TW202237840A - 用於在細胞中抑制pros1之表現的核酸 - Google Patents

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西比樂 達梅斯
艾略特 莫里森
拉查 普林斯 艾拉德那尼
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Abstract

本發明係關於干擾或抑制PROS1基因表現之核酸產物。其進一步關於以PROS1抑制作用來於治療出血病症之治療性用途。

Description

用於在細胞中抑制PROS1之表現的核酸
本發明係關於干擾或抑制PROS1 (蛋白質S)基因表現之核酸產物。其進一步關於PROS1抑制用於治療出血病症之治療性用途。
雙股RNA (dsRNA)能夠經由互補鹼基配對與所表現之mRNA結合，已表明其可藉由一種被稱為「RNA干擾(RNAi)」之機制阻斷基因表現(Fire等人, 1998, Nature. 1998年2月19日;391(6669):806-11及Elbashir等人, 2001, Nature. 2001年5月24日;411(6836):494-8)。短dsRNA在許多生物體(包括脊椎動物)中引導基因特異性的轉錄後緘黙，且已成為用於研究基因功能之適用工具。RNAi由RNA誘導型緘黙化複合體(RISC)介導，RISC為一種序列特異性的多組分核酸酶，可降解與加載至RISC複合體中的緘黙觸發子具有足夠互補性或同源性的信使RNA。諸如siRNA、反義RNA及微小RNA之干擾RNA為寡核苷酸，其藉由基因緘黙來阻止蛋白質形成，亦即經由降解mRNA分子來抑制蛋白質之基因轉譯。基因緘黙劑對於醫學中之治療應用變得愈來愈重要。
根據Watts及Corey在Journal of Pathology (2012；第226卷，第365-379頁)中所說，有演算法可以用於設計核酸緘黙觸發子，但所有此等演算法均有嚴重的侷限性。可能需要各種實驗方法來識別強效siRNA，因為演算法不考慮諸如目標mRNA之三級結構或RNA結合蛋白之參與等因素。因此，發現具有最小脫靶效應的強效核酸緘黙觸發子係一個複雜的過程。為了此等高度帶電分子的醫藥開發，有必要使其可以經濟地合成，分佈於目標組織，進入細胞且在可接受的毒性限值內發揮作用。
A型血友病及B型血友病為最常見的出血病症且其分別由促凝血因子VIII (FVIII)或因子IX (FVIX)之缺陷引起(Weyand及Pipe, 2019)。血友病之嚴重度根據殘餘內源性因子含量進行分類(Balkaransingh及Young, 2017)。患有嚴重血友病之患者在肌肉骨胳系統內常常發生自發性出血，諸如關節血腫。若不進行治療，則此可在年輕時就導致殘疾。
止血受到促凝血因子與抗凝血因子之相互作用的嚴格調節，以控制過度出血事件且預防血栓性事件。血液凝固在血管壁受損時經活化，其中FVIIa結合至暴露的組織因子且FVIIa組織因子複合體接著高效活化FX。FXa及FVa接著形成會產生凝血酶之凝血酶原酶複合體。另外，FVIIa-組織因子複合體活化FIX，FIX連同其輔因子FVIIIa一起活化FX。凝血效率由所產生的FXa及凝血酶之量決定，其中凝血酶為一種多功能酶，其使纖維蛋白原裂解為纖維蛋白且活化血小板。在具有低組織因子含量之組織(例如關節及肌肉)中，自FVIa-TF產生之FXa的量不足。因此，由FIXa-FVIIIa複合體提供之放大對於有效止血而言至關重要(Dahlbäck 2018)。
相比於凝血因子，如FVIII及FIX，蛋白質S為抗凝血劑，因為其充當活化蛋白質C及組織因子路徑抑制劑(TFPI)之輔因子。在無蛋白質S存在下，TFPIα為FXa之不佳抑制劑。同樣，在無蛋白質S之情況下，APC在抑制FVa及FVIIIa方面為低效的。因此，蛋白質S之功能喪失型突變導致小鼠及人類之不可控凝血。儘管如此，本發明人已出人意料地發現，用核酸降低蛋白質S之表現可為用於出血病症(諸如血友病)之適用治療。
當前血友病治療包括按需或在預防性治療之情況下用替代因子進行治療，以防止出血及保持健康的關節。然而，替代療法可能因出現針對FVIII及FIX之異體抗體而受到影響。此等情況發生在約25%至40%之嚴重血友病患者身上。此類患者需要用旁路藥劑及免疫耐受性誘導進行治療以根除抑制劑(Weyand及Pipe 2019)。
因此，在此項技術中明顯需要治療出血病症(諸如血友病)之新穎方式。本發明解決了此需要。
本發明之一個態樣為一種用於抑制PROS1表現之雙股核酸，其中該核酸包含第一股及第二股，其中該第一股序列包含至少15個核苷酸之序列，該序列與選自SEQ ID NO: 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、255、19、15、1、3、5、7、9、11、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47及49之序列中之任一者相差不超過3個核苷酸。
一個態樣係關於一種能夠抑制PROS1尤其在細胞中表現之雙股核酸，其用作藥物或相關診斷或治療方法，其中該核酸尤其包含第一股及第二股或由組成，且確切地說其中該第一股包含與PROS1 mRNA充分互補之序列以便介導RNA干擾。
一個態樣係關於一種組合物，其包含如本文中所揭示之核酸及溶劑(尤其水)及/或遞送媒劑及/或生理學上可接受之賦形劑及/或載劑及/或鹽及/或稀釋劑及/或緩衝劑及/或防腐劑。
一個態樣係關於一種組合物，其包含如本文所揭示之核酸及另一治療劑，該治療劑選自例如寡核苷酸、小分子、單株抗體、多株抗體及肽。
一個態樣係關於本文所揭示之核酸或組合物，其用作藥物或相關方法。
一個態樣係關於如本文所揭示之核酸或包含其之組合物，其用於預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症。
一個態樣係關於如本文所揭示之核酸或包含其之組合物的用途，其係用於預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症。出血病症尤其為血液凝血缺乏病症。血液凝血缺乏病症可為一種與延長之出血事件及/或凝血酶減少及/或凝血形成缺乏相關之病症。出血病症尤其為血友病、遺傳血友病、A型血友病、B型血友病、C型血友病、馮威里氏病(von Willebrand disease)、馮威里氏症候群(von Willebrand syndrome)、無纖維素原血症、低纖維素原血症、副血友病、關節血腫(AH)、凝血因子缺乏症、凝血因子II、V、VII、X及/或XI之遺傳缺乏症、因子V及VIII之組合缺乏症、後天性血友病、凝血因子後天性缺乏症及後天性出血病症。更特定言之，其為血友病，特定言之為A型血友病或B型血友病，最特定言之為A型血友病。
一個態樣係關於一種預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症之方法，其包含向需要治療之個體投與如本文所揭示之醫藥學上有效劑量或量之核酸或包含其之組合物，特定言之，其中該核酸或組合物係皮下、靜脈內或藉由經口、經直腸、經肺、肌肉內或腹膜內投與而向個體投與。
本發明係關於一種核酸，其為雙股的且包含PROS1之表現RNA轉錄物的一部分同源及/或互補的序列，及其組合物。此等核酸或其結合物或組合物可用於治療及預防出血病症。
本發明之第一態樣為一種用於抑制PROS1尤其在細胞中表現之雙股核酸，其中該核酸包含第一股及第二股，其中該第一股序列包含至少15個核苷酸之序列，該序列與選自SEQ ID NO: 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、255、19、15、1、3、5、7、9、11、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47及49之序列中之任一者相差不超過3個核苷酸。此等核酸以及其他核酸具有在與臨床前及臨床研發相關之各種物種中具有活性及/或具有很少相關的脫靶效應的優點。具有很少相關的脫靶效應意謂核酸特異性地抑制預期標靶且不顯著抑制其他基因，或僅以治療學上可接受之含量抑制一種或少數其他基因。
特定言之，第一股序列包含至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有19個核苷酸之序列或基本上由其組成，該序列與選自SEQ ID NO: 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、255、19、15、1、3、5、7、9、11、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47及49之序列中之任一者相差不超過3個核苷酸、特定言之不超過2個核苷酸、更特定言之不超過1個核苷酸且最特定言之不相差任何核苷酸。
特定言之，核酸之第一股序列由選自SEQ ID NO: 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、255、19、15、1、3、5、7、9、11、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47及49之序列中之任一者組成。然而，該序列可藉由不改變核苷酸之標識的多種核酸修飾來修飾。例如，核酸之主鏈或糖殘基之修飾不改變核苷酸之標識，因為鹼基本身保持與參考序列中相同。
包含根據本文中之參考序列之序列的核酸意謂核酸包含按如參考序列中所定義之次序的連續核苷酸序列。
當在本文中引用包含未顯示在該序列中經修飾之許多核苷酸或由其組成之序列時，該引用亦涵蓋相同核苷酸序列，其中一個、若干個，諸如兩個、三個、四個、五個、六個、七個或更多個，包括所有核苷酸藉由諸如2'-OMe、2'-F而經修飾連接至配位體或連接子，具有3'端或5'端修飾或任何其他修飾。其亦涵蓋其中兩個或更多個核苷酸藉由天然磷酸二酯鏈結或藉由任何其他鏈結(諸如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鏈結)彼此連接的序列。
雙股核酸為一種核酸，其中第一股與第二股在其長度之至少一部分上彼此雜交，且因此能夠在生理條件下，諸如在PBS中在37℃下以1 μM股之濃度形成雙螺旋區。第一股與第二股尤其能夠彼此雜交，且因此在至少15個核苷酸，尤其16、17、18或19個核苷酸之區域上形成雙螺旋區。此雙螺旋區包含兩股之間的核苷酸鹼基配對，特定言之基於沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對及/或擺動鹼基配對(諸如GU鹼基配對)。雙螺旋區內之兩股之所有核苷酸不必彼此鹼基配對以形成雙螺旋區。兩個股之核苷酸序列之間的某一數目個錯配、缺失或插入為可接受的。第一或第二股之任一端上的懸垂物或雙股核酸之任一端之未配對核苷酸亦為可能的。雙股核酸在生理條件下尤其為穩定雙股核酸，且例如在以1 μM各股之濃度的PBS中，尤其具有45℃或更高、50℃或更高、55℃或更高、60℃或更高、65℃或更高、70℃或更高、75℃或更高、80℃或更高或85℃或更高之解鏈溫度(Tm)。
第一股及第二股尤其能夠在i)它們長度之至少一部分，尤其它們長度之至少15個核苷酸，ii)第一股之整個長度，iii)第二股之整個長度，或iv)第一股與第二股之整個長度上形成雙螺旋區(亦即彼此互補)。在某一長度上彼此互補意謂股能夠經由沃森-克里克或擺動鹼基配對在彼長度上彼此鹼基配對。長度之各核苷酸未必必須能夠在整個給定長度上與另一股中之其對應物鹼基配對，只要可在生理條件下形成穩定雙股核苷酸即可。然而，在某些實施例中，若長度之各核苷酸可在整個給定長度上與其在另一股中之對應物鹼基配對，則為較佳的。
在siRNA之情況下第一股與目標序列之間或第一股與第二股之間可容忍一定數目之錯配、缺失或插入，且在某些情況下甚至具有增加RNA干擾(例如抑制)活性之潛力。
根據本發明之核酸之抑制活性依賴於在第一股之全部或一部分與目標核酸之一部分之間形成雙螺旋區。與第一股形成雙螺旋區之目標核酸部分(定義為以形成於第一股與目標序列之間的第一鹼基對開始且以形成於第一股與目標序列之間(包括端點)的最後一個鹼基對結束)為目標核酸序列或簡言之為目標序列。形成於第一股與第二股之間的雙螺旋區不必與形成於第一股與目標序列之間的雙螺旋區相同。亦即，第二股可具有不同於目標序列之序列；然而，至少在生理條件下第一股必須能夠與第二股及目標序列兩者形成雙螺旋結構。
第一股與目標序列之間的互補性可為完美的(亦即，相比於目標序列，在第一股中無核苷酸錯配或插入或缺失之100%一致性)。
第一股與目標序列之間的互補性可能不完美。互補可為約70%至約100%。更特定言之，互補性可為至少70%、80%、85%、90%或95%及中間值。
目標序列之第一股與互補序列之間的一致性可在約75%至約100%範圍內。更特定言之，互補性可為至少75%、80%、85%、90%或95%及中間值，其限制條件為核酸能夠降低或抑制PROS1之表現。
在第一股與目標序列之間具有小於100%互補性的核酸可以能夠PROS1表現降低至與在第一股與目標序列之間具有完美互補性的核酸相同的含量。或者，其能夠將PROS1之表現降低至藉由具有完美互補性之核酸達成之降低含量的15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的含量。
在一個態樣中，本發明之核酸係一種核酸，其中 (a)    該第一股序列包含與表1之該等第一股序列中之任一者相差不超過3個核苷酸之序列，且視情況其中該第二股序列包含與該表中之該第二股序列相差不超過3個核苷酸之序列； (b)    該第一股序列包含與表1之該等第一股序列中之任一者相差不超過2個核苷酸之序列，且視情況其中該第二股序列包含與該表中之該第二股序列相差不超過2個核苷酸之序列； (c)    該第一股序列包含與表1之該等第一股序列中之任一者相差不超過1個核苷酸之序列，且視情況其中該第二股序列包含與該表中之該第二股序列相差不超過1個核苷酸之序列； (d)    該第一股序列包含對應於表1之該等第一股序列中之任一者之5'端的核苷酸2至17的序列，且視情況其中該第二股序列包含對應於該表之同一列中該第二股序列之5'端的核苷酸2至17的序列； (e)    該第一股序列包含對應於表1之該等第一股序列中之任一者之5'端的核苷酸2至18的序列，且視情況其中該第二股序列包含對應於該表之同一列中該第二股序列之5'端的核苷酸2至18的序列； (f)    該第一股序列包含對應於表1之該等第一股序列中之任一者之5'端的核苷酸2至19的序列，且視情況其中該第二股序列包含對應於該表之同一列中該第二股序列之5'端的核苷酸2至19的序列； (g)    該第一股序列包含對應於表1之該等第一股序列中之任一者之5'端的核苷酸2至19的序列，且視情況其中該第二股序列包含對應於該表之同一列中該第二股序列之5'端的核苷酸1至18的序列； (h)    該第一股序列包含表1之該等第一股序列中之任一者的序列，且視情況其中該第二股序列包含該表中之同一列中該第二股序列的序列；或 (i)    該第一股序列由表1之該等第一股序列中之任一者組成，且視情況其中該第二股序列由該表中之同一列中該第二股序列的序列組成； 其中表1為： 表1
第一股序列 (SEQ ID NO:) 第二股序列 (SEQ ID NO:)
187 188
189 190
191 192
193 194
195 196
197 198
199 200
201 202
203 204
205 206
207 208
209 210
211 212
213 214
215 216
217 218
219 220
221 222
223 224
225 226
227 228
229 230
231 232
255 200
19 20
15 16
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11 12
13 14
17 18
21 22
23 24
25 26
27 28
29 30
31 32
33 34
35 36
37 38
39 40
41 42
43 44
45 46
47 48
49 42
122 135
122 107
123 136
123 109
在一個態樣中，核酸係一種核酸，其中： (a)    該第一股序列包含SEQ ID NO: 209之序列，且視情況其中該第二股序列包含SEQ ID NO: 210之序列； (b)    該第一股序列包含SEQ ID NO: 229之序列，且視情況其中該第二股序列包含SEQ ID NO: 230之序列； (c)    該第一股序列包含SEQ ID NO: 199之序列，且視情況其中該第二股序列包含SEQ ID NO: 200之序列；或 (d)    該第一股序列包含SEQ ID NO: 203之序列，且視情況其中該第二股序列包含SEQ ID NO: 204之序列。
在一個態樣中，若第一股之5'-大部分核苷酸為除A或U外之核苷酸，則此核苷酸經A或U置換。特定言之，若第一股之5'-大部分核苷酸為除U外之核苷酸，則此核苷酸經U置換，且更特定言之，經序列中之5' (E)-乙烯基膦酸酯置換。
在一個態樣中，第一股之5'端之第一核苷酸與第二股之對應核苷酸(若不存在錯配，則其將形成鹼基對之核苷酸)之間存在錯配。例如，第一股之5'核苷酸可為U且第二股中之對應核苷酸可為除A以外的任何核苷酸。在此情況下，兩個核苷酸不能形成經典沃森-克里克鹼基對且兩個核苷酸之間存在錯配。
當本發明之核酸不包含如例如表1中所給出之參考第一股及/或第二股序列之整個序列時，或一股或兩股與相應參考序列相差一個、兩個或三個核苷酸，與在相當的實驗中包含整個第一股及第二股參考序列之相應核酸之抑制活性相比，此核酸尤其保留至少30%、更特定言之至少50%、更特定言之至少70%、更特定言之至少80%、甚至更特定言之至少90%、更特定言之至少95%且最特定言之100%的PROS1抑制活性。
在一個態樣中，核酸為一種核酸，其中第一股序列包含SEQ ID NO: 209之序列或尤其由其組成，且視情況其中第二股序列包含SEQ ID NO: 210之序列的至少15個、特定言之至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有核苷酸的序列或尤其由其組成；或其中第一股序列包含SEQ ID NO: 229之序列或尤其由其組成，且視情況其中第二股序列包含SEQ ID NO: 230之序列的至少15個、特定言之至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有核苷酸的序列或尤其由其組成；或其中第一股序列包含SEQ ID NO: 199之序列或尤其由其組成，且視情況其中第二股序列包含SEQ ID NO: 200之序列的至少15個、特定言之至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有核苷酸的序列或尤其由其組成；或其中第一股序列包含SEQ ID NO: 203之序列或尤其由其組成，且視情況其中第二股序列包含SEQ ID NO: 204之序列的至少15個、特定言之至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有核苷酸的序列或尤其由其組成。
在一個態樣中，核酸係用於抑制PROS1尤其在細胞中表現之雙股核酸，其中該核酸包含第一核酸股及第二核酸股，其中該第一股能夠在生理條件下與選自SEQ ID NO: 188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、20、16、2、4、6、8、10、12、14、18、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48及50之序列的核酸雜交；且 其中該第二股能夠在生理條件下與該第一股雜交以形成雙螺旋區。
能夠在生理條件下雜交之核酸係能夠在股中之至少一部分相對核苷酸之間形成鹼基對(尤其沃森-克里克或擺動鹼基對)以便形成至少雙螺旋區的核酸。此類雙股核酸在生理條件下尤其為穩定雙股核酸(例如在PBS中在37℃下以各股1 μM之濃度)，此意謂在此類條件下，兩個股保持彼此雜交。雙股核苷酸之Tm尤其為45℃或更高，尤其50℃或更高且更尤其55℃或更高。
本發明之一個態樣係關於用於抑制PROS1尤其在細胞中表現之核酸，其中核酸包含與表4之序列中之任一者相差不超過3個核苷酸、特定言之不超過2個核苷酸、更特定言之不超過1個核苷酸且最特定言之不相差任何核苷酸之至少15個、特定言之至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有核苷酸的第一序列，該第一序列能夠在生理條件下與目標基因轉錄物(諸如mRNA)雜交。特定言之，該核酸進一步包含與表4之序列中之任一者相差不超過3個核苷酸、特定言之不超過2個核苷酸、更特定言之不超過1個核苷酸且最特定言之不相差任何核苷酸之至少15個、特定言之至少16個、更特定言之至少17個、又更特定言之至少18個且最特定言之所有核苷酸的第二序列，該第二序列能夠在生理條件下與第一序列雜交，且確切地說其中該核酸為能夠經由RNAi路徑抑制PROS1表現的siRNA。
一個態樣係關於如表2中所揭示之任何雙股核酸，其限制條件為該雙股核酸能夠抑制PROS1表現。此等核酸均為具有各種核苷酸修飾之siRNA。其中一些為包含GalNAc部分之結合物，該等GalNAc部分可藉由GalNAc受體特異性靶向細胞，諸如肝細胞。
一個態樣係關於一種能夠抑制PROS1尤其在細胞中表現之雙股核酸，其用作藥物或相關診斷或治療方法，其中該核酸尤其包含第一股及第二股或由組成，且確切地說其中該第一股包含與PROS1 mRNA充分互補之序列以便介導RNA干擾。
本文中所描述之核酸可能夠抑制PROS1尤其在細胞中之表現。核酸可能夠完全抑制PROS1表現，在用核酸處理後產生0%剩餘表現。核酸可能夠部分抑制PROS1表現。與在類似條件下不存在核酸相比，部分抑制意謂PROS1表現降低15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多或中間值。抑制含量可藉由將經處理樣品與未經處理樣品或經對照處理之樣品(諸如未靶向PROS1之siRNA)相比較來量測。抑制可藉由量測PROS1 mRNA及/或蛋白質含量或與蛋白質S存在或活性相關之生物標記物或指標的含量來量測。可在可能已在活體外用本文所描述之核酸處理的細胞中量測。或者或另外，抑制可在細胞(諸如肝細胞)或組織(諸如肝臟組織)或器官(諸如肝臟)中或在體液(諸如血液、血清、淋巴)中或獲自先前用本文中所揭示之核酸治療之個體的任何其他身體部分或流體中量測。特定言之，PROS1表現之抑制係藉由比較在理想條件下24小時或48小時用本文揭示之雙股RNA進行活體外處理之後在表現PROS1的細胞中量測之PROS1 mRNA含量(參見適當濃度及條件之實例)與在相同或至少類似條件下用對照雙股RNA進行處理或模擬處理之對照細胞中量測之PROS1 mRNA含量來確定。
本發明之一個態樣係關於一種核酸，其中第一股及第二股存在於環繞之核酸之單股上，使得第一股及第二股能夠彼此雜交且藉此與雙螺旋區形成雙股核酸。
特定言之，核酸之第一股及第二股為單獨股。兩個單獨股的長度尤其各自為17-25個核苷酸，更尤其18-25個核苷酸。兩股可具有相同或不同長度。第一股之長度可為17-25個核苷酸，特定言之，其長度可為18-24個核苷酸，其長度可為18、19、20、21、22、23或24個核苷酸。最特定言之，第一股之長度為19個核苷酸。第二股之長度可獨立地為17-25個核苷酸，特定言之，其長度可為18-24個核苷酸，其長度可為18、19、20、21、22、23或24個核苷酸。更特定言之，第二股之長度為18或19或20個核苷酸，且最特定言之，其長度為19個核苷酸。
特定言之，核酸之第一股及第二股形成長度為17-25個核苷酸之雙螺旋區。更特定言之，雙螺旋區之長度為18-24個核苷酸。雙螺旋區之長度可為17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在最特定實施例中，雙螺旋區長度為18或19個核苷酸。雙螺旋區在本文中定義為且包括與第二股之核苷酸成鹼基對的第一股之5'-大部分核苷酸至與第二股之核苷酸成鹼基對的第一股之3'-大部分核苷酸的區域。雙螺旋區可包含未與另一股中之核苷酸鹼基配對的任一或兩股中之核苷酸。其可在第一股及/或第二股上包含一個、兩個、三個或四個此類核苷酸。然而，尤其雙螺旋區由17-25個連續核苷酸鹼基對組成。換言之，其在兩股上尤其包含17-25個連續核苷酸，所有鹼基與另一股中之核苷酸配對。更特定言之，雙螺旋區由18或19個連續核苷酸鹼基對，最特定言之18個組成。
在本文所揭示之各實施例中，核酸可在兩端處鈍端；在一端處具有懸垂物且在另一端處具有鈍端；或在兩端處具有懸垂物。
核酸可在一端處具有懸垂物且在另一端處具有鈍端。核酸可在兩端處具有懸垂物。核酸在兩端處可為鈍端。核酸可在第一股之5'端和第二股之3'端或在第一股之3'端和第二股之5'端處為鈍端。
核酸可在3'端或5'端處包含懸垂物。核酸可在第一股上具有3'懸垂物。核酸可在第二股上具有3'懸垂物。核酸可在第一股上具有5'懸垂物。核酸可在第二股上具有5'懸垂物。核酸可在第一股之5'端及3'端處均具有懸垂物。核酸可在第二股之5'端及3'端均具有懸垂物。核酸可在第一股具有5'端懸垂物且在第二股具有3'端懸垂物。核酸可在第一股具有3'端懸垂物且在第二股具有5'端懸垂物。核酸可在第一股具有3'端懸垂物且在第二股具有3'端懸垂物。核酸可在第一股具有5'端懸垂物且在第二股具有5'端懸垂物。
第二股或第一股之3'端或5'端處之懸垂物可由長度為1、2、3、4及5個核苷酸組成。視情況，懸垂物可由1或2個核苷酸組成，其可經修飾或可不經修飾。
在一個實施例中，第一股之5'端為一個、兩個或三個核苷酸，尤其一個核苷酸之單股懸垂物。
詳言之，核酸為siRNA。siRNA為能夠經由RNA干擾(RNAi)路徑抑制目標基因表現之短干擾或短緘黙RNA。抑制經由轉錄後目標基因之mRNA轉錄物之靶向降解發生。siRNA形成RISC複合體之一部分。RISC複合體藉由第一(反義)股與目標序列之序列互補而特異性靶向目標RNA。
特定言之，核酸能夠抑制PROS1。該抑制尤其由RNA干擾(RNAi)機制介導。特定言之，核酸以至少50%抑制、更特定言之至少70%、更特定言之至少80%、甚至更特定言之至少90%、又更特定言之至少95%且最特定言之100%抑制之功效介導RNA干擾(亦即，其能夠抑制其標靶)。在可比實驗中，抑制功效尤其藉由將用PROS1特異性siRNA處理之細胞(諸如肝細胞)中之PROS1 mRNA含量與用對照處理之細胞中之PROS1 mRNA含量進行比較來量測。對照可為用靶向siRNA或不靶向siRNA之非PROS1處理。核酸或至少核酸之第一股因此特別能夠併入至RISC複合體中。因此，核酸或至少核酸之第一股因此能夠將RISC複合體引導至特定目標RNA，核酸或至少核酸之第一股與該特定目標RNA至少部分互補。RISC複合體隨後特異性裂解此目標RNA且因此導致抑制RNA來源基因的表現。
一尤其較佳實施例為一種核酸，其中第一股包含SEQ ID NO: 233或由其組成，且第二股視情況包含SEQ ID NO: 256或由其組成。此核酸可進一步與配位體結合。甚至更佳為一種核酸，其中第一股包含SEQ ID NO: 233或由其組成，且第二股視情況包含SEQ ID NO: 234或由其組成。在此情況下最佳為由SEQ ID NO: 233及SEQ ID NO: 234組成之siRNA。本發明之一個態樣為EU161。
替代性尤其較佳實施例為一種核酸，其中第一股包含SEQ ID NO: 237或由其組成，且第二股視情況包含SEQ ID NO: 257或由其組成。此核酸可進一步與配位體結合。甚至更佳為一種核酸，其中第一股包含SEQ ID NO: 237或由其組成，且第二股視情況包含SEQ ID NO: 238或由其組成。在此情況下最佳為由SEQ ID NO: 237及SEQ ID NO: 238組成之siRNA。本發明之一個態樣為EU163。
替代性尤其較佳實施例為一種核酸，其中第一股包含SEQ ID NO: 251或由其組成，且第二股視情況包含SEQ ID NO: 258或由其組成。此核酸可進一步與配位體結合。甚至更佳為一種核酸，其中第一股包含SEQ ID NO: 251或由其組成，且第二股視情況包含SEQ ID NO: 252或由其組成。在此情況下最佳為由SEQ ID NO: 251及SEQ ID NO: 252組成之siRNA。本發明之一個態樣為EU170。
本發明之一個態樣係關於蛋白質S抑制劑，諸如siRNA、抗體、小分子、肽、蛋白質或降低血液中蛋白質S之含量或阻斷其活性的任何其他藥劑，用於治療出血病症，特定言之血友病。特定言之，蛋白質S抑制劑係用於抑制人類蛋白質S且尤其用於治療有需要之人類個體。
核酸修飾本文所論述之核酸包括未經修飾之RNA以及已經修飾例如以改良功效或穩定性之RNA。未經修飾之RNA係指核酸之組分(亦即糖、鹼基及磷酸酯部分)與自然界中存在之組分(例如人類體內天然存在之組分)相同或基本上相同的分子。如本文所用之術語「經修飾之核苷酸」係指其中核苷酸之組分中之一或多者(亦即糖、鹼基及磷酸酯部分)不同於自然界中存在之核苷酸的核苷酸。在某些情況下，術語「經修飾之核苷酸」亦指作為術語嚴格意義上之核苷酸的分子，因為其缺乏或取代核苷酸之必要組分(諸如糖、鹼基或磷酸酯部分)。包含此類經修飾之核苷酸的核酸仍應理解為核酸，即使核酸之核苷酸中之一或多者已經經修飾之核苷酸置換，該經修飾之核苷酸缺少或具有核苷酸之必要組分之取代。
本發明之核酸之修飾一般提供一種克服潛在限制之強力工具，該等可能限制包括(但不限於)天然RNA分子固有之活體外及活體內穩定性及生物可用性。根據本發明之核酸可藉由化學修飾來修飾。經修飾之核酸亦可最小化在人體內誘導干擾素活性之可能性。修飾可進一步增強核酸對目標細胞之功能性遞送。本發明之經修飾之核酸可包含第一股或第二股中之任一者或兩者的一或多種經化學修飾之核糖核苷酸。核糖核苷酸可包含鹼基、糖或磷酸酯部分之化學修飾。核糖核酸可藉由用核酸或鹼基之類似物取代或插入來修飾。
在本發明之說明書通篇中，「相同或共同修飾」意謂對任何核苷酸之相同修飾，其為經諸如甲基(2'-OMe)或氟基(2'-F)之基團修飾的A、G、C或U。例如，2'-F-dU、2'-F-dA、2'-F-dC、2'-F-dG均被認為係相同或共同修飾，2'-OMe-rU；2'-OMe-rA；2'-OMe-rC；2'-OMe-rG亦如此。相比之下，2'-F修飾為相比於2'-OMe修飾不同的修飾。
特定言之，核酸之第一及/或第二股之至少一個核苷酸為經修飾之核苷酸，特定言之為非天然存在之核苷酸，諸如2'-F修飾之核苷酸。
經修飾之核苷酸可為具有糖基團修飾之核苷酸。2'羥基(OH)可經多個不同「氧基」或「去氧基」取代基修飾或置換。
「氧基」-2'羥基修飾之實例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R═H、烷基(諸如甲基)、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2OR；「鎖定」核酸(LNA)，其中2'羥基例如藉由亞甲基橋與相同核糖糖之4'碳連接；O-胺(胺=NH 2、烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)及胺基烷氧基、O(CH 2) n胺(例如，胺=NH 2、烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)。
「去氧基」修飾包括氫、鹵素、胺基(例如，NH 2、烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH 2CH 2NH) nCH 2CH 2-胺(胺=NH 2、烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基)、-NHC(O)R (R=烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫代烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經例如胺基官能基取代。某些實施例之其他取代基包括2'-甲氧基乙基、2'-OCH 3、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基及2'-氟。
糖基亦可含有一或多個碳，其具有與核糖中之相應碳相反的立體化學構型。因此，經修飾之核苷酸可含有糖，諸如阿拉伯糖。
經修飾之核苷酸亦可包括「無鹼基」糖，其在C-1'處缺乏核鹼基。此等無鹼基糖可進一步含有在組成性糖原子中之一或多者處的修飾。
2'修飾可與一或多個磷酸酯核苷間連接子修飾(例如，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)組合使用。
本發明之核酸之一或多個核苷酸可經修飾。核酸可包含至少一個經修飾之核苷酸。經修飾之核苷酸可在第一股中。經修飾之核苷酸可在第二股中。經修飾之核苷酸可在雙螺旋區中。經修飾之核苷酸可在雙螺旋區外部，亦即，在單股區中。經修飾之核苷酸可在第一股上且可在雙螺旋區外部。經修飾之核苷酸可在第二股上且可在雙螺旋區外部。第一股之3'-末端核苷酸可為經修飾之核苷酸。第二股之3'-末端核苷酸可為經修飾之核苷酸。第一股之5'-末端核苷酸可為經修飾之核苷酸。第二股之5'-末端核苷酸可為經修飾之核苷酸。
本發明之核酸可具有1個經修飾之核苷酸或本發明之核酸可具有約2-4個經修飾之核苷酸，或核酸可具有約4-6個經修飾之核苷酸、約6-8個經修飾之核苷酸、約8-10個經修飾之核苷酸、約10-12個經修飾之核苷酸、約12-14個經修飾之核苷酸、約14-16個經修飾之核苷酸、約16-18個經修飾之核苷酸、約18-20經修飾之核苷酸、約20-22經修飾之核苷酸、約22-24個經修飾之核苷酸、約24-26個經修飾之核苷酸或約26-28個經修飾之核苷酸。在各種情況下，包含該經修飾之核苷酸的核酸相比於不含該等經修飾之核苷酸的相同核酸保持其活性之至少50%，或反之亦然。核酸相比於相同核酸但不含該等經修飾之核苷酸可保留其活性之55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%及中間值，或可具有不含該等經修飾之核苷酸的相同核酸的超過100%活性。
經修飾之核苷酸可為嘌呤或嘧啶。至少一半嘌呤可經修飾。至少一半嘧啶可經修飾。所有嘌呤可經修飾。所有嘧啶可經修飾。經修飾之核苷酸可選自由以下組成之群：3'末端去氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2'-O-甲基(2'-OMe)修飾之核苷酸、2'修飾之核苷酸、2'去氧修飾之核苷酸、鎖定核苷酸、無鹼基核苷酸、2'胺基修飾之核苷酸、2'烷基修飾之核苷酸、2'-去氧-2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸、N-𠰌啉基核苷酸、胺基磷酸酯、包含核苷酸之非天然鹼基、包含5'-硫代磷酸基團之核苷酸，包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物之核苷酸及連接至膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團之末端核苷酸。
核酸可包含包含有修飾鹼基之核苷酸，其中該鹼基選自2-胺基腺苷、2,6-二胺基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氫尿苷、萘基、胺基苯基、5-烷基胞苷(例如，5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如，核糖胸苷)、5-鹵代尿苷(例如，5-溴尿苷)、6-氮雜嘧啶、6-烷基嘧啶(例如，6-甲基尿苷)、丙炔、Q核苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、懷俄丁苷(wybutosine)、懷丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙醯基胞苷、5-(羧基羥甲基)尿苷、5'-羧甲基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基胺甲基尿苷、β-D-半乳糖苷基Q核苷、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鳥苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鳥苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鳥苷、5-甲氧基胺基甲基-2-硫代尿苷、5-甲基胺基甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲基氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲基硫基-N6-異戊烯基腺苷、β-D-甘露糖苷基Q核苷、尿苷-5-氧乙酸及2-硫代胞苷。
本文中所描述且在核酸內出現之許多修飾將在多核苷酸分子內重複，諸如鹼基或磷酸酯部分或磷酸酯部分之非連接O之修飾。在一些情況下，修飾將發生在多核苷酸中的所有可能位置/核苷酸處，但在許多情況下將不存在該修飾。修飾可僅出現在3'或5'末端位置，可僅出現在末端區域，諸如末端核苷酸上的位置或股之最後2、3、4、5或10個核苷酸中。修飾可出現在雙股區域、單股區域或其兩者中。修飾可僅在本發明之核酸之雙股區域中進行，或可僅在本發明之核酸之單股區域中進行。非連接O位置處之硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾可僅出現在一個或兩個末端處，可僅出現在末端區域中，例如在末端核苷酸上的位置或在股之最後2、3、4或5個核苷酸中，或可出現在雙股及/或單股區域中，尤其在末端。5'端及/或3'端可為磷酸化的。
本發明之核酸之穩定性可藉由在懸垂物中包括特定鹼基或藉由在單股懸垂物中包括經修飾之核苷酸，例如在5'或3'懸垂物中或在兩者中增加。嘌呤核苷酸可包括於懸垂物中。可修飾3'或5'懸垂物中之所有或一些鹼基。修飾可包括使用在核糖糖之2'OH基團的修飾，使用去氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸，以及在磷酸酯基團中之修飾，諸如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾。懸垂物無需與目標序列同源。
核酸酶可水解核酸磷酸二酯鏈結。然而，對核酸之化學修飾可賦予改良之特性，且可使寡核苷酸對核酸酶更穩定。
如本文所用，經修飾之核酸可包括以下中之一或多者： (i)    改變，例如置換非連接磷酸酯氧中之一或兩者及/或連接磷酸酯氧中之一或多者(即使在本發明之核酸的5'及3'末端亦稱為連接)； (ii)   改變，例如，置換核糖糖之成分，例如，核糖糖上的2'羥基； (iii)  用「去磷酸」連接子置換磷酸酯部分； (iv)   修飾或置換天然存在之鹼基； (v)    置換或修飾核糖-磷酸酯主鏈；及 (vi)   第一股及/或第二股之3'端或5'端的修飾，例如，末端磷酸酯基團之移除、修飾或置換或部分(例如經螢光標記之部分)與一或兩股之3'或5'端的結合。
術語置換、修飾、改變指示與天然存在之分子的差異。
特定修飾更詳細地論述於下文中。
核酸可在第二及/或第一股上包含一或多個經修飾之核苷酸。替代核苷酸可經修飾以形成經修飾之核苷酸。
如本文中所描述之交替意謂以規則方式一個接一個地出現。換言之，交替意謂依次重複出現。例如，若一個核苷酸經修飾，則下一連續核苷酸未經修飾，且以下連續核苷酸經修飾等等。可用第一修飾來修飾一個核苷酸，可用第二修飾來修飾下一個連續核苷酸，且用第一修飾來修飾後面的連續核苷酸，諸如此類，其中第一及第二修飾係不同的。
本發明之一些代表性經修飾之核酸序列顯示於實例中。此等實例意欲為代表性的且不為限制性的。
在核酸之一個態樣中，第一股之至少核苷酸2及14經修飾，特定言之藉由第一共同修飾來修飾，該等核苷酸以第一股5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。第一修飾尤其為2'-F。
在一個態樣中，第一股之至少一個、若干個或特定言之所有偶數編號之核苷酸經修飾，特定言之藉由第一共同修飾來修飾，該等核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。第一修飾尤其為2'-F。
在一個態樣中，第一股之至少一個、若干個或特定言之所有奇數編號之核苷酸經修飾，該等核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。特定言之，其藉由第二修飾來修飾。若核酸亦包含第一修飾，例如核苷酸2及14或第一股之所有偶數編號之核苷酸的第一修飾，則此第二修飾尤其不同於第一修飾。第一修飾尤其為與2'-OH基團、或鎖定核酸(LNA)、或解鎖核酸(UNA)或2'-氟阿拉伯核酸(FANA)修飾具有相同大小或體積更小的任何2'核糖修飾。與2'-OH基團大小相同或體積更小之2'核糖修飾例如可為2'-F、2'-H、2'-鹵基或2'-NH 2。第二修飾尤其為體積大於2'-OH基團之任何2'核糖修飾。體積大於2'-OH基團之2'核糖修飾例如可為2'-OMe、2'-O-MOE (2'-O-甲氧基乙基)、2'-O-烯丙基或2'-O-烷基，其限制條件為在類似條件下，該核酸能夠在不進行修飾之情況下將目標基因的表現降低至至少與不具有修飾之相同核酸至少相同的程度。第一修飾尤其為2'-F及/或第二修飾尤其為2'-OMe。
在本發明之上下文中，取代基(諸如2'核糖修飾)之大小或體積特定地量測為凡得瓦爾(van der Waals)體積。
在一個態樣中，第二股之至少一個、若干個或特定言之所有核苷酸在對應於第一股之偶數編號之核苷酸的位置經修飾，特定言之藉由第三修飾來修飾。特定言之，在相同核酸核苷酸中，第一股之核苷酸2及14或所有偶數編號之核苷酸經第一修飾來修飾。另外或替代地，第一股之奇數編號之核苷酸經第二修飾來修飾。特定言之，第三修飾不同於第一修飾及/或第三修飾與第二修飾相同。第一修飾尤其為與2'-OH基團、或鎖定核酸(LNA)、或解鎖核酸(UNA)或2'-氟阿拉伯核酸(FANA)修飾具有相同大小或體積更小的任何2'核糖修飾。與2'-OH基團大小相同或體積更小之2'核糖修飾例如可為2'-F、2'-H、2'-鹵基或2'-NH 2。第二及/或第三修飾尤其為體積大於2'-OH基團之任何2'核糖修飾。體積大於2'-OH基團之2'核糖修飾例如可為2'-OMe、2'-O-MOE (2'-O-甲氧基乙基)、2'-O-烯丙基或2'-O-烷基，其限制條件為在類似條件下，該核酸能夠在不進行修飾之情況下將目標基因的表現降低至至少與不具有修飾之相同核酸至少相同的程度。第一修飾尤其為2'-F及/或第二及/或第三修飾尤其為2'-OMe。第一股上之核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。
位於例如與第一股之偶數編號之核苷酸對應的位置的第二股之核苷酸為與第一股之偶數編號之核苷酸鹼基配對的第二股之核苷酸。
在一個態樣中，第二股之至少一個、若干個或特定言之全部核苷酸在對應於第一股之奇數編號之核苷酸的位置中特定言之藉由第四修飾來修飾。特定言之，在相同核酸核苷酸中，第一股之核苷酸2及14或所有偶數編號之核苷酸經第一修飾來修飾。另外或替代地，第一股之奇數編號之核苷酸經第二修飾來修飾。另外或替代地，與第一股之偶數編號之核苷酸對應之位置的第二股之所有核苷酸均用第三修飾來修飾。第四修飾特別地不同於第二修飾，且特別地不同於第三修飾，且第四修飾特別地與第一修飾相同。第一及/或第四修飾尤其為與2'-OH基團、或鎖定核酸(LNA)、或解鎖核酸(UNA)或2'-氟阿拉伯核酸(FANA)修飾具有相同大小或體積更小的任何2'核糖修飾。與2'-OH基團大小相同或體積更小之2'核糖修飾例如可為2'-F、2'-H、2'-鹵基或2'-NH 2。第二及/或第三修飾尤其為體積大於2'-OH基團之任何2'核糖修飾。體積大於2'-OH基團之2'核糖修飾例如可為2'-OMe、2'-O-MOE (2'-O-甲氧基乙基)、2'-O-烯丙基或2'-O-烷基，其限制條件為在類似條件下，該核酸能夠在不進行修飾之情況下將目標基因的表現降低至至少與不具有修飾之相同核酸至少相同的程度。第一及/或第四修飾尤其為2'-OMe修飾及/或第二及/或第三修飾尤其為2'-F修飾。第一股上之核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。
在核酸之一個態樣中，與第一股之核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11及13或核苷酸11-13對應之位置的第二股之核苷酸/核苷酸藉由第四修飾來修飾。特定言之，除與第一股之核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11及13或核苷酸11-13對應之位置中的核苷酸/核苷酸外的第二股之所有核苷酸均藉由第三修飾來修飾。特定言之，在相同核酸核苷酸中，第一股之核苷酸2及14或所有偶數編號之核苷酸經第一修飾來修飾。另外或替代地，第一股之奇數編號之核苷酸經第二修飾來修飾。第四修飾特別地不同於第二修飾，且特別地不同於第三修飾，且第四修飾特別地與第一修飾相同。第一及/或第四修飾尤其為與2'-OH基團、或鎖定核酸(LNA)、或解鎖核酸(UNA)或2'-氟阿拉伯核酸(FANA)修飾具有相同大小或體積更小的任何2'核糖修飾。與2'-OH基團大小相同或體積更小之2'核糖修飾例如可為2'-F、2'-H、2'-鹵基或2'-NH 2。第二及/或第三修飾尤其為體積大於2'-OH基團之任何2'核糖修飾。體積大於2'-OH基團之2'核糖修飾例如可為2'-OMe、2'-O-MOE (2'-O-甲氧基乙基)、2'-O-烯丙基或2'-O-烷基，其限制條件為在類似條件下，該核酸能夠在不進行修飾之情況下將目標基因的表現降低至至少與不具有修飾之相同核酸至少相同的程度。第一及/或第四修飾尤其為2'-OMe修飾及/或第二及/或第三修飾尤其為2'-F修飾。第一股上之核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。
在核酸之一個態樣中，第一股之所有偶數編號之核苷酸藉由第一修飾來修飾，第一股之所有奇數編號之核苷酸藉由第二修飾來修飾，在對應於該第一股之偶數編號之核苷酸之位置的第二股之所有核苷酸均藉由第三修飾來修飾，在對應於該第一股之奇數編號之核苷酸之位置的第二股之所有核苷酸均藉由第四修飾來修飾，其中第一及/或第四修飾為(is/are) 2'-F及/或第二及/或第三修飾為2'-OMe。
在核酸之一個態樣中，第一股之所有偶數編號之核苷酸藉由第一修飾來修飾，第一股之所有奇數編號之核苷酸藉由第二修飾來修飾，在對應於該第一股之核苷酸11-13之位置的第二股之所有核苷酸均藉由第四修飾來修飾，除與第一股之核苷酸11-13對應之核苷酸外的第二股之所有核苷酸藉由第三修飾來修飾，其中第一及第四修飾為2'-F及第二及第三修飾為2'-OMe。在此態樣之一個實施例中，第二股之3'末端核苷酸為反向RNA核苷酸(亦即，核苷酸經由其3'碳而非經由通常情況下通過其5'碳連接到股的3'端)。當第二股之3'末端核苷酸為反向RNA核苷酸時，反向RNA核苷酸尤其為未修飾之核苷酸，意義在於其不包含相比於天然核苷酸對應物之任何修飾。特定言之，反向RNA核苷酸尤其為2'-OH核苷酸。特定言之，在此態樣中，當第二股之3'末端核苷酸為反向RNA核苷酸時，核酸至少在包含第一股之5'端的末端為鈍端。
本發明之一個態樣為如本文中所揭示之用於抑制PROS1基因尤其在細胞中表現的核酸，其中該第一股包括複數個位置處之經修飾之核苷酸或未經修飾之核苷酸以便於藉由RISC處理核酸。
在一個態樣中，「便於藉由RISC處理」意謂核酸可由RISC處理，例如，存在之任何修飾將准許核酸由RISC處理且特定言之，將有益於由RISC處理，適當地使得可發生siRNA活性。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中第一股之5'端的位置2及14處的核苷酸未經2'OMe修飾，且對應於第一股之位置11或位置13或位置11及13或位置11、12及13之第二股上之核苷酸/核苷酸未經2'-OMe修飾(換言之，其為天然存在之核苷酸或經除2'-OMe以外的修飾來修飾)。
在一個態樣中，第二股上對應於第一股之位置13的核苷酸為與第一股之位置13 (自5'端)形成鹼基對的核苷酸。
在一個態樣中，第二股上對應於第一股之位置11的核苷酸為與第一股之位置11 (自5'端)形成鹼基對的核苷酸。
在一個態樣中，第二股上對應於第一股之位置12的核苷酸為與第一股之位置12 (自5'端)形成鹼基對的核苷酸。
例如，在雙股及鈍端之19-mer核酸中，第一股之位置13 (自5'端)與第二股之位置7 (自5'端)配對。第一股之位置11 (自5'端)將與第二股之位置9 (自5'端)配對。此命名法可應用於第二股之其他位置。
在一個態樣中，在部分互補之第一股及第二股的情況下，若第二股上之核苷酸「對應於」第一股上之位置為存在錯配的位置，則該位置不一定形成鹼基對，但命名法原理仍適用。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中第一股之5'端的位置2及14處的核苷酸未經2'-OMe修飾，且對應於第一股之位置11或13或11及13或11-13之第二股上之核苷酸經2'-F修飾。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中第一股之5'端的位置2及14處的核苷酸經2'-F修飾，且對應於第一股之位置11或13或11及13或11-13之第二股上之核苷酸未經2'-OMe修飾。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中第一股之5'端的位置2及14處的核苷酸經2'-F修飾，且對應於第一股之位置11或13或11及13或11-13之第二股上之核苷酸經2'-F修飾。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中大於50%之第一及/或第二股之核苷酸包含2'-OMe修飾，諸如大於55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%或更多之第一及/或第二股包含2'-OMe修飾。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中大於50%之第一及/或第二股之核苷酸包含天然存在之RNA修飾，諸如其中大於55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%或更多之第一及/或第二股包含此類修飾。適合的天然存在之修飾包括以及2'-OMe，其他2'糖修飾，尤其2'-H修飾，產生DNA核苷酸。
一個態樣為如本文中所揭示之核酸，其包含不超過20%，諸如不超過15%，諸如不超過10%的核苷酸，其在第一及/或第二股上具有2'修飾，而不為2'-OMe修飾。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中具有的2'-O修飾不為2'-OMe修飾的第一及/或第二股中之核苷酸數目不超過7個，更特定言之不超過5個，且最特定言之不超過3個。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其包含第一及/或第二股上之不超過20% (諸如不超過15%或不超過10%) 2'-F修飾。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中具有2'-F修飾之第一股及/或第二股中之核苷酸數目不超過7個，更特定言之不超過5個，且最特定言之不超過3個。
一個態樣為如本文所揭示之核酸，其中除第一股之5'端的位置2及14及對應於第一股之位置11或13或11及13或11-13之第二股上的核苷酸以外，其中所有核苷酸經2'-OMe修飾。特定言之，未經2'-OMe修飾之核苷酸在2'位置經氟修飾(2'-F修飾)。
特定言之，核酸之所有核苷酸在糖之2'位置經修飾。特定言之，此等核苷酸經2'-F修飾來修飾，其中修飾不為2'-OMe修飾。
在一個態樣中，核酸在第一股上經修飾而具有交替的2'-OMe修飾及2-F修飾，且位置2及14 (始於5'端)經2'-F修飾。特定言之，第二股在第二股上對應於第一股之位置11或13或11及13或11-13之核苷酸處經2'-F修飾。特定言之，第二股在互補(雙股)區之第一位置開始自3'端起的位置11-13計數經2'-F修飾來修飾，且其餘修飾為天然存在之修飾，尤其為2'-OMe。互補區至少在此情況下開始於第二股之在第一股中具有對應核苷酸之第一位置，不管兩個核苷酸是否能夠彼此鹼基配對。
在核酸之一個態樣中，第一股及第二股之各核苷酸為經修飾之核苷酸。
除非另外特定說明，否則在本文中，第一股之核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續地編號。第二股之核苷酸以第二股之3'端處之核苷酸編號1開始連續編號。
若未指示核苷酸編號之末端，則「奇數編號之」核苷酸為以股中之奇數數字編號的核苷酸，其中該等核苷酸自指定末端或自股之5'端連續編號。若未指示核苷酸編號之末端，則「偶數編號之」核苷酸為以股中之偶數數字編號的核苷酸，其中該等核苷酸自指定末端或自股之5'端連續編號。
第一及/或第二股上之一或多個核苷酸可經修飾以形成經修飾之核苷酸。第一股之奇數編號之核苷酸中之一或多者可經修飾。第一股之偶數編號之核苷酸中之一或多者可藉由至少第二修飾來修飾，其中至少第二修飾不同於一或多種奇數核苷酸上之修飾。一或多個經修飾之偶數編號的核苷酸中之至少一者可與一或多個經修飾之奇數編號的核苷酸中之至少一者相鄰。
第一股中之複數個奇數編號之核苷酸可在本發明之核酸中修飾。第一股中之複數個偶數編號之核苷酸可藉由第二修飾修飾。第一股可包含相鄰核苷酸，其藉由共同修飾來修飾。第一股亦可包含藉由第二不同修飾來修飾之相鄰核苷酸(亦即，第一股可包含彼此相鄰且藉由第一修飾來修飾之核苷酸以及與彼此相鄰且藉由不同於第一修飾之第二修飾來修飾之其他核苷酸)。
第二股之奇數編號之核苷酸中的一或多者(其中該等核苷酸以第二股之3'端處之核苷酸編號1開始連續編號)可藉由不同於第一股上之奇數編號之核苷酸之修飾的修飾來進行修飾(其中該等核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號)及/或第二股之偶數編號之核苷酸中的一或多者可藉由與第一股之奇數編號之核苷酸之相同的修飾來進行修飾。第二股之一或多個經修飾之偶數編號的核苷酸中之至少一者可與一或多個經修飾之奇數編號的核苷酸相鄰。第二股之複數個奇數編號之核苷酸可藉由共同修飾來修飾及/或複數個偶數編號之核苷酸可藉由存在於第一股奇數編號之核苷酸上的相同修飾來修飾。第二股上之複數個奇數編號之核苷酸可藉由不同於第一股奇數編號之核苷酸之修飾的修飾來進行修飾。
第二股可包含藉由共同修飾來修飾之相鄰核苷酸，該共同修飾可為不同於第一股之奇數編號之核苷酸之修飾的修飾。
在本發明之核酸中，第一股中之奇數編號之核苷酸中之每一者及第二股中之偶數編號之核苷酸中之每一者可經共同修飾來進行修飾，且偶數編號之核苷酸中之每一者可在第一股中經不同修飾來進行修飾，且奇數編號之核苷酸中之每一者可在第二股中經不同修飾來進行修飾。
本發明之核酸可使第一股之經修飾之核苷酸相對於第二股之未經修飾或不同修飾之核苷酸移位至少一個核苷酸。
奇數編號之核苷酸中之一或多者或每一者可在第一股中經修飾，且偶數編號之核苷酸中之一或多者或每一者可在第二股中經修飾。任一股或兩股上交替核苷酸中之一或多者或每一者可藉由第二修飾來修飾。偶數編號之核苷酸中之一或多者或每一者可在第一股中經修飾，且偶數編號之核苷酸中之一或多者或每一者可在第二股中經修飾。任一股或兩股上交替核苷酸中之一或多者或每一者可藉由第二修飾來修飾。奇數編號之核苷酸中之一或多者或每一者可在第一股中經修飾，且奇數編號之核苷酸中之一或多者可在第二股中藉由共同修飾來修飾。任一股或兩股上交替核苷酸中之一或多者或每一者可藉由第二修飾來修飾。偶數編號之核苷酸中之一或多者或每一者可在第一股中經修飾，且奇數編號之核苷酸中之一或多者可在第二股中藉由共同修飾來修飾。任一股或兩股上交替核苷酸中之一或多者或每一者可藉由第二修飾來修飾。
本發明之核酸可包含單股或雙股構築體，該構築體包含在一股或兩股中之至少兩個交替修飾區。此等交替區域可包含至多約12個核苷酸，但特定言之包含約3至約10個核苷酸。交替核苷酸之區域可位於本發明之核酸之一股或兩股的末端。核酸可在末端中之每一者(3'及5')處包含4至約10個核苷酸之交替核苷酸，且此等區域可由約5至約12個連續未經修飾或不同或共同修飾之核苷酸間隔開。
第一股之奇數編號之核苷酸可經修飾且偶數編號之核苷酸可經第二修飾來修飾。第二股可包含經共同修飾來修飾之相鄰核苷酸，該共同修飾可與第一股之奇數編號之核苷酸的修飾相同。第二股之一或多個核苷酸亦可用第二修飾來修飾。具有第二修飾之一或多個核苷酸可彼此鄰接且與具有與第一股之奇數編號之核苷酸的修飾相同之修飾的核苷酸相鄰。第一股亦可在3'端及5'端之兩個核苷酸之間包含硫代磷酸酯鏈結或在3'端之兩個核苷酸之間包含二硫代磷酸酯鏈結。第二股可在5'端之兩個核苷酸之間包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鏈結。第二股亦可在5'端與配位體結合。
本發明之核酸可包含第一股，該第一股包含經共同修飾來修飾之相鄰核苷酸。一或多個此類核苷酸可鄰近於一或多個可經第二修飾來修飾之核苷酸。具有第二修飾之一或多個核苷酸可為相鄰的。第二股可包含經共同修飾來修飾之相鄰核苷酸，該共同修飾可與第一股之一或多個核苷酸之修飾中之一者相同。第二股之一或多個核苷酸亦可用第二修飾來修飾。具有第二修飾之一或多個核苷酸可為相鄰的。第一股亦可在3'端及5'端之兩個核苷酸之間包含硫代磷酸酯鏈結或在3'端之兩個核苷酸之間包含二硫代磷酸酯鏈結。第二股可在3'端之兩個核苷酸之間包含硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鏈結。第二股亦可在5'端與配位體結合。
在第一股上自5'至3'及第二股上自3'至5'編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23及25之核苷酸可藉由第一股上之修飾來進行修飾。編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之核苷酸可藉由第一股上之第二修飾來進行修飾。編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23之核苷酸可藉由第二股上之修飾來進行修飾。編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之核苷酸可藉由第二股上之第二修飾來進行修飾。出於本發明之核酸的原因，核苷酸在第一股上自5'至3'進行編號，且在第二股上自3'至5'進行編號。
編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之核苷酸可藉由第一股上之修飾來進行修飾。編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23之核苷酸可藉由第一股上之第二修飾來進行修飾。編號1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23之核苷酸可藉由第二股上之修飾來進行修飾。編號2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22及24之核苷酸可藉由第二股上之第二修飾來進行修飾。
明顯地，若第一及/或第二股長度比25個核苷酸短，諸如長度為19個核苷酸，則不存在待修飾之編號為20、21、22、23、24及25的核苷酸。熟習此項技術者理解以上描述適用於較短股。
第一股上之一或多個經修飾之核苷酸可與第二股上具有共同修飾之經修飾之核苷酸配對。第一股上之一或多個經修飾之核苷酸可與第二股上具有不同修飾之經修飾之核苷酸配對。第一股上之一或多個經修飾之核苷酸可與第二股上之未經修飾之核苷酸配對。第二股上之一或多個經修飾之核苷酸可與第一股上之未經修飾之核苷酸配對。換言之，交替核苷酸可在兩股上比對，諸如，第二股之交替區域中之所有修飾與第一股中之相同修飾配對，或可替代地修飾可偏移一個核苷酸，其中一股之交替區域中的共同修飾與另一股中之不同修飾(亦即，第二或進一步修飾)配對。另一選項為在每一股中具有不同修飾。
第一股上之修飾可相對於第二股上之經修飾之核苷酸移位一個核苷酸，使得共同經修飾之核苷酸不彼此配對。
修飾及/或一或多種修飾可各自且單獨地選自由以下組成之群：3'末端去氧胸腺嘧啶、2'-OMe、2'去氧修飾、2'胺基修飾、2'烷基修飾、N-𠰌啉基修飾、胺基磷酸酯修飾、5'-硫代磷酸酯基團修飾、5'磷酸酯或5'磷酸酯模擬物修飾膽固醇衍生物或十二烷酸雙癸醯胺基團修飾及/或經修飾核苷酸可為鎖定核苷酸、無鹼基核苷酸、包含核苷酸之非天然鹼基中之任一者。
至少一種修飾可為2'-OMe及/或至少一種修飾可為2'-F。如本文所描述之進一步修飾可存在於第一股及/或第二股上。
本發明之核酸可在股末端中之一或多者處包含反向RNA核苷酸。此類反向核苷酸向核酸提供穩定性。特定言之，核酸在第一股及/或第二股之3'端處及/或在第二股之5'端處包含至少反向核苷酸。更特定言之，核酸在第二股之3'端處包含反向核苷酸。最特定言之，核酸在第二股之3'端處包含反向RNA核苷酸且此核苷酸尤其為反向A。反向核苷酸為經由其3'碳而非如通常情況下經由其5'碳連接至核酸之3'端的核苷酸，或為經由其5'碳而非如通常情況下經由其3'碳連接至核酸之5'端的核苷酸。反向核苷酸尤其存在於股之末端處，而非作為懸垂物，但與另一股中之相應核苷酸相對。因此，核酸在包含反向RNA核苷酸之末端處尤其為鈍端。存在於股末端之反向RNA核苷酸尤其意謂股之此末端之最後一個核苷酸為反向RNA核苷酸。具有此類核苷酸之核酸為穩定的且易於合成。反向RNA核苷酸尤其為未經修飾之核苷酸，意義在於其與天然核苷酸對應物相比不包含任何修飾。特定言之，反向RNA核苷酸尤其為2'-OH核苷酸。
本發明之核酸可包含一或多個在2'位置處經2'-H修飾之核苷酸，且因此在核酸內具有DNA核苷酸。本發明之核酸可包含自第一股之5'端計數的第一股之位置2及/或14處的DNA核苷酸。核酸可包含位於第二股上對應於第一股之位置11、或13、或11及13、或11-13的DNA核苷酸。
在一個態樣中，每個本發明之核酸不存在超過一個DNA核苷酸。
本發明之核酸可包含一或多個LNA核苷酸。本發明之核酸可包含自第一股之5'端計數的第一股之位置2及/或14處的LNA核苷酸。核酸可包含第二股上對應於第一股之位置11、或13、或11及13、或11-13的LNA。
本發明之一些代表性經修飾之核酸序列顯示於實例中。此等實例意欲為代表性的且不為限制性的。
特定言之，核酸可包含第一修飾及第二或進一步修飾，其各自且獨立地選自包含2'-OMe修飾及2'-F修飾之群。核酸可包含修飾，該修飾為2'-OMe，其可為第一修飾；及第二修飾，其為2'-F。本發明之核酸亦可包括硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾及/或去氧修飾，其可存在於各股或兩股之末端2或3個核苷酸中或其之間。
在核酸之一個態樣中，第一及/或第二股之至少一個核苷酸為經修飾之核苷酸，其中若該第一股包含至少一個經修飾之核苷酸： (i)    第一股之核苷酸2及14中之至少一者或兩者藉由第一修飾來修飾；及/或 (ii)   第一股之至少一個、若干個或所有偶數編號之核苷酸藉由第一修飾來修飾；及/或 (iii)  第一股之至少一個、若干個或所有奇數編號之核苷酸藉由第二修飾來修飾；及/或 其中若第二股包含至少一個經修飾之核苷酸： (iv)   與第一股之偶數編號之核苷酸對應之位置的第二股之至少一個、若干個或所有核苷酸藉由第三修飾來修飾；及/或 (v)    與第一股之奇數編號之核苷酸對應之位置的第二股之至少一個、若干個或所有核苷酸藉由第四修飾來修飾；及/或 (vi)   除與第一股之核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11及13或核苷酸11-13對應之位置外的第二股之至少一個、若干個或所有核苷酸藉由第四修飾來修飾；及/或 (vii)  除與第一股之核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11及13或核苷酸11-13對應之位置外的第二股之至少一個、若干個或所有核苷酸藉由第三修飾來修飾；及/或 其中第一股上之核苷酸以第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號； 其中修飾尤其為以下中之至少一者： (a)    第一修飾尤其不同於第二修飾及第三修飾； (b)    第一修飾與第四修飾尤其相同； (c)    第二及第三修飾尤其為相同修飾； (d)    第一修飾尤其為2'-F修飾； (e)    第二修飾尤其為2'-OMe修飾； (f)    第三修飾尤其為2'-OMe修飾；及/或 (g)    第四修飾尤其為2'-F修飾；且 其中視情況，核酸與配位體結合。
一個態樣為一種用於抑制PROS1尤其在細胞中表現之雙股核酸，其中該核酸包含第一股及第二股，其中該第一股序列包含至少15個核苷酸之序列，該序列與選自SEQ ID NO: 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、255、19、15、1、3、5、7、9、11、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47及49之序列中之任一者，尤其SEQ ID NO: 199、203、209或229相差不超過3個核苷酸，其中第一股之所有偶數編號之核苷酸藉由第一修飾來修飾，第一股之所有奇數編號之核苷酸藉由第二修飾來修飾，與第一股之偶數編號之核苷酸對應之位置的第二股之所有核苷酸藉由第三修飾來修飾，與第一股之奇數編號之核苷酸對應之位置的第二股之所有核苷酸藉由第四修飾來修飾，其中第一及第四修飾為2'-F且第二及第三修飾為2'-OMe。
一個態樣為一種用於抑制PROS1尤其在細胞中表現之雙股核酸，其中該核酸包含第一股及第二股，其中該第一股序列包含至少15個核苷酸之序列，該序列與選自SEQ ID NO: 187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、255、19、15、1、3、5、7、9、11、13、17、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47及49之序列中之任一者，尤其SEQ ID NO: 199、203、209或229相差不超過3個核苷酸，其中第一股之所有偶數編號之核苷酸藉由第一修飾來修飾，第一股之所有奇數編號之核苷酸藉由第二修飾來修飾，與第一股之核苷酸11-13對應之位置的第二股之所有核苷酸藉由第四修飾來修飾，除與第一股之核苷酸11-13對應之核苷酸外的第二股之所有核苷酸藉由第三修飾來修飾，其中第一及第四修飾為2'-F且第二及第三修飾為2'-OMe。
寡核苷酸之3'及5'端可經修飾。此類修飾可在分子之3'端或5'端或兩個末端處。其可包括修飾或置換整個末端磷酸酯或磷酸酯基團之原子中之一或多者。例如，寡核苷酸之3'及/或5'端可與其他功能性分子實體結合，諸如標記部分，例如螢光團(例如，芘、TAMRA、螢光素、Cy3或Cy5染料)或保護基(基於例如硫、矽、硼或酯)。功能性分子實體可經由磷酸酯基及/或連接子附接至糖。連接子之末端原子可連接至或置換磷酸酯基或糖之C-3'或C-5' O、N、S或C基團的連接原子。或者，連接子可連接至或置換核苷酸替代物(例如PNA)之末端原子。此等間隔子或連接子可包括例如-(CH 2) n-、-(CH 2) nN-、-(CH 2) nO-、-(CH 2) nS-、-(CH 2CH 2O) nCH 2CH 2O- (例如n=3或6)、無鹼基糖、醯胺、羧基、胺、氧胺、氧亞胺、硫醚、二硫鍵、硫脲、磺醯胺或N-𠰌啉基，或生物素及螢光素試劑。3'端可為-OH基團。
末端修飾之其他實例包括染料、插入劑(例如，吖啶)、交聯劑(例如，補骨脂素、絲裂黴素C)、卟啉(TPPC4、德卟啉(texaphyrin)、賽卟啉(Sapphyrin))、多環芳烴(例如，啡𠯤、二氫啡𠯤)、人工核酸內切酶、EDTA、親脂性載劑(例如，膽固醇、膽酸、金剛烷乙酸、1-芘丁酸、二氫睾酮、1,3-雙-O(十六烷基)甘油、香葉基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕櫚酸、肉豆蔻酸、O3-(油醯基)石膽酸、O3-(油醯基)膽烯酸、二甲氧基三苯甲基或啡㗁 𠯤)及肽結合物(例如，觸角足肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷基化劑、磷酸酯、胺基、巰基、PEG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚胺基、烷基、經取代烷基、放射性標記物、酶、半抗原(例如，生物素)、轉運/吸收促進劑(例如，阿司匹林、維生素E、葉酸)、合成核糖核酸酶(例如，咪唑、雙咪唑、組胺、咪唑簇、吖啶-咪唑結合物、四氮雜大環之Eu3+錯合物)。
末端修飾亦可用於監測分佈，且在此類情況下，待添加之基團可包括螢光團，例如螢光素或Alexa染料。末端修飾亦可用於增強攝取，對此適用之修飾包括膽固醇。末端修飾亦可適用於將RNA劑交聯至另一部分。
出於多種原因可添加末端修飾，包括調節活性或調節對降解之抗性。可用於調節活性之末端修飾包括用磷酸酯或磷酸酯類似物修飾5'端。第一股或第二股上之本發明核酸可為5'磷酸化或在5'引發端包括磷醯基類似物。5'-磷酸酯修飾包括與RISC介導之基因靜默相容的彼等修飾。適合之修飾包括：5'-單磷酸酯((HO) 2(O)P-O-5')；5'-二磷酸酯((HO) 2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-三磷酸酯((HO) 2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-鳥苷封端(7-甲基化或非甲基化) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-腺苷封端(Appp)及任何經修飾之或未經修飾之核苷酸封端結構(N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5')；5'-單硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO) 2(S)P-O-5')；5'-單-二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5')、5'-硫代磷酸酯((HO) 2(O)P-S-5')；氧/硫之任何其他組合置換單磷酸酯、二磷酸酯及三磷酸酯(例如，5'-α-硫代三磷酸酯、5'-γ-硫代三磷酸酯等)、5'-胺基磷酸酯((HO) 2(O)P-NH-5'、(HO)(NH 2)(O)P-O-5')、5'-烷基膦酸酯(烷基=甲基、乙基、異丙基、丙基等，例如，RP(OH)(O)-O-5'- (其中R為烷基)、(OH) 2(O)P-5'-CH 2-)、5'乙烯基膦酸酯、5'-烷基醚膦酸酯(烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH 2-)、乙氧基甲基等，例如，RP(OH)(O)-O-5'-) (其中R烷基醚))。
某些部分可連接至第一股或第二股之5'末端。此等包括無鹼基核糖部分、無鹼基去氧核糖部分、無鹼基核糖及無鹼基去氧核糖部分之修飾包括2'-O烷基修飾；反向無鹼基核糖及無鹼基去氧核糖部分及其修飾，C6-亞胺基-Pi；包括L-DNA及L-RNA之鏡像核苷酸；5'OMe核苷酸；及核苷酸類似物，包括4',5'-亞甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃醣基)核苷酸；4'-硫基核苷酸，碳環核苷酸；5'-胺基-烷基磷酸酯；1,3-二胺-2-丙基磷酸酯，3-胺基丙基磷酸酯；6-胺基己基磷酸酯；12-胺基十二烷基磷酸酯；羥丙基磷酸酯；1,5-無水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；蘇呋喃戊醣基核苷酸；非環3',4'-斷核苷酸；3,4-二羥基丁基核苷酸；3,5-二羥基戊基核苷酸，5'-5'-反向無鹼基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5'-胺基；及橋接或非橋接甲基膦酸酯及5'-巰基部分。
在本文所描述之各序列中，C-末端「-OH」部分可經C-末端「-NH 2」部分取代，且反之亦然。
本發明亦提供根據本文所描述之本發明任何態樣之核酸，其中第一股在其5'端處具有末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。此末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸尤其藉由磷酸二酯鏈結連接於第一股中之第二核苷酸。
核酸之第一股可包含式(I)： (vp)-N (po)[N (po)] n- (I) 其中「(vp)-」為5' (E)-乙烯基膦酸酯，「N」為核苷酸，「po」為磷酸二酯鏈結，且n為1至(第一股中核苷酸之總數-2)，特定言之其中n為1至(第一股中核苷酸之總數-3)，更特定言之其中n為1至(第一股中核苷酸之總數-4)。
特定言之，末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸為RNA核苷酸，特定言之(vp)-U。
末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸為如下核苷酸，其中5'-端處之天然磷酸酯基團已經E-乙烯基膦酸酯置換，其中5'磷酸化股之末端核苷酸的橋接5'-氧原子經甲炔基(CH=)基團置換：
Figure 02_image001
5' (E)-乙烯基膦酸酯為5'磷酸酯模擬物。生物學模擬物為能夠進行與所模擬之原始分子相同的功能且在結構上極類似於所模擬之原始分子的分子。在本發明之上下文中，5' (E)-乙烯基膦酸酯模擬標準5'磷酸酯之功能，例如實現有效RISC負載。另外，由於其略微改變之結構，5' (E)乙烯基膦酸酯能夠藉由保護5'-端核苷酸免於由諸如磷酸酶之酶去磷酸化而使其穩定。
在一個態樣中，第一股在其5'端處具有末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸藉由磷酸二酯鏈結連接於第一股中之第二核苷酸，且第一股包含a)超過1個磷酸二酯鏈結；b)在至少末端三個5'核苷酸之間的磷酸二酯鏈結，及/或c)在至少末端四個5'核苷酸之間的磷酸二酯鏈結。
在一個態樣中，核酸之第一股及/或第二股包含兩個核苷酸之間的至少一個硫代磷酸酯(ps)及/或至少一個二硫代磷酸酯(ps2)鏈結。
在一個態樣中，核酸之第一股及/或第二股包含超過一個硫代磷酸酯及/或超過一個二硫代磷酸酯鏈結。
在一個態樣中，核酸之第一股及/或第二股包含末端兩個3'核苷酸之間的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鏈結，或末端三個3'核苷酸之間的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯鏈結。特定言之，第一股及/或第二股中之其他核苷酸之間的鏈結為磷酸二酯鏈結。
在一個態樣中，核酸之第一股及/或第二股包含末端兩個5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結，或末端三個5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結。
在一個態樣中，本發明之核酸包含對第一及/或第二股之末端中之一或多者的一或多個硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾。視情況，第一股之各末端或任一末端可包含一個或兩個或三個硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾之核苷酸(核苷間鏈結)。視情況，第二股之各末端或任一末端可包含一個或兩個或三個硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修飾之核苷酸(核苷間鏈結)。
在一個態樣中，核酸包含在第一及/或第二股之末端兩個或三個3'核苷酸及/或5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結。特定言之，核酸包含在第一股及第二股之末端三個3'核苷酸及末端三個5'核苷酸中之每一者之間的硫代磷酸酯鏈結。特定言之，第一股及/或第二股之核苷酸之間的所有剩餘鏈結為磷酸二酯鏈結。
在一個態樣中，核酸包含第一股之3'端的兩個、三個或四個末端核苷酸中之每一者之間的二硫代磷酸酯鏈結，及/或包含第二股之3'端的兩個、三個或四個末端核苷酸中之每一者之間的二硫代磷酸酯鏈結及/或第二股之5'端的兩個、三個或四個末端核苷酸中之每一者之間的二硫代磷酸酯鏈結，且包含除第一股之5'端的兩個、三個或四個末端核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結以外的鏈結。
在一個態樣中，核酸包含在第一股及第二股之末端三個3'核苷酸及末端三個5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結。特定言之，第一股及/或第二股之核苷酸之間的所有剩餘鏈結為磷酸二酯鏈結。
在一個態樣中，核酸： (i)    具有在第一股之末端三個3'核苷酸與末端三個5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結； (ii)   在第二股之3'端核苷酸或5'端核苷酸上與三觸角配位體結合； (iii)  在與結合於該三觸角配位體之末端相對的末端處與第二股之末端三個核苷酸之間具有硫代磷酸酯鏈結；且 (iv)   視情況第一及/或第二股之核苷酸之間的所有剩餘鏈結為磷酸二酯鏈結。
在一個態樣中，核酸： (i)    在第一股之5'端處具有末端5'(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸； (ii)   具有在第一及第二股上之末端三個3'核苷酸之間的及在第二股上之末端三個5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結，或其具有在第一及第二股上之末端兩個3'核苷酸之間的及在第二股上之末端兩個5'核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結；且 (iii)  視情況第一及/或第二股之核苷酸之間的所有剩餘鏈結為磷酸二酯鏈結。
與在同一位置中包含硫代磷酸酯之分子相比，在本發明之核酸中使用二硫代磷酸酯鏈結減少核酸分子群之立體化學的變化。硫代磷酸酯鏈結引入對掌性中心，且難以控制哪些非連接氧取代硫。使用二硫代磷酸酯確保在彼鏈結中不存在對掌性中心，且因此視核酸分子中使用之二硫代磷酸酯及硫代磷酸酯鏈結之數目而定，減少或消除核酸分子群中之任何變化。
在一個態樣中，核酸包含在第一股之3'端之兩個末端核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結，及在第二股之3'端之兩個末端核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結，及位於第二股之5'端之兩個末端核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結，且包含除第一股之5'端的兩個、三個或四個末端核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結以外的鏈結。特定言之，第一股在其5'端處具有末端5'(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。此末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸尤其藉由磷酸二酯鏈結連接於第一股中之第二核苷酸。特定言之，除第一股之3'端之兩個末端核苷酸之間的鏈結及第二股之3'端及5'端之兩個末端核苷酸之間的鏈結以外的兩個股之核苷酸之間的所有鏈結為磷酸二酯鏈結。
在一個態樣中，當末端不存在二硫代磷酸酯鏈結時，核酸包含在第一股上之三個末端3'核苷酸中之每一者之間及/或三個末端5'核苷酸中之每一者之間，及/或在第二股上之三個末端3'核苷酸中之每一者之間及/或三個末端5'核苷酸中之每一者之間的硫代磷酸酯鏈結。末端處不存在之二硫代磷酸酯鏈結意謂所討論之核酸末端之兩個末端核苷酸之間，或特定言之三個末端核苷酸之間的鏈結為除二硫代磷酸酯鏈結以外的鏈結。
在一個態樣中，除第一股之3'端處之兩個末端核苷酸之間的鏈結及第二股之3'端及5'端處之兩個末端核苷酸之間的鏈結以外的兩股之核苷酸之間的核酸的所有鏈結為磷酸二酯鏈結。
其他磷酸酯鏈結修飾為可能的。
磷酸酯連接子亦可藉由用氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)置換連接氧而經修飾。置換可在末端氧處進行。非連接氧經氮置換為可能的。
磷酸酯基團亦可單獨地經非含磷接頭置換。
可置換磷酸酯基團之部分之實例包括矽氧烷、碳酸酯、羧基甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲酸酯、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基肼、亞甲基二甲基肼及亞甲基氧基甲基亞胺基。在某些實施例中，置換可包括亞甲基羰基胺基及亞甲基甲基亞胺基。
磷酸酯連接子及核糖糖可經耐核酸酶核苷酸置換。實例包括N-𠰌啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷代替物。在某些實施例中，可使用PNA代替物。
在一個態樣中，核酸，其尤其為抑制PROS1表現之siRNA，特定言之經由RNAi，且特定言之在細胞中，該核酸包含以下中之一或多者或全部： (i)    經修飾之核苷酸； (ii)   除在第一股之5'端位置2及14處的2'-OMe修飾之核苷酸以外的經修飾之核苷酸，特定言之2'-F修飾之核苷酸； (iii)  自第一股5'端之一個開始編號之第一股的奇數編號之核苷酸中之每一者為2'-OMe修飾之核苷酸； (iv)   自第一股5'端之一個開始編號之第一股的偶數編號之核苷酸中之每一者為2'-F修飾之核苷酸； (v)    對應於第一股之位置11及/或13或11-13之第二股核苷酸經除2'-OMe修飾以外的修飾來修飾，特定言之其中此等位置中之一者或兩者或全部包含2'-F修飾； (vi)   反向核苷酸，特定言之在第二股之3'端處之3'-3'鏈結； (vii)  一或多個硫代磷酸酯鏈結； (viii) 一或多個二硫代磷酸酯鏈結；及/或 (ix)   第一股在其5'端處具有末端5'(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，在此情況下，末端5'(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸尤其為尿苷且尤其藉由磷酸二酯鏈結連接於第一股中之第二核苷酸。
核酸之所有特徵可與本文所揭示之本發明之所有其他態樣組合。
配位體本發明之核酸可與配位體結合。活體內有效遞送寡核苷酸，尤其本發明之雙股核酸遞送至細胞中係重要的且需要特異性靶向且實質性保護其免於細胞外環境，特定言之血清蛋白質。一種實現特異性靶向之方法為使配位體與核酸結合。在一些實施例中，配位體有助於使核酸靶向目標細胞，該目標細胞具有結合至結合配位體且內化結合配位體的細胞表面受體。在該等實施例中，需要為所需受體分子結合適當配位體，以便藉由諸如不同受體介導之內吞作用路徑或功能類似過程之機制由目標細胞吸收結合分子。在其他實施例中，可藉由除受體介導之內吞作用以外之機制介導核酸內化至目標細胞中之配位體可替代地與本發明之核酸結合以用於細胞或組織特異性靶向。
介導受體介導之內吞作用之結合物之一個實例為與本文所描述之GalNAc部分具有高親和力之去唾液酸醣蛋白受體複合體(ASGP-R)。ASGP-R複合體由不同比率之在肝細胞上高度豐富之膜ASGR1及ASGR2受體之多聚體構成。使用三觸角簇糖苷作為結合配位體之第一揭示內容中之一者在美國專利第US 5,885,968號中。具有三個GalNAc配位體且包含磷酸酯基團之結合物已知且描述於Dubber等人(Bioconjug. Chem. 2003年1月-2月;14(1):239-46.)中。ASGP-R複合體顯示對N-乙醯基-D-半乳糖胺(GalNAc)之親和力比對D-Gal高50倍。
ASGP-R複合體特異性識別糖基化蛋白質或其他寡醣之末端β-半乳糖苷生物亞單元(Weigel, P.H.等人, Biochim. Biophys. Acta. 2002年9月19日;1572(2-3):341-63)且可用於藉由半乳糖或半乳胺糖與原料藥之共價偶合將藥物遞送至表現受體複合體之肝臟肝細胞(Ishibashi,S.等人, J Biol. Chem. 1994年11月11日;269(45):27803-6)。此外，結合親和力可藉由多價作用顯著增加，此藉由重複靶向部分來達成(Biessen EA等人, J Med Chem. 1995 Apr 28;38(9):1538-46)。
ASGP-R複合體為用於將含有末端β-半乳糖苷之醣蛋白主動吸收至細胞之核內體的介體。因此，ASGPR高度適用於將與此類配位體結合之候選藥物，例如將核酸靶向遞送至表現受體之細胞中(Akinc等人, Mol Ther. 2010年7月;18(7):1357-64)。
更一般而言，配位體可包含經選擇對標目標細胞上之至少一種類型之受體具有親和力的醣。特定言之，受體位於哺乳動物肝細胞之表面上，例如上述肝去唾液酸醣蛋白受體複合體(ASGP-R)。
醣可選自N-乙醯基半乳胺糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺及海藻糖。醣可為N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。
因此，用於本發明之配位體連接子可包含(i)一或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分及其衍生物，及(ii)連接子，其中連接子將GalNAc部分與如任何前述態樣中所定義之核酸結合。連接子可為單價結構或二價或三價或四價分支鏈結構。核苷酸可如本文所定義經修飾。
因此，配位體可包含GalNAc。
在一個態樣中，核酸結合至包含式(II)化合物之配位體： [S-X 1-P-X 2] 3-A-X 3-    (II) 其中： S表示醣，特定言之其中醣為N-乙醯基半乳胺糖； X 1表示C 3-C 6伸烷基或(-CH 2-CH 2-O) m(-CH 2) 2-，其中m為1、2或3； P為磷酸酯或經修飾之磷酸酯，特定言之硫代磷酸酯； X 2為伸烷基或式(-CH 2) n-O-CH 2-之伸烷基醚，其中n=1-6； A為分支單元； X 3表示橋接單元； 其中根據本發明之核酸經由磷酸酯或經修飾之磷酸酯，尤其硫代磷酸酯結合至X 3。
在式(II)中，分支單元「A」尤其分支成三個，以便適應三個醣配位體。分支單元尤其共價連接於配位體及核酸之其餘繫栓部分。分支單元可包含分支鏈脂族基團，該分支鏈脂族基團包含選自烷基、醯胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚及羥胺基之基團。分支單元可包含選自烷基及醚基之基團。
分支單元A可具有選自以下之結構：
Figure 02_image003
其中各A 1獨立地表示O、S、C=O或NH；且各n獨立地表示1至20之整數。
分支單元可具有選自以下之結構：
Figure 02_image005
其中各A 1獨立地表示O、S、C=O或NH；且各n獨立地表示1至20之整數。
分支單元可具有選自以下之結構：
Figure 02_image007
其中A 1為O、S、C=O或NH；且各n獨立地表示1至20之整數。
分支單元可具有以下結構：
Figure 02_image009
。
分支單元可具有以下結構：
Figure 02_image011
。
分支單元可具有以下結構：
Figure 02_image013
。
替代地，分支單元A可具有選自以下之結構：
Figure 02_image015
， 其中： R1為氫或C1-C10伸烷基； 且R2為C1-C10伸烷基。
視情況，分支單元僅由碳原子組成。
「X 3」部分為橋接單元。橋接單元為線性的且共價鍵結至分支單元及核酸。
X 3可係選自-C 1-C 20伸烷基-、-C 2-C 20伸烯基-、式-(C 1-C 20伸烷基)-O-(C 1-C 20伸烷基)-之伸烷基醚、-C(O)-C 1-C 20伸烷基-、-C 0-C 4伸烷基(Cy)C 0-C 4伸烷基-，其中Cy表示經取代或未經取代之5或6員環伸烷基、伸芳基、伸雜環基或伸雜芳基環、-C 1-C 4伸烷基-NHC(O)-C 1-C 4伸烷基-、-C 1-C 4伸烷基-C(O)NH-C 1-C 4伸烷基-、-C 1-C 4伸烷基-SC(O)-C 1-C 4伸烷基-、-C 1-C 4伸烷基-C(O)S-C 1-C 4伸烷基-、-C 1-C 4伸烷基-OC(O)-C 1-C 4伸烷基-、-C 1-C 4伸烷基-C(O)O-C 1-C 4伸烷基-及-C 1-C 6伸烷基-S-S-C 1-C 6伸烷基-。
X 3可為式-(C 1-C 20伸烷基)-O-(C 1-C 20伸烷基)-之伸烷基醚。X 3可為式-(C 1-C 20伸烷基)-O-(C 4-C 20伸烷基)-之伸烷基醚，其中該(C 4-C 20伸烷基)連接至Z。X 3可選自由以下組成之群：-CH 2-O-C 3H 6-、-CH 2-O-C 4H 8-、-CH 2-O-C 6H 12-及-CH 2-O-C 8H 16-，尤其-CH 2-O-C 4H 8-、-CH 2-O-C 6H 12-及-CH 2-O-C 8H 16-，其中在各種情況下，-CH 2-基團連接至A。
在一個態樣中，核酸與包含式(III)化合物之配位體結合： [S-X 1-P-X 2] 3-A-X 3- (III) 其中： S表示醣，特定言之GalNAc； X 1表示C 3-C 6伸烷基或(-CH 2-CH 2-O) m(-CH 2) 2-，其中m為1、2或3； P為磷酸酯或經修飾之磷酸酯，特定言之硫代磷酸酯； X 2為C 1-C 8伸烷基； A係選自以下之分支單元：
Figure 02_image017
X 3為橋接單元； 其中根據本發明之核酸經由磷酸酯或經修飾之磷酸酯，尤其硫代磷酸酯結合至X 3。
分支單元A可具有以下結構：
Figure 02_image019
。
分支單元A可具有以下結構：
Figure 02_image021
，其中X 3連接至氮原子。
X 3可為C 1-C 20伸烷基。特定言之，X 3係選自由以下組成之群：-C 3H 6-、-C 4H 8-、-C 6H 12-及-C 8H 16，尤其-C 4H 8-、-C 6H 12-及-C 8H 16-。
在一個態樣中，核酸與包含式(IV)化合物之配位體結合： [S-X 1-P-X 2] 3-A-X 3- (IV) 其中： S表示醣，特定言之GalNAc； X 1表示C 3-C 6伸烷基或(-CH 2-CH 2-O) m(-CH 2) 2-，其中m為1、2或3； P為磷酸酯或經修飾之磷酸酯，特定言之硫代磷酸酯； X 2為式-C 3H 6-O-CH 2-之伸烷基醚； A為分支單元； X 3係選自由以下組成之群的式的伸烷基醚：-CH 2-O-CH 2-、-CH 2-O-C 2H 4-、-CH 2-O-C 3H 6-、-CH 2-O-C 4H 8-、-CH 2-O-C 5H 10-、-CH 2-O-C 6H 12-、-CH 2-O-C 7H 14-及-CH 2-O-C 8H 16-，其中在各種情況下，-CH 2-基團連接至A， 且其中X 3藉由磷酸酯或經修飾之磷酸酯，尤其硫代磷酸酯結合至根據本發明之核酸。
分支單元可包含碳。特定言之，分支單元為碳。
X 3可選自由以下組成之群：-CH 2-O-C 4H 8-、-CH 2-O-C 5H 10-、-CH 2-O-C 6H 12-、-CH 2-O-C 7H 14-及-CH 2-O-C 8H 16-。特定言之，X 3係選自由以下組成之群：-CH 2-O-C 4H 8-、-CH 2-O-C 6H 12-及-CH 2-O-C 8H 16。
X 1可為(-CH 2-CH 2-O)(-CH 2) 2-。X 1可為(-CH 2-CH 2-O) 2(-CH 2) 2-。X 1可為(-CH 2-CH 2-O) 3(-CH 2) 2-。特定言之，X 1為(-CH 2-CH 2-O) 2(-CH 2) 2-。替代地，X 1表示C 3-C 6伸烷基。X 1可為伸丙基。X 1可為伸丁基。X 1可為伸戊基。X 1可為伸己基。特定言之，烷基為直鏈伸烷基。特定言之，X 1可為伸丁基。
X 2表示式-C 3H 6-O-CH 2-之伸烷基醚，亦即C 3烷氧基亞甲基，或-CH 2CH 2CH 2OCH 2-。
對於以上態樣中之任一者，當P表示經修飾之磷酸酯基時，P可由以下表示：
Figure 02_image023
其中Y 1及Y 2各自獨立地表示=O、=S、-O-、-OH、-SH、-BH 3、-OCH 2CO 2、-OCH 2CO 2R x、-OCH 2C(S)OR x及-OR x，其中R x表示C 1-C 6烷基且其中
Figure 02_image025
指示與化合物之其餘部分之連接。
經修飾之磷酸酯意謂其中一多個非連接氧被置換之磷酸酯基。經修飾之磷酸酯基的實例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯、硼烷磷酸酯、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有經硫置換之兩個非連接氧。磷酸酯基中之一個、每個或兩個非連接氧可獨立地為S、Se、B、C、H、N或OR (R為烷基或芳基)中之任一者。
磷酸酯亦可藉由用氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)置換連接氧而經修飾。可在末端氧處進行置換。非連接氧可能被氮置換。
例如，Y 1可表示-OH，且Y 2可表示=O或=S；或 Y 1可表示-O-，且Y 2可表示=O或=S； Y 1可表示=O，且Y 2可表示-CH 3、-SH、-OR x或-BH 3Y 1可表示=S，且Y 2可表示-CH 3、OR x或-SH。
熟習此項技術者應理解，在某些情況下，Y 1與Y 2之間將存在離域。
特定言之，經修飾之磷酸酯基為硫代磷酸酯基。硫代磷酸酯基包括二硫代磷酸酯(亦即，其中Y 1表示=S且Y 2表示-S-)及單硫代磷酸酯(亦即，其中Y 1表示-O-且Y 2表示=S，或其中Y 1表示=O且Y 2表示-S-)。特定言之，P為單硫代磷酸酯。本發明人已發現，具有硫代磷酸酯基團置換磷酸酯基團之結合物具有改良的活體內效力及作用持續時間。
P亦可為乙基磷酸酯(亦即，其中Y 1表示=O且Y 2表示OCH 2CH 3)。
可選擇醣對目標細胞上至少一種類型之受體具有親和力。特定言之，受體位於哺乳動物肝細胞之表面上，例如肝去唾液酸醣蛋白受體複合體(ASGP-R)。
對於以上或以下態樣中之任一者，醣可選自具有半乳胺糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺及果糖中之一或多者的N-乙醯基。通常，待用於本發明中之配位體可包括N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)。特定言之，本發明化合物可具有3個配位體，其將各自尤其包括N-乙醯基半乳胺糖。
「GalNAc」係指2-(乙醯基胺基)-2-去氧-D-半乳哌喃糖，在文獻中通常稱為N-乙醯基半乳胺糖。參考「GalNAc」或「N-乙醯基半乳胺糖」包括以下兩者：β-形式：2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖，及α-形式：2-(乙醯基胺基)-2-去氧-α-D-半乳哌喃糖。在某些實施例中，β-形式：2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖，及α-形式：2-(乙醯基胺基)-2-去氧-α-D-半乳哌喃糖兩者可互換使用。特定言之，本發明化合物包含β-形式，2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖。
Figure 02_image027
2-(乙醯基胺基)-2-去氧-D-半乳哌喃糖
Figure 02_image029
2-(乙醯基胺基)-2-去氧-β-D-半乳哌喃糖
Figure 02_image031
2-(乙醯基胺基)-2-去氧-α-D-半乳哌喃糖
在一個態樣中，核酸為結合之核酸，其中該核酸與具有以下結構之一的三觸角配位體結合：
Figure 02_image033
Figure 02_image035
Figure 02_image037
Figure 02_image039
Figure 02_image041
其中Z為如本文所定義之任何核酸。
特定言之，核酸為結合之核酸，其中該核酸與具有以下結構之三觸角配位體結合：
Figure 02_image043
其中Z為如本文所定義之任何核酸。
式(II)、(III)或(IV)之配位體或本文所揭示之三觸角配位體中之任一者可連接在第一(反義)股之3'-端及/或第二(有義)股之3'及/或5'端中之任一者處。核酸可包含超過一個式(II)、(III)或(IV)之配位體或本文所揭示之三觸角配位體中之任一者。然而，由於單一此類配位體足以將核酸高效靶向目標細胞，所以本文所揭示之式(II)、(III)或(IV)之單一配位體或三觸角配位體中之任一者為較佳的。特定言之，在彼情況下，在與配位體所連接之核酸末端的至少最後兩個、特定言之至少最後三個且更特定言之至少最後四個核苷酸藉由磷酸二酯鏈結鍵聯。
特定言之，第一(反義)股之5'-端不連接至式(II)、(III)或(IV)之配位體或本文揭示之三觸角配位體中之任一者，因為此位置中之配位體可潛在地干擾核酸之生物活性。
在股之5'端具有式(II)、(III)或(IV)之單一配位體或本文所揭示之三觸角配位體中之任一者的核酸比在3'端具有相同配位體之相同核酸更容易且因此更便宜地合成。因此，特定言之，式(II)、(III)或(IV)中之任一者或本文所揭示之三觸角配位體中之任一者的單一配位體共價連接至(結合至)核酸之第二股的5'端。
在一個態樣中，核酸之第一股為式(V)化合物：
Figure 02_image045
其中b尤其為0或1；及 第二股為式(VI)化合物：
Figure 02_image047
； 其中： c及d獨立地尤其為0或1； Z 1及Z 2分別為核酸之第一及第二股； Y獨立地為O或S； n獨立地為0、1、2或3；及 L 1為連接至配位體之連接子，其中L 1在式(V)及(VI)中相同或不同，且當L 1在相同式內存在超過一次時，其在式(V)及(VI)內相同或不同，其中L 1尤其在式(VII)中； 且其中b+c+d尤其為2或3。
特定言之，式(V)及(VI)中之L 1在式(VII)中：
Figure 02_image049
其中： L係選自包含以下之群，或尤其由以下組成： -(CH 2) r-C(O)-，其中r = 2-12； -(CH 2-CH 2-O) s-CH 2-C(O)-，其中s = 1-5； -(CH 2) t-CO-NH-(CH 2) t-NH-C(O)-，其中t獨立地為1-5； -(CH 2) u-CO-NH-(CH 2) u-C(O)-，其中u獨立地為1-5；及 -(CH 2) v-NH-C(O)-，其中v為2-12；且 其中末端C(O) (若存在)連接至式(VII)之X，或若X不存在，則連接至式(VII)之W 1，或若W 1不存在，則連接至式(VII)之V； W 1、W 3及W 5獨立地不存在或選自包含以下之群，或尤其由以下組成： -(CH 2) r-，其中r = 1-7； -(CH 2) s-O-(CH 2) s-，其中s獨立地為0-5； -(CH 2) t-S-(CH 2) t-，其中t獨立地為0-5； X不存在或選自包含以下之群，或尤其由以下組成：NH、NCH 3或NC 2H 5； V係選自包含以下之群，或尤其由以下組成： CH、N、
Figure 02_image051
Figure 02_image053
； 其中B (若存在)為經修飾或天然核鹼基。
在一個態樣中，第一股為式(VIII)化合物
Figure 02_image055
其中b尤其為0或1；及 第二股為式(IX)化合物：
Figure 02_image057
; 其中c及d獨立地尤其為0或1； 其中： Z 1及Z 2分別為核酸之第一及第二股； Y獨立地為O或S； R 1為H或甲基； n獨立地尤其為0、1、2或3；及 L在式(VIII)及(IX)中相同或不同，且當L在相同式內存在超過一次時，其在式(VIII)及(IX)內相同或不同，且選自包含以下之群，或尤其由以下組成： -(CH 2) r-C(O)-，其中r = 2-12； -(CH 2-CH 2-O) s-CH 2-C(O)-，其中s = 1-5； -(CH 2) t-CO-NH-(CH 2) t-NH-C(O)-，其中t獨立地為1-5； -(CH 2) u-CO-NH-(CH 2) u-C(O)-，其中u獨立地為1-5；及 -(CH 2) v-NH-C(O)-，其中v為2-12；且 其中末端C(O) (若存在)連接至NH基團(為連接子的，而非靶向配位體的)； 且其中b+c+d尤其為2或3。
在一個態樣中，核酸之第一股為式(X)化合物：
Figure 02_image059
其中b尤其為0或1；及 第二股為式(XI)化合物：
Figure 02_image061
； 其中： c及d獨立地尤其為0或1； Z 1及Z 2分別為核酸之第一及第二RNA股； Y獨立地為O或S； n獨立地尤其為0、1、2或3；及 L 2在式(X)與(XI)中相同或不同且在由b、c及d加括號之部分中相同或不同，且選自包含以下之群，或尤其由以下組成：
Figure 02_image063
；或 n為0且L 2為：
Figure 02_image065
且末端OH基團不存在，使得形成以下部分：
Figure 02_image067
； 其中： F為飽和分支鏈或非分支鏈(諸如非分支鏈) C 1-8烷基(例如C 1-6烷基)鏈，其中碳原子中之一者視情況經氧原子置換，其限制條件為該氧原子與另一雜原子(例如O或N原子)分隔開至少2個碳原子； L在式(X)及式(XI)中相同或不同，且選自包含以下之群，或尤其由以下組成： -(CH 2) r-C(O)-，其中r = 2-12； -(CH 2-CH 2-O) s-CH 2-C(O)-，其中s = 1-5； -(CH 2) t-CO-NH-(CH 2) t-NH-C(O)-，其中t獨立地為1-5； -(CH 2) u-CO-NH-(CH 2) u-C(O)-，其中u獨立地為1-5；及 -(CH 2) v-NH-C(O)-，其中v為2-12；且 其中末端C(O) (若存在)連接至NH基團(為連接子的，而非靶向配位體的)； 且其中b+c+d尤其為2或3。
在一個態樣中，在式(V)及(VI)或(VIII)及(IX)或(X)及(XI)之核酸中之任一者中，b為0，c為1且d為1；b為1，c為0且d為1；b為1，c為1且d為0；或b為1，c為1且d為1。特定言之，b為0，c為1且d為1；b為1，c為0且d為1；或b為1，c為1且d為1。最特定言之，b為0，c為1且d為1。
在一個態樣中，式(V)及(VI)或(VIII)及(IX)或(X)及(XI)之核酸中之任一者中，Y為O。在另一態樣中，Y為S。在一特定態樣中，Y在式中之不同位置中獨立地選自O或S。
在一個態樣中，在式(VIII)及(IX)之核酸中之任一者中，R 1為H或甲基。在一個態樣中，R 1為H。在另一態樣中，R 1為甲基。
在一個態樣中，在式(V)及(VI)或(VIII)及(IX)或(X)及(XI)之核酸中之任一者中為0、1、2或3。特定言之，n為0。
式(X)及(XI)之核酸中之任一者中的F部分之實例包括(CH 2) 1-6，例如(CH 2) 1-4，例如CH 2、(CH 2) 4、(CH 2) 5或(CH 2) 6或CH 2O(CH 2) 2-3，例如CH 2O(CH 2)CH 3。
在一個態樣中，式(X)及(XI)中之L 2為：
Figure 02_image069
。
在一個態樣中，L 2為：
Figure 02_image071
。
在一個態樣中，L 2為：
Figure 02_image073
。
在一個態樣中，L 2為：
Figure 02_image075
。
在一個態樣中，n為0且L 2為：
Figure 02_image077
且末端OH基團不存在，使得形成以下部分：
Figure 02_image079
； 其中Y為O或S。
在一個態樣中，式(V)及(VI)或(VIII)及(IX)或(X)及(XI)之核酸中之L係選自包含以下之群，或尤其由以下組成： -(CH 2) r-C(O)-，其中r = 2-12； -(CH 2-CH 2-O) s-CH 2-C(O)-，其中s = 1-5； -(CH 2) t-CO-NH-(CH 2) t-NH-C(O)-，其中t獨立地為1-5； -(CH 2) u-CO-NH-(CH 2) u-C(O)-，其中u獨立地為1-5；及 -(CH 2) v-NH-C(O)-，其中v為2-12； 其中末端C(O)連接至NH基團。
特定言之，L為-(CH 2) r-C(O)-，其中r=2-12，更特定言之r=2-6，更特定言之r=4或6，例如4。
特定言之，L為：
Figure 02_image081
。
在由b、c及d加括號之部分內，式(X)及(XI)之核酸中之L 2通常相同。在由b、c及d加括號之部分之間，L 2可相同或不同。在一實施例中，由c加括號之部分中之L 2與由d加括號之部分中之L 2相同。在一實施例中，由c加括號之部分中之L 2與由d加括號之部分中之L 2不相同。在一實施例中，由b、c及d加括號之部分中之L 2相同，例如當連接子部分為絲胺醇衍生之連接子部分時。
絲胺醇衍生之連接子部分可基於任何立體化學之絲胺醇，亦即衍生自L-絲胺酸異構體、D-絲胺酸異構體、外消旋絲胺酸或其他異構體組合。在本發明之一較佳態樣中，絲胺醇-GalNAc部分(SerGN)具有以下立體化學：
Figure 02_image083
亦即係基於衍生自L-絲胺酸異構體之(S)-絲胺醇-醯胺或(S)-絲胺醇丁二酸酯固體負載之建構組元。
在一特定態樣中，核酸之第一股為式(VIII)化合物，且核酸之第二股為式(IX)化合物，其中： b為0； c及d為1， n為0， Z 1及Z 2分別為核酸之第一及第二股， Y為S， R 1為H，且 L為-(CH 2) 4-C(O)-，其中L之末端C(O)連接至連接子之N原子(亦即，不為靶向配位體之可能N原子)。
在另一特定態樣中，核酸之第一股為式(V)化合物，且核酸之第二股為式(VI)化合物，其中： b為0， c及d為1， n為0， Z 1及Z 2分別為核酸之第一及第二股， Y為S， 式(VII)之L 1，其中： W 1為-CH 2-O-(CH 2) 3-， W 3為-CH 2-， W 5不存在， V為CH， X為NH，且 L為-(CH 2) 4-C(O)-，其中L之末端C(O)連接至式(VII)中X之N原子。
在另一特定態樣中，核酸之第一股為式(V)化合物，且核酸之第二股為式(VI)化合物，其中： b為0， c及d為1， n為0， Z 1及Z 2分別為核酸之第一及第二股， Y為S， 式(VII)之L 1，其中： W 1、W 3及W 5不存在， V為
Figure 02_image085
， X不存在，且 L為-(CH 2) 4-C(O)-NH-(CH 2) 5-C(O)-，其中L之末端C(O)連接至式(VII)中V之N原子。
在一個態樣中，核酸與具有以下結構之三觸角配位體結合：
Figure 02_image087
其中核酸經由配位體之磷酸酯基團與配位體結合，a)與第二股之5'端處的最後一個核苷酸結合；b)與第二股之3'端處的最後一個核苷酸結合；或c)與第一股之3'端處的最後一個核苷酸結合。
在核酸之一個態樣中，由具有配位體之核酸靶向之細胞為肝細胞。
在以上配位體中之任一者(其中存在GalNAc)中，GalNAc可經任何其他靶向配位體取代，諸如本文中提及之彼等者，特定言之甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺及海藻糖。
在一個態樣中，核酸與包含脂質之配位體，且更特定言之，包含膽固醇之配位體結合。
組合物、用途及方法本發明亦提供包含本發明之核酸之組合物。核酸及組合物可單獨或與其他藥劑組合用作藥物或用作診斷劑。例如，本發明之一或多種核酸可與遞送媒劑(例如脂質體)及/或賦形劑(諸如載劑、稀釋劑)組合。亦可添加其他試劑，諸如防腐劑及穩定劑。本發明之核酸中之任一者之醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物同樣在本發明之範疇內。遞送核酸之方法為此項技術中已知的且在熟習此項技術者之知識範圍內。
本文中所揭示之組合物尤其為醫藥組合物。此類組合物適用於向個體投與。
在一個態樣中，組合物包含本文中所揭示之核酸或其醫藥學上可接受之鹽或溶劑合物，及溶劑(尤其水)及/或遞送媒劑及/或生理學上可接受之賦形劑及/或載劑及/或鹽及/或稀釋劑及/或緩衝劑及/或防腐劑。
醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑包括在適用於經口、經直腸、經鼻或非經腸(包括皮下、肌內、靜脈內、皮內及經皮)投與之調配物中使用的彼等醫藥學上可接受之載劑或稀釋劑。調配物可宜以單位劑型呈現且可利用藥劑學技術中熟知之任何方法來製備。皮下或經皮投與模式可尤其適合於本文所描述之化合物。
本發明之核酸之治療有效量將視投與途徑、所治療之哺乳動物之類型及考慮中之特定哺乳動物之物理特徵而定。決定此量之此等因素及其關係為醫學技術中熟習從業者所熟知。此量及投與方法可經調適以獲得最佳功效且可視熟習醫學技術者所熟知之因素而定，諸如體重、膳食、同時用藥情況及其他因素。最適合於人類使用之劑量大小及給藥方案可藉由本發明所獲得的結果來指導且可在恰當設計的臨床試驗中確認。
有效劑量及治療方案可藉由習知手段確定，開始在實驗動物中使用低劑量，且隨後增加劑量，同時監測效果，且同樣系統地改變給藥方案。當針對既定個體確定最佳劑量時，臨床醫師可考慮許多因素。此類考慮因素為熟習此項技術者所知。
本發明之核酸或其鹽可調配為經製備用於儲存或投與之醫藥組合物，其通常包含治療有效量之本發明核酸或其鹽於醫藥學上可接受之載劑中。
本發明之核酸或結合之核酸亦可與其他治療化合物組合投與，例如以組合單位劑量形式分開或同時投與。本發明亦包括一種組合物，其包含一或多種根據本發明之核酸於生理學/醫藥學上可接受之賦形劑中，諸如穩定劑、防腐劑、稀釋劑、緩衝劑及其類似物。
在一個態樣中，組合物包含本文所揭示之核酸及另一治療劑，該治療劑選自包含以下之群：寡核苷酸、小分子、單株抗體、多株抗體、肽及蛋白質。若其他治療劑為蛋白質，則其尤其為FVIII及/或FIX。
在某些實施例中，具有不同序列之兩種或更多種本發明核酸可同時或依序投與。
在另一態樣中，本發明提供一種組合物，例如醫藥組合物，其包含本發明之不同核酸中之一者或其組合及至少一種醫藥學上可接受之載劑。
本發明之藥物及組合物的劑量含量可由熟習此項技術者藉由實驗確定。在一個態樣中，單位劑量可含有約0.01 mg/kg與約100 mg/kg體重之間的核酸或結合核酸。替代地，劑量可為10 mg/kg至25 mg/kg體重、或1 mg/kg至10 mg/kg體重、或0.05 mg/kg至5 mg/kg體重、或0.1 mg/kg至5 mg/kg體重、或0.1 mg/kg至1 mg/kg體重、或0.1 mg/kg至0.5 mg/kg體重、或0.5 mg/kg至1 mg/kg體重。替代地，劑量可為0.5 mg/kg至約10 mg/kg體重、或約0.6 mg/kg至約8 mg/kg體重、或約0.7 mg/kg至約7 mg/kg體重、或約0.8 mg/kg至約6 mg/kg體重、或約0.9 mg/kg至約5.5 mg/kg體重、或約1 mg/kg至約5 mg/kg體重、或約2 mg/kg至約5 mg/kg體重、或約3 mg/kg至約5 mg/kg體重、或約1 mg/kg體重、或約3 mg/kg體重、或約5 mg/kg體重，其中「約」為與指示值的偏差至多30%、特定言之至多20%、更特定言之至多10%、又更特定言之至多5%及最更特定言之0%。劑量含量亦可經由其他參數，諸如體表面積來計算。
投與之劑量及頻率可視治療是否為治療性或防治性(例如預防性)而變化，且可在治療過程期間加以調整。在某些防治性應用中，在長時間段內，在相對不頻繁之間隔時間投與相對低之劑量。一些個體可在其壽命內繼續接受治療。在某些治療性應用中，有時需要以相對短之間隔投與相對高之劑量，直至疾病之進展減輕，或直至患者展示疾病之症狀部分或完全改善。其後，可將患者切換為適合的防治性給藥方案。
本發明之核酸單獨或與本發明之醫藥組合物中之一或多種其他活性成分組合之實際劑量含量可變化，以便獲得能有效的活性成分之量，以達成特定患者期望治療反應、組合物及投與模式，而不會對個體或患者產生有害副作用。所選劑量含量將視多種藥物動力學因素而定，該等因素包括所採用之特定核酸或組合物的活性；投與途徑；投與時間；待採用之特定核酸之排泄速率；治療持續時間；與所採用之特定組合物組合的其他藥物、化合物及/或材料；待治療患者之年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前病史；及醫學技術中熟知之類似因素。
醫藥組合物可為無菌可注射水性懸浮液或溶液，或呈凍乾形式。
醫藥組合物可呈單位劑型形式。在此類形式中，將組合物分成含有適當量之活性組分之單位劑量。單位劑型可為封裝製劑，該封裝含有離散量之製劑，例如，小包錠劑、膠囊及小瓶或安瓿中之粉末。單位劑型亦可為膠囊、扁囊劑或錠劑自身，或其可為適當數量之此等封裝形式中之任一者。其可以單次劑量可注射形式提供，例如，呈筆筒形式。組合物可經調配用於任何合適的投與途徑及手段。
本發明之醫藥組合物及藥物可以醫藥學上有效劑量向哺乳動物個體投與。哺乳動物可選自人類、非人類靈長類動物、猴或原猴、犬、貓、馬、牛、豬、山羊、綿羊、小鼠、大鼠、倉鼠、刺蝟及天竺鼠或其他相關性物種。在此基礎上，如本文所用之「PROS1」表示任一上述物種中之核酸或蛋白質，若天然或人工地表現於其中，則尤其此措辭表示人類核酸或蛋白質。
本發明之醫藥組合物可單獨或與一或多種其他治療劑或診斷劑組合投與。組合療法可包括本發明之核酸與至少一種其他治療劑組合，該治療劑基於待治療之特定患者、疾病或病狀選擇。其他此類藥劑之實例尤其包括治療活性小分子或多肽、單鏈抗體、經典抗體或其片段或調節一或多種其他基因之基因表現的核酸分子及可補充或以其他方式有益於治療性或防治性治療方案的類似調節治療劑。
醫藥組合物在製造及儲存條件下通常無菌且穩定。組合物可調配為溶液、微乳液、脂質體或適合於較高藥物濃度之其他有序結構。載劑可為含有例如水、醇(諸如乙醇)、多元醇(例如甘油、丙二醇及液體聚乙二醇)或任何適合混合物之溶劑或分散介質。可藉由使用包衣諸如卵磷脂、藉由維持就分散液而言所需粒度及藉由使用根據此項技術中熟知之調配化學方法的界面活性劑來維持適當的流動性。在某些實施例中，等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉可在組合物中合乎需要。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中包括延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)來達成。
本發明之一個態樣為本文所揭示之核酸或組合物，其用作藥物。核酸或組合物尤其用於預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症。
本發明提供一種核酸，其單獨或與醫藥組合物中之一或多種額外治療劑組合用於治療或預防對PROS1表現之抑制起反應的病狀、疾病及病症。
本發明之一個態樣為如本文所揭示之核酸或組合物在預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症。
本發明之一個態樣為如本文中所揭示之核酸或組合物在抑制PROS1在細胞中較佳在活體外表現之方法中的用途。
本發明之一個態樣為一種抑制細胞中，較佳活體外PROS1表現之方法，其包含較佳活體外投與如本文中所揭示之核酸或組合物至細胞之步驟。
本發明之核酸及醫藥組合物可用於治療多種病狀、病症或疾病。用本發明之核酸治療尤其導致活體內蛋白質S消耗，尤其在肝臟中及/或血液中。因此，本發明之核酸及包含其之組合物將適用於治療多種病理性病症之方法，其中抑制蛋白質S表現可為有益的，尤其諸如出血病症。本發明提供用於治療出血病症之方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量之本發明核酸的步驟。
因此，本發明提供治療或預防出血病症之方法，該方法包含向有需要之個體(例如患者)投與治療有效量之包含核酸或本發明之核酸的醫藥組合物的步驟。
最理想的治療有效量為將產生特定治療之所需功效的量，該特定治療由熟習此項技術者針對有需要之給定個體選擇。此量將視熟習此項技術者所理解之各種因素而變化，包括(但不限於)治療化合物之特徵(包括活性、藥物動力學、藥效動力學及生物可用性)、個體之生理條件(包括年齡、性別、疾病類型及階段、一般身體條件、對給定劑量之反應性及藥物類型)、調配物中之一或多種醫藥學上可接受之載劑的性質及投與途徑。熟習臨床及藥理學技術之技術者將能夠經由實驗確定治療有效量，即藉由監測個體對投與化合物之反應且相應地調節劑量。參見例如Remington:  The Science and Practice of Pharmacy 第21版, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005。
在某些實施例中，本發明之核酸及醫藥組合物可用於治療或預防出血病症。
在某些實施例中，本發明提供用於治療哺乳動物個體(諸如人類)之出血病症的方法，該方法包含向有需要之個體投與治療有效量之如本文所揭示之核酸的步驟。
「治療有效劑量」之本發明之核酸可使得疾病症狀之嚴重程度降低、無疾病症狀期之頻率或持續時間增加或預防疾病病痛所致之損傷或失能。
本發明之核酸可有益於治療或診斷可使用本文所描述之方法診斷之或治療之出血病症。亦認為其他出血病症之治療及診斷屬於本發明之範疇內。
本發明之一個態樣為一種預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症之方法，其包含向需要治療之個體投與醫藥學上有效劑量或量之本文所揭示之核酸或組合物，特定言之其中該核酸或組合物係皮下、靜脈內或藉由經口、經直腸、經肺、肌肉內或腹膜內投與向該個體投與。特定言之，其經皮下投與。
在某些實施例中，出血病症為血液凝血缺乏病症。血液凝血缺乏病症可為一種與延長之出血事件及/或凝血酶減少及/或凝血形成缺乏相關之病症。出血病症尤其為血友病、遺傳血友病、A型血友病、B型血友病、C型血友病、馮威里氏病、馮威里氏症候群、無纖維素原血症、低纖維素原血症、副血友病、關節血腫(AH)、凝血因子缺乏症、凝血因子II、V、VII、X及/或XI之遺傳缺乏症、因子V及VIII之組合缺乏症、後天性血友病、凝血因子後天性缺乏症及後天性出血病症。更特定言之，其為血友病或關節血腫(AH)。更特定言之，其為血友病，特定言之為A型血友病或B型血友病，最特定言之為A型血友病。可替代地，其為關節血腫。預想各此類疾病、病狀、病症或症狀在根據本發明之醫藥組合物之用途方面為各別實施例。
在一個實施例中，本發明之核酸或組合物係用以或用於治療方法中以： a) 增加血液凝結；及/或 b) 減少出血。
特定言之，使用本文所揭示之核酸或組合物將經核酸或組合物治療之個體之血液中的血液凝結增加至健康個體中預期之對應含量。替代地，其增加經核酸或組合物治療之個體之血液中的血液凝結，使得治療之前個體之血液中的血液凝結與健康個體中預期之對應含量之間的差異至少暫時減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
特定言之，使用本文所揭示之核酸或組合物將經核酸或組合物治療之個體的出血減少至健康個體中預期之對應含量。替代地，其減少經核酸或組合物治療之個體的出血，使得治療之前個體的出血與健康個體中預期之對應含量之間的差異至少暫時減少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。
顯而易見，核酸或組合物之適當給藥方案為達成此等結果所必需的。熟習此項技術者將能夠確定實現此等結果所需之給藥方案。
本文所揭示之核酸或組合物可用於包含每週一次或兩次、每週、每兩週、每三週、每四週、每五週、每六週、每七週、每八週、每九週、每十週、每十一週、每十二週、每三個月、每四個月、每五個月、每六個月或以不同給藥頻率(諸如上述間隔的組合)之方案中。核酸或組合物可皮下、靜脈內或使用任何其他應用途徑，諸如經口、經直腸、經肺、肌內或腹膜內使用。特定言之，其用於皮下。
例示性治療方案為每兩週一次、每三週一次、每四週一次、每月一次、每兩個月或三個月一次、每三個月、四個月、五個月或六個月或更久一次進行投與。劑量可視需要由熟練的健康照護專業人士選擇及重新調整以使特定個體(例如患者)之治療益處最大化。核酸將典型地在多個時刻投與。單次劑量之間的時間間隔可為例如2至5天、每週、每兩週、每月、每兩個月或三個月、每四個月或五個月、每六個月或每年。基於例如個體或患者之血液或肝臟中之核酸目標基因產物含量，各投與之間的時間間隔亦可為不規律的。
在用如本文所揭示之核酸或組合物治療或接受如本文所揭示之核酸或組合物的細胞及/或個體中，相比於未經治療之細胞及/或個體，PROS1表現可抑制15%至至多100%範圍，但至少約30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%或中間值。抑制之含量可允許治療出血病症或可用以進一步研究PROS1基因產物之功能及生理作用。抑制之含量較佳在經核酸或組合物治療之個體之肝臟中或血液中或腎臟中，較佳在血液中量測。
一個態樣為如本文所揭示之核酸或組合物在製造用於治療出血病症(諸如如上文所列之出血病症)或需要抑制PROS1表現之額外病變的藥物中的用途。藥物為醫藥組合物。
本發明之核酸及其醫藥學上可接受之鹽及溶劑合物中之每一者構成本發明之個別實施例。
本發明亦包括一種治療或預防出血病症諸如上文所列之彼等疾病的方法，其包含向需要治療之個體投與包含核酸的組合物或如本文所描述之組合物(以改良此類病變)。核酸或組合物可以包含每週兩次、每週一次、每兩週、每三週、每四週、每五週、每六週、每七週或每八週至十二週或更多週治療之方案或以不同給藥頻率(諸如上述間隔的組合)之方案投與。核酸或結合核酸可皮下或靜脈內，或其他應用途徑，諸如經口、經直腸或腹膜內使用。
本發明之核酸可藉由此項技術中已知之任何適當投與路徑進行投與，包括(但不限於)氣霧劑、經腸、經鼻、經眼、經口、非經腸、經直腸、經陰道或經皮(例如，局部投與乳膏、凝膠或軟膏，或藉助於經皮貼片)。「非經腸投與」典型地與在預期作用部位注射或與預期作用部位連通有關，包括眶下、輸注、動脈內、囊內、心內、皮內、肌肉內、腹膜內、肺內、脊椎內、胸骨內、鞘內、子宮內、靜脈內、蛛膜下、囊內、皮下、經黏膜或經氣管投與。
使用核酸之化學修飾模式賦予血清中之核酸酶穩定性，且使例如皮下施用途徑可行。
用於皮內或皮下施用之溶液或懸浮液通常包括以下中之一或多者：無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及/或張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可用酸或鹼調節，諸如鹽酸或氫氧化鈉，或具有檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽及其類似物之緩衝劑。此類製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
無菌可注射溶液可藉由將所需量之核酸併入具有一種或上述成分之組合的適當溶劑中，繼之以滅菌微過濾來製備。分散液可藉由將活性化合物併入至含有分散介質及視情況存在之其他成分(諸如上述之彼等成分)的無菌媒劑中來製備。在無菌粉末用於製備無菌可注射溶液之情況下，製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其自其無菌過濾溶液產生活性成分以及任何額外所需成分之粉末。
當藉由例如靜脈內、皮膚或皮下注射投與治療有效量之本發明之核酸時，核酸將呈無熱原、非經腸可接受之水溶液形式。考慮適當pH、等張性、穩定性及其類似者，用於製備非經腸可接受之溶液之方法屬於此項技術內。用於靜脈內、皮膚或皮下注射之組合物除核酸外，亦可含有等張媒劑，諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖及氯化鈉注射液、乳酸林格氏注射液或此項技術中已知之其他媒劑。本發明之醫藥組合物亦可含有穩定劑、防腐劑、緩衝劑、抗氧化劑或熟習此項技術者已知之其他添加劑。
可與載劑材料組合以產生單一劑型之核酸的量將視多種因素而變化，包括所治療之個體及特定投與模式。一般而言，組合物的量將在特定情形下產生適當治療效應。一般而言，以百分比計，此量通常在約0.01%至約99%之核酸、約0.1%至約70%之核酸或約1%至約30%之核酸與醫藥學上可接受之載劑組合的範圍內。
核酸可與將保護化合物免於快速釋放之載劑一起製備，該等載劑諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微膠囊化遞送系統。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。許多用於製備此類調配物之方法已獲得專利或為熟習此項技術者所熟知。參見例如Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。
可調節給藥方案以提供最佳所需響應(例如治療響應)。例如，可投與劑量，可隨時間投與若干分次劑量，或可依治療情況(在各情況下)之特定環境所指示按比例減少或增加劑量。當向個體或患者投與時，就投與之容易性及劑量之均勻性而言，將非經腸組合物調配成單位劑型尤其有利。如本文所用，單位劑型係指適用作所治療之個體之單位劑量的物理離散單元；各單元含有經計算以產生所要治療作用之預定量之活性化合物。本發明之單位劑型之規格視活性化合物之特定特徵及欲達成之特定治療效果及任何個別患者之治療及敏感性而定。
本發明之核酸或組合物可使用此項技術中之常規方法產生，包括化學合成，諸如固相化學合成。
本發明之核酸或組合物可與此項技術中已知之多種醫療裝置中之一或多者一起投與。例如，在一個實施例中，本發明之核酸可與無針皮下注射裝置一起投與。適用於本發明之熟知植入物及模組之實例為此項技術中的，包括例如用於控制速率遞送之可植入微輸注泵；用於經由皮膚投與之裝置；用於以精確輸注速率遞送之輸注泵；用於連續藥物遞送之變流可植入輸注裝置；及滲透藥物遞送系統。此等及其他此類植入物、遞送系統及模組為熟習此項技術者已知的。
在某些實施例中，本發明之核酸或組合物可經調配以確保活體內所需分佈。為使本發明之治療化合物或組合物靶向特定活體內位置，其可例如在脂質體中調配，該等脂質體可包含選擇性輸送至特定細胞或器官中之一或多個部分，由此增強靶向藥物遞送。
本發明之特徵在於在分子及組織定向遞送含量中的高特異性。本發明之核酸之序列對其標靶具有高度特異性，意謂其並不抑制未經設計以用於靶向的基因之表現，或僅最低限度地抑制未經設計以用於靶向的基因之表現，及/或僅抑制低數量未經設計以用於靶向的基因之表現。當核酸連接至由特定細胞類型特異性識別且內化之配位體時，可實現更高含量的特異性。例如，當核酸連接至包含GalNAc部分之配位體時，其由肝細胞特異性識別及內化。此導致核酸僅在由其所連接之配位體靶向之細胞中抑制其標靶的表現。此兩種特異性含量潛在地賦予比當前可獲得之治療更好的安全概況。在某些實施例中，本發明因此提供本發明之核酸，該核酸連接至包含一或多個GalNAc部分之配位體，或包含一或多個賦予核酸之細胞類型或組織特異性內化的其他部分，藉此賦予藉由RNA干擾之目標基因基因敲落的額外特異性。
如本文中所描述之核酸可與脂質體形式之脂質一起調配。此類調配物可在此項技術中描述為脂複合體。具有脂質/脂質體之組合物可用於輔助將本發明之核酸遞送至目標細胞。本文中描述之脂質遞送系統可用作結合配位體之替代物。當使用具有脂質遞送系統或具有配位體結合物遞送系統之本發明之核酸時，可存在本文中所描述之修飾。
此類脂複合體可包含脂質組合物，其包含： i)       陽離子脂質或其醫藥學上可接受之鹽； ii)     類固醇； iii)   磷脂醯乙醇胺磷脂；及/或 iv)    聚乙二醇化脂質。
陽離子脂質可為胺基陽離子脂質。
陽離子脂質組分之含量可為組合物之總脂質含量的約55 mol%至約65 mol%。特定言之，陽離子脂質組分為組合物之總脂質含量的約59 mol%。
組合物可進一步包含類固醇。類固醇可為膽固醇。類固醇之含量可為脂質組合物之總脂質含量的約26 mol%至約35 mol%。更特定言之，類固醇之含量可為脂質組合物之總脂質含量的約30 mol%。
磷脂醯乙醇胺磷脂可選自由以下組成之群：1,2-二植烷醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)、1,2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二月桂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二軟脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLoPE)、1-軟脂醯基-2-油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二芥醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、1,2-二角鯊烯醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSQPE)及1-硬脂醯基-2-亞油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SLPE)。磷脂之含量可為組合物之總脂質含量的約10 mol%。
聚乙二醇化脂質可選自由以下組成之群：1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)及C16-神經醯胺-PEG。聚乙二醇化脂質之含量可為組合物之總脂質含量的約1至5 mol%。
組合物中陽離子脂質組分之含量可為脂質組合物之總脂質含量的約55 mol%至約65 mol%，尤其脂質組合物之總脂質含量的約59 mol%。
組合物可具有選自以下i):ii):iii):iv)之組分莫耳比：55:34:10:1；56:33:10:1；57:32:10:1；58:31:10:1；59:30:10:1；60:29:10:1；61:28:10:1；62:27:10:1；63:26:10:1；64:25:10:1；及65:24:10:1。
中性脂質體組合物可由例如二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)或二軟脂醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)形成。陰離子脂質體組合物可由二肉豆蔻醯基磷脂醯甘油形成，而陰離子促融脂質體可由二油醯基磷脂醯乙醇胺(DOPE)形成。另一類型之脂質體組合物由磷脂醯膽鹼(PC) (諸如大豆PC及蛋PC)形成。另一類型由磷脂及/或磷脂醯膽鹼及/或膽固醇之混合物形成。
帶正電之合成陽離子脂質N-[1-(2,3-二油烯基氧基)丙基]-Ν,Ν,Ν-三甲氯化銨(DOTMA)可用於形成小型脂質體，該等脂質體自發地與核酸相互作用以形成能夠與組織培養細胞之細胞膜之帶負電脂質融合的脂質-核酸複合體。DOTMA類似物亦可用於形成脂質體。
本文中所描述之脂質之衍生物及類似物亦可用於形成脂質體。
含有核酸之脂質體可藉由多種方法製備。在一個實例中，脂質體之脂質組分溶解於清潔劑中以使得由脂質組分形成微胞。舉例而言，脂質組分可為兩性陽離子脂質或脂質結合物。清潔劑可具有高臨界微胞濃度且可為非離子性的。例示性清潔劑包括膽酸鹽、CHAPS、辛基葡糖苷、去氧膽酸鹽及月桂醯基肌胺酸。隨後將核酸製劑添加至包括脂質組分之微胞中。脂質上之陽離子基團與核酸相互作用且在核酸周圍縮合以形成脂質體。在縮合之後，例如藉由透析移除清潔劑，以產生核酸之脂質體製劑。
必要時，可在縮合反應期間添加幫助縮合之載劑化合物，例如藉由受控添加。舉例而言，載體化合物可為除核酸以外的聚合物(例如精胺或亞精胺)。亦可調節pH以促進縮合。
本發明之核酸調配物可包括界面活性劑。在一個實施例中，核酸調配為包括界面活性劑之乳液。
未電離之界面活性劑係非離子型界面活性劑。實例包括非離子酯，諸如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯等；非離子烷醇醯胺；及醚，諸如脂肪醇乙氧化物、丙氧基化醇及乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。
當溶解或分散於水中時攜帶負電荷之界面活性劑為陰離子界面活性劑。實例包括羧酸鹽，諸如皂類；醯基乳酸酯；胺基酸之醯胺；硫酸酯，諸如硫酸烷基酯及硫酸乙氧基化烷基酯；磺酸酯，諸如苯磺酸烷基酯、醯基羥乙基磺酸酯、醯基牛磺酸酯及磺基丁二酸酯；及磷酸酯。
當溶解或分散於水中時攜帶正電荷之界面活性劑為陽離子界面活性劑。實例包括四級銨鹽及乙氧化胺。
能力攜帶正電荷或負電荷之的界面活性劑為兩性界面活性劑。實例包括丙烯酸衍生物、經取代之烷基醯胺、N-烷基甜菜鹼及磷脂。
「微胞」在本文中定義為特定類型之分子組裝體，其中兩性分子以球形結構佈置以使得分子之所有疏水性部分被引導向內，留下親水性部分與周圍水相接觸。若環境為疏水性的，則存在相反配置。微胞可藉由混合核酸之水溶液、鹼金屬烷基硫酸鹽及至少一種微胞形成化合物來形成。
例示性微胞形成化合物包括卵磷脂、玻尿酸、玻尿酸之醫藥學上可接受之鹽、乙醇酸、乳酸、甘菊提取物、胡瓜提取物、油酸、亞麻油酸、次亞麻油酸、單烯醛、單油酸酯、單月桂酸酯、琉璃苣油、月見草油、薄荷醇、三羥基側氧基膽鹼基甘胺酸及其醫藥學上可接受之鹽、甘油、聚甘油、離胺酸、聚離胺酸、三油酸甘油酯、聚氧乙烯醚及其類似物、聚醚醇烷基醚及其類似物、鵝去氧膽酸鹽、去氧膽酸鹽及其混合物。
酚及/或間甲酚可添加至混合微胞組合物以充當穩定劑及防腐劑。可添加諸如丙三醇之等張劑。
核酸製劑可併入諸如微粒之粒子中。微粒可藉由噴霧乾燥、凍乾、蒸發、流化床乾燥、真空乾燥或此等方法之組合產生。
定義如本文所用，術語相對於基因表現而言「抑制」、「下調」或「降低」意謂基因之表現或編碼一或多種蛋白質或蛋白質亞單位(例如mRNA)之RNA分子或等效RNA分子之含量或一或多種蛋白質或蛋白質亞單位之活性降低至低於在不存在本發明之核酸或結合核酸的情況下所觀測到的含量或與使用與人類轉錄物無已知同源性的siRNA分子獲得的含量相比(本文稱為非緘黙對照)。此類對照可以類似於本發明之分子的方式結合及修飾且藉由相同途徑遞送至目標細胞中。用本發明之核酸處理之後的表現可降低至95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%或0%或降低至中間值，或低於在無核酸或結合核酸存在下觀察到的表現。表現可在施加核酸之細胞中量測。替代地，尤其若向個體投與核酸，則可在不同細胞組中或在組織或器官中或在體液(諸如血液或血漿)中量測含量。特定言之，在已選擇之條件下量測抑制之含量，因為其在用核酸活體外處理之細胞中展示核酸對目標mRNA含量之最大影響。抑制之含量可例如在使用濃度在0.038 nM-10µM之間、特定言之1 nM、10 nM或100 nM的核酸處理24小時或48小時後量測。此等條件對於不同核酸序列或對於不同類型之核酸可為不同的，諸如對於未經修飾或經修飾或與配位體結合之核酸為不同的。用於測定抑制之含量之適合條件之實例描述於實例中。
核酸意指包含兩股的核酸，其能夠干擾基因表現，該等股包含核苷酸。抑制可為完全或部分的且以靶向方式引起基因表現之下調。核酸包含兩個獨立的多核苷酸股；第一股，其亦可為引導股；及第二股，其亦可為隨從股。第一股及第二股可為相同多核苷酸分子之一部分，該多核苷酸分子具有自互補性，可「摺疊」形成雙股分子。核酸可為siRNA分子。
核酸可包含核糖核苷酸、經修飾之核糖核苷酸、去氧核苷酸、去氧核糖核苷酸或能夠模仿核苷酸之核苷酸類似物非核苷酸，以便它們可與基於目標序列或互補股上的相應鹼基「配對」。核酸可進一步包含由第一股之全部或一部分(此項技術中亦稱為引導股)及第二股之全部或一部分(此項技術中亦稱為隨從股)形成的雙股核酸部分或雙螺旋區。雙螺旋區定義為以形成於第一股與第二股之間的第一鹼基對開始且以形成於第一股與第二股之間(包括端點)的最後鹼基對結束。
雙螺旋區意謂藉由沃森-克里克鹼基配對或允許寡核苷酸股之間的雙螺旋體互補或實質上互補的任何其他方式與彼此形成鹼基對的兩個互補或實質上互補的寡核苷酸中之區域。例如，具有21個核苷酸單元之寡核苷酸股可與具有21個核苷酸單元之另一寡核苷酸鹼基配對，各股上僅19個核苷酸為互補或實質上互補的，使得「雙螺旋區」由19個鹼基對組成。其餘鹼基對可以5'及3'懸垂物之形式存在，或以單股區之形式存在。此外，在雙螺旋區內，不需要100%互補；在雙螺旋區內可允許實質性互補。實質上互補係指在股之間的互補，使得其能夠在生物條件下退火。憑經驗確定兩股是否能夠在生物條件下退火之技術為此項技術中所熟知。可替代地，兩股可在生物條件下合成且相加在一起以確定其是否彼此退火。形成至少一個雙螺旋區之第一股及第二股之部分可完全互補且至少部分彼此互補。視核酸之長度而定，未必需要第一股與第二股之間在鹼基互補方面之完美匹配。然而，第一股與第二股必須能夠在生理條件下雜交。
如本文中所使用，術語「非配對核苷酸類似物」意謂包括非鹼基配對部分的核苷酸類似物，該非鹼基配對部分包括(但不限於)：6-去胺基腺苷(Nebularine)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me核糖U、N3-Me核糖T、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC及N3-Me dC。在一些實施例中，非鹼基配對核苷酸類似物為核糖核苷酸。在其他實施例中，其為去氧核糖核苷酸。
如本文所用，術語「末端官能基」包括(但不限於)鹵素、醇、胺、羧酸、酯、醯胺、醛、酮及醚基。
如本文所用之「懸垂物」具有其在此項技術中之正常及慣用意義，亦即延伸超出雙股核酸中之互補股之末端核苷酸的核酸之單股部分。術語「鈍端」包括雙股核酸，其中兩股皆在同一位置終止，無論末端核苷酸是否鹼基配對。鈍端處之第一股及第二股的末端核苷酸可為鹼基配對的。鈍端處之第一股及第二股的末端核苷酸可不配對。鈍端處之第一股及第二股的末端兩個核苷酸可為鹼基配對的。鈍端處之第一股及第二股的末端兩個核苷酸可不配對。
術語「絲胺醇衍生之連接子部分」意謂包含以下結構之連接子部分：
Figure 02_image089
該結構之O原子通常連接至RNA股且N原子通常連接至靶向配位體。
在本發明之情形下，「蛋白質S」係關於由基因PROS1 (NCBI基因ID: 5627)編碼之人類「維生素K依賴性蛋白質S」(UniProt ID P07225)。
在本說明書之情形下，術語「血友病」係關於一種使得血液凝結能力受損之病狀。術語「血友病」中所包括之病狀或病症為遺傳血友病、A型或B型或C型血友病、後天性血友病、無纖維素原血症、低纖維素原血症、副血友病、關節血腫(AH)、凝血因子II、V、VII、X及/或XI之遺傳缺乏症、因子V及VIII之組合缺乏症、馮威里氏病、馮威里氏症候群、凝血因子後天性缺乏症。
術語「患者」、「個體(subject)」及「個體(individual)」可互換使用且係指人類或非人類動物。此等術語包括哺乳動物，諸如人類、靈長類動物、家畜動物(例如牛科動物、豬科動物)、伴侶動物(例如犬科動物、貓科動物)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。
如本文中所使用，「治療(treating)」或「治療(treatment)」及其文法變體係指用於獲得有益或所要結果之方法。術語可指減緩病狀、病症或疾病之發作或發展速率，減少或緩解與其相關之症狀，產生病況之完全或部分消退，或以上中之任一者之某一組合。出於本發明之目的，有益或所要臨床結果包括但不限於降低或緩解症狀、減輕疾病程度、使疾病狀態穩定(亦即不惡化)、延緩或減緩疾病惡化、改善或緩和疾病狀態及緩解(無論部分或完全)，無論可偵測或不可偵測。「治療」亦可意謂相對於在未接受治療之情況下的預期存活時間延長存活期。因此，需要治療之個體(例如人類)可為已罹患所描述疾病或病症的個體。術語「治療」包括與未進行治療相比抑制或降低病理狀態或症狀之嚴重度增加，且無需意謂暗示使相關疾病、病症或病狀完全停止。
如本文中所使用，術語「預防」及其文法變體係指一種用於預防病狀、疾病或病症之顯現或改變其病變的方法。因此，「預防」可指防治性或預防性措施。出於本發明之目的，有益或所要臨床結果包括但不限於預防或減緩疾病之症狀、進程或發展，無論可偵測或不可偵測。因此，需要預防之個體(例如人類)可為尚未罹患所描述疾病或病症之個體。術語「預防」包括與未進行治療相比減緩疾病發作，且無需意謂暗示永久性預防相關疾病、病症或病狀。因此，「預防(preventing)」或「預防(避免)」之病狀可在某些情形下係指降低發展該病狀之風險，或預防或延遲與該病狀相關之症狀的發展。
如本文所用，「有效量」、「治療有效量」或「有效劑量」為在個體中產生至少一種所需治療效果，諸如預防或治療目標病狀或有利地緩解與病狀相關之症狀的組合物(例如治療性組合物或藥劑)之量。
如本文所使用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指對接受所描述鹽之投與的患者或個體無害的鹽。其可適當地為例如選自酸加成鹽及鹼鹽當中之鹽。酸加成鹽之實例包括氯化物鹽、檸檬酸鹽及乙酸鹽。鹼性鹽之實例包括鹽，其中陽離子選自鹼金屬陽離子，諸如鈉或鉀離子；鹼土金屬陽離子，諸如鈣或鎂離子；及經取代之銨離子，諸如型N(R 1)(R 2)(R 3)(R 4) +之離子，其中R 1、R 2、R 3及R 4將獨立地通常表示氫，視情況經取代之C1-6-烷基或視情況經取代之C2-6-烯基。相關C1-6烷基之實例包括甲基、乙基、1-丙基及2-丙基。可能相關的C2-6烯基之實例包括乙烯基、1-丙烯基及2-丙烯基。醫藥學上可接受之鹽之其他實例描述於“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”, 第3版, James Swarbrick (編), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007中的“Remington's Pharmaceutical Sciences”, 第17版, Alfonso R.Gennaro(編), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985(及其較新的版本)中，及J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)中。「醫藥學上可接受之鹽」定性保持母體化合物之所需生物活性，而不相對於化合物賦予任何非所需作用。醫藥學上可接受之鹽之實例包括酸加成鹽及鹼加成鹽。酸加成鹽包括衍生於無毒無機酸之鹽，諸如鹽酸、硝酸、亞磷酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸及其類似物；或衍生於無毒有機酸之鹽，諸如脂族單甲酸及脂族二甲酸、經苯基取代之烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸及其類似物。鹼加成鹽包括衍生於鹼土金屬之鹽，諸如鈉、鉀、鎂、鈣及其類似物；以及衍生於無毒有機胺之鹽，諸如N,N'-二苯甲基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普魯卡因(chloroprocaine)、膽鹼、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因(procaine)及其類似物。
術語「醫藥學上可接受之載劑」包括標準醫藥學載劑中之任一者。用於治療性用途之醫藥學上可接受之載劑在醫藥領域中為熟知的，且描述於例如Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro編 1985)中。例如，可在略微酸性或生理pH下使用無菌鹽水及磷酸鹽緩衝鹽水。例示性pH緩衝劑包括磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、參(羥基甲基)胺基甲烷(TRIS)、N-參(羥基甲基)甲基-3-胺基丙磺酸(TAPS)、碳酸氫銨、二乙醇胺、組胺酸(其為較佳的緩衝劑)、精胺酸、離胺酸或乙酸鹽或其混合物。該術語進一步涵蓋美國藥典(US Pharmacopeia)中列舉之用於動物(包括人類)之任何載劑。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有生理學上可接受，亦即相容溶劑、分散液介質、包衣、抗微生物劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。在某些實施例中，載劑適用於靜脈內、肌內、皮下、非經腸、脊髓或表皮投與(例如藉由注射或輸注)。視選擇之投與途徑而定，核酸包覆在一或多種材料中，旨在保護化合物免受酸及其他天然失活條件的作用，當藉由特定投與途徑投與個體時，核酸可能暴露在此等條件下。
在本發明之情形下，術語「溶劑合物」係指溶質(在此情況下，根據本發明之核酸化合物或其醫藥學上可接受之鹽)與溶劑之間形成的既定化學計量之複合體。在此方面，溶劑可為例如水或另一醫藥學上可接受之(通常)小型分子有機物質，諸如(但不限於)乙酸或乳酸。當所述溶劑為水時，此類溶劑合物通常稱為水合物。
現將參考以下非限制性圖式及實例描述本發明。
實例 實例 1- 建構組元之合成如下文所描述之DMT-絲胺醇(GalNAc)-CEP及CPG之合成途徑概述於圖1中。起始材料DMT-絲胺醇(H) ( 1)根據文獻公開之方法(Hoevelmann等人, Chem. Sci., 2016,7, 128-135)自可商購之L-絲胺酸製得。GalNAc(Ac 3)-C 4H 8-COOH ( 2)根據文獻公開之方法(Nair等人, J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), 第16958-1696頁)，以可商購之全乙醯化半乳胺糖為起始材料製得。磷醯化試劑2-氰基乙基-N,N-二異丙基氯亞胺基磷酸酯( 4)為可商購品。(vp)-mU-磷之合成如以下中所描述進行：Prakash, Nucleic Acids Res. 2015, 43(6), 2993-3011及Haraszti, Nucleic Acids Res. 2017, 45(13), 7581-7592。ST43 (ST43-磷)以及ST23 (ST23-磷)之亞胺基磷酸酯衍生物及類似者之合成可如WO2017/174657中所描述進行。
DMT-絲胺醇(GalNAc) ( 3)
將HBTU (9.16 g，24.14 mmol)添加至GalNAc(Ac 3)-C 4H 8-COOH ( 2) (11.4 g，25.4 mmol)及DIPEA (8.85 ml，50.8 mmol)之攪拌溶液中。在2分鐘活化時間之後，將DMT-絲胺醇(H) ( 1) (10 g，25.4 mmol)於乙腈(無水) (200 ml)中之溶液添加至攪拌混合物中。在1小時之後，LCMS顯示良好轉化。將反應混合物真空濃縮。將殘餘物溶解於EtOAc中，隨後用水(2×)及鹽水洗滌。經Na 2SO 4乾燥有機層，過濾且在減壓下濃縮。藉由管柱層析法(3% MeOH/CH 2Cl 2+1% Et 3N，700 g二氧化矽)進一步純化殘餘物。彙集含有溶離份之產物，濃縮且用CH 2Cl 2(2×)汽提，得到10.6 g (51%)呈灰白色泡沫狀之DMT-絲胺醇(GalNAc) ( 3)。
DMT-絲胺醇(GalNAc)-CEP ( 5)
在0℃下在氬氣氛圍下將2-氰基乙基-N,N-二異丙基氯亞胺基磷酸酯( 4) (5.71 ml，25.6 mmol)緩慢添加至DMT-絲胺醇(GalNAc) ( 3) (15.0 g，17.0 mmol)、DIPEA(14.9 ml，85 mmol)及4Å分子篩於二氯甲烷(無水) (150 ml)中之攪拌混合物中。在0℃下攪拌反應混合物1小時。TLC指示完全轉化。過濾反應混合物且真空濃縮，得到稠油狀物。將殘餘物溶解於二氯甲烷中且藉由急驟層析法(0-50%丙酮/甲苯1% Et3N，220 g二氧化矽)進一步純化。彙集含有溶離份之產物且真空濃縮。用MeCN (2×)汽提所得油狀物，得到13.5 g (77%)無色DMT-絲胺醇(GalNAc)-CEP ( 5)泡沫狀物。
DMT-絲胺醇(GalNAc)-丁二酸酯( 6)
在氬氣氛圍下，將DMAP (1.11 g，9.11 mmol)添加至DMT-絲胺醇(GalNAc) ( 3) (7.5 g，9.11 mmol)及丁二酸酐(4.56 g，45.6 mmol)於二氯甲烷(50 ml)及吡啶(50 ml)之混合物中之攪拌溶液。在攪拌16小時之後，在真空中濃縮反應混合物且使殘餘物溶於EtOAc中且用5%檸檬酸(水溶液)洗滌。用EtOAc萃取水層。隨後用飽和NaHCO 3(水溶液)及鹽水洗滌合併之有機層，經Na 2SO 4乾燥，過濾且真空濃縮。藉由急驟層析法(0-5% MeOH/CH 2Cl 2+1% Et 3N，120g二氧化矽)實現進一步純化。彙集含有溶離份之產物且真空濃縮。用MeCN (3×)汽提殘餘物，得到5.9 g (70%) DMT-絲胺醇(GalNAc)-丁二酸酯( 6)。
DMT-絲胺醇(GalNAc)-丁二醯基-lcaa-CPG ( 7)
將DMT-絲胺醇(GalNAc)-丁二酸酯( 6) (1當量)及HBTU (1.1當量)溶解於CH 3CN (10 ml)中。將二異丙基乙胺(2當量)添加至溶液中，且將混合物旋動2分鐘，隨後添加天然胺基-lcaa-CPG (500 A，88 µmol/g，1當量)。懸浮液在室溫下在腕式振盪器上輕輕振盪16小時，接著過濾且用乙腈洗滌。在減壓下乾燥固體載體2小時。藉由在室溫下(2×15 min)用Ac 2O/2,6-二甲基吡啶/NMI攪拌來封端載體上之未反應之胺。如上所描述重複洗滌載體。在真空下乾燥固體，得到DMT-絲胺醇(GalNAc)-丁二醯基-lcaa-CPG ( 7) (負載：34 µmol/g，藉由去三苯甲基化分析測定)。
實例 2- 寡核苷酸合成根據下文所描述且熟習此項技術者已知之方法合成實例化合物。藉由應用亞胺基磷酸酯方法之固相合成進行寡核苷酸鏈及連接子建構組元之組裝。
下游裂解、脫除保護基及純化遵循此項技術中已知之標準程序。
使用可商購的2'O-甲基RNA及2'氟-2'去氧基RNA鹼基負載之CPG固體載體及亞胺基磷酸酯(所有標準保護，ChemGenes，LinkTech)在AKTA oligopilot 10上進行寡核苷酸合成。DMT-(S)-絲胺醇(GalNAc)-丁二醯基lcaa CPG ( 7)及DMT-(S)-絲胺醇(GalNAc)-CEP ( 5)之合成描述於實例1中。
輔助試劑購自EMP Biotech。使用0.1 M亞胺基磷酸酯於無水乙腈(＜20 ppm H 2O)中之溶液進行合成，且使用苯甲硫基四唑(BTT)作為活化劑(0.3 M於乙腈中)。偶合時間為10分鐘。應用封端/OX/封端或封端/硫基/封端循環(封端：Ac 2O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化劑：0.05 M於吡啶/H 2O中之I 2)。在乙腈(Link technologies)中使用可商購的硫醇化試劑50 mM EDITH引入硫代磷酸酯。DMT裂解藉由用含3%二氯乙酸之甲苯處理來達成。在完成程式化合成循環後，進行二乙胺(DEA)洗滌。所有寡核苷酸以DMT-關閉模式合成。
藉由使用鹼基負載之(S)-DMT-絲胺醇(GalNAc)-丁二醯基-lcaa-CPG (7)或(S)-DMT-絲胺醇(GalNAc)-CEP (5)實現絲胺醇(GalNAc)部分之連接。三觸角GalNAc簇(ST23/ST43)藉由連續偶合treble亞醯胺衍生物(C6XLT-磷)，接著GalNAc亞醯胺(ST23-磷)來引入。(vp)-mU部分之連接藉由在最後合成循環中使用(vp)-mU-磷來達成。(vp)-mU-磷不提供適合於進一步合成延長的羥基，且因此不具有DMT-基團。因此(vp)-mU-磷之偶合導致合成終止。
為移除掩蔽乙烯基膦酸酯的甲酯，將攜帶充分組裝之寡核苷酸的CPG減壓乾燥且轉移至20 ml PP注射器反應器中，用於裝配有玻璃片(Carl Roth GmbH)之固相肽合成。隨後在室溫下使CPG與250 µL TMSBr及177 µL吡啶於CH 2Cl 2(0.5 ml/µmol固體載體結合之寡核苷酸)中之溶液接觸，且用Luer封端密封反應器。反應容器在2×15分鐘之時段內略微攪動，丟棄過量試劑，且用10 ml乙腈洗滌殘餘CPG 2次。其他下游處理並未改變任何其他實例化合物。
單股藉由40%甲胺水溶液處理(90分鐘，室溫)自CPG裂解掉。所得粗寡核苷酸藉由離子交換層析法(Resource Q，6 ml GE Healthcare在AKTA Pure HPLC系統上使用氯化鈉梯度純化。將含有產物之溶離份彙集，在尺寸排阻管柱(Zetadex，EMP Biotech)上去鹽，且凍乾直至進一步使用。
所有最終單股產物藉由AEX-HPLC分析以證明其純度。各別單股產物之標識藉由LC-MS分析證明。
實例 3- 雙股形成將個別單股以60 OD/ml之濃度溶解於H 2O中。兩個個別寡核苷酸溶液一起添加於反應容器中。為了更容易地反應監測，進行滴定。如藉由260 nm下之UV吸收所測定，第一股相比於第二股過量添加25%。將反應混合物加熱至80℃持續5分鐘且接著緩慢冷卻至室溫。藉由離子成對逆相HPLC監測雙股形成。自殘餘單股之UV面積計算所需量之第二股，且將其添加至反應混合物中。將反應物再次加熱至80℃且緩慢冷卻至室溫。重複此程序直至偵測到小於10%之殘餘單股。
實例 4- 藉由轉染 PROS1 siRNA 使人類 Hep3B 細胞中人類 PROS1 mRNA 含量 降低活體外測試展示藉由將PROS1 siRNA分子EU060中之任一者轉染至EU083使人類Hep3B細胞中之PROS1 mRNA含量降低超過70%。Hep3B細胞以每孔12000個細胞之密度接種於96孔盤中。第二天，用10 nM、1 nM或0.1 nM PROS1 siRNA或非靶向對照siRNA (EU012)及1 µg/ml AtuFECT轉染細胞。其後24小時裂解細胞用於RNA提取，且藉由Taqman qRT-PCR測定PROS1及肌動蛋白mRNA含量。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA雙螺旋體列於表2中且進一步描述於表4中。結果展示於圖2中。
實例 5- 藉由轉染 PROS1 siRNA 使人類細胞中之 PROS1 mRNA 含量的 劑量依賴性降低活體外測試展示藉由多種PROS1 siRNA分子使人類Hep3B細胞中之PROS1 mRNA含量的劑量依賴性降低。Hep3B細胞以每孔12000個細胞之密度接種於96孔盤中。第二天，用0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM PROS1 siRNA或0.1 nM非靶向對照siRNA (EU012)及1 µg/ml AtuFECT轉染細胞。其後24小時裂解細胞用於RNA提取，且藉由Taqman qRT-PCR測定PROS1及肌動蛋白mRNA含量。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA雙螺旋體列於表2中且進一步描述於表4中。結果展示於圖3中。
實例 6- 藉由 PROS1 siRNA 結合物之受體介導的攝取抑制原代小鼠肝細胞中之 PROS1 目標基因表現實例展示藉由EU140至EU148之受體介導的攝取在原代肝細胞中之PROS1 mRNA含量的劑量依賴性降低。原代小鼠肝細胞以每孔25000個細胞之密度接種於96孔盤中。連接後，將其以100 nM、10 nM、1 nM及0.1 nM與PROS1 siRNA結合物一起在細胞培養基中培育，如下文所指示，或將其與100 nM非靶向對照結合物(EU110)一起培育。第二天，裂解細胞用於RNA提取，且藉由Taqman qRT-PCR測定PROS1及ApoB mRNA含量。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因ApoB所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。結果展示於圖4中。
實例 7- 藉由 PROS1 siRNA 結合物之受體介導的攝取抑制原代人類肝細胞中之 PROS1 基因表現實例展示藉由EU140至147在原代人類肝細胞中之人類PROS1 mRNA含量的劑量依賴性降低。原代人類肝細胞(Life Technologies)以盤培養基中每孔35000個細胞之密度接種於96孔盤中，且隨後如圖5中所示以100 nM、10 nM、1 nM及0.1 nM之濃度與PROS1 siRNA結合物EU140至EU147培育，或其與100 nM非靶向對照結合物(EU110)一起培育。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因ApoB所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。結果展示於圖5中。
實例 8-X- 酶活性之損失拯救 Pros1 -/- 小鼠 Pros1 +/- 雌性與 F8 -/- 雄性雜交產生25%之 F8 +/-Pros1 +/- 後代。 F8 +/-Pros1 +/- 雌性與 F8 -/- 雄性繁殖產生25%之 F8 -/-Pros1 +/- 後代(圖13a-c)。使用 F9 -/-Pros1 +/- 小鼠得到類似觀測結果(圖13d-f)。如所預期， F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠未分別顯示FVIII及FIX血漿活性，且未在 F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠血漿中偵測到PS (蛋白質S) (圖6C-D)。如所報導， F8 -/-Pros1 +/- 及 F9 -/-Pros1 +/- 中之PS含量比 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 +/+ 小鼠中小約50%至60% (圖6C-D)。
在來自 F8 -/-Pros1 +/- 繁殖對之295隻幼崽中，72隻(24%)係 F8 -/-Pros1 +/+ ，164隻(56%)係 F8 -/-Pros1 +/- ，及59隻(20%)係 F8 -/-Pros1 -/- (χ 2=4.8， P=0.09)。因此， F8 -/-Pros1 -/- 小鼠係以預期的孟德爾比率存在。相比之下，在來自 F9 -/-Pros1 +/- 繁殖對之219隻幼崽中，56隻(26%)係 F9 -/-Pros1 +/+ ，132隻(60%)係 F9 -/-Pros1 +/- ，及31隻(14%)係 F9 -/-Pros1 -/- (χ 2=14.95， P=0.001)。這與 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠的傳代比率失真相一致，與 F9 +/+Pros1 +/+ 小鼠之交配相比，每窩產仔數減少(5.2±0.7與9.8±1.8，n=4次交配/超過3 t代， P=0.046)。
F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠似乎完全正常。分別監測其存活率直至20個月( n=4)及16個月( n=2)，分別與 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 +/+ 小鼠相比，未展示出任何差異。
由於小鼠之完全Pros1缺乏導致消耗性凝血病，吾人評估 F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠是否發展出DIC。在 F8 -/-Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/- 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠(圖6C)以及 F9 -/-Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠(圖6D)中，DIC參數係可比的。由於不存在FVIII，活化部分凝血活酶時間(aPTT)在 F8 -/-Pros1 +/+ (69±2秒)、 F8 -/-Pros1 +/- (68±3秒)及 F8 -/-Pros1 -/- (63±3秒)小鼠中同樣延長(平均值±標準誤，每組 n=6， P=0.3)。藉由 F9 -/-Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠獲得可比資料。此外，在 F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠之腦、肺、肝及腎中未發現血栓或纖維蛋白沈積(圖14)。
因此，X-酶活性之損失拯救完全 Pros1缺乏之胚胎致死性。然而，在失去FIX活性之情況下，拯救僅為部分的。一種可能的解釋係與嚴重HA相比，嚴重HB似乎為不太嚴重之病狀。因此， Pros1 -/- 小鼠中之 F9中斷不如 F8中斷能夠更有效地再平衡凝血。
為探究藉由FVIII輸注恢復內源性X-酶活性是否會誘導 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之DIC、血栓及紫瘢爆發，吾人靜脈內投與重組FVIII (rFVIII)。在rFVIII注射之後無小鼠死亡。在單次注射過度劑量之rFVIII之後24小時，在 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中發現許多血管內有血栓，且肺部中有出血(圖6E-圖6F)。重複投與正常劑量之rFVIII之後24小時，凝血分析展示凝血酶原時間(PT)不穩定(未顯示)，纖維蛋白原較低以及凝血酶-抗凝血酶(TAT)含量較高，與明顯的DIC相符(圖6G)。相比之下，在 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中單次注射正常劑量rFVIII後，纖維蛋白原及TAT含量與未經處理之 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中的含量相當(圖6G)。儘管在肺及肝中可見大量血栓(圖6H-I)，但此等小鼠均未出現紫瘢爆發。
實例 9-X- 酶活性之損失不能阻止由 Pros1-/- 小鼠中之 TF 誘導之血栓栓塞引起的死亡先前吾人證實，儘管88%之 Pros1 +/+ 小鼠存活於TF誘導之血栓栓塞模型，但僅25%之 Pros1 +/- 小鼠在低TF劑量注射(約1.1 nM)之後仍存活20分鐘。當使用較高的TF劑量(約4.3 nM)時， Pros1 +/+ 及 Pros1 +/- 小鼠均在20分鐘內死亡。然而， Pros1 +/- 比 Pros1 +/+ 更早死亡。HA及WT小鼠同等地對此高TF劑量敏感，其中超過85%之小鼠在15分鐘內死亡(圖7A)。相比之下，在用低分子量肝素(LMWH)進行血栓防治下＞75% WT小鼠存活(圖7A)。因此，與LMWH相比，HA不能保護小鼠免於TF誘導之血栓栓塞。吾人隨後在相同模型中研究 F8 -/-Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/- 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠。在輸注TF (約2.1 nM)之後，40%至60%小鼠死亡( P＞0.05)，與其 Pros1基因型無關(圖7B)。然而， F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 -/-Pros1 +/- 比 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠更早死亡，且 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠比 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠更早死亡(平均死亡時間： F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠死亡時間為12±4分鐘， F8 -/-Pros1 +/- 為7±2分鐘， F8 -/-Pros1 -/- 小鼠為8±3分鐘， n=4-6/組， P=0.43)。藉由 F9 -/-Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠獲得類似資料(資料未展示)。
在TF誘導之血栓栓塞攻擊期間死亡之 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之肺動脈中偵測到纖維蛋白凝塊(圖7C)。重要地， F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之肺中存在比 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠更多的血栓(分別為 n=48與26)。此外， F8 -/-Pros1 -/- 肺部之大多數動脈完全閉塞，而 F8 -/-Pros1 +/+ 肺部中僅部分閉塞。
在TF誘導之血栓栓塞攻擊期間死亡之 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠均未出現紫瘢爆發。藉由 F9 -/-Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠獲得類似資料(未展示)。
實例 10-FVIII 之損失部分保護 Pros1 -/- 小鼠免於腸系膜小動脈中之血栓吾人隨後記錄腸系膜小動脈中之血栓形成，其為對凝血內源性路徑中之缺陷敏感的模型。在 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠中，血栓在20分鐘內增長至閉塞的大小，且所有受損小動脈經閉塞(圖7D)。如所預期， F8 -/-Pros1 +/+ 小動脈均不顯示血栓，而 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠顯示部分血栓(圖7D)。
栓塞在 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠中形成血栓期間產生，但不在 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠中產生。在 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中，多個微栓塞在部分血栓生長期間剝離，預防閉塞血栓之形成。
實例 11- Pros1 靶向限制但不廢除 HA 小鼠中之尾部出血使用輕度或重度出血模型，藉由尾部橫切評估出血表型。
在兩種模型中，與 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠相比，在 F8 -/-Pros1 -/- 中，失血量減少(圖8A-B)。當經輕度模型刺激時， F8 - / -Pros1 +/- 小鼠出血少於 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠(圖8A)。相比之下，當暴露於嚴重模型時， F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠顯示相當的失血量(圖8B)。然而，在兩種模型中 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠出血超過 F8 +/-Pros1 +/+ 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠(圖8A-B)，表明 F8 -/- 小鼠中Pros1之損失部分校正 F8 -/- 小鼠之出血表型。
接著，PS-中和抗體用於研究PS活性之抑制如何改變 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠中之尾部出血。此抗體限制了 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠中之失血量(圖8C)，其程度與 Pros1完全遺傳性喪失相同(圖8B)。
實例 12- Pros1 靶向或 PS 抑制完全保護 HA 或 HB 小鼠免受急性關節血腫 (AH)儘管出血可出現於血友病患者中之任何地方，但大部分出血出現於關節中。為了確定 Pros1損失是否預防血友病小鼠中之關節血腫，吾人將AH模型應用於 F8 -/-Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/- 、 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠。與 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠相比，在 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠中，損傷之後的膝腫脹減少(圖9A)。 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠之間的膝腫脹亦無差異(圖9A)。在 F8 -/-Pros1 +/+ (IBS=2， n=5)之關節間隙及滑膜中觀測到出血，但 F8 -/-Pros1 -/- (IBS=0， n=5)及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠(IBS=0， n=5)則未觀測到(圖9B)。相比於 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠，在 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠之關節間隙及滑膜中存在更多纖維蛋白(圖9B)。藉由 F9 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠獲得類似資料(分別為IBS=0， n=3，及IBS=2， n=3) (圖15A-B)。
藉由在 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠中在4天期間連續皮下輸注PS-中和抗體或對照抗體(在AH誘導之前1天開始)(在PS-中和抗體組中之膝腫脹為0.43±0.07 mm相對於對照組中0.69±0.09 mm， n=9， P=0.04)證實此等結果。PS-中和抗體組中PS血漿含量為26±6%，相對於對照組中之45%±3% ( n=5， P=0.017)。另外，可替代地藉由靜脈內注射鼠類PS (mPS) siRNA實現PS抑制，隨後在 F8 -/-Pros1 +/- 及 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠中進行AH攻擊(圖9C-D)。當與用對照siRNA (IBS=2， n=3)處理之小鼠相比時，IBS評估證實用mPS siRNA (IBS=0.5， n=3)處理之 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠中缺乏關節內出血(圖9C)。重要地，mPS siRNA均減少在血漿中(對照中26±3%相對於84±11%， n=3， P=0.006)及滑膜中之PS表現(圖10A)。
實例 13-PS 及 TFPI 均表現於小鼠滑膜中為理解血友病小鼠中之 Pros1之遺傳缺失及PS抑制之顯著關節內止血作用，針對PS及TFPI對膝切片進行免疫染色。PS主要存在於具有用對照siRNA處理之患有AH的 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠之滑膜組織的內裏層處，而PS之滑膜染色在接受mPS siRNA之患有AH的 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠中顯著地減少(圖10A)。相比之下，TFPI染色在來自接受mPS siRNA之血友病小鼠之滑膜組織中比在藉由對照siRNA處理之彼等者中更顯著(圖10A)。然而，TFPI表現在 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠兩者之滑膜內裏層中相當(圖10B)。
為進一步證明PS由纖維母細胞樣滑膜細胞(FLS)表現，吾等對自 F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- FLS收集之條件培養基進行西方墨點法。如圖10C中所示， F8 +/+Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 +/+ FLS之培養基顯示了一條分子量約為75kDa的帶，與PS相當且與血漿及血小板中觀測到之帶類似。如所預期，在獲自 F8 +/+Pros1 -/- FLS之培養基中未偵測到染色(圖10C)。
吾人亦研究在 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- FLS條件培養基中之TFPI表現(圖10D)。所有培養基均顯示約50 kDa之帶，類似於使用胎盤裂解物觀測到之一個帶。由於完全糖基化TFPIα及TFPIβ以相同分子量遷移，在蛋白質去糖基化之後研究TFPI同功異型物表現。自FLS培養基去糖基化TFPI在TFPIα之分子量下遷移作為單一帶，類似於胎盤TFPI (TFPIα之陽性對照) (圖10D)。此指示FLS表現TFPIα但不表現TFPIβ。此外，在用凝血酶刺激之後，在 F8 -/-Pros1 +/+ FLS中PS及TFPI表現增加(圖10E-F)。
實例 14-PS 及 TFPI 兩者均表現於患有 HA 或 HB 之患者的滑膜中接著對人類HA、HB及骨關節炎膝滑膜組織進行PS及TFPI兩者的分析(圖11A)。按需發現HA患者之滑膜內裏層及次級內裏層中之TFPI及PS的強信號( n=7)。相比之下，在防治下HA患者中PS及TFPI之免疫染色減少( n=5)。按需之HB患者與按需之HA患者相比，滑膜內裏層及次級內裏層( n=4)中之PS及TFPI兩者展現較少信號。來自骨關節炎患者之切片(n=7)不展示TFPI及PS之強烈染色，與防治下之血友病患者類似。為評價TFPI之何種同功異型物係由人類FLS表現，對自健康個體及患有骨關節炎之患者分離之人類FLS的條件培養基進行西方墨點法。類似於鼠類FLS，人類FLS表現TFPIα但不表現TFPIβ (圖11B)。
實例 15- Pros1 之損失為 HA 小鼠中缺乏 TFPI 依賴性 PS 活性及對 APC 之具有抗性的原因缺乏 Pros1或其中抑制PS之HA或HB小鼠中對AH的完全保護可至少部分地藉由缺乏關節中之APC及TFPI的PS輔因子活性來解釋。然而，在尾部出血模型中受攻擊之HA小鼠中缺乏 Pros1或PS抑制之部分止血效果的原因需要進一步研究。
離體TF-起始之凝血酶生成測試已展示血漿產生凝血酶之能力與血友病之臨床嚴重程度之間的相關性。因此，吾人研究 Pros1損失對HA小鼠血漿中凝血酶生成之影響。在血小板游離血漿(PFP)中不評估TFPI依賴性PS活性，但在富含血小板血漿(PRP)中進行評估，因為在小鼠血漿中使用凝血酶生成測試無法展現PS之TFPI輔因子活性。此藉由小鼠血漿中缺乏TFPIα而其存在於小鼠血小板中來解釋。
對於響應1 pM TF，凝血酶峰值及內源性凝血酶電位(ETP)在 F8 -/-Pros1 -/- 中顯著高於在 F8 -/-Pros1 +/+ PRP中(1072±160相對於590±10 nmol/l. min， n=3/組， P=0.04)，表明在 F8 -/-Pros1 -/- PRP中缺乏PS TFPI-輔因子的活性(圖12A)。與先前研究一致，在1、2.5或5pM TF存在下， F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之PFP中凝血酶峰值及ETP均為可比的(資料未展示)。
為評估 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠是否展現缺陷功能性APC依賴性PS活性，吾人在不存在APC之情況下、在野生型(WT)重組APC存在下或在突變(L38D)重組小鼠APC (L38D APC，一種具有剝蝕PS輔因子活性之變異體)存在下使用Ca 2+離子載體活化PRP之凝血酶生成測試。在此分析中，APC滴定顯示添加8 nM WT APC能夠使ETP在WT小鼠之活化PRP中降低90%，而相同濃度之L38D APC使ETP降低僅30% (資料未展示)。基於此等資料，記錄活化PRP之凝血酶生成曲線(3隻小鼠/分析)。所計算之APC比率(ETP +APC WT /ETP +APC L38D )指示在 F8 -/-Pros1 -/- 血漿中存在APC抗性，但在 F8 -/-Pros1 +/+ 血漿中不存在APC抗性(分別為0.87±0.13相對於0.23±0.08， P=0.01) (圖12B)。
亦在2 nM WT APC及L38D APC存在下，在來自 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之PFP中測試APC依賴性PS活性(2隻小鼠/分析)。計算之APC比率顯示 F8 -/-Pros1 -/- 中之APC抗性而非 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠中之APC抗性(分別為1.08±0.04相對於0.25±0.09， P=0.0003) (圖12B)。
實例 16- 缺乏 Pros1 小鼠之 HA 小鼠中之改良纖維蛋白網狀結構尾部出血小鼠模型不僅對血小板功能障礙敏感且亦對凝血及纖維蛋白溶解改變敏感。為理解關於尾部出血之所研究基因型之間的差異，吾人使用掃描電子顯微鏡成像來研究纖維蛋白結構(圖12C)。與 F8 -/-Pros1 +/+ 血漿凝塊相比，來自 F8 +/+Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 血漿之凝塊展示高度分支纖維蛋白纖維之更緻密網狀結構(圖16a-b)。相比之下，比 F9 -/-Pros1 +/+ 血漿凝塊相比，來自 F9 +/+Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 -/- 血漿之凝塊未顯示更密集之網狀結構，但存在增加之纖維分支的趨勢(圖16c-d)。
來自 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠之纖維蛋白纖維，以及來自 F9 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 +/+ 小鼠之纖維蛋白纖維，與來自 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠或 F9 +/+Pros1 +/+ 小鼠的纖維相比，分別顯示較大直徑。然而，與 F8 -/-Pros1 +/+ 或 F9 -/-Pros1 +/+ 小鼠相比， F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠之纖維表面分別顯示出較少的孔隙率，這表明 F8 -/-Pros1 -/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 衍生之纖維可能滲透性較低，且藉此比 F8 -/-Pros1 +/+ 或 F9 -/-Pros1 +/+ 衍生之纖維更能抵抗纖維蛋白溶解。此等資料與TFPI及APC輔因子活性結果(圖12A-B)相輔相成，有助於解釋為什麼與 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠相比， F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中之尾部出血得到改善，但卻不像 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠那樣完全得到校正。
實例 17- 血漿中之 PS 抑制恢復患有 HA 之患者中之凝血酶生成吾人隨後檢查在人類HA血漿中PS抑制對凝血酶生成之影響。PFP中之ETP在PS-中和抗體存在下增加2倍至4倍。使用針對C末端域之抗人類TFPI抗體獲得類似結果以實現有效FXa抑制，甚至在FVIII抑制劑存在下(圖12D-E)。PS抑制在PRP樣品中具有顯著作用，其中其增加ETP超過10倍(1912±37及1872±64 nM*min) (分別為圖12F及G)。因此，PS抑制在血友病血漿中完全恢復ETP (用於比較，正常血漿中之ETP：1495±2nM*min)。使用抗TFPI抗體獲得類似結果(圖12D-G)。此等資料確認人類中吾人在小鼠中觀測到的由PS抑制驅動之HA PFP及PRP中凝血酶生成之改善。
實例 18- 實例 6-17 之材料及方法 小鼠自傑克遜實驗室(The Jackson Laboratory)獲得患有C57BL/6J背景之 F8 -/- 小鼠(B6；129S4- F8 tm1Kaz /J)及 F9 -/- 小鼠(B6.129P2- F9 tm1Dws /J)。 Pros1 +/- 小鼠為原始群體之後代。瑞士聯邦獸醫局(The Swiss Federal Veterinary Office)批准該等實驗。
TF 誘導之肺栓塞6至9週齡之麻醉小鼠靜脈內接受4.25 nM(1: 2稀釋)或2.1 nM(1: 4稀釋)之人類重組TF(hrTF，Dade Innovin，Siemens) (2 µL/g)。在呼吸停滯起始兩分鐘後或在20分鐘觀察期完成時，收集肺部且固定於4% PFA中。肺切片用蘇木精(hematoxylin)及伊紅(eosin)染色，且對於纖維蛋白進行染色。以10個隨機選擇之非重疊場(×10放大率)中之血管內血栓的數目來評估肺中纖維蛋白凝塊之程度。
HA 小鼠中之尾部剪切模型如所描述，兩種不同尾部剪切模型來評估出血表型 14。簡言之，在2 mm(輕度損傷)下對8至10週齡小鼠之遠端尾部進行橫切，且出血為靜脈，或在4 mm(重度損傷)下，且出血為動脈及靜脈。出血量化為30或10分鐘後之失血量。在嚴重損傷模型中，一些 F8 -/-Pros1 +/- 小鼠經靜脈內接受劑量為2.1 mg/kg之兔抗人類PS-IgG (Dako)或兔同型IgG (R&D Systems)，2分鐘後進行尾部橫切。
急性關節血腫模型在0及72小時用數位測徑器(547-301，Kanagawa)量測關節直徑。在72小時處，將小鼠處死，將膝部分離，固定於4% PFA中，脫鈣且包埋於石蠟中。如所描述評估關節內出血分數(IBS)。
活體內 PS 抑制10週齡小鼠經由皮下滲透微型泵(模型2001，Alzet)以1 mg/kg/天之劑量連續輸注兔抗人類PS-IgG (Dako Basel，Switzerland)或兔同型IgG (R&D Systems)。
替代地，用轉染劑(Invivofectamine 3.0, Invitrogen, Life Technologies)對10週齡之小鼠進行單次劑量的小鼠特異性siRNA (s72206，Life Technologies)或對照siRNA (4459405，活體內陰性對照#1 Ambion，Life Technologies)處理，劑量為1 mg/kg，遵循製造商說明書。在PS抑制之後2.5天應用急性關節血腫模型。
統計方法值表達為平均值±標準誤。用於非連接型基因基因座之卡方(Chi-square)用於評估孟德爾對偶基因分離。使用卡本-麥爾方法標繪TF誘導之靜脈血栓栓塞模型中之存活率資料。使用對數秩檢驗在統計學上比較曲線(Prism 6.0d；GraphPad)。藉由t測試、單向及雙向ANOVA測試用GraphPad Prism 6.0d分析其他資料。小於0.05之 P 值視為統計顯著的。
鼠類血漿之製備用戊巴比妥(pentobarbital) (40 mg/kg)麻醉6至9週齡之小鼠，且將全血自下腔靜脈抽取至3.13%檸檬酸鹽(1體積抗凝血劑/9體積血液)中。用預溫熱至26℃之離心機使血液在1031 g下離心10分鐘以獲得富含血小板血漿(PRP)。或者，在室溫(RT)下在2400 g下將血液離心10分鐘，以獲得缺少血小板血漿(PPP)。為獲得血小板游離血漿(PFP)，在10000 g下額外進行離心10分鐘。
血小板計數及凝血參數之量測值用自動化細胞計數器(Procyte Dx血液學分析器，IDEXX)進行血小板計數。在自動化Sysmex CA-7000凝血分析儀(Sysmex Digitana)上量測纖維蛋白原、FVIII及FIX活性。凝血酶原時間(PT)及活化部分凝血活酶時間(APTT)在凝血計上量測( MC4plus，Merlin Medical)。
藉由 ELISA 量測鼠類 PS 抗原及 TAT 複合體96孔盤(Maxisorb，Thermo)之孔塗佈有50 µL/孔之10 µg/mL的兔多株抗人類PS (DAKO Cytomation)，且在4℃下培育隔夜。在用TBS緩衝劑(0.05 M參(羥甲基)胺基甲烷，0.15 M NaCl，pH 7.5，0.05% Tween 20)洗滌3次之後，培養盤用TBS-BSA 2%阻斷。將稀釋血漿樣品(稀釋範圍：1:300-1:600)添加至孔中且在室溫下培育2小時。在洗滌3次之後，添加50 µL之1 µg/mL生物素化之雞多株抗鼠類蛋白質S且在室溫下培育2小時。藉由添加鏈黴抗生物素蛋白-HRP結合之辣根過氧化酶(Thermo)擴增信號且培育盤1小時。洗滌培養盤3次，且添加100 µL TMB受質(KPL)。藉由添加100 µL HCl (1 M)停止反應。在450 nm下量測吸光度。藉由使用自14名健康小鼠(8隻雄性及6隻雌性，7至12週齡)獲得之混合正常血漿之連續稀釋來設定標準曲線。結果以相對於混合正常血漿之百分比表示。
使用可商購的ELISA (Enzygnost TAT micro，Siemens)，根據製造商說明書，一式兩份地量測各血漿樣品之TAT含量。
小鼠組織處理及切片、免疫組織化學及顯微鏡法未經預處理之組織切片(4 µm)對於不溶性纖維蛋白、PS或TFPI進行蘇木精/伊紅或梅森三色染色法或免疫染色染色。使用以下抗體：纖維蛋白(mAb純系102-10) 1，最終濃度15.6 µg/mL，在室溫下培育30分鐘，二級抗體兔抗人類，(ab7155 Abcam，Cambridge，UK)，1:200稀釋，在室溫下培育30分鐘；PS (MAB 4976，R&D，稀釋1:50)，在室溫下培育30分鐘，二級抗體兔抗大鼠，(ab7155 Abcam)，1:200稀釋，在室溫下培育30分鐘；TFPI (PAHTFPI-S，Hematological Technologies)，最終濃度18.6 µg /mL，在室溫下培育30分鐘，二次抗體兔抗綿羊IgG (ab7106，Abcam)，1:200稀釋，在室溫下培育30分鐘。根據製造商說明書，用免疫染色儀BOND RX(Leica Biosystems，Muttenz，Switzerland)進行所有染色。使用具有20× (NA 0.8)、40× (NA 0.95)空氣物鏡之3D HISTECH Panoramic 250 Flash II掃描整個載片。影像處理使用全景視圖軟體進行。
向具有 F8 之完全基因損失之小鼠活體內投與 FVIII用氯胺酮(80 mg/kg)及賽拉嗪(xylazine) (16 mg/kg)麻醉6至9週齡之小鼠。吾人靜脈內投與0.3 U/kg重組FVIII (Advate®，Baxalta)，使其在1小時內達到100%之FVIII含量(正常劑量)，或靜脈內投與過量之重組FVIII(2 U/kg)，使其在1小時內達到＞200%。在引入頸靜脈導管(Mouse JVC 2Fr PU 10 cm, Instech)前1小時及後1小時注射正常劑量或過量劑量，且接著在放置中心線後4小時、8小時及16小時注射。第一次注射後24小時處死小鼠。抽取血液且收集器官。如實例中所描述量測FVIII、纖維蛋白原及凝血酶-凝血酶複合體(TAT)。分離肺，固定於4%多聚甲醛(PFA)中且包埋於石蠟中。
腸系膜動脈中之 FeCl 3 損傷血栓模型根據具有輕微修改之參考文獻 2，使用活體內顯微鏡法進行腸系膜動脈中之血栓模型。藉由腹膜內注射氯胺酮(80 mg/kg)及賽拉嗪(16 mg/kg)之混合物來麻醉小鼠。藉由注射100 µL若丹明6G (1.0 mM)，在活體內直接標記血小板。在選擇研究領域之後，用10% FeCl 3飽和之濾紙(1 M Whatman紙的直徑為1 mm的紙片)局部施用1分鐘，產生血管壁損傷。用配備有親和校正水浸光學件(Zeiss，Germany)之FITC濾光器組，在螢光顯微鏡(IV-500，Micron工具，San Diego，CA)下即時監測血栓形成。明亮的螢光標記之血小板及白血球允許經由視訊觸發之頻閃落射式照明(Helmuth，El Monte，CA)觀測到1355 μm×965 μm的視場。使用具有NA0.3.之10倍的Zeiss Plan-Neofluar物鏡。使用一個定製的低滯後矽強化目標攝像機(Dage MTI, Michigan city, IN)，一個時基發生器及一個Hi-8 VCR(EV，C-100，Sony，Japan)將所有場景均記錄在錄像帶上。量測血管壁閉塞之時間，如藉由血細胞流動停止所測定。
纖維母細胞樣滑膜細胞 (FLS) 分離、培養及流式細胞術自8至10週齡小鼠分離鼠類FLS且根據 3進行培養。在三次傳代之後，採集細胞之相差圖像，且將細胞與FITC結合之大鼠抗小鼠CD11b抗體(M1/70，Pharmingen，BD Biosciences)、PE結合之大鼠抗小鼠CD90.2抗體(30-H12，Pharmingen，BD Biosciences)，FITC結合之大鼠抗小鼠CD106抗體(429 MVCAM.A，Pharmingen，BD Biosciences)，PE結合之倉鼠抗小鼠CD54抗體(3E2，Pharmingen，BD Biosciences)，以及螢光染料結合之同型對照抗體，在4℃下在黑暗中30分鐘。在最終洗滌及離心步驟之後，在LSR II流式細胞儀(BD Biosciences)及FACS Diva 7.0軟體(BD Biosciences)上分析所有經培育細胞。自健康個體及OA患者之人類FLS購自Asterand，Bioscience，且根據製造說明書進行培養。
西方墨點法在還原條件下，藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(12%梯度SDS-PAGE，Bio-Rad)在人類及小鼠樣品中偵測PS及TFPI。將蛋白質轉移至硝化纖維素膜(Bio-Rad)，且接著使用以下進行可視化：2 ug/mL單株MAB-4976 (R&D system)用於鼠PS，1 µg/mL多株AF2975 (R&D system)用於鼠TFPI。重組鼠類PS 4(30 ng)、重組人類TFPI全長(由T.Hamuro，Kaketsuken，Japan提供)、經洗滌之血小板之裂解物、來自 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠之PFP及來自 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠之胎盤裂解物用作PS、TFPIα對照。在血清游離培養基(OptiMem)中培育24小時之後收集來自匯合鼠類及人類FLS條件培養基之樣品，且使用Amicon過濾器裝置(Millipore，10 kDa截止值)濃縮40次。對於TFPI西方墨點法，在37℃下用五種蛋白質去糖苷酶(PNGase F、O-糖苷酶、神經氨酸苷酶、β1-4半乳糖苷酶、β-N-乙醯基胺基葡萄糖苷酶、去糖基化套組，V4931，Promega)之混合物處理樣品12小時，隨後負載於凝膠上。藉由使用辣根過氧化酶結合之二級抗體(Dako)及Supersignal West Dura長效化學螢光受質(Pierce)完成最終偵測，用Fuji LAS 3000IR CCD相機監測。
人類膝滑膜之免疫組織化學在佛羅倫薩大學實驗及臨床醫學系解剖學及組織學科的檔案中收集了十二名HA患者及四名HB患者之滑膜組織石蠟包埋樣本，此等患者因嚴重膝關節病而接受了關節造形術。七名HA患者接受按需治療，且五名接受二級防治治療。所有四名HB患者接收按需治療。七名骨關節炎(OA)患者之滑膜樣品被用作對照。為進行免疫組織化學分析，將滑膜組織切片(5 µm厚)去掉石蠟，復水，在檸檬酸鈉緩衝劑(10mM，pH6.0)中煮沸10分鐘以進行抗原檢索，且隨後在室溫下用於甲醇中之3% H 2O 2處理15分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶活性。隨後用PBS清洗切片，且根據製造商的方案在室溫下用Ultra V塊(UltraVision大體積偵測系統抗多價，HRP，目錄號TP-125-HL，LabVision)培育10分鐘。在阻斷非特異性位點結合後，將玻片與在PBS中稀釋之兔多株抗人類蛋白質S/PROS1抗體(1:50稀釋，目錄號NBP1-87218，Novus Biologicals)或綿羊多株抗人類組織因子路徑抑制劑(TFPI)抗體(1:500稀釋，目錄號PAHTFPI-S，Haematologic Technologies)在4℃下培育隔夜。對於PS免疫染色，根據製造商的方案，組織切片與生物素化之二級抗體一起培育，然後使用鏈黴抗生物素蛋白過氧化酶(UltraVision大體積偵測系統抗多價，HRP；LabVision)。對於TFPI免疫染色，替代地將組織切片與HRP結合之驢抗綿羊IgG (1:1000稀釋；目錄號ab97125；Abcam)一起培育30分鐘。使用3-胺基-9-乙基咔唑(AEC套組，目錄號TA-125-SA；LabVision)作為色素原發展出免疫反應性。滑膜切片最後用Mayer的蘇木精(Bio-Optica)進行對比染色，洗滌，裝在水性安裝培養基中且在Leica DM4000 B顯微鏡(Leica Microsystems)下觀察。不暴露於初級抗體的切片或與同型匹配及濃度匹配之非免疫IgG (Sigma-Aldrich)一起培育的切片包括為針對抗體特異性之陰性對照。光學顯微鏡用Leica DFC310 FX 140萬像素數碼彩色相機拍攝，其配備有Leica軟體應用程式套組LAS V3.8 (Leica Microsystems)。
纖維蛋白凝塊超微結構調查在37℃下藉由添加約5 nM TF (Dade Innovin，Siemens)自PFP製備纖維蛋白凝塊。其隨後固定於2%戊二醛中，經脫水，經乾燥且用金鈀濺鍍塗佈以用於使用掃描電子顯微鏡觀測。使用STEPanizer軟體進行網狀結構密度及纖維分支之半量化評估(www.stepanizer.com)。
鼠類樣品中之校準自動化血栓造影分析使用校準之自動化血栓圖(CAT)方法測定PFP及PRP中之凝血酶生成。
如下在PRP(150 G/L)中評估TFPI依賴性PS活性。簡言之，將10 µL小鼠PRP (150 G/L)與10 µL PRP試劑(Diagnostica Stago)及30 µL緩衝劑A(25 mm Hepes，175 mm NaCl，pH 7.4，5 mg/mL BSA)混合。凝血酶生成係在37℃下用10 μL的螢光受質/CaCl 2混合物啟動的。最終濃度如下：16.6%小鼠血漿、1 pM hrTF、4 µM磷脂、16 mM CaCl 2及0.42 mM螢光受質。
在小鼠PFP及PRP中在基於CAT之APC抗性測試中評估APC依賴性PS活性。先前使用40 µM Ca 2+離子載體(A23187)在37℃下活化PRP (150 G/L) 5分鐘。最終濃度如下：16.6%小鼠血漿、22 µM A23187、1 pM hrTF、4 µM磷脂、2 nM(對於PFP)或8 nM(對於PRP)野生型重組小鼠APC (wt-rmAPC)或突變重組小鼠APC (rmAPC L38D)、16 mM CaCl 2及0.42 mM螢光受質。
對於PFP上之TF滴定，使用以下試劑：PPP試劑及MP試劑(Diagnostica Stago)。
使用配備有施配器之Fluoroscan Ascent®螢光計量測螢光。在390 nm(激發濾光器)及460 nm(發射濾光器)之波長下偵測螢光強度。一個專用軟體程式，Thrombinoscope®版本3.0.0.29 (Thrombinoscope bv)能夠對校正器(Thrombinoscope bv)進行凝血酶活性計算，且顯示凝血酶活性與時間。在37℃下一式兩份地進行所有經歷，且量測通常持續60分鐘。
人類樣品中之 CAT 分析自患者獲得書面知情同意書。藉由靜脈穿刺在3.2%檸檬酸鈉(vol/vol)中抽取大量血液且在2000 g下離心5分鐘。隨後將缺少血小板血漿(PPP)在10000 g下離心10分鐘以獲得PFP。將PFP等分，速凍，且在-80℃下儲存直至使用。對於PRP，在180 g×10分鐘下離心血液。所有個體均知情同意參與。根據具有輕微修改之參考文獻 13，對人類PFP和PRP中之凝血酶生成進行評估。簡言之，68 μL PFP或PRP (150 G/L)與12 μL多株兔抗人類PS-IgG抗體(0.42 mg/mL，Dako)或抗TFPI單株抗體(0.66 μm，MW1848，Sanquin)或緩衝劑A一起在37℃下培育15分鐘。凝血用20 μL之PPP低及PPP 5 pm試劑(Diagnostica Stago)之7:1混合物起始以針對PFP樣品或用PRP試劑(Diagnostica Stago)起始以針對PRP樣品。在添加20 μL之CaCl 2及螢光受質(I-1140；Bachem)之後，凝血酶生成在Fluoroskan Ascent讀取器(Thermo Labsystems)中進行。
實例 6-17 之論述由於PS係凝血酶生成之關鍵調節因子，因此吾人認為靶向PS可構成血友病之潛在療法。
小鼠中之廣泛研究提供概念資料證明，支持PS及TFPI作為在血友病小鼠中導致出血及嚴重關節損傷的主要角色。靶向 Pros1或抑制PS具有改善小鼠中之血友病的能力，如藉由尾部出血分析中之出血表型的活體內改良及針對關節血腫之完全保護所判定(圖8A-C及圖9)。由於關節顯示TF表現極弱，而滑膜細胞產生大量TFPIα及PS(圖10)，因此關節內外源性路徑的活性大大降低，容易使血友病關節出血。此外，凝血調節蛋白(TM)及內皮蛋白C受體(EPCR)均由FLS表現，表明在AH之情形下，TM-凝血酶複合體活化EPCR結合之PC，以生成強有效的抗凝血劑APC。重要地，TFPIα之表現藉由凝血酶上調(圖10F)。因此，通常會導致明顯局部炎症及關節症狀，可持續數天至數週的AH亦會促進多種抗凝血劑(即APC、TFPIα及其相互輔因子PS)的局部生成及分泌，此可幫助解釋血友病關節損傷之病理生理學。
使用來自血友病患者之臨床樣品的觀測結果與自鼠類研究習得的情況一致。在人類中，在具有或不具有抑制劑下阻斷來自HA之患者之血漿中的PS使ETP標準化(圖12D-G)。與患有HA之患者相比，患有HB之患者展示TFPI及PS之較少關節內表現，與目前HB患者比HA患者出血少的知識一致(圖11)。此外，HA接收防治之患者展示的TFPI及PS滑膜表現少於僅在出血之情形下接收FVIII濃縮物之患者，亦即，所謂「按需療法」(圖11A)。最後，人類FLS分泌TFPIα及PS兩者，正如在小鼠中觀測到的，從而加強了鼠類血友病資料向人類的推斷。
在此報告中之廣泛發現使吾人提出，以靶向PS有可能轉化為對血友病有用的療法。人類及類關節中之PS係導致關節血腫的一個新病理生理學因素，且構成一個有吸引力的潛在治療目標，尤其因為其在關節內對APC及TFPIα均具有雙重輔因子活性。在PS存在下，關節血腫增加滑膜中之TFPIα表現。小鼠中靶向PS保護其免於關節血腫。因此，吾人提出由FLS產生之TFPIα及其輔因子PS以及TM-EPCR-PC路徑包含了一種對關節血腫具有重要病理性影響的強有力的關節內抗凝血系統。吾人在血友病小鼠身上成功使用的鼠類PS緘黙RNA(圖9H-I和圖10A)係吾人將為血友病患者開發的一種治療方法。與目前因子替代療法相比，緘黙RNA之優勢在於其較長的半衰期減少注射之頻率，且可能採用皮下投與的途徑。
實例 19- 藉由 PROS1 siRNA 結合物抑制原代肝細胞中之 PROS1 目標基因表現實例展示藉由EU149至EU160之受體介導的攝取在原代肝細胞中之PROS1 mRNA含量的劑量依賴性降低。
原代小鼠肝細胞以每孔25000個細胞之密度接種於96孔盤中。連接後，將其以100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM及0.01 nM與PROS1 siRNA結合物一起在細胞培養基中培育，如圖17所指示，或將其與100 nM非靶向對照結合物(EU110)一起培育。第二天，裂解細胞用於RNA提取，且藉由Taqman qRT-PCR測定PROS1及肌動蛋白mRNA含量。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。EU149至153之結果顯示於圖17A中，EU154至EU160之結果顯示於圖17B中。
實例 20- 藉由受體介導之攝取抑制原代人類肝細胞中之人類 PROS1 基因表現實例展示EU149至EU152、EU156、EU159及EU160藉由受體介導之攝取在原代人類肝細胞中對人類PROS1 mRNA含量之劑量依賴性降低。
原代人類肝細胞(Life Technologies)以盤培養基中每孔35000個細胞之密度接種於96孔盤中，且隨後如圖18中所示以100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM或0.01 nM之濃度與PROS1 siRNA結合物EU149至EU152、EU156、EU159及EU160培育，或其與100 nM非靶向對照結合物(EU110)一起培育。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。EU149至153之結果顯示於圖18A中，EU156、EU159及EU160之結果顯示於圖18B中。
實例 21- 藉由單次投與 PROS1 siRNA 結合物活體內抑制 PROS1 基因表現實例展示用EU140至EU145、EU150至EU152或藉由EU159處理之小鼠肝臟中PROS1 mRNA含量之劑量依賴性降低。
9至12週齡C57BL/6小鼠藉由皮下注射用每公斤體重1或5 mg結合物(EU140至EU145，EU150至EU152或EU159)或用媒劑PBS處理，如圖19A及19B中所指示。處理之後2週，自所有小鼠收集肝臟樣品且速凍。自肝臟樣品中提取RNA，且藉由Taqman qRT-PCR測定PROS1及肌動蛋白mRNA含量。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與源自經媒劑處理組(PBS)之肝臟樣品之平均值相關，且設定為1倍目標基因表現。散點圖中之每個條表示具有95%信賴區間之5至7隻動物之中值。
此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。在用PROS1 siRNA結合物處理之後小鼠肝臟中之PROS1 mRNA的劑量依賴性降低顯示於圖19A及19B中。
實例 22- 藉由單次投與 PROS1 siRNA 結合物抑制血友病小鼠中 PROS1 基因表現實例展示用EU152處理之A型血友病小鼠模型之肝臟中之PROS1 mRNA含量及血清中之PROS1含量的降低。
9至12週齡因子8基因敲除小鼠(F8 -/-小鼠；Prince等人, Blood (2018) 131 (12): 1360-1371)藉由皮下注射用每公斤體重3 mg EU152或用媒劑PBS處理，如圖20A及20B中所指示。在注射之後8天，自所有小鼠收集肝臟樣品且速凍。在相同時間點由所收集之血液製備血漿。自肝臟樣品中提取RNA，且藉由Taqman qRT-PCR測定PROS1及肌動蛋白mRNA含量。針對PROS1 mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與源自經媒劑處理組(PBS)之肝臟樣品之平均值相關，且設定為1倍目標基因表現。藉由特定ELISA方法量測血漿樣品中之PROS1含量(Prince等人, 2018)。
散點圖中之每個條(A)或線(B)表示平均值，其中標準偏差為8至9隻動物。
此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。在用PROS1 siRNA結合物處理之後小鼠肝臟中之PROS1 mRNA的降低顯示於圖20A中，血漿中之PROS1含量的降低描繪於圖20B中。
實例 23- 用 PROS1 siRNA 結合物處理減少急性關節血腫模型中之膝部腫脹實例展示F8 -/-小鼠之膝損傷之前及之後72小時的膝直徑之間的差異。用EU152防治性治療之小鼠群組中之關節腫脹減少。
9至12週齡因子8基因敲除小鼠(F8 -/-小鼠；Prince等人, 2018)藉由皮下注射用每公斤體重3 mg、5 mg或10 mg EU152或用媒劑PBS處理，如圖21中所指示。注射後5天，量測膝直徑且在鎮痛劑覆蓋下執行膝損傷。(Prince等人, 2018)。72小時後，再次量測膝直徑以評估腫脹。
散點圖表示7至10隻動物之中值。統計：用鄧恩氏多重比較(Dunn's multiple comparison)測試相對於對照組(PBS)進行克拉斯卡-瓦立斯檢驗(Kruskal-Wallis test)。
此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。F8 -/-小鼠之膝損傷之前及之後72小時的膝直徑差異展示於圖21中。與用媒劑(PBS)處理之血友病動物相比，在損傷之前用EU152處理之血友病小鼠顯示膝腫脹之劑量依賴性降低。
實例 24- 用 PROS1 siRNA 結合物處理提高 A 型血友病 動物模型之止血概況實例展示自野生型小鼠、A型血友病小鼠模型(F8 -/-)或自用PROS1 siRNA (F8 - / -EU152)處理之A型血友病小鼠模型收集之全血樣品的凝血時間、凝血形成時間及α角。凝血形成藉由旋轉凝血彈性量測法(Rotational Thromboelastometry，ROTEM)評估，其為一種止血的黏彈性分析，可實時量測全球凝血的形成(Gorlinger等人, Ann Card Anaesth (2016), 19:516-20)。相比於野生型小鼠中之此等止血參數之評估，在血友病小鼠中，凝血時間及凝血形成時間減少，而α角增加。利用PROS1 siRNA處理血友病小鼠減少凝血時間、凝血形成時間且增加α角。
9至12週齡因子8基因敲除小鼠(F8 -/-小鼠；Prince等人, 2018)藉由皮下注射用每公斤體重5 mg EU152或用媒劑PBS處理，如圖22A-C中所指示。在處理之後7天，收集末端血液樣品且凝血時間、凝血形成時間及α角藉由ROTEM測定。為了比較，收集來自野生型小鼠之全血樣品且藉由相同方法分析。
散點圖表示6至11隻動物之中值。統計：韋爾契方差分析(Welch's Anova)與鄧恩特氏T3事後檢驗(Dunnett's T3 post-hoc test)之對對數轉換值。
此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。自野生型小鼠(WT)、用PBS (F8 -/-PBS)處理之A型血友病小鼠及用PROS1 siRNA EU152 (F8 -/-EU152)處理之A型血友病小鼠收集之血液樣品之血液凝結時間展示於圖22A中。圖22B及圖22C中分別描繪自相同處理組收集之血液樣品的凝血形成時間及α角。
實例 25- 藉由轉染蛋白質 S siRNA 使人類 Hep3B 細胞中人類蛋白質 S mRNA 含量 降低活體外測試展示藉由將蛋白質S siRNA分子(EU199至EU222)轉染使人類Hep3B細胞中之蛋白質S mRNA含量的劑量依賴型降低。
Hep3B細胞以每孔12000個細胞之密度接種於96孔盤中。第二天，用0.1 nM、0.01 nM或0.001 nM蛋白質S siRNA或非靶向對照siRNA (EU198)及1 µg/ml AtuFECT轉染細胞。24小時後，裂解細胞用於RNA提取，且藉由Taqman qRT-PCR測定蛋白質S及肌動蛋白mRNA含量。針對蛋白質S mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關的值列舉於表A中。+/-SD表示三個生物複本之標準差。此研究中所用之siRNA雙螺旋體列於表2中且進一步描述於表4中。 表A
siRNA 雙螺旋體 siRNA 濃度 ProS mRNA 含量 相對於肌動蛋白mRNA 含量 標準化且相對於ut 設定為1 +/- SD
Ut    1.00 0.07
EU199 0.1nM 0.34 0.05
0.01nM 0.29 0.06
0.001nM 0.40 0.11
EU200 0.1nM 0.28 0.09
0.01nM 0.38 0.04
0.001nM 0.53 0.15
EU201 0.1nM 0.46 0.13
0.01nM 0.66 0.21
0.001nM 0.89 0.11
EU202 0.1nM 0.46 0.10
0.01nM 0.46 0.14
0.001nM 0.62 0.09
EU203 0.1nM 0.20 0.01
0.01nM 0.29 0.03
0.001nM 0.54 0.06
EU204 0.1nM 0.40 0.07
0.01nM 0.67 0.10
0.001nM 0.71 0.12
EU205 0.1nM 0.44 0.03
0.01nM 0.58 0.11
0.001nM 0.57 0.03
EU206 0.1nM 0.26 0.04
0.01nM 0.35 0.13
0.001nM 0.44 0.11
EU207 0.1nM 0.27 0.12
0.01nM 0.45 0.05
0.001nM 0.79 0.17
EU208 0.1nM 0.41 0.02
0.01nM 0.35 0.05
0.001nM 0.41 0.01
EU209 0.1nM 0.40 0.08
0.01nM 0.44 0.02
0.001nM 0.74 0.11
EU210 0.1nM 0.76 0.27
0.01nM 1.28 0.20
0.001nM 1.32 0.00
EU211 0.1nM 0.34 0.05
0.01nM 0.33 0.04
0.001nM 0.39 0.02
EU212 0.1nM 0.33 0.09
0.01nM 0.43 0.09
0.001nM 0.63 0.19
EU213 0.1nM 0.31 0.11
0.01nM 0.65 0.13
0.001nM 1.27 0.29
EU214 0.1nM 0.51 0.13
0.01nM 0.70 0.15
0.001nM 0.98 0.08
EU215 0.1nM 0.23 0.05
0.01nM 0.34 0.03
0.001nM 0.58 0.15
EU216 0.1nM 0.29 0.05
0.01nM 0.68 0.08
0.001nM 1.14 0.19
EU217 0.1nM 0.52 0.11
0.01nM 0.74 0.13
0.001nM 0.85 0.20
EU218 0.1nM 0.29 0.08
0.01nM 0.35 0.01
0.001nM 0.45 0.07
EU219 0.1nM 0.20 0.08
0.01nM 0.51 0.11
0.001nM 1.09 0.27
EU220 0.1nM 0.34 0.13
0.01nM 0.36 0.09
0.001nM 0.48 0.07
EU221 0.1nM 0.19 0.01
0.01nM 0.15 0.02
0.001nM 0.28 0.05
EU222 0.1nM 0.57 0.05
0.01nM 1.19 0.03
0.001nM 1.57 0.02
EU198 0.1nM 0.81 0.03
0.1nM 0.81 0.15
0.1nM 0.85 0.02
實例 26- 藉由以 1 nM 與 0.00001 nM 之間的濃度轉染蛋白質 S siRNA 使人類細胞中之蛋白質 S mRNA 含量的劑量依賴性降低活體外測試展示藉由將蛋白質S siRNA分子轉染使人類Hep3B細胞中之蛋白質S mRNA含量的劑量依賴型降低。
Hep3B細胞以每孔12000個細胞之密度接種於96孔盤中。第二天，用1 nM、0.01 nM、0.001 nM、0.0001 nM或0.00001 nM蛋白質S siRNA或1 nM非靶向對照siRNA (EU0198)及1 µg/ml AtuFECT轉染細胞。24小時後，裂解細胞用於RNA提取，且藉由Taqman qRT-PCR測定蛋白質S及肌動蛋白mRNA含量。針對蛋白質S mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA雙螺旋體列於表2中且進一步描述於表4中。結果顯示於圖23中。
實例 27- 藉由受體介導之攝取抑制原代人類肝細胞中之人類蛋白質 S 基因表現活體外測試展示在原代人類肝細胞中，藉由結合siRNA EU161至EU171，人類蛋白質S mRNA含量的劑量依賴型降低。
原代人類肝細胞(Life Technologies)以盤培養基中每孔35000個細胞之密度接種於96孔盤中，且隨後如圖24中所示以100 nM、10 nM、1 nM及0.1 nM之濃度與蛋白質S siRNA結合物EU161至EU171培育。針對蛋白質S mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。EU161至171之結果展示於圖24中。
實例 28- 藉由受體介導之攝取抑制原代獼猴肝細胞中之蛋白質 S 基因表現活體外測試展示在原代獼猴肝細胞中，藉由結合siRNA EU161至EU171，獼猴蛋白質S mRNA含量的劑量依賴型降低。
原代獼猴肝細胞(Life Technologies)以盤培養基中每孔45000個細胞之密度接種於96孔盤中，且隨後如圖25中所示以100 nM、10 nM、1 nM及0.1 nM之濃度與蛋白質S siRNA結合物EU161至EU171培育。針對蛋白質S mRNA獲得的值相對於管家基因肌動蛋白所產生的值標準化，且與設定為1倍目標基因表現之未經處理之樣品(ut)的平均值有關。各條表示三個生物複本之平均值+/-標準差。此研究中所用之siRNA結合物列於表2中且進一步描述於表4中。EU161至171之結果展示於圖25中。
實例 29- 活體內抑制蛋白質 S 表現活體內測試展示在藉由皮下注射用EU161單次處理之後第15天至第17天及第43天至第45天所收集之食蟹獼猴之肝臟組織中的蛋白質S mRNA含量降低。
將專門繁殖的食蟹獼猴(24至48個月齡，雄性及雌性)分配至不同處理組(各組2隻雄性及2隻雌性)。在第1天，一組藉由皮下注射用3 mg/kg體重EU161之單次劑量處理，而對照動物藉由皮下注射接受媒劑0.9%鹽水。在第15天至第17天及第23天至第43天之間，藉由剖腹術自各動物收集肝臟樣品且速凍。自肝臟樣品中提取RNA，且藉由Taqman qRT-PCR測定蛋白質S及ApoB mRNA含量。針對蛋白質S mRNA獲得的值相對於管家基因Apo B所產生的值標準化，且與來自設定為1倍目標基因表現之相同時間點的0.9%鹽水處理群組(鹽水)之平均值相關。各條表示4隻動物+/-標準差之平均值。
用於此研究之siRNA結合物進一步描述於表2及4中。在兩個不同時間點用EU161處理後肝臟中之蛋白質S mRNA之減少展示於圖26中。
實例 30- 活體內總蛋白質 S 血清含量之降低活體內測試展示在藉由皮下注射用EU161單次處理之後，食蟹獼猴之血清中之總蛋白質S減少。
將專門繁殖的食蟹獼猴(24至48個月齡，雄性及雌性)分配至不同處理組(各組2隻雄性及2隻雌性)。一組藉由皮下注射用3 mg/kg體重EU161之單次劑量處理。對照動物藉由皮下注射接受媒劑0.9%鹽水。在處理前第2週開始，以每週時間間隔收集靜脈血液樣品用於血清製劑。使用來自Abcam (ab190808)之人類蛋白質S ELISA套組來量測此等樣品中之總蛋白質S含量血清含量。一式三份地量測食蟹獼猴血清樣品，且自人類蛋白質S標準曲線內插食蟹獼猴蛋白質S血清含量。結果表示為具有95%信賴區間之中值。
用於此研究之siRNA結合物進一步描述於表2及4中。在用EU161處理之後總蛋白質S血清含量之減少示於圖27中。
實例 31- 活體內游離蛋白質 S 血漿含量之降低活體內測試展示在藉由皮下注射用EU161單次處理之後，食蟹獼猴之血漿中之游離蛋白質S減少。
將專門繁殖的食蟹獼猴(24至48個月齡，雄性及雌性)分配至不同處理組(各組2隻雄性及2隻雌性)。一組藉由皮下注射用3 mg/kg體重EU161之單次劑量處理。對照動物藉由皮下注射接受媒劑0.9%鹽水。在給藥之前2週及此後約每兩週，將靜脈血液樣品收集至含有檸檬酸鈉作為抗凝血劑之真空管中以製備缺少血小板血漿。使用Atellica Coag 360儀器(Siemens)藉由Innovance® Free PS Ag試劑量測來自食蟹獼猴之血漿樣品中的游離蛋白質S含量。食蟹獼猴研究樣品中之游離蛋白質S含量繪製為人類參考標準集之百分比，設定為100。結果表示為具有95%信賴區間之中值。
用於此研究之siRNA結合物描述於表2及4中。在用EU161處理之後游離蛋白質S血漿含量之減少展示於圖28中。
概述表 概述雙螺旋體表 - 表 2
雙螺旋體 單股 雙螺旋體 單股 雙螺旋體 單股
EU012 EU012A EU142    EU142A EU170 EU170A
EU012B EU142B    EU170B
EU060 EU060A EU143    EU143A EU171 EU171A
EU060B EU143B    EU171B
EU061 EU061A EU144    EU144A EU198 EU198A
EU061B EU144B    EU198B
EU062 EU062A EU145    EU145A EU199 EU199A
EU062B EU145B    EU199B
EU063 EU063A EU146    EU146A EU200 EU200A
EU063B EU146B    EU200B
EU064 EU064A EU147    EU147A EU201 EU201A
EU064B EU147B    EU201B
EU065 EU065A EU148    EU148A EU202 EU202A
EU065A EU148B    EU202B
EU066 EU066A EU149 EU149A EU203 EU203A
   EU066B    EU140B    EU203B
EU067 EU067A EU150 EU150A EU204 EU204A
   EU067B    EU141B    EU204B
EU068 EU068A EU151 EU151A EU205 EU205A
   EU068B    EU142B    EU205B
EU069 EU069A EU152 EU152A EU206 EU206A
   EU069B    EU143B    EU206B
EU070 EU070A EU153 EU153A EU207 EU207A
   EU070B    EU145B    EU207B
EU071 EU071A EU154 EU151A EU208 EU208A
   EU071B    EU154B    EU208B
EU072 EU072A EU155 EU155A EU209 EU209A
   EU072B    EU155B    EU209B
EU073 EU073A EU156 EU155A EU210 EU210A
   EU073B    EU156B    EU210B
EU074 EU074A EU157 EU152A EU211 EU211A
   EU074B    EU157B    EU211B
EU075 EU075A EU158 EU158A EU212 EU212A
   EU075B    EU158B    EU212B
EU076 EU076A EU159 EU158A EU213 EU213A
   EU076B    EU159B    EU213B
EU077 EU077A EU160 EU158A EU214 EU214A
   EU077B    EU160B    EU214B
EU078 EU078A EU161 EU161A EU215 EU215A
   EU078B    EU161B    EU215B
EU079 EU079A EU162 EU162A EU216 EU216A
   EU079B    EU162B    EU216B
EU080 EU080A EU163 EU163A EU217 EU217A
   EU080B    EU163B    EU217B
EU081 EU081A EU164 EU164A EU218 EU218A
   EU081B    EU164B    EU218B
EU082 EU082A EU165 EU165A EU219 EU219A
   EU082B    EU165B    EU219B
EU083 EU083A EU166 EU166A EU220 EU220A
   EU083B    EU166B    EU220B
EU110 EU109A EU167 EU167A EU221 EU221A
   EU110B    EU167B    EU221B
EU140 EU140A EU168 EU168A EU222 EU222A
   EU140B    EU168B    EU222B
EU141 EU141A EU169 EU169A      
   EU141B    EU169B      
概述縮寫表 - 表 3
縮寫 含義
mA、mU、mC、mG 2'-O-甲基RNA核苷酸
2'-OMe 2'-O-甲基修飾
fA、fU、fC、fG 2'去氧-2'-F RNA核苷酸
2'-F 2'-氟修飾
(ps) 硫代磷酸酯
(ps2) 二硫代磷酸酯
(vp) 乙烯基-(E)-膦酸酯
(vp)-mU
Figure 02_image091
(vp)-mU-磷
Figure 02_image093
ivA、ivC、ivU、ivG 反向RNA (3'-3')核苷酸
ST23
Figure 02_image095
ST23-磷
Figure 02_image097
ST43 (或C6XLT)
Figure 02_image099
ST43-磷(或C6XLT-磷)
Figure 02_image101
Ser (GN) (當在鏈末端時，O---中之一者為OH)
Figure 02_image103
[ST23 (ps)]3 ST43 (ps)
Figure 02_image105
[ST23]3 ST43
Figure 02_image107
[ST23(ps)]3 ST41(ps)
Figure 02_image109
[ST23]3 ST41
Figure 02_image111
如以上縮寫表中所示之縮寫可用於本文中。縮寫之清單可能並非詳盡的且可在整個此文件中發現其他縮寫及其含義。
概述序列表 - 表 4
SEQ ID NO: 名稱 (A= 第 1 股； B= 第 2 股 ) 序列 5'-3' 未修飾之序列 5 ' -3 ' 對應體
1 EU060Aun UGCUUUCAUUGCUUUGUCC UGCUUUCAUUGCUUUGUCC
2 EU060Bun GGACAAAGCAAUGAAAGCA GGACAAAGCAAUGAAAGCA
3 EU061Aun UUCCACAGACACCAUAUUC UUCCACAGACACCAUAUUC
4 EU061Bun GAAUAUGGUGUCUGUGGAA GAAUAUGGUGUCUGUGGAA
5 EU062Aun UAUUCCAGAAGCUCCUUGC UAUUCCAGAAGCUCCUUGC
6 EU062Bun GCAAGGAGCUUCUGGAAUA GCAAGGAGCUUCUGGAAUA
7 EU063Aun UUUGUGUCAAGGUUCAAGG UUUGUGUCAAGGUUCAAGG
8 EU063Bun CCUUGAACCUUGACACAAA CCUUGAACCUUGACACAAA
9 EU064Aun AUUGACACAGCUUCUUAGG AUUGACACAGCUUCUUAGG
10 EU064Bun CCUAAGAAGCUGUGUCAAU CCUAAGAAGCUGUGUCAAU
11 EU065Aun UUCUAAUUCUUCCACAGAC UUCUAAUUCUUCCACAGAC
12 EU065Aun GUCUGUGGAAGAAUUAGAA GUCUGUGGAAGAAUUAGAA
13 EU066Aun AUAUCCAUCUUCAUUGCAU AUAUCCAUCUUCAUUGCAU
14 EU066Bun AUGCAAUGAAGAUGGAUAU AUGCAAUGAAGAUGGAUAU
15 EU067Aun UUUUCAAAGACCUCCCUGG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
16 EU067Bun CCAGGGAGGUCUUUGAAAA CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
17 EU068Aun AGUUUGAAUCCUUUCUUCC AGUUUGAAUCCUUUCUUCC
18 EU068Bun GGAAGAAAGGAUUCAAACU GGAAGAAAGGAUUCAAACU
19 EU069Aun UUUCAUUGCUUUGUCCAAG UUUCAUUGCUUUGUCCAAG
20 EU069Bun CUUGGACAAAGCAAUGAAA CUUGGACAAAGCAAUGAAA
21 EU070Aun CAUUGCUUUGUCCAAGACG CAUUGCUUUGUCCAAGACG
22 EU070Bun CGUCUUGGACAAAGCAAUG CGUCUUGGACAAAGCAAUG
23 EU071Aun UAUGUUUAGAAAUGGCUUC UAUGUUUAGAAAUGGCUUC
24 EU071Bun GAAGCCAUUUCUAAACAUA GAAGCCAUUUCUAAACAUA
25 EU072Aun UGUUCUUGCACACAGCUGU UGUUCUUGCACACAGCUGU
26 EU072Bun ACAGCUGUGUGCAAGAACA ACAGCUGUGUGCAAGAACA
27 EU073Aun AUCUUGGGCAAGUUUGAAU AUCUUGGGCAAGUUUGAAU
28 EU073Bun AUUCAAACUUGCCCAAGAU AUUCAAACUUGCCCAAGAU
29 EU074Aun AACUCUUCUGAUCUUGGGC AACUCUUCUGAUCUUGGGC
30 EU074Bun GCCCAAGAUCAGAAGAGUU GCCCAAGAUCAGAAGAGUU
31 EU075Aun UUCUUCCACAGACACCAUA UUCUUCCACAGACACCAUA
32 EU075Bun UAUGGUGUCUGUGGAAGAA UAUGGUGUCUGUGGAAGAA
33 EU076Aun GUCAGGAUAAGCAUUAGUU GUCAGGAUAAGCAUUAGUU
34 EU076Bun AACUAAUGCUUAUCCUGAC AACUAAUGCUUAUCCUGAC
35 EU077Aun ACAGACACCAUAUUCCAUA ACAGACACCAUAUUCCAUA
36 EU077Bun UAUGGAAUAUGGUGUCUGU UAUGGAAUAUGGUGUCUGU
37 EU078Aun UUUGGAUAAAAAUAAUCCG UUUGGAUAAAAAUAAUCCG
38 EU078Bun CGGAUUAUUUUUAUCCAAA CGGAUUAUUUUUAUCCAAA
39 EU079Aun CUCACAACUCUUCUGAUCU CUCACAACUCUUCUGAUCU
40 EU079Bun AGAUCAGAAGAGUUGUGAG AGAUCAGAAGAGUUGUGAG
41 EU080Aun GCAUUCACUGGUGUGGCAC GCAUUCACUGGUGUGGCAC
42 EU080Bun GUGCCACACCAGUGAAUGC GUGCCACACCAGUGAAUGC
43 EU081Aun UAGGUCAGGAUAAGCAUUA UAGGUCAGGAUAAGCAUUA
44 EU081Bun UAAUGCUUAUCCUGACCUA UAAUGCUUAUCCUGACCUA
45 EU082Aun AGCACACAUGUUCUCAGAG AGCACACAUGUUCUCAGAG
46 EU082Bun CUCUGAGAACAUGUGUGCU CUCUGAGAACAUGUGUGCU
47 EU083Aun UCCACAGACACCAUAUUCC UCCACAGACACCAUAUUCC
48 EU083Bun GGAAUAUGGUGUCUGUGGA GGAAUAUGGUGUCUGUGGA
49 EU146Aun UCAUUCACUGGUGUGGCAC UCAUUCACUGGUGUGGCAC
50 EU012A mU fC mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA fC mG UCGAAGUAUUCCGCGUACG
51 EU012B fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC mG fA CGUACGCGGAAUACUUCGA
52 EU060A mU fG mC fU mU fU mC fA mU fU mG fC mU fU mU fG mU fC mC UGCUUUCAUUGCUUUGUCC
53 EU060B mG mG mA mC mA mA fA fG fC mA mA mU mG mA mA mA mG mC mA GGACAAAGCAAUGAAAGCA
54 EU061A mU fU mC fC mA fC mA fG mA fC mA fC mC fA mU fA mU fU mC UUCCACAGACACCAUAUUC
55 EU061B mG mA mA mU mA mU fG fG fU mG mU mC mU mG mU mG mG mA mA GAAUAUGGUGUCUGUGGAA
56 EU062A mU fA mU fU mC fC mA fG mA fA mG fC mU fC mC fU mU fG mC UAUUCCAGAAGCUCCUUGC
57 EU062B mG mC mA mA mG mG fA fG fC mU mU mC mU mG mG mA mA mU mA GCAAGGAGCUUCUGGAAUA
58 EU063A mU fU mU fG mU fG mU fC mA fA mG fG mU fU mC fA mA fG mG UUUGUGUCAAGGUUCAAGG
59 EU063B mC mC mU mU mG mA fA fC fC mU mU mG mA mC mA mC mA mA mA CCUUGAACCUUGACACAAA
60 EU064A mA fU mU fG mA fC mA fC mA fG mC fU mU fC mU fU mA fG mG AUUGACACAGCUUCUUAGG
61 EU064B mC mC mU mA mA mG fA fA fG mC mU mG mU mG mU mC mA mA mU CCUAAGAAGCUGUGUCAAU
62 EU065A mU fU mC fU mA fA mU fU mC fU mU fC mC fA mC fA mG fA mC UUCUAAUUCUUCCACAGAC
63 EU065A mG mU mC mU mG mU fG fG fA mA mG mA mA mU mU mA mG mA mA GUCUGUGGAAGAAUUAGAA
64 EU066A mA fU mA fU mC fC mA fU mC fU mU fC mA fU mU fG mC fA mU AUAUCCAUCUUCAUUGCAU
65 EU066B mA mU mG mC mA mA fU fG fA mA mG mA mU mG mG mA mU mA mU AUGCAAUGAAGAUGGAUAU
66 EU067A mU fU mU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU fC mC fC mU fG mG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
67 EU067B mC mC mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA mA mA CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
68 EU068A mA fG mU fU mU fG mA fA mU fC mC fU mU fU mC fU mU fC mC AGUUUGAAUCCUUUCUUCC
69 EU068B mG mG mA mA mG mA fA fA fG mG mA mU mU mC mA mA mA mC mU GGAAGAAAGGAUUCAAACU
70 EU069A mU fU mU fC mA fU mU fG mC fU mU fU mG fU mC fC mA fA mG UUUCAUUGCUUUGUCCAAG
71 EU069B mC mU mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA mA mA CUUGGACAAAGCAAUGAAA
72 EU070A mC fA mU fU mG fC mU fU mU fG mU fC mC fA mA fG mA fC mG CAUUGCUUUGUCCAAGACG
73 EU070B mC mG mU mC mU mU fG fG fA mC mA mA mA mG mC mA mA mU mG CGUCUUGGACAAAGCAAUG
74 EU071A mU fA mU fG mU fU mU fA mG fA mA fA mU fG mG fC mU fU mC UAUGUUUAGAAAUGGCUUC
75 EU071B mG mA mA mG mC mC fA fU fU mU mC mU mA mA mA mC mA mU mA GAAGCCAUUUCUAAACAUA
76 EU072A mU fG mU fU mC fU mU fG mC fA mC fA mC fA mG fC mU fG mU UGUUCUUGCACACAGCUGU
77 EU072B mA mC mA mG mC mU fG fU fG mU mG mC mA mA mG mA mA mC mA ACAGCUGUGUGCAAGAACA
78 EU073A mA fU mC fU mU fG mG fG mC fA mA fG mU fU mU fG mA fA mU AUCUUGGGCAAGUUUGAAU
79 EU073B mA mU mU mC mA mA fA fC fU mU mG mC mC mC mA mA mG mA mU AUUCAAACUUGCCCAAGAU
80 EU074A mA fA mC fU mC fU mU fC mU fG mA fU mC fU mU fG mG fG mC AACUCUUCUGAUCUUGGGC
81 EU074B mG mC mC mC mA mA fG fA fU mC mA mG mA mA mG mA mG mU mU GCCCAAGAUCAGAAGAGUU
82 EU075A mU fU mC fU mU fC mC fA mC fA mG fA mC fA mC fC mA fU mA UUCUUCCACAGACACCAUA
83 EU075B mU mA mU mG mG mU fG fU fC mU mG mU mG mG mA mA mG mA mA UAUGGUGUCUGUGGAAGAA
84 EU076A mG fU mC fA mG fG mA fU mA fA mG fC mA fU mU fA mG fU mU GUCAGGAUAAGCAUUAGUU
85 EU076B mA mA mC mU mA mA fU fG fC mU mU mA mU mC mC mU mG mA mC AACUAAUGCUUAUCCUGAC
86 EU077A mA fC mA fG mA fC mA fC mC fA mU fA mU fU mC fC mA fU mA ACAGACACCAUAUUCCAUA
87 EU077B mU mA mU mG mG mA fA fU fA mU mG mG mU mG mU mC mU mG mU UAUGGAAUAUGGUGUCUGU
88 EU078A mU fU mU fG mG fA mU fA mA fA mA fA mU fA mA fU mC fC mG UUUGGAUAAAAAUAAUCCG
89 EU078B mC mG mG mA mU mU fA fU fU mU mU mU mA mU mC mC mA mA mA CGGAUUAUUUUUAUCCAAA
90 EU079A mC fU mC fA mC fA mA fC mU fC mU fU mC fU mG fA mU fC mU CUCACAACUCUUCUGAUCU
91 EU079B mA mG mA mU mC mA fG fA fA mG mA mG mU mU mG mU mG mA mG AGAUCAGAAGAGUUGUGAG
92 EU080A mG fC mA fU mU fC mA fC mU fG mG fU mG fU mG fG mC fA mC GCAUUCACUGGUGUGGCAC
93 EU080B mG mU mG mC mC mA fC fA fC mC mA mG mU mG mA mA mU mG mC GUGCCACACCAGUGAAUGC
94 EU081A mU fA mG fG mU fC mA fG mG fA mU fA mA fG mC fA mU fU mA UAGGUCAGGAUAAGCAUUA
95 EU081B mU mA mA mU mG mC fU fU fA mU mC mC mU mG mA mC mC mU mA UAAUGCUUAUCCUGACCUA
96 EU082A mA fG mC fA mC fA mC fA mU fG mU fU mC fU mC fA mG fA mG AGCACACAUGUUCUCAGAG
97 EU082B mC mU mC mU mG mA fG fA fA mC mA mU mG mU mG mU mG mC mU CUCUGAGAACAUGUGUGCU
98 EU083A mU fC mC fA mC fA mG fA mC fA mC fC mA fU mA fU mU fC mC UCCACAGACACCAUAUUCC
99 EU083B mG mG mA mA mU mA fU fG fG mU mG mU mC mU mG mU mG mG mA GGAAUAUGGUGUCUGUGGA
100 EU109A mU (ps) fC (ps) mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA (ps) fC (ps) mG UCGAAGUAUUCCGCGUACG
101 EU110B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA CGUACGCGGAAUACUUCGA
102 EU140A mU (ps) fU (ps) mC fC mA fC mA fG mA fC mA fC mC fA mU fA mU (ps) fU (ps) mC UUCCACAGACACCAUAUUC
103 EU140B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mG mA mA mU mA mU fG fG fU mG mU mC mU mG mU mG mG (ps) mA (ps) mA GAAUAUGGUGUCUGUGGAA
104 EU141A mU (ps) fU (ps) mC fU mA fA mU fU mC fU mU fC mC fA mC fA mG (ps) fA (ps) mC UUCUAAUUCUUCCACAGAC
105 EU141B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mG mU mC mU mG mU fG fG fA mA mG mA mA mU mU mA mG (ps) mA (ps) mA GUCUGUGGAAGAAUUAGAA
106 EU142A mU (ps) fU (ps) mU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU fC mC fC mU (ps) fG (ps) mG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
107 EU142B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mC mC mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA (ps) mA (ps) mA CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
108 EU143A mU (ps)fU (ps) mU fC mA fU mU fG mC fU mU fU mG fU mC fC mA (ps) fA (ps) mG UUUCAUUGCUUUGUCCAAG
109 EU143B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mC mU mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA (ps) mA (ps) mA CUUGGACAAAGCAAUGAAA
110 EU144A mU (ps) fG (ps) mU fU mC fU mU fG mC fA mC fA mC fA mG fC mU (ps) fG (ps) mU UGUUCUUGCACACAGCUGU
111 EU144B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mA mC mA mG mC mU fG fU fG mU mG mC mA mA mG mA mA (ps) mC (ps) mA ACAGCUGUGUGCAAGAACA
112 EU145A mA (ps) fC (ps) mA fG mA fC mA fC mC fA mU fA mU fU mC fC mA (ps) fU (ps) mA ACAGACACCAUAUUCCAUA
113 EU145B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mU mA mU mG mG mA fA fU fA mU mG mG mU mG mU mC mU (ps) mG (ps) mU UAUGGAAUAUGGUGUCUGU
114 EU146A mU (ps) fC (ps) mA fU mU fC mA fC mU fG mG fU mG fU mG fG mC (ps) fA (ps) mC UCAUUCACUGGUGUGGCAC
115 EU146B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mG mU mG mC mC mA fC fA fC mC mA mG mU mG mA mA mU (ps) mG (ps) mC GUGCCACACCAGUGAAUGC
116 EU147A mA (ps) fG (ps) mC fA mC fA mC fA mU fG mU fU mC fU mC fA mG (ps) fA (ps) mG AGCACACAUGUUCUCAGAG
117 EU147B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mC mU mC mU mG mA fG fA fA mC mA mU mG mU mG mU mG (ps) mC (ps) mU CUCUGAGAACAUGUGUGCU
118 EU148A mU (ps) fC (ps) mC fA mC fA mG fA mC fA mC fC mA fU mA fU mU (ps) fC (ps) mC UCCACAGACACCAUAUUCC
119 EU148B [ST23 (ps)]3 ST43 (ps) mG mG mA mA mU mA fU fG fG mU mG mU mC mU mG mU mG (ps) mG (ps) mA GGAAUAUGGUGUCUGUGGA
120 EU149A (vp) mU fU mC fC mA fC mA fG mA fC mA fC mC fA mU fA mU (ps) fU (ps) mC UUCCACAGACACCAUAUUC
121 EU150A (vp) mU fU mC fU mA fA mU fU mC fU mU fC mC fA mC fA mG (ps) fA (ps) mC UUCUAAUUCUUCCACAGAC
122 EU151A (vp) mU fU mU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU fC mC fC mU (ps) fG (ps) mG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
123 EU152A (vp) mU fU mU fC mA fU mU fG mC fU mU fU mG fU mC fC mA (ps) fA (ps) mG UUUCAUUGCUUUGUCCAAG
124 EU153A (vp) mU fC mA fG mA fC mA fC mC fA mU fA mU fU mC fC mA (ps) fU (ps) mA UCAGACACCAUAUUCCAUA
125 EU154B Ser (GN) (ps) mC (ps) mC (ps) mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA (ps) mA (ps) mA (ps) Ser (GN) CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
126 EU155A (vp) mU fUmU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU fC mC fC mU fG (ps2) mG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
127 EU155B Ser (GN) mC (ps2) mC mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA mA (ps2) mA Ser (GN) CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
128 EU155A (vp) mU fU mU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU fC mC fC mU fG (ps2) mG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
129 EU156B [ST23]3 ST43 mC (ps2) mC mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA mA (ps2) mA CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
130 EU157B Ser (GN) (ps) mC (ps) mU (ps) mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA (ps) mA (ps) mA (ps) Ser (GN) CUUGGACAAAGCAAUGAAA
131 EU158A (vp) mU fU mU fC mA fU mU fG mC fU mU fU mG fU mC fC mA fA (ps2) mG UUUCAUUGCUUUGUCCAAG
132 EU158B Ser (GN) mC (ps2) mU mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA mA (ps2) mA Ser (GN) CUUGGACAAAGCAAUGAAA
133 EU159B [ST23]3 ST43 mC (ps2) mU mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA mA (ps2) mA CUUGGACAAAGCAAUGAAA
134 EU160B [ST23]3 ST43 mC (ps2) mU mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA mA irA CUUGGACAAAGCAAUGAAA
135 無配位體之EU142B mC mC mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA (ps) mA (ps) mA CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
136 無配位體之EU143B mC mU mU mG mG mA fC fA fA mA mG mC mA mA mU mG mA (ps) mA (ps) mA CUUGGACAAAGCAAUGAAA
137 EU198A mU fC mG fA mA fG mU fA mU fU mC fC mG fC mG fU mA fC mG UCGAAGUAUUCCGCGUACG
138 EU198B fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC mG fA CGUACGCGGAAUACUUCGA
139 EU199A mU (ps) fU (ps) mU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU fC mC fC mU (ps) fG (ps) mG UUUUCAAAGACCUCCCUGG
140 EU199B mC (ps) mC (ps) mA mG mG mG fA fG fG mU mC mU mU mU mG mA mA (ps) mA (ps) mA CCAGGGAGGUCUUUGAAAA
141 EU200A mU (ps) fU (ps) mA fU mA fA mA fA mG fG mC fA mU fU mC fA mC (ps) fU (ps) mG UUAUAAAAGGCAUUCACUG
142 EU200B mC (ps) mA (ps) mG mU mG mA fA fU fG mC mC mU mU mU mU mA mU (ps) mA (ps) mA CAGUGAAUGCCUUUUAUAA
143 EU201A mU (ps) fU (ps) mU fU mG fU mA fA mU fG mU fA mG fA mC fC mU (ps) fU (ps) mG UUUUGUAAUGUAGACCUUG
144 EU201B mC (ps) mA (ps) mA mG mG mU fC fU fA mC mA mU mU mA mC mA mA (ps) mA (ps) mA CAAGGUCUACAUUACAAAA
145 EU202A mA (ps) fU (ps) mU fA mA fU mA fU mU fC mA fC mU fU mC fC mA (ps) fU (ps) mG AUUAAUAUUCACUUCCAUG
146 EU202B mC (ps) mA (ps) mU mG mG mA fA fG fU mG mA mA mU mA mU mU mA (ps) mA (ps) mU CAUGGAAGUGAAUAUUAAU
147 EU203A mU (ps) fU (ps) mG fU mA fC mU fU mC fA mA fC mA fA mU fC mA (ps) fC (ps) mA UUGUACUUCAACAAUCACA
148 EU203B mU (ps) mG (ps) mU mG mA mU fU fG fU mU mG mA mA mG mU mA mC (ps) mA (ps) mA UGUGAUUGUUGAAGUACAA
149 EU204A mC (ps) fU (ps) mU fU mA fU mU fG mC fA mC fA mG fU mU fC mU (ps) fU (ps) mC CUUUAUUGCACAGUUCUUC
150 EU204B mG (ps) mA (ps) mA mG mA mA fC fU fG mU mG mC mA mA mU mA mA (ps) mA (ps) mG GAAGAACUGUGCAAUAAAG
151 EU205A mU (ps) fA (ps) mU fU mU fG mA fG mG fG mA fU mC fU mU fU mG (ps) fC (ps) mA UAUUUGAGGGAUCUUUGCA
152 EU205B mU (ps) mG (ps) mC mA mA mA fG fA fU mC mC mC mU mC mA mA mA (ps) mU (ps) mA UGCAAAGAUCCCUCAAAUA
153 EU206A mA (ps) fU (ps) mA fU mU fC mA fC mU fU mC fC mA fU mG fC mA (ps) fG (ps) mC AUAUUCACUUCCAUGCAGC
154 EU206B mG (ps) mC (ps) mU mG mC mA fU fG fG mA mA mG mU mG mA mA mU (ps) mA (ps) mU GCUGCAUGGAAGUGAAUAU
155 EU207A mA (ps) fG (ps) mU fA mU fA mA fU mU fA mC fA mC fA mC fA mA (ps) fG (ps) mG AGUAUAAUUACACACAAGG
156 EU207B mC (ps) mC (ps) mU mU mG mU fG fU fG mU mA mA mU mU mA mU mA (ps) mC (ps) mU CCUUGUGUGUAAUUAUACU
157 EU208A mU (ps) fA (ps) mA fU mA fG mA fC mC fA mC fC mA fU mC fU mC (ps) fU (ps) mU UAAUAGACCACCAUCUCUU
158 EU208B mA (ps) mA (ps) mG mA mG mA fU fG fG mU mG mG mU mC mU mA mU (ps) mU (ps) mA AAGAGAUGGUGGUCUAUUA
159 EU209A mA (ps) fA (ps) mA fU mG fC mA fU mC fA mC fA mG fU mA fC mC (ps) fA (ps) mG AAAUGCAUCACAGUACCAG
160 EU209B mC (ps) mU (ps) mG mG mU mA fC fU fG mU mG mA mU mG mC mA mU (ps) mU (ps) mU CUGGUACUGUGAUGCAUUU
161 EU210A mG (ps) fU (ps) mC fA mU fU mU fU mC fA mA fA mG fA mC fC mU (ps) fC (ps) mC GUCAUUUUCAAAGACCUCC
162 EU210B mG (ps) mG (ps) mA mG mG mU fC fU fU mU mG mA mA mA mA mU mG (ps) mA (ps) mC GGAGGUCUUUGAAAAUGAC
163 EU211A mU (ps) fU (ps) mG fA mA fA mA fG mA fG mC fG mA fA mG fA mC (ps) fA (ps) mA UUGAAAAGAGCGAAGACAA
164 EU211B mU (ps) mU (ps) mG mU mC mU fU fC fG mC mU mC mU mU mU mU mC (ps) mA (ps) mA UUGUCUUCGCUCUUUUCAA
165 EU212A mU (ps) fG (ps) mU fA mU fG mU fU mC fA mU fU mC fU mU fA mA (ps) fG (ps) mC UGUAUGUUCAUUCUUAAGC
166 EU212B mG (ps) mC (ps) mU mU mA mA fG fA fA mU mG mA mA mC mA mU mA (ps) mC (ps) mA GCUUAAGAAUGAACAUACA
167 EU213A mU (ps) fU (ps) mA fA mU fG mA fG mU fU mC fA mC fU mU fU mC (ps) fC (ps) mA UUAAUGAGUUCACUUUCCA
168 EU213B mU (ps) mG (ps) mG mA mA mA fG fU fG mA mA mC mU mC mA mU mU (ps) mA (ps) mA UGGAAAGUGAACUCAUUAA
169 EU214A mU (ps) fU (ps) mU fU mA fC mA fG mG fA mA fC mA fG mU fG mG (ps) fU (ps) mA UUUUACAGGAACAGUGGUA
170 EU214B mU (ps) mA (ps) mC mC mA mC fU fG fU mU mC mC mU mG mU mA mA (ps) mA (ps) mA UACCACUGUUCCUGUAAAA
171 EU215A mC (ps) fA (ps) mU fU mC fU mU fA mA fG mC fU mG fA mA fC mU (ps) fU (ps) mC CAUUCUUAAGCUGAACUUC
172 EU215B mG (ps) mA (ps) mA mG mU mU fC fA fG mC mU mU mA mA mG mA mA (ps) mU (ps) mG GAAGUUCAGCUUAAGAAUG
173 EU216A mC (ps) fA (ps) mU fU mA fU mU fA mU fA mA fU mC fU mA fU mG (ps) fU (ps) mG CAUUAUUAUAAUCUAUGUG
174 EU216B mC (ps) mA (ps) mC mA mU mA fG fA fU mU mA mU mA mA mU mA mA (ps) mU (ps) mG CACAUAGAUUAUAAUAAUG
175 EU217A mC (ps) fG (ps) mA fA mU fA mU fU mC fA mA fG mG fU mC fA mC (ps) fA (ps) mU CGAAUAUUCAAGGUCACAU
176 EU217B mA (ps) mU (ps) mG mU mG mA fC fC fU mU mG mA mA mU mA mU mU (ps) mC (ps) mG AUGUGACCUUGAAUAUUCG
177 EU218A mC (ps) fA (ps) mC fU mG fA mA fU mG fG mA fA mC fA mU fC mU (ps) fG (ps) mG CACUGAAUGGAACAUCUGG
178 EU218B mC (ps) mC (ps) mA mG mA mU fG fU fU mC mC mA mU mU mC mA mG (ps) mU (ps) mG CCAGAUGUUCCAUUCAGUG
179 EU219A mU (ps) fC (ps) mU fG mG fA mA fU mG fG mC fA mU fU mG fA mC (ps) fA (ps) mC UCUGGAAUGGCAUUGACAC
180 EU219B mG (ps) mU (ps) mG mU mC mA fA fU fG mC mC mA mU mU mC mC mA (ps) mG (ps) mA GUGUCAAUGCCAUUCCAGA
181 EU220A mA (ps) fA (ps) mG fU mU fU mG fC mC fU mC fU mG fA mG fA mC (ps) fG (ps) mG AAGUUUGCCUCUGAGACGG
182 EU220B mC (ps) mC (ps) mG mU mC mU fC fA fG mA mG mG mC mA mA mA mC (ps) mU (ps) mU CCGUCUCAGAGGCAAACUU
183 EU221A mU (ps) fU (ps) mC fG mU fA mU fA mC fA mU fC mC fA mU fC mU (ps) fA (ps) mG UUCGUAUACAUCCAUCUAG
184 EU221B mC (ps) mU (ps) mA mG mA mU fG fG fA mU mG mU mA mU mA mC mG (ps) mA (ps) mA CUAGAUGGAUGUAUACGAA
185 EU222A mC (ps) fU (ps) mU fA mG fG mG fC mC fU mG fU mA fU mC fC mG (ps) fA (ps) mU CUUAGGGCCUGUAUCCGAU
186 EU222B mA (ps) mU (ps) mC mG mG mA fU fA fC mA mG mG mC mC mC mU mA (ps) mA (ps) mG AUCGGAUACAGGCCCUAAG
187 EU200Aun UUAUAAAAGGCAUUCACUG UUAUAAAAGGCAUUCACUG
188 EU200Bun CAGUGAAUGCCUUUUAUAA CAGUGAAUGCCUUUUAUAA
189 EU201Aun UUUUGUAAUGUAGACCUUG UUUUGUAAUGUAGACCUUG
190 EU201Bun CAAGGUCUACAUUACAAAA CAAGGUCUACAUUACAAAA
191 EU202Aun AUUAAUAUUCACUUCCAUG AUUAAUAUUCACUUCCAUG
192 EU202Bun CAUGGAAGUGAAUAUUAAU CAUGGAAGUGAAUAUUAAU
193 EU203Aun UUGUACUUCAACAAUCACA UUGUACUUCAACAAUCACA
194 EU203Bun UGUGAUUGUUGAAGUACAA UGUGAUUGUUGAAGUACAA
195 EU204Aun CUUUAUUGCACAGUUCUUC CUUUAUUGCACAGUUCUUC
196 EU204Bun GAAGAACUGUGCAAUAAAG GAAGAACUGUGCAAUAAAG
197 EU205Aun UAUUUGAGGGAUCUUUGCA UAUUUGAGGGAUCUUUGCA
198 EU205Bun UGCAAAGAUCCCUCAAAUA UGCAAAGAUCCCUCAAAUA
199 EU206Aun AUAUUCACUUCCAUGCAGC AUAUUCACUUCCAUGCAGC
200 EU206Bun GCUGCAUGGAAGUGAAUAU GCUGCAUGGAAGUGAAUAU
201 EU207Aun AGUAUAAUUACACACAAGG AGUAUAAUUACACACAAGG
202 EU207Bun CCUUGUGUGUAAUUAUACU CCUUGUGUGUAAUUAUACU
203 EU208Aun UAAUAGACCACCAUCUCUU UAAUAGACCACCAUCUCUU
204 EU208Bun AAGAGAUGGUGGUCUAUUA AAGAGAUGGUGGUCUAUUA
205 EU209Aun AAAUGCAUCACAGUACCAG AAAUGCAUCACAGUACCAG
206 EU209Bun CUGGUACUGUGAUGCAUUU CUGGUACUGUGAUGCAUUU
207 EU210Aun GUCAUUUUCAAAGACCUCC GUCAUUUUCAAAGACCUCC
208 EU210Bun GGAGGUCUUUGAAAAUGAC GGAGGUCUUUGAAAAUGAC
209 EU211Aun UUGAAAAGAGCGAAGACAA UUGAAAAGAGCGAAGACAA
210 EU211Bun UUGUCUUCGCUCUUUUCAA UUGUCUUCGCUCUUUUCAA
211 EU212Aun UGUAUGUUCAUUCUUAAGC UGUAUGUUCAUUCUUAAGC
212 EU212Bun GCUUAAGAAUGAACAUACA GCUUAAGAAUGAACAUACA
213 EU213Aun UUAAUGAGUUCACUUUCCA UUAAUGAGUUCACUUUCCA
214 EU213Bun UGGAAAGUGAACUCAUUAA UGGAAAGUGAACUCAUUAA
215 EU214Aun UUUUACAGGAACAGUGGUA UUUUACAGGAACAGUGGUA
216 EU214Bun UACCACUGUUCCUGUAAAA UACCACUGUUCCUGUAAAA
217 EU215Aun CAUUCUUAAGCUGAACUUC CAUUCUUAAGCUGAACUUC
218 EU215Bun GAAGUUCAGCUUAAGAAUG GAAGUUCAGCUUAAGAAUG
219 EU216Aun CAUUAUUAUAAUCUAUGUG CAUUAUUAUAAUCUAUGUG
220 EU216Bun CACAUAGAUUAUAAUAAUG CACAUAGAUUAUAAUAAUG
221 EU217Aun CGAAUAUUCAAGGUCACAU CGAAUAUUCAAGGUCACAU
222 EU217Bun AUGUGACCUUGAAUAUUCG AUGUGACCUUGAAUAUUCG
223 EU218Aun CACUGAAUGGAACAUCUGG CACUGAAUGGAACAUCUGG
224 EU218Bun CCAGAUGUUCCAUUCAGUG CCAGAUGUUCCAUUCAGUG
225 EU219Aun UCUGGAAUGGCAUUGACAC UCUGGAAUGGCAUUGACAC
226 EU219Bun GUGUCAAUGCCAUUCCAGA GUGUCAAUGCCAUUCCAGA
227 EU220Aun AAGUUUGCCUCUGAGACGG AAGUUUGCCUCUGAGACGG
228 EU220Bun CCGUCUCAGAGGCAAACUU CCGUCUCAGAGGCAAACUU
229 EU221Aun UUCGUAUACAUCCAUCUAG UUCGUAUACAUCCAUCUAG
230 EU221Bun CUAGAUGGAUGUAUACGAA CUAGAUGGAUGUAUACGAA
231 EU222Aun CUUAGGGCCUGUAUCCGAU CUUAGGGCCUGUAUCCGAU
232 EU222Bun AUCGGAUACAGGCCCUAAG AUCGGAUACAGGCCCUAAG
233 EU161A mA (ps) fU (ps) mA fU mU fC mA fC mU fU mC fC mA fU mG fC mA (ps) fG (ps) mC AUAUUCACUUCCAUGCAGC
234 EU161B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mG mC mU mG mC mA fU fG fG mA mA mG mU mG mA mA mU (ps) mA (ps) mU GCUGCAUGGAAGUGAAUAU
235 EU162A (vp)-mU fU mA fU mU fC mA fC mU fU mC fC mA fU mG fC mA (ps) fG (ps) mC UUAUUCACUUCCAUGCAGC
236 EU162B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mG mC mU mG mC mA fU fG fG mA mA mG mU mG mA mA mU (ps) mA (ps) mU GCUGCAUGGAAGUGAAUAU
237 EU163A mU (ps) fA (ps) mA fU mA fG mA fC mC fA mC fC mA fU mC fU mC (ps) fU (ps) mU UAAUAGACCACCAUCUCUU
238 EU163B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mA mA mG mA mG mA fU fG fG mU mG mG mU mC mU mA mU (ps) mU (ps) mA AAGAGAUGGUGGUCUAUUA
239 EU164A (vp)-mU fA mA fU mA fG mA fC mC fA mC fC mA fU mC fU mC (ps) fU (ps) mU UAAUAGACCACCAUCUCUU
240 EU164B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mA mA mG mA mG mA fU fG fG mU mG mG mU mC mU mA mU (ps) mU (ps) mA AAGAGAUGGUGGUCUAUUA
241 EU165A (vp)-mU fA mA fU mA fG mA fC mC fA mC fC mA fU mC fU mC fU (ps2) mU UAAUAGACCACCAUCUCUU
242 EU165B [ST23]3 ST41 mA (ps2) mA mG mA mG mA fU fG fG mU mG mG mU mC mU mA mU mU (ps2) mA AAGAGAUGGUGGUCUAUUA
243 EU166A mU (ps) fU (ps) mG fA mA fA mA fG mA fG mC fG mA fA mG fA mC (ps) fA (ps) mA UUGAAAAGAGCGAAGACAA
244 EU166B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mU mU mG mU mC mU fU fC fG mC mU mC mU mU mU mU mC (ps) mA (ps) mA UUGUCUUCGCUCUUUUCAA
245 EU167A (vp)-mU fU mG fA mA fA mA fG mA fG mC fG mA fA mG fA mC (ps) fA (ps) mA UUGAAAAGAGCGAAGACAA
246 EU167B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mU mU mG mU mC mU fU fC fG mC mU mC mU mU mU mU mC (ps) mA (ps) mA UUGUCUUCGCUCUUUUCAA
247 EU168A (vp)-mU fU mG fA mA fA mA fG mA fG mC fG mA fA mG fA mC fA (ps2) mA UUGAAAAGAGCGAAGACAA
248 EU168B [ST23]3 ST41 mU (ps2) mU mG mU mC mU fU fC fG mC mU mC mU mU mU mU mC mA (ps2) mA UUGUCUUCGCUCUUUUCAA
249 EU169A mU (ps) fU (ps) mC fG mU fA mU fA mC fA mU fC mC fA mU fC mU (ps) fA (ps) mG UUCGUAUACAUCCAUCUAG
250 EU169B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mC mU mA mG mA mU fG fG fA mU mG mU mA mU mA mC mG (ps) mA (ps) mA CUAGAUGGAUGUAUACGAA
251 EU170A (vp)-mU fU mC fG mU fA mU fA mC fA mU fC mC fA mU fC mU (ps) fA (ps) mG UUCGUAUACAUCCAUCUAG
252 EU170B [ST23 (ps)]3 ST41 (ps) mC mU mA mG mA mU fG fG fA mU mG mU mA mU mA mC mG (ps) mA (ps) mA CUAGAUGGAUGUAUACGAA
253 EU171A (vp)-mU fU mC fG mU fA mU fA mC fA mU fC mC fA mU fC mU fA (ps2) mG UUCGUAUACAUCCAUCUAG
254 EU171B [ST23]3 ST41 mC (ps2) mU mA mG mA mU fG fG fA mU mG mU mA mU mA mC mG mA (ps2) mA CUAGAUGGAUGUAUACGAA
255 EU162Aun UUAUUCACUUCCAUGCAGC UUAUUCACUUCCAUGCAGC
256 無配位體之EU161B mG mC mU mG mC mA fU fG fG mA mA mG mU mG mA mA mU (ps) mA (ps) mU GCUGCAUGGAAGUGAAUAU
257 無配位體之EU163B mA mA mG mA mG mA fU fG fG mU mG mG mU mC mU mA mU (ps) mU (ps) mA AAGAGAUGGUGGUCUAUUA
258 無配位體之EU170B mC mU mA mG mA mU fG fG fA mU mG mU mA mU mA mC mG (ps) mA (ps) mA CUAGAUGGAUGUAUACGAA
圖 1展示DMT-絲胺醇(GalNAc)-CEP及CPG之可能合成途徑。
圖 2展示藉由轉染不同PROS1 siRNA對人類細胞中之PROS1 mRNA含量的抑制。
圖 3展示藉由PROS1 siRNA轉染降低人類細胞中之PROS1 mRNA含量的劑量反應測試。
圖 4展示藉由PROS1 siRNA結合物之受體介導的攝取抑制原代鼠類肝細胞中之PROS1目標基因表現。
圖 5展示藉由PROS1 siRNA結合物之受體介導的攝取抑制原代人類肝細胞中之PROS1目標基因表現。
圖 6展示X-酶活性之損失拯救 Pros1 -/- 小鼠。A，血友病病狀中凝血酶生成之示意性模型。主要凝血複合體中之一者為內源性X酶(X-酶)複合體。X-酶包含活化FIX (FIXa)作為蛋白酶、活化FVIII (FVIIIa)作為輔因子，及因子X (FX)作為受質。儘管組織因子(TF)在損傷部位處之產生或曝露為經由外來途徑起始凝血中之主要事件，但內源性路徑X-酶由於活體內有限量之可用活性TF及TFPI之存在而為重要的，當與活化FX (FXa)錯合時，會抑制TF/活化因子VII (FVIIa)複合體(圖6A)。因此，持續凝血酶生成視FIX及FVIII兩者之活化而定(圖6A)。此方法因為FVIII藉由FXa及凝血酶以及FIX兩者藉由FVIIa及活化因子XI (FXIa)活化而放大，後一因子先前藉由凝血酶活化。因此，FVIII及FIX活化之漸進性增加隨著FXa及凝血酶形成於B而發生，其為藉由靶向 Pros1增強嚴重A型血友病及B型血友病中凝血酶生成之實驗方法。C-D，患有及不患有 Pros1缺乏症的血友病成年小鼠種DIC血液學參數的小鼠模型驗證及評估： F8 -/-Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/- 及 F8 -/-Pros1 -/- (C)、及 F9 -/-Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/- 及 F9 -/-Pros1 -/- 成人小鼠(D) (n=5/組)中之PS (蛋白質S；抗原)、FVIII (凝血活性)或FIX (凝血活性)血漿含量；A型血友病組(c)中之血小板( n=7/組)、纖維蛋白原( n=8/組)、PT ( n=6/組)及TAT ( n=6/組)；及B型血友病組(D)中之血小板( n=5/組)、纖維蛋白原( n=4/組)、PT ( n=4/組)及TAT ( n=4/組)。E-F，在單次靜脈內注射2 U/g重組FVIII (Advate®)輸注後24小時之 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠肺部之宏觀影像(E)及肺切片中纖維蛋白凝塊的相應顯微鏡評估(F)。G，在 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 中之重組FVIII (Advate®)投與：5次靜脈內注射0.3 U/g Advate®後24小時之纖維蛋白原及TAT的血漿含量(注射時間點：導管插入前1小時及導管插入後1小時、4小時、8小時及16小時) ( n=3) (G，白色及黑色柱)，及於 F8 -/-Pros1 -/- 中單次靜脈內注射後24小時之纖維蛋白原及TAT的血漿含量( n=3) (G，虛線柱)，及允許偵測到 F8 -/-Pros1 -/- 在重複靜脈內注射0.3 U/g Advate® (H)及單次靜脈內注射0.3 U/g Advate® (i)後24小時的肺部及肝臟切片中的纖維蛋白凝塊的代表性免疫組織化學。所有資料表達為平均值±標準誤；ns，不顯著；*， P＜0.05；**， P＜0.005。
圖 7展示血栓之鼠類模型。A-C， F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 + /-及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠( n=10/基因型)中之TF誘導之靜脈血栓栓塞。經麻醉之小鼠經由下腔靜脈注射不同劑量之重組TF(Innovin)：A組為½稀釋液(~4.3 nM TF)，及B-C組為¼稀釋液(~2.1 nM TF)。在(A)中，一組 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠接受低分子量肝素之注射(皮下注射依諾肝素(enoxaparin)60 µg/g)。記錄直至呼吸停止發生之時間，至少持續2分鐘。實驗在20分鐘後終止。卡本-麥爾(Kaplan-Meier)存活率曲線(A-B)。C，呼吸停止發生2分鐘後或20分鐘觀察期完成時，切除肺部且研究纖維蛋白結塊(不溶性纖維蛋白之免疫染色，mAb純系102-10)。D， F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中藉由活體內顯微鏡記錄FeCl 3損傷的腸系膜動脈中之血栓形成，代表性實驗( n=3/基因型)。D， F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中藉由活體內顯微鏡記錄FeCl 3損傷的腸系膜動脈中之血栓形成，代表性實驗( n=3/基因型)。
圖 8展示尾部出血模型。在2 mm (A)及4 mm (B)尾部橫切30分鐘(A)及10分鐘(B)之後在一管新鮮的生理鹽水中收集血液；接著量測總失血量(μl)。 F8 +/-Pros1 +/+ 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠(白柱)作為對照組(對於A中所有組， n=5，對於A中所有組， n=6)。C，抗人類PS抗體改變在4 mm橫切之後的尾部出血。
圖 9展示急性關節血腫模型。A， F8 -/-Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/- 、 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 +/+Pros1 +/+ 小鼠受傷後72小時之膝直徑與受傷前的差異。B，在 F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠中，代表性未受傷及受傷腿部在72小時後膝內間隙的顯微鏡評估(梅森氏三色染色(Masson's trichrome stain)及不溶性纖維蛋白免疫染色)。C，使用特定siRNA進行活體內mPS緘黙：在用單次腹膜內輸注mPS siRNA或對照siRNA處理之 F8 -/-Pros1 +/- 及 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠損傷後72小時評估關節直徑。D，預先用mPS siRNA或對照siRNA處理之 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠中，在72小時之後對代表性受傷之腿的膝內間隙的顯微鏡評估(梅森氏三色染色)。量測值呈現為平均值±標準誤；*， P＜0.05；**， P＜0.005；***， P＜0.0005；****， P＜0.0001。
圖 10展示PS及TFPI均表現於鼠滑膜中。A，來自先前用對照-siRNA或mPS-siRNA處理之 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠之受傷膝內間隙中PS及TFPI的免疫染色。箭頭指向滑膜組織，及箭頭指向血管結構，對於PS及TFPI均為陽性。上部圖中之方框(比例尺：200 µm)顯示了下部圖中之放大面積(比例尺：50 µm)。B，來自 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠未受傷膝之膝內間隙中TFPI的免疫染色。C-E，使用抗PS (c)及抗TFPI (d)抗體對來自原代鼠類纖維母細胞樣滑膜細胞(FLS)培養物之條件培養基進行西方墨點分析。血小板游離血漿(PFP)、來自血小板之蛋白質裂解物(PLT)、鼠類PS (mPS)用作陽性對照組(c)。TFPI同功異型物表現係藉由比較去糖基化TFPI與充分糖基化TFPI之分子量來確定。使用鼠類胎盤作為TFPIα之陽性對照。E-F，使用抗PS (f)及抗TFPI (e)抗體，在凝血酶(Thr，+)或媒劑(-)存在下培養24小時之後，自FLS分離之總蛋白質裂解物之西方墨點分析。人類重組TFPI全長用作TFPIα (hrTFPI)之陽性對照。墨點表示三個獨立實驗。
圖 11展示人類滑膜中之PS及TFPI。A，PS及TFPI表現於HA (按需及防治)、HB (需求)或骨關節炎(OA)患者之滑液組織中。箭頭指向滑膜內裏層，及箭頭指向次級內裏層之血管結構，對於PS及TFPI均為陽性。比例尺：50 µm。B，使用抗TFPI抗體在去糖基化之前及之後對來自健康個體及OA患者之原代人類FLS (hFLS)培養物之條件培養基進行西方墨點分析。人類血小板裂解物(hPLT)用作TFPIα之陽性對照。墨點表示三個獨立實驗。
圖 12展示A型血友病中之凝血酶生成及纖維蛋白網狀結構， F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之PRP中TF-(1 pM)誘導的凝血酶生成描繪TFPI依賴性PS活性。B，來自 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之PRP及PFP中之APC依賴性PS活性。C，來自 F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- ，及來自 F9 +/+Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 -/- 纖維蛋白結構之代表性掃描電子顯微鏡影像。D-G，由來自不具有高效價抑制劑(D，F)及具有高效價抑制劑(E，G)之嚴重HA患者(FVIII＜1%)的PFP (D-E)及PRP (F-G)中之低TF濃度(1 pM)觸發的凝凝血酶生成。量測呈現為平均值±標準誤；**， P＜0.005；***， P＜0.0005。
圖 13展示基因分型方法。藉由雜交 F8 -/-Pros1 +/- (a-c)及 F9 -/-Pros1 +/- (d-f)小鼠獲得之基因型。a， Pros1對偶基因藉由多重PCR擴增。接著對PCR產物進行電泳；根據Saller, 2009， wt帶具有相比於空帶(571 bp)較低的分子量(234 bp)。b，建立多重PCR擴增基因體DNA中F8對偶基因之 wt帶(620 bp)及空帶(420 bp)。c，與(a)中相比，相同樣品上F8對偶基因擴增(空帶：420 bp)之PCR產物。d， Pros1對偶基因藉由多重PCR擴增。接著對PCR產物進行電泳；根據Saller, 2009，wt帶具有相比於空帶(571 bp)較低的分子量(234 bp)。e，建立多重PCR擴增基因體DNA中F9對偶基因之 wt帶(320 bp)及空帶(550 bp)。f，與(d)中相比，相同樣品上F9對偶基因擴增(空帶：550 bp)之PCR產物。
圖 14展示生理病狀中之組織學。 F8 -/-Pros1 -/- 及 F8 -/-Pros1 +/+ 小鼠以及 F9 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠中的肝、肺、腎、腦切片上不溶性纖維蛋白的免疫染色。比例尺：100 µm。
圖 15展示Pros1之遺傳性缺失防止患有B型血友病之小鼠中的關節血腫。A， F9 -/-Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/- 、 F9 -/-Pros1 -/- 及 F9 +/+Pros1 +/+ 小鼠受傷後72小時之膝直徑與受傷前的差異。B，在 F9 +/+Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 -/- 小鼠中，代表性未受傷及受傷腿部在72小時後膝內間隙的顯微鏡評估(梅森氏三色染色及不溶性纖維蛋白染色，mAb純系102-10)。比例尺：500 µm。量測呈現為平均值±標準誤；***， P＜0.0005。
圖 16展示纖維蛋白網狀結構密度及纖維分支之量化。a-b， F8 +/+Pros1 +/+ 、 F8 -/-Pros1 +/+ 及 F8 -/-Pros1 -/- 小鼠之纖維蛋白網狀結構。c-d， F9 +/+Pros1 +/+ 、 F9 -/-Pros1 +/+ 及 F9 -/-Pros1 -/- 之纖維蛋白網狀結構。纖維蛋白網狀結構密度之量化(a及c)。纖維分支之量化(b及d)。量測呈現為平均值±標準誤；***， P＜0.0005。
圖 17展示藉由不同PROS1 siRNA結合物抑制原代肝細胞中之PROS1目標基因表現。
圖 18展示藉由不同PROS1 siRNA結合物之受體介導的攝取抑制原代人類肝細胞中之人類PROS1基因表現。
圖 19展示藉由單次投與不同PROS1 siRNA結合物活體內抑制PROS1基因表現。
圖 20展示藉由單次投與PROS1 siRNA結合物抑制血友病小鼠中之PROS1基因表現。
圖 21展示用PROS1 siRNA結合物處理減少急性關節血腫模型中之膝部腫脹。
圖 22展示用PROS1 siRNA結合物處理改善A型血友病動物模型的止血概況。
圖 23展示藉由以1 nM與0.00001 nM之間的濃度轉染蛋白質S siRNA，人類細胞中之蛋白質S mRNA含量的劑量依賴性降低。
圖 24展示藉由PROS1 siRNA結合物之受體介導的攝取抑制原代人類肝細胞中之PROS1目標基因表現。
圖 25展示藉由PROS1 siRNA結合物之受體介導的攝取抑制原代獼猴肝細胞中之PROS1目標基因表現。
圖 26展示在兩個不同時間點用EU161處理後肝臟中蛋白質S mRNA之降低。
圖 27展示在用EU161處理後總蛋白質S血清含量之降低。
圖 28展示在用EU161處理後游離蛋白質S血漿含量之降低。 

          <![CDATA[<110>  瑞士伯恩大學(Universitat Bern)]]>
                 德商奧圖真公司(Silence Therapeutics GmbH)
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          uuccacagac accauauuc                                                    19
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          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          augcaaugaa gauggauau                                                    19
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          uuuucaaaga ccucccugg                                                    19
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          ccagggaggu cuuugaaaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          aguuugaauc cuuucuucc                                                    19
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          ggaagaaagg auucaaacu                                                    19
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          uuucauugcu uuguccaag                                                    19
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          cuuggacaaa gcaaugaaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          cauugcuuug uccaagacg                                                    19
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          cgucuuggac aaagcaaug                                                    19
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          uauguuuaga aauggcuuc                                                    19
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          gaagccauuu cuaaacaua                                                    19
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          uguucuugca cacagcugu                                                    19
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          acagcugugu gcaagaaca                                                    19
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          aucuugggca aguuugaau                                                    19
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          auucaaacuu gcccaagau                                                    19
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          aacucuucug aucuugggc                                                    19
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          gcccaagauc agaagaguu                                                    19
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          uucuuccaca gacaccaua                                                    19
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          uauggugucu guggaagaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          gucaggauaa gcauuaguu                                                    19
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          aacuaaugcu uauccugac                                                    19
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          acagacacca uauuccaua                                                    19
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          uauggaauau ggugucugu                                                    19
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          uuuggauaaa aauaauccg                                                    19
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          cggauuauuu uuauccaaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          cucacaacuc uucugaucu                                                    19
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          agaucagaag aguugugag                                                    19
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          gcauucacug guguggcac                                                    19
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          gugccacacc agugaaugc                                                    19
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          uaggucagga uaagcauua                                                    19
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          uaaugcuuau ccugaccua                                                    19
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          agcacacaug uucucagag                                                    19
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  46]]>
          cucugagaac augugugcu                                                    19
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          uccacagaca ccauauucc                                                    19
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          uuauaaaagg cauucacug                                                    19
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          cauuauuaua aucuaugug                                                    19
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          <![CDATA[<400>  174]]>
          cacauagauu auaauaaug                                                    19
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          <![CDATA[<400>  175]]>
          cgaauauuca aggucacau                                                    19
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          augugaccuu gaauauucg                                                    19
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          ucuggaaugg cauugacac                                                    19
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          aaguuugccu cugagacgg                                                    19
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          caaggucuac auuacaaaa                                                    19
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          aaaugcauca caguaccag                                                    19
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          gaaguucagc uuaagaaug                                                    19
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          cauuauuaua aucuaugug                                                    19
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          cacauagauu auaauaaug                                                    19
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          cgaauauuca aggucacau                                                    19
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          augugaccuu gaauauucg                                                    19
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          ccagauguuc cauucagug                                                    19
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          ucuggaaugg cauugacac                                                    19
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          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股 - 根據說明書末尾之彙總序列表進行修飾]]>
          <![CDATA[<400>  239]]>
          uaauagacca ccaucucuu                                                    19
          <![CDATA[<210>  240]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股 - 根據說明書末尾之彙總序列表進行修飾]]>
          <![CDATA[<400>  240]]>
          aagagauggu ggucuauua                                                    19
          <![CDATA[<210>  241]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  siRNA股 - 根據說明書末尾之彙總序列表進行修飾]]>
          <![CDATA[<400>  241]]>
          uaauagacca ccaucucuu                                                    19
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          <![CDATA[<400>  242]]>
          aagagauggu ggucuauua                                                    19
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          uugaaaagag cgaagacaa                                                    19
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          uugucuucgc ucuuuucaa                                                    19
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          uugaaaagag cgaagacaa                                                    19
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          uugucuucgc ucuuuucaa                                                    19
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          uugaaaagag cgaagacaa                                                    19
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          <![CDATA[<400>  248]]>
          uugucuucgc ucuuuucaa                                                    19
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          <![CDATA[<211>  19]]>
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          <![CDATA[<400>  249]]>
          uucguauaca uccaucuag                                                    19
          <![CDATA[<210>  250]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          cuagauggau guauacgaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  251]]>
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          uucguauaca uccaucuag                                                    19
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          cuagauggau guauacgaa                                                    19
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          uucguauaca uccaucuag                                                    19
          <![CDATA[<210>  254]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          cuagauggau guauacgaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  255]]>
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          uuauucacuu ccaugcagc                                                    19
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          gcugcaugga agugaauau                                                    19
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          aagagauggu ggucuauua                                                    19
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          cuagauggau guauacgaa                                                    19
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Claims (19)

  1. 一種抑制PROS1表現之雙股核酸，其中該核酸包含第一股及第二股，其中該第一股序列包含至少15個核苷酸之序列，該序列與選自SEQ ID NO: 199、187、189、191、193、195、197、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231及255之序列中之任一者相差不超過3個核苷酸。
  2. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該第一股與該第二股形成長度為17至25個核苷酸之雙螺旋區。
  3. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該核酸介導RNA干擾。
  4. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該第一及/或該第二股之至少一個核苷酸為經修飾之核苷酸，特定言之為非天然存在之核苷酸，諸如2'-F修飾之核苷酸。
  5. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該第一股之至少核苷酸2及14藉由第一修飾來進行修飾，該等核苷酸以該第一股之5'端處之核苷酸編號1開始連續編號。
  6. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該第一股在其5'末端處具有末端5' (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。
  7. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該核酸包含該第一股及/或該第二股之末端兩個或三個3'核苷酸及/或5'核苷酸之間的硫代磷酸酯鏈結，且特定言之其中其餘核苷酸之間的鏈結為磷酸二酯鏈結。
  8. 如前述請求項中任一項之核酸，其包含該第一股之3'端的兩個、三個或四個末端核苷酸中之每一者之間的二硫代磷酸酯鏈結，及/或包含該第二股之3'端的兩個、三個或四個末端核苷酸中之每一者之間的二硫代磷酸酯鏈結及/或該第二股之5'端的兩個、三個或四個末端核苷酸中之每一者之間的二硫代磷酸酯鏈結，且包含除該第一股之5'端的兩個、三個或四個末端核苷酸之間的二硫代磷酸酯鏈結以外的鏈結。
  9. 如前述請求項中任一項之核酸，其中該核酸與配位體結合。
  10. 如請求項10之核酸，其中該配位體包含(i)一或多個N-乙醯基半乳胺糖(GalNAc)部分或其衍生物，及(ii)連接子，其中該連接子將至少一個GalNAc部分或其衍生物與該核酸結合。
  11. 如請求項1至5、7或9至10中任一項之核酸，其中該第一股包含SEQ ID NO: 233且該第二股視情況包含SEQ ID NO: 234。
  12. 如請求項1至5、7或9至10中任一項之核酸，其中該第一股由SEQ ID NO: 233組成且其中該第二股由SEQ ID NO: 234組成。
  13. 如請求項1至5、7或9至10中任一項之核酸，其中該第一股包含SEQ ID NO: 237且該第二股視情況包含SEQ ID NO: 238。
  14. 如請求項1至5、7或9至10中任一項之核酸，其中該第一股由SEQ ID NO: 237組成且其中該第二股由SEQ ID NO: 238組成。
  15. 如請求項1至7或9至10中任一項之核酸，其中該第一股包含SEQ ID NO: 251且該第二股視情況包含SEQ ID NO: 252。
  16. 如請求項1至7或9至10中任一項之核酸，其中該第一股由SEQ ID NO: 251組成且其中該第二股由SEQ ID NO: 252組成。
  17. 一種組合物，其包含如前述請求項中任一項之核酸及溶劑及/或遞送媒劑及/或生理學上可接受之賦形劑及/或載劑及/或鹽及/或稀釋劑及/或緩衝劑及/或防腐劑及/或另一選自包含以下之群的治療劑：寡核苷酸、小分子、單株抗體、多株抗體及肽。
  18. 如請求項1至16中任一項之核酸或如請求項17之組合物，其係用作藥物。
  19. 如請求項1至16中任一項之核酸或如請求項17之組合物，其用於預防出血病症、降低罹患出血病症之風險或治療出血病症，尤其A型血友病或B型血友病。
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