BR112019019921B1 - Ácido nucleico, ácido nucleico conjugado e composições para inibir a expressão de tmprss6 - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nucleico que interferem na expressão do gene TMPRSS6 ou inibem sua expressão e usos terapêuticos, tal como no tratamento de hemocromatose, porfiria e distúrbios do sangue, tais como β-talassemias, doença falciforme e sobrecarga transfusional de ferro ou síndrome mielodisplásica.

Description

[001] A presente invenção refere-se a produtos e composições e seus usos. Em particular, a invenção refere-se a produtos de ácido nucleico que interferem com a expressão do gene TMPRSS6 ou inibem sua expressão e usos terapêuticos, tais como para o tratamento de hemocromatose, porfiria e doenças do sangue, como β- talassemia, doença falciforme e sobrecarga transfusional de ferro.

Antecedentes

[002] Demonstrou-se que o RNA de fita dupla (dsRNA) capaz de ligar complementarmente o mRNA expresso é capaz de bloquear a expressão gênica (Fire et al., 1998, Nature. 1998 19 de fev.; 391 (6669): 806-11 e Elbashir et al., 2001, Nature. 2001 24 de maio; 411 (6836): 494-8) por um mecanismo que foi denominado interferência de RNA (RNAi). Os dsRNAs curtos direcionam o silenciamento pós- transcricional específico do gene em muitos organismos, incluindo os vertebrados, e se tornaram uma ferramenta útil para o estudo da função do gene. O RNAi é mediado pelo complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), uma nuclease de múltiplos componentes específica de sequência que destrói RNAs mensageiros homólogos ao gatilho de silenciamento carregado no complexo RISC. RNA interferente (iRNA), como siRNAs, RNA antissenso e micro-RNA são oligonucleotídeos que impedem a formação de proteínas por silenciamento de genes, isto é, inibem a translação gênica da proteína através da degradação de moléculas de mRNA. Os agentes silenciadores de genes estão se tornando cada vez mais importantes para aplicações terapêuticas na medicina.

[003] De acordo com Watts e Corey no Journal de Pathology (2012; Vol 226, pp. 365-379), existem algoritmos que podem ser usados para projetar gatilhos de silenciamento de ácidos nucleicos, mas todos eles têm limitações sérias. Pode levar vários métodos experimentais para identificar potentes siRNAs, pois os algoritmos não levam em conta fatores como a estrutura terciária do mRNA alvo ou o envolvimento de proteínas de ligação ao RNA. Portanto, a descoberta de um potente gatilho de silenciamento de ácido nucleico com efeitos mínimos fora do alvo é um processo complexo. Para o desenvolvimento farmacêutico dessas moléculas altamente carregadas, é necessário que elas possam ser sintetizadas economicamente, distribuídas nos tecidos alvo, entrar nas células e funcionar dentro dos limites aceitáveis de toxicidade.

[004] Matriptase-2 (MT-2) é o produto do gene TMPRSS6. A MT- 2 é uma serina protease transmembranar tipo II que desempenha um papel crítico na regulação da homeostase do ferro. A MT-2 é um regulador negativo para a expressão gênica do hormônio peptídico hepcidina. A hepcidina é predominantemente produzida e secretada pelo fígado. A hepcidina regula o equilíbrio de ferro no organismo, agindo como um regulador negativo da absorção e liberação de ferro gastrointestinal do ferro pelas reservas celulares. A regulação positiva da hepcidina leva a uma redução na disponibilidade de ferro no organismo (McDonald et al., American Journal de Physiology, 2015, vol 08 no. 7, C539-C547). Os níveis de hepcidina são baixos em pacientes com sobrecarga de ferro. Portanto, um possível alvo para reduzir a sobrecarga de ferro é aumentar a Hepcidina silenciando a expressão do gene TMPRSS6 no fígado.

[005] O TMPRSS6 é expresso principalmente no fígado, embora altos níveis de mRNA do TMPRSS6 também sejam encontrados no rim, com níveis mais baixos no útero e quantidades muito menores detectadas em muitos outros tecidos (Ramsay et al., Haematologica (2009), 94 (* 6).), 84-849).

[006] Vários distúrbios estão associados à sobrecarga de ferro, uma condição caracterizada pelo aumento dos níveis sanguíneos e teciduais de ferro, como hemocromatose hereditária, porfiria cutânea tarda e distúrbios do sangue, como • -talassemia, anemia sideroblástica congênita (CSA), anemia disertropoiética congênita (CDA), síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia e doença falciforme (DF). Além disso, todas as populações de pacientes que recebem transfusões regulares de sangue correm risco de desenvolver sobrecarga transfusional de ferro (Coates, Free Rad Biol Med 2014, v. 72, 23-40, Bulaj et al., Blood 2000, v. 95, 1565-71). Tanto um artigo de Nai et al (Blood, 2012, v. 119, n. 21, p 5021-5027) quanto Guo et al (The Journal de Clinical Investigation, 2013, v. 123, n. 4, pp. 15311541) mostram como uma deleção ou redução da expressão de TMPRSS6 foi eficaz no tratamento da β-talassemia em camundongos. Um artigo de Schmidt (2013, Blood, Vol 121, 7, pp. 1200-1208) explora o uso do ácido nucleico de TMPRSS6 para diminuir a sobrecarga de ferro em modelos de camundongos com hemocromatose hereditária e β-talassemia. Em ambos os modelos, os autores determinaram que as nanopartículas lipídicas - tratamento com ácido nucleico de TMPRSS6 induziam hepcidina e diminuíam os níveis de ferro e tecido sérico por até 21 dias. Além disso, um artigo de Schmidt et al. (American Journal de Hematology, 2015, Vol 90, No. 4, p 310-313) demonstrou que o ácido nucleico de LNP-TMPRSS6 mais a terapia oral com deferiprona com quelante de ferro oral reduziam a sobrecarga de ferro secundária no modelo de camundongos de β-talassemia.

[007] Por conseguinte, atualmente são necessários métodos para o tratamento eficaz de distúrbios associados à sobrecarga de ferro e a presente invenção trata dessa necessidade.

[008] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 327, 331, 331, 331, 333, 335, 337, 339 , 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396 , 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442 ou o primeira fita compreende uma sequência selecionada a partir das SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 1 29.133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11 , 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163 , 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215.

[009] Um outro aspecto relacionado da invenção é um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs 318, 320, 322, 324 , 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383 , 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433 , 435,437, 439, 441 ou 443, ou a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 , 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, como uma sequência selecionada dentre as seguintes: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.

[0010] Certos ácidos nucleicos são preferidos em todos os aspectos da invenção. Em particular:

[0011] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 333 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 334.

[0012] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:17 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:18, isto é:

[0013] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:422 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:423.

[0014] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:199 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:200.

[0015] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:429 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:430.

[0016] A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:207 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:208.

[0017] Um ácido nucleico pode ser aqui descrito em uma associação de listagem de sequências com um ligante(linker) e/ou ligante(ligand) específico, mas qualquer referência ao ligante ou ligante no contexto da listagem de sequências é opcional, embora essas características sejam preferidas. Certos ligantes preferidos são descritos em combinação com certas sequências de ácidos nucleicos.

[0018] A primeira fita e/ou a referida segunda fita podem ter, cada um, 17-35 nucleotídeos de comprimento e pelo menos uma região dúplex pode ter 10-25 nucleotídeos de comprimento. O dúplex pode compreender duas fitas separados ou pode compreender uma única fita que compreende a primeira fita e a segunda fita.

[0019] O ácido nucleico pode: a) ter extremidades cegas nas duas extremidades; b) ter uma saliência em uma extremidade e uma extremidade cega na outra; ou c) ter uma saliência nas duas extremidades.

[0020] Um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita podem ser modificados. Um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da primeira fita podem ser modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação nos um ou mais nucleotídeos numerados ímpares. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados pares modificados pode ser adjacente a pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados ímpares modificados.

[0021] Uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita pode ser modificada no ácido nucleico da invenção. Uma pluralidade de nucleotídeos numerados pares na primeira fita pode ser modificada por uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação diferente.

[0022] Um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da segunda fita pode ser modificado por uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da segunda fita pode ser modificado pela mesma modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados pares modificados da segunda fita pode ser adjacente a um ou mais nucleotídeos numerados ímpares modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma modificação comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos numerados pares pode ser modificada pela mesma modificação que está presente nos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita. Uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares na segunda fita pode ser modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita.

[0023] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum, que pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita.

[0024] No ácido nucleico da invenção, cada um dos nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita e cada um dos nucleotídeos pares na segunda fita pode ser modificado com uma modificação comum e, cada um dos nucleotídeos numerados pares pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos ímpares numerados pode ser modificado na segunda fita com uma segunda modificação diferente.

[0025] O ácido nucleico da invenção pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados em pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de maneira diferente da segunda fita.

[0026] A modificação e/ou modificações podem cada uma e individualmente ser selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metila, uma modificação 2'-desóxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2'-alquila, uma modificação de morfolino, uma modificação de fosforamidato, modificação do grupo 5'- fosforotioato, uma modificação imitadora de fosfato 5' ou 5' e uma derivada de colesteril ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado podem ser qualquer um de um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.

[0027] Pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metila e/ou pelo menos uma modificação pode ser 2'-F.

[0028] A invenção fornece ainda, como um segundo aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442; ou selecionada de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125 , 127, 129.133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179 , 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231 , 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279 , 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tais como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215,

[0029] em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por primeira modificação nos nucleotídeos numerados ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos numerados pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos numerados pares e modificados por um quarta modificação, os nucleotídeos numerados ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação.

[0030] A invenção fornece ainda, como um segundo aspecto relacionado, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida segunda fita pode compreender uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID no 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 419, 421, 423, 425, 427, 429 , 431, 433, 435,437, 439, 441 ou 443, ou selecionada na SEQ ID no 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como uma sequência selecionada dentre as seguintes: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140 , 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190 , 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por primeira modificação nos nucleotídeos numerados ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos numerados pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos numerados pares e modificados por um quarta modificação, os nucleotídeos numerados ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação.

[0031] A terceira modificação e a primeira modificação podem ser as mesmas e/ou a segunda modificação e a quarta modificação pode ser a mesma.

[0032] A primeira modificação pode ser 2'OMe e a segunda modificação pode ser 2'F.

[0033] No ácido nucleico de qualquer aspecto, por exemplo, o segundo aspecto, a primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 17 e a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 18. A sequência e as modificações podem ser mostradas na tabela abaixo: em que as modificações específicas são representadas pelos seguintes números 1=2'F-dU, 2=2‘F-dA, 3=2'F-dC, 4=2'F-dG, 5=2'-OMe-rU; 6=2'-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.

[0034] Como ensinado acima, estas são sequências preferidas, juntamente com as outras sequências preferidas.

[0035] Um ácido nucleico da invenção pode compreender uma ligação de fosforotioato entre o terminal um, dois ou três nucleotídeos 3’ e/ou um dois ou três nucleotídeos 5' do primeiro e/ou da segunda fita. Pode compreender duas ligações de fosforotioato entre cada um dos três 3' terminais e entre cada um dos três nucleotídeos de 5’ terminais na primeira fita e duas ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3’ da segunda fita.

[0036] Um tal ácido nucleico pode ser conjugado com um ligante.

[0037] A invenção fornece ainda, como um terceiro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências, SEQ ID Nos: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 353 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372 , 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422 , 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442; ou selecionado de SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125 , 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 , 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229 , 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277 , 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tais como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, e em que o ácido nucleico é conjugado com um ligante.

[0038] A invenção fornece ainda, como um aspecto relacionado adicional, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências, SEQ ID Nos 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373 , 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423 , 425, 427, 429, 431, 433, 435,437, 439, 441 ou 443, ou a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID no 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 , 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168 , 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218 , 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272 , 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 31 0, 312, 314 ou 316, como uma sequência selecionada dentre as seguintes: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216, e em que o ácido nucleico é conjugado com um ligante.

[0039] O ligante pode compreender (i) uma ou mais porções N- acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc a uma sequência conforme definido em quaisquer aspectos anteriores. O ligante pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotídeos podem ser modificados como aqui definido.

[0040] O ligante pode compreender a fórmula I: [S-X1-β-X2]3-A-ligante- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetyl galactosamina; X1 representa C3-C6alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno da fórmula (-CH2)n- O-CH2- onde n = 1 - 6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade em ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado para X3 por meio de um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato).

[0041] A presente invenção, portanto, fornece adicionalmente um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas em que Z representa um ácido nucleico conforme aqui definido anteriormente.

[0042] Alternativamente, um ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser conjugado para um ligante da seguinte estrutura

[0043] A invenção também fornece uma composição compreendendo um ácido nucleico conforme aqui definido e uma formulação compreendendo: i) um lipídeo catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídeo PEGuilado.

[0044] O teor do componente lipídico catiônico na formulação pode ser de cerca de 55 % em mol a cerca de 65 % em mol do teor lipídico total da formulação lipídica, preferivelmente cerca de 59 % em mol do teor lipídico total da formulação lipídica.

[0045] A formulação pode compreender um lipídeo catiônico tendo a estruturaum esteroide tendo a estruturaum fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina tendo a estruturae um lipídeo PEGuilado tendo a estrutura

[0046] A invenção também fornece uma composição compreendendo um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de qualquer aspecto da invenção e um excipiente fisiologicamente aceitável.

[0047] Também é fornecido um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio e/ou na fabricação de um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio.

[0048] A invenção fornece um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer aspecto da invenção a um indivíduo necessitado de tratamento. O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser administrado ao indivíduo por via subcutânea, intravenosa ou usando outras vias de aplicação, como oral, retal ou intraperitoneal.

[0049] A doença ou distúrbio pode ser selecionado a partir do grupo que compreende hemocromatose, porfiria cutânea e doenças do sangue, como β-talassemia ou doença das células falciformes, anemia diseritropoiética congênita, síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia e sobrecarga transfusional de ferro. O distúrbio pode estar associado à sobrecarga de ferro e o distúrbio associado à sobrecarga de ferro pode ser a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer ou a ataxia de Friedreich.

[0050] Um método de produção de um ácido nucleico ou um ácido nucleico conjugado de acordo com a invenção também está incluído.

Descrição Detalhada da Invenção

[0051] A presente invenção refere-se a um ácido nucleico que é de fita dupla e direcionado a uma transcrição de RNA expresso de TMPRSS6 e suas composições. Estes ácidos nucleicos podem ser utilizados no tratamento de uma variedade de doenças e distúrbios em que é desejável uma expressão reduzida do produto do gene TMPRSS6.

[0052] Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos: 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, ou selecionada a partir das SEQ ID NOs 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, como SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215.

[0053] Por ácido nucleico, entende-se um ácido nucleico compreendendo duas fitas compreendendo nucleotídeos, capazes de interferir na expressão gênica. A inibição pode ser completa ou parcial e resulta na regulação negativa da expressão gênica de maneira direcionada. O ácido nucleico compreende duas fitas polinucleotídicas separadas; a primeira fita, que também pode ser uma fita guia; e uma segunda fita, que também pode ser uma fita passageira. A primeira fita e a segunda fita podem fazer parte da mesma molécula polinucleotídica que é autocomplementar que 'se dobra' para formar uma molécula de fita dupla. O ácido nucleico pode ser uma molécula de siRNA.

[0054] O ácido nucleico pode compreender ribonucleotídeos, ribonucleotídeos modificados, desoxinucleotídeos, desoxirribonucleotídeos ou análogos de nucleotídeos. O ácido nucleico pode ainda compreender uma porção de ácido nucleico de fita dupla ou região dúplex formada por toda ou uma porção da primeira fita (também conhecida na técnica como fita guia) e toda ou uma porção da segunda fita (também conhecida na técnica como fita passageira). A região dúplex é definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a segunda fita, inclusive.

[0055] Por região dúplex, entende-se a região em dois oligonucleotídeos complementares ou substancialmente complementares que formam pares de bases com um outro, por emparelhamento de bases de Watson-Crick ou de qualquer outra maneira que permita a formação de um dúplex entre as fitas de oligonucleotídeos que são complementares ou substancialmente complementares. Por exemplo, uma fita de oligonucleotídeo com 21 unidades de nucleotídeo pode emparelhar com outro oligonucleotídeo de 21 unidades de nucleotídeo, mas apenas 19 nucleotídeos em cada fita são complementares ou substancialmente complementares, de modo que a "região dúplex" consiste em 19 pares de bases. Os pares de bases restantes podem existir como saliências de 5’ e 3' ou como regiões de fita dupla. Além disso, na região dúplex, 100 % de complementaridade não é necessária; complementaridade substancial é permitida dentro de uma região dúplex. Complementaridade substancial refere-se à complementaridade entre as fitas, de modo que elas sejam capazes de se recozer sob condições biológicas. Técnicas para determinar empiricamente se duas vertentes são capazes de emparelhar em condições biológicas são bem conhecidas na técnica. Alternativamente, duas fitas podem ser sintetizadas e adicionadas em condições biológicas para determinar se elas se recozem uma à outra.

[0056] A porção da primeira fita e da segunda fita que formam pelo menos uma região dúplex pode ser totalmente complementar e pelo menos parcialmente complementar entre si.

[0057] Dependendo do comprimento de um ácido nucleico, não é necessariamente uma combinação perfeita em termos de complementaridade de bases entre a primeira fita e a segunda fita. No entanto, a primeira e a segunda fitas devem ser capazes de hibridar em condições fisiológicas.

[0058] A complementaridade entre a primeira fita e a segunda fita na pelo menos uma região dúplex pode ser perfeita, pois não há incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionais / excluídos em qualquer fita. Alternativamente, a complementaridade pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de pelo menos 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %.

[0059] A primeira fita e a segunda fita podem cada uma compreender uma região de complementaridade que compreende pelo menos 15 nucleotídeos contíguos que diferem em não mais que 3 nucleotídeos de qualquer uma das sequências listadas na Tabela 1.

[0060] Um aspecto relacionado da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeos selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID n°s 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373 , 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423 , 425, 427, 429, 431, 433, 435.437, 439, 441 ou 443, ou selecionada de SEQ ID n°s 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101 , 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202 , 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256 , 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312 , 314 ou 316, como uma sequência selecionada dentre as seguintes: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140 , 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190 , 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.

[0061] Adequadamente, em qualquer aspecto da invenção, a segunda e a primeira estão juntas, qualquer um dos pares complementares de ácidos nucleicos aqui descritos, como os das SEQ ID 1 e 2, 3 e 4, etc.

[0062] A combinação de ácidos nucleicos consistindo em SEQ ID 17 e 18 é uma combinação preferida, como é SEQ 199 com 200 e SEQ ID 207 com 208.

[0063] O ácido nucleico envolve a formação de uma região dúplex entre toda ou uma porção da primeira fita e uma porção do ácido nucleico alvo, TMPRSS6. A porção do ácido nucleico alvo que forma uma região dúplex com a primeira fita, definida como começando com o primeiro par de bases formado entre a primeira fita e a sequência- alvo e terminando com o último par de bases formado entre a primeira fita e a sequência-alvo, inclusive, é a sequência-alvo de ácido nucleico ou simplesmente, sequência-alvo. A região dúplex formada entre a primeira fita e a segunda fita não precisa ser igual à região dúplex formada entre a primeira fita e a sequência-alvo. Ou seja, a segunda fita pode ter uma sequência diferente a partir da sequência-alvo, no entanto, a primeira fita deve ser capaz de formar uma estrutura dúplex com a segunda fita e a sequência-alvo.

[0064] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência- alvo pode ser perfeita (sem incompatibilidade de nucleotídeos ou nucleotídeos adicionais / excluídos em qualquer ácido nucleico).

[0065] A complementaridade entre a primeira fita e a sequência- alvo pode não ser perfeita. A complementaridade pode ser de cerca de 70 % a cerca de 100 %. Mais especificamente, a complementaridade pode ser pelo menos 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % ou um valor intermediário.

[0066] A identidade entre a primeira fita e a sequência complementar da sequência-alvo pode ser de cerca de 75 % a cerca de 100 %. Mais especificamente, a complementaridade pode ser de pelo menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %, ou um valor intermediário, desde que um ácido nucleico seja capaz de reduzir ou inibir a expressão de TMPRSS6.

[0067] Um ácido nucleico com complementaridade inferior a 100 % entre a primeira fita e a sequência-alvo pode ser capaz de reduzir a expressão de TMPRSS6 para o mesmo nível que um ácido nucleico com complementaridade perfeita entre a primeira fita e a sequência- alvo. Como alternativa, ele pode reduzir a expressão de TMPRSS6 para um nível de 15 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ou 100 % do nível de expressão alcançada pelo ácido nucleico com perfeita complementaridade.

[0068] O ácido nucleico pode compreender uma primeira fita e uma segunda fita com 19-25 nucleotídeos de comprimento. A primeira fita e a segunda fita podem ter comprimentos diferentes.

[0069] O ácido nucleico pode ter 15-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-23 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 17-25 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 23-24 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 19-21 pares de nucleotídeos de comprimento. O ácido nucleico pode ter 2123 pares de nucleotídeos de comprimento.

[0070] O ácido nucleico pode compreender uma região dúplex que consiste em 19-25 pares de bases de nucleotídeos. A região dúplex pode consistir em 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 pares de bases que podem ser contíguos.

[0071] O ácido nucleico pode compreender uma sequência de primeira fita da SEQ ID NO: 17. O ácido nucleico pode compreender uma sequência de segunda fita da SEQ ID NO: 18. O ácido nucleico da invenção pode compreender SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18.

[0072] Em um aspecto adicional, o ácido nucleico, como aqui descrito, pode reduzir a expressão de TMPRSS6 em uma célula em pelo menos 15 % em comparação com o nível observado na ausência de um inibidor, que pode ser o ácido nucleico. Todos os recursos preferenciais de qualquer um dos aspectos anteriores também se aplicam a esse aspecto. Em particular, a expressão de TMPRSS6 em uma célula pode ser reduzida para 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 % ou menos, e valores intermediários, do que o observado na ausência de um inibidor (que pode ser o ácido nucleico).

[0073] A invenção também se refere a qualquer primeira fita ou qualquer segunda fita de ácido nucleico, como aqui descrito, que compreende não mais do que 2 alterações de base quando comparadas com a sequência específica ID fornecida. Por exemplo, uma base pode ser alterada dentro de qualquer sequência.

[0074] Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotídeo mais 5' da (primeira) fita antissenso. Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotídeo mais 3’ da (primeira) fita antissenso. Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotídeo mais 5’ da (segunda) fita de senso. Em uma modalidade, a alteração pode ser feita no nucleotídeo mais 3’ da (segunda) fita de senso.

[0075] Em uma modalidade, a alteração é feita no nucleotídeo mais 5’ da (primeira) fita antissenso. A base do nucleotídeo 5 'pode ser alterada para qualquer outro nucleotídeo. Um A ou um U na extremidade 5' é o preferido, e um A ou um U é ensinado aqui como a potencial base terminal 5' para todas as sequências antissenso (primeira fita) descritas aqui.

Saliências

[0076] O ácido nucleico pode ter extremidades cegas nas duas extremidades; ter uma saliência em uma extremidade e uma extremidade cega na outra extremidade; ou tem uma saliência nas duas extremidades.

[0077] Uma "saliência", quando aqui utilizado, tem seu significado normal e habitual na técnica, isto é, uma porção de fita dupla de um ácido nucleico que se estende além do nucleotídeo terminal de uma fita complementar em um ácido nucleico de fita dupla. O termo "extremidade cega" inclui ácido nucleico de fita dupla, pelo qual ambas as fitas terminam na mesma posição, independentemente de os nucleotídeos terminais estarem emparelhados com a base. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega pode ser emparelhado com a base. O nucleotídeo terminal de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega não pode ser emparelhado. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega podem ser emparelhados com a base. Os dois nucleotídeos terminais de uma primeira fita e uma segunda fita em uma extremidade cega não podem ser emparelhados.

[0078] O ácido nucleico pode ter uma saliência em uma extremidade e uma extremidade cega na outra. O ácido nucleico pode ter uma saliência nas duas extremidades. O ácido nucleico pode ser extremidade cega em ambas as extremidades. O ácido nucleico pode ser de extremidade cega no final com a extremidade 5’ da primeira fita e a extremidade 3' da segunda fita ou na extremidade 3’ da primeira fita e na extremidade 5' da segunda fita.

[0079] O ácido nucleico pode compreender uma saliência na extremidade 3’ ou 5'. O ácido nucleico pode ter uma saliência em 3' na primeira fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência em 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência de 5’ na primeira fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência de 5’ na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência nas extremidades 5’ e 3' da primeira fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência na extremidade 5’ e na extremidade 3' da segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência de 5’ na primeira fita e uma saliência em 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência em 3’ na primeira fita e uma saliência de 5' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência em 3’ na primeira fita e uma saliência em 3' na segunda fita. O ácido nucleico pode ter uma saliência de 5’ na primeira fita e uma saliência de 5' na segunda fita.

[0080] Uma saliência na extremidade 3’ ou na extremidade 5' da segunda fita ou na primeira fita pode ser selecionada de consistir em 1, 2, 3, 4 e 5 nucleotídeos de comprimento. Opcionalmente, uma saliência pode consistir em 1 ou 2 nucleotídeos, que podem ou não ser modificados.

Modificações

[0081] Polinucleotídeos não modificados, particularmente ribonucleotídeos, podem ser propensos à degradação por nucleases celulares e, como tal, modificações / nucleotídeos modificados podem ser incluídos no ácido nucleico da invenção.

[0082] Um ou mais nucleotídeos na segunda e/ou primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados.

[0083] As modificações do ácido nucleico da presente invenção geralmente fornecem uma ferramenta poderosa para superar possíveis limitações, incluindo, mas não se limitando a, estabilidade e biodisponibilidade in vitro e in vivo inerentes às moléculas de RNA nativas. O ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser modificado por modificações químicas. O ácido nucleico modificado também pode minimizar a possibilidade de induzir atividade de interferon em seres humanos. A modificação pode melhorar ainda mais a liberação funcional de um ácido nucleico para uma célula-alvo. O ácido nucleico modificado da presente invenção pode compreender um ou mais ribonucleotídeos quimicamente modificados de um ou ambos da primeira fita ou da segunda fita. Um ribonucleotídeo pode compreender uma modificação química das porções base, açúcar ou fosfato. O ácido ribonucleico pode ser modificado por substituição ou inserção com análogos de ácidos nucleicos ou bases.

[0084] Será apreciado que a descrição de um ácido nucleico modificado, em particular como um RNA modificado, forneça uma descrição da sequência de ácido nucleico "primária" e também as modificações dessa sequência. Uma listagem de sequências fornece, assim, as informações na sequência primária de ácido nucleico e também uma sequência modificada. Para evitar dúvidas, a invenção refere-se a sequências de ácidos nucleicos não modificadas, parcialmente modificadas e a quaisquer sequências para as quais as modificações foram completamente definidas.

[0085] Um ou mais nucleotídeos de um ácido nucleico da presente invenção podem ser modificados. O ácido nucleico pode compreender pelo menos um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita. O nucleotídeo modificado pode estar na região dúplex. O nucleotídeo modificado pode estar fora da região dúplex, isto é, em uma região de fita única. O nucleotídeo modificado pode estar na primeira fita e pode estar fora da região dúplex. O nucleotídeo modificado pode estar na segunda fita e pode estar fora da região dúplex. O nucleotídeo 3'-terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 3'-terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5'-terminal da primeira fita pode ser um nucleotídeo modificado. O nucleotídeo 5'-terminal da segunda fita pode ser um nucleotídeo modificado.

[0086] Um ácido nucleico da invenção pode ter 1 nucleotídeo modificado ou um ácido nucleico da invenção pode ter cerca de 2-4 nucleotídeos modificados, ou um ácido nucleico pode ter cerca de 4-6 nucleotídeos modificados, cerca de 6-8 nucleotídeos modificados, cerca de 8-10 nucleotídeos modificados, cerca de 10-12 nucleotídeos modificados, cerca de 12-14 nucleotídeos modificados, cerca de 14-16 nucleotídeos modificados cerca de 16-18 nucleotídeos modificados, cerca de 18-20 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 20-22 nucleotídeos modificados, cerca de 22-24 modificados nucleótidos, 24-26 nucleótidos modificados ou cerca de 26-28 nucleótidos modificados. Em cada caso, o ácido nucleico compreendendo os referidos nucleotídeos modificados retém pelo menos 50 % de sua atividade em comparação com o mesmo ácido nucleico, mas sem os referidos nucleotídeos modificados. O ácido nucleico pode reter 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % ou um valor intermediário de sua atividade em comparação com o mesmo ácido nucleico, mas sem os referidos nucleotídeos modificados, ou pode têm mais de 100 % da atividade do mesmo nucleotídeo sem os referidos nucleotídeos modificados.

[0087] O nucleotídeo modificado pode ser uma purina ou uma pirimidina. Pelo menos metade das purinas pode ser modificada. Pelo menos metade das pirimidinas pode ser modificada. Todas as purinas podem ser modificadas. Todas as pirimidinas podem ser modificadas. Os nucleotídeos modificados podem ser selecionados do grupo que consiste em um nucleotídeo de desoxitimina (dT) 3'-terminal, um nucleotídeo modificado em 2'-O-metila, um nucleotídeo modificado em 2’, um nucleotídeo modificado em 2'-desóxi, um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico, um nucleotídeo modificado em 2'- amino, um nucleotídeo modificado em 2'-alquila, um nucleotídeo morfolino, um fosforamidato, uma base não natural compreendendo nucleotídeo, um nucleotídeo compreendendo um grupo 5'- fosforotioato, um nucleotídeo compreendendo um imitador de fosfato 5’ ou 5' e um nucleotídeo terminal ligado a um derivado de colesteril ou a um grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico.

[0088] O ácido nucleico pode compreender um nucleotídeo compreendendo um nucleotídeo modificado, em que a base é selecionada de 2-aminoadenosina, 2,6-diaminopurina, inosina, piridin- 4-ona, piridin-2-ona, fenil, pseudouracila, 2, 4, 6-trimetoxibenzeno, 3- metil uracila, di-hidrouridina, naftila, aminofenila, 5-alquilcitidina (por exemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridina (por exemplo, ribotimidina), 5- halouridina (por exemplo, 5-bromouridina), 6-azapirimidina, 6- alquilpirimidina (por exemplo, 6-metiluridina), propina, quesosina, 2- tiouridina, 4-tiouridina, wybutosina, wybutoxosina, 4-acetilcitidina, 5- (carbóxi-hidroximetil)uridina, 5'-carboximetilaminometil-metil-2- tiouridina, 5-carboximetilaminometiluridina beta-D-galactosilqueosina, 1-metiladenosina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanosina, 3-metilcitidina, 2-metiladenosina, 2-metilguanosina, N6-metiladenosina, 7- metilguanosina, 5-metoxiaminometil-2-tiouridina, 5 - metilaminometiluridina, 5-metilcarbonilmetiluridina, 5-metiloxiuridina, 5- metil-2-tiouridina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenosina, beta-D- manosilqueosina, ácido uridina-5-oxiacético e 2-tiocitidina.

[0089] Os ácidos nucleicos discutidos aqui incluem RNA não modificado, bem como RNA que foi modificado, por exemplo, para melhorar a eficácia, e polímeros de substitutos de nucleosídeos. RNA não modificado refere-se a uma molécula na qual os componentes do ácido nucleico, nomeadamente açúcares, bases e porções fosfato, são iguais ou essencialmente iguais aos que ocorrem na natureza, por exemplo, como ocorrem naturalmente no corpo humano. O nucleotídeo modificado quando aqui utilizado refere-se a um nucleotídeo no qual um ou mais dos componentes do ácido nucleico, ou seja, açúcares, bases e porções fosfato, são diferentes dos que ocorrem na natureza. Embora sejam referidos como nucleotídeos modificados, é claro que, devido à modificação, incluem moléculas que não são nucleotídeos, por exemplo, moléculas polinucleotídicas nas quais a estrutura do ribofosfato é substituída por uma construção de não ribofosfato que permite a hibridização entre as fitas, ou seja, nucleotídeos modificados imitam a estrutura do ribofosfato.

[0090] Muitas das modificações descritas abaixo que ocorrem dentro de um ácido nucleico serão repetidas dentro de uma molécula de polinucleotídeo, como uma modificação de uma base, ou uma porção de fosfato, ou o O não ligante de uma porção de fosfato. Em alguns casos, a modificação ocorrerá em todas as posições / nucleotídeos possíveis no polinucleotídeo, mas em muitos casos não ocorrerá. Uma modificação pode ocorrer apenas na posição terminal 3’ ou 5', somente nas regiões terminais, como em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4, 5 ou 10 nucleotídeos de uma fita. Uma modificação pode ocorrer em uma região de fita dupla, em uma região de fita única ou em ambas. Uma modificação pode ocorrer apenas na região de fita dupla de um ácido nucleico da invenção ou pode ocorrer apenas em uma região de fita única de um ácido nucleico da invenção. Uma modificação de fosforotioato em uma posição de O não ligante pode ocorrer apenas em um ou em ambos os terminais, pode ocorrer apenas em uma região terminal, por exemplo, em uma posição em um nucleotídeo terminal ou nos últimos 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos de uma fita, ou pode ocorrer em regiões dúplex e/ou em fita dupla, particularmente nas extremidades. As extremidades 5’ ou 3' podem ser fosforiladas.

[0091] A estabilidade de um ácido nucleico da invenção pode ser aumentada pela inclusão de bases particulares em saliências, ou pela inclusão de nucleotídeos modificados, em saliências de fita dupla, por exemplo, em uma saliência de 5’ ou 3', ou em ambas. Os nucleotídeos de purina podem ser incluídos em saliências. Todas ou algumas das bases em uma saliência em 3’ ou 5' podem ser modificadas. As modificações podem incluir o uso de modificações no grupo 2'OH do açúcar ribose, o uso de desoxirribonucleotídeos, em vez de ribonucleotídeos, e modificações no grupo fosfato, como modificações de fosforotioato. Os saliências não precisam ser homólogas com a sequência-alvo.

[0092] As saliências 5’ ou 3' - na fita de senso, fita antissenso ou ambas as fitas do agente dsRNA da invenção podem ser fosforiladas. Em algumas modalidades, a região saliente contém dois nucleotídeos tendo um fosforotioato entre os dois nucleotídeos, onde os dois nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes. Em uma modalidade, a saliência está presente na extremidade 3’ da fita de senso, fita antissenso ou ambas as fitas. Em uma modalidade, esta saliência em 3’ está presente na fita antissenso. Em uma modalidade, esta saliência em 3’ está presente na fita de senso.

[0093] As nucleases podem hidrolisar as ligações fosfodiéster do ácido nucleico. No entanto, modificações químicas nos ácidos nucleicos podem conferir propriedades melhoradas e, podem tornar os oligoribonucleotídeos mais estáveis às nucleases.

[0094] Os ácidos nucleicos modificados, conforme aqui utilizados, podem incluir um ou mais de: (i) alteração, por exemplo, substituição, de um ou de ambos os oxigênios de fosfato de não ligação e/ou de um ou mais do oxigênio de fosfato de ligação (referidos como ligação mesmo que no terminal 5’ e 3' do ácido nucleico da invenção); (ii) alteração, por exemplo, substituição, de um constituinte do açúcar ribose, por exemplo, da hidroxila 2’ no açúcar ribose; (iii) substituição da porção fosfato por ligantes "defosfo"; (iv) modificação ou substituição de uma base de ocorrência natural; (v) substituição ou modificação da estrutura de ribose- fosfato; (vi) modificação da extremidade 3‘ ou da extremidade 5‘ do RNA, por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma porção, por exemplo, uma porção marcada com fluorescência, para etremidade 3‘ ou 5‘ do RNA.

[0095] Os termos substituição, modificação, alteração indicam uma diferença em relação a uma molécula de ocorrência natural.

[0096] Modificações específicas são discutidas em mais detalhes abaixo.

[0097] Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforosselenatos, borano fosfatos, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquila ou arila e fosfotriésteres. Os fosforoditioatos têm ambos os oxigênios de não ligação substituídos pelo enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênios de não ligação no grupo fosfato pode ser independentemente qualquer um dentre S, Se, B, C, H, N ou OR (R é alquila ou arila).

[0098] O ligante de fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. É possível substituir o oxigênio de não ligação com nitrogênio.

[0099] Um nucleotídeo modificado pode incluir a modificação dos grupos de açúcar. O grupo hidroxila 2' (OH) pode ser modificado ou substituído por vários substituintes "óxi" ou "desóxi" diferentes.

[00100] Exemplos de modificações no grupo "óxi" -hidroxila 2’ incluem alcóxi ou arilóxi (OR, por exemplo, R=H, alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar); polietilenoglicóis (PEG), O(CH2CH2O) nCH2CH2OR; Ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) nos quais a hidroxila 2’ está conectada, por exemplo, por uma ponte de metileno, ao carbono 4' do mesmo açúcar ribose; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ou di-heteroarilamino, etileno diamina, poliamino) e aminoalcóxi, O(CH2)nAMINA (por exemplo, AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, heteroarilamino ou diheteroarilamino, etileno diamina, poliamino).

[00101] As modificações "desóxi" incluem halo de hidrogênio; amino (por exemplo, NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino ou aminoácido); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclila, arilamino, diaril amino, heteroaril amino ou di-heteroaril amino), -NHC(O)R (R = alquila, cicloalquila, arila, aralquila, heteroarila ou açúcar), ciano; mercapto; alquil-tio-alquila; tioalcóxi; e alquila, cicloalquila, arila, alcenila e alquinila, que podem ser opcionalmente substituídos com, por exemplo, uma funcionalidade amino. Outros substituintes de certas modalidades incluem 2'-metoxietila, 2'-OCH3, 2'- O-alila, 2'-C-alila e 2'-fluoro.

[00102] O grupo açúcar também pode conter um ou mais carbonos que possuem a configuração estereoquímica oposta à do carbono correspondente na ribose. Assim, um nucleotídeo modificado pode conter um açúcar como a arabinose.

[00103] Os nucleotídeos modificados também podem incluir açúcares "abásicos", que não possuem uma nucleobase em C-I’. Estes açúcares abásicos podem ainda conter modificações em um ou mais átomos de açúcar constituintes.

[00104] As modificações 2' podem ser usadas em combinação com uma ou mais modificações do ligante de fosfato (por exemplo, fosforotioato).

[00105] O grupo fosfato pode ser substituído por conectores que não contenham fósforo.

[00106] Exemplos de porções que podem substituir o grupo fosfato incluem siloxano, carbonato, carboximetila, carbamato, amida, tioéter, ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formalcetal, oxima, metilenoimino, metilenometilimino, metileno- hidroximetil-metilenoimetil-hidróxi-metileno. Em certas modalidades, as substituições podem incluir os grupos metilenocarbonilamino e metilenometilimino.

[00107] O ligante de fosfato e o açúcar ribose podem ser substituídos por nucleotídeos resistentes à nuclease.

[00108] Exemplos incluem os substitutos nucleosídeos de morfolino, ciclobutila, pirrolidina e ácido nucleico peptídico (PNA). Em certas modalidades, substitutos de PNA podem ser usados.

[00109] As extremidades 3’ e 5' de um oligonucleotídeo podem ser modificadas. Tais modificações podem ocorrer na extremidade 3’ ou na extremidade 5' ou em ambas as extremidades da molécula. Elas podem incluir modificação ou substituição de um fosfato terminal inteiro ou de um ou mais átomos do grupo fosfato. Por exemplo, as extremidades 3’ e 5' de um oligonucleotídeo podem ser conjugadas com outras entidades moleculares funcionais, como porções de marcação, por exemplo, fluoróforos (por exemplo, pireno, TAMRA, fluoresceína, corantes Cy3 ou Cy5) ou grupos de proteção (com base, por exemplo, em enxofre, silício, boro ou éster). As entidades moleculares funcionais podem ser ligadas ao açúcar através de um grupo fosfato e/ou um ligante. O átomo terminal do ligante pode se conectar ou substituir o átomo de ligação do grupo fosfato ou do grupo C-3’ ou C-5'O, N, S ou C do açúcar. Alternativamente, o ligante pode conectar ou substituir o átomo terminal de um substituto de nucleotídeo (por exemplo, PNAs). Esses espaçadores ou ligantes podem incluir, por exemplo, -(CH2)n—, -(CH2)nN—, -(CH2)nO—, - (CH2)nS—, O (CH2CH2O)nCH2CH2OH (por exemplo, n = 3 ou 6), açúcares abásicos, amida, carbóxi, amina, oxiamina, oximina, tioéter, dissulfeto, tioureia, sulfonamida ou morfolino, ou reagentes de biotina e fluoresceína. A extremidade 3’ pode ser um grupo -OH.

[00110] Outros exemplos de modificações terminais incluem corantes, agentes intercalantes (por exemplo, acridinas), reticuladores (por exemplo, psoraleno, mitomicina C), porfirinas (TPPC4, texafirina, safirina), hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (por exemplo, fenazina, diidrofenazina), endonucleases artificiais (por exemplo, EDTA), veículos lipofílicos (por exemplo, colesterol, ácido cólico, ácido adamantano acético, ácido 1-pireno butírico, di-hidrotestosterona, glicerol 1,3-Bis-O (hexadecila), grupo geranilóxi-hexila, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecila, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleilil)litocólico, ácido O3- (oleilil)colênico, dimetoxitritila ou fenoxazina) e conjugados de peptídeos (por exemplo, peptídeo antenapedia, peptídeo Tat), agentes alquilantes , fosfato, amino, mercapto, PEG (por exemplo, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por exemplo, biotina), facilitadores de transporte / absorção (por exemplo, aspirina vitamina E, ácido fólico), ribonucleases sintéticas (por exemplo, imidazol, bisimidazol, histamina, aglomerados de imidazol, conjugados acridina-imidazol, complexos Eu3+ de tetraazamacrociclos).

[00111] Modificações de terminal podem ser adicionadas por vários motivos, inclusive para modular a atividade ou para modular a resistência à degradação. Modificações terminais úteis para modular a atividade incluem a modificação da extremidade 5’ com fosfato ou análogos de fosfato. Os ácidos nucleicos da invenção, na primeira ou na segunda fita, podem ser fosforilados em 5’ ou incluir um análogo de fosforila no terminal primário 5'. As modificações de 5'-fosfato incluem aquelas que são compatíveis com o silenciamento de genes mediado por RISC. Modificações adequadas incluem: 5'-monofosfato ((HO)2(O) P-O-5’); 5‘-difosfato ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); 5‘-trifosfato ((HO)2 (O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5‘); Tampão de 5‘-guanosina (7-meti- lada ou não metilada) (7m-GO-5‘-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)- O-5’); Tampão de 5'-adenosina (Appp) e qualquer estrutura de tampão de nucleotídeo modificada ou não modificada (N-O-5‘-(HO)(O)P-O- (HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’); 5'-monotiofosfato (fosforotioato; (HO)2 (S)P-O-5‘); 5‘-monoditofosfato (fosforoditioato; (HO)(HS)(S)P-O-5‘), 5‘- fosforotiolato ((HO)2(O)P-S-5'); qualquer combinação adicional de monofosfato, difosfato e trifosfatos substituídos por oxigênio / enxofre (por exemplo, 5'-alfa-tiotrifosfato, 5'-gama-tiotrifosfato, etc.), 5'- fosforamidatos ((HO)2(O)P—NH-5’, (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'- alquilfosfonatos (R = alquila = metila, etila, isopropila, propila, etc., por exemplo, RP(OH) (O)-O-5‘-, (OH)2(O)P-5‘-CH2-), 5'vinilfosfonato, 5'- alquileterfosfonatos (R = alquiléter = metoximetila (MeOCH2-), etoximetila, etc., por exemplo, RP(OH)(O)-O-5'-).

[00112] O ácido nucleico da presente invenção pode incluir uma ou mais modificações de fosforotioato em uma ou mais das extremidades terminais da primeira e/ou da segunda fita. Opcionalmente, cada uma das extremidades da primeira fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato. Opcionalmente, cada uma ou uma das extremidades da segunda fita pode compreender um ou dois ou três nucleotídeos modificados com fosforotioato. Opcionalmente, ambas as extremidades da primeira fita e a extremidade 5’ da segunda fita podem compreender dois nucleotídeos modificados com fosforotioato. Por nucleotídeo modificado com fosforotioato, entende-se que a ligação entre o nucleotídeo e o nucleotídeo adjacente compreende um grupo fosforotioato em vez de um grupo fosfato padrão.

[00113] Modificações terminais também podem ser úteis para monitorar a distribuição e, nesses casos, os grupos a serem adicionados podem incluir fluoróforos, por exemplo, fluoresceína ou corante Alexa. Modificações terminais também podem ser úteis para melhorar a absorção, modificações úteis para isso incluem colesterol. Modificações terminais também podem ser úteis para reticular um agente de RNA a outro grupo.

Nucleotídeos

[00114] Adenina, guanina, citosina e uracila são as bases mais comuns encontradas no RNA. Essas bases podem ser modificadas ou substituídas para fornecer RNAs com propriedades melhoradas. Por exemplo, os oligoribonucleotídeos resistentes à nuclease podem ser preparados com essas bases ou com nucleobases sintéticas e naturais (por exemplo, inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina ou tubercidina) e qualquer uma das modificações acima. Alternativamente, análogos substituídos ou modificados de qualquer uma das bases acima e "bases universais" podem ser empregados. Exemplos incluem 2-aminoadenina, 6-metila e outros derivados alquilados de adenina e guanina, 2-propila e outros derivados alquilados de adenina e guanina, 5-halouracila e citosina, 5-propinil uracila e citosina, 6-azo uracila, citosina e timina, 5-uracil (pseudouracil), 4-tiouracila, 5-halouracila, 5-(2-aminopropil) uracila, 5- amino-alil-uracila, 8-halo, amino, tiol, tioalquila, hidroxila e outras adeninas 8-substituídas e guaninas, 5-trifluorometila e outras uracilas e citosinas 5-substituídas, 7-metilguanina, pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e purinas N-2, N-6 e O-6 substituídas, incluindo 2- aminopropiladenina, 5-propiniluracila e 5-propinilcitosina, di- hidrouracila, 3-desaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracila, 7- alquilguanina, 5-alquil citosina, 7-deseazaadenina, N6, N6- dimetiladenina, 2,6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracila, N3-metiluracila, 1,2,4-triazóis substituídos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol, 5- metoxiuracila, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracila, 5- metil-2-tiouracila, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracila, 5-metilaminometil- 2-tiouracila, 3-(3-amino-3-carboxipropil) uracila, 3-metilcitosina, 5- metilcitosina, N<4>-acetil citosina, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6- isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N-metilguaninas ou bases O-alquiladas.

[00115] Quando aqui usado, os termos "análogo de nucleotídeo não emparelhado" significa um análogo de nucleotídeo que inclui uma porção de emparelhamento não base incluindo, mas não se limitando a: 6 des amino adenosina (Nebularina), 4-Me-indol, 3-nitropirrol, 5 - nitroindol, Ds, Pa, N3-Me ribo U, N3-Me riboT, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-etil-dC, N3-Me dC. Em algumas modalidades, o análogo de nucleotídeo de emparelhamento sem base é um ribonucleotídeo. Em outras modalidades, é um desoxirribonucleotídeo.

[00116] Quando aqui usado, o termo "grupo funcional terminal" inclui, sem limitação, grupos halogênio, álcool, amina, carboxílico, éster, amida, aldeído, cetona, éter.

[00117] Certas porções podem estar ligadas ao terminal 5’ da primeira fita ou da segunda fita e incluem a porção ribose abásica, porção desoxirribose abástica, modificações de porções ribose abásica e desoxirribose abástica, incluindo modificações de 2’O alquila; porções de ribose abásica invertida e desoxirribose abásica e suas modificações, C6-imino-Pi; um nucleotídeo espelho incluindo L- DNA e L-RNA; Nucleotídeo 5‘OMe; e análogos nucleotídicos incluindo nucleotídeo 4’,5'-metileno; 1-(p-D-eritrofuranosil)nucleotídeo; 4'-tio nucleotídeo, nucleotídeo carbocíclico; fosfato de 5'-amino-alquila; fosfato de 1,3-diamino-2-propila, fosfato de 3-aminopropila; fosfato de 6-amino-hexila; fosfato de 12-aminododecila; fosfato de hidroxipropila; Nucleotídeo 1,5-anidro-hexitol; alfa-nucleotídeo; nucleotídeo treo- pentofuranosila; nucleotídeo acíclico 3‘,4‘-seco; nucleotídeo 3,4-di- hidroxibutila; nucleotídeo 3,5-di-hidroxipentila, fração abásica invertida em 5'-5'; fosfato de 1,4-butanodiol; 5'-amino; e porções metilfosfonato e não em ponte e 5'-mercapto.

[00118] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser incluídos um ou mais nucleotídeos invertidos, por exemplo timidina invertida ou adenina invertida (por exemplo, veja Takei, et al., 2002. JBC 277 (26): 23800-06).

[00119] Quando aqui usado, o termo "inibir", "regular negativamente" ou "reduzir" com relação à expressão gênica significa a expressão do gene ou nível de moléculas de RNA ou moléculas de RNA equivalentes que codificam uma ou mais proteínas ou subunidades de proteínas (por exemplo, mRNA), ou a atividade de uma ou mais proteínas, subunidades ou peptídeos de proteínas é reduzida abaixo da observada na ausência de um ácido nucleico da invenção ou em referência a uma molécula de siRNA sem homologia conhecida para transcritos humanos (aqui denominada controle sem silenciamento). Esse controle pode ser conjugado e modificado de maneira análoga à molécula da invenção e liberado na célula-alvo pela mesma via; por exemplo, a expressão pode ser reduzida para 90 %, 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 15 % ou um valor intermediário, na ausência do ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção, ou na presença de um controle sem silenciamento.

[00120] O ácido nucleico da presente invenção pode compreender um nucleotídeo abásico. O termo "abásico", quando aqui utilizado, refere-se a porções que não possuem uma base ou que têm outros grupos químicos no lugar de uma base na posição 1’, por exemplo, um derivado de ribose desoxiabásico ligado à 3',3' ou 5’,5'.

[00121] O ácido nucleico pode compreender um ou mais nucleotídeos na segunda e/ou primeira fitas que são modificadas. Os nucleotídeos alternados podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados.

[00122] Alternar como aqui descrito significa ocorrer um após o outro de maneira regular. Em outras palavras, alternar significa ocorrer repetidamente. Por exemplo, se um nucleotídeo é modificado, o próximo nucleotídeo contíguo não é modificado e o seguinte nucleotídeo contíguo é modificado e assim por diante. Um nucleotídeo pode ser modificado com uma primeira modificação, o próximo nucleotídeo contíguo pode ser modificado com uma segunda modificação e o seguinte nucleotídeo contíguo é modificado com a primeira modificação e assim por diante, onde a primeira e a segunda modificações são diferentes.

[00123] Um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados em que a primeira fita é numerada de 5' a 3'. O termo "número ímpar", conforme aqui descrito, significa um número não divisível por dois. Exemplos de números ímpares são 1, 3, 5, 7, 9, 11 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da primeira fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados, em que a primeira fita é numerada de 5’ a 3'. O termo "numerado par", conforme aqui descrito, significa um número que é divisível igualmente por dois. Exemplos de números pares são 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 e assim por diante. Um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da segunda fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados em que a segunda fita é numerada de 3’ a 5'. Um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da segunda fita do ácido nucleico da invenção podem ser modificados, em que a segunda fita é numerada de 3’ a 5'.

[00124] Um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita podem ser modificados, para formar nucleotídeos modificados. Um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita podem ser modificados. Um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da primeira fita podem ser modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação no um ou mais nucleotídeos adicionados. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados pares modificados pode ser adjacente a pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados ímpares modificados.

[00125] Uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita pode ser modificada no ácido nucleico da invenção. Uma pluralidade de nucleotídeos numerados pares na primeira fita pode ser modificada por uma segunda modificação. A primeira fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. A primeira fita também pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação diferente.

[00126] Um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da segunda fita pode ser modificado por uma modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita e/ou um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da segunda fita pode ser pela mesma modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita. Pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados pares modificados da segunda fita pode ser adjacente a um ou mais nucleotídeos numerados ímpares modificados. Uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares da segunda fita pode ser modificada por uma modificação comum e/ou uma pluralidade de nucleotídeos numerados pares pode ser modificada pela mesma modificação que está presente nos primeiros nucleotídeos numerados ímpares. Uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares na segunda fita pode ser modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita.

[00127] A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum, que pode ser uma segunda modificação que é diferente da modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita.

[00128] No ácido nucleico da invenção, cada um dos nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita e cada um dos nucleotídeos pares na segunda fita pode ser modificado com uma modificação comum e, cada um dos nucleotídeos numerados pares pode ser modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos ímpares numerados pode ser modificado na segunda fita com a segunda modificação.

[00129] O ácido nucleico da invenção pode ter os nucleotídeos modificados da primeira fita deslocados em pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de maneira diferente da segunda fita.

[00130] Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados ímpares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados pares pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados pares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados pares pode ser modificado na segunda fita. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados ímpares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais nucleotídeos numerados ímpares podem ser modificados na segunda fita por uma modificação comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados pares pode ser modificado na primeira fita e um ou mais ou cada um dos nucleotídeos numerados ímpares pode ser modificado na segunda fita por uma modificação comum. Um ou mais ou cada um dos nucleotídeos alternados em uma ou em ambas as fitas podem ser modificados por uma segunda modificação.

[00131] O ácido nucleico da invenção pode compreender construções de fita dupla ou dupla que compreendem pelo menos duas regiões de modificações alternadas em uma ou em ambas as fitas. Estas regiões alternadas podem compreender até cerca de 12 nucleotídeos, mas preferivelmente compreendem de cerca de 3 a cerca de 10 nucleotídeos. As regiões de nucleotídeos alternados podem estar localizadas nos terminais de uma ou de ambas as fitas do ácido nucleico da invenção. O ácido nucleico pode compreender de 4 a cerca de 10 nucleotídeos de nucleotídeos alternados em cada terminal (3’ e 5') e essas regiões podem ser separadas por cerca de 5 a cerca de 12 nucleotídeos contíguos, não modificados ou diferentes ou comumente modificados.

[00132] Os nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita podem ser modificados e os nucleotídeos numerados pares podem ser modificados com uma segunda modificação. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum, que pode ser a mesma que a modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes um ao outro e a nucleotídeos com uma modificação que é a mesma que a modificação dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3’ e na extremidade 5'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5’. A segunda fita também pode ser conjugada com um ligante na extremidade 5’.

[00133] O ácido nucleico da invenção pode compreender uma primeira fita compreendendo nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum. Um ou mais desses nucleotídeos podem ser adjacentes a um ou mais nucleotídeos que podem ser modificados com uma segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A segunda fita pode compreender nucleotídeos adjacentes que são modificados com uma modificação comum, que pode ser a mesma que uma das modificações de um ou mais nucleotídeos da primeira fita. Um ou mais nucleotídeos da segunda fita também podem ser modificados com a segunda modificação. Um ou mais nucleotídeos com a segunda modificação podem ser adjacentes. A primeira fita também pode compreender ligações de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 5’ e na extremidade 3'. A segunda fita pode compreender uma ligação de fosforotioato entre os dois nucleotídeos na extremidade 3’. A segunda fita também pode ser conjugada com um ligante na extremidade 5’.

[00134] Os nucleotídeos numerados de 5’ a 3' na primeira fita e 3’ e 5' na segunda fita, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita. Os nucleotídeos são numerados para o ácido nucleico da presente invenção de 5’ a 3' na primeira fita e 3’ e 5' na segunda fita

[00135] Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma segunda modificação na primeira fita. Os nucleotídeos numerados 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 podem ser modificados por uma modificação na segunda fita. Os nucleotídeos numerados 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 e 24 podem ser modificados por uma segunda modificação na segunda fita.

[00136] Claramente, se o primeiro e/ou a segunda fita tem menos de 25 nucleotídeos de comprimento, como 19 nucleotídeos de comprimento, não há nucleotídeos numerados 20, 21, 22, 23, 24 e 25 a serem modificados. O especialista entende a descrição acima para aplicar a fitas mais curtas, por conseguinte.

[00137] Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser emparelhados com nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação comum. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser emparelhados com nucleotídeos modificados na segunda fita com uma modificação diferente. Um ou mais nucleotídeos modificados na primeira fita podem ser emparelhados com nucleotídeos não modificados na segunda fita. Um ou mais nucleotídeos modificados na segunda fita podem ser emparelhados com nucleotídeos não modificados na primeira fita. Em outras palavras, os nucleotídeos alternados podem ser alinhados nas duas fitas, como, por exemplo, todas as modificações nas regiões alternadas da segunda fita são emparelhadas com modificações idênticas na primeira fita ou, alternativamente, as modificações podem ser compensadas por um nucleotídeo com as modificações comuns nas regiões alternadas de uma fita emparelhando com modificações diferentes (isto é, uma segunda ou mais modificações) na outra fita. Outra opção é ter modificações diferentes em cada uma das fitas.

[00138] As modificações na primeira fita podem ser deslocadas por um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos modificados na segunda fita, de modo que os nucleotídeos modificados comuns não estejam emparelhados um com o outro.

[00139] A modificação e/ou modificações podem cada uma e individualmente ser selecionadas do grupo que consiste em desoxitimina 3'-terminal, 2'-O-metila, uma modificação 2'-desóxi, uma modificação 2'-amino, uma modificação 2’-alquila, uma modificação de morfolino, uma modificação de fosforamidato, modificação do grupo 5'- fosforotioato, uma modificação imitadora de fosfato 5' ou 5’ e uma derivada de colesterila ou uma modificação do grupo bisdecilamida do ácido dodecanoico e/ou o nucleotídeo modificado podem ser qualquer um dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo nucleotídeo.

[00140] Pelo menos uma modificação pode ser 2'-O-metila e/ou pelo menos uma modificação pode ser 2'-F. Modificações adicionais como aqui descritas podem estar presentes na primeira e/ou na segunda fita.

[00141] Ao longo da descrição da invenção, "modificação igual ou comum" significa a mesma modificação em qualquer nucleotídeo, seja A, G, C ou U modificado com um grupo como um grupo metila ou um grupo fluoro. Não se entende a mesma adição no mesmo nucleotídeo. Por exemplo, 2'F-dU, 2'F-dA, 2'F-dC, 2'F-dG são todos considerados a mesma modificação ou modificação comum, assim como 2'-OMe-rU, 2'-OMe -rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG. Uma modificação 2'F é uma modificação diferente de uma modificação 2'OMe.

[00142] Algumas sequências de ácidos nucleicos modificadas representativas da presente invenção são mostradas nos exemplos. Esses exemplos devem ser representativos e não limitativos.

[00143] De preferência, o ácido nucleico pode compreender uma modificação, e a segunda ou mais modificações que são cada uma e individualmente selecionadas do grupo que compreende a modificação 2'-O-metila e modificação 2'-F. O ácido nucleico pode compreender uma modificação que é 2'-O-metila (2'OMe) que pode ser uma primeira modificação e uma segunda modificação que é 2'-F. O ácido nucleico da invenção também pode incluir uma modificação de fosforotioato e/ou uma modificação desóxi que pode estar presente nos ou entre os 1, 2 ou 3 terminais nucleotídeos de cada uma das extremidades de cada uma ou de ambas as fitas.

[00144] A invenção fornece como um aspecto adicional, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 335, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, ou SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79 , 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125 , 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177 , 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229 , 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277 , 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, como SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29.133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos numerados ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos numerados pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos numerados pares e modificados por uma quarta modificação dos nucleotídeos numerados ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação.A terceira e primeira modificações podem ser iguais ou diferentes, a segunda e quarta modificações podem ser o mesmo ou diferente. A primeira e a segunda modificações podem ser diferentes entre si e a terceira e quarta modificações podem ser diferentes entre si.

[00145] Em um aspecto adicional, é fornecido um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, em que a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435.437, 439, 441 ou 443, ou uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID no 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, como uma sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134 , 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184 , 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216 em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por uma primeira modificação nos nucleotídeos numerados ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos numerados pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por uma terceira modificação nos nucleotídeos numerados pares e modificados por uma quarta modificação dos nucleotídeos ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação. A terceira e primeira modificações podem ser iguais ou diferentes, a segunda e quarta modificações podem ser iguais ou diferentes. A primeira e a segunda modificações podem ser diferentes entre si, e a terceira e quarta modificações podem ser diferentes entre si. Adequadamente, a sequência de nucleotídeo da segunda fita é complementar à primeira fita. Os nucleotídeos da primeira fita podem ser modificados por primeira modificação nos nucleotídeos numerados ímpares e modificados com uma segunda modificação nos nucleotídeos numerados pares, e a segunda fita pode ser modificada nos nucleotídeos numerados ímpares com a segunda modificação e modificada com a primeira modificação dos nucleotídeos numerados pares. A primeira modificação pode ser 2'OMe e a segunda modificação pode ser 2 'F. A primeira fita pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 17 e/ou a segunda fita pode compreender a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 18. As modificações podem ser as descritas na tabela 1.

[00146] O ácido nucleico da invenção pode ser conjugado com um ligante.

[00147] Alguns ligantes podem ter propriedades endossomolíticas. Os ligantes endossomolíticos promovem a lise do endossoma e/ou transporte da composição da invenção, ou de seus componentes, do endossoma ao citoplasma da célula. O ligante endossomolítico pode ser um peptídeo polianiônico ou peptidomimético que mostra a atividade da membrana dependente do pH e a fusogenicidade. O componente endossomolítico pode conter um grupo químico que sofre uma alteração na carga ou protonação em resposta a uma alteração no pH. O componente endossomolítico pode ser linear ou ramificado.

[00148] Os ligantes podem incluir modificadores terapêuticos, por exemplo, para aumentar a captação; compostos de diagnóstico ou grupos repórteres, por exemplo, para monitorar a distribuição; agentes de reticulação; e porções que conferem resistência à nuclease. Exemplos gerais incluem lipídeos, esteroides, vitaminas, açúcares, proteínas, peptídeos, poliaminas e imitações de peptídeos. Os ligantes podem incluir uma substância de ocorrência natural, como proteínas, carboidratos ou lipídeos. O ligante pode ser uma molécula recombinante ou sintética.

[00149] Os ligantes também podem incluir grupos de segmentação, por exemplo um agente de direcionamento de célula ou tecido. O ligante alvo pode ser uma lectina, glicoproteína, lipídeo ou proteína.

[00150] Outros exemplos de ligantes incluem corantes, agentes intercalantes, reticuladores, porfirinas, hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, endonucleases artificiais ou um quelante, moléculas lipofílicas, agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG, MPEG, alquila, alquila substituída, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos, transporte / absorção facilitadores, ribonucelases sintéticas ou aglomerados de imidazol.

[00151] Os ligantes podem ser proteínas, por exemplo, glicoproteínas ou peptídeos. Os ligantes também podem ser hormônios ou receptores hormonais. Eles também podem incluir espécies não peptídicas, como lipídeos, lectinas, carboidratos, vitaminas ou cofatores.

[00152] O ligante pode ser uma substância como um fármaco que pode aumentar a captação do ácido nucleico em uma célula, por exemplo, interrompendo o citoesqueleto da célula.

[00153] O ligante pode aumentar a captação do ácido nucleico na célula ativando uma resposta inflamatória. Esses ligantes incluem fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa), interleucina-1 beta ou interferon gama.

[00154] O ligante pode ser uma molécula lipídica ou à base de lipídeos. A molécula lipídica ou à base de lipídeos liga-se preferivelmente a uma proteína sérica. De preferência, o ligante à base de lipídeos se liga à albumina sérica humana (HSA). Uma molécula lipídica ou à base de lipídeos pode aumentar a resistência à degradação do conjugado, aumentar o direcionamento ou o transporte para a célula-alvo e/ou pode ajustar a ligação a uma proteína sérica. Um ligante à base de lipídeos pode ser usado para modular a ligação do conjugado para um tecido-alvo.

[00155] O ligante pode ser um esteroide. De preferência, o ligante é colesterol ou um derivado de colesterol.

[00156] O ligante pode ser uma porção, por exemplo, uma vitamina, que é absorvida por uma célula-alvo. Exemplos de vitaminas incluem as vitaminas A, E, K e B. As vitaminas podem ser absorvidas por uma célula em proliferação, que pode ser útil para fornecer o ácido nucleico a células como células tumorais malignas ou não malignas.

[00157] O ligante pode ser um agente de permeação celular, tal como um agente de permeação celular helicoidal. De um modo preferido, esse agente é anfipático.

[00158] O ligante pode ser um peptídeo ou peptidomimético. Um peptidomimético é uma molécula capaz de se dobrar em uma estrutura tridimensional definida semelhante a um peptídeo natural. O peptídeo ou ligante peptidomimético pode incluir peptídeos de ocorrência natural ou modificados, ou ambos. Um peptídeo ou peptidomimético pode ser um peptídeo de permeação celular, peptídeo catiônico, peptídeo anfipático ou peptídeo hidrofóbico. A porção peptídica pode ser um peptídeo dendrímero, peptídeo restrito ou peptídeo reticulado. A porção peptídica pode incluir uma sequência de translocação de membrana hidrofóbica. A porção peptídica pode ser um peptídeo capaz de transportar moléculas polares grandes, como peptídeos, oligonucleotídeos e proteínas através das membranas celulares, por exemplo seqüências da proteína HIV Tat (GRKKRRQRRRPPQ) e da proteína de Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK). De um modo preferido, o peptídeo ou peptidomimético é um peptídeo destinado a células, por exemplo, peptídeo de ácido arginina-glicina- aspártico (RGD).

[00159] O ligante pode ser um peptídeo de permeação celular que é capaz de permear, por exemplo, uma célula microbiana ou uma célula de mamífero.

[00160] O ligante pode ser um modulador farmacocinético. O modulador farmacocinético pode ser lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolipídeos, peptídeos, agentes de ligação a proteínas, PEG, vitaminas, etc.

[00161] Quando dois ou mais ligantes estão presentes, todos os ligantes podem ter as mesmas propriedades, todos têm propriedades diferentes ou alguns ligantes têm as mesmas propriedades, enquanto outros têm propriedades diferentes. Por exemplo, um ligante pode ter propriedades de direcionamento, atividade endossomolítica ou propriedades moduladoras de PK. Em uma modalidade preferida, todos os ligantes têm propriedades diferentes.

[00162] Os ligantes podem ser acoplados ao ácido nucleico na extremidade 3’, na extremidade 5' e/ou em uma posição interna. De preferência, o ligante é acoplado ao ácido nucleico por meio de uma ligação ou ligação intermediária.

[00163] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é um ácido nucleico de fita dupla. Em um ácido nucleico de fita dupla, o ligante pode estar ligado a uma ou ambas as fitas. Em algumas modalidades, um ácido nucleico de fita dupla contém um ligante conjugado com a fita de senso. Em outras modalidades, um ácido nucleico de fita dupla contém um ligante conjugado com a fita antissenso.

[00164] Os ligantes podem ser conjugados com nucleobases, porções de açúcar ou ligações internucleosídicas de moléculas de ácido nucleico. A conjugação com nucleobases de purinas ou seus derivados pode ocorrer em qualquer posição, incluindo átomos endocíclicos e exocíclicos. A conjugação com nucleotídeos de pirimidina ou seus derivados também pode ocorrer em qualquer posição. A conjugação com as porções de açúcar dos nucleosídeos pode ocorrer em qualquer átomo de carbono. A conjugação com ligações internucleosídicas pode ocorrer no átomo de fósforo de uma ligação contendo fósforo ou em um átomo de oxigênio, nitrogênio ou enxofre ligado ao átomo de fósforo. Para ligações internucleosídicas contendo amina ou amida, a conjugação pode ocorrer no átomo de nitrogênio da amina ou amida ou em um átomo de carbono adjacente.

[00165] O ligante é tipicamente um carboidrato, por exemplo, um monossacarídeo, dissacarídeo, trissacarídeo, tepolisossacarídeo. O ligante pode ser conjugado com o ácido nucleico por um ligante. O ligante pode ser um ligante ramificado monovalente, bivalente ou trivalente.

[00166] A liberação eficiente de oligonucleotídeos, em particular ácidos nucleicos de fita dupla da invenção, para células in vivo é importante e requer direcionamento específico e proteção substancial do ambiente extracelular, particularmente proteínas séricas. Um método para atingir um alvo específico é conjugar um ligante ao ácido nucleico. O ligante ajuda a direcionar o ácido nucleico para o sítio alvo necessário. Existe uma necessidade de conjugar ligantes apropriados para as moléculas receptoras desejadas, a fim de que as moléculas conjugadas sejam absorvidas pelas células alvo por mecanismos como diferentes vias de endocitose mediada por receptores ou processos funcionalmente análogos. A porção ou ligante alvo pode ser qualquer fração ou ligante capaz de atingir um receptor específico.

[00167] Por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína (ASGP-R) é um receptor de alta capacidade, que é altamente abundante em hepatócitos. Uma das primeiras descrições de glicosídeos triantenários de cluster estava na patente US número 5.885.968. Os conjugados com três ligantes GalNAc e compreendendo grupos fosfato são conhecidos e são descritos em Dubber et al. (2003, Bioconjug. Chem. 2003 jan-fev; 14 (1): 239-46.). O ASGP-R mostra uma afinidade 50 vezes maior para N-acetil-D-galactosilamina (GalNAc) do que D-Gal.

[00168] Hepatócitos que expressam a lectina (receptor de asialoglicoproteína; ASGPR), que reconhece subunidades β-galactosil especificamente terminais de proteínas glicosiladas ou outros oligossacarídeos (Weigel, PH et al., Biochim. Biophys. Biophys. Acoph. 19 de Setembro de 2002; 1572 (2-3) : 341-63), pode ser usados para direcionar um fármaco ao fígado por acoplamento covalente de galactose ou galactoseamina à substância do fármaco (Ishibashi, S.; et. Al., J. Biol. Chem. 11 de Nov. de 1994; 269 (45): 27803-6)). Além disso, a afinidade de ligação pode ser significativamente aumentada pelo efeito de múltiplas valências, o que é alcançado pela repetição da unidade de direcionamento (E. A. L. Biessen et al., 1995).

[00169] O ASGPR é um mediador para um transporte endossômico ativo de glicoproteínas contendo β-galactosil terminal, portanto, o ASGPR é altamente adequado para a liberação direcionada de candidatos de fármaco como ácido nucleico, que devem ser liberados na célula (Akinc et al.).

[00170] O ligante pode ser ligado ao ácido nucleico da invenção através de um ligante, que pode ser um ligante bivalente ou trivalente ou ramificado de tetrâmero.

[00171] O sacarídeo, que também pode ser chamado de ligante, pode ser selecionado para ter uma afinidade por pelo menos um tipo de receptor em uma célula-alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula hepática de mamífero, por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína hepática (ASGP-R).

[00172] O sacarídeo pode ser selecionado dentre N-acetil galactoseamina, manose, galactose, glicose, glicosamona e fucose. O sacarídeo pode ser N-acetil galactoseamina (GalNAc).

[00173] Um ligante para uso na presente invenção pode, portanto, compreender (i) uma ou mais porções de N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções de GalNAc a uma sequência como definida em quaisquer aspectos anteriores. O ligante pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. Os nucleotídeos podem ser modificados como aqui definido.

[00174] "GalNAc" refere-se a 2-(acetilamino)-2-desóxi-D-galactopi- ranose, vulgarmente referida na literatura como N-acetil galactosamina. A referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactoseamina" inclui tanto a forma β: 2-(acetilamino)-2-des0xi-β-D-galactopiranose quanto a forma α: 2-(acetilamino)-2-desóxi-a-D-galactopiranose. Tanto a forma β: 2-(acetilamino)-2-des0xi-β-D-galactopiranose como a forma α: 2-(acetilamino)-2-desóxi-a-D-galactopiranose podem ser utilizadas de forma intercambiável. De preferência, os compostos da invenção compreendem a forma β, 2-(acetilamino)-2-des0xi-β-D- galactopiranose.

[00175] O ligante pode compreender GalNAc.

[00176] O ligante pode compreender um composto de fórmula I: [S-X1-β-X2] 3-α-X3-(I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2 ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n- O-CH2- onde n = 1-6; A é uma unidade ramificada; X3 representa uma unidade em ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado com X3 através de um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato).

[00177] Na fórmula I, a unidade de ramificação "A" se ramifica em três, a fim de acomodar as três porções de sacarídeo. A unidade ramificada é covalentemente ligada às partes restantes amarradas do ligante e do ácido nucleico. A unidade de ramificação pode compreender um grupo alifático ramificado compreendendo grupos selecionados a partir de grupos alquila, amida, dissulfeto, polietilenoglicol, éter, tioéter e hidroxiamino. A unidade ramificada pode incluir grupos selecionados de grupos alquila e éter.

[00178] A unidade ramificada A pode ter uma estrutura selecionada entre: em que cada A1 independentemente representa O, S, C=O ou NH; e cada n independentemente representa um número inteiro de 1 a 20.

[00179] A unidade de ramificação pode ter a estrutura selecionada denter:em que cada A1 independentemente representa O, S, C=O ou NH; e cada n independentemente representa um número inteiro de 1 a 20.

[00180] A unidade de ramificação pode ter a estrutura selecionada dentre:em que A1 é O, S, C=O ou NH; e cada n independentemente representa um número inteiro de 1 a 20.

[00181] A unidade de ramificação pode ter a estrutura:

[00182] A unidade de ramificação pode ter a estrutura:

[00183] A unidade de ramificação pode ter a estrutura:

[00184] Opcionalmente, a unidade de ramificação consiste em apenas um átomo de carbono.

[00185] A porção "X3" dos compostos de fórmula I é uma inidade em ponte. A unidade em ponte é linear e é covalentemente ligada à unidade de ramificação e um ácido nucleico.

[00186] X3 pode ser selecionado dentre -C1-C20 alquileno-, -C2-C20 alquenileno-, um éter de alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)-O- (C1-C20 alquileno)-, -C(O)-C1-C20 alquileno-, -C0-C4 alquileno(Cy)C0-C4 alquileno- em que Cy representa um anel cicloalquileno, arileno, heterociclileno ou heteroarileno de 5 ou 6 membros substituído ou não substituído, -C1-C4 alquileno-NHC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)NH-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-SC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)S-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno- OC(O)-C1-C4 alquileno-, -C1-C4 alquileno-C(O)O-C1-C4 alquileno-, e - C1-C6 alquileno-S-S-C1-C6 alquileno-.

[00187] X3 pode ser um éter de alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)-O-(C1-C20 alquileno)-. X3 pode ser um éter de alquileno de fórmula -(C1-C20 alquileno)-O-(C4-C20 alquileno)-, em que o referido (C4-C20 alquileno) é ligado a Z. X3 pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e - CH2-O-C8H16-, especialmente -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O- C8H16-, em que em cada caso um grupo -CH2- é ligado ao A.

[00188] O ligante pode compreender um composto de fórmula (II): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (II) em que: S representa um sacarídeo; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato); X2 é C1-C8 alquileno; A é uma unidade de ramificação selecionada dentre: X3 é uma unidade em ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado com X3 por meio de um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato).

[00189] Unidade de ramificação A pode ter a estrutura:

[00190] Unidade de ramificação A pode ter a estrutura: em que X3 é ligado a um átomo de nitrogênio.

[00191] X3 pode ser C1-C20 alquileno. Preferivelmente, X3 é selecionado a partir de um grupo consistindo em -C3H6-, -C4H8-, - C6H12- e -C8H16-, especialmente -C4H8-, -C6H12- e -C8H16-.

[00192] O ligante pode compreender um composto de fórmula (III): [S-X1-P-X2]3-A-X3- (III) em que: S representa um sacarídeo; X1 representa C3-C6 alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2, ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente um tiofosfato); X2 é um éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-; A é uma unidade de ramificação; X3 é um éter de alquileno de fórmula selecionado a partir do grupo consistindo em -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, - CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, e -CH2- O-C8H16-, em que em cada caso um grupo -CH2- é ligado ao A, Z é um ácido nucleico; e em que a ligação entre X3 e Z é um fosfato ou tiofosfato

[00193] A unidade de ramificação pode compreender carbono. Preferivelmente, a unidade de ramificação é carbono.

[00194] X3 pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em - CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, e -CH2- O-C8H16-. Preferivelmente, X3 é selecionado a partir do grupo consistindo em -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- e -CH2-O-C8H16.

[00195] Para quaisquer dos aspectos acima, quando P representa o grupo fosfato modificado, P pode ser representado por: em que Y1 e Y2 cada qual independentemente representa =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx, e -ORx, em que Rx representa C1-C6 alquila e em que “ indica a ligação ao restante do composto.

[00196] Por fosfato modificado significa um grupo fosfato em que um ou mais dos oxigênios é substituído. Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotioato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrogênio, fosforoamidatos, alquil ou aril fosfonatos e fosfotriésteres. Fosforoditioatos têm ambos oxigênios sem ligação substituídos por enxofre. Um, cada um ou ambos os oxigênos sem ligação no grupo fosfato podem ser independentemente qualquer um dentre S, Se, B, C, H, N, ou OR (R é alquila ou arila).

[00197] O ligante de fosfato também pode ser modificado pela substituição de um oxigênio de ligação por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer em um oxigênio terminal. A substituição dos oxigênios sem ligação com nitrogênio é possível.

[00198] Por exemplo, Y1 pode representar -OH e Y2 pode representar =O ou =S; ou Y 1 pode representar -O- e Y2 pode representar =O ou =S; Y 1 pode representar =O e Y2 pode representar -CH3, -SH, - ORx, ou -BH3 Y 1 pode representar =S e Y2 pode representar -CH3, ORx ou -SH.

[00199] Será entendido por um especialista que em certos casos haverá deslocalização entre Y1 e Y2.

[00200] Preferivelmente, o grupo fosfato modificado é um grupo tiofosfato. Grupos tiofosfato incluem bitiofosfato (isto é, onde Y1 representa =S e Y2 representa -S-) e monotiofosfato (isto é, onde Y1 representa -O- e Y2 representa =S, ou onde Y1 representa =O e Y2 representa -S-). Preferivelmente, P é um monotiofosfato. Os inventores verificaram que os conjugados tendo grupos tiofosfato na substituição de grupos fosfato têm potência e duração melhoradas de ação in vivo.

[00201] P pode também ser um etilfosfato (isto é, onde Y1 representa =O e Y2 representa OCH2CH3).

[00202] O sacarídeo pode ser selecionado para ter uma afinidade para pelo menos um tipo de receptor em uma célula-alvo. Em particular, o receptor está na superfície de uma célula do fígado de mamífero, por exemplo, o receptor de asialoglicoproteína hepático (ASGP-R).

[00203] Para quaisquer dos aspectos acima, o sacarídeo pode ser selecionado a partir de N-acetila com um ou mais dentre galactosamina, manose, galactose, glicose, glicosamina e frutose. Preferivelmente, o sacarídeo é duas moléculas de N-acetil galactosamina (GalNAc). Os compostos da invenção podem ter 3 ligantes que são cada qual preferivelmente N-acetil galactosamina.

[00204] "GalNAc" refere-se a 2-(Acetilamino)-2-desóxi-D-galactopi- ranose, comumente referida na literatura como N-acetil galactosamina. Referência a "GalNAc" ou "N-acetil galactosamina" inclui igualmente a forma β: 2-(Acetilamino)-2-des0xi-β -D-galactopiranose e a forma α: 2- (Acetilamino)-2-des0xi-α-D- galactopiranose. Em certas modalidades, igualmente a forma β: 2-(Acetilamino)-2-desóxi-e-D-galactopiranose e a forma α: 2-(Acetilamino)-2-desóxi-a-D-galactopiranose podem ser usadas alternadamente. Preferivelmente, os compostos da invenção compreendem a forma β, 2-(Acetilamino)-2-desóxi-e-D-galactopira- nose.2-(Acetilamino)-2-desóxi-D-galactopiranose2-(Acetilamino)-2-des0xi-β-D-galactopiranose2-(Acetilamino)-2-desóxi-a-D-galactopiranose

[00205] Para quaisquer dos compostos acima de fórmula (III), X1 pode ser (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-. X1 pode ser (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-. X1 pode ser (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-. Preferivelmente, X1 é (-CH2-CH2- O)2(-CH2)2-. Alternativamente, X1 representa C3-C6 alquileno. X1 pode ser propileno. X1 pode ser butileno. X1 pode ser pentileno. X1 pode ser hexileno. Preferivelmente, a alquila é um alquileno linear. Em particular, X1 pode ser butileno.

[00206] Para compostos de fórmula (III), X2 representa um éter de alquileno de fórmula -C3H6-O-CH2-, isto é, C3alcóxi metileno, ou - CH2CH2CH2OCH2-.

[00207] A invenção fornece um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes estruturas: em que Z é um ácido nucleico como aqui definido anteriormente.

[00208] A invenção fornece, como outro aspecto, um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 317, 319 , 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 353, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376 , 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402, 404, 406, 407, 410, 412, 414, 416, 418, 420, 422, 424, 426 , 428, 430, 432, 434, 436, 438, 440 ou 442, ou selecionada das SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 67, 69, 71, 73, 74, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 85, 87, 88, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 111, 113, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 270, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 309, 311, 312, 313, 314 ou 315, tal como selecionada das SEQ ID nos 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147 , 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215, em que o ácido nucleico é conjugado indiretamente ou diretamente a um ligante por meio de um ligante.

[00209] A segunda fita pode compreender uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 357, 359. 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, 403, 401, 403, 405, 407, 409, 411, 413, 415, 417, 419, 421, 423, 425, 427, 429, 431, 433, 435,437, 439, 441 ou 443, ou selecionada a partir da SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 68, 70, 72, 75, 84, 86, 89, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 310, 312, 314 ou 316, tal como selecionada a partir da SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196 , 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216.

[00210] O ácido nucleico pode ser conjugado com um ligando conforme aqui descrito.

[00211] Os nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita podem ser modificados, conforme aqui descrito.

[00212] Preferivelmente, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 conjugadas com um ligante de fórmula I (como estabelecido acima), e em que a primeira fita é modificada com uma modificação 2’OMe nos nucleotídeos numerados ímpares, e modificada com um 2’F nos nucleotídeos numerados pares, e a segunda fita é modificada com um 2’OMe nos nucleotídeos numerados pares e modificada com um 2’F nos nucleotídeos numerados ímpares.

[00213] Mais preferivelmente, o ácido nucleico compreende SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18, em que o ácido nucleico é conjugado para um ligante de fórmula I (como estabelecido acima) e, além disso, em que o ácido nucleico tem um padrão de modificação como mostrado abaixo do qual está um extrato da Tabela 1 conforme aqui fornecido. em que as modificações específicas são descritas por números 1 = 2’F-dU, 2 = 2’F-dA, 3 = 2’F-dC, 4 = 2’F-dG, 5 = 2’-OMe-rU; 6 = 2’-OMe-rA; 7 = 2’-OMe-rC; 8 = 2’-OMe-rG.

[00214] O ligante pode compreender GalNAc e a Figura 8a ou Figura 8b ilustra ainda mais a presente invenção.

[00215] Outros ácidos nucleicos preferidos estão listados acima.

[00216] Um grupo de ligação clivável é um ligante que é estável fora da célula, porém, é clivado na entrada em uma célula-alvo. A clivagem libera as duas partes que o ligante se mantém unido.

[00217] Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico da invenção compreende um grupo de ligação clivável que é clivado pelo menos 10 vezes ou mais, preferivelmente pelo menos 100 vezes mais rápido em uma célula-alvo ou sob uma primeira condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionado para imitar ou representar condições intracelulares) que no sangue de um indivíduo, ou sob uma segunda condição de referência (que pode, por exemplo, ser selecionada para imitar ou representar condições encontradas no sangue ou soro).

[00218] Grupos de ligação cliváveis são suscetíveis a agentes de clivagem, por exemplo, pH, potencial redox ou presença de moléculas degradativas. Moléculas degradativas incluem enzimas oxidativas ou redutoras, agentes redutores (tais como mercaptanas), esterases, endossomas ou agentes que podem criar um ambiente ácido, enzimas que podem hidrolisar ou degradar um grupo de ligação clivável por ácido, agindo como um ácido geral, peptidases e fosfatases.

[00219] Um grupo de ligação clivável pode ser uma ligação de dissulfeto, que é suscetível ao pH.

[00220] Um ligante pode incluir um grupo de ligação clivável que é clivável por uma enzima específica. O tipo de grupo de ligação clivável incorporado em um ligante pode depender da célula-alvo. Por exemplo, um ligante que inclui um grupo éster é preferido quando uma célula hepática é o alvo. Os ligantes que contêm ligações peptídicas podem ser usados ao direcionar células ricas em peptidases, tais como células hepáticas e sinoviócitos.

[00221] Em geral, a adequação de um grupo de ligação clivável candidato pode ser avaliada testando a capacidade de um agente (ou condição) degradante de clivar o grupo de ligação candidato. Também será desejável testar da mesma forma o grupo de ligação clivável candidato quanto à capacidade de resistir à clivagem no sangue ou quando em contato com outro tecido não alvo. Em modalidades preferidas, os compostos candidatos úteis são clivados pelo menos 2, 4, 10 ou 100 vezes mais rápido na célula (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições intracelulares) em comparação ao sangue ou soro (ou sob condições in vitro selecionadas para imitar as condições extracelulares).

[00222] Em um aspecto, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável redox. O grupo de ligação clivável redox pode ser um grupo de ligação de dissulfeto.

[00223] Em um aspecto, o grupo de ligação pode ser um grupo de ligação clivável baseado em fosfato. As modalidades preferidas são - O-P(O)(OH)-O-, -O-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O- P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O) (H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O- P(S)(H)-S-. Uma modalidade preferida é -O-P(O)(OH)-O-.

[00224] Em um aspecto, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável por ácido. Preferivelmente, o grupo de ligação clivável por ácido é clivado em ambientes em que o pH é 6,5 ou inferior, ou é clivado por agentes tais como enzimas que podem atuar como um ácido geral. Exemplos de grupos de ligação cliváveis por ácidos incluem, porém, não estão limitados a, hidrazonas, ésteres e ésteres de aminoácidos. Grupos cliváveis por ácido podem ter a fórmula geral -C=NN-; C(O)O ou -OC(O). Uma modalidade preferida é um grupo de ligação em que o carbono ligado ao oxigênio do éster (o grupo alcóxi) é um grupo arila, grupo alquila substituído ou grupo alquila terciário, tal como dimetil pentila ou t-butila.

[00225] Em uma modalidade, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável baseado em éster. Exemplos de grupos de ligação cliváveis baseados em éster incluem, porém, não estão limitados a ésteres dos grupos alquileno, alcenileno e alcinileno.

[00226] Em uma modalidade, o grupo de ligação clivável pode ser um grupo de ligação clivável baseado em peptídeo. Grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeos são ligações peptídicas formadas entre aminoácidos para produzir oligopeptídeos (por exemplo, dipeptídeos, tripeptídeos etc.) e polipeptídeos. O grupo de clivagem baseado em peptídeo é geralmente limitado à ligação peptídica (isto é, a ligação de amida) formada entre aminoácidos que produzem peptídeos e proteínas e não inclui todo o grupo funcional amida. Os grupos de ligação cliváveis baseados em peptídeo têm a fórmula geral -NHCHRAC(O) NHCHRBC(O)-, onde RA e RB são os grupos R dos dois aminoácidos adjacentes.

[00227] O ácido nucleico conforme aqui descrito pode ser formulado com um lipídeo na forma de um lipossoma. Essa formulação pode ser descrita na técnica como um lipoplex. A formulação com um lípideo/lipossoma pode ser utilizada para ajudar na liberação do ácido nucleico da invenção às células alvo. O sistema de liberação de lipídeo aqui descrito pode ser usado como uma alternativa a um ligante conjugado. As modificações aqui descritas podem estar presentes quando se utiliza o ácido nucleico da invenção com um sistema de liberação de lipídeo ou com um sistema de liberação de conjugado de ligante.

[00228] Tal lipoplex pode compreender uma formulação lipídica compreendendo: i) um lipídeo catiônico ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídeo PEGuilado.

[00229] O lipídeo catiônico pode ser um lipídeo catiônico de amino.

[00230] O lipídeo catiônico pode ter a fórmula (I): ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que: X representa O, S ou NH; R1 e R2 cada qual independentemente representa uma cadeia de C4-C22 alquila linear ou ramificada ou uma cadeia de C4-C22 alquenila linear ou ramificada com uma ou mais ligações duplas, em que uma cadeia de alquila ou alquenila opcionalmente contém um éster, amida ou dissulfeto interveniente; quando X representa S ou NH, R3 e R4 cada qual independentemente representa hidrogênio, metila, etila, uma porção mono- ou poliamina, ou R3 e R4 juntamente formam um anel heterociclila; quando X representa O, R3 e R4 cada qual independentemente representa hidrogênio, metila, etila, uma porção mono- ou poliamina, ou R3 e R4 juntamente formam um anel heterociclila, ou R3 representa hidrogênio e R4 representa C(NH)(NH2).

[00231] O lipídeo catiônico pode ter a fórmula (IA): ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00232] O lipídeo catiônico pode ter a fórmula (IB):ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

[00233] O teor do componente lipídico catiônico pode ser de cerca de 55% em mol a cerca de 65% em mol do teor lipídico total da formulação. Em particular, o componente lipídico catiônico é de cerca de 59% em mol do teor lipídico total da formulação.

[00234] As formulações compreendem ainda um esteroide. O esteroide pode ser colesterol. O conteúdo do esteroide pode ser de cerca de 26% em mol a cerca de 35% em mol do teor lipídico total da formulação lipídica. Mais particularmente, o conteúdo de esteroide pode ser cerca de 30% em mol do teor lipídico total da formulação lipídica.

[00235] O fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1, 2-difiltanoil-sn-glicero-3-fosfoetanola- mina (DPhyPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-diestearoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), 1,2-dilauroil-sn- glicero-3-fosfoetanolamina (DLPE), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoeta- nolamina (DMPE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-Dilinoleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DLoPE), 1- Palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE), 1,2-Dierucoil- sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DEPE), 1,2-Diesqualeoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina (DSQPE) e 1-Estearoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfo- etanolamina (SLPE). O conteúdo do fosfolipídeo pode ser de cerca de 10% em mol do teor lipídico total da formulação.

[00236] O lipídeo PEGuilado pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em 1,2-dimiristoil-sn-glicerol, metoxipolietilenoglicol (DMG- PEG) e C16-Ceramida-PEG. O conteúdo do lipídeo PEGuilado pode ser de cerca de 1 a 5% em mol do teor lipídico total da formulação.

[00237] O teor do componente lipídico catiônico na composição pode ser de cerca de 55% em mol a cerca de 65% em mol do teor lipídico total da formulação lipídica, preferivelmente cerca de 59% em mol do teor lipídico total da formulação lipídica.

[00238] A formulação pode ter uma relação molar dos componentes de i): ii): iii): iv) selecionados dentre 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; e 65:24:10:1.

[00239] A composição pode compreender um lipídeo catiônico tendo a estruturaum esteroide tendo a estruturaum fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina tendo a estrutura;e um lipídeo PEGuilado tendo a estrutura;

[00240] As composições de lipossoma neutras podem ser formadas a partir de, por exemplo, dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) ou dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). As composições de lipossoma aniônicas podem ser formadas a partir de dimiristoilfosfatidilglicerol, enquanto os lipossomas fusogênicos aniônicos podem ser formados principalmente a partir de dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE). Outro tipo de composição lipossômica pode ser formado a partir de fosfatidilcolina (PC), tal como, por exemplo, PC de soja e PC de ovo. Outro tipo é formado a partir de misturas de fosfolipídeo e/ou fosfatidilcolina e/ou colesterol.

[00241] Um lipídeo catiônico sintético carregado positivamente, cloreto de N-[l-(2,3-dioleilóxi)propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA) pode ser usado para formar pequenos lipossomas que interagem espontaneamente com o ácido nucleico para formar complexos de lipídeo-ácido nucleico que são capazes de se fundir com os lipídios carregados negativamente das membranas celulares das células de cultura de tecido. Os análogos de DOTMA também podem ser usados para formar lipossomas.

[00242] Derivados e análogos de lipídeos aqui descritos também podem ser usados para formar lipossomas.

[00243] Um lipossoma contendo um ácido nucleico pode ser preparado por uma variedade de métodos. Em um exemplo, o componente lipídico de um lipossoma é dissolvido em um detergente, de modo que micelas são formadas com o componente lipídico. Por exemplo, o componente lipídico pode ser um lipídeo catiônico anfipático ou conjugado lipídico. O detergente pode ter uma alta concentração crítica de micelas e pode não ser iônico. Detergentes exemplares incluem colato, CHAPS, octilglicosídeo, desoxicolato e lauroil sarcosina. A preparação de ácido nucleico é, então, adicionada às micelas que incluem o componente lipídico. Os grupos catiônicos no lipídeo interagem com o ácido nucleico e condensam-se em torno do ácido nucleico para formar um lipossoma. Após a condensação, o detergente é removido, por exemplo, por diálise, para produzir uma preparação lipossômica de ácido nucleico.

[00244] Se necessário, um composto veículo que auxilia na condensação pode ser adicionado durante a reação de condensação, por exemplo, por adição controlada. Por exemplo, o composto veículo pode ser um polímero diferente de um ácido nucleico (por exemplo, espermina ou espermidina). O pH também pode ser ajustado para favorecer a condensação.

[00245] As formulações de ácido nucleico podem incluir um tensoativo. Em uma modalidade, o ácido nucleico é formulado como uma emulsão que inclui um tensoativo.

[00246] Um tensoativo que não é ionizado é um tensoativo não iônico. Exemplos incluem ésteres não iônicos, tais como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerila etc., alcanolamidas não iônicas, e éteres tais como etoxilatos de álcool graxo, alcoóis propoxilados e polímeros em bloco etoxilados/propoxilados.

[00247] Um tensoativo que transporta uma carga negativa quando dissolvido ou disperso em água é um tensoativo aniônico. Exemplos incluem carboxilatos, tais como sabões, acil lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico, tais como alquil sulfatos e alquil sulfatos etoxilados, sulfonatos tais como alquil benzeno sulfonatos, acil isetionatos, acil tauratos e sulfossuccinatos e fosfatos.

[00248] Um tensoativo que transporta uma carga positiva quando dissolvido ou disperso em água é um tensoativo catiônico. Exemplos incluem sais de amônio quaternário e aminas etoxiladas.

[00249] Um tensoativo que tem a capacidade de transportar uma carga positiva ou negativa é um tensoativo anfotérico. Exemplos incluem derivados do ácido acrílico, alquilamidas substituídas, N- alquilbetaínas e fosfatídeos.

[00250] "Micelas" são aqui definidas como um tipo particular de montagem molecular no qual moléculas anfipáticas estão dispostas em uma estrutura esférica de modo que todas as porções hidrofóbicas das moléculas sejam direcionadas para dentro, deixando as porções hidrofílicas em contato com a fase aquosa circundante. O arranjo inverso existe se o ambiente for hidrofóbico. Uma micela pode ser formada misturando uma solução aquosa do ácido nucleico, um alquil sulfato de metal alcalino e pelo menos um composto formador de micela.

[00251] Exemplos de compostos formadores de micelas incluem lecitina, ácido hialurônico, sais farmaceuticamente aceitáveis de ácido hialurônico, ácido glicólico, ácido láctico, extrato de camomila, extrato de pepino, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico, monooleína, monooleatos, monolauratos, óleo de borragem, óleo de prímula, mentol, tri-hidróxi oxo colanil glicina e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos sob o ponto de vista farmacêutico, glicerina, poliglicerina, lisina, polilisina, trioleína, éteres de polioxietileno e análogos dos mesmos, alquil éteres de polidocanol e análogos dos mesmos, quenodesoxicolato, desoxicolato e misturas dos mesmos.

[00252] Fenol e/ou m-cresol podem ser adicionados à composição micelar mista para atuar como estabilizador e conservante. Um agente isotônico tal como a glicerina pode ser adicionado.

[00253] Uma preparação de ácido nucleico pode ser incorporada em uma partícula tal como uma micropartícula. As micropartículas podem ser produzidas por secagem por pulverização, liofilização, evaporação, secagem em leito fluidizado, secagem a vácuo ou uma combinação destes métodos.

[00254] A presente invenção também fornece composições farmacêuticas compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção. As composições farmacêuticas podem ser usadas como medicamentos ou como agentes de diagnóstico, sozinhos ou em combinação com outros agentes. Por exemplo, um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção pode ser combinado com um veículo de liberação (por exemplo, lipossomas) e excipientes, tais como transportadores, diluentes. Outros agentes, tais como conservantes e estabilizadores, também podem ser adicionados. Os métodos para a liberação de ácidos nucleicos são conhecidos na técnica e dentro do conhecimento do especialista na técnica.

[00255] Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção também pode ser administrado em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separadamente ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada. A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção em um excipiente fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável, tal como um estabilizador, conservante, diluente, tampão e similares.

[00256] A composição farmacêutica pode ser especialmente formulada para administração na forma sólida ou líquida. A composição pode ser formulada para administração oral, administração parentérica (incluindo, por exemplo, injeção subcutânea, intramuscular, intravenosa ou peridural), aplicação tópica, administração intravaginal ou intrarretal, administração sublingual, administração ocular, administração transdérmica ou administração nasal. A liberação utilizando métodos subcutâneos ou intravenosos é preferida.

[00257] Os níveis de dosagem para o medicamento e as composições farmacêuticas da invenção podem ser determinados pelos especialistas na técnica por experimentação de rotina. Em uma modalidade, uma dose unitária pode conter entre cerca de 0,01 mg/kg e cerca de 100 mg/kg de peso corporal de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado. Alternativamente, a dose pode ser de 10 mg/kg a 25 mg/kg de peso corporal, ou 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, ou 0,05 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 5 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal, ou 0,1 mg/kg a 0,5 mg/kg de peso corporal ou 0,5 mg/kg a 1 mg/kg de peso corporal. Os níveis de dosagem também podem ser calculados através de outros parâmetros, tal como, por exemplo, área de superfície corporal.

[00258] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou solução aquosa injetável estéril, ou em uma forma liofilizada. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode compreender lipoplexos liofilizados ou uma suspensão aquosa de lipoplexos. Os lipoplexos compreendem preferivelmente um ácido nucleico da presente invenção. Tais lipoplexos podem ser utilizados para distribuir o ácido nucleico da invenção a uma célula-alvo in vitro ou in vivo.

[00259] As composições farmacêuticas e medicamentos da presente invenção podem ser administrados a um indivíduo mamífero em uma dose farmaceuticamente eficaz. O mamífero pode ser selecionado dentre um humano, um primata não humano, um símio ou prosimiano, um cachorro, um gato, um cavalo, gado, um porco, uma cabra, uma ovelha, um camundongo, um rato, um hamster, um porco- espinho e um porquinho-da-índia, ou outras espécies relevantes. Nesta base, a expressão "TMPRSS6", conforme usada aqui, denota ácido nucleico ou proteína em qualquer uma das espécies mencionadas acima, porém, preferivelmente essa expressão denota ácidos nucleicos ou proteínas humanos.

[00260] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um ácido nucleico da invenção ou à composição farmacêutica compreendendo o ácido nucleico da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio. A doença ou distúrbio pode ser selecionado a partir do grupo que compreende hemocromatose, porfiria cutânea e doenças do sangue, tais como β-talassemias ou doença das células falciformes, anemia diseritropoética congênita, síndrome da insuficiência medular, mielodisplasia e sobrecarga transfusional de ferro. O distúrbio pode estar associado à sobrecarga de ferro e o distúrbio associado à sobrecarga de ferro pode ser a doença de Parkinson, doença de Alzheimer ou ataxia de Friedreich.

[00261] Em particular, aspectos preferidos da invenção incluem:

[00262] Qualquer ácido nucleico, conforme descrito aqui, para uso em um ou mais ou todos dentre: (i) tratamento de anemia, opcionalmente determinado adequadamente por um aumento de hemoglobina ou hematócrito ou por diminuição de reticulócitos, conforme descrito pelos métodos aqui descritos; e/ou (ii) redução da esplenomegalia, opcionalmente determinada por uma redução no tamanho do baço em peso, conforme descrito pelos métodos aqui: e/ou (iii) melhoria da eritropoese ineficaz no baço, opcionalmente determinada pela redução na proporção relativa de células eritroides imaturas no baço, determinada por análise por FACS, conforme aqui descrito; e/ou (iv) Melhoria da maturação/eritropoese de glóbulos vermelhos na medula óssea, opcionalmente determinada por uma diminuição na proporção relativa de células progenitoras eritroides e aumento de células eritroides enucleadas determinadas por análise por FACS, conforme aqui descrito.

[00263] A invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo uma ou mais molécula de RNAi de acordo com a presente invenção em uma excipiente fisiologicamente/farmaceuticamente aceitável, tal como um estabilizador, conservante, diluente, tampão e similares.

[00264] A composição farmacêutica pode ser uma suspensão ou solução aquosa injetável estéril, ou em uma forma liofilizada.

[00265] As composições farmaceuticamente aceitáveis podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais ácido(s) nucleico(s) em qualquer modalidade de acordo com a invenção, empregadas isoladamente ou formuladas com um ou mais veículos, excipiente e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.

[00266] Exemplos de materiais que podem servir como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose; (2) amidos, tais como amido de milho e amido de batata; (3) celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose sódica, etil celulose e acetato de celulose; (4) tragacanto em pó; (5) malte; (6) gelatina; (7) agentes lubrificantes, tais como estado de magnésio, lauril sulfato de sódio e talco; (8) excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; (9) óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de açafrão, óleo de gergelim, azeite, óleo de milho e óleo de soja; (10) glicóis, tal como propileno glicol; (11) polióis, tais como glicerina, sorbitol, manitol e polietileno glicol; (12) ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; (13) ágar; (14) agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; (15) ácido algínico; (16) água livre de pirogênio; (17) solução salina isotônica; (18) solução de Ringer; (19) álcool etílico; (20) soluções tamponadas de pH; (21) poliésteres, policarbonatos e/ou polianidridos; (22) agentes de volume, tais como polipeptídeos e aminoácidos (23) componente sérico, tais como albumina sérica, HDL e LDL; e (22) outras substâncias compatíveis não tóxicas empregadas em formulações farmacêuticas.

[00267] Os estabilizadores podem ser agentes que estabilizam o agente de ácido nucleico, por exemplo, uma proteína que pode complexar com o ácido nucleico, quelantes (por exemplo, EDTA), sais, inibidores de RNAse e inibidores de DNAse.

[00268] Em alguns casos, é desejável retardar a absorção do fármaco por injeção subcutânea ou intramuscular, a fim de prolongar o efeito de um fármaco. Isto pode ser conseguido pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo tendo baixa solubilidade em água. A taxa de absorção do fármaco depende, então, da sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada de uma forma de fármaco administrada por via parentérica é realizada dissolvendo ou suspendendo o fármaco em um veículo oleoso.

[00269] O ácido nucleico aqui descrito pode ser capaz de inibir a expressão de TMPRSS6. O ácido nucleico aqui descrito pode ser capaz de inibir parcialmente a expressão de TMPRSS6 em uma célula. A inibição pode ser completa, isto é, 0% do nível de expressão da expressão de TMPRSS6 na ausência do ácido nucleico da invenção. A inibição da expressão de TMPRSS6 pode ser parcial, ou seja, pode ser 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% da expressão de TMRPSS6 na ausência de um ácido nucleico da invenção. A inibição pode durar 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas, 10 semanas, 11 semanas, 12 semanas, 13 semanas, 14 semanas ou até 6 meses, quando usada em um indivíduo, tal como um indivíduo humano. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção, ou composições incluindo o mesmo, pode ser usado em um regime que compreende tratamentos uma ou duas vezes por semana, toda semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas, ou a cada oito semanas, ou em regimes com frequência de dosagem variável, como combinações dos intervalos mencionados anteriormente. O ácido nucleico pode ser para uso subcutâneo, intravenoso ou usando quaisquer outras rotinas de aplicação, tal como oral, retal ou intraperitoneal.

[00270] Em células e/ou indivíduos tratados com ou recebendo o ácido nucleico da presente invenção, a expressão de TMPRSS6 pode ser inibida em comparação com células e/ou indivíduos não tratados por uma faixa de 15% a 100%, porém, pelo menos cerca de 30%, 35 %, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 100%. O nível de inibição pode permitir o tratamento de uma doença associada à expressão ou superexpressão de TMPRSS6, ou pode também permitir a investigação nas funções do produto do gene de TMPRSS6.

[00271] A expressão do gene da hepcidina em células e/ou indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção pode ser aumentada em comparação com células não tratadas e/ou indivíduos em pelo menos cerca de 1,2 vezes, cerca de 1,5 vezes, cerca de 2 vezes, cerca de 3 vezes, cerca de 4 vezes ou cerca de 5 vezes, devido à inibição completa ou parcial da expressão do gene TMPRSS6. Isto pode levar à concentração sérica de hepcidina em indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção podendo ser aumentada em comparação com indivíduos não tratados em pelo menos cerca de 10%, cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 100%, cerca de 150%, cerca de 200%, cerca de 250%, cerca de 300% ou cerca de 500%.

[00272] A concentração sérica em indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção pode ser diminuída em comparação com indivíduos não tratados em pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%. A saturação da transferrina é um exame médico laboratorial que mede a quantidade de transferrina que é ligada ao ferro. A saturação da transferrina, medida em porcentagem, é um valor médico laboratorial que mede o valor do ferro sérico dividido pela capacidade total de ligação ao ferro da transferrina. A saturação de transferrina em indivíduos tratados com um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção pode ser diminuída em comparação com indivíduos não tratados em pelo menos cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%.

[00273] Um outro aspecto da invenção refere-se ao ácido nucleico da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio, tal como doença ou distúrbio, conforme listado acima.

[00274] Também está incluído na invenção um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio, tais como os listados acima, compreendendo a administração de uma composição farmacêutica compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção, a um indivíduo que necessita de tratamento. A composição pode ser administrada duas vezes por semana, uma vez por semana, a cada duas semanas, a cada três semanas, a cada quatro semanas, a cada cinco semanas, a cada seis semanas, a cada sete semanas ou a cada oito semanas. O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado pode ser para uso subcutâneo ou intravenoso ou outras rotinas de aplicação, tal como oral, retal ou intraperitoneal.

[00275] Em uma modalidade, um indivíduo é administrado com uma dose inicial e uma ou mais doses de manutenção de um agente de ácido nucleico. A dose ou doses de manutenção podem ser iguais ou inferiores à dose inicial, por exemplo, metade a menos da dose inicial. As doses de manutenção são, por exemplo, administradas não mais que uma vez a cada 2, 5, 10 ou 30 dias. O regime de tratamento pode durar um período de tempo que varia dependendo da natureza da doença em particular, sua gravidade e a condição geral do paciente.

[00276] Em uma modalidade, a composição inclui uma pluralidade de espécies de agentes de ácidos nucleicos. Em outra modalidade, a espécie de agente de ácido nucleico tem sequências que não se sobrepõem e não são adjacentes a outra espécie em relação a uma sequência-alvo de ocorrência natural. Em outra modalidade, a pluralidade de espécies de agentes de ácidos nucleicos é específica para diferentes genes alvo de ocorrência natural. Em outra modalidade, o agente de ácido nucleico é específico do alelo.

[00277] Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da invenção também pode ser administrado ou para uso em combinação com outros compostos terapêuticos, administrados separadamente ou simultaneamente, por exemplo, como uma dose unitária combinada.

[00278] O ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado da presente invenção pode ser produzido utilizando métodos de rotina na técnica, incluindo síntese química ou expressando o ácido nucleico in vitro (por exemplo, transcrição run off) ou in vivo. Por exemplo, usando a síntese química em fase sólida ou usando um vetor de expressão baseado em ácido nucleico incluindo derivados virais ou sistemas de expressão parcialmente ou completamente sintéticos. Em uma modalidade, o vetor de expressão pode ser usado para produzir o ácido nucleico da invenção in vitro, dentro de um organismo hospedeiro intermediário ou tipo de célula, dentro de um organismo intermediário ou final ou dentro da célula-alvo desejada. Os métodos para a produção (síntese ou transcrição enzimática) do ácido nucleico aqui descrito são conhecidos pelos especialistas na técnica.

[00279] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a qualquer ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para uso, método, composição ou uso de acordo com qualquer descrição aqui, em que o ácido nucleico compreende uma modificação vinil-(E)- fosfonato, tal como uma modificação 5’ vinil-(E)-fosfonato, preferivelmente uma modificação 5’ vinil-(E)-fosfonato em combinação com uma modificação 2’-F na segunda posição da primeira fita.

[00280] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a qualquer ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para uso, método, composição ou uso de acordo com qualquer descrição aqui, em que o nucleotídeo terminal na extremidade 3’ de pelo menos uma dentre a primeira fita e a segunda fita é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 3’ do nucleotídeo terminal e o carbono 3’ do nucleotídeo adjacente e/ou o nucleotídeo terminal na extremidade 5’ de pelo menos uma dentre a primeira fita e a segunda fita é um nucleotídeo invertido e está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio do carbono 5’ do nucleotídeo terminal e do carbono 5’ do nucleotídeo adjacente, opcionalmente em que a. o nucleotídeo invertido 3’ e/ou 5’ da primeira e/ou segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosfato por meio de uma ligação de fosfodiéster; ou b. o nucleotídeo invertido 3’ e/ou 5’ da primeira e/ou segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosforotioato ou c. o nucleotídeo invertido 3’ e/ou 5’ da primeira e/ou segunda fita está ligado ao nucleotídeo adjacente por meio de um grupo fosforoditioato.

[00281] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a qualquer ácido nucleico, ácido nucleico conjugado, ácido nucleico para uso, método, composição ou uso de acordo com qualquer descrição aqui, em que o ácido nucleico compreende uma ligação de fosforoditioato, opcionalmente, em que a ligação está entre os 2 maiors nucleotídeos 5’ e/ou os 2 maiores nucleotídeos 3’ da segunda fita e/ou opcionalmente, em que o ácido nucleico adicionalmente não compreende qualquer ligação interna de fosforotioato.

[00282] Em outras modalidades da invenção, a invenção refere-se a uma sequência de ácido nucleico aqui descrita, em que a primeira fita e/ou a segunda fita do ácido nucleico compreende pelo menos um primeiro e um segundo tipo de ribonucleotídeo modificado, e em que há mais do primeiro tipo de ribonucleotídeo modificado que o segundo tipo de nucleotídeo modificado (por exemplo, mais de uma modificação 2’ O metila do que uma modificação 2’ flúor), como contado em cada fita individualmente ou através da primeira e da segunda fitas.

[00283] Para evitar dúvidas, o ácido nucleico pode ter mais de dois tipos de modificação.

[00284] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico descrita aqui, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação 2’ O-metila, tal como superior a 55%, 60%, 65 %, 70%, 75%, 80% ou 85% ou mais da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação 2’ O-metila, preferivelmente medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeiro e da segunda fitas.

[00285] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico aqui descrita, em que mais de 50% dos nucleotídeos da primeira e/ou segunda fita compreendem uma modificação de RNA de ocorrência natural, tal como em que mais de 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80% ou 85% ou mais da primeira e/ou segunda fita compreendem esta modificação, preferivelmente medida como uma porcentagem do total de nucleotídeos igualmente da primeira e da segunda fitas. Modificações de ocorrência natural adequadas incluem, bem como 2-O’ metila, outras modificações 2’ açúcar, em particular uma modificação 2’-H resultando em um nucleotídeo de DNA.

[00286] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico descrita aqui compreendendo não mais que 20%, tal como não mais que 15%, tal como não mais que 10%, de nucleotídeos que têm modificações 2’ que não são modificações 2’ O metila na primeira e/ou na segunda fita, preferivelmente como uma porcentagem do total de nucleotídeos da primeira e da segunda fitas.

[00287] Outra modalidade da invenção refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico aqui descrita compreendendo não mais que 20% (tal como não mais que 15% ou não mais que 10%) de modificações 2’ flúor na primeira e/ou segunda fita, preferivelmente como uma porcentagem do total de nucleotídeos de ambas as fitas.

[00288] Outra modalidade da invenção refere-se a um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo de HC18A como abaixo; e opcionalmente em que a referida segunda fita compreende a sequência de nucleotídeo de HC18b como abaixo:

[00289] Opcionalmente, as sequências de ácido nucleico são TMPRSS6-hc-18A, ou ambas, TMPRSS6-hc-18A e 18B, como abaixo:

[00290] Opcionalmente, as sequências de ácido nucleico são uma ou ambas as sequências listadas abaixo.

[00291] Todas as sequências são listadas 5’-3’. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo de HC23A como abaixo; e opcionalmente em que a referida segunda fita compreende a sequência de nucleotídeo de HC23B como abaixo:

[00292] Opcionalmente TMPRSS6-hc-23A, ou abaixo: te, as sequências de ácido nucleico são ambas dentre TMPRSS6-hc-23A e 23B como abaixo:

[00293] Opcionalmente, as sequências de ácido nucleico são uma ou ambas as sequências listadas abaixo.

[00294] Outra modalidade da invenção é um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS em uma célula, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene TMPRSS, em que a expressão de TMPRSS em uma célula é reduzida a níveis que são pelo menos 15% inferiores aos níveis de expressão observados nas mesmas condições de teste, porém, na ausência de ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou na presença de um controle sem silenciamento.

[00295] O ácido nucleico pode ser qualquer um aqui descrito.

[00296] Certas características preferidas da invenção estão listadas abaixo:Especificações da invenção 1. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira a fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção do RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 , 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165 , 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213 ou 215. 2. Um ácido nucleico da especificação 1, em que a segunda fita compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216. 3. Um ácido nucleico da especificação 1 ou especificação 2, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 17. 4. Um ácido nucleico de qualquer uma das especificações 1 a 3, em que a referida segunda fita compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 18. 5. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 1 a 4, em que a referida primeira fita e/ou a segunda fita são de 17 a 35 nucleotídeos no comprimento. 6. Um ácido nucleico de qualquer uma das especificações 1 a 5, em que a pelo menos uma região dúplex consiste em 19-25 pares de bases de nucleotídeo consecutivos. 7. Um ácido nucleico de qualquer especificação anterior, que a) é de extremidade cega em ambas as extremidades; ou b) tem uma saliência em uma extremidade e uma extremidade cega na outra; ou c) tem uma saliência em ambas as extremidades. 8. Um ácido nucleico, de acordo com qualquer especificação anterior, em que um ou mais nucleotídeos na primeira e/ou na segunda fita são modificados, para formar nucleotídeos modificados. 9. Um ácido nucleico da especificação 8, em que um ou mais dos nucleotídeos numerados ímpares da primeira fita são modificados. 10. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 9, em que um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da primeira fita são modificados por pelo menos uma segunda modificação, em que a pelo menos segunda modificação é diferente da modificação da especificação 9. 11. Um ácido nucleico da especificação 10, em que pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados pares modificados é adjacente a pelo menos um de um ou mais nucleotídeos numerados ímpares modificados. 12. Um ácido nucleico de qualquer uma das especificações 9 a 11, em que uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares é modificada. 13. Um ácido nucleico da especificação 10 a 12, em que uma pluralidade de nucleotídeos numerados pares é modificada por uma segunda modificação. 14. Um ácido nucleico de acordo com quaisquer das especificações 8 a 13, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. 15. Um ácido nucleico de qualquer uma das especificações 9 a 14, em que a primeira fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação da especificação 9. 16. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 9 a 15, em que um ou mais dos nucleotídeos ímpares numerados da segunda fita são modificados por uma modificação que é diferente da modificação da especificação 9. 17. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 9 a 15, em que um ou mais dos nucleotídeos numerados pares da segunda fita são modificados pela modificação da especificação 9. 18. Um ácido nucleico da especificação 16 ou 17, em que pelo menos um do um ou mais nucleotídeos numerados pares modificados da segunda fita é adjacente a um ou mais nucleotídeos numerados ímpares modificados da segunda fita. 19. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 16 a 18, em que uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares da segunda fita é modificada por uma modificação comum. 20. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 16 a 19, em que uma pluralidade de nucleotídeos numerados pares é modificada por uma modificação de acordo com a especificação 9. 21. Um ácido nucleico de qualquer uma das especificações 16 a 20, em que uma pluralidade de nucleotídeos numerados ímpares na segunda fita é modificada por uma segunda modificação, em que a segunda modificação é diferente da modificação da especificação 9. 22. Um ácido nucleico de quaisquer das especificações 16 a 21, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma modificação comum. 23. Um ácido nucleico de quaisquer das especificações 16 a 22, em que a segunda fita compreende nucleotídeos adjacentes que são modificados por uma segunda modificação que é diferente da modificação da especificação 9. 24. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 8 a 23, em que cada um dos nucleotídeos numerados ímpares na primeira fita e cada um dos nucleotídeos numerados pares na segunda fita são modificados com uma modificação comum. 25. Um ácido nucleico da especificação 24, em que cada um dos nucleotídeos numerados pares é modificado na primeira fita com uma segunda modificação e cada um dos nucleotídeos numerados ímpares é modificado na segunda fita com uma segunda modificação. 26. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 8 a 25, em que os nucleotídeos modificados da primeira fita são deslocados por pelo menos um nucleotídeo em relação aos nucleotídeos não modificados ou modificados de forma diferente da segunda fita. 27. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 8 a 26, em que a modificação e/ou modificações são cada qual e individualmente selecionadas a partir do grupo que consiste em desoxitimina 3’-terminal, 2’-O-metila, uma modificação 2’- desóxi, uma modificação 2’-amino, uma modificação 2’-alquila, uma modificação de morfolino, uma modificação de fosforamidato, modificação do grupo 5’-fosforotioato, uma modificação de 5’ fosfato ou imitativa de 5’ e um derivado de colesterila ou uma modificação do grupo bisdecilamida de ácido dodecanoico. 28. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 8 a 27, em que a modificação é qualquer um dentre um nucleotídeo bloqueado, um nucleotídeo abásico ou uma base não natural compreendendo o nucleotídeo. 29. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 8 a 28, em que pelo menos uma modificação é 2’-O- metila. 30. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 8 a 29, em que pelo menos uma modificação é 2’-F. 31. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID Nos: 1, 3, 5, 7, 9 , 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211 , 213 ou 215, em que os nucleotídeos da primeira fita são modificados por primeira modificação nos nucleotídeos numerados ímpares e modificados por uma segunda modificação nos nucleotídeos numerados pares e os nucleotídeos da segunda fita são modificados por um terceira modificação nos nucleotídeos numerados pares e modificada por uma quarta modificação nos nucleotídeos numerados ímpares, em que pelo menos a primeira modificação é diferente da segunda modificação e a terceira modificação é diferente da quarta modificação. 32. Um ácido nucleico da especificação 31, em que a segunda sequência compreende uma sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214 ou 216. 33. Um ácido nucleico da especificação 31 ou 32, em que a quarta modificação e a segunda modificação são as mesmas. 34. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 31 a 33, em que a primeira modificação e a terceira modificação são as mesmas. 35. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 31 a 34, em que a primeira modificação é 2’O-Me e a segunda modificação é 2’F. 36. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 31 a 35, em que a primeira fita compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 17 e a segunda fita compreende a sequência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 18. 37. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 31 a 36, compreendendo uma sequência e modificações, como mostrado na tabela abaixo: em que as modificações específicas são representadas por números 1. = 2’F-dU, 2. = 2’F-dA, 3. = 2’F-dC, 4. = 2’F-dG, 5. = 2’-OMe-rU; 6. = 2’-OMe-rA; 7. = 2’-OMe-rC; 8. = 2’-OMe-rG. 38. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 1 a 37, conjugado com um ligante. 39. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 1 a 38, compreendendo uma ligação de fosforotioato entre o terminal um, dois ou três nucleotídeos 3’ e/ou nucleotídeos 5’ da primeira e/ou da segunda fita. 40. Um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das especificações 1 a 39, compreendendo duas ligações de fosforotioato entre cada um dos três terminais 3’ e entre cada um dos três nucleotídeos terminais 5’ na primeira fita e duas ligações de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3’ da segunda fita. 41. Um ácido nucleico para inibir a expressão de TMPRSS6 em uma célula, compreendendo pelo menos uma região dúplex que compreende pelo menos uma porção de uma primeira fita e pelo menos uma porção de uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a pelo menos uma porção de um RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que a referida primeira fita compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das seguintes sequências: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 , 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211 , 213 ou 215, em que o referido ácido nucleico conjugado com um ligante. 42. Um ácido nucleico de acordo com a especificação 41, em que o ligante compreende (i) uma ou mais porções N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc a um ácido nucleico conforme definido na especificação 41 43. Um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 41 ou 42, em que o ligante pode ser uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente. 44. Um ácido nucleico das especificações 41 a 43, em que os nucleotídeos são modificados conforme definido em quaisquer especificações anteriores. 45. Um ácido nucleico de qualquer especificação anterior, em que o ligante compreende a fórmula I: [S-X1-P-X2]3-A-X3- (I) em que: S representa um sacarídeo, em que o sacarídeo é N-acetil galactosamina; X1 representa C3-C6alquileno ou (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2- em que m é 1, 2 ou 3; P é um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente, um tiofosfato); X2 é alquileno ou um éter de alquileno de fórmula (-CH2)n- O-CH2- onde n = 1-6; A é uma unidade de ramificação; X3 representa uma unidade em ponte; em que um ácido nucleico de acordo com a presente invenção é conjugado para X3 por meio de um fosfato ou fosfato modificado (preferivelmente, um tiofosfato). 46. Um ácido nucleico conjugado tendo uma das seguintes Estruturas em que Z é um ácido nucleico de acordo com quaisquer das especificações 1 a 40. 47. Um ácido nucleico de acordo com quaisquer das especificações 1 a 40, que é conjugado para um ligante da seguinte estrutura 48. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de qualquer especificação anterior, em que o dúplex compreende fitas separadas. 49. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de qualquer especificação anterior, em que o dúplex compreende uma fita única compreendendo uma primeira fita e uma segunda fita. 50. Uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado, conforme definido em qualquer especificação anterior e uma formulação compreendendo: i) um lipídeo catiônico, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo; ii) um esteroide; iii) um fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina; iv) um lipídeo PEGuilado. 51. Uma composição de acordo com a especificação 50, em que na formulação, o teor do componente lipídico catiônico é de cerca de 55% em mol a cerca de 65% em mol do teor lipídico total da formulação lipídica, preferivelmente cerca de 59% em mol do teor lipídico total da formulação lipídica. 52. Uma composição como declarada na especificação 50, em que a formulação compreende;Um lipídeo catiônico tendo a estrutura;o esteroide tem a estrutura;o fosfolipídeo de fosfatidiletanolamina tem a estrutura;e o lipídeo PEGuilado tem a estrutura 53. Uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de qualquer especificação anterior e um excipiente fisiologicamente aceitável. 54. Um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer especificação anterior para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio. 55. Utilização de um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer especificação anterior na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio. 56. Um método para tratar uma doença ou distúrbio compreendendo a administração de uma composição compreendendo um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer uma das especificações anteriores a um indivíduo em necessidade de tratamento. 57. O método da especificação 55, em que o ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado é administrado ao indivíduo por via subcutânea ou intravenosa. 58. Uso ou método de acordo com quaisquer das especificações 54 a 56, em que a referida doença ou distúrbio é selecionada a partir do grupo compreendendo hemocromatose, porfiria eritropoética, sobrecarga transfusional de ferro e distúrbios sanguíneos. 59. Uso ou método de acordo com a especificação 58, em que o distúrbio sanguíneo é β-talassemias, anemia falciforme, anemia sideroblástica congênita, anemia aplásica ou síndrome mielodisplásica. 60. Uso ou método de acordo com quaisquer das especificações 54 a 59, em que o distúrbio está associado à sobrecarga de ferro. 61. Uso ou método de acordo com a especificação 60, em que o distúrbio associado à sobrecarga de ferro é Doença de Parkinson, Doença de Alzheimer ou Ataxia de Friedreich. 62. Processo para produzir um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com quaisquer das especificações 1 a 49.

[00297] A invenção será agora descrita com referência às seguintes figuras e exemplos não limitativos, nos quais:

[00298] Figura 1 mostra os resultados de uma classificação da molécula de RNAi para inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B humanas;

[00299] Figura 2 mostra a dose resposta de moléculas de RNAi de TMPRSS6 em células Hep3B humanas;

[00300] Figura 3 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 no tecido hepático de camundongo por diferentes doses de moléculas de GalNAc siRNA;

[00301] Figura 4 mostra a duração da inibição do gene alvo de TMPRSS6 pelas moléculas de siRNA de TMPRSS6 e a indução da expressão de mAMP de HAMP em camundongos;

[00302] Figura 5 mostra que a inibição da expressão de TMPRSS6 por tratamento com moléculas de siRNA de TMPRSS6 reduz os níveis de ferro no soro por um período prolongado;

[00303] Figura 6 mostra a redução da expressão de TMRPSS6 em hepatócitos de camundongo 1os por captação mediada por receptor de moléculas de RNAi conjugadas com GalNAc;

[00304] Figura 7 mostra as moléculas de RNAi conjugadas com GalNAc usadas nos exemplos 1, 3, 4, 26 a 31 e 34 a 38;

[00305] Figuras 8a, 8b e 8c mostram a estrutura dos ligantes de GalNAc referidos aqui respectivamente como GN, GN2 e GN3, aos quais os oligonucleotídeos foram conjugados (veja também abaixo esta nomenclatura nos Exemplos onde TMPRSS6 hcm-9 é conjugado a cada um dos GN , GN2 e GN3);

[00306] Figura 9 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes variantes de modificação de siRNA em células Hep3B humanas;

[00307] Figura 10 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes conjugados de GalNAc-siRNA por captação mediada pelo receptor;

[00308] Figura 11 mostra a redução de TMPRSS6 e a indução da expressão de HAMP por diferentes conjugados de GalNAc-siRNA em camundongos;

[00309] Figura 12 mostra as sequências e modificações das moléculas de GalNAc-siRNA dos Exemplos 8, 9 e 10;

[00310] Figura 13 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 no tecido hepático e a redução dos níveis séricos de ferro em camundongos em diferentes pontos de tempo após a injeção única com conjugados de siRNA;

[00311] Figura 14 mostra a redução dos níveis de mRNA de TMPRSS6 no fígado e a redução dos níveis séricos de ferro em camundongos por diferentes doses de moléculas de siRNA conjugadas com GalNAc;

[00312] Figura 15 mostra o efeito de diferentes padrões de modificação na atividade de uma molécula de siRNA em células Hep3B humanas;

[00313] Figura 16 mostra o efeito de diferentes variantes de modificação de moléculas de siRNA conjugadas com GalNAc na inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B humanas;

[00314] Figura 17 mostra o efeito de uma variante de modificação de siRNAs conjugados com GalNAc na inibição da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo por captação mediada por receptor;

[00315] Figura 18 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes variantes de modificação de siRNA em células Hep3B humanas;

[00316] Figura 19 mostra a influência de nucleotídeos A e G invertidos na atividade de RNAi em células Hep3B humanas;

[00317] Figura 20 mostra a influência de nucleotídeos de RNA invertido na estabilidade do siRNA;

[00318] Figura 21 mostra a influência de nucleotídeos de RNA invertido na atividade de siRNA em células Hep3B humanas;

[00319] Figura 22 mostra a influência de nucleotídeos de RNA invertido na atividade de RNAi em células Hep3B humanas;

[00320] Figura 23 mostra a influência de nucleotídeos de RNA invertido na atividade de siRNAs conjugados com GalNAc em hepatócitos primários de camundongos por captação mediada por receptor;

[00321] Figura 24 mostra o efeito da ligação de fosforoditioato na estabilidade das moléculas de siRNA conjugadas com GalNAc;

[00322] Figura 25 mostra o efeito da ligação de fosforoditioato na atividade de uma molécula de siRNA conjugada com GalNAc na expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo;

[00323] Figura 26 mostra o efeito da ligação de fosforoditioato na estabilidade de uma molécula de siRNA conjugada com GalNAc;

[00324] Figura 27 mostra a inibição da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo por um conjugado de GalNAc siRNA contendo ligações de fosforoditioato;

[00325] Figura 28 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;

[00326] Figura 29 mostra o aumento dos níveis séricos de Hepcidina em diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;

[00327] Figura 30 mostra a redução dos níveis séricos de ferro por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;

[00328] Figura 31 mostra a redução da saturação de transferrina por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;

[00329] Figura 32 mostra o aumento da capacidade de ligação de ferro não saturada por diferentes doses de GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;

[00330] Figura 33 mostra a redução dos níveis de ferro no tecido pelos GalNAc siRNAs em um modelo animal para hemocromatose hereditária;

[00331] Figura 34 mostra a redução dos níveis de mRNA de TMPRSS6 humano nas células Hep3B pela liberação lipossômica de 43 siRNAs adicionais;

[00332] Figura 35 mostra as curvas de dose resposta de siRNAs diferentes para inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B;

[00333] Figura 36 mostra a redução da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos humanos primários por captação mediada por receptor de conjugados de GalNAc siRNA em diferentes concentrações;

[00334] Figura 37 mostra o aumento dos valores de hematócrito no modelo de roedor para a • -talassemia intermédia por tratamento com conjugados de GalNAc siRNA;

[00335] Figura 38 mostra a redução nas larguras de distribuição de glóbulos vermelhos no modelo de roedores para a • -talassemia intermédia por tratamento com conjugados de GalNAc siRNA.

[00336] Figura 39 mostra a redução na proporção de reticulócitos no modelo de sangue de roedor para a • -talassemia intermédia por tratamento com conjugados de GalNAc siRNA;

[00337] Figura 40 mostra a redução de espécies reativas de oxigênio nos glóbulos vermelhos do modelo de roedores para a • - talassemia intermédia por tratamento com conjugados de GalNAc siRNA.

[00338] Figura 41 mostra que siRNA de GalNAc TMPRSS6 aumenta os níveis de hemoglobina no modelo de roedor para a • - talassemia intermédia.

[00339] Figura 42 mostra que o GalNAc TMPRSS6 reduz a esplenomegalia no modelo de roedores para a • -talassemia intermédia.

[00340] Figura 43 mostra que GalNAc TMPRSS6 melhora a maturação de glóbulos vermelhos na medula óssea.

[00341] Figura 44 mostra que GalNAc TMPRSS6 reduz a eritropoese ineficaz no baço.

[00342] Figuras 45 a e b mostram curvas de dose-resposta de conjugados de siRNA contra TMPRSS6 em hepatócitos humanos primários.

[00343] Figura 46 mostra a inibição da expressão de mRNA de TMPRSS6 por conjugados de siRNA em hepatócitos humanos primários.

[00344] Figura 47 mostra sequências e padrão de modificação de conjugados de GalNAc siRNA que foram testados para inibição da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos humanos primários.

[00345] Figura 48 mostra sequências específicas de ácidos nucleicos usados no Exemplo 44.

[00346] Figura 49 mostra a captação mediada por receptor em hepatócitos primários de camundongo por conjugados de GalNAc siRNA direcionados a TMPRSS6 contendo diferentes químicas de estabilização final (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster).

[00347] Figura 50 mostra a estabilidade sérica de conjugados de GalNAc-siRNA com fosforotioatos, fosforoditioatos e fosfodiésteres em posições terminais e na porção GalNAc

[00348] Figura 51 mostra a inibição da expressão do gene TMPRSS6 em hepatócitos de murino primários 24h após o tratamento com TMPRSS6-siRNA transportando vinil-(E)-fosfonato 2’OMe-Uracila na posição 5’ da fita antissenso e duas ligações de fosforotioato entre os primeiros três nucleotídeos (X0204), vinil-(E)-fosfonato 2’OMe- Uracila na posição 5’ da fita antissenso e ligações de fosfodiéster entre os três primeiros nucleotídeos (X0205) (X0139) ou tetramérico (X0140)) ou uma árvore como o cluster de GalNAc trimérico (X0004) ou um GalNAc-siRNA não direcionado (X0028) nas concentrações indicadas ou deixado sem tratamento (UT).

[00349] Figura 52 mostra a estabilidade Sérica de conjugados de siRNA versus controle positivo menos estabilizado para degradação de nuclease.

Exemplos Exemplo 1

[00350] Os ácidos nucleicos de acordo com a invenção foram sintetizados, usando os oligos como estabelecido nas tabelas abaixo.

[00351] O método de síntese foi como segue, usando uma das sequências da invenção como exemplo: STS012 (GN-TMPRSS6-hcm-9) Primeira fita 5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3' Segunda fita 5' [ST23 (ps)]3 trebler longo (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) mU (ps) fU 3' fN (N = A, C, G, U) denota 2'Fluoro, 2' DesoxiNucleosídeos mN (N = A, C, G, U) denota 2'O Metil Nucleosídeos (ps) indica uma ligação de fosforotioato

[00352] ST23 é um GalNAc C4 fosforamidita (componentes estruturais como abaixo)

[00353] Um outro exemplo é GN2-TMPRSS6-hcm-9 (STS12009L4): Primeira fita 5'mA (ps) fA (ps) mC fC mA fG mA fA mG fA mA fG mC fA mG fG mU (ps) fG (ps) mA 3' Segunda fita 5' [ST23 (ps)] 3 ST41 (ps) fU mC fA mC fC mU fG mC fU mU fC mU fU mC fU mG fG (ps) mU (ps) fU 3' fN (N = A, C, G, U) denota 2'Fluoro, 2' DesoxiNucleosídeos mN (N = A, C, G, U) denota 2'O Metil Nucleosídeos (ps) indica uma ligação de fosforotioato

[00354] ST23 é como acima.

[00355] ST41 é como segue (e como descrito em WO2017/174657):

[00356] Todos os Oligonucleotídeos foram obtidos de um fabricante comercial de oligonucleotídeos (Eurogentech, Belgium; Biospring, Germany) ou sintetizados em um sintetizador AKTA oligopilot usando química padrão de fosforamidita. Utilizaram-se suporte sólido comercialmente disponível e 2’O-Metil RNA fosforamiditas, 2’Fluoro DNA fosforamiditas (toda a proteção padrão) e fosforamidita trebler longo comercialmente disponível (Glen research). A síntese foi realizada usando soluções 0,1 M de fosforamidita em acetonitrila seca e benziltiotetrazol (BTT) foi usado como ativador (0,3 M em acetonitrila). Todos os outros reagentes eram reagentes padrão comercialmente disponíveis.

[00357] A síntese de PSA contendo oligosnucleotídeos foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Glen Research, AM Biotech). 2’OMe-Uracil fosfoamidita de vinil-(E)-fosfonato foi sintetizado e utilizado na síntese de oligonucleotídeos de acordo com os métodos publicados na literatura (Haraszti et al., Nuc. Acids Res., 45(13), 2017, 7581-7592).

[00358] A conjugação do GalNAc synthon (ST23) foi alcançada acoplando a respectiva fosforamidita à extremidade 5’ da oligocadeia sob condições padrão de acoplamento de fosforamidita. Os fosforotioatos foram introduzidos utilizando reagentes de tiolação comercialmente disponíveis padrão (EDITH, Link technologies).

[00359] As fitas únicas foram clivadas do CPG usando Metilamina. Onde os RNA nucleosídeos protegidos por TBDMS foram usados, o tratamento adicional com TEA*3HF foi realizado para remover a proteção de silila. O oligonucleotídeo cru resultante foi purificado por cromatografia de troca iônica (Resource Q, 6 mL, GE Healthcare) em um Sistema de HPLC AKTA Pure usando um gradiente de cloreto de sódio.

[00360] As frações contendo o produto foram reunidas, dessalinizadas em uma coluna de exclusão por tamanho (Zetadex, EMP Biotech) e liofilizadas.

[00361] Para o recozimento, quantidades equimolares das respectivas fitas únicas foram dissolvidas em água e aquecidas a 80° C por 5 minutos. Após o resfriamento, o Dúplex resultante foi liofilizado.

[00362] As sequências dos ácidos nucleicos resultantes (siRNAs) são apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 Tabela 1: sequências de ácido nucleico testadas para inibição da expressão de TMPRSS6. Os ácidos nucleicos foram sintetizados por Biospring, Frankfurt. As modificações de nucleotídeos são representadas pelos seguintes números (coluna 4), 1=2'F-dU, 2=F'-dA, 3=2'F-dC,4=2'F-dG, 5=2’-OMe-dU; 6=2’-OMe-rA; 7=2’-OMe-dC; 8=2’-OMe-dG.Tabela 2 Tabela 2 - a posição inicial de cada sequência de ácido nucleico dentro da sequência de mRNA do TMPRSS6 Ref NM_001289000.1.Classificação para inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B humanas.

[00363] As células foram semeadas a uma densidade celular de 80.000 células por placa de 6 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com ácido nucleico 20 nM (listado na Tabela 1) e 1 μg/mL de AtuFECT (formulação de 50:50 de lipídeo catiônico Atufect01 e lipídeo fusogênico DPhyPE.). Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram determinados por q-RT-PCR usando os amplicons na Tabela 3. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de expressão do gene de manutenção PTEN. Os ácidos nucleicos para Luciferase e PTEN foram utilizados como ácidos nucleicos de controle não direcionados. Os resultados são mostrados na Figura 1.Tabela 3 Tabela 3: Sequências dos conjuntos de amplicons TMPRSS6, Actina, PTEN e HAMP que foram usadas para medir os níveis de mRNA dos respectivos genes.

Exemplo 2

[00364] Resposta da dose de ácidos nucleicos de TMPRSS6 para inibição da expressão de TMPRSS6 em células Hep3B humanas.

[00365] As células foram semeadas a uma densidade celular de 150.000 células por placa de 6 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com 1 μg/mL de AtuFECT (formulação de 50:50 de lipídeo catiônico Atufect01 e lipídeo fusogênico DPhyPE.) e diferentes quantidades de ácidos nucleicos de TMPRSS6 (30; 10; 3; 1; 0,3; 0,1; 0,003 nM, respectivamente) como representado pelo eixo X do gráfico na Figura 2. Para amostras de controle não direcionadas, as células foram transfectadas com ácido nucleico 30 e 10 nM para luciferase. Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA foram determinados por q-RT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de expressão do gene de manutenção PTEN. A maior redução da expressão do mRNA de TMPRSS6 foi observada pelo ácido nucleico de TMPRSS6- hcm9. A transfecção com ácido nucleico da luciferase não afetou os níveis de mRNA de TMPRSS6. Os resultados são mostrados na Figura 2. As sequências de moléculas de RNAi estão representadas na Tabela 1.

Exemplo 3 Inibição da expressão de TMPRSS6 no tecido hepático por diferentes doses de ácidos nucleicos de GalNAc.

[00366] Os camundongos C57/BL6 foram tratados com uma dose única de 10, 3 ou 1 mg/kg de conjugados de ácido nucleico de GalNAc por administração subcutânea. A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA são mostradas na Figura 7. Os siRNAs são conjugados para o ligante de GalNAc (GN) representado na Figura 8a e aqui descrito. Os grupos controle foram tratados com solução salina isotônica ou com conjugado controle não direcionado, GN-TTR-hc, respectivamente. A expressão do gene alvo no tecido hepático foi avaliada por qRT PCR três dias após a injeção subcutânea dos conjugados. O RNA total foi isolado a partir de amostras de tecido congelado rapidamente e o qRT-PCR foi realizado como descrito anteriormente (Kuhla et al. 2015, Apoptosis Vol 4, 50011). As sondas TaqMan que foram usadas são mostradas na Tabela 3. Os resultados são mostrados na Figura 3.

Exemplo 4

[00367] Duração da inibição do gene alvo pelas moléculas de RNAi de TMPRSS6.

[00368] Os camundongos foram tratados com moléculas de RNAi de GalNAc-TMPRSS6 de 3 mg/kg por injeção subcutânea. A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA são mostradas na Figura 7. A expressão do mRNA alvo foi avaliada no tecido do fígado nos dias 7, 14, 21, 27, 34 ou dia 41 após o tratamento (dias após a injeção, dpi). A redução da expressão de TMPRSS6 no fígado é observada até o dia 41 após a injeção. A expressão do mRNA de HAMP (hepcidina) é super-regulada no fígado de camundongos tratados com a molécula de RNAi de GN-TMPRSS6. Os resultados são mostrados na Figura 4.

Exemplo 5

[00369] A inibição da expressão de TMPRSS6 por tratamento com siRNA de TMPRSS6 reduz os níveis de ferro no sangue.

[00370] Os níveis de ferro foram analisados no soro 7, 14, 21, 27, 34 e 41 dias após o tratamento dos camundongos por via subcutânea com 3 mg/kg de conjugado de ácido nucleico de GalNAc. Os níveis séricos de ferro foram reduzidos até 41 dias após a injeção (dpi 41). A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA são mostradas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 5.

Exemplo 6

[00371] Inibição da expressão de TMPRSS6 por captação mediada por receptor.

[00372] Os hepatócitos primários de camundongo foram semeados em placas revestidas com colágeno e incubados com conjugados de siRNA diluídos em meio de cultura de células a uma concentração de 100nM a 0,03nM, como indicado. 24 Horas após a exposição das células aos conjugados de siRNA, o RNA total foi extraído e a expressão de TMPRSS6 foi quantificada por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA do TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA da actina. A inibição dependente da dose da expressão de TMPRSS6 foi observada por ambos os conjugados de siRNA GalNAc- TMPRSS6. O conjugado GN2-Luc-siRNA1 GalNAc (GN2-Luc) foi usado como controle não direcionado e não afetou a expressão do mRNA de TMPRSS6. A sequência e as modificações dos respectivos conjugados de siRNA estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 6.

Exemplo 7

[00373] Outros siRNAs de TMPRSS6 foram sintetizados, de acordo com o método descrito acima. As sequências e modificações são mostradas na Tabela 4 abaixo:

[00374] Variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6 (Sequência ID 17 e ID 18). Para cada dúplex, a primeira sequência (fita A) é listada na parte superior e a segunda sequência (fita B) abaixo. Todas as sequências correspondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). Os códigos de modificação estão listados no final da Tabela 4. Tabela 4 Tabela 4: As modificações são representadas pelos números mostrados nas fileiras na parte inferior da tabela e, para cada dúplex, a primeira fita está na parte superior e a segunda fita está abaixo.

[00375] Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. siRNAs direcionado ao PTEN e Luciferase foram utilizados como controles não relacionados e não direcionados, respectivamente. Todos os siRNAs foram transfectados com 1 μg/mL de Atufect a 1 nM (0,1 nM quando indicado). O RNA total foi extraído 48 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA do TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA da actina. Cada barra representa a média +/- SD de três replicações técnicas. Os resultados são mostrados na Figura 9.

Exemplo 8

[00376] As variantes de modificação de um siRNA conjugado com GalNAc direcionado ao TMPRSS6 foram sintetizadas e são mostradas na Figura 12. Para cada dúplex, a primeira sequência da fita é listada na parte superior e a segunda sequência da fita abaixo. As modificações são representadas como números e são como segue: GN indica conjugação para um ligante de GalNAc de acordo com a Figura 8a. A sequência e a modificação de STS12 (GN-TMPRSS6- hcm9) também estão representadas na Figura 7.

Exemplo 9

[00377] Diferentes variantes de modificação de uma sequência conjugada com GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS012) reduzem a expressão de TMPRSS6 em hepatócitos primários de camundongo. Para captação mediada por receptor, as células foram incubadas com 100, 10, 1 e 0,1 nM de conjugado de siRNA por 24 horas. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA do TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA da actina. A média +/- SD de cada três replicações técnicas é mostrada na Figura 10.

Exemplo 10

[00378] Diferentes variantes de modificação de uma sequência conjugada com GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS012, GN- TMPR SS6-hcm9) foram testadas in vivo. 1 mg/kg e 3 mg/kg de conjugado de GalNAc-siRNA foram injetados subcutaneamente em camundongos machos C57BL/6JOlaHsd. 14 Dias após o tratamento, os níveis de mRNA de TMPRSS6 (A) e HAMP (B) no fígado foram analisados por Taqman qRT-PCR. As barras representam média de pelo menos 4 animais +/- SD. Os resultados são mostrados na Figura11.

Exemplo 11

[00379] Duas variantes de modificação diferentes de uma sequência conjugada com GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS012) foram testadas in vivo. Os conjugados de GalNAc-siRNA de 1 mg/kg foram injetados subcutaneamente em camundongos machos C57BL/6JOlaHsd. 14 e 28 Dias após o tratamento, os níveis de mRNA de TMPRSS6 no fígado foram analisados por Taqman qRT-PCR (A). Além disso, os níveis séricos de ferro foram analisados (B). Os resultados são mostrados na Figura 13. Os gráficos em caixa representam a média de 4 animais. A análise estatística é baseada no teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparação múltipla de Dunn contra o grupo PBS.

[00380] As sequências são como no Exemplo 10.

Exemplo 12

[00381] Duas variantes de modificação diferentes de uma sequência conjugada com GalNAc direcionada ao TMPRSS6 (STS12009L4, GN2-TMPRSS6-hcm9) foram testadas in vivo. Os conjugados de GalNAc-siRNA de 1 mg/kg e 0,3 mg/kg foram injetados subcutaneamente em camundongos machos C57BL/6JOlaHsd. 14 Dias após o tratamento, os níveis de mRNA do TMPRSS6 no fígado foram analisados por Taqman qRT-PCR (A). Além disso, os níveis séricos de ferro foram analisados (B). Os resultados são mostrados na Figura 14. Os gráficos em caixa representam a média de 4 animais. A análise estatística é baseada no teste de Kruskal-Wallis com o teste de comparação múltipla de Dunn contra o grupo PBS.

[00382] Os dúplices usados são mostrados abaixo na Tabela 5. Todas as sequências correspondem às SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 18 mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNAfA, fU, fC, fG - 2’-F DNA(ps) - fosforotioatoGN2 = estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B Tabela 5 Tabela 5: Variantes de modificação de sequências conjugadas com GalNAc direcionadas ao TMPRSS6.

Exemplo 13

[00383] Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. Um siRNA direcionado à Luciferase foi utilizado como controle não direcionado. Todos os siRNAs foram transfectados com 1 μg/mL de Atufect a 1 nM e 0,1 nM. O RNA total foi extraído 48 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de mRNA de PTEN. Os resultados são mostrados na Figura 15. Cada barra representa a média +/- SD de três replicações técnicas.

[00384] As sequências são mostradas na Tabela 6 abaixo. Todas as sequências correspondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) – fosforotioato Tabela 6 Tabela 6: Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6.

Exemplo 14

[00385] As variantes de modificação de um siRNA conjugado com GalNAc direcionado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. 150.000 células foram semeadas por 6 cavidades. Após 24 h, os conjugados de siRNA foram transfectados com 1 μg/mL de Atufect em 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 nM (A) ou 5, 0,5, 0,05, 0,005 nM (B). Um GalNAc-siRNA contra Luciferase foi usado como controle não direcionado. O RNA total foi extraído 72 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT- PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de mRNA de PTEN (A) ou níveis de mRNA de Actina (B). Os resultados são mostrados na Figura 16. Cada barra representa a média +/- SD de três replicações técnicas.

[00386] As sequências são mostradas na Tabela 7, abaixomA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato GN2= estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B Tabela 6 Tabela 6: Diferentes variantes de modificação de um siRNA direcionado ao TMPRSS6.

Exemplo 14

[00387] Variantes de modificação de um siRNA conjugado com GalNAc direcionado ao TMPRSS6 foram testadas em células Hep3B humanas. 150.000 células foram semeadas por 6 cavidades. Após 24 h, os conjugados de siRNA foram transfectados com 1 μg/mL de Atufect 10, 1, 0,1, 0,01 e 0,001 nM (A) ou 5, 0,5, 0,05, 0,005 nM (B). Um GalNAc-siRNA contra Luciferase foi usado como controle não direcionado. O RNA total foi extraído 72 h após a transfecção e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram quantificados por Taqman qRT- PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de mRNA de PTEN (A) ou níveis de mRNA de Actina (B). Os resultados são mostrados na Figura 16. Cada barra representa a média +/- SD de três replicações técnicas.

[00388] As sequências são mostradas na Tabela 7, abaixomA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F RNA [A], [T], [C], [G] - DNA {A}, {U}, {C}, {G} - LNA (ps) – fosforotioato Tabela 8 Tabela 8: Diferentes variantes contendo DNA e LNA de um siRNA direcionado para TMPRSS6.

Exemplo 17

[00389] A influência dos nucleotídeos de RNA A e G invertidos nas posições 3’ terminais’ foi analisada usando um siRNA contra TMPRSS6. O TMP70 contém fosforotioatos em todos os terminais, enquanto o TMP82 e o TMP83 contêm ivA (TMP82) e ivG (TMP83) na extremidade 3’ do antissenso e na extremidade 3’ do sentido. Ambos os nucleotídeos invertidos estão presentes além do nucleotídeo terminal das respectivas fitas e estão ligados através de uma ligação de fosforotioato. Um siRNA não relacionado (PTEN) e um siRNA não direcionado (Luci) foram incluídos como controles. Todas as variantes testadas mostram atividade comparável sob condições testadas.

[00390] O experimento foi conduzido em células Hep3B. As células foram semeadas a uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, transfectadas com siRNA 1 nM e 0,1 nM e 1 μg/mL de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 19. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00391] As sequências são mostradas abaixo na Tabela 9. As sequências correspondem à SEQ ID NO: 17 (superior) ou SEQ ID NO: 18 (inferior).mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA ivA, ivG - RNA invertido (3’-3’) (ps) – fosforotioato Tabela 9 Tabela 9: Um siRNA contra TMPRSS6 incluindo nucleotídeos de RNA invertido em diferentes posições.

Exemplo 18

[00392] Diferentes dúplices de siRNA contendo nucleotídeos de RNA invertido em ambas as extremidades 3’ foram testados quanto à estabilidade sérica. TMP84-TMP87 contém RNA invertido além do último nucleotídeo na fita de senso e em vez do último nucleotídeo na fita antissenso. TMP88-TMP91 contém RNA invertido além do último nucleotídeo na fita antissenso e, em vez do último nucleotídeo na fita de senso. Todos os nucleotídeos de RNA invertido substituem os fosforotioatos terminalmente usados. No projeto de TMP84-TMP87, ivA e ivG conferem maior estabilidade à sequência testada do que ivU e ivC (parte A). No projeto do TMP88-TMP91, não há influência da identidade da base na estabilidade do dúplex (parte B).

[00393] Os resultados são mostrados na Figura 20. "UT" indica amostras não tratadas. "FBS" indica dúplices de siRNA que foram incubados na concentração final de 5 μM com 50% de FBS por 3 dias, extraídos com fenol/clorofórmio e precipitados com etanol. As amostras foram analisadas em géis de poliacrilamida de TBE a 20% em eletroforese em gel nativo.

[00394] As sequências são mostradas na Tabela 10 abaixo, e correspondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior). mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA ivA, ivU, ivC, ivG - RNA invertido (3’-3’) (ps) – fosforotioato Tabela 10 Tabela 10: Diferentes dúplices de siRNA contendo nucleotídeos de RNA invertido em ambas as extremidades 3’.

Exemplo 19

[00395] A influência de nucleotídeos de RNA invertido nas posições 3’ terminais’ foi analisada usando um siRNA contra TMPRSS6. O TMP70 contém fosforotioatos em todos os terminais, enquanto o TMP84-TMP87 contém ivG na extremidade 3’ da fita do senso. O nucleotídeo de RNA invertido está presente além do último nucleotídeo e substitui para dois fosforotioatos. Na extremidade 3’ antissenso, ivA (TMP84), ivU (TMP85), ivC (TMP86) e ivG (TMP87) foram testados. Estes nucleotídeos de RNA invertido foram adicionados em vez do nucleotídeo terminal e substituem os fosforotioatos. Um siRNA não relacionado (PTEN) e um siRNA não direcionado (Luci) foram incluídos como controle. Todas as variantes testadas mostram atividade comparável nas condições testadas.

[00396] O experimento foi conduzido em Hep3B. As células foram semeadas a uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, transfectadas com siRNA 1 nM e 0,1 nM e 1 μg/mL de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 21. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00397] As sequências são como na Tabela 10, acima.

Exemplo 20

[00398] A influência de nucleotídeos de RNA invertido nas posições 3’ terminais’ foi analisada usando um siRNA contra TMPRSS6. O TMP70 contém fosforotioatos em todos os terminais, enquanto o TMP88-TMP91 contém ivG na extremidade 3’ da fita antissenso. O nucleotídeo de RNA invertido está presente além do último nucleotídeo e substitui dois fosforotioatos. Na extremidade 3’ de senso, ivA (TMP88), ivU (TMP89), ivC (TMP90) e ivG (TMP91) foram testados. Estes nucleotídeos de RNA invertido foram adicionados em vez do nucleotídeo terminal e substituem os fosforotioatos. Um siRNA não relacionado (PTEN) e um siRNA não direcionado (Luci) foram incluídos como controles. Todas as variantes testadas mostram atividade comparável nas condições testadas.

[00399] O experimento foi conduzido em Hep3B. As células foram semeadas a uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, transfectadas com siRNA 1 nM e 0,1 nM e 1 μg/mL de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 22. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00400] As sequências são mostradas na Tabela 10 acima.

Exemplo 21

[00401] A influência de nucleotídeos de RNA invertido nas posições 3’ terminais foi analisada usando um conjugado de GalNAc-siRNA direcionado ao TMPRSS6 em transfecções lipossômicas. O STS12009-L4 contém fosforotioatos em todos os terminais não conjugados, enquanto as variantes testadas contêm um nucleotídeo de RNA invertido na extremidade 3’ da fita do senso e antissenso. O RNA invertido está presente além do último nucleotídeo e substitui dois fosforotioatos terminais (STS12009V10-L4 e -V11-L4) ou é usado além dos fosforotioatos terminais (STS12009V29-L4 e STS12009V30- L4). A invertido (STS12009V10-L4 e -V29-L4) e G invertido (STS12009V11-L4 e -V30-L4) foram utilizados. Todas as variantes testadas mostram atividade comparável sob as condições testadas.

[00402] O experimento foi conduzido em Hep3B. As células foram semeadas a uma densidade de 150.000 células por 6 cavidades, transfectadas com 5 nM a 0,0016 nM de siRNA e 1 μg/mL de Atufect após 24 h e lisadas após 48 h. O RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e Actina foram determinados por Taqman qRT- PCR. Os resultados são mostrados na Figura 23. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00403] As sequências são apresentadas na Tabela 11 abaixo e correspondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior).mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA ivA, ivG - RNA invertido (3’-3’) (ps) - fosforotioato GN2= estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B Tabela 11 Tabela 11: Uma sequência de siRNA incluindo nucleotídeos de RNA invertido nas extremidades 3’

Exemplo 22

[00404] Ensaio de estabilidade sérica de conjugados de GalNAc- siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais. O GalNAc foi conjugado à extremidade 5’ da fita do senso e é estabilizado internamente por quatro PS. Modificações de fosforoditioato foram colocadas nas extremidades 5’-antissenso (STS12009V37L4), 3’-antissenso (STS12009V36L4) e 3’-senso (STS12009V34L4). O STS12009L4 contém cada qual um dos dois PS terminais nas extremidades 5’-antissenso, 3’-antissenso e 3’-senso, GalNAc é ligado à extremidade 5’ senso e estabilizado por quatro PS internos. Os conjugados de GalNAc-siRNA de 5 μM foram incubados com 50% de FBS por 3 d a 37°C. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida de TBE a 20%. Os resultados são mostrados na Figura 24. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS. "Controle" indica um conjugado de GalNAc-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.

[00405] As sequências são mostradas na Tabela 12 abaixo e correspondem às SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior).mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato (ps2) - fosforoditioato GN2 = estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B Tabela 12 Tabela 12: Conjugados de GalNAc-siRNA contendo um PS2 (fosforoditioato) nas extremidades individuais.

Exemplo 23

[00406] Atividade de conjugados de GalNAc-siRNA contendo um PS2 em extremidades individuais. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5’ da fita do senso e é estabilizado internamente por quatro PS. Modificações de fosforoditioato foram colocadas nas extremidades 5’-antissenso (STS12009V37L4), 3’-antissenso (STS12009V36L4) e 3’-senso (STS12009V34L4). A experiência foi conduzida em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 250.000 células por 6 cavidades e tratadas com 100 nM, 10 nM e 1 nM de GalNAc-siRNA. Transfecções com 10 nM de GalNAc-siRNA e 1 μg/mL de Atufect serviram como controle. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e PTEN foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 25. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00407] As sequências são como apresentadas na Tabela 12 acima.

Exemplo 24

[00408] Ensaio de estabilidade sérica de um conjugado de GalNAc- siRNA (STS12009V40L4) contendo cada qual um PS2 na segunda extremidade 5’ da fita e na segunda extremidade 3’ da fita. GalNAc foi conjugado com a extremidade 5’ da segunda fita e não é estabilizado por nenhum PS interno. O STS12009L4 contém cada qual dois PS terminais nas extremidades 5’-antissenso, 3’-antissenso e 3’-senso, GalNAc é ligado à extremidade 5’ do senso e estabilizado por quatro PS internos. Os conjugados de GalNAc-siRNA 5 μM foram incubados com 50% de FBS por 3 d a 37°C. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida de TBE a 20%. Os resultados são mostrados na Figura 26. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS. "Controle" indica um conjugado de GalNAc-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.

[00409] As sequências são apresentadas na Tabela 13 abaixo, e são SEQ ID NO: 17 (superior) e SEQ ID NO: 18 (inferior).mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato (ps2) - fosforoditioato GN2 - GalNAc, estrutura de acordo com a Figura 8B GNo - GN2 com fosfodiésteres em vez de (ps) Tabela 13 Tabela 13: Conjugado de GalNAc-siRNA contendo cada qual um PS2 na segunda extremidade 5’ da fita e na segunda extremidade 3’ da fita.

Exemplo 25

[00410] Atividade de um conjugado de GalNAc-siRNA (STS12009V 40L4) contendo cada qual um PS2 na extremidade 5’ da fita de senso e na extremidade 3’ da fita de senso. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5’ da fita do senso e não é estabilizado por nenhum PS interno. O STS12009L4 contém cada qual dois PS terminais nas extremidades 5’-antissenso, 3’-antissenso e 3’-senso, GalNAc é ligado à extremidade 5’ de senso e estabilizado por quatro PS internos. A experiência foi conduzida em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 250.000 células por 6 cavidades e tratadas com 100 nM, 10 nM e 1 nM de GalNAc-siRNA. Um conjugado de GalNAc de um siRNA contra luciferase ("GalNAc- Luc") serviu como controle. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e PTEN foram determinados por Taqman qRT-PCR. Os resultados são mostrados na Figura 27. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00411] As sequências são como apresentadas na Tabela 13 acima.

Exemplo 26

[00412] Inibição da expressão de TMPRSS6 por diferentes doses de GalNAc siRNAs em modelo animal para hemocromatose hereditária. Camundongos fêmeas HFE-/- (Herrmann et al., J. Mol. Med (Berl), 2004 82, 39-48) foram tratados por via subcutânea com uma dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA, respectivamente. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-Luc) por injeção subcutânea. A expressão do gene alvo no tecido hepático foi avaliada por qRT PCR três semanas após a injeção dos conjugados. Média do grupo e +/- SD. Estatísticas: Teste de Kruskal-Wallis com Dunn não corrigido. A sequência e a modificação dos conjugados de siRNA estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 28. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05.

Exemplo 27

[00413] Aumento dos níveis séricos de Hepcidina em diferentes doses de GalNAc siRNAs em modelo animal para hemocromatose hereditária. Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por injeção subcutânea. Os grupos de controle foram tratados com PBS ou com o conjugado de controle não direcionado GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc). Os níveis de hepcidina foram determinados em amostras séricas coletadas três semanas após a injeção dos conjugados usando o kit ELISA (Intrinsic Life Science). Médias do grupo com SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc siRNA). Os resultados são mostrados na Figura 29. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05.

Exemplo 28

[00414] Redução dos níveis séricos de ferro por diferentes doses de GalNAc siRNAs em modelo animal para hemocromatose hereditária. Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutânea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com conjugado controle não direcionado (GN2-Luc siRNA). Os níveis séricos de ferro foram determinados três semanas após o tratamento. Médias de grupo +/- SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). Sequências e modificações de conjugados de siRNA estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 30. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05.

Exemplo 29

[00415] Redução da saturação de transferrina por diferentes doses de GalNAc siRNAs em modelo animal para hemocromatose hereditária. Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutânea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o conjugado controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-Luc). O % de saturação de transferrina nas amostras de sangue foi determinado três semanas após o tratamento. Médias de grupo com SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). A sequência e a modificação dos conjugados de siRNA estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 31. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; ** 01; *P<0,05.

Exemplo 30

[00416] Aumento da Capacidade de Ligação de Ferro Insaturado (UIBC) em modelo animal para hemocromatose hereditária. Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutânea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o conjugado controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-LUC). As amostras séricas foram coletadas três semanas após o tratamento para determinação da UIBC. Médias de grupo com SD. Teste de Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). Os resultados são mostrados na Figura 32. Valores de P: ****P<0,001; ***P<0,005; **,01; *P<0,05.

Exemplo 31

[00417] Redução dos níveis de ferro nos tecidos por GalNAc siRNAs em modelo animal para hemocromatose hereditária. Os camundongos HFE-/- foram tratados com dose única de 1 ou 3 mg/kg de conjugado de GalNAc siRNA por administração subcutânea. Os grupos controle foram tratados com PBS ou com o conjugado controle não direcionado GN2-Luc siRNA1 (GN2-Luc). Os níveis de ferro no tecido renal foram avaliados três semanas após o tratamento. Teste em caixa e de Wiskers (Tukey, valores medianos) Kruskal-Wallis com teste de Dunn não corrigido contra o grupo controle (GN2-Luc). Os resultados são mostrados na Figura 33.

Exemplo 32 Redução da expressão de mRNA de TMPRSS6 por diferentes siRNAs nas células Hep3B.

[00418] 8000 Células por cavidade foram semeadas em placas de 96 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com siRNA 20 nM e AtuFECT 1 μg/mL. Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram determinados por q-RT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de expressão do gene de manutenção ApoB. Um siRNAs contra Luciferase foi usado como controle não direcionado. A inibição média e o desvio padrão dos valores em triplicado em relação às células não tratadas são mostrados na Figura 34. As sequências dos siRNAs são mostradas na Tabela 14, abaixo. Tabela 14 Tabela 14: Sequências de siRNAs contra TMPRSS6 testado no exemplo 32. Desoxinucleotídeos modificados por fU, fA, fC, fG - 2’F.Nucleotídeos modificados por mU, mA, mC, mG - 2’O-metila.

Exemplo 33 Dose-resposta de siRNAs contra TMPRSS6 em células Hep3B.

[00419] 8000 Células por cavidade foram semeadas em placas de 96 cavidades. No dia seguinte, as células foram transfectadas com siRNA nas concentrações indicadas (100 nM - 0,03 nM) e 1 μg/mL de AtuFECT. Dois dias após a transfecção, as células foram lisadas e os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram determinados por q-RT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para níveis de expressão do gene de manutenção ApoB. A inibição média e o desvio padrão dos valores em triplicado em relação às células tratadas com 100 nM de um siRNA de controle de luciferase não direcionado são mostrados na Figura 35. Tabela 15, abaixo, mostra inibição máxima, IC50 e 95% de intervalo de confiança de acordo com as curvas de dose-resposta mostradas na Figura 35.Tabela 15 Tabela 15: Inibição máxima, IC50 e 95% de intervalo de confiança de acordo com a dose resposta mostrada na Fig.35.

Exemplo 34

[00420] Inibição da expressão de mRNA de TMPRSS6 por captação mediada por receptor em hepatócitos humanos 1os.

[00421] Os hepatócitos humanos primários foram semeados em placas revestidas com colágeno e incubados com conjugados de siRNA diluídos em meio de cultura de células em concentrações de 300 nM a 1 nM, como indicado. 24 Horas após a exposição das células aos conjugados de siRNA, o RNA total foi extraído e a expressão de TMPRSS6 foi quantificada por Taqman qRT-PCR. Os níveis de mRNA de TMPRSS6 foram normalizados para os níveis de mRNA de Actina e para atingir os níveis de mRNA de células tratadas com o conjugado de siRNA controle não direcionado GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc). A inibição dependente da dose da expressão de TMPRSS6 foi observada pelo conjugado de siRNA GalNAc- TMPRSS6. Sequências e modificações dos conjugados estão representadas na Figura 7. Os resultados são mostrados na Figura 36.

Exemplo 35

[00422] O siRNA de GalNAc TMPRSS6 aumenta os valores de hematócrito no modelo de roedores para a • -talassemia intermédia.

[00423] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2-Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camundongos do tipo selvagem não tratados (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão de manchamento por pontos, média +/- SD; n = 3-6. Estatística: teste t não pareado com correção de Welch. Os resultados são mostrados na Figura 37.

Exemplo 36

[00424] O siRNA de GalNAc TMPRSS6 reduz a largura de distribuição de glóbulos vermelhos no modelo de roedores para a b- talassemia intermédia.

[00425] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA1 (GN2 -Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camundongos do tipo selvagem não tratado (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão de manchamento por pontos, média +/- SD; n = 3-6. Estatística: teste t não pareado com correção de Welch. Os resultados são mostrados na Figura 38.

Exemplos 37

[00426] O siRNA de GalNAc TMPRSS6 reduz a proporção de reticulócitos no modelo de roedores para a • • talassemia intermédia.

[00427] Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2 -Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camundongos do tipo selvagem não tratados (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão de manchamento por pontos, média +/- SD; n = 3-6. Estatística: teste t não pareado com correção de Welch. Os resultados são mostrados na Figura 39.

Exemplos 38

[00428] O siRNA de GalNAc TMPRSS6 reduz a quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS) no modelo de roedores para a • - talassemia intermédia. Camundongos Hbbth3/+ (Th3/+; Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP) ou GN2-Luc 1 siRNA (GN2-Luc) como controle não direcionado. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. As medidas de ROS foram realizadas 5 min. Após a adição de 2’7’ dicloro-fluoresceína como indicador (Siwaponanan et al., 2017 Blood, 129, 3087-3099). Amostras de sangue de camundongos tratados com GN2-TMPRSS6 hcm9 foram medidas duas vezes. Os camundongos Hbbth3/+ (Th3/+) foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camundongos do tipo selvagem não tratados (WT) (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão de manchamento por pontos, média +/- SD; n = 4-6. Estatística: teste t não pareado com correção de Welch. Os resultados são mostrados na Figura 40.

Exemplo 39

[00429] O siRNA de GalNAc TMPRSS6 aumenta os níveis de hemoglobina no modelo de roedores para a • -talassemia intermédia. Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc- siRNA 1 (GN2-Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, respectivamente. No dia 36, o sangue total foi coletado em tubos revestidos com heparina para exame completo de sangue. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Amostras de sangue de camundongos não tratados (wt) do tipo selvagem (C57BL/6) foram coletadas e analisadas para comparação. Dispersão de manchamento por pontos, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: Testes t de Welch não corrigido para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 41. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7.

Exemplo 40

[00430] GalNAc TMPRSS6 reduz a esplenomegalia no modelo de roedores para a • -talassemia intermédia. Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc-siRNA 1 (GN2-Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, respectivamente. No d 39, os pesos do baço foram avaliados. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. Os pesos de baço de camundongos do tipo selvagem (peso) (C57BL/6) tratados com PBS foram avaliados para comparações. Dispersão de manchamento por pontos, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: testes t de Welch não corrigidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 42. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7.

Exemplo 41

[00431] GalNAc TMPRSS6 melhora a maturação de glóbulos vermelhos na medula óssea. Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6-hcm9 (GN2-TMP), GN2- Luc-siRNA 1 (GN2-Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, no dia d39, células foram coletados da medula óssea e analisadas por análise por FACS. As células eritroides viáveis foram separadas em populações distintas com base na coloração de CD71, Ter119 e CD44. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. As células eritroides da medula óssea de camundongos do tipo selvagem (peso) (C57BL/6) tratadas com PBS foram avaliadas para comparações. Gráfico de barras, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: testes t de Welch não corrigidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 43. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7.

Exemplo 42

[00432] GalNAc TMPRSS6 reduz a eritropoese ineficaz no baço. Camundongos Hbbth3/+ (Yang et al. 1995, PNAS Vol. 92, 11608-11612) foram tratados no d1 e no d15 por via subcutânea com 3 mg/kg de GN2-TMPRSS6 hcm9 (GN2-TMP), GN2-Luc siRNA 1 (GN2 -Luc) ou PBS como controle não direcionado ou como controle de veículo, respectivamente. No d 39, as células foram coletadas do baço e analisadas por análise por FACS. As células eritroides viáveis foram separadas em populações distintas com base na coloração de CD71, Ter119 e CD44. Os camundongos Hbbth3/+ foram obtidos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e mantidos em uma base de C57BL/6. As células eritroides dos camundongos do tipo selvagem (peso) (C57BL/6) tratadas com PBS foram avaliadas para comparações. Gráfico de barras, média +/- SD; n = 5-7. Estatística: testes t de Welch não são corrigidos para comparação múltipla. Os resultados são mostrados na Figura 44. Os conjugados de siRNA estão representados na Figura 7.

Exemplo 43 Redução da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos humanos por conjugados de GalNAc siRNA.

[00433] 30.000 cpw de hepatócitos primários humanos foram semeados em placas de 96 cavidades revestidas com colágeno. As células foram tratadas com quantidades indicadas de conjugados de siRNA imediatamente após a semeadura. As células foram lisadas 24 horas após o tratamento e a expressão do mRNA de TMPRSS6 analisada por TaqMan qRT-PCR. Valores em triplicado de TMPRSS6 normalizados para ApoB (de manutenção) e para a média de células não tratadas são mostrados.

[00434] Os resultados são mostrados nas Figuras 45a, 45b e 46, e as sequências são mostradas na Figura 47.

[00435] O ligador GN3 descrito é mostrado na Figura 8C.

Exemplo 44

[00436] Ensaio de estabilidade sérica de conjugados de GalNAc- siRNA com fosforotioatos, fosforoditioatos e fosfodiésteres em posições terminais e na porção GalNAc. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5’ da fita do senso e é estabilizado internamente por quatro PS (STS12009L4) ou não; em seguida, ligações de fosfodiéster são utilizadas (STS12009V54L50 - V57L50). Modificações de fosforoditioato foram colocadas em todas as posições terminais do dúplex, exceto na extremidade 5’ da primeira fita (-V54L50), somente nas extremidades 3’ (-V55L50, -V57L50) ou na extremidade 3’ somente da segunda fita (-V56L50). Em certos projetos, fosfodiésteres foram utilizados em posições terminais do siRNA dúplex (-V56L50, - V57L50). Os conjugados de GalNAc-siRNA 5 μM foram incubados com 50% de FBS por 3 d a 37°C. O RNA foi extraído e analisado em géis de poliacrilamida de TBE a 20%. "UT" indica amostras não tratadas, "FBS" indica tratamento com FBS. "Controle" indica um conjugado de GalNAc-siRNA menos estabilizado de sequência diferente.

[00437] Os conjugados de GalNAc de um siRNA direcionado ao TMPRSS6 contendo diferentes químicas de estabilização final (fosforotioato, fosforoditioato, fosfodiéster) foram testados por captação mediada por receptor em hepatócitos primários de camundongo. O GalNAc foi conjugado com a extremidade 5’ da segunda fita e é estabilizado internamente por quatro PS (STS12009L4) ou não, em seguida as ligações de fosfodiéster são usadas (STS12009V54L50 - V57L50). Modificações de fosforoditioato foram colocadas em todas as posições terminais do dúplex, exceto na extremidade 5’ de primeira fita (-V54L50), somente nas extremidades 3’(-V55L50, -V57L50) ou na extremidade 3’ somente da segunda fita (- V56L50). Em certos projetos, os fosfodiésteres foram utilizados em posições terminais do siRNA dúplex (-V56L50, -V57L50). A experiência foi conduzida em hepatócitos primários de camundongo. As células foram semeadas a uma densidade de 20.000 células por 96 cavidades e tratadas com 125 nM a 0,2 nM de GalNAc-siRNA. As células foram lisadas após 24 h, o RNA total foi extraído e os níveis de mRNA de TMPRSS6 e PTEN foram determinados por Taqman qRT- PCR. Cada barra representa a média ± SD de três replicações técnicas.

[00438] Os resultados e sequências relevantes são mostrados nas Figuras 48 a 50.

Exemplo 45

[00439] Redução da expressão de TMPRSS6 em hepatócitos de murino primários por conjugados de GalNAc siRNA com 2’-O-metil- uridina ou 5’- (E)-vinilfosfonato-2’-O-metil-uridina, substituindo a 2’-O- metil-adenina na posição 5’ da primeira fita.

[00440] Os hepatócitos primários de murino foram semeados em placas de 96 cavidades pré-revestidas com colágeno (Thermo Fisher Scientific, # A1142803) a uma densidade celular de 30.000 células por cavidade e tratadas com conjugados de siRNA em concentrações variando de 100nM a 0,1nM. As células após 24 horas de tratamento foram lisadas e o RNA extraído com InviTrap® RNA Cell HTS 96 Kit / C24 x 96 preps (Stratec # 7061300400) de acordo com o protocolo do fabricante. Os níveis de transcrições de TMPRSS6 e mRNA de manutenção (PtenII) foram quantificados por análise TaqMan.conjugados de siRNA: Legenda: mN 2’-O-metil ribonucleotídeo (pro exemplo, mU - 2’-O-metil Uracila) fN 2’-fluoro ribonucleotídeo (pro exemplo, fC - 2’-fluoro Citidina) (ps) fosforotioato vinilfosfonato vinil-(E)-fosfonato GN2 estrutura de acordo com a Figura 8B Sondas e iniciadores TaqMan Legenda: FAM - 6-carboxifluoresceína (corante fluorescente) TAMRA - tetrametilrodamina (extintor) BHQ1 - extintor de orifício negro 1 (extintor)

Dose-resposta in vitro

[00441] Expressão do gene alvo em hepatócitos de murino primários 24h após o tratamento com TMPRSS6-siRNA transportando vinil-(E)- fosfonato 2’OMe-Uracila na posição 5’ da fita antissenso e duas ligações de fosforotioato entre os três primeiros nucleotídeos (STS12209V4L4 ), vinil- (E)-fosfonato 2’OMe-Uracila na posição 5’ da fita antissenso e das ligações de fosfodiéster entre os três primeiros nucleotídeos (STS12209V5L4), transportando 2’-O-metil-Uracila e duas ligações de fosforotioato entre os três primeiros nucleotídeos na posição 5’ (STS12209L4) ou transportando 2’-O-metil-Uracila e duas ligações de fosfodiéster entre os três primeiros nucleotídeos na posição 5’ (STS12209V1L4) ou) ou (STS12009L4) como referência ou um GalNAc-siRNA não direcionado (STS18001) nas concentrações indicadas ou deixados sem tratamento (UT).

[00442] Os resultados são mostrados na Figura 51.

Estabilidade sérica

[00443] Estabilidade sérica de conjugados de siRNA incubados por 4 horas (4h) ou 3 dias (3d) ou deixados sem tratamento (0h) em 50% de FCS a 37°C. O RNA a seguir foi extraído por extração de fenol/clorofórmio/álcool isoamílico. A degradação foi visualizada por eletroforese em gel de Poliacrilamida de TBE e corando o RNA com SybrGold.

[00444] Os resultados são mostrados na Figura 52: Estabilidade sérica de conjugados de siRNA vs. controle positivo menos estabilizado para degradação de nuclease. Sumário TABELA DE SEQUÊNCIA Chave 1 = 2’F-dU 2 = 2’F-dA 3 = 2’F-dC 4 = 2’F-dG 5 = 2’OMe-rU 6 = 2’OMe- rA 7 = 2’OMe-rC 8 = 2’OMe-rG T = dT u = rU a = rA c = rC g = rG mA, mU, mC, mG - 2’-OMe RNA fA, fU, fC, fG - 2’-F DNA (ps) - fosforotioato GN = ligador de GalNAc GN de acordo com a figura 8A GN2 = estrutura de GalNAc de acordo com a figura 8B GN3 = estrutura de ligador de GalNAc GN de acordo com a figura 8C GNo = GN2 com fosfodiésteres em vez de (ps) [A], [T], [C], [G] - DNA {A}, {U}, {C}, {G} - LNA ivA, ivC, ivU, ivG - RNA invertido (3’-3’) (ps2) - fosforoditioato vinilfosfonato vinil-(E)-fosfonato FAM - 6-Carboxifluoresceína TAMRA - 5-Carboxitetrametilrodamina BHQ - Extintor de Orifício Negro 1

[00445] Onde ligantes específicos e/ou ligações modificadas são ensinados dentro de uma sequência de RNA, tal como PS, PS2, GN, GN2, GN3 etc etc, estas são partes opcionais da sequência, porém, são uma modalidade preferida desta sequência.

[00446] As seguintes abreviações podem ser usadas:

Claims (16)

1. Ácido nucleico para inibir a expressão de Serina protease transmembrana 6 (TMPRSS6)/Matriptase-2, caracterizado pelo fato de que compreende uma região dúplex que compreende uma primeira fita e uma segunda fita que é pelo menos parcialmente complementar à primeira fita, em que a referida primeira fita é pelo menos parcialmente complementar a uma porção do RNA transcrito a partir do gene TMPRSS6, em que o referido ácido nucleico compreende a seguinte primeira fita: 5 ‘- 3’: aaccagaagaagcagguga (SEQ ID NO: 333); e compreende ainda a segunda segunda fita: 5 ‘- 3’: ucaccugcuucuucugguu (SEQ ID NO: 334).

2. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida primeira fita compreende a sequência de nucleotídeo modificada de SEQ ID NO: 17 e em que a referida segunda fita compreende a sequência de nucleotídeo modificada de SEQ ID NO: 18 em que as modificações específicas são representadas pelos seguintes números 1 = 2’F-dU, 2 = 2’F-dA, 3 = 2’F-dC, 4 = 2’F-dG, 5 = 2’-OMe-rU; 6 = 2’-OMe-rA; 7 = 2’-OMe-rC; 8 = 2’-OMe-rG.

3. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a primeira fita consiste na sequência: 5' - 3': aaccagaagaagcagguga (SEQ ID NO: 333).

4. Ácido nucleico de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida primeira fita consiste em uma sequência de nucleotídeos modificada de SEQ ID NO:17, e em que a referida segunda fita compreende a sequência de nucleotídeos modificada de SEQ ID NO:18 em que as modificações específicas são representadas pelos seguintes números 1=2’F-dU; 2=2’F-dA; 3=2’F-dC; 4=2’F-dG; 5=2’-OMe-rU; 6=2’-OMe-rA; 7=2'-OMe-rC; 8=2'-OMe-rG.

5. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser conjugado com um ligante, opcionalmente na extremidade 5’ da segunda fita.

6. Ácido nucleico conjugado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ligante compreende (i) uma ou mais porções N-acetil galactosamina (GalNAc) e seus derivados, e (ii) um ligante, em que o ligante conjuga as porções GalNAc ao ácido nucleico.

7. Ácido nucleico conjugado de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o ligante é uma estrutura ramificada bivalente ou trivalente ou tetravalente.

8. Ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de ter a estrutura: em que Z é um ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

9. Ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou ácido nucleico conjugado de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é estabilizado na extremidade 5’ e/ou 3’ de uma ou de ambas as fitas.

10. Ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende uma ligação de fosforotioato entre os terminais 1, 2 ou 3 nucleotídeos 3’ e/ou nucleotídeos 5’ da primeira e/ou da segunda fita, ou compreendendo uma ligação de fosforoditioato.

11. Ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que compreende uma ligação de fosforotioato entre cada um dos três terminais 3’ e entre cada um dos três nucleotídeos terminais 5’ na primeira fita e uma ligação de fosforotioato entre os três nucleotídeos terminais da extremidade 3’ da segunda fita, tendo a estrutura

12. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado como definido em qualquer uma das reivindicações anteriores e um excipiente fisiologicamente aceitável.

13. Ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.

14. Ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de ser para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio, em que a doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo compreendendo hemocromatose, porfiria eritropoiética, porfiria cutânea tardia e doenças do sangue, como B- talassemia ou doença falciforme, anemia diseritropoiética congênita, síndromes de insuficiência medular, mielodisplasia e sobrecarga transfusional de ferro.

15. Ácido nucleico ou ácido nucleico conjugado ou composição de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo compreendendo hemocromatose, porfiria eritropoética, sobrecarga transfusional de ferro e distúrbios sanguíneos.

16. Ácido nucleico para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que o ácido nucleico é para um ou mais ou todos dentre: (i) tratamento da anemia, opcionalmente determinado adequadamente por um aumento na hemoglobina; e/ou (ii) melhoria da esplenomegalia, opcionalmente determinada por uma redução do tamanho ou peso do baço: e/ou (iii) redução da eritropoese estressada no baço, opcionalmente determinada pela proporção de eritroblastos e células eritroides enucleadas determinadas por análise por FACS; e/ou (iv) melhoria da maturação/eritropoese dos glóbulos vermelhos na medula óssea, opcionalmente determinada pela proporção de eritroblastos e células eritroides enucleadas determinadas por análise por FACS.