JP7120925B2 - 新規コンジュゲート - Google Patents
新規コンジュゲート Download PDFInfo
- Publication number
- JP7120925B2 JP7120925B2 JP2018552707A JP2018552707A JP7120925B2 JP 7120925 B2 JP7120925 B2 JP 7120925B2 JP 2018552707 A JP2018552707 A JP 2018552707A JP 2018552707 A JP2018552707 A JP 2018552707A JP 7120925 B2 JP7120925 B2 JP 7120925B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- modified
- nucleotides
- strand
- group
- another embodiment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
- A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
- A61P5/08—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH for decreasing, blocking or antagonising the activity of the anterior pituitary hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/30—Chemical structure
- C12N2310/35—Nature of the modification
- C12N2310/351—Conjugate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/30—Special therapeutic applications
- C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Obesity (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Child & Adolescent Psychology (AREA)
- Virology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
Description
本発明は、新規核酸コンジュゲート化合物に関する。本発明はさらに、前記コンジュゲートを含む組成物、ならびに医学、研究および診断におけるそれらの使用に関する。新規紺綬ゲート化合物は、中枢神経系疾患、炎症性疾患、代謝性疾患、遺伝性疾患および遺伝性疾患、腫瘍、感染症並びに眼疾患を含む多くの疾患の治療に使用することができる。
二本鎖RNA(dsRNA)は、遺伝子発現を阻害することが示されており(Fireら、1998およびElbashirら、2001)、これは干渉RNA分子(iRNA)によって媒介されるRNA干渉、すなわち「RNAi」と呼ばれている。短いdsRNAは、脊椎動物を含む多くの生物において、遺伝子特異的な転写後サイレンシングを指示し、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。RNAiは、サイレンシングトリガーと相同なメッセンジャーRNAを破壊する配列特異的な多成分ヌクレアーゼであるRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって媒介される。siRNA(短鎖干渉RNA)、アンチセンスRNA、およびマイクロRNAなどのiRNA(干渉RNA)は、遺伝子サイレンシング、すなわちタンパク質の翻訳の阻害によるタンパク質の形成を防止するオリゴヌクレオチドである。遺伝子サイレンシング物質は、医学における治療的な応用のためにますます重要になりつつある。
本発明は、化合物の糖部分内に3つの糖リガンドおよび修飾リン酸基を有するコンジュゲート化合物に関する。これらのコンジュゲート化合物は、インビボでの効力および持続時間が改善されていることが示されている。さらに、コンジュゲート基は、当該分野で公知のコンジュゲートと比較して、調製がずっと容易である。
Sは、糖を表し;
X1は、C3-C6アルキレンまたはエチレングリコール幹(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-を表し、この際、mは、1,2、または3であり;
Pは、修飾リン酸基であり;
X2は、アルキレンまたは式(-CH2)n-O-CH2-(n=1~6)のアルキレンエーテルであり;
Aは、分岐単位であり;
X3は、架橋単位を表し;
Zは、核酸であり;
X3とZとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
以下の定義および説明は、明細書および特許請求の範囲の双方を含むこの文書全体を通じて使用される用語に関するものである。
「コンジュゲート」または「コンジュゲート基」は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー化合物に結合した原子または原子群を意味する。一般に、コンジュゲート基は、薬力学、薬物動態、結合、吸収、細胞分布、細胞取り込み、電荷および/またはクリアランス特性を含むがそれらに限定されない、それらが結合する化合物の1つまたは複数の特性を修飾する。
Sは、糖を表し;
X1は、C3-C6アルキレンまたはエチレングリコール幹(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-を表し、この際、mは、1,2、または3であり;
Pは、修飾リン酸基であり;
X2は、アルキレンまたは式(-CH2)n-O-CH2-(n=1~6)のアルキレンエーテルであり;
Aは、分岐単位であり;
X3は、架橋単位を表し;
Zは、核酸であり;
X3とZとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
各nは、独立して1~20の整数を表す。
各nは、独立して1~20の整数を表す。
各nは、独立して1~20の整数を表す。
Sは、糖を表し;
X1は、C3-C6アルキレンまたはエチレングリコール幹(-CH2-CH2-O)m(CH2)2を表し、この際、mは、1,2、または3であり;
Pは、修飾リン酸基であり;
X2は、C1-C8アルキレンであり;
Aは、以下から選択される分岐単位であり:
Zは、核酸であり;
X3とZとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
Sは、糖を表し;
X1は、C3-C6アルキレンまたはエチレングリコール幹(-CH2-CH2-O)m(CH2)2-を表し、mは、1,2、または3であり、
Pは、修飾リン酸基であり;
X2は、式-C3H6-O-CH2-のアルキレンエーテルであり;
Aは、分岐単位であり;
X3は、-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4-H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-および-CH2-O-C8H16-からなる群から選択され、それぞれの場合において-CH2-基がAに結合しており;
Zは、核酸であり;
X3とZとの間の結合はリン酸またはチオリン酸である。
Y1が-O-を表してもよく、Y2が=Oまたは=Sを表してもよく;
Y1が=Oを表してもよく、Y2が-CH3、-SH、-ORxまたは-BH3を表してもよく;
Y1が=Sを表してもよく、Y2が-CH3、ORxまたは-SHを表してもよい。
(i)非結合のリン酸基酸素および/または1つ以上の結合リン酸基酸素の一方または双方の改変(例えば、置換)(本発明の核酸の5’末端および3’末端に存在していても結合と称する);
(ii)リボース糖の構成成分(例えば、リボース糖上の2’ヒドロキシル)の改変(例えば、置換);
(iii)リン酸部分の「脱リン」リンカーによる置換;
(iv)天然に存在する塩基の修飾または置換;
(v)リボース-リン酸骨格の置換または修飾;
(vi)RNAの3’末端または5’末端の修飾(例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換、またはRNAの3’末端または5’末端のいずれかへの蛍光標識された部分の共役)。
本発明のsiRNA分子の修飾は、一般に、天然RNA分子に内在するインビトロおよびインビボでの安定性およびバイオアベイラビリティを含むがこれに限定されない潜在的な限界を克服する強力なツールを提供する。本発明によるsiRNAは、化学修飾によって修飾することができる。修飾されたsiRNAはまた、ヒトにおけるインターフェロン活性の活性化の可能性を最小化することができる。修飾は、標的細胞へのsiRNAの機能的送達をさらに増強することができる。本発明の修飾siRNAは、アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかまたは両方の1つ以上の化学的に修飾されたリボヌクレオチドを含み得る。リボヌクレオチドは、塩基部分、糖部分またはリン酸部分の化学修飾を含み得る。リボ核酸は、核酸または塩基の類似体による置換または挿入によって修飾され得る。
別の態様は、糖部分の修飾に関する。本発明のsiRNAの1つまたは複数のヌクレオチドは、修飾リボース部分を含み得る。2’-OHが置換されている2’位の修飾としては、アルキル、置換アルキル、アルカリール、アリールアルキル、-F、-Cl、-Br、-CN、-CF3、-OCF3、-OCN、-O-アルキル、-S-アルキル、HS-アルキル-O、-O-アルケニル、-S-アルケニル、-N-アルケニル、-SO-アルキル、-アルキル-OSH、-アルキル-OH、-O-アルキル-OH、-O-アルキル-SH、-S-アルキル-OH、-S-アルキル-SH、-アルキル-S-アルキル、-アルキル-O-アルキル、-ONO2、-NO2、-N3、-NH2、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ-、アミノアルキル-、アミノアルコキシ、アミノ酸、アミノアシル、-ONH2、-O-アミノアルキル、-O-アミノ酸、-Oアミノアシル、ヘテロシクロアルキル-、ヘテロシクロアルカリール-、アミノアルキルアミノ-、ポリアルキルアミノ-、置換シリル、メトキシエチル-(MOE)、アルケニルおよびアルキニルから選択される非制限的な例が挙げられる。2’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋によって同じリボース糖の4’炭素に結合している「ロックド」核酸(LNA)は、本発明の2’修飾体としてさらに挙げられる。好ましい置換基は、2’-メトキシエチル、2’-O-CH3、2’-O-アリル、2’-C-アリルおよび2’-フルオロである。
一態様では、アンチセンス二本鎖領域は、本明細書において「修飾された基」と呼ばれる複数の修飾ヌクレオチド群を含み、各修飾された基は、1つ以上の同一に修飾されたヌクレオチドからなり、各修飾された基は、その一方の側または両側が、本明細書で「隣接する基」と呼ばれる第2のヌクレオチド群に隣接しており、各隣接する基は、修飾されていないか、または前記修飾された基のヌクレオチドとは異なる様式で修飾された1つ以上のヌクレオチドからなる。一実施形態では、アンチセンス二本鎖領域における各修飾基は同一であり、すなわち、各修飾基は、同数の同一に修飾されたヌクレオチドからなる。別の実施形態では、各隣接基は等しい数のヌクレオチドを有する。別の実施形態において、各隣接基は同一である。別の実施形態において、アンチセンス二本鎖領域における前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾塩基を含む。別の実施形態において、前記修飾された基のヌクレオチドは、修飾されたリン酸骨格を含む。別の実施形態では、前記修飾された基のヌクレオチドは修飾された2’位を含む。
別の態様は、リン酸骨格への修飾に関する。本発明のsiRNAのヌクレオチドの全部または一部は、非修飾核酸に見られるようなホスホジエステル結合を介して連結されていてもよい。しかし、本発明のsiRNAは、修飾ホスホジエステル結合を含んでいてもよい。アンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかのホスホジエステル結合は、独立して、窒素および硫黄から選択される少なくとも1つのヘテロ原子を含むように修飾され得る。一実施形態において、リボヌクレオチドを隣接するリボヌクレオチドに連結するホスホエステル基は、修飾された基で置換される。一実施形態において、ホスホエステル基を置換する修飾基は、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエートまたはホスホルアミデート基から選択される。
本発明のsiRNAは、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかまたは両方の末端5’または3’末端に、一つまたは複数の修飾ヌクレオチド、無塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含む核酸分子を含んでいてもよい。一実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の5’および3’末端ヌクレオチドは修飾されていない。別の実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、センス鎖の5’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の3’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、センス鎖の3’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の5’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の3’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の3’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、5’アンチセンス鎖の3’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の3’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の3’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の5’末端ヌクレオチドが修飾される。別の実施形態では、アンチセンス鎖の3’末端ヌクレオチドおよびセンス鎖の5’および3’末端ヌクレオチドの両方が修飾される。アンチセンス鎖の5’末端ヌクレオチドおよび3’末端ヌクレオチドの両方が修飾されてもよい。別の実施形態では、センス鎖の5’および3’末端ヌクレオチドの両方が修飾される。
別の態様は、shRNAおよび連結siRNAに関する。アンチセンス鎖とセンス鎖とは、互いに共有結合していてもよい。そのような結合は、アンチセンス鎖およびセンス鎖をそれぞれ形成するいずれのヌクレオチドの間でも起こり得、そして共有結合または非共有結合によって形成され得る。共有結合は、好ましくはメチレンブルーおよび二官能基を含む群から選択される化合物により、両方の鎖を1回または数回、1つまたは複数の位置でそれぞれ連結することによって形成され得る。そのような二官能基は、好ましくはビス(2-クロロエチル)アミン、N-アセチル-N’-(p-グリオキシルベンゾイル)シスタミン、4-チオウラシルおよびソラレンを含む群から選択される。
センス鎖またはアンチセンス鎖の3’末端または5’末端のオーバーハングは、1,2,3,4および5ヌクレオチドの長さからなるものから選択され得る。あるいは、siRNA分子は、両端が平滑末端のものであってもよく、16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28または29の連続したヌクレオチドの長さを有し得る。
本発明の核酸は、インビトロ(例えば、転写から脱落)またはインビボのいずれかで核酸を化学的に合成または発現させるなどの当技術分野における通常の方法を用いて作製することができる。例えば、固相化学合成を使用するか、または発現ベクターを使用する。一実施形態では、発現ベクターは、標的細胞において本発明の核酸を産生することができる。本明細書に記載の核酸分子の合成方法は、当業者に公知である。
siRNAおよび共役された化合物は、細胞との直接接触(「ネイキッド」siRNA)などの当業者に公知の様々な方法によって、または細胞への標的化もしくは送達を容易にする1つまたは複数の薬剤との組み合わせによって、インビトロおよびインビボの両方で細胞に送達することができる。このような薬剤および方法には、リポプレックス、リポソーム、イオントフォレシス、ヒドロゲル、シクロデキストリン、ナノカプセル、マイクロおよびナノスフェア並びにタンパク質性ベクターが含まれる。核酸/ビヒクルの組み合わせは、直接注入または注入ポンプの使用によってインビボで局所的に送達することができる。本発明のsiRNAおよびコンジュゲートは、静脈内、皮下、筋肉内もしくは皮内注射または吸入などの様々な手段によってインビボで送達することができる。分子は、医薬品として使用することができる。好ましくは、医薬品は、被験体における疾患状態の症状を予防し、発症を調節し、治療し、または緩和する。
本発明の薬剤および医薬組成物の投与量レベルは、当業者であれば通常の実験によって決定することができる。一実施形態では、単位用量は、約0.01mg/kg~約100mg/kg体重のsiRNAを含み得る。あるいは、用量は、10mg/kg~25mg/kg体重、または1mg/kg~10mg/kg体重、または0.05mg/kg~5mg/kg体重、または0.1mg/kg~5mg/kg体重、または0.1mg/kg~1mg/kg体重、または0.1mg/kg~0.5mg/kg体重、または0.5mg/kg~1mg/kg体重であり得る。
二本鎖siRNAを含むコンジュゲート組成物は、種々の経路によって被験体に送達され得る。例示的な経路としては、皮下、静脈内、局所、直腸、肛門、膣、鼻、肺、眼が挙げられる。
一般情報
特に断りのない限り、すべての反応は窒素雰囲気下で行った。NMRスペクトルをBruker 400MHz UltrashieldTMで記録し、すべての化学シフト(δ)をTMSと比較して測定した。
1,2-ジクロロエタン(700mL)中の15(64.2g、166ミリモル)の溶液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(22.10g、99ミリモル、18.04mL、0.6当量)を添加し、褐色の懸濁液を15分間撹拌した。粉砕した4Aモレキュラーシーブ(85g)を添加し、15分間攪拌を続けた。トリエチレングリコールモノベンジルエーテル(51.8g、215ミリモル、47.5mL、1.3当量)を滴下添加により15分間かけて添加し、室温で攪拌を続けた。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過し、続いて温ジクロロメタンですすいだ。濾液を氷冷NaHCO3飽和水溶液(800mL)に注ぐことによりクエンチし、激しく撹拌した。層を分離し、水層をジクロロメタン(2×300mL)でさらに2回抽出した。合わせた有機層を水(600mL)およびブライン(600mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、真空濃縮して黄色油状物を得た。精製は、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中5~100%EtOAc)により行い、19と採りエチレングリコールモノベンジルエーテルとの混合物(64g)を得た。この物質をジクロロメタン(430mL)に溶解し、続いてトリエチルアミン(38.4g、380ミリモル、52.8mL、4当量)およびDMAP(2.321g、19.00ミリモル、0.2当量)を添加した。次いで、バッチ式添加により、TBDMSCl(21.47g、142ミリモル、1.5当量)を加え、室温で2時間撹拌を続けた。反応混合物を濾過し、続いて氷冷飽和NaHCO3飽和溶液(1L)に注いだ。層を分離し、水層をジクロロメタン(2×300mL)でさらに2回抽出した。合わせた有機層をブライン(1L)で1回洗浄し、Na2SO4で乾燥させた。減圧濃縮後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中70~100%EtOAc)により19を無色油状物として得た(36g、収率30%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.38 - 7.28 (m, 5H), 6.58 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.79 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.53 (d, J = 1.3 Hz, 2H), 4.28 (dt, J = 11.2, 9.0 Hz, 1H), 4.16 - 4.06 (m, 2H), 3.88 (dd, J = 6.0, 2.7 Hz, 2H), 3.75 (td, J = 5.7, 2.7 Hz, 4H), 3.71 - 3.58 (m, 7H), 2.15 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 1.97 (s, 3H), 1.95 (s, 3H)。
テトラヒドロフラン(330mL)および2-プロパノール(330mL)中の19(47.68g、84ミリモル)の溶液に、活性炭上の10%パラジウム(12.92g、12.14ミリモル、1.45当量)を添加した。反応混合物に水素(バルーン)を入れ、室温で一晩撹拌を続けた。反応混合物を珪藻土で濾過し、温ジクロロメタンですすいだ。真空濃縮後、ST20を得た(37g、収率94%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.81 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.22 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.61 (t, J = 5.4 Hz, 1H), 4.56 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.03 (s, 3H), 3.88 (dt, J = 11.1, 8.9 Hz, 1H), 3.82 - 3.73 (m, 1H), 3.63 - 3.45 (m, 9H), 3.41 (t, J = 5.1 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.78 (s, 3H)。
無水アセトニトリル(8mL)および乾燥ジクロロメタン(40mL)中の4,5-ジシアノイミダゾール(961mg、8.13ミリモル、0.65当量)の溶液に、粉砕した4Aモレキュラーシーブ(4.4g)を添加した。次いで、2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト(4903mg、16.27ミリモル、5.16mL、1.3当量)をシリンジを介して添加し、10分間室温で撹拌した。次いで、乾燥ジクロロメタン(20mL)中のST20の溶液(6000mg、12.51ミリモル)を10分間かけて反応混合物に添加した。反応混合物を綿栓で濾過し、続いて減圧下で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィーによる精製を2回(ヘプタン中10~100%EtOAc)行い、ST21を淡黄色油状物として得た(6.9g、収率74%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.81 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.97 (dd, J = 11.2, 3.4 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.03 (d, J = 3.0 Hz, 3H), 3.88 (dt, J = 11.2, 8.9 Hz, 1H), 3.82 - 3.45 (m, 16H), 2.77 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.13 (dd, J = 6.8, 3.1 Hz, 12H)。
ジクロロメタン(870mL)中のガラクトサミンペンタアセテート(125g、321ミリモル)の懸濁液に、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(107g、482ミリモル、87mL、1.5当量)を室温で30分間かけて滴下により添加した。反応混合物を40℃に2時間加熱した後、室温に冷却し、氷冷した飽和NaHCO3水溶液(1000mL)を注ぐことによりクエンチした。層を分離し、水層をジクロロメタン(2×300mL)でさらに2回抽出した。合わせた有機層を水(500mL)およびブライン(800mL)で洗浄し、続いてNa2SO4で乾燥させた。真空中で濃縮した後、15を淡黄色油状物として得た(109g、粗収率103%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 6.00 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 5.47 (t, J = 3.0 Hz, 1H), 4.91 (dd, J = 7.4, 3.3 Hz, 1H), 4.29 - 4.06 (m, 3H), 4.03 - 3.97 (m, 1H), 2.13 (s, 3H), 2.07 (d, J = 1.0 Hz, 6H), 2.06 (d, J = 1.3 Hz, 3H)。
ジクロロメタン(1200mL)中の15(109g、331ミリモル)の溶液に、粉末状のモレキュラーシーブ4A(75g)を添加し、続いて室温で15分間撹拌した。混合物に4-ベンジルオキシ-1-ブタノール(89g、497ミリモル、87mL、1.5当量)を添加し、撹拌をさらに15分間続けた。次いで、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(44.1g、199ミリモル、36.0mL、0.6当量)を滴下により15分間かけて添加した。反応混合物の撹拌を2時間続けた。混合物の濾過を珪藻土のプラグで行い、続いてジクロロメタン(200mL)で1回すすいだ。ろ液を氷冷飽和NaHCO3水溶液(1000mL)に注ぐことによりクエンチした。層を分離し、続いて水層をジクロロメタン(2×500mL)で2回抽出した。合わせた有機層を水(600mL)およびブライン(600mL)で洗浄し、続いてNa2SO4で乾燥させた。減圧下で濃縮した後、1%Et3N(ヘプタン中20~80%EtOAc)で中和したシリカ上でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して、16を無色油状物として得て、ゆっくりと結晶化させた(109g、収率65%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.83 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.39 - 7.23 (m, 5H), 5.21 (d, J = 3.5 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.5 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.44 (s, 2H), 4.07 - 3.97 (m, 3H), 3.87 (dt, J = 11.2, 8.8 Hz, 1H), 3.72 (p, J = 5.3 Hz, 1H), 3.49 - 3.37 (m, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.54 (qd, J = 8.0, 5.2, 4.6 Hz, 4H)。
テトラヒドロフラン(1000mL)および2-プロパノール(1000mL)中の16(109.6グラム、215ミリモル)の溶液に、炭素上の10%パラジウム(17.17g、16.13ミリモル、10%、0.075当量)を添加し、フラスコに水素(大気圧)を入れた。反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。混合物を珪藻土のプラグで濾過し、減圧濃縮した。トルエン(2×300mL)およびジクロロメタン(2×300mL)で物質を2回ストリッピングした後、17を白色粘着性固体として得た(87g、収率97%)。1H NMR (400 MHz,メタノール-d4) δ 5.33 (dd, J = 3.5, 1.0 Hz, 1H), 5.05 (dd, J = 11.3, 3.3 Hz, 1H), 4.55 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.20 - 3.97 (m, 4H), 3.87 (dt, J = 10.1, 5.8 Hz, 1H), 3.60 - 3.48 (m, 3H), 3.30 (p, J = 1.8 Hz, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.02 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.92 (s, 3H), 1.61 (dtd, J = 16.8, 11.0, 10.1, 3.6 Hz, 4H)。
乾燥アセトニトリル(20mL)および乾燥ジクロロメタン(20mL)中の4,5-ジシアノイミダゾール(1.940グラム、16.43ミリモル、0.65当量)の溶液に、アルゴン雰囲気下、粉砕したモレキュラーシーブ4A(9g)を添加した。次いで、2-シアノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイト(10.00g、33.2ミリモル、10.53mL、1.31当量)をシリンジを介して添加し、10分間室温で撹拌した。次に、乾燥ジクロロメタン(50mL)中の17(10.6g、25.3ミリモル)の溶液を滴下により10分間かけて添加した。さらに30分間撹拌した後、反応混合物を綿栓で濾過し、減圧濃縮した。この物質の精製は、複数のフラッシュカラムクロマトグラフィー工程(ヘプタン中0%~100%EtOAc、5%Et3N)により行い、ST23(11.75g、収率72%)を淡黄色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.2, 3.5 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.93 - 3.82 (m, 1H), 3.78 - 3.65 (m, 3H), 3.64 - 3.49 (m, 4H), 3.48 - 3.40 (m, 1H), 2.76 (t, J = 5.9 Hz, 2H), 2.11 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.62 - 1.46 (m, 4H), 1.13 (dd, J = 6.8, 3.6 Hz, 12H). 31P NMR (162 MHz, Chloroform-d) 147 (d, J = 8.6 Hz)。
冷却し、激しく撹拌したテトラヒドロフラン(500mL)中の水素化ナトリウム(90g、2242ミリモル、3.5当量)の懸濁液に、テトラヒドロフラン(1000mL)中の1,6-ヘキサンジオール(265g、2242ミリモル、3.5当量)の溶液を滴下により1時間かけて添加した。さらに30分間撹拌した後、テトラヒドロフラン(500mL)中の臭化ベンジル(76mL、641ミリモル、1当量)の溶液を30分間かけて添加した。添加が完了したら、反応混合物を室温にし、一晩撹拌を続けた。反応混合物を5℃の温度に冷却し、続いて水(200mL)をゆっくりと添加した。次いで、混合物を減圧濃縮し、ジクロロメタン(600mL)に再溶解し、水(3000mL)で洗浄した。水層をジクロロメタン(3×500mL)でさらに3回抽出した。合わせた有機層を水(3×400mL)およびブライン(1×500mL)で洗浄し、続いてNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。重力カラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~50%EtOAc)により精製を行い、18(25g、収率20%)を得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.40 - 7.27 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.64 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.47 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.68 - 1.51 (m, 4H), 1.47 - 1.31 (m, 4H), 1.27 (s, 1H)。
ジクロロメタン(320mL)中の15(28g、85ミリモル)の溶液に、粉末状のモレキュラーシーブ4A(10g)を添加し、5分間攪拌した。次いで、18(26.6g、128ミリモル、1.5当量)を添加し、さらに15分間撹拌を続けた。トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート(9.26mL、51.0ミリモル、0.6当量)を15分間かけて滴下により添加した。撹拌を室温で2時間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、続いて氷冷飽和NaHCO3水溶液(300mL)でクエンチした。層を分離し、抽出をジクロロメタン(2×150mL)でさらに2回行った。合わせた有機層を水(150mL)およびブライン(150mL)で洗浄し、続いてNa2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の20~100%EtOAc)により精製して、ST30Bnを無色油状物として得た(25g、収率55%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 5.43 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 5.38 - 5.27 (m, 2H), 4.71 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 4.50 (s, 2H), 4.21 - 4.07 (m, 2H), 3.96 - 3.81 (m, 3H), 3.47 (t, J = 6.3 Hz, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.05 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.94 (s, 3H), 1.68 - 1.51 (m, 4H), 1.44 - 1.30 (m, 4H)。
テトラヒドロフラン(250mL)および2-プロパノール(250mL)中のST30Bn(29g、54ミリモル)の溶液に、炭素上の10%パラジウム(0.582g、0.547ミリモル、0.075当量)を添加した。フラスコに水素(大気圧)を入れ、混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過し、濾液を真空中で濃縮した。トルエン(2×200mL)およびジクロロメタン(2×200mL)で2回ストリッピングした後、ST30を無色油状物として得た(24g、収率99%)。1H NMR (400 MHz,メタノール-d4) δ 5.37 - 5.26 (m, 1H), 5.10 - 4.97 (m, 1H), 4.67 - 4.48 (m, 2H), 4.20 - 3.93 (m, 4H), 3.92 - 3.77 (m, 1H), 3.52 (hept, J = 9.4, 8.1 Hz, 3H), 3.36 - 3.23 (m, 1H), 2.17 - 2.09 (m, 3H), 2.05 - 1.98 (m, 3H), 1.97 - 1.87 (m, 6H), 1.63 - 1.45 (m, 4H), 1.43 - 1.29 (m, 4H)。
乾燥ジクロロメタン(550mL)中のST30(21.2g、47.4ミリモル)の溶液に、アルゴン雰囲気下、DIPEA(83mL、474ミリモル、10当量)およびモレキュラーシーブ4A(30グラム)を添加した。反応混合物を0℃の温度に冷却し、2-シアノエチル-N、N-ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(13.46g、56.9ミリモル、1.2当量)を滴下により10分間かけて添加した。混合物を温めながら、30分間撹拌を継続した。反応混合物を綿栓で濾過し、Et3N処理したシリカ(60g)上に直接被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の10~60%EtOAc、5%Et3N)により精製して、ST31を黄色タールとして得た(24.8g、収率78%)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.82 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.4 Hz, 1H), 4.96 (dd, J = 11.3, 3.4 Hz, 1H), 4.48 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.02 (s, 3H), 3.91 - 3.81 (m, 1H), 3.79 - 3.63 (m, 3H), 3.63 - 3.49 (m, 4H), 3.45 - 3.37 (m, 1H), 2.76 (t, J = 5.8 Hz, 2H), 2.10 (s, 3H), 2.00 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.77 (s, 3H), 1.58 - 1.40 (m, 4H), 1.37 - 1.22 (m, 4H), 1.13 (dd, J = 6.8, 3.9 Hz, 12H)。
ジメチルスルホキシド(320mL)中のペンタエリトリトール(160g、1175ミリモル、10当量)の懸濁液に、水酸化カリウム(65.9g、1175ミリモル、10当量)を添加し、室温で15分間攪拌した。次いで、1.5時間にわたって、ジメチルスルホキシド(107mL)中の4-ベンジルオキシ-1-ブロモブタン(22.32mL、118ミリモル、1当量)の溶液を添加した。添加が完了したら、反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を3M HCl水溶液の添加によりpH=2に酸性化し、得られた白色懸濁液をガラスフィルターで濾過した。濾液をさらに水(900mL)で希釈し、分液漏斗に移し、生成物をジクロロメタン(3×200mL)で抽出した。合わせた有機層を水(4×200mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。淡黄色油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の50~100%EtOAc)により精製して、1を無色油状物として得た(20.46g、収率58%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.41 - 7.27 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.70 (s, 6H), 3.52 - 3.43 (m, 6H), 2.54 (s, 3H), 1.71 - 1.64 (m, 4H)。
ジクロロメタン(300mL)中の1(20.46g、68.6ミリモル)の溶液に、N-メチルモルホリン(33.9mL、309ミリモル、4.5当量)を加えた。反応混合物を氷浴で冷却し、プロピオン酸エチル(27.8mL、274ミリモル、4当量)を単一ストリームを介して添加した。反応混合物の撹拌を15分間続け、続いて反応混合物を室温まで温めた。2時間の反応時間の後、反応混合物を減圧濃縮して暗褐色油状物を得た。粗物質の精製をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~37%EtOAc)により行い、2を黄色油状物として得た(31.56g、収率78%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.54 (d, J = 12.6 Hz, 3H), 7.39 - 7.28 (m, 5H), 5.23 (d, J = 12.6 Hz, 3H), 4.50 (s, 2H), 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.87 (s, 6H), 3.53 - 3.33 (m, 6H), 1.69 - 1.55 (m, 4H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 12H)。
エタノール(1463mL)中の2(31.56g、53.2ミリモル)の溶液に、炭素上の10%パラジウム(2.83g、2.66ミリモル、0.05当量)およびピリジン(2.153mL、26.6ミリモル、0.5当量)を加えた。反応混合物に水素(大気圧)を加え、混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を珪藻土のプラグでろ過し、続いてろ液を減圧下で濃縮した。これにより、3を黄色油状物として得た(29.75g、収率93%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.51 (s, 2H), 4.13 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.48 (t, J = 6.2 Hz, 2H), 3.39 - 3.33 (m, 8H), 3.30 (s, 2H), 2.52 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 1.70 - 1.56 (m, 4H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 9H)。
乾燥テトラヒドロフラン(331mL)中の、2.4M水素化アルミニウムリチウムのテトラヒドロフラン溶液(76mL、183ミリモル、6.2当量)を0℃の温度に冷却した。次いで、温度が10℃未満に保たれるような速度で、乾燥テトラヒドロフラン(200mL)中の3(17.7g、29.6ミリモル)の溶液を加えた。添加が完了したら、反応混合物をゆっくりと室温に到達させながら一晩撹拌を続けた。反応物をテトラヒドロフラン(100mL)でさらに希釈し、0℃の温度に冷却した。水(2.0mL)、4M NaOH水溶液(2.0mL)および水(6.0mL)をゆっくりと添加することによって、反応混合物のクエンチを行った。白色の沈殿物を乾燥Na2SO4プラグ上での濾過により除去し、続いてテトラヒドロフランで2回リンスした。濾液を真空中で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン中の0~10%MeOH)によりこれを精製して、ST40を無色油状物として得た(9.55g、収率68%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.39 - 7.27 (m, 5H), 4.51 (s, 2H), 3.74 (q, J = 5.2 Hz, 6H), 3.58 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 3.49 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 3.40 (s, 8H), 3.33 (s, 2H), 3.27 (s, 3H), 1.79 (p, J = 5.3 Hz, 6H), 1.71 - 1.58 (m, 4H)。
ピリジンで2回ストリッピングすることによりST40(9.55g、20.21ミリモル)から残留水を除去し、次いで、アルゴン雰囲気下でピリジン(464mL)に再溶解させた。反応混合物にモレキュラーシーブ3A(20g)を加え、15分間攪拌を続けた。固体DMTrCl(30.8g、91ミリモル、4.5当量)を添加し、暗橙色となった混合物の撹拌を一晩続けた。反応物を綿栓で濾過し、濾液をEt3N中和シリカに被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~40%EtOAc、5%Et3N)により精製を行い、ST40DMTrBnを黄色発泡油として得た(25.3g、収率84%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.43 - 7.37 (m, 6H), 7.33 - 7.21 (m, 23H), 7.19 - 7.13 (m, 3H), 6.82 - 6.75 (m, 12H), 4.46 (s, 2H), 3.74 (s, 18H), 3.43 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.39 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.26 - 3.17 (m, 10H), 3.06 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 1.78 (p, J = 6.4 Hz, 6H), 1.64 - 1.49 (m, 4H)。
テトラヒドロフラン(275mL)中のST40DMTrBn(25.3g、18.34ミリモル)の溶液に、ジョンソン・マッセイ・タイプ338の炭素上5%パラジウム(5.85g、2.75ミリモル、0.15当量)を添加した。フラスコに水素(大気圧)を充填し、45分の反応時間後、それを窒素でフラッシュした。反応混合物を珪藻土のプラグでろ過し、真空中で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~40%EtOAc、5%Et3N)により精製を行い、ST40DMTrOHを白色発泡固体(11.95g、収率50%)として得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.44 - 7.37 (m, 6H), 7.34 - 7.21 (m, 18H), 7.20 - 7.13 (m, 3H), 6.83 - 6.75 (m, 12H), 3.75 (s, 18H), 3.60 - 3.53 (m, 2H), 3.39 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 3.27 (t, 2H), 3.22 (s, 8H), 3.07 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 2.26 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 1.79 (p, J = 6.5 Hz, 6H), 1.60 - 1.51 (m, 4H)。
乾燥ジクロロメタン(162mL)中のST40DMtrOH(11.95g、9.27ミリモル)の溶液に、DIPEA(16.18mL、93ミリモル、10当量)およびモレキュラーシーブ4A(25g)を添加し、0℃の温度に冷却した。次いで、2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(2.61g、11.03ミリモル、1.2当量)を滴下により15分間かけて反応物に添加した。室温に到達させながら、反応混合物の撹拌をさらに15分間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をEt3N処理シリカ(50g)に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~35%EtOAc、5%Et3N)により精製を行い、無色タール(10.65g、収率77%)としてST41を得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.44 - 7.37 (m, 6H), 7.33 - 7.21 (m, 18H), 7.20 - 7.13 (m, 3H), 6.83 - 6.75 (m, 12H), 3.86 - 3.70 (m, 20H), 3.67 - 3.50 (m, 4H), 3.39 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 3.29 - 3.16 (m, 10H), 3.06 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 2.57 (t, 2H), 1.78 (p, J = 6.4 Hz, 6H), 1.65 - 1.49 (m, 4H), 1.16 (dd, J = 9.1, 6.8 Hz, 12H)。
ジメチルスルホキシド(110mL)中のペンタエリスリトール(55.2g、406ミリモル、10当量)の懸濁液に、水酸化カリウム(22.76g、406ミリモル、10当量)を加え、室温で15分間攪拌した。次いで、1.5時間にわたって、ジメチルスルホキシド(36.6mL)中のベンジル6-ブロモヘキシルエーテル(11g、40.6ミリモル、1当量)の溶液を加えた。添加が完了したら、反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を3M HCl水溶液の添加によりpH~1に酸性化し、得られた白色エマルジョンを水(700mL)でさらに希釈し、分液漏斗に移し、生成物をジクロロメタン(4×70mL)で抽出した。合わせた有機層を水(3×70mL)で洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧濃縮した。淡黄色油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の50~100%EtOAc)により精製して、4を無色油状物として得た(9.16g、収率67%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.70 (s, 6H), 3.49 - 3.39 (m, 6H), 2.83 (s, 3H), 1.66 - 1.52 (m, 4H), 1.45 - 1.28 (m, 4H)。
ジクロロメタン(150mL)中の2(9.1g、27.9ミリモル)の溶液に、N-メチルモルホリン(13.79mL、125ミリモル、4.5当量)を加えた。反応混合物を氷浴上で冷却し、そこにプロピオン酸エチル(11.30mL、112ミリモル)を単一ストリームを介して加えた。反応混合物の撹拌を15分間続け、続いて反応混合物を室温まで温めた。2時間の反応時間の後、反応混合物を減圧濃縮して暗褐色油状物を得た。粗物質の精製をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~30%EtOAc)により行い、5を淡黄色油状物として得た(15.85g、収率79%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.54 (d, J = 12.6 Hz, 3H), 7.37 - 7.27 (m, 5H), 5.23 (d, J = 12.6 Hz, 3H), 4.50 (s, 2H), 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.88 (s, 6H), 3.46 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.41 (s, 2H), 3.36 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.65 - 1.49 (m, 4H), 1.43 - 1.21 (m, 13H)。
エタノール(750mL)中の5(15.85g、25.5ミリモル)の溶液に、炭素上の10%パラジウム(1.359g、1.277ミリモル、0.05当量)およびピリジン(1.033mL、12.77ミリモル、0.5当量)を添加した。反応混合物に水素(大気圧)を加え、これを室温で一晩撹拌した。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過した後、濾液を減圧下で濃縮し、6を淡黄色油状物として得た(15.27g、収率91%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.37 - 7.27 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.47 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.40 - 3.26 (m, 10H), 2.52 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 1.69 - 1.46 (m, 4H), 1.44 - 1.30 (m, 4H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 9H)。
乾燥テトラヒドロフラン(360mL)中の6(19.27g、30.7ミリモル)の溶液を0℃の温度に冷却した。次いで、テトラヒドロフラン(128mL、307ミリモル、10当量)中の2.4M水素化アルミニウムリチウムを滴下により1時間かけて添加した。添加が完了したら、反応混合物をゆっくりと室温に到達させながら一晩撹拌を続けた。冷却した後、水(11.7mL)、4M NaOH水溶液(11.7mL)および水(35mL)をゆっくり添加することによって反応を停止させた。白色の沈殿物を乾燥Na2SO4プラグ上での濾過により除去し、続いてテトラヒドロフランで2回リンスした。濾液を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン中の0~6%MeOH)により精製を行って、ST42(11.64g、収率72%)を無色油として得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.38 - 7.27 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.74 (t, J = 5.4 Hz, 6H), 3.58 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 3.47 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.40 (s, 6H), 3.36 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.32 (s, 2H), 3.29 (s, 3H), 1.79 (p, J = 5.4 Hz, 6H), 1.70 - 1.49 (m, 4H), 1.44 - 1.28 (m, 4H)。
ピリジンで2回ストリッピングすることによりST42(4.00g、7.99ミリモル)から残留水を除去し、次いで、アルゴン雰囲気下でピリジン(165mL)に再溶解させた。反応混合物にモレキュラーシーブ4A(8g)を加え、15分間撹拌を続けた。固体DMTrCl(13.54g、39.9ミリモル、5当量)を添加し、暗橙色となった混合物の撹拌を室温で続けた。2時間後、追加のDMTrCl(4.06g、11.98ミリモル、1.5当量)を加え、撹拌を一晩続けた。反応物を綿栓で濾過し、濾液をEt3N中和シリカ(40g)に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~35%EtOAc、5%Et3N)により精製を行い、ST43DMTrBnを黄色発泡油(10.44g、収率86%)として得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.43 - 7.37 (m, 6H), 7.34 - 7.21 (m, 23H), 7.19 - 7.12 (m, 3H), 6.82 - 6.76 (m, 12H), 4.47 (s, 2H), 3.74 (s, 18H), 3.41 (dt, J = 14.6, 6.5 Hz, 8H), 3.26 - 3.16 (m, 10H), 3.06 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 1.78 (p, J = 6.5 Hz, 6H), 1.56 (p, 2H), 1.45 (p, J = 6.6 Hz, 2H), 1.38 - 1.21 (m, 4H)。
テトラヒドロフラン)(200mL)中のST43DMTrBn(10.2g、7.25ミリモル)の溶液に、炭素上の5%パラジウムであるジョンソン・マッセイ・タイプ338(2.313g、1.08ミリモル、0.15当量)を添加した。フラスコに水素(大気圧)を充填し、50分の反応時間の後、それを窒素でフラッシュした。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過し、減圧濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~40%EtOAc、5%Et3N)により精製を行い、ST43DMTrOHを白色泡状物として得た(3.83g、収率38%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.44 - 7.36 (m, 6H), 7.34 - 7.21 (m, 18H), 7.20 - 7.13 (m, 3H), 6.84 - 6.73 (m, 12H), 3.75 (s, 18H), 3.62 - 3.53 (m, 2H), 3.40 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 3.27 - 3.16 (m, 10H), 3.07 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 1.79 (p, J = 6.4 Hz, 6H), 1.56 - 1.41 (m, 4H), 1.37 - 1.23 (m, 5H)。
乾燥ジクロロメタン(50mL)中のST43DMtrOH(3.83g、2.76ミリモル)の溶液に、DIPEA(4.82mL、27.6ミリモル、10当量)およびモレキュラーシーブ4A(7g)を加え、0℃の温度に冷却した。次いで、2-シアノエチルN、N-ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(0.948g、4.00ミリモル、1.45当量)を15分かけて滴下により反応物に添加した。室温に到達させながら、反応混合物の撹拌をさらに15分間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をEt3N処理したシリカ(10g)に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~30%EtOAc、5%Et3N)により精製を行い、ST43を無色タール(3.48g、収率83%)として得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.44 - 7.37 (m, 6H), 7.33 - 7.20 (m, 18H), 7.19 - 7.13 (m, 3H), 6.83 - 6.75 (m, 12H), 3.87 - 3.69 (m, 20H), 3.66 - 3.51 (m, 4H), 3.39 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 3.28 - 3.15 (m, 10H), 3.07 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 2.60 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.79 (p, J = 6.4 Hz, 6H), 1.58 (p, J = 3.9 Hz, 2H), 1.46 (p, J = 6.7 Hz, 2H), 1.39 - 1.23 (m, 4H), 1.17 (t, J = 7.3 Hz, 12H)。
乾燥N,N-ジメチルホルムアミド(10mL)中の8-ブロモオクタン-1-オール(8g、38.3ミリモル)の溶液に、イミダゾール(6.51g、96ミリモル、2.5当量)を添加した。透明な溶液が得られたら、TBDMS-Cl(7.50g、49.7ミリモル、1.2当量)を少量ずつ添加したところ発熱反応が観察され、最高温度は40℃に達した。反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。得られた黄色の懸濁液をEt2O(40mL)で希釈し、ブライン(40mL)で洗浄した。水層をEt2O(2×40mL)でさらに2回抽出し、合わせた有機層をNa2SO4で乾燥させた。減圧下で濃縮した後、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~40%EtOAc)により精製を行い、7を無色油状物として得た(11.73g、収率95%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 3.60 (t, J = 6.6, 1.7 Hz, 2H), 3.41 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 1.85 (p, J = 7.0 Hz, 2H), 1.60 - 1.37 (m, 4H), 1.37 - 1.24 (m, 6H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。
ジメチルスルホキシド(45mL)中のペンタエリスリトール(16.84g、124ミリモル、10当量)の懸濁液に、水酸化カリウム(6.94g、124ミリモル、10当量)を加え、これを室温で15分間撹拌した。次いで、2時間かけて、7(4g、12.37ミリモル、1当量)を添加した。添加が完了したら、反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物をEt2O(3×150mL)で3回抽出し、全ての有機層をブライン(50mL)で別々に洗浄した。次いで、合わせた水層をEt2O(50mL)でもう一度抽出した。合わせた有機層をNa2SO4で乾燥し、減圧下で濃縮した。淡黄色油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~100%EtOAc)により精製して、8を無色油状物として得た(0.53g、収率11%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 3.72 (d, J = 3.7 Hz, 6H), 3.60 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.47 (s, 2H), 3.42 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.73 (s, 3H), 1.63 - 1.44 (m, 4H), 1.30 (s, 8H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。
ジクロロメタン(30mL)中の8(2.94g、7.76ミリモル)の溶液に、N-メチルモルホリン(3.84mL、34.9ミリモル、4.5当量)およびエチルプロピオネート(3.7mL、36.5ミリモル、4.7当量)を添加した。発熱反応が観察され、氷浴を用いて20℃の温度に冷却した。反応混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を減圧濃縮して暗褐色油状物を得た。これをフラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~40%EtOAc)により精製して、9を淡黄色油状物として得た(3.84g、収率73%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.54 (d, J = 12.6 Hz, 3H), 5.23 (d, J = 12.6 Hz, 3H), 4.16 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.89 (s, 6H), 3.59 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.42 (s, 2H), 3.36 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 1.56 - 1.45 (m, 4H), 1.35 - 1.22 (m, 17H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。
エタノール(167mL)中の9(3.84g、5.71ミリモル)の溶液に、炭素上の10%パラジウム(0.304g、0.285ミリモル、0.05当量)およびピリジン(0.213mL、2.85ミリモル、0.5当量)を添加した。反応混合物に水素(大気圧)を加え、混合物の撹拌を室温で一晩続けた。反応混合物を珪藻土のプラグで濾過した後、濾液を減圧濃縮し、10を黄色油状物として得た(3.86g、収率100%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 4.14 (q, J = 7.1 Hz, 6H), 3.64 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.59 (t, J = 6.7 Hz, 2H), 3.40 - 3.28 (m, 10H), 2.53 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 1.55 - 1.46 (m, 4H), 1.35 - 1.23 (m, 17H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。
乾燥テトラヒドロフラン(67mL)中の10(3.86g、5.69ミリモル)の溶液を-5℃の温度に冷却した。次いで、テトラヒドロフラン(24mL、57ミリモル、10当量)中の2.4M水素化リチウムアルミニウムを滴下により1時間かけて添加した。添加が完了したら、反応混合物をゆっくりと室温に到達させながら一晩撹拌を続けた。翌日、反応混合物を0℃の温度に冷却し、硫酸ナトリウム・十水和物(18.32g、56.9ミリモル、10当量)をバッチ式で添加することによりクエンチした。白色の沈殿物を、乾燥Na2SO4プラグによる濾過によって除去し、続いてテトラヒドロフランで2回すすいだ。濾液を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ジクロロメタン中の0~7%MeOH)による精製を行って、ST44を淡黄色油状物(1.96g、収率60%)として得た。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 3.75 (t, J = 5.3 Hz, 6H), 3.64 - 3.55 (m, 8H), 3.48 - 3.27 (m, 13H), 1.80 (h, J = 5.4, 4.8 Hz, 6H), 1.58 - 1.46 (m, 4H), 1.36 - 1.25 (m, 8H), 0.89 (s, 9H), 0.05 (s, 6H)。
ピリジンで2回ストリッピングすることによりST44(1.94g、3.51ミリモル)から残留水を除去し、次いで、アルゴン雰囲気下でピリジン(70mL)に再溶解させた。反応混合物にモレキュラーシーブ4A(4g)を加え、15分間攪拌を続けた。固体DMTrCl(4.16g、12.28ミリモル、3.5当量)を2時間かけてバッチで添加した。さらに1.5時間後、追加のDMTrCl(2.38g、7.02ミリモル、2当量)を加え、暗橙色となった混合物の撹拌を室温で一晩続けた。この反応物を、MeOH(4.4mL、109ミリモル、31当量)の添加によってクエンチし、15分間撹拌した。次いで、反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をEt3N中和シリカ(20g)に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~100%EtOAc、5%Et3N)により精製し、ST45DMTrTBDMSを黄色発泡油として得た(0.44g、収率8%)。出発物質および中間体を収率60%で回収した。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.43 - 7.38 (m, 6H), 7.27 (q, J = 8.1, 7.3 Hz, 18H), 7.19 - 7.13 (m, 3H), 6.81 - 6.76 (m, 12H), 3.76 (s, 18H), 3.58 (td, J = 6.5, 3.0 Hz, 2H), 3.44 (dt, J = 33.9, 6.4 Hz, 6H), 3.35 - 3.16 (m, 10H), 3.07 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 1.79 (h, J = 6.3 Hz, 6H), 1.52 - 1.39 (m, 4H), 1.34 - 1.20 (m, 8H), 0.89 (s, 9H), 0.04 (s, 6H)。
乾燥テトラヒドロフラン(12mL)中のST45DMTrTBDMS(2.20g、1.507ミリモル)の溶液に、テトラヒドロフラン(1.688mL、1.688ミリモル、1.12当量)中の1M TBAFを添加し、これを室温で一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~100%EtOAc、5%Et3N)により精製して、ST45DMTrOHを無色油状物として得た(1.74g、収率83%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.44 - 7.37 (m, 6H), 7.34 - 7.21 (m, 18H), 7.20 - 7.12 (m, 3H), 6.82 - 6.75 (m, 12H), 3.75 (s, 18H), 3.59 (q, J = 6.5 Hz, 2H), 3.40 (t, J = 6.5 Hz, 6H), 3.26 - 3.15 (m, 10H), 3.07 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 1.79 (p, J = 6.4 Hz, 6H), 1.56 - 1.39 (m, 4H), 1.37 - 1.20 (m, 9H)。
乾燥ジクロロメタン(25mL)中のST45DMTrOH(1.9g、1.412ミリモル)の溶液に、DIPEA(2.466mL、14.12ミリモル、10当量)およびモレキュラーシーブ4A(3.8g)を添加し、0℃の温度に冷却した。次いで、2-シアノエチルN、N-ジイソプロピルクロロホスホルアミダイト(0.401g、1.694ミリモル、1.2当量)を5分間かけて滴下により反応物に添加した。室温に到達させながら、反応混合物の撹拌をさらに15分間続けた。反応混合物を綿栓で濾過し、濾液をEt3N処理したシリカ(7.5g)上に被覆した。フラッシュカラムクロマトグラフィー(ヘプタン中の0~100%EtOAc、5%Et3N)により精製して、ST45を透明な油として得た(1.37g、収率59%)。1H NMR (400 MHz,クロロホルム-d) δ 7.44 - 7.37 (m, 6H), 7.33 - 7.20 (m, 18H), 7.19 - 7.13 (m, 3H), 6.82 - 6.74 (m, 12H), 3.88 - 3.70 (m, 20H), 3.68 - 3.52 (m, 4H), 3.39 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 3.30 - 3.15 (m, 10H), 3.07 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 2.61 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 1.79 (h, J = 6.5, 5.9 Hz, 6H), 1.63 - 1.54 (m, 2H), 1.50 - 1.40 (m, 2H), 1.37 - 1.21 (m, 8H), 1.17 (t, J = 6.4 Hz, 12H)。
すべてのオリゴヌクレオチドは、AKTAオリゴパイロットシンセサイザーで合成された。市販の固体支持体および2’O-メチルRNAホスホルアミダイト、2’-フルオロ、2’-デオキシRNAホスホルアミダイトおよび市販の長いトレブラーホスホルアミダイト(STKS)(グレンリサーチ)を使用した。オリゴヌクレオチド合成、脱保護および精製は、当技術分野で公知の標準的な手順に従った。オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドコンジュゲートの合成は、商業的に利用可能なオリゴヌクレオチド製造業者(バイオスプリング、フランクフルト、ドイツ)によって実施した。
以下の配列の修飾キー:
太字=2’O-メチルリボヌクレオチド
下線=2’フルオロ/2’デオキシリボヌクレオチド
ps=ホスホロチオエート結合
fは2’フルオロ2’デオキシリボヌクレオチドを示し、
mは2’Oメチルリボヌクレオチドを示し、
(ps)はホスホロチオエート結合を示す。
8週齢の雄のC57BL/6JOlaHsdマウスに、300μL/kgの単回皮下注射(各群4匹)によりそれぞれの用量を注射した。
新鮮な肝臓組織から、実質的にFehringら、2014年に記載の手法により、全RNAを単離した:
標的mRNAノックダウン分析のために、マウスを屠殺した直後に組織を解剖し、直ちに液体窒素中で急速冷凍した。タングステンカーバイドビーズ(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)を使用して、MixerMillMM301(レッチュゲーエムベーハー、ハーン、ドイツ)で約20mgの組織をホモジナイズした。InvisorbSpinTissueRNAMiniKit(インビテック、ベルリン、ドイツ)を用いて、全RNAをライセートから単離した。組織に応じて、25~100ngの全RNAを、バイオテズゲーエムベーハー、ベルリン、ドイツから得られたアンプリコンセットを用いた定量的TaqManRT-PCRに使用した:TaqManRT-PCR反応は、RT-PCRのための標準的なプロトコールを用いたABIPRISM7700SequenceDetector(ソフトウェア:SequenceDetectionSystem v1.6.3(エービーアイライフテクノロジーズ))またはStepOnePlusRealTimePCR System(ABI)により、それぞれ300nmol/Lおよび100nmol/Lの濃度のプライマーおよびプローブを用いて(Fehringら、2014年に記載されているように)行った。TaqManデータは、比較Ct法を用いて計算した。mRNAレベルをPTENに対して正規化した。
8週齢の雄性C57BL/6JOlaHsdマウスに、300μL/kgの単回皮下注射(1群当たり4匹)のそれぞれの用量(3、1、0.3、0.1mg/kg)を注射した。PBSをコントロールとして使用した。2日後にマウスを屠殺し、肝臓を採取し、TAQman分析を用いてTTR mRNAについて分析した。実施例4と同様にしてサンプルの分析を行った。
種々のTTR siRNA GalNAcコンジュゲートであるSTS016L4~L9のTTRノックダウンについてのインビトロでの定量を、肝細胞アッセイにより行った。
8週齢の雄のC57BL/6JOlaHsdマウスに、1mg/kgの用量を300μL/kgの単回皮下注射(1群当たり4匹)で注射した。
8週齢の雄のC57BL/6JOlaHsdマウスに、300μL/kgの単回皮下注射(1群当たり4匹)のそれぞれの用量(1、3、10mg/kg)を注射した。PBSをコントロールとして使用した。
新鮮な肝臓組織から、実質的にFehringら、2014年に記載の手法を用いて全RNAを単離した:
標的mRNAノックダウン分析のために、マウスを屠殺した直後に組織を解剖し、直ちに液体窒素中で急速冷凍した。タングステンカーバイドビーズ(キアゲン、ヒルデン、ドイツ)を使用してMixerMillMM301(レッチュゲーエムベーハー、ハーン、ドイツ)で約20mgの組織をホモジナイズした。InvisorbSpinTissueRNAMiniKit(インビテック、ベルリン、ドイツ)を用いて、全RNAをライセートから単離した。組織に応じて、25~100ngの全RNAを、バイオテズゲーエムベーハー、ベルリン、ドイツから得られたアンプリコンセットを用いた定量的TaqManRT-PCRに使用した:TaqManRT-PCR反応は、RT-PCRのための標準的なプロトコールを用いたABIPRISM7700SequenceDetector(ソフトウェア:SequenceDetectionSystem v1.6.3(エービーアイライフテクノロジーズ))またはStepOnePlusRealTimePCR System(ABI)により、それぞれ300nmol/Lおよび100nmol/Lの濃度のプライマーおよびプローブを用いて(Fehringら、2014年に記載されているように)行った。PTEN用のTaqManプローブは、実施例4に記載のものと同じであった。
1.Fire, A.; Xu, S.; Montgomery, M. K.; Kostas, S. A.; Driver, S. E.; Mello, C. C., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 1998, 391 (6669), 806-11.
2.Elbashir, S. M.; Lendeckel, W.; Tuschl, T., RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs. Genes & development 2001, 15 (2), 188-200.
3.Dubber, M.; Frechet, J. M., Solid-phase synthesis of multivalent glycoconjugates on a DNA synthesizer. Bioconjugate chemistry 2003, 14 (1), 239-46.
4.Weigel, P. H.; Yik, J. H., Glycans as endocytosis signals: the cases of the asialoglycoprotein and hyaluronan/chondroitin sulfate receptors. Biochim Biophys Acta 2002, 1572 (2-3), 341-63.
5.Ishibashi, S.; Hammer, R. E.; Herz, J., Asialoglycoprotein receptor deficiency in mice lacking the minor receptor subunit. J Biol Chem 1994, 269 (45), 27803-6.
6.Biessen, E. A.; Broxterman, H.; van Boom, J. H.; van Berkel, T. J., The cholesterol derivative of a triantennary galactoside with high affinity for hepatic asialoglycoprotein receptor: a potent cholesterol lowering agent. J Med Chem 1995, 38 (11), 1846-52.
7.Akinc, A.; Querbes, W.; De, S.; Qin, J.; Frank-Kamenetsky, M.; Jayaprakash, K. N.; Jayaraman, M.; Rajeev, K. G.; Cantley, W. L.; Dorkin, J. R.; Butler, J. S.; Qin, L.; Racie, T.; Sprague, A.; Fava, E.; Zeigerer, A.; Hope, M. J.; Zerial, M.; Sah, D. W.; Fitzgerald, K.; Tracy, M. A.; Manoharan, M.; Koteliansky, V.; Fougerolles, A. d.; Maier, M. A., Targeted Delivery of RNAi Therapeutics With Endogenous and Exogenous Ligand-Based Mechanisms. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 2010, 18 (7), 1357-1364.
8.Fehring, V.; Schaeper, U.; Ahrens, K.; Santel, A.; Keil, O.; Eisermann, M.; Giese, K.; Kaufmann, J., Delivery of therapeutic siRNA to the lung endothelium via novel Lipoplex formulation DACC. Mol Ther 2014, 22 (4), 811-20.
9.Prakash, T. P.; Brad Wan, W.; Low, A.; Yu, J.; Chappell, A. E.; Gaus, H.; Kinberger, G. A.; Ostergaard, M. E.; Migawa, M. T.; Swayze, E. E.; Seth, P. P., Solid-phase synthesis of 5′-triantennary N-acetylgalactosamine conjugated antisense oligonucleotides using phosphoramidite chemistry. Bioorganic & medicinal chemistry letters 2015, 25 (19), 4127-4130.
10.Li, L.-C.; Okino, S. T.; Zhao, H.; Pookot, D.; Place, R. F.; Urakami, S.; Enokida, H.; Dahiya, R., Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences 2006, 103 (46), 17337-17342.
Claims (7)
- 前記核酸が、RNAi、siRNA、アンチセンス核酸、リボザイム、アプタマーおよびスピーゲルマーから選択される、請求項1に記載の化合物。
- 前記核酸が、塩基、糖もしくはリン酸部分の化学修飾を含む1つ以上のヌクレオチドを含む、請求項1または2に記載の化合物。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載の化合物、および適切な担体または賦形剤を含む、組成物。
- 請求項1~3のいずれか1項に記載の化合物、および適切な担体または賦形剤を含む、医薬組成物。
- 肝疾患、遺伝子疾患、血友病および出血障害、肝線維症、非アルコール性脂肪肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、ウイルス性肝炎、稀少疾患(例えば、末端肥大症)、代謝性疾患(例えば、高コレステロール血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症)、心血管疾患、肥満、サラセミア、肝損傷(例えば、薬剤誘発性肝障害)、ヘモクロマトーシス、アルコール性肝疾患、アルコール依存性、貧血、並びに慢性疾患の貧血の治療に使用するための、請求項5に記載の医薬組成物。
- 肝細胞を、請求項1~3のいずれか1項に記載の化合物とインビトロで接触させることを含む、肝細胞への核酸の送達方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP16163939.8A EP3228326A1 (en) | 2016-04-05 | 2016-04-05 | Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate |
EP16163939.8 | 2016-04-05 | ||
PCT/EP2017/058112 WO2017174657A1 (en) | 2016-04-05 | 2017-04-05 | Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019510793A JP2019510793A (ja) | 2019-04-18 |
JP2019510793A5 JP2019510793A5 (ja) | 2020-05-14 |
JP7120925B2 true JP7120925B2 (ja) | 2022-08-17 |
Family
ID=55697082
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018552707A Active JP7120925B2 (ja) | 2016-04-05 | 2017-04-05 | 新規コンジュゲート |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10913945B2 (ja) |
EP (3) | EP3228326A1 (ja) |
JP (1) | JP7120925B2 (ja) |
CN (2) | CN109562188B (ja) |
AU (1) | AU2017245687B2 (ja) |
CA (1) | CA3019981A1 (ja) |
DK (1) | DK3439703T3 (ja) |
ES (1) | ES2805026T3 (ja) |
HU (1) | HUE049931T2 (ja) |
PL (1) | PL3439703T3 (ja) |
WO (1) | WO2017174657A1 (ja) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
MA45478A (fr) * | 2016-04-11 | 2019-02-20 | Arbutus Biopharma Corp | Compositions de conjugués d'acides nucléiques ciblés |
EP3550022A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-09 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
WO2018185253A1 (en) * | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Silence Therapeutics Gmbh | Ligand modified double-stranded nucleic acids |
WO2018185252A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-11 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acid conjugates |
EP3607067A1 (en) | 2017-04-05 | 2020-02-12 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
LT3607069T (lt) | 2017-04-05 | 2023-01-10 | Silence Therapeutics Gmbh | Produktai ir kompozicijos |
EP3483269A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-15 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
EP3385272A1 (en) | 2017-04-05 | 2018-10-10 | Silence Therapeutics GmbH | Further novel oligonucleotide-ligand conjugates |
JP7247167B2 (ja) | 2017-04-05 | 2023-03-28 | サイレンス・セラピューティクス・ゲーエムベーハー | 産物及び組成物 |
EP3710586B1 (en) * | 2017-11-13 | 2022-11-23 | Silence Therapeutics GmbH | Nucleic acids for inhibiting expression of lpa in a cell |
EP3483270A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-15 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
CA3118327A1 (en) | 2017-11-13 | 2019-05-16 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acids for inhibiting expression of aldh2 in a cell |
CA3081910A1 (en) * | 2017-11-13 | 2019-05-16 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acids for inhibiting expression of a target gene comprising phosphorodithioate linkages |
EP3549610A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-09 | Silence Therapeutics GmbH | Nucleic acid conjugates |
EP3550021A1 (en) | 2018-04-05 | 2019-10-09 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions for inhibiting expression of a target gene |
EP3775207A1 (en) | 2018-04-05 | 2021-02-17 | Silence Therapeutics GmbH | Sirnas with vinylphosphonate at the 5' end of the antisense strand |
EP3598995A1 (en) | 2018-07-26 | 2020-01-29 | Silence Therapeutics GmbH | Products and compositions |
FI3880818T3 (fi) * | 2018-11-13 | 2022-12-15 | Nukleiinihappoja LPA:n ekspression inhiboimiseksi solussa | |
EP3730617A1 (en) | 2019-04-26 | 2020-10-28 | Silence Therapeutics GmbH | Nucleic acids for inhibiting expression of c3 in a cell |
JP2022509809A (ja) | 2018-11-23 | 2022-01-24 | サイレンス・セラピューティクス・ゲーエムベーハー | 細胞におけるc3の発現を阻害するための核酸 |
EP3966325A1 (en) | 2019-05-07 | 2022-03-16 | Universität Bern | Nucleic acids for inhibiting expression of pros1 in a cell |
CN114981430A (zh) | 2019-08-27 | 2022-08-30 | 赛伦斯治疗有限责任公司 | 用于抑制细胞中的c3表达的核酸 |
WO2021081420A2 (en) * | 2019-10-24 | 2021-04-29 | Genevant Sciences Gmbh | Conjugates and methods for treating acromegaly |
AU2021281511A1 (en) | 2020-05-27 | 2023-01-05 | Asociación Centro de Investigación Cooperativa en Biociencias- CIC bioGUNE | Nucleic acids for inhibiting expression of CNNM4 in a cell |
TW202237840A (zh) | 2020-11-04 | 2022-10-01 | 瑞士伯恩大學 | 用於在細胞中抑制pros1之表現的核酸 |
AU2021373262A1 (en) | 2020-11-04 | 2023-06-01 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acids for inhibiting expression of pros1 in a cell |
WO2022184852A1 (en) | 2021-03-03 | 2022-09-09 | Silence Therapeutics Gmbh | Conjugated nucleic acids comprising a phosphorodithioate for inhibiting gene expression in a cell |
WO2022223557A1 (en) | 2021-04-20 | 2022-10-27 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acids for inhibiting expression of xdh in a cell |
MX2023012834A (es) | 2021-04-27 | 2023-11-08 | Silence Therapeutics Gmbh | Inhibidor de la matriptasa-2 para el tratamiento de trastornos mieloproliferativos. |
WO2023031359A1 (en) | 2021-09-02 | 2023-03-09 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acids for inhibiting expression of complement factor b (cfb) in a cell |
CA3235672A1 (en) * | 2021-11-29 | 2023-06-01 | Shanghai Argo Biopharmaceutical Co., Ltd. | Compositions and methods for inhibiting expression of hepatitis b virus (hbv) protein |
CN117580846A (zh) * | 2022-04-29 | 2024-02-20 | 石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司 | 具有肝靶向递送效应的化合物及其寡聚核苷酸缀合物 |
WO2024013334A1 (en) * | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Silence Therapeutics Gmbh | Nucleic acids for inhibiting expression of agt in a cell |
CN116444589B (zh) * | 2023-06-15 | 2023-09-19 | 北京悦康科创医药科技股份有限公司 | 新型GalNAc化合物及其硫代寡核苷酸缀合物和偶联方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015168589A2 (en) | 2014-05-01 | 2015-11-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression |
WO2016055601A1 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1993013121A1 (en) | 1991-12-24 | 1993-07-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Gapped 2' modified oligonucleotides |
US5378825A (en) | 1990-07-27 | 1995-01-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Backbone modified oligonucleotide analogs |
NL9201440A (nl) | 1992-08-11 | 1994-03-01 | Univ Leiden | Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing. |
US5820873A (en) | 1994-09-30 | 1998-10-13 | The University Of British Columbia | Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof |
US5885613A (en) | 1994-09-30 | 1999-03-23 | The University Of British Columbia | Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes |
US5753613A (en) | 1994-09-30 | 1998-05-19 | Inex Pharmaceuticals Corporation | Compositions for the introduction of polyanionic materials into cells |
EP1071753A2 (en) | 1998-04-20 | 2001-01-31 | Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. | Nucleic acid molecules with novel chemical compositions capable of modulating gene expression |
AU2013346767B2 (en) * | 2012-11-15 | 2019-04-11 | Roche Innovation Center Copenhagen A/S | Oligonucleotide conjugates |
NZ631552A (en) * | 2013-05-01 | 2017-02-24 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods for modulating hbv expression |
-
2016
- 2016-04-05 EP EP16163939.8A patent/EP3228326A1/en not_active Ceased
-
2017
- 2017-04-05 AU AU2017245687A patent/AU2017245687B2/en active Active
- 2017-04-05 WO PCT/EP2017/058112 patent/WO2017174657A1/en active Application Filing
- 2017-04-05 US US16/091,503 patent/US10913945B2/en active Active
- 2017-04-05 CA CA3019981A patent/CA3019981A1/en active Pending
- 2017-04-05 HU HUE17715730A patent/HUE049931T2/hu unknown
- 2017-04-05 PL PL17715730T patent/PL3439703T3/pl unknown
- 2017-04-05 CN CN201780035060.9A patent/CN109562188B/zh active Active
- 2017-04-05 EP EP20171464.9A patent/EP3744350A1/en active Pending
- 2017-04-05 DK DK17715730.2T patent/DK3439703T3/da active
- 2017-04-05 EP EP17715730.2A patent/EP3439703B1/en active Active
- 2017-04-05 ES ES17715730T patent/ES2805026T3/es active Active
- 2017-04-05 CN CN202211456959.7A patent/CN116036117A/zh active Pending
- 2017-04-05 JP JP2018552707A patent/JP7120925B2/ja active Active
-
2020
- 2020-11-25 US US17/104,502 patent/US11912993B2/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015168589A2 (en) | 2014-05-01 | 2015-11-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression |
WO2016055601A1 (en) | 2014-10-10 | 2016-04-14 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Galnac phosphoramidites, nucleic acid conjugates thereof and their use |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Bioconjugate Chemistry,2003年,Vol.14,pp.239-246,ISSN: 1043-1802 |
PRAKASH THAZHA P; ET AL,SOLID-PHASE SYNTHESIS OF 5'-TRIANTENNARY N-ACETYLGALACTOSAMINE CONJUGATED ANTISENSE 以下備考,BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS,NL,ELSEVIER,2015年08月08日,VOL:25, NR:19,PAGE(S):4127 - 4130,http://dx.doi.org/10.1016/j.bmcl.2015.08.019,OLIGONUCLEOTIDES USING PHOSPHORAMIDITE CHEMISTRY |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20210079397A1 (en) | 2021-03-18 |
CN109562188A (zh) | 2019-04-02 |
AU2017245687A1 (en) | 2018-10-25 |
EP3439703A1 (en) | 2019-02-13 |
AU2017245687B2 (en) | 2023-03-09 |
US11912993B2 (en) | 2024-02-27 |
PL3439703T3 (pl) | 2020-10-19 |
CN109562188B (zh) | 2022-12-06 |
CN116036117A (zh) | 2023-05-02 |
JP2019510793A (ja) | 2019-04-18 |
WO2017174657A1 (en) | 2017-10-12 |
CA3019981A1 (en) | 2017-10-12 |
US20190119676A1 (en) | 2019-04-25 |
EP3228326A1 (en) | 2017-10-11 |
ES2805026T3 (es) | 2021-02-10 |
EP3439703B1 (en) | 2020-04-29 |
EP3744350A1 (en) | 2020-12-02 |
HUE049931T2 (hu) | 2020-11-30 |
DK3439703T3 (da) | 2020-06-29 |
US10913945B2 (en) | 2021-02-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7120925B2 (ja) | 新規コンジュゲート | |
KR102553382B1 (ko) | 세포에서 lpa의 발현을 저해하기 위한 핵산 | |
JP7245328B2 (ja) | 細胞におけるlpaの発現を抑制するための核酸 | |
AU2018247923B2 (en) | Products and compositions | |
WO2018185253A1 (en) | Ligand modified double-stranded nucleic acids | |
US20210155926A1 (en) | siRNAs WITH AT LEAST TWO LIGANDS AT DIFFERENT ENDS | |
EP3550021A1 (en) | Products and compositions for inhibiting expression of a target gene | |
WO2018185252A1 (en) | Nucleic acid conjugates | |
US11299738B2 (en) | Further novel oligonucleotide-ligand conjugates | |
EP3549610A1 (en) | Nucleic acid conjugates | |
EP3483270A1 (en) | Products and compositions | |
EP3385381A1 (en) | Products and compositions |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190524 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200401 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200401 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210126 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210426 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210621 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211102 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220131 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220307 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220705 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220707 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220719 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220804 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7120925 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |