfonato o alquilfosfonato. En otra realización particular, todas las ligaciones de internucleótido son ligaciones de fosforotioato.

En una realización más particular, las ligaciones de internucleótido en la secuencia antisentido de oligómero se seleccionan de ligaciones de fosfodiéster y fosforotioato.

En una realización más particular, el oligómero antisentido comprende al menos dos nucleótidos modificados, más en particular, al menos dos unidades de ácido nucleico bloqueado (LNA), donde la unidad de LNA tiene una ligación de 2’O–alquil–4’C.

Una realización particular proporciona un oligómero antisentido que comprende al menos dos unidades de LNA ubicadas hacia el término 3’ y el término 5’ de ASO, más en particular, el ASO comprende al menos tres unidades de LNA ubicadas hacia el término 3’ y el término 5’ de ASO, más en particular, el ASO comprende al menos 4 unidades de LNA, y más en particular, las al menos 4 unidades de LNA se ubican hacia el término 3’ y el término 5’ de ASO, de modo tal que el ASO comprende una secuencia descrita por la fórmula 1 siguiente:

5’–LNAn–P–LNAp–P–Nm–P–NrP–LNAr–P–LNAq–3’ (fórmula 1) en donde

LNA es una unidad de ácido nucleico bloqueado que tiene una ligación de 2’–O–Me–4’C;

P se selecciona de una ligación de fosfodiéster, fosfotriéster, fosforotioato, fosforoditioato, H–fosfonato o alquilfosfonato entre un LNA y un N contiguo o entre un N y un N contiguo o entre N y un LNA contiguo, o entre un LNA y un LNA contiguo, de una dirección 5’ a 3’ de la secuencia de formula (1); y en donde

N se selecciona de una unidad de nucleótido G, C, A, T, U o X;

n y r y p y q son cada uno, de modo independiente, un número entero seleccionado de 1, 2 ó 3;

I y m son cada uno, de modo independiente, un número entero de 1 a 22; y

en donde X se selecciona de una inosina, N7–metilinosina, N7–metil guanidina, 5–metil uridina, 5–metil–timidina, 5– fluorouridina, 5–fluorotimidina.

En una realización particular relacionada, el oligómero antisentido comprende al menos 6 ligaciones de fosforotioato. En otra realización particular relacionada, el oligómero antisentido comprende todas las ligaciones de fosforotioato.

En otra realización, se suministra el tratamiento de una infección por HBV en un mamífero, incluyendo un humano, en donde el tratamiento comprende la administración de una dosis eficaz de un oligómero antisentido de la presente

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Tabla 1. Oligonucleótidos antisentido

Nombre: Secuencia Número de acceso de secuencia diana de HBV: U95551 Valores de IC50 (nM) Inhibición de ASDN de HBV a 0,6 nM

HBsAg: HBeAg citotox

RH1 (SEQ ID NO: 14): GAGAGAAGTCCACCAC nt 258–273 1,31 1,35 23,6 34%

RH2 (SEQ ID NO: 15): TGAGAGAAGTCCACCA nt 259–274 1,06 0,97 8,7 –21%

RH3 (SEQ ID NO: 16): GAGGCATAGCAGCAGG nt 414–429 1,10 1,16 39,3 26%

RH4 (SEQ ID NO: 17): TGAGGCATAGCAGCAG nt 415–430 1,04 0,97 19,9 34%

RH6 (SEQ ID NO: 18): GATGAGGCATAGCAGC nt 417–432 0,92 0,88 9,8 26%

RH6 (SEQ ID NO: 19): GATGGGATGGGAATAC nt 602–617 1,46 0,62 14,3 30%

RH7 (SEQ ID NO: 20): GGCCCACTCCCATAGG nt 639–654 0,90 0,49 22,4 40%

RH8 (SEQ ID NO: 21): AGGCCCACTCCCATAG nt 640–655 1,84 1,27 9,0 –40%

RH9 (SEQ ID NO: 22): CTGAGGCCCACTCCCA nt 643–658 1,13 0,91 8,1 22%

Control: (SEQ ID NO: 23): GTGTAACACGTCTATA 5,04 5,77 17,8 –51%

Se cultivaron monocapas de células HepG2 2.2.15, una línea celular de hepatoblastoma humano, establemente transfectadas con un plásmido que tenía dímeros de cabeza–a–cola del gen de HBV, en RPMI (Invitrogen #22400– 5 089), FBS al 10%, gentamicina (10 µg/ml) a 37 °C, 5% de CO2 y se dividieron 1:3 cuando eran confluentes 1:3.

Se prepararon soluciones de trabajo de oligonucleótidos antisentido en agua estéril y se diluyeron a una concentración de 4,25 µM para la transfección. 10 µL de oligonucleótido se mezclaron con 130 µL de Opti–Mem (Invitrogen). 100 µL de la mezcla de oligonucleótidos se mezclaron con 100 µL de Lipofectamina 2000 (Invitrogen) y se sometieron a incubación durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se prepararon soluciones seriadas 10 diluyendo 70 µL en 140 µL de Opti–Mem. 50 µL de la mezcla diluida se añadieron a una placa de 96 cavidades y se añadieron 100 µL de células HepG2 2.2.15 a una concentración de 2,8 X 105/mL. Las células transfectadas se sometieron a incubación a 37 °C, 5% de CO2 durante cuatro días con un cambio de medio en el día 2. Se retiró el material sobrenadante en el día 4 para evaluar los HBsAg, HBeAg y el ADN de HBV secretados, y se determinó la viabilidad de las células en la monocapa de células restante usando CellTiter–Glo (Promega) de acuerdo con las

15 instrucciones del fabricante. Se midieron los niveles de HBsAg usando el kit Abazyme HBVsAg, catálogo # EL10018, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se midieron los niveles de HBeAg utilizando el kit BioChain HBV e Ag, catálogo #K031006096 de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para el análisis del ADN del HBV en el material sobrenadante, se extrajo el ADN de 50 µl de material sobrenadante utilizando el kit QiaAmp 96 DNA Blood (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 5 µL de ADN se

20 utilizaron para el análisis TaqMan usando los cebadores y condiciones descritos [Thimme R et al. (2003) J. Virol. 77, 68–76]. Se utilizó una curva estándar en base a cantidades conocidas de un clon de plásmido de ADN de HBV para calcular los equivalentes de genoma de HBV secretados en el medio.

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La inhibición de la viabilidad de las células, el ADN de HBV y los antígenos secretados se normalizaron utilizando valores de células que experimentaban el procedimiento de transfección en la ausencia de oligonucleótidos. Los datos se analizaron mediante regresión no lineal y se ajustaron en una curva de log(inhibidor) vs. respuesta usando GraphPad Prism5.

Los resultados del tratamiento de las células HepG2 2.2.15 con oligómeros antisentido se muestran en la Tabla 1. Los oligómeros dirigidos contra las secuencias de HBV inhibieron la producción y la secreción de HBsAg y HBeAg con una potencia superior a la del oligómero de control. El oligómero de control también inhibió la producción y la secreción de antígenos pero esto puede deberse a la citotoxicidad por cuanto había una diferencia de solamente el triple entre los valores de IC50 para la inhibición y la citotoxicidad del antígeno. Los oligómeros antisentido dirigidos contra las secuencias del HBV tenían una diferencia muy superior entre los valores de IC50 en cuanto a la inhibición y la citotoxicidad del antígeno. Los oligómeros antisentido RH1, RH3, RH4 y RH7 presentaban las mayores diferencias y también mostraron una inhibición constante del ADN del HBV secretado. La inhibición del ADN del HBV no incrementó por arriba del 50% por lo que no se calcularon los valores de IC50. En la Tabla 1 se muestran la inhibición porcentual del ADN del HBV con una concentración de 0,6 nM de oligómero, una concentración en la que no se observó ninguna citotoxicidad para ningún oligómero y cercano a los valores de IC50 en cuanto a la inhibición del HBsAg y HBeAg.

EJEMPLO 2: Inhibición antisentido de la expresión del virus de hepatitis B SV40 en células HepAD38 (Tet–HBV) con un oligonucleótido antisentido de LNA

Se diseñó un oligonucleótido antisentido dirigido al HBV con la secuencia GAGGCATAGCAGCAGG (SEQ ID NO: 16), complementaria de la secuencia de ADN mencionada en SEQ ID NO: 4 y el GEN BANK Accession No. U95551.1, incorporada en la presente como SEQ ID NO: 16. El oligonucleótido antisentido de LNA tiene una longitud total de 16 nucleótidos, con un motivo 4–8–4 LNA, en donde el ASO tiene un segmento de huelgo central que tiene ocho 2’–desoxinucleótidos unidos consecutivamente entre sí. El segmento de huelgo está flanqueado en ambos lados (5’ y 3') por un segmento de ala. Cada segmento de ala tiene cuatro nucleótidos consecutivamente ligados. Cada nucleótido de cada segmento de ala tiene una modificación de azúcar de ácido nucleico bloqueado (LNA). Cada enlace internucleotídico a través del polinucleótido antisentido de LNA es un enlace fosforotioato (P=S). Cada citosina del oligonucleótido antisentido de LNA es una 5–metilcitosina. El oligonucleótido antisentido de LNA se evaluó en cuanto a su estabilidad para reducir el ARNm de HBV en las células HepAD38.

Se transfectaron células HepAD38 utilizando la electroporación con 741 nM, 2.222 nM, 6.667 nM y 20.000 nM de oligonucleótidos antisentido durante un intervalo de tiempo de aproximadamente 24 horas. Se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HBV mediante PCR en tiempo real. Se ajustaron los niveles de ARNm de HBV de acuerdo con el contenido total de ARN medido por RIBOGREEN. El conjunto de sondas de cebador RTS3372 (secuencia directa ATCCTATCAACACTTCCGGAAACT, designada en la presente como SEQ ID NO: 24; la secuencia inversa ACGCGGCGATTGAG, designada en la presente como SEQ ID NO: 25, la secuencia de sonda AAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACG, designada en la presente como SEQ ID NO: 26) se utilizó para medir los niveles de ARNm. Los datos se presentan en la Tabla 2, expresados como inhibición porcentual de los niveles de ARNm en comparación con las células no tratadas. El oligonucleótido antisentido de LNA redujo los niveles de ARNm en función de la dosis.

También se ensayó el oligonucleótido antisentido de LNA en las mismas condiciones que con el conjunto de sonda de cebador RTS3373MGB (secuencia directa) CCGACCTTGAGGCATACTTCA, designada en la presente como SEQ ID NO: 27; secuencia inversa AATTTATGCCTACAGCCTCCTAGTACA, designada en la presente como SEQ ID NO: 28, secuencia de sonda TTAAAGACTGGGAGGAGTTG, designada en la presente como SEQ ID NO: 29). Los resultados se presentan en la Tabla 3 como inhibición porcentual de HBV, referido a las células del control no tratadas. Como se ilustra en la Tabla 3, el oligonucleótido antisentido de LNA redujo los niveles de ARNm de HBV en función de la dosis.

Tabla 2: Inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARN de HBV en las células HepAD38, medida con RTS3372

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Tabla 3: Inhibición antisentido, dependiente de la dosis, ARNm de HBV en células HepAD38, medida con RTS3373MGB

Dosis (nM): % de inhibición

741: 0

6667: 9

20000: 50

EJEMPLO 3: Inhibición antisentido de la expresión del virus de hepatitis B o SV40 T en células THT1 con un oligonucleótido antisentido de LNA

El oligonucleótido antisentido de LNA descrito en el Ejemplo 3 se evaluó para establecer su capacidad de reducir el ARNm de HBV en las células THT1, también conocidas como células HepG2 2.2.15. Estas células se transfectaron mediante electroporación con 741 nM, 2.222 nM, 6.667 nM y 20.000 nM de oligonucleótidos antisentido durante un periodo de aproximadamente 24 horas. Se aisló el ARN de las células y se midieron los niveles de ARNm de HBV utilizando PCR cuantitativa en tiempo real. Los niveles de ARNm de HBV se ajustaron de acuerdo con el contenido total de ARN medido mediante RIBOGREEN. Los datos se presentan en la Tabla 4, expresados como inhibición porcentual de los niveles de ARNm en comparación con las células sin tratar. Como se ilustra en la Tabla 4, el oligonucleótido antisentido de LNA redujo los niveles de ARNm de HBV en función de la dosis.

Tabla 4: inhibición antisentido dependiente de la dosis de ARNm de HBV en células HepG2

Dosis (nM): % de inhibición

741: 34

2222: 38

6667: 42

20000: 57

(B) Evaluación de oligómeros antisentido en modelos animales

EJEMPLO 4: evaluación de la efectividad de ASO para reducir la carga de HBV en ratones transgénicos

Se utiliza un linaje de ratones transgénicos HBV 1.3.32 (designación oficial, genoma de Tg[HBV 1.3]Chi32) para evaluar la efectividad del oligómeros antisentido en la reducción de la carga de HBV en un modelo animal. Los ratones transgénicos replican el HBV en elevados niveles en el hígado y riñones sin ninguna evidencia de fitopatología. El linaje 1.3.32 se expande mediante cruza inversa repetitiva contra la cepa parental C57BL/6 y a continuación se cría una generación contra ratones B10D2 para producir los híbridos F1 que han de utilizarse en todos los ensayos descritos. Los ratones se agrupan de acuerdo con la edad (de 6 a 10 semanas), sexo (macho) y niveles de HBsAg (antígeno de superficie de hepatitis) en el suero (determinado mediante un kit disponible en el comercio ofrecido por Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

A) Los ratones transgénicos de HBV se tratan con oligómeros de ADN de HBV durante 7 – 21 días mediante administración intravenosa o subcutánea y a continuación se los sacrifica. Más tarde se analizan los hígados de ratón para determinar la reducción en los niveles de ADN y ARN de HBV. Se utilizan métodos de transferencia Southern o de QPCR en tiempo real para determinar los niveles de ADN; pueden utilizarse métodos de transferencia Northern o de tiempo real para determinar los niveles de transcriptos de ARN de HBV. También se analiza el suero de ratón para establecer los niveles de producción de HBeAg y HBsAg para lo cual se utilizan kits de ELISA para HBeAg y HBsAg disponibles en el comercio.

Se analiza el ADN mediante transferencias Southern y se sondea con una sonda de ADN de HBV 32P–etiquetada de acuerdo con el siguiente procedimiento. El ADN de los hepatocitos infectados con HBV se extrae, se separa por electroforesis en gel de agarosa y se transfiere a un filtro de nitrocelulosa utilizando metodologías conocidas por los expertos en la técnica. Se utiliza una sonda de ADN de HBV 32P–nick traducida. En el grupo de control viral, se cosechan los hígados los días 2, 6, 8, 10, 14, 18 y 20. En los grupos tratados con fármacos, los hígados se cosechan los días 8, 14 y 20. Las muestras de hígado se muelen en un mortero provisto de cavidades en un tubo de microcentrífuga que contiene tampón de lisis. Después de incubar durante 5 a 10 minutos a temperatura ambiente, los tubos se congelan instantáneamente en nitrógeno líquido para almacenar. Se purifica el ADN utilizando

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Claims

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