CN105164261B - 用于增强的细胞摄取的化合物和方法 - Google Patents

用于增强的细胞摄取的化合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105164261B
CN105164261B CN201480024094.4A CN201480024094A CN105164261B CN 105164261 B CN105164261 B CN 105164261B CN 201480024094 A CN201480024094 A CN 201480024094A CN 105164261 B CN105164261 B CN 105164261B
Authority
CN
China
Prior art keywords
certain embodiments
modified
modified oligonucleotide
compound
nucleoside
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201480024094.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105164261A (zh
Inventor
B·拜特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regulus Therapeutics Inc
Original Assignee
Regulus Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regulus Therapeutics Inc filed Critical Regulus Therapeutics Inc
Publication of CN105164261A publication Critical patent/CN105164261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105164261B publication Critical patent/CN105164261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

在此描述了与靶RNA互补的缀合的修饰的寡核苷酸。该缀合物促进该修饰的寡核苷酸的细胞摄取，从而引起提高的效力。

Description

用于增强的细胞摄取的化合物和方法
发明领域
在此提供了用于修饰的寡核苷酸的增强的细胞摄取的化合物和方法。
相关技术说明
用于治疗性调节RNA功能的策略经常使用反义寡核苷酸，这些反义寡核苷酸被设计成通过沃森-克里克碱基配对结合RNA靶并且一旦结合靶，则调节它的功能。此类反义寡核苷酸进行了化学修饰成以向这些寡核苷酸赋予希望的药物动力学和药效学特性。修饰的寡核苷酸可以通过各种机理调节靶RNA，包括涉及该修饰的寡核苷酸结合该靶RNA并且干扰它的功能而不促进该RNA降解的机理(例如，空间位阻)，以及通过酶如RNA酶H或阿尔古(Argonaute)2的活性在结合该修饰的寡核苷酸之后促进该RNA降解的机理。许多类型的RNA可以被选择作为修饰的寡核苷酸的靶，包括信使RNA、前信使RNA以及非编码RNA(如微小RNA)。
微小RNA(MicroRNA或microRNA))(又称为“成熟微小RNA”)是在植物和动物的基因组中编码的小型(长度为大约18至24个核苷酸)非编码RNA分子。在某些情况下，高度保守的内源性表达的微小RNA通过结合特定mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)来调节基因的表达。已在植物和动物中鉴定出了多于1000种不同的微小RNA。某些成熟微小RNA似乎起源于长的内源性初级微小RNA转录物(又称为初级微小RNA、pri-mir、pri-miR或初级前体微小RNA)，这些长的内源性初级微小RNA转录物通常长度为数百个核苷酸(李(Lee)等人，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)，2002，21(17)，4663-4670)。
发明概述
在此提供了包含共价连接至缀合部分的修饰的寡核苷酸的化合物。在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-X-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-X1-Nm-X2-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-X-Nm-Y-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，一种化合物具有结构Ln-接头-Y-Nm-Y-MO，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；每个Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，如果n大于1，则Ln-接头具有以下结构：
Figure BDA0000832350860000021
其中每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
在某些实施例中，Q’和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
在某些实施例中，一个骨架将2、3、4或5个配体连接至修饰的寡核苷酸上。在某些实施例中，一个骨架将3个配体连接至修饰的寡核苷酸上。
在某些实施例中，一种化合物具有以下结构：
Figure BDA0000832350860000022
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；并且
波形线表明连接至该接头和一个或多个配体的其余部分。
在某些实施例中，X是磷酸二酯键。
在某些实施例中，n是从1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些实施例中，n是3。
在某些实施例中，至少一个配体是碳水化合物。
在某些实施例中，至少一个配体选自：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-吡喃核糖、β-D-吡喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸、N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，至少一个配体选自：N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺以及N-异丁酰基-半乳糖胺。
在某些实施例中，每个配体都是N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，一种化合物具有以下结构：
Figure BDA0000832350860000031
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，X1和X2中的至少一个是磷酸二酯键。在某些实施例中，X1和X2各自是磷酸二酯键。
在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，Nm是N’pN”，其中每个N’独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且p是从0至4；并且N”是包含未修饰的糖部分的核苷。在某些实施例中，p是0。在某些实施例中，p是1、2、3或4。
在某些实施例中，每个N’包含未修饰的糖部分。在某些实施例中，每个未修饰的糖部分独立地是β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。在某些实施例中，N”包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，至少一个N’包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，每个嘌呤核碱基独立地选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。在某些实施例中，N”是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。
在某些实施例中，在p是1、2、3或4的情况下，至少一个N’包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，N”包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，每个嘧啶核碱基独立地选自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氢尿嘧啶。
在某些实施例中，p是1，N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷，并且N’和N”通过磷酸二酯核苷间键联连接。在某些实施例中，p是1，N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷，并且N’和N”通过磷酸二酯核苷间键联连接。在某些实施例中，p是1，N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷，并且N’和N”通过硫代磷酸酯核苷间键联连接。
在此描述的任何这些实施例中，每个N的糖部分独立地选自：β-D-核糖、β-D-脱氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及双环糖部分。在某些实施例中，每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些实施例中，cEt糖部分是S-cEt糖部分。在某些实施例中，cEt糖部分是R-cEt糖部分。在此描述的任何实施例中，每个N的糖部分独立地选自β-D-核糖、β-D-脱氧核糖以及2’-氟糖。
在此提供的任何实施例中，一种化合物包含具有与靶RNA互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该靶RNA是微小RNA。在某些实施例中，该靶RNA是信使RNA。在某些实施例中，该靶RNA是前信使RNA。在某些实施例中，该靶RNA是长的非编码RNA。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸与第二修饰的寡核苷酸杂交，其中该第二修饰的寡核苷酸的核碱基序列与该修饰的寡核苷酸的核碱基序列互补。在某些实施例中，该靶RNA是人靶RNA。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与该靶RNA的核碱基序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与微小RNA的核碱基序列部分相同。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与该微小RNA的核碱基序列至少90％、至少95％或100％相同。
在某些实施例中，该微小RNA是人微小RNA。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸由7至10个、7至12个、8至25个、12至25个、15至25个、15至22个、或17至22个连接的核苷组成。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含具有修饰的糖部分的至少一个核苷。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含具有修饰的糖部分的多个核苷和具有未修饰的糖部分的多个核苷。在某些实施例中，每个修饰的糖部分都是相同的修饰的糖部分。在某些实施例中，每个修饰的糖部分独立地选自：2’-O-甲基糖部分、2’-O-甲氧基乙基糖部分、2’-氟糖部分以及双环糖部分。在某些实施例中，每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分和LNA糖部分。在某些实施例中，每个未修饰的糖部分独立地选自β-D-脱氧核糖和β-D-核糖。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含多个非双环核苷和多个双环核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷都具有相同类型的糖部分。在某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分。在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些实施例中，每个双环核苷都具有相同类型的糖部分。在某些实施例中，至少两个双环核苷具有彼此不同的糖部分。在某些实施例中，每个双环核苷独立地选自cEt核苷和LNA核苷以及ENA核苷。在某些实施例中，每个cEt核苷都是S-cEt核苷。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的至少一个键联是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联都是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含修饰的核碱基。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
在此提供了包括使细胞与在此提供的任何这些化合物相接触的方法。在某些实施例中，该细胞是在体内。在某些实施例中，该细胞是在体外。在某些实施例中，该细胞是肝脏细胞。在某些实施例中，该细胞是肝细胞。
在此提供了包括提高修饰的寡核苷酸的效力的方法，该方法包括
a.形成具有结构Ln-接头-X-Nm-X-MO的化合物，其中每个L独立地是配体，并且n是从1至10；每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；每个X独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸；以及
b.从而相对于未缀合的修饰的寡核苷酸，提高该修饰的寡核苷酸的效力。
在此提供了一种制备具有以下结构的化合物的方法：
Figure BDA0000832350860000061
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸，该方法包括以下步骤：
提供含有如在化学式IV中所示的缀合物的固体载体；
Figure BDA0000832350860000062
在有效产生反应性羟基的条件下将DMT基团去保护；
进行顺次的亚磷酰胺偶联步骤以形成Nm；
进行顺次的亚磷酰胺偶联步骤以形成该修饰的寡核苷酸；并且
使该缀合的修饰的寡核苷酸从该固体载体上释放。
在此提供了包括向受试者施用在此提供的化合物的方法。在某些实施例中，该受试者是人。在某些实施例中，该化合物存在于药物组合物中。在某些实施例中，该受试者患有与存在于肝脏细胞中的靶RNA相关的疾病。
在此提供的任何化合物可以用于治疗中。
附图简要说明
图1.包含三个GalNAc配体的缀合部分的结构。
图2A、2B和2C.缀合的修饰的寡核苷酸结构。
图3A和3B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图4A和4B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图5A、5B和5C.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图6A和6B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图7A和7B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图8A和8B.GalNAc缀合的抗miR-122修饰的寡核苷酸的体内效力。
图9A和9B.GalNAc缀合的抗miR-21修饰的寡核苷酸的肝脏浓度。
详细说明
除非以另外的方式定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。除非提供了具体定义，否则与在此描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的术语以及其程序和技术是本领域中熟知并且通常使用的。针对在此的术语存在多个定义的情况下，此部分中的定义优先。化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗受试者可以使用标准技术。某些技术和程序可以例如在桑薇(Sangvi)和科克(Cook)编辑的“反义研究中的碳水化合物修饰(Carbohydrate Modifications in Antisense Research)”，美国化学学会(AmericanChemical Society)，华盛顿哥伦比亚特区(Washington D.C.)，1994；和“雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，”麦克出版有限公司(Mack PublishingCo.)，伊斯顿(Easton)，宾夕法尼亚州(Pa.)，第18版，1990中找到；并且出于任何目的，这些参考文件特此通过引用结合。在允许的情况下，贯穿在此的整个披露内容所涉及的所有的专利、专利申请、公布的申请和出版物、GENBANK序列、网站以及其他公开的材料，除非另外指出，否则通过引用以其全部内容结合。应当理解，在提及URL或其他此类标识符或地址的情况下，此类标识符会变化，并且因特网上的具体信息也会运行命令，但是等效信息可以通过搜索因特网来找到。如此提及证明了此种信息的可用性和公众传播。
在披露和描述本发明的这些组合物和方法之前，应当理解在此使用的术语仅是出于描述具体实施例的目的而不欲具有限制性。必须指出，如在说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文另外清楚地指明。
定义
“靶核酸”意指寡核苷酸被设计成与其进行杂交的核酸。
“靶RNA”意指寡核苷酸与其互补的RNA。
“靶向”意指将与靶核酸杂交的核碱基序列的设计和选择过程。
“对......靶向”意指具有将允许与靶核酸杂交的核碱基序列。
“靶接合”意指寡核苷酸与它所互补的微小RNA以改变该微小RNA的活性、表达或水平的方式相互作用。在某些实施例中，靶接合意指抗miR与它所互补的微小RNA相互作用以使得该微小RNA的活性被抑制。
“调节”意指干扰功能、量或活性。在某些实施例中，调节意指功能、量或活性增加。在某些实施例中，调节意指功能、量或活性减少。
“表达”意指基因的编码信息转变成存在于细胞中并且在细胞中起作用的结构所借助的任何功能和步骤。
“5’靶位点”意指与特定寡核苷酸的最3’端核碱基互补的靶核酸的核碱基。
“3’靶位点”意指与特定寡核苷酸的最5’端核碱基互补的靶核酸的核碱基。
“区”意指核酸内的连接的核苷的一部分。在某些实施例中，寡核苷酸具有与靶核酸的区互补的核碱基序列。例如，在某些实施例中，寡核苷酸与微小RNA茎环序列的区互补。在某些实施例中，寡核苷酸与微小RNA茎环序列的区完全互补。
“区段”意指区的较小或子部分。
“微小RNA”意指长度介于18与25个之间的核碱基的内源性非编码RNA，该内源性非编码RNA是由酶Dicer裂解前体微小RNA的产物。成熟的微小RNA的实例可在称为miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA数据库中找到。在某些实施例中，微小RNA缩写为“微小RNA”或“miR”。
“前体微小RNA”或“前体miR”意指具有发夹结构的非编码RNA，该非编码RNA是由称为Drosha的双链RNA特异性核糖核酸酶裂解前体miR的产物。
“茎环序列”意指具有发夹结构并且含有成熟微小RNA序列的RNA。前体微小RNA序列和茎环序列可以重叠。茎环序列的实例可在称为miRBase(http://microrna.sanger.ac.uk/)的微小RNA数据库中找到。
“初级微小RNA”或“初级miR”意指具有发夹结构的非编码RNA，该非编码RNA是双链RNA特异性核糖核酸酶Drosha的底物。
“微小RNA前体”意指起源于基因组DNA并且包含含有一个或多个微小RNA序列非编码结构RNA的转录物。例如，在某些实施例中，微小RNA前体是前体微小RNA。在某些实施例中，微小RNA前体是初级微小RNA。
“微小RNA调节的转录物”意指由微小RNA调节的转录物。
“单顺反子转录物”意指含有单个微小RNA序列的微小RNA前体。
“多顺反子转录物”意指含有两个或更多个微小RNA序列的微小RNA前体。
“种子序列”意指包含成熟微小RNA序列的5’-末端的核碱基1至9的6至8个连续核碱基的核碱基序列。
“种子匹配序列”意指与种子序列互补并且长度与该种子序列相同的核碱基序列。
“抗miR”意指具有与微小RNA互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR是修饰的寡核苷酸。
“抗miR-X”(其中“miR-X”表示一种具体微小RNA)意指具有与miR-X互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，抗miR-X与miR-X完全互补。在某些实施例中，抗miR-X与miR-X至少80％、至少85％、至少90％或至少95％互补。在某些实施例中，抗miR-X是修饰的寡核苷酸。
“完全修饰的寡核苷酸”意指每个核碱基、每种糖和/或每个核苷间键联都被修饰。
“均一修饰的寡核苷酸”意指每个核碱基、每种糖和/或每个核苷间键联在整个该修饰的寡核苷酸中具有相同的修饰。
“缺口体(Gapmer)”意指在连接的核苷的两个外部区之间安置有连接的β-D-脱氧核糖核苷的内部区的修饰的寡核苷酸，其中每个外部区的每个核苷都包含修饰的糖部分。这些β-D-脱氧核糖核苷可以具有或可以不具有修饰的核碱基。
“缺口”是位于这些外部区之间的缺口体的内部区。
“翼”是与缺口体的内部区的5’或3’末端相邻的缺口体的外部区。
“对称缺口体”意指每个外部区的每个核苷都包含相同的糖修饰。
“不对称缺口体”意指一个外部区的每个核苷都包含第一糖修饰，并且另一个外部区的每个核苷都包含第二糖修饰。
“核碱基序列”意指无关任何糖、键联和/或核碱基修饰，典型地以5’至3’方向列出的低聚化合物或核酸中的连续核碱基的顺序。
“连续核碱基”意指在核酸中彼此紧邻的核碱基。
“核碱基互补性”意指两个核碱基经由氢键结非共价配对的能力。
“互补”意指一种核酸能够与另一种核酸或寡核苷酸杂交。在某些实施例中，互补是指寡核苷酸能够与靶核酸杂交。
“完全互补”意指寡核苷酸的每个核碱基能够与靶核酸中的每个对应位置上的核碱基配对。在某些实施例中，寡核苷酸与微小RNA完全互补，即，该寡核苷酸的每个核碱基与该微小RNA中的对应位置上的核碱基互补。在某些实施例中，每个核碱基与微小RNA茎环序列的区内的核碱基具有互补性的寡核苷酸与该微小RNA茎环序列完全互补。
“互补性百分比”意指寡核苷酸中与靶核酸的等长部分互补的核碱基百分比。通过将该寡核苷酸中与该靶核酸中的对应位置上的核碱基互补的核碱基数除以该寡核苷酸中的核碱基总数来计算互补性百分比。
“同一性百分比”意指第一核酸中与第二核酸中的对应位置上的核碱基相同的核碱基数除以该第一核酸中的核碱基总数。在某些实施例中，该第一核酸是微小RNA并且该第二核酸是微小RNA。在某些实施例中，该第一核酸是寡核苷酸并且该第二核酸是寡核苷酸。
“杂交”意指通过核碱基互补性发生的互补核酸的退火。
“错配”意指第一核酸中不能够与第二核酸的对应位置上的核碱基发生配对的碱基。
在核碱基序列背景下的“相同”意指无关糖、键联和/或核碱基修饰和无关存在的任何嘧啶的甲基状态，具有相同的核碱基序列。
“低聚化合物”意指包含多个连接的单体亚单元的化合物。低聚化合物包括寡核苷酸。
“寡核苷酸”意指包含多个连接的核苷的化合物，这些连接的核苷可以各自独立地是修饰或未修饰的。
“天然存在的核苷间键联”意指核苷之间的3’至5’磷酸二酯键。
“核苷间键联”意指相邻核苷之间的共价键。
“连接的核苷”意指通过共价键联接的核苷。
“核碱基”意指能够与另一个核碱基非共价配对的杂环部分。
“核苷”意指连接至糖部分的核碱基。
“核苷酸”意指具有共价连接至核苷的糖部分的磷酸酯基团的核苷。
“包含由许多连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸的化合物”意指包括具有指定数目的连接的核苷的修饰的寡核苷酸的化合物。因此，该化合物可以包括另外的取代基或缀合物。除非另外指明，否则该化合物不包括超出该修饰的寡核苷酸的核苷的任何另外的核苷。
“修饰的寡核苷酸”意指相对于天然存在的末端、糖、核碱基和/或核苷间键联具有一个或多个修饰的寡核苷酸。修饰的寡核苷酸可以包含未修饰的核苷。
“单链修饰的寡核苷酸”意指不与互补链杂交的修饰的寡核苷酸。
“修饰的核苷”意指与天然存在的核苷相比具有任何变化的核苷。修饰的核苷可以具有修饰的糖和未修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。修饰的核苷可以具有天然糖和修饰的核碱基。
“2’-修饰的核苷”意指当位置是在2-脱氧核糖或核糖中编号时，包含在等效于呋喃糖基环的2’位置的位置上具有任何修饰的糖的核苷。应当理解，2’-修饰的核苷包括但不限于包含双环糖部分的核苷。
“修饰的核苷间键联”意指与天然存在的核苷间键联相比的任何变化。
“硫代磷酸酯核苷间键联”意指其中非桥联原子之一是硫原子的核苷之间的键联。
“硫代磷酸酯键”意指具有与硫代磷酸酯核苷间键联例如-OP(O)(S)O-相同的结构的两个化学部分之间的键联。
“磷酸二酯键”意指具有与磷酸二酯核苷间键联例如-OP(O)2O-相同的结构的两个化学部分之间的键联。
“未修饰的核碱基”意指RNA或DNA的天然存在的杂环碱基：嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)；以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)(包括5-甲基胞嘧啶)和尿嘧啶(U)。
“5-甲基胞嘧啶”意指包含连接至5位置上的甲基的胞嘧啶。
“修饰的核碱基”意指不是未修饰的核碱基的任何核碱基。
“呋喃糖基”意指包含由四个碳原子和一个氧原子组成的5元环的结构。
“天然存在的呋喃糖基”意指如在天然存在的RNA中发现的呋喃核糖基或如在天然存在的DNA中发现的呋喃脱氧核糖基。
“糖部分”意指天然存在的呋喃糖基或修饰的糖部分。
“修饰的糖部分”意指取代的糖部分或糖替代物。
“取代的糖部分”意指不是天然存在的呋喃糖基的呋喃糖基。取代的糖部分包括但不限于在天然存在的呋喃糖基的2’-位置、5’-位置和/或4’-位置上包含修饰的糖部分。某些取代的糖部分是双环糖部分。
“糖替代物”意指不包含呋喃糖基并且能够替代核苷的天然存在的呋喃糖基的结构，这样使得所得到的核苷能够(1)结合到寡核苷酸中并且(2)与互补核苷杂交。此类结构包括该呋喃糖基的相对简单的变化，如环包含不同的原子数(例如，4元环、6元环或7元环)；该呋喃糖基的氧置换为非氧原子(例如，碳、硫或氮)；或原子数变化和氧置换这两者。此类结构还可以包含与针对取代的糖部分所描述的那些取代相对应的取代(例如，6元碳环双环糖替代物任选地包含另外的取代基)。糖替代物还包括更复杂的糖置换(例如，肽核酸的非环体系)。糖替代物包括但不限于吗啉化合物、环己烯化合物和环己六醇化合物。
“β-D-脱氧核糖”意指天然存在的DNA糖部分。
“β-D-核糖”意指天然存在的RNA糖部分。
“2’-O-甲基糖”或“2’-OMe糖”意指在2’位置上具有O-甲基修饰的糖。
“2’-O-甲氧基乙基糖”或“2’-MOE糖”意指在2’位置上具有O-甲氧基乙基修饰的糖。
“2’-O-氟基”或“2’-F”意指在2’位置上具有氟基修饰的糖。
“双环糖部分”意指包含4至7元环的修饰的糖部分(包括但不限于呋喃糖基)，该修饰的糖部分包含连接该4至7元环的两个原子的桥联以形成第二环，从而产生双环结构。在某些实施例中，该4至7元环是糖环。在某些实施例中，该4至7元环是呋喃糖基。在某些此类实施例中，该桥联连接该呋喃糖基的2’-碳和4’-碳。非限制的示例性双环糖部分包括LNA、ENA、cEt、S-cEt和R-cEt。
“锁核酸(LNA)糖部分”意指在4’呋喃糖环原子与2’呋喃糖环原子之间包含(CH2)-O桥联的取代的糖部分。
“ENA糖部分”意指在4’呋喃糖环原子与2’呋喃糖环原子之间包含(CH2)2-O桥联的取代的糖部分。
“约束乙基(cEt)糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。在某些实施例中，该CH(CH3)-O桥联约束为S方向。在某些实施例中，该CH(CH3)-O桥联约束为R方向。
“S-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含S-约束的CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。
“R-cEt糖部分”意指在4'呋喃糖环原子与2'呋喃糖环原子之间包含R-约束的CH(CH3)-O桥联的取代的糖部分。
“2’-O-甲基核苷”意指具有2’-O-甲基糖修饰的修饰的核苷。
“2’-O-甲氧基乙基核苷”意指具有2’-O-甲氧基乙基糖修饰的修饰的核苷。2’-O-甲氧基乙基核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“2’-氟核苷”意指具有2’-氟基糖修饰的修饰的核苷。2’-氟核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“双环核苷”意指具有双环糖部分的修饰的核苷。双环核苷可以具有饰或未修饰的核碱基。
“cEt核苷”意指包含cEt糖部分的核苷。cEt核苷可以包含修饰或未修饰的核碱基。
“S-cEt核苷”意指包含S-cEt糖部分的核苷。
“R-cEt核苷”意指包含R-cEt糖部分的核苷。
“非双环核苷”意指具有除双环糖以外的糖的核苷。在某些实施例中，非双环核苷包含天然存在的糖。在某些实施例中，非双环核苷包含修饰的糖。在某些实施例中，非双环核苷是β-D-脱氧核糖核苷。在某些实施例中，非双环核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷。
“β-D-脱氧核糖核苷”意指天然存在的DNA核苷。
“β-D-核糖核苷”意指天然存在的RNA核苷。
“LNA核苷”意指包含LNA糖部分的核苷。
“ENA核苷”意指包含ENA糖部分的核苷。
“基序”意指寡核苷酸中的修饰和/或未修饰的核碱基、糖和/或核苷间键联的型态。在某些实施例中，基序是核苷型态。
“核苷型态”意指在寡核苷酸或其区中的核苷修饰的型态。核苷型态是描述核苷修饰在寡核苷酸中的排列的基序。
“稳定性修饰”意指在核酸酶存在下，相对于通过由磷酸二酯核苷间键联连接的2’-脱氧核苷提供的稳定性，为修饰的寡核苷酸提供增强的稳定性的对核苷的修饰。例如，在某些实施例中，稳定性修饰是稳定性核苷修饰。在某些实施例中，稳定性修饰是核苷间键联修饰。
“稳定性核苷”意指相对于2’-脱氧核苷提供的核酸酶稳定性，被修饰以对寡核苷酸提供增强的核酸酶稳定性的核苷。在一个实施例中，稳定性核苷是2’-修饰的核苷。
“稳定性核苷间键联”意指相对于磷酸二酯核苷间键联提供的核苷酶稳定性，为寡核苷酸提供提高的核酸酶稳定性的核苷间键联。在一个实施例中，稳定性核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
如在此所使用的“连接基团”是指经由一个或多个共价键将第一化学实体连接至第二化学实体的原子或原子团。
如在此所使用的“接头”是指经由一个或多个共价键将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷的原子或原子团。该修饰或未修饰的核苷可以是如在此所描述的修饰的寡核苷酸的部分，或可以通过磷酸二酯或硫代磷酸酯键连接至修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的3’末端。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的5’末端。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷，该修饰或未修饰的核苷被连接至修饰的寡核苷酸的3’末端。在一些实施例中，该接头将一个或多个配体连接至修饰或未修饰的核苷，该修饰或未修饰的核苷被连接至修饰的寡核苷酸的5’末端。当该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的3’末端或被连接至修饰的寡核苷酸的3’末端的修饰或未修饰的核苷时，在一些实施例中，该接头的连接点可以是修饰或未修饰的糖部分的3’碳。当该接头将一个或多个配体连接至修饰的寡核苷酸的5’末端或被连接至修饰的寡核苷酸的5’末端的修饰或未修饰的核苷时，在一些实施例中，该接头的连接点可以是修饰或未修饰的糖部分的5’碳。
“受试者”意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“有需要的受试者”意指其中受试者被鉴定为有疗法或治疗需要的状态。
“疑似患有的受试者”意指展现出疾病的一个或多个临床指标的受试者。
“施用”意指向受试者提供药剂或组合物，并且包括但不限于由医学专家施用和自施用。
“肠胃外施用”意指通过注射或输注施用。
肠胃外施用包括但不限于皮下施用、静脉内施用或肌肉内施用。
“皮下施用”意指在皮肤下方施用。
“静脉内施用”意指施用进入静脉中。
“心脏内施用”意指施用进入心脏中。在某些实施例中，心脏内施用凭借导管进行。在某些实施例中，心脏内施用凭借开放性心脏手术进行。
“肺部施用”意指向肺施用。
“同时施用”是指以任何方式共同施用两种药剂，其中这两种药剂的药理学作用同时在患者中显现。同时施用不要求以单一的药物组合物、以相同剂型或通过相同的施用途径来施用两种药剂。这两种药剂的作用本身不需要同时显现出来。这些作用仅需要一段时间重叠并且不需要共延。
“持续时间”意指活性或事件持续的一段时间。在某些实施例中，治疗的持续时间是施用药剂或药物组合物的剂量的一段时间。
“疗法”意指疾病治疗方法。在某些实施例中，疗法包括但不限于化学疗法、放射疗法或施用药剂。
“治疗”意指施加用于治愈或改善疾病的一种或多种特定程序。在某些实施例中，该特定程序是施用一种或多种药剂。
“改善”意指减轻病状或疾病的至少一个指标的严重性。在某些实施例中，改善包括延缓或减慢病状或疾病的一个或多个指标的进展。可以通过本领域技术人员已知的主观测量或客观测量来确定指标的严重性。
“处于发展的风险”意指受试者易于发展病状或疾病的状态。在某些实施例中，处于发展病状或疾病的风险的受试者展现出该病状或疾病的一种或多种症状，但是没有展现出诊断患有该病状或疾病的足够数量的症状。在某些实施例中，处于发展病状或疾病的风险的一个受试者展现出该病状或疾病的或多种症状，但达到诊断该病状或疾病所要求的较低程度。
“预防发作”意指在处于发展该疾病或病状的危险的受试者中预防病状或疾病的发展。在某些实施例中，处于发展该疾病或病状的风险的受试者接受与已经患有该疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。
“延缓发作”意指在处于发展该疾病或病状的风险的受试者中延缓病状或疾病的发展。在某些实施例中，处于发展该疾病或病状的风险的受试者接受与已经患有该疾病或病状的受试者所接受的治疗类似的治疗。
“治疗剂”意指用于治愈、改善或预防疾病的药剂。
“剂量”意指在单次施用中提供的药剂的指定量。在某些实施例中，剂量可以两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂形式施用。例如，在某些实施例中，在希望皮下施用的情况下，所希望的剂量要求不是通过单次注射容易地提供的体积。在此类实施例中，可以使用两次或更多次注射达到所希望的剂量。在某些实施例中，剂量可以两次或更多次注射施用以使个体体内的注射部位反应减到最小。
“剂量单位”意指提供药剂的形式。在某些实施例中，剂量单位是含有冻干的寡核苷酸的小瓶。在某些实施例中，剂量单位是含有复原的寡核苷酸的小瓶。
“治疗有效量”是指对动物提供治疗益处的药剂的量。
“药物组合物”意指包括药剂的适合用于向个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可以包含无菌水溶液。
“药剂”意指当向受试者施用时提供治疗作用的物质。
“活性药物成分”意指药物组合物中提供希望的作用的物质。
“改善的肝脏功能”意指趋向于正常限制的肝脏功能变化。在某些实施例中，通过测量存在于受试者的血液中的分子来评价肝脏功能。例如，在某些实施例中，通过血液肝转氨酶水平降低来测量改善的肝功能。
“可接受的安全性特征”意指处于临床上可接受的限制之内的副作用的型态。
“副作用”意指除希望的作用以外的可归因于治疗的生理反应。在某些实施例中，副作用包括但不限于：注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常以及肌病。此类副作用可以被直接或间接检测。例如，血清中的转氨酶水平增加可以表明肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以表明肝毒性或肝功能异常。
“注射部位反应”意指在个体的注射部位处的皮肤的炎症或异常发红。
“受试者依从性”意指受试者对建议或规定的疗法的顺从性。
“遵从”意指受试者对建议的疗法顺从。
“建议的疗法”意指医学专家针对治疗、改善或预防疾病所建议的治疗。
综述
修饰的寡核苷酸的活性基于在修饰的寡核苷酸与它的靶RNA之间发生并且产生希望的药理学端点的特定杂交事件。为了这个事件发生，必须进行某些药物动力学过程，例如将完整的药物递送至靶细胞或组织，并且使该修饰的寡核苷酸进入到含有该靶RNA的细胞中。修饰的寡核苷酸可以被缀合至改进向该靶细胞或组织的递送和/或该寡核苷酸的细胞摄取的一个或多个部分，最终产生增强的效力。例如，可以通过使用作为细胞表面受体的配体的缀合物来实现化合物的细胞摄取增加。缀合至外源分子(例如，药物)的配体与它的细胞表面受体结合导致受体介导的该缀合分子的内吞作用，从而促进该外源分子的跨膜转运。例如，可以通过将包含碳水化合物部分的缀合物共价连接至修饰的寡核苷酸上来实现向肝细胞的靶向递送。当存在于肝细胞表面上的去唾液酸糖蛋白受体识别并结合该碳水化合物部分时，该缀合的修饰的寡核苷酸转运穿过细胞膜进入肝细胞中。通过以这种方式改进递送，可以增强该修饰的寡核苷酸的效力，因为仅需要较低剂量的化合物来实现希望的药理学端点。
在此描述的某些缀合物具有以下优点：向靶细胞类型提供改进的递送并且还在体内可裂解以在体内施用时产生未缀合的修饰的寡核苷酸。如上所述，可以通过使用缀合部分来增强向特定组织或细胞类型体内靶向。然而，一旦该缀合的修饰的寡核苷酸到达它的作用位点，存在所有或部分的共价连接的缀合部分可能改变某些缀合的修饰的寡核苷酸的活性或可能影响理解该修饰的寡核苷酸的某些药物动力学特性(如在靶细胞中的半衰期)所要求的分析。因此，可能需要施用包含连接至缀合部分上的修饰的寡核苷酸的化合物，该修饰的寡核苷酸足够稳定以提高细胞摄取而且一旦该化合物被靶细胞内化，则允许该缀合部分裂解。因此，在此提供了包含连接至可裂解的缀合部分的修饰的寡核苷酸的化合物，这些化合物提高了该修饰的寡核苷酸的效力并且允许该修饰的寡核苷酸以其未缀合的形式部分或完全释放。
某些缀合的化合物
在某些实施例中，在此提供的一种化合物包含连接至修饰的寡核苷酸的5’末端或3’末端上的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至修饰的寡核苷酸的3’末端上的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至修饰的寡核苷酸的5’末端上的缀合部分。在某些实施例中，该化合物包含连接至该修饰的寡核苷酸的3’末端上的第一缀合部分和连接至修饰的寡核苷酸的5’末端上的第二缀合部分。
在某些实施例中，缀合部分包含选自以下的至少一个配体：碳水化合物、胆固醇、脂质、磷脂、抗体、脂蛋白、激素、肽、维生素、类固醇或阳离子性脂质。
配体可以通过任何适合的接头共价连接至修饰的寡核苷酸上。各种接头是本领域中已知的，并且例如在PCT公开号WO 2013/033230和美国专利号8,106,022 B2中描述了某些非限制的示例性接头。在一些实施例中，可以选择在体内对酶裂解有抗性的接头。在一些实施例中，可以选择在体内对水解裂解有抗性的接头。在一些实施例中，可以选择将在体内经受酶裂解的接头。在一些实施例中，可以选择将在体内经受水解裂解的接头。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有以下结构：
L-X1-Nm-X2-MO；
其中每个L是配体；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。在某些实施例中，m是1并且X1和X2各自是磷酸二酯。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构A：
Ln-接头-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构B：
Ln-接头-X1-Nm-X2-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m是大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构C：
Ln-接头-X-Nm-Y-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m是大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，包含在此描述的缀合的修饰的寡核苷酸的化合物具有结构D：
Ln-接头-Y-Nm-Y-MO；
其中每个L独立地是配体并且n是从1至10；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；每个Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m是大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，当n大于1时，该接头包含能够将多于一个L连接至该化合物的其余部分上(即，连接至该修饰的寡核苷酸(MO)上、连接至X1-Nm-X2-MO上、连接至X-Nm-Y-MO上，等等)的骨架。在一些此类实施例中，该化合物(如结构A、结构B、结构C或结构D的化合物)的Ln-接头部分包含结构E：
Figure BDA0000832350860000181
其中每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
在一些实施例中，每个Q’和Q”独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
在一些实施例中，一个骨架能够将2、3、4或5个配体连接至修饰的寡核苷酸上。在一些实施例中，一个骨架能够将3个配体连接至修饰的寡核苷酸上。
一种非限制性的示例性结构E是结构E(i)：
Figure BDA0000832350860000182
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(ii)：
Figure BDA0000832350860000191
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1是H或甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(iii)：
Figure BDA0000832350860000192
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3、R4和R5各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3、R4和R5各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(iv)：
Figure BDA0000832350860000201
其中L1和L2各自独立地是配体；Q’1、Q’2和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(v)：
Figure BDA0000832350860000202
其中L1和L2各自独立地是配体；Q’1、Q’2和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(vi)：
Figure BDA0000832350860000211
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(vii)：
Figure BDA0000832350860000212
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2和R3各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基；并且Z和Z’各自独立地选自O和S。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2和R3各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2和R3各自选自H和甲基。在一些实施例中，在至少一个P原子上的Z或Z’是S，并且另一个Z或Z’是O(即，硫代磷酸酯键)。在一些实施例中，每个-OP(Z)(Z’)O-都是硫代磷酸酯键。在一些实施例中，在至少一个P原子上的Z和Z’均是O(即，磷酸二酯键)。在一些实施例中，每个-OP(Z)(Z’)O-都是磷酸二酯键。
另一种非限制性的示例性结构E是结构E(viii)：
Figure BDA0000832350860000221
其中L1、L2和L3各自独立地是配体；Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地是连接基团；并且R1、R2、R3和R4各自独立地选自H、C1-C6烷基和取代的C1-C6烷基。
在一些实施例中，Q’1、Q’2、Q’3和Q”各自独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自独立地选自：H、甲基、乙基、丙基、异丙基以及丁基。在一些实施例中，R1、R2、R3和R4各自选自H和甲基。
例如PCT公开号WO 2013/033230；美国专利号8,106,022 B2；美国公开号2012/0157509 A1；美国专利号5,994,517；美国专利号7,491,805 B2；美国专利号8,313,772 B2；马诺哈兰马(Manoharan,M.)，第16章，反义药物技术(Antisense Drug Technology)，斯汀克鲁克(Crooke,S.T.)、马塞尔德克尔(Marcel Dekker)公司，2001，391-469描述了非限制性的示例性骨架和/或包含骨架的接头及其合成。
在一些实施例中，化合物的Ln-接头部分包含结构F：
Figure BDA0000832350860000222
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；并且
波形线表明连接至该接头和一个或多个配体的其余部分。
在某些实施例中，波形线表明连接至以上结构E。
在某些实施例中，n是从1至5、1至4、1至3、或1至2。在某些实施例中，n是1。在某些实施例中，n是2。在某些实施例中，n是3。在某些实施例中，n是4。在某些实施例中，n是5。
在一些实施例中，化合物的Ln-接头部分包含结构G：
Figure BDA0000832350860000231
其中：
B选自-O-、-S-、-N(RN)-、-Z-P(Z’)(Z”)O-、-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-X-以及-Z-P(Z’)(Z”)O-Nm-Y-；
MO是修饰的寡核苷酸；
RN选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基以及苯甲基；
Z、Z’和Z”各自独立地选自O和S；
每个N独立地是修饰或未修饰的核苷；
m是从1至5；
X选自磷酸二酯键和硫代磷酸酯键；
Y是磷酸二酯键；
每个L独立地是配体；n是从1至10；S是骨架；并且Q’和Q”独立地是连接基团。
在一些实施例中，每个Q’和Q”独立地选自：肽、醚、聚乙二醇、烷基、C1-C20烷基、取代的C1-C20烷基、C2-C20烯基、取代的C2-C20烯基、C2-C20炔基、取代的C2-C20炔基、C1-C20烷氧基、取代的C1-C20烷氧基、氨基、酰胺基、吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯以及6-氨基己酸。
化合物的一个非限制的示例性Ln-接头部分(例如，具有结构F或结构G)在以下结构H中示出：
Figure BDA0000832350860000241
其中波形线表明连接至该修饰的寡核苷酸(MO)上、例如结构B中的X1上或例如结构C或结构D中的X或Y上。
在某些实施例中，每个配体都是碳水化合物。当被细胞表面凝集素识别时，包含碳水化合物缀合的修饰的寡核苷酸的化合物转运穿过细胞膜进入细胞中。在某些实施例中，细胞表面凝集素是C型凝集素。在某些实施例中，该C型凝集素存在于枯否细胞(Kuppfercell)上。在某些实施例中，C型凝集素存在于巨噬细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于内皮细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于单核细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于白细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于树突状细胞上。在某些实施例中，C型凝集素存在于B细胞上。缀合物可以促进抗miR-122化合物摄取到表达C-型凝集素的任何细胞类型中。
在某些实施例中，C型凝集素是无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。在某些实施例中，缀合物包含对该ASGPR具有亲和性的一个或多个配体，包括但不限于半乳糖或半乳糖衍生物。在某些实施例中，对该ASGPR具有亲和性的配体是N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺或N-异丁酰基半乳糖胺。此类缀合物促进化合物摄取到表达该ASGPR的细胞中，例如肝细胞和树突状细胞。
在某些实施例中，配体是选自以下的碳水化合物：甘露糖、葡萄糖、半乳糖、核糖、阿拉伯糖、果糖、岩藻糖、木糖、D-甘露糖、L-甘露糖、D-半乳糖、L-半乳糖、D-葡萄糖、L-葡萄糖、D-核糖、L-核糖、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-果糖、L-果糖、D-岩藻糖、L-岩藻糖、D-木糖、L-木糖、α-D-呋喃甘露糖、β-D-呋喃甘露糖、α-D-吡喃甘露糖、β-D-吡喃甘露糖、α-D-呋喃葡萄糖、β-D-呋喃葡萄糖、α-D-吡喃葡萄糖、β-D-吡喃葡萄糖、α-D-呋喃半乳糖、β-D-呋喃半乳糖、α-D-吡喃半乳糖、β-D-吡喃半乳糖、α-D-呋喃核糖、β-D-呋喃核糖、α-D-吡喃核糖、β-D-吡喃核糖、α-D-呋喃果糖、α-D-吡喃果糖、葡糖胺、半乳糖胺、唾液酸以及N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，配体选自：N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、半乳糖胺、N-甲酰基半乳糖胺、N-丙酰基-半乳糖胺、N-正丁酰基半乳糖胺以及N-异丁酰基-半乳糖胺。
在某些实施例中，配体是N-乙酰基半乳糖胺。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
Figure BDA0000832350860000251
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m是大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，一种化合物包含以下结构：
Figure BDA0000832350860000252
其中X是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m是大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在某些实施例中，一种化合物包含以下结构：
Figure BDA0000832350860000261
其中X是磷酸二酯键；每个N独立地是修饰或未修饰的核苷，并且m是从1至5；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，当m是大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。
在一些实施例中，一种化合物具有以下结构：
Figure BDA0000832350860000262
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，X1和X2中的至少一个是磷酸二酯键。在某些实施例中，X1和X2各自是磷酸二酯键。
在某些实施例中，m是1。在某些实施例中，m是2。在某些实施例中，m是2、3、4或5。在某些实施例中，m是3、4或5。在某些实施例中，当m大于1时，Nm的每个修饰或未修饰的核苷都可以通过磷酸二酯核苷间键联或硫代磷酸酯核苷间键联连接至Nm的相邻的修饰或未修饰的核苷上。在某些实施例中，当m是2时，Nm的这些核苷通过磷酸二酯核苷间键联连接。
在此描述的任何这些实施例中，Nm可以是N’pN”，其中每个N’独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且p是从0至4；并且N”是包含未修饰的糖部分的核苷。
在某些实施例中，p是0。在某些实施例中，p是1、2、3或4。在某些实施例中，当p是1、2、3或4时，每个N’包含未修饰的糖部分。
在某些实施例中，未修饰的糖部分是β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。
在某些实施例中，在p是1、2、3或4的情况下，N’包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，N”包含嘌呤核碱基。在某些实施例中，嘌呤核碱基选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。在某些实施例中，N是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。在某些实施例中，N”是β-D-脱氧核糖腺苷或β-D-脱氧核糖鸟苷。在一些实施例中，p是1并且N’和N”各自是β-D-脱氧核糖腺苷。
在某些实施例中，在p是1、2、3或4的情况下，N’包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，N”包含嘧啶核碱基。在某些实施例中，嘧啶核碱基选自：胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及5,6-二氢尿嘧啶。
在此描述的任何这些实施例中，每个N的糖部分独立地选自：β-D-核糖、β-D-脱氧核糖、2’-O-甲氧基糖、2’-O-甲基糖、2’-氟糖以及双环糖部分。在某些实施例中，每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分、LNA糖部分以及ENA糖部分。在某些实施例中，该cEt糖部分是S-cEt糖部分。在某些实施例中，该cEt糖部分是R-cEt糖部分。在此描述的任何实施例中，每个N的糖部分可以独立地选自β-D-核糖、β-D-脱氧核糖以及2’-氟糖。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
Figure BDA0000832350860000281
其中X是磷酸二酯键；m是1；N是β-D-脱氧核糖腺苷；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，化合物包含以下结构：
Figure BDA0000832350860000282
其中X是磷酸二酯键；m是2；每个N是β-D-脱氧核糖腺苷；N的核苷通过磷酸二酯核苷间键联连接；Y是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸。
用于缀合至修饰的寡核苷酸的另外的部分包括吩嗪、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明(rhodamine)、香豆素以及染料。在某些实施例中，缀合基团是直接连接至修饰的寡核苷酸上。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列与靶RNA的核碱基序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少96％或100％互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸与靶RNA至少90％、至少93％、至少94％、至少95％或100％互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含具有修饰的糖部分的至少一个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含多个非双环核苷和多个双环核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少70％的核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少80％的核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少90％的核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少95％的核苷包含修饰的糖部分。
在某些实施例中，至少两个双环核苷包含彼此不同的糖部分。在某些实施例中，每个双环核苷都具有相同类型的糖部分。在某些实施例中，至少两个非双环核苷包含彼此不同的糖部分。在某些实施例中，每个非双环核苷都具有相同类型的糖部分。
在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷、β-D-核糖核苷、2’-O-甲基核苷、2’-O-甲氧基乙基核苷以及2’-氟核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷独立地选自β-D-脱氧核糖核苷和2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，每个非双环核苷都是β-D-脱氧核糖核苷。
在某些实施例中，该双环核苷选自cEt核苷和LNA核苷以及ENA核苷。在某些实施例中，该cEt核苷是S-cEt核苷。在某些实施例中，该cEt核苷是R-cEt核苷。
在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸包含多个修饰的核苷和多个β-D-脱氧核糖核苷，其中每个β-D-脱氧核糖核苷都可以包含修饰或未修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸是缺口体。在某些实施例中，每个核苷的糖部分都是修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷。在某些实施例中，修饰的核苷是S-cEt核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由7至10个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8至10个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8至12个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至22个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由17至22个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由7个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由9个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由10个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由11个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由13个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由14个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由17个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由21个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由22个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由23个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由24个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由25个连接的核苷组成。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少一个核苷间键联是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联都是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，该修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的至少一个嘧啶包含5-甲基基团。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的至少一个核苷包含5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，在修饰的寡核苷酸的长度为7与12个连接的核苷之间的情况下，该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，在修饰的寡核苷酸的长度为7与10个连接的核苷之间的情况下，该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，在修饰的寡核苷酸是在8与12个连接的核苷之间的情况下，该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由7个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由9个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由10个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由11个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12个连接的核苷组成，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含双环糖部分。在某些实施例中，该双环糖部分是cEt糖部分。在某些实施例中，该cEt糖部分是S-cEt糖部分。在某些实施例中，该双环糖部分是LNA糖部分。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是缺口体。
某些代谢产物
当在体外或体内暴露于核酸外切酶和/或核酸内切酶时，化合物可以经受在整个化合物的不同位置上的裂解。此种裂解的产物可以保留一定程度的母体化合物的活性，并且因此被认为是活性代谢物。因此，化合物的代谢产物可以用于在此描述的这些方法中。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸(未缀合或缀合的)经受5’末端和/或3’末端上的裂解，从而产生相对于母体修饰的寡核苷酸在5’末端和/或3’末端上少1个、2个或3个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受5’末端上的裂解，释放5’-末端的核苷酸并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在5’末端上少1个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受5’末端上的裂解，释放两个5’-末端的核苷并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在5’末端上少两个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受3’末端上的裂解，释放3’-末端的核苷酸并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在3’末端上少一个核苷酸的代谢产物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸经受3’末端上的裂解，释放两个3’-末端的核苷并且产生相对于母体修饰的寡核苷酸在3’末端上少两个核苷酸的代谢产物。
包含连接至缀合部分的修饰的寡核苷酸的化合物还可以经受该修饰的寡核苷酸与配体之间的接头内的一个位点上的裂解。在某些实施例中，裂解产生包含一部分缀合部分的母体修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，裂解产生在修饰的寡核苷酸与配体之间包含接头的一个或多个亚单位的母体修饰的寡核苷酸。例如，在化合物具有结构Ln-接头-Nm-P-MO的情况下，在一些实施例中，裂解产生包含Nm的一个或多个核苷酸的母体修饰的寡核苷酸。在一些实施例中，缀合的修饰的寡核苷酸的裂解产生母体修饰的寡核苷酸。在一些此类实施例中，例如，在化合物具有结构Ln-接头-Nm-P-MO的情况下，在一些实施例中，裂解产生不包含Nm的任何核苷酸的母体修饰的寡核苷酸。
缀合的修饰的寡核苷酸的某些用途
在某些实施例中，靶RNA与疾病相关。因此，向受试者施用缀合的修饰的寡核苷酸化合物可以治疗、预防或延缓与该靶RNA相关的疾病的发作。在某些实施例中，该疾病与在肝脏细胞中表达的靶RNA相关。在某些实施例中，该疾病与在肝细胞中表达的靶RNA相关。在某些实施例中，该疾病与在巨噬细胞中表达的靶RNA相关。在某些实施例中，该疾病与在树突状细胞中表达的靶RNA相关。在某些实施例中，该靶RNA是微小RNA。
在此提供了用于治疗中的缀合的化合物。
某些靶RNA
在此提供的任何这些化合物可以包含具有与靶RNA互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。在此描述的任何这些实施例中，靶RNA可以是能够被靶向的任何核酸，包括但不限于：微小RNA、初级微小RNA、前体微小RNA、前信使RNA、信使RNA、长的非编码RNA、小的转移RNA、小的核RNA、小的核仁RNA、小的核糖体RNA、小的发夹RNA、内源反义RNA、引导RNA、极小非编码RNA、在着丝点或其他染色体起点处由异染色质重复编码的小的单链或双链RNA以及其任何前体。靶RNA可以是编码或非编码的序列；单链或双链或具有部分双链特征的单链；可以天然存在于信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)或转移RNA(tRNA)的内含子或外显子内；并且可以内源转录或外源产生。
当修饰的寡核苷酸与它的靶RNA杂交时，可以通过非降解性机理(例如RNA拮抗作用、调节RNA剪接、调节聚腺苷酸化、破坏RNA二级结构以及抑制翻译)或通过促进靶RNA降解的机理(例如RNA酶H、RNA干扰、核糖酶以及双链RNA酶)来抑制该靶RNA的功能。
某些微小RNA靶标
在此提供的任何这些化合物可以包含具有与微小RNA互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。
某些成熟微小RNA的核碱基序列和它们的对应茎环序列可在miRBase(在microrna.sanger.ac.uk中找到的微小RNA序列和注释的一种可在线搜索数据库)中找到。该miRBase序列数据库中的条目代表微小RNA转录物的预测的发夹部分(茎环)，具有成熟微小RNA序列的位置和序列方面的信息。该数据库中的这些微小RNA茎环序列不是严格地前体微小RNA(前体微小RNA)，并且在一些情况下可以包括前体微小RNA和来自假定的初级转录物的一些侧翼序列。这些微小RNA靶标的序列涵盖任何型式的微小RNA，包括在该miRBase序列数据库的发布版15.0中描述的序列和在该miRBase序列数据库的任何更早发布版中描述的序列。序列数据库发布版可能引起某些微小RNA重新命名。本发明的这些组合物涵盖与这些微小RNA靶标的任何核碱基序列型式互补的修饰的寡核苷酸。
在某些实施例中，靶向微小RNA的修饰的寡核苷酸的每个核碱基都能够经历与该微小RNA或其前体的核碱基序列中的每个对应位置上的核碱基进行碱基配对。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列可以相对于它的靶微小RNA或前体序列具有一个或多个错配的碱基对，并且仍保持能够与它的靶序列杂交。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有与微小RNA前体的核碱基序列(如微小RNA茎环序列)互补的核碱基序列。当成熟微小RNA被包含在微小RNA前体序列内时，具有与微小RNA互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸也与对应的微小RNA前体的区互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由许多连接的核苷组成，这许多连接的核苷等于与其互补的微小RNA序列的长度。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数是小于微小RNA或其前体的长度。在某些实施例中，该寡核苷酸具有与该微小RNA或其前体的区互补的核碱基序列。具有小于该微小RNA长度的许多连接的核苷的修饰的寡核苷酸(其中修饰的寡核苷酸的每个核碱基都与微小RNA核碱基序列中的对应位置上的每个核碱基互补)被认为具有与微小RNA核碱基序列的区完全互补的核碱基序列的修饰的寡核苷酸。例如，由22个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸(其中核苷1至22的核碱基各自与微小RNA的对应位置互补，该微小RNA的长度为23个核碱基)与该微小RNA的核碱基序列的22个核碱基区完全互补。这种修饰的寡核苷酸具有与该微小RNA的22个核碱基部分100％互补的核碱基序列。此外，这种修饰的寡核苷酸被认为是与该微小RNA100％互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数比该微小RNA的长度小1。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在5’末端上少一个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在3’末端上少一个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在5’末端上少两个核苷。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸在3’末端上少两个核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列的区与微小RNA的核碱基序列的区完全互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的8个连续核碱基各自与微小RNA的8个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的9个连续核碱基各自与微小RNA的9个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的10个连续核碱基各自与微小RNA的10个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的11个连续核碱基各自与微小RNA的11个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的12个连续核碱基各自与微小RNA的12个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的13个连续核碱基各自与微小RNA的13个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的14个连续核碱基各自与微小RNA的14个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的15个连续核碱基各自与微小RNA的15个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的16个连续核碱基各自与微小RNA的16个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的17个连续核碱基各自与微小RNA的17个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的18个连续核碱基各自与微小RNA的18个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的19个连续核碱基各自与微小RNA的19个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的20个连续核碱基各自与微小RNA的20个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的22个连续核碱基各自与微小RNA的22个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的23个连续核碱基各自与微小RNA的23个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的24个连续核碱基各自与微小RNA的24个连续核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的25个连续核碱基各自与微小RNA的25个连续核碱基互补。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含与种子序列互补的核碱基序列，即修饰的寡核苷酸包含种子匹配序列。在某些实施例中，种子序列是六聚体种子序列。在某些实施例中，六聚体种子序列是微小RNA的核碱基1-6。在某些实施例中，六聚体种子序列是微小RNA的核碱基2-7。在某些实施例中，六聚体种子序列是微小RNA的核碱基3-8。在某些实施例中，种子序列是七聚体种子序列。在某些实施例中，七聚体种子序列是微小RNA的核碱基1-7。在某些实施例中，七聚体种子序列是微小RNA的核碱基2-8。在某些实施例中，该种子序列是八聚体种子序列。在某些实施例中，八聚体种子序列是微小RNA的核碱基1-8。在某些实施例中，八聚体种子序列是微小RNA的核碱基2-9。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的核碱基序列与在此列出的微小RNA核碱基序列或其前体100％互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有相对于微小RNA或其前体的核碱基序列具有一个错配的核碱基序列。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有相对于微小RNA或其前体的核碱基序列具有两个错配的核碱基序列。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有相对于微小RNA或其前体的核碱基序列具有不多于两个错配的核碱基序列。在某些实施例中，这些错配的核碱基是连续的。在某些实施例中，这些错配的核碱基是不连续的。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数大于微小RNA序列的长度。在某些实施例中，额外的核苷的核碱基与微小RNA茎环序列的核碱基互补。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数比微小RNA的长度大1。在某些实施例中，另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的5’末端上。在某些实施例中，另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的3’末端上。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的连接的核苷数比微小RNA的长度大2。在某些实施例中，这两个另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的5’末端上。在某些实施例中，这两个另外的核苷是处于修饰的寡核苷酸的3’末端上。在某些实施例中，一个另外的核苷位于修饰的寡核苷酸的5’末端上并且一个另外的核苷位于修饰的寡核苷酸的3’末端上。在某些实施例中，该修饰的寡核苷酸的区可以与微小RNA的核碱基序列完全互补，但是该整个修饰的寡核苷酸不与微小RNA完全互补。例如，由23个连接的核苷组成的修饰的寡核苷酸(其中核苷1至22的核碱基各自与微小RNA的对应位置互补，该微小RNA的长度为22个核碱基)具有与微小RNA的核碱基序列100％互补的22个核苷部分。
某些核碱基序列
在此列出的任何核碱基序列(包括但不限于在实例中和在序列表中找到的那些)无关于对核酸的任何修饰。因此，由SEQ ID NO定义的核酸可以独立地包含对一个或多个糖部分、对一个或多个核苷间键联和/或对一个或多个核碱基的一个或多个修饰。
虽然本文件所附序列表将每个核碱基序列根据需要鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上那些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域技术人员将易于领会，如“RNA”或“DNA”这样的名称描述修饰的寡核苷酸在一定程序上是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被描述为具有修饰的糖(针对DNA的天然2’-H为2’-OH)的DNA或具有修饰的碱基(针对RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化的尿嘧啶))的RNA。
因此，在此提供的核酸序列(包括但不限于在序列表中的那些)旨在涵盖含有任何组合的天然或修饰的RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为进一步实例而不是限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的低聚化合物涵盖具有此种核碱基序列的任何低聚化合物，无论修饰或未修饰，包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些和具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些以及具有其他修饰的碱基如“ATmeCGAUCG”的低聚化合物，其中meC表明在5-位置上包含甲基的胞嘧啶碱基。
某些合成方法
可以使用本领域中已知的自动化固相合成方法来制得修饰的寡核苷酸。在固相合成过程中，亚磷酰胺单体依次与共价连接至固体载体上的核苷偶联。此核苷是该修饰的寡核苷酸的3’末端核苷。典型地，该偶联循环包括四步：脱三苯甲基(用酸去除5’-羟基保护基团)、偶联(将活化的亚磷酰胺连接至载体结合的核苷或寡核苷酸)、氧化或硫化(用氧化剂或硫化剂转化新形成的亚磷酸三酯)，并且加帽(乙酰化未反应的5’-羟基)。在最后的偶联循环之后，使该固体载体结合的寡核苷酸经受脱三苯甲基步骤，接着是裂解和去保护步骤，该裂解和去保护步骤同时使寡核苷酸从固体载体上释放并且使保护基团从碱基上去除。通过过滤去除固体载体，浓缩滤液并且测试所得到的溶液的特性和纯度。然后例如使用填充有阴离子交换树脂的柱来纯化寡核苷酸。
可以使用与产生未缀合的寡核苷酸的固相合成类似的自动固相合成来制得GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸。在合成GalNAc缀合的寡核苷酸过程中，这些亚磷酰胺单体依次与共价连接至固体载体上的GalNAc缀合物偶联。GalNAc缀合物和GalNAc缀合物固体载体的合成例如在美国专利号8,106,022中描述，为了描述含碳水化合物的缀合物(包括包含一个或多个GalNAc部分的缀合物)的合成和共价连接至固体载体上的缀合物的合成，该参考文件通过引用以其全部内容结合在此。
在此提供了制备具有在化学式(IV)中示出的结构的GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸的方法：
Figure BDA0000832350860000361
其中每个N独立地是修饰的或未修饰的核苷，并且m是从1至5；X1和X2各自独立地是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸；这些方法包括以下步骤：
提供包含如在化学式IV中所示的缀合物的固体载体；
Figure BDA0000832350860000362
在有效产生反应性羟基的条件下将DMT基团去保护；
进行顺次的亚磷酰胺偶联步骤以形成Nm；
进行顺次的亚磷酰胺偶联步骤以形成MO；
并且使该缀合的修饰的寡核苷酸从该固体载体上释放。
某些修饰的寡核苷酸
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至30个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12至25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至21个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至19个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15至16个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由19至24个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由21至24个连接的核苷组成。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由8个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由9个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由10个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由11个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由12个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由13个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由14个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由15个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由16个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由17个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由18个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由19个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由20个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由21个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由22个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由23个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由24个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由25个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由26个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由27个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由28个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由29个连接的核苷组成。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸由30个连接的核苷组成。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是完全修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸在每个核苷上都包含糖修饰。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸包含至少一个修饰的核苷间键联。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸在每个核苷上都包含糖修饰，并且每个核苷间键联都是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸在每个核苷上都包含糖修饰，并且包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸在每个核苷上都包含糖修饰，并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，完全修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含相同的修饰的糖部分。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是均匀修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，均匀修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含相同的糖修饰的部分。在某些实施例中，均匀修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联都包含相同的修饰的核苷间键联。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸具有缺口体基序。在某些实施例中，每个外部的每个核苷都包含相同的修饰的糖部分。在某些实施例中，一个外部区的至少两个核苷包含彼此不同的修饰的糖部分。在某些实施例中，每个外部区的至少两个核苷包含彼此不同的修饰的糖部分。在某些实施例中，每个外部区的每个核苷都包含2’-O-甲氧基乙基糖。在某些实施例中，每个外部区的每个核苷都包含双环糖部分。在某些实施例中，该双环糖部分是cEt糖部分。在某些实施例中，该cEt糖部分是S-cEt糖部分。在某些实施例中，该双环糖部分是LNA糖部分。
在某些实施例中，缺口体的每个外部区都由相同数目的连接的核苷组成。在某些实施例中，缺口体的一个外部区由与另一个外部区的连接的核苷数不同的数目的连接的核苷组成。
在某些实施例中，每个外部区独立地包含1至6个核苷。在某些实施例中，外部区包含1个核苷。在某些实施例中，外部区包含2个核苷。在某些实施例中，外部区包含3个核苷。在某些实施例中，外部区包含4个核苷。在某些实施例中，外部区包含5个核苷。在某些实施例中，外部区包含6个核苷。在某些实施例中，该内部区由17至28个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由17至21个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由17个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由18个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由19个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由20个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由21个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由22个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由23个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由24个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由25个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由26个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由27个连接的核苷组成。在某些实施例中，内部区由28个连接的核苷组成。
在某些实施例中，每个外部区都包含5个连接的核苷，并且内部区包含10个连接的核苷。在某些实施例中，每个外部区都包含4个连接的核苷，并且内部区包含10个连接的核苷。在某些实施例中，每个外部区都包含3个连接的核苷，并且内部区包含10个连接的核苷。在某些实施例中，每个外部区都包含2个连接的核苷，并且内部区包含10个连接的核苷。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是单链siRNA。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是双链siRNA。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是单链微小RNA模拟物。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸是双链微小RNA模拟物。
某些修饰
在此提供了包含被连接至缀合部分的修饰的寡核苷酸的化合物。修饰的寡核苷酸可以包含对核碱基、糖和/或核苷间键联的一种或多种修饰。可以因为希望的特性(例如像细胞摄取增强、对其他寡核苷酸或核酸靶标的亲和性增强以及在核酸酶存在下的稳定性增加)选择修饰的核碱基、糖和/或核苷间键联优先于未修饰的形式。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核苷。在某些实施例中，修饰的核苷是稳定性核苷。稳定性核苷的一个实例是糖修饰的核苷。
在某些实施例中，修饰的核苷包含修饰的糖部分。在某些实施例中，包含修饰的糖部分的修饰的核苷包含未修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的糖包含修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核苷是2’-修饰的核苷。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含双环糖部分。在某些实施例中，该双环糖部分是呈α构型的D糖。在某些实施例中，该双环糖部分是呈β构型的D糖。在某些实施例中，该双环糖部分是呈α构型的L糖。在某些实施例中，该双环糖部分是呈β构型的L糖。
在某些实施例中，该双环糖部分在2'碳原子与4'碳原子之间包含桥联基团。在某些实施例中，该桥联基团包含1至8个连接的双基团。在某些实施例中，该双环糖部分包含1至4个连接的双基团。在某些实施例中，该双环糖部分包含2个或3个连接的双基团。在某些实施例中，该双环糖部分包含2个连接的双基团。此类4’至2’糖取代基的实例包括但不限于：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(RaRb)-N(R)-O-或-C(RaRb)-O-N(R)-；4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'；4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)-S-2'；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)和4'-CH(CH2OCH3)-O-2'及其类似物(参见，例如于2008年7月15日发行的美国专利7,399,845)；4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见，例如于2009年1月8日出版的WO 2009/006478)；4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见，例如于2008年12月11日出版的WO 2008/150729)；4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见，例如于2004年9月2日出版的US 2004/0171570)；4'-CH2-O-N(R)-2和4'-CH2-N(R)-O-2'-，其中每个R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基；4'-CH2-N(R)-O-2'，其中R是H、C1-C12烷基或保护基团(参见，于2008年9月23日发行的美国专利7,427,672)；4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见，例如查多帕迪亚亚(Chattopadhyaya)等人，有机化学杂志(J.Org.Chem.)，2009，74，118-134)；以及4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，于2008年12月8日出版的公开PCT国际申请WO2008/154401)。
在某些实施例中，此类4’至2’桥联独立地包含1个或2至4个连接的基团，这些连接的基团独立地选自-[C(Ra)(Rb)]n-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-以及-N(Ra)-；
其中：
X是0、1或2；
n是1、2、3或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)或亚磺酰基(S(＝O)-J1)；并且
每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基、或保护基团。
包含双环糖部分的核苷称为双环核苷或BNA。在某些实施例中，双环核苷包括但不限于如下所描绘的(A)α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(B)β-D-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)BNA；(C)亚乙基氧基(4’-(CH2)2-O-2’)BNA；(D)氨基氧基(4’-CH2-O-N(R)-2’)BNA；(E)氧基氨基(4’-CH2-N(R)-O-2’)BNA；(F)甲基(亚甲基氧基)(4’-CH(CH3)-O-2’)BNA(又称为约束的乙基或cEt)；(G)亚甲基硫代(4’-CH2-S-2’)BNA；(H)亚甲基-氨基(4’-CH2-N(R)-2’)BNA；(I)甲基碳环(4’-CH2-CH(CH3)-2’)BNA；(J)c-MOE(4’-CH2-OMe-2’)BNA以及(K)亚丙基碳环(4’-(CH2)3-2’)BNA。
Figure BDA0000832350860000401
Figure BDA0000832350860000411
其中Bx是核碱基部分，并且R独立地是H、保护基团或C1-C12烷基。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2'-取代基：卤基、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-、S-或N(Rm)-烷基；O-、S-或N(Rm)-烯基；O-、S-或N(Rm)-炔基；O-亚烷基-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)或O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团或取代或未取代的C1-C10烷基。这些2'-取代基可以进一步被独立地选自以下的一个或多个取代基取代：羟基、氨基、烷氧基、羰基、苯甲基、苯基、硝基(NO2)、硫醇基、硫代烷氧基(S-烷基)、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、NH2、N3、OCF3、O-CH3、O(CH2)3NH2、CH2-CH＝CH2、O-CH2-CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(Rm)(Rn)、-O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及N-取代的乙酰胺(O-CH2-C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团或取代或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、OCF3、O-CH3、OCH2CH2OCH3、2'-O(CH2)2SCH3、O-(CH2)2-O-N(CH3)2-、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2以及O-CH2-C(＝O)-N(H)CH3。
在某些实施例中，2’-修饰的核苷包含选自以下的2’-取代基：F、O-CH3和OCH2CH2OCH3。
在某些实施例中，包含修饰的糖部分的核苷是4’-硫代修饰的核苷。在某些实施例中，包含修饰的糖部分的核苷是4’-硫代-2’-修饰的核苷。4’-硫代修饰的核苷具有β-D-核糖核苷，其中4’-O置换为4’-S。4'-硫代-2'-修饰的核苷是2'-OH置换为2'-取代基的4'-硫代修饰的核苷。适合的2'-取代基包括2'-OCH3、2'-O-(CH2)2-OCH3和2'-F。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个核苷间修饰。在某些实施例中，寡核苷酸的每个核苷间键联都是修饰的核苷间键联。在某些实施例中，修饰的核苷间键联包含磷原子。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含至少一个硫代磷酸酯核苷间键联。在某些实施例中，修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
在某些实施例中，修饰的核苷间键联不包含磷原子。在某些实施例中，核苷间键联由短链烷基核苷间键联形成。在某些实施例中，核苷间键联由环烷基核苷间键联形成。在某些实施例中，核苷间键联由混合的杂原子与烷基核苷间键联形成。在某些实施例中，核苷间键联由混合的杂原子与环烷基核苷间键联形成。在某些实施例中，核苷间键联由一个或多个短链杂原子核苷间键联形成。在某些实施例中，核苷间键联由一个或多个杂环核苷间键联形成。在某些实施例中，核苷间键联具有酰胺骨架。在某些实施例中，核苷间键联具有混合的N、O、S和CH2组分部分。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：5-羟基甲基胞嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮鸟苷、2-氨基吡啶以及2-吡啶酮。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
在某些实施例中，修饰的核碱基包含多环杂环。在某些实施例中，修饰的核碱基包含三环杂环。在某些实施例中，修饰的核碱基包含吩嗪衍生物。在某些实施例中，该吩嗪可以进一步被修饰以形成本领域中称为G-夹的核碱基。
在某些实施例中，修饰的寡核苷酸包含连接至寡核苷酸的一个或两个末端上的一个或多个稳定基团以增强例如像核酸酶稳定性的特性。稳定性基团中包括帽结构。这些末端修饰保护寡核苷酸免受核酸外切酶降解，并且可以帮助在细胞内内递送和/或定位。帽可以存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或可以存在于这两个末端上。帽结构包括例如反向脱氧无碱基帽。
适合的帽结构包括：4',5'-亚甲基核苷酸、1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、1,5-脱水己糖醇核苷酸、L-核苷酸、α-核苷酸、修饰的碱基核苷酸、二硫代磷酸酯键、苏式呋喃戊糖基核苷酸、无环3',4'-开环核苷酸、无环3,4-二羟基丁基核苷酸、无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分、3'-3'-反向无碱基部分、3'-2'-反向核苷酸部分、3'-2'-反向无碱基部分、1,4-丁二醇磷酸酯、3'-氨基磷酸酯、己基磷酸酯、氨基己基磷酸酯、3'-磷酸酯、3'-硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥联的甲基磷酸酯部分和非桥联的甲基磷酸酯部分5'-氨基-烷基磷酸酯、1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯、6-氨基己基磷酸酯、1,2-氨基十二烷基磷酸酯、羟基丙基磷酸酯、5'-5'-反向核苷酸部分、5'-5'-反向无碱基部分、5'-氨基磷酸酯、5'-硫代磷酸酯、5'-氨基、桥联和未桥联的5'-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯以及5'-巯基部分。
某些药物组合物
在此提供的任何这些化合物都可以制备成药物组合物。
在某些实施例中，以剂量单位(例如，片剂、胶囊、大丸剂等等)的形式施用药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含选自以下的范围内的剂量的在此提供的化合物：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg以及400mg至600mg。在某些实施例中，此类药物组合物包含以选自以下的剂量存在的在此提供的化合物：25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、270mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg、605mg、610mg、615mg、620mg、625mg、630mg、635mg、640mg、645mg、650mg、655mg、660mg、665mg、670mg、675mg、680mg、685mg、690mg、695mg、700mg、705mg、710mg、715mg、720mg、725mg、730mg、735mg、740mg、745mg、750mg、755mg、760mg、765mg、770mg、775mg、780mg、785mg、790mg、795mg以及800mg。在某些此类实施例中，药物组合物包含选自以下的剂量的在此提供的化合物：25mg、50mg、75mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、500mg、600mg、700mg以及800mg。
在某些实施例中，药物组合物包含在以下剂量下施用的在此提供的化合物：10mg/kg或更少、9mg/kg或更少、8mg/kg或更少、7.5mg/kg或更少、7mg/kg或更少、6.5mg/kg或更少、6mg/kg或更少、5.5mg/kg或更少、5mg/kg或更少、4.5mg/kg或更少、4mg/kg或更少、3.5mg/kg或更少、3mg/kg或更少、2.5mg/kg或更少、2mg/kg或更少、1.5mg/kg或更少、1mg/kg或更少、0.75mg/kg或更少、0.5mg/kg或更少、或0.25mg/kg或更少。
在某些实施例中，药剂是用适合的稀释剂(例如，注射用无菌水或注射用无菌盐水)复原的无菌冻干化合物。在稀释到盐水中之后，复原的产品以皮下注射或静脉内输注形式施用。冻干的药物产品由化合物组成，该化合物已在注射用水中或在注射用盐水中制备，在制备过程中用酸或碱调节至pH7.0-9.0，并且然后冻干。冻干的化合物可以是25mg至800mg的寡核苷酸。应当理解，这涵盖了25mg、50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、425mg、450mg、475mg、500mg、525mg、550mg、575mg、600mg、625mg、650mg、675mg、700mg、725mg、750mg、775mg以及800mg的修饰的冻干寡核苷酸。此外，在一些实施例中，冻干的化合物以在以下范围内的量存在：25mg至800mg、25mg至700mg、25mg至600mg、25mg至500mg、25mg至400mg、25mg至300mg、25mg至200mg、25mg至100mg、100mg至800mg、200mg至800mg、300mg至800mg、400mg至800mg、500mg至800mg、600mg至800mg、100mg至700mg、150mg至650mg、200mg至600mg、250mg至550mg、300mg至500mg、300mg至400mg、或400mg至600mg。冻干的药物产品可以被包装在2mL I型透明玻璃小瓶(经过硫酸铵处理的)中，用溴丁基橡胶封闭件塞住并且用铝
Figure BDA0000832350860000441
密封件密封。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含治疗有效量的化合物。在某些实施例中，该治疗有效量足以预防、缓解或改善疾病的症状或延长正治疗的受试者的存活期。确定治疗有效量完全处于本领域技术人员的能力之内。
在某些实施例中，在此提供的这些药物组合物可以另外包含其他本领域熟知用量的在药物组合物中常规存在的辅助组分。因此，例如这些组合物可以包含另外的、可相容的药物活性材料，例如像止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以包含对物理配制本发明的这些组合物的各种剂型有用的另外的材料，如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加此类材料时，它们不应当过度干扰本发明的这些组合物的组分的生物活性。可以对这些配制品进行灭菌并且必要时与助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的这个或这些寡核苷酸发生有害的相互作用。
脂质部分已用于各种方法中的核酸疗法中。在一个方法中，核酸被引入到预形成的脂质体或由阳离子性脂质与中性脂质的混合物制成的脂质复合物中。在另一个方法中，在没有中性脂质存在的情况下形成与单阳离子性脂质或聚阳离子性脂质的DNA复合物。在某些实施例中，选择脂质部分来增加药剂向特定细胞或组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分来增加药剂向脂肪组织的分布。在某些实施例中，选择脂质部分来增加药剂向肌肉组织的分布。
在某些实施例中，使用英脱利匹特(INTRALIPID)来制备包含寡核苷酸的药物组合物。英脱利匹特是制备用于静脉内施用的脂肪乳液。它由10％大豆油、1.2％蛋黄磷脂、2.25％甘油以及注射用水组成。另外，添加氢氧化钠以调节pH使得最终产品pH范围是6至8.9。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含聚胺化合物或与核酸复合的脂质部分。此类制备描述在PCT公布WO/2008/042973中，为了披露脂质制备该文献通过引用以其全部内容结合在此。某些另外的制备描述在埃克里克(Akinc)等人，自然生物技术(NatureBiotechnology)26，561-569(2008年5月1日)中，为了披露脂质制备，该参考文件通过引用以其全部内容结合在此。
在某些实施例中，在此提供的多种药物组合物包含一种或多种化合物和一种或多种赋形剂。在某些此类实施例中，赋形剂选自：水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素以及聚乙烯吡咯烷酮。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物使用已知的技术，包括但不限于混合、溶解、造粒、制糖丸、粉碎、乳化、囊封、截留或压片工艺来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物是液体(例如，混悬液、酏剂和/或溶液)。在某些此类实施例中，液体药物组合物使用本领域已知的成分，包括但不限于水、二醇、油、醇、芳香剂、防腐剂以及着色剂来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物是固体(例如，散剂、片剂和/或胶囊)。在某些此类实施例中，包含一种或多种寡核苷酸的固体药物组合物使用本领域已知的成分，包括但不限于淀粉、糖、稀释剂、粒化剂、润滑剂、粘合剂以及崩解剂来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物被配制成储积型(depot)制剂。某些此类储积型制剂典型地比非储积型制剂作用更长。在某些实施例中，此类制剂通过植入(例如，皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。在某些实施例中，储积型制剂使用适合的聚合材料或疏水材料(例如，可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或作为微溶性衍生物(例如作为微溶性盐)来制备。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含递送系统。递送系统的实例包括但不限于脂质体和乳液。某些递送系统适用于制备某些药物组合物，包括包含疏水化合物的那些组合物。在某些实施例中，使用了某些有机溶剂，如二甲亚砜。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含被设计成将在此提供的一种或多种化合物递送至特定组织或细胞类型的一种或多种组织特异性递送分子。例如，在某些实施例中，药物组合物包括涂有组织特异性抗体的脂质体。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含共溶剂系统。某些此类共溶剂系统包含例如苯甲醇、非极性表面活性剂、水不可混溶的有机聚合物以及水相。在某些实施例中，此类共溶剂系统用于疏水化合物。这种共溶剂系统的一个非限制性实例是VPD共溶剂系统，该VPD共溶剂系统是包含3％w/v苯甲醇、8％w/v非极性表面活性剂聚山梨醇酯80TM和65％w/v聚乙二醇300的无水乙醇溶液。此类共溶剂系统中的比例可以在不显著改变它们的溶解性和毒性特征的情况下大幅度改变。此外，共溶剂组分的特性可以改变：例如，可以使用其他表面活性剂代替聚山梨醇酯80TM；聚乙二醇的部分大小可以改变；其他生物可相容聚合物可以代替聚乙二醇，例如聚乙烯吡咯烷酮；并且其他糖或多糖可以取代葡萄糖。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物包含持续释放系统。这种持续释放系统的一个非限制性实例是固体疏水聚合物的半渗透基质。在某些实施例中，持续释放系统可以取决于它们的化学性质在数小时、数天、数周或数月的时间里释放药剂。
在某些实施例中，在此提供的药物组合物被制备用于口服施用。在某些此类实施例中，药物组合物通过将包含修饰的寡核苷酸的一种或多种化合物与一种或多种药学上可接受的载剂组合来配制。某些此类载剂能够使药物组合物配制成用于由受试者口服摄入的片剂、大丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、混悬剂等。在某些实施例中，用于口服使用的药物组合物通过将寡核苷酸与一种或多种固体赋形剂混合来获得。适合的赋形剂包括但不限于：填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如像玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。在某些实施例中，任选地研磨这种混合物并且任选地添加助剂。在某些实施例中，使药物组合物成形以获得片剂或糖衣丸芯。在某些实施例中，添加崩解剂(例如，交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，如海藻酸钠)。
在某些实施例中，糖衣丸芯具有涂层。在某些此类实施例中，可以使用浓缩的糖溶液，这些浓缩的糖溶液可以任选地包含阿拉伯胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液以及适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或糖衣丸涂层中。
在某些实施例中，用于口服施用的药物组合物是由明胶制成的推入配合胶囊。某些此类推入配合胶囊包含与一种或多种填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或乳化剂如滑石或硬脂酸镁以及任选地稳定剂相混合的本发明的一种或多种药剂。在某些实施例中，用于口服施用的药物组合物是由明胶和增塑剂(如甘油或山梨醇)制成的软密封胶囊。在某些软胶囊中，本发明的一种或多种药剂被溶解或悬浮在适合的液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。另外，可以添加稳定剂。
在某些实施例中，药物组合物被制备用于经颊施用。某些此类药物组合物是以常规方式配制的片剂或锭剂。
在某些实施例中，药物组合物被制备用于通过注射(例如，静脉内、皮下、肌肉内等)来施用。在某些此类实施例中，药物组合物包含载剂并且被配制在水溶液中，如水或生理上相容的缓冲液如汉克斯溶液(Hanks's solution)、林格氏溶液(Ringer's solution)或生理盐水缓冲液。在某些实施例中，包括其他成分(例如，帮助溶解或充当防腐剂的成分)。在某些实施例中，使用适当的液体载剂、悬浮剂等来制备可注射混悬液。某些注射用药物组合物以单位剂型存在，例如在安瓿中或在多剂量容器中。某些注射用药物组合物是油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液，并且可以包含配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。适合用于注射用药物组合物的某些溶剂包括但不限于：亲脂性溶剂和脂肪油，如芝麻油；合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；以及脂质体。水性注射混悬液可以包含增加该混悬液的粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，此类混悬液还可以包含适合的稳定剂或增加药剂溶解性以允许制备高浓度溶液的药剂。
在某些实施例中，药物组合物被制备用于透粘膜施用。在某些此类实施例中，在配制品中使用了适合于透过屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本领域中已知的。
在某些实施例中，在此提供的一种或多种修饰的寡核苷酸以前药形式施用。在某些实施例中，当体内施用时，前药以化学或酶促方式转化为寡核苷酸的生物学上、药学上或治疗上更有活性的形式。在某些实施例中，前药是有用的，因为它们比对应的活性形式更容易施用。例如，在某些情况下，前药可以是比对应的活性形式更具有可生物利用性(例如，通过口服施用)。在某些实施例中，前药具有优良的跨细胞膜传输。在某些实施例中，前药有利于修饰的寡核苷酸递送至所希望的细胞类型、组织或器官。在某些实施例中，前药是包含缀合的修饰的寡核苷酸的化合物。在某些实施例中，与对应的活性形式相比，前药可以具有提高的溶解性。在某些实施例中，前药比对应的活性形式的水溶性小。在某些实施例中，前药是酯。在某些此类实施例中，当施用时，该酯被代谢水解成羧酸。在某些情况下，含有羧酸的化合物是对应的活性形式。在某些实施例中，前药包含结合至酸基团的短肽(聚氨基酸)。在某些此类实施例中，当施用时，该肽裂解以形成对应的活性形式。
在某些实施例中，通过修饰药物活性化合物以使得该活性化合物在体内施用时将再生来产生前药。该前药可以被设计成改变药物的代谢稳定性或转运特征，掩蔽副作用或毒性，改进药物的香味和/或改变药物的其他特征或特性。凭借体内的药物动力学过程和药物代谢的知识，本领域技术人员一旦已知药物活性化合物，就可以设计该化合物的前药(参见，例如诺甘地(Nogrady)(1985)药物化学A生物化学方法(Medicinal Chemistry ABiochemical Approach)，牛津大学出版，纽约，第388-392页)。在某些实施例中，前药是包含连接至缀合的部分上的修饰的寡核苷酸的化合物，连接的方式允许在体内施用时该缀合部分裂解和该修饰的寡核苷酸再生。包含连接至可裂解的缀合部分的修饰的寡核苷酸的化合物(例如像在此描述的具有结构B、C、D、(I)或(II)的化合物)在体内施用时，可以释放未缀合形式的该修饰的寡核苷酸。
某些施用途径
在某些实施例中，向受试者施用包括肠胃外施用。在某些实施例中，向受试者施用包括静脉内施用。在某些实施例中，向受试者施用包括皮下施用。
在某些实施例中，向受试者施用包括动脉内、肺部、口服、直肠、透粘膜、肠内、小肠内、局部、透皮、栓剂、鞘内、心室内、腹膜内、鼻内、眼内、肌肉内、髓内以及瘤内施用。
某些另外的疗法
对于与靶RNA相关的疾病的治疗可以包括多于一种疗法。因此，在某些实施例中，在此提供了用于治疗患有或怀疑患有与靶RNA相关的疾病的受试者的方法，这些方法包括除了施用GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸以外，还施用至少一种疗法。
在某些实施例中，该至少一种另外的疗法包含药剂。
在某些实施例中，药剂包括抗炎剂。在某些实施例中，抗炎剂是类固醇抗炎剂。在某些实施例中，类固醇抗炎剂是皮质类固醇。在某些实施例中，皮质类固醇是强的松(prednisone)。在某些实施例中，抗炎剂是非类固醇抗炎药物。在某些实施例中，非类固醇抗炎剂是布洛芬(ibuprofen)、COX-I抑制剂或COX-2抑制剂。
在某些实施例中，药剂包括但不限于：利尿剂(例如螺内酯(sprionolactone)、依普利酮(eplerenone)、利尿磺胺)、正性肌力药(例如多巴酚丁胺、米力农(milrinone))、地高辛(digoxin)、血管扩张剂、血管紧张素II转换酶(ACE)抑制剂(例如是卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、赖诺普利(lisinopril)、贝那普利(benazepril)、喹那普利(quinapril)、福辛普利(fosinopril)以及雷米普利(ramipril))、血管紧张素II受体阻断剂(ARB)(例如坎地沙坦(candesartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、奥美沙坦(olmesartan)、氯沙坦(losartan)、缬沙坦(valsartan)、替米沙坦(telmisartan)、依普罗沙坦(eprosartan))、钙通道阻断剂、硝酸异山梨酯、肼屈嗪、硝酸酯类(例如单硝酸异山梨酯、硝酸异山梨酯)、肼屈嗪、β-阻断剂(例如卡维地洛(carvedilol)、美托洛尔(metoprolol))以及利钠肽(例如奈西立肽)。
在某些实施例中，药剂包括类肝素。在某些实施例中，类肝素是戊聚糖多硫酸酯。
在某些实施例中，另外的疗法可以是增强身体免疫系统的药剂，包括低剂量环磷酰胺、胸腺刺激素、维生素和营养补充剂(例如，抗氧化剂，包括维生素A、维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、锌、硒、谷胱甘肽、辅酶Q-10以及松果菊)以及疫苗，例如包含组合多聚体形式的抗原和佐剂的疫苗配制品的免疫刺激性复合物(ISCOM)。
在某些实施例中，选择该另外的疗法来治疗或改善本发明的一种或多种药物组合物的副作用。此类副作用包括但不限于：注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常以及肌病。例如，血清中的转氨酶水平增加可以表明肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以表明肝毒性或肝功能异常。
另外的药剂的其他实例包括但不限于：免疫球蛋白，包括但不限于静脉内免疫球蛋白(IVIg)；镇痛剂(例如，对乙酰氨基酚)；水杨酸盐；抗生素；抗病毒剂；抗真菌剂；肾上腺素能调节剂；激素(例如，合成代谢类固醇、雄激素、雌激素、降钙素、孕激素、生长抑素(somatostan)以及甲状腺激素)；免疫调节剂；肌肉松弛剂；抗组胺剂；骨质疏松剂(例如，双膦酸盐、降钙素和雌激素)；前列腺素；抗肿瘤剂；心理治疗剂；镇静剂；毒橡树或毒漆树产物；抗体；以及疫苗。
某些试剂盒
在此提供的任何化合物可以存在于试剂盒中。该试剂盒还可以包含关于使用在此提供的化合物的说明书。在一些实施例中，在此提供的化合物可以存在于小瓶内。在例如分配包装中可以存在多个小瓶，如10个。在一些实施例中，小瓶制造成注射器可接近。
在一些实施例中，这些试剂盒可以用于向受试者施用在此提供的化合物。在此类情况下，除了在此提供的化合物以外，该试剂盒可以进一步包括以下中的一个或多个：注射器、酒精棉签、棉球和/或纱布垫。在一些实施例中，这些化合物可以存在于预填充注射器(如具有例如带针保护器的27号、1/2英寸针头的单次剂量注射器)中，而不是小瓶中。在例如分配包装中可以存在多个预填充注射器，如10个。该试剂盒还可以包含关于施用这些化合物的说明书。
某些定量测定
可以通过本领域中已知的各种方法来评价修饰的寡核苷酸对它的靶RNA的活性的作用。在某些实施例中，这些方法用来定量体外或体内细胞或组织中的微小RNA水平。
在某些实施例中，通过微阵列分析来测量靶标水平和/或活性的变化。在某些实施例中，通过若干商业上可获得的PCR测定之一如
Figure BDA0000832350860000501
微小RNA测定(应用生物系统)来测量靶标水平和/或活性的变化。
可以使用荧光素酶细胞培养测定来评价抗miR化合物的体外活性。在这个测定中，微小RNA荧光素酶传感器构建体被工程改造成包含相关微小RNA的一个或多个结合位点以及荧光素酶基因。当微小RNA结合荧光素酶传感器构建体中它的同源位点时，荧光素酶表达被压制。当将适当的抗miR引入到细胞中时，它结合靶微小RNA并且解除荧光素酶表达的压制。因此，在这个测定中，作为相关抗miR的有效抑制剂的抗miR将引起荧光素酶表达增加。
可以通过测量微小RNA的靶标的mRNA和/或蛋白质水平来评价抗miR化合物的活性。微小RNA在一个或多个靶RNA内结合它的同源位点，导致压制靶RNA，因此抑制该微小RNA引起该微小RNA的靶标的mRNA和/或蛋白质的水平增加(即，去阻抑)。可以在体内或体外测量一个或多个靶RNA的去阻抑。
实例
提出以下实例以便更完全地说明本发明的一些实施例。然而，这些实例决不应当解释为对本发明的宽泛范围的限制。
本领域普通技术人员将易于在不背离本发明的精神的情况下，采用本发现的基本原理来设计各种化合物。
实例1：缀合的修饰的寡核苷酸
通过将图2中的结构缀合至表A中示出的修饰的寡核苷酸的3’末端上来形成含GalNAc的化合物。糖部分、核苷间键联以及核碱基指明如下：上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；后面有下标“L”的核苷是LNA核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
表A：未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸
Figure BDA0000832350860000511
评价该GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸的体内效力，全长未缀合的修饰的寡核苷酸的释放以及肝脏和组织浓度。
为了确定体内效力，针对这些化合物使通常被miR-122活性压制的基因，即脏醛缩酶A(ALDOA)的表达去阻抑的能力，对它们进行评估。抑制miR-122导致ALDOA表达增加，因此ALDOA mRNA水平可以用来测量体内的miR-122抑制活性。向小鼠施用化合物，并且通过定量PCR测量从肝脏中分离出的RNA中的ALDOA mRNA水平。相对于盐水，计算ALDOA mRNA的倍数变化以确定体内效力。
如在图3A和3B中所示，在表A中示出的每个GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸比对应的未缀合的修饰的寡核苷酸更有效。相对于未缀合的38128和38577，化合物38856和38853展现出效力增加大约10倍。
还测试了在表B中示出的含LNA的未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸。
表B：含LNA的化合物
Figure BDA0000832350860000521
糖部分和键部分指明如下：其中后面没有下标的核苷表明β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“L”的核苷表明LNA核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
根据与以上所述相同的方案测试化合物38848和38852的体内效力，以评估这些化合物抑制miR-122活性和增加ALDOA表达的能力。如在图4A中所示，虽然每种化合物均是miR-122的有效抑制剂，但是GalNAc缀合的化合物38852展现出比未缀合的化合物38848更大的效力。
根据与以上所述相同的方案测试化合物38632的体内效力，以评估该化合物抑制miR-122活性和增加ALDOA表达的能力。如在图4B中所示，虽然每种化合物均是miR-122的有效抑制剂，但是GalNAc缀合的化合物38632展现出比未缀合的化合物38848和缀合的化合物38852这两者更大的效力。在这个实验中，38848的ED50是4.24mg/kg，并且38632的ED50是0.31mg/kg，证明了效力提高至少20倍。
通过将图2中的结构缀合至38649修饰的寡核苷酸的3’末端上来制得另外的含GalNAc的化合物。修饰的寡核苷酸38649具有结构AE MeCEAE MeCE MeCEAETETGUSCSACSACSTCSCS(SEQID NO:5)，其中上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-MOE核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
该含GalNAc的部分与38649的3’-末端之间的键有所不同，如在表C中所示。例如，在化合物38368中，该含GalNAc的部分通过磷酸二酯键直接连接至38649的3’-末端核苷上，如在图2C中所示，其中X是磷酸二酯键并且MO是38649。在化合物38458中，该含GalNAc的部分通过β-D-脱氧核苷连接至38649的3’-末端核苷上，其中在38649的3’-末端核苷之间具有硫代磷酸酯键并且在该β-D-脱氧核苷与该含GalNAc的部分之间具有磷酸二酯键，如在图2A中所示，其中X2是硫代磷酸酯键，m是1，Nm是β-D-脱氧核苷，X1是磷酸二酯键，并且MO是38649。
表C：含GalNAc的化合物
Figure BDA0000832350860000531
如在图5A、5B和5C中所示，表C中的这三种GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸中的每一种都比未缀合的修饰的寡核苷酸更有效。相对于未缀合的38649，化合物38368和38371展现出效力增加大约3倍(图5A)。化合物38458和38459(每种化合物均具有β-D-脱氧核糖核苷连接基团)展现出效力增加至少10倍(图5B)。化合物38597和38598(每种化合物均具有2’-糖修饰的连接基团)也展现出效力增加至少10倍(图5C)。在另外的研究中，针对化合物38459、38458、38597和38598，已观察到效力增加高达20倍。
还测量了在1mg/kg和3mg/kg剂量下单次皮下给予化合物38368和38371以及在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg剂量下单次皮下给予化合物38458和38459第7天后的肝脏和肾脏组织中的未缀合的修饰的寡核苷酸的量。对每个样品进行高效液相色谱法-飞行时间质谱法(HPLC-TOF MS)以测量寡核苷酸长度和量。由这种方法定量的下限(LLOQ)是0.2μg/g至1.0μg/g。
发现这些GalNAc缀合的修饰的寡核苷酸具有不同的未缀合的修饰的寡核苷酸的形成速率。例如，在施用化合物38368之后，在肝脏中检测到小于10％的化合物38649(未缀合的修饰的寡核苷酸)。在施用化合物38371之后，在化合物38371的任一剂量下，在肝脏中都检测不到化合物38649。相反地，在皮下施用化合物38459七天后，仅检测到的未缀合的修饰的寡核苷酸种类是未缀合的38649；未检测到母体化合物38459。在施用化合物38458之后，检测到两种形式的未缀合的修饰的寡核苷酸：38649以及38649-PO-A(化合物38458的一种代谢物)。在高于未缀合的38649的水平处检测到这种代谢物。
还测量了在0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg剂量下单次皮下给予化合物38458和38459之后24小时肝脏中的未缀合的修饰的寡核苷酸的量。通过LC-TOF测量抗miR水平。由这种方法定量的下限(LLOQ)是0.2μg/g至1.0μg/g。观察到在施用化合物38459之后，存在于肝脏中的总化合物的90％是未缀合的化合物38649。在施用38458之后，存在于肝脏中的总化合物的大约46％是未缀合的化合物38649。因此，未缀合的化合物38649从化合物38459的释放比从化合物38458的释放快。
寡核苷酸一般在肾脏组织中的积累水平最高，接着是肝脏组织。关于未缀合的化合物，为了确定GalNAc缀合物相比于肾脏组织是否改变了化合物在肝脏组织中的积累，还测量了肾脏组织中未缀合的38649的量。如上所述，在施用化合物38459之后，在肝脏中发现的总化合物的100％都是未缀合的38649，这表明38649从该GalNAc缀合的化合物38459中完全释放。在施用化合物38459之后，相对于施用化合物38649之后的化合物38649的积累，相对于肝脏，化合物38649在肾脏中积累更少(即展现出更低的肾脏:肝脏比率)。因此，与未缀合的38649相比，38459可以优先将化合物38649递送至肝脏，同时使向肾脏的递送减至最少。
在体内研究中评估了化合物38459的作用的起效和持续时间。给予各组小鼠0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的化合物38459的单次皮下(SC)剂量。在10mg/kg的剂量下向另外一组小鼠施用未缀合的化合物38649。来自每种处理的一组动物在第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第14天、第21天、第28天和第56天的每一天被处死。从肝脏中分离出RNA，并且通过实时PCR测量ALDOA mRNA水平。计算每组的平均ALDOA水平。相对于对照组(PBS-处理的)的倍数变化在表D中示出。
表D：化合物38459的作用的起效和持续时间
Figure BDA0000832350860000541
Figure BDA0000832350860000551
表D中的数据证明化合物38459以及化合物38649具有快速的作用起效，如通过早在单次剂量的化合物后1天的ALDOA去阻抑所证实。另外，在单次给予化合物之后，ALDOA去阻抑维持至少8周。
这些数据证明：效力比未缀合的38649化合物高至少10倍的GalNAc缀合的化合物38459在显著更低的肝脏组织浓度下即可实现这种效力，其中优先递送至肝脏组织。另外，化合物38459展现出快速的作用起效和至少8周的作用持续时间。
实例2：缀合的较短修饰寡核苷酸
通过将图2中的结构缀合至表E中示出的修饰的寡核苷酸的3’末端上来形成含GalNAc的化合物。糖部分、核苷间键联以及核碱基指明如下：后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
表E：未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸
Figure BDA0000832350860000552
为了确定体内效力，评估这些化合物使肝脏醛缩酶A(ALDOA)的表达去阻抑的能力。向小鼠施用化合物，并且通过定量PCR测量从肝脏中分离出的RNA中的ALDOA mRNA水平。相对于盐水，计算ALDOA mRNA的倍数变化以确定体内效力(图6A和6B以及图7A和7B)。从那些实验的结果中计算的ED50(ALDOA去阻抑是最大值的50％的化合物浓度)和ED90(ALDOA去阻抑是最大值的90％的化合物浓度)在表F和表G中示出。
表F：缀合和未缀合的抗miR-122化合物的体内效力
Figure BDA0000832350860000561
表G：缀合和未缀合的抗miR-122化合物的体内效力
Figure BDA0000832350860000562
如在表F中所示，根据本发明的GalNAc缀合使8聚体抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少100倍。如在表G中所示，根据本发明的GalNAc缀合使13聚体抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少10倍。
还确定了化合物38634和38998对另一种miR-122靶基因CD320的去阻抑。结果类似于针对在表F中示出的ALDOA所获得的结果：根据本发明的GalNAc缀合分别使实验1和实验2中的ED50提高343倍和272倍，并且分别使实验1和实验2中的ED90提高492倍和545倍。
在此描述的GalNAc缀合还提高了针对包含GalNAc的这些化合物所观察到的胆固醇下降效力。来自实验1的示例性结果在图8A和8B中示出。作为GalNAc缀合物的化合物38633和38634比缺乏GalNAc的化合物38591和38998更有效。针对实验2获得类似结果(数据未示出)。
实例3：缀合的RNA酶H修饰的寡核苷酸
在此描述的GalNAc缀合还提高了靶向蛋白质编码RNA的修饰的寡核苷酸的效力。所测试的该寡核苷酸是靶向PTEN mRNA的5-10-52’-MOE修饰的‘缺口体’。该缺口体修饰的寡核苷酸与PTEN mRNA杂交导致该mRNA被RNA酶H裂解，从而降低PTEN mRNA的水平。通过化合物降低PTEN mRNA的水平的能力来评估该化合物的效力。
通过将图2中的结构缀合至表H中所示的修饰的寡核苷酸的3’末端上来形成含GalNAc的化合物。
表H：未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸
Figure BDA0000832350860000571
糖部分、核苷间键联以及核碱基指明如下：上标“Me”表明5-甲基胞嘧啶；后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“E”的核苷是2’-O-甲氧基乙基核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联。
在1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量下，向小鼠皮下施用单次剂量的未缀合的化合物(n＝3)。在0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的剂量下，向小鼠皮下施用单次剂量的缀合的化合物(n＝6)。施用后两天，终止研究，并且从由每只动物中收集的肝脏组织中萃取RNA。进行定量PCR以测量PTEN mRNA的水平。如在表I中所示，化合物38631在测试的任何3个剂量下都不会显著减少PTEN mRNA。然而，在3mg/kg和10mg/kg的剂量下，含GalNAc的化合物显著减少PTEN mRNA。
表I：缀合和未缀合的PTEN修饰的寡核苷酸的体内效力
Figure BDA0000832350860000572
实例4：缀合的修饰的寡核苷酸
将抗miR-21修饰的寡核苷酸缀合至含GalNAc的部分上，以确定该缀合是否将提高这些寡核苷酸的效力。
通过将图1中的结构缀合至36731修饰的寡核苷酸的3’末端上来形成含GalNAc的化合物。在化合物40601中，该含GalNAc的部分通过β-D-脱氧核苷连接至36731的3’-末端核苷上，其中在36731的3’-末端核苷之间具有磷酸二酯(PO)键并且在该β-D-脱氧核苷(β-D-脱氧腺苷(A))与该含GalNAc的部分之间具有磷酸二酯(PO)键，如在图2A中所示，其中X2是磷酸二酯键，m是1，Nm是β-D-脱氧核苷(A)，X1是磷酸二酯键，并且MO是化合物36731。在化合物40379中，该含GalNAc的部分通过在36731的3’-末端核苷与该含GalNAc的部分之间的磷酸二酯(PO)键连接至36731的3’-末端核苷上，如在图2C中所示，其中X是磷酸二酯键，并且MO是化合物36731。
40601：AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-PO-A-PO-GalNAc(SEQ ID NO:8)
40379：AECSAETECSAEGETECSTGAUSAAGCSUSAS-PO-GalNAc(SEQ ID NO:8)
在三至五只野生型C7/Bl6小鼠中单次皮下给予化合物之后48小时和168小时，测量36731和40601的肝脏浓度。在1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下施用36731的修饰的寡核苷酸部分，并且在0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下施用40601。对每个样品进行液相色谱法串联质谱法(LC-MS/MS)以测量寡核苷酸长度和量。如在表J和图9A中所示，在这两个时间点，施用40601之后修饰的寡核苷酸的肝脏浓度比施用类似剂量的36731之后显著更高。在图9A和表J中示出的每个40601浓度是由LC-MS/MS检测的所有含修饰的寡核苷酸的物种的总浓度。缀合修饰的寡核苷酸引起肝脏中的化合物与剂量成比例增加。
还评估了40601释放修饰的寡核苷酸36731的代谢作用。发现在单次皮下施用化合物40601之后48小时，由LC-MS/MS鉴定的主要物种是36731。表J和表9B示出在单次皮下施用化合物36731或化合物40601之后在小鼠肝脏中的修饰的寡核苷酸36731的浓度。表J示出在施用40601之后在小鼠肝脏中检测到的36731物种的百分比(CV％＝变异系数)。
表J：在单次SC剂量之后在小鼠肝脏中的36731和40601的浓度
Figure BDA0000832350860000581
Figure BDA0000832350860000591
在五只野生型C7/Bl6小鼠中单次皮下给予化合物之后48小时和168小时，还测量了40379的肝脏浓度。在0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg下施用该化合物。对每个样品进行液相色谱法串联质谱法(LC-MS/MS)以测量寡核苷酸长度和量。如针对化合物40601所观察，在这两个时间点，施用40379之后化合物的肝脏浓度比施用类似剂量的36731之后显著更高。缀合修饰的寡核苷酸引起肝脏中的化合物与剂量成比例增加。还评估了40379释放修饰的寡核苷酸36731的代谢作用。发现在单次皮下施用化合物40601之后48小时，存在化合物36371，但是相对于在施用化合物40379后存在的化合物36371的量处于较低的浓度(数据未示出)。然而，在48小时或168小时之后至少50％的化合物40601以化合物36731形式存在，大约15％至30％的化合物40379以化合物36731形式存在。因此，虽然化合物40379确实经历了引起未缀合的化合物36731的释放的一些代谢作用，但是未缀合的化合物的释放小于关于化合物40601所观察到的释放。这些数据表明PO-A-PO接头的存在促进了未缀合的修饰的寡核苷酸从含GalNAc的化合物中释放。
为了评价抑制miR-21对已知的mRNA靶标的作用，在向野生型小鼠施用单次剂量的36731(1mg/kg和10mg/kg)或单次剂量的40601(0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg)之后测量正常小鼠肝脏中的SPG20、Rnf167和Taf7的去阻抑。在施用之后4天或7天收集肝脏。如在表K中所示，在单次给予36731之后七天观察到SPG20和Taf7的适度靶基因去阻抑，而Rnf167在最高剂量下在这两个时间点去阻抑。单次剂量施用40601表明在这两个时间点SPG20和Taf7两者的靶去阻抑提高和类似的Rnf167去阻抑。提高的靶去阻抑包括靶基因表达更大的倍数变化和去阻抑更早起效。
表K：在施用36731或40601后正常肝脏中的miR-21靶基因的去阻抑
Figure BDA0000832350860000601
在用来对小鼠中的肝细胞癌(HCC)进行建模的肝脏特异性强力霉素调节的致癌基因表达系统中，评估抗miR-21化合物的递送和功效。在这个模型中，转基因小鼠在强力霉素可阻抑的肝脏特异性启动子(Tet-o-H-rasG12V；LAP-TTA；参见例如林(Lim)等人，肝病学(Hepatology)，2013)的控制下表达致癌基因H-rasG12V。当去除强力霉素时，在肝脏中激活H-rasG12V转基因表达并且小鼠发展肝脏肿瘤。已证实，在去除强力霉素后至少6周，GalNAc受体ASGR1和ASGR2的表达仍保持高水平，而miR-21表达随着形态上可检测的疾病发作而增加(数据未示出)。
为了证明化合物40601和36731向肝脏肿瘤的递送，在去除强力霉素之后4周向小鼠施用这些化合物，到这个时候小鼠具有显著的肿瘤负荷。在每组五只小鼠中两次给予化合物之后，在168小时测量肝脏肿瘤组织(包含肿瘤的整个肝脏)中的36731和40601的浓度。在0小时给予第一剂量，在72小时给予第二剂量并且在168小时收集肿瘤组织。在10mg/kg下施用化合物36731，而在0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg下施用化合物40601。如在表L中所示，与36731相比，40601达到的总药物水平是80％以上。从化合物40601上释放的36731修饰的寡核苷酸在总量的44％与70％之间。
表L：在施用后小鼠肝脏肿瘤组织中的36731和40601的定量
Figure BDA0000832350860000602
Figure BDA0000832350860000611
还在肝脏肿瘤组织中评估了在正常肝脏中评估的三种miR-21靶基因的靶去阻抑。虽然没有达到统计显著性，但是与媒介物相比在处理的肝脏肿瘤组织中存在趋向去阻抑的趋势。表M示出在施用化合物40601或化合物36731之后肝脏肿瘤组织中的SPG21、Rnf167和Taf7的去阻抑。
表M：在施用36731或40601后肝脏肿瘤组织中的miR-21靶基因的去阻抑
Figure BDA0000832350860000612
另外，在施用化合物40601或化合物36731后评估肝脏肿瘤组织中的AFP水平。在接受两周一次剂量的10mg/kg 40601的小鼠中存在趋向AFP水平降低的趋势。
接下来，在Tet-o-H-rasG12V；LAP-TTA转基因小鼠中测试化合物40601和36731的功效。通过从6周龄雄性小鼠中去除强力霉素来引发肿瘤发展。在去除强力霉素两周之后，将小鼠分成5个治疗组：媒介物3673125mg/kg两周一次(BIW)，4060125mg/kg BIW，4060125mg/kg每周一次(Q7D)以及406015mg/kg BIW。对小鼠处理4周。肝脏形态(斑杂外观)用作肿瘤形成的指示，并且在研究结束时由对治疗组一无所知的调查者来评分。如在表N中所示，媒介物组中的大多数(6/8)动物具有斑杂肝脏，而在25mg/kg36731BIW组中的大约一半(5/9)动物具有斑杂肝脏。在化合物40601的这些BIW施用组中看到斑杂外观发生率极大地减小，其中25mg/kg 40601BIW组中3/8和5mg/kg 40601BIW组中2/8显示斑杂肝脏。每周一次施用25mg/kg 40601产生与媒介物类似的斑杂外观频率(8/10)。
表N：在施用36731或40601后转基因小鼠中的斑杂肝脏的发生率
化合物 剂量 小鼠总数 #斑杂肝脏 #无斑杂肝脏
媒介物 8 6 2
36731 25mg/kg BIW 9 5 4
40601 5mg/kg BIW 8 2 6
40601 25mg/kg BIW 8 3 5
40601 25mg/kg Q7D 10 8 2
在研究结束时，通过蛋白质印迹分析根据样品中的肝脏肿瘤的标记物对肝脏肿瘤组织AFP进行评价，根据β-肌动蛋白进行归一化。如在表O中所示，用25mg/kg 40601BIW处理使AFP显著降低。
表O：在施用36731或40601后转基因小鼠的肝脏肿瘤中的AFP水平
处理 剂量 频率 AFP平均值
媒介物 0.09
36731 25mg/kg BIW 0.08
40601 25mg/kg BIW 0.03
40601 5mg/kg BIW 0.06
40601 25mg/kg Q7D 0.07
在转基因小鼠的肝脏肿瘤组织中评价36731或40601施用后的靶去阻抑。如在表P中所示，在研究结束时SPG20和Rnf167转录物在来自36731和40601BIW施用组的样品中去阻抑。还评估了Taf7，但没有显示一致的去阻抑(数据未示出)。
表P：在施用36731或40601后转基因小鼠的肝脏肿瘤中的SPG20和Rnf167靶去阻抑
处理 剂量 频率 SPG20平均值 Rnf167平均值
媒介物 1.00 1.00
36731 25mg/kg BIW 1.75 2.01
40601 25mg/kg BIW 1.59 2.44
40601 5mg/kg BIW 1.51 2.09
40601 25mg/kg Q7D 1.33 1.78
最后，在研究结束时评估肿瘤药物浓度。如在表Q中所示，36731和总40601达成相当的水平。从40601中释放36731修饰的寡核苷酸在所有三个剂量是总量的大约50％。
表Q：在施用后肝脏肿瘤组织中的36731和40601的定量
Figure BDA0000832350860000621
Figure BDA0000832350860000631
为了评估是否存在对更晚期疾病开始处理的效力参数的影响，开始了具有可比设计的研究，除了在去除强力霉素之后4周开始处理并且仅对小鼠处理三周以外。在这个实验中，不包括每周一次给药组。在研究结束时测量AFP和靶基因评价。观察到在40601，25mg/kgBIW的高剂量组中存在趋向AFP水平降低的趋势(数据未示出)。在这些治疗组中还观察到靶接合，在25mg/kg的36731和40601下Taf7达到统计显著性(数据未示出)。
如在此所证明，将修饰的寡核苷酸缀合至含GalNAc的部分上引起该寡核苷酸的效力提高。可以通过核苷连接基团将该含GalNAc的部分连接至修饰的寡核苷酸上来进一步提高效力，例如在图2A和2B中所示。另外，使用核苷连接基团使得未缀合的修饰的寡核苷酸从缀合的结构中更完全释放。
实例5：缀合的较短修饰寡核苷酸
通过将胆固醇缀合至在表R中示出的修饰的寡核苷酸的3’末端上来形成含胆固醇的化合物。糖部分、核苷间键联以及核碱基指明如下：后面没有下标的核苷是β-D-脱氧核糖核苷；后面有下标“S”的核苷是S-cEt核苷；并且每个核苷间键联都是硫代磷酸酯核苷间键联，除了由下标(O)指示的核苷间键联以外，这些核苷间键联是磷酸二酯键。
表R：未缀合和缀合的修饰的寡核苷酸
Figure BDA0000832350860000632
Figure BDA0000832350860000641
为了确定体内效力，评估这些化合物使肝脏醛缩酶A(ALDOA)的表达去阻抑的能力。向小鼠施用化合物，并且通过定量PCR测量从肝脏中分离出的RNA中的ALDOA mRNA水平。相对于盐水，计算ALDOA mRNA的倍数变化以确定体内效力。从那些实验的结果中计算的ED50(ALDOA去阻抑是最大值的50％的化合物浓度)和ED90(ALDOA去阻抑是最大值的90％的化合物浓度)在表S中示出。
表S：缀合和未缀合的抗miR-122化合物的体内效力
Figure BDA0000832350860000642
如在表S中所示，根据本发明的胆固醇缀合使8聚体抗miR-122化合物的ED50和ED90提高至少30倍。
还确定了化合物38070和38998对另一种miR-122靶基因CD320的去阻抑。结果类似于针对ALDOA所获得的结果(数据未示出)。
在此描述的胆固醇缀合还提高了胆固醇下降效力。在测试的大多数浓度下，化合物38070使胆固醇降低的程度比相同浓度的化合物38998大(数据未示出)。
除了在此描述的那些修改之外，本发明的各种修改将因前述说明而对本领域的技术人员变得清楚。意欲此类修改也处于所附权利要求书的范围之内。本申请中引用的每个参考文件(包括，但不限于杂志文章、美国专利和非美国专利、专利申请公布、国际专利申请公布、
Figure BDA0000832350860000651
保藏编号等)通过引用以其全部内容明确结合在此。
Figure IDA0000832350900000011
Figure IDA0000832350900000021
Figure IDA0000832350900000031

Claims (20)

1.一种化合物，其具有以下结构：
Figure FDF0000013495140000011
其中Nm的每个N是未修饰的核苷并且m是1；X1和X2各自是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由8至25个连接的核苷组成且包含具有cEt修饰的糖部分的至少一个核苷，且其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与微小RNA互补。
2.如权利要求1所述的化合物，其中Nm的每个N都独立地包含β-D-核糖或β-D-脱氧核糖。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其中至少一个N包含嘌呤核碱基，其中该嘌呤核碱基选自：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。
4.如权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸与第二修饰的寡核苷酸杂交，其中该第二修饰的寡核苷酸的核碱基序列与该修饰的寡核苷酸的核碱基序列互补。
5.如权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与所述微小RNA的核碱基序列至少90％相同。
6.如权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中该微小RNA是人微小RNA。
7.如权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸由12至25个、15至25个、15至22个或17至22个连接的核苷组成。
8.如权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸包含具有修饰的糖部分的至少一个核苷。
9.如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷都包含修饰的糖部分。
10.如权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸包含具有修饰的糖部分的多个核苷和具有未修饰的糖部分的多个核苷。
11.如权利要求8至10中任一项所述的化合物，其中每个修饰的糖部分独立地选自：2’-O-甲基糖部分、2’-O-甲氧基乙基糖部分、2’-氟糖部分以及双环糖部分。
12.如权利要求11所述的化合物，其中每个双环糖部分独立地选自cEt糖部分和LNA糖部分。
13.如权利要求12所述的化合物，其中每个cEt核苷都是S-cEt核苷。
14.如权利要求1至13中任一项所述的化合物，其中该修饰的寡核苷酸的至少一个键联是修饰的核苷间键联，或其中该修饰的寡核苷酸的每个核苷间键联都是修饰的核苷间键联，并且任选地，其中该修饰的核苷间键联是硫代磷酸酯核苷间键联。
15.一种药物组合物，其包含如权利要求1至14中任一项所述的化合物。
16.一种体外方法，包括使细胞与如权利要求1至14中任一项所述的化合物相接触。
17.如权利要求16所述的方法，其中该细胞是肝脏细胞，如肝细胞。
18.一种提高修饰的寡核苷酸的效力的方法，该方法包括
a.形成具有如下结构的化合物：
Figure FDF0000013495140000031
其中Nm的每个N是未修饰的核苷并且m是1；X1和X2各自是磷酸二酯键；并且MO是修饰的寡核苷酸，该修饰的寡核苷酸由8至25个连接的核苷组成且包含具有cEt修饰的糖部分的至少一个核苷，且其中该修饰的寡核苷酸的核碱基序列与微小RNA互补；
b.从而相对于未缀合的修饰的寡核苷酸，提高该修饰的寡核苷酸的效力。
19.如权利要求1至14中任一项所述的化合物在制备药物中的用途。
20.如权利要求19所述的用途，其中该药物用于治疗与存在于肝脏细胞中的微小RNA相关的疾病。
CN201480024094.4A 2013-05-01 2014-04-30 用于增强的细胞摄取的化合物和方法 Active CN105164261B (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361818447P 2013-05-01 2013-05-01
US201361818441P 2013-05-01 2013-05-01
US61/818,441 2013-05-01
US61/818,447 2013-05-01
US201361822115P 2013-05-10 2013-05-10
US61/822,115 2013-05-10
US201361895708P 2013-10-25 2013-10-25
US61/895,708 2013-10-25
PCT/US2014/036136 WO2014179445A1 (en) 2013-05-01 2014-04-30 Compounds and methods for enhanced cellular uptake

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105164261A CN105164261A (zh) 2015-12-16
CN105164261B true CN105164261B (zh) 2022-03-18

Family

ID=50943547

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201480024094.4A Active CN105164261B (zh) 2013-05-01 2014-04-30 用于增强的细胞摄取的化合物和方法

Country Status (11)

Country Link
US (3) US9506030B2 (zh)
EP (1) EP2992096B1 (zh)
JP (1) JP6649248B2 (zh)
CN (1) CN105164261B (zh)
AU (1) AU2014259953B2 (zh)
CA (1) CA2909868C (zh)
HK (1) HK1221257A1 (zh)
IL (1) IL241973B (zh)
NZ (1) NZ630921A (zh)
TW (1) TWI680767B (zh)
WO (1) WO2014179445A1 (zh)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014059356A2 (en) 2012-10-12 2014-04-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
CN105164261B (zh) 2013-05-01 2022-03-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
AU2014259954B2 (en) 2013-05-01 2019-11-07 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-122
EP3060664B1 (en) 2013-10-25 2021-07-07 Sanofi Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
WO2015188194A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
US9487783B2 (en) 2014-08-07 2016-11-08 Regulus Therapeutics Inc. Targeting microRNAs for metabolic disorders
US10577388B2 (en) 2015-10-02 2020-03-03 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugation process
CA2998898A1 (en) 2015-10-08 2017-04-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
EP3394258B1 (en) 2015-10-22 2021-09-22 Roche Innovation Center Copenhagen A/S In vitro toxicity screening assay
US11105794B2 (en) 2016-06-17 2021-08-31 Hoffmann-La Roche Inc. In vitro nephrotoxicity screening assay
CN109312403B (zh) 2016-06-17 2023-06-27 豪夫迈·罗氏有限公司 体外肾毒性筛选测定法
JP2019535839A (ja) 2016-11-29 2019-12-12 ピュアテック ヘルス エルエルシー 治療剤の送達のためのエクソソーム
AU2018385257A1 (en) * 2017-12-15 2020-06-18 Elanco Animal Health Gmbh Immunostimulatory oligonucleotides
JP2021511029A (ja) 2018-01-18 2021-05-06 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス Ｓｒｅｂｐ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド
JP2021522808A (ja) 2018-05-07 2021-09-02 ロシュ イノベーション センター コペンハーゲン エーエス オリゴヌクレオチド治療剤の超並列発見方法
US12005120B2 (en) 2018-05-08 2024-06-11 Regulus Therapeutics Inc. Galnac conjugated modified oligonucleotides as miR-122 inhibitor having HCV antiviral activity with reduced hyperbilirubinemia side-effect
WO2020007826A1 (en) 2018-07-05 2020-01-09 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting mbtps1
WO2020011745A2 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting cers6
WO2020011744A2 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Antisense oligonucleotides targeting cers5
US20220098581A1 (en) * 2018-07-20 2022-03-31 Regulus Therapeutics Inc. Methods for Oral Delivery of Oligonucleotides
CN111377985B (zh) * 2018-12-29 2023-11-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 化合物和缀合物及其制备方法和用途
CN111041025B (zh) 2019-12-17 2021-06-18 深圳市瑞吉生物科技有限公司 基于结合N-乙酰半乳糖胺多肽的mRNA靶向分子及其制备方法
CN111744019B (zh) 2020-07-01 2023-08-04 深圳瑞吉生物科技有限公司 基于甘露糖的mRNA靶向递送系统及其应用
JP2023543335A (ja) * 2020-10-30 2023-10-13 スピア、トッド オリゴヌクレオチドベースの治療剤およびその使用
CA3201661A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
CN116917476A (zh) * 2021-03-03 2023-10-20 国立大学法人东京大学 非环式苏氨醇核酸
MX2024004011A (es) 2021-10-01 2024-07-01 Adarx Pharmaceuticals Inc Composiciones moduladoras de precalicreína y métodos de uso de estas.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006078278A2 (en) * 2004-04-27 2006-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
WO2009073809A2 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
WO2013033230A1 (en) * 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996034876A1 (en) * 1995-05-04 1996-11-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
WO1995030746A1 (en) 1994-05-10 1995-11-16 The General Hospital Corporation Antisense inhibition of hepatitis c virus
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
JP2003511016A (ja) 1999-10-04 2003-03-25 エクシコン エ／エス オリゴヌクレオチドを補充する高親和性ｒｎアーゼｈの設計
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
AU2002217980A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
CN1344803A (zh) * 2001-09-27 2002-04-17 吴昌 核酸靶分子选择及扩增方法
AU2003291753B2 (en) 2002-11-05 2010-07-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
JP4597976B2 (ja) 2003-04-17 2010-12-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 修飾ｉＲＮＡ剤
US20050256071A1 (en) * 2003-07-15 2005-11-17 California Institute Of Technology Inhibitor nucleic acids
CA2533701A1 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
ATE555118T1 (de) 2003-08-28 2012-05-15 Takeshi Imanishi Neue synthetische nukleidsäuren vom typ mit quervernetzter n-o-bindung
CA2536139A1 (en) 2003-09-25 2005-04-07 Coley Pharmaceutical Group, Inc. Nucleic acid-lipophilic conjugates
RU2377301C2 (ru) 2003-12-23 2009-12-27 Сантарис Фарма А/С ОЛИГОМЕРНОЕ СОЕДИНЕНИЕ, ПОНИЖАЮЩЕЕ ЭКСПРЕССИЮ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ГЕНА Bcl-2, КОНЪЮГАТ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ ОЛИГОМЕРНОГО СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА
CA2574603C (en) 2004-08-04 2014-11-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising a ligand tethered to a modified or non-natural nucleobase
WO2006031461A2 (en) * 2004-09-09 2006-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidinyl groups for attaching conjugates to oligomeric compounds
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
US20120122801A1 (en) 2005-01-05 2012-05-17 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
WO2006078217A1 (en) 2005-01-24 2006-07-27 Avaris Ab COMPLEX CONTAINING SiRNA, ShRNA OR ANTISENSE MOLECULE AND FUNCTIONAL ENTITY, FOR IMPROVED SPECIFICITY AND DELIVERY
WO2007021896A2 (en) 2005-08-10 2007-02-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro rna and uses thereof
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
AU2007211080B9 (en) 2006-01-27 2012-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1984499B1 (en) 2006-01-27 2015-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for the use in modulation of micrornas
KR101407707B1 (ko) 2006-04-03 2014-06-19 산타리스 팔마 에이/에스 Ａｎｔｉ-ｍｉｒｎａ 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 약학적 조성물
CN102851291B (zh) 2006-04-03 2016-03-09 斯特拉有限责任公司 包含抗微小rna反义寡核苷酸的药物组合物
WO2008042973A2 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid containing formulations
NZ581200A (en) 2007-05-01 2012-04-27 Santaris Pharma As Rna antagonist compounds for the modulation of beta-catenin
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
DK2173760T4 (en) 2007-06-08 2016-02-08 Isis Pharmaceuticals Inc Carbocyclic bicyclic nukleinsyreanaloge
ES2376507T5 (es) 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
CN101821391B (zh) 2007-10-04 2016-04-27 桑塔里斯制药公司 微小聚体
MX2010005703A (es) 2007-11-26 2010-06-11 Enzon Pharmaceuticals Inc Antagonistas de acido nucleico entrelazado que eligen como objetivo al receptor de androgeno.
US8404659B2 (en) 2008-03-07 2013-03-26 Santaris Pharma A/S Pharmaceutical compositions for treatment of MicroRNA related diseases
JP5793423B2 (ja) 2008-12-31 2015-10-14 ロシュ・イノベーション・センター・コペンハーゲン・アクティーゼルスカブＲｏｃｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ Ａ／Ｓ 急性冠症候群の治療のためのＬＮＡＡｐｏＢアンチセンスオリゴマーの使用
EP2421970B1 (en) 2009-04-24 2016-09-07 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Pharmaceutical compositions for treatment of hcv patients that are non-responders to interferon
WO2011047312A1 (en) 2009-10-16 2011-04-21 Glaxo Group Limited Hbv antisense inhibitors
DK2539451T3 (da) 2010-02-24 2016-04-04 Arrowhead Res Corp Sammensætninger til målrettet tilførsel af siRNA
JP2013528665A (ja) 2010-03-26 2013-07-11 メルサナ セラピューティックス， インコーポレイテッド ポリヌクレオチドの送達のための修飾ポリマー、その製造方法、およびその使用方法
WO2011130458A2 (en) 2010-04-13 2011-10-20 John Rossi Rna aptamers against baff-r as cell-type specific delivery agents and methods for their use
WO2012007477A1 (en) 2010-07-12 2012-01-19 Santaris Pharma A/S Anti hcv oligomers
JP2014504295A (ja) 2010-12-17 2014-02-20 アローヘッド リサーチ コーポレイション ｓｉＲＮＡ用ガラクトースクラスター−薬物動態調節剤標的指向部分
EP2658981B1 (en) 2010-12-29 2016-09-28 F.Hoffmann-La Roche Ag Small molecule conjugates for intracellular delivery of nucleic acids
WO2013068348A1 (en) 2011-11-07 2013-05-16 Santaris Pharma A/S Lna oligomers for improvement in hepatic function
EP2920304B1 (en) 2012-11-15 2019-03-06 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligonucleotide conjugates
EP2951305B1 (en) 2013-01-30 2018-08-15 F.Hoffmann-La Roche Ag Lna oligonucleotide carbohydrate conjugates
WO2014118272A1 (en) 2013-01-30 2014-08-07 Santaris Pharma A/S Antimir-122 oligonucleotide carbohydrate conjugates
AU2014259954B2 (en) 2013-05-01 2019-11-07 Regulus Therapeutics Inc. MicroRNA compounds and methods for modulating miR-122
CN105164261B (zh) 2013-05-01 2022-03-18 莱古路斯治疗法股份有限公司 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
EP2992098B1 (en) 2013-05-01 2019-03-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006078278A2 (en) * 2004-04-27 2006-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Single-stranded and double-stranded oligonucleotides comprising a 2-arylpropyl moiety
WO2009073809A2 (en) * 2007-12-04 2009-06-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
WO2013033230A1 (en) * 2011-08-29 2013-03-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Synthesis and Cellular Uptake of Fluorescently Labeled Multivalent Hyaluronan Disaccharide Conjugates of Oligonucleotide Phosphorothioates;Marika Karskela et al.;《Bioconjugate Chem.》;20081119;2549-2558 *
Synthesis of Antisense Oligonucleotides Conjugated to a Multivalent Carbohydrate Cluster for Cellular Targeting;Martin A. Maier et al.;《Bioconjugate Chem.》;20021203;18-29 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2014259953A1 (en) 2015-11-05
TW201505657A (zh) 2015-02-16
TWI680767B (zh) 2020-01-01
CN105164261A (zh) 2015-12-16
CA2909868A1 (en) 2014-11-06
HK1221257A1 (zh) 2017-05-26
CA2909868C (en) 2021-10-19
NZ630921A (en) 2017-12-22
US20170096668A1 (en) 2017-04-06
IL241973B (en) 2019-11-28
US10941400B2 (en) 2021-03-09
US20150031130A1 (en) 2015-01-29
EP2992096B1 (en) 2021-03-03
US9506030B2 (en) 2016-11-29
AU2014259953B2 (en) 2020-07-02
JP2016518841A (ja) 2016-06-30
EP2992096A1 (en) 2016-03-09
JP6649248B2 (ja) 2020-02-19
US20190309292A1 (en) 2019-10-10
WO2014179445A1 (en) 2014-11-06
US10240151B2 (en) 2019-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105164261B (zh) 用于增强的细胞摄取的化合物和方法
KR102350647B1 (ko) 4'-포스페이트 유사체 및 이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드
JP7120925B2 (ja) 新規コンジュゲート
JP6985288B2 (ja) トリチル−モノ−ＧａｌＮＡｃ化合物とその利用
CN104254607B (zh) 用于调节mir-21活性的微小rna化合物及方法
CN103620035B (zh) 用于调节mir-21活性的微rna化合物以及方法
US20220307024A1 (en) Delivery of oligonucleotides to the striatum
EP2992098A2 (en) Compositions and methods for modulating hbv and ttr expression
EP3177721A1 (en) Targeting micrornas for metabolic disorders
EP3060664B1 (en) Microrna compounds and methods for modulating mir-21 activity
CN112424356A (zh) 用于经口递送寡核苷酸的方法
JP7208911B2 (ja) 核酸分子発現の調節
US20240254490A1 (en) Short Duplex DNA as a Novel Gene Silencing Technology and Use Thereof
WO2024124218A1 (en) Antisense rna (asrna) technology and use thereof
WO2024124216A1 (en) Short duplex rna with interspersed deoxyribonucleotides as a gene silencing technology and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant