KR20210040079A - Tmprss6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 철 킬레이터 - Google Patents

Tmprss6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 철 킬레이터 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제품 및 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터 및 가능한 다른 활성 작용제와 조합된, TMPRSS6 유전자 발현을 방해하거나 또는 그의 발현을 억제하는 핵산 제품, 뿐만 아니라 혈색소증, 포르피린증 및 혈액 장애 예컨대 베타-지중해빈혈, 겸상 적혈구 질환 및 수혈성 철 과부하 또는 골수이형성 증후군, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료를 위한 것과 같은 치료 용도에 관한 것이다.

Description

TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 철 킬레이터
본 발명은 제품 및 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다른 활성 작용제와 조합된, TMPRSS6 유전자 발현을 방해하거나 또는 그의 발현을 억제하는 핵산 제품, 및 혈색소증, 포르피린증 및 혈액 장애 예컨대 β-지중해빈혈, 겸상 적혈구 질환 및 수혈성 철 과부하, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료를 위한 것과 같은 치료 용도에 관한 것이다.
발현된 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 RNA 간섭 (RNAi)으로 명명된 메커니즘에 의해 유전자 발현을 차단할 수 있는 것으로 제시된 바 있다 (문헌 [Fire et al., 1998, Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11] 및 [Elbashir et al., 2001, Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8]). 짧은 dsRNA는 척추동물을 포함하는 다수의 생물에서 유전자-특이적 전사후 침묵화를 지시하고, 유전자 기능을 연구하기 위한 유용한 도구가 되었다. RNAi는 RNA-유도 침묵화 복합체 (RISC)에 의해 매개되고, 이는 RISC 복합체 내로 로딩된 침묵화 촉발제와 상동성인 메신저 RNA를 파괴하는 서열-특이적 다성분 뉴클레아제이다. 간섭 RNA (iRNA) 예컨대 siRNA, 안티센스 RNA, 및 마이크로-RNA는 유전자-침묵화, 즉 mRNA 분자의 분해를 통해 단백질의 유전자 번역을 억제하는 것에 의해 단백질 형성을 방지하는 올리고뉴클레오티드이다. 유전자-침묵화 작용제는 의약에서의 치료 용도에 점점 더 중요해지고 있다.
문헌 [Watts and Corey, Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379)]에 따르면, 핵산 침묵화 촉발제를 디자인하는데 사용될 수 있는 알고리즘이 있지만, 모두가 심각한 한계가 있다. 이는 강력한 siRNA를 확인하기 위해 다양한 실험 방법을 취할 수 있는데, 알고리즘이 표적 mRNA의 3차 구조 또는 RNA 결합 단백질의 관여와 같은 요인을 고려하지 않기 때문이다. 따라서, 표적을 벗어나는 효과가 최소인 강력한 핵산 침묵화 촉발제의 발견은 복잡한 공정이다. 이러한 고도로 장전된 분자의 제약 개발을 위해, 이들이 경제적으로 합성될 수 있고, 표적 조직에 분포될 수 있으며, 세포에 진입할 수 있고, 허용가능한 독성 한계 내에서 기능할 수 있는 것이 필요하다.
매트립타제-2 (MT-2)는 TMPRSS6 유전자의 산물이다. MT-2는 철 항상성의 조절에서 결정적인 역할을 하는 II형 막횡단 세린 프로테아제이다. MT-2는 펩티드 호르몬 헵시딘의 유전자 발현에 대한 음성 조절인자이다. 헵시딘은 주로 간에 의해 생산 및 분비된다. 헵시딘은 위장 철 흡수 및 세포 저장소로부터의 철 방출의 음성 조절인자로서 작용함으로써 신체 내의 철 균형을 조절한다. 헵시딘의 상향조절은 신체 내의 철 이용가능성에서의 감소로 이어진다 (McDonald et al., American Journal of Physiology, 2015, vol 08 no. 7, C539-C547). 철 과부하가 있는 환자에서는 헵시딘 수준이 낮다. 따라서, 철 과부하를 감소시키기 위한 가능한 목표는 간에서 TMPRSS6 유전자 발현을 침묵화시킴으로써 헵시딘을 증가시키는 것이다.
TMPRSS6은 주로 간에서 발현되지만, 높은 수준의 TMPRSS6 mRNA가 신장에서 또한 발견되고, 더 낮은 수준으로 자궁에서 발견되며, 훨씬 더 작은 양이 다수의 다른 조직에서 발견된다 (Ramsay et al., Haematologica (2009), 94(*6), 84-849).
다양한 장애, 예컨대 유전성 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 및 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈, 선천성 철적혈모구 (CSA), 선천성 적혈구생성이상 빈혈 (CDA), 골수 부전 증후군, 골수이형성증 및 겸상 적혈구 질환 (SCD)이 혈액 및 조직 철 수준 증가를 특징으로 하는 병태인 철 과부하와 연관된다. 추가적으로, 정기적으로 수혈을 받는 모든 환자 집단은 수혈성 철 과부하가 발달될 위험이 있다 (Coates, Free Rad Biol Med 2014, Vol 72, 23-40, Bulaj et al., Blood 2000, Vol 95, 1565-71). 논문 [Nai et al., Blood, 2012, Vol 119, No. 21, p 5021-5027] 및 [Guo et al., The Journal of Clinical Investigation, 2013, Vol 123, No. 4, p 1531-1541] 둘 다는 어떻게 TMPRSS6 발현의 결실 또는 감소가 마우스에서 β-지중해빈혈을 치료하는데 효과적이었는지를 나타낸다. 논문 [Schmidt, 2013, Blood, Vol 121, 7, p 1200-1208]은 유전성 혈색소증 및 β-지중해빈혈의 마우스 모델에서 TMPRSS6 핵산을 사용하여 철 과부하를 감소시키는 것을 탐구한다. 양쪽 모델에서, 저자는 지질 나노입자 - TMPRSS6 핵산 처리가 헵시딘을 유도하였고, 조직 및 혈청 철 수준을 21일까지 감소시킨 것으로 결정하였다. 추가로, 논문 [Schmidt et al., American Journal of Hematology, 2015, Vol 90, No. 4, p 310-313]에서는 LNP-TMPRSS6 핵산 + 경구 철 킬레이터 데페리프론 요법이 β-지중해빈혈의 마우스 모델에서 2차 철 과부하를 감소시켰음이 입증되었다. 또한, 골수 이식을 받은 철 과부하 환자가 감염 및 비-재발 관련 사망에 대한 위험 강화를 경험한다는 증거가 있다. 강화된 전신 철 수준은 면역 손상으로 인해, 그리고 높아진 미생물 독성에 의해 감염 위험을 증가시킨다. 골수 이식을 받는 환자는 이식을 위해 환자를 준비시키는데 요구되는 세포독성 컨디셔닝이 환자의 골수를 제거하고 또한 적혈구생성이 손상됨에 따라 전신 철 수준을 증가시키기 때문에 특히 감염에 취약하다. 추가로, 높은 전신 철 수준은 이식 및 생착된 공여자 줄기 세포의 증식에 부정적인 영향을 미칠 수 있다.
골수 이식을 받는 환자의 컨디셔닝 전 및 동안 철 과부하 및 전신 철 수준을 감소시키는 것은 감염 및 비-재발 관련 사망의 위험을 감소시킬 수 있다 (Wermke et al., 2018, Lancet Haematol. May; 5 (5):e201-e210).
따라서, 철 과부하와 연관된 장애의 효과적인 치료를 위한 방법이 현재 요구되고, 본 발명은 이러한 요구를 다룬다.
본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 핵산 또는 접합된 핵산에 관한 것이다.
핵산 및 접합된 핵산
본원에 개시된 제1 측면은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호(SEQ ID NO): 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 제1 가닥은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129,133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314, 또는 315, 예컨대 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 핵산에 관한 것이다.
추가적인 관련된 측면은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제2 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 제2 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314, 또는 316로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 예컨대 하기: 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 핵산이다.
특정 핵산이 본 발명의 모든 측면에서 바람직하다. 특히, 하기와 같다:
제1 가닥은 서열식별번호: 333의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 334의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00001
제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00002
제1 가닥은 서열식별번호: 422의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 423의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00003
제1 가닥은 서열식별번호: 199의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 200의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00004
제1 가닥은 서열식별번호: 429의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 430의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00005
제1 가닥은 서열식별번호: 207의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 208의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
Figure pct00006
핵산은 본원에서 특정 링커 및/또는 리간드와 함께 서열 목록에서 개시될 수 있지만, 서열 목록의 맥락에서의 링커 또는 리간드에 대한 임의의 언급은 이러한 특색이 바람직함에도 불구하고 임의적이다. 특정한 바람직한 링커가 특정한 핵산 서열과 함께 개시된다.
제1 가닥 및/또는 상기 제2 가닥은 각각 뉴클레오티드 17-35개 길이일 수 있고, 적어도 하나의 듀플렉스 영역은 뉴클레오티드 10-25개 길이일 수 있다. 듀플렉스는 2개의 별개의 가닥을 포함할 수 있거나, 또는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 단일 가닥을 포함할 수 있다.
핵산은 a) 양쪽 단부에서 평활 말단일 수 있거나; b) 한쪽 단부에 오버행 및 다른쪽에 평활 말단을 가질 수 있거나; 또는 c) 양쪽 단부에 오버행을 가질 수 있다.
제1 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되어, 변형된 뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 적어도 제2 변형에 의해 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나는 하나 이상의 변형된 홀수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나와 인접할 수 있다.
본원에 개시된 핵산에서 제1 가닥 내의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 제1 가닥 내의 복수의 짝수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 제2의 상이한 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다.
제2 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 제1 가닥 상의 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형에 의해 변형될 수 있고/거나, 제2 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 제1 가닥 상의 홀수 번호 뉴클레오티드와 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 하나 이상의 변형된 홀수 번호 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 변형될 수 있고/거나, 복수의 짝수 번호 뉴클레오티드는 제1 가닥 홀수 번호 뉴클레오티드 상에 존재하는 것과 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있고, 여기서 제2 변형은 제1 가닥 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 상이하다.
제2 가닥은 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 제2 변형일 수 있는 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 핵산에서, 제1 가닥 내의 각각의 홀수 번호 뉴클레오티드 및 제2 가닥 내의 각각의 짝수 번호 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 변형될 수 있고, 제1 가닥에서 각각의 짝수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 각각의 홀수 번호 뉴클레오티드는 제2의 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 제2 가닥의 비변형된 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드에 비교하여 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 모르폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트 기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/거나, 변형된 뉴클레오티드는 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드 또는 비-천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드 중 어느 하나일 수 있다.
적어도 1개의 변형은 2'-O-메틸일 수 있고/거나 적어도 1개의 변형은 2'-F일 수 있다.
본 개시내용은, 제2 측면으로서, 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열:
서열식별번호: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442
로부터 선택되거나; 또는
서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129,133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314, 또는 315,
예컨대 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215
로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제1 변형에 의해 변형되고 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제2 변형에 의해 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오티드는 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제3 변형에 의해 변형되고 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이한 것인
핵산을 추가로 제공한다.
본 개시내용은, 관련된 제2 측면으로서, 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제2 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443으로부터 선택되거나, 또는
서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314, 또는 316,
예컨대 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216
으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고,
여기서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서의 제1 변형에 의해 변형되고 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서의 제2 변형에 의해 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오티드는 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서의 제3 변형에 의해 변형되고 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서의 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이한 것인
핵산을 추가로 제공한다.
제3 변형 및 제1 변형은 동일할 수 있고/거나 제2 변형 및 제4 변형은 동일할 수 있다.
제1 변형은 2'OMe일 수 있고, 제2 변형은 2'F일 수 있다.
임의의 측면, 예를 들어 제2 측면의 핵산에서, 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 서열 및 변형은 하기 표에 제시된 바와 같을 수 있다:
Figure pct00007
여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
상기 교시된 바와 같이, 다른 바람직한 서열과 함께, 이들은 바람직한 서열이다.
본원에 개시된 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단의 1개, 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 1개, 2개 또는 3개의 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 이는 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각 사이 및 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결, 및 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다.
이같은 핵산은 리간드에 접합될 수 있다.
본 개시내용은, 제3 측면으로서, 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열:
서열식별번호: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 353, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442
로부터 선택되거나; 또는
서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314, 또는 315,
예컨대 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215
로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 핵산은 리간드에 접합되는 것인
핵산을 추가로 제공한다.
본 개시내용은, 추가로 관련된 측면으로서, 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제2 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 또는 제2 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314, 또는 316으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 예컨대 하기: 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216으로부터 선택된 서열을 포함하고,
여기서 핵산은 리간드에 접합되는 것인
핵산을 추가로 제공한다.
리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 GalNAc 모이어티를 임의의 상기 측면에서 정의된 바와 같은 서열에 접합시킨다. 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오티드는 본원에서 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
리간드는 화학식 I을 포함할 수 있으며:
[S-X1-P-X2]3-A-링커- (I)
여기서
S는 사카라이드를 나타내며, 여기서 사카라이드는 N-아세틸 갈락토스아민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내며, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)이고;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에테르이며, 여기서 n = 1-6이고;
A는 분지 단위이고;
X3은 가교 단위를 나타내고;
여기서 본원에 개시된 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)를 통해 X3에 접합된다.
따라서 본 발명은 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산을 추가적으로 제공한다:
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
여기서 Z는 본원에서 이전에 정의된 바와 같은 핵산을 나타낸다.
대안적으로, 본원에 개시된 핵산은 하기 구조의 리간드에 접합될 수 있다:
Figure pct00012
본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에서 정의된 바와 같은 핵산, 및 하기를 포함하는 제형을 포함하는 조성물을 또한 제공한다:
i) 양이온성 지질, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질;
iv) PEG화 지질.
제형 중 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 제형의 총 지질 함량의 약 55 mol% 내지 약 65 mol%, 바람직하게는 지질 제형의 총 지질 함량의 약 59 mol%일 수 있다.
제형은 하기를 포함할 수 있다:
하기 구조를 갖는 양이온성 지질;
Figure pct00013
하기 구조를 갖는 스테로이드;
Figure pct00014
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질;
Figure pct00015
및 하기 구조를 갖는 PEG화 지질;
Figure pct00016
철 킬레이터
철 킬레이터는 신체 내의 금속 철 이온에 결합할 수 있고, 신체로부터 과량의 철을 제거하거나 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 철-매개 독성을 완화시킬 수 있는 임의의 분자이다.
하나 이상의 철 킬레이터가, 예를 들어, 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스 (엑스자이드(Exjade)) 및 데페라시록스 (자데누(Jadenu)), 바람직하게는 데페리프론으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 임의의 측면의 핵산 또는 접합된 핵산, 및 생리학상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물을 또한 제공한다.
질환 또는 장애의 치료 및/또는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 용도를 위한, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 핵산 또는 접합된 핵산이 또한 제공된다.
본 발명은 치료를 필요로 하는 개체에게 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 임의의 측면에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
핵산 또는 접합된 핵산은 대상체에게 피하 투여될 수 있거나, 정맥내 투여될 수 있거나, 또는 임의의 다른 적용 경로 예컨대 경구, 직장 또는 복막내를 사용하여 투여될 수 있다.
철 킬레이터는 대상체에게 피하 투여될 수 있거나, 정맥내 투여될 수 있거나, 또는 임의의 다른 적용 경로 예컨대 경구, 직장 또는 복막내를 사용하여 투여될 수 있다.
핵산 또는 접합된 핵산은 하나 이상의 철 킬레이터와 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
따라서, 핵산 또는 접합된 핵산이 철 킬레이터와 조합되어 전달될 수 있거나 (예컨대 고정 용량 조성물), 조합물이 별개의 제약 조성물들로서 전달될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
질환 또는 장애는 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증 및 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증 및 수혈성 철 과부하를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 장애는 철 과부하와 연관될 수 있고, 철 과부하와 연관된 장애는 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조일 수 있다. 질환 또는 장애는 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망으로부터 선택될 수도 있다. 본원에 개시된 바와 같은 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터로 치료될 바람직한 질환 또는 장애는 혈색소증이다.
하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 제조하는 방법이 또한 포함된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된, 이중 가닥이고 TMPRSS6의 발현된 RNA 전사체에 대해 지시된 핵산, 및 그의 조성물에 관한 것이다. 이러한 핵산은 TMPRSS6 유전자 산물의 감소된 발현이 바람직한 다양한 질환 및 장애의 치료에서 사용될 수 있다.
본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 임의의 측면에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 제공한다.
본원에 개시된 제1 측면은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 세포에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열:
서열식별번호: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442
로부터 선택되거나, 또는
서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314, 또는 315,
예컨대 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215
로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
핵산에 관한 것이다.
핵산은, 유전자 발현을 방해할 수 있는, 뉴클레오티드를 포함하는 2개의 가닥을 포함하는 핵산을 의미한다. 억제는 완전하거나 또는 부분적일 수 있고, 표적화된 방식으로 유전자 발현의 하향 조절을 초래한다. 핵산은 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥을 포함한다; 가이드 가닥일 수도 있는 제1 가닥 및 패신저 가닥일 수도 있는 제2 가닥. 제1 가닥 및 제2 가닥은 이중 가닥 분자를 형성하도록 '폴딩되는' 자가 상보적인 동일한 폴리뉴클레오티드 분자의 일부분일 수 있다. 핵산은 siRNA 분자일 수 있다.
핵산은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥 (관련 기술분야에서 가이드 가닥으로도 알려짐) 전체 또는 그의 일부분 및 제2 가닥 (관련 기술분야에서 패신저 가닥으로도 알려짐) 전체 또는 그의 일부분에 의해 형성된 이중-가닥 핵산 부분 또는 듀플렉스 영역을 추가로 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 (경계를 포함하여) 제1 가닥과 제2 가닥 사이에서 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하여 제1 가닥과 제2 가닥 사이에서 형성된 마지막 염기 쌍에서 끝나는 것으로 정의된다.
듀플렉스 영역은 왓슨-크릭 염기 쌍형성에 의해 또는 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 가닥 사이의 듀플렉스 형성을 허용하는 임의의 다른 방식에 의해 서로 염기 쌍을 형성하는 2개의 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 내의 영역을 의미한다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오티드 단위를 갖는 올리고뉴클레오티드 가닥은 21개의 뉴클레오티드 단위의 또 다른 올리고뉴클레오티드와 염기 쌍형성될 수 있지만, "듀플렉스 영역"이 19개의 염기 쌍으로 이루어지도록 각각의 가닥 상의 19개의 뉴클레오티드만 상보적이거나 실질적으로 상보적이다. 나머지 염기 쌍은 5' 및 3' 오버행으로서 또는 단일 가닥 영역으로서 존재할 수 있다. 추가로, 듀플렉스 영역 내에서, 100% 상보성이 요구되지 않는다; 실질적인 상보성이 듀플렉스 영역 내에서 허용가능하다. 실질적인 상보성은 생물학적 조건 하에 어닐링될 수 있는 가닥 사이의 상보성을 지칭한다. 2개의 가닥이 생물학적 조건 하에 어닐링될 수 잇는지를 실험적으로 결정하는 기술이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 2개의 가닥을 합성하고 함께 생물학적 조건 하에 첨가하여 이들이 서로 어닐링되는지를 결정할 수 있다.
적어도 하나의 듀플렉스 영역을 형성하는 제1 가닥 및 제2 가닥의 일부분은 완전히 상보적일 수 있고, 서로 적어도 부분적으로 상보적이다.
핵산의 길이에 따라, 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 염기 상보성 관점에서의 완벽한 매칭이 필수적으로 요구되지는 않는다. 그러나, 제1 및 제2 가닥은 생리학적 조건 하에 혼성화될 수 있어야 한다.
적어도 하나의 듀플렉스 영역 내의 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 상보성은 어느 가닥에도 뉴클레오티드 미스매치 또는 추가적인/결실된 뉴클레오티드가 없다는 점에서 완벽할 수 있다. 대안적으로, 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%일 수 있다.
제1 가닥 및 제2 가닥은 표 1에 열거된 서열 중 어느 하나로부터 뉴클레오티드 3개 이하만큼 상이한 적어도 15개의 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 상보성 영역을 각각 포함할 수 있다.
본 개시내용의 관련된 측면은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 세포에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제2 가닥은 하기 서열:
서열식별번호: 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443
으로부터 선택되거나, 또는
서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314, 또는 316,
예컨대 하기: 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216으로부터 선택된 서열
로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인
핵산에 관한 것이다.
적합하게는, 본 개시내용의 임의의 측면에서, 제2 및 제1 가닥은 함께 본원에 개시된 상보적인 핵산 쌍, 예컨대 서열식별번호: 1 및 2, 3 및 4 등의 것 중 임의의 것이다.
서열식별번호: 17 및 18로 이루어진 핵산 조합이 바람직한 조합이며, 서열식별번호: 199와 200, 및 서열식별번호: 207과 208도 그러하다.
핵산은 제1 가닥 전체 또는 그의 일부분과 표적 핵산인 TMPRSS6의 일부분 사이에 듀플렉스 영역이 형성되는 것을 수반한다. 경계를 포함하여 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하여 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 마지막 염기 쌍으로 끝나는 것으로 정의되는 제1 가닥과의 듀플렉스 영역을 형성하는 표적 핵산의 일부분이 표적 핵산 서열 또는 간단하게는 표적 서열이다. 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 듀플렉스 영역이 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스 영역과 동일할 필요는 없다. 즉, 제2 가닥은 표적 서열과 서열이 상이할 수 있지만, 제1 가닥은 제2 가닥 및 표적 서열 둘 다와 듀플렉스 구조를 형성할 수 있어야 한다.
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성은 완벽할 수 있다 (어느 핵산에도 뉴클레오티드 미스매치 또는 추가적인/결실된 뉴클레오티드가 없음).
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 약 70% 내지 약 100%일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상보성은 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열의 상보적 서열 사이의 동일성은 약 75% 내지 약 100%일 수 있다. 더욱 구체적으로, 상보성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%, 또는 중간 값일 수 있고, 단 핵산은 TMPRSS6의 발현을 감소시키거나 또는 억제할 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성이 100% 미만인 핵산이 제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성이 완벽한 핵산과 동일한 수준으로 TMPRSS6의 발현을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 이는 완벽한 상보성의 핵산으로 달성되는 발현 수준의 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%인 수준으로 TMPRSS6의 발현을 감소시킬 수 있다.
핵산은 각각 뉴클레오티드 19-25개 길이인 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함할 수 있다. 제1 가닥 및 제2 가닥은 길이가 상이할 수 있다.
핵산은 뉴클레오티드 쌍 15-25개 길이일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 쌍 17-23개 길이일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 쌍 17-25개 길이일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 쌍 23-24개 길이일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 쌍 19-21개 길이일 수 있다. 핵산은 뉴클레오티드 쌍 21-23개 길이일 수 있다.
핵산은 19-25개의 뉴클레오티드 염기 쌍으로 이루어진 듀플렉스 영역을 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 인접할 수 있는 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개의 염기 쌍으로 이루어질 수 있다.
핵산은 서열식별번호: 17의 제1 가닥 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 서열식별번호: 18의 제2 가닥 서열을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 핵산은 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 18을 포함할 수 있다.
추가 측면에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산은 이러한 핵산일 수 있는 억제제의 부재 하에 관찰된 수준에 비교하여 적어도 15%만큼 세포에서 TMPRSS6의 발현을 감소시킬 수 있다. 이전 측면 중 임의의 것의 모든 바람직한 특색이 이러한 측면에 또한 적용된다. 특히, 세포에서의 TMPRSS6의 발현이 억제제 (이러한 핵산일 수 있음)의 부재 하에 관찰되는 것보다 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 이하, 및 중간 값으로 감소될 수 있다.
본 개시내용은 제공된 특정한 서열식별번호에 비교했을 때 2개 이하의 염기 변화를 포함하는, 본원에 개시된 바와 같은 핵산의 임의의 제1 가닥 또는 임의의 제2 가닥에 또한 관련된다. 예를 들어, 임의의 서열 내에서 1개의 염기가 변화될 수 있다.
한 실시양태에서, 변화는 안티센스 (제1) 가닥의 가장 5'인 뉴클레오티드에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 변화는 안티센스 (제1) 가닥의 가장 3'인 뉴클레오티드에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 변화는 센스 (제2) 가닥의 가장 5'인 뉴클레오티드에 이루어질 수 있다. 한 실시양태에서, 변화는 센스 (제2) 가닥의 가장 3'인 뉴클레오티드에 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 변화는 안티센스 (제1) 가닥의 가장 5'인 뉴클레오티드에 이루어진다. 5' 뉴클레오티드의 염기가 임의의 다른 뉴클레오티드로 변화될 수 있다. 5' 단부의 A 또는 U가 바람직하고, 본원에서 A 또는 U가 본원에 개시된 모든 안티센스 (제1 가닥) 서열에 대한 잠재적인 5' 말단 염기로서 교시된다.
오버행
핵산은 양쪽 단부에서 평활 말단일 수 있거나; 한쪽 단부에 오버행 및 다른쪽에 평활 말단을 가질 수 있거나; 또는 양쪽 단부에 오버행을 가질 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "오버행"은 관련 기술분야에서의 이의 일반적이고 관례적인 의미이고, 즉, 이중 가닥 핵산의 상보적 가닥의 말단 뉴클레오티드 너머로 연장된 핵산의 단일 가닥 부분이다. 용어 "평활 말단"은, 말단 뉴클레오티드(들)가 염기 쌍을 형성하는지와 관계 없이, 양쪽 가닥이 동일한 위치에서 종료되는 이중 가닥 핵산을 포함한다. 평활 말단에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오티드는 염기 쌍을 형성할 수 있다. 평활 말단에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오티드는 염기 쌍을 형성하지 않을 수 있다. 평활 말단에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 2개의 말단 뉴클레오티드는 염기 쌍을 형성할 수 있다. 평활 말단에서의 제1 가닥 및 제2 가닥의 2개의 말단 뉴클레오티드는 염기 쌍을 형성하지 않을 수 있다.
핵산은 한쪽 단부에 오버행 및 다른쪽에는 평활 말단을 가질 수 있다. 핵산은 양쪽 단부에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 양쪽 단부에서 평활 말단일 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5'-단부 및 제2 가닥의 3'-단부 또는 제1 가닥의 3'-단부 및 제2 가닥의 5'-단부에서 평활 말단일 수 있다.
핵산은 3'- 또는 5'-단부에 오버행을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 3'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 3'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 5'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 5'-오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5'-단부 및 3'-단부 양쪽에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5'-단부 및 3'-단부 양쪽에 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 5' 오버행 및 제2 가닥 상의 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 3' 오버행 및 제2 가닥 상의 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 3' 오버행 및 제2 가닥 상의 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상의 5' 오버행 및 제2 가닥 상의 5' 오버행을 가질 수 있다.
제2 가닥 또는 제1 가닥의 3'-단부 또는 5' 단부의 오버행은 1, 2, 3, 4 및 5개 길이의 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 임의적으로, 오버행은 뉴클레오티드 1 또는 2개로 이루어질 수 있고, 이는 변형되거나 또는 변형되지 않을 수 있다.
변형
비변형된 폴리뉴클레오티드, 특히 리보뉴클레오티드는 세포 뉴클레아제에 의해 분해되기 쉬울 수 있고, 따라서, 변형/변형된 뉴클레오티드가 본원에 개시된 핵산에 포함될 수 있다.
본원에 개시된 핵산의 제2 및/또는 제1 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형될 수 있다.
일반적으로 본원에 개시된 핵산의 변형은 천연 RNA 분자에 대해 고유한 시험관내 및 생체내 안정성 및 생체이용률을 포함하나 이에 제한되지는 않는 잠재적인 한계를 극복하는 것에서 강력한 도구를 제공한다. 본원에 개시된 핵산은 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 인간에서 인터페론 활성을 유도할 가능성을 또한 최소화할 수 있다. 변형은 표적 세포로의 핵산의 기능적 전달을 추가로 강화할 수 있다. 본원에 개시된 변형된 핵산은 제1 가닥 또는 제2 가닥 중 어느 하나 또는 양쪽의 하나 이상의 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드는 염기, 당 또는 포스페이트 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 리보핵산은 핵산 또는 염기의 유사체의 치환 또는 삽입에 의해 변형될 수 있다.
변형된 핵산, 특히 예컨대 변형된 RNA를 개시하는 것이 "1차" 핵산 서열, 및 또한 이러한 서열의 변형 둘 다를 제공한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 서열 목록은 1차 핵산 서열, 및 또한 변형된 서열에 대한 정보 둘 다를 제공한다. 의심의 여지를 피하기 위해, 본 개시내용은 비변형된 핵산 서열, 특히 변형이 완전히 정의되지 않은 임의의 변형된 서열 둘 다에 관한 것이다.
본원에 개시된 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 핵산은 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 듀플렉스 영역 내에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 듀플렉스 영역 외부에, 즉, 단일 가닥 영역 내에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에 있을 수 있고, 듀플렉스 영역의 외부에 있을 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에 있을 수 있고, 듀플렉스 영역의 외부에 있을 수 있다. 제1 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제2 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제1 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제2 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 1개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있거나, 또는 본원에 개시된 핵산은 약 2-4개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있거나, 또는 핵산은 약 4-6개의 변형된 뉴클레오티드, 약 6-8개의 변형된 뉴클레오티드, 약 8-10개의 변형된 뉴클레오티드, 약 10-12개의 변형된 뉴클레오티드, 약 12-14개의 변형된 뉴클레오티드, 약 14-16개의 변형된 뉴클레오티드, 약 16-18개의 변형된 뉴클레오티드, 약 18-20개의 변형된 뉴클레오티드, 약 20-22개의 변형된 뉴클레오티드, 약 22-24개의 변형된 뉴클레오티드, 24-26개의 변형된 뉴클레오티드 또는 약 26-28개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 각각의 경우에, 상기의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 동일하지만 상기의 변형된 뉴클레오티드가 없는 핵산에 비교하여 그의 활성의 적어도 50%를 유지한다. 핵산은 동일하지만 상기의 변형된 뉴클레오티드가 없는 핵산에 비교하여 그의 활성의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 또는 중간 값을 유지할 수 있거나, 또는 동일하지만 상기의 변형된 뉴클레오티드가 없는 뉴클레오티드의 활성의 100%를 초과할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 퓨린의 적어도 절반이 변형될 수 있다. 피리미딘의 적어도 절반이 변형될 수 있다. 모든 퓨린이 변형될 수 있다. 모든 피리미딘이 변형될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 3'-말단 데옥시-티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드, 2' 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-변형된 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-아미노-변형된 뉴클레오티드, 2'-알킬-변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드, 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기에 연결된 말단 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 여기서 염기는 2-아미노아데노신, 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디히드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘 (예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘 (예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘 (예를 들어, 5-브로모우리딘), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘 (예를 들어 6-메틸우리딘), 프로핀, 퀘노신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 와이부토신, 와이부톡소신, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실퀘오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 베타-D-만노실퀘오신, 우리딘-5-옥시아세트산 및 2-티오시티딘으로부터 선택된다.
본원에 논의된 핵산은 비변형된 RNA, 뿐만 아니라 예를 들어 효능을 개선하도록 변형된 RNA, 및 뉴클레오시드 대용물의 중합체를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉 당, 염기 및 포스페이트 모이어티가 천연에서 발생하는 것, 예를 들어, 인체에서 천연적으로 발생하는 것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 변형된 뉴클레오티드는 핵산의 성분, 즉 당, 염기 및 포스페이트 모이어티 중 하나 이상이 천연에서 발생하는 것과 상이한 뉴클레오티드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드로 지칭되는 경우, 이는, 변형으로 인해, 뉴클레오티드가 아닌 분자, 예를 들어, 리보포스페이트 백본이 가닥 사이의 혼성화를 허용하는 비-리보포스페이트 구축물로 교체된 폴리뉴클레오티드 분자를 당연히 포함할 것이고, 즉 변형된 뉴클레오티드는 리보포스페이트 백본을 모방한다.
핵산 내에서 일어나는 하기에 기술된 변형 중 다수, 예컨대 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형이 폴리뉴클레오티드 분자 내에서 반복될 것이다. 일부 경우에, 변형은 폴리뉴클레오티드 내의 모든 가능한 위치/뉴클레오티드에서 일어날 것이지만, 다수의 경우에 그렇지 않을 것이다. 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 일어날 수 있고, 말단 영역에서만, 예컨대 말단 뉴클레오티드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오티드에서 일어날 수 있다. 변형은 이중 가닥 영역, 단일 가닥 영역, 또는 둘 다에서 일어날 수 있다. 변형은 본원에 개시된 핵산의 이중 가닥 영역에서만 일어날 수 있거나, 또는 본원에 개시된 핵산의 단일 가닥 영역에서만 일어날 수 있다. 비-연결 O 위치의 포스포로티오에이트 변형이 한쪽 또는 양쪽 말단에서만 일어날 수 있거나, 말단 영역에서만, 예를 들어, 말단 뉴클레오티드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에서 일어날 수 있거나, 또는 듀플렉스 및/또는 단일 가닥 영역에서, 특히 말단에서 일어날 수 있다. 5' 단부 또는 3' 단부가 인산화될 수 있다.
오버행 내에 특정 염기를 포함함으로써, 또는 단일 가닥 오버행 내에, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행 내에, 또는 둘 다 내에 변형된 뉴클레오티드를 포함함으로써 본원에 개시된 핵산의 안정성이 증가될 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드가 오버행 내에 포함될 수 있다. 3' 또는 5' 오버행 내의 모든 염기 또는 일부 염기가 변형될 수 있다. 변형은 리보스 당의 2' OH 기에서의 변형을 사용하는 것, 리보뉴클레오티드 대신 데옥시리보뉴클레오티드를 사용하는 것, 및 포스페이트 기에서의 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요가 없다.
본원에 개시된 dsRNA 작용제의 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥의 5'- 또는 3'-오버행이 인산화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 오버행 영역은 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트를 갖는 2개의 뉴클레오티드를 함유하고, 여기서 2개의 뉴클레오티드는 동일하거나 또는 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, 오버행은 센스 가닥, 안티센스 가닥 또는 양쪽 가닥의 3'-단부에 존재한다. 한 실시양태에서, 이러한 3'-오버행은 안티센스 가닥에 존재한다. 한 실시양태에서, 이러한 3'-오버행은 센스 가닥에 존재한다.
뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 그러나, 핵산에 대한 화학적 변형은 개선된 성질을 부여할 수 있고, 올리고리보뉴클레오티드를 뉴클레아제에 대해 더욱 안정적이게 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 변형된 핵산은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:　
(i) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상 (본원에 개시된 핵산의 5' 및 3' 말단에 있는 경우에도 연결로 지칭됨)의 변경, 예를 들어, 교체;
(ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 히드록실의 변경, 예를 들어, 교체;　
(iii) 포스페이트 모이어티가 "데포스포" 링커로 교체되는 것;　
(iv) 천연 발생 염기의 변형 또는 교체;　
(v) 리보스-포스페이트 백본의 교체 또는 변형;　
(vi) RNA의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 교체, 또는 모이어티, 예를 들어, 형광 표지 모이어티가 RNA의 3' 또는 5' 단부에 접합되는 것.　
교체, 변형, 변경이라는 용어는 천연 발생 분자로부터의 차이를 가리킨다.
구체적인 변형이 하기에서 더욱 상세하게 논의된다.
변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로디티오에이트는 비-연결 산소 둘 다가 황으로 교체된다. 포스페이트 기 내의 1개, 각각 또는 둘 다의 비-연결 산소가 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 연결 산소가 질소 (가교 포스포로아미데이트), 황 (가교 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교 메틸렌포스포네이트)로 교체되는 것에 의해 또한 변형될 수 있다. 교체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소가 질소로 교체되는 것이 가능하다.　
변형된 뉴클레오티드는 당 기의 변형을 포함할 수 있다. 2' 히드록실 기 (OH)가 변형되거나 또는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 교체될 수 있다.
"옥시"-2' 히드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시 (OR, 예를 들어, R-H, 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; 2' 히드록실이, 예를 들어, 메틸렌 다리에 의해, 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠금" 핵산 (LNA); O-AMINE (AMINE=NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)nAMINE, (예를 들어, AMINE=NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 폴리아미노)를 포함한다.
"데옥시" 변형은 히드로겐 할로; 아미노 (예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE (AMINE=NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노), -NHC(O)R (R=알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐 (이들은 예를 들어 아미노 관능기로 임의로 치환될 수 있음)을 포함한다. 특정 실시양태의 다른 치환기는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 및 2'-플루오로를 포함한다.
당 기는 리보스 내의 상응하는 것과 반대의 입체화학 형상을 지니는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 뉴클레오티드는 아라비노스와 같은 당을 함유할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 "무염기성" 당을 또한 포함할 수 있고, 이는 C-I'의 핵염기가 결여된다. 이러한 무염기성 당은 구성성분 당 원자 중 하나 이상에서의 변형을 추가로 함유할 수 있다.
2' 변형이 하나 이상의 포스페이트 링커 변형 (예를 들어, 포스포로티오에이트)과 조합되어 사용될 수 있다.
포스페이트 기가 인을 함유하지 않은 연결 기로 교체될 수 있다.
포스페이트 기를 교체할 수 있는 모이어티의 예는 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥시드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다. 특정 실시양태에서, 교체는 메틸렌카르보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노 기를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드로 교체될 수 있다.
예는 모르폴리노, 시클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함한다. 특정 실시양태에서, PNA 대용물이 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 단부가 변형될 수 있다. 이같은 변형은 분자의 3' 단부 또는 5' 단부 또는 양쪽 단부에 있을 수 있다. 이는 전체 말단 포스페이트 또는 포스페이트 기의 원자 중 하나 이상의 변형 또는 교체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 단부가 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단 (예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기 (예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스테르를 기재로 함)와 같은 기능성 분자 실체에 접합될 수 있다. 기능성 분자 실체는 포스페이트 기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트 기의 연결 원자 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 기에 연결되거나 또는 이를 교체할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오티드 대용물 (예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결되거나 또는 이를 교체할 수 있다. 이러한 스페이서 또는 링커는, 예를 들어, -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, O(CH2CH2O)nCH2CH2OH (예를 들어, n=3 또는 6), 무염기성 당, 아미드, 카르복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디술피드, 티오우레아, 술폰아미드, 또는 모르폴리노, 또는 비오틴 및 플루오레세인 시약을 포함할 수 있다. 3' 단부는 -OH 기일 수 있다.
말단 변형의 다른 예는 염료, 인터칼레이팅제 (예를 들어, 아크리딘), 가교-링커 (예를 들어, 소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 다환식 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제 (예를 들어, EDTA), 친지성 캐리어 (예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 제라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 접합체 (예를 들어, 안테나페디아(antennapedia) 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지된 마커, 효소, 합텐 (예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 엽산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 착물)를 포함한다.
활성을 조정하는 것 또는 분해에 대한 저항성을 조정하는 것을 포함하는 다수의 이유로 말단 변형이 부가될 수 있다. 활성을 조정하는데 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체로 5' 단부가 변형되는 것을 포함한다. 제1 또는 제2 가닥 상의 본원에 개시된 핵산은 5' 인산화될 수 있거나 또는 5' 프라임 말단에 포스포릴 유사체를 포함한다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 침묵화와 상용성인 것을 포함한다. 적합한 변형은 하기를 포함한다: 5'-트리포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트 ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡 (7-메틸화 또는 비-메틸화) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡 (Appp), 및 임의의 변형 또는 비변형된 뉴클레오티드 캡 구조 (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트 (포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'; 5'-모노디티오포스페이트 (포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 교체 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가적인 조합 (예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등)), 5'-포스포르아미데이트 ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트 (R=알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5' 비닐포스포네이트, 5'-알킬에테르포스포네이트 (R=알킬에테르=메톡시메틸 (MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어, RP(OH)(O)-O-5'-).
본 개시내용의 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 단부 중 하나 이상에 하나 이상의 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 임의적으로, 제1 가닥의 각각의 단부 또는 어느 한쪽 단부가 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 임의적으로, 제2 가닥의 각각의 단부 또는 어느 한쪽 단부가 1개 또는 2개 또는 3개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 임의적으로, 제1 가닥의 양쪽 단부 및 제2 가닥의 5' 단부가 2개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드와 인접한 뉴클레오티드 사이의 연결이 표준 포스페이트 기를 대신하여 포스포로티오에이트 기를 포함한다는 것을 의미한다.
말단 변형은 분포를 모니터링하는데 또한 유용할 수 있고, 이같은 경우, 부가될 기는 형광단, 예를 들어, 플루오레세인 또는 알렉사(Alexa) 염료를 포함할 수 있다. 말단 변형은 흡수를 강화하는데 또한 유용할 수 있고, 이에 유용한 변형은 콜레스테롤을 포함한다. 말단 변형은 RNA 작용제를 또 다른 모이어티에 가교시키는데 또한 유용할 수 있다.
뉴클레오티드
아데닌, 구아닌, 시토신 및 우라실은 RNA에 발견되는 가장 통상적인 염기이다. 이러한 염기는 성질이 개선된 RNA를 제공하도록 변형 또는 교체될 수 있다. 예를 들어, 이러한 염기로 또는 합성 및 천연 핵염기 (예를 들어, 이노신, 티민, 크산틴, 하이포크산틴, 누불라린, 이소구아니신, 또는 투베르시딘) 및 상기 변형 중 어느 하나로 뉴클레아제 저항성 올리고리보뉴클레오티드가 제조될 수 있다. 대안적으로, 상기 염기 및 "만능 염기" 중 임의의 것의 치환된 또는 변형된 유사체가 사용될 수 있다. 예는 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 5-할로우라실, 5-(2-아미노프로필)우라실, 5-아미노 알릴 우라실, 8-할로, 아미노, 티올, 티오알킬, 히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환된 퓨린 (2-아미노프로필아데닌 포함), 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신, 디히드로우라실, 3-데아자-5-아자시토신, 2-아미노퓨린, 5-알킬우라실, 7-알킬구아닌, 5-알킬 시토신, 7-데아자아데닌, N6,N6-디메틸아데닌, 2,6-디아미노퓨린, 5-아미노-알릴-우라실, N3-메틸우라실, 치환된 1,2,4-트리아졸, 2-피리디논, 5-니트로인돌, 3-니트로피롤, 5-메톡시우라실, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메톡시카르보닐메틸우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 5-메톡시카르보닐메틸-2-티오우라실, 5-메틸아미노메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-카르복시프로필)우라실, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N<4>-아세틸 시토신, 2-티오시토신, N6-메틸아데닌, N6-이소펜틸아데닌, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, N-메틸구아닌, 또는 O-알킬화 염기를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "비-쌍형성 뉴클레오티드 유사체"는 6 데스 아미노 아데노신 (네불라린(Nebularine)), 4-Me-인돌, 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보T, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-에틸-dC, N3-Me dC를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-염기 쌍형성 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 비-염기 쌍형성 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 이는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "말단 관능기"는 할로겐, 알콜, 아민, 카르복실산, 에스테르, 아미드, 알데히드 케톤, 에테르 기를 비제한적으로 포함한다.
특정 모이어티가 제1 가닥 또는 제2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있고, 무염기성 리보스 모이어티, 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 변형 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 (2' O 알킬 변형 포함); 역전된 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 및 그의 변형, C6-이미노-Pi; L-DNA 및 L-RNA를 포함하는 거울상 뉴클레오티드; 5'OMe 뉴클레오티드; 및 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 유사체; 1-(β-D-에리트로푸라노실)뉴클레오티드; 4'-티오뉴클레오티드, 탄소환식 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 12-아미노도데실 포스페이트; 히드록시프로필 포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비환식 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 및 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토 모이어티를 포함한다.
본원에 개시된 핵산은 하나 이상의 역전된 뉴클레오티드, 예를 들어, 역전된 티미딘 또는 역전된 아데닌을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Takei, et al., 2002. JBC 277 (26):23800-06]을 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 발현에 관한 용어 "억제하다", "하향 조절하다" 또는 "감소시키다"는 유전자의 발현, 또는 RNA 분자 또는 하나 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 등가의 RNA 분자 (예를 들어, mRNA)의 수준, 또는 하나 이상의 단백질, 단백질 서브유닛 또는 펩티드의 활성이 본원에 개시된 핵산의 부재 하에 또는 인간 전사체에 대한 상동성이 알려져 있지 않은 siRNA 분자 (본원에서 비-침묵화 대조군으로 명명됨)와 관련하여 관찰되는 것 아래로 감소된다는 것을 의미한다. 이같은 대조군은 본원에 개시된 분자와 유사한 방식으로 접합 및 변형될 수 있고, 동일한 경로에 의해 표적 세포 내로 전달될 수 있다; 예를 들어, 발현이 본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 또는 비-침묵화 대조군의 존재 하의 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15% 또는 중간 값으로 감소될 수 있다.
본 개시내용의 핵산은 무염기성 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "무염기성"은 염기가 결여되거나 또는 1' 위치의 염기 대신에 다른 화학기, 예를 들어 3',3'-연결 또는 5',5'-연결 데옥시 무염기성 리보스 유도체를 갖는 모이어티를 지칭한다.
핵산은 제2 및/또는 제1 가닥 상에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 교대되는 뉴클레오티드는 변형되어, 변형된 뉴클레오티드를 형성할 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 교대는 규칙적인 방식으로 하나씩 하나씩 발생하는 것을 의미한다. 달리 말하면, 교대는 차례대로 반복적으로 발생하는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오티드가 변형되면, 다음의 인접한 뉴클레오티드는 변형되지 않고, 그 다음의 인접한 뉴클레오티드는 변형되는 식이다. 하나의 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형될 수 있고, 다음의 인접한 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있으며, 이어지는 인접한 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형되는 식이고, 여기서 제1 및 제2 변형은 상이하다.
본원에 개시된 핵산의 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제1 가닥은 5'에서 3'으로 번호 매겨진다. 본원에 기술된 바와 같은 용어 "홀수 번호"는 2로 나눌 수 없는 숫자를 의미한다. 홀수의 예는 1, 3, 5, 7, 9, 11 등이다. 본원에 개시된 핵산의 제1 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제1 가닥은 5'에서 3'으로 번호 매겨진다. 본원에 기술된 바와 같은 용어 "짝수 번호"는 2로 균등하게 나눌 수 있는 숫자를 의미한다. 짝수의 예는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 등이다. 본원에 개시된 핵산의 제2 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제2 가닥은 3'에서 5'으로 번호 매겨진다. 본원에 개시된 핵산의 제2 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있고, 여기서 제2 가닥은 3'에서 5'으로 번호 매겨진다.
제1 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형되어, 변형된 뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 적어도 제2 변형에 의해 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 하나 이상의 홀수 뉴클레오티드 상에서의 변형과 상이하다. 하나 이상의 변형된 짝수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 하나 이상의 변형된 홀수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나에 인접할 수 있다.
본원에 개시된 핵산에서 제1 가닥 내의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 제1 가닥 내의 복수의 짝수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 제2의 상이한 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 또한 포함할 수 있다.
제2 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 제1 가닥 상의 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형에 의해 변형될 수 있고/거나, 제2 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드와 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 하나 이상의 변형된 홀수 번호 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 변형될 수 있고/거나, 복수의 짝수 번호 뉴클레오티드는 제1 가닥 홀수 번호 뉴클레오티드 상에 존재하는 것과 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있고, 여기서 제2 변형은 제1 가닥 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 상이하다.
제2 가닥은 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 제2 변형일 수 있는 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 핵산에서, 제1 가닥 내의 각각의 홀수 번호 뉴클레오티드 및 제2 가닥 내의 각각의 짝수 번호 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 변형될 수 있고, 제1 가닥에서 각각의 짝수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 각각의 홀수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 제2 가닥의 비변형된 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드에 비교하여 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 이동된 제1 가닥의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다.
제1 가닥에서 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥에서 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥에서 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥에서 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 변형될 수 있다. 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 하나 이상 또는 각각이 제2 변형에 의해 변형될 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 한쪽 또는 양쪽 가닥 내에 변형이 교대되는 영역을 적어도 2개 포함하는 단일 또는 이중 가닥 구축물을 포함할 수 있다. 이러한 교대 영역은 약 12개 이하의 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 약 3개 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 뉴클레오티드가 교대되는 영역은 본원에 개시된 핵산의 한쪽 또는 양쪽 가닥의 말단에 위치할 수 있다. 핵산은 4개 내지 약 10개의 교대되는 뉴클레오티드를 각각의 말단 (3' 및 5')에 포함할 수 있고, 이러한 영역들은 약 5개 내지 약 12개의 인접한 비변형된 뉴클레오티드 또는 상이하게 또는 공통적으로 변형된 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드는 변형될 수 있고, 짝수 번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 제2 변형으로 또한 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드는 서로, 그리고 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드의 변형과 동일한 변형을 갖는 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제1 가닥은 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 또한 포함할 수 있다. 제2 가닥은 5' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또한 제2 가닥은 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
본원에 개시된 핵산은 공통 변형으로 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥을 포함할 수 있다. 이같은 뉴클레오티드 중 하나 이상이 제2 변형으로 변형될 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드는 인접할 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드의 변형 중 하나와 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 하나 이상의 뉴클레오티드는 제2 변형으로 또한 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 하나 이상의 뉴클레오티드는 인접할 수 있다. 제1 가닥은 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 또한 포함할 수 있다. 제2 가닥은 3' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 또한 제2 가닥은 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
제1 가닥에서는 5'에서 3'으로, 제2 가닥에서는 3'에서 5'으로 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 뉴클레오티드는 본 개시내용의 핵산을 위해 제1 가닥에서는 5'에서 3'으로, 제2 가닥에서는 3'에서 5'으로 번호 매겨진다.
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 번호 매겨진 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다.
명백하게, 제1 및/또는 제2 가닥의 길이가 뉴클레오티드 25개보다 짧으면, 예컨대 뉴클레오티드 19개이면, 20, 21, 22, 23, 24 및 25로 번호 매겨진 변형될 뉴클레오티드가 없다. 관련 기술분야의 기술자는 이에 따라 더 짧은 가닥에 적용될 상기 설명을 이해한다.
제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 공통 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 상이한 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 제1 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 비변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 제2 가닥 상의 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 비변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 달리 말하면, 예를 들어, 제2 가닥의 교대 영역 내의 모든 변형이 제1 가닥 내의 동일한 변형과 쌍형성하도록, 또는 대안적으로 하나의 가닥의 교대 영역 내의 공통 변형이 다른 가닥 내의 유사하지 않은 변형 (즉, 제2 변형 또는 추가 변형)과 쌍형성하면서 변형이 1개의 뉴클레오티드만큼 오프셋될 수 있도록 교대 뉴클레오티드는 2개의 가닥 상에서 정렬될 수 있다. 또 다른 선택권은 각각의 가닥에 유사하지 않은 변형을 갖는 것이다.
공통 변형된 뉴클레오티드가 서로 쌍형성하지 않도록, 제1 가닥 상의 변형이 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드에 비교하여 1개의 뉴클레오티드만큼 이동될 수 있다.
변형 및/또는 변형들은 각각 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 모르폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트 기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/거나, 변형된 뉴클레오티드는 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드 또는 비-천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드 중 어느 하나일 수 있다.
적어도 1개의 변형은 2'-O-메틸일 수 있고/거나 적어도 1개의 변형은 2'-F일 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 추가 변형이 제1 및/또는 제2 가닥 상에 존재할 수 있다.
본 발명 및 개시내용의 설명 전반에 걸쳐, "동일한 또는 공통 변형"은 임의의 뉴클레오티드, 즉 메틸 기 또는 플루오로 기와 같은 기로 변형된 A, G, C 또는 U에 대한 동일한 변형임을 의미한다. 이는 동일한 뉴클레오티드 상에서의 동일한 부가를 의미하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 예를 들어, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG가 모두 동일한 또는 공통 변형인 것으로 간주되고, 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG도 그러하다. 2'F 변형은 2'OMe 변형과 상이한 변형이다.
본 개시내용의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에 제시된다. 이러한 예들은 대표적이고 비제한적인 것으로 의도된다.
바람직하게는, 핵산은, 2'-O-메틸 변형 및 2'-F 변형으로 이루어진 군으로부터 각각 개별적으로 선택되는, 변형 및 제2 변형 또는 추가 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 변형일 수 있는 2'-O-메틸 (2'OMe)인 변형, 및 2'-F인 제2 변형을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 핵산은 각각의 가닥 또는 양쪽 가닥의 각각의 단부 또는 임의의 단부의 말단의 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드 내에 또는 그 사이에 존재할 수 있는 포스포로티오에이트 변형 및/또는 데옥시 변형을 또한 포함할 수 있다.
본 개시내용은, 추가 측면으로서, 서열식별번호: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442의 뉴클레오티드 서열,
또는 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314, 또는 315, 예컨대 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215의 뉴클레오티드 서열
을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서,
여기서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제1 변형에 의해 변형되고 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제2 변형에 의해 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오티드는 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제3 변형에 의해 변형되고 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이한 것인 핵산을 제공한다. 제3 및 제1 변형은 동일하거나 상이할 수 있고, 제2 및 제4 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 및 제2 변형은 서로 상이할 수 있고, 제3 및 제4 변형은 서로 상이할 수 있다.
추가 측면에서, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 제2 가닥은 서열식별번호: 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443의 뉴클레오티드 서열,
또는 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314, 또는 316의 뉴클레오티드 서열, 예컨대 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216의 뉴클레오티드 서열
을 포함하고,
여기서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제1 변형에 의해 변형되고 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제2 변형에 의해 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오티드는 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제3 변형에 의해 변형되고 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이한 것인 핵산이 제공된다. 제3 및 제1 변형은 동일하거나 상이할 수 있고, 제2 및 제4 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 제1 및 제2 변형은 서로 상이할 수 있고, 제3 및 제4 변형은 서로 상이할 수 있다. 적합하게는, 제2 가닥의 뉴클레오티드 서열이 제1 가닥에 대해 상보적이다. 제1 가닥의 뉴클레오티드는 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제1 변형에 의해 변형될 수 있고, 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제2 변형으로 변형될 수 있고, 제2 가닥은 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제2 변형으로 변형될 수 있으며, 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제1 변형으로 변형될 수 있다. 제1 변형은 2'OMe일 수 있고, 제2 변형은 2' F일 수 있다. 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있고/거나 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 변형은 표 1에 기재된 바와 같은 것들일 수 있다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥의 모든 짝수-번호 뉴클레오티드가 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수 번호 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 뉴클레오티드 이외의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되며, 여기서 제1 및 제4 변형은 바람직하게는 2'-F이고, 제2 및 제3 변형은 바람직하게는 2'-OMe이다.
본원에 개시된 핵산은 리간드에 접합될 수 있다.
일부 리간드는 엔도솜용해 성질을 가질 수 있다. 엔도솜용해 리간드는 엔도솜의 용해 및/또는 본 발명의 조성물 또는 그의 성분이 엔도솜에서 세포의 세포질로 운송되는 것을 촉진한다. 엔도솜용해 리간드는 pH 의존적 막 활성 및 융합원성을 나타내는 다가음이온성 펩티드 또는 펩티드모방체일 수 있다. 엔도솜용해 성분은 pH 변화에 반응하여 양성자화 또는 전하의 변화가 진행되는 화학기를 함유할 수 있다. 엔도솜용해 성분은 선형 또는 분지형일 수 있다.
리간드는 예를 들어 흡수를 강화하기 위한, 치료적 변형제; 예를 들어 분포를 모니터링하기 위한, 진단 화합물 또는 리포터 기; 가교제; 및 뉴클레아제-저항성 부여 모이어티를 포함할 수 있다. 일반적인 예는 지질, 스테로이드, 비타민, 당, 단백질, 펩티드, 폴리아민, 및 펩티드 모방체를 포함한다. 리간드는 천연 발생 물질, 예컨대 단백질, 탄수화물, 또는 지질을 포함할 수 있다. 리간드는 재조합 또는 합성 분자일 수 있다.
리간드는 표적화 기, 예를 들어, 세포 또는 조직 표적화제를 또한 포함할 수 있다. 표적화 리간드는 렉틴, 당단백질, 지질 또는 단백질일 수 있다.
리간드의 다른 예는 염료, 인터칼레이팅제, 가교-링커, 포르피린, 다환식 방향족 탄화수소, 인공 엔도뉴클레아제 또는 킬레이터, 친지성 분자, 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG, MPEG, 알킬, 치환된 알킬, 방사성 표지된 마커, 효소, 합텐, 수송/흡수 촉진제, 합성 리보뉴클레아제, 또는 이미다졸 클러스터를 포함한다.
리간드는 단백질, 예를 들어 당단백질 또는 펩티드일 수 있다. 리간드는 또한 호르몬 또는 호르몬 수용체일 수 있다. 이는 비-펩티드 종, 예컨대 지질, 렉틴, 탄수화물, 비타민 또는 보조인자를 또한 포함할 수 있다.
리간드는, 예를 들어, 세포의 세포골격을 파괴하는 것에 의해, 핵산이 세포 내로 흡수되는 것을 증가시킬 수 있는 약물과 같은 물질일 수 있다.
리간드는 염증 반응을 활성화시킴으로써 핵산이 세포 내로 흡수되는 것을 증가시킬 수 있다. 이같은 리간드는 종양 괴사 인자 알파 (TNF-알파), 인터루킨-1 베타, 또는 감마 인터페론을 포함한다.
리간드는 지질 또는 지질-기반 분자일 수 있다. 지질 또는 지질-기반 분자는 바람직하게는 혈청 단백질에 결합한다. 바람직하게는, 지질-기반 리간드는 인간 혈청 알부민 (HSA)에 결합한다. 지질 또는 지질-기반 분자는 접합체의 분해에 대한 저항성을 증가시킬 수 있고/거나, 표적 세포 내로의 표적화 또는 수송을 증가시킬 수 있고/거나, 혈청 단백질에 결합하는 것을 조정할 수 있다. 지질-기반 리간드는 접합체가 표적 조직에 결합하는 것을 조정하는데 사용될 수 있다.
리간드는 스테로이드일 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 콜레스테롤 또는 콜레스테롤 유도체이다.
리간드는 표적 세포에 의해 흡수되는 모이어티, 예를 들어, 비타민일 수 있다. 예시적인 비타민은 비타민 A, E, K, 및 B 비타민을 포함한다. 비타민은 증식 중인 세포에 의해 흡수될 수 있고, 이는 핵산을 세포 예컨대 악성 또는 비-악성 종양 세포로 전달하는데 유용할 수 있다.
리간드는 세포-침투 작용제, 예컨대 나선형 세포-침투 작용제일 수 있다. 바람직하게는, 이같은 작용제는 양친매성이다.
리간드는 펩티드 또는 펩티드모방체일 수 있다. 펩티드모방체는 천연 펩티드와 유사한 규정된 3차원 구조로 폴딩될 수 있는 분자이다. 펩티드 또는 펩티드모방체 리간드는 천연 발생 또는 변형 펩티드 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 펩티드 또는 펩티드모방체는 세포 침투 펩티드, 양이온성 펩티드, 양친매성 펩티드, 또는 소수성 펩티드일 수 있다. 펩티드 모이어티는 덴드리머 펩티드, 구속성 펩티드, 또는 가교 펩티드일 수 있다. 펩티드 모이어티는 소수성 막 전위 서열을 포함할 수 있다. 펩티드 모이어티는 세포 막을 가로 질러 대형 극성 분자 예컨대 펩티드, 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 운반할 수 있는 펩티드, 예를 들어 HIV Tat 단백질 (GRKKRRQRRRPPQ) 및 드로소필라(Drosophila) 안테나페디아 단백질 (RQIKIWFQNRRMKWKK)로부터의 서열일 수 있다. 바람직하게는, 펩티드 또는 펩티드모방체는 세포 표적화 펩티드, 예를 들어, 아르기닌-글리신-아스파르트산 (RGD)-펩티드이다.
리간드는 예를 들어 미생물 세포 또는 포유동물 세포에 침투할 수 있는 세포 침투 펩티드일 수 있다.
리간드는 약동학 조정제일 수 있다. 약동학 조정제는 친지체, 담즙산, 스테로이드, 인지질 유사체, 펩티드, 단백질 결합제, PEG, 비타민 등일 수 있다.
2개 이상의 리간드가 존재하는 경우, 리간드는 모두 성질이 동일할 수 있거나, 모두 성질이 상이할 수 있거나, 또는 일부 리간드는 성질이 동일한 한편 나머지는 성질이 상이할 수 있다. 예를 들어, 리간드는 표적화 성질을 갖거나, 엔도솜용해 활성을 갖거나, 또는 PK 조정 성질이 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 모든 리간드는 성질이 상이하다.
리간드는 3'-단부, 5'-단부, 및/또는 내부 위치에서 핵산에 커플링될 수 있다. 바람직하게는, 리간드는 개재 테터 또는 링커를 통해 핵산에 커플링된다.
일부 실시양태에서, 핵산은 이중 가닥 핵산이다. 이중 가닥 핵산에서, 한쪽 또는 양쪽 가닥에 리간드가 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 핵산은 센스 가닥에 접합된 리간드를 함유한다. 다른 실시양태에서, 이중 가닥 핵산은 안티센스 가닥에 접합된 리간드를 함유한다.
리간드는 핵산 분자의 핵염기, 당 모이어티, 또는 뉴클레오시드간 연결에 접합될 수 있다. 퓨린 핵염기 또는 그의 유도체에 접합되는 것은 내환 및 외환 원자를 포함하는 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 피리미딘 뉴클레오티드 또는 그의 유도체에 접합되는 것 또한 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 뉴클레오시드의 당 모이어티에 접합되는 것은 임의의 탄소 원자에서 일어날 수 있다. 뉴클레오시드간 연결에 접합되는 것은 인-함유 연결의 인 원자에서 또는 인 원자에 결합된 산소, 질소 또는 황 원자에서 일어날 수 있다. 아민- 또는 아미드-함유 뉴클레오시드간 연결의 경우, 접합은 아민 또는 아미드의 질소 원자에서 또는 인접한 탄소 원자에 일어날 수 있다.
리간드는 전형적으로 탄수화물, 예를 들어 모노사카라이드, 디사카라이드, 트리사카라이드, 테트라사카라이드 또는 폴리사카라이드이다. 리간드는 링커에 의해 핵산에 접합될 수 있다. 링커는 1가, 2가 또는 3가 분지형 링커일 수 있다.
본원에 개시된 올리고뉴클레오티드, 특히 이중 가닥 핵산이 생체 내에서 세포에 효율적으로 전달되는 것이 중요하고, 이는 특이적 표적화 및 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 실질적인 보호를 필요로 한다. 특이적 표적화를 달성하는 한 방법은 리간드를 핵산에 접합시키는 것이다. 리간드는 핵산을 필요한 표적 부위로 표적화하는 것을 돕는다. 접합된 분자가 상이한 수용체-매개 세포내이입 경로 또는 기능적으로 유사한 프로세스와 같은 메카니즘에 의해 표적 세포에 의해 흡수되기 위해, 원하는 수용체 분자에 대한 적절한 리간드를 접합시키는 것이 요구된다. 표적화 모이어티 또는 리간드는 특이적 수용체를 표적화할 수 있는 임의의 모이어티 또는 리간드일 수 있다.
예를 들어, 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)는 간세포에 고도로 풍부한 고용량 수용체이다. 3-안테나 클러스터 글리코시드의 최초의 개시 중 하나는 미국 특허 번호 US 5,885,968에서였다. 3개의 GalNAc 리간드를 갖고 포스페이트 기를 포함하는 접합체가 공지되어 있고, 문헌 [Dubber et al., 2003, Bioconjug. Chem. 2003 Jan-Feb;14(1):239-46]에 기술되어 있다. ASGP-R은 N-아세틸-D-갈락토실아민 (GalNAc)에 대해 D-Gal보다 50배 더 높은 친화력을 나타낸다.
글리코실화 단백질 또는 다른 올리고사카라이드의 말단 β-갈락토실 서브유닛을 특이적으로 인식하는 렉틴 (아시알로당단백질 수용체; ASGPR) (Weigel, P.H. et al., Biochim. Biophys. Acta. 2002 Sep 19;1572(2-3):341-63)을 발현하는 간세포가 갈락토스 또는 갈락토스아민을 약물 물질에 공유결합으로 커플링시키는 것에 의해 약물을 간에 표적화하는데 사용될 수 있다 (Ishibashi,S.; et al., J Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45):27803-6)). 또한, 표적화 단위의 반복에 의해 달성하는 다가 효과에 의해 결합 친화력이 유의하게 증가될 수 있다 (E. A. L. Biessen et al., 1995).
ASGPR은 말단 β-갈락토실 함유 당단백질의 활성 엔도솜 수송을 위한 매개물이고, 따라서 ASGPR이 세포 내로 전달되어야 하는 핵산과 같은 약물 후보의 표적화된 전달에 고도로 적합하다 (Akinc et al.).
리간드는 2가 또는 3가 또는 사량체 분지형 링커일 수 있는 링커를 통해 본원에 개시된 핵산에 부착될 수 있다.
리간드로 지칭될 수도 있는 사카라이드는 표적 세포 상의 적어도 1개의 유형의 수용체에 대한 친화력을 갖도록 선택될 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면 상에 있고, 예를 들어, 간 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)이다.
사카라이드는 N-아세틸 갈락토스아민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스로부터 선택될 수 있다. 사카라이드는 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc)일 수 있다.
따라서, 본 개시내용에서 사용하기 위한 리간드는 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 GalNAc 모이어티를 임의의 이전 측면에서 정의된 바와 같은 서열에 접합시킨다. 링커는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오티드는 본원에서 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
"GalNAc"는 통상적으로 문헌에서 N-아세틸 갈락토스아민으로 지칭되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토스아민"을 언급하는 것은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D- 갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 화합물은 β-형태인 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
리간드는 GalNAc를 포함할 수 있다.
리간드는 화학식 I의 화합물을 포함할 수 있으며:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
여기서
S는 사카라이드를 나타내며, 여기서 사카라이드는 N-아세틸 갈락토스아민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내며, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)이고;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에테르이며, 여기서 n = 1-6이고;
A는 분지 단위이고;
X3은 가교 단위를 나타내고;
여기서 본원에 개시된 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)를 통해 X3에 접합된다.
화학식 I에서, 분지 단위 "A"는 3개의 사카라이드 모이어티를 수용하기 위해 3개로 분지된다. 분지 단위는 리간드 및 핵산의 나머지 테터링된 부분에 공유결합으로 부착된다. 분지 단위는 알킬, 아미드, 디술피드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 히드록시아미노 기로부터 선택된 기를 포함하는 분지형 지방족 기를 포함할 수 있다. 분지 단위는 알킬 및 에테르 기로부터 선택된 기를 포함할 수 있다.
분지 단위 A는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00017
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00018
여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기로부터 선택된 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00019
여기서 A1은 O, S, C=O 또는 NH이고;
각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00020
.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00021
.
분지 단위는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00022
.
임의적으로, 분지 단위는 탄소 원자로만 이루어질 수 있다.
화학식 I의 화합물의 "X3" 부분은 가교 단위이다. 가교 단위는 선형이고, 분지 단위 및 핵산에 공유결합으로 결합된다.
X3은 -C1-C20 알킬렌-, -C2-C20 알케닐렌-, 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르, -C(O)-C1-C20 알킬렌-, -C0-C4 알킬렌(Cy)C0-C4 알킬렌- (여기서 Cy는 치환된 또는 치환되지 않은 5 또는 6원 시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로시클릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리를 나타냄), -C1-C4 알킬렌-NHC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)NH-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-SC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)S-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-OC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)O-C1-C4 알킬렌-, 및 -C1-C6 알킬렌-S-S-C1-C6 알킬렌-으로부터 선택될 수 있다.
X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르일 수 있다. X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C4-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르일 수 있고, 상기 (C4-C20 알킬렌)은 Z에 연결된다. X3은 -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-, 특히 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 각각의 경우에 -CH2- 기가 A에 연결된다.
리간드는 화학식 (II)의 화합물을 포함할 수 있으며:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
여기서
S는 사카라이드를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내며, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)이고;
X2는 C1-C8 알킬렌이고;
A는 하기로부터 선택된 분지 단위이고:
Figure pct00023
X3은 가교 단위이고;
여기서 본원에 개시된 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)를 통해 X3에 접합된다.
분지 단위 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00024
.
분지 단위 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00025
, 여기서 X3은 질소 원자에 부착된다.
X3은 C1-C20 알킬렌일 수 있다. 바람직하게는, X3은 -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-, 특히 -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
리간드는 화학식 (III)의 화합물을 포함할 수 있으며:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
여기서
S는 사카라이드를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내며, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)이고;
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에테르이고;
A는 분지 단위이고;
X3은 -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식의 알킬렌 에테르이고, 각각의 경우에 -CH2- 기가 A에 연결되고,
Z는 핵산이고;
X3과 Z 사이의 연결은 포스페이트 또는 티오포스페이트이다.
분지 단위는 탄소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분지 단위는 탄소이다.
X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, 및 -CH2-O-C8H16-로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
상기 측면 중 임의의 것에 대해, P가 변형된 포스페이트 기를 나타내는 경우, P는 하기에 의해 표현될 수 있다:
Figure pct00026
여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx, 및 -ORx를 나타내고, Rx는 C1-C6 알킬을 나타내며,
Figure pct00027
는 나머지 화합물의 부착을 가리킨다.
변형된 포스페이트는 산소 중 하나 이상이 교체된 포스페이트 기를 의미한다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 히드로겐 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로디티오에이트는 비-연결 산소 둘 다가 황으로 교체된다. 포스페이트 기 내의 1개, 각각 또는 둘 다의 비-연결 산소가 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트 링커는 연결 산소가 질소 (가교 포스포로아미데이트), 황 (가교 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교 메틸렌포스포네이트)로 교체되는 것에 의해 또한 변형될 수 있다. 교체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소가 질소로 교체되는 것이 가능하다.
예를 들어, Y1은 -OH를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나;
Y1은 -O-를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나;
Y1은 =O를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, -SH, -ORx, 또는 -BH3을 나타낼 수 있거나;
Y1은 =S를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, ORx 또는 -SH를 나타낼 수 있다.
관련 기술분야의 기술자는 특정한 경우에 Y1과 Y2 사이에 비편재화가 있을 것임을 이해할 것이다.
바람직하게는, 변형된 포스페이트 기는 티오포스페이트 기이다. 티오포스페이트 기는 바이티오포스페이트 (즉, Y1은 =S를 나타내고, Y2는 -S-를 나타내는 경우) 및 모노티오포스페이트 (즉, Y1은 -O-를 나타내고, Y2는 =S를 나타는 경우, 또는 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 -S-를 나타내는 경우)를 포함한다. 바람직하게는, P는 모노티오포스페이트이다. 본 발명가들은 포스페이트 기 대신 티오포스페이트 기를 갖는 접합체가 개선된 효능 및 생체내 작용 기간을 갖는다는 것을 발견하였다.
P는 또한 에틸포스페이트 (즉, Y1은 =O를 나타내고, Y2는 OCH2CH3을 나타내는 경우)일 수 있다.
사카라이드는 표적 세포 상의 적어도 1개의 유형의 수용체에 대한 친화력을 갖도록 선택될 수 있다. 특히, 수용체는 포유동물 간 세포의 표면 상에 있고, 예를 들어, 간 아시알로당단백질 수용체 (ASGP-R)이다.
상기 측면 중 임의의 것에 대해, 사카라이드는 갈락토스아민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스 중 하나 이상을 갖는 N-아세틸로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 사카라이드는 2개의 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc) 분자이다. 본원에 개시된 화합물은 3개의 리간드를 가질 수 있고, 이들은 각각 바람직하게는 N-아세틸 갈락토스아민이다.
"GalNAc"는 통상적으로 문헌에서 N-아세틸 갈락토스아민으로 지칭되는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭한다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토스아민"을 언급하는 것은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D- 갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. 특정 실시양태에서, β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 개시된 화합물은 β-형태인 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
Figure pct00028
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스
Figure pct00029
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스
Figure pct00030
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스
상기 화학식 (III)의 화합물 중 임의의 것에 대해, X1은 (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-일 수 있다. 바람직하게는, X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-이다. 대안적으로, X1은 C3-C6 알킬렌을 나타낸다. X1은 프로필렌일 수 있다. X1은 부틸렌일 수 있다. X1은 펜틸렌일 수 있다. X1은 헥실렌일 수 있다. 바람직하게는, 알킬은 선형 알킬렌이다. 특히, X1은 부틸렌일 수 있다.
화학식 (III)의 화합물에 대해, X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에테르, 즉 C3 알콕시 메틸렌, 또는 -CH2CH2CH2OCH2-를 나타낸다.
본 개시내용은 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산을 제공한다:
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
여기서 Z는 본원에서 이전 또는 이후에 정의된 바와 같은 핵산이다.
하기 구조 중 하나를 갖는 핵산이 바람직하고:
Figure pct00036
Figure pct00037
여기서 Z는 본원에서 이전 또는 이후에 정의된 바와 같은 핵산이지만, 이러한 2가지 구조 중 첫번째 구조의 핵산이 특히 바람직하다.
본 개시내용은, 또 다른 측면으로서, 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 세포에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442
로부터 선택되거나, 또는
서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314, 또는 315,
예컨대 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215
로부터 선택된
뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 핵산은 링커를 통해 간접적으로 또는 직접적으로 리간드에 접합되는 것인
핵산을 제공한다.
제2 가닥은 서열식별번호: 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443의 뉴클레오티드 서열, 또는
서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314, 또는 316으로부터 선택된,
예컨대 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216으로부터 선택된
뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
핵산은 본원에 기술된 바와 같이 리간드에 접합될 수 있다.
제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같이 변형될 수 있다.
바람직하게는, 핵산은 화학식 I (상기 기재된 바와 같음), 특히 도 8a에 제시된 화학식의 리간드에 접합된 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 18을 포함하고, 여기서 제1 가닥은 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 2'OMe 변형으로 변형되고 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 2'F로 변형되고, 제2 가닥은 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 2'OMe로 변형되고 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 2'F로 변형된다.
더욱 바람직하게는, 핵산은 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 18을 포함하고, 여기서 핵산은 화학식 I의 리간드 (상기 기재된 바와 같음)에 접합되고, 추가로 핵산은 본원에서 제공된 바와 같은 표 1의 발췌물인 하기 제시된 바와 같은 변형 패턴을 갖는다.
Figure pct00038
여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
리간드는 GalNAc를 포함할 수 있고, 도 8a 또는 도 8b 또는 도 8c가 본 발명을 추가로 도해한다.
다른 바람직한 핵산이 상기 및 하기에서 열거된다.
절단성 연결 기는 세포 밖에서는 안정적이지만 표적 세포 내로의 진입 시 절단되는 링커이다. 절단은 링커가 함께 잡고 있는 2개의 부분을 방출한다.
바람직한 실시양태에서, 본원에 개시된 핵산은 표적 세포에서 또는 제1 기준 조건 (예를 들어, 세포내 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음) 하에 대상체의 혈액 또는 제2 기준 조건 (예를 들어, 혈액 또는 혈청에서 발견되는 조건을 모방하거나 나타내도록 선택될 수 있음)보다 적어도 10배 이상, 바람직하게는 적어도 100배 더 빠르게 절단되는 절단성 연결 기를 포함한다.
절단성 연결 기는 절단 작용제, 예를 들어 pH, 산화환원 전위, 또는 분해성 분자의 존재에 대해 감수성이다. 분해성 분자는 산화 또는 환원 효소, 환원제 (예컨대 메르캅탄), 에스테라제, 엔도솜, 또는 산성 환경을 생성시킬 수 있는 작용제, 일반적인 산으로서 작용함으로써 산 절단성 연결 기를 가수분해하거나 절단할 수 있는 효소, 펩티다제 및 포스파타제를 포함한다.
절단성 연결 기는 디술피드 결합일 수 있고, 이는 pH에 대해 감수성이다.
링커는 특정 효소에 의해 절단될 수 있는 절단성 연결 기를 포함할 수 있다. 링커 내로 혼입된 절단성 연결 기의 유형은 표적 세포에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 간 세포가 표적인 경우에 에스테르 기를 포함하는 링커가 바람직하다. 펩티다제가 풍부한 세포, 예컨대 간 세포 및 윤활막세포를 표적화하는 경우에 펩티드 결합을 함유하는 링커가 사용될 수 있다.
일반적으로, 분해성 작용제 (또는 조건)가 후보 연결 기를 절단하는 능력을 테스트함으로써 후보 절단성 연결 기의 적합성을 평가할 수 있다. 혈액에서 또는 다른 비-표적 조직과 접촉될 때 절단에 저항하는 능력에 대해 후보 절단성 연결 기를 또한 테스트하는 것이 또한 바람직할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 유용한 후보 화합물은 세포에서 (또는 세포내 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건 하에) 혈액 또는 혈청 (또는 세포외 조건을 모방하도록 선택된 시험관내 조건)에 비교하여 적어도 2, 4, 10 또는 100배 더 빠르게 절단된다.
한 측면에서, 절단성 연결 기는 산화환원 절단성 연결 기일 수 있다. 산화환원 절단성 연결 기는 디술피드 연결 기일 수 있다.
한 측면에서, 연결 기는 포스페이트-기반 절단성 연결 기일 수 있다. 바람직한 실시양태는 -O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-이다. 바람직한 실시양태는 -O-P(O)(OH)-O-이다.
한 측면에서, 절단성 연결 기는 산 절단성 연결 기일 수 있다. 바람직하게는, 산 절단성 연결 기는 pH가 6.5 이하인 환경에서 절단되거나, 또는 일반적인 산으로서 작용할 수 있는 작용제 예컨대 효소에 의해 절단된다. 산 절단성 연결 기의 예는 히드라존, 에스테르, 및 아미노산의 에스테르를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 산 절단성 기는 일반 화학식이 -C=NN-; C(O)O, 또는 -OC(O)일 수 있다. 바람직한 실시양태는 에스테르의 산소에 부착된 탄소 (알콕시 기)가 아릴 기, 치환된 알킬 기, 또는 3차 알킬 기 예컨대 디메틸 펜틸 또는 t-부틸인 연결 기이다.
한 실시양태에서, 절단성 연결 기는 에스테르-기반 절단성 연결 기일 수 있다. 에스테르-기반 절단성 연결 기의 예는 알킬렌, 알케닐렌 및 알키닐렌 기의 에스테르를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 절단성 연결 기는 펩티드-기반 절단성 연결 기일 수 있다. 펩티드-기반 절단성 연결 기는 올리고펩티드 (예를 들어, 디펩티드, 트리펩티드 등) 및 폴리펩티드가 산출되도록 아미노산들 사이에 형성된 펩티드 결합이다. 일반적으로 펩티드 기반 절단 기는 펩티드 및 단백질이 산출되는 아미노산들 사이에 형성된 펩티드 결합 (즉, 아미드 결합)에 제한되고, 전체 아미드 관능기를 포함하지 않는다. 펩티드-기반 절단성 연결 기는 일반 화학식이 -NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)- (여기서 RA 및 RB는 2개의 인접한 아미노산의 R 기임)이다.
본원에 기술된 바와 같은 핵산은 리포솜의 형태로 지질과 함께 제형될 수 있다. 이같은 제형은 관련 기술분야에서 리포플렉스로 기술될 수 있다. 지질/리포솜의 제형은 본원에 개시된 핵산을 표적 세포에 전달하는 것을 보조하는데 사용될 수 있다. 본원에 기술된 지질 전달 시스템은 접합된 리간드에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 핵산을 지질 전달 시스템 또는 리간드 접합체 전달 시스템과 함께 사용할 때 본원에 기술된 변형이 존재할 수 있다.
이같은 리포플렉스는 하기를 포함하는 지질 제형을 포함할 수 있다:
i) 양이온성 지질, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질;
iv) PEG화 지질.
양이온성 지질은 아미노 양이온성 지질일 수 있다.
양이온성 지질은 화학식 (IV):
Figure pct00039
또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있고,
여기서
X는 O, S 또는 NH를 나타내고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C4-C22 선형 또는 분지형 알킬 사슬 또는 하나 이상의 이중 결합을 갖는 C4-C22 선형 또는 분지형 알케닐 사슬을 나타내고, 알킬 또는 알케닐 사슬은 임의적으로 개재 에스테르, 아미드 또는 디술피드를 함유하고;
X가 S 또는 NH를 나타내는 경우, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 모노- 또는 폴리아민 모이어티를 나타내거나, 또는 R3 및 R4가 함께 헤테로시클릴 고리를 형성하고;
X가 O를 나타내는 경우, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 모노- 또는 폴리아민 모이어티를 나타내거나, 또는 R3 및 R4가 함께 헤테로시클릴 고리를 형성하거나, 또는 R3은 수소를 나타내고 R4는 C(NH)(NH2)를 나타낸다.
양이온성 지질은 화학식 (V):
Figure pct00040
또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다.
양이온성 지질은 화학식 (VI):
Figure pct00041
또는 그의 제약상 허용되는 염일 수 있다.
양이온성 지질 성분의 함량은 제형의 총 지질 함량의 약 55 mol% 내지 약 65 mol%일 수 있다. 특히, 양이온성 지질 성분은 제형의 총 지질 함량의 약 59 mol%이다.
제형은 스테로이드를 추가로 포함한다. 스테로이드는 콜레스테롤일 수 있다. 스테로이드의 함량은 지질 제형의 총 지질 함량의 약 26 mol% 내지 약 35 mol%일 수 있다. 더욱 특히, 스테로이드의 함량은 지질 제형의 총 지질 함량의 약 30 mol%일 수 있다.
포스파티딜에탄올아민 인지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DMPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLoPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (POPE), 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE), 1,2-디스쿠알레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSQPE) 및 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (SLPE)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 인지질의 함량은 제형의 총 지질 함량의 약 10 mol%일 수 있다.
PEG화 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG) 및 C16-세라마이드-PEG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PEG화 지질의 함량은 제형의 총 지질 함량의 약 1 내지 5 mol%일 수 있다.
제형 내의 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 제형의 총 지질 함량의 약 55 mol% 내지 약 65 mol%, 바람직하게는 지질 제형의 총 지질 함량의 약 59 mol%일 수 있다.
제형은 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; 및 65:24:10:1로부터 선택된 i):ii):iii):iv)의 성분의 몰비를 가질 수 있다.
제형은 하기를 포함할 수 있다:
하기 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00042
하기 구조를 갖는 스테로이드:
Figure pct00043
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질:
Figure pct00044
및 하기 구조를 갖는 PEG화 지질:
Figure pct00045
예를 들어, 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터, 중성 리포솜 조성물이 형성될 수 있다. 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 음이온성 리포솜 조성물이 형성될 수 있는 한편, 음이온성 융합원성 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)으로부터 형성될 수 있다. 예를 들어, 대두 PC, 및 난 PC와 같은 포스파티딜콜린 (PC)으로부터 또 다른 유형의 리포솜 조성물이 형성될 수 있다. 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 또 다른 유형이 형성된다.
양으로 하전된 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)를 사용하여, 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 하전된 지질과 융합될 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하도록 핵산과 자발적으로 상호작용하는 소형 리포솜을 형성시킬 수 있다. DOTMA 유사체 또한 리포솜을 형성시키는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 지질의 유도체 및 유사체 또한 리포솜을 형성시키는데 사용될 수 있다.
핵산을 함유하는 리포솜은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 예에서, 리포솜의 지질 성분이 세제에 용해되어, 지질 성분과 함께 미셀이 형성된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 임계 미셀 농도가 높을 수 있고, 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트, 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 그 후, 핵산 제제를 지질 성분을 포함하는 미셀에 첨가한다. 지질 상의 양이온성 기가 핵산과 상호작용하고, 핵산 주변에서 응축되어 리포솜을 형성한다. 응축 후, 예를 들어, 투석에 의해, 세제를 제거하여 핵산의 리포솜 제제를 산출시킨다.
필요하다면, 응축을 보조하는 담체 화합물이, 예를 들어, 제어 첨가에 의해, 응축 반응 동안 첨가될 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 중합체 (예를 들어, 스퍼민 또는 스퍼미딘)일 수 있다. 응축을 유리하게 하기 위해 pH 또한 조정될 수 있다.
핵산 제형은 계면활성제를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 계면활성제를 포함하는 에멀션으로서 제형된다.
이온화되지 않는 계면활성제는 비-이온성 계면활성제이다. 예는 비-이온성 에스테르, 예컨대 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르 등, 비이온성 알칸올아미드, 및 에테르 예컨대 지방 알콜, 에톡실레이트, 프로폭시화 알콜, 및 에톡시화/프로폭시화 블럭 중합체를 포함한다.
물에 용해 또는 분산될 때 음성 전하를 보유하는 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 예는 카르복실레이트, 예컨대 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르 예컨대 알킬 술페이트 및 에톡시화 알킬 술페이트, 술포네이트 예컨대 알킬 벤젠 술포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 술포숙시네이트, 및 포스페이트를 포함한다.
물에 용해 또는 분산될 때 양성 전하를 보유하는 계면활성제는 양이온성 계면활성제이다. 예는 4차 암모늄 염 및 에톡시화 아민을 포함한다.
양전하 또는 음전하를 보유하는 능력을 갖는 계면활성제는 양쪽성 계면활성제이다. 예는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
"미셀"은 분자의 모든 소수성 부분이 안쪽을 향하여, 친수성 부분이 주변의 수성 상과 접촉하게 하도록 양친매성 분자들이 구형 구조로 배열되어 있는 특정 유형의 분자 어셈블리로서 본원에서 정의된다. 환경이 소수성이면 반대 배열이 존재한다. 핵산의 수성 용액, 알칼리금속 알킬 술페이트, 및 적어도 하나의 미셀 형성 화합물을 혼합함으로써 미셀이 형성될 수 있다.
예시적인 미셀 형성 화합물은 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 제약상 허용되는 염, 글리콜산, 락트산, 캐모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 멘톨, 트리히드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그의 제약상 허용되는 염, 글리세린, 폴리글리세린, 라이신, 폴리라이신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그의 유사체, 폴리도카놀 알킬 에테르 및 그의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 이들의 혼합물을 포함한다.
혼합된 미셀 조성물에 페놀 및/또는 m-크레졸이 첨가되어 안정화제 및 방부제로서 작용할 수 있다. 등장성 작용제 예컨대 글리세린이 첨가될 수 있다.
입자 예컨대 마이크로입자 내로 핵산 제제가 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무-건조, 동결건조, 증말, 유동층 건조, 진공 건조, 또는 이러한 방법들의 조합에 의해 생산될 수 있다.
철 킬레이터
철 킬레이트화 요법은 철 과부하를 감소시키는데 사용된다. 철은 상이한 조직에서 상이한 속도로 제거된다. 킬레이트화 요법의 목표는 과량의 철의 축적 및 그의 합병증 예컨대 간 내분비학적 및 심장 기능장애를 방지하는 것이다. 몇몇 철 킬레이터가 복합체를 형성하는 것에 의해 소변 또는 대변을 통해 조직 철을 배출하도록 디자인되었다.
1. 데프록사민: 이것은 β-지중해빈혈 및 기타 철 과부하 질환에서의 장기적인 철 킬레이화 요법에 효과적인 임상적으로 승인된 킬레이터이다. 이의 짧은 혈장 반감기로 인해, 이는 효과적이기 위해 연속적인 정맥내 또는 피하 주입에 의해 제공된다.
2. 데페리프론: 이것은 일반적으로 하루에 3회 복용되는 경구 킬레이터이다.
3. 데페라시록스 (엑스자이드): 이것은 반감기가 연장된 또 다른 경구 철 킬레이터이다. 이는 매일 사용용으로 처방된다.
4. 데페라시록스 (자데누): 이것은 데페라시록스 (엑스자이드)와 상이한 제형의 필름 코팅 정제이다. 이점은 가벼운 식사와 함께 복용될 수 있다는 것이다.
본 개시내용의 맥락에서의 바람직한 철 킬레이터는 데페리프론이다.
상이한 킬레이터는 상이한 스펙트럼의 부작용, 데페록사민에 의한 주사 부위 반응, 데페록사민 및 데페라시록스에 의한 신부전, 데페리프론으로의 관절통 및 호중구감소증이 있다. 위장 장애는 모든 클래스의 킬레이터에 의해 보고되는 부작용이다. 킬레이트화 요법에 대한 환자 순응이 계속 문제이지만, 경구로 복용될 수 있는 철 킬레이터의 이용가능성으로 개선되었다 (문헌 [Chalmers AW, Shammo JM. 2016. 'Evaluation of a new tablet formulation of deferasirox to reduce chronic iron overload after long-term blood transfusions', Ther Clin Risk Manag, 12: 201-8]; 및 [Mobarra N, Shanaki M, Ehteram H, Nasiri H, Sahmani M, Saeidi M, Goudarzi M, Pourkarim H, Azad M. 2016. 'A Review on Iron Chelators in Treatment of Iron Overload Syndromes', Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 10: 239-47]).
특히 혈색소증 치료를 위해, 킬레이터 및 TMPRSS6를 억제하는 siRNA의 본 발명의 조합물을 사용하는 것의 한 이점은 조합 치료가 간의 철 수준을 신속하게, 그리고 효율적으로 감소시킬 수 있다는 것이다 (실시예 47 참조). 초기의 조합 치료 후, 킬레이터 용량의 양이 극적으로 감소될 수 있고, 필요에 따라, 그리고 필요한 경우에 킬레이터가 보충되면서 본질적으로 siRNA로만 치료가 계속될 수 있다. 이것은 환자가 철 킬레이터로부터 경험하는 부작용으로 인해 환자에게 매우 이롭다. 따라서, 본 발명의 한 측면은 본원에 기술된 바와 같은 핵산 및 철 킬레이터가 제1 치료 단계에서 조합되어 투여되고, 제1 단계에 비교하여 제2 치료 단계에서 철 킬레이터의 투여량이 강하게 감소되는 것인, 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물, 사용을 위한 조성물 또는 치료 방법이다. 이러한 맥락에서 강하게 감소된다는 것은 제1 단계와 제2 단계의 유사한 양의 시간 사이에 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 더욱 바람직하게는 적어도 70%, 가장 바람직하게는 적어도 80%만큼 감소된다는 것을 의미한다. 제1 단계의 기간은 바람직하게는 3주 이하, 더욱 바람직하게는 2주 이하이다.
본 발명은 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 제약 조성물을 또한 제공한다. 이러한 제약 조성물은 의약으로서 또는 진단제로서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 또는 접합된 핵산 및/또는 철 킬레이터는 전달 비히클 (예를 들어, 리포솜) 및 부형제, 예컨대 담체, 희석제와 조합될 수 있다. 다른 작용제 예컨대 방부제 및 안정화제가 또한 첨가될 수 있다. 핵산 전달을 위한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있고, 관련 기술분야의 기술자의 지식 내에 속한다.
핵산 또는 접합된 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터는 별개로, 순차적으로 또는 동시에, 예를 들어, 조합된 단위 용량으로서 투여될 수 있다.
본 개시내용의 맥락에서의 조합물은 반드시 2개의 요소 (예컨대 핵산 및 킬레이터)가 단일 조성물에서 조합된다는 것을 의미하지는 않는다는 것을 주지하여야 한다. 오히려, 바람직하게는 이는 2개의 요소, 예컨대 핵산 및 킬레이터가 양쪽 요소에 대해 동시에 또는 서로 짧은 기간 이내에 발생할 수 있는 조합 투여를 위한 것임을 의미한다. 짧은 기간은 바람직하게는 1주일이지만, 더욱 바람직하게는 6일, 더욱 바람직하게는 5일, 더욱 바람직하게는 4일, 더욱 바람직하게는 3일, 더욱 바람직하게는 2일, 더욱 바람직하게는 1일, 가장 바람직하게는 1일 미만, 예컨대 12시간, 6시간, 4시간, 2시간 또는 1시간이다.
하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 핵산 또는 접합된 핵산은 별개로 또는 동시에, 예를 들어, 조합된 단위 용량으로서 투여되는 다른 치료 화합물과 조합되어 투여될 수도 있다. 본 발명은 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 완충제 등 내에 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 제약 조성물을 또한 포함한다. 본 발명은 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 완충제 등 내의 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 제약 조성물, 및 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 완충제 등 내의 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 제약 조성물을 또한 포함한다.
제약 조성물은 고체 또는 액체 형태의 투여를 위해 특별하게 제형될 수 있다. 조성물은 경구 투여, 비경구 투여 (예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내, 또는 경막외 주사를 포함함), 국소 적용, 질내 또는 직장내 투여, 설하 투여, 안구 투여, 경피 투여, 또는 비강 투여용으로 제형될 수 있다. 피하 또는 정맥내 방법을 사용하는 전달이 바람직하다.
한 실시양태에서, 단위 용량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/체중 kg의 핵산 또는 접합된 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 용량은 10 mg/kg 내지 25 mg/체중 kg, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/체중 kg, 또는 0.05 mg/kg 내지 5 mg/체중 kg, 또는 0.1 mg/kg 내지 5 mg/체중 kg, 또는 0.1 mg/kg 내지1 mg/체중 kg, 또는 0.1 mg/kg 내지 0.5 mg/체중 kg, 또는 0.5 mg/kg 내지 1 mg/체중 kg일 수 있다. 다른 파라미터, 예를 들어, 체표면적을 통해 투여량 수준이 계산될 수도 있다.
제약 조성물은 주사용 멸균 수성 현탁액 또는 용액 또는 동결건조 형태일 수 있다. 한 실시양태에서, 제약 조성물은 동결건조된 리포플렉스 또는 리포플렉스의 수성 현탁액을 포함할 수 있다. 리포플렉스는 바람직하게는 본원에 개시된 핵산을 포함한다. 이같은 리포플렉스는 시험관 내에서 또는 생체 내에서 본원에 개시된 핵산을 표적 세포에 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 및 의약은 제약상 유효 용량으로 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 유인원, 원원류, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 래트, 햄스터, 고슴도치 및 기니 피그, 또는 다른 관련 종으로부터 선택될 수 있다. 이를 기반으로 하여, 본원에서 사용된 바와 같은 "TMPRSS6"이라는 표현은 상기 언급된 종 중 임의의 것의 핵산 또는 단백질을 나타내지만, 바람직하게는 이러한 표현은 인간 핵산 또는 단백질을 나타낸다.
본 발명의 추가 측면은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 핵산 또는 본원에 개시된 핵산을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 질환 또는 장애는 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증 및 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증 및 수혈성 철 과부하를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 장애는 철 과부하와 연관될 수 있고, 철 과부하와 연관된 장애는 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조일 수 있다. 바람직하게는, 장애는 혈색소증이다.
특히, 본 발명의 바람직한 측면은 하기 중 하나 이상 또는 이들 모두에서의 사용을 위한 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 바와 같은 임의의 핵산을 포함한다:
(i) 임의적으로, 본원의 방법에 의해 개시된 바와 같이 헤모글로빈 또는 적혈구용적률에서의 증가 또는 망상적혈구에서의 감소에 의해 적합하게 결정되는, 빈혈의 치료; 및/또는
(ii) 임의적으로, 본원의 방법에 의해 개시된 바와 같이 비장 크기 (중량 기준)에서의 감소에 의해 결정되는, 비장비대의 감소; 및/또는
(iii) 임의적으로, 본원에 기술된 바와 같이 FACS 분석에 의해 결정되는 비장 내의 미성숙 적혈구계 세포의 상대적인 비율에서의 감소에 의해 결정되는, 비장에서의 무효 적혈구생성의 호전; 및/또는
(iv) 임의적으로, 본원에 기술된 바와 같이 FACS 분석에 의해 결정되는 적혈구계 전구 세포의 상대적인 비율에서의 감소 또는 제핵 적혈구계 세포에서의 증가에 의해 결정되는, 골수에서의 적혈구 성숙/적혈구생성의 개선;
(v) 혈색소증의 치료;
(vi) 철 과부하의 치료.
본 발명은 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 완충제 등 내의 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 하나 이상의 본원에 개시된 RNAi 분자를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
본 발명은 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 완충제 등 내의 하나 이상의 본원에 개시된 RNAi 분자를 포함하는 제약 조성물, 및 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 방부제, 희석제, 완충제 등 내의 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.
제약 조성물은 주사용 멸균 수성 현탁액 또는 용액 또는 동결건조 형태일 수 있다.
제약상 허용되는 조성물은 단독으로 취해지거나 또는 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제와 함께 제형된 치료적 유효량의 본 발명에 따른 임의의 실시양태에서의 하나 이상의 핵산(들)을 포함할 수 있다.
제약상 허용되는 담체로서의 역할을 할 수 있는 물질의 예는 (1) 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로스 및 그의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 윤활제, 예컨대 황산마그네슘, 소듐 라우릴 술페이트 및 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약용 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; (15) 알긴산; (16) 발열원이 없는 물; (17) 등장성 염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알콜; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스테르, 폴리카르보네이트 및/또는 폴리안히드리드; (22) 벌크화제, 예컨대 폴리펩티드 및 아미노산, (23) 혈청 성분, 예컨대 혈청 알부민, HDL 및 LDL; 및 (22) 제약 제형에서 사용되는 다른 비-독성 상용성 물질을 포함한다.
안정화제는 핵산 작용제를 안정화시키는 작용제, 예를 들어, 핵산과 복합체를 이룰 수 있는 단백질, 킬레이터 (예를 들어 EDTA), 염, RNAse 억제제, 및 DNAse 억제제일 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 연장하기 위해 피하 또는 근육내 주사로부터의 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 수 용해성이 불량한 결정질 또는 무정형 물질의 액체 현탁액을 사용함으로써 달성될 수 있다. 그러면 약물의 흡수 속도가 그의 용해 속도에 좌우되고, 차례로 이것은 결정 크기 및 결정질 형태에 좌우될 수 있다. 대안적으로, 비경구 투여 약물 형태의 흡수 지연은 약물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다.
본원에 기술된 핵산은 TMPRSS6의 발현을 억제할 수 있다. 본원에 기술된 핵산은 세포에서 TMPRSS6의 발현을 부분적으로 억제할 수 있다. 억제는 완전할 수 있고, 즉, 본원에 개시된 핵산의 부재 하의 TMPRSS6 발현의 발현 수준의 0%일 수 있다. TMPRSS6 발현의 억제는 부분적일 수 있고, 즉 이는 본원에 개시된 핵산의 부재 하의 TMPRSS6 발현의 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%일 수 있다. 억제는 대상체, 예컨대 인간 대상체에서 사용될 때 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 또는 최대 6개월까지 지속될 수 있다. 본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산, 또는 이를 포함하는 조성물은 주 1회 또는 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다 또는 8주마다의 치료를 포함하는 요법에서 또는 투약 빈도가 다양한 요법 예컨대 상기 언급된 간격의 조합에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 핵산은 피하, 정맥내, 또는 임의의 다른 적용 경로 예컨대 경구, 직장 또는 복막내 사용을 위한 것일 수 있다.
본원에 개시된 핵산으로 치료되거나 또는 본 발명의 핵산이 제공된 세포 및/또는 대상체에서, TMPRSS6 발현이 미치료 세포 및/또는 대상체에 비교하여 15%에서 100%까지의 범위만큼, 그러나 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100%만큼 억제될 수 있다. 이러한 억제 수준은 TMPRSS6 발현 또는 과발현과 연관된 질환의 치료를 허용할 수 있거나, 또는 TMPRSS6 유전자 산물의 기능에 대한 추가 조사를 허용할 수 있다.
본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산으로 치료된 세포 및/또는 대상체에서의 헵시딘 유전자 발현이 TMPRSS6 유전자 발현의 완전한 억제 또는 부분적 억제로 인해 미치료 세포 및/또는 대상체에 비교하여 적어도 약 1.2배, 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 또는 약 5배만큼 증가될 수 있다. 이는 본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산으로 치료된 대상체에서의 혈청 헵시딘 농도가 미치료 대상체에 비교하여 적어도 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 250%, 약 300%, 또는 약 500%만큼 증가될 수 있는 것에 이를 수 있다.
본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산으로 치료된 대상체에서의 혈청 또는 혈장 철 농도가 미치료 대상체에 비교하여 적어도 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%만큼 감소될 수 있다. 트랜스페린 포화는 철에 결합된 트랜스페린의 양을 측정하는 의학 실험실 테스트이다. 백분율로 측정된 트랜스페린 포화는 총 트랜스페린 철-결합 용량으로 나눈 혈청 철의 값을 측정하는 의학 실험실 값이다. 본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산으로 치료된 대상체에서의 트랜스페린 포화는 미치료 대상체에 비교하여 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%만큼 감소될 수 있다.
본 발명의 추가 측면은 질환 또는 장애, 예컨대 상기 열거된 바와 같은 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 핵산에 관한 것이다.
하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 제약 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애, 예컨대 상기 언급된 것들을 치료 또는 예방하는 방법이 본 발명에 또한 포함된다. 조성물은 주 2회, 주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다 또는 8주마다 투여될 수 있다. 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 핵산 또는 접합된 핵산은 피하, 정맥내, 또는 다른 적용 경로 예컨대 경구, 직장 또는 복막내 사용을 위한 것일 수 있다. 핵산 또는 접합된 핵산은 둘 다를 포함하는 단일 조성물로서, 또는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해, 동일한 또는 상이한 투여량으로, 그리고 동일한 또는 상이한 투여량 빈도로 별개로 투여되는 상이한 조성물들에서 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 초기 용량 및 하나 이상의 유지 용량의 핵산 작용제가 대상체에게 투여된다. 유지 용량 또는 용량들은 초기 용량과 동일하거나 또는 이보다 낮을 수 있고, 예를 들어, 초기 용량의 절반 미만일 수 있다. 유지 용량은, 예를 들어, 2, 5, 10, 또는 30일마다 1회 이하로 투여된다. 이러한 치료 요법은 특정 질환의 성질, 그의 중증도 및 환자의 전반적인 상태에 따라 변할 기간 동안 지속될 수 있다. 대상체는 siRNA와 조합된 킬레이터를 siRNA로의 치료 전반에 걸쳐 또는 siRNA로의 치료의 일부에 대해서만 투여받을 수 있다. siRNA와 조합되어 투여되는 킬레이터의 투여량은 대상체의 특정한 요구에 대해 적합화될 수 있다. 대상체의 요구는 예를 들어 조합 치료의 필요성을 지시하는 간 철 수준 또는 다른 마커의 치수를 기반으로 결정될 수 있다.
한 실시양태에서, 조성물은 복수의 핵산 작용제 종을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 작용제 종은 천연 발생 표적 서열과 관련하여 또 다른 종에 대해 중첩되지 않고 인접하지 않은 서열을 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 복수의 핵산 작용제 종은 상이한 천연 발생 표적 유전자들에 대해 특이적이다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 작용제는 대립유전자 특이적이다.
하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 별개로 또는 동시에, 예를 들어 조합된 단위 용량으로서 투여되는 다른 치료 화합물와 조합되어 투여될 수 있거나 또는 이와 조합되어 사용하기 위한 것일 수 있다.
하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본 개시내용의 핵산 또는 접합된 핵산은 화학적 합성 또는 시험관 내에서 (예를 들어, 런 오프 전사) 또는 생체 내에서 핵산을 발현시키는 것을 포함하는 관련 기술분야의 일상적인 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 고체 상 화학적 합성을 사용하거나 또는 바이러스 유도체 또는 부분적으로 합성이거나 또는 완전히 합성인 발현 시스템을 포함하는 핵산-기반 발현 벡터를 사용한다. 한 실시양태에서, 발현 벡터를 사용하여, 시험관 내에서, 중간체 숙주 생물 또는 세포 유형 내에서, 중간체 또는 최종 생물 내에서, 또는 원하는 표적 세포 내에서 본원에 개시된 핵산을 생산할 수 있다. 본원에 기술된 핵산의 생산 (합성 또는 효소에 의한 전사)을 위한 방법이 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 핵산이 비닐-(E)-포스포네이트 변형, 예컨대 5' 비닐-(E)-포스포네이트 변형, 바람직하게는 제1 가닥의 제2 위치의 2'-F 변형과 조합된 5' 비닐-(E)-포스포네이트 변형을 포함하는, 본원의 임의의 개시내용에 따른 임의의 핵산, 접합된 핵산, 사용을 위한 핵산, 방법, 조합물, 사용을 위한 조합물, 키트, 조성물 또는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 제1 가닥 및 제2 가닥 중 적어도 1개의 3' 단부의 말단 뉴클레오티드가 역전된 뉴클레오티드이고, 말단 뉴클레오티드의 3' 탄소 및 인접한 뉴클레오티드의 3' 탄소를 통해 인접한 뉴클레오티드에 부착되고/거나, 제1 가닥 및 제2 가닥 중 적어도 1개의 5' 단부의 말단 뉴클레오티드가 역전된 뉴클레오티드이고, 말단 뉴클레오티드의 5' 탄소 및 인접한 뉴클레오티드의 5' 탄소를 통해 인접한 뉴클레오티드에 부착되며,
임의적으로,
a. 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 및/또는 5' 역전된 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연결에 의해 포스페이트 기를 통해 인접한 뉴클레오티드에 부착되거나; 또는
b. 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 및/또는 5' 역전된 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 기를 통해 인접한 뉴클레오티드에 부착되거나, 또는
c. 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 및/또는 5' 역전된 뉴클레오티드가 포스포로디티오에이트 기를 통해 인접한 뉴클레오티드에 부착된 것인
본원의 임의의 개시내용에 따른 임의의 핵산, 접합된 핵산, 사용을 위한 핵산, 방법, 조합물, 사용을 위한 조합물, 키트, 조성물 또는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 핵산이 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고,
임의적으로, 이러한 연결이 제2 가닥의 2개의 가장 마지막 5'의 뉴클레오티드 및/또는 2개의 가장 마지막 3'의 뉴클레오티드 사이에 있고/거나,
임의적으로, 핵산이 추가적으로 어떠한 내부 포스포로티오에이트 연결도 포함하지 않는 것인
본원의 임의의 개시내용에 따른 임의의 핵산, 접합된 핵산, 사용을 위한 핵산, 방법, 조합물, 사용을 위한 조합물, 키트, 조성물 또는 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥이 적어도 제1 및 제2 유형의 변형된 리보뉴클레오티드를 포함하고,각각의 가닥에서 개별적으로 또는 제1 및 제2 가닥 양쪽에 걸쳐 계수했을 때, 제1 유형의 변형된 리보뉴클레오티드가 제2 유형의 변형된 뉴클레오티드보다 더 많은 (예를 들어, 2' O 메틸 변형이 2' 플루오로 변형보다 더 많은), 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 본원에 개시된 핵산 서열에 관한 것이다.
의심의 여지를 피하기 위해, 핵산은 2개를 초과하는 유형의 변형을 가질 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 50% 초과가 2' O-메틸 변형을 포함하는, 예컨대 제1 및/또는 제2 가닥의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85% 이상을 초과하는 뉴클레오티드가 2' O-메틸 변형을 포함하는, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 임의의 본원에 개시된 핵산 서열에 관한 것이고, 바람직하게는 이는 제1 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오티드의 백분율로서 계산된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 50% 초과가 천연 발생 RNA 변형을 포함하는, 예컨대 제1 및/또는 제2 가닥의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85% 이상을 초과하는 뉴클레오티드가 이같은 변형을 포함하는, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 임의의 본원에 개시된 핵산 서열에 관한 것이고, 바람직하게는 이는 제1 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오티드의 백분율로서 계산된다. 적합한 천연 발생 변형은, 2-O' 메틸 뿐만 아니라, 다른 2' 당 변형, 특히 DNA 뉴클레오티드를 초래하는 2'-H 변형을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 제1 및/또는 제2 가닥 상에 2' O 메틸 변형이 아닌 2' 변형을 갖는 뉴클레오티드를 20% 이하, 예컨대 15% 이하, 예컨대 10% 이하로 포함하는, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 임의의 본원에 개시된 핵산 서열에 관한 것이고, 바람직하게는 이는 제1 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오티드의 백분율이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 제1 및/또는 제2 가닥 상에 20% 이하 (예컨대 15% 이하 또는 10% 이하)의 2' 플루오로 변형을 포함하는, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된 임의의 본원에 개시된 핵산 서열에 관한 것이고, 바람직하게는 이는 양쪽 가닥의 총 뉴클레오티드의 백분율이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기와 같은 HC18A의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의적으로 여기서 상기 제2 가닥은 하기와 같은 HC18b의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산에 관한 것이다:
Figure pct00046
임의적으로, 핵산 서열은 하기와 같은 TMPRSS6-hc-18A, 또는 TMPRSS6-hc-18A 및 18B 둘 다이다:
Figure pct00047
임의적으로, 핵산 서열은 하기 열거된 서열 중 하나 또는 이들 둘 다이다.
Figure pct00048
모든 서열은 5'-3'으로 열거된다. 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기와 같은 HC23A의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 임의적으로 여기서 상기 제2 가닥은 하기와 같은 HC23B의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산:
Figure pct00049
임의적으로, 핵산 서열은 하기와 같은 TMPRSS6-hc-23A, 또는 TMPRSS6-hc-23A 및 23B 둘 다이다:
Figure pct00050
임의적으로, 핵산 서열은 하기 열거된 서열 중 하나 또는 이들 둘 다이다.
Figure pct00051
본 발명의 또 다른 실시양태는 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 하나 이상의 철 킬레이터와 조합된, 세포에서 TMPRSS의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이고, 세포에서의 TMPRSS의 발현이 동일한 테스트 조건 하에, 그러나 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 또는 비-침묵화 대조군의 존재 하에 관찰된 발현 수준보다 적어도 15% 더 낮은 수준으로 감소되는 핵산이다.
핵산은 본원에 개시된 임의의 것일 수 있다.
특정한 바람직한 실시양태
1. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 조합물로서,
여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열식별번호: 333을 포함하는 것인 조합물.
2. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료에서의 사용을 위한, 바람직하게는 혈색소증의 치료를 위한 조합물로서,
조합물 (또는 조성물)은 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열식별번호: 333을 포함하는 것인 조합물.
3. 의약으로서의 사용을 위한 핵산, 바람직하게는 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료에서의 사용을 위한, 바람직하게는 혈색소증의 치료를 위한 핵산으로서,
여기서 핵산은 TMPRSS6의 발현을 억제하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열식별번호: 333을 포함하고,
여기서 핵산은 하나 이상의 철 킬레이터와 함께 투여되는 것인 핵산.
4. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 키트로서,
여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열식별번호: 333을 포함하는 것인 키트.
5. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 제약 조성물로서,
여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333 , 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열식별번호: 333을 포함하고,
여기서 핵산, 철 킬레이터 또는 둘 다는 생리학상 허용되는 부형제와 조합된 것인 제약 조성물.
6. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료에서의 사용을 위한, 바람직하게는 혈색소증의 치료를 위한 제약 조성물로서,
여기서 제약 조성물은 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열, 바람직하게는 서열식별번호: 333을 포함하고,
여기서 핵산, 철 킬레이터 또는 둘 다는 생리학상 허용되는 부형제와 조합된 것인 제약 조성물.
7. 바람직한 실시양태 1-6 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥이 서열식별번호: 334, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443, 바람직하게는 서열식별번호: 334의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
8. 바람직한 실시양태 1-7 중 어느 하나에 있어서, 하나 이상의 철 킬레이터가 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스 (엑스자이드) 및 데페라시록스 (자데누)로부터 선택되고, 임의적으로 철 킬레이터가 데페리프론인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
9. 바람직한 실시양태 1-8 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되어, 변형된 뉴클레오티드를 형성하는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물. 핵산은 제1 변형일 수 있는 2'-O-메틸 (2'OMe)인 변형, 및 2'-F인 제2 변형을 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는, 명백하게, 자신의 염기 신원 (A, C, G, T, U)을 보존하지만 예를 들어 당 상의 1개의 변형 또는 여러 변형, 예컨대 2'-OH → 2'OMe 또는 2'F의 변형을 갖는 뉴클레오티드이다.
10. 바람직한 실시양태 9에 있어서, 상기 제1 가닥이 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제2 가닥이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 또는 사용을 위한 핵산:
Figure pct00052
여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
11. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 데페리프론을 포함하는 조합물로서,
여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물.
12. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료에서의 사용을 위한, 바람직하게는 혈색소증의 치료를 위한 조합물로서,
TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 데페리프론을 포함하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물.
13. 의약으로서의 사용을 위한 핵산, 바람직하게는 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망의 치료에서의 사용을 위한, 바람직하게는 혈색소증의 치료를 위한 핵산으로서,
여기서 핵산은 TMPRSS6의 발현을 억제하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
여기서 핵산은 데페리프론과 함께 투여되는 것인 핵산.
14. 바람직한 실시양태 1-13 중 어느 하나에 있어서, 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터가 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 투여되는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물. 바람직하게는, 핵산 및 킬레이터는 단일 용량에서가 아니라 별개로 투여된다. 이는 핵산 및 특히 킬레이터의 투여량을 대상체의 요구에 대해 적합화하는 것을 허용한다.
15. 바람직한 실시양태 1-14 중 어느 하나에 있어서, 핵산이, 임의적으로 제2 가닥의 5' 단부에서, 리간드에 접합되고, 임의적으로 여기서 리간드가 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하며, 여기서 링커는 GalNAc 모이어티를 핵산에 접합시키는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
16. 바람직한 실시양태 15에 있어서, 접합된 핵산이 하기 구조를 갖는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물:
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
여기서 Z는 바람직한 실시양태 1 내지 14 중 어느 하나에 따른 핵산이다.
17. 바람직한 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥의 5' 및/또는 3' 단부에서 안정화되고, 임의적으로
여기서 핵산이 하기 구조를 갖는, 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각 사이 및 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결, 및 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인
조합물, 사용을 위한 조합물, 또는 사용을 위한 핵산, 또는 접합된 핵산:
Figure pct00057
여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG
(ps) = 포스포로티오에이트 연결.
18. 바람직한 실시양태 1-17 중 어느 하나에 따른 핵산 또는 접합된 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 조합물을 질환 또는 장애, 바람직하게는 혈색소증의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애, 바람직하게는 혈색소증을 치료하는 방법.
바람직하게는 핵산의 제1 가닥은 바람직하게는 서열식별번호: 17에서와 같이 변형되고 임의적으로 서열식별번호: 217에 제시된 바와 같이 포스포로티오에이트 연결로 안정화된 뉴클레오티드 서열 서열식별번호: 333을 포함하거나 또는 그로 이루어진다.
바람직하게는 핵산의 제2 가닥은 바람직하게는 서열식별번호: 18에서와 같이 변형되고 임의적으로 서열식별번호: 218에 제시된 바와 같이 포스포로티오에이트 연결로 안정화된 뉴클레오티드 서열 서열식별번호: 334를 포함하거나 또는 그로 이루어진다. 리간드는 서열식별번호: 218에 제시된 바와 같은 리간드 또는 상이한 리간드일 수 있지만, 바람직하게는 리간드는 서열식별번호: 218에 제시된 바와 같다.
바람직하게는 핵산은, 임의적으로 제2 가닥의 5' 단부에서, 리간드에 접합되고, 임의적으로 여기서 리간드는 GN (도 8a), GN2 (도 8b) 또는 GN3 (도 8c), 더욱 바람직하게는 GN2이다.
핵산의 제1 가닥은 바람직하게는 서열식별번호: 217을 포함하거나 또는 그로 이루어지고/거나, 핵산의 제2 가닥은 바람직하게는 서열식별번호: 218을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 양쪽 경우에 뉴클레오티드간 변형을 포함하는 모든 변형 및 제시된 바와 같은 리간드가 있다.
바람직하게는, 치료될 질환 또는 장애는 혈색소증이고, 가장 바람직하게는 유전성 혈색소증이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 질환 또는 장애는 바람직하게는 철 과부하, 예컨대 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애 또는 철 과부하와 연관된 프리드라이히 운동실조이다.
바람직하게는, 다중 용량의 siRNA가 투여된다. 본원에 개시된 핵산, 또는 이를 포함하는 조성물은 주 1회 또는 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 또는 8주마다의 치료를 포함하는 체계에서, 또는 변하는 투약 빈도 예컨대 상기 언급된 간격의 조합의 체계에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 대상체에게 초기 용량 및 1회 이상의 유지 용량의 핵산 작용제가 투여된다. 유지 요량 또는 용량들은 초기 용량과 동일하거나 또는 이보다 낮을 수 있고, 예를 들어, 초기 용량의 절반 미만일 수 있다. 유지 용량은, 예를 들어, 2, 5, 10, 또는 30일마다 1회 이하로 투여된다.
바람직한 실시양태는 본원에 개시된 임의의 다른 측면, 실시양태, 진술 및 특색과 조합될 수 있다.
특정한 바람직한 특색이 하기에서 열거된다:
진술
1. 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215의 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
2. 진술 1에 있어서, 제2 가닥이 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
3. 진술 1 또는 진술 2에 있어서, 상기 제1 가닥이 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
4. 진술 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 가닥이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
5. 진술 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가닥 및/또는 상기 제2 가닥이 각각 뉴클레오티드 17-35개 길이인 핵산.
6. 진술 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 듀플렉스 영역이 19-25개의 연속적인 뉴클레오티드 염기 쌍으로 이루어진 것인 핵산.
7. 이전 진술 중 어느 하나에 있어서,
a) 양쪽 단부에서 평활 말단이거나; 또는
b) 한쪽 단부에 오버행 및 다른쪽에 평활 말단을 갖거나; 또는
c) 양쪽 단부에 오버행을 갖는 것인
핵산.
8. 이전 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되어, 변형된 뉴클레오티드를 형성하는 것인 핵산.
9. 진술 8에 있어서, 제1 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형된 것인 핵산.
10. 진술 9에 있어서, 제1 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 적어도 제2 변형에 의해 변형되고, 적어도 제2 변형이 진술 9의 변형과 상이한 것인 핵산.
11. 진술 10에 있어서, 하나 이상의 변형된 짝수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 하나 이상의 변형된 홀수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나에 인접한 것인 핵산.
12. 진술 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드가 변형된 것인 핵산.
13. 진술 10 내지 12에 있어서, 복수의 짝수 번호 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
14. 진술 8 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥이 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
15. 진술 9 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥이 진술 9의 변형과 상이한 제2 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
16. 진술 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 홀수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 진술 9의 변형과 상이한 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
17. 진술 9 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 짝수 번호 뉴클레오티드 중 하나 이상이 진술 9의 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
18. 진술 16 또는 17에 있어서, 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 짝수 번호 뉴클레오티드 중 적어도 하나가 제2 가닥의 하나 이상의 변형된 홀수 번호 뉴클레오티드에 인접한 것인 핵산.
19. 진술 16 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드가 공통 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
20. 진술 16 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 복수의 짝수 번호 뉴클레오티드가 진술 9에 따른 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
21. 진술 16 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥 상의 복수의 홀수 번호 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 제2 변형이 진술 9의 변형과 상이한 것인 핵산.
22. 진술 16 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥이 공통 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
23. 진술 16 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥이 진술 9의 변형과 상이한 제2 변형에 의해 변형된 인접한 뉴클레오티드를 포함하는 것인 핵산.
24. 진술 8 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 내의 각각의 홀수 번호 뉴클레오티드 및 제2 가닥 내의 각각의 짝수 번호 뉴클레오티드가 공통 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
25. 진술 24에 있어서, 제1 가닥에서 각각의 짝수 번호 뉴클레오티드가 제2 변형으로 변형되고, 제2 가닥에서 각각의 홀수 번호 뉴클레오티드가 제2 변형으로 변형된 것인 핵산.
26. 진술 8 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 변형된 뉴클레오티드가 제2 가닥의 비변형된 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드에 비교하여 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 이동된 것인 핵산.
27. 진술 8 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 변형 및/또는 변형들이 각각 개별적으로 3'-말단 데옥시-티민, 2'-O-메틸, 2'-데옥시-변형, 2'-아미노-변형, 2'-알킬-변형, 모르폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트 기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 핵산.
28. 진술 8 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 변형이 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드 또는 비-천연 염기를 포함하는 뉴클레오티드 중 어느 하나인 핵산.
29. 진술 8 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개의 변형이 2'-O-메틸인 핵산.
30. 진술 8 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 적어도 1개의 변형이 2'-F인 핵산.
31. 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 세포에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215의 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제1 변형에 의해 변형되고 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제2 변형에 의해 변형되고, 제2 가닥의 뉴클레오티드는 짝수 번호 뉴클레오티드 상에서 제3 변형에 의해 변형되고 홀수 번호 뉴클레오티드 상에서 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 적어도 제1 변형은 제2 변형과 상이하고, 제3 변형은 제4 변형과 상이한 것인 핵산.
32. 진술 31에 있어서, 제2 서열이 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 또는 216의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
33. 진술 31 또는 32에 있어서, 제4 변형 및 제2 변형이 동일한 것인 핵산.
34. 진술 31 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 제1 변형 및 제3 변형이 동일한 것인 핵산.
35. 진술 31 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 제1 변형이 2'O-Me이고, 제2 변형 2'F인 핵산.
36. 진술 31 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥이 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 핵산.
37. 진술 31 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 하기 표에 제시된 바와 같은 서열 및 변형을 포함하는 핵산:
Figure pct00058
여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
1=2'F-dU,
2=2'F-dA,
3=2'F-dC,
4=2'F-dG,
5=2'-OMe-rU;
6=2'-OMe-rA;
7=2'-OMe-rC;
8=2'-OMe-rG.
38. 진술 1 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 리간드에 접합된 핵산.
39. 진술 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥의 말단의 1개, 2개 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 5' 뉴클레오티드 사이의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 핵산.
40. 진술 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각 사이 및 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결, 및 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 핵산.
41. 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하는, 세포에서 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산으로서, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 또는 215의 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 여기서 상기 핵산은 리간드에 접합되는 것인 핵산.
42. 진술 41에 있어서, 리간드가 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하며, 여기서 링커는 GalNAc 모이어티를 진술 41에서 정의된 바와 같은 핵산에 접합시키는 것인 핵산.
43. 진술 41 또는 42에 있어서, 링커가 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있는 것인 핵산.
44. 진술 41 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오티드가 이전 진술 중 어느 하나에서 정의된 바와 같이 변형된 것인 핵산.
45. 이전 진술 중 어느 하나에 있어서, 리간드가 화학식 I을 포함하며:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (I)
여기서
S는 사카라이드를 나타내며, 여기서 사카라이드는 N-아세틸 갈락토스아민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내며, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)이고;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에테르이며, 여기서 n = 1-6이고;
A는 분지 단위이고;
X3은 가교 단위를 나타냄;
여기서 진술 1 내지 40 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 (바람직하게는 티오포스페이트)를 통해 X3에 접합되는 것인
핵산.
46. 하기 구조 중 하나를 갖는 접합된 핵산:
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
여기서 Z는 진술 1 내지 40 중 어느 하나에 따른 핵산이다.
47. 진술 1 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 하기 구조의 리간드에 접합된 핵산.
Figure pct00063
48. 이전 진술 중 어느 하나에 있어서, 듀플렉스가 별개의 가닥을 포함하는 포함하는 것인 핵산 또는 접합된 핵산.
49. 이전 진술 중 어느 하나에 있어서, 듀플렉스가 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는 단일 가닥을 포함하는 것인 핵산 또는 접합된 핵산.
50. 이전 진술 중 어느 하나에서 정의된 바와 같은 핵산 또는 접합된 핵산, 및 하기를 포함하는 제형을 포함하는 조성물:
i) 양이온성 지질, 또는 그의 제약상 허용되는 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질;
iv) PEG화 지질.
51. 진술 50에 있어서, 제형에서, 양이온성 지질 성분의 함량이 지질 제형의 총 지질 함량의 약 55 mol% 내지 약 65 mol%, 바람직하게는 지질 제형의 총 지질 함량의 약 59 mol%인 조성물.
52. 진술 50에 있어서, 제형이 하기를 포함하는 것인 조성물:
하기 구조를 갖는 양이온성 지질;
Figure pct00064
하기 구조를 갖는 스테로이드;
Figure pct00065
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질;
Figure pct00066
및 하기 구조를 갖는 PEG화 지질;
Figure pct00067
53. 이전 진술 중 어느 하나의 핵산 또는 접합된 핵산 및 생리학상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
54. 이전 진술 중 어느 하나에 있어서, 질환 또는 장애의 치료에서의 사용을 위한 핵산 또는 접합된 핵산.
55. 질환 또는 장애를 치료하기 위한 의약의 제조에서의 이전 진술 중 어느 하나에 따른 핵산 또는 접합된 핵산의 용도.
56. 치료를 필요로 하는 개체에게 이전 진술 중 어느 하나에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료 하는 방법.
57. 진술 55에 있어서, 핵산 또는 접합된 핵산이 대상체에게 피하 또는 정맥내 투여되는 것인 방법.
58. 진술 54 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 질환 또는 장애가 혈색소증, 적혈구조혈성 포르피린증, 수혈성 철 과부하 및 혈액 장애를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 용도 또는 방법.
59. 진술 58에 있어서, 혈액 장애가 β-지중해빈혈, 겸상 적혈구 빈혈, 선천성 철적혈모구 빈혈, 재생불량 빈혈 또는 골수이형성 증후군인 용도 또는 방법.
60. 진술 54 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 장애가 철 과부하와 연관된 것인 용도 또는 방법.
61. 진술 60에 있어서, 철 과부하와 연관된 장애가 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조인 용도 또는 방법.
62. 진술 1 내지 49 중 어느 하나에 따른 핵산 또는 접합된 핵산을 제조하는 방법.
이제 본 발명이 하기 비제한적인 도면 및 예를 참조로 기술될 것이다:
도 1은 인간 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대한 RNAi 분자 스크린의 결과를 나타낸다;
도 2는 인간 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6 RNAi 분자의 용량 반응을 나타낸다;
도 3은 상이한 용량의 GalNAc siRNA 분자에 의한 마우스 간 조직에서의 TMPRSS6 발현의 감소를 나타낸다;
도 4는 마우스에서의 TMPRSS6 siRNA 분자에 의한 TMPRSS6 표적 유전자 억제 및 HAMP mRNA 발현의 유도의 기간을 나타낸다;
도 5는 TMPRSS6 siRNA 분자로의 처리에 의한 TMPRSS6 발현의 억제가 연장된 시간 동안 혈청에서 철 수준을 감소시킨다는 것을 나타낸다;
도 6은 GalNAc 접합 RNAi 분자의 수용체 매개 흡수에 의한 1° 마우스 간세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제를 나타낸다;
도 7은 실시예 1, 3, 4 , 26 내지 31 및 34 내지 38에서 사용된 GalNAc 접합 RNAi 분자를 나타낸다;
도 8a, 8b 및 8c는 올리고뉴클레오티드가 접합된, 본원에서 각각 GN, GN2, 및 GN3으로 지칭되는 GalNAc 리간드의 구조를 나타낸다 (TMPRSS6 hcm-9가 GN, GN2 및 GN3 각각에 접합되는 실시예에서 이러한 명명법을 하기에서 또한 참조);
도 9는 인간 Hep3B 세포에서의 상이한 siRNA 변형 변이체들에 의한 TMPRSS6 발현의 감소를 나타낸다;
도 10은 수용체 매개 흡수에 의한 상이한 GalNAc-siRNA 접합체들에 의한 TMPRSS6 발현의 감소를 나타낸다;
도 11은 마우스에서의 상이한 GalNAc-siRNA 접합체들에 의한 TMPRSS6의 감소 및 HAMP 발현의 유도를 나타낸다;
도 12는 실시예 8, 9 및 10의 GalNAc-siRNA 분자의 서열 및 변형을 나타낸다;
도 13은 siRNA 접합체의 단일 주사 후 상이한 시점들에서의 마우스에서의 간 조직에서의 TMPRSS6 발현의 감소 및 혈청 철 수준의 감소를 나타낸다;
도 14는 상이한 용량의 GalNAc 접합 siRNA 분자에 의한 마우스에서의 간에서의 TMPRSS6 mRNA 수준의 감소 및 혈청 철 수준의 감소를 나타낸다;
도 15는 인간 Hep3B 세포에서의 siRNA 분자의 활성에 대한 상이한 변형 패턴들의 효과를 나타낸다;
도 16은 인간 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대한 GalNAc 접합 siRNA 분자의 상이한 변형 변이체들의 효과를 나타낸다;
도 17은 수용체 매개 흡수에 의한 1차 마우스 간세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대한 GalNAc 접합 siRNA의 변형 변이체의 효과를 나타낸다;
도 18은 인간 Hep3B 세포에서의 상이한 siRNA 변형 변이체들에 의한 TMPRSS6 발현의 감소를 나타낸다;
도 19는 인간 Hep3B 세포에서의 RNAi 활성에 대한 역전된 A 및 G 뉴클레오티드의 영향을 나타낸다;
도 20은 siRNA 안정성에 대한 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 나타낸다;
도 21은 인간 Hep3B 세포에서의 siRNA 활성에 대한 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 나타낸다;
도 22는 인간 Hep3B 세포에서의 RNAi 활성에 대한 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 나타낸다;
도 23은 수용체 매개 흡수에 의한 1차 마우스 간세포에서의 GalNAc 접합 siRNA의 활성에 대한 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 나타낸다;
도 24는 GalNAc 접합 siRNA 분자의 안정성에 대한 포스포로디티오에이트 연결의 효과를 나타낸다;
도 25는 마우스 1차 간세포에서의 TMPRSS6 발현에 대한 GalNAc 접합 siRNA 분자의 활성에 대한 포스포로디티오에이트 연결의 효과를 나타낸다;
도 26은 GalNAc 접합 siRNA 분자의 안정성에 대한 포스포로디티오에이트 연결의 효과를 나타낸다;
도 27은 포스포로디티오에이트 연결을 함유하는 GalNAc siRNA 접합체에 의한 마우스 1차 간세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제를 나타낸다;
도 28은 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 TMPRSS6 발현의 감소를 나타낸다;
도 29는 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 혈청 헵시딘 수준의 증가를 나타낸다;
도 30은 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 혈청 철 수준의 감소를 나타낸다;
도 31은 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 트랜스페린 포화의 감소를 나타낸다;
도 32는 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 불포화 철 결합능에서의 증가를 나타낸다;
도 33은 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 GalNAc siRNA에 의한 조직 철 수준의 감소를 나타낸다;
도 34는 43개의 추가적인 siRNA의 리포솜 전달에 의한 Hep3B 세포에서의 인간 TMPRSS6 mRNA 수준의 감소를 나타낸다;
도 35는 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대한 상이한 siRNA들의 용량 반응 곡선을 나타낸다;
도 36은 상이한 농도의 GalNAc siRNA 접합체의 수용체 매개 흡수에 의한 1차 인간 간세포에서의 TMPRSS6 발현의 감소를 나타낸다;
도 37은 GalNAc siRNA 접합체로의 처리에 의한 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서의 적혈구용적률 값의 증가를 나타낸다;
도 38은 GalNAc siRNA 접합체로의 처리에 의한 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서의 적혈구 분포 폭의 감소를 나타낸다.
도 39는 GalNAc siRNA 접합체로의 처리에 의한 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델의 혈액에서의 망상적혈구의 비율의 감소를 나타낸다;
도 40은 GalNAc siRNA 접합체로의 처리에 의한 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델의 적혈구에서의 반응성 산소 종의 감소를 나타낸다.
도 41은 GalNAc TMPRSS6 siRNA가 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 헤모글로빈 수준을 상승시킨다는 것을 나타낸다.
도 42는 GalNAc TMPRSS6이 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 비장비대를 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 43은 GalNAc TMPRSS6이 골수에서 적혈구 성숙을 개선시킨다는 것을 나타낸다.
도 44는 GalNAc TMPRSS6이 비장에서 무효 적혈구생성을 감소시킨다는 것을 나타낸다.
도 45 a 및 b는 1차 인간 간세포에서의 TMPRSS6에 대한 siRNA 접합체의 용량-반응 곡선을 나타낸다.
도 46은 1차 인간 간세포에서의 siRNA 접합체에 의한 TMPRSS6 mRNA 발현의 억제를 나타낸다.
도 47은 1차 인간 간세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대해 테스트된 GalNAc siRNA 접합체의 서열 및 변형 패턴을 나타낸다.
도 48은 실시예 44에서 사용된 핵산의 특정한 서열을 나타낸다.
도 49는 상이한 단부 안정화 화학 (포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포디에스테르)을 함유하는 TMPRSS6을 표적화하는 GalNAc siRNA 접합체에 의한 1차 마우스 간세포에서의 수용체-매개 흡수를 나타낸다.
도 50은 말단 위치 및 GalNAc 모이어티에 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 포스포디에스테르를 갖는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성을 나타낸다.
도 51은 지시된 농도의 안티센스 가닥의 5'-위치의 비닐-(E)-포스포네이트 2'OMe-우라실 및 처음 3개의 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결 (X0204), 안티센스 가닥의 5'-위치의 비닐-(E)-포스포네이트 2'OMe-우라실 및 처음 3개의 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합 (X0205), (X0139) 또는 사량체 (X0140)) 또는 나무형 삼량체 GalNAc-클러스터 (X0004) 또는 비-표적화 GalNAc-siRNA (X0028)를 보유하는 TMPRSS6-siRNA로의 처리 24시간 후 또는 미처리 (UT)의 1차 뮤린 간세포에서의 TMPRSS6 유전자 발현의 억제를 나타낸다.
도 52는 뉴클레아제 분해에 대한 siRNA-접합체 대 덜 안정화된 양성 대조군의 혈청 안정성을 나타낸다.
도 53은 1형 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 TMPRSS6 siRNA 치료에 의한 트랜스페린 포화의 감소를 나타낸다.
도 54는 TMPRSS6 siRNA로의 치료가 철 킬레이터에 의한 조직 철 수준의 감소를 강화한다는 것을 나타낸다.
실시예
실시예 1
하기 표에 기재된 바와 같은 올리고를 사용하여, 본 개시내용에 따른 핵산을 합성하였다.
본 개시내용의 서열 중 하나를 예로서 사용하여, 합성 방법은 하기와 같았다:
STS012 (GN-TMPRSS6-hcm-9)
제1 가닥
5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3'
제2 가닥
5'[ST23 (ps)]3 롱 트레블러 (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3'
fN (N=A, C, G, U)은 2'플루오로, 2' 데옥시뉴클레오시드를 나타낸다.
mN (N=A, C, G, U)은 2'O 메틸 뉴클레오시드를 나타낸다.
(ps)는 포스포로티오에이트 연결을 가리킨다.
ST23은 GalNAc C4 포스포르아미디트 (하기와 같은 구조 성분)이다:
Figure pct00068
롱 트레블러 (STKS)
추가 예는 GN2-TMPRSS6-hcm-9 (STS12009L4)이다:
제1 가닥
5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3'
제2 가닥
5'[ST23 (ps)]3 ST41 (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3'
fN (N=A, C, G, U)은 2'플루오로, 2' 데옥시뉴클레오시드를 나타낸다.
mN (N=A, C, G, U)은 2'O 메틸 뉴클레오시드를 나타낸다.
(ps)는 포스포로티오에이트 연결을 가리킨다.
ST23은 상기와 같다.
ST41은 하기와 같다 (그리고 WO2017/174657에 기술된 바와 같음):
Figure pct00069
모든 올리고뉴클레오티드는 상업적인 올리고뉴클레오티드 제조사 (유로젠테크(Eurogentech), 벨기에; 바이오스프링(Biospring), 독일)로부터 수득되거나, 또는 표준 포스포르아미디트 화학을 사용하여 AKTA 올리고파일럿(oligopilot) 합성기 상에서 합성되었다. 시판되는 고체 지지체 및 2'O-메틸 RNA 포스포르아미디트, 2'플루오로 DNA 포스포르아미디트 (모두 표준 보호) 및 시판되는 롱 트레블러 포스포르아미디트 (글렌 리서치(Glen research))를 사용하였다. 건조 아세토니트릴 내의 포스포르아미디트의 0.1 M 용액을 사용하여 합성을 수행하였고, 벤질티오테트라졸 (BTT)을 활성화제로서 사용하였다 (아세토니트릴 내의 0.3 M). 모든 다른 시약은 시판되는 표준 시약이었다.
PS2 함유 올리고뉴클레오티드의 합성을 제조사 (글렌 리서치, AM 바이오테크(AM Biotech))의 설명서에 따라 수행하였다. 문헌에 공개된 방법에 따라 비닐-(E)-포스포네이트 2'OMe-우라실 포스포르아미디트를 합성하고 올리고뉴클레오티드 합성에서 사용하였다 (Haraszti et al., Nuc. Acids Res., 45(13), 2017, 7581-7592).
각각의 포스포르아미디트를 표준 포스포르아미디트 커플링 조건 하에 올리고사슬의 5' 단부에 커플링시킴으로써 GalNAc 신톤(synthon) (ST23)의 접합이 달성되었다. 시판되는 표준 티올화 시약 (EDITH, 링크 테크놀러지즈(Link technologies))를 사용하여 포스포로티오에이트가 도입되었다.
메틸아민을 사용함으로써 단일 가닥을 CPG로부터 절단하였다. TBDMS-보호 RNA 뉴클레오시드가 사용된 경우, TEA*3HF로의 추가적인 처리를 수행하여 실릴 보호를 제거하였다. 생성된 미정제 올리고뉴클레오티드를 염화나트륨 구배를 사용하여 AKTA 퓨어(AKTA Pure) HPLC 시스템 상에서 이온 교환 크로마토그래피 (리소스 Q(Resource Q), 6 mL, GE 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 정제하였다. 산물을 함유하는 분획을 풀링하고, 크기 배제 칼럼 (제타덱스(Zetadex), EMP 바이오텍(EMP Biotech))에서 탈염시키고, 동결건조시켰다.
어닐링을 위해, 등몰량의 각각의 단일 가닥을 물에 용해시키고, 5분 동안 80℃로 가열하였다. 냉각 후, 생성된 듀플렉스를 동결건조시켰다.
생성된 핵산 (siRNA)의 서열이 표 1에 기재된다.
Figure pct00070
Figure pct00071
표 1
표 1: TMPRSS6 발현의 억제에 대해 테스트된 핵산 서열. 프랑크푸르트의 바이오스프링에 의해 핵산이 합성되었다. 하기 번호에 의해 뉴클레오티드 변형이 나타내어진다 (4열), 1=2'F-dU, 2=F'-dA, 3=2'F-dC, 4=2'F-dG, 5=2'-OMe-dU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-dC; 8=2'-OMe-dG.
Figure pct00072
표 2
표 2 - TMPRSS6 mRNA 서열 기준물 NM_001289000.1 내의 각각의 핵산 서열의 시작 위치
인간 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대한 스크린
세포를 80,000개의 세포/6웰 접시의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 20 nM 핵산 (표 1에 열거됨) 및 1 μg/ml AtuFECT (양이온성 지질 Atufect01 및 융합원성 지질 DPhyPE의 50:50 제형)로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 용해시키고, TMPRSS6 mRNA 수준을 표 3의 앰플리콘을 사용하여 q-RT-PCR에 의해 결정하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 하우스 키핑 유전자 PTEN의 발현 수준에 대해 정규화하였다. 루시페라제 및 PTEN에 대한 핵산이 비-표적화 대조군 핵산으로서 사용되었다. 결과가 도 1에 제시된다.
Figure pct00073
표 3
표 3: 각각의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는데 사용된 TMPRSS6, 액틴, PTEN 및 HAMP 앰플리콘 세트의 서열
실시예 2
인간 Hep3B 세포에서의 TMPRSS6 발현의 억제에 대한 TMPRSS6 핵산의 용량 반응.
세포를 150,000개의 세포/6웰 접시의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 1 μg/ml AtuFECT (양이온성 지질 Atufect01 및 융합원성 지질 DPhyPE의 50:50 제형), 및 도 2의 그래프의 X축에 의해 도시된 바와 같은 상이한 양의 TMPRSS6 핵산 (각각 30; 10; 3; 1; 0.3; 0.1, 0.003 nM)으로 형질감염시켰다. 비-표적화 대조군 샘플의 경우, 세포를 루시퍼라제에 대한 30 및 10 nM 핵산으로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 용해시키고, mRNA 수준을 q-RT-PCR에 의해 결정하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 하우스 키핑 유전자 PTEN의 발현 수준에 대해 정규화하였다. TMPRSS6 mRNA 발현의 가장 높은 감소가 TMPRSS6-hcm9 핵산에 의해 관찰되었다. 루시퍼라제 핵산으로의 형질감염은 TMPRSS6 mRNA 수준에 영향을 미치지 않았다. 결과가 도 2에 제시된다. RNAi 분자의 서열이 표 1에 도시된다.
실시예 3
상이한 용량의 GalNAc 핵산에 의한 간 조직에서의 TMPRSS6 발현의 억제.
C57/BL6 마우스를 피하 투여에 의해 단일 용량의 10, 3 또는 1 mg/kg의 GalNAc 핵산 접합체로 처리하였다. 각각의 siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 제시된다. siRNA가 도 8a에 도시되고 본원에 기술된 GalNAc 링커 (GN)에 접합된다. 대조군은 등장성 염수 또는 비-표적화 대조군 접합체인 GN-TTR-hc로 각각 처리하였다. 간 조직에서의 표적 유전자 발현을 접합체의 피하 주사 3일 후에 qRT PCR에 의해 평가하였다. 총 RNA를 급속 냉동 조직 샘플로부터 단리하고, 이전에 기술된 바와 같이 qRT-PCR을 수행하였다 (Kuhla et al. 2015, Apoptosis Vol 4, 500-11). 사용된 택맨(TaqMan) 프로브가 표 3에 제시된다. 결과가 도 3에 제시된다.
실시예 4
TMPRSS6 RNAi 분자에 의한 표적 유전자 억제의 기간.
마우스를 피하 주사에 의해 3 mg/kg GalNAc-TMPRSS6 RNAi 분자로 처리하였다. 각각의 siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 제시된다. 표적 mRNA 발현을 처리 후 제7일, 제14일, 제21일, 제27일, 제34일 또는 제41일 (주사 후 일수, dpi)에 간 조직에서 평가하였다. 간에서의 TMPRSS6 발현의 감소가 주사 후 제41일까지 관찰된다. HAMP (헵시딘) mRNA 발현이 GN-TMPRSS6 RNAi 분자로 처리된 마우스의 간에서 상향조절된다. 결과가 도 4에 제시된다.
실시예 5
TMPRSS6 siRNA로의 처리에 의한 TMPRSS6 발현의 억제가 혈액 내의 철 수준을 감소시킨다.
마우스에 3 mg/kg GalNAc 핵산 접합체를 피하 처리하고 나서 7, 14, 21, 27, 34 및 41일 후에 혈청에서 철 수준을 분석하였다. 주사후 41일 (dpi 41)까지 혈청 철 수준이 감소되었다. 각각의 siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 제시된다. 결과가 도 5에 제시된다.
실시예 6
수용체 매개 흡수에 의한 TMPRSS6 발현의 억제.
1차 마우스 간세포를 콜라겐 코팅 접시에 플레이팅하고, 지시된 바와 같이 100 nM 내지 0.03 nM의 농도로 세포 배양 배지에 희석된 siRNA 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 siRNA 접합체에 노출시키고 나서 24시간 후에, 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 발현을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 액틴 mRNA 수준에 대해 정규화하였다. TMPRSS6 발현의 용량 의존적 억제가 양쪽 GalNAc-TMPRSS6 siRNA 접합체에 의해 관찰되었다. GN2-Luc-siRNA 1 GalNAc 접합체 (GN2-Luc)가 비-표적화 대조군으로서 사용되었고, TMPRSS6 mRNA 발현에 영향을 미치지 않았다. 각각의 siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 도시된다. 결과가 도 6에 제시된다.
실시예 7
추가의 TMPRSS6 siRNA를 상기 기술된 방법에 따라 합성하였다. 서열 및 변형이 하기 표 4에 제시된다.
TMPRSS6를 표적화하는 siRNA의 변형 변이체 (서열식별번호: 17 및 18). 각각의 듀플렉스에 대해, 제1 서열 (A 가닥)이 위에, 제2 서열 (B 가닥)이 아래에 열거된다. 모든 서열은 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다. 변형 코드가 표 4의 단부에서 열거된다.
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
표 4
표 4: 표 하단의 행에 제시된 번호에 의해 변형이 도시되고, 각각의 듀플렉스에 대해, 제1 가닥이 위에 있고, 제2 가닥이 아래에 있다.
TMPRSS6를 표적화하는 한 siRNA의 상이한 변형 변이체들을 인간 Hep3B 세포에서 테스트하였다. PTEN 및 루시퍼라제를 표적화하는 siRNA가 각각 관련되지 않은 대조군 및 비-표적화 대조군으로서 사용되었다. 모든 siRNA를 1 nM (지시된 경우에 0.1 nM)로 1 μg/ml Atufect와 함께 형질감염시켰다. 형질감염 48시간 후에 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 액틴 mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복의 평균 +/- SD를 나타낸다. 결과가 도 9에 제시된다.
실시예 8
TMPRSS6를 표적화하는 GalNAc-접합 siRNA의 변형 변이체를 합성하였고, 이들이 도 12에 제시된다. 각각의 듀플렉스에 대해, 제1 가닥 서열이 위에, 그리고 제2 가닥 서열이 아래에 열거된다. 변형은 번호로 나타내어지고, 하기와 같다: GN은 도 8a에 따른 GalNAc 링커에 대한 접합을 가리킨다. STS12 (GN-TMPRSS6-hcm9)의 서열 및 변형 또한 도 7에 도시된다.
실시예 9
TMPRSS6를 표적화하는 하나의 GalNAc 접합 서열 (STS012)의 상이한 변형 변이체들이 마우스 1차 간세포에서 TMPRSS6 발현을 감소시킨다. 수용체-매개 흡수를 위해, 세포를 100, 10, 1 및 0.1 nM siRNA 접합체와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 액틴 mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 각각의 3회의 기술적 반복의 평균 +/- SD가 도 10에 제시된다.
실시예 10
TMPRSS6를 표적화하는 하나의 GalNAc-접합 서열 (STS012, GN-TMPRSS6-hcm9)의 상이한 변형 변이체들을 생체 내에서 테스트하였다. 1 mg/kg 및 3 mg/kg GalNAc-siRNA 접합체를 수컷 C57BL/6JOlaHsd 마우스에 피하 주사하였다. 처리 14일 후, 간에서의 TMPRSS6 (A) 및 HAMP (B) mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 분석하였다. 막대는 적어도 4마리의 동물의 평균 +/- SD를 나타낸다. 결과가 도 11에 제시된다.
실시예 11
TMPRSS6를 표적화하는 하나의 GalNAc-접합 서열 (STS012)의 2개의 상이한 변형 변이체를 생체 내에서 테스트하였다. 1 mg/kg GalNAc-siRNA 접합체를 수컷 C57BL/6JOlaHsd 마우스에 피하 주사하였다. 처리 14일 후 및 28일 후, 간에서의 TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 분석하였다 (A). 추가적으로, 혈청 철 수준을 분석하였다 (B). 결과가 도 13에 제시된다. 박스 플롯은 4마리의 동물의 중앙값을 나탄낸다. 통계 분석은 PBS 군에 대한 크루스칼-왈리스 검정과 던 다중 비교를 기반으로 한다.
서열은 실시예 10에서와 같다.
실시예 12
TMPRSS6를 표적화하는 하나의 GalNAc-접합 서열 (STS12009L4, GN2-TMPRSS6-hcm9)의 2개의 상이한 변형 변이체를 생체 내에서 테스트하였다. 1 mg/kg 및 0.3 mg/kg GalNAc-siRNA 접합체를 수컷 C57BL/6JOlaHsd 마우스에 피하 주사하였다. 처리 14일 후, 간에서의 TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 분석하였다 (A). 추가적으로, 혈청 철 수준을 분석하였다 (B). 결과가 도 14에 제시된다. 박스 플롯은 4마리의 동물의 중앙값을 나탄낸다. 통계 분석은 PBS 군에 대한 크루스칼-왈리스 검정과 던 다중 비교를 기반으로 한다.
사용된 듀플렉스가 하기 표 5에 제시된다. 모든 서열은 서열식별번호: 17 및 서열식별번호: 18에 상응한다.
Figure pct00078
표 5
표 5: TMPRSS6를 표적화하는 GalNAc-접합 서열의 변형 변이체.
실시예 13
TMPRSS6를 표적화하는 하나의 siRNA의 상이한 변형 변이체들을 인간 Hep3B 세포에서 테스트하였다. 루시퍼라제를 표적화하는 siRNA가 비-표적화 대조군으로서 사용되었다. 모든 siRNA를 1 nM 및 0.1 nM로 1 μg/ml Atufect와 함께 형질감염시켰다. 총 RNA를 형질감염 48시간 후에 추출하고, TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 PTEN mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 결과가 도 15에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복의 평균 +/- SD를 나타낸다.
하기 표 6에 서열이 제시된다. 모든 서열은 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00079
표 6
표 6: TMPRSS6을 표적화하는 한 siRNA의 상이한 변형 변이체들.
실시예 14
TMPRSS6를 표적화하는 GalNAc-접합 siRNA의 변형 변이체들을 인간 Hep3B 세포에서 테스트하였다. 6-웰 당 150,000개의 세포를 시딩하였다. 24시간 후, siRNA 접합체를 10, 1, 0.1, 0.01, 및 0.001 nM (A) 또는 5, 0.5, 0.05, 0.005 nM (B)로 1 μg/ml Atufect와 함께 형질감염시켰다. 루시퍼라제에 대한 GalNAc-siRNA가 비-표적화 대조군으로서 사용되었다. 총 RNA를 형질감염 72시간 후에 추출하고, TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 PTEN mRNA 수준 (A) 또는 액틴 mRNA 수준 (B)에 대해 정규화하였다. 결과가 도 16에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복의 평균 +/- SD를 나타낸다.
하기 표 7에 서열이 제시된다.
Figure pct00080
표 7
표 7: TMPRSS6을 표적화하는 GalNAc-접합 siRNA의 변형 변이체
실시예 15
TMPRSS6를 표적화하는 GalNAc-접합 서열의 변형 변이체 (STS12009L4)를 마우스 1차 간세포에서 테스트하였다. 수용체-매개 흡수를 위해, 세포를 24시간 동안 100, 25, 5, 1, 0.25 및 0.05 nM siRNA 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 관련되지 않은 서열을 표적화하는 GalNAc-siRNA (GN-TTR) 및 비-표적화 GalNAc-siRNA (GN-Luc)가 대조군으로서 사용되었다. 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 PTEN mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 결과가 도 17에 제시된다. 각각의 3회의 기술적 반복의 평균 +/- SD가 제시된다.
상기 표 7에 서열이 제시된다.
실시예 16
TMPRSS6를 표적화하는 한 siRNA의 상이한 DNA- 및 LNA-함유 변이체를 인간 Hep3B 세포에서 테스트하였다. 따라서, 6-웰 당 150,000개의 세포를 시딩하였다. 24시간 후, siRNA를 0.1 nM siRNA로 1 μg/ml Atufect와 함께 형질감염시켰다. 총 RNA를 형질감염 48시간 후에 추출하고, TMPRSS6 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 액틴 mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 결과가 도 18에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복의 평균 +/- SD를 나타낸다.
하기 표 8에 서열이 제시된다. 모든 서열은 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00081
표 8
표 8: TMPRSS6을 표적화하는 한 siRNA의 상이한 DNA- 및 LNA-함유 변이체.
실시예 17
말단 3' 위치의 역전된 A 및 G RNA 뉴클레오티드의 영향을 TMPRSS6에 대한 siRNA를 사용하여 분석하였다. TMP70은 모든 말단에 포스포로티오에이트를 함유하는 반면, TMP82 및 TMP83은 안티센스의 3'-단부 및 센스의 3'-단부에 ivA (TMP82) 및 ivG (TMP83)를 함유한다. 양쪽의 역전된 뉴클레오티드는 각각의 가닥의 말단 뉴클레오티드에 추가적으로 존재하고, 포스포로티오에이트 결합을 통해 연결된다. 관련되지 않은 siRNA (PTEN) 및 비-표적화 siRNA (Luci)가 대조군으로서 포함되었다. 모든 테스트된 변이체가 테스트 조건 하에 유사한 활성을 나타낸다.
Hep3B 세포에서 실험을 수행하였다. 세포를 6-웰 당 150,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 24시간 후에 1 nM 및 0.1 nM siRNA 및 1 μg/ml Atufect로 형질감염시키고, 48시간 후에 용해시켰다. 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 액틴 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과가 도 19에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
하기 표 9에 서열이 제시된다. 서열은 서열식별번호: 17 (위) 또는 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00082
표 9
표 9: 상이한 위치에 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 TMPRSS6에 대한 siRNA.
실시예 18
양쪽 3'-단부에 역전된 RNA 뉴클레오티드를 함유하는 상이한 siRNA 듀플렉스들을 혈청 안정성에 대해 테스트하였다. TMP84TMP87은 센스 가닥 내의 마지막 뉴클레오티드에 추가적으로, 그리고 안티센스 가닥 내의 마지막 뉴클레오티드 대신에 역전된 RNA를 함유한다. TMP88-TMP91은 안티센스 가닥의 마지막 뉴클레오티드에 추가적으로, 그리고 센스 가닥 내의 마지막 뉴클레오티드 대신에 역전된 RNA를 함유한다. 모든 역전된 RNA 뉴클레오티드가 말단에서 사용된 포스포로티오에이트를 치환한다. TMP84-TMP87의 디자인에서, 테스트된 서열에 ivA 및 ivG가 ivU 및 ivC보다 더 높은 안정성을 부여한다 (파트 A). TMP88-TMP91의 디자인에서, 듀플렉스 안정성에 대한 염기 신원의 영향이 없다 (파트 B).
결과가 도 20에 제시된다. "UT"는 미처리 샘플을 가리킨다. "FBS"는 5 μM 최종 농도로 50% FBS와 함께 3일 동안 인큐베이션되고, 페놀/클로로포름-추출되고, 에탄올로 침전된 siRNA 듀플렉스를 가리킨다. 샘플을 천연 겔 전기영동으로 20% TBE 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다.
하기 표 10에서 서열이 제시되고, 이는 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00083
표 10
표 10: 양쪽 3'-단부에 역전된 RNA 뉴클레오티드를 함유하는 상이한 siRNA 듀플렉스들.
실시예 19
말단 3' 위치의 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 TMPRSS6에 대한 siRNA를 사용하여 분석하였다. TMP70은 모든 말단에 포스포로티오에이트를 함유하는 반면, TMP84-TMP87은 센스 가닥의 3'-단부에 ivG를 함유한다. 역전된 RNA 뉴클레오티드는 마지막 뉴클레오티드에 추가적으로 존재하고, 2개의 포스포로티오에이트를 치환한다. 안티센스 3'-단부에서, ivA (TMP84), ivU (TMP85), ivC (TMP86) 및 ivG (TMP87)를 테스트하였다. 이러한 역전된 RNA 뉴클레오티드는 말단 뉴클레오티드 대신 부가되었고, 포스포로티오에이트를 치환한다. 관련되지 않은 siRNA (PTEN) 및 비-표적화 siRNA (Luci)가 대조군으로서 포함되었다. 모든 테스트된 변이체가 테스트 조건 하에 유사한 활성을 나타낸다.
Hep3B에서 실험을 수행하였다. 세포를 6-웰 당 150,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 24시간 후에 1 nM 및 0.1 nM siRNA 및 1 μg/ml Atufect로 형질감염시키고, 48시간 후에 용해시켰다. 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 액틴 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과가 도 21에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열은 상기 표 10에서와 같다.
실시예 20
말단 3' 위치의 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 TMPRSS6에 대한 siRNA를 사용하여 분석하였다. TMP70은 모든 말단에 포스포로티오에이트를 함유하는 반면, TMP88-TMP91은 안티센스 가닥의 3'-단부에 ivG를 함유한다. 역전된 RNA 뉴클레오티드는 마지막 뉴클레오티드에 추가적으로 존재하고, 2개의 포스포로티오에이트를 치환한다. 센스 3'-단부에서, ivA (TMP88), ivU (TMP89), ivC (TMP90) 및 ivG (TMP91)를 테스트하였다. 이러한 역전된 RNA 뉴클레오티드는 말단 뉴클레오티드 대신 부가되었고, 포스포로티오에이트를 치환한다. 관련되지 않은 siRNA (PTEN) 및 비-표적화 siRNA (Luci)가 대조군으로서 포함되었다. 모든 테스트된 변이체가 테스트 조건 하에 유사한 활성을 나타낸다.
Hep3B에서 실험을 수행하였다. 세포를 6-웰 당 150,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 24시간 후에 1 nM 및 0.1 nM siRNA 및 1 μg/ml Atufect로 형질감염시키고, 48시간 후에 용해시켰다. 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 액틴 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과가 도 22에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열은 상기 표 10에 제시된 바와 같다.
실시예 21
말단 3' 위치의 역전된 RNA 뉴클레오티드의 영향을 리포솜 형질감염에서 TMPRSS6을 표적화하는 GalNAc-siRNA 접합체를 사용하여 분석하였다. STS12009-L4는 모든 비-접합 말단에 포스포로티오에이트를 함유하는 반면, 테스트된 변이체는 센스 및 안티센스 가닥 둘 다의 3'-단부에 역전된 RNA 뉴클레오티드를 함유한다. 역전된 RNA 뉴클레오티드는 마지막 뉴클레오티드에 추가적으로 존재하고, 2개의 포스포로티오에이트를 치환하거나 (STS12009V10-L4 및 -V11-L4), 또는 말단 포스포로티오에이트에 추가적으로 사용된다 (STS12009V29-L4 및 STS12009V30-L4). 역전된 A (STS12009V10-L4 및 -V29-L4) 및 역전된 G (STS12009V11-L4 및 -V30-L4)가 사용되었다. 모든 테스트된 변이체가 테스트 조건 하에 유사한 활성을 나타낸다.
Hep3B에서 실험을 수행하였다. 세포를 6-웰 당 150,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 24시간 후에 5 nM 내지 0.0016 nM siRNA 및 1 μg/ml Atufect로 형질감염시키고, 48시간 후에 용해시켰다. 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 액틴 mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과가 도 23에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복의 평균 ± SD를 나타낸다.
하기 표 11에서 서열이 제시되고, 이는 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00084
표 11
표 11: 3' 단부에 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 siRNA 서열
실시예 22
개별적인 단부에 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정법. GalNAc가 센스 가닥의 5'-단부에 접합되었고, 4개의 PS에 의해 내부적으로 안정화된다. 포스포로디티오에이트 변형이 5'-안티센스 (STS12009V37L4), 3'-안티센스 (STS12009V36L4) 및 3'-센스 (STS12009V34L4) 단부에 놓였다. STS12009L4는 5'-안티센스, 3'-안티센스 및 3'-센스 단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유하고, GalNAc가 센스 5'-단부에 부착되고, 4개의 내부 PS에 의해 안정화된다. 5 μM GalNAc-siRNA 접합체를 50% FBS와 함께 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 결과가 도 24에 제시된다. "UT"는 미처리 샘플을 가리키고, "FBS"는 FBS 처리를 가리킨다. "대조군"은 상이한 서열의 덜 안정화된 GalNAc-siRNA 접합체를 가리킨다.
하기 표 12에서 서열이 제시되고, 이는 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00085
표 12
표 12: 개별적인 단부에 PS2 (포스포로디티오에이트)를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체.
실시예 23
개별적인 단부에 하나의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체의 활성. GalNAc가 센스 가닥의 5'-단부에 접합되었고, 4개의 PS에 의해 내부적으로 안정화된다. 포스포로디티오에이트 변형이 5'-안티센스 (STS12009V37L4), 3'-안티센스 (STS12009V36L4) 및 3'-센스 (STS12009V34L4) 단부에 놓였다. 마우스 1차 간세포에서 실험이 수행되었다. 세포를 6-웰 당 250,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 100 nM, 10 nM 및 1 nM GalNAc-siRNA로 처리하였다. 10 nM GalNAc-siRNA 및 1 μg/ml Atufect로의 형질감염이 대조군으로서의 역할을 하였다. 세포를 24시간 후에 용해시키고, 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 PTEN mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과가 도 25에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열은 상기 표 12에 기재된 바와 같다.
실시예 24
제2 가닥 5'-단부 및 제2 가닥 3'-단부에 각각 1개의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체 (STS12009V40L4)의 혈청 안정성 검정법. GalNAc가 제2 가닥의 5'-단부에 접합되었고, 어떠한 내부 PS에 의해서도 안정화되지 않는다. STS12009L4는 5'-안티센스, 3'-안티센스 및 3'-센스 단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유하고, GalNAc가 센스 5'-단부에 부착되고, 4개의 내부 PS에 의해 안정화된다. 5 μM GalNAc-siRNA 접합체를 50% FBS와 함께 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. 결과가 도 26에 제시된다. "UT"는 미처리 샘플을 가리키고, "FBS"는 FBS 처리를 가리킨다. "대조군"은 상이한 서열의 덜 안정화된 GalNAc-siRNA 접합체를 가리킨다.
하기 표 13에서 서열이 제시되고, 이는 서열식별번호: 17 (위) 및 서열식별번호: 18 (아래)에 상응한다.
Figure pct00086
표 13
표 13: 제2 가닥 5'-단부 및 제2 가닥 3'-단부에 각각 1개의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체.
실시예 25
센스 가닥 5'-단부 및 센스 가닥 3'-단부에 각각 1개의 PS2를 함유하는 GalNAc-siRNA 접합체 (STS12009V40L4)의 활성. GalNAc가 센스 가닥의 5'-단부에 접합되었고, 어떠한 내부 PS에 의해서도 안정화되지 않는다. STS12009L4는 5'-안티센스, 3'-안티센스 및 3'-센스 단부에 각각 2개의 말단 PS를 함유하고, GalNAc가 센스 5'-단부에 부착되고, 4개의 내부 PS에 의해 안정화된다. 마우스 1차 간세포에서 실험이 수행되었다. 세포를 6-웰 당 250,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 100 nM, 10 nM 및 1 nM GalNAc-siRNA로 처리하였다. 루시퍼라제에 대한 siRNA의 GalNAc 접합체 ("GalNAc-Luc")가 대조군으로서의 역할을 하였다. 24시간 후에 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 PTEN mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 결과가 도 27에 제시된다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
서열은 상기 표 13에 기재된 바와 같다.
실시예 26
유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 TMPRSS6 발현의 억제. HFE -/- 암컷 마우스 (Herrmann et al., J. Mol. Med (Berl), 2004 82, 39-48)를 각각 단일 용량의 1 또는 3 mg/kg의 GalNAc siRNA 접합체로 피하 처리하였다. 대조군은 피하 주사에 의해 PBS로 또는 비-표적화 대조군 GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc)로 처리하였다. 접합체를 주사하고 나서 3주 후에 qRT PCR에 의해 간 조직에서의 표적 유전자 발현을 평가하였다. 군 평균 및 +/- SD. 통계: 크루스칼-왈리스 검정과 미보정 던. siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 도시된다. 결과가 도 28에 제시된다. P 값: ****P<.001; ***P<0.005; **.01; *P<.05.
실시예 27
유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 혈청 헵시딘 수준의 증가. HFE -/- 마우스를 피하 주사에 의해 단일 용량의 1 또는 3 mg/kg의 GalNAc siRNA 접합체로 처리하였다. 대조군은 PBS로 또는 비-표적화 대조군 접합체 GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc)로 처리하였다. ELISA 키트 (인트린직 라이프 사이언스(Intrinsic Life Science))를 사용하여 접합체를 주사하고 나서 3주 후에 수집된 혈청 샘플에서 헵시딘 수준을 결정하였다. 군 평균 + SD. 대조군 (GN2-Luc siRNA)에 대한 크루스칼-왈리스 검정과 미보정 던 검정. 결과가 도 29에 제시된다. P 값: ****P<.001; ***P<0.005; **.01; *P<.05.
실시예 28
유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 혈청 철 수준의 감소. HFE -/- 마우스를 피하 투여에 의해 단일 용량의 1 또는 3 mg/kg의 GalNAc siRNA 접합체로 처리하였다. 대조군은 PBS로 또는 비-표적화 대조군 접합체 (GN2-Luc siRNA)로 처리하였다. 처리 3주 후에 혈청 철 수준을 결정하였다. 군 평균 +/- SD. 대조군 (GN2-Luc)에 대한 크루스칼-왈리스 검정과 미보정 던 검정. siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 도시된다. 결과가 도 30에 제시된다. P 값: ****P<.001; ***P<0.005; **.01; *P<.05.
실시예 29
유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 상이한 용량의 GalNAc siRNA에 의한 트랜스페린 포화의 감소. HFE -/- 마우스를 피하 투여에 의해 단일 용량의 1 또는 3 mg/kg의 GalNAc siRNA 접합체로 처리하였다. 대조군은 PBS로 또는 비-표적화 대조군 접합체 GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc)로 처리하였다. 처리 3주 후에 혈액 샘플 내의 % 트랜스페린 포화를 결정하였다. 군 평균 + SD. 대조군 (GN2-Luc)에 대한 크루스칼-왈리스 검정과 미보정 던 검정. siRNA 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 도시된다. 결과가 도 31에 제시된다. P 값: ****P<.001; ***P<0.005; **.01; *P<.05.
실시예 30
유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 불포화 철 결합능 (UIBC)의 증가. HFE -/- 마우스를 피하 투여에 의해 단일 용량의 1 또는 3 mg/kg의 GalNAc siRNA 접합체로 처리하였다. 대조군은 PBS로 또는 비-표적화 대조군 접합체 GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc)로 처리하였다. UIBC를 결정하기 위해 처리 3주 후에 혈청 샘플을 수집하였다. 군 평균 + SD. 대조군 (GN2-Luc)에 대한 크루스칼-왈리스 검정과 미보정 던 검정. 결과가 도 32에 제시된다. P 값: ****P<.001; ***P<0.005; **.01; *P<.05.
실시예 31
유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 GalNAc siRNA에 의한 조직 철 수준의 감소. HFE -/- 마우스를 피하 투여에 의해 단일 용량의 1 또는 3 mg/kg의 GalNAc siRNA 접합체로 처리하였다. 대조군은 PBS로 또는 비-표적화 대조군 접합체 GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc)로 처리하였다. 신장 조직에서의 철 수준을 처리 3주 후에 평가하였다. 대조군 (GN2-Luc)에 대한 박스 앤 휘스커 (터키, 중앙값) 크루스칼-왈리스 검정과 미보정 던 검정. 결과가 도 33에 제시된다.
실시예 32
Hep3B 세포에서의 상이한 siRNA들에 의한 TMPRSS6 mRNA 발현의 감소.
8000개의 세포/웰을 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 20 nM siRNA 및 1 μg/ml AtuFECT로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 용해시키고, TMPRSS6 mRNA 수준을 q-RT-PCR에 의해 결정하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 하우스 키핑 유전자 ApoB의 발현 수준에 대해 정규화하였다. 루시퍼라제에 대한 siRNA가 비-표적화 대조군으로서 사용되었다. 미처리 세포 대비 삼중 값의 평균 억제 및 표준 편차가 도 34에 제시된다. siRNA의 서열이 하기 표 14에 제시된다.
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
표 14
표 14: 실시예 32에서 테스트된 TMPRSS6에 대한 siRNA의 서열. fU, fA, fC, fG - 2'F 변형 데옥시뉴클레오티드. mU, mA, mC, mG - 2'O-메틸 변형된 뉴클레오티드.
실시예 33
Hep3B 세포에서의 TMPRSS6에 대한 siRNA의 용량-반응.
8000개의 세포/웰을 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 지시된 농도 (100 nM- 0.03 nM)의 siRNA 및 1 μg/ml AtuFECT로 형질감염시켰다. 형질감염 2일 후, 세포를 용해시키고, TMPRSS6 mRNA 수준을 q-RT-PCR에 의해 결정하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 하우스 키핑 유전자 ApoB의 발현 수준에 대해 정규화하였다. 100 nM의 비-표적화 루시퍼라제-대조군 siRNA로 처리된 세포 대비 삼중 값의 평균 억제 및 표준 편차가 도 35에 제시된다. 하기 표 15는 도 35에 제시된 용량-반응 곡선에 따른 최대 억제, IC50 및 95% 신뢰 구간을 나타낸다.
Figure pct00090
표 15
표 15: 도 35에 제시된 용량 반응에 따른 최대 억제, IC50 및 95% 신뢰 구간.
실시예 34
1° 인간 간세포에서의 수용체 매개 흡수에 의한 TMPRSS6 mRNA 발현의 억제.
1차 인간 간세포를 콜라겐 코팅 접시 접시에 플레이팅하고, 지시된 바와 같이 300 nM 내지 1 nM의 농도로 세포 배양 배지에 희석된 siRNA 접합체와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 siRNA 접합체에 노출시키고 나서 24시간 후에, 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 발현을 택맨 qRT-PCR에 의해 정량화하였다. TMPRSS6 mRNA 수준을 액틴 mRNA 수준, 및 비-표적화 대조군 siRNA 접합체 GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc)로 처리된 세포의 표적 mRNA 수준에 대해 정규화하였다. TMPRSS6 발현의 용량 의존적 억제가 GalNAc-TMPRSS6 siRNA 접합체에 의해 관찰되었다. 접합체의 서열 및 변형이 도 7에 도시된다. 결과가 도 36에 제시된다.
실시예 35
GalNAc TMPRSS6 siRNA가 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 적혈구용적률 값을 상승시킨다.
Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하였다. 제36일에, 전체 혈액 검사를 위해 전혈을 헤파린 코팅 튜브 내로 수집하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory) (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. 미처리 야생형 (WT) 마우스 (C57BL/6)로부터의 혈액 샘플을 수집하고, 비교용으로 분석하였다. 스캐터 도트 블롯, 평균 +/- SD; n=3-6. 통계: 비대응 t 검정 + 웰치 보정. 결과가 도 37에 제시된다.
실시예 36
GalNAc TMPRSS6 siRNA가 중간성 b-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 적혈구 분포 폭을 감소시킨다.
Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하였다. 제36일에, 전체 혈액 검사를 위해 전혈을 헤파린 코팅 튜브 내로 수집하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. 미처리 야생형 (WT) 마우스 (C57BL/6)로부터의 혈액 샘플을 수집하고, 비교용으로 분석하였다. 스캐터 도트 블롯, 평균 +/- SD; n=3-6. 통계: 비대응 t 검정 + 웰치 보정. 결과가 도 38에 제시된다.
실시예 37
GalNAc TMPRSS6 siRNA가 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 망상적혈구의 비율을 감소시킨다.
Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하였다. 제36일에, 전체 혈액 검사를 위해 전혈을 헤파린 코팅 튜브 내로 수집하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. 미처리 야생형 (WT) 마우스 (C57BL/6)로부터의 혈액 샘플을 수집하고, 비교용으로 분석하였다. 스캐터 도트 블롯, 평균 +/- SD; n=3-6. 통계: 비대응 t 검정 + 웰치 보정. 결과가 도 39에 제시된다.
실시예 38
GalNAc TMPRSS6 siRNA가 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 반응성 산소 종 (ROS)의 양을 감소시킨다. Hbbth3/+ 마우스 (Th3/+; Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP) 또는 GN2-Luc 1 siRNA (GN2-Luc) (비-표적화 대조군)를 피하 처리하였다. 제36일에, 전체 혈액 검사를 위해 전혈을 헤파린 코팅 튜브 내로 수집하였다. 지표물로서의 2'7' 디클로로-플루오레세인을 첨가하고 나서 5분 후에 ROS 측정을 수행하였다 (Siwaponanan et al., 2017 Blood, 129, 3087-3099). GN2-TMPRSS6 hcm9 처리 마우스로부터의 혈액 샘플을 2회 측정하였다. Hbb th3/+ 마우스 (Th3/+)는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. 미처리 야생형 (WT) 마우스 (C57BL/6)로부터의 혈액 샘플을 수집하고, 비교용으로 분석하였다. 스캐터 도트 블롯, 평균 +/- SD; n=4-6. 통계: 비대응 t 검정 + 웰치 보정. 결과가 도 40에 제시된다.
실시예 39
GalNAc TMPRSS6 siRNA가 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 헤모글로빌 수준을 상승시킨다. Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc-siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하였다. 제36일에, 전체 혈액 검사를 위해 전혈을 헤파린 코팅 튜브 내로 수집하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. 미처리 야생형 (wt) 마우스 (C57BL/6)로부터의 혈액 샘플을 수집하고, 비교용으로 분석하였다. 스캐터 도트 블롯, 평균 +/- SD; n=5-7. 통계: 다중 비교에 대해 보정되지 않은 웰치 t-검정. 결과가 도 41에 제시된다. siRNA 접합체가 도 7에 도시된다.
실시예 40
GalNAc TMPRSS6가 중간성 β-지중해빈혈에 대한 설치류 모델에서 비장비대를 감소시킨다. Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc-siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하였다. 제39일에, 비장 중량을 평가하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. PBS로 처리된 야생형 (wt) 마우스 (C57BL/6)로부터의 비장 중량을 비교용으로 평가하였다. 스캐터 도트 블롯, 평균 +/- SD; n=5-7. 통계: 다중 비교에 대해 보정되지 않은 웰치 t-검정. 결과가 도 42에 제시된다. siRNA 접합체가 도 7에 도시된다.
실시예 41
GalNAc TMPRSS6가 골수에서 적혈구 성숙을 개선시킨다. Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc-siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하고, 제39일에 골수로부터 세포를 수집하고, FACS 분석에 의해 분석하였다. CD71, Ter119 및 CD44 염색을 기반으로 하여 별개의 집단들로부터 생육성 적혈구계 세포를 분리하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. PBS로 처리된 야생형 (wt) 마우스 (C57BL/6)의 골수로부터의 적혈구계 세포를 비교용으로 평가하였다. 막대 그래프, 평균 +/- SD; n=5-7. 통계: 다중 비교에 대해 보정되지 않은 웰치 t-검정. 결과가 도 43에 제시된다. siRNA 접합체가 도 7에 도시된다.
실시예 42
GalNAc TMPRSS6이 비장에서 무효 적혈구생성을 감소시킨다. Hbbth3/+ 마우스 (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612)에 d1 및 d15에 3 mg/kg GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc) 또는 PBS (각각 비-표적화 대조군 또는 비히클 대조군)를 피하 처리하였다. 제39일에, 비장으로부터 세포를 수집하고, FACS 분석에 의해 분석하였다. CD71, Ter119 및 CD44 염색을 기반으로 하여 별개의 집단들로부터 생육성 적혈구계 세포를 분리하였다. Hbb th3/+ 마우스는 잭슨 래버러토리 (메인주, 바 하버)로부터 수득되었고, C57BL/6 배경에서 유지되었다. PBS로 처리된 야생형 (wt) 마우스 (C57BL/6)로부터의 적혈구계 세포를 비교용으로 평가하였다. 막대 그래프, 평균 +/- SD; n=5-7. 통계: 다중 비교에 대해 보정되지 않은 웰치 t-검정. 결과가 도 44에 제시된다. siRNA 접합체가 도 7에 도시된다.
실시예 43
GalNAc siRNA 접합체에 의한 인간 간 세포에서의 TMPRSS6 발현의 감소.
30,000 cpw 인간 1차 간세포를 콜라겐-코팅 96-웰 플레이트에 시딩하였다. 플레이팅 직후에, 세포를 지시된 양의 siRNA 접합체로 처리하였다. 처리 24시간 후에 세포를 용해시키고, TMPRSS6 mRNA 발현을 택맨 qRT-PCR에 의해 분석하였다. ApoB (하우스키퍼) 및 미처리 세포의 평균에 대해 정규화된 TMPRSS6의 삼중 값이 제시된다.
결과가 도 45a, 45b 및 도 46에 제시되고, 서열이 도 47에 제시된다.
기술된 GN3 링커가 도 8c에 제시된다.
실시예 44
말단 위치 및 GalNAc 모이어티 내에 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 포스포디에스테르를 갖는 GalNAc-siRNA 접합체의 혈청 안정성 검정법. GalNAc가 센스 가닥의 5'-단부에 접합되었고, 4개의 PS에 의해 내부적으로 안정화되거나 (STS12009L4), 또는 그렇지 않고, 포스포디에스테르 연결이 대신 사용된다 (STS12009V54L50 - V57L50). 포스포로디티오에이트 변형이 제1 가닥 5'-단부를 제외한 듀플렉스의 모든 말단 위치에 놓이거나 (-V54L50), 3'-단부에만 놓이거나 (-V55L50, -V57L50), 또는 제2 가닥의 3'-단부에만 놓였다 (-V56L50). 특정 디자인에서, 포스포디에스테르가 siRNA 듀플렉스의 말단 위치에서 사용되었다 (-V56L50, -V57L50). 5 μM GalNAc-siRNA 접합체를 50% FBS와 함께 3일 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. RNA를 추출하고, 20% TBE 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다. "UT"는 미처리 샘플을 가리키고, "FBS"는 FBS 처리를 가리킨다. "대조군"은 상이한 서열의 덜 안정화된 GalNAc-siRNA 접합체를 가리킨다.
상이한 단부 안정화 화학 (포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포디에스테르)을 함유하는 TMPRSS6을 표적화하는 siRNA의 GalNAc 접합체를 1차 마우스 간세포에서의 수용체-매개 흡수에 의해 테스트하였다. GalNAc가 제2 가닥의 5'-단부에 접합되었고, 4개의 PS에 의해 내부적으로 안정화되거나 (STS12009L4), 또는 그렇지 않고, 포스포디에스테르 연결이 대신 사용된다 (STS12009V54L50 - V57L50). 포스포로디티오에이트 변형이 제1 가닥 5'-단부를 제외한 듀플렉스의 모든 말단 위치에 놓이거나 (-V54L50), 3'-단부에만 놓이거나 (-V55L50, -V57L50), 또는 제2 가닥의 3'-단부에만 놓였다 (-V56L50). 특정 디자인에서, 포스포디에스테르가 siRNA 듀플렉스의 말단 위치에서 사용되었다 (-V56L50, -V57L50). 마우스 1차 간세포에서 실험이 수행되었다. 세포를 96-웰 당 20,000개의 세포의 밀도로 시딩하고, 125 nM 내지 0.2 nM GalNAc-siRNA로 처리하였다. 24시간 후 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출하고, TMPRSS6 및 PTEN mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복의 평균 ± SD를 나타낸다.
결과 및 관련 서열이 도 48-50에 제시된다.
실시예 45
제1 가닥의 5' 위치에서 2'-O-메틸-우리딘 또는 5'-(E)-비닐포스포네이트-2'-O-메틸-우리딘이 2'-O-메틸-아데닌을 교체하는 GalNAc siRNA 접합체에 의한 1차 뮤린 간세포에서의 TMPRSS6 발현의 감소.
뮤린 1차 간세포를 콜라겐으로 미리 코팅된 96웰 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific), #A1142803) 내로 30,000개의 세포/웰의 세포 밀도로 시딩하고, 100 nM 내지 0.1 nM 범위의 농도의 siRNA-접합체로 처리하였다. 처리 24시간 후, 세포를 용해시키고, RNA를 제조사의 프로토콜에 따라 인비트랩(InviTrap)® RNA 세포 HTS 96 키트 / C24 x 96 프렙 (스트라텍(Stratec) #7061300400)으로 추출하였다. TMPRSS6 및 하우스키핑 mRNA (PtenII)의 전사체 수준을 택맨 분석에 의해 정량화하였다.
siRNA 접합체:
Figure pct00091
택맨 프라이머 및 프로브
Figure pct00092
시험관내 용량 반응
지시된 농도의 안티센스 가닥의 5'-위치의 비닐-(E)-포스포네이트 2'OMe-우라실 및 처음 3개의 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결 (STS12209V4L4), 안티센스 가닥의 5'-위치의 비닐-(E)-포스포네이트 2'OMe-우라실 및 처음 3개의 뉴클레오티드 사이의 포스포디에스테르 결합 (STS12209V5L4), 2'-O-메틸-우라실 및 5' 위치의 처음 3개의 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결 (STS12209L4), 또는 5'-위치에 2'-O-메틸-우라실 및 처음 3개의 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포디에스테르 연결 (STS12209V1L4)을 보유하는 TMPRSS6-siRNA, 또는 기준물질로서의 (STS12009L4), 또는 비-표적화 GalNAc-siRNA (STS18001)로 처리하고 나서 24시간 후 또는 미처리 (UT)의 1차 뮤린 간세포에서의 표적 유전자 발현.
결과가 도 51에 제시된다.
혈청 안정성
50% FCS, 37℃에서 4시간 (4h) 또는 3일 (3d) 동안 인큐베이션되거나 또는 미처리 (0h)인 siRNA 접합체의 혈청 안정성. 이어서 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 추출에 의해 RNA를 추출하였다. TBE-폴리아크릴아미드-겔-전기영동 및 RNA를 SybrGold로 염색하는 것에 의해 분해가 가시화되었다.
결과가 도 52에 제시된다: 뉴클레아제 분해에 대한 siRNA-접합체 대 덜 안정화된 양성 대조군의 혈청 안정성.
실시예 46
1형 유전성 혈색소증에 대한 동물 모델에서의 TMPRSS6 siRNA 치료에 의한 트랜스페린 포화의 감소. 3개월령 C57BL6/J 유사유전자형 암컷 HFE 녹-아웃 마우스 (-/-) 및 3개월령 암컷 C57BL6/J 야생형 마우스 (+/+)가 이러한 연구에서 사용되었다 (Herrmann et al., Mol. Med, 2004. 82 (1): p1-3). HFE -/- 마우스 (n=8)에 제1일 (1×) 또는 제1일 및 제22일 (2×)에 PBS (PBS) 또는 3 mg/kg TMPRSS6 siRNA 접합체 (TMP) 또는 3 mg/kg 비-표적화 siRNA 접합체 (Luc)를 피하 처리하였다. 추가적으로, 코호트 7 내지 10은 0.5 mg/ml의 농도로 음용수에 공급된 데페리프론을 받았다. 코호트 1 및 2는 제1일 (투약전)에 종결하고, 모든 다른 코호트는 제43일 (처리 시작 6주 후)에 종결하여, 분석용으로 혈청 및 조직 샘플을 수집하였다.
혈청 철 수준 (SFBC) 및 불포화 철 결합 능력 UIBC을 열량측정 방법에 의해 평가하였다. 트랜스페린 포화 (Tf Sat)를 하기 식을 사용하여 계산하였다: TfSat=(SFBC/TIBC)X100. 처리 단계를 시작할 때 3개월령 HFE -/- 마우스에서 트랜스페린 포화가 상승된다 (코호트 2, 투약전). 단독으로 또는 데페리프론과 조합하여 TMPRSS6 siRNA 접합체로 처리하는 것이 유전성 혈색소증 및 철 과부하에 대한 이러한 설치류 모델에서 트랜스페린 포화를 감소시켰다.
결과가 도 53에 제시된다.
siRNA 접합체:
Figure pct00093
실시예 47
TMPRSS6 siRNA로의 처리가 철 킬레이터에 의한 조직 철 수준의 감소를 강화한다. 3개월령 HFE -/- (유전성 혈색소증 및 철 과부하에 대한 설치류 모델) 또는 야생형 마우스가 이러한 연구에 사용되었고, 실시예 46에 기술된 바와 같이 처리되었다. 간 조직 샘플을 수집하여, 처리 시작 전 (투약전) 및 제43일 (처리 시작 6주 후)의 연구 종료 시의 간 철 농도를 평가하였다. 간 조직 샘플을 건조시키고, 건조 중량으로부터의 철 농도를 산 추출 방법에 의해 결정하였다. 연구 시작 시, 간 철 수준이 야생형 대조군 마우스에 비교하여 HFE -/-에서 이미 상승되었다 (투약전). 데페리프론과 조합된 TMPRSS6 siRNA 접합체로의 HFE -/- 마우스 처리가 철 킬레이터에 의한 조직 철 수준의 감소를 강화하였다. 달리 말하면, 조합된 siRNA/철 킬레이터 처리가 siRNA 또는 킬레이터 단독으로의 처리에 의해 달성된 것보다 간 내의 철 함량의 훨씬 더 큰 감소에 이르렀다 (칼럼 5 및 9 또는 6 및 10을 비교한다). 이것은 siRNA 단독 (칼럼 3과 칼럼 5 및 6을 비교한다) 또는 철 킬레이터 단독 (칼럼 7)으로의 처리가 간 철 함량에 거의 효과가 없기 때문에 뜻밖이다. 간 철 함량이 다중 용량의 siRNA의 투여에 의해 추가로 감소된다 (칼럼 9 및 10을 비교한다).
siRNA 접합체는 실시예 46에 기술된 바와 같고, 결과는 도 54에 제시된다.
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
Figure pct00097
Figure pct00098
Figure pct00099
Figure pct00100
Figure pct00101
Figure pct00102
Figure pct00103
Figure pct00104
Figure pct00105
Figure pct00106
Figure pct00107
Figure pct00108
Figure pct00109
Figure pct00110
Figure pct00111
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
특정한 링커 또는 변형된 연결, 예컨대 PS, PS2, GN, GN2, GN3 등이 RNA 서열에서 교시되는 경우, 이는 서열의 임의적인 부분이지만, 그러한 서열의 바람직한 실시양태이다.
하기 약어가 사용될 수 있다:
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
SEQUENCE LISTING <110> Silence Therapeutics GmbH <120> Nucleic acids for inhibiting expression of TMPRSS6 and iron chelators <130> O34526.00285 <150> EP18185879.6 <151> 26.07.2018 <160> 449 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 1 augucuuuca cacuggcuu 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 2 aagccagugu gaaagacau 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 3 auugaguaca cgcagacug 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 4 cagucugcgu guacucaau 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 5 aaguugaugg ugaucccgg 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 6 ccgggaucac caucaacuu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 7 uucuggaucg uccacuggc 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 8 gccaguggac gauccagaa 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 9 auucacagaa 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end of the description <400> 62 guuccucugu ucugugaau 19 <210> 63 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 63 cggccuggau gagagaaac 19 <210> 64 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 64 cauucaccuu ccaguguga 19 <210> 65 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 65 cggggucgac acaucugug 19 <210> 66 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 66 agaggacagc caugacuac 19 <210> 67 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at 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modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 195 uauuccaaag ggcagcuga 19 <210> 196 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 196 ucagcugccc uuuggaaua 19 <210> 197 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 197 aucuucuggg cuuuggcgg 19 <210> 198 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 198 ccgccaaagc ccagaagau 19 <210> 199 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 199 uuuucucuug gaguccuca 19 <210> 200 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 200 ugaggacucc aagagaaaa 19 <210> 201 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 201 gaauagacgg agcuggagu 19 <210> 202 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 202 acuccagcuc cgucuauuc 19 <210> 203 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 203 uaguagcugg ggaaguacg 19 <210> 204 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 204 cguacuuccc cagcuacua 19 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 205 agauccuggg agaaguggc 19 <210> 206 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 206 gccacuucuc ccaggaucu 19 <210> 207 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 207 cuguucugga ucguccacu 19 <210> 208 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 208 aguggacgau ccagaacag 19 <210> 209 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 209 cucaccuuga aggacaccu 19 <210> 210 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 210 agguguccuu caaggugag 19 <210> 211 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 211 aguuucucuc auccaggcc 19 <210> 212 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 212 ggccuggaug agagaaacu 19 <210> 213 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 213 guacccuagg aaauaccag 19 <210> 214 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 214 cugguauuuc cuaggguac 19 <210> 215 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agcagguga 19 <210> 220 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 220 ucaccugcuu cuucugguu 19 <210> 221 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 221 aaccagaaga agcagguga 19 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 222 ucaccugcuu cuucugguu 19 <210> 223 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 223 ucgaaguauu ccgcguacg 19 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 224 cguacgcgga auacuucga 19 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 225 aaccagaaga agcagguga 19 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 226 ucaccugcuu cuucugguu 19 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 227 aaccagaaga agcagguga 19 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 228 ucaccugcuu cuucugguu 19 <210> 229 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <220> <223> modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the 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19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 356 cugaggacgc ccugggagu 19 <210> 357 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 357 acucccaggg cguccucag 19 <210> 358 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 358 gcugaggacg cccugggag 19 <210> 359 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 359 cucccagggc guccucagc 19 <210> 360 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 360 ugcugaggac gcccuggga 19 <210> 361 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 361 ucccagggcg uccucagca 19 <210> 362 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 362 gugcugagga cgcccuggg 19 <210> 363 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 363 cccagggcgu ccucagcac 19 <210> 364 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 364 ggugcugagg acgcccugg 19 <210> 365 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 365 ccagggcguc cucagcacc 19 <210> 366 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 366 gggugcugag gacgcccug 19 <210> 367 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 367 cagggcgucc ucagcaccc 19 <210> 368 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 368 cggggugcug aggacgccc 19 <210> 369 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 369 gggcguccuc agcaccccg 19 <210> 370 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 370 acggggugcu gaggacgcc 19 <210> 371 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 371 ggcguccuca gcaccccgu 19 <210> 372 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 372 uacggggugc ugaggacgc 19 <210> 373 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 373 gcguccucag caccccgua 19 <210> 374 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 374 guacggggug cugaggacg 19 <210> 375 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 375 cguccucagc accccguac 19 <210> 376 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 376 aguacggggu gcugaggac 19 <210> 377 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 377 guccucagca ccccguacu 19 <210> 378 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 378 aaguacgggg ugcugagga 19 <210> 379 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 379 uccucagcac cccguacuu 19 <210> 380 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 380 ggaaguacgg ggugcugag 19 <210> 381 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 381 cucagcaccc cguacuucc 19 <210> 382 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 382 gggaaguacg gggugcuga 19 <210> 383 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 383 ucagcacccc guacuuccc 19 <210> 384 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 384 ggggaaguac ggggugcug 19 <210> 385 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 385 cagcaccccg uacuucccc 19 <210> 386 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 386 uggggaagua cggggugcu 19 <210> 387 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 387 agcaccccgu acuucccca 19 <210> 388 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 388 cuggggaagu acggggugc 19 <210> 389 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 389 gcaccccgua cuuccccag 19 <210> 390 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 390 agcuggggaa guacggggu 19 <210> 391 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 391 accccguacu uccccagcu 19 <210> 392 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 392 uagcugggga aguacgggg 19 <210> 393 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 393 ccccguacuu ccccagcua 19 <210> 394 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 394 guagcugggg aaguacggg 19 <210> 395 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 395 cccguacuuc cccagcuac 19 <210> 396 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 396 aguagcuggg gaaguacgg 19 <210> 397 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 397 ccguacuucc ccagcuacu 19 <210> 398 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 398 guaguagcug gggaaguac 19 <210> 399 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 399 guacuucccc agcuacuac 19 <210> 400 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 400 aguaguagcu ggggaagua 19 <210> 401 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 401 uacuucccca gcuacuacu 19 <210> 402 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 402 gaguaguagc uggggaagu 19 <210> 403 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 403 acuuccccag cuacuacuc 19 <210> 404 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 404 cgaguaguag cuggggaag 19 <210> 405 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 405 cuuccccagc uacuacucg 19 <210> 406 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 406 gcgaguagua gcuggggaa 19 <210> 407 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 407 uuccccagcu acuacucgc 19 <210> 408 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 408 ggcgaguagu agcugggga 19 <210> 409 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 409 uccccagcua cuacucgcc 19 <210> 410 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 410 gggcgaguag uagcugggg 19 <210> 411 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 411 ccccagcuac uacucgccc 19 <210> 412 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 412 ggggcgagua guagcuggg 19 <210> 413 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 413 cccagcuacu acucgcccc 19 <210> 414 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 414 uggggcgagu aguagcugg 19 <210> 415 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 415 ccagcuacua cucgcccca 19 <210> 416 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 416 uuggggcgag uaguagcug 19 <210> 417 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 417 cagcuacuac ucgccccaa 19 <210> 418 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 418 uauuccaaag ggcagcuga 19 <210> 419 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 419 ucagcugccc uuuggaaua 19 <210> 420 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 420 aucuucuggg cuuuggcgg 19 <210> 421 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 421 ccgccaaagc ccagaagau 19 <210> 422 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 422 uuuucucuug gaguccuca 19 <210> 423 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 423 ugaggacucc aagagaaaa 19 <210> 424 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 424 gaauagacgg agcuggagu 19 <210> 425 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 425 acuccagcuc cgucuauuc 19 <210> 426 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 426 uaguagcugg ggaaguacg 19 <210> 427 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 427 cguacuuccc cagcuacua 19 <210> 428 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 428 agauccuggg agaaguggc 19 <210> 429 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 429 gccacuucuc ccaggaucu 19 <210> 430 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 430 cuguucugga ucguccacu 19 <210> 431 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 431 aguggacgau ccagaacag 19 <210> 432 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 432 cucaccuuga aggacaccu 19 <210> 433 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 433 agguguccuu caaggugag 19 <210> 434 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 434 aguuucucuc auccaggcc 19 <210> 435 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 435 ggccuggaug agagaaacu 19 <210> 436 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 436 guacccuagg aaauaccag 19 <210> 437 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 437 cugguauuuc cuaggguac 19 <210> 438 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 438 cuguugacug uggacagca 19 <210> 439 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 439 ugcuguccac agucaacag 19 <210> 440 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 440 uaccagaaga agcagguga 19 <210> 441 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 441 ucaccugcuu cuucuggua 19 <210> 442 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 442 ucgaaguauu ccgcguacg 19 <210> 443 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 443 cguacgcgga auacuucga 19 <210> 444 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 444 caccgccaaa tttaactgca ga 22 <210> 445 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 445 aagggtttga taagttctag ctgt 24 <210> 446 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 446 tgcacagtat ccttttgaag accataaccc a 31 <210> 447 <211> 17 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 447 ccgccaaagc ccagaag 17 <210> 448 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 448 ggtccctccc caaaggaata g 21 <210> 449 <211> 28 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 449 cagcacccgc ctgggaactt actacaac 28

Claims (18)

  1. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 조합물로서,
    여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물.
  2. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망, 바람직하게는 혈색소증의 치료에서의 사용을 위한 조합물로서,
    조합물은 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물.
  3. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망, 바람직하게는 혈색소증의 치료에서의 사용을 위한 핵산으로서,
    여기서 핵산은 TMPRSS6의 발현을 억제하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    여기서 핵산은 하나 이상의 철 킬레이터와 함께 투여되는 것인 핵산.
  4. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 키트로서,
    여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 키트.
  5. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 제약 조성물로서,
    여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333 , 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    여기서 핵산, 철 킬레이터 또는 둘 다는 생리학상 허용되는 부형제와 조합된 것인 제약 조성물.
  6. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망, 바람직하게는 혈색소증의 치료에서의 사용을 위한 제약 조성물로서,
    여기서 제약 조성물은 TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 상기 제1 가닥은 하기 서열: 서열식별번호: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440, 또는 442로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    여기서 핵산, 철 킬레이터 또는 둘 다는 생리학상 허용되는 부형제와 조합된 것인 제약 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 가닥이 서열식별번호: 334, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441, 또는 443의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 철 킬레이터가 데페록사민, 데페리프론, 데페라시록스 (엑스자이드(Exjade)) 및 데페라시록스 (자데누(Jadenu))로부터 선택되고, 임의적으로 철 킬레이터가 데페리프론인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥 상의 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되어, 변형된 뉴클레오티드를 형성하는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제1 가닥이 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 제2 가닥이 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 또는 사용을 위한 핵산:
    Figure pct00118

    여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
    1=2'F-dU,
    2=2'F-dA,
    3=2'F-dC,
    4=2'F-dG,
    5=2'-OMe-rU;
    6=2'-OMe-rA;
    7=2'-OMe-rC;
    8=2'-OMe-rG.
  11. TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 데페리프론을 포함하는 조합물로서,
    여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물.
  12. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망, 바람직하게는 혈색소증의 치료에서의 사용을 위한 조합물로서,
    TMPRSS6의 발현을 억제하기 위한 핵산 및 데페리프론을 포함하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 조합물.
  13. 혈색소증, 지연성 피부 포르피린증, 혈액 장애, 예컨대 β-지중해빈혈 또는 겸상 적혈구 질환, 선천성 적혈구생성이상 빈혈, 골수 부전 증후군, 골수이형성증, 수혈성 철 과부하, 철 과부하와 연관된 장애, 철 과부하와 연관된 파킨슨병, 알츠하이머병 또는 프리드라이히 운동실조, 및 골수 이식과 연관된 감염 및 비-재발 관련 사망, 바람직하게는 혈색소증의 치료에서의 사용을 위한 핵산으로서,
    여기서 핵산은 TMPRSS6의 발현을 억제하며, 여기서 핵산은 제1 가닥의 적어도 일부분 및 제1 가닥에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 제2 가닥의 적어도 일부분을 포함하는 적어도 하나의 듀플렉스 영역을 포함하며, 여기서 상기 제1 가닥은 TMPRSS6 유전자로부터 전사된 RNA의 적어도 일부분에 대해 적어도 부분적으로 상보적이며, 여기서 제1 가닥은 서열식별번호: 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 제2 가닥은 서열식별번호: 18의 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    여기서 핵산은 데페리프론과 함께 투여되는 것인 핵산.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터가 동시에, 별개로, 또는 순차적으로 투여되는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이, 임의적으로 제2 가닥의 5' 단부에서, 리간드에 접합되고, 임의적으로 여기서 리간드가 (i) 하나 이상의 N-아세틸 갈락토스아민 (GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하며, 여기서 링커는 GalNAc 모이어티를 핵산에 접합시키는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 접합된 핵산이 하기 구조를 갖는 것인 조합물, 사용을 위한 조합물, 사용을 위한 핵산, 키트, 조성물 또는 사용을 위한 조성물:
    Figure pct00119

    Figure pct00120

    Figure pct00121

    Figure pct00122

    Figure pct00123

    여기서 Z는 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 핵산이다.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 어느 한쪽 또는 양쪽 가닥의 5' 및/또는 3' 단부에서 안정화되고, 임의적으로
    핵산이, 하기 구조를 갖는, 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각 사이 및 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결, 및 제2 가닥의 3' 단부의 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 2개의 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 것인
    조합물, 사용을 위한 조합물, 또는 사용을 위한 핵산, 또는 접합된 핵산:
    Figure pct00124

    여기서 구체적 변형은 하기 번호에 의해 나타내어짐:
    1=2'F-dU,
    2=2'F-dA,
    3=2'F-dC,
    4=2'F-dG,
    5=2'-OMe-rU;
    6=2'-OMe-rA;
    7=2'-OMe-rC;
    8=2'-OMe-rG
    (ps) = 포스포로티오에이트 연결.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 접합된 핵산 및 하나 이상의 철 킬레이터를 포함하는 조합물을 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
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