BR112021001181A2 - ácidos nucleicos para inibir a expressão de tmprss6 e quelantes de ferro - Google Patents

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Abstract

"ÁCIDOS NUCLEICOS PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE TMPRSS6 E QUELANTES DE FERRO". A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nucleico que interferem na expressão do gene TMPRSS6 ou inibem sua expressão em combinação com um ou mais quelantes de ferro e possivelmente outros agentes ativos, bem como usos terapêuticos, tal como para o tratamento de hemocromatose, porfiria e transtornos sanguíneos, tais como ß-talassemia, anemia falciforme e sobrecarga transfusional de ferro ou síndrome mielodisplásica e infecções e mortalidade não relacionada à recidiva associada ao transplante de medula óssea.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ÁCIDOS NUCLEICOS PARA INIBIR A EXPRESSÃO DE TMPRSS6 E QUE- LANTES DE FERRO".
[0001] A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nu- cleico que interferem com a expressão do gene de TMPRSS6 ou inibem sua expressão, em combinação com outros agentes ativos, e usos tera- pêuticos, tal como para o tratamento de hemocromatose, porfiria e do- enças sanguíneas, como β-talassemia, anemia falciforme e sobrecarga transfusional de ferro e infecções e mortalidade não relacionada à reci- diva associada ao transplante de medula óssea. Antecedentes
[0002] Foi mostrado que o RNA fita dupla (dsRNA) capaz de se ligar de forma complementar ao mRNA expresso é capaz de bloquear a ex- pressão gênica (Fire et al., 1998, Nature. 19 de fevereiro de 1998; 391 (6669): 806-11 e Elbashir et al., 2001, Nature. 24 de maio de 2001; 411 (6836): 494-8) por meio de um mecanismo que foi denominado interfe- rência de RNA (RNAi). Os dsRNAs curtos controlam o silenciamento pós-transcricional específico para gene em muitos organismos, inclu- indo os vertebrados, e se tornaram uma ferramenta útil para o estudo da função do gene. O RNAi é mediado pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RNA-Induced Silencing Complex, RISC), uma nu- clease de múltiplos componentes específica para sequência que destrói RNAs mensageiros homólogos ao gatilho de silenciamento carregado no complexo RISC. RNA interferente (iRNA), tais como siRNAs, RNA antissenso e micro-RNA, são oligonucleotídeos que impedem a forma- ção de proteínas através de silenciamento gênico, isto é, inibição da tradução gênica da proteína através da degradação de moléculas de mRNA. Os agentes de silenciamento gênico estão se tornando cada vez mais importantes para aplicações terapêuticas em medicina.
[0003] De acordo com Watts e Corey no Journal of Pathology (2012; Vol. 226, páginas 365-379), há algoritmos que podem ser usados para projetar gatilhos de silenciamento de ácidos nucleicos, porém, todos eles têm limitações sérias. Podem ser necessários vários métodos ex- perimentais para identificar siRNAs potentes, uma vez que os algoritmos não levam em conta fatores tais como a estrutura terciária do mRNA alvo ou o envolvimento de proteínas de ligação ao RNA. Portanto, a descoberta de um gatilho de silenciamento de ácidos nucleicos potente com efeitos mínimos fora do alvo é um processo complexo. Para o de- senvolvimento farmacêutico destas moléculas altamente carregadas, é necessário que elas possam ser sintetizadas de forma econômica, dis- tribuídas aos tecidos alvo, entrar nas células e funcionar dentro de limi- tes aceitáveis de toxicidade.
[0004] A matriptase-2 (MT-2) é o produto do gene de TMPRSS6. A MT-2 é uma serina protease transmembrana de tipo II que desempenha um papel crítico na regulação da homeostase do ferro. A MT-2 é um regulador negativo para a expressão gênica do hormônio peptídico hep- cidina. A hepcidina é predominantemente produzida e secretada pelo fígado. A hepcidina regula o equilíbrio de ferro no organismo, atuando como um regulador negativo da absorção gastrintestinal de ferro e libe- ração de ferro das reservas celulares. A regulação positiva da hepcidina leva a uma redução na disponibilidade de ferro dentro do organismo (McDonald et al., American Journal of Physiology, 2015, vol 08 Nº. 7, C539-C547). Os níveis de hepcidina são baixos em pacientes com so- brecarga de ferro. Portanto, um possível alvo para reduzir a sobrecarga de ferro é aumentar a Hepcidina ao silenciar a expressão do gene de TMPRSS6 no fígado.
[0005] O TMPRSS6 é expresso principalmente no fígado, embora altos níveis de mRNA de TMPRSS6 também sejam encontrados no rim,
com níveis mais baixos no útero e quantidades muito menores detecta- das em muitos outros tecidos (Ramsay et al., Haematologica (2009), 94 (*6)), 84-849).
[0006] Vários transtornos estão associados à sobrecarga de ferro, uma condição caracterizada pelo aumento dos níveis sanguíneos e te- ciduais de ferro, tais como hemocromatose hereditária, porfiria cutânea tardia e transtornos sanguíneos, tais como -talassemia, anemia side- roblástica congênita (CSA), anemia disertropoiética congênita (CDA), síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia e anemia falciforme (DF). Além disso, todas as populações de pacientes que recebem trans- fusões regulares de sangue correm risco de desenvolver sobrecarga transfusional de ferro (Coates, Free Rad Biol Med 2014, v. 72, 23-40, Bulaj et al., Blood 2000, v. 95, 1565-71). Tanto um artigo de Nai et al (Blood, 2012, v. 119, Nº 21, páginas 5021-5027) quanto Guo et al (The Journal of Clinical Investigation, 2013, v. 123, Nº 4, páginas 1531-1541) mostram como uma eliminação ou redução da expressão de TMPRSS6 foi eficaz no tratamento de β-talassemia em camundongos. Um artigo de Schmidt (2013, Blood, Vol. 121, 7, páginas 1200-1208) explora o uso de ácidos nucleicos de TMPRSS6 para diminuir a sobrecarga de ferro em modelos de hemocromatose hereditária e β-talassemia em camun- dongos. Em ambos os modelos, os autores determinaram que nanopar- tículas lipídicas - tratamento com ácidos nucleicos de TMPRSS6 induzi- ram à hepcidina e diminuíram os níveis de ferro teciduais e séricos por até 21 dias. Além disso, um artigo de Schmidt et al. (American Journal of Hematology, 2015, Vol. 90, No. 4, páginas 310-313) demonstrou que o ácido nucleico de LNP-TMPRSS6 mais terapia oral com o quelante de ferro deferiprona reduziam a sobrecarga de ferro secundária no modelo de β-talassemia em camundongos.
[0007] Além disso, há evidências de que pacientes com sobrecarga de ferro submetidos a transplante de medula óssea apresentam um risco aumentado de infecção e mortalidade não relacionada à recidiva. Níveis aumentados de ferro sistêmico aumentam o risco de infecções em virtude do comprometimento da imunidade e aumento da virulência microbiana. Os pacientes que recebem transplantes de medula óssea são particularmente vulneráveis a infecções, uma vez que o condiciona- mento citotóxico necessário para preparar os pacientes para o trans- plante faz a ablação de sua medula óssea e também aumenta os níveis de ferro sistêmico, pois a eritropoiese é prejudicada. Além disso, níveis elevados de ferro sistêmico podem ter um impacto negativo sobre a im- plantação e crescimento das células-tronco do doador enxertadas.
[0008] Reduzir a sobrecarga de ferro e os níveis sistêmicos de ferro antes e durante o condicionamento de pacientes que receberam trans- plante de medula óssea pode reduzir o risco de infecções e mortalidade não relacionada à recidiva (Wermke et al., 2018, Lancet Haematol. Maio; 5 (5): e201-e210).
[0009] Consequentemente, são necessários atualmente métodos para o tratamento eficaz de transtornos associados à sobrecarga de ferro e a presente invenção aborda esta necessidade.
[0010] A invenção se refere a um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção em combina- ção com um ou mais quelantes de ferro. Ácidos Nucleicos e Ácidos Nucleicos Conjugados
[0011] Um primeiro aspecto descrito no presente documento refere- se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que com- preende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma se- gunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 327, 331, 331, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442 ou a primeira fita compreende uma sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 1 29.133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215.
[0012] Um outro aspecto relacionado é um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dú- plex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcial- mente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365,
367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435,437, 439, 441 ou 443 ou a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como uma sequência selecionada a partir das se- guintes: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou
216.
[0013] Determinados ácidos nucleicos são preferidos em todos os aspectos da invenção. Em particular:
[0014] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 333 e/ou a segunda fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 334. 333 TMPRSS6-hcm-9A aaccagaagaagcagguga 334 TMPRSS6-hcm-9B ucaccugcuucuucugguu
[0015] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 17 e/ou a segunda fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18, isto é: SEQ ID 17 TMPRSS6-hcm-9A 6273646282647284546
SEQ ID 18 TMPRSS6-hcm-9B 1727354715351718451
[0016] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 422 e/ou a segunda fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 423. TMPRSS6-hc-18A UUUUCUCUUGGAGUCCUCA TMPRSS6-hc-18B UGAGGACUCCAAGAGAAAA
[0017] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 199 e/ou a segunda fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 200. TMPRSS6-hc- mU (ps) fU (ps) mUfUmCfUmCfUmUfGmGfAmGfUmCfCmU 18A (ps) fC (ps) mA TMPRSS6-hc- fUmGfAmGfGmAfCmUfCmCfAmAfGmAfGmAfA (ps) mA (ps) 18B fA
[0018] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 429 e/ou a segunda fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 430. TMPRSS6-hc-23A CUGUUCUGGAUCGUCCACU TMPRSS6-hc-23B AGUGGACGAUCCAGAACAG
[0019] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 207 e/ou a segunda fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 208. TMPRSS6-hc- mC (ps) fU (ps) mGfUmUfCmUfGmGfAmUfCmG- 23A fUmCfCmA (ps) fC (ps) mU TMPRSS6-hc- fAmGfUmGfGmAfCmGfAmUfCmCfAmGfAmAfC 23B (ps) mA (ps) fG
[0020] Um ácido nucleico pode ser descrito no presente documento em uma associação de listagem de sequências com um agente de liga- ção (linker) e/ou ligante (ligand) específico, porém, qualquer referência a agente de ligação ou ligante no contexto da listagem de sequências é opcional, embora estas características sejam preferidas. Determinados ligantes preferidos são descritos em combinação com determinadas se- quências de ácidos nucleicos.
[0021] As ditas primeira fita e/ou segunda fita podem ter, cada uma, 17-35 nucleotídeos de comprimento e pelo menos uma região dúplex pode ter 10-25 nucleotídeos de comprimento. O dúplex pode compre- ender duas fitas separadas ou pode compreender uma única fita que compreende a primeira fita e a segunda fita.
[0022] O ácido nucleico pode: a) ter extremidades cegas nas duas extremidades; b) ter uma saliência em uma extremidade e uma extremi- dade cega na outra; ou c) ter uma saliência nas duas extremidades.
[0023] Um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita podem ser mo- dificados. Um ou mais dos nucleotídeos de número par da primeira fita podem ser modificados através de pelo menos uma segunda modifica- ção, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modifi- cação nos um ou mais nucleotídeos de número ímpar. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número par modificados pode ser adja- cente a pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número ímpar modificados.
[0024] Uma pluralidade de nucleotídeos de número ímpar na pri- meira fita pode ser modificada no ácido nucleico descrito no presente documento. Uma pluralidade de nucleotídeos de número par na primeira fita pode ser modificada com uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação em comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma segunda modi- ficação diferente.
[0025] Um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da segunda fita podem ser modificados com uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de número ímpar na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos de número par da segunda fita podem ser modificados com a mesma modificação dos nucleotídeos de número ím- par da primeira fita. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número par modificados da segunda fita pode ser adjacente a um ou mais nucleotídeos de número ímpar modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos de número ímpar da segunda fita pode ser modificada com uma modificação em comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos de número par pode ser modificada com a mesma modificação que está presente nos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita. Uma plu- ralidade de nucleotídeos de número ímpar na segunda fita pode ser mo- dificada com uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos de número ímpar da pri- meira fita.
[0026] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação em comum, a qual pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotí- deos de número ímpar da primeira fita.
[0027] No ácido nucleico descrito no presente documento, cada um dos nucleotídeos de número ímpar na primeira fita e cada um dos nu- cleotídeos de número par na segunda fita podem ser modificados com uma modificação em comum e cada um dos nucleotídeos de número par pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de número ímpar pode ser modificado na segunda fita com uma segunda modificação diferente.
[0028] O ácido nucleico descrito no presente documento pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados em pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modi- ficados de maneira diferente da segunda fita.
[0029] A modificação e/ou modificações podem, cada uma e indivi- dualmente, ser selecionadas a partir do grupo que consiste em desoxi- timina 3'-terminal, 2'-O-metila, uma modificação 2'-desóxi, uma modifi- cação 2'-amino, uma modificação 2'-alquila, uma modificação de morfo- lino, uma modificação de fosforamidato, uma modificação do grupo 5'- fosforotioato, uma modificação de 5' fosfato ou mímica de 5' fosfato e uma modificação de um derivado de colesterila ou grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado pode ser qualquer um de um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural que compreende nucleotídeo.
[0030] A pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metila e/ou a pelo menos uma modificação pode ser 2'-F.
[0031] A invenção fornece ainda, como um segundo aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442; ou selecionada a partir de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129.133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173,
175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tais como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados com uma primeira modificação nos nucleotídeos de número ímpar e modificados com uma segunda modificação nos nucleotídeos de número par e os nucleotídeos da segunda fita são modificados através de uma terceira modificação nos nucleotídeos de número par e modificados através de uma quarta modificação nos nucleotídeos de número ímpar, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação.
[0032] A invenção fornece ainda, como um segundo aspecto relaci- onado, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo me- nos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita segunda fita pode compreender uma sequên- cia de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433,
435,437, 439, 441 ou 443, ou selecionada a partir de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como uma sequência se- lecionada a partir das seguintes: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados com uma primeira modificação nos nucleotídeos de número ímpar e modificados com uma segunda modificação nos nucleotídeos de número par e os nucleotídeos da segunda fita são modificados atra- vés de uma terceira modificação nos nucleotídeos de número par e mo- dificados através de uma quarta modificação nos nucleotídeos de nú- mero ímpar, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta mo- dificação.
[0033] A terceira modificação e a primeira modificação podem ser as mesmas e/ou a segunda modificação e a quarta modificação podem ser as mesmas.
[0034] A primeira modificação pode ser 2'OMe e a segunda modifi- cação pode ser 2'F.
[0035] No ácido nucleico de acordo com qualquer aspecto, por exemplo, o segundo aspecto, a primeira fita pode compreender a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita pode com- preender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18. A sequência e as modificações podem ser conforme mostrado na tabela abaixo: SEQ ID NO: 17 5´aaccagaagaagcagguga 3´ 6273646282647284546 SEQ ID NO: 18 5´ucaccugcuucuucugguu 3´ 1727354715351718451 em que as modificações específicas são representadas pelos seguintes números: 1=2'F-dU, 2=2‘F-dA, 3=2'F-dC, 4=2'F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
[0036] Conforme ensinado acima, estas são sequências preferidas, juntamente com as outras sequências preferidas.
[0037] Um ácido nucleico descrito no presente documento pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os primeiro, segundo ou terceiro nucleotídeos 3' terminais e/ou os primeiro, segundo ou ter- ceiro nucleotídeos 5' das primeira e/ou segunda fitas. Ele pode compre- ender duas ligações de fosforotioato entre cada um dos três nucleotí- deos 3' terminais e entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e duas ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita.
[0038] Tal ácido nucleico pode ser conjugado a um ligante.
[0039] A invenção fornece ainda, como um terceiro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 353 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442; ou selecionado a partir de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tais como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, e em que o ácido nucleico é conjugado a um ligante.
[0040] A invenção fornece ainda, como um aspecto relacionado adi- cional, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo me- nos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a segunda fita compreende uma sequência de nu- cleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435,437, 439, 441 ou 443, ou a segunda fita compreende uma sequência de nu- cleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 31 0, 312, 314 ou 316, tal como uma sequência selecio- nada a partir das seguintes: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216, e em que o ácido nucleico é conjugado a um ligante.
[0041] O ligante pode compreender (i) uma ou mais porções N-ace- til galactosamina (GalNAc) e derivados da mesma e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc a uma sequência conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligante pode ser uma es- trutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotí- deos podem ser modificados conforme definido no presente documento.
[0042] O ligante pode compreender a fórmula I: [S-X1-β-X2]3-A-ligante- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-, em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tio- fosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno da fórmula (-CH2)n-O- CH2- onde n = 1 - 6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade de ligação em ponte; em que um ácido nucleico descrito no presente documento é conjugado a X3 por meio de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
[0043] A invenção, portanto, fornece adicionalmente um ácido nu- cleico conjugado que tem uma das seguintes estruturas:
OH OH OH HO ACHN OH O OH O O ACHN O O O O O O S P O OH O O OH S P O ACHN O OH O O O O O O S O Z O P O O O S O P O
O em que Z representa um ácido nucleico conforme definido anterior- mente.
[0044] Alternativamente, um ácido nucleico descrito no presente do- cumento pode ser conjugado a um ligante da seguinte estrutura:
[0045] A invenção também fornece uma composição que compre- ende um ácido nucleico conforme definido no presente documento em combinação com um ou mais quelantes de ferro e uma formulação que compreende: i) um lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídio PEGuilado.
[0046] O teor do componente lipídico catiônico na formulação pode ser a partir de cerca de 55 % molar a cerca de 65 % molar do teor lipídico total da formulação lipídica, de preferência cerca de 59 % molar do teor lipídico total da formulação lipídica.
[0047] A formulação pode compreender um lipídio catiônico que tem a estrutura: um esteroide que tem a estrutura: m fosfolipídio de fosfatidiletanolamina que tem a estrutura: e um lipídio PEGuilado que tem a estrutura:
Quelantes de Ferro
[0048] Um quelante de ferro é qualquer molécula capaz de se ligar a íons metálicos de ferro no corpo e remover ou diminuir o excesso de ferro do corpo, deste modo, aliviando a toxicidade mediada pelo ferro.
[0049] O um ou mais quelantes de ferro podem ser selecionados, por exemplo, a partir de deferoxamina, deferiprona, deferasirox (Exjade) e deferairox (Jadenu), de preferência deferiprona.
[0050] A invenção também fornece uma composição que compre- ende um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção, em combinação com um ou mais que- lantes de ferro, e um excipiente fisiologicamente aceitável.
[0051] Também é fornecido um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção, em combina- ção com um ou mais quelantes de ferro, para uso no tratamento de uma doença ou transtorno e/ou na fabricação de um medicamento para tra- tamento de uma doença ou transtorno.
[0052] A invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou transtorno que compreende administrar uma compo- sição que compreende um ácido nucleico ou um ácido nucleico conju- gado de acordo com qualquer aspecto da invenção, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, a um indivíduo que precisa de tra- tamento.
[0053] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser ad- ministrado ao indivíduo através da via subcutânea, intravenosa ou usando outras vias de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
[0054] O quelante de ferro pode ser administrado ao indivíduo atra- vés da via subcutânea, intravenosa ou usando qualquer outra via de aplicação, tal como oral, retal ou intraperitoneal.
[0055] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser ad- ministrado simultânea, separada ou sequencialmente com um ou mais quelantes de ferro.
[0056] Portanto, será reconhecido que o ácido nucleico ou ácido nu- cleico conjugado pode ser administrado em combinação com um que- lante de ferro (tal como uma composição de dose fixa) ou a combinação pode ser administrada como composições farmacêuticas separadas.
[0057] A doença ou transtorno pode ser selecionado a partir do grupo que compreende hemocromatose, porfiria cutânea e doenças sanguíneas, tal como β-talassemia ou anemia falciforme, anemia dise- ritropoiética congênita, síndromes de insuficiência medular, mielodispla- sia e sobrecarga transfusional de ferro. O transtorno pode estar associ- ado à sobrecarga de ferro e o transtorno associado à sobrecarga de ferro pode ser mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou ataxia de Frie- dreich. A doença ou transtorno também pode ser selecionado a partir de infecções e mortalidade não relacionada à recidiva associada ao transplante de medula óssea. Uma doença ou transtorno preferido a ser tratado com um ácido nucleico conforme descrito no presente docu- mento e um ou mais quelantes de ferro é a hemocromatose.
[0058] Um método de produção de um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de acordo com a invenção, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, também está incluído. Descrição Detalhada da Invenção
[0059] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico que é fita dupla e direcionado a um transcrito de RNA expresso de TMPRSS6 e em combinação com um ou mais quelantes de ferro e composições dos mesmos. Estes ácidos nucleicos podem ser usados no tratamento de uma variedade de doenças e transtornos onde é desejável uma expres- são reduzida do produto do gene de TMPRSS6.
[0060] A presente invenção fornece um ácido nucleico ou ácido nu- cleico conjugado de acordo com qualquer aspecto descrito no presente documento em combinação com um ou mais quelantes de ferro.
[0061] Um primeiro aspecto descrito no presente documento refere- se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente com- plementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma se- quência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, ou selecionada a partir de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tal como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143,
145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215.
[0062] Por ácido nucleico entenda-se um ácido nucleico que com- preende duas fitas que compreendem nucleotídeos capaz de interferir na expressão gênica. A inibição pode ser completa ou parcial e resulta na regulação negativa da expressão gênica de maneira direcionada. O ácido nucleico compreende duas fitas de polinucleotídeos distintas; a primeira fita, a qual também pode ser uma fita guia; e uma segunda fita, a qual também pode ser uma fita passageira. A primeira fita e a segunda fita podem fazer parte da mesma molécula polinucleotídica que é auto- complementar que 'se dobra' para formar uma molécula fita dupla. O ácido nucleico pode ser uma molécula de siRNA.
[0063] O ácido nucleico pode compreender ribonucleotídeos, ribo- nucleotídeos modificados, desoxinucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou análogos de nucleotídeos. O ácido nucleico pode compreender ainda uma porção de ácido nucleico fita dupla ou região dúplex formada por toda ou uma porção da primeira fita (também conhecida na técnica como fita guia) e toda ou uma porção da segunda fita (também conhe- cida na técnica como fita passageira). A região dúplex é definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita, inclusive.
[0064] Por região dúplex entenda-se a região em dois oligonucleo- tídeos complementares ou substancialmente complementares que for- mam pares de bases entre si por meio de emparelhamento de bases de Watson-Crick ou qualquer outra maneira que permita a formação de um dúplex entre as fitas de oligonucleotídeos que são complementares ou substancialmente complementares. Por exemplo, uma fita de oligonu-
cleotídeos que tem 21 unidades nucleotídicas pode emparelhar com ou- tro oligonucleotídeo de 21 unidades nucleotídicas, porém, apenas 19 nucleotídeos em cada fita são complementares ou substancialmente complementares, de modo que a "região dúplex" consiste em 19 pares de bases. Os pares de bases restantes podem existir como saliências 5' e 3' ou como regiões fita dupla. Além disso, na região dúplex, 100 % de complementaridade não são necessários; complementaridade subs- tancial é permitida dentro de uma região dúplex. Complementaridade substancial refere-se à complementaridade entre as fitas, de modo que elas sejam capazes de hibridizar sob condições biológicas. Métodos para determinar empiricamente se duas fitas são capazes de empare- lhar sob condições biológicas são bem conhecidos na técnica. Alterna- tivamente, duas fitas podem ser sintetizadas e adicionadas sob condi- ções biológicas para determinar se elas se hibridizam entre si.
[0065] As porções da primeira fita e da segunda fita que formam pelo menos uma região dúplex podem ser totalmente complementares ou pelo menos parcialmente complementares entre si.
[0066] Dependendo do comprimento de um ácido nucleico, uma correspondência perfeita em termos de complementaridade de bases entre a primeira fita e a segunda fita não é necessária. No entanto, as primeira e segunda fitas devem ser capazes de hibridizar sob condições fisiológicas.
[0067] A complementaridade entre a primeira fita e a segunda fita na pelo menos uma região dúplex pode ser perfeita, uma vez que não há incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionados/eli- minados em qualquer fita. Alternativamente, a complementaridade pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %.
[0068] A primeira fita e a segunda fita podem, cada uma, compre- ender uma região de complementaridade que compreende pelo menos
15 nucleotídeos contíguos que diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências listadas na Tabela 1.
[0069] Um aspecto relacionado da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula que com- preende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma se- gunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435, 437, 439, 441 ou 443, ou selecionada a partir de SEQ ID Nos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como uma sequência selecio- nada a partir das seguintes: SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.
[0070] Adequadamente, em qualquer aspecto da invenção, as se- gunda e primeira fitas juntas são qualquer um dos pares de ácidos nu- cleicos complementares descritos no presente documento, tais como aqueles de SEQ ID Nos 1 e 2, 3 e 4, etc.
[0071] A combinação de ácidos nucleicos que consiste em SEQ ID Nos. 17 e 18 é uma combinação preferida, assim como SEQ ID Nos 199 com 200 e SEQ ID Nos 207 com 208.
[0072] O ácido nucleico envolve a formação de uma região dúplex entre toda ou uma porção da primeira fita e uma porção do ácido nu- cleico alvo, TMPRSS6. A porção do ácido nucleico alvo que forma uma região dúplex com a primeira fita, definida como começando com o pri- meiro par de bases formado entre a primeira fita e a sequência-alvo e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a sequência-alvo, inclusive, é a sequência-alvo de ácido nucleico ou sim- plesmente, sequência-alvo. A região dúplex formada entre a primeira fita e a segunda fita não precisa ser igual à região dúplex formada entre a primeira fita e a sequência-alvo. Ou seja, a segunda fita pode ter uma sequência diferente da sequência-alvo, no entanto, a primeira fita deve ser capaz de formar uma estrutura dúplex com a segunda fita e a se- quência-alvo.
[0073] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência- alvo pode ser perfeita (sem incompatibilidade de nucleotídeos ou nucle- otídeos adicionados/eliminados em qualquer ácido nucleico).
[0074] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência- alvo pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de cerca de 70 % a cerca de 100 %. Mais especificamente, a complementaridade pode ser pelo menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % ou um valor intermediário.
[0075] A identidade entre a primeira fita e a sequência complemen- tar da sequência-alvo pode ser de cerca de 75 % a cerca de 100 %.
Mais especificamente, a complementaridade pode ser de pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %, ou um valor intermediário, contanto que o ácido nucleico seja capaz de reduzir ou inibir a expressão de TMPRSS6.
[0076] Um ácido nucleico com menos de 100 % de complementari- dade entre a primeira fita e a sequência-alvo pode ser capaz de reduzir a expressão de TMPRSS6 para o mesmo nível que um ácido nucleico que tem complementaridade perfeita entre a primeira fita e a sequência- alvo. Alternativamente, ele pode reduzir a expressão de TMPRSS6 para um nível de 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de expressão alcançada pelo ácido nucleico com com- plementaridade perfeita.
[0077] O ácido nucleico pode compreender uma primeira fita e uma segunda fita que têm, cada uma, 19-25 nucleotídeos de comprimento. A primeira fita e a segunda fita podem ter comprimentos diferentes.
[0078] O ácido nucleico pode ter 15-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-23 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 23-24 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 19-21 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 21-23 pares de nucleotídeos de comprimento.
[0079] O ácido nucleico pode compreender uma região dúplex que consiste em 19-25 pares de bases de nucleotídeos. A região dúplex pode consistir em 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases, os quais podem ser contíguos.
[0080] O ácido nucleico pode compreender uma sequência de pri- meira fita de SEQ ID NO: 17. O ácido nucleico pode compreender uma sequência de segunda fita de SEQ ID NO: 18. O ácido nucleico descrito no presente documento pode compreender SEQ ID NO: 17 e SEQ ID
NO: 18.
[0081] Em um aspecto adicional, o ácido nucleico, conforme des- crito no presente documento, pode reduzir a expressão de TMPRSS6 em uma célula em pelo menos 15 % comparado com o nível observado na ausência de um inibidor, o qual pode ser o ácido nucleico. Todas as características preferidas de qualquer um dos aspectos anteriores tam- bém se aplicam a este aspecto. Em particular, a expressão de TMPRSS6 em uma célula pode ser reduzida para 90 %, 80 %, 70 %, 60%, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 % ou menos, e valores intermediários, daqueles observados na ausência de um inibidor (o qual pode ser o ácido nucleico).
[0082] A invenção também se refere a qualquer primeira fita ou qualquer segunda fita de ácidos nucleicos, conforme descrito no pre- sente, a qual compreende não mais do que 2 alterações de base quando comparado com a sequência ID específica fornecida. Por exemplo, uma base pode ser alterada dentro de qualquer sequência.
[0083] Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotí- deo mais 5' da (primeira) fita antissenso. Em uma modalidade, a altera- ção pode ser feita no nucleotídeo mais 3' da (primeira) fita antissenso. Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotídeo mais 5' da (segunda) fita senso. Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotídeo mais 3' da (segunda) fita de senso.
[0084] Em uma modalidade, a alteração é feita no nucleotídeo mais 5' da (primeira) fita antissenso. A base do nucleotídeo 5' pode ser tro- cada por qualquer outro nucleotídeo. Uma A ou uma U na extremidade 5' é preferido e uma A ou uma U é ensinado no presente documento como a base 5' terminal potencial para todas as sequências antissenso (primeira fita) descritas no presente documento. Saliências
[0085] O ácido nucleico pode ter extremidades cegas nas duas ex- tremidades; ter uma saliência em uma extremidade e uma extremidade cega na outra extremidade; ou ter uma saliência nas duas extremidades.
[0086] Uma "saliência", conforme usado no presente documento, tem seu significado normal e habitual na técnica, isto é, uma porção fita dupla de um ácido nucleico que se estende além do nucleotídeo terminal de uma fita complementar em um ácido nucleico fita dupla. O termo "ex- tremidade cega" inclui um ácido nucleico fita dupla pelo que ambas as fitas terminam na mesma posição, independentemente se o(s) nucleotí- deo(s) terminal(is) está(ão) emparelhado(s) com a base. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode ser emparelhado com a base. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode não ser emparelhado. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem ser emparelhados com a base. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem não ser emparelhados.
[0087] O ácido nucleico pode ter uma saliência em uma extremi- dade e uma extremidade cega na outra. O ácido nucleico pode ter uma saliência nas duas extremidades. O ácido nucleico pode ter uma extre- midade cega em ambas as extremidades. O ácido nucleico pode ter uma extremidade cega na extremidade com a extremidade 5' da pri- meira fita e a extremidade 3' da segunda fita ou na extremidade 3' da primeira fita e na extremidade 5' da segunda fita.
[0088] O ácido nucleico pode compreender uma saliência na extre- midade 3' ou 5'. O ácido nucleico pode ter uma saliência 3' na primeira fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 5' na primeira fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 5' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma sa- liência nas extremidades 5' e 3' da primeira fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência na extremidade 5' e na extremidade 3' da segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 5' na primeira fita e uma saliên- cia 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 3' na primeira fita e uma saliência 5' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 3' na primeira fita e uma saliência 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência 5' na primeira fita e uma saliên- cia 5' na segunda fita.
[0089] Uma saliência na extremidade 3' ou na extremidade 5' da se- gunda fita ou da primeira fita pode ser selecionada para consistir em 1, 2, 3, 4 e 5 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente, uma saliência pode consistir em 1 ou 2 nucleotídeos, os quais podem ou não ser mo- dificados. Modificações
[0090] Polinucleotídeos não modificados, particularmente ribonu- cleotídeos, podem ser propensos à degradação por nucleases celulares e, como tal, modificações//nucleotídeos modificados podem ser incluí- dos no ácido nucleico descrito no presente documento.
[0091] Um ou mais nucleotídeos nas segunda e/ou primeira fitas do ácido nucleico descrito no presente documento podem ser modificados.
[0092] As modificações do ácido nucleico descrito no presente do- cumento constituem, de modo geral, uma ferramenta poderosa para su- perar possíveis limitações incluindo, porém sem limitações, estabilidade e biodisponibilidade in vitro e in vivo inerentes às moléculas de RNA nativas. O ácido nucleico descrito no presente documento pode ser mo- dificado através de modificações químicas. O ácido nucleico modificado também pode minimizar a possibilidade de induzir à atividade de inter- feron em seres humanos. A modificação pode melhorar ainda mais a liberação funcional de um ácido nucleico para uma célula-alvo. O ácido nucleico modificado descrito no presente documento pode compreender um ou mais ribonucleotídeos quimicamente modificados de qualquer uma ou ambas da primeira fita ou da segunda fita. Um ribonucleotídeo pode compreender uma modificação química das porções de base, açú- car ou fosfato. O ácido ribonucleico pode ser modificado através de substituição ou inserção com análogos de ácidos nucleicos ou bases.
[0093] Será reconhecido que a descrição de um ácido nucleico mo- dificado, em particular como um RNA modificado, fornece uma descri- ção da sequência de ácidos nucleicos "primária" e também as modifica- ções desta sequência. Uma listagem de sequências fornece, assim, tanto informação sobre a sequência de ácidos nucleicos primária como também uma sequência modificada. Para evitar dúvidas, a invenção re- fere-se a sequências de ácidos nucleicos não modificadas, parcialmente modificadas e a quaisquer sequências para as quais as modificações tenham sido completamente definidas.
[0094] Um ou mais nucleotídeos de um ácido nucleico descrito no presente documento invenção podem ser modificados. O ácido nucleico pode compreender pelo menos um nucleotídeo modificado. O nucleotí- deo modificado pode estar na primeira fita. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita. O nucleotídeo modificado pode estar na re- gião dúplex. O nucleotídeo modificado pode estar fora da região dúplex, isto é, em uma região fita simples. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita e pode estar fora da região dúplex. O nucleotídeo modi- ficado pode estar na segunda fita e pode estar fora da região dúplex. O nucleotídeo 3'-terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modifi- cado. O nucleotídeo 3'-terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5'-terminal da primeira fita pode ser um nu- cleotídeo modificado. O nucleotídeo 5'-terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado.
[0095] Um ácido nucleico descrito no presente documento pode ter 1 nucleotídeo modificado ou um ácido nucleico descrito no presente do- cumento pode ter cerca de 2-4 nucleotídeos modificados, ou um ácido nucleico pode ter cerca de 4-6 nucleotídeos modificados, cerca de 6-8 nucleotídeos modificados, cerca de 8-10 nucleotídeos modificados, cerca de 10-12 nucleotídeos modificados, cerca de 12-14 nucleotídeos modificados, cerca de 14-16 nucleotídeos modificados cerca de 16-18 nucleotídeos modificados, cerca de 18-20 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 22-24 modificados nucleótidos, 24-26 nucleótidos modificados ou cerca de 26-28 nucleótidos modificados. Em cada caso, o ácido nucleico que compreende os ditos nucleotídeos modificados re- tém pelo menos 50 % de sua atividade comparado com o mesmo ácido nucleico, mas sem os ditos nucleotídeos modificados. O ácido nucleico pode reter 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % ou um valor intermediário de sua atividade comparado com o mesmo ácido nucleico, mas sem os ditos nucleotídeos modificados, ou pode ter mais de 100 % da atividade do mesmo nucleotídeo sem os ditos nucleotídeos modificados.
[0096] O nucleotídeo modificado pode ser uma purina ou uma piri- midina. Pelo menos metade das purinas pode ser modificada. Pelo me- nos metade das pirimidinas pode ser modificada. Todas as purinas po- dem ser modificadas. Todas as pirimidinas podem ser modificadas. Os nucleotídeos modificados podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em um nucleotídeo de desoxitimina (dT) 3'-terminal, um nucle- otídeo 2'-O-metila modificado, um nucleotídeo 2' modificado, um nucle- otídeo 2'-desóxi modificado, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo 2'-amino modificado, um nucleotídeo 2'-alquila modificado, um nucleotídeo de morfolino, um fosforamidato, uma base não natural que compreende nucleotídeo, um nucleotídeo que compre- ende um grupo 5'-fosforotioato, um nucleotídeo que compreende 5' fos- fato ou um mímico de 5' fosfato e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesterila ou um grupo bisdecilamida de ácido dodeca- noico.
[0097] O ácido nucleico pode compreender um nucleotídeo que compreende um nucleotídeo modificado, em que a base é selecionada a partir de 2-aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenila, pseudouracila, 2,4,6-trimetoxibenzeno, 3-metil ura- cila, di-hidrouridina, naftila, aminofenila, 5-alquilcitidina (por exemplo, 5- metilcitidina), 5-alquiluridina (por exemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por exemplo, 5-bromouridina), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidina (por exemplo, 6-metiluridina), propino, quesosina, 2-tiouridina, 4-tiouridina, wibutosina, wibutoxosina, 4-acetilcitidina, 5-(carboxi-hidroximetil)uri- dina, 5'-carboximetilaminometil-metil-2-tiouridina, 5-carboximetilamino- metiluridina, beta-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilino- sina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metil- guanosina, N6-metiladenosina, 7-metilguanosina, 5-metoxiaminometil- 2-tiouridina, 5-metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-me- tiloxiuridina, 5-metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, beta-D-manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético e 2-tiocitidina.
[0098] Os ácidos nucleicos discutidos no presente documento in- cluem RNA não modificado, bem como RNA que foi modificado, por exemplo, para melhorar a eficácia, e polímeros de substitutos de nu- cleosídeos. RNA não modificado refere-se a uma molécula na qual os componentes do ácido nucleico, particularmente as porções de açúca- res, bases e fosfato, são iguais ou essencialmente iguais àquelas que ocorrem na natureza, por exemplo, ocorrem naturalmente no corpo hu- mano. Nucleotídeo modificado, conforme usado no presente docu- mento, refere-se a um nucleotídeo no qual um ou mais dos componen- tes do ácido nucleico, ou seja, porções de açúcares, bases e fosfato, são diferentes daqueles que ocorrem na natureza. Embora sejam deno- minados como nucleotídeos modificados é evidente que, em virtude da modificação, eles incluem moléculas que não são nucleotídeos, por exemplo, moléculas polinucleotídicas nas quais a estrutura de ribofos- fato é substituída por uma construção não ribofosfato que permite a hi- bridização entre as fitas, ou seja, os nucleotídeos modificados imitam o esqueleto de ribofosfato.
[0099] Muitas das modificações descritas abaixo que ocorrem den- tro de um ácido nucleico serão repetidas dentro de uma molécula de polinucleotídeos, tal como uma modificação de uma base, ou uma por- ção de fosfato, ou o O não ligante de uma porção de fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições/nucleotídeos pos- síveis no polinucleotídeo, porém, em muitos casos, não ocorrerá. Uma modificação pode ocorrer apenas na posição 3' ou 5' terminal, apenas nas regiões terminais, tal como em um nucleotídeo terminal ou nos últi- mos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região fita dupla, em uma região fita simples ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região fita dupla de um ácido nucleico descrito no presente documento ou pode ocorrer ape- nas em uma região fita simples de um ácido nucleico descrito no pre- sente documento. Uma modificação de fosforotioato em uma posição de O não ligante pode ocorrer apenas em um ou em ambos os términos, pode ocorrer apenas em uma região terminal, por exemplo, em uma po- sição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4 ou 5 nucleotí- deos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões dúplex e/ou fita dupla, particularmente nas extremidades. As extremidades 5' ou 3' podem ser fosforiladas.
[0100] A estabilidade de um ácido nucleico descrito no presente do- cumento pode ser aumentada pela inclusão de bases particulares em saliências ou pela inclusão de nucleotídeos modificados em saliências fita dupla, por exemplo, em uma saliência 5' ou 3', ou em ambas. Nucle- otídeos purina podem ser incluídos em saliências. Todas ou algumas das bases em uma saliência 3' ou 5' podem ser modificadas. As modifi- cações podem incluir o uso de modificações no grupo 2'OH do açúcar ribose, o uso de desoxirribonucleotídeos, em vez de ribonucleotídeos, e modificações no grupo fosfato, tais como modificações de fosforotioato. As saliências não precisam ser homólogas à sequência-alvo.
[0101] As saliências 5' ou 3' - na fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas do agente de dsRNA descrito no presente documento podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a região da saliência contém dois nucleotídeos que têm um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma mo- dalidade, a saliência está presente na extremidade 3' da fita senso, fita antissenso ou ambas as fitas. Em uma modalidade, esta saliência 3' está presente na fita antissenso. Em uma modalidade, esta saliência 3' está presente na fita senso.
[0102] Nucleases podem hidrolisar as ligações de fosfodiéster do ácido nucleico. No entanto, modificações químicas nos ácidos nucleicos podem conferir propriedades aprimoradas e podem tornar os oligoribo- nucleotídeos mais estáveis às nucleases.
[0103] Os ácidos nucleicos modificados, conforme usado no pre- sente documento, podem incluir um ou mais de: (i) uma alteração, por exemplo, substituição, de um ou de ambos os oxigênios do fosfato de não ligação e/ou de um ou mais do oxigênio do fosfato de ligação (denominado como ligação, mesmo que no terminais 5' e 3' do ácido nucleico descrito no presente documento); (ii) uma alteração, por exemplo, substituição, de um constituinte do açú- car ribose, por exemplo, da 2' hidroxila no açúcar ribose; (iii) uma substituição da porção fosfato por ligantes "defosfo"; (iv) uma modificação ou substituição de uma base de ocorrência natural; (v) uma substituição ou modificação da estrutura de ribose-fosfato; (vi) uma modificação da extremidade 3′ ou da extremidade 5' do RNA,
por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma porção, por exemplo, uma porção mar- cada com fluorescência, à extremidade 3' ou 5' do RNA.
[0104] Os termos substituição, modificação, alteração indicam uma diferença em relação a uma molécula de ocorrência natural.
[0105] Modificações específicas são discutidas em mais detalhes abaixo.
[0106] Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotio- ato, fosforosselenatos, borano fosfatos, ésteres de borano fosfato, fos- fonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquila ou arila e fosfotriésteres. Os fosforoditioatos têm ambos os oxigênios de não liga- ção substituídos por enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênios de não ligação no grupo fosfato pode ser independentemente qualquer um dentre S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquila ou arila).
[0107] O ligante de fosfato também pode ser modificado pela subs- tituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos li- gados em ponte), enxofre (fosforotioatos ligados em ponte) e carbono (metilenofosfonatos ligados em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. É possível substituir o oxigênio de não ligação por nitrogênio.
[0108] Um nucleotídeo modificado pode incluir a modificação dos grupos de açúcar. O grupo 2' hidroxila (OH) pode ser modificado ou substituído por vários substituintes "óxi" ou "desóxi" diferentes.
[0109] Exemplos de modificações "óxi” no grupo 2' hidroxila incluem alcóxi ou arilóxi (OR, por exemplo, R═H, alquila, cicloalquila, arila, aral- quila, heteroarila ou açúcar); polietileno glicóis (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "bloqueados" (Locked Nu- cleic Acid, LNA) nos quais a 2' hidroxila está conectada, por exemplo, através de uma ponte de metileno, ao carbono 4' do mesmo açúcar ri- bose; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila,
arilamino, diarilamino, heteroarilamino ou di-heteroarilamino, etileno di- amina, poliamino) e aminoalcóxi, O(CH2)nAMINA (por exemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ou di-heteroarilamino, etileno diamina, poliamino).
[0110] As modificações "desóxi" incluem halo de hidrogênio; amino (por exemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino ou aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquila- mino, heterociclila, arilamino, diaril amino, heteroaril amino ou di-hete- roaril amino), -NHC(O)R (R = alquila, cicloalquila, arila, aralquila, hete- roarila ou açúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquila; tioalcóxi; e alquila, cicloalquila, arila, alquenila e alquinila, os quais podem ser opcional- mente substituídos, por exemplo, por uma funcionalidade amino. Outros substituintes de determinadas modalidades incluem 2'-metoxietila, 2'- OCH3, 2'-O-alila, 2'-C-alila e 2'-fluoro.
[0111] O grupo açúcar também pode conter um ou mais carbonos que possuem a configuração estereoquímica oposta àquela do carbono correspondente na ribose. Assim, um nucleotídeo modificado pode con- ter um açúcar, tal como arabinose.
[0112] Os nucleotídeos modificados também podem incluir açúca- res "abásicos", os quais não possuem uma nucleobase em C-I’. Estes açúcares abásicos podem ainda conter modificações em um ou mais átomos de açúcar constituintes.
[0113] As modificações 2' podem ser usadas em combinação com uma ou mais modificações do ligante de fosfato (por exemplo, fosforoti- oato).
[0114] O grupo fosfato pode ser substituído por conectores que não contenham fósforo.
[0115] Exemplos de porções que podem substituir o grupo fosfato incluem siloxano, carbonato, carboximetila, carbamato, amida, tioéter,
ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formal- cetal, oxima, metilenoimino, metilenometilimino, metileno-hidroximetil- metilenometil-hidróxi-metileno. Em determinadas modalidades, as subs- tituições podem incluir os grupos metilenocarbonilamino e metilenome- tilimino.
[0116] O ligante de fosfato e o açúcar ribose podem ser substituídos por nucleotídeos resistentes à nuclease.
[0117] Exemplos incluem os substitutos nucleosídicos morfolino, ci- clobutila, pirrolidina e ácido nucleico peptídico (Peptide Nucleic Acid, PNA). Em determinadas modalidades, substitutos de PNA podem ser usados.
[0118] As extremidades 3' e 5' de um oligonucleotídeo podem ser modificadas. Tais modificações podem ocorrer na extremidade 3' ou na extremidade 5' ou em ambas as extremidades da molécula. Elas podem incluir modificação ou substituição de um fosfato terminal inteiro ou de um ou mais átomos do grupo fosfato. Por exemplo, as extremidades 3' e 5' de um oligonucleotídeo podem ser conjugadas a outras entidades moleculares funcionais, tais como porções de marcação, por exemplo, fluoroforos (por exemplo, pireno, TAMRA, fluoresceína, corantes Cy3 ou Cy5) ou grupos de proteção (com base, por exemplo, em enxofre, silício, boro ou éster). As entidades moleculares funcionais podem ser ligadas ao açúcar através de um grupo fosfato e/ou um ligante. O átomo termi- nal do ligante pode se conectar ou substituir o átomo de ligação do grupo fosfato ou do grupo O, N, S ou C C-3' ou C-5' do açúcar. Alternativa- mente, o ligante pode conectar ou substituir o átomo terminal de um substituto nucleotídico (por exemplo, PNAs). Estes espaçadores ou li- gantes podem incluir, por exemplo, -(CH2)n—, -(CH2)nN—, -(CH2)nO—, -(CH2)nS—, O (CH2CH2O)nCH2CH2OH (por exemplo, n = 3 ou 6), açú- cares abásicos, amida, carbóxi, amina, oxiamina, oximina, tioéter, dis-
sulfeto, tioureia, sulfonamida ou morfolino, ou reagentes de biotina e flu- oresceína. A extremidade 3' pode ser um grupo -OH.
[0119] Outros exemplos de modificações terminais incluem coran- tes, agentes intercalantes (por exemplo, acridinas), reticuladores (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safi- rina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, di-hidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), carre- adores lipofílicos (por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adaman- tano acético, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, glicerol 1,3- Bis-O (hexadecila), um grupo geranilóxi-hexila, hexadecilglicerol, bor- neol, mentol, 1,3-propanodiol, um grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleilil)litocólico, ácido O3-(oleilil)colênico, di- metoxitritila ou fenoxazina) e conjugados peptídicos (por exemplo, pep- tídeo de antennapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poli- amino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte/absorção (por exemplo, aspirina vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, aglomerados de imi- dazol, conjugados de acridina-imidazol, complexos de Eu3+ de tetra-aza- macrociclos).
[0120] Modificações dos terminais podem ser adicionadas por vá- rios motivos, inclusive para modular a atividade ou modular a resistência à degradação. Modificações terminais úteis para modular a atividade in- cluem a modificação da extremidade 5' com fosfato ou análogos de fos- fato. Os ácidos nucleicos descritos no presente documento, nas primeira ou segunda fitas, podem ser fosforilados em 5' ou incluir um análogo de fosforila no terminal 5' primário. As modificações 5'-fosfato incluem aquelas que são compatíveis com o silenciamento gênico mediado por RISC. Modificações adequadas incluem: 5'-monofosfato ((HO)2(O)P-O-
5'); 5'-difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-trifosfato ((HO)2(O)P- O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); um cap de 5'-guanosina (7-metilada ou não metilada) (7m-GO-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); um cap de 5'-adenosina (Appp) e qualquer estrutura de cap de nucleotídeos modificada ou não modificada (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O- P(HO)(O)-O-5'); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2(S)P-O-5'); 5'- monoditofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); qualquer combinação adicional de monofosfato, difos- fato e trifosfatos substituídos por oxigênio/enxofre (por exemplo, 5'-alfa- tiotrifosfato, 5'-gama-tiotrifosfato, etc.), 5'-fosforamidatos ((HO)2(O)P— NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-alquilfosfonatos (R = alquila = metila, etila, isopropila, propila, etc., por exemplo, RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P- 5'-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'-alquiléterfosfonatos (R = alquiléter = meto- ximetila (MeOCH2-), etoximetila, etc., por exemplo, RP(OH)(O)-O-5'-).
[0121] O ácido nucleico descrito no presente documento pode in- cluir uma ou mais modificações de fosforotioato em uma ou mais das extremidades terminais das primeira e/ou segunda fitas. Opcional- mente, cada uma das extremidades da primeira fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato. Opcio- nalmente, cada uma ou uma das extremidades da segunda fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforo- tioato. Opcionalmente, ambas as extremidades da primeira fita e a ex- tremidade 5' da segunda fita podem compreender dois nucleotídeos mo- dificados com fosforotioato. Por nucleotídeo modificado com fosforotio- ato entenda-se que a ligação entre o nucleotídeo e o nucleotídeo adja- cente compreende um grupo fosforotioato, em vez de um grupo fosfato padrão.
[0122] Modificações terminais também podem ser úteis para moni- torar a distribuição e, nestes casos, os grupos a serem adicionados po- dem incluir fluoroforos, por exemplo, fluoresceína ou um corante Alexa.
Modificações terminais também podem ser úteis para melhorar a absor- ção e modificações úteis para isto incluem colesterol. Modificações ter- minais também podem ser úteis para reticular um agente de RNA a ou- tro grupo. Nucleotídeos
[0123] Adenina, guanina, citosina e uracila são as bases mais co- muns encontradas no RNA. Estas bases podem ser modificadas ou substituídas para fornecer RNAs com propriedades aprimoradas. Por exemplo, oligoribonucleotídeos resistentes à nuclease podem ser pre- parados com estas bases ou com nucleobases sintéticas e naturais (por exemplo, inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina ou tubercidina) e qualquer uma das modificações acima. Alternativa- mente, análogos substituídos ou modificados de qualquer uma das ba- ses acima e "bases universais" podem ser empregados. Exemplos in- cluem 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquilados de ade- nina e guanina, 2-propila e outros derivados alquilados de adenina e guanina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo ura- cila, citosina e timina, 5-uracila (pseudouracila), 4-tiouracila, 5-haloura- cila, 5-(2-aminopropil)uracila, 5-amino-alil-uracila, 8-halo, amino, tiol, ti- oalquila, hidroxila e outras adeninas e guaninas 8-substituídas, 5-triflu- orometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina, pi- rimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-pro- pinilcitosina, di-hidrouracila, 3-desaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5- alquiluracila, 7-alquilguanina, 5-alquil citosina, 7-deaza-adenina, N6,N6- dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracila, N3-metiluracila, 1,2,4-triazóis substituídos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5-me- toxiuracila, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracila, 5-me- til-2-tiouracila, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracila, 5-metilaminometil-2-ti-
ouracila, 3-(3-amino-3-carboxipropil)uracila, 3-metilcitosina, 5-metilcito- sina, N4-acetil citosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6-isopentilade- nina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N-metilguaninas ou bases O-al- quiladas.
[0124] Conforme usado no presente documentoConforme usado no presente documento, os termos "análogo de nucleotídeo não empare- lhado" significa um análogo de nucleotídeo que inclui uma porção sem emparelhamento de bases incluindo, porém sem limitações: 6 des amino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5 -nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3-Me dC. Em algumas modalidades, o análogo de nucleotídeo sem emparelhamento de bases é um ribonucleotídeo. Em outras modalidades, ele é um desoxirribonucleotídeo.
[0125] Conforme usado no presente documento, o termo "grupo funcional terminal" inclui, sem limitação, grupos halogênio, álcool, amina, carboxílico, éster, amida, aldeído, cetona, éter.
[0126] Determinadas porções podem estar ligadas ao terminal 5' da primeira fita ou da segunda fita e incluem a porção ribose abásica, por- ção desoxirribose abásica, modificações de porções ribose abásica e desoxirribose abásica, incluindo modificações 2’O alquila; porções de ribose abásica invertida e desoxirribose abásica e modificações das mesmas, C6-imino-Pi; um nucleotídeo de espelho, incluindo L-DNA e L- RNA; nucleotídeo 5'OMe; e análogos nucleotídicos, incluindo um nucle- otídeo 4’,5'-metileno; 1-(p-D-eritrofuranosil)nucleotídeo; nucleotídeo 4'- tio, nucleotídeo carbocíclico; fosfato de 5'-amino-alquila; fosfato de 1,3- diamino-2-propila, fosfato de 3-aminopropila; fosfato de 6-amino-hexila; fosfato de 12-aminododecila; fosfato de hidroxipropila; nucleotídeo de 1,5-anidro-hexitol; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo de treo-pentofurano- sila; nucleotídeo acíclico 3',4'-seco; nucleotídeo de 3,4-di-hidroxibutila; nucleotídeo de 3,5-di-hidroxipentila, porção abásica invertida em 5'-5';
fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino; e porções metilfosfonato e 5'-mer- capto não ligadas em ponte.
[0127] Os ácidos nucleicos descrito no presente documento podem ser incluídos um ou mais nucleotídeos invertidos, por exemplo, timidina invertida ou adenina invertida (por exemplo, vide Takei, et al., 2002. JBC 277 (26): 23800-06).
[0128] Conforme usado no presente documento, o termo "inibir", "regular negativamente" ou "reduzir", em relação à expressão gênica, significa que a expressão do gene ou nível de moléculas de RNA ou moléculas de RNA equivalentes que codificam uma ou mais proteínas ou subunidades de proteínas (por exemplo, mRNA), ou a atividade de uma ou mais proteínas, subunidades ou peptídeos de proteínas é redu- zida abaixo daquela observada na ausência de um ácido nucleico des- crito no presente documento ou em referência a uma molécula de siRNA sem homologia conhecida por transcritos humanos ( denominado no presente documento como controle sem silenciamento). Este controle pode ser conjugado e modificado de maneira análoga à molécula des- crita no presente documento e liberado na célula-alvo através da mesma via; por exemplo, a expressão pode ser reduzida para 90%, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 % ou um valor intermediário, na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no pre- sente documento ou na presença de um controle sem silenciamento.
[0129] O ácido nucleico descrito no presente documento pode com- preender um nucleotídeo abásico. O termo "abásico", conforme usado no presente documento, refere-se a porções que não possuem uma base ou que têm outros grupos químicos em lugar de uma base na po- sição 1', por exemplo, um derivado de ribose desoxiabásico ligado à 3',3' ou 5',5'.
[0130] O ácido nucleico pode compreender um ou mais nucleotí- deos nas segunda e/ou primeira fitas que são modificados. Nucleotídeos alternados podem ser modificados para formar nucleotídeos modifica- dos.
[0131] Alternados, conforme usado no presente documento, signi- fica ocorrer um após o outro de maneira regular. Em outras palavras, alternados significa ocorrer repetidamente. Por exemplo, se um nucleo- tídeo é modificado, o próximo nucleotídeo contíguo não é modificado e o nucleotídeo contíguo seguinte é modificado e assim por diante. Um nucleotídeo pode ser modificado com uma primeira modificação, o pró- ximo nucleotídeo contíguo pode ser modificado com uma segunda mo- dificação e o nucleotídeo contíguo seguinte é modificado com a primeira modificação e assim por diante, onde as primeira e segunda modifica- ções são diferentes.
[0132] Um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita do ácido nucleico descrito no presente documento podem ser modi- ficados, em que a primeira fita é numerada de 5' para 3'. O termo "nú- mero ímpar", conforme descrito no presente documento, significa um número não divisível por dois. Exemplos de números ímpares são 1, 3, 5, 7, 9, 11 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos de número par da primeira fita do ácido nucleico descrito no presente documento podem ser modificados, em que a primeira fita é numerada de 5' para 3'. O termo "numerado par", conforme descrito no presente documento, significa um número que é divisível igualmente por dois. Exemplos de números pares são 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da segunda fita do ácido nucleico descrito no presente documento podem ser modificados, em que a se- gunda fita é numerada de 3' para 5'. Um ou mais dos nucleotídeos de número par da segunda fita do ácido nucleico descrito no presente do- cumento podem ser modificados, em que a segunda fita é numerada de 3' para 5'.
[0133] Um ou mais nucleotídeos na psrimeira e/ou segunda fitas po- dem ser modificados para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita podem ser modifica- dos. Um ou mais dos nucleotídeos de número par da primeira fita podem ser modificados com pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação no um ou mais nucleotídeos adicionados. Pelo menos um de um ou mais nucleo- tídeos de número par modificados pode ser adjacente a pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número ímpar modificados.
[0134] Uma pluralidade de nucleotídeos de número ímpar na pri- meira fita pode ser modificada no ácido nucleico descrito no presente documento. Uma pluralidade de nucleotídeos de número par na primeira fita pode ser modificada com uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação em comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma segunda modi- ficação diferente.
[0135] Um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da segunda fita podem ser modificados com uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos de número ímpar na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos de número par da segunda fita podem ser modificados através da mesma modificação dos nucleotídeos de nú- mero ímpar da primeira fita. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número par modificados da segunda fita pode ser adjacente a um ou mais nucleotídeos de número ímpar modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos de número ímpar da segunda fita pode ser modificada com uma modificação em comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos de número par pode ser modificada com a mesma modificação que está presente nos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita. Uma plu-
ralidade de nucleotídeos de número ímpar na segunda fita pode ser mo- dificada com uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos de número ímpar da pri- meira fita.
[0136] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação em comum, a qual pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotí- deos de número ímpar da primeira fita.
[0137] No ácido nucleico descrito no presente documento, cada um dos nucleotídeos de número ímpar na primeira fita e cada um dos nu- cleotídeos de número par na segunda fita podem ser modificados com uma modificação em comum e, cada um dos nucleotídeos de número par pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de número ímpar pode ser modificado na segunda fita com a segunda modificação.
[0138] O ácido nucleico descrito no presente documento pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados em pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modi- ficados de maneira diferente da segunda fita.
[0139] Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de número ímpar pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nu- cleotídeos de número par pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas pode ser modificado com uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de número par pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de número par pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nu- cleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas pode ser modifi- cado com uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nu- cleotídeos de número ímpar pode ser modificado na primeira fita e um ou mais nucleotídeos de número ímpar podem ser modificados na se- gunda fita com uma modificação em comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas pode ser modificado com uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de número par pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos de número ímpar pode ser modi- ficado na segunda fita com uma modificação em comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas pode ser modificado com uma segunda modificação.
[0140] O ácido nucleico descrito no presente documento pode com- preender construções fita dupla ou simples que compreendem pelo me- nos duas regiões de modificações alternadas em uma ou em ambas as fitas. Estas regiões alternadas podem compreender até cerca de 12 nu- cleotídeos, porém, de preferência, compreendem a partir de cerca de 3 a cerca de 10 nucleotídeos. As regiões de nucleotídeos alternados po- dem estar localizadas nos terminais de uma ou de ambas as fitas do ácido nucleico descrito no presente documento. O ácido nucleico pode compreender a partir de 4 a cerca de 10 nucleotídeos de nucleotídeos alternados em cada terminal (3' e 5') e estas regiões podem ser separa- das por cerca de 5 a cerca de 12 nucleotídeos contíguos, não modifica- dos ou diferentes ou comumente modificados.
[0141] Os nucleotídeos de número ímpar da primeira fita podem ser modificados e os nucleotídeos de número par podem ser modificados com uma segunda modificação. A segunda fita pode compreender nu- cleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação em comum, a qual pode ser a mesma que a modificação dos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos que têm a segunda modificação podem ser adjacen- tes entre si e a nucleotídeos que têm uma modificação que é a mesma que a modificação dos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato en- tre os dois nucleotídeos na extremidade 3' e na extremidade 5'. A se- gunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5'. A segunda fita também pode ser conju- gada a um ligante na extremidade 5'.
[0142] O ácido nucleico descrito no presente documento pode com- preender uma primeira fita que compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação em comum. Um ou mais destes nucleotídeos podem ser adjacentes a um ou mais nucleotídeos que podem ser modificados com uma segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos que têm a segunda modificação podem ser adjacentes. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modi- ficados com uma modificação em comum, a qual pode ser a mesma que uma das modificações de um ou mais nucleotídeos da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A primeira fita também pode com- preender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extre- midade 5' e na extremidade 3'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3'. A segunda fita também pode ser conjugada com um ligante na extremi- dade 5'.
[0143] Os nucleotídeos numerados de 5' a 3' na primeira fita e 3' e 5' na segunda fita, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modifi- cados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4,
6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita. Os nucleotídeos são numerados para o ácido nucleico da presente invenção de 5' a 3' na primeira fita e 3' e 5' na segunda fita.
[0144] Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 po- dem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modifi- cados por uma segunda modificação na segunda fita.
[0145] Evidentemente, se as primeiro e/ou segunda fitas têm menos de 25 nucleotídeos de comprimento, tal como 19 nucleotídeos de com- primento, não há nucleotídeos numerados 20, 21, 22, 23, 24 e 25 a se- rem modificados. Aqueles versados na técnica entendem a descrição acima para aplicar a fitas mais curtas, consequentemente.
[0146] Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser emparelhados com nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação em comum. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser emparelhados com nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação diferente. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser emparelhados com nucleotídeos não modificados na segunda fita. Um ou mais nucleotídeos modificados na segunda fita podem ser emparelhados com nucleotídeos não modi- ficados na primeira fita. Em outras palavras, nucleotídeos alternados po- dem ser alinhados nas duas fitas tal como, por exemplo, todas as modi- ficações nas regiões alternadas da segunda fita são emparelhadas com modificações idênticas na primeira fita ou, alternativamente, as modifi-
cações podem ser compensadas por um nucleotídeo com as modifica- ções em comum nas regiões alternadas de uma fita que emparelham com modificações diferentes (isto é, uma segunda ou mais modifica- ções) na outra fita. Outra opção é ter modificações diferentes em cada uma das fitas.
[0147] As modificações na primeira fita podem ser deslocadas por um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos modificados na segunda fita, de modo que os nucleotídeos modificados em comum não estejam emparelhados entre si.
[0148] A modificação e/ou modificações pode(m), cada uma e indi- vidualmente, ser selecionada(s) a partir do grupo que consiste em de- soxitimina 3'-terminal, 2'-O-metila, uma modificação 2'-desóxi, uma mo- dificação 2'-amino, uma modificação 2’-alquila, uma modificação de morfolino, uma modificação de fosforamidato, uma modificação do grupo 5'-fosforotioato, uma modificação de fosfato 5' ou mímica de fos- fato 5' e um derivado de colesterila ou uma modificação do grupo bisde- cilamida de ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado pode ser qualquer um dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural que compreende nucleotídeo.
[0149] A pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metila e/ou a pelo menos uma modificação pode ser 2'-F. Modificações adicionais conforme descrito no presente documento podem estar presentes na primeira e/ou na segunda fita.
[0150] Ao longo da descrição da invenção, "modificação igual ou em comum" significa a mesma modificação em qualquer nucleotídeo, seja A, G, C ou U, modificado com um grupo como um grupo metila ou um grupo fluoro. Isto não se destina a significar a mesma adição no mesmo nucleotídeo. Por exemplo, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG são todos considerados a mesma modificação ou modificação em comum, assim como 2'-OMe-rU, 2'-OMe -rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG. Uma modificação
2'F é uma modificação diferente de uma modificação 2'OMe.
[0151] Algumas sequências de ácidos nucleicos modificadas repre- sentativas da presente invenção são mostradas nos exemplos. Estes exemplos devem ser representativos e não limitativos.
[0152] De preferência, o ácido nucleico pode compreender uma mo- dificação e a segunda ou mais modificações as quais são, cada uma e individualmente, selecionadas a partir do grupo que compreende uma modificação 2'-O-metila e uma modificação 2'-F. O ácido nucleico pode compreender uma modificação que é 2'-O-metila (2'OMe), a qualpode ser uma primeira modificação, e uma segunda modificação, a qual é 2'- F. O ácido nucleico descrito no presente documento também pode in- cluir uma modificação de fosforotioato e/ou uma modificação desóxi que pode estar presente em ou entre os 1, 2 ou 3 nucleotídeos terminais de cada uma das extremidades de cada uma ou de ambas as fitas.
[0153] A invenção fornece, como um aspecto adicional, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 335, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, ou SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299,
301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29.133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, em que os nucleotídeos da pri- meira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotí- deos de número ímpar e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos de número par e os nucleotídeos da segunda fita são mo- dificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos de número par e modificados por uma quarta modificação dos nucleotídeos de número ímpar, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da se- gunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modi- ficação. As terceira e primeira modificações podem ser iguais ou dife- rentes, as segunda e quarta modificações podem ser iguais ou diferen- tes. As primeira e segunda modificações podem ser diferentes entre si e as terceira e quarta modificações podem ser diferentes entre si.
[0154] Em um aspecto adicional, é fornecido um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, em que a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435.437, 439, 441 ou 443, ou uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID no 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248,
250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modifi- cação nos nucleotídeos de número ímpar e modificados por uma se- gunda modificação nos nucleotídeos de número par e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nu- cleotídeos de número par e modificados por uma quarta modificação dos nucleotídeos de número ímpar, em que pelo menos a primeira mo- dificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação.
As terceira e primeira modificações po- dem ser iguais ou diferentes, as segunda e quarta modificações podem ser iguais ou diferentes.
As primeira e segunda modificações podem ser diferentes entre si e as terceira e quarta modificações podem ser dife- rentes entre si.
Adequadamente, a sequência de nucleotídeos da se- gunda fita é complementar à primeira fita.
Os nucleotídeos da primeira fita podem ser modificados por primeira modificação nos nucleotídeos de número ímpar e modificados com uma segunda modificação nos nu- cleotídeos de número par e a segunda fita pode ser modificada nos nu- cleotídeos de número ímpar com a segunda modificação e modificada com a primeira modificação nos nucleotídeos de número par.
A primeira modificação pode ser 2'OMe e a segunda modificação pode ser 2 'F.
A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 18. As modificações podem ser aquelas descritas na Tabela 1.
[0155] Em um aspecto, todos os nucleotídeos de número par da pri- meira fita do ácido nucleico são modificados por uma primeira modifica- ção, todos os nucleotídeos de número ímpar da primeira fita são modi- ficados por uma segunda modificação, todos os nucleotídeos da se- gunda fita nas posições que correspondem aos nucleotídeos 11-13 da primeira fita são modificados por uma quarta modificação, todos os nu- cleotídeos da segunda fita, exceto os nucleotídeos que correspondem aos nucleotídeos 11-13 da primeira fita, são modificados por uma ter- ceira modificação, em que as primeira e quarta modificações são, de preferência, 2'-F e as segunda e terceira modificações são, de preferên- cia, 2'-OMe.
[0156] O ácido nucleico descrito no presente documento pode ser conjugado a um ligante.
[0157] Alguns ligantes podem ter propriedades endossomolíticas. Os ligantes endossomolíticos promovem a lise do endossoma e/ou transporte da composição da invenção, ou seus componentes, do en- dossoma para o citoplasma da célula. O ligante endossomolítico pode ser um peptídeo polianiônico ou peptidomimético que mostra atividade de membrana dependente do pH e fusogenicidade. O componente en- dossomolítico pode conter um grupo químico que sofre uma alteração na carga ou protonação em resposta a uma alteração no pH. O compo- nente endossomolítico pode ser linear ou ramificado.
[0158] Os ligantes podem incluir modificadores terapêuticos, por exemplo, para aumentar a absorção; compostos diagnósticos ou grupos repórteres, por exemplo, para monitorar a distribuição; agentes de reti- culação; e porções que conferem resistência à nuclease. Exemplos ge- rais incluem lipídios, esteroides, vitaminas, açúcares, proteínas, peptí- deos, poliaminas e mímicos peptídicos. Os ligantes podem incluir uma substância de ocorrência natural, tais como proteínas, carboidratos ou lipídios. O ligante pode ser uma molécula recombinante ou sintética.
[0159] Os ligantes também podem incluir grupos de direciona- mento, por exemplo um agente de direcionamento de célula ou tecido. O ligante de direcionamento pode ser uma lectina, glicoproteína, lipídio ou proteína.
[0160] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes in- tercalantes, reticuladores, porfirinas, hidrocarbonetos aromáticos policí- clicos, endonucleases artificiais ou um quelante, moléculas lipofílicas, agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG, MPEG, alquila, al- quila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos, faci- litadores de transporte/absorção, ribonucelases sintéticas ou aglomera- dos de imidazol.
[0161] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteí- nas ou peptídeos. Os ligantes também podem ser hormônios ou recep- tores hormonais. Eles também podem incluir espécies não peptídicas, tais como lipídios, lectinas, carboidratos, vitaminas ou cofatores.
[0162] O ligante pode ser uma substância tal como um fármaco que pode aumentar a absorção do ácido nucleico em uma célula, por exem- plo, ao romper o citoesqueleto da célula.
[0163] O ligante pode aumentar a absorção do ácido nucleico na célula ao ativar uma resposta inflamatória. Estes ligantes incluem fator alfa de necrose tumoral (TNF-alfa), interleucina-1 beta ou interferon gama.
[0164] O ligante pode ser uma molécula lipídica ou com base em lipídios. De preferência, a molécula lipídica ou com base em lipídios se liga a uma proteína sérica. De preferência, o ligante com base em lipí- dios se liga à albumina sérica humana (HSA). Uma molécula lipídica ou com base em lipídios pode aumentar a resistência à degradação do con- jugado, aumentar o direcionamento ou o transporte para a célula-alvo e/ou pode regular a ligação a uma proteína sérica. Um ligante com base em lipídios pode ser usado para modular a ligação do conjugado a um tecido-alvo.
[0165] O ligante pode ser um esteroide. De preferência, o ligante é colesterol ou um derivado de colesterol.
[0166] O ligante pode ser uma porção, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula-alvo. Exemplos de vitaminas incluem as vitaminas A, E, K e B. As vitaminas podem ser absorvidas por uma cé- lula em proliferação, o que pode ser útil para fornecer o ácido nucleico a células, tais como células tumorais malignas ou não malignas.
[0167] O ligante pode ser um agente de permeação celular, tal como um agente de permeação celular helicoidal. De preferência, este agente é anfipático.
[0168] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida similar a um peptídeo natural. O peptídeo ou li- gante peptidomimético pode incluir peptídeos de ocorrência natural ou modificados, ou ambos. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser um peptídeo de permeação celular, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático ou peptídeo hidrofóbico. A porção peptídica pode ser um peptídeo den- drimérico, peptídeo restrito ou peptídeo reticulado. A porção peptídica pode incluir uma sequência de translocação de membrana hidrofóbica. A porção peptídica pode ser um peptídeo capaz de transportar molécu- las polares grandes, tais como peptídeos, oligonucleotídeos e proteínas, através das membranas celulares, por exemplo, sequências da proteína Tat de HIV (GRKKRRQRRRPPQ) e da proteína de Drosophila Anten- napedia (RQIKIWFQNRRMKWKK). De preferência, o peptídeo ou pep- tidomimético é um peptídeo que tem como alvo células, por exemplo, peptídeo de arginina-glicina-ácido aspártico (RGD).
[0169] O ligante pode ser um peptídeo de permeação celular que é capaz de permear, por exemplo, uma célula microbiana ou uma célula de mamífero.
[0170] O ligante pode ser um modulador farmacocinético. O modu- lador farmacocinético pode ser lipófilos, ácidos biliares, esteroides, aná- logos de fosfolipídios, peptídeos, agentes de ligação a proteínas, PEG, vitaminas, etc.
[0171] Quando dois ou mais ligantes estão presentes, todos os li- gantes podem ter as mesmas propriedades, todos têm propriedades di- ferentes ou alguns ligantes têm as mesmas propriedades, enquanto que outros têm propriedades diferentes. Por exemplo, um ligante pode ter propriedades de direcionamento, atividade endossomolítica ou proprie- dades moduladoras de PK. Em uma modalidade preferida, todos os li- gantes têm propriedades diferentes.
[0172] Os ligantes podem ser acoplados ao ácido nucleico na extre- midade 3', na extremidade 5' e/ou em uma posição interna. De prefe- rência, o ligante é acoplado ao ácido nucleico por meio de uma ligação ou ligação intermediária.
[0173] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nu- cleico fita dupla. Em um ácido nucleico fita dupla, o ligante pode estar ligado a uma ou ambas as fitas. Em algumas modalidades, um ácido nucleico fita dupla contém um ligante conjugado à fita de senso. Em outras modalidades, um ácido nucleico fita dupla contém um ligante con- jugado à fita antissenso.
[0174] Os ligantes podem ser conjugados a nucleobases, porções açúcar ou ligações internucleosídicas de moléculas de ácidos nucleicos. A conjugação a nucleobases purinas ou derivados das mesmas pode ocorrer em qualquer posição, incluindo átomos endocíclicos e exocícli- cos. A conjugação a nucleotídeos de pirimidina ou derivados dos mes- mos também pode ocorrer em qualquer posição. A conjugação a por- ções açúcar dos nucleosídeos pode ocorrer em qualquer átomo de car- bono. A conjugação a ligações internucleosídicas pode ocorrer no átomo de fósforo de uma ligação que contém fósforo ou em um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado ao átomo de fósforo. Para li- gações internucleosídicas que contêm amina ou amida, a conjugação pode ocorrer no átomo de nitrogênio da amina ou amida ou em um átomo de carbono adjacente.
[0175] O ligante é, tipicamente, um carboidrato, por exemplo, um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tepolisossacarídeo. O li- gante pode ser conjugado ao ácido nucleico através de um ligante. O ligante pode ser um ligante ramificado monovalente, bivalente ou triva- lente.
[0176] A liberação eficiente de oligonucleotídeos, em particular áci- dos nucleicos fita dupla descritos no presente documento, para células in vivo é importante e requer direcionamento específico e proteção subs- tancial do ambiente extracelular, particularmente proteínas séricas. Um método para atingir um alvo específico é conjugar um ligante ao ácido nucleico. O ligante ajuda a direcionar o ácido nucleico para o sítio alvo necessário. Há uma necessidade de conjugar ligantes apropriados às moléculas receptoras desejadas para que as moléculas conjugadas se- jam absorvidas pelas células alvo através de mecanismos tais como di- ferentes vias de endocitose mediadas por receptores ou processos fun- cionalmente análogos. A porção ou ligante alvo pode ser qualquer por- ção ou ligante capaz de atingir um receptor específico.
[0177] Por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) é um receptor de alta capacidade, o qual é altamente abundante em he- patócitos. Uma das primeiras descrições de glicosídeos de agrupamen- tos triantenários foi na Patente Norte-Americana número 5.885.968. Conjugados que têm três ligantes GalNAc e compreendem grupos fos- fato são conhecidos e são descritos em Dubber et al. (2003, Bioconjug. Chem. jan-fev de 2003; 14 (1): 239-46). O ASGP-R mostra uma afini- dade 50 vezes maior pela N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) do que D-Gal.
[0178] Hepatócitos que expressam a lectina (receptor de asialogli- coproteína; ASGPR), a qual reconhece subunidades de β-galactosila especificamente terminais de proteínas glicosiladas ou outros oligossa- carídeos (Weigel, P.H. et al., Biochim. Biophys. Biophys. Acoph. 19 de Setembro de 2002; 1572 (2-3): 341-63), pode ser usados para direcionar um fármaco ao fígado por meio de acoplamento covalente de galactose ou galactosamina à substância medicamentosa (Ishibashi, S.; et. al., J. Biol. Chem. 11 de Nov. de 1994; 269 (45): 27803-6)). Além disso, a afi- nidade de ligação pode ser significativamente aumentada pelo efeito de múltiplas valências, o qual é alcançado pela repetição da unidade de direcionamento (E. A. L. Biessen et al., 1995).
[0179] O ASGPR é um mediador para um transporte endossômico ativo de glicoproteínas que contêm β-galactosila terminal, portanto, o ASGPR é altamente adequado para a distribuição direcionada de fár- macos candidatos, taiscomo ácidos nucleicos, que devem ser liberados na célula (Akinc et al.).
[0180] O ligante pode ser ligado ao ácido nucleico descrito no pre- sente documento através de um ligante, o qual pode ser um ligante bi- valente ou trivalente ou tetramérico ramificado.
[0181] O sacarídeo, o qual também pode ser denominado de li- gante, pode ser selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula-alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R).
[0182] O sacarídeo pode ser selecionado a partir de N-acetil galac- tosamina, manose, galactose, glicose, glicosamina e fucose. O sacarí- deo pode ser N-acetil galactosamina (GalNAc).
[0183] Um ligante para uso na presente invenção pode, portanto, compreender (i) uma ou mais porções de N-acetil galactosamina (Gal- NAc) e derivados da mesma e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc a uma sequência conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligante pode ter uma estrutura bivalente ou triva- lente ou tetravalente ramificada. Os nucleotídeos podem ser modifica- dos conforme definido no presente documento.
[0184] "GalNAc" refere-se a 2-(acetilamino)-2-desóxi-D-galactopira- nose, comumente denominada na literatura como N-acetil galactosa- mina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui tanto a forma β: 2-(acetilamino)-2-desóxi-β-D-galactopiranose quanto a forma α: 2-(acetilamino)-2-desóxi-α-D-galactopiranose. Tanto a forma β: 2- (acetilamino)-2-desóxi-β-D-galactopiranose como a forma α: 2-(acetila- mino)-2-desóxi-α-D-galactopiranose podem ser usadas de forma alter- nada. De preferência, os compostos da invenção compreendem a forma β, 2-(acetilamino)-2-desóxi-β-D-galactopiranose.
[0185] O ligante pode compreender GalNAc.
[0186] O ligante pode compreender um composto de fórmula I: [S-X1-β-X2] 3-α-X3-(I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-, em que m é 1, 2 ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tio- fosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n-O- CH2-, onde n = 1-6; A é uma unidade ramificada; X3 representa uma unidade de ligação em ponte; em que um ácido nucleico descrito no presente documento é conjugado a X3 através de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
[0187] Na fórmula I, a unidade de ramificação "A" se ramifica em três a fim de acomodar as três porções sacarídicas. A unidade ramifi- cada é covalentemente ligada às porções restantes amarradas do li- gante e do ácido nucleico. A unidade de ramificação pode compreender um grupo alifático ramificado que compreende grupos selecionados a partir de grupos alquila, amida, dissulfeto, polietileno glicol, éter, tioéter e hidroxiamino. A unidade ramificada pode incluir grupos selecionados a partir de grupos alquila e éter.
[0188] A unidade ramificada A pode ter uma estrutura selecionada a partir de: em que cada A1 representa independentemente O, S, C=O ou NH; e cada n representa independentemente um número inteiro a partir de 1 a 20.
[0189] A unidade de ramificação pode ter a estrutura selecionada a partir de: em que cada A1 representa independentemente O, S, C=O ou NH; e cada n representa independentemente um número inteiro a partir de 1 a 20.
[0190] A unidade de ramificação pode ter uma estrutura selecio- nada a partir de:
em que A1 é O, S, C=O ou NH; e cada n representa independentemente um número inteiro a partir de 1 a 20.
[0191] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: .
[0192] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: .
[0193] A unidade de ramificação pode ter a estrutura: .
[0194] Opcionalmente, a unidade de ramificação consiste em ape- nas um átomo de carbono.
[0195] A porção "X3" dos compostos de fórmula I é uma unidade de ligação em ponte. A unidade de ligação em ponte é linear e é covalen- temente ligada à unidade de ramificação e um ácido nucleico.
[0196] X3 pode ser selecionado a partir de -C1-C20 alquileno-, -C2- C20 alquenileno-, um éter de alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)-O-
(C1-C20 alquileno)-, -C(O)-C1-C20 alquileno-, -C0-C4 alquileno(Cy)C0-C4 alquileno- em que Cy representa um anel de cicloalquileno, arileno, he- terociclileno ou heteroarileno de 5 ou 6 elementos substituído ou não substituído, -C1-C4 alquileno-NHC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno- C(O)NH-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-SC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1- C4 alquileno-C(O)S-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-OC(O)-C1-C4 al- quileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)O-C1-C4 alquileno-, e -C1-C6 alquileno-S- S-C1-C6 alquileno-.
[0197] X3 pode ser um éter de alquileno de fórmula -(C1-C20 alqui- leno)-O-(C1-C20 alquileno)-. X3 pode ser um éter de alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)-O-(C4-C20 alquileno)-, em que o dito (C4-C20 alqui- leno) é ligado a Z. X3 pode ser selecionado a partir do grupo que con- siste em -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16-, especialmente -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16- em que, em cada caso, um grupo -CH2- é ligado a A.
[0198] O ligante pode compreender um composto de fórmula (II): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (II) em que: S representa um sacarídeo; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-, em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato); X2 é C1-C8 alquileno; A é uma unidade de ramificação selecionada a partir de:
X3 é uma unidade em ponte; em que um ácido nucleico descrito no presente documento é conjugado a X3 por meio de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato).
[0199] Unidade de ramificação A pode ter a estrutura: .
[0200] Unidade de ramificação A pode ter a estrutura: , em que X3 é ligado a um átomo de nitrogênio.
[0201] X3 pode ser C1-C20 alquileno. De preferência, X3 é selecio- nado a partir de um grupo que consiste em -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- e - C8H16-, especialmente -C4H8-, -C6H12- e -C8H16-.
[0202] O ligante pode compreender um composto de fórmula (III): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (III) em que: S representa um sacarídeo; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato); X2 é um éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-; A é uma unidade de ramificação; X3 é um éter de alquileno de fórmula selecionado a partir do grupo que consiste em -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, e -CH2-O-C8H16- em que, em cada caso, um grupo -CH2- é ligado a A, Z é um ácido nucleico;
e em que a ligação entre X3 e Z é um fosfato ou tiofosfato.
[0203] A unidade de ramificação pode compreender carbono. De preferência, a unidade de ramificação é carbono.
[0204] X3 pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em - CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, e -CH2-O- C8H16-. De preferência, X3 é selecionado a partir do grupo que consiste em -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16.
[0205] Para quaisquer dos aspectos acima, quando P representa o grupo fosfato modificado, P pode ser representado por: em que Y1 e Y2 representam, cada um independentemente, =O, =S, -O- , -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx, e -ORx, em que Rx representa C1-C6 alquila e em que indica a ligação ao res- tante do composto.
[0206] Por fosfato modificado entenda-se um grupo fosfato em que um ou mais dos oxigênios são substituídos. Exemplos de grupos fosfato modificado incluem fosforotioato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, hidrogeno fosfonatos, fosforoamidatos, fosfonatos de alquila ou arila e fosfotriésteres. Fosforoditioatos têm am- bos os oxigênios não ligantes substituídos por enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênos não ligantes no grupo fosfato podem ser indepen- dentemente qualquer um dentre S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquila ou arila).
[0207] O ligante de fosfato também pode ser modificado através de substituição de um oxigênio ligante por nitrogênio (fosforamamidatos li- gados em ponte), enxofre (fosforotioatos ligados em ponte) e carbono (metilenofosfonatos ligados em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. A substituição dos oxigênios não ligantes por ni- trogênio é possível.
[0208] Por exemplo, Y1 pode representar -OH e Y2 pode representar =O ou =S; ou Y1 pode representar -O- e Y2 pode representar =O ou =S; Y1 pode representar =O e Y2 pode representar -CH3, -SH, - ORx ou -BH3 Y1 pode representar =S e Y2 pode representar -CH3, ORx ou -SH.
[0209] Será entendido por aqueles versados na técnica que, em de- terminados casos, haverá deslocalização entre Y1 e Y2.
[0210] De preferência, o grupo fosfato modificado é um grupo tiofos- fato. Grupos tiofosfato incluem bitiofosfato (isto é, onde Y1 representa =S e Y2 representa -S-) e monotiofosfato (isto é, onde Y1 representa -O- e Y2 representa =S, ou onde Y1 representa =O e Y2 representa -S-). De preferência, P é um monotiofosfato. Os inventores descobriram que con- jugados que têm grupos tiofosfato na substituição de grupos fosfato têm potência e duração de ação aprimoradas in vivo.
[0211] P pode também ser um etilfosfato (isto é, onde Y1 representa =O e Y2 representa OCH2CH3).
[0212] O sacarídeo pode ser selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula-alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína hepático (ASGP-R).
[0213] Para qualquer um dos aspectos acima, o sacarídeo pode ser selecionado a partir de N-acetila com um ou mais dentre galactosamina, manose, galactose, glicose, glicosamina e frutose. De preferência, o sa- carídeo é duas moléculas de N-acetil galactosamina (GalNAc). Os com- postos descritos no presente documento podem ter 3 ligantes que são, cada um, de preferência, N-acetil galactosamina.
[0214] "GalNAc" refere-se a 2-(Acetilamino)-2-desóxi-D-galactopira- nose, comumente denominada na literatura como N-acetil galactosa- mina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui igual- mente a forma β: 2-(Acetilamino)-2-desóxi-β-D-galactopiranose e a forma α: 2-(Acetilamino)-2-desóxi-α-D-galactopiranose. Em determina- das modalidades, tanto a forma β: 2-(Acetilamino)-2-desóxi-β-D-galac- topiranose quanto a forma α: 2-(Acetilamino)-2-desóxi-α-D-galactopira- nose podem ser usadas alternadamente. De preferência, os compostos descritos no presente documento compreendem a forma β, 2-(Acetila- mino)-2-desóxi-β-D-galactopiranose.
2-(Acetilamino)-2-desóxi-D-galactopiranose 2-(Acetilamino)-2-desóxi-β-D-galactopiranose 2-(Acetilamino)-2-desóxi-α-D-galactopiranose
[0215] Para qualquer um dos compostos acima de fórmula (III), X1 pode ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X1 pode ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X1 pode ser (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. De preferência, X1 é (-CH2-CH2-O)2(- CH2)2-. Alternativamente, X1 representa C3-C6 alquileno. X1 pode ser propileno. X1 pode ser butileno. X1 pode ser pentileno. X1 pode ser he- xileno. De preferência, a alquila é um alquileno linear. Em particular, X1 pode ser butileno.
[0216] Para compostos de fórmula (III), X2 representa um éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-, isto é, C3alcóxi metileno ou - CH2CH2CH2OCH2-.
[0217] A invenção fornece um ácido nucleico conjugado que tem uma das seguintes estruturas:
OH OH OH HO ACHN OH O OH O O ACHN O O O O O O S P O OH O O OH S P O ACHN O OH O O O O O O S O Z O P O O O S O P O
O em que Z é um ácido nucleico conforme definido no presente documento antes ou depois.
[0218] É preferido um ácido nucleico que tem uma das seguintes estruturas:
em que Z é um ácido nucleico conforme definido no presente documento antes ou depois, porém, um ácido nucleico que tem a primeira destas duas estruturas é particularmente preferido.
[0219] A invenção fornece, como outro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos se- lecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442 ou selecionada a partir de SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 113,
115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tal como selecionada a partir de SEQ ID nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, em que o ácido nucleico é conju- gado direta ou indiretamente a um ligante através de um agente de liga- ção.
[0220] A segunda fita pode compreender uma sequência de nucle- otídeos de SEQ ID NO 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435,437, 439, 441 ou 443 ou selecionada a partir de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como selecionada a partir de SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,
24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.
[0221] O ácido nucleico pode ser conjugado a um ligante, conforme descrito no presente documento.
[0222] Os nucleotídeos das primeira e/ou segunda fitas podem ser modificados, conforme descrito no presente documento.
[0223] De preferência, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 conjugadas a um ligante de fórmula I (conforme apresentado acima), particularmente da fórmula mostrada na Figura 8a, e em que a primeira fita é modificada com uma modificação 2’OMe nos nucleotídeos de número ímpar e modificada com um 2’F nos nucleotí- deos de número par e a segunda fita é modificada com um 2’OMe nos nucleotídeos de número par e modificada com um 2’F nos nucleotídeos de número ímpar.
[0224] Mais preferivelmente, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, em que o ácido nucleico é conjugado a um ligante de fórmula I (conforme apresentado acima) e, além disso, em que o ácido nucleico tem um padrão de modificação conforme mostrado abaixo, o qual é extraído a partir da Tabela 1 conforme fornecido no presente documento. SEQ ID NO: 17 5´aaccagaagaagcagguga 3´ 6273646282647284546 SEQ ID NO: 18 5´ucaccugcuucuucugguu 3´ 1727354715351718451 em que as modificações específicas são descritas pelos números: 1 = 2’F-dU, 2 = 2’F-dA, 3 = 2’F-dC, 4 = 2’F-dG, 5 = 2’-OMe-rU;
6 = 2’-OMe-rA; 7 = 2’-OMe-rC; 8 = 2’-OMe-rG.
[0225] O ligante pode compreender GalNAc e a Figura 8a ou Figura 8b ou Figura 8c ilustra ainda mais a presente invenção.
[0226] Outros ácidos nucleicos preferidos estão listados acima e abaixo.
[0227] Um grupo de ligação clivável é um ligante que é estável fora da célula, porém, é clivado quanto de entrada em uma célula-alvo. A clivagem libera as duas partes que o ligante mantém unidas.
[0228] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico descrito no presente documento compreende um grupo de ligação clivável que é clivado pelo menos 10 vezes ou mais, de preferência pelo menos 100 vezes mais rápido em uma célula-alvo ou sob uma primeira condição de referência (a qual pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições intracelulares) do que no sangue de um indivíduo ou sob uma segunda condição de referência (a qual pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).
[0229] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de cli- vagem, por exemplo, pH, potencial redox ou presença de moléculas de- gradativas. Moléculas degradativas incluem enzimas oxidativas ou re- dutoras, agentes redutores (tais como mercaptanos), esterases, endos- somas ou agentes que podem criar um ambiente ácido, enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido ao atuar como um ácido geral, peptidases e fosfatases.
[0230] Um grupo de ligação clivável pode ser uma ligação de dis- sulfeto, a qual é suscetível ao pH.
[0231] Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima específica. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligante pode depender da célula-alvo. Por exemplo, um ligante que inclui um grupo éster é preferido quando uma célula he- pática é o alvo. Ligantes que contêm ligações peptídicas podem ser usa- dos ao direcionar células ricas em peptidases, tais como células hepá- ticas e sinoviócitos.
[0232] Em geral, a adequabilidade de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada ao testar a capacidade de um agente (ou condição) degradante de clivar o grupo de ligação candidato. Também será desejável testar da mesma forma o grupo de ligação clivável can- didato quanto à capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Em modalidades preferidas, os compostos candidatos úteis são clivados pelo menos 2, 4, 10 ou 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições intracelulares) comparado ao sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições extracelu- lares).
[0233] Em um aspecto, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável redox. O grupo de ligação clivável redox pode ser um grupo de ligação de dissulfeto.
[0234] Em um aspecto, o grupo de ligação pode ser um grupo de ligação clivável com base em fosfato. As modalidades preferidas são - O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O- P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O- Ρ(O)(Η)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)- S-, -O-P(S)(H)-S-. Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-.
[0235] Em um aspecto, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável por ácido. De preferência, o grupo de ligação clivável por ácido é clivado em ambientes nos quais o pH é 6,5 ou infe- rior ou é clivado por agentes tais como enzimas que podem atuar como um ácido em geral. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácidos incluem, porém sem limitações, hidrazonas, ésteres e ésteres de ami- noácidos. Grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral -C=NN- ; C(O)O ou -OC(O). Uma modalidade preferida é um grupo de ligação no qual o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído ou grupo alquila terciário, tal como dimetil pentila ou t-butila.
[0236] Em uma modalidade, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável com base em éster. Exemplos de grupos de ligação cliváveis com base em éster incluem, porém sem limitações, ésteres dos grupos alquileno, alquenileno e alquinileno.
[0237] Em uma modalidade, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável com base em peptídeo. Grupos de ligação cliváveis com base em peptídeos são ligações peptídicas formadas en- tre aminoácidos para produzir oligopeptídeos (por exemplo, dipeptí- deos, tripeptídeos, etc.) e polipeptídeos. O grupo de clivagem com base em peptídeo é, em geral, limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação de amida) formada entre aminoácidos que produzem peptídeos e pro- teínas e não inclui todo o grupo funcional amida. Os grupos de ligação cliváveis com base em peptídeo têm a fórmula geral - NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes.
[0238] O ácido nucleico conforme descrito no presente documento pode ser formulado com um lipídio na forma de um lipossoma. Esta for- mulação pode ser descrita na técnica como um lipoplex. A formulação com um lípideo/lipossoma pode ser usada para auxiliar na distribuição do ácido nucleico da invenção às células alvo. O sistema de distribuição lipídico descrito no presente documento pode ser usado como uma al- ternativa a um ligante conjugado. As modificações descritas no presente documento podem estar presentes quando se usa o ácido nucleico da invenção com um sistema de liberação lipídico ou com um sistema de distribuição de conjugadoe ligante.
[0239] Tal lipoplex pode compreender uma formulação lipídica que compreende: i) um lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídio PEGuilado.
[0240] O lipídio catiônico pode ser um lipídio catiônico de amino.
[0241] O lipídio catiônico pode ter a fórmula (IV): (IV) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: X representa O, S ou NH; R1 e R2 representam, cada um independentemente, uma cadeia de C4- C22 alquila linear ou ramificada ou uma cadeia de C4-C22 alquenila linear ou ramificada com uma ou mais ligações duplas, em que a cadeia de alquila ou alquenila contém opcionalmente um éster, amida ou dissul- feto interveniente; quando X representa S ou NH, R3 e R4 representam, cada um indepen- dentemente, hidrogênio, metila, etila, uma porção mono- ou poliamina ou R3 e R4 juntos formam um anel de heterociclila; quando X representa O, R3 e R4 representam, cada um independente- mente, hidrogênio, metila, etila, uma porção mono- ou poliamina ou R3 e R4 juntos formam um anel de heterociclila ou R3 representa hidrogênio e R4 representa C(NH)(NH2).
[0242] O lipídio catiônico pode ter a fórmula (V):
(V) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0243] O lipídio catiônico pode ter a fórmula (VI): (VI) ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
[0244] O teor do componente lipídico catiônico pode ser de cerca de 55% molar a cerca de 65% molar do teor lipídico total da formulação. Em particular, o componente lipídico catiônico é cerca de 59 % molar do teor lipídico total da formulação.
[0245] As formulações compreendem ainda um esteroide. O este- roide pode ser colesterol. O teor do esteroide pode ser de cerca de 26% molar a cerca de 35 % molar do teor lipídico total da formulação lipídica. Mais particularmente, o teor de esteroide pode ser cerca de 30 % molar do teor lipídico total da formulação lipídica.
[0246] O fosfolipídio de fosfatidiletanolamina pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-difiltanoil-sn-glicero-3-fosfoetano- lamina (DPhyPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-diestearoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 1,2-dilauroil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoeta- nolamina (DMPE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-Dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLoPE), 1-Pal- mitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), 1,2-Dierucoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), 1,2-Diesqualeoil-sn-glicero-3-fosfo- etanolamina (DSQPE) e 1-Estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfoetano- lamina (SLPE). O teor do fosfolipídio pode ser de cerca de 10 % molar do teor lipídico total da formulação.
[0247] O lipídio PEGuilado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietileno glicol (DMG-PEG) e C16-Ceramida-PEG. O teor do lipídio PEGuilado pode ser de cerca de 1 a 5 % molar do teor lipídico total da formulação.
[0248] O teor do componente lipídico catiônico na composição pode ser a partir de cerca de 55 % molar a cerca de 65 % molar do teor lipídico total da formulação lipídica, de preferência cerca de 59 % molar do teor lipídico total da formulação lipídica.
[0249] A formulação pode ter uma proporção molar dos componen- tes i): ii): iii): iv) selecionada a partir de 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; e 65:24:10:1.
[0250] A composição pode compreender um lipídio catiônico que tem a estrutura: um esteroide que tem a estrutura: um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina que tem a estrutura:
e um lipídio PEGuilado que tem a estrutura:
[0251] Composições lipossômicas neutras podem ser formadas, por exemplo, a partir de dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoilfos- fatidilcolina (DPPC). Composições lipossômicas aniônicas podem ser formadas a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, enquanto que liposso- mas fusogênicos aniônicos podem ser formados principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipos- sômica pode ser formado a partir de fosfatidilcolina (PC) tal como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de mis- turas de fosfolipídio e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.
[0252] Um lipídio catiônico sintético positivamente carregado, clo- reto de N-[l-(2,3-dioleilóxi)propil]-Ν,Ν,N-trimetilamônio (DOTMA) pode ser usado para formar pequenos lipossomas que interagem espontane- amente com o ácido nucleico para formar complexos de lipídio-ácido nucleico que são capazes de se fundir com os lipídios negativamente carregados das membranas celulares das células de cultura tecidual. Análogos de DOTMA também podem ser usados para formar liposso- mas.
[0253] Derivados e análogos de lipídios descritos no presente do- cumento também podem ser usados para formar lipossomas.
[0254] Um lipossoma que contém um ácido nucleico pode ser pre- parado através de uma variedade de métodos. Em um exemplo, o com- ponente lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente, de modo que micelas são formadas com o componente lipídico. Por exem- plo, o componente lipídico pode ser um lipídio catiônico anfipático ou conjugado lipídico. O detergente pode ter uma alta concentração crítica de micelas e pode não ser iônico. Detergentes exemplificativos incluem colato, CHAPS, octilglicosídeo, desoxicolato e lauroil sarcosina. A pre- paração de ácidos nucleicos é, então, adicionada a micelas que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos no lipídio interagem com o ácido nucleico e condensam em torno do ácido nucleico para formar um lipossoma. Após a condensação, o detergente é removido, por exemplo, por meio de diálise, para produzir uma preparação lipossômica de áci- dos nucleicos.
[0255] Se necessário, um composto carreador que auxilia na con- densação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, através de adição controlada. Por exemplo, o composto car- reador pode ser um polímero diferente de um ácido nucleico (por exem- plo, espermina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.
[0256] As formulações de ácido nucleico podem incluir um tensoa- tivo. Em uma modalidade, o ácido nucleico é formulado como uma emul- são que inclui um tensoativo.
[0257] Um tensoativo que não é ionizado é um tensoativo não iô- nico. Exemplos incluem ésteres não iônicos, tais como ésteres de eti- leno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila etc., alcano- lamidas não iônicas, e éteres tais como etoxilatos de álcool graxo, al- coóis propoxilados e polímeros em blocos etoxilados/propoxilados.
[0258] Um tensoativo que traz uma carga negativa quando dissol- vido ou disperso em água é um tensoativo aniônico. Exemplos incluem carboxilatos, tais como sabões, lactilatos de acila, amidas de acila de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico, tais como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos, tais como alquil benzeno sulfonatos, isetionatos de acila, tauratos de acila e sulfossuccinatos e fosfatos.
[0259] Um tensoativo que traz uma carga positiva quando dissolvido ou disperso em água é um tensoativo catiônico. Exemplos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas.
[0260] Um tensoativo que tem a capacidade de portar uma carga positiva ou negativa é um tensoativo anfotérico. Exemplos incluem deri- vados de ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N-alquilbetaínas e fosfatídeos.
[0261] "Micelas" são definidas no presente documento como um tipo particular de montagem molecular no qual moléculas anfipáticas es- tão dispostas em uma estrutura esférica, de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas sejam direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa circundante. O arranjo inverso existe se o ambiente for hidrofóbico. Uma micela pode ser formada ao misturar uma solução aquosa do ácido nucleico, um al- quil sulfato de metal alcalino e pelo menos um composto formador de micelas.
[0262] Exemplos de compostos formadores de micelas incluem le- citina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hi- alurônico, ácido glicólico, ácido láctico, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, mono-oleína, mono-oleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula, men- tol, tri-hidróxi oxo colanil glicina e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos , glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de po- lioxietileno e análogos dos mesmos, alquil éteres de polidecanol e aná- logos dos mesmos, quenodesoxicolato, desoxicolato e misturas dos mesmos.
[0263] Fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para atuar como estabilizante e conservante. Um agente isotônico, tal como glicerina, pode ser adicionado.
[0264] Uma preparação de ácidos nucleicos pode ser incorporada em uma partícula, tal como uma micropartícula. As micropartículas po- dem ser produzidas através de secagem por pulverização, liofilização, evaporação, secagem em leito fluidizado, secagem a vácuo ou uma combinação destes métodos. Quelantes de Ferro
[0265] A terapia de quelação de ferro é usada para reduzir a sobre- carga de ferro. O ferro é removido de diferentes tecidos em taxas dife- rentes. O objetivo da terapia de quelação é prevenir o acúmulo exces- sivo de ferro e suas complicações, tal como disfunção hepática endocri- nológica e cardíaca. Vários quelantes de ferro foram concebidos para excretar o ferro dos tecidos através da urina ou fezes, formando com- plexos.
[0266] 1. Deferoxamina: Este é um quelante clinicamente aprovado, o qual é eficaz para terapia de quelação de ferro de longo prazo em β- talassemia e outras doenças com sobrecarga de ferro. Em virtude de sua meia-vida plasmática curta, ela é administrada por meio de infusão intravenosa contínua ou subcutânea para ser eficaz.
[0267] 2. Deferiprona: Este é um quelante oral geralmente tomado 3 vezes ao dia.
[0268] 3. Deferasirox (Exjade): Este é outro quelante de ferro oral com meia-vida prolongada. Ele é prescrito para uso diário.
[0269] 4. Deferasirox (Jadenu): Este é um comprimido revestido por filme com uma formulação diferente do Deferasirox (Exjade). A vanta- gem é que ele pode ser tomado junto com uma refeição leve.
[0270] O quelante de ferro preferido no contexto da presente inven- ção é a deferiprona.
[0271] Os diferentes quelantes têm um espectro diferente de efeitos colaterais, ou seja, reações no local da injeção pela Deferoxamina, in- suficiência renal pelar Deferoxamina e Deferasirox, atralgia e neutrope- nia pela Deferiprona. Transtornos gastrintestinais são efeitos colaterais relatados por todas as classes de quelantes. A adesão do paciente à terapia de quelação continua a ser um problema, mas melhorou com a disponibilidade de quelantes de ferro que podem ser tomados por via oral (Chalmers A.W., Shammo J.M. 'Evaluation of a new tablet formula- tion of deferasirox to reduce chronic iron overload after long-term blood transfusions', Ther Clin Risk Manag, 12: 201-8; e Mobarra N, Shanaki M, Ehteram H, Nasiri H, Sahmani M, Saeidi M, Goudarzi M, Pourkarim H, Azad M. 2016, 'A Review on Iron Chelators in Treatment of Iron Over- load Syndromes', Int J Hematol Oncol Stem Cell. 239-47).
[0272] Uma vantagem de usar a presente combinação de um que- lante e um siRNA que inibe TMPRSS6, especialmente para o tratamento de hemocromatose, é que o tratamento combinado permite reduzir os níveis de ferro no fígado de forma rápida e eficiente (vide Exemplo 47). Após o tratamento combinado inicial, a quantidade de doses do quelante pode ser drasticamente reduzida e o tratamento pode continuar essen- cialmente apenas com o siRNA, suplementado com o quelante como e quando necessário. Isto é altamente benéfico para os pacientes em vir- tude aos efeitos colaterais que eles experimentam dos quelantes de ferro. Consequentemente, um aspecto da presente invenção é uma combinação, uma combinação para uso, um ácido nucleico para uso, um kit, uma composição, uma composição para uso ou um método de tratamento em que um ácido nucleico e um quelante de ferro, conforme descrito no presente documento, são administrado em combinação em uma primeira fase do tratamento e em que a dosagem de quelante de ferro é fortemente reduzida em uma segunda fase do tratamento com-
parado com a primeira fase. Fortemente reduzido neste contexto signi- fica reduzido em pelo menos 50%, de preferência pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 80% entre quantidades comparáveis de tempo das primeira e segunda fases. A duração da primeira fase é, de preferência, de três semanas ou menos, mais preferivelmente duas semanas ou menos.
[0273] A presente invenção também fornece composições farma- cêuticas que compreendem um ácido nucleico ou ácido nucleico conju- gado da invenção em combinação com um ou mais quelantes de ferro. As composições farmacêuticas podem ser usadas como medicamentos ou como agentes diagnósticos, individualmente ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, um ácido nucleico ou ácido nucleico con- jugado pode ser combinado com um veículo de distribuição (por exem- plo, lipossomas) e excipientes, tais como carreadores, diluentes. Outros agentes, tais como conservantes e estabilizantes, também podem ser adicionados. Métodos para a distribuição de ácidos nucleicos são co- nhecidos na técnica e estão dentro do conhecimento daqueles versados natécnica.Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção um ou mais quelantes de ferro podem ser administrados separada, se- quencial ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada.
[0274] Deve ser observado que uma combinação no contexto da presente invenção não significa necessariamente que dois elementos (tais como o ácido nucleico e o quelante) são combinados em uma única composição. Em vez disso significa, de preferência, que os dois elemen- tos, tais como o ácido nucleico e o quelante, são para administração combinada, o que pode ocorrer ao mesmo tempo para ambos os ele- mentos ou em um curto período de tempo um do outro. Um curto perí- odo de tempo é, de preferência, uma semana, mas mais preferivelmente 6 dias, mais preferivelmente 5 dias, mais preferivelmente 4 dias, mais preferivelmente 3 dias, mais preferivelmente 2 dias, mais preferivel- mente 1 dia e mais preferivelmente menos de um dia, tal como 12 horas, 6 horas, 4 horas, 2 horas ou 1 hora.
[0275] Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, também pode ser administrado em combinação com outros compostos terapêuticos, ad- ministrados separada ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada.
[0276] A invenção também inclui uma composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da inven- ção, em combinação com um ou mais quelantes de ferro,em um excipi- ente fisiológica/farmaceuticamente aceitável, tal como um estabilizante, conservante, diluente, tampão e assim por diante. A invenção também inclui uma composição farmacêutica que compreende um ácido nu- cleico ou ácido nucleico conjugado em um excipiente fisiológica/farma- ceuticamente aceitável, tal como um estabilizante, conservante, dilu- ente, tampão e assim por diante, e uma composição farmacêutica que compreende um ou mais quelantes de ferro em um excipiente fisioló- gica/farmaceuticamente aceitável, tal como um estabilizante, conser- vante, diluente, tampão e assim por diante.
[0277] A composição farmacêutica pode ser especialmente formu- lada para administração na forma sólida ou líquida. A composição pode ser formulada para administração oral, administração parentérica (inclu- indo, por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou peridural), aplicação tópica, administração intravaginal ou intrarretal, ad- ministração sublingual, administração ocular, administração transdér- mica ou administração nasal. A distribuição usando métodos subcutâ- neos ou intravenosos é preferida.
[0278] Em uma modalidade, uma dose unitária pode conter entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado. Alternativamente, a dose pode ser a partir de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, ou 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, ou 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal ou 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Os níveis de dosagem também podem ser cal- culados através de outros parâmetros tais como, por exemplo, a área de superfície corporal.
[0279] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou so- lução aquosa injetável estéril ou estar em uma forma liofilizada. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode compreender lipoplexos liofilizados ou uma suspensão aquosa de lipoplexos. Os lipoplexos com- preendem, de preferência, um ácido nucleico descrito no presente do- cumento. Tais lipoplexos podem ser usados para distribuir o ácido nu- cleico descrito no presente documento a uma célula-alvo in vitro ou in vivo.
[0280] As composições farmacêuticas e medicamentos da presente invenção podem ser administrados a um indivíduo mamífero em uma dose farmaceuticamente eficaz. O mamífero pode ser selecionado a partir de um ser humano, um primata não humano, um símio ou prosi- miano, um cachorro, um gato, um cavalo, gado, um porco, uma cabra, uma ovelha, um camundongo, um rato, um hamster, um porco-espinho e um porquinho-da-índia, ou outras espécies relevantes. Com base nisto, a expressão "TMPRSS6", conforme usado aqui, denota ácido nu- cleico ou proteína em qualquer uma das espécies supracitadas, porém, de preferência, tal expressão denota ácidos nucleicos ou proteínas hu- manos.
[0281] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um ácido nu- cleico descrito no presente documento ou à composição farmacêutica que compreende o ácido nucleico descrito no presente documento, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou transtorno. A doença ou transtorno pode ser selecionado a partir do grupo que compreende hemocroma- tose, porfiria cutânea e doenças sanguíneas, tais como β-talassemias ou anemia falciforme, anemia diseritropoética congênita, síndrome de insuficiência medular, mielodisplasia e sobrecarga transfusional de ferro. O transtorno pode estar associado à sobrecarga de ferro e o trans- torno associado à sobrecarga de ferro pode ser mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou ataxia de Friedreich. De preferência, o transtorno é he- mocromatose.
[0282] Em particular, aspectos preferidos da invenção incluem:
[0283] Qualquer ácido nucleico, conforme descrito no presente do- cumento, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, para uso em um ou mais ou todos dentre: (i) tratamento de anemia, opcionalmente determinado adequadamente por um aumento de hemoglobina ou hematócrito ou por uma diminuição de reticulócitos, conforme descrito pelos métodos no presente docu- mento; e/ou (ii) redução de esplenomegalia, opcionalmente determinada por uma re- dução no tamanho ou peso do baço, conforme descrito pelos métodos no presente documento: e/ou (iii) melhoria da eritropoese ineficaz no baço, opcionalmente determi- nada pela redução na proporção relativa de células eritroides imaturas no baço, determinado por meio de análise FACS, conforme descrito no presente documento; e/ou (iv) melhoria da maturação/eritropoese de glóbulos vermelhos na me- dula óssea, opcionalmente determinado por uma diminuição na propor- ção relativa de células progenitoras eritroides e aumento de células eri- troides enucleadas determinado por meio de análise FACS, conforme descrito no presente documento;
(v) tratamento de hemocromatose; (vi) tratamento de sobrecarga de ferro.
[0284] A invenção inclui uma composição farmacêutica que com- preende uma ou mais moléculas de RNAi descritas aqui em combinação com um ou mais quelantes de ferro em um excipiente fisiológica/farma- ceuticamente aceitável, tal como um estabilizanter, conservante, dilu- ente, tampão e assim por diante.
[0285] A invenção inclui uma composição farmacêutica que com- preende uma ou mais moléculas de RNAi descritas no presente docu- mento em um excipiente fisiológica/farmaceuticamente aceitável, tal como um estabilizante, conservante, diluente, tampão e assim por di- ante e uma composição farmacêutica que compreende um ou mais que- lantes de ferro em um excipiente fisiológica/farmaceuticamente aceitá- vel, tal como um estabilizante, conservante, diluente, tampão e assim por diante.
[0286] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou so- lução aquosa injetável estéril ou estar em uma forma liofilizada.
[0287] As composições farmaceuticamente aceitáveis podem com- preender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais áci- dos nucleicos em qualquer modalidade de acordo com a invenção, em- pregadas isoladamente ou formuladas com um ou mais carreadores, excipiente e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
[0288] Exemplos de materiais que podem servir como carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como man- teiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de ger- gelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propi- leno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hi- dróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água isenta de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e amino- ácidos (23) componente sérico, tais como albumina sérica, HDL e LDL; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em for- mulações farmacêuticas.
[0289] Os estabilizantes podem ser agentes que estabilizam o agente de ácido nucleico, por exemplo, uma proteína que pode formar complexos com o ácido nucleico, quelantes (por exemplo, EDTA), sais, inibidores de RNAse e inibidores de DNAse.
[0290] Em alguns casos, é desejável retardar a absorção do fár- maco através de injeção subcutânea ou intramuscular a fim de prolongar o efeito de um fármaco. Isto pode ser conseguido pelo uso de uma sus- pensão líquida de material cristalino ou amorfo que tem baixa solubili- dade em água. A taxa de absorção do fármaco depende, então, da sua taxa de dissolução a qual, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrada por via parentérica é obtida ao dis- solver ou suspender o fármaco em um veículo oleoso.
[0291] O ácido nucleico descrito no presente documento pode ser capaz de inibir a expressão de TMPRSS6. O ácido nucleico descrito no presente documento pode ser capaz de inibir parcialmente a expressão de TMPRSS6 em uma célula. A inibição pode ser completa, isto é, 0 % do nível de expressão da expressão de TMPRSS6 na ausência do ácido nucleico da invenção. A inibição da expressão de TMPRSS6 pode ser parcial, ou seja, pode ser 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 75 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % da expressão de TMRPSS6 na ausência de um ácido nucleico da invenção. A inibição pode durar 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas ou até 6 meses, quando usada em um indivíduo, tal como um ser humano. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no presente documento, ou composições que incluem o mesmo, pode ser usado em um regime que compreende tratamentos uma ou duas vezes por semana, toda semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas, ou a cada oito semanas ou em regimes com fre- quência de dosagem variável, tais como combinações dos intervalos mencionados anteriormente. O ácido nucleico pode ser para uso subcu- tâneo, intravenoso ou usando quaisquer outras rotinas de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal.
[0292] Em células e/ou indivíduos tratados com ou que recebem o ácido nucleico descrito no presente documento, a expressão de TMPRSS6 pode ser inibida comparado com células e/ou indivíduos não tratados em uma faixa de 15 % a 100 %, porém, pelo menos cerca de 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 100 %. O nível de inibição pode permitir o tratamento de uma doença associada à expressão ou superexpressão de TMPRSS6 ou pode também permitir a investigação das funções do produto do gene de TMPRSS6.
[0293] A expressão do gene da hepcidina em células e/ou indiví- duos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado des- crito no presente documento pode ser aumentada comparado com cé- lulas não tratadas e/ou indivíduos em pelo menos cerca de 1,2 vezes,
cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes ou cerca de 5 vezes em virtude de inibição completa ou parcial da expressão do gene de TMPRSS6. Isto pode levar à concentração sérica de hepcidina em indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção podendo ser aumentada compa- rado com indivíduos não tratados em pelo menos cerca de 10 %, cerca de 25 %, cerca de 50 %, cerca de 100 %, cerca de 150 %, cerca de 200 %, cerca de 250 %, cerca de 300 % ou cerca de 500 %.
[0294] A concentração sérica em indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no presente documento pode ser diminuída comparado com indivíduos não tratados em pelo menos cerca de 10 %, cerca de 20 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %. A satura- ção da transferrina é um exame médico laboratorial que mede a quanti- dade de transferrina que é ligada ao ferro. A saturação da transferrina, medida em porcentagem, é um valor médico laboratorial que mede o valor do ferro sérico dividido pela capacidade total de ligação ao ferro da transferrina. A saturação de transferrina em indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no presente do- cumento pode ser diminuída comparado com indivíduos não tratados em pelo menos cerca de 10 %, cerca de 20 %, cerca de 30 %, cerca de 40 %, cerca de 50 %, cerca de 60 %, cerca de 70 %, cerca de 80 %.
[0295] Um outro aspecto da invenção refere-se ao ácido nucleico descrito no presente documento em combinação com um ou mais que- lantes de ferro na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou transtorno, tal como uma doença ou trans- torno, conforme listado acima.
[0296] Também está incluído na invenção um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou transtorno, tais como os listados acima, que compreende administrar uma composição farmacêutica que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no presente documento em combinação com um ou mais quelantes de ferro a um indivíduo que precisa de tratamento. A composição pode ser administrada duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas ou a cada oito semanas. O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, em com- binação com um ou mais quelantes de ferro, pode ser para uso subcu- tâneo ou intravenoso ou outras rotinas de aplicação, tais como oral, retal ou intraperitoneal. O ácido nucleico e o quelante podem ser administra- dos como uma única composição que compreende ambos ou em dife- rentes composições que são administradas separadamente, seja pela mesma via ou por uma via diferente, na mesma dosagem ou em dosa- gens diferentes, e na mesma ou em diferentes frequências de dosagem.
[0297] Em uma modalidade, um indivíduo recebe uma dose inicial e uma ou mais doses de manutenção de um agente de ácido nucleico. A dose ou doses de manutenção podem ser iguais ou menores do que a dose inicial, por exemplo, metade a menos da dose inicial. As doses de manutenção são, por exemplo, administradas não mais que uma vez a cada 2, 5, 10 ou 30 dias. O regime de tratamento pode durar um período de tempo que varia dependendo da natureza da doença em particular, sua gravidade e a condição geral do paciente. O indivíduo pode receber um quelante em combinação com o siRNA, tanto ao longo do tratamento com o siRNA ou apenas durante parte do tratamento com o siRNA. A dosagem do quelante que é administrada em combinação com o siRNA pode ser adaptada à necessidade particular do indivíduuo. A necessi- dade do indivíduo pode ser determinada, por exemplo, com base na medição dos níveis de ferro no fígado ou outros marcadores que indi- cam a necessidade de um tratamento combinado.
[0298] Em uma modalidade, a composição inclui uma pluralidade de espécies de agentes de ácidos nucleicos. Em outra modalidade, a espécie de agente de ácido nucleico tem sequências que não se sobre- põem e não são adjacentes a outra espécie em relação a uma sequên- cia-alvo de ocorrência natural. Em outra modalidade, a pluralidade de espécies de agentes de ácidos nucleicos é específica para diferentes genes-alvo de ocorrência natural. Em outra modalidade, o agente de ácido nucleico é específico para o alelo.
[0299] Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no presente documento em combinação com um ou mais quelantes de ferro também pode ser administrado ou para uso em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separada ou simultanea- mente, por exemplo, como uma dose unitária combinada.
[0300] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado descrito no presente documento em combinação com um ou mais quelantes de ferro pode ser produzido usando métodos de rotina na técnica, incluindo síntese química ou ao expressar o ácido nucleico in vitro (por exemplo, transcrição run off) ou in vivo. Por exemplo, usando a síntese química em fase sólida ou usando um vetor de expressão com base em ácidos nucleicos, incluindo derivados virais ou sistemas de expressão parcial ou completamente sintéticos. Em uma modalidade, o vetor de expres- são pode ser usado para produzir o ácido nucleico descrito no presente documento in vitro, dentro de um organismo hospedeiro intermediário ou tipo de célula, dentro de um organismo intermediário ou final ou den- tro da célula-alvo desejada. Métodos para a produção (síntese ou trans- crição enzimática) do ácido nucleico descrito no presente documento são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[0301] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a qualquer ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para uso, método, combinação, combinação para uso, kit, composição ou uso de acordo com qualquer descrição aqui, em que o ácido nucleico compreende uma modificação vinil-(E)-fosfonato, tal como uma modifi- cação 5' vinil-(E)-fosfonato, de preferência uma modificação 5' vinil-(E)- fosfonato em combinação com uma modificação 2’-F na segunda posi- ção da primeira fita.
[0302] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a qualquer ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para uso, método, combinação, combinação para uso, kit, composição ou uso de acordo com qualquer descrição aqui, em que o nucleotídeo ter- minal na extremidade 3' de pelo menos uma dentre a primeira fita e a segunda fita é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo ad- jacente por meio do carbono 3' do nucleotídeo terminal e o carbono 3' do nucleotídeo adjacente e/ou o nucleotídeo terminal na extremidade 5' de pelo menos uma dentre a primeira fita e a segunda fita é um nucleo- tídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do car- bono 5' do nucleotídeo terminal e do carbono 5' do nucleotídeo, opcio- nalmente em que: a. o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' das primeira e/ou segunda fitas está ligado ao nucleotídeo adjacente através de um grupo fosfato por meio de uma ligação de fosfodiéster; ou b. o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' das primeira e/ou segunda fitas está ligado ao nucleotídeo adjacente através de um grupo fosforotioato ou c. o nucleotídeo invertido 3' e/ou 5' das primeira e/ou segunda fitas está ligado ao nucleotídeo adjacente através de um grupo fosforoditioato.
[0303] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a qualquer ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para uso, método, combinação, combinação para uso, kit, composição ou uso de acordo com qualquer descrição aqui, em que o ácido nucleico compreende uma ligação de fosroditioato, opcionalmente, em que a li- gação está entre os 2 principais nucleotídeos 5' e/ou os 2 principais nu-
cleotídeos 3' da segunda fita e/ou opcionalmente em que o ácido nu- cleico não compreende adicionalmente qualquer ligação interna de fos- forotioato.
[0304] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos descrita no presente documento, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, em que a primeira fita e/ou a segunda fita do ácido nucleico compreende pelo menos um primeiro e um segundo tipos de ribonucleotídeo modificado e em que há mais do primeiro tipo de ribonucleotídeo modificado do que o segundo tipo de nucleotídeo modificado (por exemplo, mais de uma modificação 2’O metila do que uma modificação 2’ flúor), conforme computado em cada fita individualmente ou através das primeira e segunda fitas.
[0305] Para evitar dúvidas, o ácido nucleico pode ter mais de dois tipos de modificação.
[0306] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequên- cia de ácidos nucleicos descrita no presente documento, em combina- ção com um ou mais quelantes de ferro, em que mais de 50 % dos nu- cleotídeos das primeira e/ou segunda fitas compreendem uma modifi- cação 2’ O-metila, tal como mais de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80% ou 85% ou as primeira e/ou segunda fitas compreendem uma modifica- ção 2’ O-metila, de preferência medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos das primeira e segunda fitas.
[0307] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequên- cia de ácidos nucleicos descrita no presente documento, em combina- ção com um ou mais quelantes de ferro, em que mais de 50 % dos nu- cleotídeos das primeira e/ou segunda fitas compreendem uma modifi- cação de RNA de ocorrência natural, tal como em que mais de 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % ou 85 % ou mais das primeira e/ou segunda fitas compreendem esta modificação, de preferência medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos igualmente das primeira e se- gunda fitas. Modificações de ocorrência natural adequadas incluem, as- sim como 2-O’ metila, outras modificações 2’ açúcar, em particular uma modificação 2’-H que resulta em um nucleotídeo de DNA.
[0308] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequên- cia de ácidos nucleicos descrita no presente documento, em combina- ção com um ou mais quelantes de ferro, que compreende não mais de 20 %, tal como não mais de 15 %, tal como não mais de 10 %, de nu- cleotídeos que têm modificações 2’ que não são modificações 2’O metila nas primeira e/ou segunda fitas, de preferência como uma porcentagem do total de nucleotídeos das primeira e segunda fitas.
[0309] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequên- cia de ácidos nucleicos aqui no presente documento, em combinação com um ou mais quelantes de ferro, que compreende não mais de 20 % (tal como não mais de 15 % ou não mais de 10 %) de modificações 2’ flúor nas primeira e/ou segunda fitas, de preferência como uma porcen- tagem do total de nucleotídeos de ambas as fitas.
[0310] Outra modalidade da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em combinação com um ou mais quelantes de ferro que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente com- plementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos par- cialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos de HC18A conforme abaixo; e opcio- nalmente em que a dita segunda fita compreende a sequência de nu- cleotídeos de HC18b conforme abaixo: TMPRSS6-hc-18A UUUUCUCUUGGAGUCCUCA TMPRSS6-hc-18B UGAGGACUCCAAGAGAAAA
[0311] Opcionalmente, as sequências de ácidos nucleicos são TMPRSS6-hc-18A ou tanto TMPRSS6-hc-18A como 18B, conforme abaixo: TMPRSS6-hc- mU (ps) fU (ps) mUfUmCfUmCfUmUfGmGfAmGfUmCfCmU 18A (ps) fC (ps) mA TMPRSS6-hc- fUmGfAmGfGmAfCmUfCmCfAmAfGmAfGmAfA (ps) mA (ps) 18B fA
[0312] Opcionalmente, as sequências de ácidos nucleicos são uma ou ambas as sequências listadas abaixo. TMPRSS6-hc- mU (ps) fU (ps) mUfUmCfUmCfUmUfGmGfAmG- 18A fUmCfCmU (ps) fC (ps) mA TMPRSS6-hc- GN3 - fUmGfAmGfGmAfCmUfCmCfAmAfGmAfG- 18B mAfA (ps) mA (ps) fA
[0313] Todas as sequências são listadas de 5' para 3'. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos de HC23A conforme abaixo; e opcionalmente em que a dita segunda fita compre- ende a sequência de nucleotídeos de HC23B conforme abaixo: TMPRSS6-hc-23A CUGUUCUGGAUCGUCCACU TMPRSS6-hc-23B AGUGGACGAUCCAGAACAG
[0314] Opcionalmente, as sequências de ácido nucleico são TMPRSS6-hc-23A ou tanto TMPRSS6-hc-23A como 23B conforme abaixo: TMPRSS6-hc- mC (ps) fU (ps) mGfUmUfCmUfGmGfAmUfCmG- 23A fUmCfCmA (ps) fC (ps) mU
TMPRSS6-hc- fAmGfUmGfGmAfCmGfAmUfCmCfAmGfAmAfC 23B (ps) mA (ps) fG
[0315] Opcionalmente, as sequências de ácidos nucleicos são uma ou ambas as sequências listadas abaixo. TMPRSS6-hc- mC (ps) fU (ps) mGfUmUfCmUfGmGfAmUfCmG- 23A fUmCfCmA (ps) fC (ps) mU TMPRSS6-hc- GN3 - fAmGfUmGfGmAfCmGfAmUfCmCfAmGfA- 23B mAfC (ps) mA (ps) fG
[0316] Outra modalidade da invenção é um ácido nucleico para ini- bir a expressão de TMPRSS, em combinação com um ou mais quelan- tes de ferro, em uma célula que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcial- mente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS, em que a expressão de TMPRSS em uma célula é reduzida para níveis que são pelo menos 15% menores do que os níveis de expressão observados sob as mes- mas condições de teste, porém, na ausência de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle sem silenciamento.
[0317] O ácido nucleico pode ser qualquer um descrito no presente documento.
[0318] Determinadas características preferidas da invenção são lis- tadas abaixo: Determinadas Modalidades Preferidas
[0319] 1. Uma combinação que compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente com- plementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos par- cialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes se- quências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442 , de preferência SEQ ID NO: 333.
[0320] 2. Uma combinação para uso no tratamento de hemocroma- tose, porfiria cutânea tardia, doenças sanguíneas, tais como - talasse- mia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndro- mes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga de ferro trans- fusional, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkin- son, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade relacionadas não recidivantes asso- ciada a transplante de medula óssea, de preferência para o tratamento de hemocromatose,
[0321] a combinação (ou composição) compreendendo um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcial- mente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes se- quências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331,
335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, de preferência SEQ ID NO: 333.
[0322] 3. Um ácido nucleico para uso como um medicamento, de preferência um ácido nucleico para uso no tratamento de hemocroma- tose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como - talas- semia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndro- mes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga de ferro trans- fusional, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkin- son, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade relacionadas não recidivantes asso- ciada a transplante de medula óssea, de preferência para o tratamento de hemocromatose,
[0323] em que o ácido nucleico inibe a expressão de TMPRSS6, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente com- plementar à primeira fita, em que a dota primeira fita é pelo menos par- cialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes se- quências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325 , 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384 , 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434 , 436, 438, 440 ou 442, de preferência SEQ ID NO: 333,
[0324] em que o ácido nucleico é administrado com um ou mais quelantes de ferro.
[0325] 4. Um kit que compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro,
[0326] em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma re- gião de dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma pri- meira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita pri- meira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442 , de preferência SEQ ID NO: 333.
[0327] 5. Composição farmacêutica que compreende um ácido nu- cleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro,
[0328] em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma re- gião de dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma pri- meira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita pri- meira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416,
418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442 , de preferência SEQ ID NO: 333,
[0329] em que o ácido nucleico, quelante de ferro ou ambos são combinados com um excipiente fisiologicamente aceitável.
[0330] 6. Uma composição farmacêutica para uso no tratamento de hemocromatose, porfiria cutânea tardia, doenças sanguíneas, tais como - talassemia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética con- gênita, síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga de ferro transfusional, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade relacionadas não reci- divantes associada a transplante de medula óssea, de preferência para o tratamento de hemocromatose,
[0331] em que a composição farmacêutica compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcial- mente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, de preferência SEQ ID NO: 333,
[0332] em que o ácido nucleico, quelante de ferro ou ambos são combinados com um excipiente fisiologicamente aceitável.
[0333] 7. A combinação de acordo com a modalidade preferida 1, combinação para uso de acordo com a modalidade preferida 2, ácido nucleico para uso de acordo com a modalidade preferida 3, kit de acordo com a modalidade preferida 4, composição de acordo com a modalidade preferida 5 ou composição para uso de acordo com a modalidade pre- ferida 6, em que a segunda fita compreende um sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 334, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369 , 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419 , 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435.437, 439, 441 ou 443, de preferência SEQ ID NO: 334.
[0334] 8. A combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades preferidas 1-7, em que o um ou mais quelantes de ferro são selecionados a partir de deferoxamina, deferiprona, defera- sirox (Exjade) e deferairox (Jadenu), opcionalmente em que o quelante de ferro é deferiprona.
[0335] 9. A combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades preferidas 1-8, em que o um ou mais nucleotídeos nas primeira e/ou segunda fitas são modificados para formar nucleotí- deos modificados. O ácido nucleico pode compreender uma modifica- ção que é 2'-O-metila (2'OMe), a qual pode ser uma primeira modifica- ção, e uma segunda modificação que é 2'-F. Os nucleotídeos modifica- dos são, evidentemente, nucleotídeos que conservam sua identidade de base (A, C, G, T, U), mas têm uma ou várias modificações, por exem- plo, no açúcar, tal como uma modificação 2'-OH para 2'OMe ou 2 'F.
[0336] 10. A combinação, combinação para uso ou ácido nucleico para uso de acordo com a modalidade preferida 9, em que a dita pri- meira fita compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO:
17 e em que a dita segunda fita compreende a sequência de nucleotí- deos de SEQ ID NO: 18: 5´aumaccumagumaumagumaumagcu- SEQ ID NO: 17 6273646282647284546 maggvocêgum 3´ 5´ucumaccvocêgcvocêvocêcvocêvo- SEQ ID NO: 18 1727354715351718451 cêcvocêggvocêu 3´
[0337] em que as modificações específicas são representadas pe- los seguintes números: 1 = 2'F-dU; 2 = 2'F-dA; 3 = 2'F-dC; 4 = 2'F-dG; 5 = 2'-OMe-rU; 6 = 2'-OMe-rA; 7 = 2'-OMe-rC; 8 = 2'-OMe-rG.
[0338] 11. Uma combinação que compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e deferiprona,
[0339] em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma re- gião de dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma pri- meira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita pri- meira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a pri- meira fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18.
[0340] 12. Uma combinação para uso no tratamento de hemocro- matose, porfiria cutânea tardia, doenças sanguíneas, tais como - talas- semia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndro-
mes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga de ferro trans- fusional, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkin- son, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade relacionadas não recidivantes asso- ciadas a transplante de medula óssea, de preferência para o tratamento de hemocromatose,
[0341] que compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e deferiprona, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a primeira fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO : 18.
[0342] 13. Um ácido nucleico para uso como um medicamento, de preferência um ácido nucleico para uso no tratamento de hemocroma- tose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como -talas- semia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndro- mes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga de ferro trans- fusional, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkin- son, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade relacionadas não recidivantes asso- ciadas a transplante de medula óssea, de preferência para o tratamento de hemocromatose,
[0343] em que o ácido nucleico inibe a expressão de TMPRSS6, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente com- plementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos par- cialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a primeira fita compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compre- ende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18, e
[0344] em que o ácido nucleico é administrado com deferiprona.
[0345] 14. A combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com qual- quer uma das modalidades preferidas 1-13, em que o ácido nucleico e um ou mais quelantes de ferro são administrados simultânea, separada ou sequencialmente. De preferência, o ácido nucleico e o quelante são administrados não em uma única dose, mas separadamente. Isto per- mite adaptar a dosagem do ácido nucleico e principalmente do quelante à necessidade do indivíduo.
[0346] 15. A combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com qual- quer uma das modalidades preferidas 1-14, em que o ácido nucleico é conjugado a um ligante, opcionalmente na extremidade 5' da segunda fita, opcionalmente em que o ligante compreende (i) uma ou mais por- ções N-acetil galactosamina (GalNAc) e derivados da mesma e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc ao ácido nucleico.
[0347] 16. A combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com a modalidade preferida 15, em que o ácido nucleico conjugado tem a es- trutura:
[0348] em que Z é um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das modalidades preferidas 1 a 14,17. Uma combinação, combinação para uso ou ácido nucleico para uso de acordo com qualquer uma das modalidades preferidas de 1 a 14, ou um ácido nucleico conjugado de acordo com modalidades preferidas 15-16, em que o ácido nucleico é estabilizado na extremidade 5' e/ou 3' de uma ou ambas as fitas, opcio-
nalmente em que o ácido nucleico compreende duas ligações de fosfo- rotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita, e duas ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita que tem a estrutura: 5'-3 ' TMPRSS6-hcm-9A 6 (ps) 2 (ps) 736462826472845 (ps) 4 (ps) 6 5'-3 ' TMPRSS6-hcm-9B 17273547153517184 (ps) 5 (ps) 1
[0349] em que as modificações específicas são representadas pe- los seguintes números: 1 = 2'F-dU, 2 = 2'F-dA, 3 = 2'F-dC, 4 = 2'F-dG, 5 = 2'-OMe-rU; 6 = 2'-OMe-rA; 7 = 2'-OMe-rC; 8 = 2'-OMe-rG (ps) = ligação de fosforotioato.
[0350] 18. Um método de tratamento de uma doença ou transtorno, de preferência hemocromatose, que compreende administrar uma com- binação que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conju- gado e um ou mais quelantes de ferro de acordo com qualquer uma das modalidades preferidas 1-17 a um indivíduo que precisa de tratamento.
[0351] A primeira fita de ácidos nucleicos compreende ou, de prefe- rência, consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 333, de preferência modificada em SEQ ID NO: 17 e opcionalmente estabilizada com ligações de fosforotioato, conforme mostrado em SEQ ID NO: 217.
[0352] A segunda fita de ácidos nucleicos compreende ou, de pre- ferência, consiste na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 334, de preferência modificada em SEQ ID NO: 18 e opcionalmente estabilizada com ligações de fosforotioato, conforme mostrado em SEQ ID NO: 218.
O ligante pode ser o ligante conforme mostrado em SEQ ID NO: 218 ou um ligante diferente, porém, o ligante é, de preferência, conforme mos- trado em SEQ ID NO: 218.
[0353] O ácido nucleico é, de preferência, conjugado a um ligante, opcionalmente na extremidade 5' da segunda fita, opcionalmente em que o ligante é GN (Figura 8a), GN2 (Figura 8b) ou GN3 (Figura 8c), mais preferivelmente GN2.
[0354] A primeira fita de ácidos nucleicos compreende ou, de prefe- rência, consiste em SEQ ID NO: 217 e/ou a segunda fita de ácidos nu- cleicos compreende ou, de preferência, consiste em SEQ ID NO: 218, em ambos os casos com todas as modificações, incluindo modificações internucleotídicas, e com o ligante conforme mostrado.
[0355] De preferência, a doença ou transtorno a ser tratado é he- mocromatose e, mais preferivelmente, hemocromatose hereditária. Al- ternativamente, ou além disso, a doença ou transtorno é, de preferência, sobrecarga de ferro, tal como sobrecarga de ferro transfusional, um transtorno associado à sobrecarga de ferro ou Ataxia de Friedreich as- sociada à sobrecarga de ferro.
[0356] De preferência, são administradas doses múltiplas do siRNA. O ácido nucleico descrito no presente documento, ou composi- ções que incluem os mesmos, podem ser para uso em um regime que compreende tratamentos uma ou duas vezes por semana, toda semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas ou a cada oito semanas, ou regimes com uma frequência de dosagem variá- vel, tais como combinações dos intervalos mencionados anterior- mente. Em uma modalidade, um indivíduo recebe uma dose inicial e uma ou mais doses de manutenção de um agente de ácidos nuclei- cos. A dose ou doses de manutenção podem ser iguais ou menores do que a dose inicial, por exemplo, metade a menos da dose inicial. As do- ses de manutenção são, por exemplo, administradas não mais do que uma vez a cada 2, 5, 10 ou 30 dias.
[0357] As modalidades preferidas podem ser combinadas com quaisquer outros aspectos, modalidades, declarações e características descritas no presente documento.
[0358] Determinadas características preferidas estão listadas abaixo: Especificações
[0359] 1. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à pri- meira fita, em que a dita primeira a fita é pelo menos parcialmente com- plementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215.
[0360] 2. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 1, em que a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.
[0361] 3. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 1 ou especificação 2, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17.
[0362] 4. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 3, em que a dita segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18.
[0363] 5. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 4, em que as ditas primeira fita e/ou segunda fita têm a partir de 17 a 35 nucleotídeos de comprimento.
[0364] 6. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 5, em que a pelo menos uma região dúplex consiste em 19-25 pares de bases de nucleotídeo consecutivos.
[0365] 7. Um ácido nucleico de acordo com qualquer especificação anterior o qual: a) tem uma extremidade cega em ambas as extremidades; ou b) tem uma saliência em uma extremidade e uma extremidade cega na outra; ou c) tem uma saliência em ambas extremidades.
[0366] 8. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer especificação anterior, em que um ou mais nucleotídeos nas primeira e/ou na segunda fitas são modificados para formar nucleotídeos modificados.
[0367] 9. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 8, em que um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da primeira fita são modificados.
[0368] 10. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 9, em que um ou mais dos nucleotídeos de número par da primeira fita são modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação de acordo com a especificação 9.
[0369] 11. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 10, em que pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número par modifi- cados é adjacente a pelo menos um de um ou mais nucleotídeos de número ímpar modificados.
[0370] 12. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 9 a 11, em que uma pluralidade de nucleotídeos de número ímpar é modificada.
[0371] 13. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 10 a 12, em que uma pluralidade de nucleotídeos de número par é modifi- cada por uma segunda modificação.
[0372] 14. Um ácido nucleico de acordo com quaisquer das especi- ficações 8 a 13, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adja- centes que são modificados por uma modificação em comum.
[0373] 15. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 9 a 14, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação de acordo com a especificação 9.
[0374] 16. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 9 a 15, em que um ou mais dos nucleotídeos de número ímpar da segunda fita são modificados por uma modificação que é dife- rente da modificação de acordo com a especificação 9.
[0375] 17. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 9 a 15, em que um ou mais dos nucleotídeos de número par da segunda fita são modificados pela modificação de acordo com a especificação 9.
[0376] 18. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 16 ou 17, em que pelo menos um do um ou mais nucleotídeos de número par modificados da segunda fita é adjacente a um ou mais nucleotídeos de número ímpar modificados da segunda fita.
[0377] 19. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 16 a 18, em que uma pluralidade de nucleotídeos de nú- mero ímpar da segunda fita é modificada por uma modificação em co- mum.
[0378] 20. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 16 a 19, em que uma pluralidade de nucleotídeos de nú- mero par é modificada por uma modificação de acordo com a especifi- cação 9.
[0379] 21. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 16 a 20, em que uma pluralidade de nucleotídeos de nú- mero ímpar na segunda fita é modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação de acordo com a especificação 9.
[0380] 22. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 16 a 21, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação em comum.
[0381] 23. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 16 a 22, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação de acordo com a especificação 9.
[0382] 24. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 8 a 23, em que cada um dos nucleotídeos de número ímpar na primeira fita e cada um dos nucleotídeos de número par na segunda fita são modificados com uma modificação em comum.
[0383] 25. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 24, em que cada um dos nucleotídeos de número par é modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos de nú- mero ímpar é modificado na segunda fita com uma segunda modifica- ção.
[0384] 26. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 8 a 25, em que os nucleotídeos modificados da primeira fita são deslocados em pelo menos um nucleotídeo em relação aos nu- cleotídeos não modificados ou modificados de forma diferente da se- gunda fita.
[0385] 27. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 8 a 26, em que a modificação e/ou modificações são, cada uma e individualmente, selecionadas a partir do grupo que consiste em desoxitimina 3'-terminal, 2’-O-metila, uma modificação 2’-desóxi, uma modificação 2’-amino, uma modificação 2’-alquila, uma modificação de morfolino, uma modificação de fosforamidato, modificação do grupo 5'- fosforotioato, uma modificação de 5' fosfato ou que imita de 5' fosfato e um derivado de colesterila ou uma modificação do grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico.
[0386] 28. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 8 a 27, em que a modificação é qualquer uma dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natu- ral que compreende o nucleotídeo.
[0387] 29. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 8 a 28, em que a pelo menos uma modificação é 2’-O-me- tila.
[0388] 30. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 8 a 29, em que a pelo menos uma modificação é 2’-F.
[0389] 31. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente com- plementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos par- cialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA trans- crito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compre- ende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211,
213 ou 215, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados com uma primeira modificação nos nucleotídeos de número ímpar e mo- dificados com uma segunda modificação nos nucleotídeos de número par e os nucleotídeos da segunda fita são modificados com uma terceira modificação nos nucleotídeos de número par e modificados com uma quarta modificação nos nucleotídeos de número ímpar, em que a pelo menos primeira modificação é diferente da segunda modificação e a ter- ceira modificação é diferente da quarta modificação.
[0390] 32. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 31, em que a segunda sequência compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.
[0391] 33. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 31 ou 32, em que a quarta modificação e a segunda modificação são as mes- mas.
[0392] 34. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 31 a 33, em que a primeira modificação e a terceira modi- ficação são as mesmas.
[0393] 35. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 31 a 34, em que a primeira modificação é 2’O-Me e a se- gunda modificação é 2’F.
[0394] 36. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 31 a 35, em que a primeira fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18.
[0395] 37. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 31 a 36 que compreende uma sequência e modificações, conforme mostrado na tabela abaixo:
SEQ ID NO: 17 5´aaccagaagaagcagguga 3´ 6273646282647284546 SEQ ID NO: 18 5´ucaccugcuucuucugguu 3´ 1727354715351718451
[0396] em que as modificações específicas são representadas por números: 1 = 2’F-dU, 2 = 2’F-dA, 3 = 2’F-dC, 4 = 2’F-dG, 5 = 2’-OMe-rU; 6 = 2’-OMe-rA; 7 = 2’-OMe-rC; 8 = 2’-OMe-rG.
[0397] 38. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 37 conjugado a um ligante.
[0398] 39. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 38 que compreende uma ligação de fosforotioato entre um, dois ou três nucleotídeos 3' e/ou nucleotídeos 5' terminais das pri- meira e/ou segunda fitas.
[0399] 40. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 39 que compreende duas ligações de fosforotioato en- tre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e duas ligações de fosforotio- ato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita.
[0400] 41. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula que compreende pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente com- plementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos par-
cialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA trans- crito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compre- ende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, em que o dito ácido nucleico conjugado a um ligante.
[0401] 42. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 41, em que o ligante compreende (i) uma ou mais porções N-acetil galactosa- mina (GalNAc) e derivados da mesma e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc a um ácido nucleico conforme definido na especificação 41.
[0402] 43. Um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 41 ou 42, em que o ligante pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente.
[0403] 44. Um ácido nucleico de acordo com as especificações 41 a 43, em que os nucleotídeos são modificados conforme definido em quaisquer especificações anteriores.
[0404] 45. Um ácido nucleico de acordo com qualquer especificação anterior, em que o ligante compreende a fórmula I: [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosa- mina; X1 representa C3-C6alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-, em que m é 1, 2 ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (de preferência um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n-O-CH2-, onde n = 1-6;
A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade de ligação em ponte em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conju- gado a X3 por meio de um fosfato ou fosfato modificado (de preferência, um tiofosfato).
[0405] 46. Um ácido nucleico conjugado que tem uma das seguintes estruturas:
[0406] em que Z é um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 1 a 40.
[0407] 47. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das es- pecificações 1 a 40, o qual é conjugado a um ligante da seguinte estru- tura:
[0408] 48. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer especificação anterior, em que o dúplex compre- enfitas separadas.
[0409] 49. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer especificação anterior, em que o dúplex compre- ende uma fita simples que compreende uma primeira fita e uma se- gunda fita.
[0410] 50. Uma composição que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, conforme definido em qualquer especificação anterior e uma formulação que compreende: i) um lipídio catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídio de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídio PEGuilado.
[0411] 51. Uma composição de acordo com a especificação 50 em que, na formulação, o teor do componente lipídico catiônico é de cerca de 55 % % molar a cerca de 65 % % molar do teor lipídico total da for- mulação lipídica, de preferência cerca de 59 % % molar do teor lipídico total da formulação lipídica.
[0412] 52. Uma composição conforme apresentado na especifica- ção 50, em que a formulação compreende:
[0413] um lipídio catiônico que tem a estrutura:
[0414] o esteroide tem a estrutura:
[0415] o fosfolipídio de fosfatidiletanolamina tem a estrutura:
[0416] E o lipídio PEGuilado que tem a estrutura:
[0417] 53. Uma composição que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer especificação ante- rior e um excipiente fisiologicamente aceitável.
[0418] 54. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer especificação anterior para uso no tratamento de uma doença ou transtorno.
[0419] 55. Um uso de um ácido nucleico ou ácido nucleico conju- gado de acordo com qualquer especificação anterior na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou transtorno.
[0420] 56. Um método para tratar uma doença ou transtorno que compreende administrar uma composição que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer uma das especificações anteriores a um indivíduo que precisa de tratamento.
[0421] 57. O método de acordo com a especificação 55, em que o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado é administrado ao indivíduo através da via subcutânea ou intravenosa.
[0422] 58. Um uso ou método de acordo com qualquer uma das es- pecificações 54 a 56, em que a dita doença ou transtorno é selecionado a partir do grupo que compreende hemocromatose, porfiria eritropoé- tica, sobrecarga transfusional de ferro e transtornos sanguíneos.
[0423] 59. O uso ou método de acordo com a especificação 58, em que o transtorno sanguíneo é β-talassemias, anemia falciforme, anemia sideroblástica congênita, anemia aplásica ou síndrome mielodisplásica.
[0424] 60. O uso ou método de acordo com qualquer uma das es- pecificações 54 a 59, em que o transtorno está associado à sobrecarga de ferro.
[0425] 61. Uso ou método de acordo com a especificação 60, em que o transtorno associado à sobrecarga de ferro é mal de Parkinson,
mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich.
[0426] 62. Processo para produzir um ácido nucleico ou ácido nu- cleico conjugado de acordo com qualquer uma das especificações 1 a
49.
[0427] A invenção será agora descrita com referência às figuras e exemplos não limitativos a seguir, nos quais:
[0428] a Figura 1 mostra os resultados de uma classificação da mo- lécula de RNAi para inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B humanas;
[0429] a Figura 2 mostra a resposta à dose de moléculas de RNAi de TMPRSS6 em células Hep3B humanas;
[0430] a Figura 3 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 no tecido hepático de camundongo por diferentes doses de moléculas de GalNAc siRNA;
[0431] a Figura 4 mostra a duração de inibição do gene-alvo de TMPRSS6 pelas moléculas de siRNA e a indução da expressão de mAMP de HAMP em camundongos;
[0432] a Figura 5 mostra que a inibição da expressão de TMPRSS6 por meio de tratamento com moléculas de siRNA de TMPRSS6 reduz os níveis de ferro no soro por um período prolongado;
[0433] a Figura 6 mostra a redução da expressão de TMRPSS6 em hepatócitos primários de camundongo através de absorção mediada por receptor de moléculas de RNAi conjugadas com GalNAc;
[0434] a Figura 7 mostra as moléculas de RNAi conjugadas com GalNAc usadas nos Exemplos 1, 3, 4, 26 a 31 e 34 a 38;
[0435] as Figuras 8a, 8b e 8c mostram a estrutura dos ligantes de GalNAc denominados, respectivamente, no presente documento como GN, GN2 e GN3, aos quais os oligonucleotídeos foram conjugados (vide também abaixo esta nomenclatura nos Exemplos onde TMPRSS6 hcm- 9 é conjugado a cada um de GN,, GN2 e GN3);
[0436] a Figura 9 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes variantes de modificação de siRNA em células Hep3B huma- nas;
[0437] a Figura 10 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes conjugados de GalNAc-siRNA através de absorção me- diada por receptor;
[0438] a Figura 11 mostra a redução de TMPRSS6 e a indução da expressão de HAMP por diferentes conjugados de GalNAc-siRNA em camundongos;
[0439] a Figura 12 mostra as sequências e modificações das molé- culas de GalNAc-siRNA dos Exemplos 8, 9 e 10;
[0440] a Figura 13 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 no tecido hepático e a redução dos níveis séricos de ferro em camundon- gos em diferentes pontos de tempo após uma única injeção com conju- gados de siRNA;
[0441] a Figura 14 mostra a redução dos níveis de mRNA de TMPRSS6 no fígado e a redução dos níveis séricos de ferro em camun- dongos por diferentes doses de moléculas de siRNA conjugadas com GalNAc;
[0442] a Figura 15 mostra o efeito de diferentes padrões de modifi- cação na atividade de uma molécula de siRNA em células Hep3B hu- manas;
[0443] a Figura 16 mostra o efeito de diferentes variantes de modi- ficação de moléculas de siRNA conjugadas com GalNAc na inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B humanas;
[0444] a Figura 17 mostra o efeito de uma variante de modificação de siRNAs conjugados com GalNAc na inibição da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo através de absor- ção mediada por receptor;
[0445] a Figura 18 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes variantes de modificação de siRNA em células Hep3B hu- manas;
[0446] a Figura 19 mostra a influência de nucleotídeos A e G inver- tidos sobre a atividade de RNAi em células Hep3B humanas;
[0447] a Figura 20 mostra a influência de nucleotídeos de RNA in- vertido sobre a estabilidade do siRNA;
[0448] a Figura 21 mostra a influência de nucleotídeos de RNA in- vertido sobre a atividade de siRNA em células Hep3B humanas;
[0449] a Figura 22 mostra a influência de nucleotídeos de RNA in- vertido sobre a atividade de RNAi em células Hep3B humanas;
[0450] a Figura 23 mostra a influência de nucleotídeos de RNA in- vertido sobre a atividade de siRNAs conjugados com GalNAc em hepa- tócitos primários de camundongos através de absorção mediada por re- ceptor;
[0451] a Figura 24 mostra o efeito da ligação de fosforoditioato so- bre a estabilidade das moléculas de siRNA conjugadas com GalNAc;
[0452] a Figura 25 mostra o efeito da ligação de fosforoditioato so- bre a atividade de uma molécula de siRNA conjugada com GalNAc na expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo;
[0453] a Figura 26 mostra o efeito da ligação de fosforoditioato so- bre a estabilidade de uma molécula de siRNA conjugada com GalNAc;
[0454] a Figura 27 mostra a inibição da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo por um conjugado de GalNAc siRNA que contém ligações de fosforoditioato;
[0455] a Figura 28 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para he- mocromatose hereditária;
[0456] a Figura 29 mostra o aumento dos níveis séricos de Hepci- dina em diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;
[0457] a Figura 30 mostra a redução dos níveis séricos de ferro por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemo- cromatose hereditária;
[0458] a Figura 31 mostra a redução da saturação de transferrina por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para he- mocromatose hereditária;
[0459] a Figura 32 mostra o aumento da capacidade de ligação de ferro não saturada por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um mo- delo animal para hemocromatose hereditária;
[0460] a Figura 33 mostra a redução dos níveis de ferro tecidual pe- los GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose heredi- tária;
[0461] a Figura 34 mostra a redução dos níveis de mRNA de TMPRSS6 humano nas células Hep3B pela liberação lipossômica de 43 siRNAs adicionais;
[0462] a Figura 35 mostra as curvas de dose/resposta de diferentes siRNAs para inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B;
[0463] a Figura 36 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos humanos primários através de absorção mediada por receptor de conjugados de GalNAc siRNA em diferentes concentrações;
[0464] a Figura 37 mostra o aumento dos valores de hematócrito no modelo de roedor para -talassemia intermediária através de tratamento com conjugados de GalNAc siRNA;
[0465] a Figura 38 mostra a redução nas larguras de distribuição de glóbulos vermelhos no modelo de roedores para -talassemia interme- diária através de tratamento com conjugados de GalNAc siRNA;
[0466] a Figura 39 mostra a redução na proporção de reticulócitos no modelo de sangue de roedor para -talassemia intermediária através de tratamento com conjugados de GalNAc siRNA;
[0467] a Figura 40 mostra a redução de espécies reativas de oxigê- nio nos glóbulos vermelhos do modelo de roedores para -talassemia intermediária através de tratamento com conjugados de GalNAc siRNA;
[0468] a Figura 41 mostra que siRNA de GalNAc TMPRSS6 au- menta os níveis de hemoglobina no modelo de roedor para -talassemia intermediária;
[0469] a Figura 42 mostra que o GalNAc TMPRSS6 reduz a esple- nomegalia no modelo de roedores para -talassemia intermediária;
[0470] a Figura 43 mostra que GalNAc TMPRSS6 melhora a matu- ração de glóbulos vermelhos na medula óssea;
[0471] a Figura 44 mostra que GalNAc TMPRSS6 reduz a eritropo- ese ineficaz no baço;
[0472] as Figuras 45 a e b mostram curvas de dose-resposta de conjugados de siRNA contra TMPRSS6 em hepatócitos humanos pri- mários;
[0473] a Figura 46 mostra a inibição da expressão de mRNA de TMPRSS6 por conjugados de siRNA em hepatócitos humanos primá- rios;
[0474] a Figura 47 mostra sequências e o padrão de modificação de conjugados de GalNAc siRNA que foram testados quanto à inibição da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos humanos primários;
[0475] a Figura 48 mostra sequências específicas de ácidos nuclei- cos usados no Exemplo 44;
[0476] a Figura 49 mostra a absorção mediada por receptor em he- patócitos primários de camundongo por conjugados de GalNAc siRNA direcionados a TMPRSS6 que contêm diferentes químicas de estabili- zação de extremidade (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster);
[0477] a Figura 50 mostra a estabilidade sérica de conjugados de GalNAc-siRNA com fosforotioatos, fosforoditioatos e fosfodiésteres em posições terminais e na porção GalNAc;
[0478] a Figura 51 mostra a inibição da expressão do gene de TMPRSS6 em hepatócitos primários de murino 24h após o tratamento com TMPRSS6-siRNA que traz vinil-(E)-fosfonato 2’OMe-Uracila na po- sição 5' da fita antissenso e duas ligações de fosforotioato entre os pri- meiros três nucleotídeos (X0204), vinil-(E)-fosfonato 2’OMe-Uracila na posição 5' da fita antissenso e ligações de fosfodiéster entre os três pri- meiros nucleotídeos (X0205) (X0139) ou tetramérico (X0140)) ou uma árvore como o agrupamento de GalNAc trimérico (X0004) ou um Gal- NAc-siRNA não direcionado (X0028) nas concentrações indicadas ou deixado sem tratamento (UT);
[0479] a Figura 52 mostra a estabilidade sérica de conjugados de siRNA versus controle positivo menos estabilizado para degradação de nuclease;
[0480] a Figura 53 mostra a redução da saturação de transferrina por meio de tratamento com siRNA de TMPRSS6 em um modelo animal para hemocromatose hereditária de tipo 1;
[0481] a Figura 54 mostra que o tratamento com siRNAs de TMPRSS6 aumenta a redução dos níveis de ferro nos tecidos pelo que- lante de ferro. Exemplos Exemplo 1
[0482] Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção foram sinte- tizados usando os oligos conforme apresentado nas tabelas abaixo.
[0483] O método de síntese foi como segue, usando uma das se- quências da invenção como exemplo: STS012 (GN-TMPRSS6-hcm-9) Primeira fita 5´mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3´ Segunda fita
5´ [ST23 (ps)]3 trebler longo (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) mU (ps) fU 3´ fN (N = A, C, G, U) denota 2'Fluoro, 2' Desoxi Nucleosídeos mN (N = A, C, G, U) denota 2'O Metil Nucleosídeos (ps) indica uma ligação de fosforotioato
[0484] ST23 é um GalNAc C4 fosforamidita (componentes estrutu- rais conforme abaixo): formatar fórmula abaixo conforme original da pag 104 Trebler longo (STKS)
[0485] Um outro exemplo é GN2-TMPRSS6-hcm-9 (STS12009L4): Primeira fita 5´mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3´ Segunda fita 5´ [ST23 (ps)] 3 ST41 (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3´ fN (N = A, C, G, U) denota 2'Fluoro, 2' DesoxiNucleosídeos mN (N = A, C, G, U) denota 2'O Metil Nucleosídeos (ps) indica uma ligação de fosforotioato
[0486] ST23 é conforme acima.
[0487] ST41 é como segue (e conforme descrito no documen- toWO2017/174657):
[0488] Todos os oligonucleotídeos foram obtidos a partir de um fa- bricante comercial de oligonucleotídeos (Eurogentech, Bélgica; Bios- pring, Alemanha) ou sintetizados em um sintetizador AKTA Oligopilot usando química padrão de fosforamidita. Foram usados um suporte só- lido comercialmente disponível e 2’O-Metil RNA fosforamiditas, 2’Fluoro DNA fosforamiditas (todas proteção padrão) e fosforamidita trebler longo comercialmente disponível (Glen Research). A síntese foi reali- zada usando soluções a 0,1 M de fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). Todos os outros reagentes eram reagentes padrão comercialmente dis- poníveis.
[0489] A síntese de PSA que contém oligosnucleotídeos foi reali- zada de acordo com as instruções do fabricante (Glen Research, AM Biotech). 2’OMe-Uracil fosfoamidita de vinil-(E)-fosfonato foi sintetizada e usada na síntese de oligonucleotídeos de acordo com os métodos pu- blicados na literatura (Haraszti et al., Nuc. Acids Res., 45(13), 2017, 7581-7592).
[0490] A conjugação do GalNAc synthon (ST23) foi alcançada ao acoplar a respectiva fosforamidita à extremidade 5' da oligocadeia sob condições padrão de acoplamento de fosforamidita. Os fosforotioatos foram introduzidos usando reagentes de tiolação comercialmente dispo- níveis padrão (EDITH, Link Technologies).
[0491] As fitas simples foram clivadas do CPG usando Metilamina. Onde RNAs de nucleosídeo protegidos por TBDMS foram usados, o tra- tamento adicional com TEA*3HF foi realizado para remover a proteção de silila. O oligonucleotídeo bruto resultante foi purificado por meio de cromatografia de troca iônica (Resource Q, 6 mL, GE Healthcare) em um Sistema de HPLC AKTA Pure usando um gradiente de cloreto de sódio. As frações que contêm o produto foram reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão por tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e lio- filizadas.
[0492] Para hibridização, quantidades equimolares das respectivas fitas simples foram dissolvidas em água e aquecidas a 80°C durante 5 minutos. Após o resfriamento, o dúplex resultante foi liofilizado.
[0493] As sequências dos ácidos nucleicos resultantes (siRNAs) são apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 SEQ ID NO: Nome - TMPRSS6-… Sequência Modificações 1 hc-1A 5´augucuuucacacuggcuu 3´ 6181715172727184715 2 hc-1B 5´aagccagugugaaagacau 3´ 2647364545462646361 3 h-2A 5´auugaguacacgcagacug 3´ 6154645272747282718 4 h-2B 5´cagucugcguguacucaau 3´ 3645354745452717261 5 h-3A 5´aaguugauggugaucccgg 3´ 6281546184546173748 6 h-3B 5´ccgggaucaccaucaacuu 3´ 3748461727361726351 7 hc-4A 5´uucuggaucguccacuggc 3´ 5171846174537271847 8 hc-4B 5´gccaguggacgauccagaa 3´ 4736454827461736462 9 h-5A 5´auucacagaacagaggaac 3´ 6153636462728284627 10 h-5B 5´guuccucuguucugugaau 3´ 4517353545171818261 11 h-6A 5´guagucauggcuguccucu 3´ 8164536184718173535 12 h-6B 5´agaggacagccaugacuac 3´ 2828463647361827163 13 h-7A 5´aguuguaguaaguucccag 3´ 6451816452645173728 14 h-7B 5´cugggaacuuacuacaacu 3´ 3548462715271636271 15 hcmr-8A 5´uuguacccuaggaaauacc 3´ 5181637352846261637 16 hcmr-8B 5´gguauuuccuaggguacaa 3´ 4816151735284816362 17 hcm-9A 5´aaccagaagaagcagguga 3´ 6273646282647284546 18 hcm-9B 5´ucaccugcuucuucugguu 3´ 1727354715351718451 19 hc-10A 5´uaacaacccagcguggaau 3´ 5263627372838184625 20 hc-10B 5´auuccacgcuggguuguua 3´ 2517363835484518152 21 hc-11A 5´guuucucucauccaggccg 3´ 8151717172537284738 22 hc-11B 5´cggccuggaugagagaaac 3´ 3847354825464646263 23 hcm-12A 5´gcaucuucugggcuuuggc 3´ 8361715354847151847 24 hcm-12B 5´gccaaagcccagaagaugc 3´ 4736264737282646183 25 hc-13A 5´ucacacuggaaggugaaug 3´ 5363635482648182618 26 hc-13B 5´cauucaccuuccaguguga 3´ 3615363715372818182 27 hcmr-14A 5´cacagaugugucgaccccg 3´ 7272825454538273738 28 hcmr-14B 5´cggggucgacacaucugug 3´ 3848453827272535454 29 hcmr-15A 5´uguacccuaggaaauacca 3´ 5452737164826252736 30 hcmr-15B 5´ugguauuuccuaggguaca 3´ 1845251537164845272 31 Luc-siRNA-1A 5´ucgaaguauuccgcguacg 3´ 5382645251738381638 32 Luc-siRNA-1B 5´cguacgcggaauacuucga 3´ 3816383856252715382 33 PTEN-A 5´uaaguucuagcuguggugg 3´ 5a6g5u7u6g7u8u8g5g8 34 PTEN-B 5´ccaccacagcuagaacuua 3´ c7a7c6c6g7u6g6a7u5a
[0494] Tabela 1: Sequências de ácidos nucleicos testadas quanto à inibição da expressão de TMPRSS6. Os ácidos nucleicos foram sinteti- zados pela Biospring, Frankfurt. As modificações de nucleotídeos são representadas pelos seguintes números (coluna 4), 1=2'F-dU, 2=F`-dA, 3=2'F-dC, 4=2'F-dG, 5=2’-OMe-dU; 6=2’-OMe-rA; 7=2’-OMe-dC; 8=2’- OMe-dG. Tabela 2 Inicial Oligo Ácido nucleico correspondente SEQ ID NO: 253 GGUAUUUCCUAGGGUACAA TMPRSS6-hcmr-8 16 305 CAGUCUGCGUGUACUCAAU TMPRSS6-h-2 4 381 GCCAAAGCCCAGAAGAUGC TMPRSS6-hcm-12 24 426 CUGGGAACUUACUACAACU TMPRSS6-h-7 14 478 UCACCUGCUUCUUCUGGUU TMPRSS6-hcm-9 18 652 AAGCCAGUGUGAAAGACAU TMPRSS6-hc-1 2 682 AUUCCACGCUGGGUUGUUA TMPRSS6-hc-10 20 1234 GCCAGUGGACGAUCCAGAA TMPRSS6-hc-4 8 1318 CCGGGAUCACCAUCAACUU TMPRSS6-h-3 6 1418 GUUCCUCUGUUCUGUGAAU TMPRSS6-h-5 10 1481 CGGCCUGGAUGAGAGAAAC TMPRSS6-hc-11 22 1633 CAUUCACCUUCCAGUGUGA TMPRSS6-hc-13 26 1824 CGGGGUCGACACAUCUGUG TMPRSS6-hcmr-14 28 2018 AGAGGACAGCCAUGACUAC TMPRSS6-h-6 12 252 UGGUAUUUCCUAGGGUACA TMPRRS6-hcmr-15 30
[0495] Tabela 2 - A posição inicial de cada sequência de ácidos nu- cleicos dentro da sequência de mRNA do TMPRSS6, Ref. NM_001289000.1. Classificação de Inibição da Expressão de TMPRSS6 em Células Hep3B Humanas
[0496] As células foram semeadas em uma densidade celular de
80.000 células por placa com 6 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com ácido nucleico a 20 nM (listado na Tabela 1) e 1 µg/ml de AtuFECT (formulação a 50:50 de lipídio catiônico Atufect01 e lipídio fusogênico DPhyPE.). Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram determinados por meio de q-RT-PCR usando os amplicons na Tabela 3. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de expressão do gene de manutenção PTEN. Os ácidos nucleicos para Luciferase e
PTEN foram usados como ácidos nucleicos de controle não direciona- dos. Os resultados são mostrados na Figura 1. Tabela 3 SEQ ID NO: hTMPRSS6 (superior) 5´CCGCCAAAGCCCAGAAG 3´ 35 hTMPRSS6 (inferior) 5´GGTCCCTCCCCAAAGGAATAG 3´ 36 hTMPRSS6 (sonda) 5´CAGCACCCGCCTGGGAACTTACTACAAC 3´ 37 mTMPRSS6 (superior) 5´CGGCACCTACCTTCCACTCTT 3´ 38 mTMPRSS6 (inferior) 5´TCGGTGGTGGGCATCCT 3´ 39 mTMPRSS6 (sonda) 5´CCGAGATGTTTCCAGCTCCCCTGTTCTA 3´ 40 h-Aktin (superior) 5´GCATGGGTCAGAAGGATTCCTAT 3´ 41 h-Aktin (inferior) 5´TGTAGAAGGTGTGGTGCCAGATT 3´ 42 h-Aktin (sonda) 5´TCGAGCACGGCATCGTCACCAA 3´ 43 mAktin (superior) 5´GTTTGAGACCTTCAACACCCCA 3´ 44 mAktin (inferior) 5´GACCAGAGGCATACAGGGACA 3´ 45 mAktin (sonda) 5´CCATGTACGTAGCCATCCAGGCTGTG 3´ 46 PTEN (superior) 5´CACCGCCAAATTTAACTGCAGA 3´ 47 PTEN (inferior) 5´AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT 3´ 48 PTEN (sonda) 5´TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA 3´ 49 mHAMP: (superior) 5´CCTGTCTCCTGCTTCTCCTCCT 3´ 50 mHAMP: (inferior) 5´AATGTCTGCCCTGCTTTCTTCC 3´ 51 mHAMP: (sonda) 5´TGAGCAGCACCACCTATCTCCATCAACA3´ 52
[0497] Tabela 3: Sequências dos conjuntos de amplicons TMPRSS6, Actina, PTEN e HAMP que foram usados para medir os ní- veis de mRNA dos respectivos genes. Exemplo 2 Resposta à Dose de Ácidos Nucleicos de TMPRSS6 para Inibição da Expressão de TMPRSS6 em Células Hep3B Humanas
[0498] As células foram semeadas em uma densidade celular de
150.000 células por placa com 6 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com 1 µg/ml de AtuFECT (formulação a 50:50 de lipídio catiônico Atufect01 e lipídio fusogênico DPhyPE) e diferentes quantidades de ácidos nucleicos de TMPRSS6 (30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1; 0,003 nM, respectivamente) conforme representado pelo eixo X do grá- fico na Figura 2. Para amostras de controle não direcionadas, as células foram transfectadas com ácido nucleico a 30 e 10 nM para luciferase. Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA foram determinados por meio de q-RT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de expressão do gene de manutenção PTEN. A maior redução da expressão do mRNA de TMPRSS6 foi observada para o ácido nucleico de TMPRSS6-hcm9. A transfecção com ácido nucleico de luciferase não afetou os níveis de mRNA de TMPRSS6. Os resultados são mostrados na Figura 2. As se- quências de moléculas de RNAi estão representadas na Tabela 1. Exemplo 3 Inibição da Expressão de TMPRSS6 no Tecido Hepático por Diferentes Doses de Ácidos Nucleicos de GalNAc
[0499] Camundongos C57/BL6 foram tratados com uma dose única de 10, 3 ou 1 mg/kg de conjugados de ácido nucleico de GalNAc por meio de administração subcutânea. A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA são mostradas na Figura 7. Os siR- NAs são conjugados ao ligante de GalNAc (GN) representado na Figura 8a e descrito no presente documento. Os grupos controle foram tratados com solução salina isotônica ou com conjugado de controle não direci- onado, GN-TTR-hc, respectivamente. A expressão do gene alvo no te- cido hepático foi avaliada por meio de qRT-PCR três dias após a injeção subcutânea dos conjugados. O RNA total foi isolado a partir de amostras de tecido congelado rapidamente e o qRT-PCR foi realizada conforme anteriormente descrito (Kuhla et al. 2015, Apoptosis Vol 4, 500-11). As sondas TaqMan que foram usadas são mostradas na Tabela 3. Os re- sultados são mostrados na Figura 3. Exemplo 4 Duração de Inibição do Gene-Alvo Pelas Moléculas de RNAi de TMPRSS6
[0500] Os camundongos foram tratados com moléculas de RNAi de GalNAc-TMPRSS6 a 3 mg/kg por injeção subcutânea. A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA são mostradas na
Figura 7. A expressão do mRNA-alvo foi avaliada no tecido hepático nos dias 7, 14, 21, 27, 34 ou 41 após o tratamento (dias após a injeção, dpi). Uma redução da expressão de TMPRSS6 no fígado é observada até o dia 41 após a injeção. A expressão do mRNA de HAMP (hepcidina) é positivamente regulada no fígado de camundongos tratados com a mo- lécula de RNAi de GN-TMPRSS6. Os resultados são mostrados na Fi- gura 4. Exemplo 5 Inibição da Expressão de TMPRSS6 por Meio de Tratamento com siRNA de TMPRSS6 Reduz os Níveis de Ferro no Sangue
[0501] Os níveis de ferro foram analisados no soro 7, 14, 21, 27, 34 e 41 dias após o tratamento dos camundongos por via subcutânea com 3 mg/kg de conjugado de ácido nucleico de GalNAc. Os níveis séricos de ferro foram reduzidos até 41 dias após a injeção (dpi 41). A sequên- cia e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA são mos- tradas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 5. Exemplo 6 Inibição da Expressão de TMPRSS6 através de Absorção Mediada por Receptor
[0502] Os hepatócitos primários de camundongo foram semeados em placas revestidas com colágeno e incubados com conjugados de siRNA diluídos em meio de cultura celular em uma concentração de 100 nM a 0,03 nM, conforme indicado. 24 horas após a exposição das célu- las aos conjugados de siRNA, o RNA total foi extraído e a expressão de TMPRSS6 foi quantificada por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA de actina. Inibição dependente da dose da expressão de TMPRSS6 foi observada para ambos os conjugados de siRNA GalNAc-TMPRSS6. O conjugado GN2-Luc-siRNA1 GalNAc (GN2-Luc) foi usado como controle não dire- cionado e não afetou a expressão do mRNA de TMPRSS6. A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA estão repre- sentadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 6. Exemplo 7
[0503] Outros siRNAs de TMPRSS6 foram sintetizados, de acordo com o método descrito acima. As sequências e modificações são mos- tradas na Tabela 4 abaixo:
[0504] Variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6 (Sequência ID 17 e ID 18). Para cada dúplex, a primeira se- quência (fita A) é listada na parte superior e a segunda sequência (fita B) abaixo. Todas as sequências correspondem a SEQ ID NO: 17 (supe- rior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Os códigos de modificação estão lista- dos no final da Tabela 4. Tabela 4 ID do Dúplex Fita A sequência sequência e química Fita B (5'-3') (5'-3') TMP01 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451 TMP02 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142 TMPJH02B ucaccugcuucuucugguu 1723314715355754815 TMP03 TMPJH03A aaccagaagaagcagguga 2273282646283248182 TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP04 TMPJH04A aaccagaagaagcagguga 2273282646683248182 TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP05 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815 TMP06 TMPJH05A aaccagaagaagcagguga 2273242242643244542 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP07 TMPJH06A aaccagaagaagcagguga 2277646242643244542 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP08 TMPJH07A aaccagaagaagcagguga 2277686242643244542 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP09 TMPJH08A aaccagaagaagcagguga 2273242246687244542 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP10 TMPJH09A aaccagaagaagcagguga 2273242682687244542 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455 TMP11 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586 TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455
TMP12 TMPJH11A aaccagaagaagcagguga 2273242242643288586
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455
TMP13 TMPJH12A aaccagaagaagcagguga 2273242246687284586
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455
TMP14 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH13B ucaccugcuucuucugguu 5767354315755758855
TMP15 TMPJH14A aaccagaagaagcagguga 2273282282283284182
TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415
TMP16 TMPJH15A aaccagaagaagcagguga 2273282282643284182
TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415
TMP17 TMPJH16A aaccagaagaagcagguga 2237242242247244582
TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411
TMP18 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP19 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH02B ucaccugcuucuucugguu 1723314715355754815
TMP20 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815
TMP21 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH13B ucaccugcuucuucugguu 5767354315755758855
TMP22 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415
TMP23 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411
TMP24 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP25 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815
TMP26 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455
TMP27 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH13B ucaccugcuucuucugguu 5767354315755758855
TMP28 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415
TMP29 TMPJH02A aaccagaagaagcagguga 2237242282243284142
TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411
TMP30 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP31 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH02B ucaccugcuucuucugguu 1723314715355754815
TMP32 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH03B ucaccugcuucuucugguu 5363718351715354815
TMP33 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455
TMP34 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH14B ucaccugcuucuucugguu 5327318315315318415
TMP35 TMPJH13A aaccagaagaagcagguga 6277646246687284586
TMPJH16B ucaccugcuucuucugguu 1723314355311358411
TMP36 TMPJH10A aaccagaagaagcagguga 2273242242643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP37 TMPJH17A aaccagaagaagcagguga 2273282242643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP38 TMPJH18A aaccagaagaagcagguga 6277682242643288142
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP39 TMPJH19A aaccagaagaagcagguga 6277682242643288586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP40 TMPJH20A aaccagaagaagcagguga 2233282242643284142
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP41 TMPJH21A aaccagaagaagcagguga 2277282242643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP42 TMPJH22A aaccagaagaagcagguga 2273282642643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP43 TMPJH23A aaccagaagaagcagguga 2273282282643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP44 TMPJH24A aaccagaagaagcagguga 2273282246643284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP45 TMPJH25A aaccagaagaagcagguga 2273282242683284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP46 TMPJH26A aaccagaagaagcagguga 2273282242647284586
TMPJH01B ucaccugcuucuucugguu 1727354715351718451
TMP47 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH05B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355754455
TMP48 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH27B ucaccugcuucuucugguu 5727754715355754855
TMP49 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH28B ucaccugcuucuucugguu 1723314311351714411
TMP50 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH29B ucaccugcuucuucugguu 5767354315355754455
TMP51 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH30B ucaccugcuucuucugguu 5727754315355754455
TMP52 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH31B ucaccugcuucuucugguu 5727358315355754455
TMP53 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546
TMPJH32B ucaccugcuucuucugguu 5727354315755754455
TMP54 TMPJH01A aaccagaagaagcagguga 6273646282647284546 TMPJH33B ucaccugcuucuucugguu 5727354315355758455 1 = 2’F-dU 2 = 2’F-dA 3 = 2’F-dC 4 = 2’F-dG 5 = 2’OMe-rU 6 = 2’OMe-rA 7 = 2’OMe-rC 8 = 2’OMe-rG Tabela 4: As modificações são representadas pelos números mostrados nas fileiras na parte inferior da tabela e, para cada dúplex, a primeira fita está na parte superior e a segunda fita está abaixo.
[0505] Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcio- nado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. siRNAs direcionado ao PTEN e Luciferase foram usados como controles não relacionados e não direcionados, respectivamente. Todos os siRNAs fo- ram transfectados com 1 µg/ml de Atufect a 1 nM (0,1 nM quando indi- cado). O RNA total foi extraído 48 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os ní- veis de mRNA do TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA da actina. Cada barra representa a média +/- SD de três réplicas técnicas. Os resultados são mostrados na Figura 9. Exemplo 8
[0506] As variantes de modificação de um siRNA conjugado com GalNAc direcionado ao TMPRSS6 foram sintetizadas e são mostradas na Figura 12. Para cada dúplex, a primeira sequência da fita é listada na parte superior e a segunda sequência da fita abaixo. As modificações são representadas como números e são como segue: GN indica conju- gação a um ligante de GalNAc de acordo com a Figura 8a. A sequência e a modificação de STS12 (GN-TMPRSS6-hcm9) também estão repre- sentadas na Figura 7.
Exemplo 9
[0507] Diferentes variantes de modificação de uma sequência con- jugada a GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS012) reduzem a ex- pressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo. Para absorção mediada por receptor, as células foram incubadas com 100, 10, 1 e 0,1 nM de conjugado de siRNA durante 24 horas. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA do TMPRSS6 foram normaliza- dos para os níveis de mRNA da actina. A média +/- SD de cada três réplicas técnicas é mostrada na Figura 10. Exemplo 10
[0508] Diferentes variantes de modificação de uma sequência con- jugada a GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS012, GN-TMPRSS6- hcm9) foram testadas in vivo. 1 mg/kg e 3 mg/kg de conjugado de Gal- NAc-siRNA foram injetados subcutaneamente em camundongos ma- chos C57BL/6JOlaHsd. 14 dias após o tratamento, os níveis de mRNA de TMPRSS6 (A) e HAMP (B) no fígado foram analisados por Taqman qRT-PCR. As barras representam média de pelo menos 4 animais +/- SD. Os resultados são mostrados na Figura 11. Exemplo 11
[0509] Duas variantes de modificação diferentes de uma sequência conjugada a GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS012) foram testa- das in vivo. Os conjugados de GalNAc-siRNA foram injetados subcuta- neamente a 1 mg/kg em camundongos machos C57BL/6JOlaHsd. 14 e 28 dias após o tratamento, os níveis de mRNA de TMPRSS6 no fígado foram analisados por Taqman qRT-PCR (A). Além disso, os níveis séri- cos de ferro foram analisados (B). Os resultados são mostrados na Fi- gura 13. Os gráficos em caixa representam a média de 4 animais. A análise estatística é com base no teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparação múltipla de Dunnett contra o grupo com PBS.
As sequências são conforme no Exemplo 10. Exemplo 12
[0510] Duas variantes de modificação diferentes de uma sequência conjugada a GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS12009L4, GN2- TMPRSS6-hcm9) foram testadas in vivo. Os conjugados de GalNAc- siRNA foram injetados subcutaneamente a 1 mg/kg e 0,3 mg/kg em ca- mundongos machos C57BL/6JOlaHsd. 14 dias após o tratamento, os níveis de mRNA do TMPRSS6 no fígado foram analisados por Taqman qRT-PCR (A). Além disso, os níveis séricos de ferro foram analisados (B). Os resultados são mostrados na Figura 14. Os gráficos em caixa representam a média de 4 animais. A análise estatística é com base no teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparação múltipla de Dunnett contra o grupo com PBS.
[0511] Os duplexes usados são mostrados abaixo na Tabela 5. To- das as sequências correspondem a SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 Tabela 5 ID do dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') STS12009L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU STS12009V2L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-mUmCmAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUmGmG(ps)mU(ps)mU STS12009V8L4 mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGmGmU(ps)mG(ps)mA GN2-mUmCmAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUmGmG(ps)mU(ps)mU GN2-Luc mU(ps)fU(ps)mAfGmUfAmAfAmCfCmUfUmUfUmGfAmG(ps)fA(ps)mC GN2-fGmUfCmUfCmAfAmAfAmGfGmUfUmUfAmCfU(ps)mA(ps)fA mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato GN2 = estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B
[0512] Tabela 5: Variantes de modificação de sequências conjuga- das com GalNAc direcionadas ao TMPRSS6 Exemplo 13
[0513] Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcio- nado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. Um siRNA direcionado à Luciferase foi usado como controle não direcio- nado. Todos os siRNAs foram transfectados com 1 µg/ml de Atufect a 1 nM e 0,1 nM. O RNA total foi extraído 48 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT- PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de mRNA de PTEN. Os resultados são mostrados na Figura 15. Cada barra representa a média +/- SD de três réplicas técnicas.
[0514] As sequências são mostradas na Tabela 6 abaixo. Todas as sequências correspondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 6 ID do dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') TMP01 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP66 mAfAmCfCmAmGfAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP69 fAfAfCfCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGfUfGfA fUmCfAfCfCfUfGfCfUfUfCmUfUmCfUfGfGfUfU TMP79 fAfAmCfCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGmUmGmA mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU TMP80 fAfAmCmCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGmUmGmA mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU TMP81 fAfAmCfCfAmGfAfAfGfAmAfGmCfAmGfGmUmGmA mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) – fosforotioato
[0515] Tabela 6: Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6 Exemplo 14
[0516] Variantes de modificação de um siRNA conjugado a GalNAc direcionado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas.
150.000 células foram semeadas por 6 cavidades. Após 24 h, os conju- gados de siRNA foram transfectados com 1 µg/ml de Atufect a 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 nM (A) ou 5, 0,5, 0,05, 0,005 nM (B). Um GalNAc- siRNA contra Luciferase foi usado como controle não direcionado. O RNA total foi extraído 72 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de mRNA de PTEN (A) ou níveis de mRNA de Actina (B). Os resultados são mostra- dos na Figura 16. Cada barra representa a média +/- SD de três réplicas técnicas.
[0517] As sequências são mostradas na Tabela 7, abaixo Tabela 7 ID do dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA STS12009L4 GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGmGmU(ps)mG(ps)mA STS12009V27L4 GN2-mUmCmAmCmCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUmGmG(ps)mU(ps)mU mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGmGmU(ps)mG(ps)mA STS12009V41L4 GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) – fosforotioato GN2= estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B
[0518] Tabela 6: Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6. Exemplo 14
[0519] Variantes de modificação de um siRNA conjugado a GalNAc direcionado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas.
150.000 células foram semeadas por 6 cavidades. Após 24 h, os conju- gados de siRNA foram transfectados com 1 µg/ml de Atufect a 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 nM (A) ou 5, 0,5, 0,05, 0,005 nM (B). Um GalNAc-
siRNA contra Luciferase foi usado como controle não direcionado. O RNA total foi extraído 72 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA de PTEN (A) ou níveis de mRNA de Actina (B). Os resultados são mostra- dos na Figura 16. Cada barra representa a média +/- SD de três réplicas técnicas.
[0520] As sequências são mostradas na Tabela 7, abaixo. Tabela 7 ID do dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') TMP01 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP95 mAfAmCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP99 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP112 mA[A]mCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP114 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmU{G}mCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP115 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmC{U}mUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP116 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmU[G]mCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP117 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmC[U]mUmCmUmUmCmUmGmGmUmU mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F RNA [A], [T], [C], [G] - DNA {A}, {U}, {C}, {G} - LNA (ps) - fosforotioato
[0521] Tabela 7: Diferentes variantes contendo DNA e LNA de um siRNA direcionado para TMPRSS6 Exemplo 15
[0522] Uma variante de modificação de uma sequência conjugada a GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS12009L4) foi testada em he- patócitos primários de camundongo. Para absorção mediada por recep- tor, as células foram incubadas com conjugado de siRNA a 100, 25, 5, 1, 0,25 e 0,05 nM durante 24 h. Um GalNAc-siRNA direcionado a uma sequência não relacionada (GN-TTR) e um GalNAc-siRNA não direcio- nado (GN-Luc) foram usados como controles. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA de PTEN. Os resultados são mostrados na Figura
17. A média +/- SD de cada três réplicas técnicas são mostrados.
[0523] As sequências são mostradas na Tabela 7 acima. Exemplo 16
[0524] Diferentes variantes que contêm DNA e LNA de um siRNA direcionado a TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. Portanto, 150.000 células foram semeadas por 6 cavidades. Após 24 h, os siRNAs foram transfectados com Atufect a 1 µg/ml a 0,1 nM de siRNA. O RNA total foi extraído 48 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os ní- veis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA de Actina. Os resultados são mostrados na Figura 18. Cada barra representa a média +/- SD de três réplicas técnicas.
[0525] As sequências são mostradas na Tabela 8, abaixo. Todas as sequências correspondem a SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 8 ID do dúplex Sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') TMP01 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP95 mAfAmCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP99 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU
TMP112 mA[A]mCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUmGmA fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU TMP114 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmU{G}mCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP115 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmC{U}mUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP116 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmU[G]mCfUmUmCmUmUmCmUmGmGmUmU TMP117 mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA mUmCmAmCmCmUfGmC[U]mUmCmUmUmCmUmGmGmUmU mA, mU, mC, mG – 2‘-OMe RNA fA, fU, fC, fG – 2‘-F RNA [A], [T], [C], [G] - DNA {A}, {U}, {C}, {G} - LNA (ps) – fosforotioato
[0526] Tabela 8: Diferentes variantes que contêm DNA e LNA de um siRNA que tem como alvo TMPRSS6 Exemplo 17
[0527] A influência dos nucleotídeos de RNA A e G invertidos sobre as posições 3' terminais’ foi analisada usando um siRNA contra TMPRSS6. O TMP70 contém fosforotioatos em todos os terminais, en- quanto que o TMP82 e o TMP83 contêm ivA (TMP82) e ivG (TMP83) na extremidade 3' antissenso e na extremidade 3' senso. Ambos os nucle- otídeos invertidos estão presentes além do nucleotídeo terminal das res- pectivas fitas e estão ligados através de uma ligação de fosforotioato. Um siRNA não relacionado (PTEN) e um siRNA não direcionado (Luci) foram incluídos como controles. Todas as variantes testadas mostram atividade comparável sob as condições testadas.
[0528] O experimento foi conduzido em células Hep3B. As células foram semeadas em uma densidade de 150.000 células por 6 cavida- des, transfectadas com siRNA a 1 nM e 0,1 nM e 1 µg/ml de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT-
PCR. Os resultados são mostrados na Figura 19. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0529] As sequências são mostradas abaixo na Tabela 9. As se- quências correspondem à SEQ ID NO: 17 (superior) ou SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 9 sequência e química ID do dúplex (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') TMP70 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU TMP82 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA(ps)ivA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU(ps)ivA TMP83 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA(ps)ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU(ps)ivG mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA ivA, ivG - RNA invertido (3'-3') (ps) - fosforotioato
[0530] Tabela 9: Um siRNA contra TMPRSS6 incluindo nucleotí- deos de RNA invertido em diferentes posições. Exemplo 18
[0531] Diferentes duplexes de siRNA que contêm nucleotídeos de RNA invertido em ambas as extremidades 3' foram testados quanto à estabilidade sérica. TMP84-TMP87 contém RNA invertido além do úl- timo nucleotídeo na fita de senso e em vez do último nucleotídeo na fita antissenso. TMP88-TMP91 contém RNA invertido além do último nucle- otídeo na fita antissenso e, em vez do último nucleotídeo na fita senso. Todos os nucleotídeos de RNA invertido substituem os fosforotioatos terminalmente usados. Na concepção de TMP84-TMP87, ivA e ivG con- ferem maior estabilidade à sequência testada do que ivU e ivC (parte A). Na concepção de TMP88-TMP91, não há influência da identidade da base na estabilidade do dúplex (parte B).
[0532] Os resultados são mostrados na Figura 20. „UT" indica amostras não tratadas. „FBS" indica dúplices de siRNA que foram incu- bados na concentração final de 5 µM com 50 % de FBS por 3 dias, ex- traídos com fenol/clorofórmio e precipitados com etanol. As amostras foram analisadas em géis de poliacrilamida de TBE a 20 % em eletrofo- rese em gel nativo.
[0533] As sequências são mostradas na Tabela 10 abaixo, e cor- respondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 10 sequência e química ID do dúplex (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') TMP70 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU TMP84 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivA fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP85 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivU fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP86 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivC fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP87 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU ivG TMP88 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivA TMP89 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivU TMP90 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivC TMP91 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA ivG fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivG mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA ivA, ivU, ivC, ivG - RNA invertido (3'-3') (ps) - fosforotioato
[0534] Tabela 10: Diferentes duplexes de siRNA que contêm nucle- otídeos de RNA invertido em ambas extremidades 3'. Exemplo 19
[0535] A influência de nucleotídeos de RNA invertido nas posições
3' terminais’ foi analisada usando um siRNA contra TMPRSS6. O TMP70 contém fosforotioatos em todos os terminais, enquanto o TMP84-TMP87 contém ivG na extremidade 3' da fita do senso. O nucle- otídeo de RNA invertido está presente além do último nucleotídeo e substitui para dois fosforotioatos. Na extremidade 3' antissenso, ivA (TMP84), ivU (TMP85), ivC (TMP86) e ivG (TMP87) foram testados. Es- tes nucleotídeos de RNA invertido foram adicionados em vez do nucle- otídeo terminal e substituem os fosforotioatos. Um siRNA não relacio- nado (PTEN) e um siRNA não direcionado (Luci) foram incluídos como controle. Todas as variantes testadas mostram atividade comparável nas condições testadas.
[0536] O experimento foi conduzido em Hep3B. As células foram semeadas a uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, trans- fectadas com siRNA 1 nM e 0,1 nM e 1 µg/ml de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os re- sultados são mostrados na Figura 21. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0537] As sequências são conforme na Tabela 10, acima. Exemplo 20
[0538] A influência de nucleotídeos de RNA invertido nas posições 3' terminais’ foi analisada usando um siRNA contra TMPRSS6. O TMP70 contém fosforotioatos em todos os terminais, enquanto o TMP88-TMP91 contém ivG na extremidade 3' da fita antissenso. O nu- cleotídeo de RNA invertido está presente além do último nucleotídeo e substitui dois fosforotioatos. Na extremidade 3' de senso, ivA (TMP88), ivU (TMP89), ivC (TMP90) e ivG (TMP91) foram testados. Estes nucle- otídeos de RNA invertido foram adicionados em vez do nucleotídeo ter- minal e substituem os fosforotioatos. Um siRNA não relacionado (PTEN)
e um siRNA não direcionado (Luci) foram incluídos como controles. To- das as variantes testadas mostram atividade comparável nas condições testadas.
[0539] O experimento foi conduzido em Hep3B. As células foram semeadas a uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, trans- fectadas com siRNA 1 nM e 0,1 nM e 1 µg/ml de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os re- sultados são mostrados na Figura 22. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0540] As sequências são mostradas na Tabela 10 acima. Exemplo 21
[0541] A influência de nucleotídeos de RNA invertido nas posições 3' terminais foi analisada usando um conjugado de GalNAc-siRNA dire- cionado ao TMPRSS6 em transfecções lipossômicas. O STS12009-L4 contém fosforotioatos em todos os terminais não conjugados, enquanto as variantes testadas contêm um nucleotídeo de RNA invertido na ex- tremidade 3' da fita do senso e antissenso. O RNA invertido está pre- sente além do último nucleotídeo e substitui dois fosforotioatos terminais (STS12009V10-L4 e -V11-L4) ou é usado além dos fosforotioatos termi- nais (STS12009V29-L4 e STS12009V30-L4). A invertido (STS12009V10-L4 e -V29-L4) e G invertido (STS12009V11-L4 e -V30- L4) foram usados. Todas as variantes testadas mostram atividade com- parável sob as condições testadas.
[0542] O experimento foi conduzido em Hep3B. As células foram semeadas em uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, transfectadas com 5 nM a 0,0016 nM de siRNA e 1 µg/ml de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT- PCR. Os resultados são mostrados na Figura 23. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0543] As sequências são apresentadas na Tabela 11 abaixo e cor- respondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 11 ID do Dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') STS12009L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU STS12009V10L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmAivA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfUivA STS12009V11L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmAivG GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfUivG STS12009V29L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mAivA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fUivA STS12009V30L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mAivG GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fUivG mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA ivA, ivG - RNA invertido (3'-3') (ps) - fosforotioato GN2= estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B Tabela 11: Uma sequência de siRNA incluindo nucleotídeos de RNA invertido nas extremidades 3' Exemplo 22 Ensaio de Estabilidade Sérica dDe Conjugados de GalNAc-siRNA que Contêm um PS2 em Extremidades Individuais
[0544] O GalNAc foi conjugado à extremidade 5' da fita do senso e é estabilizado internamente por quatro PS. Modificações de fosforoditi- oato foram colocadas nas extremidades 5'-antissenso (STS12009V37L4), 3'-antissenso (STS12009V36L4) e 3'-senso (STS12009V34L4). O STS12009L4 contém cada qual um dos dois PS terminais nas extremidades 5'-antissenso, 3'-antissenso e 3'-senso, Gal- NAc é ligado à extremidade 5' senso e estabilizado por quatro PS inter- nos. Os conjugados de GalNAc-siRNA de 5 µM foram incubados com
50 % de FBS por 3 d a 37°C. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida de TBE a 20 %. Os resultados são mostrados na Fi- gura 24. „UT" indica amostras não tratadas, „FBS" indica tratamento com FBS. „Controle" indica um conjugado de GalNAc-siRNA menos es- tabilizado de sequência diferente.
[0545] As sequências são mostradas na Tabela 12 abaixo e corres- pondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 12 ID do dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') STS12009L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU STS12009V34L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU(ps2)fU STS12009V36L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG(ps2)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU STS12009V37L4 mA(ps2)fAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato (ps2) - fosforoditioato GN2 = estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B
[0546] Tabela 12: Conjugados de GalNAc-siRNA que contêm um PS2 (fosforoditioato) nas extremidades individuais Exemplo 23 Atividade de Conjugados de GalNAc-siRNA que Contêm um PS2 em Extremidades Individuais
[0547] O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da fita do senso e é estabilizado internamente por quatro PS. Modificações de fos- foroditioato foram colocadas nas extremidades 5'-antissenso (STS12009V37L4), 3'-antissenso (STS12009V36L4) e 3'-senso
(STS12009V34L4). A experiência foi conduzida em hepatócitos primá- rios de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de
250.000 células por 6 cavidades e tratadas com 100 nM, 10 nM e 1 nM de GalNAc-siRNA. Transfecções com 10 nM de GalNAc-siRNA e 1 µg/ml de Atufect serviram como controle. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e PTEN foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 25. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0548] As sequências são como apresentadas na Tabela 12 acima. Exemplo 24 Ensaio de Estabilidade Sérica de um Conjugado de GalNAc-siRNA (STS12009V40L4) que Contém, Cada Um, Um PS2 na Segunda Extre- midade 5' da Fita e na Segunda Extremidade 3' da Fita
[0549] GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da segunda fita e não é estabilizado por nenhum PS interno. O STS12009L4 contém cada qual dois PS terminais nas extremidades 5'-antissenso, 3'-antis- senso e 3'-senso, GalNAc é ligado à extremidade 5' do senso e estabi- lizado por quatro PS internos. Os conjugados de GalNAc-siRNA 5 µM foram incubados com 50 % de FBS por 3 d a 37°C. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida de TBE a 20 %. Os resultados são mostrados na Figura 26. „UT" indica amostras não tratadas, „FBS" indica tratamento com FBS. „Controle" indica um conjugado de GalNAc- siRNA menos estabilizado de sequência diferente.
[0550] As sequências são apresentadas na Tabela 13 abaixo, e são SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Tabela 13 ID do dúplex sequência e química (superior: primeira fita, inferior: segunda fita, ambas 5'-3') STS12009L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG(ps)mU(ps)fU STS12009V40L4 mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmU(ps)fG(ps)mA
GNo-fU(ps2)mCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU(ps2)fU mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato (ps2) - fosforoditioato GN2 - GalNAc, estrutura de acordo com a Figura 8B GNo - GN2 com fosfodiésteres em vez de (ps) Tabela 13: Conjugado de GalNAc-siRNA contendo cada qual um PS2 na segunda extremidade 5' da fita e na segunda extremidade 3' da fita. Exemplo 25 Atividade de um conjugado de GalNAc-siRNA (STS12009V40L4) que contém, cada um, um PS2 na extremidade 5' da fita de senso e na ex- tremidade 3' da fita de senso
[0551] O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da fita do senso e não é estabilizado por nenhum PS interno. O STS12009L4 con- tém cada qual dois PS terminais nas extremidades 5'-antissenso, 3'-an- tissenso e 3'-senso, GalNAc é ligado à extremidade 5' de senso e esta- bilizado por quatro PS internos. A experiência foi conduzida em hepató- citos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma den- sidade de 250.000 células por 6 cavidades e tratadas com 100 nM, 10 nM e 1 nM de GalNAc-siRNA. Um conjugado de GalNAc de um siRNA contra luciferase ("GalNAc-Luc") serviu como controle. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e PTEN foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os re- sultados são mostrados na Figura 27. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0552] As sequências são conforme apresentado na Tabela 13 acima. Exemplo 26 Inibição da Expressão de TMPRSS6 por Diferentes Doses de GalNAc siRNAs em Modelo Animal para Hemocromatose Hereditária
[0553] Camundongos fêmeas HFE-/- (Herrmann et al., J. Mol. Med (Berl), 2004 82, 39-48) foram tratados por via subcutânea com uma dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA, respectiva- mente. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-Luc) por injeção subcutânea. A expressão do gene alvo no tecido hepático foi avaliada por qRT PCR três semanas após a injeção dos conjugados. Média do grupo e +/- SD. Estatísticas: Teste de Kruskal-Wallis com Dunn não corrigido. A sequên- cia e a modificação dos conjugados de siRNA estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 28. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05. Exemplo 27 Aumento dos Níveis Séricos de Hepcidina em Diferentes Doses de Gal- NAc siRNAs em Modelo Animal para Hemocromatose Hereditária
[0554] Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por injeção subcutânea. Os grupos de controle foram tratados com PBS ou com o conjugado de controle não direcionado GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc). Os níveis de hepcidina foram determinados em amostras séricas coletadas três se- manas após a injeção dos conjugados usando o kit ELISA (Intrinsic Life Science). Médias do grupo com SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc siRNA). Os resultados são mostrados na Figura 29. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05. Exemplo 28 Redução dos Níveis Séricos de Ferro Por Diferentes Doses de GalNAc siRNAs em Modelo Animal Para Hemocromatose Hereditária
[0555] Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutâ- nea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com conjugado controle não direcionado (GN2-Luc siRNA). Os níveis séricos de ferro foram determinados três semanas após o tratamento. Médias de grupo +/- SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). Sequências e modificações de conjugados de siRNA estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostra- dos na Figura 30. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05. Exemplo 29 Redução da Saturação de Transferrina por Diferentes Doses de GalNAc siRNAs em Modelo Animal para Hemocromatose Hereditária
[0556] Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutâ- nea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o conjugado controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-Luc). O % de satura- ção de transferrina nas amostras de sangue foi determinado três sema- nas após o tratamento. Médias de grupo com SD. Teste de Kruskal- Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2- Luc). A sequência e a modificação dos conjugados de siRNA estão re- presentadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 31. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05. Exemplo 30 Aumento da Capacidade de Ligação de Ferro Insaturado (UIBC) em Mo- delo Animal para Hemocromatose Hereditária
[0557] Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutâ- nea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o conjugado controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-LUC). As amostras sé- ricas foram coletadas três semanas após o tratamento para determina- ção da UIBC. Médias de grupo com SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). Os re- sultados são mostrados na Figura 32. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; **,01; *P<0,05. Exemplo 31 Redução dos Níveis de Ferro nos Tecidos por GalNAc siRNAs em Mo- delo Animal para Hemocromatose Hereditária
[0558] Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutâ- nea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o conjugado controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-Luc). Os níveis de ferro no tecido renal foram avaliados três semanas após o tratamento. Teste em caixa e de Wiskers (Tukey, valores medianos) Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). Os resultados são mostrados na Figura 33. Exemplo 32 Redução da Expressão de mRNA de TMPRSS6 por Diferentes siRNAs em Células Hep3B
[0559] 8000 Células por cavidade foram semeadas em placas de 96 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com siRNA 20 nM e AtuFECT 1 µg/ml. Dois dias após a transfecção, as células fo- ram lisadas e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram determinados por q-RT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de expressão do gene de manutenção ApoB. Um siRNAs contra Luciferase foi usado como controle não direcionado. A inibição média e o desvio padrão dos valores em triplicado em relação às células não tratadas são mostrados na Figura 34. As sequências dos siRNAs são mostradas na Tabela 14, abaixo. Tabela 14 ID do Dúplex ID da fita SEQ ID NO: sequência de siRNA hcTMP-SR1-A 133 mCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmCfCmUfGmGfGmAfGmU TMPRSS6-SR1 hcTMP-SR1-B 134 fAmCfUmCfCmCfAmGfGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfG hcTMP-SR2-A 135 mGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmCfUmGfGmGfAmG TMPRSS6-SR2 hcTMP-SR2-B 136 fCmUfCmCfCmAfGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfC hcTMP-SR3-A 137 mUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmCfCmUfGmGfGmA TMPRSS6-SR3 hcTMP-SR3-B 138 fUmCfCmCfAmGfGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfA hcTMP-SR4-A 139 mGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmCfUmGfGmG TMPRSS6-SR4 hcTMP-SR4-B 140 fCmCfCmAfGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfC hcTMP-SR5-A 141 mGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmCfCmUfGmG TMPRSS6-SR5 hcTMP-SR5-B 142 fCmCfAmGfGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfC hcTMP-SR6-A 143 mGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmCfUmG TMPRSS6-SR6 hcTMP-SR6-B 144 fCmAfGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfC hcTMP-SR8-A 145 mCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmC TMPRSS6-SR8 hcTMP-SR8-B 146 fGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfG hcTMP-SR9-A 147 mAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmC TMPRSS6-SR9 hcTMP-SR9-B 148 fGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfU hcTMP-SR10-A 149 mUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmC TMPRSS6-SR10 hcTMP-SR10-B 150 fGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfA hcTMP-SR11-A 151 mGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmG TMPRSS6-SR11 hcTMP-SR11-B 152 fCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfC hcTMP-SR12-A 153 mAfGmUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmC TMPRSS6-SR12 hcTMP-SR12-B 154 fGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfAmCfU hcTMP-SR13-A 155 mAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmA TMPRSS6-SR13 hcTMP-SR13-B 156 fUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfU hcTMP-SR15-A 157 mGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmG TMPRSS6-SR15 hcTMP-SR15-B 158 fCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfC hcTMP-SR16-A 158 mGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmA TMPRSS6-SR16 hcTMP-SR16-B 160 fUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfC hcTMP-SR17-A 161 mGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmG TMPRSS6-SR17 hcTMP-SR17-B 162 fCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfC hcTMP-SR18-A 163 mUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmU TMPRSS6-SR18 hcTMP-SR18-B 164 fAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfA hcTMP-SR19-A 165 mCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmC TMPRSS6-SR19 hcTMP-SR19-B 166 fGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfG hcTMP-SR21-A 167 mAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmU TMPRSS6-SR21 hcTMP-SR21-B 168 fAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfU hcTMP-SR22-A 169 mUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmGfGmG TMPRSS6-SR22 hcTMP-SR22-B 170 fCmCfCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfA hcTMP-SR23-A 171 mGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmG TMPRSS6-SR23 hcTMP-SR23-B 172 fCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfC hcTMP-SR24-A 173 mAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmG TMPRSS6-SR24 hcTMP-SR24-B 174 fCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfU hcTMP-SR26-A 175 mGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmC TMPRSS6-SR26 hcTMP-SR26-B 176 fGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfC hcTMP-SR27-A 177 mAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmA TMPRSS6-SR27 hcTMP-SR27-B 178 fUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfU hcTMP-SR28-A 179 mGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmU TMPRSS6-SR28 hcTMP-SR28-B 180 fAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfC hcTMP-SR29-A 181 mCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmG TMPRSS6-SR29 hcTMP-SR29-B 182 fCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfG hcTMP-SR30-A 183 mGfCmGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmA TMPRSS6-SR30 hcTMP-SR30-B 184 fUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfCmGfC hcTMP-SR31-A 185 mGfGmCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmA TMPRSS6-SR31 hcTMP-SR31-B 186 fUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfGmCfC hcTMP-SR32-A 187 mGfGmGfCmGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmG TMPRSS6-SR32 hcTMP-SR32-B 188 fCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfCmGfCmCfC hcTMP-SR33-A 189 mGfGmGfGmCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmG TMPRSS6-SR33 hcTMP-SR33-B 190 fCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfGmCfCmCfC hcTMP-SR34-A 191 mUfGmGfGmGfCmGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmG TMPRSS6-SR34 hcTMP-SR34-B 192 fCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfCmGfCmCfCmCfA hcTMP-SR35-A 193 mUfUmGfGmGfGmCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmG TMPRSS6-SR35 hcTMP-SR35-B 194 fCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfGmCfCmCfCmAfA
TMPRSS6-hc-16A 195 mUfAmUfUmCfCmAfAmAfGmGfGmCfAmGfCmUfGmA TMPRSS6-hc-16 TMPRSS6-hc-16B 196 fUmCfAmGfCmUfGmCfCmCfUmUfUmGfGmAfAmUfA
TMPRSS6-hc-17A 197 mAfUmCfUmUfCmUfGmGfGmCfUmUfUmGfGmCfGmG TMPRSS6-hc-17 TMPRSS6-hc-17B 198 fCmCfGmCfCmAfAmAfGmCfCmCfAmGfAmAfGmAfU
TMPRSS6-hc-18A 199 mUfUmUfUmCfUmCfUmUfGmGfAmGfUmCfCmUfCmA TMPRSS6-hc-18 TMPRSS6-hc-18B 200 fUmGfAmGfGmAfCmUfCmCfAmAfGmAfGmAfAmAfA
TMPRSS6-hc-19A 201 mGfAmAfUmAfGmAfCmGfGmAfGmCfUmGfGmAfGmU TMPRSS6-hc-19 TMPRSS6-hc-19B 202 fAmCfUmCfCmAfGmCfUmCfCmGfUmCfUmAfUmUfC
TMPRSS6-hc-21A 203 mUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmG TMPRSS6-hc-21 TMPRSS6-hc-21B 204 fCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfA
TMPRSS6-hc-22A 205 mAfGmAfUmCfCmUfGmGfGmAfGmAfAmGfUmGfGmC TMPRSS6-hc-22 TMPRSS6-hc-22B 206 fGmCfCmAfCmUfUmCfUmCfCmCfAmGfGmAfUmCfU
TMPRSS6-hc-23A 207 mCfUmGfUmUfCmUfGmGfAmUfCmGfUmCfCmAfCmU TMPRSS6-hc-23 TMPRSS6-hc-23B 208 fAmGfUmGfGmAfCmGfAmUfCmCfAmGfAmAfCmAfG
TMPRSS6-hcmr-24A 209 mCfUmCfAmCfCmUfUmGfAmAfGmGfAmCfAmCfCmU TMPRSS6-hcmr-24 TMPRSS6-hcmr-24B 210 fAmGfGmUfGmUfCmCfUmUfCmAfAmGfGmUfGmAfG
TMPRSS6-hcm-25A 211 mAfGmUfUmUfCmUfCmUfCmAfUmCfCmAfGmGfCmC TMPRSS6-hcm-25 TMPRSS6-hcm-25B 212 fGmGfCmCfUmGfGmAfUmGfAmGfAmGfAmAfAmCfU
TMPRSS6-hcr-26A 213 mGfUmAfCmCfCmUfAmGfGmAfAmAfUmAfCmCfAmG TMPRSS6-hcr-26 TMPRSS6-hcr-26B 214 fCmUfGmGfUmAfUmUfUmCfCmUfAmGfGmGfUmAfC
TMPRSS6-hc-27A 215 mCfUmGfUmUfGmAfCmUfGmUfGmGfAmCfAmGfCmA TMPRSS6-hc-27 TMPRSS6-hc-27B 216 fUmGfCmUfGmUfCmCfAmCfAmGfUmCfAmAfCmAfG Tabela 14: Sequências de siRNAs contra TMPRSS6 testado no exem- plo 32. Desoxinucleotídeos modificados por fU, fA, fC, fG - 2’F. Nucleo- tídeos modificados por mU, mA, mC, mG - 2’O-metila. Exemplo 33 Dose-resposta de siRNAs contra TMPRSS6 em células Hep3B
[0560] 8000 Células por cavidade foram semeadas em placas de 96 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com siRNA nas concentrações indicadas (100 nM - 0,03 nM) e 1 µg/ml de AtuFECT. Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram determinados por q-RT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de expressão do gene de manutenção ApoB. A inibição média e o desvio padrão dos va- lores em triplicado em relação às células tratadas com 100 nM de um siRNA de controle de luciferase não direcionado são mostrados na Fi- gura 35. Tabela 15, abaixo, mostra inibição máxima, IC50 e 95 % de intervalo de confiança de acordo com as curvas de dose-resposta mos- tradas na Figura 35. Tabela 15 ID do Dúplex intervalo de confiança de kd a 20 nM conforme Inibição máxima IC50 [nM] sd 95 % [nM] mostrado na Fig 34 TMPRSS6-hcmr-24 73 % 0,8 0,1- 6,2 70 % 2% TMPRSS-hc-17 82 % 2,4 1,1 - 5,0 79 % 5% TMPRSS-SR-27 94 % 2,8 0,7 - 10,8 84 % 4% TMPRSS-hcr-26 100 % 3,5 1,4 - 9,0 98 % 2% TMPRSS-hc-18 95 % 4,6 1,5 - 14,1 90 % 1% TMPRSS-hc-23 83 % 4,6 1,9 - 11,1 70 % 7% TMPRSS-hcm-25 87 % 4,6 2,1 - 10,2 85 % 3% TMPRSS-SR-21 100 % 5,8 0,9 - 36,9 92 % 4% TMPRSS-hc-19 100 % 6,1 3,0 - 12,5 89 % 2% TMPRSS-hc-16 100 % 7,7 2,6 - 22,6 91 % 3% TMPRSS-hc-22 99 % 8,1 2,1 - 31,1 73 % 20 % TMPRSS-SR-16 100 % 8,4 2,5 - 28,2 88 % 2% TMPRSS-SR-5 100 % 8,4 2,4 - 29,0 85 % 2%
Tabela 15: Inibição máxima, IC50 e 95 % de intervalo de confiança de acordo com a dose resposta mostrada na Fig.35. Exemplo 34 Inibição da expressão de mRNA de TMPRSS6 através de absorção me- diada por receptor em hepatócitos primários humanos
[0561] Os hepatócitos humanos primários foram semeados em pla- cas revestidas com colágeno e incubados com conjugados de siRNA diluídos em meio de cultura de células em concentrações de 300 nM a 1 nM, como indicado. 24 Horas após a exposição das células aos con- jugados de siRNA, o RNA total foi extraído e a expressão de TMPRSS6 foi quantificada por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA de Actina e para atingir os níveis de mRNA de células tratadas com o conjugado de siRNA controle não direcionado GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc). A inibição dependente da dose da expressão de TMPRSS6 foi observada pelo conjugado de siRNA GalNAc-TMPRSS6. Sequências e modificações dos conjugados estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 36. Exemplo 35 siRNA de GalNAc TMPRSS6 aumenta os valores de hematócrito no mo- delo de roedores para -talassemia intermediária
[0562] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 ( GN2- Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camun- dongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camun- dongos do tipo selvagem não tratados (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão por dot blot, média +/- SD; n = 3-6. Estatística: t-teste não pareado com correção de Welch. Os re- sultados são mostrados na Figura 37. Exemplo 36 siRNA de GalNAc TMPRSS6 reduz a largura de distribuição de glóbulos vermelhos no modelo de roedores para -talassemia intermediária
[0563] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA1 (GN2 - Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camun- dongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camun- dongos do tipo selvagem não tratado (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão por dot blot, média +/- SD; n = 3-6. Estatística: t-teste não pareado com correção de Welch. Os re- sultados são mostrados na Figura 38. Exemplo 37 siRNA de GalNAc TMPRSS6 reduz a proporção de reticulócitos no mo- delo de roedores para -talassemia intermediária
[0564] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2 - Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camun- dongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camun- dongos do tipo selvagem não tratados (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão por dot blot, média +/- SD; n = 3-6. Estatística: t-teste não pareado com correção de Welch. Os re- sultados são mostrados na Figura 39. Exemplos 38 siRNA de GalNAc TMPRSS6 reduz a quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS) no modelo de roedores para -talassemia intermedi- ária
[0565] Camundongos Hbbth3/+ (Th3/+; Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP) ou GN2-Luc 1 siRNA (GN2-Luc) como controle não direcionado. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. As medidas de ROS foram realizadas 5 min. Após a adição de 2’7’ dicloro-fluoresceína como indicador (Siwaponanan et al., 2017 Blood, 129, 3087-3099). Amostras de sangue de camundongos tratados com GN2-TMPRSS6 hcm9 foram medidas duas vezes. Os camundon- gos Hbbth3/+ (Th3/+) foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de ca- mundongos do tipo selvagem não tratados (WT) (C57BL/6) foram cole- tadas e analisadas para comparação. Dispersão por dot blot, média +/- SD; n = 4-6. Estatística: t-teste não pareado com correção de Welch. Os resultados são mostrados na Figura 40. Exemplo 39 siRNA de GalNAc TMPRSS6 aumenta os níveis de hemoglobina no mo- delo de roedores para -talassemia intermediária
[0566] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc- siRNA 1 (GN2- Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camun- dongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camun- dongos não tratados (wt) do tipo selvagem (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão por dot blot, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: t-testes de Welch não corrigidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 41. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7. Exemplo 40 GalNAc TMPRSS6 reduz a esplenomegalia no modelo de roedores para -talassemia intermediária
[0567] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc-siRNA 1 (GN2- Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, respectivamente. No d 39, os pesos do baço foram avaliados. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Har- bor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Os pesos de baço de camundongos do tipo selvagem (peso) (C57BL/6) tratados com PBS fo- ram avaliados para comparações. Dispersão por dot blot, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: t-testes de Welch não corrigidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 42. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7. Exemplo 41 GalNAc TMPRSS6 melhora a maturação de glóbulos vermelhos na me- dula óssea
[0568] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc-siRNA 1 (GN2-
Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, no dia d39, células foram coletados da medula óssea e analisadas por análise por FACS. As células eritroides viáveis foram separadas em populações distintas com base na coloração de CD71, Ter119 e CD44. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. As células eritroides da medula óssea de camundongos do tipo selvagem (peso) (C57BL/6) tratadas com PBS foram avaliadas para comparações. Gráfico de bar- ras, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: testes t de Welch não corrigidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 43. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7. Exemplo 42 GalNAc TMPRSS6 reduz a eritropoese ineficaz no baço
[0569] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2 - Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veí- culo, respectivamente. No d 39, as células foram coletadas do baço e analisadas por análise por FACS. As células eritroides viáveis foram se- paradas em populações distintas com base na coloração de CD71, Ter119 e CD44. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. As células eritroides dos camundongos do tipo selvagem (peso) (C57BL/6) tratadas com PBS foram avaliadas para comparações. Gráfico de bar- ras, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: testes t de Welch não são corri- gidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura
44. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7. Exemplo 43 Redução da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos humanos por con- jugados de GalNAc siRNA
[0570] 30.000 cpw de hepatócitos primários humanos foram seme- ados em placas de 96 cavidades revestidas com colágeno. As células foram tratadas com quantidades indicadas de conjugados de siRNA imediatamente após a semeadura. As células foram lisadas 24 horas após o tratamento e a expressão do mRNA de TMPRSS6 analisada por TaqMan qRT-PCR. Valores em triplicado de TMPRSS6 normalizados para ApoB (de manutenção) e para a média de células não tratadas são mostrados.
[0571] Os resultados são mostrados nas Figuras 45a, 45b e 46, e as sequências são mostradas na Figura 47.
[0572] O ligante GN3 descrito é mostrado na Figura 8C. Exemplo 44 Ensaio de estabilidade sérica de conjugados de GalNAc-siRNA com fos- forotioatos, fosforoditioatos e fosfodiésteres em posições terminais e na porção GalNAc
[0573] O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da fita do senso e é estabilizado internamente por quatro PS (STS12009L4) ou não; em seguida, ligações de fosfodiéster são usadas (STS12009V54L50 - V57L50). Modificações de fosforoditioato foram co- locadas em todas as posições terminais do dúplex, exceto na extremi- dade 5' da primeira fita (-V54L50), somente nas extremidades 3' (- V55L50, -V57L50) ou na extremidade 3' somente da segunda fita (- V56L50). Em certos projetos, fosfodiésteres foram usados em posições terminais do siRNA dúplex (-V56L50, -V57L50). Os conjugados de Gal- NAc-siRNA 5 µM foram incubados com 50 % de FBS por 3 d a 37°C. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida de TBE a 20 %. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS. "Controle" indica um conjugado de GalNAc-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.
[0574] Os conjugados de GalNAc de um siRNA direcionado ao
TMPRSS6 contendo diferentes químicas de estabilização final (fosforo- tioato, fosforoditioato, fosfodiéster) foram testados absorçãoatravés de absorção mediada por receptor em hepatócitos primários de camun- dongo. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5' da segunda fita e é estabilizado internamente por quatro PS (STS12009L4) ou não, em seguida as ligações de fosfodiéster são usadas (STS12009V54L50 - V57L50). Modificações de fosforoditioato foram colocadas em todas as posições terminais do dúplex, exceto na extremidade 5' de primeira fita (-V54L50), somente nas extremidades 3'(-V55L50, -V57L50) ou na ex- tremidade 3' somente da segunda fita (-V56L50). Em certos projetos, os fosfodiésteres foram usados em posições terminais do siRNA dúplex (- V56L50, -V57L50). A experiência foi conduzida em hepatócitos primá- rios de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de
20.000 células por 96 cavidades e tratadas com 125 nM a 0,2 nM de GalNAc-siRNA. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi ex- traído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e PTEN foram determinados por Taqman qRT-PCR. Cada barra representa a média ± SD de três réplicas técnicas.
[0575] Os resultados e sequências relevantes são mostrados nas Figuras 48 a 50. Exemplo 45 Redução da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos de murino primá- rios por conjugados de GalNAc siRNA com 2’-O-metil-uridina ou 5'- (E)- vinilfosfonato-2’-O-metil-uridina, substituindo a 2’-O-metil-adenina na posição 5' da primeira fita
[0576] Os hepatócitos primários de murino foram semeados em pla- cas de 96 cavidades pré-revestidas com colágeno (Thermo Fisher Sci- entific, # A1142803) a uma densidade celular de 30.000 células por ca- vidade e tratadas com conjugados de siRNA em concentrações vari- ando de 100nM a 0,1nM. As células após 24 horas de tratamento foram lisadas e o RNA extraído com InviTrap® RNA Cell HTS 96 Kit/C24 x 96 preps (Stratec # 7061300400) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de transcrições de TMPRSS6 e mRNA de manutenção (Pte- nII) foram quantificados por análise TaqMan.
[0577] Conjugados de siRNA: primeira fita/se- siRNA dúplex sequência & modificação gunda fita TMPR-SS6-hcm9-A mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA STS12009L4 (X0027) TMPR-SS6-hcm9- GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU BL4 TMPRSS6- vinilfosfonato-mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU STS12209V4L hcm209AV4 (ps) fG (ps) mA 4 (X0204) TMPRSS6-hcm209- GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA BL4 TMPRSS6-hcm209- vinilfosfonato-mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) STS12209V5L AV5 mA 4 (x0205) TMPRSS6-hcm209- GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA BL4 TMPRSS6-hcm209A mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA STS12209L4 (x0207) TMPRSS6-hcm209- GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA BL4 TMPRSS6-hcm9- mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA STS12209V1L AV1 4 (x0208) TMPRSS6-hcm209- GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA BL4 STS18001A mU(ps)fC(ps)mGfAmAfGmUfAmUfUmCfCmGfCmGfUmA(ps)fC(ps)mG STS18001 (X0028) STS18001BL4 GN2 fCmGfUmAfCmGfCmGfGmAfAmUfAmCfUmUfC (ps) mG (ps) fA Legenda: mN 2’-O-metil ribonucleotídeo (pro exemplo, mU - 2’-O-metil Ura- cila) fN 2’-fluoro ribonucleotídeo (pro exemplo, fC - 2’-fluoro Citidina) (ps) fosforotioato
[001] vinilfosfonato vinil-(E)-fosfonato GN2 estrutura de acordo com a Figura 8B Sondas e iniciadores TaqMan PTEN-2 CACCGCCAAATTTAACTGCAGA PTEN-2 AAGGGTTTGATAAGTTCTAGCTGT PTEN-2 FAM-TGCACAGTATCCTTTTGAAGACCATAACCCA-TAMRA hTMSS6:379U17 CCGCCAAAGCCCAGAAG hTMSS6:475L21 GGTCCCTCCCCAAAGGAATAG hTMSS6:416U28FL FAM-CAGCACCCGCCTGGGAACTTACTACAAC-BHQ1 Legenda: FAM – 6- carboxifluoresceína (corante fluorescente) TAMRA – tetrametilrodamina (extintor) BHQ1 – extintor de orifício negro 1 (extintor) Dose-resposta in vitro
[0578] Expressão do gene alvo em hepatócitos de murino primários 24h após o tratamento com TMPRSS6-siRNA transportando vinil-(E)- fosfonato 2’OMe-Uracila na posição 5' da fita antissenso e duas ligações de fosforotioato entre os três primeiros nucleotídeos (STS12209V4L4 ), vinil- (E)-fosfonato 2’OMe-Uracila na posição 5' da fita antissenso e das ligações de fosfodiéster entre os três primeiros nucleotídeos (STS12209V5L4), transportando 2’-O-metil-Uracila e duas ligações de fosforotioato entre os três primeiros nucleotídeos na posição 5' (STS12209L4) ou transportando 2’-O-metil-Uracila e duas ligações de fosfodiéster entre os três primeiros nucleotídeos na posição 5' (STS12209V1L4) ou) ou (STS12009L4) como referência ou um Gal- NAc-siRNA não direcionado (STS18001) nas concentrações indicadas ou deixados sem tratamento (UT).
[0579] Os resultados são mostrados na Figura 51. Estabilidade sérica
[0580] Estabilidade sérica de conjugados de siRNA incubados por 4 horas (4h) ou 3 dias (3d) ou deixados sem tratamento (0h) em 50 % de FCS a 37°C. O RNA a seguir foi extraído por extração de fenol/clo- rofórmio/álcool isoamílico. A degradação foi visualizada por eletroforese em gel de Poliacrilamida de TBE e corando o RNA com SybrGold.
[0581] Os resultados são mostrados na Figura 52: Estabilidade sé- rica de conjugados de siRNA vs. controle positivo menos estabilizado para degradação de nuclease. Exemplo 46 Redução da saturação de transferrina por meio de tratamento com siRNA de TMPRSS6 em modelo animal para hemocromatose hereditá- ria de tipo 1
[0582] Camundongos C57BL6/J fêmeas congênicos knock-out de três meses (-/-) e camundongos C57BL6/J selvagens de três meses de idade (+/+) foram usados neste estudo (Herrmann et al., Mol. Med,
2004. 82 (1): páginas 1-3). Camundongos HFE -/- (n = 8) foram tratados no Dia 1 (1X) ou no Dia 1 e no Dia 22 (2X) por via subcutânea com PBS (PBS) ou 3 mg/kg de conjugado de siRNA de TMPRSS6 (TMP) ou 3 mg/kg de conjugado de siRNA não direcionado (Luc). Além disso, as coortes 7 a 10 receberam deferiprona fornecida na água de beber na concentração de 0,5 mg/ml. As coortes 1 e 2 foram encerradas no dia 1 (pré-dose), todas as outras coortes no dia 43 (6 semanas após o início do tratamento) para coletar amostras de soro e tecido para análises.
[0583] Os níveis séricos de ferro (SFBC) e a capacidade de ligação do ferro insaturado UIBC foram avaliados por meio de métodos calori- métricos. A saturação da transferrina (Tf Sat) foi calculada usando a se- guinte fórmula: TfSat = (SFBC/TIBC) X100. A saturação da transferrina é elevada em camundongos HFE -/- de 3 meses de idade no início da fase de tratamento (coorte 2, Pré-dose). O tratamento com conjugados de siRNA TMPRSS6 isoladamente ou em combinação com Deferiprona reduziu a saturação de transferrina neste modelo de roedor para hemo- cromatose hereditária e sobrecarga de ferro.
[0584] Os resultados são mostrados na Figura 53. Conjugados de siRNA: Conjugado Fitas simples Sequência e química de siRNA Fita TMP-A 5´ mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3´ SEQ ID NO: 217
TMP Fita TMP-B 5´GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3´ SEQ ID NO: 218
Luc-A 5´mU(ps)fC(ps)mGfAmAfGmUfAmUfUmCfCmGfCmGfUmA (ps) fC(ps) mG 3´ Luc Luc-B 5´GN2 fC mG fU mA fC mG fC mG fG mA fA mU fA mC fU mU fC (ps) mG (ps) fA 3´ Legenda: fN (N=A, C, G, U) denota 2´Fluoro, 2´ DesosiNucleosídeos mN (N=A, C, G, U) denota 2´O Metil Nucleosídeos (ps) indica uma ligação de fosforotioato Estrutura de GN2 GalNAc conforme na Figura 8B TMP-A é idêntica a SEQ ID NO: 111 TMP-B é idêntica a SEQ ID NO: 112, exceto, evidentemente, que GN foi substituído por GN2 A sequência de base de TMP-A é idêntica à SEQ ID NO: 333 A sequência de base de TMP-B é idêntica à SEQ ID NO:334 O padrão de modificação de TMP-A é idêntico à SEQ ID NO: 17 O padrão de modificação de TMP-B é idêntico à SEQ ID NO: 18 Luc-A é idêntica à SEQ ID NO: 109 Luc-B é idêntica à SEQ ID NO: 110 A sequência de base de Luc-A é idêntica à SEQ ID NO: 347 A sequência de base de Luc-B é idêntica à SEQ ID NO:348 O padrão de modificação de Luc-A é idêntico à SEQ ID NO: 31 O padrão de modificação de Luc-B é idêntico à SEQ ID NO: 32 Exemplo 47
[0585] O tratamento com siRNAs TMPRSS6 aumenta a redução dos níveis de ferro nos tecidos pelo quelante de ferro. Camundongos HFE -/- de 3 meses de idade (modelo de roedor para hemocromatose hereditária e sobrecarga de ferro) ou camundongos do tipo selvagem foram usados para este estudo e tratados conforme descrito no Exemplo
46. Amostras de tecido hepático foram coletadas para avaliar as con- centrações de ferro no fígado antes do início do tratamento ( pré-dose)
e no final do estudo no Dia 43 (6 semanas após o início dos tratamen- tos). As amostras de tecido hepático foram secas e as concentrações de ferro dos pesos secos foram determinadas por meio do método de extração com ácido. No início do estudo, os níveis de ferro no fígado já estavam elevados em camundongos HFE -/- comparado com camun- dongos de controle de tipo selvagem (Predose). O tratamento de ca- mundongos HFE -/- com conjugados de siRNA TMPRSS6 em combina- ção com Deferiprona aumentou a redução dos níveis de ferro nos teci- dos pelo quelante de ferro. Em outras palavras, o tratamento combinado de siRNA/quelante de ferro levou a uma redução muito maior do teor de ferro no fígado do que foi alcançado pelo tratamento com o siRNA ou o quelador apenas (compare as colunas 5 e 9 ou 6 e 10). Isto é surpreen- dente, uma vez que o tratamento com o siRNA apenas (compare a co- luna 3 com as colunas 5 e 6) ou com o quelante de ferro apenas (coluna 7) tem pouco ou nenhum efeito sobre o teor de ferro do fígado. O teor de ferro do fígado é ainda mais reduzido pela administração de doses múltiplas de siRNA (compare as colunas 9 e 10).
[0586] Os conjugados de siRNA são conforme descritos no Exem- plo 46 e os resultados são mostrados na Figura 54. Sumário
TABELA DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO Nome Sequência (5'-3') 1 TMPRSS6-hc-1A 6181715172727184715 2 TMPRSS6-hc-1B 2647364545462646361 3 TMPRSS6-h-2A 6154645272747282718 4 TMPRSS6-h-2B 3645354745452717261 5 TMPRSS6-h-3A 6281546184546173748 6 TMPRSS6-h-3B 3748461727361726351 7 TMPRSS6-hc-4A 5171846174537271847 8 TMPRSS6-hc-4B 4736454827461736462 9 TMPRSS6-h-5A 6153636462728284627 10 TMPRSS6-h-5B 4517353545171818261 11 TMPRSS6-h-6A 8164536184718173535 12 TMPRSS6-h-6B 2828463647361827163
13 TMPRSS6-h-7A 6451816452645173728
14 TMPRSS6-h-7B 3548462715271636271
15 TMPRSS6-hcmr-8A 5181637352846261637
16 TMPRSS6-hcmr-8B 4816151735284816362
17 TMPRSS6-hcm-9A 6273646282647284546
18 TMPRSS6-hcm-9B 1727354715351718451
19 TMPRSS6-hc-10A 5263627372838184625
20 TMPRSS6-hc-10B 2517363835484518152
21 TMPRSS6-hc-11A 8151717172537284738
22 TMPRSS6-hc-11B 3847354825464646263
23 TMPRSS6-hcm-12A 8361715354847151847
24 TMPRSS6-hcm-12B 4736264737282646183
25 TMPRSS6-hc-13A 5363635482648182618
26 TMPRSS6-hc-13B 3615363715372818182
27 TMPRSS6-hcmr-14A 7272825454538273738
28 TMPRSS6-hcmr-14B 3848453827272535454
29 TMPRSS6-hcmr-15A 5452737164826252736
30 TMPRSS6-hcmr-15B 1845251537164845272
31 TMPRSS6-Luc-siRNA-1A 5382645251738381638
32 TMPRSS6-Luc-siRNA-1B 3816383856252715382
33 TMPRSS6-PTEN-A 5a6g5u7u6g7u8u8g5g8
34 TMPRSS6-PTEN-B c7a7c6c6g7u6g6a7u5a
35 hTMPRSS6 (superior) ccgccaaagcccagaag
36 hTMPRSS6 (inferior) ggTcccTccccaaaggaaTag
37 hTMPRSS6 (sonda) cagcacccgccTgggaacTTacTacaac
38 mTMPRSS6 (superior) cggcaccTaccTTccacTcTT
39 mTMPRSS6 (inferior) TcggTggTgggcaTccT
40 mTMPRSS6 (sonda) ccgagaTgTTTccagcTccccTgTTcTa
41 h-Aktin (superior) gcaTgggTcagaaggaTTccTaT
42 h-Aktin (inferior) TgTagaaggTgTggTgccagaTT
43 h-Aktin (sonda) TcgagcacggcaTcgTcaccaa
44 mAktin (superior) gTTTgagaccTTcaacacccca
45 mAktin (inferior) gaccagaggcaTacagggaca
46 mAktin (sonda) ccaTgTacgTagccaTccaggcTgTg
47 PTEN (superior) caccgccaaaTTTaacTgcaga
48 PTEN (inferior) aagggTTTgaTaagTTcTagcTgT
49 PTEN (sonda) TgcacagTaTccTTTTgaagaccaTaaccca
50 mHAMP (superior) ccTgTcTccTgcTTcTccTccT
51 mHAMP (inferior) aaTgTcTgcccTgcTTTcTTcc
52 mHAMP (sonda) TgagcagcaccaccTaTcTccaTcaaca
53 TMPRSS6-hcmr-8B 4816151735284816362
54 TMPRSS6-h-2B 3645354745452717261
55 TMPRSS6-hcm-12B 4736264737282646183
56 TMPRSS6-h-7B 3548462715271636271
57 TMPRSS6-hcm-9B 1727354715351718451
58 TMPRSS6-hc-1B 2647364545462646361
59 TMPRSS6-hc-10B 2517363835484518152
60 TMPRSS6-hc-4B 4736454827461736462
61 TMPRSS6-h-3B 3748461727361726351
62 TMPRSS6-h-5B 4517353545171818261
63 TMPRSS6-hc-11B 3847354825464646263
64 TMPRSS6-hc-13B 3615363715372818182
65 TMPRSS6-hcmr-14B 3848453827272535454
66 TMPRSS6-h-6B 2828463647361827163
67 TMPJH01A 6273646282647284546
68 TMPJH01B 1727354715351718451
69 TMPJH02A 2237242282243284142
70 TMPJH02B 1723314715355754815
71 TMPJH03A 2273282646283248182
72 TMPJH03B 5363718351715354815
73 TMPJH04A 2273282646683248182
74 TMPJH05A 2273242242643244542
75 TMPJH05B 5727354315355754455
76 TMPJH06A 2277646242643244542
77 TMPJH07A 2277686242643244542
78 TMPJH08A 2273242246687244542
79 TMPJH09A 2273242682687244542
80 TMPJH10A 2273242242643284586
81 TMPJH11A 2273242242643288586
82 TMPJH12A 2273242246687284586
83 TMPJH13A 6277646246687284586
84 TMPJH13B 5767354315755758855
85 TMPJH14A 2273282282283284182
86 TMPJH14B 5327318315315318415
87 TMPJH15A 2273282282643284182
88 TMPJH16A 2237242242247244582
89 TMPJH16B 1723314355311358411
90 TMPJH17A 2273282242643284586
91 TMPJH18A 6277682242643288142
92 TMPJH19A 6277682242643288586
93 TMPJH20A 2233282242643284142
94 TMPJH21A 2277282242643284586
95 TMPJH22A 2273282642643284586
96 TMPJH23A 2273282282643284586
97 TMPJH24A 2273282246643284586
98 TMPJH25A 2273282242683284586
99 TMPJH26A 2273282242647284586
100 TMPJH27B 5727754715355754855
101 TMPJH28B 1723314311351714411
102 TMPJH29B 5767354315355754455
103 TMPJH30B 5727754315355754455
104 TMPJH31B 5727358315355754455
105 TMPJH32B 5727354315755754455
106 TMPJH33B 5727354315355758455
107 GN-TTR-hc-A ucuugguuacaugaaauccca
108 GN-TTR-hc-B ugggauuucauguaaccaaga
109 GN2-Luc-siRNA 1-A 5(ps)3(ps)826452517383816(ps)3(ps)8
110 GN2-Luc-siRNA 1-B GN2-38163838462527153(ps)8(ps)2
111 STS012-A 6(ps)2(ps)736462826472845(ps)4(ps)6
112 STS012-B GN-17273547153517184(ps)5(ps)1
113 STS012-1-A 6(ps)2(ps)736462826472845(ps)4(ps)6
114 STS012-1-B GN-57677547153517588(ps)5(ps)5
115 STS012-2-A 6(ps)2(ps)736462826472845(ps)4(ps)6
116 STS012-2-B GN-57673543157557588(ps)5(ps)5
117 STS012-3-A 6(ps)2(ps)736462826472845(ps)4(ps)6
118 STS012-3-B GN-57A7C547153517T8G(ps)5(ps)T
119 STS012-4-A 6(ps)2(ps)776462466872845(ps)8(ps)6
120 STS012-4-B GN-57673543157557588(ps)5(ps)5
121 STS012-5-A 6(ps)2(ps)736462426472845(ps)4(ps)6
122 STS012-5-B GN-17273543153517184(ps)5(ps)1
123 STS012-6-A 6(ps)2(ps)73646242647284546(ps)7(ps)7
124 STS012-6-B GN-17273543153517184(ps)5(ps)1
125 STS012-7-A 6(ps)2(ps)776866866472885(ps)8(ps)6
126 STS012-7-B GN-57677547153517588(ps)5(ps)5
127 STS012-8-A 6(ps)2(ps)776866866472885(ps)8(ps)6
128 STS012-8-B GN-57673543157557588(ps)5(ps)5
129 STS012-9-A 2(ps)2(ps)772422422472445(ps)4(ps)2
130 STS012-9-B GN-57277547157557544(ps)5(ps)5
131 control siRNA A 5(ps)1(ps)645262735151828(ps)2(ps)7
132 control siRNA B GN-45353626284515271(ps)6(ps)2
133 hcTMP-SR1-A mCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmCfCmUfGmGfGmAfGmU
134 hcTMP-SR1-B fAmCfUmCfCmCfAmGfGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfG
135 hcTMP-SR2-A mGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmCfUmGfGmGfAmG
136 hcTMP-SR2-B fCmUfCmCfCmAfGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfC
137 hcTMP-SR3-A mUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmCfCmUfGmGfGmA
138 hcTMP-SR3-B fUmCfCmCfAmGfGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfA
139 hcTMP-SR4-A mGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmCfUmGfGmG
140 hcTMP-SR4-B fCmCfCmAfGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfC
141 hcTMP-SR5-A mGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmCfCmUfGmG
142 hcTMP-SR5-B fCmCfAmGfGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfC
143 hcTMP-SR6-A mGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmCfUmG
144 hcTMP-SR6-B fCmAfGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfC
145 hcTMP-SR8-A mCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmCfCmC
146 hcTMP-SR8-B fGmGfGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfG
147 hcTMP-SR9-A mAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmGfCmC
148 hcTMP-SR9-B fGmGfCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfU
149 hcTMP-SR10-A mUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmCfGmC
150 hcTMP-SR10-B fGmCfGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfA
151 hcTMP-SR11-A mGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmAfCmG
152 hcTMP-SR11-B fCmGfUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfC
153 hcTMP-SR12-A mAfGmUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmAfGmGfAmC
154 hcTMP-SR12-B fGmUfCmCfUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfAmCfU
155 hcTMP-SR13-A mAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmGfGmA
156 hcTMP-SR13-B fUmCfCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfU
157 hcTMP-SR15-A mGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmGfAmG
158 hcTMP-SR15-B fCmUfCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfC
159 hcTMP-SR16-A mGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmUfGmA
160 hcTMP-SR16-B fUmCfAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfC
161 hcTMP-SR17-A mGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmCfUmG
162 hcTMP-SR17-B fCmAfGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfC
163 hcTMP-SR18-A mUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmGfGmGfUmGfCmU
164 hcTMP-SR18-B fAmGfCmAfCmCfCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfA
165 hcTMP-SR19-A mCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmUfGmC
166 hcTMP-SR19-B fGmCfAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfG
167 hcTMP-SR21-A mAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmGfGmU
168 hcTMP-SR21-B fAmCfCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfU
169 hcTMP-SR22-A mUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmGfGmG
170 hcTMP-SR22-B fCmCfCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfA
171 hcTMP-SR23-A mGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmGfGmG
172 hcTMP-SR23-B fCmCfCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfC
173 hcTMP-SR24-A mAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmCfGmG
174 hcTMP-SR24-B fCmCfGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfU
175 hcTMP-SR26-A mGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmUfAmC
176 hcTMP-SR26-B fGmUfAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfC
177 hcTMP-SR27-A mAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmA
178 hcTMP-SR27-B fUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfU
179 hcTMP-SR28-A mGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmAfGmU
180 hcTMP-SR28-B fAmCfUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfC
181 hcTMP-SR29-A mCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmG
182 hcTMP-SR29-B fCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfG
183 hcTMP-SR30-A mGfCmGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmGfAmA
184 hcTMP-SR30-B fUmUfCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfCmGfC
185 hcTMP-SR31-A mGfGmCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmA
186 hcTMP-SR31-B fUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfGmCfC
187 hcTMP-SR32-A mGfGmGfCmGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmGfGmG
188 hcTMP-SR32-B fCmCfCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfCmGfCmCfC
189 hcTMP-SR33-A mGfGmGfGmCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmG
190 hcTMP-SR33-B fCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfGmCfCmCfC
191 hcTMP-SR34-A mUfGmGfGmGfCmGfAmGfUmAfGmUfAmGfCmUfGmG
192 hcTMP-SR34-B fCmCfAmGfCmUfAmCfUmAfCmUfCmGfCmCfCmCfA
193 hcTMP-SR35-A mUfUmGfGmGfGmCfGmAfGmUfAmGfUmAfGmCfUmG
194 hcTMP-SR35-B fCmAfGmCfUmAfCmUfAmCfUmCfGmCfCmCfCmAfA
195 TMPRSS6-hc-16A mUfAmUfUmCfCmAfAmAfGmGfGmCfAmGfCmUfGmA
196 TMPRSS6-hc-16B fUmCfAmGfCmUfGmCfCmCfUmUfUmGfGmAfAmUfA
197 TMPRSS6-hc-17A mA (ps) fU (ps) mCfUmUfCmUfGmGfGmCfUmUfUmGfGmC (ps) fG (ps) mG 198 TMPRSS6-hc-17B GN3 - fCmCfGmCfCmAfAmAfGmCfCmCfAmGfAmAfG (ps) mA (ps) fU 199 TMPRSS6-hc-18A mU (ps) fU (ps) mUfUmCfUmCfUmUfGmGfAmGfUmCfCmU (ps) fC (ps) mA 200 TMPRSS6-hc-18B GN3 - fUmGfAmGfGmAfCmUfCmCfAmAfGmAfGmAfA (ps) mA (ps) fA 201 TMPRSS6-hc-19A mGfAmAfUmAfGmAfCmGfGmAfGmCfUmGfGmAfGmU
202 TMPRSS6-hc-19B fAmCfUmCfCmAfGmCfUmCfCmGfUmCfUmAfUmUfC
203 TMPRSS6-hc-21A mUfAmGfUmAfGmCfUmGfGmGfGmAfAmGfUmAfCmG
204 TMPRSS6-hc-21B fCmGfUmAfCmUfUmCfCmCfCmAfGmCfUmAfCmUfA
205 TMPRSS6-hc-22A mAfGmAfUmCfCmUfGmGfGmAfGmAfAmGfUmGfGmC
206 TMPRSS6-hc-22B fGmCfCmAfCmUfUmCfUmCfCmCfAmGfGmAfUmCfU
207 TMPRSS6-hc-23A mC (ps) fU (ps) mGfUmUfCmUfGmGfAmUfCmGfUmCfCmA (ps) fC (ps) mU 208 TMPRSS6-hc-23B GN3 - fAmGfUmGfGmAfCmGfAmUfCmCfAmGfAmAfC (ps) mA (ps) fG 209 TMPRSS6-hcmr-24A mCfUmCfAmCfCmUfUmGfAmAfGmGfAmCfAmCfCmU
210 TMPRSS6-hcmr-24B fAmGfGmUfGmUfCmCfUmUfCmAfAmGfGmUfGmAfG
211 TMPRSS6-hcm-25A mA (ps) fG (ps) mUfUmUfCmUfCmUfCmAfUmCfCmAfGmG (ps) fC (ps) mC 212 TMPRSS6-hcm-25B GN3 - fGmGfCmCfUmGfGmAfUmGfAmGfAmGfAmAfA (ps) mC (ps) fU 213 TMPRSS6-hcr-26A mG (ps) fU (ps) mAfCmCfCmUfAmGfGmAfAmAfUmAfCmC (ps) fA (ps) mG 214 TMPRSS6-hcr-26B GN3 - fCmUfGmGfUmAfUmUfUmCfCmUfAmGfGmGfU (ps) mA (ps) fC 215 TMPRSS6-hc-27A mCfUmGfUmUfGmAfCmUfGmUfGmGfAmCfAmGfCmA
216 TMPRSS6-hc-27B fUmGfCmUfGmUfCmCfAmCfAmGfUmCfAmAfCmAfG
217 STS12009L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mA 218 STS12009L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fU 219 STS12009V2L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mA 220 STS12009V2L4-B GN2-mUmCmAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUm- GmG(ps)mU(ps)mU 221 STS12009V8L4-A mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGm- GmU(ps)mG(ps)mA 222 STS12009V8L4-B GN2-mUmCmAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUm- GmG(ps)mU(ps)mU
223 GN2-Luc-A mU(ps)fU(ps)mAfGmUfAmAfAmCfCmUfUmUfUmG- fAmG(ps)fA(ps)mC 224 GN2-Luc-B GN2-fGmUfCmUfCmAfAmAfAmGfGmUfUmU- fAmCfU(ps)mA(ps)fA 225 TMP01-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
226 TMP01-B fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
227 TMP66-A mAfAmCfCmAmGfAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUm- GmA 228 TMP66-B mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmG- mUmU 229 TMP69-A fAfAfCfCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGfUfGfA
230 TMP69-B fUmCfAfCfCfUfGfCfUfUfCmUfUmCfUfGfGfUfU
231 TMP79-A fAfAmCfCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGmUmGmA
232 TMP79-B mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU
233 TMP80-A fAfAmCmCfAmGfAfAfGfAmAfGfCfAmGfGmUmGmA
234 TMP80-B mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU
235 TMP81-A fAfAmCfCfAmGfAfAfGfAmAfGmCfAmGfGmUmGmA
236 TMP81-B mUmCfAmCfCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUfGfGmUmU
237 STS12009V27L4-A mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGm- GmU(ps)mG(ps)mA 238 STS12009V27L4-A GN2-mUmCmAmCmCmUfGfCfUmUmCmUmUmCmUm- GmG(ps)mU(ps)mU 239 STS12009V41L4-A mA(ps)fA(ps)mCmCmAmGmAmAmGmAmAfGmCfAmGm- GmU(ps)mG(ps)mA 240 STS12009V41L4-A GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fU 241 TMP95-A mAfAmCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmGmUm- GmA 242 TMP95-B fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
243 TMP99-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
244 TMP99-B mUmCmAmCmCmUfGmCfUmUmCmUmUmCmUmGmG- mUmU 245 TMP112-A mA[A]mCmCmAmGmAmAmGmAmAmGmCfAmGmG- mUmGmA 246 TMP112-B fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmUfU
247 TMP114-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
248 TMP114-B mUmCmAmCmCmU{G}mCfUmUmCmUmUmCmUmGmG- mUmU 249 TMP115-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
250 TMP115-B mUmCmAmCmCmUfGmC{U}mUmCmUmUmCmUmGmG- mUmU 251 TMP116-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
252 TMP116-B mUmCmAmCmCmU[G]mCfUmUmCmUmUmCmUmGmG- mUmU 253 TMP117-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
254 TMP117-B mUmCmAmCmCmUfGmC[U]mUmCmUmUmCmUmGmG- mUmU 255 TMP70-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mA 256 TMP70-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fU
257 TMP82-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmA(ps)ivA 258 TMP82-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfU(ps)ivA 259 TMP83-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmA(ps)ivG 260 TMP83-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfU(ps)ivG 261 TMP84-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivA 262 TMP84-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfU ivG 263 TMP85-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivU 264 TMP85-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfU ivG 265 TMP86-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivC 266 TMP86-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfU ivG 267 TMP87-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG ivG 268 TMP87-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfU ivG 269 TMP88-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmA ivG 270 TMP88-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivA 271 TMP89-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmA ivG 272 TMP89-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivU 273 TMP90-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmA ivG 274 TMP90-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivC 275 TMP91-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmA ivG 276 TMP91-B fU(ps)mC(ps)fAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU ivG 277 STS12009V10L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmAivA 278 STS12009V10L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfUivA 279 STS12009V11L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUf- GmAivG 280 STS12009V11L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfG- mUfUivG 281 STS12009V29L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mAivA 282 STS12009V29L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fUivA 283 STS12009V30L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mAivG
284 STS12009V30L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fUivG 285 STS12009V34L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mA 286 STS12009V34L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGf- GmU(ps2)fU 287 STS12009V36L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfG- mUfG(ps2)mA 288 STS12009V36L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fU 289 STS12009V37L4-A mA(ps2)fAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mA 290 STS12009V37L4-B GN2-fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUm- GfG(ps)mU(ps)fU 291 STS12009V40L4-A mA(ps)fA(ps)mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGf- GmU(ps)fG(ps)mA 292 STS12009V40L4-B GNo-fU(ps2)mCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGf- GmU(ps2)fU 293 STS12209V4L4-A vinilfosfonato-mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 294 STS12209V4L4-B GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA 295 STS12209V5L4-A vinilfosfonato-mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 296 STS12209V5L4-B GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA 297 STS12209L4-A mU (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 298 STS12209L4-B GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA 299 STS12209V1L4-A mU fA mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 300 STS12209V1L4-B GN2 fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fA 301 STS18001-A mU(ps)fC(ps)mGfAmAfGmUfAmUfUmCfCmGfCmG- fUmA(ps)fC(ps)mG 302 STS18001-B GN2 fCmGfUmAfCmGfCmGfGmAfAmUfAmCfUmUfC (ps) mG (ps) fA 303 PTEN-2-A caccgccaaaTTTaacTgcaga
304 PTEN-2-B aagggTTTgaTaagTTcTagcTgT
305 PTEN-2-C FAM-TgcacagTaTccTTTTgaagaccaTaaccca-TAMRA
306 hTMSS6:379U17 ccgccaaagcccagaag
307 hTMSS6:475L21 ggTcccTccccaaaggaaTag
308 hTMSS6:416U28FL FAM-cagcacccgccTgggaacTTacTacaac-BHQ1
309 STS12009V54L50-A mA (ps) fA (ps) mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfG- mUfG (ps2) mA 310 STS12009V54L50-B GNo - fU (ps2) mCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmG- fGmU (ps2) fU 311 STS12009V55L50-A mA (ps) fA (ps) mCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfG- mUfG (ps2) mA 312 STS12009V55L50-B GNo - fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU (ps2) fU 313 STS12009V56L50-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfGmA
314 STS12009V56L50-B GNo - fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU (ps2) fU 315 STS12009V57L50-A mAfAmCfCmAfGmAfAmGfAmAfGmCfAmGfGmUfG (ps2) mA 316 STS12009V57L50-B GNo - fUmCfAmCfCmUfGmCfUmUfCmUfUmCfUmGfGmU (ps2) fU 317 TMPRSS6-hc-1A augucuuucacacuggcuu
318 TMPRSS6-hc-1B aagccagugugaaagacau
319 TMPRSS6-h-2A auugaguacacgcagacug
320 TMPRSS6-h-2B cagucugcguguacucaau
321 TMPRSS6-h-3A aaguugauggugaucccgg
322 TMPRSS6-h-3B ccgggaucaccaucaacuu
323 TMPRSS6-hc-4A uucuggaucguccacuggc
324 TMPRSS6-hc-4B gccaguggacgauccagaa
325 TMPRSS6-h-5A auucacagaacagaggaac
326 TMPRSS6-h-5B guuccucuguucugugaau
327 TMPRSS6-h-6A guagucauggcuguccucu
328 TMPRSS6-h-6B agaggacagccaugacuac
329 TMPRSS6-h-7A aguuguaguaaguucccag
330 TMPRSS6-h-7B cugggaacuuacuacaacu
331 TMPRSS6-hcmr-8A uuguacccuaggaaauacc
332 TMPRSS6-hcmr-8B gguauuuccuaggguacaa
333 TMPRSS6-hcm-9A aaccagaagaagcagguga
334 TMPRSS6-hcm-9B ucaccugcuucuucugguu
335 TMPRSS6-hc-10A uaacaacccagcguggaau
336 TMPRSS6-hc-10B auuccacgcuggguuguua
337 TMPRSS6-hc-11A guuucucucauccaggccg
338 TMPRSS6-hc-11B cggccuggaugagagaaac
339 TMPRSS6-hcm-12A gcaucuucugggcuuuggc
340 TMPRSS6-hcm-12B gccaaagcccagaagaugc
341 TMPRSS6-hc-13A ucacacuggaaggugaaug
342 TMPRSS6-hc-13B cauucaccuuccaguguga
343 TMPRSS6-hcmr-14A cacagaugugucgaccccg
344 TMPRSS6-hcmr-14B cggggucgacacaucugug
345 TMPRSS6-hcmr-15A uguacccuaggaaauacca
346 TMPRSS6-hcmr-15B ugguauuuccuaggguaca
347 TMPRSS6-Luc-siRNA-1A ucgaaguauuccgcguacg
348 TMPRSS6-Luc-siRNA-1B cguacgcggaauacuucga
349 TMPRSS6-PTEN-A uaaguucuagcuguggugg
350 TMPRSS6-PTEN-B ccaccacagcuagaacuua
351 GN-TTR-hc-A ucuugguuac augaaauccc a
352 GN-TTR-hc-B ugggauuuca uguaaccaag a
353 STS012-6-A aaccagaagaagcaggugacc
354 control siRNA A uuaguaaaccuuuugagac
355 control siRNA B gucucaaaagguuuacuaa
356 hcTMP-SR1-A cugaggacgcccugggagu
357 hcTMP-SR1-B acucccagggcguccucag
358 hcTMP-SR2-A gcugaggacgcccugggag
359 hcTMP-SR2-B cucccagggcguccucagc
360 hcTMP-SR3-A ugcugaggacgcccuggga
361 hcTMP-SR3-B ucccagggcguccucagca
362 hcTMP-SR4-A gugcugaggacgcccuggg
363 hcTMP-SR4-B cccagggcguccucagcac
364 hcTMP-SR5-A ggugcugaggacgcccugg
365 hcTMP-SR5-B ccagggcguccucagcacc
366 hcTMP-SR6-A gggugcugaggacgcccug
367 hcTMP-SR6-B cagggcguccucagcaccc
368 hcTMP-SR8-A cggggugcugaggacgccc
369 hcTMP-SR8-B gggcguccucagcaccccg
370 hcTMP-SR9-A acggggugcugaggacgcc
371 hcTMP-SR9-B ggcguccucagcaccccgu
372 hcTMP-SR10-A uacggggugcugaggacgc
373 hcTMP-SR10-B gcguccucagcaccccgua
374 hcTMP-SR11-A guacggggugcugaggacg
375 hcTMP-SR11-B cguccucagcaccccguac
376 hcTMP-SR12-A aguacggggugcugaggac
377 hcTMP-SR12-B guccucagcaccccguacu
378 hcTMP-SR13-A aaguacggggugcugagga
379 hcTMP-SR13-B uccucagcaccccguacuu
380 hcTMP-SR15-A ggaaguacggggugcugag
381 hcTMP-SR15-B cucagcaccccguacuucc
382 hcTMP-SR16-A gggaaguacggggugcuga
383 hcTMP-SR16-B ucagcaccccguacuuccc
384 hcTMP-SR17-A ggggaaguacggggugcug
385 hcTMP-SR17-B cagcaccccguacuucccc
386 hcTMP-SR18-A uggggaaguacggggugcu
387 hcTMP-SR18-B agcaccccguacuucccca
388 hcTMP-SR19-A cuggggaaguacggggugc
389 hcTMP-SR19-B gcaccccguacuuccccag
390 hcTMP-SR21-A agcuggggaaguacggggu
391 hcTMP-SR21-B accccguacuuccccagcu
392 hcTMP-SR22-A uagcuggggaaguacgggg
393 hcTMP-SR22-B ccccguacuuccccagcua
394 hcTMP-SR23-A guagcuggggaaguacggg
395 hcTMP-SR23-B cccguacuuccccagcuac
396 hcTMP-SR24-A aguagcuggggaaguacgg
397 hcTMP-SR24-B ccguacuuccccagcuacu
398 hcTMP-SR26-A guaguagcuggggaaguac
399 hcTMP-SR26-B guacuuccccagcuacuac
400 hcTMP-SR27-A aguaguagcuggggaagua
401 hcTMP-SR27-B uacuuccccagcuacuacu
402 hcTMP-SR28-A gaguaguagcuggggaagu
403 hcTMP-SR28-B acuuccccagcuacuacuc
404 hcTMP-SR29-A cgaguaguagcuggggaag
405 hcTMP-SR29-B cuuccccagcuacuacucg
406 hcTMP-SR30-A gcgaguaguagcuggggaa
407 hcTMP-SR30-B uuccccagcuacuacucgc
408 hcTMP-SR31-A ggcgaguaguagcugggga
409 hcTMP-SR31-B uccccagcuacuacucgcc
410 hcTMP-SR32-A gggcgaguaguagcugggg
411 hcTMP-SR32-B ccccagcuacuacucgccc
412 hcTMP-SR33-A ggggcgaguaguagcuggg
413 hcTMP-SR33-B cccagcuacuacucgcccc
414 hcTMP-SR34-A uggggcgaguaguagcugg
415 hcTMP-SR34-B ccagcuacuacucgcccca
416 hcTMP-SR35-A uuggggcgaguaguagcug
417 hcTMP-SR35-B cagcuacuacucgccccaa
418 TMPRSS6-hc-16A uauuccaaagggcagcuga
419 TMPRSS6-hc-16B ucagcugcccuuuggaaua
420 TMPRSS6-hc-17A aucuucugggcuuuggcgg
421 TMPRSS6-hc-17B ccgccaaagcccagaagau
422 TMPRSS6-hc-18A uuuucucuuggaguccuca
423 TMPRSS6-hc-18B ugaggacuccaagagaaaa
424 TMPRSS6-hc-19A gaauagacggagcuggagu
425 TMPRSS6-hc-19B acuccagcuccgucuauuc
426 TMPRSS6-hc-21A uaguagcuggggaaguacg
427 TMPRSS6-hc-21B cguacuuccccagcuacua
428 TMPRSS6-hc-22A agauccugggagaaguggc
429 TMPRSS6-hc-22B gccacuucucccaggaucu
430 TMPRSS6-hc-23A cuguucuggaucguccacu
431 TMPRSS6-hc-23B aguggacgauccagaacag
432 TMPRSS6-hcmr-24A cucaccuugaaggacaccu
433 TMPRSS6-hcmr-24B agguguccuucaaggugag
434 TMPRSS6-hcm-25A aguuucucucauccaggcc
435 TMPRSS6-hcm-25B ggccuggaugagagaaacu
436 TMPRSS6-hcr-26A guacccuaggaaauaccag
437 TMPRSS6-hcr-26B cugguauuuccuaggguac
438 TMPRSS6-hc-27A cuguugacuguggacagca
439 TMPRSS6-hc-27B ugcuguccacagucaacag
440 STS12209V4L4-A uaccagaagaagcagguga
441 STS12209V4L4-B ucaccugcuucuucuggua
442 STS18001-A ucgaaguauuccgcguacg
443 STS18001-B cguacgcggaauacuucga
444 PTEN-2-A caccgccaaaTTTaacTgcaga
445 PTEN-2-B aagggTTTgaTaagTTcTagcTgT
446 PTEN-2-C TgcacagTaTccTTTTgaagaccaTaaccca
447 hTMSS6:379U17 ccgccaaagcccagaag
448 hTMSS6:475L21 ggTcccTccccaaaggaaTag
449 hTMSS6:416U28FL cagcacccgccTgggaacTTacTacaac
Chave 1 = 2’F-dU 2 = 2’F-dA 3 = 2’F-dC 4 = 2’F-dG 5 = 2’OMe-rU 6 = 2’OMe- rA 7 = 2’OMe-rC 8 = 2’OMe-rG T = dT mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato GN = ligante de GalNAc GN de acordo com a figura 8A GN2 = estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B GN3 = estrutura de ligante de GalNAc GN de acordo com a figura 8C GNo = GN2 com fosfodiésteres em vez de (ps)
[A], [T], [C], [G] - DNA {A}, {U}, {C}, {G} - LNA ivA, ivC, ivU, ivG - RNA invertido (3'-3') (ps2) - fosforoditioato vinilfosfonato vinil-(E)-fosfonato FAM - 6-Carboxifluoresceína TAMRA - 5-Carboxitetrametilrodamina
BHQ - Extintor de Orifício Negro 1
[0587] Onde ligantes específicos e/ou ligações modificadas são en- sinados dentro de uma sequência de RNA, tal como PS, PS2, GN, GN2, GN3 etc etc, estas são partes opcionais da sequência, porém, são uma modalidade preferida desta sequência.
[0588] As seguintes abreviações podem ser usadas:
GN GN2
GN3
GNo Mesmo como GN2, porém, com fosfodiésteres em vez de fosforotioatos ST23 (bloco de construção para síntese) ST41/C4XLT (bloco de constru- ção para síntese)
ST43/C6XLT (bloco de constru- ção para síntese) Long trebler/ltrb/STKS (bloco de constru- ção para síntese) [ST23 (ps)]3 GN2 (vide acima) ST41 (ps) [ST23 (ps)]3 GN3 (vide acima) ST43 (ps) ST23(ps) long GN (vide acima)
trebler(ps)

Claims (18)

REIVINDICAÇÕES
1. Combinação que compreende um ácido nucleico para ini- bir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou
442.
2. Combinação para uso no tratamento de hemocromatose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como -talassemia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga transfusional de ferro, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade não relacionada à recidiva associada ao trans- plante de medula óssea, de preferência hemocromatose, caracterizada pelo fato de que a combinação compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita pri- meira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442.
3. Ácido nucleico para uso no tratamento de hemocroma- tose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como -talas- semia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndro- mes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga transfusional de ferro, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkin- son, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade não relacionada à recidiva associada ao transplante de medula óssea, de preferência hemocromatose, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibe a ex- pressão de TMPRSS6, em que o ácido nucleico compreende pelo me- nos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou
442, em que o ácido nucleico é administrado com um ou mais quelantes de ferro.
4. Kit que compreende um ácido nucleico para inibir a ex- pressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou
442.
5. Composição farmacêutica que compreende um ácido nu- cleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356,
358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, em que o ácido nucleico, quelante de ferro ou ambos são combinados com um excipiente fisiologicamente aceitável.
6. Composição farmacêutica para uso no tratamento de he- mocromatose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como -talassemia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética con- gênita, síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga transfusional de ferro, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade não relacionada à reci- diva associada ao transplante de medula óssea, de preferência hemo- cromatose, caracterizada pelo fato de que a composição farmacêutica compreende um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e um ou mais quelantes de ferro, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecio- nada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 333, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, em que o ácido nucleico, quelante de ferro ou ambos são combinados com um excipiente fisiologicamente aceitável.
7. Combinação, de acordo com a reivindicação 1, combina- ção para uso como definida na reivindicação 2, ácido nucleico para uso como definido na reivindicação 3, kit como definido na reivindicação 4, composição como definida na reivindicação 5 ou composição para uso como definida na reivindicação 6, caracterizados pelo fato de que a se- gunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 334, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435.437, 439, 441 ou 443.
8. Combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso como definidos em qual- quer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que o um ou mais quelantes de ferro são selecionados a partir de defe- roxamina, deferiprona, deferasirox (Exjade) e deferairox (Jadenu), opci- onalmente, em que o quelante de ferro é deferiprona.
9. Combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que um ou mais nucleotídeos nas primeira e/ou segunda fitas são modifica- dos para formar nucleotídeos modificados.
10. Combinação, combinação para uso ou ácido nucleico para uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizados pelo fato de que a dita primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e em que a dita segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18: SEQ ID NO: 17 5´aaccagaagaagcagguga 3´ 6273646282647284546 SEQ ID NO: 18 5´ucaccugcuucuucugguu 3´ 1727354715351718451 em que as modificações específicas são representadas pe- los seguintes números: 1=2´F-dU, 2=2‘F-dA, 3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.
11. Combinação que compreende um ácido nucleico para ini- bir a expressão de TMPRSS6 e deferiprona, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compreende pelo menos uma por- ção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a primeira fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18.
12. Combinação para uso no tratamento de hemocromatose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como -talassemia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga transfusional de ferro, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkinson, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade não relacionada à recidiva associada ao trans- plante de medula óssea, de preferência hemocromatose,
caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nu- cleico para inibir a expressão de TMPRSS6 e deferiprona, em que o ácido nucleico compreende pelo menos uma região duplex que compre- ende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente comple- mentar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcial- mente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a primeira fita compreende a se- quência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compre- ende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18.
13. Ácido nucleico para uso no tratamento de hemocroma- tose, porfiria cutânea tardia, transtornos sanguíneos, tais como -talas- semia ou anemia falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndro- mes de insuficiência medular, mielodisplasia, sobrecarga transfusional de ferro, um transtorno associado à sobrecarga de ferro, mal de Parkin- son, mal de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich associada à sobrecarga de ferro e infecções e mortalidade não relacionada à recidiva associada ao transplante de medula óssea, de preferência hemocromatose, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico inibe a ex- pressão de TMPRSS6, em que o ácido nucleico compreende pelo me- nos uma região duplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a dita primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene de TMPRSS6, em que a primeira fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 18, e em que o ácido nucleico é administrado com deferiprona.
14. Combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que o ácido nucleico e um ou mais quelantes de ferro são administrados si- multânea, separada ou sequencialmente.
15. Combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que o ácido nucleico é conjugado a um ligante, opcionalmente na extremidade 5' da segunda fita, opcionalmente em que o ligante compreende (i) uma ou mais porções de N-acetil galactosamina (GalNAc) e derivados da mesma e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções de Gal- NAc ao ácido nucleico.
16. Combinação, combinação para uso, ácido nucleico para uso, kit, composição ou composição para uso de acordo com a reivindi- cação 15, caracterizados pelo fato de que o ácido nucleico conjugado tem a estrutura:
em que Z é um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
17. Combinação, combinação para uso ou ácido nucleico para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou um ácido nucleico conjugado de acordo com as reivindicações 15-16, ca- racterizados pelo fato de que o ácido nucleico é estabilizado na extre- midade 5' e/ou 3' de uma ou ambas as fitas, opcionalmente em que o ácido nucleico compreende duas ligações de fos- forotioato entre cada um dos três nucleotídeos 3' terminais e entre cada um dos três nucleotídeos 5' terminais na primeira fita e duas ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3' da segunda fita, que têm a estrutura: 5’-3’ TMPRSS6-hcm-9A 6 (ps) 2 (ps) 736462826472845 (ps) 4 (ps) 6 5’-3’ TMPRSS6-hcm-9B 17273547153517184 (ps) 5 (ps) 1 em que as modificações específicas são representadas pe- los seguintes números: 1=2´F-dU, 2=2‘F-dA,
3=2´F-dC, 4=2´F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG (ps) = ligação de fosforotioato.
18. Método de tratamento de uma doença ou transtorno, ca- racterizado pelo fato de que compreende administrar uma combinação que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado e um ou mais quelantes de ferro, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes a um indivíduo que precisa de tratamento.
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