KR100855907B1

KR100855907B1 - 내성 ＨＢＶ 균주 치료용 β-Ｌ-2'-데옥시뉴클레오시드 및병용 요법

Info

Publication number: KR100855907B1
Application number: KR1020057004375A
Authority: KR
Inventors: 데이빗 스탠드링; 쟝-피에르 솜마도시; 에이프릴 엘. 패티; 마리아 세이퍼
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2002-09-13
Filing date: 2003-09-15
Publication date: 2008-09-02
Also published as: US7928086B2; KR20050051662A; KR20080053419A; ES2547002T3; AU2003278816A1; US20080182814A1; JP2008273960A; WO2004024095A3; BR0314259A; CN100536853C; CA2498731C; US20050080034A1; JP4173861B2; US7186700B2; SI1572095T1; AU2003278816A8; US8158606B2; HUE027522T2; CN1777363A; US20110172178A1

Abstract

β-L-2'-데옥시뉴클레오시드는 돌연변이를 포함하는 약물-내성 B형 간염 바이러스에 대하여 활성인 것으로 밝혀졌다. β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙주에서 라미부딘 내성 HBV (M552V)를 치료하는 방법을 제공한다. 또한, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 원(naive) 숙주에서 라미부딘 내성 HBV (M552V) 돌연변이가 발생하지 못하도록 예방하는 방법을 제공한다. 또한 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, HBV 더블 뮤턴트(L528M/M552V)의 출현을 예방 및/또는 시키는 방법 또한 제공한다.

Description

내성 ＨＢＶ 균주 치료용 β-Ｌ-2'-데옥시뉴클레오시드 및 병용 요법{β-L-2'-Deoxynucleosides for the treatment of resistant HBV strains and combination therapies}

본 발명은 2002년 9월 13일에 출원된 미국 특허 제 60/410,675 호를 우선권으로 주장한다.

본 발명은 공지된 항-HBV 약물에 대하여 내성을 나타내는 B형 간염 균주의 치료를 위한 2'-데옥시-β-L-뉴클레오시드, 및 면역조절제와 2'-데옥시-β-L-뉴클레오시드의 배합 치료를 포함한다.

B형 간염 바이러스("HBV")는 인체의 암의 원인으로서 담배에 이어 두 번째이다. HBV가 직접적으로 종양 발생을 유발할 수 있거나, 감염과 연관된 만성 염증, 경변(cirrhosis), 및 세포 재생을 통해 간접적으로 종양 발생을 유발할 수 있다고 추정되고 있지만, HBV가 암을 유발하는 메카니즘(mechanism)이 알려져 있지 않다.

B형 간염 바이러스는 전세계적으로 전염병 수준에 도달되어 있다. 숙주가 감염을 알지 못하는 2 내지 6개월의 잠복기 후에, HBV 감염은 급성 간염과 간 손상을 유발할 수 있으며, 이것은 복부 통증, 황달, 및 일정한 효소의 혈액 수준 상승을 야기한다. HBV는 극발성(fulminant) 간염, 즉 간의 대부분이 파괴되는 급속 진 행성의, 때로 치명적인 형태의 질병을 야기시킬 수 있다. 환자는 전형적으로 급성 간염으로부터 회복된다. 그러나, 몇몇 환자에서, 높은 수준의 바이러스 항원이 연장되거나, 무한정의 기간 동안 혈액에 남아 있어서, 만성 감염을 야기시킨다. 만성 감염은 지속성 만성 간염을 유발할 수 있다. 지속성 만성 HBV에 감염된 환자는 개발도상국에 가장 보편적이다. 지속성 만성 간염은 피로, 간의 경변, 및 원발성 간암인 간세포암을 야기시킬 수 있다. 서양의 산업국가에서, HBV 감염에 대한 위험성이 높은 그룹은 HBV 보균자 또는 그들의 혈액 샘플과 접촉하는 사람들을 포함한다. HBV의 역학은 후천성 면역 결핍 증후군(AIDS)의 역학과 매우 유사하며, 이것은 HBV 감염이 AIDS 또는 AIDS 관련 복합증을 가진 환자중에서 통상적이라는 이유를 설명하고 있다. 그러나, HBV는 HIV보다 전염성이 크다.

현재까지, 단 3종의 약물만이 만성 HBV 감염 치료에 대하여 FDA로부터 승인을 받았다: 인터페론 알파, 3TC(에피비르, 라미부딘) 및 아데포비르 디피복실(Hepsera^®Gilead Sciences).

HBV에 대하여 FDA 승인받은 약물:

약물 명칭	약물 부류	제조사	FDA 상태
인트론 A (인터페론 α-2b)	인터페론	Schering-Plough	FDA-승인
3TC (라미부딘;에피비르-HBV)	뉴클레오시드 유사체	GlaxoSmithKline	FDA-승인
아데포비르 디피복실	뉴클레오시드 유사체	Gilead Sciences	FDA-승인

인터페론 알파

제조된 인터페론 형태를 사용하여 B형 간염을 치료한다. 이러한 치료법은 약 4개월간 인터페론을 주사로 투여하는 것을 포함한다.

모든 환자가 인터페론에 반응하는 것은 아니면, 때때로 재치료가 필요시된 다. 임상 연구에서 주사용 A (인터페론 알파-2b, 재조합, Schering Corporation)를 통해 B 형 간염을 치료받던 환자중 단지 45%에서만 시간에 따라 혈액내 B형 간염 바이러스가 존재하지 않았다. 또한 대부분의 환자는 인터페론 치료를 참아냄에 있어 어려움을 나타내었고, 이는 중증 플루-양 증상, 체중감소, 및 에너지 및 원기 부족을 유발하였다.

3TC

3TC(에피비르, 라미부딘)로도 공지되어 있는 BCH-189의 (-)-에난티오머는(2', 3'-디데옥시-3'-티아시티딘) HIV 및 HBV 모두에 대하여 활성인 항바이러스 약물이다. 복제하기 위하여 HIV 및 HBV가 필요로 하는 역전사효소의 생산을 차단하여 작용하는 일명 뉴클레오시드 유사체 역전사효소 저해제(NRTI)로 불리는 약물 부류에 속한다. 3TC는 본래 HIV를 치료하기 위한 목적으로 개발되었지만, 연구자들은 3TC가 B형 간염 바이러스에도 작용한다는 적을 발견하게 되었다. 1998년 12월 U. S. Food and Drug Administration(FDA)는 B형 간염 치료용으로 에피비르 HBV를 승인하였다.

3TC는 효과적으로 HBV 복제를 저해하지만, 3TC 요법시 바이러스 제거에 대하여 느린 동역학(Nowak, M. , S. Bonhoeffer, et al. 1996. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 93: 4398-4402) 및 자발적인 게놈의 변이성에 의해 역전사효소(RT) 영역을 손상시키는 돌연변이를 수반하는 약물-내성 뮤턴트가 출현된다(Mason, W. S. , J. Cullen, et al. 1998. Virology 245: 18-32. Nafa, S. , S. Ahmed, et al. 2000. Hepatology 32:1078-1088 ; Melegari, M. , P. P. Scaglioni, and J. R. Wands. 1998 Hepatology 27: 628-633. ; Seigneres, B. , C. Pichoud, et al. 2000. J. Infect. Dis. 181:1221-1233). 3TC에 의해 치료한 후 3년째 치료받은 환자중 대략 50%에서 바이러스 내성을 나타내었다(Leung, N. W. , C. L. Lai, et al.2001. Hepatology 33: 1527-1532). 뉴클레오시드 유사체에 대한 내성은 아미노산 서열 HBV RT의 아미노산 서열내 변화를 유발하는 중합효소 유전자의 핵산 서열, 특히 촉매 부위내 YMDD 모티프에서의 치환과 관련된다. 가장 보편적인 중합효소 변이체는 촉매 부위 변이체에 고도의 복제능을 제공하는 RT의 B 영역내 보상성 돌연변이(rtL180M)와 촉매 부위내 돌연변이(rtM204V)가 결합된 rtL180M-plus-M204V 변형 (최근 HBV 약물-내성 변이체에 대한 유전자형-독립적 명칭) (Stuyver, L.J., S. A. Locarnini, et al. 2001. Hepatology 33: 751-757)이다(Allen, M. I. , M. Deslauriers, et al. 1998.Hepatology 27: 1670- 1677. Chayama, K. , Y. Suzuki, et al. 1998. Hepatology 27: 1711-1716. Melegari, M. , P. P.Scaglioni, and J. R. Wands. 1998. Hepatology 27: 628-633. Ono, S.K., N. Kato, et al. 2001. J. Clin. Investig. 107: 449-455. Seigneres, B. , S.Aguesse-Germon, et al. 2001. J. Hepatol. 34: 114-122).

아데포비르 디피복실(헵세라)

2002년 9월 20일 U. S. Food and Drug Administration는 만성 B형 간염 치료에 대하여 아데포비르 디피복실을 승인하였다. HEPSERA^TM가 아데포비르의 디에스테르 프로드럭인 아데포비르 디피복실의 상표명이다. 아데포비르는 자연발생 기질 데옥시아데노신 트리포스페이트와 경쟁시키고 바이러스 DNA내로 도입시킨 후 DNA 쇄 종결을 유발시켜 B형 간염 바이러스 (HBV) DNA 폴리머라제를 저해시키는 아데노신 모노포스페이트의 어사이클릭 뉴클레오티드 유사체이다. 아데포비르 디피복실의 화학명은 9-[2-[비스[ (피발로일옥시)메톡시]포스피닐]메톡시]-에틸]아데닌이다. 아데포비르는 세포 키나제에 의해 활성 대사 물질인 아데포비르 디포스페이트로 인산화된다. 참조, 예를 들면,미국 특허 5,641, 763 및 5,142, 051(피리미딘 및 퓨린 염기의 N-포프소닐메톡시 알킬 유도체 및 항바이러스 활성을 갖는 그의 치료학적 조성물).

내성 HBV 균주

라미부딘는 주로 비자연발생 L- 뉴클레오시드 및 자연발생 기질인 D-뉴클레오시드, 및 특히 싱글 뮤턴트, YMDD 뮤턴트(M552I 또는 M552V) 및 L528M, 및 더블 뮤턴트 (L528M/M552V)를 식별할 수 있는 바이러스의 내성 균주를 선별하는 HBV 치료용 L-뉴클레오시드이다. 참조 미국 특허 6,242, 187 and 6,265, 181; and International Publication No. WO01/04358. See also: Ahmed et al. "Early Detection of 바이러스 Resistance by Determination of Hepatitis B virus polymerase Mutations in patient Treated by Lamivudine for Chronic Hepatitis B"Hepatology, 2000, 32 (5), 1078-1088; Ono et al. "The polymerase L528M mutation cooperates with nucleotide binding-site mutations, increasing Hepatitis B virus replication and drugresistance"Journal of Clinical Investigation, February 2001,107 (4), 449-455; Allen"Identification and Characterization of Mutations in Hepatitis B virus resistent to Lamivudine" Hepatology, 1998,7 (6), 1670-1677; Das et al. "Molecular Modeling and Biochemical Characterization Reveal the Mechanism of Hepatitis B virus polymerase Resistance to Lamivudine (3TC) and Emtricitabine(FTC)"Journal of Virology, May 2001, 75 (10), 4771-4779; Delaney "Cross-Resistance Testing of Antihepadna viral Compounds using Novel Recombinant Baculoviruses which Encode Drug-Resistant Strains of Hepatitis B virus "Antimicrobial Agents and Chemotherapy, June 2001, 45 (6), 1705-1713; Fu "Role of Additional Mutations outside the YMDD Motif of Hepatitis B virus polymerase in L- (-)-SddC(3TC)Resistance "Biochemical Pharmacology), 1998, 55 (10), 1567-1572; Fu "Sensitivity of L- (-)-2', 3'-Dideoxythiacytidine Resistant Hepatitis B virus to Other Antivirus Nucleoside Analogues "Biochemical Pharmacology, 1999, 57 (12), 1351-1359 ; Gauthier "Quantitation of Hepatitis B Viremia and Emergence of YMDD Variants in patients with Chronic Hepatitis B Treated with Lamivudine"The Journal of Infection Diseases, December 1999, 180, 1757-1762; Kioko "YMDD Motif in Hepatitis B virus DNA polymerase Influences on Replication and Lamivudine Resistance: A Study by In Vitro Full-Length viral DNA Transfection "Hepatology, March 1999, 29 (3), 939-945;Kioko "Susceptibility of Lamivudine-resistant hepatitis B virus to other reverse transcriptase inhibitors"The Journal of Clinical Investigation, June 1999,3 (12),1635-1640 ; Zoulim "Drug therapy for chronic hepatitis B: antiviral efficacy and influence of hepatitis B virus polymerase mutations on the outcome of therapy" Journal of Hepatology, 1998,29, 151-168; and Ying et al. J. viral Hepat., March 2000, 7 (2), 161-165.

HBV-감염 환자에 라미부딘 (100 mg qd)을 투여한 대조군 임상 연구에서 치료 1년 후 YMDD-뮤턴트 HBV의 유병율은 14 내지 32%이고, 치료 후 2 내지 3년 후에는 58%였다. YMDD 돌연변이를 포함하지 않는 라미부딘-치료 환자와 관련하여 치료 반응이 감소되었다는 증거와 뮤턴트 바이러스가 연관성을 갖고 있다. Ono et al. The Journal of Clinical Investigation, 2001,107 (4), 449-455.

라미부딘을 투여받는 동안 HBV 복제가 재생된 환자로부터 수득된 바이러스 분리물의 유전자형 분석을 통해 라미부딘에 대한 HBV의 감수성의 감소는 HBV 폴리머라제의 촉매 영역내 YMDD 부위(위치 552번)의 메티오닌을 발린 또는 이소류신으로 치환시키는 것 및 위치 515번 또는 528번(HBV의 유전자형/서트타입에 따라)의 류신을 메티오닌으로 치환시키는 돌연변이와 관련된다고 제안되었다.

현재 환자로부터의 라미부딘-내성 HBV 분리물로 감염된 세포에 대한 항바이러스제의 활성을 평가하기 위하여 사용될 수 있는 세포-기초 HBV 감염 시스템은 존재하지 않는다. 이 모델에서 사용된 1차 오리 간염세포는 세포 배양액에서 수주 이상동안 유지될 수 없기 때문에 약물-내성 돌연변이를 선별함에 있어 시험관내 모델 로서의 오리 HBV(DHBV)는 유용하지 못하다고 입증되었다. 우드척에서의 라미부딘-내성 뮤턴트의 스펙트럼이 HBV-감염 환자에서 확인된 것과 일치하지 않기 때문에 실험관내 모델로서 우드척에서의 약물-내성 뮤턴트를 선별하는 능력은 명확치 않다.

인터페론

인터페론은 면역게를 조절하고 다른 세포 작용을 조절하는 신체내에서 자연적으로 제조된 단백질이다. 인터페론의 주종은 인터페론 알파, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 오메가 및 인터페론 타우이다. 인터페론은 생체내에서 안정성을 증가시키기 위하여 변형될 수 있고, 사이 변형은 페길화(pegylation), 또는 분자의 안정성을 증진시키기 위한 다른 수단을 포함한다.

인터페론중 인터페론 알파 부류의 예로서 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 페길화된 인터페론 알파-2a, 페길화된 인터페론 알파-2b ROFERON®-A (인터페론 알파-2a, Roche),PEGASYS® (페길화된 인터페론 알파- 2a, Roche),INTRON®A (인터페론 알파-2b,Schering Corporation),PEG-INTROND® (페길화된 인터페론 알파-2b, Schering Corporation), 컨센수스 인터페론, INFERGEN (인터페론 알파콘-1)(InterMune), OMNIFERON (자연발생 인터페론)(Viragen,ALBUFERON by 인간 게놈 Sciences), 오랄 인터페론 알파(Amarillo Biosciences) 및 SuperFeron (자연발생 인간 멀티-서브타입 IFN-알파, Genetrol, Inc.)를 포함한다.

다른 타입의 인터페론은 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인 터페론 오메가, REBIF (인터페론 베타-1a)(Ares-Serono), 오메가 인터페론(BioMedicine), 인터페론 감마-1b(InterMune) 및 HuFeron (인간 IFN-베타, Genetrol, Inc.)을 포함한다.

유전공학적으로 처리된 단백질인 α-인터페론에 의한 1일 치료가 가능성을 나타낸다. 인간 혈청-유래 백신이 HBV에 대하여 환자를 면역화시키기 위하여 개발되었다. 유전공학을 통해 백신을 생산할 수 있다. 백신이 효능이 있는 것으로 밝혀졌지만, 만성 보균자로부터 인간 혈청을 공급받는 것은 제한되어 있고, 정제 공정이 길며 비용이 비싸기 때문에 백신 생산에 있어 문제가 있다. 추가로, 안전성을 확인하기 위하여 상이한 혈청으로부터 제조된 백신의 각 배치를 침팬지에서 시험하여야 한다. 추가로, 바이러스로 이미 감염된 환자에 대하여는 백신이 도움이 되지 못한다.

바이러스 질환, 및 특히, HBV 및 HIV에 대한 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오시드의 작용 모드에서 필수 단계는 모노-, 디- 및 트리포스페이트 유도체를 수득하기 위하여 세포 및 바이러스 키나제에 의한 그의 대사 활성화이다. 생물학적으로 활성인 다수의 뉴클레오시드 종은 트리포스페이트 형태이고, 이는 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 저해하거나 쇄 종결을 일으킨다.

HBV에 대하여 활성을 나타내는 다수의 합성 뉴클레오시드가 확인되었다. 3TC로서 알려진, BCH-189의 (-)-에난티오머는 B형 간염 치료용으로 미국 식품의약청에서 승인된 바 있다(참조 미국특허 제 5,532, 246 호 및 BioChem Pharma, Inc.에 의해 출원된 EPA 0 494 119 A1).

PMEA로 언급되는 아데포비르(9- {2- (포스포노메톡시) 에틸} 아데닌 또는 ({2-(6-아미노-9H-푸린-9-일)에톡시} 메틸포스폰산)도 B형 간염 바이러스로 감염된 환자의 치료에 대하여 승인받았다. 참조, 예를 들면, 미국 특허 5,641, 763 및 5,142,051. HBV를 사용하는 환자에서 아데포비르 치료에 대한 내성이 보고되어 있다.

미국 특허 5,814, 639 및 5,914에서 Liotta et al.에 의해 청구된 바 있는 β-2-하이드록시메틸-5- (5-플루오로사이토신-1-일)-1, 3-옥사티올란("FTC")는 HBV에 대하 활성을 나타내었다. 참조, Furman et al.,"The Anti-Hepatitis B virusr Activities, cytoxities, and Anabolic Profiles of the (-) and (+) enantiomers of cis-5-fluoro-1-{2-(Hydroxymethyl)- 1,3-oxathiolane-5-yl}-cytosin" Antimicrobial Agents and Cl2enzotherapy, December 1992,2686-2692 ; and Cheng, etal., Journal of Biological Chemistry, 1992, 267 (20), 13938-13942.

미국 특허 5,565, 438,5, 567,688 및 5,587, 362 (Chu, et al.)에는 B형 간염 및 Epstein Barr 바이러스 치료를 위한 2'-플루오로-5-메틸--β-L-아라비노푸라노일우리딘 (L-FMAU)의 용도에 대하여 기술되어 있다.

펜시클로비르 (PCV;2-아미노-1, 9-디하이드로-9-{4-하이드록시-3-(하이드록시메틸)부틸}-6H-푸린-6-온)은 B형 간염에 대하여 활성이 입증되었다. 참조 미국 특허 5,075, 445 및 5,684, 153.

Yale University 및 The University of Georgia Research Foundation, Inc. 은 WO 92/18517에 B형 간염 바이러스 치료를 위한 L-FDDC(5-플루오로-3'-티아-2', 3'-디데옥시시티딘)의 용도에 대하여 기술하였다.

HBV 치료를 위해 연구된 다른 약물은 아데노신 아라비노시드, 티모신, 어사이클로비르, 포스포노포르메이트, 지노부딘, (+)-시아니다놀, 퀴나크린, 및 2'- 플루오로아라비노실-5-요오도우라실을 포함한다.

미국 특허 5,444, 063 및 5,684, 010에는 Emory University에 의해 B형 간염을 치료하기 위한 에난티오머적으로 순수한 β-D-1, 3-디옥솔란 퓨린 뉴클레오시드 가 기술되어 있다.

WO 96/40164에는 Emory University, UAB Research Foundation, and the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)에 의한 다수의 β--L-2', 3'- 디데옥시뉴클레오시드가 B형 간염을 치료하기 위한 것으로 기술되어 있다.

WO 95/07287에는 또한 Emory University, UAB Research Foundation, and the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)에 의한 2'- 또는 3'-데옥시 및 2',3'-디데옥시-β-L-펜토푸라노실 뉴클레오시드가 HIV 감염을 치료하기 위한 것으로 기술되어 있다.

W096/13512에는 Genencor International,Inc., 및 Lipitek, Inc.에 의해 항종양제 및 비루시드로서 L-리보푸라노실 뉴클레오시드가 기술되어 있다.

W095/32984에는 면역억제제로서 뉴크레오시드 모노포스페이트의 리피드 에스테르를 기술하고 있다.

DE 4224737에는 사이토신 뉴클레오시드 및 그의 약제학적 용도가 기술되어 있다.

Tsai et al.[BiocZzem. Pharmacol. 1994, 48 (7), 1477-81]는 항-HIV 제 2'-β-D-F-2', 3'-디데옥시뉴클레오시드 유사체의 미토콘드리아 DNA의 세포 함량 및 락테이트 생산에 대한 효능을 기술하였다.

Galvez, J.[Class.Irzf. Comput Sci. 1994, 35 (5), 1198-203]는 β-D-3'-아지도-2', 3'-디데옥시-5-플루오로시티딘의 분자적 평가를 기술하였다.

Mahmoudian, Pharm. Research [1991, 8(1), 43-6]는 HIV 제 예로서, β-D-3'-아지도-2', 3'-디데옥시-5-플루오로시티딘의 양적 구조-활성 관계 분석을 기술하였다.

미국 특허 5,703,058에는 HIV 또는 HBV의 치료를 위한 (5-카복시미도 또는 5-플루오로)-(2', 3'- 불포화 또는 3'-변형) 피리미딘 뉴클레오시드가 기술되어 있다.

Lin et al는 [J. Med. Chem. 1988, 31 (2), 336-340]에 β-D-뉴클레오시드의 3'-아지도의 다양한 유사체의 항바이러스 활성 및 합성에 대하여 기술하였다.

Idenix Pharmaceuticals, Ltd.에 의한 WO/00/3998에는 치환된 6-벤질-4-옥소피리미딘의 제조 방법, 및 HIV의 치료를 위한 상기 피리미딘의 용도에 대하여 기술되어 있다.
Idenix Pharmaceuticals, Ltd.는 미국 특허 6,395, 716; 6,444, 652; 6,566, 344 및 6,539, 837에 HBV 치료를 위한 2'-데옥시-β-L-에리트로펜토푸라노- 뉴클레오시드, 및 그의 용도에 대하여 기술하였다. 참조, WO 00/09531. 인간 및 다른 동물에서 B형 간염 감염을 치료하는 방법은 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체중 단독으로 또는 배합되어, β-L- 데옥시리보티미딘 (β-L-dT), β-L-데옥시리보시티딘 (β-L-dC), β-L-데옥시리보우리딘 (β-L-dU), β-L-데옥시리보-구아노신 (β-L-dG), β-L-데옥시리보우리딘 (β-L-dA) 및 β-L-데옥시리보이노신(β-L-dI)을 포함하는 생물학적으로 활성인 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 (다르게는 β-L-dN 또는β-L-2'-dN로 언급)을 유효량으로 투여하는 것을 기술하고 있다. 활성 화합물의 5' 및 N⁴ (시티딘) 또는 N⁶(아데노신) 아실화 또는 알킬화된 유도체, 또는 5'-포스포피리드 또는 5'-에테르 리피드 또한 기술되어 있다.

삭제

von Janta-Lipinski et al.의 [J. Med. Chem., 1998, 41 (12), 2040-2046] 에는 B형 간염 폴리머라제를 억제시키기 위한 3'-플루오로-변형-β-2'-데옥시리보뉴클레오시드 5'- 트리포스페이트의 L-에난티오머의 용도에 대하여 기술되어 있다. 특히, 3'-데옥시-3'-플루오로-β-L-티미딘 (R-L-FTTP), 2', 3'-디데옥시-3'-플루오로-β-L-시티딘 (β-L-FdCTP), 및 2',3'-디데옥시-3'-플루오로-β-L-5-메틸시티딘 (β-L- FMethGTP)의 의 5'-트리포스페이트는 HBV DNA 폴리머라제의 유효한 억제제로서 기술되어 있다. 또한, von Janta-Lipinski et al.는 HBV 및 DHBV의 내인성 DNA 폴리머라제의 뉴클레오시드 저해제로서 β-L-티미딘(β-L-2'-dC 제외)의 트리포스페이트의 생물학적 활성에 대하여 기술하고 있다. 그러나, 인산화되지 않은 형태를 제외한 삼인산화된 β-L-티미딘만이 평가되었고, 논문에 β-L-뉴클레오시드가 세포내 또는 생체내에서 인산화되었는지에 대한 언급은 없고, 더욱 중요하게 생체내에서의 β-L-티미딘의 인산화 효능에 대한 언급도 없다. 이러한 이유에서, β- L-티미딘이 세포내 또는 생체내에서 B형 간염에 활성을 갖고 있다고 교시한 논문은 없다. 참조, WO 96/1204.

Johansson et al.의 유럽 특허 No. 0 352 248 A1에는 B형 간염 치료를 위한 L-리보푸라노실 화합물의 용도에 대하여 기술되어 있다.

Lin et al.는 ["Synthesis of Several pyrimidien L-nucleoside Analogues as Potential 항바이러스Agents"Tetrahedron, 1995, 51 (4), 1055-1068]에서 β-L-5-요오도-2'- 데옥시우리딘(β-L-IUdR, 화합물 7)이 허피스 감염 및 다양한 DNA 바이러스에 대하여 활성이고, BVdU 및 β-L-BV-ara-U 또한 허피스에 대하여 활성이고 β-L- BV-ara-U는 수두대상포진바이러스에 대하여 활성이고; 2', 3'-디데옥시-β-L-aza시티딘는 HBV에 대하여 활성인 것으로 기술되어 있다.

Idenix Pharmaceuticals, Ltd.의 미국 특허 20030083306에는 HBV의 치료를 위한 2'-데옥시-β-L-뉴클레오시드의 3'-프로드럭이 기술되어 있다. 참조, WO01/96353.

Beauchamp의 미국 특허 4,957, 924에는 어사이클로비르의 다양한 치료상의 에스테르가 기술되어 있다.

2002년 4월 17-21일에 스페인 마드리드에서 개최된 European Association for the Study of the Liver 미팅에서 Siihnel et al. of Gilead Sciences, Inc.는 아데포비르와 β-L-2'데옥시티미딘의 배합물이 시험관내에서 HBV에 대하여 추가의 항바이러스 활성을 제공한다고 기술하는 포스터를 제시하였다.

상기 미팅에서 Delaney et al. of Gilead Sciences, Inc.는 라미부딘-내성 HBV, 즉 L528M (rtL180M) 또는M552I(rtM204I)에서의 싱글 돌연변이, 또는 L528M(rtL528M) 및 M552V(rN204V)에서의 이중 돌연변이를 포함하는 HBV 선택 균주는 시험관내에서 L-dT 및 L-dC에 대하여 크로스-내성이라고 구두로 언급하였다.

B형 간염 감염 치료는 인터페론을 사용하는 치료를 포함하는 [Lok and McMahon,AASLD Practice Guidelines, pp. 1225-1241 (2001)]에 기술되어 있다. 우드척 간염 바이러스 (WHV)로 만성적으로 감염딘 이스턴 우드척을 1-(2-플루오로-5-메틸-β-L-아라비노푸라노실-우라실 (L-FMAU)의 항바이러스 효능 및 WHV 표면 항원 백신 연구를 위한 HBV 감염 모델로 사용하였다. L-FMAU 배합물 및 백신과 관련되는 체액면역 및 세포면역은 자가-제한 WHV 감염에서 관찰되는 것과 유사하였다. Menne etal., J. Virology, 76 (11): 5305-5314 (2002).

WO 98/23285에는 유효량 또는 예방학적 유효량의 펜시클로비르 (또는 그의 생물학적 전구체 예: 팜사이클로비르) 및 알파-인터페론를 환자에 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 동물 환자에서 B형 간염 바이러스 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 기술하고 있다.

B형 간염 바이러스에 대하여 활성인 것으로 확인된 항바이러스제의 예로서 하기를 포함한다; 현재 임상적으로 개발중인 약제로 포함한다:

약물 명칭	약물 부류	제조사	FDA 상태
인트론 A (인터페론 α-2b)	인터페론	Schering-Plough	FDA-승인
에피비르-HBV (라미부딘;3TC)	뉴클레오시드 유사체	GlaxoSmithKline	FDA-승인
아데포비르 디피복실	뉴클레오시드 유사체	Gilead Sciences	단계 III^* (NDA 2002년 3월)
코비라실 (엠트리시타빈:FTC)	뉴클레오시드 유사체	Triangle Pharmaceuticals	단계 Ⅲ
엔테카비르	뉴클레오시드 유사체	Bristol-Myers Squibb	단계 Ⅲ
클레부딘(L-FMAU)	뉴클레오시드 유사체	Triangle Pharmaceuticals	단계 Ⅱ
ACH 126,443(L-Fd4C)	뉴클레오시드 유사체	Achillion Pharmaceuticals	단계 Ⅱ
AM 365	뉴클레오시드 유사체	Amrad	단계 Ⅱ(아시아 및 호주)
DAPD	뉴클레오시드 유사체	Triangle Pharmaceuticals	단계 Ⅱ
LdT(텔바부딘)	뉴클레오시드 유사체	Idenix	단계 Ⅱ
XTL 001	모노클로날 항체	XTL Biopharm	단계 Ⅱ(이스라엘)
테리디금	면역 자극제	Epimmune	단계 Ⅱ
자닥신^**(티모신)	면역 자극제	SciClone	Epivir-HBV와 단계 II
EHT 899	바이러스 단백질	Enzo Biochem	단계 II(이스라엘)
HBV DNA 백신	면역 자극제	PowderJect (UK)	단계 I
MCC 478	뉴클레오시드 유사체	E1i Lilly	단계 I(독일)
valdC(발토르시타빈)	뉴클레오시드 유사체	Idenix	단계 I
ICN 2001	뉴클레오시드 유사체	ICN	임상전
플루오로 L 및 D 뉴클레오시드	뉴클레오시드 유사체	Pharmasset	임상전
라시비르	뉴클레오시드 유사체	Pharmasset	임상전
로부스타플라본	뉴클레오시드 유사체	Advanced Life Sciences	임상전

** 자닥신: US에서 희귀의약품으로 인정됨(orphan drug)

노출 후 및/또는 간 이식 치료 후

BayHepB	HBV 이뮤노글루블린	Bayer(US)	FDA 승인
항-B형 간염	HBV 이뮤노글루블린	Cangene(캐나다)	2001년 NDA 제출
Nabi-HB	HBV 이뮤노글루블린	Nabi	FDA 승인

Mark Nelson, MD. Selected Highlights from Drug Development forAnti레트로바이러스 Therapies 2001 (Hep DART 2001) December 16-20,2001, Maui, Hawaii; Selected Highlights from American Association for the Study of Liver Diseases 52nd Annual Meeting (52nd AASLD). November 9-13,2001. Dallas, Texas ; Report on Hepatitis B from Digestive Disease Week2001 ; May 20-23,2001, Atlanta, Georgia.

2002년 6월 25일 공개된 U. S. Application No. 20020098199에는 HBV 및 HCV의 치료를 위한 면역자극 서열이 기술되어 있다.

The Regents of the University of California and Dynavax Technologies Corp.로 양도된 미국 특허 6,225, 292에는 ISS-ODN (면역자극 서열 올리고데옥시뉴클레오시드)의 면역자극 활성을 저해하는 올리고뉴클레오티드, 및 그의 확인 방법및 사용법이 기술되어 있다. 기술된 올리고뉴클레오티드는 치료학적으로 의도하는 ISS-ODN 애주번트 활성 및 재조합 발현 벡터, 예로서, 유전자 요법 및 유전자 면역화에 사용된 것에 의해 영향을 받은 원치않는 ISS-ODN 활성을 조절하는데 유용하다. 올리고뉴클레오티드는 또한 ISS-ODN 포함 미생물에 의한 숙주 감염에 대한 반응에서 염증을 감소시키고, 자가면역 질환을 조절하고, 항원에 대한 숙주의 Th2형 면역 반응을 증가시키는데 있어 유용한 항-염증 활성을 갖는다. 상기 특허는 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 약제학적으로 유용한 컨쥬게이트를 포함한다(컨쥬게이트 파트너 예: 항원 및 항체 포함).

Dynavax Technologies Corp. 로 양도된 미국 특허 6,589, 940에는 면역자극 올리고뉴클레오티드 조성물이 기술되어 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 면역자극 옥타뉴클레오티드 서열을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 면역자극 펩티드 또는 항원와 결합되어 투여될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 투여시 면역 반응을 조절하는 방법이 기술되어 있다. 추가로, 면역자극 활성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 확인하는 시험관내 선별방법이 제공된다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 미국 특허 6,562, 798에는 변형된 사이토신을 포함하는 면역자극 헥사뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역조절 올리고뉴클레오티드 조성물이 기술되어 있다. 올리고뉴클레오티드는 면역조절 펩티드 또는 항원과 결합되어 투여될 수 있다. 변형된 면역자극 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 투여할 때 면역 반응을 조절하는 방법이 기술되어 있다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO 03/014316 A2에는 각개의 면역조절 방법 및 조성물이 기술되어 있다. 3-6mer 면역조절 올리고뉴클레오티드을 포함하는 면역조절폴리뉴클레오티드/미세담체(IMO/MC) 컴플렉스를 투여하여 면역조절한다. IMO/MC 컴플렉스는 공유 또는 비공유결합일 수 있다. 또한, MC내 캡슐화된 3-6mer IMO를 포함하는 면역조절 조성물이 기술되어 있다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO 03/000922 A2에는 면역조절 화합물 및 면역조절 화합물을 사용하는 개개의 면역조절 방법이 기술되어 있다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO 02/052002 A2에는 면역조절 폴리뉴클레오티드 및 면역조절 폴리뉴클레오티드을 사용하는 개개의 면역조절 방법이 기술되어 있다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO01/68144A2 및 PCTW00168143A2에는 조성물 및 개개의 면역조절 방법이 기술되어 있다. 면역조절폴리뉴클레오티드 /미세담체(IMP/MC) 컴플렉스를 투여하므로써 면역조절은 수행된다. IMP/MC 컴플렉스는 공유 또는 비공유 결합일 수 있고, 생분해성 미세담체 또는 나노담체에 결합된 적어도 하나의 면역자극 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 특징으로 한다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO01/68117 A2에는 유두종 바이러스 감염을 치료하는 방법이 기술되어 있다. 면역자극 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 유두종 바이러스에 노출되었거나 감염된 개체에 투여한다. 폴리뉴클레오티드를 유두종 바이러스 항원과 함께 투여하지 않는다. 폴리뉴클레오티드를 투여하여 유두종 바이러스 감염의 증상을 호전시킨다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO01/68078 A2에는 B형 간염 바이러스 (HBV) 및 C형 간염 바이러스 (HCV) 감염 치료 방법이 기술되어 있다. 면역자극 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 HBV 및/또는 HCV에 노출되었거나 감염된 개체에 투여한다. 폴리뉴클레오티드를 HCV 또는 HBV 항원과 함께 투여하지 않는다. 폴리뉴클레오티드를 투여하여 HBV 및/또는 HCV 감염의 증상을 호전시킨다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO01/68077 A3에는 바이러스에 의한 감염을 억제, 예방 및/또는 치료하는 방법이 기술되어 있다. 면역자극 서열 ("ISS")을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 바이러스에 노출될 위험이 있는 개체, 노출되었거나 감염된 개체에 투여한다. ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 바이러스 항원 없이 투여된다. ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 투여하므로써 하나 이상의 바이러스 감염 증상의 발병율 및/또는 중증도는 감소되었다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO01/12223 A2는 1차 항원 및 면 역자극 폴리뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는 2차 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법을 기술하고 있다. 면역 반응의 조절은 통상 Th1 반응의 자극으로서 입증된다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO 00/21556 A1에는 면역자극 폴리뉴클레오티드 및 HIV 항원, 예로서, gpl20을 포함하는 항-바이러스 면역 조절 조성물이 개시되어 있다. 올리고뉴클레오티드 및 항원 조성물 투여시 면역 반응을 조절하는 방법 또한 기술되어 있다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO 00/16804 A1에는 IgE-관련 지환 치료 방법 및 그에 사용되는 조성물이 기술되어 있다. 본 방법은 특히 알레르기 및 알레르기-관련 질환의 치료에 유용하다. 통상 본 방법은 IgE 저해제 (예: 항-IgE 항체) 및 항원 및/또는 면역자극 폴리뉴클레오티드 서열 (ISS)을 투여하는 것을 포함한다. 이 배합법은 예로서, 아나필락시스와 같은 원치않는 부작용은 감소시키면서 좀더 공격적인 요법을 허여하는 것과 같은 현저한 잇점을 제공한다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO 99/62923 A2에는 변형된 사이토신을 포함하는 면역자극헥사뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술되어 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 면역조절 펩티드 또는 항원과 결합되어 투여될 수 있다. 변형된 면역자극 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 투여할 때 면역 반응을 조절하는 방법 또한 기술되어 있다.

Dynavax Technologies Corp.에 양도된 PCT WO98/55495 A2에는 면역자극 옥타뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역자극 올리고뉴클레오티드 조성물이 기술되어 있 다. 이들 올리고뉴클레오티드는 면역자극 펩티드 또는 항원과 결합되어 투여될 수 있다. 올리고뉴클레오티드를 투여할 때 면역 반응을 조절하는 방법 또한 기술되어 있다. 또한, 면역자극 활성을 갖는 올리고뉴클렝로티드를 확인하는 시험관내 선별방법이 기술되어 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO03/015711 A2에는 적어도 2개의 기능상 및 구조상 정의된 영역을 갖는 면역자극 핵산 부류가 기술되어 있다. 이 부류의 결합 모티프 면역자극 핵산은 면역 반응을 활성화시키고 암, 감염 질환 및 알레르기과 같은 다양한 면역 관련 질환의 치료에 유용하다. 또한 핵산은 자연발생 사멸 세포의 활성화 및 1형 인터페론 생산을 자극한다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 미국 특허 6,406, 705에는 적어도 하나의 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드 (CpG ODN)를 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 비핵산 애쥬번트의 시너지적 배합물을 사용하는 방법 및 산물이 기술되어 있다. 애쥬번트 배합물은 항원과 함께 또는 단독으로 사용될 수 있다. 세포면역을 유도하기 위하여 적어도 하나의 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드 (CpG ODN)를 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 및 산물 또한 기술되어 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 미국 특허 6,339, 068에는 CpG-N 모티프를 제거하고 임의로 CpG-S 모티프를 임의로 추가하여 개선될 수 있는 DNA 백신 벡터가 기술되어 있다. 추가로, 고도의 장기간 지속되는 발현 수준 위한 최적화된 벡터는 면역자극 CpG 모티프에 의해 유도된 사이토카인에 의해 하향-조절되지 않는 프로모터/인핸서를 포함하여야 한다. 면역자극을 위한 벡터 및 사용 방법 또 한 제공되어 있다. 본 발명은 또한 작제물에 존재하는 CpG-N 및 CpG-S 모티프를 확인하고, 자극 CpG (CpG-S) 모티프를 제거하고/거나 중화 CpG (CpG-N) 모티프를 삽입하여 핵산 작제물이 치료학적 폴리펩티드의 발현을 증가시킬 수 있도록 하는 개선된 유전자 요법 벡터를 제공한다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 미국 특허 6,239, 116에는 Th1 패턴의 면역 활성화, 사이토카인 생산, NK 용균 활성, 및 B 세포 증식을 자극하는 것을 포함하는 면역 반응을 조절하는 비메틸화 CpG 디뉴클레오시드를 포함하는 핵산 서열이 기술되어 있다. 서열은 또한 유용한 합성 애쥬번트이다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 미국 특허 6,207, 646에는 면역 자극을 자극하고 대상에서 Th1 반응에 대한 Th2 반응을 다시 디렉트하는 능력에 기초한 비메틸화 CpG 디뉴클레오시드를 포함하는 핵산 및 치료적 용도가 기술되어 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 미국 특허 6,194,388에는 대상에서 면역반응을 자극하는 능력에 기초한 비메틸화 CpG 디뉴클레오시드를 포함하는 올리고뉴클레오티드및 치료적 용도가 기술되어 있다. 비메틸화 CpG 디뉴클레오시드를 포함하지 않는 올리고뉴클레오티드(즉, 메틸화 CpG 서열 또는 비 CpG 서열)를 대상에 투여하여 비메틸화 CpG 핵산과 결합경쟁시키는 것을 포함하는, 비메틸화 CpG 디뉴클레오시드에 의해 개시된 면역계 활성화와 관련된 질환을 대상에서 치료하는 요법이 기술되어 있다. 추가로 안티센스 요법에 사용하기 위한 메틸화 CpG 포함 디뉴클레오시드 또는 생체내 하이브리제이션 프로브로서의 메틸화 CpG 포함 디 뉴클레오시드, 및 항바이러스 치료제로서 사용하기 위한 면역저해성 올리고뉴클레오티드가 기술되어 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 U.S. publication no. 20030091599 A1에는 적어도 하나의 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드 (CpG ODN) 를 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드 및 비핵산 애주번트의 시너지 배합물을 이용하는 방법 및 산물이 기술되어 있다. 애쥬번트 배합물은 항원과 함께 또는 단독으로 사용될 수 있다. 유아에서 세포면역을 유도하기 위하여 적어도 하나의 비메틸화 CpG 디뉴클레오티드 (CpG ODN)를 갖는 면역자극 올리고뉴클레오티드를 사용하는 방법 및 산물 또한 기술되어 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO 03/031573 A2에는 면역자극 화합물, TLR3을 통해 작용하는 그의 작용제 및 길항제를 확인하고, 특징화하고, 최적화하기 위하여 제공되는 방법 및 조성물을 기술하고 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO 03/012061 A2에는 가지 세포 발현 데이타베이스에 관련된 방법 및 조성물을 기술하고 있다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO02/069369 A2에는 CpG 디뉴클레오티드의 C, G, 또는 C 및 G의 특정 치환에도 불구하고 CpG 핵산의 면역자극 특성을 갖는 핵산을 포함하는 CpG-양 핵산으로서 기술되어 있는 면역자극 조성물이 기술되어 있다. 다른 것중에서 치환은 C를 위한 메틸화된 C, G를 위한 이노신, 및 CpG를 위한 ZpY(Z는 사이토신 또는 스페이서이고 Y는 이노신, 2-아미노퓨린,네부라린 또는 d스페이서이다)의 교환을 포함한다. CpG-양 핵산을 사용하여 대상자에서 면역 반응을 유도하는 방법 또한 기술되어 있다. 감염 질환, 알레르기, 천식, 암, 빈혈, 저혈소판증 또는 호중성백혈구감소증을 갖거나 상기 질환이 발생할 위험에 있는 대상자의 치료에 유용하다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO01/95935 A1에는 면역자극 핵산을 사용하여 면역 반응을 유도하는 방법 및 산물이 기술되어 있다. 특히, 우선적으로 면역자극 핵산은 Th2 면역 반응을 유도한다. 본 발명은 Th1 면역 반응과 관련된 질환의 예방 및 치료, 또는 Th2 면역 반응에 감수성인 질환의 치료를 위한 Th2 환경을 형성함에 유용하다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO01/22990 A2는 다양한 바이러스 및 증식성 질환 치료에서 IFN-'알파'의 임상적 용도를 확장시키기 위한 방법 및 조성물을 기술하고 있다. 또한 IFN-'알파' 치료의 효능을 증가시키고 IFN-'알파' 치료와 관려된 부작용을 저하시키는 방법 또한 기술되어 있다. 또한, 외인성 IL-3 또는 GM-CSF없이 시험관내에서 자연발생 인터페론 생산 세포(IPCs)를 활성화시키고 생존을 유지시키는 방법 또한 제공한다.

Coley Pharmaceutical Group, Inc.에 양도된 PCT WO01/22972 A2에는 면역자극 핵산 조성물 및 조성물 제조 방법이 기술되어 있다. T-풍부 핵산은 폴리 T 서열을 포함하고/거나 25 % 초과의 T 뉴클레오티드 잔기를 갖는다. TG 핵산은 TG 디뉴클레오시드를 갖는다. C-풍부 핵산은 적어도 하나의 폴리-C 부위 및/또는 50% 초과의 c 뉴클레오시드를 갖는다. 면역자극 핵산은 핵산 포함 CpG 모티프와 유사한 방식으로 작용한다. 본 발명은 또하느 바람직한 CpG 핵산을 포함한다.

B형 간염 바이러스가 전세계적으로 전염병 수준에 도달되었고, 감염된 환자에게 심각하고 때로 비극적인 작용을 가지고 있다는 사실에 비추어, 숙주에 대해 저독성을 갖는 약물-내성 바이러스, 즉, 라미부딘 내성 HBV로 감염된 인간을 치료하는데 효과적인 신규한 약제를 제공하는데 강한 필요성이 남아 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 숙주, 예로서, 인간 환자에서 라미부딘 내성 HBV 감염을 치료 및/또는 예방하기 위한 화합물, 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 원(naive) 숙주, 예로서, 인간 환자에서 내성 HBV 뮤턴트, 예를 들면 YMDD HBV (M552V) 감염을 예방하는 방법, 및 조성물, 및 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 약물 내성 형태의 HBV로 감염된 환자의 치료를 위한 방법, 및 조성물, 및 화합물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 환자에서 내성 내성 HBV 균주의 발현을 억제 또는 예방하고/거나 HBV의 치료하기 위한 효과적인 병용 요법 조성물을 제공하는 것이다.

발명의 요약

β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'- 데옥시시티딘 및 β-L-2'-데옥시티미딘는 552 (M 내지 V) 코돈, 바이러스 역전사효소 부위의 204 (M 내지 V) 코돈에 돌연변이를 갖는 약물-내성 B형 간염 바이러스에 대하여 활성인 것을 발견하게 되었다. 이러한 발견에 기초하여, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙 주, 예로서, 포유동물, 특히 인간에서 라미부딘 내성 HBV (M552V)를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙주, 예로서, 포유동물, 특히 인간에서 라미부딘 내성 HBV (M552V)를 예방하는 방법을 제공한다. β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙주, 예로서, 포유동물, 특히 인간에서 HBV 이중 뮤턴트(L528M/M552V)의 출현을 예방 및/또는 시키는 방법 또한 제공한다.

일면에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 β-L 2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 모든 토토머 및 입체이성체, 및 모든 그의 토토머 및 입체이성체를 제공한다:

상기 식에서,

R¹은 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이고;

R²는 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬,CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이고;

X는 O, S, SO₂ 또는 CH₂이고;

BASE는 임의로 치환될 수 있는 퓨린 또는 피리딘 염기이다.

바람직한 일면에서, X는 O이다.

일면에서, 아미노산 잔기는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄이고, 프롤린에서 R⁸은 임의로 R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있거나; 다르게는, R⁸은 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭 부위이고; R⁹ 는 수소, 알킬 (저급 알킬 포함) 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 (R⁸에 결합된 아실 포함) 또는 알킬 (제한하는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 프로필, 및 사이클로프로필 포함)이다.

본 발명의 또다른 일면으로 β-L 2'-데옥시뉴클레오시드는 하기 화학식의 β-L-2'-데옥시퓨린 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 토토머 및 입체이성체이다:

상기 식에서,

R¹은 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬,CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬,CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹ 및 X²는 H, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고; R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬 (특히 사이클로프로필), 디알킬아미노알킬렌 (특히, 디메틸아미노메틸렌), 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이다.

본 발명의 또다른 일면으로 β-L 2'-데옥시뉴클레오시드는 하기 화학식의 β-L-2'-데옥시피리미딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 토토머 및 입체이성체이다:

R¹은 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬,CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이고;

R²는 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹은 H, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 선택되고; R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬 (특히 사이클로프로필), 디알킬아미노알킬렌 (특히,디메틸아미노메틸렌), 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이다.

특정 일례로 β-L 2'-데옥시뉴클레오시드는 하기 화학식의 β-L-2'- 데옥시시티딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 토토머 및 입체이성체이다:

상기 식에서,

R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬 (특히 사이클로프로필), 디알킬아미노알킬렌 (특히,디메틸아미노메틸렌), 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이다.

바람직한 일면에서, R¹ 및/또는 R²는 H이다.

또다른 바람직한 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 아미노산 잔기, 및 특히 L-발리닐이다.

일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 디메틸아미노메틸렌이다.

또다른 일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 아세틸이다.

또다른 일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 L-발리닐이다.

또다른 특정 일면에서, β-L-2'-데옥시시티딘은 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭이다:

또다른 특정 일면에서, β-L-2'-데옥시시티딘은 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:

상기 식에서,

R²는 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 프로드럭이고;

R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO- 아릴옥시알킬,CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 프로드럭이다.

또다른 일면으로, β-L 2'-데옥시뉴클레오시드는 하기 화학식의 β-L-2'-데옥시티미딘 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 토토머 및 입체이성체이다:

상기식에서,

R¹은 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이고;

R³은 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬 (특히 사이클로프로필), 아실, 아세틸, 부티릴, 디알킬아미노알킬렌 (특히,디메틸아미노메틸렌), CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 유도체이다.

바람직한 일면에서, R¹ 및/또는 R²는 H이다.

또다른 바람직한 일면으로 R¹ 및/또는 R²는 아미노산 잔기, 및 특히 L-발리닐이다.

특정 일례로, β-L-2'-데옥시티미딘는 하기 화학식의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭이다:

또다른 특정 일례로, β-L-2'-데옥시티미딘는 하기 화학식의 하기 화학식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:

또다른 특정 일례로, β-L-2'-데옥시티미딘는 하기 화학식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 토토머 및 입체이성체이다:

R²는 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO- 알킬, CO-알릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 프로드럭이고;

R³은 수소, 직쇄, 분지쇄 또는 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트, 또는 포스페이트 프로드럭이다.

또다른 추가의 일례로, β-L-2'-데옥시티미딘은 하기 화학식의 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다:

바람직한 일면에서, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드에는 그의 반대되는 β-D-에난티오머는 적어도 90% 결여되어 있다.

또다른 일면으로, 본 발명은 기술된 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 유도체의 염, 에스테르 또는 프로드럭을 HBV의 치료학적 양으로 투여하는 것을 포함하는 HBV로 감염된 인간을 치료하는 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 프로드럭은 생체내에서서 투여시 뉴클레오시드로 전환되는 화합물을 뜻한다. 비제한적인 실시예는 활성 화합물의 약제학적으로 허용되는 염(별도로 "생리적으로 허용되는 염"으로 지칭함), 5' 및 N⁴(시티딘) 또는 N⁶(아데노신) 아실화되거나 알킬화된 유도체, 또는 활성 화합물의 5'-포스포리피드 또는 5'-에테르 리피드를 포함한다.

2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드는 하나 이상의 다른 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 또는 B형 간염 바이러스에 대해 활성을 나타내는 하나 이상의 다른 화합물과 교대로 또는 병행하여 투여된다.

본 명세서에서 사용되는 바, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 및 특히 β-L-2'-dC 또는 β-L-2'-dT, 또는 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 포스페이트, 또는 이들 화합물의 프로드럭의 항-B형 간염 바이러스 활성은 두개 이상의 이들 뉴클레오시드와 교대로 또는 병행하여 투여되어 증가될 수 있다. 다르게는 예를 들면, 본 명세서에서 사용되는 바, 하나 이상의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히β-L-2'-dC 또는 β-L-2'-dT는 B형 간염 바이러스에 대하여 활성을 나타내는 하나 이상의 다른 화합물과 교대로 또는 병행하여 투여될 수 있다. 비제한적인 예로서, FTC, L-FMAU, DAPD, 팜시클로비르(famciclovir), 펜시클로비르(penciclovir), BMS-200475, 비스 폼(bis pom) PMEA(아데포비르(adefovir), 디피복실(dipivoxil)); 로부카비르(lobucavir), 간시클로비르(ganciclovir), 데노포비르(tenofovir), LfdaC, 인터페론, 페길화된 인터페론 또는 리바바린(ribavarin)을 포함한다. 일면에서, 본 명세서에서 사용되는 바, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'-dC 또는 β-L-2'-dT는 3TC와 교대로 또는 병행하여 투여될 수 있다.

일면에서, 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드는 내성 또는 야생형 HBV 감염 치료를 위해 하나 이상의 면역조절제, 예로서, TH1 사이토카인, 및 특히 인터페론, 바람직하게 인터페론 감마와 교대로 또는 병행하여 투여된다.

본 발명의 일면에서 면역조절제는 단백질 형태로 전달된다. 다른 일면에서 면역조절제는 면역조절제 단백질을 발현시키는 유전자 또는 유전자 단편 형태로 전 달된다. 본 발명의 특정 일면으로 면역조절제는 유전자 또는 유전자 단편 형태로 전달되고, 아데노바이러스에 의해 매개된다. 본 발명의 특정 일면으로 면역조절제는 인터페론 (예: 인터페론 감마)이고 그의 전달은 아데노바이러스에 의해 매개되는 유전자 또는 유전자 단편 형태로 전달된다.

인터페론, 예로서, 인터페론 알파 또는 인터페론 감마와 교대로 및/또는 병행하여 투여되는 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드는 B형 간염 바이러스에 대하여 인간에서 우수한 요법을 제공한다. 일면에서 인터페론은 단백질 형태로 전형적으로 정맥 또는 동맥으로 직접 투여된다. 본 발명의 다른 일면으로 숙주에서 발현되는 유전자 또는 유전자 단편, 핵산 형태로 투여된다. 인터페론 핵산은 숙주에 "내이키드(naked)"로, 즉 벡터없이 전달될 수 있거나, 다르게는 바이러스 벡터, 예로서 아데노바이러스 벡터로 제한하는 것은 아니지만 벡터를 통해 전달될 수 있다.

일면에서, 인터페론은 인터페론 알파, 임의로, 페길화된 인터페론 알파이다. 또다른 일면으로, 인터페론 알파는 제한하는 것은 아니지만, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 페길화된 인터페론 알파-2a, 페길화된 인터페론 알파-2b ROFERON®-A (인터페론 알파-2a, Roche),PEGASYS® (페길화된 인터페론 알파- 2a, Roche),INTRON®A (인터페론 알파-2b,Schering Corporation),PEG-INTROND® (페길화된 인터페론 알파-2b, Schering Corporation), 컨센수스 인터페론, INFERGEN (인터페론 알파콘-1)(InterMune), OMNIFERON (자연발생 인터페론)(Viragen,ALBUFERON by 인간 게놈 Sciences), 오랄 인터페론 알파(Amarillo Biosciences) 및 SuperFeron (자연발생 인간 멀티-서브타입 IFN-알파, Genetrol, Inc.)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 다른 일면에서, 인터페론은 인터레론 감마이다. 또다른 일면에서 인터페론은 인터페론 베타, 인터페론 타우, 또는 인터페론 오메가이다. 인터페론은 제한하는 것은 아니지만, REBIF (인터페론 베타-1a)(Ares-Serono), 오메가 인터페론(BioMedicine), 인터페론 감마-1b(InterMune) 및 HuFeron (인간 IFN-베타, Genetrol, Inc.)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

일반적으로 교대 요법시 각 약제를 유효량으로 순차적으로 투여하는 반면, 병용 요법에서는 두개 이상의 약제를 유효량으로 함께 투여한다. 용량은 약물의 흡수, 불활성화, 생분포도, 대사 및 배출속도 및 본 기술의 숙련가에게 알려진 다른 인자에 좌우될 것이다. 투여량 값은 또한 완화될 증상의 심각도에 따라 달라질 것임을 알아야 한다. 또한 어떤 특정 환자에 대해, 특정 투여량 요법은 횟수에 대해 환자의 필요성과 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 직업적인 판단에 따라 조정되어야 한다. 적절한 용량 범위의 예는 과학 문헌 및 Physicians Desk Reference를 통해 알 수 있다. 본 명세서에 기술된 다른 화합물의 적절한 투여량 범위의 예로서 다수가 공개 문헌에 기술되어 있고 공지된 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 이 투여량 범위는 원하는 결과를 이루기 위하여 변형될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1a는 출발물질로서 L-리보스 또는 L-크실로스를 사용하여 β-L-에리트로펜타푸라노-뉴클레오시드(β-L-dN)를 수득하는 일반적인 방법을 기술하고 있다. 도 1b 및 1c는 각각 2'-데옥시-β-L- 시티딘로부터 2'-데옥시-β-L-시티딘 (β-L-dC) 의 3'- 및 5'-발리닐 에스테르를 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 2는 2'-데옥시-β-L- 시티딘로부터 N⁴-아세틸-2'-데옥시-β-L-시티딘을 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 3은 2'-데옥시-β-L- 시티딘로부터 N⁴-[(디메틸아미노) 메틸렌〕-2'-데옥시-β-L-시티딘을 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 4는 2'-데옥시-β-L- 시티딘로부터 3', 5'-디-O-아세틸-2'-데옥시-β-L-시티딘을 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 5는 2'-데옥시-β-L- 시티딘로부터 2'-데옥시-β-L-시티딘의 3', 5'-디-O-발리닐 에스테르를 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 6은 2'-데옥시-β-L- 시티딘로부터 2'-데옥시-β-L-시티딘의 N⁴-(Boc-발리닐) 에스테르를 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 7은 3',5', N⁴-트리- (Boc-L-발리닐)-2'-데옥시-β-L-시티딘으로부터 3', 5',N⁴-트리- (L-발리닐)-2'-데옥시-β-L-시티딘을 합성하는 본 발명에 따른 비제한적인 일례이다.

도 8은 다양한 뉴클레오시드의 용해도를 측정함에 유용한 표준 보정 기술을 도시화한 선형 그래프이다. 도 8a는 자연발생 β-D-데옥시리보사이토신에 대하여 측정된 보정 곡선이다. 도 8b는 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르에 대하여 측정된 보정 곡선이다.

도 9a는 pH 7.42에서 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르의 안정성을 평가하기 위하여 사용된 HPLC 프로파일의 비제한적 예이다. HPLC 프로파일은 3개의 활성 대사물질, β-L-데옥시리보사이토신의 3'-발리닐 에스테르, β-L-데옥시리보사이토신의 5'-발리닐 에스테르, 및 L-dC와 함께 3', 5'-디발리닐 에스테르의 존재를 나타낸다. 도 9b는 시간에 따른 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르 및 그의 대사물질의 상대 농도를 도시한 선형 그래프이다.

유사하게, 도 1Oa 및 11a는 각각 pH 7.20 및 4.51에서의 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르의 안정성을 평가하기 위하여 사용된 HPLC 프로파일의 비제한적 예이다. 이들 pH에서, HPLC 프로파일은 3개의 활성 대사물질, β-L-데옥시리보사이토신의 3'-발리닐 에스테르, β-L-데옥시리보사이토신의 5'-발리닐 에스테르, 및 L-dC와 함께 3', 5'-디발리닐 에스테르의 존재를 나타낸다. 도 1Ob 및 11b는 시간에 따른 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르 및 그의 대사물질의 상대 농도를 도시한 선형 그래프이다.

도 12는 pH 1.23에서의 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르의 안정성을 평가하기 위하여 사용된 HPLC 프로파일의 비제한적 예이다. 이 pH에서, HPLC 프로파일은 그의 3개의 활성 대사물질중 어느 것으로도 분해되지 않은 3', 5'-디발리닐 에스테르만의 존재를 나타낸다.

도 13은 인간 혈장내 β-L-데옥시리보사이토신의 3', 5'-디발리닐 에스테르의 시험관내 대사를 도시한 선형 그래프이다.

도 14는 HepG2 세포에서 β-L- 데옥시리보사이토신 (L-dC)의 세포내 대사를 도시한 선형 그래프이다.

도 15는 1차 인간 간세포에서 L-dC의 세포내 축적을 도시한 선형 그래프이다.

도 16은 인간 Hep G2 세포에서의 축적 및 붕괴에 의한 L-dA, L-dC, 및 L-dT의 대사를 도시한 그래프이다. 세포를 10μM의 화합물과 함께 인큐베이션시켰다.

β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'- 데옥시시티딘 및 β-L-2'-데옥시티미딘는 552 (M 내지 V) 코돈, 바이러스 역전사효소 부위의 204 (M 내지 V) 코돈에 돌연변이를 갖는 약물-내성 B형 간염 바이러스에 대하여 활성인 것을 발견하게 되었다. 이러한 발견에 기초하여, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙주, 예로서, 포유동물, 특히 인간에서 라미부딘 내성 HBV (M552V)를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙주, 예로서, 포유동물, 특히 인간에서 라미부딘 내성 HBV (M552V)를 예방하는 방법을 제공한다. β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는 숙주, 예로서, 포유동물, 특히 인간에서 HBV 이중 뮤턴트(L528M/M552V)의 출현을 예방 및/또는 시키는 방법 또한 제공한다.

또다른 일면에서, 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드는 B형 바이러스에 대해 활성을 보이는 하나 이상의 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 또는 하나 이상의 다른 화합물이 교대로 또는 병행하여 투여된다. 일반적으로 교대 요법시 각 약제를 유효량으로 순차적으로 투여하는 반면, 병용 요법에서는 두개 이상의 약제를 유효량으로 함께 투여한다. 용량은 약물의 흡수, 불활성화, 생분포도, 대사 및 배출속도 및 본 기술의 숙련가에게 알려진 다른 인자에 좌우될 것이다. 투여량 값은 또한 완화될 증상의 심각도에 따라 달라질 것임을 알아야 한다. 또한 어떤 특정 환자에 대해, 특정 투여량 요법은 횟수에 대해 환자의 필요성과 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 직업적인 판단에 따라 조정되어야 한다.

또다른 일면으로, 본 발명은 기술된 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 유도체의 염, 에스테르 또는 프로드럭을 HBV의 치료학적 양으로 투여하는 것을 포함하는 HBV로 감염된 인간을 치료하는 방법을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 프로드럭은 생체내에서서 투여시 뉴클레오시드로 전환되는 화합물을 뜻한다. 비제한적인 실시예는 활성 화합물의 약제학적으로 허용되는 염(별도로 "생리적으로 허용되는 염"으로 지칭함), 5' 및 N⁴(시티딘) 및/또는 N⁶(아데노신) 아실화되거나 알킬화된 유도체, 또는 활성 화합물의 5'-포스포리피드 또는 5'-에테르 리피드를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일면은 임의로 약제학적으로 허용가능한 담체중 β-L-2'-데옥시아데노신,β-L-2'-데옥시시티딘, β-L-2'-데옥시우리딘,β-L-2'-구아노신,β-L-2'-데옥시이노신, 및 β-L-2'-데옥시티미딘, 또는 포스페이트, 5' 및/또는 N⁶ 알킬화 또는 아실화 유도체를 포함하는 그의 약제학적으로 허용가능한 프로드럭, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 2'-데옥시- β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 유도체를 유효량으로 투여하는 것을 포함하는 인간 또는 다른 숙주 동물에서 HBV 감염을 치료하는 방법이다. 바람직한 일면에서, 2'-데옥시-β-L-에리트로펜토푸라노-뉴클레오시드는 적어도 지정된 입체배위로 대략 적어도 95%의 단일 이성체의 형태로 투여된다.

1. 본 발명의 정의된 화합물

일면에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 β-L 2'-데옥시뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭, 및 그의 모든 토토머 및 입체이성체를 제공한다:

상기 식에서,

X는 O, S, SO₂ 또는 CH₂이고;

BASE는 임의로 치환될 수 있는 퓨린 또는 피리딘 염기이다.

바람직한 일면에서, X는 O이다.

제 1 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-알킬 (저급 알킬 포함) 또는 아릴이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 2 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-저급 알킬이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 3 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 4 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 5 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 이소프로필이고, R¹⁰ 및 R¹¹은중 적어도 하나는 수소이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 6 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 아미노산 쇄이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 7 하위 일면으로, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 비극성 아미노산 쇄이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

하위 일면의 비제한적인 일례로서, 화학식(I)의 화합물은 하기로 정의될 수 있다:

(1) R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 사이토신이다.

(2) R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(3) R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 티민이다.

(4) R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 사이토신이다.

(5) R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(6) R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 티민이다.

제 8 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-알킬 (저급 알킬 포함) 또는 아릴이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 9 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-저급 알킬이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 10 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 11 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 12 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 이소프로필이고, R¹⁰ 및 R¹¹은중 적어도 하나는 수소이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 13 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 아미노산 쇄이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 14 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 비극성 아미노산 쇄이고, R⁸및R⁶중적어도 하나는 수소이고 B는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

(1) X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 사이토신이다.

(2) X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(3) X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 티민이다.

(4) X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸은 이소프로필이고 BASE는 사이토신이다.

(5) X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(6) X는 O이고, R¹ 및/또는 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 티민이다.

제 15 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고, R²는 C(O)-알킬 (저급 알킬 포함) 또는 아릴이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 16 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)-저급 알킬이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 17 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)-메틸이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 18 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 19 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 이소프로필이고, R¹⁰ 및 R¹¹은중 적어도 하나는 수소이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 20 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 아미노산 쇄이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 21 하위 일면으로, X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 비극성 아미노산 쇄이고, R⁸및R⁶중적어도 하나는 수소이고 B는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

(1) X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 사이토신이다.

(2) X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(3) X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)-메틸이고 BASE는 티민이다.

(4) X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 사이토신이다.

(5) X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(6) X는 O이고, R¹은 수소이고 R²는 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 티민이다.

제 22 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)-알킬 (저급 알킬 포함) 또는 아릴이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 23 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)-저급 알킬이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 24 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)-메틸이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 25 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 26 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 이소프로필이고, R¹⁰ 및 R¹¹은중 적어도 하나는 수소이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 27 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 아미노산 쇄이고, BASE는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

제 28 하위 일면으로, X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹)이고, R⁸은 비극성 아미노산 쇄이고, R⁸및R⁶중적어도 하나는 수소이고 B는 사이토신, 보호된 사이토신 또는 티미딘이다.

(1) X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)-메틸이고 BASE는 사이토신이다.

(2) X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)-메틸이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(3) X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)-메틸이고 BASE는 티민이다.

(4) X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸은 이소프로필이고 BASE는 사이토신이다.

(5) X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 사이토신이다.

(6) X는 O이고, R¹ 및 R²는 독립적으로 C(O)C(R⁸)(H)(NH₂)이고, R⁸은 이소프로필이고 BASE는 보호된 티민이다.

상기 식에서,

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

일면에서, 아미노산 잔기는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄이고, 프로핀에서 R⁸은 임의로 R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있거나; 다르게는, R⁸은 알킬, 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로사이클릭 부위이고; R⁹ 는 수소, 알킬 (저급 알킬 포함) 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 (R⁸에 결합된 아실 포함) 또는 알킬 (제한하는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 프로필, 및 사이클로프로필 포함)이다.

일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 디메틸아미노메틸렌이다.

또다른 일면으로,R³은 수소이고 R⁴는 아세틸이다.

또다른 일면으로, R³은 수소이고 R⁴는 L-발리닐이다.

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

상기 식에서,

바람직한 일면에서, R¹ 및/또는 R²는 H이다.

일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 디메틸아미노메틸렌이다.

또다른 일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 아세틸이다.

또다른 일면에서, R³은 수소이고 R⁴는 L-발리닐이다.

상기 식에서,

상기식에서,

바람직한 일면에서, R¹ 및/또는 R²는 H이다.

II. 정의

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "내성 바이러스"는 제한하는 것을 아니지만, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs), 또는 MT2 또는 MT4 세포를 포함하는 상존 세포주에서 원(native) 바이러스와 비교하여 EC₅₀가 3배 및 더욱 전형적으로 5배 이상 증가한 바이러스를 나타낸다.

본 명세서에서 사용되는 바, B형 간염 및 관련된 증상이란 항-HBV 항체 양성 및 HBV-양성 증상, HBV에 의해 야기된 만성 간염증, 경변, 급성 간염, 극발성 간염, 지속성 만성 간염, 및 피로와 같은 B형 간염 및 관련 증상을 뜻한다. 본 발명의 방법은 항-HBV 항체 또는 HBV-항원 양성이거나 HBV에 노출되었던 환자의 임상적 질병의 진행을 예방적으로 예방하거나 지연시키도록 2'-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드 유도체의 사용을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 생물학적으로 활성인 뉴클레오시드는 간염 리온으로 형질감염된 2.2. 15 세포에서 시험되었을 때 EC₅₀이 15 마이크로몰 이하인 뉴클레오시드를 언급한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "실질적으로 순수한" 또는 "실질적으로 단일 광학 이성체 형태에서"는 적어도 약 95% 내지 98%, 또는 더욱 바람직하게는 99% 내지 100%의 상기 뉴클레오시드의 단일 에난티오머를 포함하는 뉴클레오시드 조성물을 언급한다. 바람직한 일례로, β-L-2'-데옥시뉴클레오사이드는 기술되는 지시에 따라 실질적으로 순수한 형태로 투여된다.

유사하게, 용어 "분리된" 이란 뉴클레오사이드를 적어도 약 85 또는 90 중량%, 바람직하게는 95% 내지 98중량%, 더욱더 바람직하게 99% 내지 100중량%의 뉴클레오사이드이고, 나머지는 다른 화학물 종류 또는 에난티오머를 포함하는 뉴클레오사이드 조성물을 언급한다.

용어 "실질적으로 순수한 형태"는 대략 90% 초과, 다르게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 싱글 에난티오머 화합물을 포함하는 기술하기 위하여 사용된다. 특정 배위(D 또는 L)의 뉴클레오시드가 본 명세서에서 언급되는 경우, 뉴클레오시드는 실질적으로 순수한 형태로 투여되는 것으로 가정된다.

본 명세서에서 용어 "독립적으로"는 독립적으로 적용되는 변수는 적용시마다 독립적으로 다르다는 것을 언급하기 위하여 사용된다. 따라서, 예로서, R"XYR" 화합물에서 R"는 "독립적으로 탄소 또는 질소,"이고 양 R" 모두 탄소일 수 있고, 양 R" 모두 질소일 수 있거나 R" 하나는 탄소이고, 다른 하나의 R"는 질소일 수 있다.

본 원에서 사용되는, 용어 "알킬"은, 다르게 특정되지 않는 한, 전형적으로 C₁ 내지 C₁₈ (바람직하게 C₁ 내지 C₆인C₁ 내지 C₁₀과 같은)의 포화된 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭의 일차, 이차, 또는 삼차 탄화수소를 의미하고, 특히 트리플루오로메틸, CC1₃, CFC1₂, CF₂Cl, CH₂CF₃, CF₂CF₃, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, t-펜틸, 네오펜틸, 아밀, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 사이클로헥실메틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸 및 2,3-디메틸부틸을 포함한다. 이들 용어는 치환 및 비치환 알킬 그룹 둘다를 포함하고, 특히 할로겐화된 알킬 그룹, 및 보다 특히 불소화 알킬 그룹을 포함한다. 알킬 그룹이 치환될 수 있는 부분의 비한정적인 예는 예를 들어 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용되는 [Greene, et al., "Protective groups in Organic Synthesis" John Wiley and Sjons, Second Edition, 1991]에 교시된 바와 같이 당업자들에게 공지된 바에 따라, 할로겐(플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 인산, 포스페이트 및 포스포네이트(이들은 보호되지 않거나, 또는 필요에 따라 보호된다)로 구성된 그룹중에서 선택된다.

용어 저급 알킬이 본원 에 사용되는 경우, 이 용어는 다르게 특정되지 않는 한, 치환 및 비치환 형태 둘다를 포함하여 C₁ 내지 C₄의 포화된 직쇄, 측쇄 또는 사이클릭(예: 사이클로프로필) 알킬 그룹을 의미한다. 본 출원에서 다르게 특정되지 않는 한, 알킬이 적합한 부위인 경우, 저급 알킬이 바람직하다. 유사하게, 알킬 또는 저급 알킬 적합한 부분인 경우, 비치환 알킬 또는 저급 알킬이 바람직하다.

본 원에 사용된 용어 아릴은 다르게 특정되지 않는 한, 페닐, 비페닐 또는 나프틸 및 바람직하게는 페닐을 의미한다. 이 용어는 치환 및 비치환된 부분 둘다를 포함한다. 아릴 그룹은 예를 들어 본 명세서에서 참고 문헌으로 인용되는 [Greene, et al., "Protective groups in Organic Synthesis" John Wiley and Sjons, Second Edition, 1991]에 교시된 바와 같이 당업자들에게 공지된 바에 따라, 할로겐(플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트 및 포스포네이트(이들은 보호되지 않거나, 또는 필요에 따라 보호된다)로 구성된 그룹중에서 선택되나, 이들에만 한정되지 않는 하나 이상의 부분에 의해 치환될 수 있다.

본 발명에서 사용된, 아실이란 식 -C(O)R'의 부분(moiety)을 뜻하며, 여기서 R'은 알킬; 아릴, 알크아릴, 아르알킬, 헤테로아로마틱, 메톡시메틸을 포함한 알콕시알킬; 벤질을 포함한 아릴알킬; 페녹시메틸과 같은 아릴옥시알킬; 할로겐(예를 들어, F, Cl, Br 또는 I), C₁ 내지 C₄ 알킬 또는 C₁ 내지 C₄ 알콕시, 또는 아미노산의 잔기로 임의로 치환된 페닐을 포함한 아릴이다. 아실은 구체적으로 아세틸, 프로피오닐, 부티릴, 펜타노일, 3-메틸부티릴, 히드로겐 숙시닐, 3-클로로벤조일, 벤조일, 아세틸, 피발로일, 메실레이트, 프로피오닐, 발레릴, 카프로익, 카프릴릭, 카프릭, 라우릭, 미리스틱, 팔미틱, 스테아릭, 및 올레익을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 메탄 설포닐, 모노, 디 또는 트리 포스페이트 에스테르, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 트리알킬실닐(예를 들어, 디메틸-t부틸실닐) E또는 디페닐메틸시닐을 포함하는 알킬 또는 아르알킬 설포닐과 같은 설포네이트 에스테르 또한 포함한다.

본 발명에서 사용된, 퓨린 또는 피리미딘 염기란 6-알킬퓨린 및 N⁶-알킬퓨린, N⁶-아실퓨린, N⁶-벤질퓨린, 6-할로퓨린, N⁶-비닐퓨린, N⁶-아세틸레닉 퓨린, N⁶-아실 퓨린, N⁶-히드록시알킬 퓨린, N⁶-티오알킬 퓨린, N² _-알킬퓨린, N⁴-알킬피리미딘, N⁴-아실피리미딘, 4-벤질피리미딘, N⁴-할로피리미딘, N⁴-아세틸레닉 피리미딘, 4-아실 및 N⁴-아실 피리미딘, 4-히드록시알킬 피리미딘, 4-티오알킬 피리미딘, 티민, 사이토신, 6-아자사이토신을 포함하여, 6-아자피리미딘, 2- 및/또는 4-머캅토피리미딘, 우라실, C⁵-알킬피리미딘, C⁵-벤질피리미딘, C⁵-할로피리미딘, C⁵-비닐피리미딘, C⁵-아세틸레닉 피리미딘, C⁵-아실 피리미딘, C⁵-히드록시알킬 퓨린, C⁵-아미노피리미딘, C⁵-시아노피리미딘, C⁵-니트로피리미딘, C⁵-아미노피리미딘, N²-알킬퓨린, N²-알킬-6-티오퓨린, 5-아자사이토신, 5-아자우라실, 트리아졸로피리딘, 이미다졸로피리디닐, 피롤로피리미딘, 및 피라졸로피리미딘을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 염기상의 작용성 산소와 질소 그룹은 필요하거나 원한다면 보호될 수 있다. 적합한 보호 그룹은 본 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 트리메틸실릴, 디메틸헥실실릴, t-부틸디메틸실릴, 및 t-부틸디페닐실릴, 트리틸, 알킬 그룹, 아세틸 및 프로피오닐과 같은 아실 그룹, 메탄설포닐, 및 p-톨루엔설포닐을 포함한다.

바람직한 염기의 예는 사이토신, 5-플루오로사이토신, 5-브로모사이토신, 5-요오드사이토신, 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-요오드우라실, 5-메틸우라실, 티민, 아데닌, 구아닌, 이노신, 크산틴, 2,6-디아미노퓨린, 6-아미노퓨린, 6-클로로퓨린, 및 2,6-디클로로퓨린, 6-브로모퓨린, 2,6-디브로모퓨린, 6-요오도퓨린, 2,6-디-요오도퓨린, 5-브로모비닐사이토신, 5-브로모비닐우라실, 5-브로모에테닐사이토신, 5-브로모에테닐우라실, 5-트리플루오로메틸사이토신, 5-트리플루오로메틸우라실을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "아미노산 잔기"은 제한하는 것은 아니지만, 알라닐, 발리닐, 류시닐, 이소류시닐, 프롤리닐, 페닐알라닐, 트립토파닐, 메틴오닐, 글리시닐, 세리린, 트레오니닐, 시스테이닐, 티로시닐, 아스카르아기닐, 글루타미닐, 아스파토일, 글루타오일, 리시닐, 아르기니닐, 및 히스티디닐의 L 또는 D 에난티오머 또는 라세미 혼합물을 포함하는 그의 혼합물, 모든 토토머 및 입체화학적 배위를 포함한다. 바람직한 아미노산은 L-입체배위이고, 바람직한 아미노산은 L-발릴이다.

표 1에 본 명세서에서 사용되는 아미노산의 약어를 기술한다.

표 1

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "면역조절제" 또는 "면역반응 조절"은 면역 반응을 직접 또는 간접적으로 조절하는 케모카인 또는 사이토카인을 언급하고, 이는 면역자극 및 면역억제 효과를 포함한다. 면역조절은 주로 전체 면역 반응의 양적 변화이고, 또한 이러한 양적 변화는 면역조절과 함께 발생할 수 있다. 면역조절는 "Th2-형" 면역 반응과 반대로 "Th1-형" 면역 반응으로 바뀌는(shift) 면역 반응을 포함할 수 있다. Th1-형 면역 반응은 통상 세포 면역계(예로서, 세포독성 림프구) 반응이고, Th2-형 면역 반응은 일반적으로 "체액", 또는 항체-기초이다. Th1형 면역 반응은 항원에 대한 "지연형 과민성" 반응으로서 특징화되고, 생화학적 수준으로 Th1-관련 사이토카인, 예로서, IFN-감마, IL-2, IL-12, 및 TNF-베타, 및 IFN-알파 및 IL-6의 수준 증가에 의해 검출될 수 있지만, IL-6 또한 Th2형 반응과 관련될 수 있다. Th1형 면역 반응은 일반적으로 세포독성 림프구(CTLs)의 생산 및 낮은 수준의 항체 또는 항체의 일시적 생산와 관련된다. Th2형 면역 반응은 IgE 생산을 포함하는 더욱 높은 수준의 항체 생산, CTL 생산의 부재 또는 극소의 CTL 생산, 및 Th2-관련 사이토카인, 예로서, IL-4의 발현과 관련된다. 따라서, 일면에서 면역조절은 처리하지 않는 것과 비교하여 본 발명에 따라 처리된 개체에서 예를 들면, IFN-감마의 증가 및/또는 IgE 생산의 감소에 의해 인지될 수 있다.

면역조절제는 제한하는 것을 아니지만, 면역반응에 직접 또는 간접적으로 작용하는 케모카인 또는 사이토카인과 같은 분자를 포함한다. 면역조절제의 비제한적인 예로서, TH1 사이토카인, 및 특히, 인터페론, 인터페론-α, 정제된 인터페론-α, 인터페론-α2a, 인터페론-α2b, 인터페론-β , 인터페론-γ, 컨센수스 인터페론, 페길화된 인터페론, 페길화된 인터페론-α, 과립구큰포식세포집락자극인자, 인터루킨, 인터루킨-2, 및 인터루킨-12을 포함한다. 일면에서, 면역조절제는 인터페론, 예로서, 인터페론-γ이다.

본 명세서에서 사용되는 약어는 하기를 의미한다.

Ad IFN 우드척 인터페론 감마를 발현시키는 아데노바이러스 벡터

Ad RFP 우드척 인터페론 감마 유전자를 포함하지 않는 아데노바이러스 벡터

CCC DNA 공유결합된 폐환형 바이러스 DNA

DNA 데옥시리보핵산

FTC (-)-β-2', 3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아시티딘

GFP 그린 형광 단백질

HBV B형 간염 바이러스

IFN 인터페론

L-FMAU 1-(2-플루오로-5-메틸-β, L-아라비노푸라노실)티민

M1, M2 각각 치료 시작 후 1 또는 2개월

PCNA 증식 세포 핵 항원

PCR 폴리머라제 연쇄 반응

Pfu 플라크 형성 유니트

RFP 레드 형광 단백질

RI 복제 중간체

RT 역전사

TUNEL 말단 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라제 (TdT)-매개 dUTP 닉-엔드표지 에세이

WHV 우드척 B형 간염 바이러스

본 명세서에서 사용되는 바 "치료"는 임상적 결과를 포함하는 유리하거나 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위한 유리하거나 원하는 결과는 제한하는 것은 아니지만, 검출하거나 검출할 수 없는 하나 이상의 증상을 완화 또는 호전시키거나, 질환의 정도를 감소시키거나, 질환 상태를 안정화(즉, 더이상 악화시키지 않는 것), 질환의 진행을 예방하거나, 질환의 진행을 지연시키거나 저속화시키거나, 질환 상태를 호전 또는 완화시키고, (부분적으로 또는 전체적으로) 진정시키는 것을 포함한다. "치료"는 또한 치료받지 않은 경우 생존할 수 없을 것으로 예상되는 것과 비교하여 생존을 지연시키는 것을 의미할 수 있다.

본 원에서 사용되는 용어 "숙주"는 세포주 및 동물, 및 바람직하게 인간을 포함하여 바이러스가 복제할 수 있는 단세포 또는 다세포 유기체를 의미한다. 또한, 숙주는 B형 감염 바이러스 게놈의 일부를 운반할 수 있고, 그의 복제 또는 작용은 본 발명의 화합물에 의해 변화될 수 있다. 용어 숙주는 특히 감염된 세포, HBV 게놈 전체 또는 일부에 의해 형질감염된 세포 및 동물, 특히, 영장류(침팬지 포함) 및 인간을 의미한다. 본 발명의 대부분의 동물 적용예에 있어, 숙주는 인간 환자이다. 그러나, 특별한 지시가 있는 경우 본 발명에 의해 수의학적 적용도 명확하게 기대된다(예: 침팬지).

III. 뉴클레오티드 염 또는 프로드럭 제조

용어 "약제학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭"은 본 명세서에서 환자에게 투여되는 경우 β-L-2'- 데옥시뉴클레오시드를 직접 또는 간접적으로 제공하거나 그의 활성을 나타내는 뉴클레오사이드의 모든 약제학적으로 허용되는 형태(예로서, 에스테르, 포스페이트 에스테르, 에스테르 염 또는 관련 그룹의 염)를 기술하기 위하여 사용된다. 약제학적으로 허용되는 염은 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기 염기 및 산으로부터 유도된 것을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 프로드럭은 예를 들어 숙주에서 대사되어 예컨대 가수분해 또는 산화되어 본 발명의 화합물을 형성하는 화합물을 의미한다. 프로드럭의 전형적인 예는 활성 화합물의 작용 부위상에 생물학적으로 불안정한 보호 그룹을 갖는 화합물을 포함한다. 프로드럭은 산화, 환원, 아민화, 탈아민화, 하이드록실화, 탈하이드록실화, 가수분해, 탈가수분해, 알킬화, 탈알킬화, 아실화, 탈아실화, 포스포릴화, 탈포스포릴화하여 활성 화합물을 생성할 수 있는 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물은 HBV, 및 특히 라미부딘- 내성 HBV (M552V)에 대하여 항바이러스 활성을 갖거나 그러한 활성을 갖는 화합물로 대사된다.

본 발명에서 사용된, 약제학적으로 허용되는 염 또는 컴플렉스란 모체 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하고 어쨌든 원하지 않는 최소의 독성 효과를 나타내는 B-L-2'-데옥시뉴클레오시드의 염 또는 착체를 뜻한다. 이러한 염의 제한되지 않는 일예는 (a) 무기산(예를들어, 염산, 브롬산, 황산, 인산, 질산, 중탄산, 탄산 등)으로 형성된 산부가염, 및 아세트산, 옥살산, 포름산, 푸마르산, 프로피온산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 타닌산, 팔모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌설폰산, 나프탈렌디설폰산, 및 폴리갈락투론산과 같은 유기산으로 형성된 염; (b) 소듐, 포타슘, 아연, 칼슘, 비스무쓰, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴, 소듐, 포타슘, 등과 같은 양이온으로, 또는 N,N-디벤질-에틸렌디아민, 암모늄, 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온으로 형성된 염기 부가염; 또는 (c) (a)와 (b)의 병행; 예를들어, 진크 탄네이트 염 등이다.

본 발명에서 설명한 뉴클레오시드를 뉴클레오시드의 활성, 생이용성, 안정성을 증가시키거나 또는 달리 그의 특성을 변경하도록 안정화된 뉴클레오티드 프로드럭로서 투여할 수 있다. 많은 뉴클레오티드 프로드럭 리간드가 알려져 있다. 일반적으로, 뉴클레오시드의 모노, 디 또는 트리포스페이트의 알킬화, 아실화 또는 다른 친유성 변형으로 뉴클레오티드의 안정성을 증가시킬 것이다. 포스페이트 부분상의 하나 이상의 수소를 대체할 수 있는 구성 그룹의 일예는 알킬, 아릴, 스테로이드, 당을 비롯하여, 카보히드레이트, 1,2-디아실글리세롤 및 알코올이다. 대부분이 문헌[R. Jones and N. Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995) 1-17]에 기재되어 있다. 이들중 어떤 것은 개시된 뉴클레오시드와 병행하여 사용됨으로써 원하는 효과를 얻을 수 있다.

일면에서, β-L-2'- 데옥시뉴클레오시드의 5' 및/또는 3'-O 위치 및/또는 N⁴ 위치에서 아실화, 알킬화 또는 인산화된다 (모노, 디 및 트리포스페이트 에스테르 및 안정화된 포스페이트 및 포스포리피드 포함). 일면에서, 아실 그룹은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄, 분지쇄, 또는 사이클릭 알킬, 메톡시메틸를 포함하는 알콕시알킬, 벤질을 포함하는 아르알킬, 페녹시메틸을 포함하는 아릴옥시알킬, 할로겐, 알킬, 알킬 또는 알콕시로 임의로 치환된 페닐을 포함하는 아릴, 설포네이트 에스테르 예: 알킬 또는 아르알킬 설포닐, 예로서, 메탄설포닐, 트리틸 또는 모노메톡시트리틸, 치환된 벤질, 트리알킬실릴, 또는 디페닐메틸실릴로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다. 에스테르중 아실 그룹은 임의로 페닐 그룹을 포함한다. 알킬 그룹은 직쇄, 분지쇄, 또는 사이클릭이고, 바람직하게, C₁ 내지 C₁₈이다.

β-L-2'-데옥시뉴클레오시드는 산 할라이드 또는 안하이드라이드와 같은 적절한 에스테르화제와 반응시켜 약제학적으로 허용가능한 에스테르로 전환될 수 있다. 뉴클레오시드 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 프로드럭은 통상의 방법으로, 예를 들면, 적절한 염기 또는 산으로 처리하여 전환될 수 있다. 에스테르 또는 염은 모 뉴클레오시드로, 예를 들면, 가수분해에 의해 전환될 수 있다. 활성 화합물, 특히 5' 및/또는 3'-O 위치 및/또는 N⁴ 위치에서의 변형은 활성 화합물의 생체이용성 및 대사 속도에 영향을 줄 수 있고, 따라서, 활성 종류에 대하여 조절할 수 있다. 바람직한 변형은 3' 및/또는 5'-아미노산 에스테르이고 이는 L-발리닐 에스테르를 포함한다.

활성 뉴클레오시드는 또한 5'-포스포에테르 리피드 또는 5'- 에테르 리피드로서 제공될 수 있고, 이는 하기 문헌에 기술되며 이들은 참조문헌으로서 인용된다: Kucera, L. S. , N. Iyer, E. Leake, A. Raben, Modest E. K. , D. L. W. , and C. Piantadosi"Novel membrane-interactive ether lipid analogue that inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation."AIDS Res. Hum. retrovirus es,1990. 6,491-501 ; Piantadosi, C. , J. Marasco C. J. , S. L.Morris-Natschke, K. L. Meyer, F. Gumus, J. R. Surles, K. S. Ishaq, L. S. Kucera, N. Iyer, C. A. Wallen, S. Piantadosi, and E. J. Modest"Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleosideconjugates for nti-HIVactivity." Med. Chem.1991, 34, 1408.1414 ; Hosteller, K. Y. , D. D.richman, D. A. Carson, L. M. Stuhmiller, G. M. T. vanWijk, and H. van den Bosch"Greatly enhanced inhibition of Huamn immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C cell by 3'-deoxythimidin diphosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3,-deoxythimidin."247ltimierob. AgentsClzemother. 1992, 36, 2025. 2029; Hosetler, K. Y. , L. M. Stuhmiller, H이다. B. Lenting, H. van den Bosch, and D. D.richnan,"Synthesis and antiretrovirus activity of phospholipid analogue of azidothimidine and other antivirusnucleoside." Biol.Chenu. 1990, 265, 61127.

뉴클레오시드에, 바람직하게는 뉴클레오시드 또는 친유성 제제의 5'-OH 위치에 공유적으로 도입될 수 있는 적절한 친유성 치환체를 기술하는 U. S. patents의 비제한적인 예로서 미국 특허 5,149, 794 (Sep. 22, 1992, Yatvin etal.) ; 5,194, 654 (Mar. 16,1993, Hostetler etal., 5,223, 263 (June 29, 1993, Hostetler etal.) ; 5,256, 641 (Oct. 26,1993, Yatvin etal.) ; 5,411, 947 (May 2,1995, Hostetler etal.) ; 5,463, 092 (Oct. 31,1995, Hostetler etal.) ; 5,543, 389 (Aug. 6,1996, Yatvin etal.) ; 5,543, 390 (Aug. 6,1996, Yatvin etal.) ; 5,543, 391 (Aug. 6,1996, Yatvin etal.) ; and 5,554, 728 (Sep. 10,1996 ; Basava etal.)를 포함하고, 이는 참고문헌으로서 인용된다. 본 발명의 뉴클레오시드에 결합할 수 있는 친유성 치환체, 또는 친유성 제조법을 기술하는 외국 특허 출원은 WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00910, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0 350 287, EP 93917054.4, 및 WO 91/19721을 포함한다.

뉴클레오티드 프로드럭의 비제한적인 예로서, Ho, D. H. W. "Distribution of kinase and deaminase of β-D-arabinnofuranosylcytosin in tissues of man andmuse."Cancer Res. 1973, 33, 2816- 2820; Holy, A. "Isopolar phosphorous-modified nucleotide analogues,"In : De Clercq (Ed. ), JAI Press,Advances in A7lti바이러스 Drug Design, 1992, Vol.I,179-231 ; Hong, C. I., Nechaev, A. , and West, C. R. "Synthesis and antitumorctivity of 1ss-D-arabino-furanosylcytosien conjugates of cortisol and cortisone." Biochem. Biophys. Rs. Commun. 1979a,88, 1223-1229; Hong, C. I. , Nechaev, A.,Kirisits, A. J. Buchheit, D. J. and West, C. R. "nucleoside conjugates as potential antitumorgents. 3. Synthesis and antitumorctivity of 1-(β-D-arabinnofuranosylcytosyl conjugates of corticosteroids and selected lipophilic alcohols."J. Med. Chenu. 1980, 28, 171-177; Hosteller, K. Y. , Stuhmiller, L. M. , Lenting, H. B. M. van den Bosch,H. andRiclnnanJ.Biol. CZzem. 265, 6112-6117 ; Hosteller, K. Y. , Carson, D. A. and richman, D. D. 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Aryl phophate derivates of AZT retain activity againstHIV-1 in cell line which are resistent to the action of AZT.A7ttivirus Res. 1992,17, 311-321 ; McGuigan, C. , Pathirana, R. N., Choi, S. M., Kinchington, D. and O'Connor, T. J. phophoramidate derivates of AZT as inhibitors of HIV ; studies on the 카복시l terminus. antivirus Chemin.Chemother. 1993a, 4, 97-101; McGuigan, C., Pathirana, R. N. , Balzarini, J. and DeClercq, E. "Intracell delivery of bioactive AZT nucleoside by aryl phophate derivates ofAZT."J. Med.Client. 1993b, 36, 1048- 1052.

항 HIV제 AZT의 알킬 수소 포스페이트 유도체는 모 뉴클레오시드 유사체보다 다소 덜 독성일 수 있다.

유용한 포스페이트 프로드럭의 예는 S-아실-2-티오에틸 그룹으로 "SATE"로도 언급된다.

IV.병용 또는 교대 요법

항바이러스제를 사용한 장기간 치료 후 HBV의 약물-내성 변이체가 출현할 수 있다고 인지되었다. 가장 통상적으로 HBV의 경우에 있어서 바이러스 생활주기에 사용되는 효소인 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자의 돌연변이에 의해 약물 내성이 가장 통상적으로 발생한다 최근 주요 약물에 의해 발생하는 것과는 다른 돌연변이를 유발하는 2차 및 아마도 3차, 항바이러스 화합물과의 화합물의 병용 또는 교대로 투여하는 것에 의해 HBV 감염에 대한 약물의 효능이 지연, 증가 또는 재구성될 수 있음이 증명되었다. 다르게는 약물의 약동력학, 생체분포 또는 다른 파라미터가 이러한 병용 또는 교체 요법에 의해 변형될 수 있다. 용량치는 완화시키고자 하는 증상의 심각성에 따라 달라질 수 있음에 주의하여야 한다. 추가로, 특정 대상자의 경우 특적의 투여 요법 및 스케줄은 개체의 요구 및 조성물 투여를 감독하거나 투여하는 전문가의 판단에 따라 조절되어야 함을 이해하여야 한다. 항-HBV 화합물에 대한 적절한 투여량 범위는 과학적 문헌 및 Physicians Desk Reference를 통해 알 수 있다. 본 명세서에 기술된 다른 화합물에 대한 적절한 투여량 범위의 예 또한 공개 문헌에서 알 수 있거나 공지된 방법을 통해 확인할 수 있다. 이 투여량 범위는 원하는 결과를 얻기 위하여 변형될 수 있다.

일반적으로 병용 요법시 유효량의 2 이상의 약제를 함께 투여하는 반면, 교대 요법에서는 유효량의 각 약제를 순차적으로 투여한다. 교대 요법에서, 예를 들면, 하나 이상의 제 1 약제를 바이러스 감염을 치료하기 위한 유효 시간동안 유효량으로 투여한 후, 상기 요법에서 하나 이상의 제 2 약제로 제 1 약제를 대체하고 유사하게 유효 시간동안 유효량으로 투여한다. 배합법이 바이러스상에서 다중의 스트레스를 동시에 유도하기 때문에 교대법보다 바람직하다.

본 명세서에서 기술된 일례중 본 발명의 β-L-2'-뉴클레오시드가 활성 형태로 인산화된 제 2 뉴클레오시드 또는 비뉴클레오시드 역전사효소 저해제와 배합되어 또는 교대뢰 투여되는 경우, 제 2 화합물은 생체내에서 선택된 본 발명의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드를 인산화시키는 것과 상이한 효소에 의해 인산화되어야 한다. 키나제 효소의 예로서, 티미딘 키나제, 사이토신 키나제, 구아노신 키나제, 아데노신 키나제, 데옥시시티딘 키나제, 5'-뉴클레오시다제 및 데옥시구아노신 키나제이다.

본 명세서에서 제공되는 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'-dC 또는 β- L-2'-dT, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 프로드럭의 야생형 또는 내성 HBV 균주에 대한 항-B형 간염 바이러스 활성은 이 병용 요법 및 교대 요법에서 2 이상의 뉴클레오시드를 투여하므로써 증진될 수 있다. 다르게는, 예를 들면, 본 명세서에서 제공되는 하나 이상의 β-L-2'- 데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'-dC 또는 β-L-2'-dT는 단독으로, 또는 B형 간염 바이러스에 대하여 활성을 나타내는 1개 이상의 다른 화합물과 함께 병용 및/또는 교대로 투여될 수 있다. 제한하는 것을 아니지만, 이들 예로서 FTC, L-FMAU, DAPD, DXG, 팜시클로비르, 펜시클로비르, BMS-200475, bis pom PMEA (아데포비르, 디피복실), 로부카비르, 칸시클로비르, 데노포비르, Lfd4C, 포스카메트 (트리소듐포스포노포르메이트), 이소프리이노신, 레바미졸, N-아세틸시스틴(NAC), 인터페론, 페길화된 인터페론, 리바비린, PC1323 또는 폴리아데노사이클릭 폴리우리딜산을 포함한다. 일면에서, 본 명세서에서 제공되는 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히β-L-2'-dC 또는 β-L-2'-dT는 3TC와 함께 병용 및/또는 교대로 투여될 수 있다.

B형 간염 바이러스에 대하여 활성인 것으로 확인되었고, 따라서, 본 발명의 조성물과 함께 병용 및/또는 교대로 사용될 수 있는 약제의 예를 하기에 포함되어 있다:

약물 명칭	약물 부류	제조사	FDA 상태
인트론 A (인터페론 α-2b)	인터페론	Schering-Plough	FDA-승인
에피비르-HBV (라미부딘;3TC)	뉴클레오시드 유사체	GlaxoSmithKline	FDA-승인
아데포비르 디피복실	뉴클레오시드 유사체	Gilead Sciences	단계 III^* (NDA 2002년 3월)
코비라실 (엠트리시타빈:FTC)	뉴클레오시드 유사체	Triangle Pharmaceuticals	단계 Ⅲ
엔테카비르	뉴클레오시드 유사체	Bristol-Myers Squibb	단계 Ⅲ
클레부딘(L-FMAU)	뉴클레오시드 유사체	Triangle Pharmaceuticals	단계 Ⅱ
ACH 126,443(L-Fd4C)	뉴클레오시드 유사체	Achillion Pharmaceuticals	단계 Ⅱ
AM 365	뉴클레오시드 유사체	Amrad	단계 Ⅱ(아시아 및 호주)
DAPD	뉴클레오시드 유사체	Triangle Pharmaceuticals	단계 Ⅱ
LdT(텔바부딘)	뉴클레오시드 유사체	Idenix	단계 Ⅱ
XTL 001	모노클로날 항체	XTL Biopharm	단계 Ⅱ(이스라엘)
테리디금	면역 자극제	Epimmune	단계 Ⅱ
자닥신^**(티모신)	면역 자극제	SciClone	Epivir-HBV와 단계 II
EHT 899	바이러스 단백질	Enzo Biochem	단계 II(이스라엘)
HBV DNA 백신	면역 자극제	PowderJect (UK)	단계 I
MCC 478	뉴클레오시드 유사체	E1i Lilly	단계 I(독일)
valdC(발토르시타빈)	뉴클레오시드 유사체	Idenix	단계 II
ICN 2001	뉴클레오시드 유사체	ICN	임상전
플루오로 L 및 D 뉴클레오시드	뉴클레오시드 유사체	Pharmasset	임상전
라시비르	뉴클레오시드 유사체	Pharmasset	임상전
로부스타플라본	뉴클레오시드 유사체	Advanced Life Sciences	임상전

** 자닥신: US에서 희귀의약품으로 인정됨(orphan drug)

노출 후 및/또는 간 이식 치료 후

공급원: : Hepatitis B Foundation Drug Watch. Compounds in Development for Hepatitis B. www. hepb. org, Pharmaceutical Research and Manufacturers of America. Mark Nelson, MD. Selected Highlights from Drug Development forAntiretrovirus Therapies 2001 (Hep DART 2001) December 16-20,2001, Maui, Hawaii; Selected Highlights from American Association for the Study of Liver Diseases 52nd Annual Meeting (52ndAASLD). November 9-13,2001. Dallas, Texas; Report on Hepatitis B from Digestive Disease Week2001 ; May 20-23,2001, Atlanta, Georgia.

일면에서, 2'-데옥시-β-L-에티트로-펜토푸라노뉴클레오시드는 야생형 또는 내성 HBV 균주의 치료 및/또는 야생형 또는 내성 HBV 균주의 저해 또는 예방을 위해 하나 이상의 면역자극제 및/또는 면역조절제, 예로서, TH1 사이토카인, 및 특히 인터페론, 바람직하게 인터페론 감마와 함께 병용 및/또는 교대로 투여될 수 있다. 예를 들면, 면역자극 서열은 상기 및 하기에 기술된 것을 사용할 수 있다:

우드척 모델 및 형질전환된 마우스에서 IFN 감마, TNF 알파, 및 인터루킨 12를 포함하는 TH1 사이토카인의 간내 발현을 비세포질 경로를 통해 바이러스 복제의 저해를 유도할 수 있다고 제시되었다(Guidotti, L. G. , P. Borrow, A. Brown, H. McClary,R. Koch, and F. V. Chisari"Noncytopathic clearance of lymphocyticchoriomeningitis virus from the hepatocyte"J Exp Med. 1999,189, 1555-1564; Guo, J. T. , H. Zhou, C. Liu, C. Aldrich, J. Saputelli, T. Whitaker, M.1. Barrasa, W. S. Mason, and C. Seeger"Apoptosis and regeneration of hepatocyte during recover from transient hepadnavirus infection "J Virol. 2000, 74,1495-1505.

또다른 일면으로, 본 발명에서 제공되는 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'-dC 또는 β-L-2'-dT는 인터페론, 예: 인터페론 알파 또는 인터페론 감마와 함께 병용 및/또는 교대로 투여되어 인간에서 B형 간염 바이러스 야생형 또는 내성 균주에 대하여 우수한 요법을 제공하고/거나 내성 HBV 발현을 억제시키거나 저해할 수 있다. 일면에서, 인터페론을 예를 들면, 정맥 또는 동맥에 직접 단백질 형태로 투여한다. 다른 일면으로 인터페론을 숙주에 의해 발현되는 그의 유전자 또는 유전자 단편, 핵산 형태로 투여한다. 인터페론 핵산은 숙주에 "내이키드(naked)"로, 즉, 벡터를 포함하지 않고 전달되거나, 다르게는 제한하는 것을 아니지만, 아데노신 벡터와 같은 바이러스 벡터를 통해 전달될 수 있다. 본 발명의 특정 일면에서 면역조절제는 유전자 또는 그의 유전자 단편 형태로 전달되고 그 전달은 아데노바이러스에 의해 조절된다. 본 발명의 특정 일면에서 면역조절제는 인터페론 (예: 인터페론 감마)이고 그의 전달은 아데노바이러스에 의해 조절되는 유전자 또는 그의 유전자 단편 형태로 된다.

면역자극 서열

본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "ISS" 또는 "면역자극 서열은 단독으로 및/또는 MC와 함께 생체내 및/또는 생체외에서 측정되는 바 같은 측정가능한 면역 반응을 일으키는 폴리뉴클레오티드 서열을 언급한다. 측정가능한 면역 반응의 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 항원-특이 항체 생산, 사이토카인 분비, NK 세포, CD4⁺T 림프구, CD8⁺T 림프구, B 림프구 등과 같은 림프구 군집의 활성화 또는 확대를 포함한다. 바람직하게 ISS 서열은 우선적으로 Th1-형 반응을 활성화시킨다. 본 발명에서 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 ISS를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바 "ISS"는 또한 ISS-포함 폴리뉴클레오티드에 대한 약칭이다.

ISS를 포함하는 폴리뉴클레오티드(또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물)를 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 사용할 수 있다. 면역조절 폴리뉴클레오티드는 적어도 하나의 ISS 또는 다수의 ISSs를 포함할 수 있다. ISSs는 폴리뉴클레오티드내 인접하게 존재할 수 있거나, 폴리뉴클레오티드내 추가의 뉴클레오티드 염기에 의해 분리될 수 있다. 다르게, 다수의 ISSs는 각개 폴리뉴클레오티드로서 전달될 수 있다.

ISS는 본 분야에 기술되어 있고 사이토카인 분비, 항체 생산, NK 세포 활성화 및 T 세포 증식와 같은 다양한 면역 반응을 나타내는 표준 에세이를 사용하여 용이하게 확인할 수 있다. 참조, WO 97/28259; WO 98/16247 ; WO 99/11275; Krieg etal. (1995); Yamamoto et al. (1992); Ballas et al. (1996);Klinman et al. (1997); Sato et al. (1996); Pisetsky (1996a) ; Shimada etal. (1986); Jpn. Cancer Res. 77: 808-816 ; Cowdery et al. (1996) J Innnunol. 156: 4570-4575; Roman et al. (1997); and Lipford et al. (1997a).

ISS의 길이는 6 초과의 염기 또는 염기쌍일 수 있고, 이는 통상 서열 5'-사이토신, 구아닌-3'을 포함하고, 바람직하게 길이는 15초과의 염기 또는 염기쌍일 수 있고, 더욱 바람직하게 20 초과의 염기 또는 염기쌍일 수 있다. 본 분야에 공지되어 있는 바와 같이 5'-사이토신, 구아닌-3' 서열의 사이토신은 비메틸화되어 있다. ISS는 또한 서열 5'-퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘, C, G-3'. An ISS 서열 5'-퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘, C, C3'을 포함할 수 있다. 하기 폴리뉴클레오티드 서열에서 나타낸 바와 같이 ISS는 (즉, 하나 이상의) 서열 5'-T, C, G-3'을 포함할 수 있다. 일면에서 ISS는 서열 5'-C, G, 피리미딘, 피리미딘, C, G-3' (예: 5'-CGTTCG-3')을 포함할 수 있다. 일면에서 ISS는 서열 5'-C, G, 피리미딘, 피리미딘, C, G-3' (예: 5'-CGTTCG-3')을 포함할 수 있다. 일면에서 ISS는 서열 5'-C, G, 피리미딘, 피리미딘, C, G, 퓨린, 퓨린-3'을 포함할 수 있다. 일면에서 ISS는 서열 5'-퓨린, 퓨린, C, G, 피리미딘, 피리미딘-3' (예: 5'-AACGTT-3')을 포함한다.

일면에서, ISS는 서열 5'-퓨린, T, C, G, 피리미딘, 피리미딘-3'을 포함할 수 있다.

일면에서, ISS-포함 폴리뉴클레오티드의 길이는 대략 하기 길이 미만이다(염기 또는 염기쌍으로): 10,000 ; 5,000 ; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; 25; 10. 일면에서, ISS-포함 폴리뉴클레오티드의 길이는 대략 하기 길이 초과이다(염기 또는 염기쌍으로): 8; 10; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000 ; 20000; 50000. 다르게는, ISS는 크기의 상한 범위가 10,000 ; 5,000 ; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 50; 25; 또는 10일 수 있고, 독립적으로 하한은 8; 10; 15 ; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500로부터 선택되고, 여기에서 하한은 상한 미민이다.

일면으로, ISS는 하기 서열중 하나를 포함한다:

GACGCTCC ; GACGTCCC ; GACGTTCC ; GACGCCCC ; AGCGTTCC ; AGCGCTCC ; AGCGTCCC ; AGCGCCCC ; AACGTCCC ; AACGCCCC ; AACGTTCC ; AACGCTCC ; GGCGTTCC ; GGCGCTCC ; GGCGTCCC ; GGCGCCCC ; GACGCTCG ; GACGTCCG ; GACGCCCG ; GACGTTCG ; AGCGCTCG ; AGCGTTCG ; AGCGTCCG ; GCGCCCG ; AACGTCCG ; AACGCCCG ; AACGTTCG ; AACGCTCG ; GGCGTTCG ; GGCGCTCG ; GGCGTCCG ; GGCGCCCG. 일면으로, 면역조절 폴리뉴클레오티드는 서열 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-Y (서열번호 : 1)를 포함한다.

일면으로, ISS는 하기 서열중 하나를 포함한다:

GACGCU ; GACGUC ; GACGUU ; GACGUT ; GACGTU ; AGCGUU ; AGCGCU ; AGCGUC ; AGCGUT ; AGCGTU ; AACGUC ; AACGUU ; AACGCU ; AACGUT ; AACGTU ; GGCGUU ; GGCGCU ; GGCGUC ; GGCGUT ; GGCGTU.

일면으로, ISS는 하기 서열중 하나를 포함한다:

GABGCTCC ; GABGTCCC ; GABGTTCC ; GABGCCCC ; AGBGTTCC ; AGBGCTCC ; AGBGTCCC ; AGBGCCCC ; AABGTCCC ; AABGCCCC ; AABGTTCC ; AABGCTCC ; GGBGTTCC ; GGBGCTCC ; GGBGTCCC ; GGBGCCCC ; GABGCTCG ; GABGTCCG ; GABGCCCG ; GABGTTCG ; AGBGCTCG ; AGBGTTCG ; AGBGTCCG ; GBGCCCG ; AABGTCCG ; AABGCCCG ; AABGTTCG ; AABGCTCG ; GGBGTTCG ; GBGCTCG ; GGBGTCCG ; GGBGCCCG ; GABGCTBG ; GABGTCBG ; GABGCCBG ; GABGTTBG ; AGBGCTBG ; AGBGTTBG ; AGBGTCBG ; AGBGCCBG ; AABGTCBG ; AABGCCBG ; AABGTTBG ; AABGCTBG ; GGBGTTBG ; GGBGCTBG ; GGBGTCBG ; GGBGCCBG(여기에서, B는 5-브로모사이토신이다).

일면으로, ISS는 하기 서열중 하나를 포함한다:

GABGCUCC ; GABGUCCC ; GABGUTCC ; GABGTUCC ; GABGWCC ; GBGUUCC ; AGBGTUCC ; AGBGUTCC ; AGBGCUCC ; AGBGUCCC ; AABGUCCC ; ABGUUCC ; AABGUTCC ; AABGTUCC ; AABGCUCC ; GGBGWCC ; GGBGUTCC ; GBGTUCC ; GGBGCUCC ; GGBGUCCC ; GABGCUCG ; GABGUCCG ; GABGUUCG ; ABGUTCG ; GABGTUCG ; AGBGCUCG ; AGBGUUCG ; AGBGUTCG ; AGBGTUCG ; AGBGUCCG ; AABGUCCG ; AABGUUCG ; AABGUTCG ; AABGTUCG ; AABGCUCG ; GGBGUUCG ; GGBGUTCG ; GGBGTUCG ; GGBGCUCG ; GGBGUCCG ; GABGCUBG ; GABGUCBG ; GABGUUBG ; GABGUTBG ; GABGTUBG ; AGBGCUBG ; AGBGUUBG ; AGBGUCBG ; AGBGUTBG ; AGBGTUBG ; AABGUCBG ; AABGUUBG ; AABGUTBG ; AABGTUBG ; AABGCUBG ; GGBGWBG ; GGBGUTBG ; GGBGTUBG ; GGBGCUBG ; GGBGUCBG(여기에서, B는 5-브로모사이토신이다).

다른 일면으로, ISS는 하기 서열중 하나를 포함한다:

5'-TGACCGTGAACGTTCGAGATGA-3' ; 5'-TCATCTCGAACGTTCCACAGTCA- 3' ; 5'-TGACTGTGAACGTTCCAGATGA-3' ; 5'-TCCATAACGTTCGCCTAACGTTCGTC-3' ; 5'-TGACTGTGAABGTTCCAGATGA-3'(여기에서, B는 5-브로모사이토신이다); 5'-TGACTGTGAABGTTCGAGATGA-3'(여기에서, B는 5-브로모사이토신이다), 및 5'-TGACTGTGAABGTTBGAGATGA-3'(여기에서, B는 5-브로모사이토신이다).

ISS및/또는 ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 변형을 포함할 수 있다. ISS의 변형은 본 분야에 공지되어 있는 것을 포함하고, 제한하는 것을 아니지만, 3'-OH 또는 5'-OH 그룹의 변형, 뉴클레오티드 염기의 변형, 당 성분의 변형 및 포스페이트 그룹의 변형을 포함한다. 상기 변형의 예를 하기에 기술한다.

ISS는 싱글 스트랜드 더블 스트랜드 DNA, 및 싱글 또는 더블-스트랜드 RNA 또는 다른 변형된 폴리뉴클레오티드일 수 있다. ISS는 상기 기술된 모티프에 존재할 수 있거나, 상기 모티프 외로 신장될 수 있는 하나이상의 앞뒤역순상동서열(palindromic) 부위를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. ISS는 추가의 Ranking 서열을 포함할 수 있고, 그중 일부를 본 명세서에 기술한다. ISS는 자연발생되거나 변형되거나, 비자연발생된 염기를 포함할 수 있고 변형된 당, 포스페이트, 및/또는 말단을 포함할 수 있다. 예를 들면, 포스페이트 변형은 제한하는 것을 아니지만, 메틸 포스페이트, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트 (가교 또는 비가교 결합), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트를 포함하고 배합하여 사용될 수 있다. 다른 비- 포스페이트 결합 또한 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 백본을 포함할 수 있다. 본 분야에서 공지되어 있는 변형, 예: 2'-알콕시- RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체 및 2'-알콕시- 또는 아미노 -RNA/DNA 키메라 및 본 명세서에 기술된 다른 것은 제조될 수 있고, 어느 포스페이트 변형과 조합될 수 있다. 염기 변형의 예는 제한하는 것을 아니지만, ISS 사이토신의 C-5 및/또는 C-6(예: 5-브로모사이토신, 5-클로로사이토신, 5-플루오로사이토신, 5-요오도사이토신)에 전자를 끄는 부위(electron-withdrawing moiety)를 가하는 것을 포함할 수 있다.

ISS는 제한하는 것을 아니지만, 효소적 방법, 화학적 방법, 및 거대 올리고뉴클레오티드 서열 분해를 포함하는 본 분야에 공지되어 있는 핵산 합성 장치 및 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 참조, 예를 들면, Ausubel et al. (1987); andSambrook etal. (1989). 효소적으로 어셈블리 시킬 때 각 유니트는 예를 들면, 리가제, 예로서, T4 DNA 또는 RNA 리가제로 결찰될 수 있다. 미국 특허 5,124, 246. 올리고뉴클레오티드 분해는 미국 특허 4,650, 675에 예시된 바와 같이 뉴클레아제에 올리고뉴클레오티드를 노출시킴으로써 수행될 수 있다.

ISS는 또한 통상의 폴리뉴클레오티드 분리 방법을 통해 분리될 수 있다. 제한하는 것을 아니지만, 상기 방법은 공유 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위한 프로브와 게놈 또는 cDNA 라이브러리의 하이브리제이션, 공유하는 구조상의 특성을 검출하기 위한 발현 라이브러리의 항체 스크린 및 중합효소연쇄반응에 의한 특정 원(native) 서열의 합성을 포함한다.

환상의 ISS는 재조합 방법을 통해 합성, 분리될 수 있거나, 화학적으로 합성될 수 있다. 환상의 ISS가 분리 또는 재조합 방법을 통해 수득될 경우, ISS는 바람직하게 플라스미드일 것이다. 작은 환상의 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 문헌에 기술된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 참조, 예: Gao et al. (1995) NucleicAcids Res. 23: 2025-2029; and Wang et al. (1994) 핵산 Res. 22: 2326-2333.

올리고뉴클레오티드 및 변형된 올리고뉴클레오티드를 제조하는 기술은 본 분야에 공지되어 있다. 포스포디에스테르 결합을 포함하는 자연발생 DNA 또는 RNA는 순차적으로 3'-말단에 고체 지지체에 결합된 성장 올리고뉴클레오티드의 5'-하이드록시 그룹에 적절한 뉴클레오시드 포스포르마이다이트를 커플링시키고 중간체 포스파이트 트리에스테르를 포스페이트 트리에스테르로 산화시켜 통상 합성된다. 일단 원하는 올리고뉴클레오티드 서열이 합성되면 올리고뉴클레오티드를 지지체로부터 제거하고 포스페이트 트리에스테르 그룹을 포스페이트 디에스테르로 탈보호화하고 뉴클레오시드 염기를 수성 암모니아 또는 다른 염기를 사용하여 탈보호화한다. 참조, 예를 들면, Beaucage (1993)"Oligodeoxyribonucleotide Synthesis"in Protocols for oligonucleotide and analogue, Synthesis and Properties (Agrawal,ed.) Human a Press, Totowa, NJ; Warner et al. (1 984) DNA 3: 401 and U. S. Patent No. 4,458, 066.

ISS는 또한 포스페이트-변형 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트 결합 또는 비-포스페이트 결합을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 분야에 공지되어 있다. 참조: Matteucci(I 997)"Oligonucleotide analogue: an Overview"inOligonueleotides as TlaerapeuticAgents, (D. J.Chadwick and G. Cardew, ed. ) John Wiley and Sons, New York, NY. 본 발명의 올리고뉴클레오티드중 당 또는 당 유도체 부위에 결합할 수 있는 인산 유도체(또는 변형된 인산 그룹)은 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 포스포로티오에이트,포스포로디티오에이트 등이다. 상기 언급한 포스페이트 유사체의 제조, 및 뉴클레오시드, 변형된 뉴클레오시드 및 올리고뉴클레오티드로의 그의 도입은 잘 공지되어 있고, 본 명세서에서는 상세히 기술하지 않는다.Peyrottes et al. (1996) NucleicAcids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi etal. (1996) nucleic acid Res. 24: 2318-2323; and Schultz etal. (1996) nucleic acid Res. 24:2966-2973. 예를 들면, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 합서은 산화 단계가 황화 단계로 대체된 자연발생 올리고뉴클레오티드에 대하여 상기 기술된 것과 유사하다(Zon (1993) "Oligonucleoside phophorothiates"in Protocols for Oligonucleoside and analogue, Synthesis and Properties (Agrawal, ed. ) Human a Press, pp. 165-190). 유사하게, 다른 포스페이트 유사체, 예:포스포트리에스테르(Miller et al. (1971)JACS 93 : 6657-6665), 비교차 포스포르아미데이트 (Jager et al. (1988)Biochem. 27: 7247-7246), N3' 내지 P5'포스포르아미데이트 (Nelson et al. (1997) JOC 62: 7278-7287) 및 포스포로디티오에이트 (미국 특허 5,453, 496)의 합성 또한 기술되어 있다. 다른 비-인산 기초의 변형된 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다(Stirchak et al. (1989) nucleic aicd Res. 17: 6129-6141). 포스포로티오에이트 백본을 포함하는 올리고뉴클레오티드는 포스포디에스테르 백본을 포함하는 것보다 더욱 면역원성일 수 있고, 숙주로 주입된 후 분해에 대하여 더욱 내성을 나타낼 수 있다. Braun etal. (1988)Immunol. 141: 2084-2089; and Latimer et al. (1995) Mol.Immu7101. 32: 1057-1064.

본 발명에서 사용되는 ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 리보뉴클레오시드 (당만을 포함하거나 주요 당 성분으로서 리포스 포함), 데옥시리보뉴클레오시드 (주요 당 성분으로서 데옥시리보스 포함)를 포함할 수 있거나, 본 분야에 공지되어 있고, 변형된 당 또는 당 유사체는 ISS에 도입될 수 있다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스외에, 당 부위는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 크실로스, 리소스, 및 당 "유사체" 사이클로펜틸 그룹일 수 있다. 당은 피라노실, 또는 푸라노실 형태일 수 있다. ISS에서, 당 부위는 바람직하게 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보스의 푸라노시드이고 당은 α 또는 β 배위로 각 헤테로사이클릭 염기에 결합할 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 당 변형은 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함한다. 이들 당 또는 당 유사체 및 각 "뉴클레오시드"(여기에서, 상기 당 또는 유사체는 헤테로사이클릭 염기(핵산 염기)에 그 자체로서 결합되어 있다)는 공지되어 있고, 제조가 특정 실시예에 포함할 수 있다는 것을 제외하면 본 명세서에 기술할 필요없다. 당 변형은 형성되고 ISS의 제조에서 포스페이트 변형과 함께 결합될 수 있다.

ISS에 도입될 수 있는 헤테로사이클릭 염기, 또는 핵산 염기는 자연발생된 주요 퓨린 및 피리미딘 염기, (즉, 우라실 또는 티민, 사이토신, 아데닌 및 구아닌, 상기 언급한 바와 같음), 및 주요 염기의 자연발생 및 합성 변형일 수 있다.

본 분야의 기술자는 다양한 헤테로사이클릭염기 및 다양한 당 부위(및 당 유사체)를 포함하는 다수의 "합성" 비자연발생 뉴클레오시드를 이용할 수 있고, 본 발명의 다른 조건을 충족시키는 한, ISS는 자연발생 핵산의 주된 5개의 염기 성분외에 하나 또는 수개의 헤테로사이클릭 염기를 포함할 수 있다는 것에 주의하여야 한다. 그러나, 바람직하게, ISS중 헤테로사이클릭 염기는 제한하는 것은 아니지만, 우라실-5-일, 사이토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일,구아닌-7-일,구아닌-8-일, 4- 아미노피롤로 [2.3-d] 피리미딘-5-일,2-아미노-4-옥소피롤로[2, 3-d] 피리미딘-5-일, 2- 아미노-4-옥소피롤로 [2.3-d] 피리미딘-3-일 그룹을 포함할 수 있고, 여기에서, 퓨린은 9번 위치에 의해 ISS의 당 부위에, 1번 위치에 의해 피리미딘에, 7번 위치에 의해 피롤로피리미딘에, 및 1번 위치에 의해 피라졸로피리미딘에 결합되어 있다.

ISS 및/또는 IMP는 예를 들면, international application WO 99/62923에 기술된 바와 같은 적어도 하나의 변형된 염기를 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "변형 염기"는 "염기 유사체"의 유사어이며, 예를 들면, "변형 사이토신"은 "사이토신 유사체"의 유사어이다. 유사하게, "변형" 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 는 본 명세서에서 뉴클레오시드 or 뉴클레오티드 "유사체"의 유사어이다. 제한하는 것은 아니지만 염기 변형의 예는 ISS 사이토신의 C-5 및/또는 C-6에 전자 당김 부위(electron-withdrawing moiety)를 가하는 것을 포함할 수 있다. 바람직하게, 전자 당김 부위는 할로겐이다. 변형된 사이토신은 제한하는 것은 아니지만 아자사이토신, 5-브로모사이토신,5-클로로사이토신, 염소화 사이토신, 사이클로사이토신, 사이토신 아라비노시드, 5-플루오로사이토신, 플루오로피리미딘, 5,6-디하이드로사이토신, 5-요오도사이토신,5-니트로사이토신, 5-하이드록시- 사이토신, 및 다른 피리미딘 유사체 또는 변형된 피리미딘을 포함한다. 바람직하게 변형된 우라실은 C-5 및/또는 C-6에서 바람직하게 할로겐으로 변형되고, 제한하는 것은 아니지만, 브로모우라실 예: 5-브로모우라실, 클로로우라실 예: 5-클로로우라실, 플루오로우라실 예: 5-플루오로우라실, 요오도우라실 예: 5-요오도우라실 및 하이드록시우라실을 포함한다. 참조, Kandimalla etal., 2001, Bioorg. Med.Cherfi. 9:807-813. See, For example, International Patent Application No. WO 99/62923. 염기 변형의 다른 예로서 하나 이상의 티올 그룹을 염기에 가하는 것을 포함하고, 제한하는 것은 아니지만 6-티오-구아닌, 4-티오-티민 및 4-티오우라실을 포함한다. 추가로 일부 IMPs는 변형되된 염기, 예:7-데아자구아노신을 구아노신 잔기 대신 포함하거나, 5'-CG-3' 사이토신을 포함하는 사이토신 잔기 대신 N⁴-에틸사이토신 또는 N⁴-메틸사이토신으로부터 선택되는 변형된 사이토신을 포함할 수 있다.

염기-변형 뉴클레오시드의 제조, 및 전구체로서 염기-변형 뉴클레오시드를 사용한 변형된 올리고뉴클레오티드의 합성은 예를 들면, U. S. Pat. Nos. 4,910, 300,4, 948,882, 및 5,093, 232에 기술되어 있다. 이들 염기-변형 뉴클레오시드는 화학 합성에 의해 올리고뉴클레오티드이 말단 또는 내부 위치에 도입될 수 있도록 디자인될 수 있다. 올리고뉴클레오티드이 말단 또는 내부 위치에 존재하는 염기-변형 뉴클레오시드가 펩티드 또는 다른 항원의 결합 부위로서 작용할 수 있다. 당 부위에서 변형된 뉴클레오시드가 기술되어 있고(예로서, , U. S. Pat. Nos. 4,849, 513; 5,015, 733; 5,118, 800; 5,118, 802) 유사하게 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 ISS는 ISS-미세전달체(microcarrier) 컴플렉스로서 제조될 수 있다. ISS-미세전달체 컴플렉스는 미세전달체 (MC)에 결합된 ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 포함한다. ISS-MC 컴플렉스는 미세전달체 표면에 결합(즉, ISS는 MC내 캡슐화되어 있지 않다), 미세전달체내 흡착 (예로서, PGLA 비드로 흡착), 또는 MC내로 캡슐화(예로서, 리포좀내 혼입)된 ISS를 포함한다.

미세입자에 결합된 ISS-포함 올리고뉴클레오티드(세파로스^R 비드)는 시험관내에서 면역자극 활성을 갖는것으로 나타났다(Liang etal., (1996),J Clin. Invest. 98:1119-1129). 그러나 최근 결과를 통해 보면 금, 라텍스 및 자기 입자에 결합된 ISS-포함 올리고뉴클레오티드는 ISS-포함 올리고뉴클레오티드에 반응하여 증식하는 7TD1 세포의 증식을 자극함에 있어 불활성인 것으로 나타났다(Manzel etal., (1999).Antisense Nacl. Acid Drug Dev. 9: 459-464).

미세전달체는 순수한 물에서 불용성이고, 그 크기는 약 50-60㎛ 미만, 바람직하게 약 10 ㎛ 미만, 더욱 바람직하게 약 10㎛ 내지 10㎛, 25 nm 내지 약 5㎛, 50nm 내지 약 4.5㎛ 또는 1.0㎛ 내지 약 2.0㎛이다. 구형 미세전달체가 통상 바람직하지만, 미세전달체는 모든 형태, 예로서 구형, 타원형, 막대형 등 일 수 있다. 바람직한 미세전달체의 크기는 약 50 mn, 200 nm, 1㎛, 1.2㎛, 1.4㎛, 1.5㎛, 1. 6㎛, 1.8㎛, 2. 0㎛, 2.5㎛ 또는 4.5㎛이다. 미세전달체의 "크기"는 통상 "디자인 크기"이거나 제조사에 의해 언급된 입자 크기를 의미한다. 크기는 평균 또는 최대 지름과 같이 직접 측정된 크기일 수 있거나, 여과 선별 분석과 같은 간접적 분석에 의해 측정될 수 있다. 미세전달체 크기의 직접적인 측정은 공지된 크기의 입자와 비교하거나 마이크로미터를 참고로 하여 현미경, 일반적으로 광학 현미경 또는 스캐닝 전자 현미경(SEM)을 사용하여 수행된다. 제조시 크기상에 있어 최소한의 변수가 있을 수 있기 때문에 미세전달체에 측정치가 언급된 측정치의 약 5-10%인 경우 미세전달체는 언급된 크기를 갖는 것으로 본다. 동적광산란에 의해 크기상의 특징을 결정할 수 있다. 다르게는, 미세전달체 크기는 여과 선별 분석에 의해 측정될 수 있다. 입자중 적어도 97%가 언급된 크기의 "선별형" 필터(즉, 필터내 입자 로지(lodge)를 유지하는 "심부필터(depthfilter)"와 반대되는 필터의 표면상에 입자가 유지되는 필터, 예로서, 폴리카보네이트 또는 폴리에테르설폰 필터)를 통과하는 경우 미세전달체는 언급된 크기보다 작다. 미세전달체 입자중 적어도 97%가 언급된 크기의 "선별형" 필터에 의해 유지되는 경우 미세전달체는 언급된 크기보다 크다. 따라서, 크기가 I 0 tim 내지 약 I 0 mn인 적어도 약 97%의 미세전달체가 공극 크기가 10μn인 선별 필터를 통과하고 10nm 선별 필터에 의해 유지된다.

상기 논의한 바와 같이 미세전달체에 대한 크기 또는 크기 범위에 대한 언급은 암시적으로 언급한 크기 및/또는 크기 범위의 변화량 및 근사치를 포함한다. 이는 크기 및/또는 크기 범위에 대하여 언급할 때 용어 "약"을 사용하는 것을 반영하고, "약"으로 언급하지 않는 크기 및/또는 크기 범위는 크기 및/또는 크기 범위가 정확하다고 의미하는 것은 아니다.

미세전달체는 고체상(예로서, 폴리스티렌 비드) 또는 액상(예로서, 리포좀, 미셀, 또는 유수 에멀젼내 오일 드로플릿)일 수 있다. 액상 미세전달체는 리포좀, 미셀, 오일 드로플릿 및 다른 리피드 또는 오일-기초 입자를 포함한다. 바람직한 액상 미세전달체는 수중유 에멀져내 오일 드로플릿이다. 바람직하게, 미세전달체에서 사용되는 수중유 에멀젼은 생적합성 치환체, 예로서, 스쿠알렌을 포함한다. 액상 미세전달체는 통상 비생체분해성이지만, 액상 미세전달체 제제내 하나 이상의 생체분해성 폴리머를 도입하여 생체분해성 액상 미세전달체를 제조할 수 있다. 바람직한 일례로 미세전달체는 수성 pH 완충액중 스쿠알렌, 소르비탄 트리올레이트, TWEEN 80®을 유화시켜 제조된 수중유 에멀젼내 오일 드로플릿이다.

ISS-미세전달체 컴플렉스에서 사용하기 위한 고체상 미세전달체는 생체분해성 물질 또는 비생체분해성 물질로부터 제조될 수 있고, 아가로스 또는 변형된 아가로스 미세전달체를 포함하거나 제외시킬 수 있다. 유용한 고체상 생체분해성 미세전달체는 제한하는 것은 아니지만 생체분해성 폴리에스테르, 예: 폴리 (락트산), 폴리 (글리콜산), 및 그의 코폴리머(블락 코폴리머), 및 폴리 (락트산) 및 폴리 (에틸렌 글리콜)의 블락 코폴리머; 폴리오르토에스테르 예: 3,9-디에틸리덴-2, 4, 8, 10- 테트라옥사스피로[5. 5] 운데칸(DETOSU)에 기초한 폴리머 ; 폴리안하이드라이드 예: 세반산에 기초한 폴리 (안하이드라이드) 폴리머, p-(카복시페녹시) 프로판, 또는 p-(카복시- 페녹시) 헥산; 폴리안하이드라이드 이미디, 예: 아미노산을 혼입한 세반산 유도 모노머에 기초한 폴리안하이드라이드 폴리머(즉, 아미노-말단 질소를 통해 이미드 결합에 의해 세반산에 연결) 예: 글리신 또는 알라닌; 폴리안하이드라이드 에스테르; 폴리포스파젠, 특히 카복실산 그룹의 형성을 통해 폴리머 백본의 분해를 촉진시킬 수 있는 가수분해-감수성 에스테르 그룹을 포함하는 폴리 (폴리포스파젠)(Schacht et al. (1996)Biotech7t0L Bioellg. 1996: 102); 및 폴리아미드 예: 폴리 (락트산-코-라이신)을 포함한다. 미세전달체를 제조하기에 적절한 비생체분해성 물질이 다양하게 공지되어 있고, 제한하는 것을 아니지만, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 라텍스, 금, 및 강자성 또는 상자성 물질을 포함한다. 고체상 미세전달체는 공유적으로 변형되어 ISS 결합에 사용하기 위한 하나 이상의 부위를 혼입하고, 예를 이는 아민-반응 가교결합제를 사용하여 공유 결합하이 위한 아민 그룹을 가함으로써 형성된다.

ISS-미세전달체 컴플렉스는 공유 또는 비공유 결합할 수 있다. 공유결합된 ISS-MC 컴플렉스는 하나 이상의 원자의 가교결합 부위(통상 가교결합제의 잔기)에 의해 결합하거나 직접 결합할 수 있다. 변형되지 않은 ISS는 정전기적 상호작용 또는 염기쌍(예로서, 적어도 하나의 ISS 부위와 미세전달체에 결합된 상보적 올리고뉴클레오티드와의 염기쌍에 의해) 비공유결합 ISS-MC 컴플렉스를 형성에 사용될 수 있지만 ISS는 변형되어 (예로서, 공유 가교결합을 위한 유리 설프하이드릴의 혼입에 의해서, 또는 소수성 결합을 위해 리피드, 스테로이드, 리피드,스테롤 예: 콜레스테롤, 및 테르펜과 같은 소수성 부위의 첨가에 의해) MC와의 결합할 수 있도록 하거나 그의 결합을 강화시킬 수 있다. ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 고체상 미세전달체 또는 다른 화학 부위에 결합하여 본 분야에 공지된 통상의 기술, 예로서, 이용가능한 헤테로이작용성 가교결합제 사용(예로서, 아민-유도된 미세전달체 및 유리 설프하이드릴을 포함하도록 변형된 ISS를 공유결합시키기 위한 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트 또는 그의 설포-유도체)하여 ISS-MC 컴플렉스 형성을 촉진시킬 수 있거나 콜레스테롤과 같은 화합물을 가하여(예로서, Godard et al.[(1995) Eur. JBiochem. 232: 404-410]의 방법에 의해) 수중유 유제중 오일 드로플릿과 같은 소수성 미세전달체와의 결합을 촉진시킬 수 있다. 다르게는, 본 분야에 공지된 것과 같은 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드를 ISS의 어느 말단, 또는 그의 내부에 혼입시킬 수 있다. 이들은 탈블록(deblock)된 경우 미세전달체와의 결합을 촉진시키는 부위 또는 미세전달체상에 존재하거나 그에 결합할 수 있는 다양한 작용 그룹과 반응하는 차단 작용 그룹을 포함할 수 있다. 비공유 결합된 ISS-MC 컴플렉스의 특정 일례는 결합쌍(예로서, 항체 및 그의 동족 항원 또는 바이오틴 및 스트렙타비딘 또는 아비딘),을 이용한다(여기에서, 결합쌍중 하나의 원은 ISS에 결합하고 미세전달체는 결합쌍중 다른 한 원으로 유도화된다(예로서, 바이오틴화된 ISS 및 스트렙타비딘-유도 미세전달체는 결합하여 비공유 결합된 ISS-MC 컴플렉스를 형성할 수 있다).

통상 정전기 결합에 의해 결합된 비공유 ISS-MC 콤플렉스는 폴리뉴클레오티드 백본의 고도의 음전하를 이용하다. 비공유 결합된 ISS-MC 콤플렉스에서 사용하기 위한 미세전달체는 일반적으로 생리학적 pH(예로서, 약 pH 6.8-7. 4)에서 양전하를 띤다. 미세전달체는 본질적으로 양전하를 가질 수 있지만, 통상 양전하를 갖지 않는 화합물로부터 제조된 미세전달체는 양전하로 변형되거나 유도될 수 있다. 예를 들면, 미세전달체를 제조하기 위하여 사용되는 폴리머는 양전하 그룹 예로서 1차 아민을 가하기 위하여 유도화될 수 있다. 다르게는, 양전하 화합물은 제조하는 동안 미세전달체 제형에 도입될 수 있다(예: 폴리 (락트산) /폴리 (글리콜산) 코폴리머를 제조하는 동안 양전하 계면활성제를 사용하여 생성되는 미세전달제 입상에 양전하를 제공할 수 있다).

고체상 중심체는 본 분야의 공지된 기술을 사용하여 제조되고, 예를 들면, 유액-용매 추출법/증발 기술에 의해 제조될 수 있다.

일반적으로 이 기술에서 생체분해성 폴리머 예: 폴리안하이드레이트, 폴리 (알킬-α-시아노아크릴레이트) 및 폴리 (α-하이드록시 에스테르), 예를 들면, 폴리 (락트산), 폴리 (글리콜산), 폴리 (D, L-락트-코-글리콜산) 및 폴리 (카프로락톤)을 적절한 유기 용매, 예로서, 메틸렌 클로라이드에 용해시켜 분산된 상(DP)의 유제를 구성한다. DP를 예를 들면, 폴리비닐알코올 (PVA) 또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)를 포함하는 용해된 계면활성제를 포함하는 과량의 수성 연속상(CP)내로 고속 균질화시켜 유화시킨다 . CP중 계면활성제는 분리된 적정 크기의 유제 드로플릿을 확실하에 형성시킨다. 이어서 유기 용매는 CP로 추출되고 연속하여 시스템 온도를 상승시켜 증발시킨다. 고체 미세입자를 원심분리 또는 여과에 의해 분리하고 4℃에 저장하기 앞서 예로서 동결건조 또는 진공에 적용시켜 건조시킨다.

일반적으로 양이온 중심체, 양이온 리피드 또는 폴리머, 예를 들면, 1,2-디올레오일-1, 2,3-트리메틸암몬로프로판 (DOTAP), 세틸트리메틸- 암모늄브로마이드(CTAB) 또는 폴리리신을 DP 또는 CP를 그의 용해도에 따라서 이들 상에 가한다.

물리화학적 특성, 예로서, 평균 크기, 크기 분포 및 건조된 중심체의 표면 전하를 측정할 수 이다. 크기상의 특성은 예를 들면, 동적 빛 산란 기술에 의해 측정할 수 있고, 표면 전하는 제타 전위 측정에 의해 측정하였다.

일반적으로 4℃에서 입자 및 ISS를 밤새도록 수성 인큐베이션시켜 양이온 중심체상에 ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 흡착시킬 수 있다. ISS 적용 전후 크기 및 표면 전하로서 중심체는 특징화된다. 선택된 배치의 활성은 본 명세서에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다.

바이러스 노출 전, 후 및/또는 노출시 ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 투여할 수 있다. 또한 ISS 폴리뉴클레오티드는 바이러스 감염 전, 후 및/또는 감염시 투여될 수 있다. 또한, ISS 폴리뉴클레오티드는 바이러스 증상의 개시 전, 후에 투여될 수 있다. 따라서, ISS- 포함 폴리뉴클레오티드는 바이러스에 대한 노출, 감염 및/또는 바이러스 감염에 의한 증상의 개시와 관련하여 다양한 시점에 수행될 수 있다. 추가로, 하나 이상 투여가 존재한다. ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 여러 차례 투여하는 경우 ISS는 예를 들면, 1일 1회, 2일마다 1번, 3일마다 1번, 4일마다 1번, 5일마다 1번, 6일마다 1번, 1주에 1번, 2주에 1번, 매달, 또는 1개월에 1번 또는 그보다 길게 (치료 과정동안 동일하거나 상이할 수 있다) 의사에 의해 선택된 스케줄에 따라 투여될 수 있다. 다중 투여되는 경우 ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 이상 별개로 투여될 수 있다. 일반적으로, 필수적인 것은 아니지만, ISS-포함 폴리뉴클레오티드의 효능을 얻기 위해서는 적어도 3일 간격이 필수적이다.

ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 바이러스에 노출될 위험이 있는 개체에 투여할 때(즉, 감염 전), ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 바이러스 노출 전 약 14일미만, 바람직하게 바이러스 노출 전 약 10일미만, 더욱 바람직하게 바이러스 노출 전 약 7일미만, 더욱더 바람직하게 바이러스 노출 전 약 5일미만으로 투여된다. 일면으로, ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 바이러스 노출 약 3일전에 투여된다.

추가의 일면으로 ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 증상이 나타나기 전, 바이러스에 노출된 후 투여된다. 바람직하게, ISS 포함 폴리뉴클레오티드는 노출 시간이 알려져 있거나 추측할 수 있을 경우 바이러스에 노출된 후 약 3일째, 더욱 바람직하게 약 1일, 12시간, 6시간 또는 2시간째 투여된다.

또다른 일면으로, ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 바이러스 감염에 대한 적어도 하나의 증상이 나타난 후 투여된다. 예를 들면, ISS 포함 폴리뉴클레오티드는 바이러스 감염에 대한 증상이 나타난 후 약 28, 21, 14, 7, 5 또는 3일내 투여된다. 그러나, 증상을 나타내는 몇몇 10명의 감염된 개체는 또다른 요법과 함께 하나 이상의 치료 과정에 착수하였을 것이다. 그러한 개체, 또는 그러한 증상의 의미를 이해하지 못한 개체에서는 ISS-포함 폴리뉴클레오티드를 감염 후 어느 시점에 투여할 수 있다.

추가로, ISS-포함 폴리뉴클레오티드을 사용하는 치료법은 다른 치료법와 함께 사용할 수 있거나 '제 1 라인" 치료 실패후 사용되는 "제 2 라인"으로서 사용될 수 있다.

ISS 폴리뉴클레오티드는 본 분야에 공지된 제형, 예로서 건성 분말, 반고체 또는 액상 제형으로 제형화될 수 있다. 비경구적 투여를 위해 ISS 폴리뉴클레오티드는 바람직하게 액상 제형으로 투여되지만, 고체 또는 반고체 제형은 특히 ISS 폴리뉴클레오티드가 저속 방출 데포 형태로 제형화된 것이 허용가능할 수 있다. ISS 폴리뉴클레오티드는 국소 투여를 위해 액상 또는 건성 분말 형태로 제형화되는 반면, 반고체 제형도 때때로 유용할 수 있다.

ISS 폴리뉴클레오티드 제제는 추가의 성분, 예로서, 염, 완충제, 벌크제, 삼투압제, 항산화제, 세제, 계면활성제 및 본 분야에 공지되어 있는 다른 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 통상, 액상 ISS 폴리뉴클레오티드 제제는 주사용으로서 USP 물중 제조되고 멸균, 등장성이고 생리학적으로 허용가능한 pH로 완충처리된 pH, 예: 약 pH 6.8 내지 7.5이다.

ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 전달 비히클, 예로서, 리포좀, 오일/물 유제 또는 저속 방출 데포 제형으로 제형화될 수 있다. 상기 제형으로 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다.

ISS-포함 폴리뉴클레오티드 제제는 본 분야에 잘 공지되어 있는 면역조절제, 예: 애주번트 및 면역자극 사이토카인를 포함하거나 제외시킬 수 있다.

적절한 투여량 범위 또는 유효량은 바이러스 감염을 억제하고/거나 증상을바람직하게 저하시키는 것이고 다수의 요소, 즉 특정 호흡기 바이러스, 폴리뉴클레오티드의 ISS 서열, 폴리뉴클레오티드의 분자량 및 투여 경로에 따라 달라진다. 투여량은 본 분야에 공지된 다양한 파라미터, 예로서 증상의 중증도, 환자의 병력 등에 따라 의사 또는 다른 건강 케어 전문가에 의해 선택된다. 일반적으로, 약 20개의 염기의 ISS-포함 폴리뉴클레오티드에 대한 투여량 범위는 예를 들면, 독립적으로 선택된 하한 예로서, 약 0.1, 0.25, 0.5, 1,2, 5,10, 20, 30, 40,50, 60,80, 100,200, 300,400 또는 500㎛/kg으로부터 하한을 초과하는 독립적으로 선택된 상한, 약 60,80,100, 200,300, 400,500, 750,1000, 1500,2000, 3000,4000, 5000,6000, 7000, 8000,9000 또는 10,000㎛/kg 이하이다. 예를 들면, 투여량은 하기중 하나일 수 있다: 0.1 내지 100 ㎛/kg, 0.1 내지 50㎛/kg, 0.1 내지 25㎛/kg, 0.1 내지 10㎛/kg, 1 내지 500㎛/kg, 100 내지 400㎛/kg, 200 내지 300㎛/kg, 1 내지 100㎛/kg, 100 내지 200㎛/kg, 300 내지 400㎛/kg, 400 내지 500㎛/kg, 500 내지 1000㎛/kg, 500 내지 5000㎛/kg, 또는 500 내지 10,000㎛/kg. 일반적으로 길이가 증가하는 ISS-포함 폴리뉴클레오티드와 같이 감염 조직에 더욱 직접적으로 투여하는 것과 비교하여 비경구적 투여 경로가 더욱 많은 ISS를 요할 수 있다.

ISS를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 전신(예: 비경구) 또는 국소(예: 국부) 투여될 수 있다.

일례로, ISS-포함 폴리뉴클레오티드(들)은 예로서 호흡기 점막(예: 코 통로 또는 폐)에 국소 투여된다. 코인두 및 폐 투여 경로는 제한하는 것은 아니지만, 비내, 흡입, 경기관지 및 경치조(transalveolar) 경로를 포함한다. 따라서, ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 에어로졸, 분무처리된 액상 또는 분말의 흡입으로 투여될 수 있다. ISS-포함 조성물 흡입에 의한 투여에 적절한 장치는 제한하는 것은 아니지만, 분무기(nebulizers), 분무기(atomizers), 기화기, 및 계량 흡입기를 포함한다. ISS- 포함 폴리뉴클레오티드(들)을 포함하는 저장소로 충진되거나 그를 사용하는 분무기(nebulizers), 분무기(atomizers), 기화기, 및 계량 흡입기는 ISS- 포함 폴리뉴클레오티드(들) 흡입 전달에 사용하기 적절한 다양한 장치중 하나이다. 호흡기 점막에 전달하는 다른 방법은 예로서 코 점적제에 의해 액상 제형으로 전달되는 것을 포함한다.

다른 일면에서, ISS-포함 폴리뉴클레오티드는 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여 경로는 제한하는 것은 아니지만, 경피, 경점막 및 직접 주사를 포함한다. 주사에 의해 비경구 투여는 비경구적 주사 경로, 제한하는 것은 아니지만, 정맥내 (IV), 복강내 (IP), 근육내 (IM), 피하 (SC) 및 진피내 (ID) 경로를 포함한다.

경피 및 경점막 투여는 예를 들면, 캐리어(예로서,, 디메틸설폭사이드, DMSO) 포함, 전기 충격(예: 이온삼투법) 적용 또는 그의 병용에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 사용할 수 있는 경피 투여용의 다양한 장치를 이용할 수 있다. 호흡기 바이러스는 기도의세포를 감염시키기 때문에 ISS 폴리뉴클레오티드를 기도에 전달하는 경로, 예로서, 흡입 및 비강내 전달(상기 논의됨)은 상기 경로를 통한 전달은 일반적으로 비경구 전신 경로 투여로 사료되지만 전신 경로 투여보다 국소 경로인 것으로 판단된다.

IV, IP, IM 및 ID 투여는 볼루스 또는 주입 투여에 의할 수 있다. SC 투여를 위해, 볼루스, 주입에 의해 또는 이식가능한 장치, 예로서, 이식가능한 미니펌프(예: 쌈투 또는 기계적 미니펌프) 또는 저속 방출 임플란트에 의해 투여될 수 있다. ISS 폴리뉴클레오티드(들)는 IV, IP, IM, ID 또는 SC 투여를 위해 적합화된 저속 방출 제형으로 전달될 수 있다. 주입과 유사한 전달은 분무기 사용을 통해 수행될 수 있지만, 흡입에 의한 투여는 바람직하게 분리된 용량(예로서, 계량흡입기)로 수행된다. 경피 및 경점막 경로를 통한 투여는 연속적 또는 박동성일 수 있다.

다른 약제

본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는 다른 치료제는 리바비린(Ribapharm, Inc. ), B형 간염 이뮨 글로블린 (Nabi-HB 정맥내, Nabi Pharmaceuticals), ZADAXINTM (티모신 알파 1, SCV-07 (SciClone Pharmaceuticals), 테라디금(Epimmune), 항-B형 간염 하이퍼이뮨 산물(Cangene Corp), RC-529(Corixa/RheinBiochem), HYB2055(Hybridon), ViroKine (인간 항바이러스 단백질, Genetrol, Inc.), 레보비린(Ribapharm, Inc. ), 인터루킨-2(IL-2), 종양 괴사 인자-알파, 인터루킨1-베타, 인터루킨-12 (IL- 12), 과립구-대식세포집락자극인자(GM-CSF), 폴리아데닐- 폴리우리딜산, 티모신 알파, Ampligen^R (Hemispherx BioPharma), Polyadenur^TM (폴리 A: 폴리 U RNA, HemispherxBioPharms), Oragen^TM (HemispherxBioPharms), B형 간염 바이러스(HBV)-특이 세포독성 T 림프구 (CTL) (cellExSys, Inc.), 치료용 B형 간염 백신(Epimmune), PJ Hep B DNA 예방용 백신(Powderject Pharmaceuticals), 인터루킨 4, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 과립구 코로닝 자극 인자.

B형 간염 바이러스 표면 항원 백신은 또한 본 명세서에 기술된 방법 및 조성물에 사용될 수 있다. 일면에서, FTC 및 B형 간염 바이러스 항원 백신예러서, 표면 항원 백신은 임의로 다른 치료제, 예로서, 인터페론과 배합되어 병용 또는 교대로 B형 간염 바이러스 감염 치료 또는 예방을 위한 유효량으로 숙주에 투여된다.

투여할 수 있는 다른 백신는 Engerix-B^R(GlaxoSmithKline), Recombivax HB(Merck), HepatitisB Vaccine (재조합), PJ Hep B DNA 치료용 백신(Powderject Pharmaceuticals), Hepavax-GeneX (DNA 재조합 B형 간염 백신, Berna Biotech 그룹), Gen H-BVaux (Chiron Corporation), Hepatavax-B(Merck & Co.),Hevac BO (Pasteur), KGCO (Korea Green Cross), TGP943TM (Takeda Chem, Japan), GenHevacBOO (Pasteur, France), Bio-Hep-B/Sci-B- VaC(Bio-Technology General, Israel), AG-3,Hepagene,HepacareTM, (Medeva, UK, Evans UK).

V. 유전자 요법

본 발명의 또다른 일면은 생체내 유전자 요법을 사용하여 HBV를 치료하기 위하여 작용 및/또는 시너지 효과의 다른 방법과 함께 본 발명의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드를 병용 및/또는 교대로 면역조절제를 전달하는 것이다. 유전자 요법은 숙주, 예로서, 동물, 및 특히 인간에게 핵산(DNA, RAN, 및 안티센스 DNA 또는 RNA)를 도입하여 프로모터 및/또는 표적 조직에 의한 그의 발현에 필요한 다른 유전자 요소에 작동가능하게 연결될 수 있는 면역조절제의 발현을 증가시키는 것에 관한 것이다. 그러한 유전자 요법 및 전달 기술 및 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들면 하기와 같다: WO 90/11092, WO 98/11779, U.S. Pat. No. 5693622,5705151,5580859, Tabata H.et al(1997). Cardiovasc. Res. 35 (3): 470-479, Chao J et al. (1997)P/lar7nacol. Res. 35 (6): 517-522, Wolff J. A. (1997)NeuronzuscuL Disord. 7 (5): 314-318, Schwartz B. et al. (1996) Genether. 3 (5): 405-411,Tsurumi Y. et al. (1996)Cinculatiooz 94 (12): 3281-3290.

유전자 요법에서 사용되는 폴리펩티드 벡터 작제물은 바람직하게 숙주 게놈내로 통합되지도 않고, 복제가능한 서열을 포함하지 않는 작제물이다. 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 강력한 프로모터를 사용하여 DNA를 발현시킬 수 있다.

폴리펩티드 작제물은 동물 세포내로 주사가능한 물질을 전달하는 방법, 예로서, 조직(심장, 근육, 피부, 폐, 간, 소장 등)의 사이질 공간에 주사하여 전달될 수 있다. 폴리펩티드 작제물은 약제학적으로 허용가능한 액상 또는 수성 캐리어를 통해 전달될 수 있다.

폴리펩티드 작제물은 근육, 피부, 뇌, 폐, 간, 지라, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 정소, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 눈, 선(gland) 및 결합 조직을 포함하는 동물내 조직의 사이질 공간에 전달될 수 있다. 조직의 사이질 공간은 세포내 체액, 장기 조직의 망상섬유중 점액폴리사카라이드 매트릭스, 혈관벽 또는 챔버내 탄력섬유, 섬유 조직의 콜라겐 섬유, 또는 근육 세포 집형성 결합조직내 또는 골소강내 동일한 매트릭스를 포함한다. 유사하게 순환 혈장 및 림프 채널의 림프액으로 채워진 공간이다. 이는 용이하게 이들 세포를 포함하는 조직내 주사에 의해 전달될 수 있다. 비분화 또는 다소 덜 완전하게 분화된 세포, 예로서, 혈액의 줄기 세포 또는 피부 섬유모세포에서 전달 및 발현될 수 있지만, 바람직하게 분화된 지속성 비분할 세포로 전달되고 발현된다.

본 발명의 추가의 일면으로 면역조절제를 발현시키도록 유전자 조작된 세포는 생체내로 환자에 투여된다. 세포는 환자 또는 MHC 적합성 기증자로부터 수득될 수 있고, 제한하는 것은 아니지만, 섬유모세포, 골수 세포, 혈액 세포 (예로서, 림프구), 지방세포 근육세포, 내피 세포등을 포함할 수 있다. 세포는 재조합 DNA 기술을 사용하여 시험관내에서 유전자 조작하거나, 다르게는 제한하는 것은 아니지만, 플라스미드, 코스미드, YACs, 내이키드 DNA, 전기천공, 리포좀 등을 포함하는 형질감염 방법 또는 트랜스덕션(바이러스 벡터 사용, 및 바람직하게 세포 게놈내로 트랜스진을 통합하는 테거의 사용)에 의해 면역조절제의 폴리펩티드의 코딩서열을 도입한다. 면역조절제의 코딩서열은 면역조절 발현, 및 바람직하게 분비를 위한 강력한 구성 또는 유동성 프로모터 또는 프로모터/인핸서의 조절하에 놓여질 수 있다. 면역조절제를 발현 및 바람직하게 분비하는 유전자 조작된 세포는 환자에 예를 들면, 순환 또는 복강내로 전신으로 도입될 수 있다.

다르게는, 세포는 매트릭스내로 혼입될 수 있거나 신체내로 삽입될 수 있고, 예를 들면, 유전자 조작된 내피 세포는 림프관 또는 혈관 이식편의 일부로서 삽입될 수 있다(참조, 예를 들면, Anderson et al. U. S. Pat. No. 5,399, 349; and Mulligan & Wilson, U. S. Pat. No. 5,460, 959).

투여하는 세포가 비자가 또는 비-MHC 적합성 세포인 경우 도입하는 세포에 대하여 숙주에서 면역반응이 일어나지 못하도록 하는 공지된 기술을 사용하여 세포를 투여할 수 있다. 예를 들면, 인접한 세포외 환경과 성분을 교환시키는 동안 숙주의 면역계에 의해 도입된 세포가 인식되지 못하도록 하는 캡슐화된 형태로 세포가 도입될 수 있다.

면역조절제의 발현을 위한 핵산, 유전자 또는 그의 유전자 단편을 포함하는 감염 바이러스 입자로 형질도입될 수 있는 진핵 세포는 제한하는 것은 아니지만, 1차 세포, 예: 1차 유핵 혈액 세포, 예: 백혈구, 과립구, 단핵구, 대식세포, 림프구 (T림프구 및 B-림프구), 전능 줄기 세포, 및 종양 침윤성 림프구 (TIL 세포); 골수 세포; 내피 세포; 상피 세포; 각지세포 ; 줄기 세포; 간세포(예: 간세포 전구 세포); 섬유모세포 ; 중간엽 세포; 중피 세포; 및 실질 세포를 포함한다.

일면에서, 세포는 특정 부위로 표적화되어 세포는 특정 부위에서 치료제로서 작용할 수 있다. 다르게는, 세포는 특정 부위로 표적화되지 않는 세포일 수 있고, 이 세포는 전식 치료제로서 작용한다.

형질도입된 세포를 숙주 세포, 예를 들면, 환자로부터 제거되고 배양액에서 확장된 혈액 세포에 본 발명에 따라 면역조절제를 코딩하는 유전자를 포함하는 감염 바이러스 입자를 도입하는 HBV 치료법에 사용할 수 있다. 세포는 원하는 유전자를 포함하는 감염 바이러스 입자로 형질도입되기 전 또는 후에 다수 확장될 수 있다. 따라서, 본 과정은 환자내로 주입할 때 형질전환된 세포를 환자의 체내에서 면역조절제를 생산하는 것과 유사한 방식으로 수행한다.

형질도입된 세포에 의해 전달되는 유전자 또는 핵산은 구체적으로 면역조절제에 대한 서열을 포함하지만 세포의 치료 효능을 직접, 또는 간접적으로 증진시키는 어느 서열 또한 포함할 수 있다. 형질도입된 세포에 의해 전달되는 유전자는 또한 형질전환된 세포가 보통 갖지 않는 치료적 효능을 발휘할 수 있도록 하는 서열, 예로서, 혈우병 치료에 유용한 응집 인자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 유전자는 치료적 효능을 갖는 하나 이상의 산물을 코딩한다. 적절한 유전자 또는 핵산의 예로서 사이토카인 예: TNF, 인터루킨 (인터루킨 1-14), 인터페론(.알파, .베타, . .감마, .-인터페론), T-세포 수용체 단백질 및 항체의 항원-결합 영역에 대한 Fc 수용체, 예: 이뉴노글로블린을 코딩하는 것을 포함한다. 추가의 적절한 유전자의 예는 세포가 일반적으로 "표적화"하지 않는 신체내 부위로 세포가 "표적화"되도록 변형시키는 유전자를 포함하고, 이로써 상기 부위에서 세포의 치료적 성질을 사용할 수 있도록 한다. 예를 들면, TIL 세포와 같은 혈액 세포는 예를 들면, 모노클로날 항체의 Fab 부위를 세포내로 도입하여 세포가 선택된 항원을 인식할 수 있도록 변형시킬 수 있다.

"벡터"로서 공지된 캐리어를 사용하여 세포내로 핵산을 전달하는 것은 통상적이지만, 필수적인 것은 아니다. 유전자 요법에서 가장 보편적으로 사용되는 벡터 타입은 바이러스이다. 과학자들은 바이러스가 세포의 DNA를 진입시키는 유일한 능력을 갖고 있기 때문에 바이러스를 사용한다. 유전자 요법에서 벡터로서 사용되는 바이러스는 유전적으로 불능이고; 스스로 재생할 수 없다. 대부분의 유전자 요법 임상 시험은 원하는 유전자를 전달하기 위하여 마우스 레트로바이러스에 의존한다. 벡터로서 사용되는 다른 바이러스는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 폭스바이러스 및 헤르페스 바이러스를 포함한다.

예를 들면, 환자로부터의 세포는 제거되고 실험실에서 배양된다. 원하는 유전자를 전달하는 바이러스에 세포를 노출시킨다. 바이러스는 세포내로 진입하고, 원하는 유전자는 세포 DNA의 일부가 된다. 세포는 실험실에서 성장하고 환자로다로 보내진다. 이러한 유형의 유전자 요법을 생체외(ex vivo)로 명명되고, 이는 "인체 외부"를 의미한다. 세포가 환자의 신체외부에 있는 동안 유전자는 환자의 세포내로 이동된다. 다른 연구에서 벡터 또는 리포좀 (지방 입자)를 사용하여 원하는 유전자를 환자의 신체내에서 세포로 전달한다. 유전자가 환자의 신체내에서 세포로 이동하기 때문에 이러한 형태의 유전자 요법을 생체내(in vivo)라 명명한다.

바이러스 벡터를 사용하여 유전자를 신체내로 전달할 때 의도하는 세포외의 것도 변형시킬 수 있다. 또다른 위험은 새로운 유전자는 DNA의 잘못된 위치에 삽입되어 가능하게는 암 또는 다른 상해를 유발할 수 있다. 또한, DNA를 직접 조입하거나, 리포솜을 전달 시스템을 사용할 때 DNA는 생식 세포내로 도입되어 유전자 변형을 일으킬 수 있다.

다른 관심사로서는 전달된 유전자는 "과잉발현"되어 얼마의 결손 단백질이 유해하게 할 수 있고, 바이러스 벡터는 염증 또는 면역 반응을 유발할 수 있고; 바이러스는 환자로부터 다른 개체 또는 환경으로 전염될 수 있다는 가능성이 포함된다.

본 분야에 공지된 다수의 벡터가 존재한다. 어느 공지된 벡터를 본 발명에 사용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일면에서 벡터는 특이 유전자 전달을 위해 특정 세포 타입을 표적화할 수 있다.

아데노바이러스 벡터

어느 아데노바이러스 벡터를 사용하여 세포 및/또는 세포주를 형질감염시켜 면역조절제를 발현시키고/거나 분비시킬 수 있다. 아데노바이러스는 선형의 더블 스트랜드 DNA 게놈을 포함하는 비-인벨럽 바이러스이다. 아데노바이러스중 40개 이상 혈청형 균주가 존재하지만, 이중 대부분은 인간에서 악성 호흡 기관 감염을 유발하고, 서브그룹 C 혈청형 2 또는 5가 주로 벡터로서 사용된다. 라이프 사이클은 보통 숙주 게놈내로의 통합을 포함하기 보다는, 숙주 세포의 핵내에서 에피좀 요소로서 복제하므로써 삽입돌연변이의 위험이 없도록 한다. 야생형 아데노바이러스 게놈은 대략 35 kb이고, 이중 30 kb까지는 외래 DNA로 대체될 수 있다(Smith, 1995,Venna and Somia, 1997). 조절 작용을 갖는 4개의 초기 전사 유니트(E1, E2, E3 and E4), 및 구조 단백질을 코딩하는 후기 트랜스크립트가 존재한다. 전구 벡터는 헬퍼 바이러스, 플라스미드에 의해 트랜스 공급되거나 헬퍼 세포 게놈(인간 태아 신장 세포, 세포주 293, Graham, F. L. , Smiley, J. , Russell, W. L. and Nairn, R. (1997). General Virology 36: 59-72. )내로 통합되는 미싱 유전자와 함께 불활성화된 E1 또는 E3 유전자를 갖는다. 2차 형성 벡터는 추가로 E2a 온도 민감성 뮤턴트 (Engelhardt, J. F. , Litsky, L. , and Wilson, J. M.(1994). Human Gene7therapy 5: 1217-1229. ) 또는 E4 결실(Armentano, D. , Zabner, J. , et al. (1997).Journal of Virology 71 : 2408-2416. )을 사용한다. 가장 최근에 "구트리스(gutless)" 벡터는 트랜스진 주변에 패킹 서열 및 역 말단 리피트(inverted terminal repeats (ITRs))만을 포함하고, 모든 필요한 바이러스 유전자는 헬퍼 바이러스에 의해 제공된다(Chen, H이다., Mack, L. M., Kelly, R. , et al. (1997). Proceedingsof the National ScarZemy of Sciences of the US. A. 94: 1645-1650. ).

아데노바이러스 벡터는 시험관내 및 생체내에서 표적 세포를 형질도입함에 매우 효과적이고, 높은 역가에서 생산될 수 있다(>1O¹¹/mL). E1 결실 벡터를 사용하여 래트의 뇌에서 트랜스진 발현을 연장시킨 Geddes, B. J., Harding, T. C.,Lightman,S. L. andUney, J. B. (1997). Nature Medicine 3: 1402-1404.)을 제외하고, 전구체 벡터로부터의 트랜스진 발현은 일시적인 경향이 있다 (Verma,I. M. and Somia, N. (1997). Gene therapy-promises, problems and prospects. Nature 389: 239-242. ). 정맥내 주사된 후, 투여된 벡터중 90%가 비면역-매개 기작에 의해 간에서 분해된다(Worgall, S. , Wolff, G., Falck- Pedersen, E. and Crystal R. G.(1997).HunzarzGene Tlzerapy 8: 37-44. ). 이후, 바이러스 감염된 세포를 제거하는 CD8⁺ CTLs 및 IFN-알파를 분비하는 CD⁴⁺ 세포를 사용하는 MHC 부류 I 제한된 면역 반응이 발생하므로써 항-아데노바이러스 항체를 형성하게 된다 (Yang, Y. and Wilson, J. M.(1995).. Journalof ImmmunoZogy 155: 2564-2569.). 아데노바이러스 벡터를 변경하므로써 일부 CTL 에피토프를 제거할 수 있다. 인식되는 에피토프는 숙주 MHC 주조직적합항원염색체(haplotype)와는 상이하다(Sparer, T. E. , Wynn, S. G., Clarket al.(1997).Journal of Virology 71: 2277-2284. Jooss,K.,Ertl, H이다. C. J. and Wilson, J. M. (1998). Journal of Virology 72: 2945-2954. ). 분해되지 않은 상기 세포내 잔존하는 벡터는 그들의 프로모터를 불활성화시키고 (Armentano, D., Zabner, J. , et al. (1997). Journal of Virology 71: 2408-2416. ) 항체를 유지시켜 차후 벡터 투입을 방지한다.

일시적인 면역억제 요법을 포함하는 면역 반응을 피하는 방법이 트랜스진 발현을 연장시키고 2차 유전자를 전달시킬 수 있었다(Jooss, K. , Yang, Y. and Wilson, J. M. (1996). 인간. Gene Therapy 7: 1555-1566. Kay, M. A. , Meuse, L. , et al. (1997). Proceedings of the National Academy ofSciences of the U. S. A. 94: 4686-4691). 숙주 UV 불활성화 벡터를 공급하여 덜 개입적인 방법으로 경구 내성을 유도하였다(Kagami, H.,Atkinson, J. C. , et al. (1998). Human Gene Therapy 9: 305-313. ). 그러나, 숙주보다는 벡터를 조작하는 것이 바람직하다. 단지 복제 결핍 벡터를 사용할지라도, 바이러스 단백질은 면역계에 제시되는 매우 낮은 수준으로 발현된다. 궁극적으로 바이러스 코딩 서열을 포함하지 않는 "구트리스" 벡터로 보다 적은 유전자를 포함하는 벡터를 개발하여 간 조직에서의 시험관내 트랜스진 발현을 연장시켰다 (Schiedner, G. , Morral, N. , et al. (1998). Nature Genetics 18: 180-183. ). 대다수는 분해되고 면역계에 제시되는 아데노바이러스 단백질내 대량의 DNA를 초기에 전달하는 것은 임상 시도에 있어서도 문제를 일으킬 것이다. 또한, 인간 군집은 MHC 주조직적합항원염색체와 관련하여 이질성이고 대다수의 군집은 이미 아데노바이러스 균주에 노출되어 있을 것이다(Gahry-Sdard, H., Molinier-Frenkel, V. , et al. (1997). Journal of Clinical Investigation 100: 2218- 2226.)

최근까지, 아데노바이러스가 숙주 세포를 표적시키는 기작에 대하여 완전히 이해되고 있지 않다. 따라서, 조직 특이 발현은 단지 세포 프로모터/인해서 예로서, 미오신 경쇄 1 프로모터 (Shi, Q., Wang, Y. and Worton, R. (1997). Human GeneTZzerapy 8: 403-410.) 평활근 세포 SM22a 프로모터 (Kim, S. , Lin, H. , et al. (1997). Journal of Clinical Investigation 100: 1006-1014. )를 사용하거나 국소 부위로의 직접 전달(Rome, J. J.,Shayani, V. , et al. (1994). Human GeneTlierapy 5: 1249-1258. )에 의해서만 가능한 것이었다. 아데노바이러스 입자의 흡수는 MHC I 분류 분자를 포함하는 세포 수용체 또는 수용체들(Hong, S. S.,Karayan, L. , et al. (1997).EMBO Journal 16 : 2294-2306. ) 및 콕스사키에바이러스바이러스-아데노바이러스 수용체 (Bergelson, J. M., Cunningham J. A. , et al. (1997)Science 275: 1320-1323. )와 아데노바이러스내 섬유 코트 단백질과의 초기 상호작용을 포함하는 2단계 과정을 나타내었다. 이어서, 아데노바이러스 입자의 펜톤 염기 단백질은 수용체 매개 세포내이입을 통해 내부화시키면서 세포 표면 헤테로다이머의 인테그린 패밀리와 결합한다(Wickham, T. J.,Ma티아s, P. , et al. (1993). 세포 73 : 309-319. ), 대부분의 세포는 아데노바이러스 섬유 코트 단백질에 대한 1차 수용체를 발현시키지만, 내부화는 더욱 선택적이다(Harris, J. D. andLemoine, N. R.(1996). Trends ira Genetics 12: 400-404. ). 바이러스 흡수를 증가시키는 방법은 표적 세포가 적절한 인테그린을 발현시키도록 자극하는 것(Davison, E. , Diaz, R. M. , et al. (1997). Journal of Virology 71: 6204-6207. ) 및 표적 세포 타입별 특이성을 갖는 항체를 아데노바이러스와 컨쥬게이트시키는 것(Wickham, T. J. , Lee, G. M, et al. (1997b). Journal of Virology 71: 7663-7669. Goldman, C. K. , Rogers, B. E. , et al. (1997).Cancer Research 57:1447-1451.)을 포함한다. 항체를 사용하는 것이 벡터 생산의 난점을 증가시키고 보체 시스템을 활성화시키는 잠복된 위험성을 증가시킨다. Wiclcham et al. (Wickham, T. J., Tzeng, E. , et al. (1997a). Journal of Virology 71: 8221-8229. )등은 수용체 결합 모티프를 섬유 코트 단백질내로 도입하여 손상된 내피 또는 평활근 세포에 의해 발현된 인테그린, 또는 다수의 세포 타입에 의해 발현된 헤파린 설페이트 수용체들에 바이러스가 결합할 수 있도록 하였다.

어느 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하여 세포 및/또는 세포주가 면역조절제를 발현시키고/거나 분비할 수 있도록 할 수 있다. 아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비병원성 인간 파보바이러스이고 헬퍼 바이러스에 의존하여 통상 증식되는아데노바이러스이다. 분할 및 비분할 세포 모두를 감염시킬 수 있고, 헬퍼 바이러스 부재하에서 고도로 빈번하게 숙주 게놈의 특정 부위(19q 13-qter)내로 통합된다 at a high frequency (Kotin, R. M., Siniscalco, M. , et al. (1990). Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 87: 2211-2215. ). 야생형 게놈은 싱글 스트랜드 DNA 분자이고 이는 두개의 유전자; 바이러스 복제, 구조 유전자 발현, 및 숙주 게놈내로의 통합을 조정하는 단백질을 코딩하는 rep, 및 캡시드 구조 단백질을 코딩하는 cap으로 구성되어 있다. 게놈 말단에는 프로모터를 포함하는 145bp의 말단 리피트(TR)가 존재한다.

벡터로서 사용될 때, rep 및 cap 유전자는 트랜스진 및 그와 관련된 조절 서열에 의해 대체된다. 인서트의 총 길이는 최대로 야생형 게놈의 길이인 4.7kb를 초과할 수 없다(Smith,A. E. (1995). Annual Review of Microbiology 49: 807-838. ). 재조합 벡터의 생산을 위해서는 헬퍼 바이러스 유전자 산물 (아데노바이러스 게놈으로부터의 E1a, E1b, E2a, E4 및 VA RNA)과 함께 rep 및 cap가 트랜스로 제공되어야 한다. 통상의 방법은 벡터용으로서 하나, rep 및 cap을 위해서 또다른 하나, 즉 두개의 플라스미드를 아데노바이러스로 감염된 293 세포에 공형질감염시키는 것이다(Samulski, R.J., Chang, L. , and Shenk, T. (1989). Journal of Virology 63: 3822-3828. ). 그러나, 이 방법은 성가시고, 수율이 낮고(< 10⁴ 입자/ml) 아데노바이러스 및 야생형 AAV로 오염되기 쉽다. 수율이 낮은 이유중 하나는 아데노바이러스 복제에 대한 rep 유전자의 저해 작용 때문이다(Vincent, K. A, Piraino, S. T. and Wadsworth, S. C.(1997).Journal of Virology 71: 1897-1905. ). 더욱 최근의 프로토콜은 모든 아데노바이러스 구조 유전자를 제거하고 rep 내성 플라스미드를 사용하거나(Xiao, X. , Li,J. and Samulski, R. J. (1998) Journal of Virology 72: 2224-2232. ) 감염에 앞서 rep 발현 플라스미드를 성숙 바이러스에 컨쥬게이트시킨다(Fisher, K. J. , Kelley, W. M, Burda, J. F. and Wilson, J. M. (1996) Human Genetherapy 7: 2079-2087. ).

rep 부재하에, 일단 말단 리피트는 조금 분해됨녀 AAV 벡터는 무작위적으로 싱글 프로바이러스 또는 헤드 내지 테이 콘카테머로서 통합된다(Rutledge, E. A. and Russell, D. W. (1997).Journal of Virology 71: 8429- 8436. ). 트랜스진 발현을 연장시키는 숙주 게놈내로의 통합에 의해 AAV 벡터에 대하여 관심이 쏠리게 되었다. 다른 종으로부터 트랜스진이 유래되지 않았을 때 연장된 발현과 함께 혈관 내피세포(Maeda, Y. , Ikeda,U., et al. (1997). Cardiovascular Research 35:514-521.), 횡문근 (Fisher, K. J. , Jooss, K. , et al. (1997).Nature Medicine 3: 306-316. Herzog, R. W. , et al. (1997). Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 94:5804-5809.) 및 간세포 (Snyder, R.O., Miao, C. H. , et al. (1997). Nature Genetics 16: 270-275. )내로의 유전자 전달이 보고되었다. 항체를 AAV 캡시드로 중화시키는 것은 검출가능하지만 벡터의 재투입은 막을 수없거나 프로모터 활성을 차단할 수 없다. 가능하게는 면역 반응이 약독화(muted)되도록 바이러스 캡시드를 단순화시키는 것에 기인한다. AAV 항체가 인간 군집에 존재할 것이고 이는 추가로 연구할 필요가 있을 것이다. 국소 벡터 전달에 의한 것을 제외하고 특정의 세포 타입을 표적하기 위해 시도된 바 없다.

특히, 본 명세서에서 참고문헌으로서 인용되는 미국 특허 5,693, 531에 기술된 아데노-관련 벡터는 AAVp5neo ;pSV-β-갈락토시다제; TRF169; LZ11 ; pSP72; pSP72nLacZ; pAdRSV4; pAdRSVnLacZ; AAVmLac ; SV40; pBluescriptSK ; pSV40 ori AAV1 ;및 pKMTll. 를 포함하고 이를 사용할 수 있다.

레트로바이러스 벡터

어느 레트로바이러스 벡터를 사용하여 세포 및/또는 세포주를 형질감염시켜 면역조절제를 발현시키고/거나 분비할 수 있다. 레트로바이러스는 게놈으로서 싱글 스트랜드 RNA 분자를 포함하는 인벨럽 바이러스 부류이다. 감염 후 바이러스 게놈 더블 스트랜드 DNA로 역전사되고 숙주 게놈내로 통합되고 단백질로서 발현된다. 바이러스 게놈은 대략 10kb로 적어도 3개의 유전자: gag (코어 단백질 코딩), pol (역전사효소 코딩) 및 env (바이러스 인벨럽 단백질 코딩)를 포함한다.

게놈 각 말단에는 통합에 관여하는 서열 및 프로모터/인핸서 영역을 포함하는 장쇄의 말단 리피트(LTRs)가 존재한다. 또한, env 유전자내 RNA 스플라이스 부위 및 바이러스 DNA(psi)를 패킹에 필요한 서열이 존재한다. 일부 레트로바이러스는 프로토온코진을 포함하고, 돌연변이화되었을 때 암을 유발할 수 있지만, 벡터 생산에서 이들은 제거된다. 또한 레트로바이러스는 세포 프로토온코진 주변으로 통합되고 LTR로부터 부적절한 발현을 유도하거나, 종양 억제자 유전자를 파쇄시켜 세포를 형질전환시킬 수 있다. 삽입돌연변이라 명명되는 이러한 이벤트는 극히 드물기는 하지만 레트로바이러스가 벡터로 사용되는 경우에는 여전히 발생할 수 있다.

레트로바이러스 벡터는 주로 마우스 모델에서 벡터를 발생시킬 수 있는 마우스 세포, 및 인간 치료를 가능케하는 인자 세포 모두를 감염시킬 수 있는 양생 바이러스인 원숭이 뮤린 백혈병 바이러스(Mo-MLV)에 기초한다. 바이러스 유전자(gag, pol and env)는 관심의 대상이 되는 트랜스진으로 대체되고 패킹 세포주내 플라스미드사에서 발현된다. 비필수 유전자는 패킹 서열(psi)에 없기 때문에 비리온 입자내 포함되어 있지 않다. 복제 능력이 있는 레트로바이러스를 제공하는 재조합을 막기 위하여 벡터 백본과 상동성인 모든 영역을 제거하여야 하고, 비필수 유전자는 적어도 두개의 전사 유니트에 의해 발현되어야 한다(Markowitz, D. , Goff, S. and Bank, A. (1988). A safe packaging line for gene transfer: separating 바이러스 유전자on two different plasmids. Journal of Virology 62: 1120-1124. ). 이러한 경우에도 복재 능력이 있는 레트로바이러스는 낮은 빈도로 발생한다.

필수 영역은 5' 및 3' LTRs를 포함하고 패킹 서열은 5'LTR의 하류에 존재한다. 트랜스진 발현은 5'LTR 내 프로모터/인핸서 영역에 의해 유도되거나, 대체 바이러스 바이러스 (예로서, 사이토메갈로바이러스, 루스 사코마 바이러스) 또는 세포 (예로서, 베타 액틴, 티로신) 프로모터에 의해 유도된다. 돌연변이 분석을 통해 전장의 gag 코딩 서열 이하 및 직후 상류 부위는 바이러스 패킹 또는 트랜스진 발현에 아무런 작용을 하지 않고 제거될 수 있다(Kim, S. H이다., Yu, S. S. , et al. (1998). Journal of Virology 72: 994-1004. ). 그러나, 트랜스진 개시 코돈의 정확한 위치화 및 5'LTR의 일부 변경이 트랜스진 발현에 영향을 준다(Rivire, I., Brose, K. and Mulligan, R. C. (1995). Proceedings of theNational Academy of Sciences of tlae U. SA. 92: 6733-6737. ). 형질전화된 세포의 확인을 돕기 위하여 선별가능한 마커, 예로서, 네오마이신 및 베타 갈라토시다제가 포함될 수 있고, 트랜즈진 발현은 내부 리보좀 사이트의 첨가로 개선될 수 있다(Saleh, M.(1997). Human Gene Therapv 8: 979-983. ). 레트로바이러스 벡터의 이용가능한 수반 능력은 대략 7.5 kb (Verma,I. M. and Somia, N. (1997). Nature 389: 239-242. )으로, 이는 cDNA가 될 경우에도 일부 유전자에는 극히 작다.

레트로바이러스 인벨럽은 특정 세포 단백질과 상호작용하여 표적 세포 범위를 결정한다. env 유전자 또는 그의 산물을 변경하여 세포 범위를 조작하는 성공적인 수단을 입증하게 되었다. 접근법은 인벨럽 단백질 및 세포 수용체 상의 결합 부위의 직접적인 변형을 포함하지만, 이러한 접근법은 바이러스 입자의 순차적인 내부화를 방해하는 경향이 있다(Harris, J.D. and Lemoine, N. R. (1996).Trends in Genetics 12: 400-404. ). env 유전자 일부를 에리트로포이에틴 단백질(EPO)로부터의 150 코돈으로 대체하여 Kasahara et al.(Kasahara, N. , Dozy, A.M. and Kan, Y. W. (1994). Science 266: 1374- 1376. )는 높은 친화도로 세포를 포함하는 EPO 수용체를 표적화시킬 수 있었다. 스트렙토바딘 브릿지를 통해 2차 세포 특이 항체에 대한 친화력을 갖는 바이러스 입자와 항체의 커플링을 통해 바이러스 흡수는 개선되지만, 내부화는 바이러스 분해를 유도하는 경향이 있다(Roux, P. , Jeanteur, P. , andPiechaczyk, M. (1989). Proceedings of the National24academy of Sciences USA 86 : 9079-9083. ). Neda et al (Neda, H. , Wu, C. H., and Wu. G. Y.(1991) The Journal of Biological Chemist7y 266: 14143-14146. )는 바이러스 입자를 락토스로 처리하여 아시아글리코단백질 수용체를 발현시키면서 세포, 주로 간세포에 의해 흡수되도록 하였다. 이어서 가능하게는 엔도솜 막과 바이러스 인벨럽이 융합할 수 있도록 하는 엔도솜의 산성화에 기인하여 유효한 바이럿 트랜스진 발현이 존재하였다.

그의 친화성과 관련하여 바이러스는 또다른 바이러스의 것으로 env 유전자를 대체를 통해 상이하고, 숙주 범위는 위형별(pseudotyping)로 공지된 기술에서 확장될 수 있다. 베시쿨라 스토마티스 바이러스 G 단백질이 Mo-MLV 유래 벡터에 포함되고 (Burns, J. C. , Matsubara, T. , et al. (1994).Developnaeyatal Biology 165: 285-289. ), 이는 초원심분리에 의해 정제되었을 때 더욱 안정화된다. 최근 Qing (Qing, K. , Bachelot, T., Mukherjee, P. , et al. (1997). Journal of Virology 71: 5663- 5667. )는 먼저 레트로바이러스 인벨럽 단백질에 대하여 세포 수용체를 발현시키는 아데노-관련 벡터 (이하 기술)로 수혜 세포를 처리하여 다수의 세포주로의 형질도입을 개선시켰다.

바이러스 유전자의 레트로바이러스 통합 및 발현에 대한 요건은 표적 세포는 분할되어야 한다는 것이다. 이는 생체내 또는 생체외에서 세포를 증식시키는 유전자 요법을 제한하고, 이로써, 세포는 환자로 되돌려지기 전에 인체로부터 제거되고 복제를 자극하도록 처리된 후 레트로바이러스 벡터로 형질도입된다. 생체외 세포는 더욱 높은 바이러스 역가 및 성장 인자에 노출되어 있기 때문에 더욱 효과적으로 형질도입될 수 있다(Glimm, H. , Kiem, H이다. P., et al. (1997). Human Gene Therapy 8: 2079- 2086. ). 추가로, 생체외에서 처리된 종양 세포는 종양 덩어리와 관련되고 살종양(tumoricidal) 효능을 유발할 수 있다(Oldfield, E. H. and Ram, Z. (1995). Human Gene Therapy 6: 55-85.;Abdel-Wahab, Z. , Weltz, C. , et al. (1997). Cancer 80: 401-412. ).

렌티바이러스는 증식 및 비증식 세포 모두를 감염시킬 수 있는 서브클래스의 레트로바이러스이다. 추가로 6개의 tat, rev, vpr, vpu, nef 및 vif 단백질을 포함하며 단순 레트로바이러스보다 더욱 복잡한 것으로 사료된다. 현 패킹 세포주는 위형별 env 유전자, 트랜스진 작제물, 및 트랜스로 구조 및 조절 유전자를 공급하는 패킹 작제물에 대한 플라스미드를 분류할 수 있다(Naldini, L., Blmer, U. , et al. (1996). Science 272: 263-267. ). 근육, 간 및 신경 조직의 생체내에서 장기간의 발현을 보이는, 마커 유전자를 사용한 초기 결과는 가망이 있었다(Blmer, U. , Naldini, L. , et al. (1997).Jourraal of Yirology 71 : 6641-6649.; Miyoshi, H. , Takahashi, M. , Gage, F. H이다. and Venna, I. M. (1997). Proceedings of the NationalAcadenzy ofscietices of the U. S. A. 94: 10319-10323.;Kafri, T. , Blmer, U. , et al. (1997). Nature Genetics 17: 314-317). 흥미롭게도, 트랜즈진은 내부 조작된 사이토메가로바이러스 프로모터에 의해 유도되고, 이는 MoMLV 벡터에서와는 달리 불활성화되지 않는다. 이는 벡터 주입에 대한 제한된 염증 반응에 기인할 수 있고, 이는 크기상에 있어 염수 대조군과 동일하였다(Blmer, U. , Naldini, L.,Kafri, T. , Trono, D. , Verma,1. M. and Gage, F. H이다. (1997). Journal of Virology 71: 6641-6649).

사용된 렌티바이러스 벡터는 인간면역결핍 바이러스(HIV)로부터 유래되었고, 일부 비필수 조절 유전자를 제거하는 것과 관련하여 안전성에 있어 평가중에 있다. vpr 및 vif 뮤턴트는 저하된 효율로 근육 또는 간세포를 제외한 뉴론을 감염시킬 수 있다(Blmer,U., Naldini, L.,Kafri, T. , Trono, D. , Verma,1. M. and Gage, F. H. (1997). Journal of Virology 71: 6641-6649; Kafri, T., Blmer, U. , et al. (1997). Nature Genetics 17: 314-317. ).

특정 일면으로, 레트로바이러스 벡터 pLXIN,pSIR,pLXSH,pLNCX,pLAPSN, pFB and pFB-Neo가 사용된다.

단순헤르페스바이러스 벡터

어느 단순헤르페스바이러스 벡터를 사용하여 세포 및/또는 세포주를 형질감염시켜 면역조절제를 발현시키고/거나 분비시킬 수 있다. 제 1형 단순헤르페스바이러스(HSV-1)는 인간 향신경 바이러스이고, 결과적으로 주로 신경계에 유전자를 이동시키기 위한 벡터로서 HSV- 1를 사용하는 것으로 관심이 집중되게 되었다. 야생형 HSV-1 바이러스는 뉴론을 감염시킬 수 있고, 용균성 생활주기로 진행되거나 잠복 상태에서 핵내 에피솜으로서 유지되었다. 잠복적으로 감염된 뉴론은 정상적으로 작용하고 면역계에 의해 거부되지 않는다. 잠복 바이러스는 전사상(transcriptionally) 거의 무반응(silent)이지만, 잠복기동안 작용할 수 있는 뉴론 특이 프로모터를 소지하고 있다.

인간 군집에서 HSV-1에 대한 항체는 보편화되어 있지만 헤르페스 감염에 기인한 합병증, 예를 들면, 뇌염은 극히 드물다.

바이러스 게놈은 152kb의 선형의 더블 스트랜드 DNA 분자이다. 내부 반복 서열 (IRL 및 IRS)에 의해 어느 방향으로 연결된 길고 짧은 2개의 유니크 부위(일명 UL 및 US)가 존재한다. 이 유니크 부위중 비-링커 말단에는 말단 리피트(TRL 및 TRS)가 존재한다. 81개 이하의 유전자가 존재하고(Marconi, P. , Krisky, D. , et al. (1996). Proceedings of the National Academy of Sciences UNA 93: 11319-11320. ), 이중 약 1/2은 세포 배양액에서 성장에 필수적인 것은 아니다. 일단 이 비필수 유전자가 결실되면, 40-50 kb의 외부 DNA가 바이러스내 공급될 수 있다(Glorioso, J. C. , DeLuca, N. A. and Fink, D.J (1995). nnual Review of Microbiology 49: 675-710. ). HSV-1 유전자의 3개의 주요 부류가 확인되었고, 즉, 초기발현(immediate-early)(IE 또는 알파) 유전자, 조기발현(early)(E 또는 베타) 유전자 및 후기발현(L 또는 감마) 유전자이다.

감수성 세포에서 감염 후 용균 복제는 일시적으로 유전자 전사의 조화(co-ordinated)서열에 의해 조절된다. Vmw65 (외피 구조 단백질)은 조기발현 유전자를 생산할 수 있도록 하는 전사활성화 인자인 초기발현 유전자(IPO, ICP4, ICP22, ICP27 및 ICP477)를 활성화시킨다. 조기발현 유전자는 뉴클레오티드 대사 및 DNA 복제를 위한 유전자를 코딩한다. 후기발현 유전자는 조기발현 유전자에 의해 활성화된 구조 단백질을 코딩한다. 전체 주기는 10시간 미만으로 소요되며 결국은 변함없이 세포는 사멸하게 된다.

잠복기에 이르게 하는 분자적 이벤트는 전체적으로 결정되지 않았다. 잠복기동안 유전자 발현은 IRL 부위 게놈에 위치하는 잠복기 관련 트랜스크립트(LATs)에 의해 유도된다. 두개의 LATs(2.0 및 1.5kb)는 IE 유전자 ICPO에 반대 방향으로 전사된다. LATs는 잠복기로부터 HSV- 1을 재활성화시키고(Steiner, I., Spivack, J. G. , et al.(1989). EMBO Journal8 : 505-511. ) 잠복기 확립(Sawtell, N. M. and Thompson, R. L. (1992). Journal of Virology 66: 2157-2169. )시키는 작용을 한다. LATs의 발현을 유도하는 2개의 잠복기 활성 프로모터가 확인되었고(Marconi, P., Krisky, D. , et al.. (1996). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 11319-11320. ) 벡터 트랜스진 발현에 유용한 것으로 입증될 수 있다.

HSV-1 벡터 생산을 위해 2개의 기본 접근법, 즉, 앰플리콘 및 재조합 HSV-1 바이러스를 사용하였다. 앰플리콘은 col EI ori (Escherishia coli 복제기원), OriS (HSV- 1 복제기원), HSV-1 패킹 서열, 초기발현 프로코터의 조절하의 트랜스진 및 선별가능한 마커를 포함하는 세균 생산 플라스미드이다(Federoff, H. J. , Geschwind, M. D., Geller, A.I. and Kessler, J. A. (1992).Proceedings of the National Academy of Sciences USA89 : 1636-1640. ). 앰플리콘은 모든 결손 구조 및 조절 유전자를 트랜스로 제공하는 헬퍼 바이러스(온도 민감성 뮤턴트)를 포함하는 세포주내로 형질감염된다. 헬퍼 및 앰플리콘 포함 바이러스 입자는 수혜자에게 전달된다. 더욱 최근의 앰플리콘은 플라스미드 에피솜 유지를 위한 Epstein-Barr 바이러스 유래된 서열을 포함한다(Wang, S. and Vos, J.(1996). Journal of Virology 70: 8422-8430. ).

재조합 바이러스는 트랜스로 제공되는 초기발현 유전자중 하나, 예로서 ICP4의 결실에 의해 복제 결핍에 의해 제조된다. 뇌 조직에서 트랜스진 발현을 지시할 수 있고, 덜 병원성이지만, 배양액중 뉴론에는 독성을 이다(Marconi, P., Krisky, D. , et al.. (1996).Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 11319-11320. ). 다수의 초기발현 유전자의 결실은 실질적으로 세포독성을 저하시키고 야생형 잠복바이러스에서 무반응성인(silence) 프로모터로부터 발현될 수 있도록 한다. 이 프로모터는 장기간 유전자 발현을 지시하는데 유용할 수 있다.

복제-조건부 뮤턴트는 단지 특정 세포주에서 복제할 수 있다. 증식허용 세포주는 모두 증식성이고 바이러스 결핍을 보충하기 위한 세포 효소를 공급한다. 뮤턴트는 티미딘 키나제 (During, M. J. , Naegele, J. R., OMalley, K. L. and Geller, A. 1. (1994). Science 266: 1399-1403. ), 리보뉴클레아제 리덕타제 (Kramm, C. M. , Chase, M., et al. (1997).Huma71 Gene SXZerapy 8: 2057- 2068. ), UTPase, or the neurovirulence factor g34.5 (Kesari, S. , Randazzo, B. P. , et al. (1995). Laboratory Investigation 73: 636-648. )를 포함한다.

비-바이러스 벡터

바이러스 벡터 모두 어느 정도까지 면역 반응을 유도하고 안전성 위험을 가질 수 있다(예: 삽입 돌연변이화 및 독성 문제). 추가로, 그의 능력은 제한되어 있고 대랴 생산하기는 어려울 수 있다. 따라서, 본 발명의 일면에서는 단지 소량의 단백질만을 필요로 하고, 실질적으로 무한한 능력을 갖고, 감염 또는 돌연변이유발 능력은 없는 비바이러스성 유전자 전달 방법을 사용하고, 약제학적 기술을 사용하여 대량 생산할 수 있다. 3개의 비바이러스성 DNA 전달 방법, 즉, 내이키드 DNA, 리포좀 및 분자 컨쥬게이트가 존재한다.

내이키드(Naked) 핵산

내이키드 DNA 또는 핵산을 사용하여 면역조절제를 숙주에 전달할 수 있다. 이는 플라스미드 형태로 근육 세포내로 직접 주사되어 전달될 수 있거나(Wolff, J. A. , Malone, R. W. , Williams, P., Chong, W. , Acsadi, G. , Jani,A. and Felgner P. L. (1990). Science 247: 1465-1468. ) 조직내 박힌 금 입자에 결합되어 전달될 수 있다 (Cheng, L. , Ziegelhoffer, P. R. and Yang, N. S. (1993). Proceedingsof the National Acade77iy of Sciences of fAe U. S. A. 90: 4455-4459. ). 용어 "내이키드" 핵산, DNA 또는 RNA는 바이러스 서열, 바이러스 입자, 리포좀 제제, 리포펙틴 또는 침전제 등을 포함하는 세포내로의 진입을 보조, 증진, 또는 촉진시키는 작용을 하는 어느 전달 비히클이 없는 서열을 언급한다. 효율은 매우 낮지만, 생체내에서 장기간동안 낮은 수준으로 발현시킬 수 있따. 다른 유전자 요법 기술과 달리 표적 세포내로 내이키드 핵산 서열을 도입시키는 하나의 잇점은 세포에서 일시적인 면역조절제 합성이다. 연구를 통해 비복제 DNA 서열을 세포내로 도입하여 6개월 이하의 기간동안 원하는 면역조절제를 생산할 수 있다고 나타났다. 상기 방법이 간단하고 발현이 유지되기 때문에 DNA 백신을 개발하게 되었다. 통상의 약독화된 단백질 기초 백신과 비교하여 예를 들면 모(maternal) 항체에 기인한 선재한 면역성에 영향을 받지 않고 상대적으로 가격이 저렴하고, 싱글 플라스미드상에 다수의 병원체 항원을 전달할 수 있다(Manickan, E. , Karem, K. L. , and Rouse, B. T. (1997). Critical Reviews in Immunology 17: 139-154. ). DNA 백신은 존재하는 백신이 없는 병원체, 예로서, HIV(Lekutis, C. , Shiver, J. W. , Liu, M. A. , and Letvin, L. N. (1997). TheJouriaal of Inarmunology 158:4471-4477.) 또는 현 백신이 전체적으로 유효하지 못한 병원체, 예로서, 인플루엔자 (Maclclin, M. D. , McCabe, D. , et al. (1998)Journal of Virology 72: 1491-1496.)를 위해 개발중에 있다. 고도로 보존적인 유전자를 사용하여 Ulmer 등은(Ulmer, J. B., Donnelly, J. J. , et al. (1993). Science 254: 1745-1749.) 혈청학적으로 구별이 되는 2개의 인플루엔자 애 대하여 마우스를 면역화시킬 수 있었다. 그러나 대부분의 경우에 있어 DNA 백신이 현 백신보다 우수한 것으로 보이지는 않았다(Macklin, M. D. , McCabe, D. , et al. (1998). Journal of Virology 72: 1491-1496. ). 실제 면역 반응 유형은 적절한 사이토카인을 코딩하는 유전자의 공형질전환에 의해 조절될 수 있고(Xiang, Z. and Ertl, H. C. (1995). Immunity 2: 129-135.) 이 방법은 부적절한 면역 반응을 재지시하는데 유용한 것으로 입증될 수 있다(Manickan, E. , Karem, K. L. , and Rouse, B. T. (1997). Critical Reviews irz Imfzunology 17: 139- 154. ). 내이키드 DNA의 다른 용도는 암 면역침강반응(이하 기술, Corr. M. , Tighe, H. , Lee. D. , Dudler, J. , et al. (1997). The Journal of Laboratory Investigation 159: 4999-5004. ), 췌장 인슐린 작용 수복(Goldfine.I. D. , German, M. S. , Tseng, H. , et al. (1997). NatureBiotechnology 15 : 1378-1382. ), 및 곁혈관 발생의 자극(Takeshita, S.,Tsurumi, Y. , et al. (1996). Laboratory Investigation 75: 487-501. )을 포함한다. 근육 세포에서 유전자 산물의 발현은 콜라게나제, 파파베린의 공투여 및 허혈 증상에 의해 개선될 수 있다 (Budker, V. , Zhang, G.,Danko, I. , Williams, P. and Wolff, J. (1998). Gene Therapy 5: 272-276. ). 근육 특이 프로모터(Skarli, M. , Kiri, A. , et al.(1998). Gene Therapy5 : 514-520. ) 및 다른 인트라진 조절 서열, 예: the 폴리 A 및 전사 종결 서열 (Hartikka, J., Sawdey, M. , et al. (1996). Human Gene Therapy 7: 1205-1217. ) 또한 트랜스진 발현을 개선시킬 것이다.

내이키드 폴리펩티드 주입을 위한 DNA 또는 RNA 유효 투여량은 약 0.05g/kg(체중) 내지 약 50 mg/kg(체중) 범위일 것이다. 바람직하게 용량은 약 0.005mg/kg 내지 약 20mg/kg이고 더욱 바람직하게 약 0.05mg/kg 내지 약 5mg/kg이다. 물론 본 분야의 기술자가 이해하고 있는 바와 같이 투여량은 주입하는 조직 부위에 따라 달라질 것이다. 본 분야의 기술자는 핵산 서열의 적정량 및 유효량을 용이하게 결정할 수 있는 이는 치료하고자 하는 증상 및 투여경로에 따라 달라질 것이다. 투여 경로는 조직의 사이질 공간으로 주입되는 비경구적 경로에 의하거나다른 비경구적 경로, 예로서, 특히 폐 또는 기관지 조직, 인후 또는 코 점막으로 전달하기 위한 에어로졸 제제의 흡입를 사용할 수 있다. 또한, 내이키드 폴리펩티드 작제물은 수술에 사용되는 카테터에 의해 혈관성형술시 동맥에 투여될 수 있다.

또한 면역조절제는 본 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있는 방법으로 제조될 수 있는 리포좀 제제로 투여될 수 있다(예: those taught in Felgner P. L. et al. (1995) Ann.NYAcad. Sci. 772: 126-139 and AbdallahB. et al. (1995) Biol. cell 85 (1) :1-7). 리포좀은 방수(aqueous fluid) 분획을 포획하는 리피드 이중층이다. DNA 는 (그의 전하에 의해) 양이온 리포좀의 외부 표면에 자발적으로 결합하고 이들 리포좀은 세포막과 상호작용할 것이다(Felgner, J. H.,Kumar, R. , et al.(1994). Journal of BiologicalClaefrzistiy 269: 2550- 2561. ). 시험관내에서 특정 90% 이하의 세포주가 형질감염될 수 있다. 다른 양이온 리포좀내 소량의 음이온 리피드를 포함하므로써 DNA는 리포좀 내부 표면으로 혼입될 수 있고, 그로써 효소 분해로부터 보호할 수 있다(Crespo et al, 1996, cited in Alio, S. F. (1997).Bioclle7nical Pllarmacology 54:9-13.). 엔도좀으로서 세포내로의 흡수를 촉진시키기 위하여 예로서, 항-MHC 항체(Wang, C. , and Huang, L. (1987). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84 : 7851-7855.) 트랜스페린 (Stavridis, J. C. , Deliconstantinos, G. , et al. (1986).Experimental 세포 Research 164: 568-572. ), 및 Sendai 바이러스 또는 그의 F 단백질과 같이 (Dzau, J. V. , Mann, M. J, Morishita, R. and Kaneda, Y. (1996). Proceedings of the National Academy of Sciences USA 93: 11421-11425. ) 표적 단백질이 리포좀내 포함될 수 있다. Sendai 바이러스는 추가로 플라스미드 DNA가 엔도좀으로부터 세포질로 빠져나와 분해되지 못하도록 할 수 있다. DNA 결합 단백질(28 kDa 이동성이 높은 단백질 그룹 1)의 봉입은 플라스미드를 핵으로 이동시키므로서 전사를 촉진시킨다(Dzau et al, 1997 Am J Cardiol. 1997 Nov 6; 80 (9A):33I-39I).

분자 컨쥬게이트는 DNA 결합제에 결합되어 있는 합성 리간드 또는 단백질로 구성되어 있다. 세포로 이동시키는 것을 리포좀에 대한 것과 유사한 기술을 사용하여 개선될 수 있다. 표적 단백질은 아시아로글리코프로테인 (Wagner, E., Cotten, M. , Foisner, R. and Birnstiel, M. L. (1991). Proceedings of the National Academy of Science USA 88 : 4255-4259. ), 트랜스페린(Wu, C. H. , Wilson, J. M. and Wu. , G. Y. (1989).Journal of Biological Chemistry. 264: 16985-16987. ), 폴리머 IgA (Ferkol, T. , Kaetzel, C. S. and Davis, P. B. (1993). Journal of Clinical Investigation 92: 2394-2400. ) 및 아데노바이러스 (Madon, J. and Blum, H. E. (1996). Hepatology 24: 474-481. )를 포함한다. 트랜스진 발현은 일시적인 성향이 있고, 엔도좀/리포좀 분해에 의해 제한을 받는다.

VI. 약제학적 조성물

B형 간염을 포함하는, 상기 기술된 어느 질환으로 고생하는 인간은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 β-2'-데옥시-β - L-에리트로-펜토푸라노뉴클레오시드, 예를 들면,β-L-2'-데옥시아데노신,β-L-2'- 데옥시시티딘, β-L-2'-데옥시우리딘, β-L-2'-데옥시구아노신 또는 β-L-2'-데옥시티미딘 또는 약제학적으로 허용가능한 프로드럭 또는 염을 환자에 투여하므로써 치료될 수 있다. 활성 물질은 적절한 경로, 예를 들면, 경루, 비경구, 정맥내, 진피내, 피하, 또는 국소로 액상 또는 고체 형태로 투여될 수 있다.

활성 화합물은 치료받는 환자에 심각한 독성 효과를 일으키지 않으면서 치료학적 유효량의 화합물을 환자에 전달하여 생체내에서 바이러스 복제를 저해하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용가능한 담체내 포함된다. "저해량"은 예를 들면 본 명세서에 기술된 것과 같은 에세이에 의해 측정된 바와 같은 저해 효과를 발휘하기에 충부한 활성 성분의 양을 의미한다.

상기 언급된 모든 잉상에 대한 화합물의 바람직한 투여량은 1일 수혜자의 체중 1kg당 약 1 내지 50mg/kg, 바람직하게 1 내지 20 mg/kg, 더욱 일반적으로 0.1 내지 약 100 mg 범위일 것이다. 약제학적으로 허용가능한 프로드럭의 유효량 범위는 전달되는 모 뉴클레오시드의 중량에 기초하여 산출될 수 있다. 프로드럭이 그 자체로서 활성을 나타내는 경우 유효량은 프로드럭의 중량을 사용하여 상기와 같이 추정될 수 있거나, 본 분야의 기술자에게 공지된 다른 방법에 의해 추정될 수 있다.

본 화합물은 제한하는 것은 아니지만 복용 단위 형태 당 7 내지 3000 mg, 바람직하게는 70 내지 1400 mg의 활성 성분을 포함하는 것을 포함하여 적절한 복용 단위 형태로 편리하게 투여된다. 50-1000 mg의 경구 투여량이 보통 편리하다.

이상적으로, 유효 성분은 약 0.2 내지 70μM, 바람직하게는 약 1.0 내지 10 μM의 활성 성분의 피크 혈장 농도가 이루어지도록 투여되어야 한다. 이것은, 예를 들면 임의적으로 식염수 내에 있는, 활성 성분의 0.1 내지 5% 용액을 정맥내 주사하여 이루어지거나 활성 성분의 볼루스(bolus)로서 투여된다.

의약 조성물 내의 활성 성분의 농도는 약물의 흡수도, 불활성화 및 배설 속도 및 당업자에게 공지된 다른 인자에 따라 달라질 것이다. 또한 투여량은 경감시키기 위한 상태의 중증도에 따라 달라질 수 있음에 주의하여야 한다. 특정 대상자의 경우는 조성물을 투여하고 이를 감독하는 사람의 판단 및 개인의 요구에 따라 특정 투여 요법 및 스케줄이 시간에 따라 조성되어야 함을 이해하여야 하고, 본 명세서에서 기술된 농도 범위는 단지 일례이며 청구하는 조성물의 범위 또는 실시렐 제한하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 활성 성분은 한번에 투여되거나, 다양한 시간 간격으로 투여되는 다수의 더 작은 용량으로 나누어질 수 있다.

활성 화합물 투여의 바람직한 모드는 경구이다. 경구용 조성물은 통상 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 이들은 젤라틴 캡슐에 싸여 있거나 정제로 압착된다. 치료적 경구 투여 목적을 위해, 활성 화합물은 부형제와 혼입될 수 있고 정제, 트로키, 또는 캡슐의 형태로 사용될 수 있다. 약제학적으로 적절한 결합제, 및/또는 어쥬반트 물질이 본 조성물의 일부로서 포함될 수 있다.

정제, 환제, 캅셀제, 트로키 등은 하기 성분중 어느 것, 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 미결정 셀룰로즈, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스같은 부형제, 알긴산, 프리모겔(Primogel), 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 스테로테스(Sterotes)와 같은 활택제; 콜로이드성 실리콘 옥사이드와 같은 윤활제; 수크로스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페파민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지 향료와 같은 풍미제. 복용 단위 형태가 캡슐인 경우, 상기 유형의 물질외에, 지방성 오일과 같은 액상 담체를 포함할 수 있다. 또한, 복용 단위 형태는 투여 단위의 물리적 형태를 변화시키는 다양한 다른 물질, 예를 들면, 당 코팅, 셀락, 또는 다른 장용제를 함유할 수 있다.

본 화합물이 엘릭서(elixir), 현탁제, 시럽, 웨이퍼, 츄잉검 등의 성분으로서 투여될 수 있다. 시럽은, 활성 성분에 부가적으로, 감미제로서 수크로스 및 특정 보존제, 염료 및 착색제 및 풍미제를 포함할 수 있다.

본 화합물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 프로드럭 또는 염은 또한 다른 뉴클레오사이드 화합물을 포함하여 소기의 작용에 손상을 주지 않는 다른 활성 물질, 또는 소기의 작용을 보충하는 물질, 예를 들면, 항생제, 항균제, 항염증제, 또는 다른 항바이러스제와 혼합될 수 있다. 비경구, 경피, 피하, 또는 국소 투여용으로 사용되는 액제 또는 현탁제는 하기의 성분을 포함할 수 있다: 주사용 물, 식염수 용액, 비휘발성 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매과 같은 무균 희석제; 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 소듐 바이설파이트와 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트와 같은 완충액 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 등장도 조절용 시약. 비경구용 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다용량 바이알 내에 포함될 수 있다.

정맥내 투여되는 경우, 바람직한 담체는 생리학적 식염수 또는 포스페이트 완충된 식염수(PBS)이다.

바람직한 실시예에서, 활성 화합물은 임플란트 및 마이크로캡슐화된 전달계를 포함하는 방출 조절형 제제와 같이 본 화합물이 인체로부터 급속히 제거되는 것으로부터 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드라이드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리아세트산과 같은 생분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 그러한 제제의 제조 방법은 당업자에게 명백하다. 이러한 물질은 알자 사(Alza Corporation)로부터 상업적으로 얻을 수도 있다.

리포좀 현탁액(바이러스성 항원에 대한 모노클론 항체로 감염된 세포를 표적으로하는 리포좀을 포함하는)이 약제학적으로 허용되는 담체로서 또한 바람직하다. 이들은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들면 미국특허 제 4,522,811호(전체가 본 명세서에 참고문헌으로서 포함됨)에 기술된 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들면, 리포좀 제제는 적절한 액체(예를 들면 스테로일포스파티딜 에탄올아민, 스테로일 포스파티딜 콜린, 아라키도일 포스파티딜 콜린, 및 콜레스테롤과 같은)를 이후에 증발되어 용기의 표면에 건조된 지방의 박막을 남기는 무기 용매 내에 용해시켜 제조될 수 있다. 활성 화합물 또는 그 모노포스페이트, 디포스페이트, 및/또는 트리포스페이트 유도체의 수성 용액은 이후 용기에 도입된다. 용기는 이후 손으로 저어 지방 물질이 용기 측면으로부터 유리되어 지방 응집물로서 분산되고, 이에 의해 리포좀 현탁액을 형성하도록 한다.

VII. 서방성 제제(controlled release formulations)

서방성 제제에 대한 본 장에서 인용되는 모든 U. S. 특허 출원은 전체적으로 참고 문헌으로서 인용된다.

생체분해성 폴리머의 분자는 폴리락트산의 합성 및 생체분해능이 Kulkami et al. ("폴리락트산 for surgicalimplants,"Arch. Surg, 1966, 93, 839)에 의해 보고된 후 신속하게 발전하게 되었다. 전달 장치용 매트릭스 물질로서 유용한 것으로 보고된 다른 폴리머의 예로서 폴리안하이드라이드, 폴리에스테르 예: 폴리글리콜라이드 및 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리아미노산 예: 폴리라이신, 폴리에틸렌 옥사이드의 폴리머 및 코폴리머, 아크릴 종결 폴리에틸렌 옥사이드, 폴리아미드, 폴리우레탄, 폴리오르토에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 및 폴리포스파젠을 포함한다. 참조, 예를 들면, 미국 특허 4,891, 225 and 4,906, 474 to Langer (폴리an하이드라이드s), 4,767, 628 to Hutchinson (폴리락티드,폴리락티드-코-글리콜리드산), and 4,530, 840 to Tice, et al. (폴리락티드, 폴리글리콜리드, 및 코폴리머). 참조: 미국 특허 5,626, 863 to Hubbell, et al (상기에는 조직 접촉 물질 및 서방성 캐리어로서의 광폴리머화(photopolymerizable) 생체분해성 하이드로겔(생체분해성 모노머 또는 올리고머 신장을 갖는 친수성 올리고머를 포함하는 폴리머화되고 가교결합된 마크로머의 하이드로겔로서, 이는 폴리머화 및 가교결합이 가능한 말단에 캡핑된 모노머 또는 올리고머이다)이 기술되어 있다); 및 Focal, Inc.의 PCT WO 97/05185(상기에는 약물 전달을 위한 서방성 제제 및 조직 치료제로서 사용하기 위한 다중 차단 생체분해성 하이드로겔이 기술되어 있다).

생체 기원의 분해성 물질이 잘 공지되어 있고, 예로서 가교결합된 젤라틴을 들 수 있다. 히알루론산은 가교결합되어 있고, 생물 의학 적용을 위한 분해성 팽윤 폴리머로서 사용된다(U. S. Patent 4,957, 744 to Della Valle et. al. ;"Surface modification of polymeric biomaterials for reducedthrombogenicity,"polym. Mater. Sci. Ezlg., 1991,62,731-735]).

다수의 분산계가 물질, 특히 생물학적으로 활성인 화합물의 캐리어로서 현재 사용중에 있거나 개발중에 있다. 약제 및 화장품에서 사용되는 분산계는 현탁액 또는 유액으로 분류될 수 있다. 현탁액은 현탁제를 사용하여 액상 매질내 분산되어 있는 크기가 나모미터 내지 수백 마이크론 범위인 고체 입자로서 정의된다. 고체 입자는 중심체, 미세캡슐, 및 나노스피어를 포함한다. 유제는 계면활성제 및 리피드와 같은 유화제의 계면 필름에 의해 안정화된 또다른 액상중의 하나의 액상의 분산액으로 정의된다. 유제 제형은 유중수 및 수중유 유제, 다중 유제, 미세유제, 마이크로드로플릿, 리포좀을 포함한다. 드로플릿은 단층 포스포리피드 비히클로서 Haynes의 미국 특허 4,622, 219 및 4,725, 442에 의해 정의된 바와 내부에 오일상과 함께 구형의 리피드 층으로 구성되어 있다. 리포좀은 불수용성의 극성 리피드를 수용액과 혼합하여 제조된 포스포리피드 비히클이다. 물에 불용성 리피드를 혼합하여 형성된 바람직하지 못한 엔트로피는 포획 수용액과 함께 집중적인 포스포리피드의 클로징 막의 고도한 어셈블리을 형성하게 한다.

Dunn, et al.의 미국 특허 4,938, 763에는 생체적합성, 수용성 용매에 비반응성 불수용성 열가소성 폴리머를 용해시켜 액체을 형성하고, 체내에 상기 액체를 놓고 용매를 산재시켜 고체 임플란트를 제조하는 방법이 기술되어 있다. 중합체 용액은 주사기를 통해 몸에 위치할 수 있다. 임플란트는 그를 둘러싼 캐비티의 모형으로 가정될 수 있다. 다른 일면에서, 임플란트는 용매를 포함하지 않고 고체를 형성하기 않고 통상 경화(cure) 촉매를 가함으로서 경화시키는 반응성 액상 올리고머 폴리머로부터 형성된다.

다수의 특허 출원에는 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 또는 그의 다른 정의된 프로드럭을 투여하기 위하여 사용될 수 있는 약물 전달 시스템이 기술되어 있다. 미국 특허 5,749, 847에는 전기충격(electrophoration)에 의해 뉴클레오시드를 그의 유기체내로 전달하는 방법이 기술되어 있다. 미국 특허 5,718, 921에는 폴리머 및 그 내부에 분산되어 있는 약물을 포함하는 중심체가 기술되어 있다. 미국 특허 5,629, 009에는 생체활성 인자의 서방성 방출을 위한 전달 시스템이 기술되어 있다. U. S. Patent No, 5,578, 325에는 나노입자 및 마이크로입자의 비선형 친수성 친유성 다중블락 코폴리머가 기술되어 있다. 미국 특허 5,545, 409에는 생체활성 인자의 서방성 방출을 위한 전달 시스템이 기술되어 있다. 미국 특허 5,494, 682에는 이온 가교결합된 폴리머 미세캡슐이 기술되어 있다.

Andrx Pharmaceuticals, Inc.의 미국 특허 5,728, 402에는 하이드로겔 형성제와 함께 활성 약물, 그의 염, 에스테르 또는 프로드럭을 포함하는 내부 상, 및 위에서의 용해되지 못하도록 하는 코팅을 포함하는 외부 상을 포함하는 서방성 제제에 대하여 기술되어 있다. Andrx Pharmaceuticals, Inc.의 미국 특허 5,736, 159 및 5,558, 879에는 동소에 통로가 형성되어 있는 거의 불수용성인 약물의 서방성 제제에 대하여 기술되어 있다. Andrx Pharmaceuticals, Inc.의 미국 특허 5,567, 441에는 1일 1회 투여용의 서방성 약제가 기술되어 있다. 미국 특허 5,508, 040에는 다중미립자 박동성 전달 시스템에 대하여 기술되어 있다. 미국 특허 5,472, 708에는 박동성 입자 기초 약물 전달 시스템에 대하여 기술되어 있다. 미국 특허 5,458, 888에는 평균 분자량이 3,000 내지 10,000인 폴리에틸렌 글리콜 폴리머를 포함하는 외부 상 및 내부 약물 포함 상을 갖는 혼화물을 사용하여 제조될 수 있는 서방성 정제에 대하여 기술되어 있다. 미국 특허 5,419, 917에는 실질적으로 하이드로겔로부터 약물을 0차의 속도로 방출할 수 있도록 하는 유효량의 약제학적으로 허용가능한 이온화 화합물을 사용하는 것에 기초하여 하이드로겔로부터 약물을 방출하는 속도를 변화시키는 방법에 대하여 기술되어 있다. 미국 특허 5,458, 888에는 서방성 정제에 대하여 기술되어 있다.

E1an Corporation, plc의 미국 특허 5,641, 745에는 생체분해성 폴리머중 활성 약물을 포함하여 중심체 또는 나노스피어를 형성하는 서방성 약제가 기술되어 있다. 생체분해성 폴리머는 적절하게 폴리-D, L- 락티드 또는 폴리-D,L-락티드 및 폴리-D, L-락티드-코-글리콜리드의 혼화물이다. E1an Corporation, plc의의 미국 특허 5,616, 345에는 유기산과 결합된 활성 화합물 및 대다수의 코어를 둘러싸고, 약제학적으로 허용가능한 필름-형성, 불수용성 합성 폴리머 및 소수의 약제학적으로 허용가능한 필름-형성, 수용성 합성 폴리머를 포함하는 다층막을 포함하는, 1일 1회 투여용의 서방성 약제가 기술되어 있다. 미국 특허 5,641, 515에는 생체분해성 나노입자에 기초한 서방성 약제가 기술되어 있다. 미국 특허 5,637, 320에는 1일 1회 투여용의 서방성 약제가 기술되어 있다. 미국 특허 5,580, 580 및 5,540, 938는 신경 질환 치료에서의 용도 및 제제에 관한 것이다. 미국 특허 5,533, 995는 서방성 약물 전달을 위한 수동 경피 장치에 관한 것이다. 미국 특허 5,505, 962는 서방성 약제가 기술되어 있다.

VIII. 활성 화합물의 제조

본 발명의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드는 본 분야에 잘 공지되어 있고, [Holy, Collect. Czech.Chenu.Commu7l. 1972, 37 (12), 4072-87 and Mol. Plays. 1967,3 (4), 386-95]에 기술된 방법에 따라 제조할 수 있다.

β-L-2'-데옥시뉴클레오시드 (β-L-dN)를 수득하는 일반 방법을 출발 물질로서 L-리보스 또는 L-크실로스를 사용하여 도 1에 나타낸다.

공개된 방법에 따라 기술된 바와 같이 활성 뉴클레오시드의 모노, 디 및 트리포스페이트 유도체를 제조할 수 있다. 모노포스페이트는 [Imai et al., J. Org. Chem., June 1969, 34 (6), 1547-1550.]의 방법에 따라 제조할 수 있다. 디포스페이트는 [Davisson et al., J.07-g. C1ze7n., 1987, 52 (9), 1794-1801]의 방법에 따라 제조할 수 있다. 트리포스페이트는 [Hoard et al. , J. Am. Clietn. Soc., 1965, 87 (8), 1785-1788]의 방법에 따라 제조할 수 있다.

β-L-뉴클레오시드의 β-L-5'-유도체 제조 방법

β-L-뉴클레오시드의 β-L-5'-유도체는 본 분야의 공지된 방법, 특히 알코올을 아실 부위, 즉 안하이드라이드를 통해 보호하거나, 커플링제의 도움을 통한 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, β-L-5'-유도체는 하기 반응 순서에 따라 제조될 수 있다:

바람직한 일면에서, 5'-유도체는 아미노아실 부위로부터 유도된다. 본 과정을 위한 중요한 출발 물질은 적절하게 치환된 β-L- 뉴클레오시드이다. β-L-뉴클레오시드는 구입가능하거나 L-당 부위, 예로서, 데옥시리보스와의 표준 커플링 반응을 포함하는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 아미노아실 유도체는 바람직하게 뉴클레오시드의 추가적인 보호없이 아미노산을 β-L-뉴클레오시드에 선택적으로 커플링시켜 제조할 수 있다. 커플링을 촉진하는 적절한 커플링 시약을 사용하여 커플링 반응을 수행할 수 있다. 커플링 시약의 비제한적인 일례는 트리페닐 포스핀 또는 다양한 유형의 카보기이미드와 Mitsunobu형 시약 (예로서, 디알킬 아조디카복실레이트 예: 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 디에틸 아조디카복실레이트)이다.

커플링 반응은 원하는 결과를 얻기 위한 어느 온도, 즉, 분해를 촉진시키지 않거나 과량의 부산물없이 적절한 속도로 반응을 진행시키기에 적절한 어느 온도에서 수행될 수 있다.

어느 반응 용매는 필요한 온도를 얻을 수 있고 반응 성분을 용해시킬 수 있는 것으로 선택될 수 있다. 비제한적인 예는 비양성자성 용매이고, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 알킬 또는 할로-알킬 용매 예: 헥산, 사이클로헥산, 디클로로메탄 또는 디클로로에탄, 톨루엔, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디티안, THF, 디옥산, 아세토니트릴, 디에틸 에테르, 피리딘, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸설폭사이드 (DMSO), 디메틸아세트아미드, 또는 그의 배합물을 포함한다.

도식 1은 L-데옥시리보뉴클레오시드로부터 유도된 β-L-5'-아미노아실- 뉴클레오시드를 제조하는 비제한적인 예이다.

도식 1

β-L-뉴클레오시드의 β-L-3'-유도체의 제조 방법

2'-데옥시-뉴클레오시드의 β-L-3'-유도체는 본 분야의 공지된 방법, 특히 2차 알코올을 아실 부위, 즉 안하이드라이드를 통해 보호하거나, 커플링제의 도움을 통한 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, 3'-유도체는 하기 반응 순서에 따라 제조될 수 있다:

다르게는, 3'-유도체는 아미노아실 부위로부터 유도된다. 본 과정을 위한 중요한 출발 물질은 적절하게 치환된 β-L- 뉴클레오시드이다. β-L-뉴클레오시드는 구입가능하거나 L-당 부위와의 표준 커플링 반응을 포함하는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다.

이들 아미노아실 유도체는 우선 5'- 하이드록실을 적절한 산소 보호 그룹, 예로서 아실 또는 실릴 보호 그룹으로 보호하고, 임의로 헤테로사이클릭 또는 헤테로방햐족 염기내 유리 아민을 보호하여 제조할 수 있다. 연속하여 유리 3'-하이드록실은 N-보호된 β 또는 β 아미노산으로 커플링될 수 있다.

연속하여 β-L-뉴클레오시드를 커플링을 촉진하는 적절한 커플링 시약을 사용하여 아미노아실에 커플링시킨다. 커플링 시약의 비제한적인 일례는 트리페닐 포스핀 또는 다양한 유형의 카보기이미드와 Mitsunobu형 시약 (예로서, 디알킬 아조디카복실레이트 예: 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 디에틸 아조디카복실레이트)이다.

어느 반응 용매는 필요한 온도를 얻을 수 있고 반응 성분을 용해시킬 수 있는 것으로 선택될 수 있다. 비제한적인 예는 비양성자성 용매이고, 예로서, 제한하는 것은 아니지만, 알킬 또는 할로-알킬 용매 예: 헥산, 사이클로헥산, 디클로로메탄 또는 디클로로에탄, 톨루엔, 아세톤, 에틸 아세테이트, 디티안, THF, 디옥산, 아세토니트릴, 디에틸 에테르, 피리딘, 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸sulf옥사이드 (DMSO), 디메틸아세트아미드, 또는 그의 배합물을 포함한다.

도식 2는 L-데옥시리보뉴클레오시드로부터 유도된 β-L-3'-아미노아실- 뉴클레오시드를 제조하는 비제한적인 예이다.

도식 2

β-L-뉴클레오시드의 β-L-3',5'-비스-O-유도체의 제조 방법

β-L-뉴클레오시드의 β-L-3',5'-비스-O-유도체는 본 분야의 공지된 방법, 특히 1차 및 2차 알코올을 아실 부위, 즉 안하이드라이드를 통해 보호하거나, 커플링제의 도움을 통한 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 비제한적인 예로서, β-L-3',5'-비스-O-유도체는 하기 반응 순서에 따라 제조될 수 있다:

바람직한 일면에서, 3',5'-비스-O-유도체는 아미노아실 부위로부터 유도된다. 본 과정을 위한 중요한 출발 물질은 적절하게 치환된 β-L- 뉴클레오시드이다. β-L-뉴클레오시드의 3',5'-비스-O-유도체는 구입가능하거나 L-당 부위, 예로서, 데옥시리보스와의 표준 커플링 반응을 포함하는 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 연속하여 유리 3'- 및 5'-하이드록실은 N-보호된 β 또는 β 아미노산으로 커플링될 수 있다. 커플링을 촉진하는 적절한 커플링 시약을 사용하여 커플링 반응을 수행할 수 있다. 커플링 시약의 비제한적인 일례는 트리페닐 포스핀 또는 다양한 유형의 카보기이미드와 Mitsunobu형 시약 (예로서, 디알킬 아조디카복실레이트 예: 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 디에틸 아조디카복실레이트)이다.

삭제

도식 3은 L-데옥시리보뉴클레오시드로부터 유도된 β-L-3', 5'-디- 아미노아실-뉴클레오시드를 제조하는 비제한적인 예이다.

도식 3

아미노아실 부위 확장을 위한 임의 방법

표제 화합물은 3' 및 5'-하이드록실을 적절한 유도체, 예로서, 아실, 및 특히 아미노아실 그룹과 반응시켜 제조할 수 있다. 뉴클레오시드가 아미노아실 부위로 유도된 경우, 추가로 유리 아민을 N-보호된 β 또는 β 아미노산과 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 커플링을 촉진하는 적절한 커플링 시약을 사용하여 커플링 반응을 수행할 수 있다. 커플링 시약의 비제한적인 일례는 트리페닐 포스핀 또는 다양한 유형의 카보기이미드와 Mitsunobu형 시약 (예로서, 디알킬 아조디카복실레이트 예: 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 디에틸 아조디카복실레이트)이다.

헤테로방향족 또는 헤테로사이클릭 염기를 유도화시키는 임의 방법

표제 화합물은 헤테로사이클릭 또는 헤테로방향족 염기, 예를 들면 N⁴-사이토신, N⁶-아데닌 또는 N²-구아닌중 유리 아미노를 임의로 보호화하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 아민은 하기 일반적일 프로토콜에 의해 아실 부위 또는 디알킬아미노메틸렌 부위에 의해 보호될 수 있다.

보호 반응은 원하는 결과를 얻기 위한 어느 온도, 즉, 분해를 촉진시키지 않거나 과량의 부산물없이 적절한 속도로 반응을 진행시키기에 적절한 어느 온도에서 수행될 수 있다.

연속하여 유리 3'-하이드록실을 N-보호된 β 또는 β 아미노산과 커플링시킬 수 있다. 커플링을 촉진하는 적절한 커플링 시약을 사용하여 커플링 반응을 수행할 수 있다. 커플링 시약의 비제한적인 일례는 트리페닐 포스핀 또는 다양한 유형의 카보기이미드와 Mitsunobu형 시약 (예로서, 디알킬 아조디카복실레이트 예: 디이소프로필 아조디카복실레이트 및 디에틸 아조디카복실레이트)이다.

다른 일면에서, N⁴- 또는 N⁶-아실 유도체는 아미노아실 부위로부터 유도되고, 하기 반응 순서에 의해, 임의로 유리 하이드록실을 보호한 후 적절하게 보호화된 아미노 에스테르와 축합 반응시키고 필요한 경우 하이드록실 그룹을 제거하여 제조할 수 있다.

융점은 Gallenkamp MFB- 595-010 M 기기상의 개방 모세관에서 측정하고 보정하지 않았다. UV 흡광 스펙트럼은 에탄올중 Uvikon 931 (KONTRON) 분광광도계에서 기록하였다. ¹H-NMR 스펙트럼은 Bruker AC 250 또는 400 분광광도계로실온에서 DMSO-d₆에서 이동시켰다. 화학적 시프트는 ppm으로 하고, 참고로서 DMSO-d5는 2.49ppm으로 세팅하였다. 중수소 교환, 탈커플링 실험 또는 2D-COSY를 수행하여 양성자 할당을 확인하였다. 시그날 다중성은 s (singlet), d (doublet), dd (doublet of doublets), t (triplet), q (quadruplet), br (broad), m (multiplet)으로 나타내었다. 모든 J-값은 Hz이다. FAB 질얀 스펙트럼은 양성 -(FAB > 0) 또는 음성-(FAB < 0) 이온 모드로 JEOL DX 300 질량 분광광도계에서 기록하였다. 매트릭스는 3-니트로벤질 알코올(NBA) 또는 글리세로 및 티오글리세롤의 혼합물(50: 50, v/v)(GT)이었다. 특정 회적은 Perkin-E1mer 241 분광편광계 (패스 길이 1cm)상에 측정하고 10^-1 deg cm² g^-1유니트로 제공한다. 원소 분석은 "Service de Microanalyses du CNRS, Division de Venaison" (France이 수행하였다. 원소 기호 또는 기능을 나타내는 분석치는 이론치의 ±0.4%이내였다. 박층 크로마토그래피는 Silica Gel 60F₂₅₄의 사전 코팅된 알루미늄 시트 (Merck, Art. 5554)에서 수행되고, 산물의 UV 투시법은 UV 흡수 후 10% 에탄올 황산으로 까맣게 하고(char) 가열하여 수행하였다. 칼럼 크로마토그래피는 대기압하에 Silica Gel 60(Merck, Art. 9385)에서 수행하였다.

실시예 1

2'-데옥시-β-L-시티딘의 입체특이적 합성

1-(3, 5-디-O-벤조일-β-L-크실로푸라노실) 우라실(2)

하이드라진 하이드레이트 (1.4 mL, 28.7 mmol)을 피리딘(60mL) 및 아세트산 (15 mL)중 1-(2-O-아세틸- 3, 5-디-O-벤조일-β-L-크실로푸라노실) 우라실 1 [Ref. : Gosselin, G.; Bergogne, M. -C. ; Imbach, J.β-L.,"Synthesis and Antivirus Evaluation ofβ-L-Xylofuranosyl nucleoside of the Five naturally occurring nucleic acid Bases", Journal of Heterocyclic Claemistry, Oct. -Nov. 1993,30, 1229-1233] (4.79 g, 9.68 mmol)용액에 가하였다. 용액을 밤새도록 실온에서 교반하였다. 아세톤을 가하고(35 mL) 혼합물을 30분동안 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 증발시켰다. 생성된 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 [용리제: 디클로로메탄 중 메탄올의 단계적 구배(0-4%)] 사이클로헥산/디클롤로메탄으로부터 결정화된 2 (3.0 g, 68%)를 수득하였다:

1-(3, 5-디-0-벤조일-β-L-아라비노푸라노실) 우라실(3)

무수 벤젠-DMSO 혼합물(265ml, 6:4, v/v)중 1- (3, 5-디-0-벤조일-β-L-크실로푸라노실)우라실 2(8g, 17.7ml) 용액에 무수 피리딘(1.4ml), 디사이클로헥실카보디미이드(10.9g, 53mmol) 및 디클로로아세트산(0.75ml)을 가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 4시간동안 교반한 후, 에틸 아세테이트(400ml)로 희석하고 메탄올(14ml)중 옥살산 용액(4.8g, 53mmol)을 가하였다. 1시간동안 교반한 후, 용액을 여과하였다. 여액을 NaCl 포화 용액(2x500ml), 3% NaHCO₃ 용액(2x500ml) 및 물(2x500ml)로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 증발시켰 다. 생성된 잔류물을 EtOH 무수-벤젠 혼합물(140ml, 2:1, v/v)에 용해시켰다. 0℃에서 이 용액에 NaBH₄(0.96g, 26.5mmol)을 가하였다. 1시간동안 교반한 후, 용액을 에틸 아세테이트(400ml)로 희석하고 여과하였다. 여액을 NaCl 포화 용액(400ml), 및 물(400ml)로 세척하였다. 유기 상을 Na₂SO₄상에서 건조시킨 후 감압하에 증발시켰다. 생성된 조 물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 [용리제: 디클로로메탄 중 메탄올의 단계적 구배(0-3%)] 아세토니트릴로부터 결정화된 3 (5.3 g, 66%)를 수득하였다:

1- (3, 5-디-0-벤조일-2-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노실) 우라실(4)

무수 1, 2-디클로로에탄 (120 mL)중 1-(3, 5-디-O-벤조일-β-L-아라비노푸라노실) 우라실 3 (5.2 g,11. 4mmoL)에 페녹시티오카보닐 클로라이드 (4.7 mL, 34.3 mL) 및 4- (디메틸아미노) 피리딘(DMAP, 12.5 g, 102.6 mmoL)를 가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간동안 아르곤 대기하에 교반하고 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (300 mL)에 용해시키고 유기 용액을 연속하여 빙냉 0.2 N 염산 용액 (3x 200 mL) 및 물(2x200 mL)로 세척하고, Na₂S0₄상에서 건조시키고 감압하에 증발시켰다. 조 물질을 무수 디옥산과 여러 차레 공증발시키고 이 용매(110ml)에 용해시켰다. 아르곤하에서 생성된 용액에 트리스- (트리메틸실릴) 실란 하이드라이 드 (4.2 mL, 13.7 mmol) 및 α,α'-아조이소부티로니트릴 (AIBN, 0.6 g, 3.76 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 가열하고 아르곤하에 100℃에서 1시간동안 교반한 후 실온으로 냉각시키고 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 [용리제: 메탄올의 단계적 구배(0-5%)] EtOH로부터 결정화된 4(2.78 g, 56%)를 수득하였다:

2'-데옥시-β-L-시티딘 (β-L-dC)

Lawesson's 시약 (1.72 g, 4.26 mmol)을 아르곤하에 무수 1, 2-디클로로에탄 (120mL)중 1-(3,5-디-O-벤조일-2-데옥시-β-L-에리트로-펜토푸라노실)우라실 4 (2.66 g, 6.1 mmol) 용액에 가하고 반응 혼합물을 환류하에 2시간동안 교반하였다. 용매를 감압하에 증발시키고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 [용리제: 디클로로메탄중 에틸 아세테이트의 단계적 구배(0-8%)] 황색 기포로서 4-티오 중간체를 수득하였다. 메탄올 암모니아(50 mL)(앞서 -10℃에서 포화되고 타이트하게 종결됨)중 이 티오-중간체(1.5 g, 3.31 mmol) 용액를 스테인리스-스틸 밤(bomb)내에서 100℃에서 3시간동안 가열한 후 0℃으로 냉각시켰다. 용액을 감압하에 증발시켰다. 생성된 조 물질을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다[용리제: 디클로로메탄중 메탄올의 단계적 구배(0-20%)]. 최종적으로, 적절한 분획을 풀링하고, 유니트 Millex HV-4 (0,45 m Millipore)를 통해 여과하고 감압하에 증발시켜 무수 EtOH로부터 결정화된 원하는 2'-데옥시-β-L- 시티딘(β-L-dC)을 기포로서(0. 6 g, 80%) 수득하였다:

상업적으로 이용가능한 D-에난티오머의 하이드로클로라이드 염

실시예 2

2'-데옥시-β-L-시티딘 (β-L-dC) 입체특이적 합성

2-아미노-β-L-아라비노푸라노-[1',2': 4, 5]-옥사졸린(5)

L-아라비노스 (170 g, 1.13 mol: Fluka, > 99.5%, ref 10839), 시아나미드(100g, 2.38 mol: Fluka, > 98%, ref 28330), 메탄올 (300 mL), 및 6M- NH₄OH (50 mL) 혼합물을 3일동안 실온에서 교반하고 밤새도록 -10℃에 방치하였다. 흡입하여 산물을 수거하고, 메탄올 및 에테르로 연속하여 세척하고 진공하에 건조시켰다. 분석으로 순수한 화합물 5의 수율, 130 g (66.0%)

O^2,2'-안하이드로-β-L-우리딘 (6)

50% 수성 에탄올(740 mL)중 화합물 5 (98. 8 g, 0.57 mol) 및 메틸 프로피오레이트 (98 mL: Fluka, > 97%, ref 81863) 용액을 5시간동안 환류시키고, 냉각시키고 감압하에서 원 부피의 1/2로 농축시켰다. 아세톤(600 ml)으로 침전시킨 후, 산물을 흡입하여 수거하고 에탄올 및 에테르로 세척하고 건조시켰다. 모(mother) 액체를 부분적으로 농축시키고 농축물을 아세톤(1000 ml)으로 침전시키고, 고체를 흡입하여 수거하고 아세톤 및 에테르로 세척하여 또다른 산물을 수득하였다. 화합물 6의 총 수율, 80 g(62%),

3', 5'-디-O-벤조일-O ^2,2' -안하이드로-β-L-우리딘 (7)

무수 피리딘(1200 ml) 중 화합물 6 (71.1 g, 0.31 mol) 용액에 벤조일 클로라이드 (80.4 mL: Fluka, p. a. , ref 12930)를 0℃에서 아르곤하에 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 5시간동안 수분이 제거된 대기하에서 교반하고 에탄올을 가하여 종결시켰다. 용매를 감압하에 증발시키고 생성된 잔류물을 톨루엔 및 무수 에탄올과 함께 공증발시켰다. 조 혼합물을 에탄올로 희석하고 침전물을 흡입하여 수 거하고, 에탄올 및 에테르로 연속하여 세척하고, 건조시켰다. 수율, 화합물 7: 129 g (95.8%)

3', 5'-디-O-벤조일-2'-클로로-2'-데옥시-β,L-우리딘 (8)

0℃에서 디메틸포름아미드 (460 ml)중 화합물 7 (60.3 g, 0. 139 mol) 용액에 3.2 N-HCl/DMF 용액 (208 ml, 동소 0℃에서 27.3 mL의 메탄올 및 133.5 mL의 디메틸포름아미드 용액에 47.2 ml의 아세틸 클로라이드 (Fluka, p. a. , ref 00990)를 가하여 제조)을 가하였다. 반응 혼합물을 수분을 제거한 대기하에서 1시간동안 100℃에서 교반하고, 물(4000 mL)에 부었다. 화합물 8의 침전물을 흡입하여 수거하고 물로 세척하고 에탄올로부터 재결정화시켰다. 결정을 수거하고 냉에탄올 및 에테르로 세척하고 감압하에 건조시켰다. 수율, 화합물 8: 60.6 g (92.6%),

3',5'-디-O-벤조일-2'-데옥시-β,L-우리딘 (9)

건 톨루엔(720 ml)중 화합물 8 (60.28 g, 0.128 mol), 트리-n-부틸틴 하이드라이드 (95 mL: Fluka, > 98%, ref 90915) 및 아자비스이소부티로니트릴 (0.568 g: Fluka, > 98%, ref 11630) 혼합물을 5시간동안 교반하면서 환류시키고 냉각시켰다. 고체를 흡입하여 수거하고 냉 톨루엔 및 페트롤륨 에테르로 세척하였다. 여액을 감압하에 농축시키고 페트롤륨 에테르로 희석하여 추가의 산물로서 화합물 9를 침전 시켰다. 수율, 화합물 9: 54.28 g (97.2%);

3', 5'-디-O-벤조일-2'-데옥시-β-L-4-티오-우리딘 (10)

무수 메틸렌 클로라이드 (3900 ml)중 화합물 9 (69 g, 0. 158 mol) 및Lawesson's 시약 (74 g: Fluka, > 98%, ref 61750) 용액을 밤새도록 아르곤하에서 환류시켰다. 용매를 증발시킨 후, 조 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여[용리제: 메틸렌 클로라이드중 메탄올 구배(0-2%)] 양적으로 순수한 화합물 10(73 g)을 수득하였다;

2'-데옥시-β-L-사이토신

메탄올(앞서 -5℃에서 포화된 암모니아로 포화되고 타이트하게 종결되고 냉각기에서 방치됨)중 화합물 10 (7.3 g, 0.016 mol) 용액(73ml)을 스테인리스-스틸 실린더에서 3시간동안 100℃에서 가열하였다. 주의깊게 냉각시킨 후, 용매를 감압하에 증발시켰다. 잔류물의 수용액을 에틸 에세테이트로 세척하고 증발건조시켰다. 화합물 10(10의 총량=73g)중 9개의 다른 샘플(각 7.3g)에 대하여 상기 공정을 수행하였다. 10개의 잔류물을 혼합하고 무수 에탄올로 희석하고 냉각시켜 결정으로서 2'-데옥시-β-L- 사이토신을 수득하였다. 미량의 벤즈아미드를 고체-액체 추출법(1시간동안 에틸 아세테이트중 환류)에 의해 2'-데옥시-β-L-사이토신의 결정으로부터 제거하였다. 수율, 화합물 6: 28.75 g (78.6%)

실시예 3

2'-데옥시-β-L-티미딘 (β-L-dT) 입체특이적 합성

3', 5-'디-O-벤조일-2'-데옥시-5-요오도-β-L-우리딘 (11)

화합물 9 (105.8 g, 0.242 mol), 요오드 (76.8 g: Fluka, 99.8%, ref 57650), 세륨 질산암모늄(CAN) (66.4 g: Aldrich, > 98.5%, ref 21,547-3) 및 아세토니트릴 (2550 ml) 혼합물을 3시간동안 80℃에서 교반한 후 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 화합물 11을 결정화시켰다(86.6 g, 63.5%) ;

3', 5'-디-O-벤조일-2'-데옥시-3-N-톨루오일-β-L-티미딘 (13)

디이소프로필에틸아민(53.6 ml: Aldrich, > 99.5%, ref 38,764-9)을 포함하는 무수 피리딘(1530 ml)중 화합물 11 (86.6g, 0.154 mol)에 0℃에서 p-톨루오일 클로라이드 (40.6 ml: Aldrich, 98%, ref 10,663-1)을 소량씩 가하였다. 반응 혼합물을 2시간동안 실온에서 교반하고 물을 가하여 반응을 종결시키고 반응 혼합물을 메틸렌 클로라이드로 추출하였다. 유기상을 물로 세척하고 황산나트륨상에서 건조시키고 증발 건조시켜 조 3', 5'-디-O-벤조일-2'-데옥시-3-N-톨루오일-5-요오도-β-L-우리딘 (12)를 수득하고 다음 단계에서 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

트리에틸아민 (4.3 mL)을 포함하는 N-메틸피롤리디논 (1375 mL: Aldrich, > 99%, ref 44,377-8)중 조 혼합물 12, 파라듐 아세테이트 (3.44 g: Aldrich, > 99.98%, ref 37,987-5), 트리페닐포스핀 (8.0 g: Fluka, > 97%, ref 93092) 용액을 실온에서 45분간 교반하였다. 테트라메틸틴 (42.4 mL: Aldrich, > 99%, ref 14,647-1)을 0℃에서 아르곤하에 적가하였다. 100-110℃에서 밤새도록 교반한 후, 반응 혼합물을 물에 붓고 디에틸 에테르로 추출하였다. 유기 용액을 황산나트륨상에서 건조시키고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여[용리제: 톨루엔중 에틸 아세테이트의 단계적 구배(0-10%)] 기포로서 화합물 13을 수득하였다(42.3 g, 48.3% for the 2steps).

2'-데옥시-β-L-티미딘

메탄올(앞서 -5℃에서 암모니아로 포화되고 타이트하게 종결되고 냉각기에서 방치됨)중 화합물 13 (42.3 g, 0.074 mol) 용액(1850ml)을 2일동안 실온에서 교반하였다. 용매를 증발시킨 후, 잔류물을 물로 희석하고 에틸 에세테이트로 수회 세척하였다. 수층을 분리하고, 감압하에 증발시키고 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여[용리제: 메틸렌 클로라이드중 메탄올의 단계적 구배(0-10%)] 에탄올로부터 결정화된 순수한 2'-데옥시-β-L-티미딘 (11.62 g, 64.8%)를 수득하였다;

실시예 4

β-L-dC 5'-L-발릴 에스테르의 화학적 합성

β-L-dC 아미노 에스테르 합성을 설명한 일례와 같이 (CH₃)₃SiCl을 사용하여 β-L-dC의 아민 그룹을 먼저 보호하여 β-L-dC 5'-L- 발릴 에스테르를 합성한다. N-Boc L- 발린을 가하여 보호된 β-L-dC를 에스테르화시킨다. 에스테르를 탈보호화시켜 β-L-dC 5'-L-발릴 에스테르를 수득한다. 아미노산 에스테르르 합성하는 다른 방법은 미국 특허 5,700, 936 및 4,957, 924에 기술되어 있고, 이는 전체적으로 참고문헌으로서 인용된다. L-dA, L-dC, L-dT, 및 L-dU의 L-발리닐 5'-O-에스테르는 본 발명의 바람직한 일례이다.

Ref 1: D 시리즈에서 앞서 기술된 방법을 변형: Nyilas, A. et al. Tetrahedron 1990, 46 (6), 2149-2164.

Ref 2 : 어사이클로비르 L-발릴 에스테르에 대하여 기술된 방법을 변형: Beauchamp, L. M.. et al. 항바이러스 Chemistry & Chemotherapy 1992,3 (3), 157-164.

실시예 5

⁴ N-mMTr-2'-데옥시-β-L-시티딘 (1, 도 1)

β-L-dC(1 g; 4.40 mmol)을 건성 피리딘(44 ml)에 용해시켰다. 트리메틸실릴 그룹 (TMSCl, 3.34 ml, 26.4 mmol)으로 일시적으로 보호한 후 mMTrCl (3. 38 mg, 11 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 540 mg, 4.40 mmol)을 가하고 반응 혼합물을 3일동안 실온에서 교반하였다{A. Nyilas; C. Glemarec ; J. Chattopadhyaya; Tetrahedron Lett. 1990,46, 2149-2164}. 중탄산나트륨으로 추출한 후 유기층을 물로 세척하고 증발시키고 디옥산(40 mL)에 용해시켰다. 수성 암모니아(8.5 ml)를 적가하고 반응 혼합물을 밤새도록 교반하였다. 모든 휘발성 물질을 증발시키고, 고체 잔류물을 실리카겔 칼럼상에서 정제하여{용리제 : CH₂Cl₂중 MeOH의 단계적 구배 (0-10%)} 원하는 화합물 1 (1.02 g, 46.5%)을 기포로서 수득하였다.

실시예 6

⁴ N-mMTr-2'-데옥시-β-L-시티딘의 5'-L-N-(t-부톡시카보닐) 발린 에스테르 (2, 도 1)

건성 DMF (34 ml)중 화합물 1(1 g, 2.00 mmol) 용액에 4-디메틸아미노피리딘(DMAP, 37 mg, 0.3 mmol), N-(t-부톡시-카보닐)-L-발린(Boc-Val-OH, 587 mg, 2.7 mmol), 및 N,N'-디사이클로헥실카보디이미드(DCC, 660 mg, 3.2 mmol)를 가하였다 {L. M. Beauchamp; G. F. Orr; P. De Miranda; T. Bumette ; T. A. Krenitsky; Antiviral Chem. Chemother. 1992,3,157- 164.}. 용액을 실온에서 교반하였다. 40시간 후, 반응 혼합물을 추가의 DMAP (37 mg, 0.3 mmol), Boc-Val-OH (587 mg, 2.7 mmol) 및 DCC(660 mg, 3.2 mmol)로 채우고 실온에서 40시간동안 교반하였다. 혼합물을 여과하고 여액으로부터 DMF를 감압하에 제거하고 잔류물을 실리카겔상에서 크로마토그래피하여{용리제 : CH₂Cl₂중 MeOH의 단계적 구배(0-10%)} 원하는 화합물 2 (515 mg, 37%)를 기포로서 수득하였다.

실시예 7

2'-데옥시-β-L-시티딘 하이드로클로라이드의 5'-L-발린 에스테르 (3, 도 1)

화합물 2 (500 mg, 0.715 mmol)를 CH₂Cl₂ (25 ml)중 20%의 트리플루오로아세트산 용액에 용해시키고 트리이소프로필실란 (1.47 ml, 71.5 mmol)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반하고 발린 에스테르를 Et₂0중에 트리플루오로아세테이트 염으로서 침전시켰다. 물과 함께 수회에 걸쳐 공증발시킨 후, 침전물을 물(2 ml)에 용해시키고, 디옥산(20 ml) 중 HCl 포화 용액으로 처리하고 감압하에 증발시켰다. 이러한 처리를 3회 반복하고 최종적으로 원하는 화합물 3을 에테르 (207 mg, 73%)에 하이드로클로라이드 염으로서 침전시켰다.

실시예 8

N ⁴ -아세틸-2'-데옥시-β-L-시티딘 (4, 도 2)

N, N-디메틸포름아미드 (9.2ml)중 뉴클레오시드, β-L-dC(415 mg, 1.83 mmol) 현탁액에 무수 아세트산(207㎕, 2.20 mmol)을 가하고 혼합물을 24시간동안 실온에서 교반하였다[V. Bhat; B. G.Ugarkar ; V. A. Sayeed,K.Grimm ; N. Kosora; P. A. Domenico; E. Stocker, Nucleoside & Nucleotides, 1989,8 (2), 179-183]. 감압하에 DMF를 제거한 후, 생성된 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하여 [용리제 : CH₂Cl₂중 15% MeOH ] 에탄올로부터 결정화된 원하는 화합물 4(310 mg, 63%)을 수득하였다;

실시예 9

N ⁴ -[(Di메틸아미노)메틸렌]-2'-데옥시-β-L-시티딘 (5, 도 3)

표제 화합물을 상응하는 D-에난티오머의 제조를 위해 개발된 공개 방법에 따라 제조하였다[S. G. Kerr, and T. I. Kalman, J. Pharm. Sci. 1994,83, 582-586]. DMF (4.8 ml)중 L-dC(500 mg, 2.20 mmol) 용액을 디메틸포름아미드 디메틸아세탈(2.8 ml, 21.08 mmol)로 처리하고 실온에서 밤새도록 교반하였다. 용액을 감압하에 증발시키고 에탄올과 함께 증발시켰다. 에탄올/에테르로부터 결정화하여 옅은 황색 결정으로서 표제 화합물 (501.2 mg, 81%)을 수득하였다.

실시예 10

3',5'-디-O-아세틸-2'-데옥시-β-시티딘 (6, 도 4)

표제 화합물을 D-에난티오머의 제조를 위해 Breiner et al [R. G. Breiner; W. Rose; J. A. Dunn; J. E. MaeDiarmid and J. Bardos; J. Med. Chem. 1990,33,2596-2603]에 의해 개발된 공개 방법에 따라 L-dC로부터 출발하는 1 단계로 합성하였다. 빙초산(4.8 ml)중 L-dC(765 mg, 3.37 mmol) 및 아세틸 클로라이드 (960㎕, 13.48 mmol) 용액을 10분간 실온에서 교반하고 건성 클로로포름(3.5 ml)을 가하고 24h동안 교반을 계속하였다. 용액을 감압하에 증발시키고 에탄올과 함께 공증발시켰다. 에탄올을 결정화하여 78%의 원하는 화합물을 수득하였다, mp 192.193 ℃(lit:187-189 ℃ for the D-에난티오머 [Breiner et al. J. Med. Chem. 1990,33,2596-2603]);

실시예 11

2'-데옥시-β-L-시티딘의 3',5'-L-N-(t-부톡시카보닐)발린 디에스테르 (9, 도 5)

DMF (35 ml)중 N⁴-[(디메틸아미노)메틸렌]-2'-데옥시-β-L-시티딘 (7, 500 mg, 1.77 mmol) 용액을 Boc-Val-OH (1.31 g, 6.03 mmol), DMAP (86.5 mg, 0.71 mmol), 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드(EDC) (1.36 g, 7.09 mmol)으로 처리하고 실온에서 40시간동안 교반하였다. 추가량의 Boc-Val-OH (655 mg, 3.01 mmol), DMAP (43.2 mg, 0.35 mmol), EDC(680 mg, 3.55 mmol)을 가하고 용액을 20시간동안 추가로 교반하였다. 감압하에 증발시키고 잔류물을 CH₂Cl₂에 용해시키고, 물로 수회 추출하였다. 유기층을 염수(100 ml)로 세척하고, 건조시키고(Na₂SO₄) 감압하에 증발시켜 조 물질로서 8을 수득하고, 추가로 정제하지 않고 다음 단계에 사용하였다. 잔류물을 디옥산(18 ml)에 용해시키고 aq. 26% NH₄0H으로 처리하고 1시간 동안 실온에서 교반하였다. 용액을 감압하에 증발시키고 잔류물을 CH₂Cl₂중 MeOH의 단계적 구배(0-5%)를 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 (698.7 mg, 9로부터 58%)을 수득하였다.

실시예 12

2'-데옥시-β-L-시티딘 하이드로클로라이드의 3,5'-L-발린 에스테르(10, 도 5)

디옥산 (30 ml)중 9 (675 mg, 1.08 mmol)의 용액을 26% HCl 디옥산 (30 ml) 용액으로 처리하고 1시간 55분동안 실온에서 교반하였다. 생성된 백색 현탁액을 감압하에 증발시켰다. 백색 고체 잔류물을 초소량의 MeOH에 용해시키고 에테르에 침전시켜 백색 고체로서 표제 화합물 10을 수득하였다.

실시예 13

2'-데옥시-β-L-시티딘의 N ⁴ -Boc-발리닐 에스테르 (13, 도 6)

무수 THF (80 ml)중 L-dC(1.80 g, 7.92 mmol) 및 트리에틸아민(8.8 ml, 63.14 mmol) 혼합물을 클로로트리메틸실란 (6 ml, 47.28 mmol)으로 처리하고 실온에서 밤새도록 교반하였다. NH₄Cl 포화수용액(26 ml) 및 물(10 mL)을 가하여 반응을 종결시켰다. 수층을 EtOAc로 3회 추출하였다. 유기층을 혼합하고, 염수로 세척하고 건조시키고(Na₂SO₄) 감압하에 증발시켜 11을 포함하는 옅은 황색의 조(crude) 기포성 오일을 수득하고, 다음 단계에 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 이 잔류 물을 CH₂Cl₂ (104 ml)에 용해시키고 N- (t-부톡시카보닐)-L- 발린(Boc-Val-OH, 1.72 g, 7.90mmol), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스(디메틸아미노) 포스포니움헥사플루오로포스페이트 (BOP, 4.20 g, 9. 50 mmol), 트리에틸아민 (2.2 ml, 15.78mmol)으로 처리하고 2일동안 실온에서 교반하였다. 용액을 EtOAc로 희석시키고 포화 NaHC0₃으로 2회 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na₂SO₄) 감압하에 증발시켜 조 물질로서 12를 수득하고, 다음 단계에 추가로 정제하지 않고 사용하였다. 이 잔류물을 디옥산 (80 ml)에 용해시키고 aq. 26% NH₄0H 용액으로 처리하고 실온에서 6시간 45분동안 교반하였다. 용액을 감압하에 증발시키고 무수 EtOH과 함께 증발시키고 잔류물을 CH₂Cl₂중 MeOH의 단계적 구배(5-10%)를 사용하여 실리카겔상에서 크로마토그래피에 의해 정제하여 표제 화합물 13을 기포로서 수득하였다.(1. 64 g,총 수율: 48. 5%).

실시예 14

3', 5'-N ⁴ -트리발릴-2'-데옥시시티딘 (14, 도 7)

출발물질, 3', 5'-N⁴-트리 (Boc-발릴)-2'-데옥시시티딘을 CH₂Cl₂에 용해시켰지만, 일부의 불용성 물질이 존재하여 Perlita를 통해 여과하였다. 이로서 사용된 CH₂Cl₂의 용량은 증가되었다. 이어서 HCl/디옥산 시약을 교반하면서 가하였다. 몇초안에 용액내에서 버블링되는 것을 일부 관찰할 수 있었고, 이어서 혼합물은 혼탁화되었다. 혼합물을 약 1시간동안 실온에서 교반하였다. 이 시간동안 침전물은 더욱 결정화였다. 혼합물을 신속하게 여과하고, 필터 케이크를 CH₂Cl₂로 세척한 후 펌프상에서 건조시켜 0.16g (69%)의 크림 백색의 결정을 수득하였다. 시약 및 조건은하기 표 1에 더욱 정확하게 기술한다.

표 1

실시예 15

DiBoc발릴-2'-dC 및 DiBoc발릴-2'-dU에 대한 HPLC 에세이

무수 에탄올중 원하는 화합물을 용해시켜 1.O mg/mL의 샘플을 제조하였다. 농도가 0.16mg/mL될 때까지 용액을 50% MeOH 및 50% KH₂PO₄(0. 015M, pH=3.30-3. 50)을 포함하는 용액으로 희석하였다. (주의: 사용한 모든 용매는 사용전 탈가스화시켰다). 20㎕의 용액을 즉시 WATERS (NOVAPAKC18- 4pm-3,9 X 150mm)로부터 HPLC 칼럼내로 주입하였다. 유속은 1 mL/분으로 칼럼 온도는 35℃으로 세팅하였다. 화합물을 검출하기 위하여 검출 파장은 디-Boc 2'dC에 대하여 275nm, 디-Boc2'dU에 대하여 260nm로, 15분후 불순물에 대하여 204로 하였다. 칼럼을 Pump A에서 KH₂P0₄(0.015M, pH=3.30-3.50, H₃PO₄ 10%v/v로 조절) 및 Pump B에서 HPLC 그래이드 아세토니트릴로 이동시켰다. 표 2에 구배 패턴을 나타낸다.

표 2

IX. 활성 화합물의 약동학

인간 DNA 폴리머라제 및 미토콘드리다의 작용은 시험관내에서 L-dC에 의해 영향을 받지 않았다. L-dC는 인간 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs), 골수 전구체 세포 및 인간 및 인간이 아닌 포유동물 기원의 다수의 세포주에 대하여 비세포독성이었다.

항바이러스 뉴클레오시드 및 뉴클레오시드 유사체는 바이러스 복제시 바이러스 폴리머라제의 수준으로 세포내 트리포스페이트 유도체로서 그의 항바이러스 작용을 발휘한다. 자연발생 뉴클레오시드 (D-데옥시시티딘 및 D-티미딘) 및 항바이러스 뉴클레오시드 유사체 (예로서, , 라미부딘 및 지노부딘)와 같이, L-dC는 인산화에 의해 세포내에서 활성화되었다. 인간 간세포에서 데옥시시티딘 키나제 (dCK)는 L-dC의 용량에 의존하는 5'-모노포스페이트 (MP) 유도체로의 초기 전환의 원인이 되었다. 이어서, L-dC-MP는 5'-디포스페이트 (DP) 형태로 전환되었고, 연속하여 주로 세포내 5'-트리포스페이트 (TP) 대사물질로 전환되었다. L-dC-TP 수준은 24시간째 10μM L-dC(1차 인간 간세포에서 90.1μM)에 노출된 HepG2 세포에서 72.4μM에 도달하였고 세포내에서 15.5시간의 반감기를 가졌다. L-dC 에 1차 배양액중 인간 간세포 또는 HepG2 세포를 노출시켜 2차 TP 유도체, β-L-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트 (L-dU-TP)를 제조하였다. L-dU-TP 수준은 24시간째 10μM L-dC(1차 인간 간세포에서 43.5μM)에 노출된 HepG2 세포에서 18.2μM에 도달하였다.

1차 인간 간세포 배양액 및 인간 간암 세포주 (HepG2)에서, L-dC의 주요 대사물질은 L-dC-TP이었다. 이들 세포를 L-dC에 노출시켰을 때 L-dU-TP가 형성되었다. L-dC-TP 및 L-dU-TP는 시험된 최대 농도인 농도 100μM까지는 인간 DNA 폴리머라제 α, β 및 γ를 저해하지 못했다.

실시예 16

용해도 연구

물중 자연발생 데옥시리보사이토신 (D-dC), L-dC의 3'-발리닐 에스테르 및 3', 5'-디발리닐 에스테르의 용해도를 비교하였다. L-dC의 용해도는 먼저 표 3에 나타낸 바와 같이 잘 알려진 다양한 농도의 β-L-dC를 연속 주입하여 HPLC 데이타 (즉, 곡선하 면적)에 의해 평가하였다. HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다. 용액 농도 대 곡선하 면적을 통해 y=4150049477 x- 4334.46845의 1차 관계가 형성되었다(도 8a).

표 3

농도(mol/l)	10^-3	5x10^-4	10^-4	10^-5
면적	4175916	2031950	440122	55264

이로부터 자연발생 데옥시리보사이토신(D-dC)로 포화 용액을 제조하였다; 3개의 샘플을 취하고 HPLC에 주입하였다. 포화 용액의 농도는 1.07, 1.08 및 0.96 mol/L로 측정되었고; 이로써, 포화 용액의 평균 포화 농도는 1.03 mol/L 또는 272 g/L이었다. 이 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4

결과	면적	농도(mol/L)
1차 샘플	4420674000	1.07
2차 샘플	4475191000	1.08
3차 샘플	3983845000	0.96

유사하게, 물중 β-L-dC의 3'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드의 용해도를 평가하였다. 보정 곡선은 다양한 농도의 β-L-dC의 3'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드를 HPLC에 연속 주입하고 곡선하 면적을 측정하여 측정하고 표 5에 나타내었다. 다시, HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다. 용액 농도 대 곡선하 면적을 통해 y=3176423963 x-33051.63의 1차 관계가 형성되었다.

표 5

농도(mol/L)	10^-3	5x10^-4	10^-4	5x10^-5	10^-5
면적	3,166,842	1,514,479	254.296	119,668	19,269

이로부터 β-L-dC의 3'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드에 대하여 포화 용액을 시도하였다; 그러나, 수득하지 못했다. 따라서, 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 최대량의 β-L-dC의 3'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드를 물에 용해시켰다. 3개의 샘플을 수거하고 HPLC로부터의 곡선하 면적을 측정하여 평균 농도는 1.013, 0.996 및 1.059 mol/L이었다. 결과를 표 6에 나타낸다.

표 6

결과	면적	농도(mol/L)
1차 샘플	3218013000	1.013
2차 샘플	3162471000	0.996
3차 샘플	3362725000	1.059

3개의 결과 모두 보정 곡선으로부터 산출된 예상 범위내 포함되어 있고, 이는 고농도로 화합물이 완전히 용해되고, 이 샘플의 포화 용액은 샘플 3개의 평균을 초과, 즉 1.023 mo/L 또는 408 g/L을 초과한다는 것을 언급한다.

물중 β-L-dC의 3', 5'-디발리닐 에스테르 하이드로클로라이드의 용해도를 평가하였다. 보정 곡선은 다양한 농도의 β-L-dC의 3', 5'-디발리닐 에스테르 하이드로클로라이드를 HPLC에 연속 주입하고 곡선하 면적을 측정하여 측정하고 표 7에 나타내었다. 다시, HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다. 용액 농도 대 곡선하 면적을 통해 y=3176423963x-33051. 63 의 1차 관계가 형성되었다(도 8b).

표 7

농도(mol/l)	10 ^-3	5x10 ^-4	10 ^-4	5x10 ^-5	10 ^-5
면적	2863372	1466574	211046	115678	14435

이로부터 β-L-dC의 3', 5'-디발리닐 에스테르 하이드로클로라이드에 대하여 포화 용액을 시도하였다; 그러나, 수득하지 못했다. 따라서, 실험실에서 쉽게 사용할 수 있는 최대량의 β-L-dC의 3', 5'-디발리닐 에스테르 하이드로클로라이드를 물에 용해시켰다. 3개의 샘플을 수거하고 HPLC로부터의 곡선하 면적을 측정하여 평균 농도는 2.8, 2.4 및 2.4mol/L이었다. 결과를 표 8에 나타낸다.

표 8

결과	면적	농도(mol/L)
1차 샘플	8336188000	2.8
2차 샘플	7054012000	2.4
3차 샘플	6970838000	2.4

3개의 결과 모두 보정 곡선으로부터 산출된 예상 범위내 포함되어 있고, 이는 고농도로 화합물이 완전히 용해되고, 이 샘플의 포화 용액은 샘플 3개의 평균을 초과, 즉 2.5 mo/L 또는 1337 g/L 이상이었다.

유사한 용해도 연구를 β-L-dC의 5'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드(5.1 mol/L 또는 1664 g/L 이상) 및 β-L-dC의 3', 5'-디아세틸 에스테르 하이드로클로라이드(3.3 mol/L 또는 1148 g/L)에 대하여 수행하였다. 누적 결과를 표 9에 나타낸다.

표 9

화합물	용해도(mol/L)	용해도(g/L)
D-dC	1.03	272
5`-발-L-dC	> 5.1	> 1664
3`-발-L-dC	> 1.023	> 408
3`5`-디아세틸-L-dC	3.3	1148
3`5`-디발-L-dC	> 2.5	> 1337

Log P 연구-포스페이트 완충액

옥타놀-1 (B)로 포화된 1 염기 인산칼륨용액 (28.5 mL) 및 2 염기 인산칼륨 용액 (71.5 mL)의 혼합물로부터 제조된 2.2 mL의 0.02 M 포스페이트 완충액 (A, 100 mL, pH 7.2)에 대략 1.5 mg의 D-dC를 용해시켰다. 1 mL의 이 용액에, 0.02 M 포스페이트 완충액 (A)으로 포화된 1 mL의 옥타놀-1 (B)을 가하였다. 생성된 혼합물을 진탕시키고 원심분리하였다; 각 상으로부터 3개의 샘플을 수거하고 HPLC에 의해 분석하고, 표 10에 나타내었다. HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다. D-dC의 log P는 -1.41인 것으로 관측되었고, 따라서, D-dC는 옥타놀보다 물을 선호한다는 것을 발견하게 되었다.

표 10

유사하게, 1 염기 인산칼륨용액 (28.5 mL) 및 2 염기 인산칼륨 용액 (71.5 mL)의 혼합물로부터 제조된 2.5 mL의 0.02 M 포스페이트 완충액 (A, 100 mL, pH 7.2)에 대략 대략 1.5 mg의 L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드를 용해시켰다. 옥타놀-1 (B)로 이 용액을 포화시켰다. 1 mL의 이 용액에, 0.02 M 포스페이트 완충액 (A)으로 포화된 1 mL의 옥타놀-1 (B)을 가하였다. 생성된 혼합물을 진탕시키고 원심분리하였다; 각 상으로부터 3개의 샘플을 수거하고 HPLC에 의해 분석하고, 표 11에 나타내었다. HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다.

표 11

Ave.	3385227	100284	3439738	100955
P(B/A),	0.0296		0.0293
log P	-1.53		-1.53

L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드의 log P는 -1.53인 것으로 관측되었고, 따라서, L-dC-3'-발린 에스테르는 D-dC보다도 더 큰 정도로 옥타놀보다 물을 선호한다는 것을 발견하게 되었다.

Log P 값을 L-dC-5'-발린 에스테르 하이드로클로라이드 및 L-dC- 3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드에 대하여 산출하였다. 결과를 표 12에 나타내었다. 그러나, L-dC- 3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드에 대한 log P 값은 측정치(-0.86)보다 더 낮을 있음에 주의하여야 한다. 실험하는 동안 디발린 에스테르가 3'- 또는 5'-모노발리닐 에스테르 또는 L-dC로도 상당부가 전환되었음이 관찰되었다. 수성상에서는 L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드가 50% 전환되었고, 유기상에서는 14%가 전환된 것이 검출되었다. 이러한 전환은 pH 7의 인산 완충액에서 에스테르가 불안정하기 때문이다(참조 실시예 15 및 16).

표 12

화합물	LogP(옥탄올/물)
D-dC	-1.41
L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드	-1.53
L-dC-5'-발린 에스테르 하이드로클로라이드	-1.42
L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드	-0.86
L-dC-3', 5'-디아세틸 에스테르 하이드로클로라이드	-0.74

Log P' 연구-MilliQ 물

디발린 에스테르가 모노 에스테르 및 L- dC로 전환되는 것을 막기 위하여 인산 완충액 대신 MilliQ 물(A')(pH 7.2 대신 6.5) 대체 log P 연구를 수행하였다. 디발리닐 에스테르의 하이드로클로라이드 형태만이 물에서 참작될 수 있다는 것에 주의하는 것이 중요하다. 대략 1.5 mg의 L-dC-3', 5'-디발리닐 에스테르 하이드로클로라이드를 옥타놀-1 (B)로 포화된 2.2mL의 MilliQ 물(A', pH 6.5)에 용해시켰다. 1 mL의 이 용액에, MilliQ 물(A')로 포화된 1 mL의 옥타놀-1 (B)을 가하였다. 생성된 혼합물을 진탕시키고 원심분리하였다; 각 상으로부터 3개의 샘플을 수거하고 HPLC에 의해 분석하고, 표 13에 나타내었다. HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다. 이러한 조건하에서의 3',5'-디발린의 log P'는 -2.72인 것으로 관측되었고, 이는 인산 완충액내 카운터 이온의 강력한 작용을 나타낸다. 디발린은 수성 또는 유기상중 어느 것에서도 모노에스테르 또는 L-dC 어느 것으로도 전환되지 않았다.

표 13

유사하게, 대략 1.5 mg의 L-dC-5'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드를 옥 타놀-1 (B)로 포화된 2.2mL의 MilliQ 물(A', pH 6.5)에 용해시켰다. 1 mL의 이 용액에, MilliQ 물(A')로 포화된 1 mL의 옥타놀-1 (B)을 가하였다. 생성된 혼합물을 진탕시키고 원심분리하였다; 각 상으로부터 3개의 샘플을 수거하고 HPLC에 의해 분석하고, 표 14에 나타내었다. HPLC를 유속 1ml/분으로 15분으로 프로그램화된 20mM 트리에틸암모늄 아세테이트 완충액(TEAAc)에서 0 내지 25%의 CH₃CN의 구배로 Nova-Pack C18 칼럼(3.9 x 150 mm)상에서 이동시켰다. 이러한 조건하에서의 5'-발린의 log P'는 -2.75 것으로 관측되었고, 이는 인산 완충액을 사용한 log P에서의 관측치보다 낮은 값이었다.

표 14

이러한 조건하에서, L-dC-5'-발리닐 에스테르 하이드로클로라이드 및 L-dC-3', 5'-디발리닐 에스테르 하이드로클로라이드에 대한 log P' 값은 매우 유사하였다(표 15).

표 15

화합물	log P (옥타놀/물)	log P' (옥타놀/물)
L-dC-5'-발린 에스테르 하이드로클로라이드	-1.42	-2.75
L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드	-0.86	-2.72

pH 7. 4에서의 안정성 연구

L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드의 각 대사물질의 분해 속도를 산출하였다. 37℃에서 pH 7.40에서의 L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드의 반감기는 0.2M 트리스-HCl 용액중 7시간인 것으로 측정되었다. 이러한 조건하에서 L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드는 L-dC으로 간단하게 형질전환된다. 따라서, 사이토신은 검출되지 않았고, 검출가능한 글리코시드 결합 분해는 존재하지 않았다.

유사하게, L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드의 각 대사물질의 분해 속도를 산출하였다. 37℃에서 pH 7.42에서의 L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드 반감기는 0.2M 트리스-HCl 용액중 2.4시간인 것으로 측정되었다. 이러한 조건하에서 L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드는 부분적으로 3'- 및 5'-발리닐-L-dC으로 가수분해되고, 이후 L-dC으로 형질전환된다. 따라서, 사이토신은 검출되지 않았고, 검출가능한 글리코시드 결합 분해는 존재하지 않았다(도식 4, 도 9a 및 9b).

도식 4

pH 7.20에서의 안정성 연구

pH 7.20에서의 L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드의 반감기는 20mM 인산 완충액에서 2.2시간인 것으로 측정되었다. 이러한 조건하에서 L-dC-3', 5'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드는 부분적으로 3'- 및 5'-발리닐-L-dC으로 가수분해되고, 이후 L-dC으로 형질전환된다. 따라서, 사이토신은 검출되지 않았고, 검출가능한 글리코시드 결합 분해는 존재하지 않았다(도식 5, 도 10a 및 10b).

도식 5

pH 4.5에서의 안정성 연구

pH 4.5에서의 L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드의 반감기는 20mM 아세테이트 완충액에서 8.6일인 것으로 측정되었다. 다시, L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드는 간단하게 L-dC으로 형질전환된다. 따라서, 사이토신은 검출되지 않았고, 검출가능한 글리코시드 결합 분해는 존재하지 않았다. 유사하게, pH 4.51에서의 L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드의 반감기는 20mM 아세테이트 완충액에서 44시간 동안 측정되었다. 이 상태에서, L-dC-3'-디발린 에스테르 하이드로클로라이드는 3`- 및 5`-발리닐-L-dC로 부분적으로 가수분해되고, 나중에 L-dC으로 형질전환된다. 따라서, 사이토신은 검출되지 않았고, 검출가능한 글리코시드 결합 분해는 존재하지 않았다. (도 11a 및 11b)

pH 1.2에서의 안정성 연구

pH 1.2에서의 L-dC-3'-발린 에스테르 하이드로클로라이드의 반감기는 135 mM KCl-HCl 완충액에서 48시간인 것으로 측정되었다. 사이토신은 검출되지 않았고, 검출가능한 글리코시드 결합 분해는 존재하지 않았다

유사하게, L-dC-5'-발린 에스테르 하이드로클로라이드에 대하여 안정성 연구를 수행하였다. pH 1.2에서 이 화합물은 전체적으로 안정적이고, 23시간까지는 다른 대사물질 또는 분해 산물을 검출되지 않았다. 용액중에서 2일까지는 글리코시드 결합 분해도 검출되지 않았다.

pH 1.2에서 L-dC의 3', 5'-디아세틸 에스테르의 반감기는 11.2시간인 것으로 밝혀졌다. 이러한 조건하에서 화합물은 부분적으로 3'- 또는 5'-유도체으로 가수분해된 후, L-dC로 형질전환되었다. 용액중에서 2일까지는 글리코시드 결합 분해도 검출되지 않았다.

이러한 조건하에서 48시간까지는 다른 화합물이 검출되지 않았기 때문에 pH 1.23에서 L-dC의 3', 5'-디발리닐 에스테르는 전체적으로 안정적인 것으로 밝혀졌다. 용액중에서 2일까지는 글리코시드 결합 분해도 검출되지 않았다(도l2).

다르게는, L-dC의 N⁴ 부위가 디메틸아미노- 메틸렌 또는 아세틸로 차단(mask)된 경우, pH 1.2에서 이 화합물들의 반감기는 각각 26분 또는 50분이었다.

시노모로구스 원숭이에서 L-dC 단일 용량의 생체 이용성

시노모로구스 원숭이에 L-dC를 IV 및 경구 투여한 후의 L-dC의 약동학을 측정하였다. 이 연구에서, 10 mg/kg 트리튬 ([³H]) 방사선동위원소로 식별된 L-dC를 단일 IV 용량으로 시노모로구스 원숭이에 투여하였다. 6주간의 세척 기간후, 동일한 시노모로구스 원숭이에에 동량의 L-dC를 경구투여하였다. 약동학 분석을 위해 혈액 샘플을 투여전 및 투여 후 0.25, 0.5, 1,2, 3, 6, 8 및 24시간째 채취하였다. 약동학 분석을 위해 뇨 샘플을 투여 전 팬 캐취(pan catch)통해 채취하고 투여 후 0-2,2-4, 4-8, 및 8-12시간 간격으로, 이어서 투여 후 336시간동안 12시간 간격으로 채취하였다. 약물이 검출되었고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 기술에 의해 농도를 측정하였다. 혈액 및 뇨내 약물 수준 데이타는 비-모델 수학적 방법에 의해 분석하고 선형 사다리꼴 공식에 의해 AUC's를 유도하였다.

L-dC의 정맥내 투여. IV 투여 후 L-dC의 평균 Cmax는 95.7μM이고 모든 동물에 대하여 최초 샘플링 시간(투여 후 15분째)에 형성되었다. L-dC 혈장 농도는 IV 볼루스 후 시간에 따라 감소하였다. 평균 t_1/2은 1.59시간이었다. IV 투여 후 L-dC의 총 제거율(CL) 및 신제거율(CLR)은 각각 평균적으로 0.53L/h/kg 및 0.46L/h/kg였다. 겉보기 분포 용적(Vd)의 평균은 1.22 L/kg이고, 이는 상당부의 L-dC가 혈관외 조직에 분포하고 있음을 나타낸다.

뇨 배출은 빠르고, 투여된 용량의 71%가 2시간내 회수되었다. L-dC는 뇨에서 회수된 용량의 대다수(94%)를 차지하였다. 신제거율(0.46 L/h/kg)이 총 L-dC 제거율의 87%를 차지하였고, 이는 신 배출이 제거의 주요 경로임을 나타내었다.

L-dU는 혈장 및 뇨에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대사성 제거 또한 IV 투여 후 발생하였음을 나타낸다. 혈장내 검출 한도에서 낮은 수준의 L-dU가 검출되었다(검출 하한(LLOD)= 0.1μM). L-dU의 신장 배출은 뇨에서 회수된 총 용량중 4.0%였다. L-dU 배출을 제외하면, 혈장 또는 뇨에서 다른 대사물질은 검출되지 않았다.

L-dC의 경구 투여. Cmax는 3.38μM이고 이는 2.33시간의 T_max에서 형성되었다. L-dC의 혈장 농도는 최종 t_1/2의 평균은 2.95시간으로 이상성 방식으로 감소하였고, 모든 원숭이에서 24시간까지는 검출 한도 미만이었다. 경구적 생체이용성(F)의 평균은 16.4%로 L-dC는 위장관으부터 흡수되었다.

L-dU는 혈장 및 뇨에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대사성 제거 또한 IV 투여 후 발생하였음을 나타낸다. 혈장내 LLOD에서 낮은 수준의 L-dU가 검출되었다. L-dU 배출을 제외하면, 혈장 또는 뇨에서 다른 대사물질은 검출되지 않았다.

경구 투여된 용량중 대략 8.5%가 12시간내 회수되었다. 72시간 후 15.5%±8%가 회수되었다. L-dC는 뇨에서 배출된 약물의 대다수(~69%)를 차지하였다. L-dU의 신배출율은 총 회수 용량의 29%였다. 대변은 채취하지 않았다.

표 16에 시노모로구스 원숭이에 L-dC를 IV 및 경구 투여하였을 때의 약동학 결과 요약하여 나타낸다 .

표 16 시노모로구스 원숭이에 L-dC(10 mg/kg)를 정맥 및 경구 투여한 후의 약동학적 분석

평균 값(±SD)

레수스 원숭이에서 L-dC 단일 용량의 생체 이용성

레수스 원숭이에 L-dC를 경구 투여한 후의 L-dC의 약동학을 측정하였다. 이 연구에서, 10 mg/kg ([³H]) 방사선동위원소로 식별된 L-dC를 단일 경구 투여량으로 3마리의 레수스 원숭이에 투여하였다. 약동학 분석을 위해 혈액 샘플을 투여전 및 투여 후 0.25, 0.5, 1,2, 3, 6, 8 및 24시간째 채취하였다. 약동학 분석을 위해 뇨 샘플을 투여 전 팬 캐취(pan catch)통해 채취하고 투여 후 0-2,2-4, 4-8, 및 8-12시간 간격으로, 이어서 투여 후 336시간동안 12시간 간격으로 채취하였다. 약물이 검출되었고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 기술에 의해 농도를 측정하였다. 혈액 및 뇨내 약물 수준 데이타는 비-모델 수학적 방법 및 선형 사다리꼴 공식에 의해 유도된 AUC'2에 의해 분석하였다.

평균 AUC_o.25→8 및 Cmax 값은 각각 12.2 mgM. h 및 3.23 mgM이었다. Cmax는 T_max=0.83시간째 형성되었다. t_1/2의 평균은 3.34시간이고 L-dC 혈장 농도는 모든 원숭이에서 24시간까지 검출 수준 미만이었다. L-dC의 신제거율 평균은 0.273 L/h/kg이었다. L-dC를 투여받은 원숭이의 혈장내에서는 어떤 대사물지로 관찰되지 않았다.

경구 투여된 용량중 대략 8.5%(L-dC의 경구적 생체 이용성 ~16%)가 8시간내 뇨에서 회수되었다. 48시간 후 15%가 회수되었다. L-dC는 뇨에서 배출된 약물의 대다수(~77%)를 차지하였다. L-dU의 신배출율은 총 회수 용량의 23%였다. L-dU를 제외하고 다른 대사 물질은 검출되지 않았다.

레수스 원숭이에 경구 투여한 후 L-dC에 대한 AUC 및 Cmax는 시노모로구스 원숭이에서 관찰된 것과 유사하였다.

래트에서 L-dC 단일 용량의 생체 이용성

래트에 L-dC를 경구 투여한 후의 L-dC의 약동학 및 생체이용성을 측정하였다. 이 연구에서, 10 mg/kg ([³H]) 방사선동위원소로 식별된 L-dC를 단일 경구 투여량으로 3마리의 Sprague- Dawley 암컷 래트에 투여하였다. 3마리의 제 2그룹 동물에 동량의 L-dC를 투여하였다. 약동학 분석을 위해 혈액 샘플을 투여전 및 투여 후 0.17, 0.33, 0.5, 1, 2,3, 4,6, 8 및 24시간째 채취하였다. 뇨를 투여 후 8 및 24시간째 채취하였다. 약물이 검출되었고, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 기술에 의해 농도를 측정하였다. 혈액 및 뇨내 약물 수준 데이타는 비-모델 수학적 방법 및 선형 사다리꼴 공식에 의해 유도된 AUCs에 의해 분석하였다.

L-dC의 정맥내 투여. 평균 AUC_o.25→8 값은 30.1 mM. h이었다. L-dC의 Cmax는 91.1mgM이었고 모든 동물에 대하여 초기 샘플링 시간(투여 후 10분)에 형성되었다. L-dC 혈장 농도는 IV 볼루스 후 시간에 따라 감소하였고 평균 t_1/2은 1.21시간이었다. 평균 Vd는 2.53L/kg이고, 이는 상당부의 L-dC가 혈관외 조직에 분포하고 있음을 나타낸다. L-dC를 투여받은 래트의 혈장에서 어느 대사 물질도 관찰되지 않았다.

L-dC는 뇨에서 회수된 방사능의 대다수를 차지하였다. L-dU가 뇨에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대사적 제거는 IV 투여 후 발생한다는 것을 나타낸다.

L-dC의 경구 투여. 평균 AUC_0.25→8 값은 4.77mM.h이었다. 평균 Cmax는 1.50mgM이고 이는 1.0시간의 T_max에서 형성되었다. L-dC의 혈장 농도는 최종 t_1/2의 평균은 2.52시간으로 감소하였다. 경구적 생체이용성(F)의 평균은 15.4%로 L-dC는 위장관으부터 흡수를 제한하였다. L-dC를 경구 투여한 후 래트의 혈장내에서는 어느 대사 물질도 관찰되지 않았다.

L-dC는 뇨에서 회수된 방사능의 대다수를 차지하였다. L-dU가 혈장 및 뇨에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대사적 제거는 경구 투여 후 발생한다는 것을 나타낸다.

표 17에 L-dC의 IV 및 경구 투여하였을 때의 약동학 결과 요약하여 나타낸다 .

표 17 래트에 L-dC(10 mg/kg)를 정맥 및 경구 투여한 후의 약동학적 분석

평균 값(±SD)

우드척에서 L-dC 단일 용량의 생체 이용성

우드척에서 L-dC의 약동학 및 생체이용성을 측정하였다. 이 연구에서, 10 mg/kg ([³H]) 방사선동위원소로 식별된 L-dC를 단일 IV 용량으로 3마리의 우드척에 투여하였다. 약동학 분석을 위해 혈액 샘플을 투여 후 2, 5, 15, 및 30 분째 및 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 및 24 시간째 채취하였다. 7일간의 세척기간 후, 동일한 동물에 단일 경구 투여량으로 10 mg/kg L-dC를 투여하였다. 약동학 분석을 위해 혈액 샘플을 투여 후 15 및 30분째 및 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0, 8.0, 및 24시간째 채취하였다. 뇨를 투여 후 24시간 간격으로 채취하였다. 혈장 약물 수준, CL, t_1/2, 및 F를 측정하였다. 약물 수준은 섬광 계수 및 인-라인 방사능 검출을 포함하는 HPLC 방법을 사용하여 측정하였다.

L-dC의 정맥내 투여. L-dC의 평균Cmax는 112μM이었고 모든 동물에 대하여 초기 샘플링 시간(투여 후 2분)에 형성되었다. L-dC 혈장 농도는 IV 볼루스 후 이상성 방식으로 시간에 따라 감소하였고 평균 t_1/2은 2.85시간이었다. L-dC의 CL의 평균은 0.39L/h/kg였다. 평균 Vd는 1.17L/kg였다. L-dC는 뇨에서 회수된 방사능의 대다수를 차지하였다. L-dU가 혈장 및 뇨에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대사적 제거는 IV 투여 후 발생한다는 것을 나타낸다. 혈장내에서 간헐적으로 검출된 L-dU의 수준은 평균 Cmax = 0.75μM로, 분석적 측량 한도 이하였다.

L-dC의 경구 투여. 평균 Cmax는 1.37μM이고 이는 3시간의 T_max에서 형성되었다. t_1/2의 평균은 5.22시간으로 L-dC의 혈장 농도는 감소하였다. 경구적 생체이용성의 범위는 5.60 내지 16.9%로 평균은 9.57%로 L-dC는 위장관으부터 흡수되었다. L-dC는 뇨에서 회수된 방사능의 대다수를 차지하였다. L-dU가 혈장 및 뇨에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대사적 제거는 경구 투여 후 발생한다는 것을 나타낸다. 혈장내 L-dU는 평균 Cmax = 0.19μM로, 대략 분석적 측량 한도였다.

표 18은 L-dC의 IV 및 경구 투여하였을 때의 약동학 결과 요약하여 나타낸다 .

표 18 우드척에 L-dC(10 mg/kg)를 정맥 및 경구 투여한 후의 약동학적 분석

a. IV 투여 후 t = 0. 033 시간 및 PO 투여 후 0.25 시간

b. 평균치(± SD)

L-dC 프로드억의 생체이용성

시노모로구스 원숭이에서 L-dC, L-dC의 5'-모노에스테르, L-dC의 디발린 에스테르, 및 L-dC의 디아세틸 에스테르 L-dC를 L-dT와 함께 및 L-dT 없이 평가하였다. L-dC의 디발린 에스테르를 원숭이에 경구 투여하고, 투여량중 대략 73%가 흡수되었다. 흡수된 L-dC의 디발린 에스테르중 99% 초과량이 신속하게 L-dC로 전환되어 혈장내에서 고농도의 L-dC를 제공하였고, L-dC의 디발린 에스테르는 검출할 수 없었다. 혈장내 저농도의 L-dC의 모노발린 에스테르는 L-dC의 디발린 에스테르를 경구 투여한 추기에 검출되었다. 혈장내 저농도의 β-L-2'-데옥시우리딘 (L-dU)은 간헐적으로 검출되었다. 다른 대사물질은 검출되지 않았다. 결과를 표 19에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, L-dC의 3', 5'-디발릴 에스테르와 L-dT의 배합물은 L-dC의 가장 큰 생체이용성을 제공하였다.

표 19

¹ L-dC(경구 투여)의 AUC에 상대적으로 예측됨

² 10 mg/kg L-dT와 공투여

³총 방사성 용량에 기초한 특이적 활성 5'-모노-발린 연구

ND, 검출되지 않음

순도 = 87% L-dC-모노-발린, 12% L-dC

시노모로구스 원숭이에서의 Dival-L-dC의 단일 용량의 생체이용성

9.0%의 멸균 염수에 용해된 미량의 트리튬([3H]^-) 표지된 약물(250μCi)과 함께 dival-L-dC의 10 mg/kg를 투약받은 바 있는(non-naive) 3마리의 시노모로구스 원숭이(Macaca fascicularis)에 투여하였다. 6주간의 세척 기간 후, 동일한 3마리의 동물에 동량의 dival-L-dC을 경구 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 전(~18 시간) 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간째 헤파린화 튜브에서 채취하였다. 뇨 샘플을 0-2,2-4, 4-8, 및 8-12시간 간격으로, 이어서 투여 후 336시간동안 12시간 간격으로 채취하였다. 액체 크로마토그래피-질량 분광법(LC-MS) 기술에 의해 혈장 및 뇨에서 약물을 측량하였다. dival-L-dC를 투여한 후, 시간 경과에 따른 L-dC의 혈장 농도를 비-모델 수학적 방법 및 선형 사다리꼴 공식에 의해 유도된 곡선하 면적(AUC)에 의해 분석하였다. dival-L-dC를 IV 및 PO 투여한 후 L-dC의 생체이용성(F)을 L-dC AUCs로부터 산출하였다(F = AUC_po/AUC_iv x iv투여량/po투여량).

정맥내 투여된 dival-L-dC는 정맥내 투여 후 신속하게 L-dC로 전환되었다. 15분(1.39μM) 및 30분(0.36μM, 3마리중 1마리)째 혈장에서 Dival-L-dC가 검출되었다[측량값의 하한(LLOQ)= 0.23μM 또는 100 ng/mL]. Dival-L-dC는 혈장내에서 투여 30분 후 검출되지 않았다. 부분적으로 탈에스테르화된 형태의 dival-L-dC, β-L-2'-데옥시시티딘-5'- 발린 에스테르가 15분째 혈장내에서검출되었고(3.23μM) 2시간까지 0.08μM로 농도는 감소하였다(LLOQ = 0.031μM 또는 10ng/mL). 정맥내 투여한 후 혈장내 존재하는 대다수의 약물은 L-dC로 나타났다. L-dC에 대한 평균 AUC_o.25→8 값은 19.8μM·h이었다. L-dC의 피크 혈장 농도의 평균(Cmax)은 24.6μM (LLOQ = 0.088μM 또는 20ng/mL)이고 모든 동물에 대하여 초기 샘플링 시간(투여 후 15분)에 형성되었다. L-dC 혈장 농도는 IV 볼루스 후 이상성 방식으로 시간에 따라 감소하였고 평균 t_1/2은 1.73시간이었다. L-dC의 전체 인체 제거율(CL) 및 겉보기 분포 용적(Vd)의 평균은 각각 1.01L/h/kg 및 2.46L/kg이고, 이는 상당부의 L-dC가 혈관외 조직에 분포하고 있음을 나타낸다. 생체외에서 인간 혈장 단백질과 dival-L-dC 및 L-dC의 결합율은 13.3%±2.6% 및 19.7%± 5.9%였다. dival-L-dC 및 L-dC 프리-약물 수준에 대한 인간 혈장 단백질 결합에 대한 영향력은 작고 이는 결합 부위 치환을 포함하는 약물 상호작용은 예측할 수 없음을 제안한다.

뇨 배출은 빠르고, 투여된 dival-L-dC 양중 58±3%가 정맥내 투여 후 2시간내 배출되었다. L-dC가 뇨 배출된 약물의 대다수(~93%)를 차지하였다. L-dU는 혈장 및 뇨에서 검출되었다. 이는 L-dC의 대사적 제거는 dival-L-dC의 투여 후 발생한다는 것을 제시한다. 0. 22 μM 내지 0.88μM (LLOQ = 0.22μM 또는 50 ng/mL) 범위의 농도로 낮은 수준의 L-dU가 3마리중 2마리의 혈장에서 간헐적으로 검출되었다. 세번째 원숭이에서는 어느 시점에서도 L-dU 수준이 검출되지 않았다. L-dU 및 dival-L-dC의 부분적으로 탈에스테르화된 형태인 β-L-2'-데옥시시티딘-5'-발린 에스테르의 신 배출은 극도로 적고, 이는 각각 총 회수량중 대략 2.5% 및 3.7%를 차지하였다. IV 투여 후 2시간째 3마리중 1마리의 뇨에서 Dival-L-dC가 검출되었고, 이는 회수량의 대략 0.15%를 차지하였다.

혈장 및 뇨중 간헐적인 저농도의 모노발린 에스테르 및 L-dU 때문에 대사물질의 약동학적 분석을 수행하기는 쉽지 않다. dival-L-dC이 L-dC로 전환될 때 나타내고 매개하는바, dival-L-dC의 모노발린 에스테르의 출현이 예상되었다. 또한, 원숭이, 래트 및 인간 1차 간세포 및 HepG2 세포의 추출물의 시험관내 세포 대사 연구에서 L-dC는 L-dU로 직접 탈아민화되지 않고, L-dC 모노포스페이트 (-MP)는 L-dU-MP로 전환되고 이는 L-dU 디스포스페이트 (-DP), 트리포스페이트 (-TP)로 활성화되거나 L-dU로 대사된 후 세포외 구획(혈장)에서 검출되었다. L-dU는 비독성(CC₅₀ > 200μM)이고 B형 간염 바이러스 데옥시리보핵산(DNA)에 대한 시험관내의 L-dU-TP의 IC₅₀은 5.26μM (참조: Microbiology and Virology, Section 10)이었다.

경구 투여된 dival-L-dC 또한 경구 투여 후 신속하게 L-dC로 전환되었고, 어느 시점에서도 혈장 샘플에서 검출할 수 없었다(용액중 dival-L-dC의 LLOQ = 0.23㎛ 또는 100ng/mL). dival-L-dC의 부분적으로 탈에스테르화된 대사물질, β-L-2'-데옥시시티딘-5'-발린 에스테르는 0. 034B μM 내지 0. 107B μM (용액중 모노에스테르의 LLOQ = 0. 031μM 또는 10 ng/mL) 범위 농도로 30분 및 1시간째 혈장에서 검출되었다.

dival-L-dC의 경구 투여 후 L-dC가 혈장 약물 수준의 대다수(Cmax에서 > 99% )를 차지하였다. L-dC의 평균 AUC_0.25→8 값은 14.0 μM h였다. L-dC의 Cmax는 8.26μM (용액중 L-dC의 LLOQ = 0.088μM 또는 20 ng/mL)이고 dival-L-dC 투여 후 0.67시간째 형성되었다. L-dC의 혈장 농도는 최종 t_1/2의 평균은 2.28시간으로 이상성 방식으로 감소하였다. L-dU 또한 혈장에서 검출되었고, 이는 L-dC의 대상 제거는 dival-L-dC 경구 투여 후 형성된다는 것을 나타낸다. 낮은 수준의 L-dU가 3마리중 2마리에서 0. 24 μM 내지 0. 66μM ( L-dU의 LLOQ = 0. 22μM 또는 50 ng/mL) 범위 농도로 30분 및 4시간째 혈장에서 검출되고, 단 한마리의 동물에서는 0.39μM 농도로 8시간째 혈장에서 검출되었다.

삭제

경구 투여 후, dival-L-dC는 위장관으로부터 빠르게 흡수되었고, 일차 통과 창자 및/또는 간 대사에 의해 L-dC로 전환되었다. dival-L-dC 또는 L-dC 어느 것도 간의 미세소체효소와 관련되지 않았다. dival-L-dC의 수준을 고용량으로 하여 투여한 후 모노발린 에스테르 L-dC는 L-dC로 전환되기 앞서 일시적으로 검출되었다. 경구 투여 후 dival-L-dC는 검출되지 않았다. 간헐적인 혈장내 저수준의 L- dU는 분석 측량의 하한 이하에서 검출되었다. L-dC 세포 흡수 수 L-dU는 L-dC의 탈 아민화에 의해 형성되었다.

경구 투여된 투여량중 대략 31± 8%가 4시간내 뇨에서 회수되었다. 72시간 후 39±8%가 회수되었다. 뇨에서 배출된 약물중 대다수(~95%)를 L-dC가 차지하였다. L-dU의 뇨 배출 및 dival-L-dC의 부분적으로 탈에스테르화된 형태, β-L-2'-데옥시시티딘-5'-발린 에스테르는 극도로 적었고, 이는 각각 총 회수량중 대략 2.5% 및 0.2%를 차지하였다. 뇨에서 dival-L-dC는 검출되지 않았다.

표 20에 dival-L-dC를 IV 및 경구 투여한 후 L-dC에 대한 약동학적 결과를 요약하여 나타낸다.

표 20 시노모로구스 원숭이에서 Dival-L-dC(10 mg/kg)를 정맥내 및 경구 투여한 후 약동학적 분석

약동학적 파라미터 ²

(3) 평균치[표준편차(SD)].

표 21은 dival-L-dC를 IV 및 경구 투여한 후 dival-L-dC, L-dC의 모노발린 유도체, L-dC, 및 L-dU의 대사물질 형성 형태의 도식을 나타낸다. 각 대사물질의 Cmax도 기록하였다.

표 21 Dival-L-dC를 IV 및 PO 투여한 후의 대사물질 형성

정낵내(10 mg/kg Dival-L-dC)
	dival-L-dC→	모노-val-L-dC→	L-dC→→	L-dU
Cmax	1.39μM	3.23μM	24.6μM	0.88μM
경구(10 mg/kg Dival-L-dC)
	dival-L-dC→	모노-val-L-dC→	L-dC→→	L-dU
Cmax	검출되지 않음	0.11μM	8.26μM	0.66μM

시노모로구스 원숭이에서의 Dival-L-dC에 의한 L-dC의 경구 생체이용성

9.0%의 멸균 염수에 용해된 미량의 ([3H]) 표지된 약물(250μCi)과 함께 10 mg/kg of dival-L-dC를 투약받은 바 있는(non-naive) 3마리의 시노모로구스 원숭이(Macaca fascicularis)에 경구 투여하였다. 혈액 샘플을 투여 전(~18 시간) 및 투여 후 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24시간째 헤파린화 튜브에서 채취하였다. 뇨 샘플을 0-2,2-4, 4-8, 및 8-12시간 간격으로, 이어서 투여 후 336시간동안 12시간 간격으로 채취하였다. HPLC에 의해 혈장 및 뇨에서 약물을 측량하였다. dival-L-dC를 투여한 후, 시간 경과에 따른 L-dC의 혈장 농도를 비-모델 수학적 방법 및 선형 사다리꼴 공식에 의해 유도된 곡선하 면적(AUC)에 의해 분석하였다. Dival-L-dC은 경구 투여 후 빠르게 흡수되고 L-dC로 전환되었다. 혈장 샘플의 방사크로마토그래피 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 통해 회수된 방사능중 대다수가 L-dC임을 확인하게 되었다. 투여 후 15분째 단 한마리에서만 Dival-L-dC가 0.35μM로 검출되었다. dival-L-dC의 부분적으로 탈에스테르화된 형태인 β-L-2'-데옥시시티딘-5'-발린 에스테르는 혈장 또는 뇨 어느 것에서도 검출되지 않았다 . 경구 투여된 용량중 대략 26%가 8시간내 뇨에서 회수되었다. 72시간 후 31%가 회수되었다. L-dC는 뇨에서 배출된 약물의 대다수(~89%)를 차지하였다. L-dU의 뇨 배출은 극도로 적고, 이는 대략 회수량의 10%을 차지한다. dival-L-dC 또는 그의 부분적으로 탈에스테르화된 형태, 및 어느 대사물질도 뇨에서 검출되지 않았다.

유사한 Cmax 대 AUC 비에 의해 입증된 바와 같이 전체 약동학 프로파일은 약동학 연구에서 측정된 바 것과 유사하였다. 낮은 수준의 L-dU가 3마리중 2마리의 동물 혈장내에서 검출되었고, 이의 평균 Cmax는 0.33μM였다. 세번째 동물의 혈장에서는 L-dU가 검출되지 않았다. L-dU의 수준은 측량 한도 이하였고, 이는 약동학 분석을 방해하는 것이다.

Dival-L-dC의 시험관내 대사

인간 혈장내에서 dival-L- dC 및 그의 탈에스테르화된 대사물질의 단백질 결합 및 안정성을 측정하기 위한 연구를 수행하였다. Dival-L-dC 를 인간 혈장중 37℃에서 인큐베이션시키고 24시간까지 다양한 시점에 샘플을 분석하였다(도 3). 24시간째에는 L- dC로 완전히 전환되어 어느 dival-L-dC도 존재하지 않았다. 추가로 2개의 대사물질(β-L-2'-데옥시시티딘-5'-발린 에스테르 및β-L-2'- 데옥시시티딘-발린 에스테르) 또한 관찰되었다. 이들 대사물질의 일시적 성질은 dival-L-dC이 L-dC로 전환될 때의 중간체라는 것을 나타내었다. 인간 혈장중 37℃에서 Dival-L-dC의 시험관내 반감기는 대략 39분으로 측정되었다.

유리 수준의 dival-L-dC 및 L- dC에 대한 인간 혈장 단백질 결합의 작용은 한외여과법을 사용하여 조사하였다. dival-L-dC의 인간 혈장 단백질 결합율은 13.3% ±2.6%이었다. 혈장 단백질에 대한 L-dC의 결합율은 19.7% ±5.9%이었다. 이러한 연구를 통해 dival-L-dC 및 L- dC에 대한 인간 혈장 단백질 결합의 작용은 극도로 작고 이는 결합 부위 치환을 포함하는 약물간의 상호작용은 예상할 수 없다고 제안되었다.

L-dC의 대사 활성화 및 세포내 프로파일

L-dC의 세포 대사를 HepG2 세포 및 인간 1차 간세포를 사용하여 조사하였다. 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석을 통해 L-dC는 간세포에서 대량으로 인산화된다고 입증되었다. 24시간동안 10μM L-dC에 노출된 HepG2 세포중의 주요 대사물질은 L-dC-TP로서, 72.4 ±1.8μM(참조 표 23)에 달하였다. 1차 인간 간세포에서, 24시간째 L- dC-TP의 농도는 90.1±37μM였고, 이는 HepG2 세포에서의 인산화 수준과 유사하였다. L-dC에 대한 간세포의 노출을 통해 두번째 S'-트리포스페이트 유도체, L-dU-TP가 활성화되었다. 10μM L-dC에 노출된 HepG2 세포에서 L-dU-TP 수준은 24시간째 18.2μM에 달하였다(1차 인간 간세포에서 43.5PM). 1차 래트 및 원숭이 간세포에서 L-dC의 인산화 함량은 극도로 낮았다.

표 23 간세포에서의 L-dC(10μM)의 활성화

(a) 세포를 24시간동안 [³H]-L-dC와 함께 인큐베이션시키고, 특이 활성: HepG2 에세이 = 0.5Ci/mmol; 인간, 원숭이 및 래트 간세포 에세이 = 1.0Ci/mmol

L-dC 및 L-dU의 인산화된 유도체외에, β-L-2'-데옥시리포뉴클레오티드 대사물질의 형성이 관찰되었다. 24시간동안 10μM에 노출된 HepG2 세포 및 1차 간세포 배양액에서, 3-L-2'-데옥시시티딘-5'-디포스포콜린(L-dC-DP-콜린)이 각각 25.6μM(범위 25.6-25.7μM) 및 12.3μM(범위 8.82-15.8μM)의 농도로 검출되었다.

HepG2 세포를 24시간동안 [³H]-L-dC에 노출시킨 후 수득된 대사물질의 프로파일을 도 14에 나타낸다. L-dC-TP의 세포내에서의 겉보기 반감기는 15.5±0.34시간이고, 이는 바이러스 재결합 시험에서 약물 중단 후 항바이러스 활성이 연장된 것과 관련된다. 1차 인간 간세포에서 검출된 인산화 패턴은 질적 및 양적으로 HepG2 세포에서 수득된 것와 유사하였다(도 15).

대사물질 활성화와 관련된 세포 키나제

D-데옥시시티딘(dCyd)는 dCyd-5'-모노포스페이트(dCMP)로 전환되는 세포질 dCyd 키자네(dCK) 및 미토콘드리아 티미딘 키나제(TK2)의 자연발생된 기질이다. 세포질 티미딘 키나제(TK1) 및 TK2는 Thd-5'-모노포스페이트(TMP)로 전환시키기 위한 자연발생된 기질로서 D-티미딘(Thd)를 사용한다. L-dC의 초기 인산화에 관여하는 세포 키나제는 L-dC 및 자연발생된 내인성 Thd 및 dCyd를 사용하여 경쟁 연구에서 확인되었다. L-dC의 세포내 인산화는 Thd가 아닌 dCyd에 의해 용량에 의존하는 방식으로 감소하였다. 따라서, dCyd는 L-dC 인산화의 저해제로서 작용하였다. L-dC의 세포내 인산화에서 변화는 HcpG2 세포를 Thd 및 dCyd 또는 dCyd중 하나에 노출시켰을 때와 유사하였다. 단 자연발생된 데옥시피리미딘, dCyd에 의한 L-dC 인산화의 저해는 dCK가 L-dC 인산화에 관여한다는 것을 제시하였다.

L-dC 인산화에서 이들 피리미딘 뉴클레오시드 키나제 활성의 역할을 키나제가 결핍된 세포주에서 추가로 조사하였다. dCK가 결핍된 세포주에서 L-dC의 인산화된 대사물질의 양은 현저히 감소하였다. 그러나, TK1이 결핍된 세포주에서 L-dC의 인산화에서 관찰된 것과는 별다른 차이는 없었다. 이들 데이타는 상기 기술된 경쟁 연구와 일치하였고, 이는 dCK가 L-dC의 L-dC-MP로의 인산화에서 중요한 작용을 한다는 것을 나타내었다.

효소원으로서 HepG2 세포의 세포질 추출물을 사용한 L-dC, Thd, 및 dCyd 인산화에 대한 항정상태의 동역학은 겉보기 Michaelis-Menten 상수(Km) 및 최대 개시 속도(Vmax) 값(L-dC: Km = 5.75 mM 및 Vmax= 1.12 mmol/min/mg 단백질; Thd: Km = 4.06 mM 및 Vmax = 1.26nmol/min/mg 단백질 ;dCyd : Km = 4.85 mM 및 Vmax = 2.15nmol/min/mg 단백질)에 의해 언급된 것과 유사하였다. 또한, L-dC, Thd, 및dCyd 인산화 효율은 그의 상응하는 Vmax/Km 값(각각 0.19, 0.31, 및 0.44)에 의해 정의된 것과 유사하였다.

또한, 세포내 L-dC의 인산화 정도를 우드척 간세포 추출물내 자연발생된 내인성 기질인 Thd 및 dCyd의 것과 비교하였다. 만성 B형 간염 바이러스 감염의 우드척 모델에서 항바이러스 시험을 지지하기 위하여 수행하였다. L-dC의 인산화는 내인성 기질의 것과 유사하였다. 추가로, L-dC의 인산화 수준은 인간 간세포 추출물내 내인성 기질의 것 및 L-dC의 것과 유사하였다(comparable).

X. 약물-내성 HBV에 대한 활성 화합물의 활성

β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 및 특히 β-L-2'-데옥시시티딘 및 β-L-2'-데옥시티미딘은 약물-내성 HBV (M552V)에 효능이 있고 선별적인 저해제이다. YMDD 돌연변이를 포함하는 HBV 재조합체(HBV 폴리머라제의 아스파테이트 뉴클레오티드-결합 로커스, 티로신, 메티오닌, 아스파테이트에서 아미노산 치환으로 정의됨)를 사용하여 라미부딘-내성 HBV를 발현시키는 세포주를 제조할 수 있지만, 이들 게놈은 주로 시험관내 야생형 HBV보다 복제능은 다소 떨어진다(Fu and Cheng, 1998). 이들 재조합 시스템을 통해 내성과 관련된 문제를 처리하는 최상의 접근법을 제공받았다. 2001년 Ono 등에 의해 기술된 접근법에 따라 상기와 같은 평가를 위한 바람직한 세포계인 Huh-7 간 세포를 사용하는 일과성 형질감염 분석을 사용하므로써 라미 부딘-내성 HBV 균주 (YMDD 뮤턴트)에 대한 LdT (IND 60,459)의 활성을 측정하였다. 그러나, Huh-7 세포에서 LdT는 야생형 HBV에 대해서도 불충분한 활성을 나타내었다. Huh-7 세포는 라미부딘을 꽤 잘 인산화시키는 반면, 활성 트리포스페이트로의 LdT의 인산화는 극도로 적었다. 이러한 결과는 Agency for the LdT End of Phase 2 Meeting (IND 60,459 ; Serial 024)에 제출된 자료에 요약되어 있다. 따라서, Ono 등의 시스템은 이들 약물 분석에 적합치 못하다.

대체 접근법으로서, 돌연변이화된 HBV 게놈을 일과성 형질감염을 통해 HepG2 세포에 도입하였다. 이들 실험도 유사하게, 주로 불충분하고 다양한 이들 세포의 형질감염능에 기인하여 성공적이지 못하였고, 이는 항바이러스 효능에 대한 일정한 값을 얻지 못하도록 하였다.

LdT 및 LdC에 대한 내성 문제를 처리하는 좀더 적절한 방법은 각각 552번 및 515번 또는 528번 위치에 라미부딘-내성 돌연변이 및 야생형 게놈을 포함하는 재조합 HBV 바이러스를 발현시키는 안정적인 HepG2 세포주를 사용하는 것이다. 선행 방법과 비교하여 이들 안정적인 세포주는 우수한 신호대잡음비와 연합된 일정한 폴리머라제 발현 수준을 제공한다.

약물 LdT (텔비부딘) 및 LdC의 시험관내 활성을 B형 간염 바이러스 (HBV)의 라미부딘-내성 뮤턴트에 대하여 측정하였다. 임상 세팅에서 내성을 라미부딘 요법에 제공하는 것으로서 결정된 생물학적으로 관련된 HBV (서브타입 ayw) 뮤턴트는 폴리머라제 유전자에서 발생하고 중요한 YMDD 활성 부위 모티프에서 발견되는 두개의 싱글 돌연변이, M552V 및 M552I, 및 두개의 더블 뮤턴트 L515M/M552V 및 L515M/M552I를 포함한다. [본 명세서에서 참고로 하는 L515M 뮤턴트는 HBV 내성 연우에서 주로 인용되는 B 영역내 L526M 또는 L528M 돌연변이와 동등하고; 번호상의 차이는 상이한 HBV 유전자형내 서열 삽입/결실을 반영한다].

재료 및 방법

이들 라미부딘-내성 뮤턴트에 상응하는 재조합 DNA 작제물은 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)에 의해 제조되었다. 시험 시스템은 각각의 형질감염된 뮤턴트 게놈, 및 야생형 대조군 HBV 게놈을 포함하는 안정적인 세포주 를 포함하였다. 각 시험 세포주에서 뮤턴트 및 야생형 HBV 게놈에 대하여 대조군 약물 라미부딘 및 PMEA과 함께 LdT (텔비부딘) 및 LdC의 항바이러스 활성을 측정하였다.

LdC는 L515M/M552V 뮤턴트에 대하여 EC₅₀에 도달하지 못하였지만 LdT (텔비부딘) 및 LdC는 M552I 싱글 뮤턴트 또는 L515M/M552V 및 L515M/M552I 더블 뮤턴트에 대하여 최소의 활성을 나타내었다. 그러나, 라미부딘과 달리 두개의 약물은 M552V 싱글 뮤턴트 HBV 게놈에 대해서는 거의 완전환 항바이러스 활성을 유지하였다. M552V 돌연변이는 라미부딘에 대하여 현저하게 내성을 나타내고, 이는 라미부딘 내성에 대한 해결 방법을 개발하기 위한 주요 방법에서 중요한 매개 수단인 것으로 판단되었다. 라미부딘-치료 환자에서, 고도로 내성인 L515M/M552V 더블 뮤턴트의 출현에 앞서 M552V 뮤턴트는 통상 4 내지 8주 전에 출현하고(Gauthier et al, 1999), 이는 B형 간염 환자에서 모든 라미부딘 내성중 60-70%를 차지하는 것으로 보고되었다(Ahmed et al, 2000).

이들 결과를 통해 LdT (텔비부딘) 및 LdC의 M552V 뮤턴트에 대한 활성이 상당수의 YMDD-매개되는 환자의 항바이러스 내성 출현을 저해하는데 도움을 줄수 있다고 제안되었다. 현재 IIB 단계의 임상 시험에서 LdT로 치료받는 환자 (라미부딘 수혜자와 비교)에 관찰되는 양적으로 우수한 HBV 보제 저해와 함께 이러한 결과는 YMDD-매개되는 LdT에 대한 HBV 내성은 라미부딘 치료로 관찰되는 것보다 실질적으로 다소 덜 자수 발생한다고 제안하였다.

HBV-감염 환자에 투여된 라미부딘 (100 mg qd)의 대조군 임상 연구에서 1년간 치료한 후 YMDD-뮤턴트 HBV의 발병율은 14 내지 32%였고, 2 내지 3년간 치료한 후 58%였다. 뮤턴트 바이러스는 YMDD 돌연변이를 포함하지 않는 라미부딘-치료 환자와 관련하여 치료 반응이 감소하였다는 증거와 관련되었다.

라미부딘을 투여받는 동안 HBV 복제가 재생된 환자로부터 수득한 바이러스 분리물의 유전자형에 대하여 분석한 결과 라미부딘에 대한 HBV 감수성이 감소된 것은 HBV 폴리머라제의 촉매 영역중 TMDD 모티프(552번 위치)에서 메티오닌의 발린 또는 이소류신으로의 치환 및 515번 또는 528번(HBV의 유전자형/서브타입에 따라)의 류신의 메티오닌으로의 치환을 유발하는 돌연변이와 관련된다고 제안되었다.

현재, 환자로부터 유래된 라미부딘-내성 HBV 분리물로 감염된 세포에 대한 항바이러스제의 활성을 평가할 수 있는 세포-기초 HBV 감염 시스템은 없다. 시험관내 모델로 DHBV는 이 모델에서 사용되는 1차 오리 간세포는 세포 배양액내에서 수 주 이상동안 유지될 수 없기 때문에 약물-내성 돌연변이를 선별하는데 있어 유용한 것으로 입증되지 못했다. 생체내 우드척에서 약물-내성 뮤턴트 선별과의 관련성은 우드척에서 라미부딘-내성 뮤턴트의 범위는 HBV-감염 환자에서 확인된 것과 일치하지 않기 때문에 모호하다.

이들 게놈은 주로 시험관내 야생형 HBV보다 복제능이 떨어지지만 YMDD 돌연변이를 포함하는 HBV 재조합체를 사용하여 라미부딘-내성 HBV를 발현시키는 세포주를 제조할 수 있다(Fu and Cheng, 1998). 이들 재조합 시스템을 통해 내성과 관련된 문제를 처리하는 최상의 접근법을 제공받았다. 2001년 Ono 등에 의해 기술된 접근법에 따라 상기와 같은 평가를 위한 바람직한 세포계인 Huh-7 간 세포를 사용하는 일과성 형질감염 분석을 사용하므로써 라미부딘-내성 HBV 균주 (YMDD 뮤턴트)에 대한 LdT (IND 60,459)의 활성을 측정하였다. 그러나, Huh-7 세포에서 LdT는 야생형 HBV에 대해서도 불충분한 활성을 나타내었다. Huh-7 세포는 라미부딘을 꽤 잘 인산화시키는 반면, 활성 트리포스페이트로의 LdT의 인산화는 극도로 적었다. 이러한 결과는 Agency for the LdT End of Phase 2 Meeting (IND 60,459 ; Serial 024)에 제출된 자료에 요약되어 있다. 따라서, Ono 등의 시스템은 이들 약물 분석에 적합치 못하다.

실시예 17

라미부딘-내성 안정적인 세포주를 제조하기 위한 HepG2 세포의 형질감염

라미부딘-내성 및 야생형 HBV 게놈의 성질을 갖는 안정적으로 형질전화된 세포를 수득하고, 대조군으로서 라미부딘 및 아데포비르과 함께 뮤턴트에 대하여 LdT 및 LdC의 활성을 시험하였다.

HepG2 성장 배지

EMEM (Mediatech, Cat#num;MT 10-010-CV)

10% FBS (Mediatech, Cat#num;MT35-011-CV)

1x L-글루타민(2mM 최종)

1x 페니실린-스트렙토마이신 (100I.U./100μg/ml, 최종)

1 x Na-피루베이트(1mM 최종)

1x 비필수 아미노산 (NEAA,0.1mM 최종)

HepG2 형질감염 배지

EMEM (Mediatech, Cat#num;MT10-010-CV)

10% FBS (Mediatech, Cat#num;MT35-011-CV)

1x L-글루타민 (2mM 최종)

1xNa-피루베이트(lmM 최종)

1x NEAA (0.1mM 최종)

HepG2-안정적인 세포주 성장/선별 배지

EMEM (Mediatech, Cat#num;MT 10-010-CV)

10% FBS (Mediatech, Cat#num;MT35-011-CV)

1x L-글루타민 (2mM 최종)

1x 페니실린-스트렙토마이신 (100I.U./μg/ml 최종)

1x NaPyruvate (1mM 최종)

1x NEAA (O.1mM 최종)

500μg/ml Geneticin (G-418, Life Technologies Cat#; 10131)

작제물

pCMV-WT (ayw)

pCMV-M552V

pCMV-M552I

pCMV-L515M/M552V

pCMV-L515M/M552I

pCMV-neo

모든 작제물은 CMV 프로모터뒤에 클로닝된 HBV 게놈을 포함하였다. 점-돌연변이 폴리머라제 유전자를 포함하는 HBV 플라스미드는 모체로서 pCMV-hbv 및 상업용 키트(Stratagene's Quik변형 kit, Cat. #; 200518-5)를 사용하여 (Allen et al. , 1998)에 기술된 바와 같이 부위특이적 돌연변이법(site-directed mutagenesis)에 의해 유도되었다. pCMVhbv (Dr. C. Seeger, Fox Chase Cancer Institute에 의해 제공)는 전장의 HBV 게놈 서브타입 ayw을 포함하였다. 싱글 L515M 돌연변이를 포함하는 작제물은 보상 돌연변이(Gauthier et al, 1999)로 작용하기 보다는 라미부딘에 대하여 최소한의 내성을 제공하는 것으로 판단되었기 때문에 제조하지 않았다

플라스미드 pCMV-neo를 사용하요 G-418 항생제(네오마이신)에 대한 내성을 제공하였다. 이 플라스미드는 EGFP 발현 카세트를 제외한 SV40-유래 Kan^r/Neo^r 발현 카세트를 포함하는 pEGFP-N1 (Clontech Cat#; 6085-1)의 백본을 포함하였다.

형질감염용 세포의 제조: 세포를 콜라겐-코팅된 6-웰 플레이트(Biocoat, Becton Dickinson, Cat-#; 35-4400)에 2x10⁵세포/웰로 3 mL의 HepG2 성장 배지에서 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 인큐베이션시켰다.

Fugene: DNA 컴플렉스의 제조: 각 작제물을 사용하여 콜라겐-코팅된 6-웰 플레이트중 2웰을 형질감염시켰다. 대조군은 pCMV-neo DNA을 포함하지 않고 pCMVhbv 야생형 작제물을 포함하는 1웰 및 neo ^R- 플라스미드만을 포함하느 1웰을 포함하였다. 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 세포를 3:1의 Fugene-대-DNA 비(3ul Fugene + 1ug의 슈퍼코일 플라스미드 DNA/웰)로 Fugene (Rochecat#;1815091)을 사용하여 형질감염시켰다. 간략하게, 6㎕의 Fugene을 미세원심분리기 튜브내의 200ul의 무혈청 EMEM 배지에서 희석하였다. 2μg의 각각의 HBV 플라스미드 DNA를 0.2μg의 pCMV neo DNA와 함께 가하였다. 용액을 서서히 가한 후 실온에서 15분간 인큐베이션시켰다.

세포의 형질감염; 6웰 플레이트를 흡입기로 빨아들이고, 2ml HepG2 형질감염 배지를 제공하였다. 플레이트를 와동시키면서 Fugene: DNA 컴플렉스 용액을 서서히가하여 용액이 균일하게 분산되도록 하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. HepG2-안정적인 세포주 성장/선별 배지를 다음날 가하였다.

실시예 18

안정적인 세포주 콜로니 및 서브클론의 선별

뚜렷한 G418-내성 콜로니가 형성될 때까지 2 1/2주동안 1주에 두번씩 형질감염된 세포를 제공하였다. "클론(clonal)"(다른 콜로니와 접촉하고 있지 않은 것)으로 보여지는 콜로니를 피펫 팁을 사용하여 6-웰 플레이트에서 채취하고 150㎕의 HepG2-안정적인 세포주 성장/선별 배지중 BD 96-웰 콜라겐 플레이트에 놓았다. 구성당 16개의 콜로니가 채취되었다.

매 3-4일마다 배지를 교환하였다. 100㎕의 배양 상등액을 ELISA를 통해 HBeAg의 존재에 대하여 시험하여 HBV를 발현시키는 콜로니를 확인하였다(하기 참조). 콜라겐 96-웰 플레이트에서 희석율을 제한하므로써 양성 콜로니를 서브클로닝하고, 2주 후 배양물을 ELISA에 의해 선별하였다(매 3-4일마다 배지를 교환하였다). 양성 웰을 확장시키고, 냉동 보존액을 제조하고, 희석율을 제한하므로써 세포주를 다시 서브클로닝시키고, 2주 후 배양 상등액을 ELISA에 의해 선별하였다.

실시예 19

안정적인 형질감염된 세포주 시험

두개의 시험을 통해 바이러스 게놈의 발현에 대하여 안정적인 세포주 클론을 선별하였다. 첫번째 분석은 바이러스 복제와 관련된 바이러스 단백질 마커인 B형 간염 바이러스 e 항원(HBeAg)의 생산을 측정하는 반-측량적 ELISA 분석이었다. 이어서 고수준의 HBeAg를 생산하는 세포주를 내인성 폴리머라제 분석을 사용하여 복제 바이러스 게놈 생산에 대하여 시험하였다.

안정적인 세포주 배양 상등액의 HBeAg-ELISA: 포획 항체는 1Oug/ml으로 사용된 마우스 항--HBeAg mAb였다. 100ul의 배양 상등액을 96-웰세포 배양 플레이트로부터 직접 사용하였다. 검출 항체는 폴리클로날 (래빗) 항-HBc/eAg-항체 (DAKO, Cat#; B0586)으로 10% FCS/TNE에서 1: 3,000 로 희석되었다. 퍼옥시다제-컨쥬게이트 고트 항-래빗-IgG (1: 10,000 ; Zymed Cat#; 81-6120) )을 사용하여 전개시키고 기질은 시트레이트/인산 완충액중 o-페닐렌디아민 (Zymed Cat#; 00-2003)이었다. Fusion 플레이트 판독기(Packard Instuments)로 490nm에서 광학 밀도(O.D.)을 판독하기 앞서 2N Na₂SO₄를 사용하여 더이상 전개되지 못하도록 하였다.

세포 분해물의 내인성 폴리머라제 분석(EPA): 3-4일동안 100% 융합될 때까지 세포를 12-웰 콜라겐 플레이트에서 배양하고, 세포질 분해물은 1ml의 50mM 트리스-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 5mM MgCl₂, 0.2% NP-40에서 제조하였다. (Seifer et al. , 1998)에 기술된 바와 같이 EPAs를 수행하였다. 간단하게, 세포내 HBV 뉴클레오캡시드를 4℃으로 밤새도록 폴리클로날 래빗 항-HBc/eAg 항체 (DaKo Cat#; B0586)를 사용하여 세포질 분해물로부터 면역침전화시키고,단백질 A 세파로스 CL-4B 비드(AmershamPhannacia Cat#num;17-0780-01)에서 이동시켰다. 이동된 캡시드를 세척하고 내인성 폴리머라제 반응을 5OmM 트리스-HCl pH7.4, 75mM NH₄Cl, 1mM EDTA, 20mM MgCl₂, O.1mM B-ME, 0.5% NP-40, 100μM 냉 dGTP, TTP, dCTP, 및 50nM ³³P-dATP(Perkin E1mer Life Sciences Cat#; NEG 612H)를 포함하는 50㎕의 반응량에서 개시하고, 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 37℃에서 1mg/ml의 Proteinase K (Roche, Cat#num;1373196)로 분해한 후, ³³P-표지된 HBV DNA를 페놀/클로로포름 추출법을 통해 유리화시켰다. 최종적으로 동량의 5M NH₄-아세테이트 및 2.5 용량 100% EtOH으로 핵산을 침전시키고, 트리스-보레이트 완충액중 1% 원(native) 아가로스 겔상에서 분리하였다. 겔을 7% TCA상에 고정시킨 후 건조시키거나 양전하 나일론 막(Pall Biodyne Plus Cat#; 60406)상에서 밤새도록 실온에서 0.4 N NaOH중 모세관 이동에 의해 블랏팅하였다. 건조된 겔/막을 포스포이미지 스크린(Molecular Dynamics)에 밤새도록 실온에서노출시킨 후 스캐닝하고(Storm 860, Molecular Dynamics) ImageQuant (Molecular Dynamics) 소프트웨어로 측량하였다.

높은 수준의 HBeAg 발현 및 복제 게놈 생산 수준이 높은 것으로서 선별된 클로날 세포주를 하기에 나타내었다:

세포주	바이러스
WT3/C1	야생형 (ayw)
V1/C9	M552V
I2	M552I
MV5/B3	L515M/M552V
MI4	L515M/M552I

실시예 20

항바이러스 시험

LdT (텔비부딘, Idenix), LdC-HCl (Idenix), 라미부딘 (Moravec) 및 PMEA (Moravec)

PMEA는 프로드럭 아데포비르의 활성 성분이다.

12-웰 Biocoat 콜라겐 I 플레이트(BectonDickinson Cat#num;35-4500)에 5% FBS, 2 mM L-글루타민, 100 I.U. 페니실린/100μg/mL 스트렙토마이신, 및 0. 5mg/mL G-418을 포함하는 2ml DMEM중 0.5-1x10⁶ 세포/웰의 밀도로 세포를 시딩하였다.

200x 보존액으로서 100% DMSO에서 새로 약물 희석액을 제조하였다. 각 실험을 위해 4 분취량의 각 약물 희석액 시리즈를 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 일단 세포가 융합되면 10㎕의 약물 희석액을 2ml의 새 DMEM + 5% FBS에 가하여 약물 처리를 개시하였다. 따라서, 최종 DMSO 농도는 0.5%를 초과하지 않았다. 비-약물 대조군 웰에는 10㎕ DMSO만을 투여하였다. 총 8일동안 매 2일마다 세포를 2 mL의 새 약물/매질로 처리하였다. 세포 분해물을 하기 기술한 바와 같이 10일째 채취하였다.:

배지를 흡입기로 빨아내고 세포 단층을 1 mL의 PBS로 1회 세정한다.

1 ml의 분해 완충액(50 mM 트리스-HCl pH 7.5/150 mM NaCl/5 mMMgCl₂/0.2% NP-40)을 가하고, 30분 내지 4시간동안 얼음상에서 저장한다.

분해된 세포를 수거한다. 1.5 ml의 마이크로퓨즈 튜브로 이동시킨다.

RT 및 14,000 rpm에서 5분간 회전시켜 분해물을 정화시킨다.

정화된 분해물을 새 튜브에 이동시키고, 건성 얼음상에서 급냉시키고 상기 기술된 바와 같이 실질적으로 내인성 폴리머라제 분석을 위해 준비할 때까지 -80℃에서 저장한다.

EC₅₀은 Xlfit 소프트웨어를 사용하여 곡선 피팅에 의해 포스포이미지 데이타로부터 형성되었다.

표 24는 안정하게 형질감염된 HepG2 세포에서 발현된 야생형 HBV 게놈 및 상이한 뮤턴트에 대하여 LdT 및 LdC, 및 라미부딘 및 PMEA 대조군의 활성을 시험하였을 때 수득한 결과를 요약한다. 항바이러스 활성을 표 24a에 나타낸다. 야생형 바이러스에 대한 상이한 약물에 대하여 수득된 EC₅₀ 값은 단, LdT에 대한 평균 EC₅₀ 값은 본 발명자의 대부분의 선행 연구에서 나타난 바 약 200nM의 통상적인 값 초과인 것을 제외하면 통상 문헌에 보고된 값과 일치하였다. 세포 배양액내 LdT의 항바이러스 활성은 매우 다양하였고, 세포 배양액 분석에서 LdT의 효능은 임상 세팅에서 환자에서 나타난 효능에 전조가 되지 못했다.

라미부딘-내성 뮤턴트에 대하여 관찰된 활성과 관련하여 앞서 보고된 바와 같이(참조 GileadFDA briefing document, 2002) PMEA는 모든 뮤턴트에 대하여 우수 한 활성을 유지하였다. 2개의 더블 또는 M552I 싱글 뮤턴트에 대하여 LdT, LdC 및 라미부딘은 대체로 불활성이고(EC₅₀ >1 mM), LdC의 EC₅₀는 대략 780μM 으로서 L515M/M552V 뮤턴트에 대하여 최소 활성을 나타내었다. 본 연구로부터 얻은 주요 결과는 LdT 및 LdC는 M552V 싱글 뮤턴트에 대하여 거의 완전하게 활성을 유지하고 있었지만, 이 뮤턴트에 대한 라미부딘의 활성은 현저히 저하되었다.

약물의 관측된 효능에 대한 라미부딘-내성 뮤턴트의 작용은 표 24b에 제시되는 폴드-내성 분석으로부터 가장 잘 알 수 있다. 본 연구로부터 얻은 결과는 선행 연구와 광범위하게 일치한다.(as summarized in the GileadFDA Advisory Committee Briefing Document, 2002). 표 24b로부터 더블 뮤턴트 또는 M552I 싱글 뮤턴트중 어느 하나에 대해 시험되었을 때 LdT, LdC 및 라미부딘이 실질적으로 폴드 내성을 나타낸다는 것을 확인하게 되었다. 그러나, 싱글 M552V 뮤턴트의 상태는 매우 상이하다. LdT 및 LdC는 본직절으로 이 뮤턴트에 대하여 본질적으로 변하지 않은 항바이러스 활성을 나타내고, 각 폴드 내성 변화는 1.2 및 2.1배였고 반면 라미부딘은 본 관찰에서는 24.8 폴드 내성을 나타내고 Glaxo 그룹 (Allen etal, 1998)에서는 153 폴드 내성을 나타내었다.

LdT 및 LdC는 입증된 라미부딘 내성을 갖는 B형 간염 환자에서 통상 발견되는 더블-뮤턴트 HBV 균주에 대하여 상대적으로 불활성이었다. 시험관내 활성을 통해 임상 활성이 예측되는 경우, 이 결과는 현재 임상적으로 연구중에 있는 LdT 및 LdC 프로드럭은 입증된 라미부딘 내성이고, 더블-뮤턴트 HBV 균주를 수반하는 환자 에서 최소의 항-HBV 활성을 가질 수 있다. 그러나, 최근 2개의 문헌상의 요약 보고를 통해 때때로 실험실상의 형질감염체를 사용한 결과는 병원에서의 활성과 관련하여 적합치 못한 예측값을 갖는다는 문제를 안고 있다고 관심이 집중되었다. Gilead virologists (Delaney etal., 2001)로부터의 보고를 통해 YMDD- 뮤턴트 HBV 균주에 대한 에테카비르의 시험관내에서의 최소 활성이 제안되었고, 동일한 미티(AASLD 2001)에서 또다른 요약서에는 에테카비르 스폰서(Bristol Myers Squibb)에 의해 수행된 거대 예상 시험의 결과, 즉 라미부딘-내성 B형 간염 환자에서 에테카비르 치료법이 실질적으로 HBV DNA를 감소시켰다는 것이 기술되어 있었다. 따라서, HBV-관련된 실험실상의 결과에 대한 임상적 예측치의 문제와 관련하여 더블-뮤턴트 HBV 균주에 대하여 이들 2개의 화합물의 시험관내 활성은 최소이지만, 라미부딘- 내성 HBV를 갖는 환자에서 Ldt(및 LdC)에 대한 소규모의 임상적 시험을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.

라미부딘와 다르게 M552V HBV 뮤턴트에 대하여 Ldt 및 LdC에 대한 비변형 항바이러스 활성이 본 연구를 통해 실질적으로 입증되었다. B형 간염 환자에서 라미부딘 내성의 60-70%를 차진하는 M515L/M552V 더블 뮤턴트를 유발하는 경로에서 제 1단계로서 판단되는 바, M552V 돌연변이는 라미부딘 내성 개발에 있어 중요하다. (Ahmed et al, 2000). 이러한 시험관내 발견은 중요한 M552V 돌연변이에 대한 활성이 LdT (텔비부딘)로 치료하고자 하는 B형 간염 환자에서 바이러스 내성의 출현을 억제시키는데 도움이 될 수 있기 때문에 LdT (텔비부딘)의 잠재된 내성 프로파일을 전체적으로 이해하는 것이 중요하다.

임상 항바이러스 내성 패턴은 임상 시험으로부터만 확정될 수 있지만, 현재 IIB 단계의 임상 시험에서 LdT 처리 환자에서 관찰되는 바와 같은 보다 우수한 HBV 복제의 양적 억제와 커플링되는, M552V HBV 뮤턴트에 대한 LdT 및 LdC의 비변형 활성은 LdT에 대한 YMDD-매개 HBV 내성이 라미부딘 치료에서 관찰되는 것보다 실질적으로 덜 빈번할 수 있다는 것을 제시하였다.

표 24. 저해 프로파일 [세포내 뉴클레오캡시드의 EPA에 의해 측정된 안정 세포주로부터 유래된 라미부딘-내성 뮤턴트 HBV 바이러스 및 야생형에 대한 LdT, LdC, 라미부딘 및 PMEA의 (a) 항바이러스 효능 ; 및 (b) 폴드 내성]

표 24a 항바이러스 효능

표 24b 폴드 내성

양 표에 있는 모든 숫자는 3 내지 4개의 독립적인 실험으로부터 유도된 평균치 +/-SD를 나타낸다.

EC₅₀ = 세포 배양액내에서 50%까지 바이러스 생산을 감소시키는 유효 농도

폴드 내성 = 야생형 HBV에 대한 EC₅₀로 나눈 뮤턴트 HBV에 대한 EC₅₀

본 발명은 그의 바람직한 구체예와 관련하여 설명되었다. 본 발명의 변형과 수정은 본 발명에 대한 이전의 상세한 설명으로부터 본 기술의 숙련가에게 명백할 것이다. 이들 변형과 수정 모두는 본 발명의 범위내에 포함되어 있다.

Claims

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약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 β-L-2'-데옥시티미딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 β-L-2'-데옥시시티딘, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식(I)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

X는 O, S, SO₂ 또는 CH₂이고;

BASE는 치환될 수 있는 퓨린 또는 피리딘 염기이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹ 및 X²는 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬,CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹은 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 83항에 있어서, R³ 또는 R⁴가 H인 약제학적 조성물.
제 83항에 있어서, R¹ 또는 R²가 H인 약제학적 조성물.
제 83항에 있어서, R¹, R², 또는 R⁴중 적어도 하나는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)의 잔기이며(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄, 알킬, 아릴이거나, R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있고, R⁹는 수소, 알킬 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이다);

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르인 약제학적 조성물.
제 86항에 있어서, 아미노산 잔기가 L-발리닐인 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹은 및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

R³은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, 디알킬아미노알킬렌, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며,

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 92항에 있어서, R³이 H인 약제학적 조성물.
제 92항에 있어서, R¹ 또는 R²가 H인 약제학적 조성물.
제 92항에 있어서, R¹또는 R²중 적어도 하나는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)의 잔기이며(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄, 알킬, 아릴이거나, R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있고, R⁹는 수소, 알킬 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이다);

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르인 약제학적 조성물.
제 95항에 있어서, 아미노산 잔기가 L-발리닐인 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이를 나타내는 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
유효량의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 투여하는 것을 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식(I)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

X는 O, S, SO₂ 또는 CH₂이고;

BASE는 치환될 수 있는 퓨린 또는 피리딘 염기이며,

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹ 및 X²는 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹은 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 105항에 있어서, R³ 또는 R⁴가 H인 약제학적 조성물.
제 105항에 있어서, R¹ 또는 R²가 H인 약제학적 조성물.
제 105항에 있어서, R¹, R², 또는 R⁴중 적어도 하나는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)의 잔기이며(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄, 알킬, 아릴이거나, R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있고, R⁹는 수소, 알킬 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이다);

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 108항에 있어서, 아미노산 잔기가 L-발리닐인 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기식에서,

R¹은 및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

R³은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, 디알킬아미노알킬렌, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 114항에 있어서, R³이 H인 약제학적 조성물.
제 114항에 있어서, R¹ 또는 R²가 H인 약제학적 조성물.
제 114항에 있어서, R¹또는 R²중 적어도 하나는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)의 잔기이며(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄, 알킬, 아릴이거나, R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있고, R⁹는 수소, 알킬 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이다);

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르인 약제학적 조성물.
제 117항에 있어서, 아미노산 잔기가 L-발리닐인 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
유효량의 β-L-2'-데옥시뉴클레오시드, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 투여하는 것을 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식(I)의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

X는 O, S, SO₂ 또는 CH₂이고;

BASE는 치환될 수 있는 퓨린 또는 피리딘 염기이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹ 및 X²는 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 독립적으로 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

Y는 OR³, NR³R⁴ 또는 SR³이고;

X¹은 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, 할로겐, OR⁵, NR⁵R⁶ 또는 SR⁵로 구성된 그룹으로부터 선택되고;

R³, R⁴, R⁵ 및 R⁶은 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기 식에서,

R¹및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

R³ 및 R⁴는 독립적으로 H, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 디알킬아미노알킬렌, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬,CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 127항에 있어서, R³ 또는 R⁴가 H인 약제학적 조성물.
제 127항에 있어서, R¹ 또는 R²가 H인 약제학적 조성물.
제 127항에 있어서, R¹, R², 또는 R⁴중 적어도 하나는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)의 잔기이며(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄, 알킬, 아릴이거나, R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있고, R⁹는 수소, 알킬 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이다);

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르인 약제학적 조성물.
제 130항에 있어서, 아미노산 잔기가 L-발리닐인 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 형태의 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:

상기식에서,

R¹은 및 R²는 독립적으로 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, CO-알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이고;

R³은 수소, 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, 아실, 아세틸, 부티릴, 디알킬아미노알킬렌, CO- 알킬, CO-아릴, CO-알콕시알킬, CO-아릴옥시알킬, CO-치환된 아릴, 알킬설포닐, 아릴설포닐, 아르알킬설포닐, 아미노산 잔기, 모노, 디 또는 트리포스페이트이며;

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 사이클릭 알킬은 C_3-18사이클릭 알킬이며; 알콕시는 C_1-18알콕시이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; CO-치환된 아릴은 아릴이 할로겐(플루오르, 클로로, 브로모 또는 요오드), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 및 포스포네이트로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 부분으로 치환되는 CO-치환된 아릴이며; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르이다.
제 136항에 있어서, R³이 H인 약제학적 조성물.
제 136항에 있어서, R¹ 또는 R²가 H인 약제학적 조성물.
제 136항에 있어서, R¹또는 R²중 적어도 하나는 식 C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹)의 잔기이며(여기에서, R⁸은 아미노산의 측쇄, 알킬, 아릴이거나, R¹⁰에 결합하여 환 구조를 형성할 수 있고, R⁹는 수소, 알킬 또는 아릴이고; R¹⁰ 및 R¹¹은 독립적으로 수소, 아실 또는 알킬이다);

상기 알킬은 C_1-18알킬이고; 아릴은 페닐, 바이페닐 또는 나프틸이고; 아실은 에스테르 그룹의 비카보닐 부위가 직쇄 또는 분지쇄 알킬, 사이클릭 알킬, C_1-4알킬, 알콕시알킬, 아릴옥시알킬, 아릴 및 할로겐, C_1-4알킬 또는 알콕시, 아미노산 잔기 또는 헤테로방향족으로 치환되는 아릴로 구성된 그룹으로부터 선택되는 카복실산 에스테르인 약제학적 조성물.
제 139항에 있어서, 아미노산 잔기가 L-발리닐인 약제학적 조성물.
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제중 유효량의 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 L-발리닐 에스테르를 포함하는 3' 또는 5'-아미노산 에스테르를 포함하는, 숙주에서 HBV의 DNA 폴리머라제 부위내 552번째 코돈에서 메티오닌으로부터 발린 및 526 또는 528번째 코돈에서 류신으로부터 메티오닌으로의 돌연변이 발현을 예방 또는 억제하여 라미부딘-내성 B형 간염 바이러스로 감염된 숙주를 치료하기 위한 약제학적 조성물:
제 76항 내지 제 144항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 유효량의 하나 이상의 항-B형 간염 바이러스 약제를 포함하는 약제학적 조성물.
제 76항 내지 제 144항 중 어느 한 항에 있어서, 2', 3'-디데옥시-3'-티아시티딘(3TC), β-2-하이드록시메틸-5-(5-플루오로시토신-1-일)-1, 3-옥사티올란(FTC), 2'-플루오로-5-메틸-β-L-아라비노푸라노일우리딘(L-FMAU), (-)-β-D-2,6-디아미노퓨린 디옥솔란(DAPD), (-)-β-D-디옥솔란 구아닌(DXG), 팜시클로비르, 펜시클로비르, 데노포비르, 2-아미노-1,9-디하이드로-9-[(1S,3R,4S)-4-히드록시-3-(히드록시메틸)-2-메틸렌사이클로펜틸]-6H-퓨린-6-온, 모노하이드레이트(BMS-200475), 비스 폼 PMEA(아데포비르 디피복실, 또는 또는 {2-(6-아미노-9H-푸린-9-일)에톡시} 메틸포스폰산); 로부카비르, 간시클로비르, β-L-플루오르-2',3'-디데하이드로-2',3'-디데옥시티딘(Lfd4C), 포스카메트 (트리소듐포스포노포르메이트), 이소프리이노신, 레바미졸, N-아세틸시스틴(NAC), 인터페론, 페길화된 인터페론, 면역자극 서열(ISS), 리바비린, 바소큐프로인 디술폰산(PC1323) 또는 폴리아데노사이클릭 폴리우리딜산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유효량의 하나 이상의 항-B형 간염 바이러스 약제를 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 76항 내지 제 144항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 인터페론을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 76항 내지 제 144항 중 어느 한 항에 있어서, 인터페론이 인터페론 알파, 페길화된 인터페론 알파, 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2b, 페길화된 인터페론 알파-2a, 페길화된 인터페론 알파-2b, 인터페론 베타, 인터페론 감마, 인터페론 타우, 인터페론 오메가, 컨센수스 인터페론, INFERGEN (인터페론 알파콘-1), OMNIFERON (자연발생 인터페론), REBIF (인터페론 베타-1a), 오메가 인터페론, 오랄 인터페론 알파, 인터페론 감마-1b, SuperFeron (자연발생 인간 멀티-서브타입 IFN-알파), 및 HuFeron (인간 IFN-베타)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 유효량의 인터페론을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
제 76항 내지 제 144항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 포유 동물인 약제학적 조성물.
제 76항 내지 제 144항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주가 인간인 약제학적 조성물.
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