KR20220047865A - 세포에서 c3의 발현을 억제하기 위한 핵산 - Google Patents

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아드리엔 바인게르트너
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사일런스 테라퓨틱스 게엠베하
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Abstract

본 발명은 보체 성분 C3 유전자 발현을 방해하거나 또는 그의 발현을 억제하는 핵산 생성물에 관한 것이다. 핵산은 바람직하게는 보체 성분 C3 연관 질환, 장애 또는 증후군, 특히 C3 사구체병증 (C3G), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 루푸스 신염, IgA 신병증 (IgA N), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), 및 원발성 막성 신병증의 치료, 예방 또는 그를 앓을 위험의 감소로서 사용하기 위한 것이다.

Description

세포에서 C3의 발현을 억제하기 위한 핵산
본 발명은 보체 성분 C3 유전자 발현을 방해하거나 억제하는 핵산 생성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 예컨대 보체 경로 탈조절 및/또는 과다활성화 또는 신체 내 보체 성분 C3의 이소성 발현 또는 국재화 또는 축적과 연관된 질환 및 장애의 치료를 위한 이러한 억제의 치료 용도에 관한 것이다.
상보적 염기 쌍형성을 통해 발현된 mRNA에 결합할 수 있는 이중-가닥 RNA (dsRNA)는 "RNA 간섭 (RNAi)"으로 명명된 메카니즘에 의해 유전자 발현을 차단하는 것으로 밝혀졌다 (Fire et al., 1998, Nature. 1998 Feb 19;391(6669):806-11 및 Elbashir et al., 2001, Nature. 2001 May 24;411(6836):494-8). 짧은 dsRNA는 척추동물을 포함한 많은 유기체에서 유전자 특이적, 전사후 침묵을 지시하고, 유전자 기능을 연구하기 위한 유용한 도구가 되었다. RNAi는 RNA 유도된 침묵 복합체 (RISC)에 의해 매개되며, 이는 RISC 복합체에 로딩된 침묵 촉발자에 대해 충분한 상보성 또는 상동성을 갖는 메신저 RNA를 분해하는 서열 특이적, 다성분 뉴클레아제이다. 간섭 RNA, 예컨대 siRNA, 안티센스 RNA, 및 마이크로 RNA는 유전자 침묵에 의해 단백질의 형성을 막는, 즉 mRNA 분자의 분해를 통해 단백질의 유전자 번역을 억제하는 올리고뉴클레오티드이다. 유전자 침묵화제는 의약에서의 치료 용도가 점점 더 중요해지고 있다.
문헌 [Watts and Corey in the Journal of Pathology (2012; Vol 226, p 365-379)]에 따르면, 핵산 침묵 촉발제를 설계하는데 사용될 수 있는 알고리즘들이 존재하지만, 이들 모두는 심각한 한계를 갖는다. 알고리즘은 표적 mRNA의 3차 구조 또는 RNA 결합 단백질의 수반과 같은 인자를 고려하지 않기 때문에, 강력한 siRNA를 확인하기 위해 다양한 실험 방법을 취할 수 있다. 따라서, 최소의 오프-타겟 효과를 갖는 강력한 핵산 침묵 촉발제를 발견하는 것은 복잡한 과정이다. 이들 고도로 하전된 분자의 제약 개발을 위해, 이들이 경제적으로 합성되고, 표적 조직에 분포되고, 세포에 진입하고, 독성의 허용되는 한계 내에서 기능할 수 있는 것이 필요하다.
보체계 또는 경로는 침입 병원체에 대한 숙주 방어의 선천성 면역계의 일부이다. 이는 주로 전구체 형태로 혈류에서 순환하는 다수의 단백질로 이루어진다. 보체 성분 단백질 C3 (또한 본원에서 간단히 C3으로도 지칭됨)을 포함한, 보체계를 형성하는 대부분의 단백질은 주로 간에서 합성되고, 간세포에 의해 혈류 내로 분비된다. 시스템의 활성화는 염증 반응을 유발하여 식세포 유인 및 옵소닌화 및 결과적으로 병원체, 면역 복합체 및 세포 파편의 클리어런스를 발생시킨다 (Janeway's Immunobiology 9th Edition). 보체계는 3가지 경로 (전형적, 렙틴 및 대안적 경로)로 이루어지며, 이들은 모두 소위 보체 성분 3 컨버타제 효소 복합체의 형성에 수렴한다. 이들 효소 복합체는 보체 성분 C3 단백질을 C3a 및 C3b로 절단한다. 일단 절단되면, C3b는 복합체의 일부를 형성하고, 이는 다시 C5를 C5a 및 C5b로 절단한다. 절단 후, C5b는 주요 보체 경로 이펙터인 막 공격 복합체의 주요 성분 중 하나이다. 따라서, C3은 보체계 활성화 경로의 주요 성분이다.
여러 질환은 보체 경로의 비정상적인 후천성 또는 유전적 활성화 뿐만 아니라 C3의 비정상적인 발현 또는 과다-발현과 연관된다. 특히, 이들은 C3 사구체병증 (C3G), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 면역 복합체-매개 사구체신염 (IC-매개 GN), 감염후 사구체신염 (PIGN), 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 허혈/재관류 손상 및 IgA 신병증 (IgA N; 문헌 [Ricklin et al., Nephrology, 2016] 등에서 검토됨)이다. 이들 질환의 대부분은 신장과 연관되며, 이는 이 기관이 보체-유도된 손상에 고유하게 감수성이기 때문이다. 그러나, 다른 기관의 질환, 예컨대 연령-관련 황반 변성 (AMD), 류마티스 관절염 (RA), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), 디스바이오틱 치주 질환, 말라리아 빈혈, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH) 및 패혈증도 또한 보체 기능장애와 관련된 것으로 공지되어 있다.
C3G에서, C3은 신장에서 사구체에 축적되어 이를 막는다. C3의 축적은 또한 신장 손상을 초래한다. 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS)에서, 보체계는 적혈구를 표적화하고, 이는 적혈구의 용해로 이어진다.
현재 보체계 매개 질환, 장애 및 증후군에 대한 치료는 단지 소수이다. 모노클로날 인간화 항체 에쿨리주맙은 이들 중 하나이다. 이는 보체 단백질 C5에 결합하여, 보체 캐스케이드의 말미에 막 공격 복합체를 차단하는 것으로 공지되어 있다 (Hillmen et al., 2006 NEJM). 그러나, 상기 열거된 질환을 앓고 있는 환자의 하위세트만이 에쿨리주맙 요법에 반응한다. 따라서, 보체 매개 또는 연관 질환의 의학적 치료에 대한 높은 미충족 필요가 존재한다. C3은 보체 경로 활성화에서 중추적 인자이다. 따라서, C3 발현을 억제하는 것은 많은 보체-매개 질환에 대한 유망한 치료 전략을 제시한다.
본 발명의 한 측면은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥 서열은 서열식별번호(SEQ ID NO): 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416의 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인, 보체 성분 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산이다.
한 측면은 의약으로서 또는 연관된 진단 또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 세포에서 보체 성분 C3의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 핵산에 관한 것이며, 여기서 핵산은 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 바람직하게는 제1 가닥은 RNA 간섭을 매개하도록 보체 성분 C3 mRNA에 충분히 상보성인 서열을 포함한다.
한 측면은 본원에 개시된 바와 같은 핵산 및 용매 (바람직하게는 물) 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리학상 허용되는 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충제 및/또는 보존제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면은 본원에 개시된 바와 같은 핵산, 및 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 펩티드로부터 선택된 추가의 치료제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면은 의약으로서 또는 연관된 방법에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면은 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 사용하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 그를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
한 측면은 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에서의 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 그를 포함하는 조성물의 용도에 관한 것이며, 여기서 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 C3 사구체병증 (C3G)이다.
한 측면은 제약 유효 용량 또는 양의 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 그를 포함하는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 여기서 핵산 또는 조성물을 대상체에게 피하로, 정맥내로, 또는 경구, 직장, 폐, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 투여하는 것인, 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 그를 앓을 위험을 감소시키거나, 또는 그를 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 이중-가닥이고, 보체 성분 C3의 발현된 RNA 전사체에 상동성인 서열을 포함하는 핵산, 및 그의 조성물에 관한 것이다. 이들 핵산, 또는 그의 접합체 또는 조성물은 C3 유전자 생성물의 감소된 발현이 바람직한 다양한 질환, 장애 및 증후군의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.
본 발명의 제1 측면은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416으로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인, 바람직하게는 세포에서 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산이다. 이들 핵산은 특히 전-임상 및 임상 개발과 관련된 다양한 종에서 활성이고/거나 관련 오프-타겟 효과를 거의 갖지 않는다는 이점을 갖는다. 관련 오프-타겟 효과를 거의 갖지 않는다는 것은 핵산이 의도된 표적을 특이적으로 억제하고, 다른 유전자를 유의하게 억제하지 않거나 또는 오직 1종 또는 소수의 다른 유전자만을 치료상 허용되는 수준으로 억제한다는 것을 의미한다.
바람직하게는, 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416으로부터 선택된 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이하고, 가장 바람직하게는 어떠한 뉴클레오티드도 상이하지 않은, 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 19개의 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
바람직하게는, 핵산의 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416으로부터 선택된 서열 중 하나로 이루어진다. 그러나, 서열은 뉴클레오티드의 동일성을 변화시키지 않는 다수의 핵산 변형에 의해 변형될 수 있다. 예를 들어, 핵산의 백본 또는 당 잔기의 변형은 염기 자체가 참조 서열에서와 동일하게 유지되기 때문에 뉴클레오티드의 동일성을 변화시키지 않는다.
본원에서 참조 서열에 따른 서열을 포함하는 핵산은 핵산이 참조 서열에 정의된 바와 같은 순서로 인접 뉴클레오티드의 서열을 포함한다는 것을 의미한다.
본원에서 뉴클레오티드를 포함하거나 또는 그로 이루어진 참조 서열을 참조할 때, 이러한 참조는 비변형된 뉴클레오티드를 갖는 서열로 제한되지 않는다. 동일한 참조는 또한 1개, 여러개, 예컨대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개 또는 모두를 포함한 그 초과의 뉴클레오티드가 변형, 예컨대 2'-OMe, 2'-F, 리간드, 링커, 3' 단부 또는 5' 단부 변형 또는 임의의 다른 변형에 의해 변형된 동일한 뉴클레오티드 서열을 포괄한다. 이는 또한 2개 이상의 뉴클레오티드가 천연 포스포디에스테르 연결에 의해 또는 임의의 다른 연결, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결에 의해 서로 연결된 서열을 지칭한다.
이중-가닥 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥이 그의 길이의 적어도 일부에 걸쳐 서로 혼성화하고, 따라서 생리학적 조건 하에, 예컨대 37℃의 PBS 중에서 각각의 가닥의 1 μM의 농도에서 듀플렉스 영역을 형성할 수 있는 핵산이다. 제1 및 제2 가닥은 바람직하게는 서로 혼성화할 수 있고, 따라서 적어도 15개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 16, 17, 18 또는 19개의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 듀플렉스 영역을 형성할 수 있다. 이러한 듀플렉스 영역은 바람직하게는 왓슨-크릭 염기 쌍형성 및/또는 워블 염기 쌍형성 (예컨대 GU 염기 쌍형성)에 기초한, 2개의 가닥 사이의 뉴클레오티드 염기 쌍형성을 포함한다. 듀플렉스 영역 내의 2개의 가닥의 모든 뉴클레오티드가 듀플렉스 영역을 형성하기 위해 서로 염기 쌍을 형성할 필요는 없다. 2개의 가닥의 뉴클레오티드 서열 사이에 특정 수의 미스매치, 결실 또는 삽입이 허용된다. 제1 또는 제2 가닥의 어느 하나의 단부 상의 오버행 또는 이중-가닥 핵산의 어느 하나의 단부에서의 쌍형성되지 않은 뉴클레오티드가 또한 가능하다. 이중-가닥 핵산은 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안정한 이중-가닥 핵산이고, 바람직하게는 예를 들어 PBS 중 각각의 가닥의 1 μM의 농도에서 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상의 용융 온도 (Tm)를 갖는다.
생리학적 조건 하에서 안정한 이중-가닥 핵산은 예를 들어 PBS 중 각각의 가닥의 1 μM의 농도에서 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상의 Tm을 갖는 이중-가닥 핵산이다.
제1 가닥 및 제2 가닥은 바람직하게는 i) 그의 길이의 적어도 일부에 걸쳐, 바람직하게는 둘 다의 그의 길이의 적어도 15개의 뉴클레오티드에 걸쳐, ii) 제1 가닥의 전체 길이에 걸쳐, iii) 제2 가닥의 전체 길이에 걸쳐 또는 iv) 제1 및 제2 가닥 둘 다의 전체 길이에 걸쳐 듀플렉스 영역을 형성할 수 있다 (즉, 서로 상보적이다). 특정 길이에 걸쳐 서로 상보적인 가닥은 가닥이 그러한 길이에 걸쳐 왓슨-크릭 또는 워블 염기 쌍형성을 통해 서로 염기 쌍형성할 수 있음을 의미한다. 각각의 뉴클레오티드의 길이는, 생리학적 조건 하에서 안정한 이중-가닥 뉴클레오티드가 형성될 수 있는 한, 반드시 전체 주어진 길이에 걸쳐 다른 가닥 내의 그의 대응물과 염기 쌍형성할 수 있어야 하는 것은 아니다. 그러나, 특정 실시양태에서, 각각의 뉴클레오티드의 길이는 전체 주어진 길이에 걸쳐 다른 가닥 내의 그의 대응물과 염기 쌍형성할 수 있는 것이 바람직하다.
제1 가닥과 표적 서열 사이, 또는 제1 가닥과 제2 가닥 사이의 특정 수의 미스매치, 결실 또는 삽입은 siRNA와 관련하여 허용될 수 있고, 심지어 특정 경우에 RNA 간섭 (예를 들어, 억제) 활성을 증가시키는 잠재력을 갖는다.
본 발명에 따른 핵산의 억제 활성은 제1 가닥의 전부 또는 부분과 표적 핵산의 부분 사이의 듀플렉스 영역의 형성에 의존한다. 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 제1 염기 쌍에서 시작하여 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 마지막 염기 쌍으로 끝나는 것으로 정의되는, 제1 가닥과 듀플렉스 영역을 형성한 표적 핵산의 부분은 표적 핵산 서열 또는 간단히 표적 서열이다. 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 듀플렉스 영역은 제1 가닥과 표적 서열 사이에 형성된 듀플렉스 영역과 동일할 필요는 없다. 즉, 제2 가닥은 표적 서열과 상이한 서열을 가질 수 있지만; 제1 가닥은 적어도 생리학적 조건 하에 제2 가닥 및 표적 서열 둘 다와 듀플렉스 구조를 형성할 수 있어야 한다.
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성은 완벽할 수 있다 (즉, 표적 서열과 비교하여 제1 가닥에서 뉴클레오티드 미스매치 또는 삽입 또는 결실 없이 100% 동일성).
제1 가닥과 표적 서열 사이의 상보성은 완벽하지 않을 수 있다. 상보성은 약 70% 내지 약 100%일 수 있다. 보다 구체적으로, 상보성은 적어도 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열의 상보적 서열 사이의 동일성은 약 75% 내지 약 100% 범위일 수 있다. 보다 구체적으로, 핵산이 보체 성분 C3의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 한, 상보성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 및 중간 값일 수 있다.
제1 가닥과 표적 서열 사이에 100% 미만의 상보성을 갖는 핵산은 제1 가닥과 표적 서열 사이에 완벽한 상보성을 갖는 핵산과 동일한 수준으로 보체 성분 C3의 발현을 감소시킬 수 있다. 대안적으로, 보체 성분 C3의 발현을 완벽한 상보성을 갖는 핵산에 의해 달성되는 감소 수준의 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%인 수준으로 감소시킬 수 있다.
한 측면에서, 본 개시내용의 핵산은
(a) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하거나;
(b) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나와 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열과 2개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하거나;
(c) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 서열을 포함하거나;
(d) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 17에 상응하는 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 17에 상응하는 서열을 포함하거나;
(e) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 18에 상응하는 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 18에 상응하는 서열을 포함하거나;
(f) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 19에 상응하는 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 19에 상응하는 서열을 포함하거나;
(g) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 2 내지 19에 상응하는 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 5' 단부로부터의 뉴클레오티드 1 내지 18에 상응하는 서열을 포함하거나;
(h) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 서열을 포함하거나; 또는
(i) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 서열로 이루어진 것
인 핵산이고;
여기서 표 1은 하기이다:
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
한 측면에서, 핵산은
(a) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 361의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112의 서열을 포함하거나;
(b) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 95의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 96의 서열을 포함하거나;
(c) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 111의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112의 서열을 포함하거나;
(d) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 125의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 126의 서열을 포함하거나;
(e) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 131의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 132의 서열을 포함하거나;
(f) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 361로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112로 이루어지거나;
(g) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 95로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 96으로 이루어지거나;
(h) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 111로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112로 이루어지거나;
(i) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 125로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 126으로 이루어지거나;
(j) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 131로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 132로 이루어지거나;
(k) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 364의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 363 또는 375의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(l) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 365의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 363의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(m) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 366의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 367 또는 376의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(n) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 368의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 369의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(o) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 370의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 371 또는 379, 바람직하게는 379의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(p) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 372의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 373 또는 380의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(q) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 362의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 374의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(r) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 377의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 378의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나;
(s) 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 416의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 26의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것
인 핵산이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 가장 5'의 뉴클레오티드가 A 또는 U 이외의 뉴클레오티드인 경우, 이러한 뉴클레오티드는 A 또는 U로 대체된다. 바람직하게는, 제1 가닥의 가장 5'의 뉴클레오티드가 U 이외의 뉴클레오티드인 경우, 이러한 뉴클레오티드는 U로, 보다 바람직하게는 5' 비닐포스포네이트를 갖는 U로 대체된다.
본 발명의 핵산이 예를 들어 표 1에 주어진 바와 같은 참조 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 서열의 전체 서열을 포함하지 않거나, 또는 하나 또는 둘 다의 가닥이 상응하는 참조 서열과 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드만큼 상이한 경우에, 이러한 핵산은 대등한 실험에서 전체 제1 가닥 및 제2 가닥 참조 서열을 포함하는 상응하는 핵산의 억제 활성과 비교하여 바람직하게는 적어도 30%, 보다 바람직하게는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 적어도 100%의 C3 억제 활성을 보유한다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 361의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 95의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 96의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 111의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 125의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 126의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 131의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 132의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 364의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 363 또는 375의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 365의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 363의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 366의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 367 또는 376의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 368의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 369의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 370의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 371 또는 379, 바람직하게는 379의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 372의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 373 또는 380의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 362의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 374의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 377의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 378의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어지거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 416의 서열을 포함하거나 또는 바람직하게는 그로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 26의 서열의 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나 또는 그로 이루어진 것인 핵산이다.
한 측면에서, 핵산은 바람직하게는 세포에서 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산이고, 여기서 핵산은 제1 핵산 가닥 및 제2 핵산 가닥을 포함하고, 여기서 제1 가닥은 생리학적 조건 하에 서열식별번호: 379, 363, 375, 367, 376, 369, 371, 373, 380, 374, 378, 112, 96, 126, 132, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 128, 130 또는 134로부터 선택된 서열의 핵산에 혼성화할 수 있고;
제2 가닥은 생리학적 조건 하에 제1 가닥에 혼성화하여 듀플렉스 영역을 형성할 수 있다.
생리학적 조건 하에 혼성화할 수 있는 핵산은 가닥에서 대향하는 뉴클레오티드의 적어도 일부 사이에 염기 쌍, 바람직하게는 왓슨-크릭 또는 워블 염기-쌍을 형성하여 적어도 듀플렉스 영역을 형성할 수 있는 핵산이다. 이러한 이중-가닥 핵산은 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 (예를 들어 37℃의 PBS 중에서 각각의 가닥의 1 μM의 농도에서) 안정한 이중-가닥 핵산이며, 이는 이러한 조건 하에서 2개의 가닥이 서로 혼성화된 상태로 유지된다는 것을 의미한다. 이중-가닥 뉴클레오티드의 Tm은 바람직하게는 45℃ 이상, 바람직하게는 50℃ 이상, 보다 바람직하게는 55℃ 이상이다.
본 발명의 한 측면은 보체 성분 C3의 발현을 억제하기 위한 핵산에 관한 것이며, 여기서 핵산은 표 5의 서열 중 임의의 것과 3개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이하고, 가장 바람직하게는 어떠한 뉴클레오티드도 상이하지 않은, 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 제1 서열을 포함하고, 제1 서열은 생리학적 조건 하에 표적 유전자 전사체 (예컨대 mRNA)에 혼성화할 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 표 5의 서열 중 임의의 것과 3개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2개 이하의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이하고, 가장 바람직하게는 어떠한 뉴클레오티드도 상이하지 않은, 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 16개, 보다 바람직하게는 적어도 17개, 보다 더 바람직하게는 적어도 18개, 가장 바람직하게는 모든 뉴클레오티드의 제2 서열을 포함하고, 제2 서열은 생리학적 조건 하에 제1 서열에 혼성화할 수 있고, 바람직하게는 핵산은 RNAi 경로를 통해 C3 발현을 억제할 수 있는 siRNA이다.
한 측면은 바람직하게는 보체 성분 C3의 발현을 억제하기 위한, 표 3에 개시된 바와 같은 임의의 이중-가닥 핵산에 관한 것이며, 단 이중-가닥 핵산은 보체 성분 C3의 발현을 억제할 수 있는 것을 조건으로 한다. 이들 핵산은 모두 다양한 뉴클레오티드 변형을 갖는 siRNA이다. 이들 중 일부는 GalNAc 수용체를 갖는 세포, 예컨대 간세포에 특이적으로 표적화될 수 있는 GalNAc 모이어티를 포함하는 접합체이다.
한 측면은 의약으로서 또는 연관된 진단 또는 치료 방법에서 사용하기 위한, 바람직하게는 세포에서 보체 성분 C3의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 핵산에 관한 것이며, 여기서 핵산은 바람직하게는 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하거나 또는 그로 이루어지고, 바람직하게는 제1 가닥은 RNA 간섭을 매개하도록 보체 성분 C3 mRNA에 충분히 상보성인 서열을 포함한다.
본원에 기재된 핵산은 보체 성분 C3의 발현을 억제할 수 있다. 억제는 완전할 수 있고, 즉 잔류 발현이 0%일 수 있다. C3 발현의 억제는 부분적일 수 있고, 즉 본 발명의 핵산의 부재 하의 C3 발현 수준의 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 그 초과, 또는 중간 값의 억제일 수 있다. 억제 수준은 처리된 샘플을 비처리된 샘플 또는 대조군, 예컨대 예를 들어 C3을 표적화하지 않는 siRNA로 처리된 샘플과 비교함으로써 측정될 수 있다. 억제는 C3 mRNA 및/또는 단백질 수준 또는 C3 존재 또는 활성과 상관관계가 있는 바이오마커 또는 지시자의 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 이는 본원에 기재된 핵산으로 시험관내 처리될 수 있는 세포에서 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 억제는 세포, 예컨대 간세포, 또는 조직, 예컨대 간 조직, 또는 기관, 예컨대 간에서, 또는 체액, 예컨대 혈액, 혈청, 림프 또는 본원에 개시된 핵산으로 이전에 치료된 대상체로부터 채취한 임의의 다른 신체 부분 또는 체액에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, C3 발현의 억제는 이상적 조건 (적절한 농도 및 조건에 대해서는 실시예 참조) 하에 본원에 개시된 이중-가닥 RNA로의 24 또는 48시간 시험관내 처리 후 C3-발현 세포에서 측정된 C3 mRNA 수준을 비처리 또는 모의 처리 또는 동일한 조건 하에 대조군 이중-가닥 RNA로 처리된 대조군 세포에서 측정된 C3 mRNA 수준과 비교함으로써 결정된다.
본 발명의 한 측면은 제1 가닥 및 제2 가닥이 서로 혼성화하여 듀플렉스 영역을 갖는 이중-가닥 핵산을 형성할 수 있도록 제1 가닥 및 제2 가닥이 루프 주위의 핵산의 단일 가닥 상에 존재하는 것인 핵산에 관한 것이다.
바람직하게는, 핵산의 제1 가닥 및 제2 가닥은 별개의 가닥이다. 2개의 별개의 가닥은 바람직하게는 각각 17-25개 뉴클레오티드 길이, 보다 바람직하게는 18-25개 뉴클레오티드 길이이다. 2개의 가닥은 동일하거나 상이한 길이일 수 있다. 제1 가닥은 17-25개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 바람직하게는 18-24개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 가장 바람직하게는, 제1 가닥은 19개 뉴클레오티드 길이이다. 제2 가닥은 독립적으로 17-25개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 바람직하게는 18-24개 뉴클레오티드 길이일 수 있고, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 보다 바람직하게는, 제2 가닥은 18 또는 19 또는 20개 뉴클레오티드 길이이고, 가장 바람직하게는 19개 뉴클레오티드 길이이다.
바람직하게는, 핵산의 제1 가닥 및 제2 가닥은 17-25개 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 형성한다. 보다 바람직하게는, 듀플렉스 영역은 18-24개 뉴클레오티드 길이이다. 듀플렉스 영역은 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 가장 바람직한 실시양태에서, 듀플렉스 영역은 18 또는 19개 뉴클레오티드 길이이다. 듀플렉스 영역은 본원에서 제2 가닥의 뉴클레오티드와 염기 쌍형성된 제1 가닥의 가장 5'의 뉴클레오티드와 제2 가닥의 뉴클레오티드와 염기 쌍형성된 제1 가닥의 가장 3'의 뉴클레오티드를 포함한 이들 사이의 영역으로 정의된다. 듀플렉스 영역은 다른 가닥의 뉴클레오티드와 염기-쌍형성되지 않은 어느 하나의 또는 둘 다의 가닥의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이는 제1 가닥 및/또는 제2 가닥 상의 1, 2, 3 또는 4개의 이러한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그러나, 바람직하게는, 듀플렉스 영역은 17-25개의 연속 뉴클레오티드 염기 쌍으로 이루어진다. 즉, 이는 바람직하게는 모든 염기가 다른 가닥의 뉴클레오티드와 쌍형성하는 17-25개의 연속 뉴클레오티드를 둘 다의 가닥 상에 포함한다. 보다 바람직하게는, 듀플렉스 영역은 18 또는 19개의 연속 뉴클레오티드 염기 쌍, 가장 바람직하게는 18개로 이루어진다.
본원에 개시된 각각의 실시양태에서, 핵산은 둘 다의 단부에서 평활 단부일 수 있거나; 한 단부에서 오버행 및 다른 단부에서 평활 단부를 가질 수 있거나; 또는 둘 다의 단부에서 오버행을 가질 수 있다.
핵산은 한 단부에서 오버행 및 다른 단부에서 평활 단부를 가질 수 있다. 핵산은 둘 다의 단부에서 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 둘 다의 단부에서 평활 단부일 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5' 단부 및 제2 가닥의 3' 단부 또는 제1 가닥의 3' 단부 및 제2 가닥의 5' 단부인 단부에서 평활 단부일 수 있다.
핵산은 3' 또는 5' 단부에서 오버행을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥 상에 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 5' 단부 및 3' 단부 둘 다에서 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제2 가닥의 5' 단부 및 3' 단부 둘 다에서 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 5' 오버행 및 제2 가닥 상에 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 3' 오버행 및 제2 가닥 상에 5' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 3' 오버행 및 제2 가닥 상에 3' 오버행을 가질 수 있다. 핵산은 제1 가닥 상에 5' 오버행 및 제2 가닥 상에 5' 오버행을 가질 수 있다.
제2 가닥 또는 제1 가닥의 3' 단부 또는 5' 단부에서의 오버행은 1, 2, 3, 4 및 5개 뉴클레오티드 길이로 이루어질 수 있다. 임의로, 오버행은 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있는 1 또는 2개의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, 제1 가닥의 5' 단부는 1, 2 또는 3개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 1개의 뉴클레오티드의 단일-가닥 오버행이다.
바람직하게는, 핵산은 siRNA이다. siRNA는 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 통해 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 짧은 간섭 또는 짧은 침묵 RNA이다. 억제는 전사 후 표적 유전자의 mRNA 전사체의 표적화된 분해를 통해 발생한다. siRNA는 RISC 복합체의 일부를 형성한다. RISC 복합체는 제1 (안티센스) 가닥의 표적 서열과의 서열 상보성에 의해 표적 RNA를 특이적으로 표적화한다.
바람직하게는, 핵산은 RNA 간섭 (RNAi)을 매개한다. 바람직하게는, 핵산은 RNA 간섭을 적어도 50% 억제, 보다 바람직하게는 적어도 70%, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 보다 더 바람직하게는 적어도 95%, 가장 바람직하게는 100% 억제의 효능으로 매개한다. 억제 효능은 바람직하게는 대등한 실험에서 C3 특이적 siRNA로 처리된 세포, 예컨대 간세포에서의 C3 mRNA 수준을 대조군으로 처리된 세포에서의 C3 mRNA 수준과 비교함으로써 측정된다. 대조군은 비-C3 표적화 siRNA를 사용한 처리 또는 siRNA를 사용하지 않은 처리일 수 있다. 따라서, 핵산, 또는 핵산의 적어도 제1 가닥은 바람직하게는 RISC 복합체 내로 혼입될 수 있다. 그 결과, 핵산, 또는 핵산의 적어도 제1 가닥은 따라서 핵산, 또는 핵산의 적어도 제1 가닥이 적어도 부분적으로 상보적인 특이적 표적 RNA로 RISC 복합체를 가이드할 수 있다. 이어서, RISC 복합체는 이러한 표적 RNA를 특이적으로 절단하고, 그 결과 RNA가 유도되는 유전자의 발현의 억제로 이어진다.
핵산 변형
본원에 논의된 핵산은 비변형된 RNA 뿐만 아니라, 예를 들어 효능 또는 안정성을 개선시키기 위해 변형된 RNA를 포함한다. 비변형된 RNA는 핵산의 성분, 즉 당, 염기, 및 포스페이트 모이어티가 자연에서 발생하는 것, 예를 들어 인간 신체에서 자연적으로 발생하는 것과 동일하거나 본질적으로 동일한 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 성분, 즉 당, 염기, 및 포스페이트 모이어티 중 1개 이상이 자연에서 발생하는 것과 상이한 뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "변형된 뉴클레오티드"는 또한 특정 경우에 뉴클레오티드의 필수 성분, 예컨대 당, 염기 또는 포스페이트 모이어티가 결여되거나 또는 그의 치환체를 갖기 때문에 용어의 엄격한 의미에서 뉴클레오티드가 아닌 분자를 지칭한다. 이러한 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은, 핵산의 뉴클레오티드 중 1개 이상이 뉴클레오티드의 필수 성분이 결여되거나 또는 그의 치환을 갖는 변형된 뉴클레오티드에 의해 대체된 경우에도, 여전히 핵산인 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 핵산의 변형은 일반적으로 천연 RNA 분자에 고유한 시험관내 및 생체내 안정성 및 생체이용률을 포함하나 이에 제한되지는 않는 잠재적 한계를 극복하는데 있어서 강력한 도구를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산은 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 인간에서 인터페론 활성을 유도할 가능성을 최소화할 수 있다. 변형은 표적 세포로의 핵산의 기능적 전달을 추가로 증진시킬 수 있다. 본 발명의 변형된 핵산은 제1 가닥 또는 제2 가닥 중 하나 또는 둘 다의 1개 이상의 화학적으로 변형된 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 리보뉴클레오티드는 염기, 당 또는 포스페이트 모이어티의 화학적 변형을 포함할 수 있다. 리보핵산은 핵산 또는 염기의 유사체로의 치환 또는 그의 삽입에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 설명 전반에 걸쳐, "동일하거나 공통적인 변형"은 임의의 뉴클레오티드에 대한 동일한 변형이 메틸 기 (2'-OMe) 또는 플루오로 기 (2'-F)와 같은 기로 변형된 A, G, C 또는 U인 것을 의미한다. 예를 들어, 2'-F-dU, 2'-F-dA, 2'-F-dC, 2'-F-dG는 모두, 2'-OMe-rU, 2'-OMe-rA; 2'-OMe-rC; 2'-OMe-rG와 같이, 동일하거나 공통적인 변형인 것으로 간주된다. 대조적으로, 2'-F 변형은 2'-OMe 변형과 비교하여 상이한 변형이다.
바람직하게는, 핵산의 제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 1개의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 바람직하게는 비-자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 바람직하게는 2'-F 변형된 뉴클레오티드이다.
변형된 뉴클레오티드는 당 기의 변형을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다. 2' 히드록실 기 (OH)는 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 변형 또는 대체될 수 있다.
"옥시"-2' 히드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시 (OR, 예를 들어, R=H, 알킬 (예컨대 메틸), 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR; 2' 히드록실이 예를 들어 메틸렌 가교에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결된 "잠금" 핵산 (LNA); O-아민 (아민=NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 또는 폴리아미노) 및 아미노알콕시, O(CH2)n아민, (예를 들어, 아민=NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노, 에틸렌 디아민, 또는 폴리아미노)을 포함한다.
"데옥시" 변형은 수소, 할로겐, 아미노 (예를 들어, NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 디헤테로아릴 아미노, 또는 아미노산); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-아민 (아민=NH2, 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로시클릴, 아릴아미노, 디아릴 아미노, 헤테로아릴 아미노, 또는 디헤테로아릴 아미노), -NHC(O)R (R=알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당), 시아노; 메르캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 예를 들어 아미노 관능기로 임의로 치환될 수 있는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함한다. 특정 실시양태의 다른 치환기는 2'-메톡시에틸, 2'-OCH3, 2'-O-알릴, 2'-C-알릴, 및 2'-플루오로를 포함한다.
당 기는 또한 리보스에서의 상응하는 탄소의 입체화학적 배위와 반대의 입체화학적 배위를 보유하는 1개 이상의 탄소를 함유할 수 있다. 따라서, 변형된 뉴클레오티드는 당, 예컨대 아라비노스를 함유할 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 또한 C - 1'에서 핵염기가 결여된 "무염기성" 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기성 당은 구성성분 당 원자 중 1개 이상에서 변형을 추가로 함유할 수 있다.
2' 변형은 1개 이상의 포스페이트 뉴클레오시드간 링커 변형 (예를 들어, 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트)과 조합되어 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산의 1개 이상의 뉴클레오티드는 변형될 수 있다. 핵산은 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 듀플렉스 영역에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 듀플렉스 영역 외부에, 즉 단일-가닥 영역에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에 존재할 수 있고, 듀플렉스 영역 외부에 존재할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에 존재할 수 있고, 듀플렉스 영역 외부에 존재할 수 있다. 제1 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제2 가닥의 3'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제1 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다. 제2 가닥의 5'-말단 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드일 수 있다.
본 발명의 핵산은 1개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있거나 또는 본 발명의 핵산은 약 2-4개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있거나, 또는 핵산은 약 4-6개의 변형된 뉴클레오티드, 약 6-8개의 변형된 뉴클레오티드, 약 8-10개의 변형된 뉴클레오티드, 약 10-12개의 변형된 뉴클레오티드, 약 12-14개의 변형된 뉴클레오티드, 약 14-16개의 변형된 뉴클레오티드, 약 16-18개의 변형된 뉴클레오티드, 약 18-20개의 변형된 뉴클레오티드, 약 20-22개의 변형된 뉴클레오티드, 약 22-24개의 변형된 뉴클레오티드, 약 24-26개의 변형된 뉴클레오티드 또는 약 26-28개의 변형된 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 각 경우에, 상기 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 동일한 핵산이지만 상기 변형된 뉴클레오티드가 없는 것과 비교하여 그의 활성의 적어도 50%를 보유하거나 또는 그 반대이다. 핵산은 동일한 핵산이지만 상기 변형된 뉴클레오티드가 없는 것과 비교하여 그의 활성의 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 및 중간 값을 보유할 수 있거나, 또는 상기 변형된 뉴클레오티드가 없는 동일한 핵산의 활성의 100% 초과를 가질 수 있다.
변형된 뉴클레오티드는 퓨린 또는 피리미딘일 수 있다. 퓨린의 적어도 절반이 변형될 수 있다. 피리미딘의 적어도 절반이 변형될 수 있다. 모든 퓨린이 변형될 수 있다. 모든 피리미딘이 변형될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 3' 말단 데옥시 티민 (dT) 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 (2'-OMe) 변형된 뉴클레오티드, 2' 변형된 뉴클레오티드, 2' 데옥시 변형된 뉴클레오티드, 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드, 2' 아미노 변형된 뉴클레오티드, 2' 알킬 변형된 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 포스포르아미데이트, 비-천연 염기 포함 뉴클레오티드, 5'-포스포로티오에이트 기를 포함하는 뉴클레오티드, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체를 포함하는 뉴클레오티드 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기에 연결된 말단 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
핵산은 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 여기서 염기는 2-아미노아데노신, 2,6-디아미노퓨린, 이노신, 피리딘-4-온, 피리딘-2-온, 페닐, 슈도우라실, 2,4,6-트리메톡시 벤젠, 3-메틸 우라실, 디히드로우리딘, 나프틸, 아미노페닐, 5-알킬시티딘 (예를 들어, 5-메틸시티딘), 5-알킬우리딘 (예를 들어, 리보티미딘), 5-할로우리딘 (예를 들어, 5-브로모우리딘), 6-아자피리미딘, 6-알킬피리미딘 (예를 들어, 6-메틸우리딘), 프로핀, 퀘소신, 2-티오우리딘, 4-티오우리딘, 와이부토신, 와이부톡소신, 4-아세틸시티딘, 5-(카르복시히드록시메틸)우리딘, 5'-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우리딘, 베타-D-갈락토실퀘오신, 1-메틸아데노신, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아노신, 3-메틸시티딘, 2-메틸아데노신, 2-메틸구아노신, N6-메틸아데노신, 7-메틸구아노신, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우리딘, 5-메틸아미노메틸우리딘, 5-메틸카르보닐메틸우리딘, 5-메틸옥시우리딘, 5-메틸-2-티오우리딘, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신, 베타-D-만노실퀘오신, 우리딘-5-옥시아세트산 및 2-티오시티딘으로부터 선택된다.
본원에 기재된, 핵산 내에서 발생하는 많은 변형, 예컨대 염기, 또는 포스페이트 모이어티, 또는 포스페이트 모이어티의 비-연결 O의 변형은 폴리뉴클레오티드 분자 내에서 반복될 것이다. 일부 경우에, 변형은 폴리뉴클레오티드 내의 모든 가능한 위치/뉴클레오티드에서 발생할 것이지만, 많은 경우에 그렇지 않을 것이다. 변형은 3' 또는 5' 말단 위치에서만 발생할 수 있고, 말단 영역, 예컨대 말단 뉴클레오티드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4, 5, 또는 10개의 뉴클레오티드에서만 발생할 수 있다. 변형은 이중-가닥 영역, 단일-가닥 영역, 또는 둘 다에서 발생할 수 있다. 변형은 본 발명의 핵산의 이중-가닥 영역에서만 발생할 수 있거나, 또는 본 발명의 핵산의 단일-가닥 영역에서만 발생할 수 있다. 비-연결 O 위치에서의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형은 하나 또는 둘 다의 말단에서만 발생할 수 있거나, 말단 영역에서만, 예를 들어 말단 뉴클레오티드 상의 위치에서 또는 가닥의 마지막 2, 3, 4 또는 5개의 뉴클레오티드에서 발생할 수 있거나, 또는 듀플렉스 및/또는 단일-가닥 영역에서, 특히 말단에서 발생할 수 있다. 5' 단부 및/또는 3' 단부는 인산화될 수 있다.
본 발명의 핵산의 안정성은 오버행에 특정한 염기를 포함시킴으로써, 또는 단일-가닥 오버행에, 예를 들어 5' 또는 3' 오버행에 또는 둘 다에 변형된 뉴클레오티드를 포함시킴으로써 증가될 수 있다. 퓨린 뉴클레오티드가 오버행에 포함될 수 있다. 3' 또는 5' 오버행 내의 염기의 전부 또는 일부가 변형될 수 있다. 변형은 리보스 당의 2' OH 기에서의 변형의 사용, 리보뉴클레오티드 대신 데옥시리보뉴클레오티드의 사용, 및 포스페이트 기에서의 변형, 예컨대 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 오버행은 표적 서열과 상동성일 필요는 없다.
뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 그러나, 핵산에 대한 화학적 변형은 개선된 특성을 부여할 수 있고, 올리고리보뉴클레오티드를 뉴클레아제에 대해 보다 안정하게 만들 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 변형된 핵산은
(i) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 (본 발명의 핵산의 5' 및 3' 말단의 것이라도 연결로 지칭됨) 중 하나 이상의 변경, 예를 들어 대체;
(ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어 리보스 당의 2' 히드록실의 변경, 예를 들어 대체;
(iii) 포스페이트 모이어티의 "데포스포" 링커로의 대체;
(iv) 자연 발생 염기의 변형 또는 대체;
(v) 리보스-포스페이트 백본의 대체 또는 변형; 및
(vi) 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 하나 또는 둘 다의 가닥의 3' 또는 5' 단부에의 모이어티, 예를 들어 형광 표지된 모이어티의 접합
중 1개 이상을 포함할 수 있다.
용어 대체, 변형 및 변경은 자연 발생 분자와의 차이를 나타낸다.
구체적인 변형이 하기에서 보다 상세하게 논의된다.
핵산은 변형된 제2 및/또는 제1 가닥 상의 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 교대 뉴클레오티드가 변형되어 변형된 뉴클레오티드를 형성할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 교대는 규칙적인 방식으로 차례로 일어나는 것을 의미한다. 다시 말해서, 교대는 차례로 반복해서 일어나는 것을 의미한다. 예를 들어, 하나의 뉴클레오티드가 변형되면, 다음 인접 뉴클레오티드는 변형되지 않고, 그 다음 인접 뉴클레오티드는 변형되는 등이다. 하나의 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형될 수 있고, 다음 인접 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있고, 그 다음 인접 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형되는 등이며, 여기서 제1 및 제2 변형은 상이하다.
본 발명의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에서 제시된다. 이들 실시예는 대표적인 것으로 의도되고 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 적어도 뉴클레오티드 2 및 14는 바람직하게는 제1 공통 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 적어도 1개, 여러개 또는 바람직하게는 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 바람직하게는 제1 공통 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 적어도 1개, 여러개 또는 바람직하게는 모든 홀수-번호 뉴클레오티드가 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 바람직하게는, 이들은 제2 변형에 의해 변형된다. 이러한 제2 변형은 바람직하게는, 핵산이 또한 예를 들어 제1 가닥의 뉴클레오티드 2 및 14 또는 모든 짝수-번호 뉴클레오티드의 제1 변형을 포함하는 경우에, 제1 변형과 상이하다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 임의의 2' 리보스 변형, 또는 잠금 핵산 (LNA), 또는 비잠금 핵산 (UNA), 또는 2'-플루오로아라비노 핵산 (FANA) 변형이다. 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로, 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있으며, 단 핵산은 대등한 조건 하에 변형(들) 없는 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 것을 조건으로 한다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이고/거나 제2 변형은 바람직하게는 2'-OMe이다.
본 개시내용의 문맥에서, 치환기, 예컨대 2' 리보스 변형의 크기 또는 부피는 바람직하게는 반 데르 발스 부피로서 측정된다.
한 측면에서, 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 적어도 1개, 여러개 또는 바람직하게는 모든 뉴클레오티드는 바람직하게는 제3 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는, 동일한 핵산에서 제1 가닥의 뉴클레오티드 2 및 14 또는 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형된다. 또한 또는 대안적으로, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형된다. 바람직하게는, 제3 변형은 제1 변형과 상이하고/거나 제3 변형은 제2 변형과 동일하다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 임의의 2' 리보스 변형, 또는 잠금 핵산 (LNA), 또는 비잠금 핵산 (UNA), 또는 2'-플루오로아라비노 핵산 (FANA) 변형이다. 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로, 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있으며, 단 핵산은 대등한 조건 하에 변형(들) 없는 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 것을 조건으로 한다. 제1 변형은 바람직하게는 2'-F이고/거나 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OMe이다. 제1 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
예를 들어 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 있는 제2 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드와 염기 쌍형성된 제2 가닥의 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 적어도 1개, 여러개 또는 바람직하게는 모든 뉴클레오티드는 바람직하게는 제4 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는, 동일한 핵산에서 제1 가닥의 뉴클레오티드 2 및 14 또는 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형된다. 또한 또는 대안적으로, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형된다. 또한 또는 대안적으로, 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형으로 변형된다. 제4 변형은 바람직하게는 제2 변형과 상이하고, 바람직하게는 제3 변형과 상이하고, 제4 변형은 바람직하게는 제1 변형과 동일하다. 제1 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 임의의 2' 리보스 변형, 또는 잠금 핵산 (LNA), 또는 비잠금 핵산 (UNA), 또는 2'-플루오로아라비노 핵산 (FANA) 변형이다. 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로, 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있으며, 단 핵산은 대등한 조건 하에 변형(들) 없는 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 것을 조건으로 한다. 제1 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형이고/거나 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-F 변형이다. 제1 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 제2 가닥의 뉴클레오티드/뉴클레오티드들은 제4 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 뉴클레오티드/뉴클레오티드들 이외의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형된다. 바람직하게는, 동일한 핵산에서 제1 가닥의 뉴클레오티드 2 및 14 또는 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형으로 변형된다. 또한 또는 대안적으로, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형된다. 제4 변형은 바람직하게는 제2 변형과 상이하고, 바람직하게는 제3 변형과 상이하고, 제4 변형은 바람직하게는 제1 변형과 동일하다. 제1 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 임의의 2' 리보스 변형, 또는 잠금 핵산 (LNA), 또는 비잠금 핵산 (UNA), 또는 2'-플루오로아라비노 핵산 (FANA) 변형이다. 2'-OH 기와 부피상 동일한 크기 또는 더 작은 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-F, 2'-H, 2'-할로, 또는 2'-NH2일 수 있다. 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 임의의 2' 리보스 변형이다. 2'-OH 기보다 부피상 더 큰 2' 리보스 변형은 예를 들어 2'-OMe, 2'-O-MOE (2'-O-메톡시에틸), 2'-O-알릴 또는 2'-O-알킬일 수 있으며, 단 핵산은 대등한 조건 하에 변형(들) 없는 동일한 핵산과 적어도 동일한 정도로 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 것을 조건으로 한다. 제1 및/또는 제4 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형이고/거나 제2 및/또는 제3 변형은 바람직하게는 2'-F 변형이다. 제1 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 제1 및/또는 제4 변형은 2'-F이고/거나, 제2 및/또는 제3 변형은 2'-OMe이다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥의 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 뉴클레오티드 이외의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되며, 여기서 제1 및 제4 변형은 2'-F이고, 제2 및 제3 변형은 2'-OMe이다. 이러한 측면의 한 실시양태에서, 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드는 역전된 RNA 뉴클레오티드이다 (즉, 뉴클레오티드는 통상적인 경우에서와 같이 그의 5' 탄소를 통해서가 아니라 그의 3' 탄소를 통해 가닥의 3' 단부에 연결된다). 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드가 역전된 RNA 뉴클레오티드인 경우에, 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 천연 뉴클레오티드 대응물과 비교하여 임의의 변형을 포함하지 않는다는 점에서 비변형된 뉴클레오티드이다. 구체적으로, 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 2'-OH 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 이러한 측면에서, 제2 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드가 역전된 RNA 뉴클레오티드인 경우에, 핵산은 적어도 제1 가닥의 5' 단부를 포함하는 단부에서 평활-단부이다.
본 발명의 한 측면은 바람직하게는 세포에서 C3 유전자의 발현을 억제하기 위한 본원에 개시된 바와 같은 핵산이며, 여기서 상기 제1 가닥은 RISC에 의한 핵산의 프로세싱을 용이하게 하기 위해 복수의 위치에서 변형된 뉴클레오티드 또는 비변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
한 측면에서, "RISC에 의한 프로세싱을 용이하게 한다"는 핵산이 RISC에 의해 프로세싱될 수 있다는 것을 의미하고, 예를 들어 존재하는 임의의 변형은 핵산이 RISC에 의해 프로세싱되는 것을 허용할 것이고, 바람직하게는, 적합하게는 siRNA 활성이 발생할 수 있도록 RISC에 의한 프로세싱에 유익할 것이다.
제1 가닥의 5' 단부로부터의 위치 2 및 14의 뉴클레오티드가 2' OMe 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 위치 11 또는 위치 13 또는 위치 11 및 13 또는 위치 11, 12 및 13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드/뉴클레오티드들이 2'-OMe 변형으로 변형되지 않은 (즉, 이들이 변형되지 않거나 또는 2'-OMe 이외의 변형으로 변형된) 본원에 개시된 바와 같은 핵산.
한 측면에서, 제1 가닥의 위치 13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 13과 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 위치 11에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 11과 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드이다.
한 측면에서, 제1 가닥의 위치 12에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 12와 염기 쌍을 형성하는 뉴클레오티드이다.
예를 들어, 이중-가닥이고 평활 단부인 19량체 핵산에서, 제1 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 13은 제2 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 7과 쌍형성할 것이다. 제1 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 11은 제2 가닥의 (5' 단부로부터의) 위치 9와 쌍형성할 것이다. 이러한 명명법은 제2 가닥의 다른 위치에 적용될 수 있다.
한 측면에서, 부분적으로 상보적인 제1 및 제2 가닥의 경우에, 제1 가닥 상의 위치"에 상응하는" 제2 가닥 상의 뉴클레오티드는 그 위치가 미스매치가 존재하는 위치인 경우에 반드시 염기 쌍을 형성하지는 않을 수 있지만, 명명법의 원리는 여전히 적용된다.
한 측면은 제1 가닥의 5' 단부로부터의 위치 2 및 14의 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형으로 변형되지 않고, 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드가 2'-F 변형으로 변형된 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 제1 가닥의 5' 단부로부터의 위치 2 및 14의 뉴클레오티드가 2'-F 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형으로 변형되지 않은 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 제1 가닥의 5' 단부로부터의 위치 2 및 14의 뉴클레오티드가 2'-F 변형으로 변형되고, 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드가 2'-F 변형으로 변형된 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 50% 초과가 2'-OMe 변형을 포함하고, 예컨대 제1 및/또는 제2 가닥의 55% 초과, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85%, 또는 그 초과가 2'-OMe 변형을 포함하는 것인 본원에 개시된 바와 같은 핵산이며, 이는 바람직하게는 제1 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오티드의 백분율로서 측정된다.
한 측면은 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 50% 초과가 자연 발생 RNA 변형을 포함하는, 예컨대 제1 및/또는 제2 가닥의 55% 초과, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 또는 85% 또는 그 초과가 이러한 변형을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산이며, 이는 바람직하게는 제1 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오티드의 백분율로서 측정된다. 적합한 자연 발생 변형은 2'-OMe 뿐만 아니라 다른 2' 당 변형, 특히 DNA 뉴클레오티드를 생성하는 2'-H 변형을 포함한다.
한 측면은 제1 및/또는 제2 가닥 상에 바람직하게는 제1 및 제2 가닥 둘 다의 총 뉴클레오티드의 백분율로서 20% 이하, 예컨대 15% 이하, 예컨대 10% 이하의 2'-OMe 변형이 아닌 2' 변형을 갖는 뉴클레오티드를 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 2'-OMe 변형이 아닌 2'-변형을 갖는 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 수가 7개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하인 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 제1 및/또는 제2 가닥 상에 바람직하게는 둘 다의 가닥의 총 뉴클레오티드의 백분율로서 20% 이하 (예컨대 15% 이하 또는 10% 이하)의 2'-F 변형을 포함하는 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 2'-F 변형을 갖는 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드의 수가 7개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하, 가장 바람직하게는 3개 이하인 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다.
한 측면은 제1 가닥의 5' 단부로부터의 위치 2 및 14 및 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드를 제외하고 모든 뉴클레오티드가 2'-OMe 변형으로 변형된 본원에 개시된 바와 같은 핵산이다. 바람직하게는, 2'-OMe로 변형되지 않은 뉴클레오티드는 2' 위치에서 플루오로로 변형된다 (2'-F 변형).
핵산의 모든 뉴클레오티드가 당의 2' 위치에서 변형된 본원에 개시된 바와 같은 핵산이 바람직하다. 바람직하게는, 이들 뉴클레오티드는 변형이 2'-OMe 변형이 아닌 2'-F 변형으로 변형된다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥 상에서 교대 2'-OMe 변형 및 2-F 변형으로 변형되고, 위치 2 및 14 (5' 단부로부터 시작함)는 2'-F로 변형된다. 바람직하게는, 제2 가닥은 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상의 뉴클레오티드에서 2'-F 변형으로 변형된다. 바람직하게는, 제2 가닥은 3' 단부로부터 카운팅하여 상보적 (이중-가닥) 영역의 제1 위치에서 시작하여 위치 11-13에서 2'-F 변형으로 변형되고, 나머지 변형은 자연 발생 변형, 바람직하게는 2'-OMe이다. 적어도 이 경우에 상보적 영역은, 2개의 뉴클레오티드가 서로 염기 쌍형성할 수 있는지에 관계없이, 제1 가닥에서 상응하는 뉴클레오티드를 갖는 제2 가닥의 제1 위치에서 시작한다.
핵산의 한 측면에서, 제1 가닥 및 제2 가닥의 뉴클레오티드 각각은 변형된 뉴클레오티드이다.
본원에 기재된 용어 "홀수-번호"는 2로 나눌 수 없는 수를 의미한다. 홀수의 예는 1, 3, 5, 7, 9, 11 등이다. 본원에 기재된 용어 "짝수-번호"는 2로 균등하게 나눌 수 있는 수를 의미한다. 짝수의 예는 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 등이다.
달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 제1 가닥의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다. 제2 가닥의 뉴클레오티드는 제2 가닥의 3' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된다.
제1 및/또는 제2 가닥 상의 1개 이상의 뉴클레오티드는 변형되어 변형된 뉴클레오티드를 형성할 수 있다. 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상이 변형될 수 있다. 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상은 적어도 제2 변형에 의해 변형될 수 있고, 여기서 적어도 제2 변형은 1개 이상의 홀수 뉴클레오티드 상의 변형과 상이하다. 1개 이상의 변형된 짝수-번호 뉴클레오티드 중 적어도 1개는 1개 이상의 변형된 홀수-번호 뉴클레오티드 중 적어도 1개에 인접할 수 있다.
제1 가닥의 복수의 홀수-번호 뉴클레오티드는 본 발명의 핵산에서 변형될 수 있다. 제1 가닥의 복수의 짝수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥은 공통 변형에 의해 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제1 가닥은 또한 제2의 상이한 변형에 의해 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다 (즉, 제1 가닥은 서로 인접하고 제1 변형에 의해 변형된 뉴클레오티드 뿐만 아니라 서로 인접하고 제1 변형과 상이한 제2 변형에 의해 변형된 다른 뉴클레오티드를 포함할 수 있음).
제2 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 (여기서, 뉴클레오티드는 제2 가닥의 3' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링됨)은 제1 가닥 상의 홀수-번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형에 의해 변형될 수 있고/거나 (여기서, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링됨), 제2 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상은 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드의 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥의 1개 이상의 변형된 짝수-번호 뉴클레오티드 중 적어도 1개는 1개 이상의 변형된 홀수-번호 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 가닥의 복수의 홀수-번호 뉴클레오티드는 공통 변형에 의해 변형될 수 있고/거나 복수의 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 가닥 홀수-번호 뉴클레오티드 상에 존재하는 동일한 변형에 의해 변형될 수 있다. 제2 가닥 상의 복수의 홀수-번호 뉴클레오티드는 제1 가닥 홀수-번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형에 의해 변형될 수 있다.
제2 가닥은 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드의 변형과 상이한 변형일 수 있는 공통 변형에 의해 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 핵산에서, 제1 가닥의 각각의 홀수-번호 뉴클레오티드 및 제2 가닥의 각각의 짝수-번호 뉴클레오티드는 공통 변형으로 변형될 수 있고, 각각의 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 가닥에서 상이한 변형으로 변형될 수 있고, 각각의 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 가닥에서 상이한 변형으로 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 제1 가닥의 변형된 뉴클레오티드가 제2 가닥의 비변형된 또는 상이하게 변형된 뉴클레오티드에 비해 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 시프트될 수 있다.
제1 가닥에서 홀수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 짝수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 둘 다의 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥에서 짝수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 짝수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 둘 다의 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥에서 홀수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 홀수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상은 공통 변형에 의해 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 둘 다의 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 제1 가닥에서 짝수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 변형될 수 있고, 제2 가닥에서 홀수-번호 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 공통 변형에 의해 변형될 수 있다. 어느 하나 또는 둘 다의 가닥 상의 교대 뉴클레오티드 중 1개 이상 또는 각각은 제2 변형에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 핵산은 가닥 중 하나 또는 둘 다에서 적어도 2개의 교대 변형 영역을 포함하는 단일- 또는 이중-가닥 구축물을 포함할 수 있다. 이들 교대 영역은 최대 약 12개의 뉴클레오티드를 포함할 수 있지만, 바람직하게는 약 3 내지 약 10개의 뉴클레오티드를 포함한다. 교대 뉴클레오티드 영역은 본 발명의 핵산의 하나 또는 둘 다의 가닥의 말단에 위치할 수 있다. 핵산은 각각의 말단 (3' 및 5')에서 4 내지 약 10개의 뉴클레오티드의 교대 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이들 영역은 약 5 내지 약 12개의 인접 비변형된 또는 상이하게 또는 공통적으로 변형된 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다.
제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드는 변형될 수 있고, 짝수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드의 변형과 동일할 수 있는 공통 변형으로 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드는 또한 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 1개 이상의 뉴클레오티드는 서로, 및 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드의 변형과 동일한 변형을 갖는 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제1 가닥은 또한 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결 또는 3' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 5' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 또한 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
본 발명의 핵산은 공통 변형으로 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함하는 제1 가닥을 포함할 수 있다. 1개 이상의 이러한 뉴클레오티드는 제2 변형으로 변형될 수 있는 1개 이상의 뉴클레오티드에 인접할 수 있다. 제2 변형을 갖는 1개 이상의 뉴클레오티드는 인접할 수 있다. 제2 가닥은 제1 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드의 변형 중 1개와 동일할 수 있는, 공통 변형으로 변형된 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 제2 가닥의 1개 이상의 뉴클레오티드는 또한 제2 변형으로 변형될 수 있다. 제2 변형을 갖는 1개 이상의 뉴클레오티드는 인접할 수 있다. 제1 가닥은 또한 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결 또는 3' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 3' 단부의 2개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함할 수 있다. 제2 가닥은 또한 5' 단부에서 리간드에 접합될 수 있다.
제1 가닥 상에서 5'에서 3'로 및 제2 가닥 상에서 3'에서 5'로 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 및 25로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 뉴클레오티드는 본 발명의 핵산을 위해 제1 가닥 상에서 5'에서 3'로 및 제2 가닥 상에서 3'에서 5'로 넘버링된다.
2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 넘버링된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23으로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 변형에 의해 변형될 수 있다. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 및 24로 넘버링된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상에서 제2 변형에 의해 변형될 수 있다.
명백하게, 제1 및/또는 제2 가닥이 25개 미만의 뉴클레오티드 길이, 예컨대 19개의 뉴클레오티드 길이라면, 변형될 20, 21, 22, 23, 24 및 25로 넘버링된 뉴클레오티드는 존재하지 않는다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 따라서 보다 짧은 가닥에 적용되는 상기 기재를 이해한다.
제1 가닥 상의 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 공통 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 제1 가닥 상의 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 상이한 변형을 갖는 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 제1 가닥 상의 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 제2 가닥 상의 비변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 제2 가닥 상의 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드는 제1 가닥 상의 비변형된 뉴클레오티드와 쌍형성될 수 있다. 다시 말해서, 교대 뉴클레오티드는 2개의 가닥 상에서 정렬될 수 있고, 예컨대 예를 들어, 제2 가닥의 교대 영역 내의 모든 변형은 제1 가닥의 동일한 변형과 쌍형성되거나, 또는 대안적으로 변형은 하나의 가닥의 교대 영역 내의 공통 변형이 다른 가닥의 비유사한 변형 (즉, 제2 또는 추가의 변형)과 쌍형성하면서 하나의 뉴클레오티드에 의해 상쇄될 수 있다. 또 다른 옵션은 각각의 가닥에서 비유사한 변형을 갖는 것이다.
제1 가닥 상의 변형은 제2 가닥 상의 변형된 뉴클레오티드에 비해 1개의 뉴클레오티드만큼 시프트될 수 있어서, 공통 변형된 뉴클레오티드는 서로 쌍형성되지 않는다.
변형 및/또는 변형들은 각각 및 개별적으로 3' 말단 데옥시 티민, 2'-OMe, 2' 데옥시 변형, 2' 아미노 변형, 2' 알킬 변형, 모르폴리노 변형, 포스포르아미데이트 변형, 5'-포스포로티오에이트 기 변형, 5' 포스페이트 또는 5' 포스페이트 모방체 변형 및 콜레스테릴 유도체 또는 도데칸산 비스데실아미드 기 변형으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고/거나 변형된 뉴클레오티드는 잠금 뉴클레오티드, 무염기성 뉴클레오티드 또는 비-천연 염기 포함 뉴클레오티드 중 어느 하나일 수 있다.
적어도 1개의 변형은 2'-OMe일 수 있고/거나 적어도 1개의 변형은 2'-F일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 추가의 변형이 제1 및/또는 제2 가닥 상에 존재할 수 있다.
본 발명의 핵산은 하나 또는 여러 개의 가닥 단부에서 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이러한 역전된 뉴클레오티드는 핵산에 안정성을 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 3' 단부 및/또는 제2 가닥의 5' 단부에서 적어도 역전된 뉴클레오티드를 포함한다. 보다 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 뉴클레오티드를 포함한다. 가장 바람직하게는, 핵산은 제2 가닥의 3' 단부에서 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함하고, 이러한 뉴클레오티드는 바람직하게는 역전된 A이다. 역전된 뉴클레오티드는 통상적인 경우에서와 같이 그의 5' 탄소를 통해서가 아니라 그의 3' 탄소를 통해 핵산의 3' 단부에 연결되거나 또는 통상적인 경우에서와 같이 그의 3' 탄소를 통해서가 아니라 그의 5' 탄소를 통해 핵산의 5' 단부에 연결된 뉴클레오티드이다. 역전된 뉴클레오티드는 바람직하게는 오버행으로서가 아니라 다른 가닥의 상응하는 뉴클레오티드에 대향하는 가닥의 단부에 존재한다. 따라서, 핵산은 바람직하게는, 역전된 RNA 뉴클레오티드를 포함하는 단부에서 평활 단부이다. 역전된 RNA 뉴클레오티드가 가닥의 단부에 존재한다는 것은 바람직하게는 가닥의 이러한 단부의 마지막 뉴클레오티드가 역전된 RNA 뉴클레오티드라는 것을 의미한다. 이러한 뉴클레오티드를 갖는 핵산은 안정하고 합성하기 쉽다. 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 천연 뉴클레오티드 대응물과 비교하여 어떠한 변형도 포함하지 않는다는 의미에서 비변형된 뉴클레오티드이다. 구체적으로, 역전된 RNA 뉴클레오티드는 바람직하게는 2'-OH 뉴클레오티드이다.
본 발명의 핵산은 2' 위치에서 2'-H로 변형된 1개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 따라서 핵산 내에 DNA 뉴클레오티드를 갖는다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 단부로부터 카운팅하여 제1 가닥의 위치 2 및/또는 14에서 DNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상에 DNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산당 1개 이하의 DNA 뉴클레오티드가 존재한다.
본 발명의 핵산은 1개 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 제1 가닥의 5' 단부로부터 카운팅하여 제1 가닥의 위치 2 및/또는 14에서 LNA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 위치 11, 또는 13, 또는 11 및 13, 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 상에 LNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 대표적인 변형된 핵산 서열이 실시예에서 제시된다. 이들 실시예는 대표적인 것으로 의도되고 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
바람직하게는, 핵산은 각각 및 개별적으로 2'-OMe 변형 및 2'-F 변형을 포함하는 군으로부터 선택된 제1 변형 및 제2 또는 추가의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 제1 변형일 수 있는 2'-OMe인 변형, 및 2'-F인 제2 변형을 포함할 수 있다. 본 발명의 핵산은 또한 각각의 또는 둘 다의 가닥의 각각의 또는 임의의 단부의 말단 2 또는 3개의 뉴클레오티드 내에 또는 그 사이에 존재할 수 있는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형 및/또는 데옥시 변형을 포함할 수 있다.
핵산의 한 측면에서, 제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 1개의 뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드이고, 여기서 제1 가닥이 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우에:
(i) 제1 가닥의 뉴클레오티드 2 및 14 중 적어도 하나 또는 둘 다가 제1 변형에 의해 변형되고/거나;
(ii) 제1 가닥의 적어도 1개, 여러개, 또는 모든 짝수-번호 뉴클레오티드가 제1 변형에 의해 변형되고/거나;
(iii) 제1 가닥의 적어도 1개, 여러개, 또는 모든 홀수-번호 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고/거나;
여기서 제2 가닥이 적어도 1개의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 경우에:
(iv) 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 적어도 1개, 여러개, 또는 모든 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되고/거나;
(v) 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 적어도 1개, 여러개, 또는 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고/거나;
(vi) 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 제2 가닥의 적어도 1개, 여러개, 또는 모든 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되고/거나;
(vii) 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치 이외의 위치의 제2 가닥의 적어도 1개, 여러개, 또는 모든 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되고;
여기서 제1 가닥 상의 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링되고;
여기서 변형은 바람직하게는 하기:
(a) 제1 변형은 바람직하게는 제2 및 제3 변형과 상이함;
(b) 제1 변형은 바람직하게는 제4 변형과 동일함;
(c) 제2 및 제3 변형은 바람직하게는 동일한 변형임;
(d) 제1 변형은 바람직하게는 2'-F 변형임;
(e) 제2 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형임;
(f) 제3 변형은 바람직하게는 2'-OMe 변형임; 및/또는
(g) 제4 변형은 바람직하게는 2'-F 변형임;
중 적어도 하나이며,
여기서 임의로 핵산은 리간드에 접합된다.
한 측면은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416, 바람직하게는 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377 또는 416의 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 여기서 제1 가닥의 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형되고, 여기서 제1 및 제4 변형은 2'-F이고, 제2 및 제3 변형은 2'-OMe인, 바람직하게는 세포에서 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산이다.
한 측면은 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416, 바람직하게는 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377 또는 416의 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 여기서 제1 가닥의 모든 짝수-번호 뉴클레오티드는 제1 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 모든 홀수-번호 뉴클레오티드는 제2 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제4 변형에 의해 변형되고, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 뉴클레오티드 이외의 제2 가닥의 모든 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형되고, 여기서 제1 및 제4 변형은 2'-F이고, 제2 및 제3 변형은 2'-OMe인, 바람직하게는 세포에서 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산이다.
올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 단부는 변형될 수 있다. 이러한 변형은 분자의 3' 단부 또는 5' 단부 또는 둘 다의 단부에 존재할 수 있다. 이들은 전체 말단 포스페이트 또는 포스페이트 기의 원자 중 1개 이상의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 단부는 다른 기능적 분자 엔티티, 예컨대 표지 모이어티, 예를 들어, 형광단 (예를 들어, 피렌, TAMRA, 플루오레세인, Cy3 또는 Cy5 염료) 또는 보호기 (예를 들어, 황, 규소, 붕소 또는 에스테르를 기초로 함)에 접합될 수 있다. 기능적 분자 엔티티는 포스페이트 기 및/또는 링커를 통해 당에 부착될 수 있다. 링커의 말단 원자는 포스페이트 기의 연결 원자 또는 당의 C-3' 또는 C-5' O, N, S 또는 C 기에 연결되거나 또는 이를 대체할 수 있다. 대안적으로, 링커는 뉴클레오티드 대용물 (예를 들어, PNA)의 말단 원자에 연결되거나 또는 이를 대체할 수 있다. 이들 스페이서 또는 링커는 예를 들어 -(CH2)n-, -(CH2)nN-, -(CH2)nO-, -(CH2)nS-, -(CH2CH2O)nCH2CH2O- (예를 들어, n=3 또는 6), 무염기성 당, 아미드, 카르복시, 아민, 옥시아민, 옥시이민, 티오에테르, 디술피드, 티오우레아, 술폰아미드, 또는 모르폴리노, 또는 비오틴 및 플루오레세인 시약을 포함할 수 있다. 3' 단부는 -OH 기일 수 있다.
말단 변형의 다른 예는 염료, 삽입제 (예를 들어, 아크리딘), 가교제 (예를 들어, 프소랄렌, 미토마이신 C), 포르피린 (TPPC4, 텍사피린, 사피린), 폴리시클릭 방향족 탄화수소 (예를 들어, 페나진, 디히드로페나진), 인공 엔도뉴클레아제, EDTA, 친지성 담체 (예를 들어, 콜레스테롤, 콜산, 아다만탄 아세트산, 1-피렌 부티르산, 디히드로테스토스테론, 1,3-비스-O(헥사데실)글리세롤, 게라닐옥시헥실 기, 헥사데실글리세롤, 보르네올, 멘톨, 1,3-프로판디올, 헵타데실 기, 팔미트산, 미리스트산, O3-(올레오일)리토콜산, O3-(올레오일)콜렌산, 디메톡시트리틸, 또는 페녹사진) 및 펩티드 접합체 (예를 들어, 안테나페디아 펩티드, Tat 펩티드), 알킬화제, 포스페이트, 아미노, 메르캅토, PEG (예를 들어, PEG-40K), MPEG, [MPEG]2, 폴리아미노, 알킬, 치환된 알킬, 방사성표지된 마커, 효소, 합텐 (예를 들어, 비오틴), 수송/흡수 촉진제 (예를 들어, 아스피린, 비타민 E, 폴산), 합성 리보뉴클레아제 (예를 들어, 이미다졸, 비스이미다졸, 히스타민, 이미다졸 클러스터, 아크리딘-이미다졸 접합체, 테트라아자마크로사이클의 Eu3+ 착물)를 포함한다.
말단 변형은 또한 분포를 모니터링하는데 유용할 수 있고, 이러한 경우에 부가될 기는 형광단, 예를 들어 플루오레세인 또는 알렉사 염료를 포함할 수 있다. 말단 변형은 또한 흡수를 증진시키는데 유용할 수 있고, 이에 유용한 변형은 콜레스테롤을 포함한다. 말단 변형은 또한 RNA 작용제를 또 다른 모이어티에 가교시키는데 유용할 수 있다.
말단 변형은 활성을 조정하거나 또는 분해에 대한 저항성을 조정하는 것을 포함한 다수의 이유로 부가될 수 있다. 활성을 조정하는데 유용한 말단 변형은 포스페이트 또는 포스페이트 유사체를 사용한 5' 단부의 변형을 포함한다. 제1 또는 제2 가닥 상의 본 발명의 핵산은 5' 인산화될 수 있거나 또는 5' 프라임 말단에서 포스포릴 유사체를 포함할 수 있다. 5'-포스페이트 변형은 RISC 매개 유전자 침묵과 상용성인 것을 포함한다. 적합한 변형은 5'-모노포스페이트 ((HO)2(O)P-O-5'); 5'-디포스페이트 ((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-트리포스페이트 ((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-구아노신 캡 (7-메틸화 또는 비-메틸화) (7m-G-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-아데노신 캡 (Appp), 및 임의의 변형된 또는 비변형된 뉴클레오티드 캡 구조 (N-O-5'-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5'); 5'-모노티오포스페이트 (포스포로티오에이트; (HO)2(S)P-O-5'); 5'-모노디티오포스페이트 (포스포로디티오에이트; (HO)(HS)(S)P-O-5'), 5'-포스포로티올레이트 ((HO)2(O)P-S-5'); 산소/황 대체된 모노포스페이트, 디포스페이트 및 트리포스페이트의 임의의 추가의 조합 (예를 들어, 5'-알파-티오트리포스페이트, 5'-감마-티오트리포스페이트 등), 5'-포스포르아미데이트 ((HO)2(O)P-NH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-알킬포스포네이트 (알킬=메틸, 에틸, 이소프로필, 프로필, 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'- (여기서 R은 알킬임), (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5' 비닐포스포네이트, 5'-알킬에테르포스포네이트 (알킬에테르=메톡시메틸 (MeOCH2-), 에톡시메틸 등, 예를 들어 RP(OH)(O)-O-5'- (여기서 R은 알킬에테르임))를 포함한다.
특정 모이어티는 제1 가닥 또는 제2 가닥의 5' 말단에 연결될 수 있다. 이들은 무염기성 리보스 모이어티, 무염기성 데옥시리보스 모이어티, 2'-O 알킬 변형을 포함하는 변형 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티; 역전된 무염기성 리보스 및 무염기성 데옥시리보스 모이어티 및 그의 변형, C6-이미노-Pi; 거울 뉴클레오티드 포함 L-DNA 및 L-RNA; 5'OMe 뉴클레오티드; 및 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 4',5'-메틸렌 뉴클레오티드; 1-(β-D-에리트로푸라노실)뉴클레오티드; 4'-티오 뉴클레오티드, 카르보시클릭 뉴클레오티드; 5'-아미노-알킬 포스페이트; 1,3-디아미노-2-프로필 포스페이트, 3-아미노프로필 포스페이트; 6-아미노헥실 포스페이트; 12-아미노도데실 포스페이트; 히드록시프로필 포스페이트; 1,5-안히드로헥시톨 뉴클레오티드; 알파-뉴클레오티드; 트레오-펜토푸라노실 뉴클레오티드; 비-시클릭 3',4'-세코 뉴클레오티드; 3,4-디히드록시부틸 뉴클레오티드; 3,5-디히드록시펜틸 뉴클레오티드, 5'-5'-역전된 무염기성 모이어티; 1,4-부탄디올 포스페이트; 5'-아미노; 및 가교 또는 비-가교 메틸포스포네이트 및 5'-메르캅토 모이어티를 포함한다.
본원에 기재된 각각의 서열에서, C-말단 "-OH" 모이어티는 C-말단 "-NH2" 모이어티를 치환할 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다.
본 발명은 또한 제1 가닥이 그의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖는 것인, 본원에 기재된 본 발명의 임의의 측면에 따른 핵산을 제공한다. 이러한 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결된다.
핵산의 제1 가닥은 화학식 (I)을 포함할 수 있으며:
(vp)-N(po)[N(po)]n- (I)
여기서 '(vp)-'는 5' (E)-비닐포스포네이트이고, 'N'은 뉴클레오티드이고, 'po'는 포스포디에스테르 연결이고, n은 1 내지 (제1 가닥의 뉴클레오티드의 총수 - 2)이고, 바람직하게는 n은 1 내지 (제1 가닥의 뉴클레오티드의 총수 -3)이고, 보다 바람직하게는 n은 1 내지 (제1 가닥의 뉴클레오티드의 총수 -4)이다.
바람직하게는, 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드, 바람직하게는 (vp)-U이다.
말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 5'-단부의 천연 포스페이트 기가 E-비닐포스포네이트로 대체된 뉴클레오티드이고, 여기서 5' 인산화된 가닥의 말단 뉴클레오티드의 가교 5'-산소 원자는 메티닐 (-CH=) 기로 대체된다:
Figure pct00004
5' (E)-비닐포스포네이트는 5' 포스페이트 모방체이다. 생물학적 모방체는 모방되는 원래 분자와 동일한 기능을 수행할 수 있고 구조적으로 매우 유사한 분자이다. 본 발명의 문맥에서, 5' (E)-비닐포스포네이트는 정상 5' 포스페이트의 기능을 모방하며, 예를 들어 효율적인 RISC 로딩을 가능하게 한다. 또한, 그의 약간 변경된 구조 때문에, 5' (E) 비닐포스포네이트는 5'-단부 뉴클레오티드를 효소, 예컨대 포스파타제에 의한 탈인산화로부터 보호함으로써 안정화시킬 수 있다.
한 측면에서, 제1 가닥은 그의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖고, 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결되고, 제1 가닥은 a) 1개 초과의 포스포디에스테르 연결; b) 적어도 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포디에스테르 연결 및/또는 c) 적어도 말단 4개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포디에스테르 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 2개의 뉴클레오티드 사이에 적어도 1개의 포스포로티오에이트 (ps) 및/또는 적어도 1개의 포스포로디티오에이트 (ps2) 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 1개 초과의 포스포로티오에이트 및/또는 1개 초과의 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 말단 2개의 3' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결 또는 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 제1 가닥 및/또는 제2 가닥의 다른 뉴클레오티드 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥 및/또는 제2 가닥은 말단 2개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결 또는 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명의 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 단부 중 1개 이상 상에 1개 이상의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형을 포함한다. 임의로, 제1 가닥의 각각의 또는 어느 하나의 단부는 1 또는 2 또는 3개의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형된 뉴클레오티드 (뉴클레오시드간 연결)를 포함할 수 있다. 임의로, 제2 가닥의 각각의 또는 어느 하나의 단부는 1 또는 2 또는 3개의 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 변형된 뉴클레오티드 (뉴클레오시드간 연결)를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 핵산은 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 2 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 및 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 나머지 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥의 3' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고/거나 제2 가닥의 3' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결 및/또는 제2 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고, 제1 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함한다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 및 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 바람직하게는, 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 나머지 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은:
(i) 제1 가닥의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 및 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
(ii) 제2 가닥의 3' 단부 뉴클레오티드 또는 5' 단부 뉴클레오티드 상의 삼중안테나 리간드에 접합되고;
(iii) 삼중안테나 리간드에 접합된 것에 대향하는 단부에서 제2 가닥의 말단 3개의 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖고;
(iv) 임의로 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 나머지 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은:
(i) 제1 가닥의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖고;
(ii) 제1 및 제2 가닥 상의 말단 3개의 3' 뉴클레오티드 사이 및 제2 가닥 상의 말단 3개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 갖거나, 또는 제1 및 제2 가닥 상의 말단 2개의 3' 뉴클레오티드 사이 및 제2 가닥 상의 말단 2개의 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 갖고;
(iii) 임의로 제1 및/또는 제2 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 나머지 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
본 발명의 핵산에서 포스포로디티오에이트 연결의 사용은 동일한 위치에서 포스포로티오에이트를 포함하는 분자와 비교하여 핵산 분자의 집단의 입체화학에서 변동을 감소시킨다. 포스포로티오에이트 연결은 키랄 중심을 도입하고, 어떠한 비-연결 산소가 황을 치환하는지 제어하기가 어렵다. 포스포로디티오에이트의 사용은 그 연결에 키랄 중심이 존재하지 않는 것을 보장하고, 따라서 핵산 분자에 사용된 포스포로디티오에이트 및 포스포로티오에이트 연결의 수에 따라 핵산 분자의 집단에서 임의의 변동을 감소시키거나 제거한다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥의 3' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드의 사이에 포스포로디티오에이트 연결, 제2 가닥의 3' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드의 사이에 포스포로디티오에이트 연결 및 제2 가닥의 5' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고, 제1 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함한다. 바람직하게는, 제1 가닥은 그의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖는다. 이러한 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결된다. 바람직하게는, 제1 가닥의 3' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 및 제2 가닥의 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 이외에 둘 다의 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
한 측면에서, 핵산은 제1 가닥 상의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각의 사이에 및/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각의 사이에, 및/또는 제2 가닥의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각의 사이에 및/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각의 사이에, 포스포로디티오에이트 연결이 그러한 단부에 존재하지 않는 경우에, 포스포로티오에이트 연결을 포함한다. 포스포로디티오에이트 연결이 단부에 존재하지 않는다는 것은 해당 핵산 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이, 또는 바람직하게는 3개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결이 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결이라는 것을 의미한다.
한 측면에서, 제1 가닥의 3' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 및 제2 가닥의 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 이외에 둘 다의 가닥의 뉴클레오티드 사이의 핵산의 모든 연결은 포스포디에스테르 연결이다.
다른 포스페이트 연결 변형이 가능하다.
포스페이트 링커는 또한 연결 산소를 질소 (가교된 포스포로아미데이트), 황 (가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소의 질소로의 대체가 가능하다.
포스페이트 기는 또한 개별적으로 비-인 함유 연결기에 의해 대체될 수 있다.
포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸, 카르바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸렌 옥시드 링커, 술포네이트, 술폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌히드라조, 메틸렌디메틸히드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함한다. 특정 실시양태에서, 대체는 메틸렌카르보닐아미노 및 메틸렌메틸이미노 기를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커 및 리보스 당은 뉴클레아제 저항성 뉴클레오티드에 의해 대체될 수 있다. 예는 모르폴리노, 시클로부틸, 피롤리딘 및 펩티드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함한다. 특정 실시양태에서, PNA 대용물이 사용될 수 있다.
한 측면에서, 바람직하게는 RNAi를 통해, 바람직하게는 세포에서 보체 성분 C3의 발현을 억제하는, 바람직하게는 siRNA인 핵산은 다음 중 하나 이상 또는 전부를 포함한다:
(i) 변형된 뉴클레오티드;
(ii) 제1 가닥의 5' 단부로부터 위치 2 및 14에서 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드 이외의 변형된 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-F 변형된 뉴클레오티드;
(iii) 제1 가닥의 5' 단부에서 1로부터 시작하여 넘버링된 바와 같은 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드 각각은 2'-OMe 변형된 뉴클레오티드임;
(iv) 제1 가닥의 5' 단부에서 1로부터 시작하여 넘버링된 바와 같은 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드 각각은 2'-F 변형된 뉴클레오티드임;
(v) 제1 가닥의 위치 11 및/또는 13 또는 11-13에 상응하는 제2 가닥 뉴클레오티드는 2'-OMe 변형 이외의 변형에 의해 변형되고, 바람직하게는 여기서 이들 위치 중 하나 또는 둘 다 또는 모두는 2'-F 변형을 포함함;
(vi) 제2 가닥의 3' 단부의 역전된 뉴클레오티드, 바람직하게는 3'-3' 연결;
(vii) 1개 이상의 포스포로티오에이트 연결;
(viii) 1개 이상의 포스포로디티오에이트 연결; 및/또는
(ix) 제1 가닥은 그의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖고, 이러한 경우에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 우리딘이고, 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결됨.
핵산의 모든 특색은 본원에 개시된 본 발명의 모든 다른 측면과 조합될 수 있다.
리간드
본 발명의 핵산은 리간드에 접합될 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 특히 이중-가닥 핵산을 생체내 세포에 효율적으로 전달하는 것은 중요하며, 특이적 표적화 및 세포외 환경, 특히 혈청 단백질로부터의 실질적인 보호를 필요로 한다. 특이적 표적화를 달성하는 하나의 방법은 리간드를 핵산에 접합시키는 것이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 접합된 리간드에 결합하여 이를 내재화하는 세포 표면 수용체를 갖는 표적 세포에 핵산을 표적화하는 것을 돕는다. 이러한 실시양태에서, 접합된 분자가 상이한 수용체-매개 세포내이입 경로 또는 기능적으로 유사한 과정과 같은 메카니즘에 의해 표적 세포에 의해 흡수되도록 하기 위해 목적하는 수용체 분자에 대한 적절한 리간드를 접합시키는 것이 필요하다. 다른 실시양태에서, 수용체 매개 세포내이입 이외의 메카니즘에 의해 표적 세포 내로의 핵산의 내재화를 매개할 수 있는 리간드는 대안적으로 세포 또는 조직 특이적 표적화를 위해 본 발명의 핵산에 접합될 수 있다.
수용체 매개 세포내이입을 매개하는 접합체의 한 예는 본원에 기재된 GalNAc 모이어티에 대해 높은 친화도를 갖는 아시알로당단백질 수용체 복합체 (ASGP-R)이다. ASGP-R 복합체는 간세포 상에 고도로 풍부한 막 ASGR1 및 ASGR2 수용체의 다량체의 다양한 비로 구성된다. 접합된 리간드로서 삼중안테나 클러스터 글리코시드를 사용하는 것의 첫번째 개시내용 중 하나는 미국 특허 번호 US 5,885,968에 있었다. 3개의 GalNAc 리간드를 갖고 포스페이트 기를 포함하는 접합체가 공지되어 있고, 문헌 [Dubber et al., (Bioconjug. Chem. 2003 Jan-Feb;14(1):239-46.)]에 기재되어 있다. ASGP-R 복합체는 D-Gal보다 N-아세틸-D-갈락토사민 (GalNAc)에 대해 50-배 더 높은 친화도를 나타낸다.
ASGP-R 복합체는 글리코실화된 단백질 또는 다른 올리고사카라이드의 말단 β-갈락토실 서브유닛을 특이적으로 인식하고 (Weigel, P.H. et al., Biochim. Biophys. Acta. 2002 Sep 19;1572(2-3):341-63), 약물 물질에 대한 갈락토스 또는 갈락토사민의 공유 커플링에 의해 수용체 복합체를 발현하는 간의 간세포에 약물을 전달하는데 사용될 수 있다 (Ishibashi,S.; et al., J Biol. Chem. 1994 Nov 11;269(45):27803-6). 또한, 결합 친화도는 표적화 모이어티의 반복에 의해 달성되는 다가 효과에 의해 유의하게 증가될 수 있다 (Biessen EA, et al., J Med Chem. 1995 Apr 28;38(9):1538-46).
ASGP-R 복합체는 말단 β-갈락토실 함유 당단백질의 세포의 엔도솜으로의 능동 흡수를 위한 매개인자이다. 따라서, ASGPR은 예를 들어 핵산과 같은, 리간드에 접합된 약물 후보의 수용체-발현 세포 내로의 표적화된 전달에 고도로 적합하다 (Akinc et al., Mol Ther. 2010 Jul;18(7):1357-64).
보다 일반적으로 리간드는 표적 세포 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대해 친화도를 갖도록 선택된 사카라이드를 포함할 수 있다. 특히, 수용체, 예를 들어, 앞서 기재된 간 아시알로당단백질 수용체 복합체 (ASGP-R)는 포유동물 간 세포의 표면 상에 존재한다.
사카라이드는 N-아세틸 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스로부터 선택될 수 있다. 사카라이드는 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc)일 수 있다.
따라서, 본 발명에 사용하기 위한 리간드는 (i) 1개 이상의 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 모이어티 및 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함할 수 있으며, 여기서 링커는 GalNAc 모이어티를 임의의 상기 측면에 정의된 바와 같은 핵산에 접합시킨다. 링커는 1가 구조 또는 2가 또는 3가 또는 4가 분지형 구조일 수 있다. 뉴클레오티드는 본원에 정의된 바와 같이 변형될 수 있다.
따라서, 리간드는 GalNAc를 포함할 수 있다.
한 측면에서, 핵산은 화학식 (II)의 화합물:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
을 포함하는 리간드에 접합되며,
여기서:
S는 사카라이드를 나타내고, 바람직하게는 여기서 사카라이드는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에테르이고, 여기서 n = 1- 6이고;
A는 분지화 유닛이고;
X3은 가교 유닛을 나타내고;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트를 통해 X3에 접합된다.
화학식 (II)에서, 분지화 유닛 "A"는 바람직하게는 3개의 사카라이드 리간드를 수용하기 위해 3개로 분지된다. 분지화 유닛은 바람직하게는 리간드 및 핵산의 나머지 테더링된 부분에 공유 부착된다. 분지화 유닛은 알킬, 아미드, 디술피드, 폴리에틸렌 글리콜, 에테르, 티오에테르 및 히드록시아미노 기로부터 선택된 기를 포함한 분지화된 지방족 기를 포함할 수 있다. 분지화 유닛은 알킬 및 에테르 기로부터 선택된 기를 포함할 수 있다.
분지화 유닛 A는
Figure pct00005
로부터 선택된 구조를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지화 유닛은
Figure pct00006
로부터 선택된 구조를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 A1은 독립적으로 O, S, C=O 또는 NH를 나타내고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지화 유닛은
Figure pct00007
로부터 선택된 구조를 가질 수 있으며, 여기서 각각의 A1은 O, S, C=O 또는 NH이고; 각각의 n은 독립적으로 1 내지 20의 정수를 나타낸다.
분지화 유닛은 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00008
.
분지화 유닛은 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00009
.
분지화 유닛은 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00010
.
대안적으로, 분지화 유닛 A는
Figure pct00011
로부터 선택된 구조를 가질 수 있으며, 여기서:
R1은 수소 또는 C1-C10 알킬렌이고;
R2는 C1-C10 알킬렌이다.
임의로, 분지화 유닛은 탄소 원자만으로 이루어진다.
"X3" 부분은 가교 유닛이다. 가교 유닛은 선형이고, 분지화 유닛 및 핵산에 공유 결합된다.
X3은 -C1-C20 알킬렌-, -C2-C20 알케닐렌-, 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르, -C(O)-C1-C20 알킬렌-, -C0-C4 알킬렌(Cy)C0-C4 알킬렌- (여기서 Cy는 치환 또는 비치환된 5 또는 6원 시클로알킬렌, 아릴렌, 헤테로시클릴렌 또는 헤테로아릴렌 고리를 나타냄), -C1-C4 알킬렌-NHC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)NH-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-SC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)S-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-OC(O)-C1-C4 알킬렌-, -C1-C4 알킬렌-C(O)O-C1-C4 알킬렌-, 및 -C1-C6 알킬렌-S-S-C1-C6 알킬렌-으로부터 선택될 수 있다.
X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C1-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르일 수 있다. X3은 화학식 -(C1-C20 알킬렌)-O-(C4-C20 알킬렌)-의 알킬렌 에테르일 수 있고, 여기서 상기 (C4-C20 알킬렌)는 Z에 연결된다. X3은 -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-, 특히 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 여기서 각 경우에 -CH2- 기는 A에 연결된다.
한 측면에서, 핵산은 화학식 (III)의 화합물:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
을 포함하는 리간드에 접합되며, 여기서:
S는 사카라이드, 바람직하게는 GalNAc를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 C1-C8알킬렌이고;
A는
Figure pct00012
로부터 선택된 분지화 유닛이고,
X3은 가교 단위이고;
여기서 본 발명에 따른 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트를 통해 X3에 접합된다.
분지화 유닛 A는 하기 구조를 가질 수 있다:
Figure pct00013
.
분지화 유닛 A는 하기 구조를 가질 수 있으며:
Figure pct00014
, 여기서 X3은 질소 원자에 부착된다.
X3은 C1-C20 알킬렌일 수 있다. 바람직하게는, X3은 -C3H6-, -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-, 특히 -C4H8-, -C6H12- 및 -C8H16-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 측면에서, 핵산은 화학식 (IV)의 화합물:
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (IV)
을 포함하는 리간드에 접합되며, 여기서:
S는 사카라이드, 바람직하게는 GalNAc를 나타내고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에테르이고;
A는 분지화 유닛이고;
X3은 -CH2-O-CH2-, -CH2-O-C2H4-, -CH2-O-C3H6-, -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, 및 -CH2-O-C8H16-로 이루어진 군으로부터 선택된 화학식의 알킬렌 에테르이고, 여기서 각 경우에 -CH2- 기는 A에 연결되고,
여기서 X3은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트에 의해 본 발명에 따른 핵산에 접합된다.
분지화 유닛은 탄소를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 분지화 유닛은 탄소이다.
X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C5H10-, -CH2-O-C6H12-, -CH2-O-C7H14-, 및 -CH2-O-C8H16-로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, X3은 -CH2-O-C4H8-, -CH2-O-C6H12- 및 -CH2-O-C8H16으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
X1은 (-CH2-CH2-O)(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-일 수 있다. X1은 (-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-일 수 있다. 바람직하게는, X1은 (-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-이다. 대안적으로, X1은 C3-C6 알킬렌을 나타낸다. X1은 프로필렌일 수 있다. X1은 부틸렌일 수 있다. X1은 펜틸렌일 수 있다. X1은 헥실렌일 수 있다. 바람직하게는 알킬은 선형 알킬렌이다. 특히, X1은 부틸렌일 수 있다.
X2는 화학식 -C3H6-O-CH2-의 알킬렌 에테르 즉 C3 알콕시 메틸렌, 또는 -CH2CH2CH2OCH2-를 나타낸다.
상기 측면 중 임의의 것에 대해, P가 변형된 포스페이트 기를 나타내는 경우, P는
Figure pct00015
에 의해 나타내어질 수 있고, 여기서 Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 =O, =S, -O-, -OH, -SH, -BH3, -OCH2CO2, -OCH2CO2Rx, -OCH2C(S)ORx, 및 -ORx를 나타내고, 여기서 Rx는 C1-C6 알킬을 나타내고, 여기서
Figure pct00016
는 화합물의 나머지에 대한 부착을 나타낸다.
변형된 포스페이트는 비-연결 산소 중 1개 이상이 대체된 포스페이트 기를 의미한다. 변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 포스포로디티오에이트는 둘 다의 비-연결 산소가 황에 의해 대체된다. 포스페이트 기 내의 비-연결 산소 중 하나, 각각 또는 둘 다는 독립적으로 S, Se, B, C, H, N, 또는 OR (R은 알킬 또는 아릴임) 중 어느 하나일 수 있다.
포스페이트는 또한 연결 산소를 질소 (가교된 포스포로아미데이트), 황 (가교된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (가교된 메틸렌포스포네이트)로 대체함으로써 변형될 수 있다. 대체는 말단 산소에서 일어날 수 있다. 비-연결 산소의 질소로의 대체가 가능하다.
예를 들어, Y1은 -OH를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나; 또는
Y1은 -O-를 나타낼 수 있고, Y2는 =O 또는 =S를 나타낼 수 있거나;
Y1은 =O를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, -SH, -ORx, 또는 -BH3을 나타낼 수 있거나
Y1은 =S를 나타낼 수 있고, Y2는 -CH3, ORx 또는 -SH를 나타낼 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 특정 경우에 Y1 및 Y2 사이에 탈국재화가 존재할 것임을 이해할 것이다.
바람직하게는, 변형된 포스페이트 기는 티오포스페이트 기이다. 티오포스페이트 기는 비티오포스페이트 (즉, 여기서 Y1은 =S를 나타내고, Y2는 -S-를 나타냄) 및 모노티오포스페이트 (즉, 여기서 Y1은 -O-를 나타내고, Y2는 =S를 나타내거나, 또는 여기서 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 -S-를 나타냄)를 포함한다. 바람직하게는, P는 모노티오포스페이트이다. 본 발명자들은 포스페이트 기를 대체하여 티오포스페이트 기를 갖는 접합체가 생체내에서 개선된 효력 및 작용 지속기간을 갖는다는 것을 발견하였다.
P는 또한 에틸포스페이트일 수 있다 (즉, 여기서 Y1은 =O를 나타내고, Y2는 OCH2CH3을 나타냄).
사카라이드는 표적 세포 상의 적어도 하나의 유형의 수용체에 대해 친화도를 갖도록 선택될 수 있다. 특히, 수용체, 예를 들어, 간 아시알로당단백질 수용체 복합체 (ASGP-R)는 포유동물 간 세포의 표면 상에 존재한다.
상기 또는 하기 측면 중 임의의 것의 경우, 사카라이드는 갈락토사민, 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 프룩토스 중 1개 이상을 갖는 N-아세틸로부터 선택될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에서 사용되는 리간드는 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc)을 포함할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 화합물은 3개의 리간드를 가질 수 있으며, 이는 각각 바람직하게는 N-아세틸 갈락토사민을 포함할 것이다.
"GalNAc"는 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스를 지칭하며, 이는 통상적으로 문헌에서 N-아세틸 갈락토사민으로 지칭된다. "GalNAc" 또는 "N-아세틸 갈락토사민"에 대한 언급은 β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다를 포함한다. 특정 실시양태에서, β-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스 및 α-형태: 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스 둘 다는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 β-형태, 2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스를 포함한다.
Figure pct00017
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-D-갈락토피라노스
Figure pct00018
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-β-D-갈락토피라노스
Figure pct00019
2-(아세틸아미노)-2-데옥시-α-D-갈락토피라노스
한 측면에서, 핵산은 접합된 핵산이며, 여기서 핵산은 하기 구조:
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
중 하나를 갖는 삼중안테나 리간드에 접합되고, 여기서 Z는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 핵산이다.
바람직하게는, 핵산은 접합된 핵산이며, 여기서 핵산은 하기 구조:
Figure pct00025
를 갖는 삼중안테나 리간드에 접합되고, 여기서 Z는 본원에 정의된 바와 같은 임의의 핵산이다.
화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 리간드 또는 본원에 개시된 삼중안테나 리간드 중 어느 하나는 제1 (안티센스) 가닥의 3'-단부 및/또는 제2 (센스) 가닥의 3' 및/또는 5' 단부 중 임의의 것에 부착될 수 있다. 핵산은 1개 초과의 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 리간드 또는 본원에 개시된 삼중안테나 리간드 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 그러나, 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 단일 리간드 또는 본원에 개시된 삼중안테나 리간드 중 어느 하나가 바람직한데, 이는 이러한 단일 리간드가 핵산을 표적 세포로 효율적으로 표적화하기에 충분하기 때문이다. 바람직하게는, 이 경우에, 리간드가 부착되는 핵산의 단부의 적어도 마지막 2개, 바람직하게는 적어도 마지막 3개, 보다 바람직하게는 적어도 마지막 4개의 뉴클레오티드가 포스포디에스테르 연결에 의해 연결된다.
바람직하게는, 제1 (안티센스) 가닥의 5'-단부는 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 리간드 또는 본원에 개시된 삼중안테나 리간드 중 어느 하나에 부착되지 않는데, 이는 이러한 위치의 리간드가 핵산의 생물학적 활성을 잠재적으로 방해할 수 있기 때문이다.
가닥의 5' 단부에 화학식 (II), (III) 또는 (IV)의 단일 리간드 또는 본원에 개시된 삼중안테나 리간드 중 어느 하나를 갖는 핵산은 3' 단부에 동일한 리간드를 갖는 동일한 핵산보다 합성하기가 더 용이하고, 따라서 더 저렴하다. 따라서 바람직하게는, 화학식 (II), (III) 또는 (IV) 중 임의의 것의 단일 리간드 또는 본원에 개시된 삼중안테나 리간드 중 어느 하나는 핵산의 제2 가닥의 5' 단부에 공유 부착된다 (그와 접합된다).
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (V)의 화합물이며:
Figure pct00026
여기서 b는 바람직하게는 0 또는 1이고;
제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이며:
Figure pct00027
;
여기서:
c 및 d는 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제1 및 제2 가닥이고;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
n은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이고;
L1은 리간드가 부착되는 링커이고, 여기서 L1은 화학식 (V) 및 (VI)에서 동일하거나 상이하고, L1이 동일한 화학식 내에 1회 초과로 존재하는 경우에 화학식 (V) 및 (VI) 내에서 동일하거나 상이하고, 여기서 L1은 바람직하게는 화학식 (VII)을 갖고;
여기서 b + c + d는 바람직하게는 2 또는 3이다.
바람직하게는, 화학식 (V) 및 (VI)에서 L1은 화학식 (VII)을 갖고:
Figure pct00028
여기서:
L은
-(CH2)r-C(O)- (여기서 r = 2-12);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)- (여기서 s = 1-5);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)- (여기서 t는 독립적으로 1-5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)- (여기서 u는 독립적으로 1-5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)- (여기서 v는 2-12임)
를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 말단 C(O)는, 존재하는 경우에, 화학식 (VII)의 X에, 또는 X가 부재하는 경우에, 화학식 (VII)의 W1에, 또는 W1이 부재하는 경우에, 화학식 (VII)의 V에 부착되고;
W1, W3 및 W5는 개별적으로 부재하거나, 또는 하기:
-(CH2)r- (여기서 r = 1-7);
-(CH2)s-O-(CH2)s- (여기서 s는 독립적으로 0-5임);
-(CH2)t-S-(CH2)t- (여기서 t는 독립적으로 0-5임)
를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되고;
X는 부재하거나, 또는 NH, NCH3 또는 NC2H5를 포함하는, 또는 바람직하게는 이로 이루어진 군으로부터 선택되고;
V는:
CH, N,
Figure pct00029
를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 B는, 존재하는 경우에, 변형된 또는 천연 핵염기이다.
한 측면에서, 제1 가닥은 화학식 (VIII)의 화합물이며:
Figure pct00030
여기서 b는 바람직하게는 0 또는 1이고;
제2 가닥은 화학식 (IX)의 화합물이며:
Figure pct00031
;
c 및 d는 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이고;
여기서:
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제1 및 제2 가닥이고;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
R1은 H 또는 메틸이고;
n은 독립적으로 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3이고;
L은 화학식 (VIII) 및 (IX)에서 동일하거나 상이하고, L이 동일한 화학식 내에 1회 초과로 존재하는 경우에 화학식 (VIII) 및 (IX) 내에서 동일하거나 상이하고, 하기를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되고:
-(CH2)r-C(O)- (여기서 r = 2-12);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)- (여기서 s = 1-5);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)- (여기서 t는 독립적으로 1-5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)- (여기서 u는 독립적으로 1-5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)- (여기서 v는 2-12임);
여기서 말단 C(O)는, 존재하는 경우에, (표적화 리간드가 아닌, 링커의) NH 기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 바람직하게는 2 또는 3이다.
한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (X)의 화합물이며:
Figure pct00032
여기서 b는 바람직하게는 0 또는 1이고;
제2 가닥은 화학식 (XI)의 화합물이며:
Figure pct00033
;
여기서:
c 및 d는 독립적으로 바람직하게는 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 제1 및 제2 RNA 핵산 가닥이고;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
n은 독립적으로 바람직하게는 0, 1, 2 또는 3이고;
L2는 화학식 (X) 및 (XI)에서 동일하거나 상이하고, b, c 및 d에 의해 괄호로 표시된 모이어티에서 동일하거나 상이하고,
Figure pct00034
를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는
n은 0이고, L2는:
Figure pct00035
이고, 말단 OH 기는 부재하여 하기 모이어티가 형성되고:
Figure pct00036
;
여기서:
F는 포화 분지형 또는 비분지형 (예컨대 비분지형) C1-8알킬 (예를 들어 C1-6알킬) 쇄이며, 여기서 탄소 원자 중 1개는 산소 원자로 임의로 대체되나, 단 상기 산소 원자는 또 다른 헤테로원자 (예를 들어 O 또는 N 원자)로부터 적어도 2개의 탄소 원자만큼 분리되고;
L은 화학식 (X) 및 (XI)에서 동일하거나 상이하고,
-(CH2)r-C(O)- (여기서 r = 2-12);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)- (여기서 s = 1-5);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)- (여기서 t는 독립적으로 1-5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)- (여기서 u는 독립적으로 1-5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)- (여기서 v는 2-12임)
를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되고;
여기서 말단 C(O)는, 존재하는 경우에, (표적화 리간드가 아닌, 링커의) NH 기에 부착되고;
여기서 b + c + d는 바람직하게는 2 또는 3이다.
한 측면에서, 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 핵산 중 임의의 것에서 b는 0이고, c는 1이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 0이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 1이고, d는 0이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다. 바람직하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이거나; b는 1이고, c는 0이고, d는 1이거나; 또는 b는 1이고, c는 1이고, d는 1이다. 가장 바람직하게는, b는 0이고, c는 1이고, d는 1이다.
한 측면에서, 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 핵산 중 임의의 것에서 Y는 O이다. 또 다른 측면에서, Y는 S이다. 바람직한 측면에서, Y는 독립적으로 화학식의 상이한 위치에서 O 또는 S로부터 선택된다.
한 측면에서, 화학식 (VIII) 및 (IX)의 핵산 중 임의의 것에서 R1은 H 또는 메틸이다. 한 측면에서, R1은 H이다. 또 다른 측면에서, R1은 메틸이다.
한 측면에서, 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 핵산 중 임의의 것에서 n은 0, 1, 2 또는 3이다. 바람직하게는, n은 0이다.
화학식 (X) 및 (XI)의 핵산 중 임의의 것에서 F 모이어티의 예는 (CH2)1-6 예를 들어 (CH2)1-4 예를 들어 CH2, (CH2)4, (CH2)5 또는 (CH2)6, 또는 CH2O(CH2)2-3, 예를 들어 CH2O(CH2)CH3을 포함한다.
한 측면에서, 화학식 (X) 및 (XI)에서 L2는
Figure pct00037
이다.
한 측면에서, L2는
Figure pct00038
이다.
한 측면에서, L2는
Figure pct00039
이다.
한 측면에서, L2는
Figure pct00040
이다.
한 측면에서, n은 0이고, L2는
Figure pct00041
이고,
말단 OH 기는 부재하여 하기 모이어티가 형성되고:
Figure pct00042
;
여기서 Y는 O 또는 S이다.
한 측면에서, 화학식 (V) 및 (VI) 또는 (VIII) 및 (IX) 또는 (X) 및 (XI)의 핵산에서 L은
-(CH2)r-C(O)- (여기서 r = 2-12);
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)- (여기서 s = 1-5);
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)- (여기서 t는 독립적으로 1-5임);
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)- (여기서 u는 독립적으로 1-5임); 및
-(CH2)v-NH-C(O)- (여기서 v는 2-12임)
를 포함하는, 또는 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되며;
여기서 말단 C(O)는 NH 기에 부착된다.
바람직하게는, L은 -(CH2)r-C(O)-이고, 여기서 r = 2-12, 보다 바람직하게는 r = 2-6, 보다 더 바람직하게는 r = 4 또는 6, 예를 들어 4이다.
바람직하게는, L은
Figure pct00043
이다.
b, c 및 d에 의해 괄호로 표시된 모이어티 내에서, 화학식 (X) 및 (XI)의 핵산에서 L2는 전형적으로 동일하다. b, c 및 d에 의해 괄호로 표시된 모이어티 사이에서, L2는 동일하거나 상이할 수 있다. 한 실시양태에서, c에 의해 괄호로 표시된 모이어티에서의 L2는 d에 의해 괄호로 표시된 모이어티에서의 L2와 동일하다. 한 실시양태에서, c에 의해 괄호로 표시된 모이어티에서의 L2는 d에 의해 괄호로 표시된 모이어티에서의 L2와 동일하지 않다. 한 실시양태에서, b, c 및 d에 의해 괄호로 표시된 모이어티에서의 L2는, 예를 들어 링커 모이어티가 세리놀-유래 링커 모이어티인 경우에 동일하다.
세리놀 유래 링커 모이어티는 임의의 입체화학의 세리놀에 기초할 수 있으며, 즉 L-세린 이성질체, D-세린 이성질체, 라세미 세린 또는 이성질체의 다른 조합으로부터 유래될 수 있다. 본 발명의 바람직한 측면에서, 세리놀-GalNAc 모이어티 (SerGN)는 하기 입체화학을 갖고:
Figure pct00044
즉, 이는 L-세린 이성질체로부터 유래된 (S)-세리놀-아미다이트 또는 (S)-세리놀 숙시네이트 고체 지지된 빌딩 블록을 기초로 한다.
바람직한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (VIII)의 화합물이고, 핵산의 제2 가닥은 화학식 (IX)의 화합물이며, 여기서:
b는 0이고;
c 및 d는 1이고,
n은 0이고,
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제1 및 제2 가닥이고,
Y는 S이고,
R1은 H이고,
L은 -(CH2)4-C(O)-이고, 여기서 L의 말단 C(O)는 링커의 N 원자에 부착된다 (즉, 표적화 리간드의 가능한 N 원자가 아님).
또 다른 바람직한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (V)의 화합물이고, 핵산의 제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이며, 여기서:
b는 0이고,
c 및 d는 1이고,
n은 0이고,
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제1 및 제2 가닥이고,
Y는 S이고,
L1은 화학식 (VII)을 갖고, 여기서
W1은 -CH2-O-(CH2)3-이고,
W3은 -CH2-이고,
W5는 부재하고,
V는 CH이고,
X는 NH이고,
L은 -(CH2)4-C(O)-이고, 여기서 L의 말단 C(O)는 화학식 (VII)의 X의 N 원자에 부착된다.
또 다른 바람직한 측면에서, 핵산의 제1 가닥은 화학식 (V)의 화합물이고, 핵산의 제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이며, 여기서:
b는 0이고,
c 및 d는 1이고,
n은 0이고,
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제1 및 제2 가닥이고,
Y는 S이고,
L1은 화학식 (VII)을 갖고, 여기서
W1, W3 및 W5는 부재하고,
V는
Figure pct00045
이고,
X는 부재하고,
L은 -(CH2)4-C(O)-NH-(CH2)5-C(O)-이고, 여기서 L의 말단 C(O)는 화학식 (VII)의 V의 N 원자에 부착된다.
한 측면에서, 핵산은 하기 구조:
Figure pct00046
를 갖는 삼중안테나 리간드에 접합되며, 여기서 핵산은 리간드에 리간드의 포스페이트 기를 통해 a) 제2 가닥의 5' 단부의 마지막 뉴클레오티드에; b) 제2 가닥의 3' 단부의 마지막 뉴클레오티드에; 또는 c) 제1 가닥의 3' 단부의 마지막 뉴클레오티드에 접합된다.
핵산의 한 측면에서, 리간드를 갖는 핵산에 의해 표적화되는 세포는 간세포이다.
GalNAc가 존재하는 상기 리간드 중 어느 하나에서, GalNAc는 임의의 다른 표적화 리간드, 예컨대 본원에 언급된 것, 특히 만노스, 갈락토스, 글루코스, 글루코사민 및 푸코스로 치환될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태는 제1 가닥이 서열식별번호: 409를 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 423을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이다. 이러한 핵산은 추가로 리간드에 접합될 수 있다. 제1 가닥이 서열식별번호: 409를 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 410을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이 보다 더 바람직하다. 서열식별번호: 409 및 서열식별번호: 410으로 이루어진 siRNA가 가장 바람직하다. 본 발명의 한 측면은 EJ0020이다.
대안적인 특히 바람직한 실시양태는 제1 가닥이 서열식별번호: 420을 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 424를 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이다. 이러한 핵산은 추가로 리간드에 접합될 수 있다. 제1 가닥이 서열식별번호: 420을 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 421을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이 보다 더 바람직하다. 서열식별번호: 420 및 서열식별번호: 421로 이루어진 siRNA가 가장 바람직하다. 본 발명의 한 측면은 EV0212이다.
대안적인 특히 바람직한 실시양태는 제1 가닥이 서열식별번호: 417을 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 425를 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이다. 이러한 핵산은 추가로 리간드에 접합될 수 있다. 제1 가닥이 서열식별번호: 417을 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 418을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이 보다 더 바람직하다. 서열식별번호: 417 및 서열식별번호: 418로 이루어진 siRNA가 가장 바람직하다. 본 발명의 한 측면은 EV0210이다. 예비 NHP 데이터는 이러한 siRNA가 놀랍게도 고등 종에서 생체내에서 강력하다는 것을 보여준다.
한 측면에서, 핵산은 지질을 포함하는 리간드, 보다 바람직하게는 콜레스테롤을 포함하는 리간드에 접합된다.
조성물, 용도 및 방법
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 포함하는 조성물을 제공한다. 핵산 및 조성물은 의약으로서 또는 진단제로서 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 1개 이상의 핵산(들)은 전달 비히클 (예를 들어, 리포솜) 및/또는 부형제, 예컨대 담체, 희석제와 조합될 수 있다. 다른 작용제, 예컨대 보존제 및 안정화제가 또한 첨가될 수 있다. 본 발명의 핵산 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물도 마찬가지로 본 발명의 범주 내에 있다. 핵산의 전달 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 관련 기술분야의 통상의 기술자의 지식 내에 있다.
본원에 개시된 조성물은 특히 제약 조성물이다. 이러한 조성물은 대상체에게 투여하기에 적합하다.
한 측면에서, 조성물은 본원에 개시된 핵산, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물, 및 용매 (바람직하게는 물) 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리학상 허용되는 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충제 및/또는 보존제를 포함한다.
제약상 허용되는 담체 또는 희석제는 경구, 직장, 비강 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 및 경피 포함) 투여에 적합한 제제에 사용되는 것을 포함한다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 제약 관련 기술분야에 널리 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 피하 또는 경피 투여 방식이 본원에 기재된 화합물에 특히 적합할 수 있다.
본 발명의 핵산의 치료 유효량은 투여 경로, 치료되는 포유동물의 유형, 및 고려되는 구체적 포유동물의 신체 특징에 좌우될 것이다. 이들 인자 및 이러한 양을 결정하는 것에 대한 그의 관계는 의학 기술분야의 숙련된 진료의에게 널리 공지되어 있다. 이러한 양 및 투여 방법은 최적의 효능을 달성하도록 조정될 수 있고, 체중, 식이, 공동 의약, 및 의학 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 인자와 같은 인자에 좌우될 수 있다. 인간 용도로 가장 적절한 투여량 크기 및 투여 요법은 본 발명에 의해 수득된 결과에 의해 가이드될 수 있고, 적절하게 설계된 임상 시험에서 확인될 수 있다.
유효 투여량 및 치료 프로토콜은 실험실 동물에서 저용량으로 시작한 다음, 효과를 모니터링하면서 투여량을 증가시키고, 또한 투여 요법을 체계적으로 변화시키는 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다. 주어진 대상체에 대한 최적 투여량을 결정할 때 임상의는 수많은 인자를 고려할 수 있다. 이러한 고려사항은 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본 발명의 핵산 또는 그의 염은 전형적으로 치료 유효량의 본 발명의 핵산 또는 그의 염을 제약상 허용되는 담체 중에 포함하는, 저장 또는 투여를 위해 제조된 제약 조성물로서 제제화될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산은 또한 다른 치료 화합물과 조합되어 투여될 수 있고, 개별적으로 또는 동시에, 예를 들어 조합된 단위 용량으로서 투여될 수 있다. 본 발명은 또한 생리학상/제약상 허용되는 부형제, 예컨대 안정화제, 보존제, 희석제, 완충제 등 중에 본 발명에 따른 1개 이상의 핵산을 포함하는 조성물을 포함한다.
한 측면에서, 조성물은 본원에 개시된 핵산, 및 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택된 추가의 치료제를 포함한다. 바람직하게는, 추가의 치료제는 보체 성분 C3 또는 또 다른 요소, 예컨대 단백질, 면역계 또는 보다 구체적으로 보체 경로의 발현 또는 활성을 표적화하는, 바람직하게는 억제하는 작용제이다. 바람직하게는, 추가의 치료제는 하기: a) 보체 경로의 성분 중 하나, 바람직하게는 C3 또는 C5 또는 그의 서브유닛 중 하나의 발현 또는 활성을 억제하는 펩티드; b) 생리학적 조건 하에 보체 경로의 성분 중 하나, 바람직하게는 C3 또는 C5 또는 그의 서브유닛 중 하나에 특이적으로 결합하는 항체; c) 에쿨리주맙 또는 그의 항원-결합 유도체 중 하나이다.
에쿨리주맙은 보체 성분 C5에 특이적으로 결합하는 인간화 모노클로날 항체이고, 상표명 솔리리스(SOLIRIS)® 하에 상업화된다. 이는 보체 성분 C5에 고친화도로 특이적으로 결합하고, C5의 C5a 및 C5b로의 절단을 억제한다. 항체는 예를 들어 특허 EP 0 758 904 B1 및 그의 패밀리 구성원에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 상이한 서열을 갖는 본 발명의 2개 이상의 핵산은 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상이한 핵산 중 하나 또는 그의 조합 및 적어도 1종의 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 및 조성물에 대한 투여량 수준은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 실험에 의해 결정될 수 있다. 한 측면에서, 단위 용량은 약 0.01 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중의 핵산 또는 접합된 핵산을 함유할 수 있다. 대안적으로, 용량은 10 mg/kg 내지 25 mg/kg 체중, 또는 1 mg/kg 내지 10 mg/kg 체중, 또는 0.05 mg/kg 내지 5 mg/kg 체중, 또는 0.1 mg/kg 내지 5 mg/kg 체중, 또는 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 체중, 또는 0.1 mg/kg 내지 0.5 mg/kg 체중, 또는 0.5 mg/kg 내지 1 mg/kg 체중일 수 있다. 대안적으로, 용량은 약 0.5 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 체중, 또는 약 0.6 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 체중, 또는 약 0.7 mg/kg 내지 약 7 mg/kg 체중, 또는 약 0.8 mg/kg 내지 약 6 mg/kg 체중, 또는 약 0.9 mg/kg 내지 약 5.5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 체중, 또는 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 5 mg/kg 체중일 수 있고, 여기서 "약"은 나타낸 값으로부터 최대 30%, 바람직하게는 최대 20%, 보다 바람직하게는 최대 10%, 보다 더 바람직하게는 최대 5%, 가장 바람직하게는 0%의 편차이다. 투여량 수준은 또한 다른 파라미터, 예컨대 예를 들어 체표면적을 통해 계산될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태는 제1 가닥이 서열식별번호: 409를 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 423을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이다. 이러한 핵산은 추가로 리간드에 접합될 수 있다. 제1 가닥이 서열식별번호: 409를 포함하거나 또는 그로 이루어지고 제2 가닥이 임의로 서열식별번호: 410을 포함하거나 또는 그로 이루어진 핵산이 보다 더 바람직하다. 서열식별번호: 409 및 서열식별번호: 410으로 이루어진 siRNA가 가장 바람직하다. 본 발명의 한 측면은 EJ0020이다. 이들 핵산의 용량 단위는 바람직하게는 약 1 mg/kg 내지 약 5 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 내지 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 1 mg/kg 체중, 또는 약 3 mg/kg 체중, 또는 약 5 mg/kg 체중을 포함한다. 핵산의 용량 단위에 의해 치료된 대상체의 간에서의 C3 mRNA 수준 및/또는 혈장 또는 혈액에서의 C3 단백질 수준은 바람직하게는 핵산으로 치료되지 않았거나 대등한 조건 하에 대조군 핵산으로 치료된 대조군과 비교하여 최대 효과의 시점에서 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 또는 적어도 70%만큼 감소된다.
투여량 및 투여 빈도는 치료가 치료적인지 또는 예방적인지 (예를 들어, 방지적인지)에 따라 달라질 수 있고, 치료 과정 동안 조정될 수 있다. 특정 예방 용도에서, 비교적 낮은 투여량이 비교적 장기간에 걸쳐 비교적 드문 간격으로 투여된다. 일부 대상체는 그의 일생에 걸쳐 계속 치료 받을 수 있다. 특정 치료 용도에서, 질환의 진행이 감소될 때까지 또는 환자가 질환 증상의 부분적 또는 완전한 호전을 나타낼 때까지 때때로 비교적 높은 투여량이 비교적 짧은 간격으로 요구된다. 그 후, 환자는 적합한 예방적 투여 요법으로 전환될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 중 단독의 또는 1종 이상의 다른 활성 성분과 조합된 본 발명의 핵산의 실제 투여량 수준은, 대상체 또는 환자에게 유해한 부작용을 유발하지 않으면서 특정한 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하는데 효과적인 활성 성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 인자, 예컨대 약동학적 인자, 예컨대 사용되는 특정한 핵산 또는 조성물의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정한 핵산의 배출 속도, 치료 지속기간, 사용되는 특정한 조성물과 조합되어 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 대상체 또는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 과거 병력, 및 의학 기술분야에 널리 공지된 유사한 인자에 좌우될 것이다.
제약 조성물은 멸균 주사가능한 수성 현탁액 또는 용액, 또는 동결건조 형태일 수 있다.
제약 조성물은 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 형태에서, 조성물은 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 분할된다. 단위 투여 형태는 포장된 제제, 개별 양의 제제를 함유하는 포장, 예를 들어 패킷된 정제, 캡슐, 및 바이알 또는 앰플 내의 분말일 수 있다. 단위 투여 형태는 또한 캡슐, 카쉐, 또는 정제 자체일 수 있거나, 또는 적절한 수의 이들 포장된 형태 중 임의의 것일 수 있다. 이는 단일 용량 주사가능한 형태, 예를 들어 펜의 형태로 제공될 수 있다. 조성물은 임의의 적합한 투여 경로 및 수단을 위해 제제화될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 및 의약은 제약 유효 용량으로 포유동물 대상체에게 투여될 수 있다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 원숭이 또는 원원류, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 래트, 햄스터, 헷지호그 및 기니 피그, 또는 다른 관련 종으로부터 선택될 수 있다. 이에 기초하여, 본원에 사용된 "C3"은 상기 언급된 종 중 임의의 것에서 자연적으로 또는 인공적으로 발현된다면 그러한 것에서의 핵산 또는 단백질을 나타내지만, 바람직하게는 이러한 단어는 인간 핵산 또는 단백질을 나타낸다.
본 발명의 제약 조성물은 단독으로 또는 1종 이상의 다른 치료제 또는 진단제와 조합되어 투여될 수 있다. 조합 요법은 치료될 특정한 환자, 질환 또는 상태에 기초하여 선택된 적어도 1종의 다른 치료제와 조합된 본 발명의 핵산을 포함할 수 있다. 다른 이러한 작용제의 예는, 특히, 치료 활성 소분자 또는 폴리펩티드, 단일 쇄 항체, 전형적 항체 또는 그의 단편, 또는 1종 이상의 추가의 유전자의 유전자 발현을 조정하는 핵산 분자, 및 치유적 또는 예방적 치료 요법을 보완하거나 또는 다르게는 유익하게 할 수 있는 유사한 조정 치료제를 포함한다.
제약 조성물은 전형적으로 멸균성이고, 제조 및 저장 조건 하에 안정하다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙적 구조로서 제제화될 수 있다. 담체는, 예를 들어 물, 알콜, 예컨대 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜), 또는 임의의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 제제 화학에 따른 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 특정 실시양태에서, 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨이 조성물에서 바람직할 수 있다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
본 발명의 한 측면은 의약으로서 사용하기 위한 본원에 개시된 핵산 또는 조성물이다. 핵산 또는 조성물은 바람직하게는 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 사용하기 위한 것이다.
본 발명은 C3 발현의 억제에 반응성인 상태, 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 위해, 제약 조성물에서 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용하기 위한 핵산을 제공한다.
본 발명의 한 측면은 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에서의 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물의 용도이다.
본 발명의 핵산 및 제약 조성물은 다양한 상태, 장애 또는 질환의 치료에 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산을 사용한 치료는 바람직하게는 간 및/또는 혈액에서 생체내 C3 고갈로 이어진다. 따라서, 본 발명의 핵산 및 그를 포함하는 조성물은 C3의 발현을 억제하는 것이 유익할 수 있는 다양한 병리학적 장애를 치료하는 방법에 유용할 것이다. 본 발명은 질환, 장애 또는 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 질환, 장애 또는 증후군의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 환자)에게 치료 유효량의 본 발명의 핵산 또는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 질환, 장애 또는 증후군의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
가장 바람직한 치료 유효량은 그를 필요로 하는 주어진 대상체에 대해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 선택된 특정한 치료의 목적하는 효능을 생성할 양이다. 이러한 양은 치료 화합물의 특징 (활성, 약동학, 약역학, 및 생체이용률 포함), 대상체의 생리학적 상태 (연령, 성별, 질환 유형 및 병기, 일반적 신체 상태, 주어진 투여량에 대한 반응성, 및 의약의 유형 포함), 제제 중 제약상 허용되는 담체 또는 담체들의 성질, 및 투여 경로를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 숙련된 작업자에 의해 이해되는 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 임상 및 약리학적 기술분야의 통상의 기술자는 실험을 통해, 즉 화합물의 투여에 대한 대상체의 반응을 모니터링하고 그에 따라 투여량을 조정함으로써 치료 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed., Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2005]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 및 제약 조성물은 질환, 장애 또는 증후군을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 질환, 장애 또는 증후군의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 본원에 개시된 바와 같은 핵산을 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 대상체, 예컨대 인간에서 질환, 장애 또는 증후군을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 핵산의 "치료 유효 투여량"의 투여는 질환 증상의 중증도의 감소, 질환 무증상 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 발생시킬 수 있다.
본 발명의 핵산은 본원에 기재된 방법을 사용하여 진단 또는 치료될 수 있는 질환, 장애 또는 증후군을 치료 또는 진단하는데 유익할 수 있다. 다른 질환, 장애 또는 증후군의 치료 및 진단이 또한 본 발명의 범주 내에 속하는 것으로 간주된다.
본 발명의 한 측면은 제약상 유효 용량 또는 양의 본원에 개시된 핵산 또는 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 그를 앓을 위험을 감소시키거나, 또는 치료하는 방법이며, 바람직하게는 여기서 핵산 또는 조성물은 대상체에게 피하로, 정맥내로, 또는 경구, 직장, 폐, 근육내 또는 복강내 투여에 의해 투여된다. 바람직하게는, 이는 피하로 투여된다.
본원에 개시된 핵산 또는 조성물로 예방 또는 치료될 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 보체-매개 질환, 장애 또는 증후군 또는 보체 경로와 연관된 질환, 장애 또는 증후군이다.
본원에 개시된 핵산 또는 조성물로 예방 또는 치료될 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 보체 경로의 이상 활성화 및/또는 과다활성화 (초활성화) 및/또는 보체 성분 C3의 과다발현 또는 이소성 발현 또는 국재화 또는 축적과 연관된다. C3의 축적을 수반하는 질환의 한 예는 C3 사구체병증 (C3G)이다. 이러한 질환에서, C3은 신장 사구체에 축적된다. 예방 또는 치료될 보체 경로의 이상 또는 과다활성화는 유전적 원인을 가질 수 있거나 또는 후천성일 수 있다. 바람직하게는, 예방 또는 치료될 질환, 장애 또는 증후군은 C3 사구체병증 (C3G)이다.
본원에 개시된 핵산 또는 조성물로 예방 또는 치료될 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 a) C3 사구체병증 (C3G), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 루푸스 신염, IgA 신병증 (IgA N), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), 원발성 막성 신병증, 면역 복합체-매개 사구체신염 (IC-매개 GN), 감염후 사구체신염 (PIGN), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 허혈/재관류 손상, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 류마티스 관절염 (RA), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), 디스바이오틱 치주 질환, 말라리아 빈혈, 시신경척수염, HCT 후 / 실질 기관 이식 (TMAs), 길랑-바레 증후군, 막성 사구체신염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 및 패혈증을 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 b) C3 사구체병증 (C3G), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 루푸스 신염, IgA 신병증 (IgA N) 및 원발성 막성 신병증을 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되거나; 또는 c) C3 사구체병증 (C3G), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), IgA 신병증 (IgA N), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)를 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되거나; d) C3 사구체병증 (C3G), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), 시신경척수염, 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), IgA 신병증 (IgA N), HCT 후 / 실질 기관 이식 (TMAs), 길랑-바레 증후군, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 막성 사구체신염, 루푸스 신염 및 혈전성 혈소판감소성 자반증을 포함하는, 바람직하게는 그로 이루어진 군으로부터 선택되거나; e) C3 사구체병증 (C3G), 저온 응집소 질환 (CAD) 및 IgA 신병증 (IgA N)이거나, 또는 f) 이는 C3 사구체병증 (C3G)이다. 본 발명에 따른 핵산 또는 조성물로 치료될 대상체는 바람직하게는 이들 질환, 장애 또는 증후군 중 하나를 앓고 있는 대상체이다.
본원에 개시된 핵산 또는 조성물은 매주 1회 또는 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 10주마다, 11주마다, 12주마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다의 치료를 포함하는 요법에서, 또는 다양한 투여 빈도, 예컨대 상기 언급된 간격의 조합을 갖는 요법에서 사용하기 위한 것일 수 있다. 핵산 또는 조성물은 피하로, 정맥내로 사용하거나 또는 임의의 다른 적용 경로, 예컨대 경구, 직장, 폐, 또는 복강내로 사용하기 위한 것일 수 있다. 바람직하게는, 이는 피하로 사용하기 위한 것이다.
본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물로 치료되거나 또는 그를 제공받는 세포 및/또는 대상체에서, C3 발현은 비치료된 세포 및/또는 대상체와 비교하여 15% 내지 최대 100%의 범위, 그러나 적어도 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 100% 또는 중간 값만큼 억제될 수 있다. 억제 수준은 C3 발현 또는 과다발현 또는 보체 과다활성화와 연관된 질환의 치료를 가능하게 할 수 있거나, 또는 C3 유전자 생성물의 기능 및 생리학적 역할을 추가로 조사하는 역할을 할 수 있다. 억제 수준은 바람직하게는 핵산 또는 조성물로 치료된 대상체의 간 또는 혈액 또는 신장, 바람직하게는 혈액에서 측정된다.
한 측면은 질환, 장애 또는 증후군, 예컨대 상기 열거된 바와 같은 것, 또는 바람직하게는 혈액 또는 신장에서의 C3의 상승된 수준, 또는 보체 경로의 과다활성화와 연관된 추가의 병리상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서의, 또는 C3 발현의 억제를 목적으로 하는 추가의 치료 접근법에서의 본원에 개시된 바와 같은 핵산 또는 조성물의 용도이다. 의약은 제약 조성물이다.
본 발명의 핵산 및 그의 제약상 허용되는 염 및 용매화물 각각은 본 발명의 개별 실시양태를 구성한다.
또한, (이러한 병리상태를 개선시키기 위해) 치료를 필요로 하는 개체에게 핵산을 포함하는 조성물 또는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 질환, 장애 또는 증후군, 예컨대 상기 열거된 것을 치료 또는 예방하는 방법이 본 발명에 포함된다. 핵산 또는 조성물은 매주 2회, 매주 1회, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 또는 8 내지 12주 또는 그 초과마다의 치료를 포함하는 요법으로, 또는 다양한 투여 빈도, 예컨대 상기 언급된 간격의 조합을 갖는 요법으로 투여될 수 있다. 핵산 또는 접합된 핵산은 피하로 또는 정맥내로 또는 다른 적용 경로, 예컨대 경구, 직장 또는 복강내로 사용하기 위한 것일 수 있다.
본 발명의 핵산은 에어로졸, 경장, 비강, 눈, 경구, 비경구, 직장, 질, 또는 경피 (예를 들어, 크림, 겔 또는 연고의 국소 투여, 또는 경피 패치에 의한 것)를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 관련 기술분야에 공지된 임의의 적절한 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. "비경구 투여"는 전형적으로 안와하, 주입, 동맥내, 피막내, 심장내, 피내, 근육내, 복강내, 폐내, 척수내, 흉골내, 척수강내, 자궁내, 정맥내, 지주막하, 피막하, 피하, 경점막, 또는 경기관 투여를 포함한, 의도된 작용 부위에서의 또는 그와 연통되는 주사와 연관된다.
핵산의 화학적 변형 패턴의 사용은 혈청에서 뉴클레아제 안정성을 부여하고, 예를 들어 피하 적용 경로를 실현가능하게 한다.
피내 또는 피하 적용에 사용되는 용액 또는 현탁액은 전형적으로 하기: 멸균 희석제 예컨대 주사용수, 염수 용액, 고정 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 다른 합성 용매; 항박테리아제 예컨대 벤질 알콜 또는 메틸 파라벤; 항산화제 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제 예컨대 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트; 및/또는 장성 조정제 예컨대, 예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스 중 1종 이상을 포함한다. pH는 산 또는 염기, 예컨대 염산 또는 수산화나트륨, 또는 시트레이트, 포스페이트, 아세테이트 등을 함유하는 완충제로 조정될 수 있다. 이러한 제제는 유리 또는 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 시린지 또는 다중 용량 바이알 내에 봉입될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 필요한 양의 핵산을 상기 기재된 성분 중 하나 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입시킨 후, 필요에 따라 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 분산액은 활성 화합물을 분산 매질 및 임의로 다른 성분, 예컨대 상기 기재된 것을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 그의 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 추가의 목적하는 성분에 더하여 활성 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
치료 유효량의 본 발명의 핵산이, 예를 들어 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 의해 투여되는 경우에, 핵산은 발열원-무함유의 비경구로 허용되는 수용액의 형태일 것이다. 적절한 pH, 등장성, 안정성 등을 고려하여 비경구로 허용되는 용액을 제조하는 방법은 관련 기술분야의 기술 내에 있다. 정맥내, 피부, 또는 피하 주사를 위한 바람직한 제약 조성물은 핵산에 더하여 등장성 비히클, 예컨대 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 락테이트화 링거 주사, 또는 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 다른 비히클을 함유할 것이다. 본 발명의 제약 조성물은 또한 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제, 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 핵산의 양은 치료될 대상체 및 특정한 투여 방식을 포함한 다양한 인자에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 이는 특정한 상황 하에 적절한 치료 효과를 생성하는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 퍼센트 중에서, 이러한 양은 제약상 허용되는 담체와 조합된 약 0.01% 내지 약 99%의 핵산, 약 0.1% 내지 약 70%, 또는 약 1% 내지 약 30%의 핵산의 범위일 것이다.
핵산은 급속 방출에 대해 화합물을 보호할 담체, 예컨대 이식물, 경피 패치, 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조를 위한 많은 방법이 특허를 받았거나 또는 일반적으로 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조한다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 용량이 투여될 수 있거나, 여러 분할 용량이 시간 경과에 따라 투여될 수 있거나, 또는 용량은 사례별로 특정한 치료 상황 환경에 의해 지시되는 바와 같이 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 대상체 또는 환자에게 투여 시 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대한 단일 투여량으로서 적합한 물리적 이산 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 상세사항은 활성 화합물의 구체적 특징 및 달성될 특정한 치료 효과(들) 및 임의의 개별 환자의 치료 및 감수성에 좌우된다.
본 발명의 핵산 또는 조성물은 화학적 합성, 예컨대 고체 상 화학적 합성을 포함한 관련 기술분야의 상용 방법을 사용하여 생산될 수 있다.
본 발명의 핵산 또는 조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 의료 장치 중 하나 이상에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 무바늘 피하 주사 장치에 의해 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 널리 공지된 이식물 및 모듈의 예는, 예를 들어 제어 속도 전달을 위한 이식가능한 마이크로-주입 펌프; 피부를 통한 투여를 위한 장치; 정확한 주입 속도로의 전달을 위한 주입 펌프; 연속 약물 전달을 위한 가변 유동 이식가능한 주입 장치; 및 삼투 약물 전달 시스템을 포함하여 관련 기술분야에 있는 것이다. 이들 및 다른 이러한 이식물, 전달 시스템, 및 모듈은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 핵산 또는 조성물은 생체내에서 목적하는 분포를 보장하도록 제제화될 수 있다. 본 발명의 치료 화합물 또는 조성물을 특정한 생체내 위치로 표적화하기 위해, 이들은 예를 들어 특정 세포 또는 기관 내로 선택적으로 수송하여 표적화된 약물 전달을 증진시키는 1개 이상의 모이어티를 포함할 수 있는 리포솜으로 제제화될 수 있다.
본 발명은 분자 및 조직-지정 전달 수준에서 높은 특이성을 특징으로 한다. 본 발명의 핵산의 서열은 그의 표적에 대해 고도로 특이적이며, 이는 이들이 표적화하도록 설계되지 않은 유전자의 발현은 억제하지 않거나 또는 이들이 표적화하도록 설계되지 않은 유전자의 발현을 단지 최소로 억제하고/거나 이들이 표적화하도록 설계되지 않은 적은 수의 유전자의 발현만을 억제한다는 것을 의미한다. 추가의 수준의 특이성은 핵산이 특정한 세포 유형에 의해 특이적으로 인식되고 내재화되는 리간드에 연결될 때 달성된다. 이는 예를 들어 핵산이 간세포에 의해 특이적으로 인식되고 내재화되는 GalNAc 모이어티를 포함하는 리간드에 연결되는 경우이다. 이는 핵산이 연결된 리간드에 의해 표적화되는 세포에서만 그의 표적의 발현을 억제하게 한다. 이들 2가지 수준의 특이성은 현재 이용가능한 치료보다 더 우수한 안전성 프로파일을 잠재적으로 부여한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 따라서 1개 이상의 GalNAc 모이어티를 포함하거나, 또는 핵산의 세포-유형 또는 조직-특이적 내재화를 부여함으로써 RNA 간섭에 의한 표적 유전자 녹다운의 추가의 특이성을 부여하는 1개 이상의 다른 모이어티를 포함하는 리간드에 연결된 본 발명의 핵산을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같은 핵산은 리포솜 형태의 지질과 함께 제제화될 수 있다. 이러한 제제는 관련 기술분야에서 리포플렉스로서 기재될 수 있다. 지질/리포솜을 갖는 조성물은 표적 세포로의 본 발명의 핵산의 전달을 보조하는데 사용될 수 있다. 본원에 기재된 지질 전달 시스템은 접합된 리간드에 대한 대안으로서 사용될 수 있다. 본원에 기재된 변형은 본 발명의 핵산을 지질 전달 시스템 또는 리간드 접합체 전달 시스템과 함께 사용하는 경우에 존재할 수 있다.
이러한 리포플렉스는
i) 양이온성 지질 또는 그의 제약상 허용되는 염;
ii) 스테로이드;
iii) 포스파티딜에탄올아민 인지질; 및/또는
iv) PEG화 지질
을 포함하는 지질 조성물을 포함할 수 있다.
양이온성 지질은 아미노 양이온성 지질일 수 있다.
양이온성 지질은 화학식 (XII):
Figure pct00047
또는 그의 제약상 허용되는 염을 가질 수 있으며, 여기서
X는 O, S 또는 NH를 나타내고;
R1 및 R2는 각각 독립적으로 C4-C22 선형 또는 분지형 알킬 쇄 또는 1개 이상의 이중 결합을 갖는 C4-C22 선형 또는 분지형 알케닐 쇄를 나타내고, 여기서 알킬 또는 알케닐 쇄는 개재 에스테르, 아미드 또는 디술피드를 임의로 함유하고;
X가 S 또는 NH를 나타내는 경우에, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 모노- 또는 폴리아민 모이어티를 나타내거나, 또는 R3 및 R4는 함께 헤테로시클릴 고리를 형성하고;
X가 O를 나타내는 경우에, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 메틸, 에틸, 모노- 또는 폴리아민 모이어티를 나타내거나, 또는 R3 및 R4는 함께 헤테로시클릴 고리를 형성하거나, 또는 R3는 수소를 나타내고 R4는 C(NH)(NH2)를 나타낸다.
양이온성 지질은 화학식 (XIII):
Figure pct00048
또는 그의 제약상 허용되는 염을 가질 수 있다.
양이온성 지질은 화학식 (XIV):
Figure pct00049
또는 그의 제약상 허용되는 염을 가질 수 있다.
양이온성 지질 성분의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 55 mol% 내지 약 65 mol%일 수 있다. 특히, 양이온성 지질 성분은 조성물의 전체 지질 함량의 약 59 mol%이다.
조성물은 스테로이드를 추가로 포함할 수 있다. 스테로이드는 콜레스테롤일 수 있다. 스테로이드의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 26 mol% 내지 약 35 mol%일 수 있다. 보다 특히, 스테로이드의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 30 mol%일 수 있다.
포스파티딜에탄올아민 인지질은 1,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPhyPE), 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DOPE), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE), 1,2-디라우로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLPE), 1,2-디미리스토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DMPE), 1,2-디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DPPE), 1,2-디리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DLoPE), 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (POPE), 1,2-디에루코일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DEPE), 1,2-디스쿠알레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSQPE) 및 1-스테아로일-2-리놀레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (SLPE)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 인지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 10 mol%일 수 있다.
PEG화 지질은 1,2-디미리스토일-sn-글리세롤, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 (DMG-PEG) 및 C16-세라미드-PEG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. PEG화 지질의 함량은 조성물의 전체 지질 함량의 약 1 내지 5 mol%일 수 있다.
조성물 중 양이온성 지질 성분의 함량은 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 55 mol% 내지 약 65 mol%, 바람직하게는 지질 조성물의 전체 지질 함량의 약 59 mol%일 수 있다.
조성물은 55:34:10:1; 56:33:10:1; 57:32:10:1; 58:31:10:1; 59:30:10:1; 60:29:10:1; 61:28:10:1; 62:27:10:1; 63:26:10:1; 64:25:10:1; 및 65:24:10:1로부터 선택된 i):ii):iii):iv)의 성분의 몰비를 가질 수 있다.
조성물은 하기 구조를 갖는 양이온성 지질
Figure pct00050
하기 구조를 갖는 스테로이드
Figure pct00051
하기 구조를 갖는 포스파티딜에탄올아민 인지질
Figure pct00052
및 하기 구조를 갖는 PEG화 지질
Figure pct00053
을 포함할 수 있다.
중성 리포솜 조성물은, 예를 들어 디미리스토일 포스파티딜콜린 (DMPC) 또는 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC)으로부터 형성될 수 있다. 음이온성 리포솜 조성물은 디미리스토일 포스파티딜글리세롤로부터 형성될 수 있는 한편, 음이온성 융합생성 리포솜은 주로 디올레오일 포스파티딜에탄올아민 (DOPE)으로부터 형성될 수 있다. 또 다른 유형의 리포솜 조성물은 포스파티딜콜린 (PC), 예컨대 예를 들어 대두 PC 및 난 PC로부터 형성될 수 있다. 또 다른 유형은 인지질 및/또는 포스파티딜콜린 및/또는 콜레스테롤의 혼합물로부터 형성된다.
양으로 하전된 합성 양이온성 지질인 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)를 사용하여, 핵산과 자발적으로 상호작용하여 조직 배양 세포의 세포막의 음으로 하전된 지질과 융합할 수 있는 지질-핵산 복합체를 형성하는 소형 리포솜을 형성할 수 있다. 또한 DOTMA 유사체를 사용하여 리포솜을 형성할 수 있다.
본원에 기재된 지질의 유도체 및 유사체는 또한 리포솜을 형성하는데 사용될 수 있다.
핵산을 함유하는 리포솜은 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 한 예에서, 리포솜의 지질 성분은 세제에 용해되어 지질 성분에 의해 미셀이 형성된다. 예를 들어, 지질 성분은 양친매성 양이온성 지질 또는 지질 접합체일 수 있다. 세제는 높은 임계 미셀 농도를 가질 수 있고 비이온성일 수 있다. 예시적인 세제는 콜레이트, CHAPS, 옥틸글루코시드, 데옥시콜레이트 및 라우로일 사르코신을 포함한다. 이어서, 핵산 제제를 지질 성분을 포함하는 미셀에 첨가한다. 지질 상의 양이온성 기는 핵산과 상호작용하고, 핵산 주변에서 축합되어 리포솜을 형성한다. 축합 후, 세제를 예를 들어 투석에 의해 제거하여 핵산의 리포솜 제제를 수득한다.
필요한 경우, 축합을 보조하는 담체 화합물을 축합 반응 동안, 예를 들어 제어된 첨가에 의해 첨가할 수 있다. 예를 들어, 담체 화합물은 핵산 이외의 다른 중합체 (예를 들어, 스페르민 또는 스페르미딘)일 수 있다. pH를 또한 축합에 유리하도록 조정할 수 있다.
본 발명의 핵산 제제는 계면활성제를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 핵산은 계면활성제를 포함하는 에멀젼으로서 제제화된다.
이온화되지 않은 계면활성제는 비-이온성 계면활성제이다. 예는 비-이온성 에스테르, 예컨대 에틸렌 글리콜 에스테르, 프로필렌 글리콜 에스테르, 글리세릴 에스테르 등, 비이온성 알칸올아미드, 및 에테르, 예컨대 지방 알콜 에톡실레이트, 프로폭실화 알콜, 및 에톡실화/프로폭실화 블록 중합체를 포함한다.
물에 용해 또는 분산될 때 음전하를 보유하는 계면활성제는 음이온성 계면활성제이다. 예는 카르복실레이트, 예컨대 비누, 아실 락틸레이트, 아미노산의 아실 아미드, 황산의 에스테르, 예컨대 알킬 술페이트 및 에톡실화 알킬 술페이트, 술포네이트, 예컨대 알킬 벤젠 술포네이트, 아실 이세티오네이트, 아실 타우레이트 및 술포숙시네이트, 및 포스페이트를 포함한다.
물에 용해 또는 분산될 때 양전하를 보유하는 계면활성제는 양이온성 계면활성제이다. 예는 4급 암모늄 염 및 에톡실화 아민을 포함한다.
양전하 또는 음전하를 보유하는 능력을 갖는 계면활성제는 양쪽성 계면활성제이다. 예는 아크릴산 유도체, 치환된 알킬아미드, N-알킬베타인 및 포스파티드를 포함한다.
"미셀"은 양친매성 분자가 분자의 모든 소수성 부분이 안쪽으로 향하도록 구형 구조로 배열되어 친수성 부분이 주위 수성 상과 접촉되는, 분자 어셈블리의 특정한 유형으로서 본원에 정의된다. 반대 배열은 환경이 소수성인 경우에 존재한다. 미셀은 핵산의 수용액, 알칼리 금속 알킬 술페이트, 및 적어도 1종의 미셀 형성 화합물을 혼합함으로써 형성될 수 있다.
예시적인 미셀 형성 화합물은 레시틴, 히알루론산, 히알루론산의 제약상 허용되는 염, 글리콜산, 락트산, 카모마일 추출물, 오이 추출물, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 모노올레인, 모노올레에이트, 모노라우레이트, 보리지 오일, 달맞이꽃 오일, 멘톨, 트리히드록시 옥소 콜라닐 글리신 및 그의 제약상 허용되는 염, 글리세롤, 폴리글리세롤, 리신, 폴리리신, 트리올레인, 폴리옥시에틸렌 에테르 및 그의 유사체, 폴리도칸올 알킬 에테르 및 그의 유사체, 케노데옥시콜레이트, 데옥시콜레이트, 및 그의 혼합물을 포함한다.
페놀 및/또는 m-크레졸이 혼합된 미셀 조성물에 첨가되어 안정화제 및 보존제로서 작용할 수 있다. 등장화제, 예컨대 글리세린이 첨가될 수 있다.
핵산 제제는 입자, 예컨대 마이크로입자 내로 혼입될 수 있다. 마이크로입자는 분무-건조, 동결건조, 증발, 유동층 건조, 진공 건조, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성될 수 있다.
정의
유전자 발현과 관련하여 본원에 사용된 용어 "억제하다", "하향-조절하다", 또는 "감소시키다"는 유전자의 발현, 또는 1개 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛을 코딩하는 RNA 분자 또는 등가의 RNA 분자 (예를 들어, mRNA)의 수준, 또는 1개 이상의 단백질 또는 단백질 서브유닛의 활성이 본 발명의 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에 또는 인간 전사체에 대해 공지된 상동성을 갖지 않는 siRNA 분자 (본원에서 비-침묵 대조군으로 불림)를 사용하여 수득된 것과 비교하여 관찰된 것 미만으로 감소된다는 것을 의미한다. 이러한 대조군은 본 발명의 분자와 유사한 방식으로 접합 및 변형될 수 있고, 동일한 경로에 의해 표적 세포 내로 전달될 수 있다. 본 발명의 핵산으로 처리한 후의 발현은 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5% 또는 0%로 또는 중간 값으로, 또는 핵산 또는 접합된 핵산의 부재 하에 관찰된 것 미만으로 감소될 수 있다. 발현은 핵산이 적용되는 세포에서 측정될 수 있다. 대안적으로, 특히 핵산이 대상체에게 투여되는 경우에, 수준은 상이한 세포 군에서 또는 조직 또는 기관에서 또는 체액 예컨대 혈액 또는 혈장에서 측정될 수 있다. 억제 수준은 바람직하게는 선택된 조건에서 측정되는데, 이는 이들이 시험관내에서 핵산으로 처리된 세포에서 표적 mRNA 수준에 대한 핵산의 가장 큰 효과를 나타내기 때문이다. 억제 수준은 예를 들어 0.038 nM - 10 μM, 바람직하게는 1 nM, 10 nM 또는 100 nM의 농도의 핵산으로 24시간 또는 48시간 처리한 후에 측정될 수 있다. 이들 조건은 상이한 핵산 서열에 대해 또는 상이한 유형의 핵산에 대해, 예컨대 비변형되거나 변형되거나 리간드에 접합되거나 접합되지 않은 핵산에 대해 상이할 수 있다. 억제 수준을 결정하기 위한 적합한 조건의 예는 실시예에 기재되어 있다.
핵산은 유전자 발현을 방해할 수 있는, 뉴클레오티드를 포함하는 2개의 가닥을 포함하는 핵산을 의미한다. 억제는 완전 또는 부분적일 수 있고, 표적화된 방식으로 유전자 발현의 하향 조절을 발생시킨다. 핵산은 2개의 별개의 폴리뉴클레오티드 가닥; 가이드 가닥일 수도 있는 제1 가닥; 및 패신저 가닥일 수도 있는 제2 가닥을 포함한다. 제1 가닥 및 제2 가닥은 다시 '폴딩'되어 이중-가닥 분자를 형성하는 자기-상보적인 동일한 폴리뉴클레오티드 분자의 일부일 수 있다. 핵산은 siRNA 분자일 수 있다.
핵산은 리보뉴클레오티드, 변형된 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 표적 서열 또는 상보적 가닥 상의 상응하는 염기와 '쌍형성'할 수 있도록 뉴클레오티드를 모방할 수 있는 뉴클레오티드 유사체 비-뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 핵산은 제1 가닥의 전부 또는 일부 (관련 기술분야에서 가이드 가닥으로도 공지됨) 및 제2 가닥의 전부 또는 일부 (관련 기술분야에서 패신저 가닥으로도 공지됨)에 의해 형성된 이중-가닥 핵산 부분 또는 듀플렉스 영역을 추가로 포함할 수 있다. 듀플렉스 영역은 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 제1 염기 쌍으로 시작하여 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 형성된 마지막 염기 쌍으로 끝나는 것으로 정의된다.
듀플렉스 영역은 왓슨-크릭 염기 쌍형성 또는 상보적 또는 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 가닥 사이의 듀플렉스를 허용하는 임의의 다른 방식에 의해 서로 염기 쌍을 형성하는 2개의 상보적 또는 실질적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 내의 영역을 의미한다. 예를 들어, 21개의 뉴클레오티드 단위를 갖는 올리고뉴클레오티드 가닥은 21개의 뉴클레오티드 단위의 또 다른 올리고뉴클레오티드와 염기 쌍형성할 수 있지만, 각각의 가닥 상의 단지 19개의 뉴클레오티드만이 상보성이거나 실질적으로 상보성이어서, "듀플렉스 영역"은 19개의 염기 쌍으로 이루어진다. 나머지 염기 쌍은 5' 및 3' 오버행으로서, 또는 단일-가닥 영역으로서 존재할 수 있다. 추가로, 듀플렉스 영역 내에서, 100% 상보성이 요구되지 않고; 실질적인 상보성이 듀플렉스 영역 내에서 허용될 수 있다. 실질적인 상보성은 생물학적 조건 하에 어닐링할 수 있는 가닥 사이의 상보성을 지칭한다. 2개의 가닥이 생물학적 조건 하에 어닐링할 수 있는지 실험적으로 결정하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 대안적으로, 2개의 가닥을 합성하고, 이들이 서로 어닐링하는지 결정하기 위해 생물학적 조건 하에 함께 첨가할 수 있다. 적어도 1개의 듀플렉스 영역을 형성하는 제1 가닥 및 제2 가닥의 부분은 완전히 상보적일 수 있고, 서로 적어도 부분적으로 상보적이다. 핵산의 길이에 따라, 제1 가닥과 제2 가닥 사이에 염기 상보성의 관점에서 완벽한 매치가 반드시 요구되는 것은 아니다. 그러나, 제1 및 제2 가닥은 생리학적 조건 하에 혼성화할 수 있어야 한다.
본원에 사용된 용어 "비-쌍형성 뉴클레오티드 유사체"는 6 데스 아미노 아데노신 (네뷸라린), 4-Me-인돌, 3-니트로피롤, 5-니트로인돌, Ds, Pa, N3-Me 리보 U, N3-Me 리보T, N3-Me dC, N3-Me-dT, N1-Me-dG, N1-Me-dA, N3-에틸-dC, 및 N3-Me dC를 포함하나 이에 제한되지는 않는 비-염기 쌍형성 모이어티를 포함하는 뉴클레오티드 유사체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 비-염기 쌍형성 뉴클레오티드 유사체는 리보뉴클레오티드이다. 다른 실시양태에서, 이는 데옥시리보뉴클레오티드이다.
본원에 사용된 용어 "말단 관능기"는 비제한적으로 할로겐, 알콜, 아민, 카르복실, 에스테르, 아미드, 알데히드, 케톤, 및 에테르 기를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "오버행"은 관련 기술분야에서의 그의 통상적이고 관례적인 의미를 가지며, 즉 이중-가닥 핵산에서 상보적 가닥의 말단 뉴클레오티드를 넘어 연장된 핵산의 단일-가닥 부분이다. 용어 "평활 단부"는 말단 뉴클레오티드(들)가 염기-쌍형성되는지와 무관하게 둘 다의 가닥이 동일한 위치에서 종결되는 이중-가닥 핵산을 포함한다. 평활 단부에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오티드는 염기 쌍형성할 수 있다. 평활 단부에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 뉴클레오티드는 쌍형성하지 않을 수 있다. 평활 단부에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 2개의 뉴클레오티드는 염기-쌍형성할 수 있다. 평활 단부에서 제1 가닥 및 제2 가닥의 말단 2개의 뉴클레오티드는 쌍형성하지 않을 수 있다.
용어 "세리놀-유래 링커 모이어티"는 링커 모이어티가 하기 구조를 포함하는 것을 의미한다:
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상기 구조의 O 원자는 전형적으로 RNA 가닥에 연결되고, N 원자는 전형적으로 표적화 리간드에 연결된다.
용어 "환자", "대상체", 및 "개체"는 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다. 이들 용어는 포유동물, 예컨대 인간, 영장류, 가축 동물 (예를 들어, 소, 돼지), 반려 동물 (예를 들어, 개, 고양이) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함한다.
본원에 사용된 "치료하는" 또는 "치료" 및 그의 문법적 변형은 유익한 또는 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법을 지칭한다. 용어는 상태, 장애 또는 질환의 발병 또는 발생 속도를 늦추거나, 그와 연관된 증상을 감소 또는 완화시키거나, 상태의 완전한 또는 부분 퇴행을 생성하거나, 또는 상기 중 임의의 것의 일부 조합을 지칭할 수 있다. 본 발명의 목적상, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는, 검출가능하든 또는 검출불가능하든, 증상의 감소 또는 완화, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 둔화, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 (부분적이든 전체적이든)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는 경우에 예상되는 생존 시간에 비해 생존을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. 따라서, 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)는 이미 해당 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상체일 수 있다. 용어 "치료"는 치료의 부재에 비해 병리학적 상태 또는 증상의 중증도의 증가의 억제 또는 감소를 포함하고, 반드시 관련 질환, 장애 또는 상태의 완전한 중지를 암시하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "예방하는" 및 그의 문법적 변형은 상태, 질환 또는 장애의 발생을 예방하거나 또는 그의 병리상태를 변경시키기 위한 접근법을 지칭한다. 따라서, "예방"은 방지적 또는 예방적 조치를 지칭할 수 있다. 본 발명의 목적상, 유익한 또는 목적하는 임상 결과는, 검출가능하든 또는 검출불가능하든, 질환의 증상, 진행 또는 발생의 예방 또는 둔화를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 예방을 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)는 아직 해당 질환 또는 장애를 앓지 않는 대상체일 수 있다. 용어 "예방"은 치료의 부재에 비해 질환의 발병을 늦추는 것을 포함하고, 반드시 관련 질환, 장애 또는 상태의 영구적 예방을 암시하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 상태의 "예방하는" 또는 "예방"은 특정 문맥에서 상태가 발생할 위험을 감소시키거나, 또는 상태와 연관된 증상의 발생을 예방 또는 지연시키는 것을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 "유효량", "치료 유효량" 또는 "유효 용량"은 대상체에서 적어도 1종의 목적하는 치료 효과, 예컨대 표적 상태를 예방 또는 치료하거나 또는 상태와 연관된 증상을 유익하게 완화시키는 것을 발생시키는 조성물 (예를 들어, 치료 조성물 또는 작용제)의 양이다.
본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는 염"은 해당 염이 투여되는 환자 또는 대상체에게 유해하지 않은 염을 지칭한다. 이는, 예를 들어 산 부가염 및 염기성 염 중에서 선택된 염일 수 있다. 산 부가염의 예는 클로라이드 염, 시트레이트 염 및 아세테이트 염을 포함한다. 염기성 염의 예는 양이온이 알칼리 금속 양이온, 예컨대 나트륨 또는 칼륨 이온, 알칼리 토금속 양이온, 예컨대 칼슘 또는 마그네슘 이온, 뿐만 아니라 치환된 암모늄 이온, 예컨대 유형 N(R1)(R2)(R3)(R4)+의 이온으로부터 선택된 염을 포함하며, 여기서 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 전형적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬 기 또는 임의로 치환된 C2-6-알케닐 기를 나타낼 것이다. 관련 C1-6-알킬 기의 예는 메틸, 에틸, 1-프로필 및 2-프로필 기를 포함한다. 가능한 관련 C2-6-알케닐 기의 예는 에테닐, 1-프로페닐 및 2-프로페닐을 포함한다. 제약상 허용되는 염의 다른 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences", 17th edition, Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985 (and more recent editions thereof), in the "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", 3rd edition, James Swarbrick (Ed.), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007, 및 J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)]에 기재되어 있다. "제약상 허용되는 염"은 화합물에 비해 임의의 바람직하지 않은 효과를 부여하지 않으면서 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 정성적으로 보유한다. 제약상 허용되는 염의 예는 산 부가염 및 염기 부가염을 포함한다. 산 부가염은 비독성 무기 산, 예컨대 염산, 질산, 인, 인산, 황산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산 등으로부터, 또는 비독성 유기 산, 예컨대 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 염을 포함한다. 염기 부가염은 알칼리 토금속, 예컨대 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등, 뿐만 아니라 비독성 유기 아민, 예컨대 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 프로카인 등으로부터 유래된 염을 포함한다.
용어 "제약상 허용되는 담체"는 표준 제약 담체 중 임의의 것을 포함한다. 치료 용도를 위한 제약상 허용되는 담체는 제약 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 약산성 또는 생리학적 pH의 멸균 염수 및 포스페이트-완충 염수가 사용될 수 있다. 예시적인 pH 완충제는 포스페이트, 시트레이트, 아세테이트, 트리스/히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS), N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산 (TAPS), 중탄산암모늄, 디에탄올아민, 바람직한 완충제인 히스티딘, 아르기닌, 리신, 또는 아세테이트 또는 그의 혼합물을 포함한다. 상기 용어는 인간을 비롯한 동물에서 사용하기 위한 미국 약전에 열거된 임의의 작용제를 추가로 포괄한다. "제약상 허용되는 담체"는 임의의 및 모든 생리학상 허용되는, 즉 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅, 항미생물제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합하다. 선택된 투여 경로에 따라, 핵산은 특정한 투여 경로에 의해 대상체에게 투여될 때 핵산이 노출될 수 있는 산 및 다른 천연 불활성화 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하도록 의도된 물질 또는 물질들로 코팅될 수 있다.
본 발명의 문맥에서 용어 "용매화물"은 용질 (본 경우에, 본 발명에 따른 핵산 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염)과 용매 사이에 형성된 정의된 화학량론의 복합체를 지칭한다. 이와 관련하여 용매는, 예를 들어 물 또는 또 다른 제약상 허용되는, 전형적으로 소분자 유기 종, 예컨대 비제한적으로 아세트산 또는 락트산일 수 있다. 해당 용매가 물인 경우에, 이러한 용매화물은 통상적으로 수화물로 지칭된다.
본 발명은 이제 하기 비제한적 도면 및 실시예를 참조하여 기재될 것이다.
도 1a, 1b 및 1c는 선택된 siRNA의 농도-반응-곡선을 보여준다.
도 2a 및 2b는 인간 1차 간세포에서의 선택된 siRNA GalNAc 접합체의 농도-반응-곡선을 보여준다.
도 3a 및 3b는 마우스 1차 간세포에서의 선택된 siRNA GalNAc 접합체의 농도-반응-곡선을 보여준다.
도 4a, 4b 및 4c는 1차 마우스, 인간 및 시노몰구스 간세포에서의 선택된 siRNA GalNAc 접합체 각각의 농도-의존적 C3 mRNA 억제를 보여준다.
도 5는 DMT-세리놀(GalNAc)-CEP 및 CPG로의 가능한 합성 경로를 보여준다.
도 6a 및 6b는 선택된 siRNA GalNAc 접합체로의 마우스의 sc 처리에 반응한 간세포에서의 생체내 C3 mRNA 수준 뿐만 아니라 혈청에서의 C3 단백질 수준을 보여준다.
도 7a, 7b 및 7c는 액틴 mRNA에 대해 정규화된, 선택된 siRNA GalNac 접합체 (1nM, 10nM 및 100nM)와의 인큐베이션 후의 1차 마우스 (a), 시노몰구스 (b) 및 인간 (c) 간세포에서의 상대 C3 mRNA 발현을 보여준다.
도 8a 및 8b는 GalNAc 접합된 siRNA EV0201, EV0203, EV0204, EV0205 및 EV0207의 단일 투여 후 14일 (a) 또는 42일 (b)째의 뮤린 간에서의 % 단위의 상대 C3 mRNA 발현을 보여준다. 데이터는 막대 차트로 평균 ± SD (군당 n=4)로서 제시된다.
도 9a-e는 5 또는 10 mg/kg siRNA의 투여 전 (BL), 투여 후 연구의 제4일, 제10일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일 및 제42일에 채취한 마우스 혈청 샘플로부터의 % 단위의 상대 C3 단백질 혈청 수준을 보여준다. 데이터 포인트는 표준 C3 ELISA를 사용하여 결정된 개별 동물의 혈청 C3 수준을 도시한다. 데이터를 각각의 군의 기준선 평균에 대해, 이어서 100%로 설정된 시간 매칭 PBS 대조군에 대해 정규화하였다. 플롯팅된 선은 각각의 시점에서 개별 군 평균을 연결한다.
a) 5 및 10 mg/kg EV0201의 투여 후 정규화된 C3 혈청 수준
b) 5 및 10 mg/kg EV0203의 투여 후 정규화된 C3 혈청 수준
c) 5 mg/kg EV0204의 투여 후 정규화된 C3 혈청 수준
d) 5 및 10 mg/kg EV0205의 투여 후 정규화된 C3 혈청 수준
e) 5 및 10 mg/kg EV0207의 투여 후 정규화된 C3 혈청 수준.
도 10은 시험관내 다양한 siRNA에 의한 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 11은 시험관내 다양한 siRNA에 의한 인간 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 12는 시험관내 다양한 siRNA에 의한 마우스 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 13은 마우스 간세포에서의 다양한 siRNA 접합체에 의한 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 14는 시노몰구스 간세포에서의 다양한 siRNA 접합체에 의한 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 15는 마우스 간세포에서의 siRNA 접합체 변이체에 의한 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 16은 시노몰구스 간세포에서의 siRNA 접합체 변이체에 의한 C3 mRNA 녹다운 효율을 보여준다.
도 17은 GalNAc 접합된 C3 siRNA EJ0020의 단일 투여 43일 후의 뮤린 간에서의 % 단위의 상대 C3 mRNA 발현을 보여준다.
도 18은 1 또는 3 mg/kg GalNAc 접합된 C3 siRNA EJ0020의 투여 전, 투여 후 연구의 제7일, 제14일, 제28일 및 제43일에 채취한 마우스 혈청 샘플로부터의 % 단위의 상대 C3 단백질 혈청 수준을 보여준다.
도 19는 1, 10 및 100nM의 GalNAc siRNA 접합체 EV0210, EV0211, EV0212 및 EV0213과의 인큐베이션 후 1차 인간 간세포에서의 C3 mRNA의 발현을 보여준다.
도 20은 처리 10일 후에 야생형 및 C3G 질환 모델 마우스에서의 C3 세관 침착에 대한 상이한 용량의 접합된 C3 siRNA를 사용한 처리의 효과를 보여준다.
도 21은 처리 10일 후에 야생형 및 C3G 질환 모델 마우스에서의 보체 인자 B 단편화에 대한 상이한 용량의 접합된 C3 siRNA를 사용한 처리의 효과를 보여준다.
도 22a 및 22b는 C3G 질환 모델 마우스에서의 C3α-쇄 및 C3α-쇄 단편의 수준에 대한 다중 용량의 접합된 C3 siRNA를 사용한 처리의 효과를 보여준다.
도 23은 C3G 질환 모델 마우스에서의 보체 인자 B 단편화에 대한 다중 용량의 접합된 C3 siRNA를 사용한 처리의 효과를 보여준다.
실시예
실시예 1
10 nM siRNA의 형질감염 후 시험된 siRNA의 C3 mRNA 녹다운 효능을 보여주는 HepG2 세포에서의 시험관내 연구.
siRNA EV0001-EV0100의 C3 녹다운 효능을 HepG2 세포에서 10 nM siRNA의 형질감염 후에 결정하였다. 결과를 하기 표 2에 제시한다. 녹다운 후 잔류 C3 mRNA 수준은 6 내지 83% 범위였다. 가장 강력한 siRNA는 EV0001, EV0007, EV0008, EV0009, EV0012, EV0013, EV0018, EV0020, EV0030, EV0033, 및 EV0004였다.
HepG2 세포를 siRNA로 형질감염시키기 위해, 세포를 콜라겐-코팅된 96-웰 조직 배양 플레이트 (#655150, GBO, 독일)에 15,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. siRNA의 형질감염은 시딩 직후에 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMax (인비트로젠(Invitrogen)/라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 독일 카를스루에)를 사용하여 수행하였다. 스크리닝은 C3 siRNA를 10 nM에서 사중으로 사용하여, 비특이적 대조군으로서 Aha1, 반딧불이-루시페라제 및 인자 VII를 표적화하는 siRNA 및 모의 형질감염을 사용하여 수행하였다. siRNA와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 150 μl 배지-용해 혼합물 (1 부피 용해 혼합물, 2 부피 세포 배양 배지) 중에 용해시킨 다음, 53℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. bDNA 검정을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. RT에서 암실에서 30분 인큐베이션한 후, 1420 발광 카운터 (왈락 빅토르 라이트(WALLAC VICTOR Light), 퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 독일 로트가우-위게스하임)를 사용하여 발광을 판독하였다. 각각의 웰에 대해, C3 mRNA 수준을 각각의 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 주어진 C3 siRNA의 활성을 대조군 웰에 걸쳐 평균한 C3 mRNA 농도 (GAPDH mRNA에 대해 정규화됨) 대비 처리된 세포에서의 퍼센트 잔류 C3 mRNA 농도 (GAPDH mRNA에 대해 정규화됨)로서 표현하였다.
표 2
Figure pct00055
Figure pct00056
표 2: C3 siRNA의 스크리닝 결과 - 각각의 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 아이덴티티, 뿐만 아니라 그의 서열 및 변형은 표의 설명의 말미에서 확인된다.
실시예 2
0.01 pM - 100 nM siRNA의 형질감염 후 시험된 siRNA의 C3 mRNA 녹다운 효능을 보여주는 HepG2 세포에서의 시험관내 연구 (농도-반응-곡선 실험).
siRNA EV0001, EV0008, EV0013, EV0030, EV0033, EV0039, EV0043, EV0053, EV0054, EV0059, EV0060, EV0061, EV0066, EV0072, EV0075, EV0081, EV0091 및 EV0098의 C3 녹다운 효능을 HepG2 세포에서 0.01 pM - 100 nM siRNA의 형질감염 후에 결정하였다. 각각의 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 아이덴티티 뿐만 아니라 그의 서열은 표의 설명의 말미에서 확인된다. 결과를 도 1a, 1b 및 1c에 제시한다. 모든 siRNA는 형질감염 후 C3 mRNA의 용량-의존성 녹다운을 보여주었다. 가장 강력한 siRNA는 EV0008, EV0033 및 EV0081이었고, 100 nM siRNA에서 잔류 C3 발현이 각각 4.3, 5.3 및 5.3%였다.
HepG2 세포를 siRNA로 형질감염시키기 위해, 세포를 콜라겐-코팅된 96-웰 조직 배양 플레이트 (#655150, GBO, 독일)에 15,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. siRNA의 형질감염은 시딩 직후에 제조업체의 지침에 따라 리포펙타민 RNAiMax (인비트로젠/라이프 테크놀로지스, 독일 카를스루에)를 사용하여 수행하였다. C3 siRNA를 사용하여 100 nM에서 시작하여 6-배 희석 단계로 0.01 pM까지, 사중으로 형질감염되는 10개의 농도로 농도-반응 실험을 수행하였다. 모의 형질감염된 세포는 CRC 실험에서 대조군으로서의 역할을 하였다. siRNA와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 150μl 배지-용해 혼합물 (1 부피 용해 혼합물, 2 부피 세포 배양 배지) 중에 용해시킨 다음, 53℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. bDNA 검정을 제조업체의 지침에 따라 수행하였다. RT에서 암실에서 30분 인큐베이션한 후, 1420 발광 카운터 (왈락 빅토르 라이트, 퍼킨 엘머, 독일 로트가우-위게스하임)를 사용하여 발광을 판독하였다. 각각의 웰에 대해, C3 mRNA 수준을 각각의 GAPDH mRNA 수준에 대해 정규화하였다. 주어진 C3 siRNA의 활성을 대조군 웰에 걸쳐 평균한 C3 mRNA 농도 (GAPDH mRNA에 대해 정규화됨) 대비 처리된 세포에서의 퍼센트 잔류 C3 mRNA (GAPDH mRNA에 대해 정규화됨)로서 표현하였다. 농도-반응-곡선을 추가의 제약 없이 4-파라미터 로지스틱 (4PL) 모델을 사용하여 그래프패드 프리즘 버전 7.05로 피팅하였다.
실시예 3
시험된 siRNA-GalNAc 접합체의 C3 mRNA 녹다운 효능을 농도-반응-곡선 포맷으로 보여주는 1차 인간 간세포에서의 시험관내 연구 (0.038 nM - 10 μM siRNA 접합체).
GalNAc siRNA 접합체 EV0101, EV0102, EV0103, EV0104, EV0105, EV0106, EV0107, EV0108, EV0109, EV0110, EV0111 및 EV0312와의 인큐베이션 후의 C3 mRNA의 발현을 농도-반응 포맷으로 분석하였다. 각각의 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 아이덴티티 뿐만 아니라 그의 서열은 표의 설명의 말미에서 확인된다. 결과를 도 2a 및 2b에 제시한다. 하우스키핑 유전자 GAPDH의 mRNA 수준은 모든 실험에 대해 대조군으로서의 역할을 하였다. 모든 siRNA GalNAc 접합체는 C3 mRNA 수준을 10 μM에서 각각 32 내지 70%의 최대 억제로, 농도-의존성 방식으로 감소시킬 수 있었다. 가장 강력한 siRNA는 10 μM에서 C3 mRNA 수준의 61% 감소를 갖는 EV0102, 67% 감소를 갖는 EV0109, 69% 감소를 갖는 EV0111 및 70% 감소를 갖는 EV0312였다.
인간 동결보존된 1차 간세포는 프리마사이트(Primacyt) (독일 슈베린, cat#GuCPI, Lot# BHum16061-P)로부터 구입하였다. 처리 직전에, 세포를 해동시키고, 해동 배지 (프리마사이트, cat#HTM)가 담긴 튜브로 옮기고, 원심분리하고, 세척 배지 (프리마사이트, cat#HWM)로 세척하였다. 세포를 콜라겐 코팅된 96-웰 플레이트 (그라이너-바이오-원(Greiner-Bio-One), #655150) 상의 플레이팅 배지 (프리마사이트, cat#MPM-cryo) 중에 웰당 90,000개의 세포 밀도로 시딩하였다. 시딩 직후에, 세포가 플레이팅 배지에서 단층으로서 부착됨에 따라 이를 siRNA로 처리하였다. 각각의 siRNA를 농도-반응-곡선으로 10 μM로 시작하여 순차적으로 4-배 희석 단계로 38 pM까지 희석시킨 농도로 세포에 적용하였다. 각각의 농도를 사중으로 적용하였다. 5시간 후, 배지를 유지 배지 (프리마사이트 cat#HHMM)로 교체하였다. 배지를 24시간마다 교체하고, 시딩 48시간 후에 퀀티진 bDNA 검정에 의한 분석을 위해 세포를 수거하였다. C3 mRNA 농도를 GAPDH mRNA에 대해 정규화하였다. 농도-반응-곡선을 추가의 제약 없이 4-파라미터 로지스틱 (4PL) 모델을 사용하여 그래프패드 프리즘 버전 7.05로 피팅하였다.
실시예 4
시험된 siRNA-GalNAc 접합체의 C3 mRNA 녹다운 효능을 농도-반응-곡선 포맷으로 보여주는 1차 마우스 간세포에서의 시험관내 연구 (0.038 nM - 10 μM siRNA 접합체).
GalNAc siRNA 접합체 EV0104, EV0105, EV0107, EV0108, EV0109, EV0110, EV0111 및 EV0312와의 인큐베이션 후의 C3 mRNA의 발현을 농도-반응 포맷으로 분석하였다. 각각의 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 아이덴티티 뿐만 아니라 그의 서열은 표의 설명의 말미에서 확인된다. 하우스키핑 유전자 GAPDH의 mRNA 수준은 대조군으로서의 역할을 하였다. siRNA GalNAc 접합체는 C3 mRNA 수준을 10 μM에서 56 내지 72%의 최대 억제로, 농도 의존성 방식으로 감소시킬 수 있었다. 가장 강력한 siRNA는 10 μM에서 C3 mRNA의 각각 68% 감소를 갖는 EV0104, 67% 감소를 갖는 EV0109 및 72% 감소를 갖는 EV0111이었다.
동결보존된 뮤린 간세포는 써모 피셔(Thermo Fisher) (#MSCP10, Lot#MC817)로부터 구입하였고, 플레이팅 배지에 플레이팅하였다 (써모 피셔 Sci, Cat. No. CM3000 보충 팩이 윌리엄 이 배지(William's E Medium)에 첨가된 것, 페놀 레드 부재 - 총 500 ml까지, 써모 피셔 Sci, Cat. No. A12176-01). 시딩 당일에, 세포를 해동시키고, 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 (그라이너-바이오-원, #655150)에 웰당 60,000개의 세포 밀도로 플레이팅하였다. 시딩 직후에, 세포가 플레이팅 배지에서 단층으로서 부착됨에 따라 이를 siRNA로 처리하였다. 각각의 siRNA를 농도-반응-곡선으로 10 μM로 시작하여 순차적으로 4-배 희석 단계로 0.038 nM까지 희석시킨 농도로 세포에 적용하였다. 각각의 농도를 사중으로 적용하였다. 5시간 후, 배지를 유지 배지로 교체하였다 (써모 피셔 Sci, Cat. No. CM4000 보충 팩이 윌리엄 이 배지에 첨가된 것, 페놀 레드 부재 - 총 500 ml까지, 써모 피셔 Sci, Cat. No. A12176-01). 배지를 24시간마다 교체하고, 시딩 48시간 후에 퀀티진 bDNA 검정에 의한 분석을 위해 세포를 수거하였다.
결과를 도 3a 및 3b에 제시한다. 이는 GAPDH mRNA에 대해 정규화된 siRNA GalNAc 접합체 (0.038 nM - 10 μM)와의 인큐베이션 후 1차 마우스 간세포에서의 % 잔류 C3 mRNA 발현을 도시한다. 농도-반응 곡선을 추가의 제약 없이 4-파라미터 로지스틱 (4PL) 모델을 사용하여 그래프패드 프리즘 버전 7.05로 피팅하였다.
실시예 5
시험된 siRNA-GalNAc 접합체의 1, 10 및 100nM에서의 C3 mRNA 녹다운 효능을 보여주는 1차 마우스, 인간 및 시노몰구스 간세포에서의 시험관내 연구.
GalNAc siRNA 접합체 EV0312 및 EV0313과의 1, 10 및 100nM에서의 인큐베이션 후 C3 mRNA의 발현을 분석하였다. 각각의 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 아이덴티티 뿐만 아니라 그의 서열은 표의 설명의 말미에서 확인된다. 하우스키핑 유전자 액틴의 mRNA 수준은 대조군으로서의 역할을 하였다.
40,000개 (인간), 30,000개 (마우스) 또는 45,000개 (시노몰구스) 세포를 콜라겐-코팅된 96-웰 플레이트 상에 시딩하였다. 표시된 농도의 siRNA를 시딩 직후에 첨가하였다. 처리 24시간 후, 인비트랩(InviTrap) RNA 세포 HTS96 키트/C (스트라텍(Stratec))를 사용하여 세포를 용해시켰다. C3 및 액틴에 대한 mRNA-특이적 프라이머 및 프로브를 사용하여 qPCR을 수행하였다.
결과를 도 4a, 4b 및 4c에 제시한다.
실시예 6 - 빌딩 블록의 합성
하기 기재된 바와 같은 DMT-세리놀(GalNAc)-CEP 및 CPG에 대한 합성 경로를 도 5에 요약한다. 출발 물질 DMT-세리놀(H) (1)은 상업적으로 입수가능한 L-세린으로부터 문헌 공개된 방법 (Hoevelmann et al., Chem. Sci., 2016,7, 128-135)에 따라 제조하였다. GalNAc(Ac3)-C4H8-COOH (2)는 상업적으로 입수가능한 퍼-아세틸화 갈락토스 아민으로부터 시작하여 문헌 공개된 방법 (Nair et al., J. Am. Chem. Soc., 2014, 136 (49), pp 16958-1696)에 따라 제조하였다. 포스피틸화 시약 2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르-아미다이트 (4)는 상업적으로 입수가능하다. (vp)-mU-phos의 합성은 문헌 [Prakash, Nucleic Acids Res. 2015, 43(6), 2993-3011 및 Haraszti, Nucleic Acids Res. 2017, 45(13), 7581-7592]에 기재된 바와 같이 수행하였다. ST43 (ST43-phos) 뿐만 아니라 ST23 (ST23-phos)의 포스포르아미다이트 유도체의 합성은 WO2017/174657에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다.
DMT-세리놀(GalNAc) (3)
HBTU (9.16 g, 24.14 mmol)를 GalNAc(Ac3)-C4H8-COOH (2) (11.4 g, 25.4 mmol) 및 DIPEA (8.85 ml, 50.8 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 2분의 활성화 시간 후, 아세토니트릴 (무수) (200 ml) 중 DMT-세리놀(H) (1) (10 g, 25.4 mmol)의 용액을 교반 혼합물에 첨가하였다. 1시간 후, LCMS는 우수한 전환율을 나타내었다. 반응 혼합물을 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 EtOAc 중에 용해시키고, 후속적으로 물 (2x) 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 추가로 칼럼 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 3% MeOH + 1% Et3N, 700g 실리카)에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, 농축시키고, CH2Cl2 (2x)로 스트리핑하여, DMT-세리놀(GalNAc) (3) 10.6g (51%)을 회백색 발포체로서 수득하였다.
DMT-세리놀(GalNAc)-CEP (5)
2-시아노에틸-N,N-디이소프로필클로로포스포르아미다이트 (4) (5.71 ml, 25.6 mmol)를 아르곤 분위기 하에 0℃에서 디클로로메탄 (건조) (150 ml) 중 DMT-세리놀(GalNAc) (3) (15.0 g, 17.0 mmol), DIPEA (14.9 ml, 85 mmol) 및 4Å 분자체의 교반 혼합물에 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하였다. TLC는 완전한 전환을 나타내었다. 반응 혼합물을 여과하고, 진공 하에 농축시켜 농후한 오일을 수득하였다. 잔류물을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 플래쉬 크로마토그래피 (톨루엔 중 0-50% 아세톤 1%Et3N, 220 g 실리카)에 의해 추가로 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, 진공 하에 농축시켰다. 생성된 오일을 MeCN (2x)으로 스트리핑하여 무색 DMT-세리놀(GalNAc)-CEP (5) 발포체 13.5g (77%)을 수득하였다.
DMT-세리놀(GalNAc)-숙시네이트 (6)
DMAP (1.11 g, 9.11 mmol)를 아르곤 분위기 하에 디클로로메탄 (50 ml) 및 피리딘 (50 ml)의 혼합물 중 DMT-세리놀(GalNAc) (3) (7.5 g, 9.11 mmol) 및 숙신산 무수물 (4.56 g, 45.6 mmol)의 교반 용액에 첨가하였다. 16시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 진공 하에 농축시키고, 잔류물을 EtOAc에 녹이고, 5% 시트르산 (aq)으로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기층을 후속적으로 포화 NaHCO3 (aq.) 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 추가의 정제를 플래쉬 크로마토그래피 (CH2Cl2 중 0-5% MeOH +1% Et3N, 120g 실리카)에 의해 달성하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, 진공 하에 농축시켰다. 잔류물을 MeCN (3x)으로 스트리핑하여 5.9g (70%) DMT-세리놀(GalNAc)-숙시네이트 (6)를 수득하였다.
DMT-세리놀(GalNAc)-숙시닐-lcaa-CPG (7)
DMT-세리놀(GalNAc)-숙시네이트 (6) (1 당량) 및 HBTU (1.1 당량)를 CH3CN (10 ml) 중에 용해시켰다. 디이소프로필에틸아민 (2 당량)을 용액에 첨가하고, 혼합물을 2분 동안 와류시킨 후, 천연 아미노-lcaa-CPG (500 A, 88μmol/g, 1 당량)를 첨가하였다. 현탁액을 실온에서 리스트-액션 진탕기 상에서 16시간 동안 부드럽게 진탕시킨 다음, 여과하고, 아세토니트릴로 세척하였다. 고체 지지체를 감압 하에 2시간 동안 건조시켰다. 지지체 상의 미반응 아민을 실온에서 Ac2O/2,6-루티딘/NMI와 함께 교반함으로써 캡핑하였다 (2x15분). 지지체의 세척을 상기와 같이 반복하였다. 고체를 진공 하에 건조시켜 DMT-세리놀(GalNAc)-숙시닐-lcaa-CPG (7)를 수득하였다 (로딩: 34 μmol/g, 탈트리틸화 검정에 의해 결정됨).
실시예 7 - 올리고뉴클레오티드 합성
실시예 화합물을 하기 기재되고 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라 합성하였다. 올리고뉴클레오티드 쇄 및 링커 빌딩 블록의 어셈블리를 포스포르아미다이트 방법론을 적용하는 고체 상 합성에 의해 수행하였다.
하류 절단, 탈보호 및 정제는 관련 기술분야에 공지된 표준 절차에 따랐다.
상업적으로 입수가능한 2'O-메틸 RNA 및 2'플루오로-2'데옥시 RNA 염기 로딩된 CPG 고체 지지체를 사용하여 AKTA 올리고파일롯 10 상에서 올리고뉴클레오티드 합성을 수행하였고, 포스포르아미다이트 (모두 표준 보호, 켐진스(ChemGenes), 링크테크(LinkTech))를 사용하였다. DMT-(S)-세리놀(GalNAc)-숙시닐 lcaa CPG (7) 및 DMT-(S)-세리놀(GalNAc)-CEP (5)의 합성은 실시예 6에 기재되어 있다.
보조 시약은 EMP 바이오테크(EMP Biotech)로부터 구입하였다. 합성은 건조 아세토니트릴 (<20 ppm H2O) 중 포스포르아미다이트의 0.1 M 용액을 사용하여 수행하였고, 벤질티오테트라졸 (BTT)을 활성화제로서 사용하였다 (아세토니트릴 중 0.3M). 커플링 시간은 10분이었다. Cap/OX/Cap 또는 Cap/Thio/Cap 사이클을 적용하였다 (Cap: Ac2O/NMI/루티딘/아세토니트릴, 산화제: 피리딘/H2O 중 0.05M I2). 포스포로티오에이트는 아세토니트릴 중 상업적으로 입수가능한 티올화 시약 50mM EDITH (링크 테크놀로지스(Link technologies))를 사용하여 도입하였다. DMT 절단은 톨루엔 중 3% 디클로로아세트산을 사용한 처리에 의해 달성하였다. 프로그래밍된 합성 사이클의 완료 시, 디에틸아민 (DEA) 세척을 수행하였다. 모든 올리고뉴클레오티드는 DMT-오프 모드로 합성하였다.
세리놀(GalNAc) 모이어티의 부착은 염기-로딩된 (S)-DMT-세리놀(GalNAc)-숙시닐-lcaa-CPG (7) 또는 (S)-DMT-세리놀(GalNAc)-CEP (5)의 사용에 의해 달성하였다. 분지화 트레블러 아미다이트 유도체 (C6XLT-phos)에 이은 GalNAc 아미다이트 (ST23-phos)의 연속 커플링에 의해 삼중-안테나 GalNAc 클러스터 (ST23/ST43)를 도입하였다. (vp)-mU 모이어티의 부착은 마지막 합성 사이클에서 (vp)-mU-phos의 사용에 의해 달성하였다. (vp)-mU-phos는 추가의 합성 신장에 적합한 히드록시 기를 제공하지 않으며, 따라서 DMT-기를 보유하지 않는다. 따라서, (vp)-mU-phos의 커플링은 합성 종결을 발생시킨다.
비닐포스포네이트를 차폐하는 메틸 에스테르의 제거를 위해, 완전히 어셈블리된 올리고뉴클레오티드를 보유하는 CPG를 감압 하에 건조시키고, 디스크 프릿 (칼 로트 게엠베하(Carl Roth GmbH))이 장착된 고체 상 펩티드 합성을 위한 20 ml PP 시린지 반응기로 옮겼다. 이어서, CPG를 실온에서 CH2Cl2 (0.5 ml/μmol 고체 지지체 결합된 올리고뉴클레오티드) 중 250 μL TMSBr 및 177 μL 피리딘의 용액과 접촉시키고, 반응기를 루어(Luer) 캡으로 밀봉하였다. 반응 용기를 2x15분의 기간에 걸쳐 약간 교반하고, 과량의 시약을 폐기하고, 잔류 CPG를 10 ml 아세토니트릴로 2x 세척하였다. 추가의 하류 가공은 임의의 다른 실시예 화합물에서 변경되지 않았다.
단일 가닥을 40% 수성 메틸아민 처리에 의해 CPG로부터 절단하였다 (90분, RT). 생성된 조 올리고뉴클레오티드를 AKTA 퓨어 HPLC 시스템 상에서 이온 교환 크로마토그래피 (리소스 Q, 6 ml, 지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 염화나트륨 구배를 사용하여 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, 크기 배제 칼럼 (제타덱스, EMP 바이오테크) 상에서 탈염시키고, 추가 사용시까지 동결건조시켰다.
모든 최종 단일-가닥 생성물을 AEX-HPLC에 의해 분석하여 그의 순도를 입증하였다. 각각의 단일-가닥 생성물의 아이덴티티를 LC-MS 분석에 의해 입증하였다.
실시예 8 - 이중-가닥 형성
개별 단일 가닥을 H2O 중에 60 OD/ml의 농도로 용해시켰다. 둘 다의 개별 올리고뉴클레오티드 용액을 반응 용기에 함께 첨가하였다. 보다 용이한 반응 모니터링을 위해 적정을 수행하였다. 제1 가닥을, 260 nm에서의 UV-흡수에 의해 결정되는 바와 같이, 제2 가닥에 비해 25% 과량으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 80℃로 5분 동안 가열한 다음, 실온으로 천천히 냉각시켰다. 이중-가닥 형성을 이온 쌍형성 역상 HPLC에 의해 모니터링하였다. 잔류 단일 가닥의 UV-면적으로부터 필요한 양의 제2 가닥을 계산하고, 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응물을 다시 80℃로 가열하고, RT로 천천히 냉각시켰다. 이 절차를 잔류 단일 가닥의 10% 미만이 검출될 때까지 반복하였다.
실시예 9
1 또는 5 mg/kg GalNAc 접합된 siRNA의 단일 피하 투여 후 뮤린 간 조직 및 혈청 단백질에서의 C3 mRNA의 녹다운을 보여주는 생체내 연구.
8주령의 암컷 C57BL/6 N 마우스를 독일 슐츠펠트 소재의 찰스 리버(CHARLES RIVER)로부터 입수하였다. 동물 실험은 2013년 7월 버전의 독일 동물 보호법(German Protection of Animals Act)의 윤리 가이드라인에 따라 수행하였다. 마우스를 체중에 따라 4마리의 마우스 군으로 무작위화하였다. 연구 제0일에, 동물에게 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 용해된 1 또는 5 mg/kg siRNA 또는 대조군으로서 PBS 단독의 단일 피하 용량을 제공하였다. 마우스의 생존율, 체중 및 거동을 병리학적 소견 없이 연구 동안 모니터링하였다. 혈청 샘플을 적용 전, 제4일, 제10일 및 제14일에 채취하였다. 제14일에 연구를 종결시키고, 동물을 안락사시키고, 간 샘플을 순간 동결시키고, 추가의 분석까지 -80℃에서 저장하였다. 분석을 위해, RNA를 스트라텍으로부터의 인비트랩 스핀 조직 RNA 미니 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단리하였다. QPCR은 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)로부터의 퀀트스튜디오6 장치 상에서 C3 및 액틴 특이적 프라이머 프로브 세트 및 타키온(Takyon)™ 원-스텝 로우 록스 프로브 5X 마스터믹스 dTTP를 사용하여 단일-플렉스 384 웰 포맷으로 수행하였다. 델타 델타 Ct 방법을 사용하여 발현 차이를 계산하였고, PBS 대조군 실험에 대해 정규화된 하우스키핑 유전자 액틴 대비 C3의 상대 발현을 상이한 siRNA의 비교를 위해 사용하였다. EV0107, EV0313 및 EV0110은 간 C3 mRNA의 용량 의존성 녹다운을 유도하였다. 최대 달성된 녹다운은 siRNA EV0107 (57%) 및 EV0110 (61%)을 사용하여, 각각 5 mg/kg siRNA를 사용한 경우에 관찰되었다. 결과를 도 6a에 제시한다. 도면은 GalNAc 접합된 siRNA EV0107, EV0313 및 EV0110의 단일 투여 14일 후 뮤린 간에서의 % 단위의 상대 C3 mRNA 발현을 보여준다. 각각의 siRNA 듀플렉스를 형성하는 단일 가닥의 아이덴티티 뿐만 아니라 그의 서열은 표의 설명의 말미에서 확인된다. 데이터는 막대 차트로 평균 ± SD로서 제시된다 (군당 n=4).
혈청 샘플을 상업적으로 입수가능한 C3 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였고, C3 혈청 수준을 각각의 투여전 수준에 대비하여 계산하였다. 결과를 도 6b에 제시한다. 도면은 5mg/kg EV0313, EV0110 및 EV0107 GalNAc 접합된 siRNA의 투여 전, 투여 후 연구의 제4일, 제10일 및 제14일에 채취한 마우스 혈청 샘플로부터의 % 단위의 상대 C3 단백질 혈청 수준을 보여준다. 데이터는 평균 ± SD로서 제시된다 (군당 n=3 또는 4).
실시예 10
시험된 siRNA-GalNAc 접합체의 1, 10 및 100nM에서의 C3 녹다운 효능을 보여주는 1차 마우스, 인간 및 시노몰구스 간세포에서의 시험관내 연구.
GalNAc siRNA 접합체 EV0201, EV0203, EV0204, EV0205 및 EV0207과의 1, 10 및 100nM에서의 인큐베이션 후 C3 mRNA의 발현을 측정하였다 (도 7). siRNA 서열 및 변형이 표 3 및 5에 열거된다. 하우스키핑 유전자 액틴의 mRNA 수준은 하우스키핑 대조군으로서의 역할을 하였다. 인간 및 시노몰구스 1차 간세포를 콜라겐 I-코팅된 96-웰 플레이트 (라이프 테크놀로지스)에 웰당 40,000개의 세포 밀도로 시딩하였다. 마우스 간세포를 웰당 25,000개의 세포 밀도로 시딩하였다. GalNAc-접합된 siRNA를 플레이팅 직후에 이전에 규정된 배지에 100, 10 및 1 nM의 최종 siRNA 농도로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 용해시키고, 인비트랩 RNA 세포 HTS96 키트/C (스트라텍)를 사용하여 RNA를 단리하였다.
각각 ACTB (유로젠텍(Eurogentec)) 및 C3 (바이오테즈 게엠베하(BioTez GmbH), 독일 베를린)에 대한 앰플리콘 세트/서열을 사용하여 수행되는 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR)에 의한 유전자 발현 분석을 위해 10 μl의 RNA-용액을 사용하였다. RT-qPCR 반응은 ABI 스텝원 플러스 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 매사추세츠주 소재의 써모 피셔 사이언티픽의 분사)를 사용하여 RT-PCR을 위한 표준 프로토콜 (48℃ 30분, 95℃ 10분, 95℃ 15초에 이어서 60℃ 1분의 40 사이클)을 사용하여 수행하였다. 2-델타델타 Ct 방법으로도 공지되어 있는 비교예 CT 방법을 사용하여 데이터를 계산하였다. siRNA EV0201, EV0203, EV0204, EV0205 및 EV0207은 1차 간세포에서 C3 mRNA 발현의 용량-의존성 억제를 보여준다.
실시예 11
5 또는 10 mg/kg GalNAc 접합된 변형된 siRNA의 단일 피하 투여 후 뮤린 간 조직 및 혈청 단백질에서의 C3 mRNA의 녹다운을 보여주는 생체내 연구.
siRNA 서열 및 변형이 표 3 및 5에 열거된다. 하우스키핑 유전자 액틴의 mRNA 수준은 하우스키핑 대조군으로서의 역할을 하였다. 약 8주령의 수컷 C57BL/6 N 마우스를 독일 슐츠펠트 소재의 찰스 리버로부터 입수하였다. 동물 실험은 동물 보호를 규제하는 헝가리법 1998: XXVIII의 원리 (최근 개정법 2011 CLVIII) 및 동물 실험에 대한 정부령 40/2013을 준수하여 수행하였다. 마우스를 4마리 마우스의 군으로 배정하였다. 연구 제0일에, 동물에게 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 용해된 5 또는 10 mg/kg siRNA 또는 대조군으로서 PBS 단독의 단일 피하 용량을 제공하였다. 마우스의 생존율, 체중 및 거동을 병리학적 소견 없이 연구 동안 모니터링하였다. 혈청 샘플을 적용 전, 제4일, 제10일, 제14일, 제21일, 제28일, 제35일 및 제42일에 채취하였다. 제14일 및 제42일에 각각 군의 절반을 종결시키고, 동물을 안락사시키고, 간 샘플을 순간 동결시키고, 추가의 분석까지 -80℃에서 저장하였다.
분석을 위해, RNA를 스트라텍으로부터의 인비트랩 스핀 조직 RNA 미니 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단리하였다. RT-qPCR은 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 퀀트스튜디오6 장치 상에서 C3 및 액틴 특이적 프라이머 프로브 세트 및 타키온™ 원-스텝 로우 록스 프로브 5X 마스터믹스 dTTP를 사용하여 단일-플렉스 384 웰 포맷으로 수행하였다. 델타 델타 Ct 방법을 사용하여 발현 차이를 계산하였고, PBS 군에 대해 정규화된 하우스키핑 유전자 액틴 대비 C3의 상대 발현을 상이한 siRNA의 비교를 위해 사용하였다.
모든 시험된 siRNA (EV0201, EV0203, EV0204, EV0205 및 EV0207)는 5 또는 10 mg/kg의 단일 용량 14일 후에 C3 mRNA 발현을 70% 초과만큼 억제하였다 (도 8a). 42일 후, EV0203, EV0204, EV0205 및 EV0207에 의한 C3 발현의 억제는 10 mg/kg siRNA 용량에서 여전히 80% 초과의 녹다운이었다 (도 8b).
C3 단백질 수준 분석을 위해, 혈청 샘플을 상업적으로 입수가능한 C3 ELISA 키트를 사용하여 측정하였다. 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였고, % C3 혈청 수준을 기준선에서의/적용 전의 군 평균에 대비하여, 및 시간 매칭 PBS 대조군의 평균에 대비하여 계산하였다. C3 단백질 분석에 대한 데이터는 RNA 분석으로부터의 결과를 반영한다 (도 9). EV0203, EV0204, EV0205 및 EV0207은 오래 지속되는 C3 혈청 감소를 유도할 수 있었다. EV0203의 경우 10 mg/kg의 단일 적용 42일 후에 최대 80%의 감소가 수득되었다 (도 9b).
실시예 12
C3을 표적화하는 다양한 siRNA는 시험관내에서 활성이다.
siRNA EJ0001, EJ0002, EJ0003 및 EJ0004의 C3 녹다운 효능을 Hep3B 세포에서 0.1 - 10 nM siRNA의 형질감염 후에 결정하였다. 결과를 도 10에 도시한다. EJ0001로의 형질감염 후에, C3 mRNA 수준의 용량 의존성 감소가 최대 ~90% 녹다운으로 관찰된다. EJ0002, EJ0003 및 EJ0004는 유사한 활성 범위에 있다.
Hep3B 세포를 siRNA로 형질감염시키기 위해, 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 12,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 시딩 24시간 후에 아투펙트(Atufect) 리포솜 형질감염 시약으로 siRNA의 형질감염을 수행하였다. C3을 표적화하는 siRNA를 사용하여 0.1, 1 및 10 nM에서 삼중으로 스크리닝을 수행하였다. 반딧불이 루시페라제 ("Luc")를 표적화하는 siRNA를 대조군으로서 사용하였다. siRNA와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 ApoB mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 13
인간 C3을 표적화하는 다양한 siRNA는 시험관내에서 활성이다.
siRNA EJ0001, EJ0005, EJ0006 및 EJ0007의 C3 녹다운 효능을 Hep3B 세포에서 0.01 - 1 nM siRNA의 형질감염 후에 결정하였다. 결과를 도 11에 도시한다. 1 nM로의 형질감염 후에, C3 mRNA 녹다운은 모든 시험된 siRNA에 대해 약 90%이고, 0.1 nM에서 녹다운은 EJ0001, EJ0006 및 EJ0007에 대해 약 50%이다. EJ0005는 0.1 nM에서 80% 녹다운으로 보다 잘 수행한다.
Hep3B 세포를 siRNA로 형질감염시키기 위해, 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 8,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 시딩 24시간 후에 아투펙트 리포솜 형질감염 시약으로 siRNA의 형질감염을 수행하였다. 0.01, 0.1 및 1 nM siRNA 농도에서 삼중으로 스크리닝을 수행하였다. 반딧불이 루시페라제 ("Luc")를 표적화하는 siRNA를 대조군으로서 사용하였다. siRNA와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 PTEN mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 14
마우스 C3을 표적화하는 다양한 siRNA는 시험관내에서 활성이다.
siRNA EJ0001, EJ005, EJ0006 및 EJ0007의 C3 녹다운 효능을 AML12 세포에서 0.01 - 10 nM siRNA의 형질감염 후에 결정하였다. 결과를 도 12에 도시한다. siRNA 형질감염 후, 최대 약 60%의 용량-의존성 C3 mRNA 녹다운이 도달된다.
AML12 세포를 형질감염시키기 위해, 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 6,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 시딩 24시간 후에 아투펙트 리포솜 형질감염 시약으로 siRNA의 형질감염을 수행하였다. C3을 표적화하는 siRNA를 사용하여 0.01, 0.1, 1 및 10 nM에서 삼중으로 스크리닝을 수행하였다. 반딧불이 루시페라제 ("Luc")를 표적화하는 siRNA를 대조군으로서 사용하였다. siRNA와 함께 24시간 인큐베이션한 후, 배지를 제거하고, 세포를 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 PTEN mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 15
마우스 C3을 표적화하는 다양한 GalNAc-접합된 siRNA는 시험관내에서 활성이다.
GalNAc siRNA 접합체 EV0201, EJ0010, EJ0011, EJ0012, EJ0014 및 EJ0015의 C3 mRNA 녹다운 효율을 마우스 1차 간세포에서 수용체-매개 흡수 후에 결정하였다. 결과를 도 13에 도시한다. 최대 약 75%의 용량-의존성 녹다운이 달성되었다.
마우스 1차 간세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 25,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 플레이팅 직후에 100, 10, 1 및 0.1 nM GalNAc-접합된 siRNA로 처리하였다. GalNAc-접합된, 스크램블된 서열을 비-표적화 대조군 (NTC)으로서 사용하였다. 세포를 GalNAc-접합체와의 24시간 인큐베이션 후에 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 APOB mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 16
시노몰구스 C3을 표적화하는 다양한 GalNAc-접합된 siRNA는 시험관내에서 활성이다.
GalNAc siRNA 접합체 EV0201, EJ0010, EJ0011, EJ0012, EJ0014 및 EJ0015의 C3 mRNA 녹다운 효율을 시노몰구스 1차 간세포에서 수용체-매개 흡수 후에 결정하였다. 결과를 도 14에 도시한다. 최대 약 90%의 용량-의존성 녹다운이 달성되었다.
시노몰구스 1차 간세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 36,500개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 플레이팅 직후에 100 및 10 nM GalNAc-접합된 siRNA로 처리하였다. GalNAc-접합된, 스크램블된 서열을 비-표적화 대조군 (NTC)으로서 사용하였다. 세포를 GalNAc-접합체와의 24시간 인큐베이션 후에 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 APOB mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 17
GalNAc-접합된 siRNA의 변이체는 1차 마우스 간세포에서 C3을 억제한다.
GalNAc-siRNA 접합체 EV0201 및 그의 변이체 (EJ0009, EV0203), EJ0014 및 그의 변이체 (EJ0019, EJ0020), EJ0015 및 그의 변이체 (EJ0021-23) 뿐만 아니라 EJ0012 및 그의 변이체 (EJ0016-18)의 C3 mRNA 녹다운 효율을 마우스 1차 간세포에서 수용체-매개 흡수 후에 결정하였다. 결과를 도 15에 도시한다. 최대 약 85%의 용량-의존성 녹다운이 일부 변이체에 의해 달성되었다.
마우스 1차 간세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 25,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 플레이팅 직후에 100, 10 및 1 nM GalNAc-접합된 siRNA로 처리하였다. GalNAc-접합된, 스크램블된 서열을 비-표적화 대조군 (NTC)으로서 사용하였다. 세포를 GalNAc 접합체와의 24시간 인큐베이션 후에 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 APOB mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 18
GalNAc-접합된 siRNA의 변이체는 1차 시노몰구스 간세포에서 C3을 억제한다
GalNAc-siRNA 접합체 EV0201 및 그의 변이체 (EJ0009, EV0203), EJ0014 및 그의 변이체 (EJ0019, EJ0020), EJ0015 및 그의 변이체 (EJ0021-23) 뿐만 아니라 EJ0012 및 그의 변이체 (EJ0016-18)의 C3 mRNA 녹다운 효율을 시노몰구스 1차 간세포에서 수용체-매개 흡수 후에 결정하였다. 결과를 도 16에 도시한다. 최대 약 90%의 용량-의존성 녹다운이 일부 변이체에 의해 달성되었다.
시노몰구스 1차 간세포를 96-웰 조직 배양 플레이트에 40,000개 세포/웰의 밀도로 시딩하고, 플레이팅 직후에 100, 10 및 1 nM GalNAc-접합된 siRNA로 처리하였다. GalNAc-접합된, 스크램블된 서열을 비-표적화 대조군 (NTC)으로서 사용하였다. 세포를 GalNAc 접합체와의 24시간 인큐베이션 후에 용해시키고, 총 RNA를 추출하였다. C3 및 ACTB mRNA 수준을 택맨 qRT-PCR에 의해 결정하였다. 각각의 막대는 3회의 기술적 반복으로부터의 평균 ± SD를 나타낸다.
실시예 19
1 또는 3 mg/kg GalNAc 접합된 C3 siRNA EJ0020의 단일 피하 투여 후 뮤린 간 조직 및 혈청 단백질에서의 C3 mRNA의 녹다운을 보여주는 시험관내 연구.
8주령의 수컷 C57BL/6 N 마우스를 프랑스 소재의 장비에(Janvier)로부터 입수하였다. 동물 실험은 2013년 7월 버전의 독일 동물 보호법(German Protection of Animals Act)의 윤리 가이드라인에 따라 수행하였다. 마우스를 체중에 따라 4마리의 마우스 군으로 무작위화하였다. 연구 제0일에, 동물에게 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 용해된 1 또는 3 mg/kg siRNA 또는 대조군으로서 PBS 단독의 단일 피하 용량을 제공하였다. 마우스의 생존율, 체중 및 거동을 병리학적 소견 없이 연구 동안 모니터링하였다. 혈청 샘플을 적용 전, 제7일, 제14일, 제28일 및 제43일에 채취하였다. 제43일에 연구를 종결시키고, 동물을 안락사시키고, 간 샘플을 순간 동결시키고, 추가의 분석까지 -80℃에서 저장하였다.
분석을 위해, RNA를 스트라텍으로부터의 인비트랩 스핀 조직 RNA 미니 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 단리하였다. qPCR은 어플라이드 바이오시스템즈로부터의 퀀트스튜디오6 장치 상에서 C3 및 액틴 특이적 프라이머 프로브 세트 및 타키온™ 원-스텝 로우 록스 프로브 5X 마스터믹스 dTTP를 사용하여 단일-플렉스 384 웰 포맷으로 수행하였다. 델타 델타 Ct 방법을 사용하여 발현을 계산하였고, PBS에 대해 정규화된 하우스키핑 유전자 대비 C3의 상대 발현을 비교를 위해 사용하였다. 1 mg/kg siRNA EJ0020을 사용하여 38% C3 mRNA 녹다운이 관찰되었고, 3 mg/kg의 동일한 siRNA를 사용하여 73% C3 녹다운이 관찰되었다. 결과를 도 17에 제시한다 (데이터는 막대 차트로 평균 ± SD로서 제시됨 (군당 n=4)).
상업적으로 입수가능한 C3 ELISA 키트를 사용하여 혈청 중 C3 단백질 수준을 수득하였다. 분석은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였고, C3 혈청 수준을 각각의 투여전 수준에 대비하여 계산하였다. 결과를 도 18에 제시한다 (데이터는 평균 ± SD로서 제시됨 (군당 n=3 또는 4)).
실시예 20
시험된 siRNA-GalNAc 접합체의 1, 10 및 100nM에서의 C3 녹다운 효능을 보여주는 1차 인간 간세포에서의 시험관내 연구.
GalNAc siRNA 접합체 EV0210, EV0211, EV0212 및 EV0213과의 1, 10 및 100nM에서의 인큐베이션 후 C3 mRNA의 발현을 도 19에 제시한다. siRNA GalNAc 접합체는 표 3에 열거한다. 유전자 APOB의 mRNA 수준이 하우스키핑 대조군으로서의 역할을 하였다.
인간 1차 간세포를 콜라겐 I-코팅된 96-웰 플레이트 (라이프 테크놀로지스)에 웰당 40,000개의 세포 밀도로 시딩하였다. GalNAc-접합된 siRNA를 플레이팅 직후에 100, 10 및 1 nM의 최종 siRNA 농도로 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 5% CO2 분위기 하에 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 용해시키고, 인비트랩 RNA 세포 HTS96 키트/C (스트라텍)를 사용하여 RNA를 단리하였다.
각각 APOB (유로젠텍) 및 C3 (바이오테즈 게엠베하, 독일 베를린)에 대한 앰플리콘 세트/서열을 사용하여 수행되는 역전사 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-qPCR)에 의한 유전자 발현 분석을 위해 10 μl의 RNA-용액을 사용하였다. RT-qPCR 반응은 ABI 스텝원 플러스 (어플라이드 바이오시스템즈, 미국 매사추세츠주 소재의 써모 피셔 사이언티픽의 분사)를 사용하여 RT-PCR을 위한 표준 프로토콜 (48℃ 30분, 95℃ 10분, 95℃ 15초에 이어서 60℃ 1분의 40 사이클)을 사용하여 수행하였다. 2-델타델타 Ct 방법으로도 공지되어 있는 비교예 CT 방법을 사용하여 데이터를 계산하였다.
siRNA EV0210, EV0211, EV0212 및 EV0213은 1차 인간 간세포에서 C3 mRNA 발현을 용량-의존성 방식으로 억제할 수 있었다.
실시예 21
C3 사구체병증 (C3G)의 뮤린 질환 모델에서의 C3 siRNA GalNAc 접합체의 효능의 생체내 연구.
EV0203을 C3 사구체병증의 뮤린 질환 모델 및 야생형 마우스에서 시험하였다. 이형접합 보체 인자 H 결핍 마우스 (Cfh def.)를 C3 사구체병증 질환 모델로서 사용하였다. 동물을 단일 용량의 EV0203 또는 대조군 (PBS 또는 비-표적화 siRNA)으로 처리하였다. 마우스를 처리 10일 후에 희생시키고, 항-C3 항체를 사용한 C3 염색에 의해 마우스의 신장에서 C3의 세관 침착을 측정하고, 정량화하였다 (결과는 도 20에 제시됨). Ba 단편 대 전장 FB의 비로서 결정되는 보체 인자 B (FB) 단편화를 또한 웨스턴 블롯에 의해 혈장에서 측정하고 정량화하였고 - 결과를 도 21에 제시한다. C3 염색의 결과는 세관 C3 침착물이 접합된 C3 siRNA를 사용한 처리에 의해 용량-의존성 방식으로 유의하게 감소됨을 보여준다. FB 단편화 데이터는 Cfh def. 마우스가 야생형 마우스와 비교하여 증가된 수준의 FB 단편화를 갖지만, 이러한 증가된 단편화 수준은 접합된 C3 siRNA를 사용한 처리에 의해 감소될 수 있다는 것을 보여준다. 따라서, 접합된 C3 siRNA는 C3-관련 질환, 특히 C3 사구체병증 및/또는 적어도 그의 증상에 대한 강력한 치료일 것으로 예상된다.
실시예 22
C3 사구체병증 (C3G)의 뮤린 질환 모델에서 다중 용량의 C3 siRNA GalNAc 접합체의 효능의 생체내 연구.
EV0203을 C3 사구체병증의 뮤린 질환 모델에서 시험하였다. 이형접합 보체 인자 H 결핍 마우스 (Cfh def.)를 C3 사구체병증 질환 모델로서 사용하였다. 7- 내지 8-개월령 마우스를 연구의 제1일에 처리한 다음, 5 mg/kg의 EV0203 또는 대조군으로서 PBS 또는 비-표적화 siRNA로 매월 처리하였다. PBS로 처리된 야생형 마우스를 또한 대조군으로서 사용하였다. 마우스를 연구 시작 3개월 후에 (즉, 접합된 C3 siRNA 또는 대조군으로 3회 처리한 후에) 희생시켰다. 혈장 내의 C3α-쇄 및 C3α-쇄 단편 (활성화된 C3 단편)의 수준을 웨스턴 블롯에 의해 측정하고, 정량화하였다 (결과를 도 22a 및 22b에 제시함). Ba 단편 대 전장 FB의 비로서 결정되는 보체 인자 B (FB) 단편화를 또한 웨스턴 블롯에 의해 혈장에서 측정하고 정량화하였고 - 결과를 도 23에 제시한다. 이들 데이터는 접합된 C3 siRNA가 노화된 마우스에서 C3 단편 수준 및 FB 단편화를 감소시키는데 효과적임을 확인시켜 준다.
사구체 C3d 침착물을 또한 C3d 염색에 의해 측정하였다. 3회 용량의 접합된 C3 siRNA는 Cfh def. 마우스의 사구체 C3d 침착물을 연령-매칭된 야생형 마우스의 수준과 유사한 수준으로 감소시킬 수 있었다. 따라서, 접합된 C3 siRNA는 C3-관련 질환, 특히 C3 사구체병증 및/또는 적어도 그의 증상에 대한 강력한 치료일 것으로 예상된다.
실시예 23
EV0210, EV0212 및 EJ0020을 비롯한 상기 실시예로부터의 접합된 C3 siRNA를 건강한 시노몰구스 원숭이에서 생체내 시험하였다. 동물을 상이한 용량의 접합된 C3 siRNA로 1회 또는 다수회 처리하였다. 시험된 접합된 C3 siRNA로 처리된 원숭이로부터의 예비 데이터는 혈청에서 감소된 C3 단백질 수준을 나타낸다. 이들 생체내 실험은 현재 진행중이다. 건강한 시노몰구스 원숭이에서의 접합된 C3 siRNA의 추가의 생체내 시험을 계획하였다. 상이한 용량의 접합된 C3 siRNA로 1회 또는 다수회 처리한 후, 혈청에서 C3 단백질 수준을 측정하고, 간 조직에서 C3 mRNA 수준을 측정한다. 혈청에서의 C3 단백질 수준 및 간에서의 C3 mRNA 수준은 둘 다 유효 용량의 접합된 C3 siRNA를 사용한 치료 후에 감소될 것으로 예상된다.
진술
하기 진술은 본 발명의 측면을 나타낸다.
1. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377, 361, 95, 111, 125, 131, 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 127, 129, 133 또는 416의 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인, 보체 성분 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산.
2. 진술 1에 있어서,
(a) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 18개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열과 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 18개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나;
(b) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나와 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 18개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열과 1개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 18개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나;
(c) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나의 적어도 18개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 적어도 18개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는
(d) 제1 가닥 서열이 표 1의 제1 가닥 서열 중 어느 하나로 이루어지고, 임의로 제2 가닥 서열이 표의 동일한 라인의 제2 가닥 서열의 서열로 이루어지고;
여기서 표 1은 하기인 핵산.
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
3. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 361의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 112의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 95의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 96의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 125의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 126의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 131의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 132의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 364의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 363 또는 375의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 365의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 363의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 366의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 367 또는 376의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 368의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 369의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 370의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 371 또는 379, 바람직하게는 379의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 372의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 373 또는 380의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 362의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 374의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 377의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 378의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하거나; 또는 제1 가닥 서열이 서열식별번호: 416의 서열을 포함하고, 임의로 제2 가닥 서열이 서열식별번호: 26의 서열의 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인 핵산.
4. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 보체 성분 C3의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 핵산.
5. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥이 별개의 가닥이고, 각각 18-25개의 뉴클레오티드 길이인 핵산.
6. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥이 17-25개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 형성하는 것인 핵산.
7. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 듀플렉스 영역이 17-25개의 연속 뉴클레오티드 염기 쌍으로 이루어진 것인 핵산.
8. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서,
a) 둘 다의 단부에서 평활 단부이거나;
b) 한 단부에서 오버행 및 다른 단부에서 평활 단부를 갖거나; 또는
c) 둘 다의 단부에서 오버행을 갖는
핵산.
9. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, siRNA인 핵산.
10. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, RNA 간섭을 매개하는 핵산.
11. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 1개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드인 핵산.
12. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 적어도 뉴클레오티드 2 및 14가 제1 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된 것인 핵산.
13. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드 각각이 제1 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된 것인 핵산.
14. 진술 12 또는 13에 있어서, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드가 제2 변형에 의해 변형되고, 여기서 제2 변형은 제1 변형과 상이한 것인 핵산.
15. 진술 12-14 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 짝수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 뉴클레오티드가 제3 변형에 의해 변형되며, 여기서 제3 변형은 제1 변형과 상이한 것인 핵산.
16. 진술 12-15 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 홀수-번호 뉴클레오티드에 상응하는 위치의 제2 가닥의 뉴클레오티드가 제4 변형에 의해 변형되며, 여기서 제4 변형은 제2 및/또는 제3 변형이 존재하는 경우에 제2 변형과 상이하고 제3 변형과 상이한 것인 핵산.
17. 진술 12-14 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 뉴클레오티드 11 또는 뉴클레오티드 13 또는 뉴클레오티드 11 및 13 또는 뉴클레오티드 11-13에 상응하는 위치의 제2 가닥의 뉴클레오티드/뉴클레오티드들이 제4 변형에 의해 변형되고, 바람직하게는 여기서 제4 변형에 의해 변형되지 않은 제2 가닥의 뉴클레오티드는 제3 변형에 의해 변형된 것인 핵산.
18. 진술 12-17 중 어느 하나에 있어서, 제1 변형 및 제4 변형 둘 다가 핵산에 존재하는 경우에 제1 변형은 제4 변형과 동일하고, 바람직하게는 제2 변형 및 제3 변형 둘 다가 핵산에 존재하는 경우에 제2 변형은 제3 변형과 동일한 것인 핵산.
19. 진술 12-18 중 어느 하나에 있어서, 제1 변형이 2'-F 변형이고; 제2 변형이 핵산 내에 존재하는 경우에 바람직하게는 2'-OMe 변형이고; 제3 변형이 핵산 내에 존재하는 경우에 바람직하게는 2'-OMe 변형이고; 제4 변형이 핵산 내에 존재하는 경우에 바람직하게는 2'-F 변형인 핵산.
20. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥의 뉴클레오티드 각각이 변형된 뉴클레오티드인 핵산.
21. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥이 그의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖고, 여기서 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드는 바람직하게는 포스포디에스테르 연결에 의해 제1 가닥의 제2 뉴클레오티드에 연결된 것인 핵산.
22. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 핵산이 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 2 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 바람직하게는 여기서 나머지 뉴클레오티드 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결인 핵산.
23. 진술 1-21 중 어느 하나에 있어서, 제1 가닥의 3' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고/거나 제2 가닥의 3' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결 및/또는 제2 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고, 제1 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함하는 핵산.
24. 진술 23에 있어서, 제1 가닥의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각의 사이에 및/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각의 사이에, 및/또는 제2 가닥의 3개의 말단 3' 뉴클레오티드 각각의 사이에 및/또는 3개의 말단 5' 뉴클레오티드 각각의 사이에, 포스포로디티오에이트 연결이 그러한 단부에 존재하지 않는 경우에, 포스포로티오에이트 연결을 포함하는 핵산.
25. 진술 23에 있어서, 제1 가닥의 3' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 및 제2 가닥의 3' 단부 및 5' 단부의 2개의 말단 뉴클레오티드 사이의 연결 이외에 둘 다의 가닥의 뉴클레오티드 사이의 모든 연결이 포스포디에스테르 연결인 핵산.
26. 상기 진술 중 어느 하나에 있어서, 리간드에 접합된 핵산.
27. 진술 26에 있어서, 리간드가 (i) 1개 이상의 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 모이어티 또는 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하며, 여기서 링커는 적어도 1개의 GalNAc 모이어티 또는 그의 유도체를 핵산에 접합시키는 것인 핵산.
28. 진술 1-27 중 어느 하나에 있어서, 화학식 (II)의 화합물을 포함하는 리간드에 접합되며,
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
여기서:
S는 사카라이드를 나타내고, 바람직하게는 여기서 사카라이드는 N-아세틸 갈락토사민이고;
X1은 C3-C6 알킬렌 또는 (-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-를 나타내고, 여기서 m은 1, 2, 또는 3이고;
P는 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트이고;
X2는 알킬렌 또는 화학식 (-CH2)n-O-CH2-의 알킬렌 에테르이고, 여기서 n = 1- 6이고;
A는 분지화 유닛이고;
X3은 가교 유닛을 나타내고;
여기서 진술 1 내지 27 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 핵산은 포스페이트 또는 변형된 포스페이트, 바람직하게는 티오포스페이트를 통해 X3에 접합된 것인 핵산.
29. 진술 1-27 중 어느 하나에 있어서, 핵산의 제1 가닥이 화학식 (V)의 화합물이며:
Figure pct00060
여기서 b는 0 또는 1이고;
여기서 제2 가닥은 화학식 (VI)의 화합물이며:
Figure pct00061
;
여기서:
c 및 d는 독립적으로 0 또는 1이고;
Z1 및 Z2는 각각 핵산의 제1 및 제2 가닥이고;
Y는 독립적으로 O 또는 S이고;
n은 독립적으로 0, 1, 2 또는 3이고;
L1은 리간드가 부착되는 링커이고, 여기서 L1은 화학식 (V) 및 (VI)에서 동일하거나 상이하고, L1이 동일한 화학식 내에 1회 초과로 존재하는 경우에 화학식 (V) 및 (VI) 내에서 동일하거나 상이하고;
여기서 b + c + d는 2 또는 3인 핵산.
30. 상기 진술 중 어느 하나의 핵산, 및 용매 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리학상 허용되는 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충제 및/또는 보존제를 포함하는 조성물.
31. 진술 1-29 중 어느 하나의 핵산, 및 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택된 추가의 치료제를 포함하는 조성물.
32. 진술 1-3 및 5-31 중 어느 하나에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 핵산 또는 조성물.
33. 진술 1-32 중 어느 하나에 있어서, 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 사용하기 위한 핵산 또는 조성물.
34. 진술 33에 있어서, 질환, 장애 또는 증후군이 보체-매개 질환, 장애 또는 증후군인 핵산 또는 조성물.
35. 진술 33 또는 34에 있어서, 질환, 장애 또는 증후군이 보체 경로의 이상 활성화 또는 과다활성화 및/또는 C3의 과다발현 또는 이소성 발현 또는 국재화 또는 축적과 연관된 것인 핵산 또는 조성물.
36. 진술 33-35 중 어느 하나에 있어서, 질환, 장애 또는 증후군이
a) C3 사구체병증 (C3G), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 루푸스 신염, IgA 신병증 (IgA N), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), 원발성 막성 신병증, 면역 복합체-매개 사구체신염 (IC-매개 GN), 감염후 사구체신염 (PIGN), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 허혈/재관류 손상, 연령-관련 황반 변성 (AMD), 류마티스 관절염 (RA), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), 디스바이오틱 치주 질환, 말라리아 빈혈, 시신경척수염, HCT 후 / 실질 기관 이식 (TMAs), 길랑-바레 증후군, 막성 사구체신염, 혈전성 혈소판감소성 자반증 및 패혈증을 포함하는 군으로부터 선택되거나;
b) C3 사구체병증 (C3G), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 루푸스 신염, IgA 신병증 (IgA N) 및 원발성 막성 신병증을 포함하는 군으로부터 선택되거나;
c) C3 사구체병증 (C3G), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), IgA 신병증 (IgA N), 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH)를 포함하는 군으로부터 선택되거나;
d) C3 사구체병증 (C3G), 저온 응집소 질환 (CAD), 중증 근무력증 (MG), 시신경척수염, 비정형 용혈성 요독성 증후군 (aHUS), 항호중구 세포질 자가항체-연관 혈관염 (ANCA-AV), IgA 신병증 (IgA N), HCT 후 / 실질 기관 이식 (TMAs), 길랑-바레 증후군, 발작성 야간 혈색소뇨 (PNH), 막성 사구체신염, 루푸스 신염 및 혈전성 혈소판감소성 자반증을 포함하는 군으로부터 선택되거나
e) C3 사구체병증 (C3G), 저온 응집소 질환 (CAD) 및 IgA 신병증 (IgA N)을 포함하는 군으로부터 선택되거나; 또는
f) C3 사구체병증 (C3G)인
핵산 또는 조성물.
37. 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에서의 진술 1-29 중 어느 하나의 핵산 또는 진술 30 또는 31의 조성물의 용도이며, 여기서 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 C3 사구체병증 (C3G)인 용도.
38. 제약 유효 용량의 진술 1-29 및 32-36 중 어느 하나의 핵산 또는 진술30-36 중 어느 하나의 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하고, 바람직하게는 핵산 또는 조성물을 대상체에게 피하로, 정맥내로, 또는 경구, 직장 또는 복강내 투여에 의해 투여하는 것인, 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 그를 앓을 위험을 감소시키거나, 또는 치료하는 방법.
요약 표
요약 듀플렉스 표 - 표 3
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
요약 약어 표 - 표 4
Figure pct00065
Figure pct00066
상기 약어 표에 제시된 바와 같은 약어가 본원에 사용될 수 있다. 약어 목록은 포괄적인 것이 아닐 수 있고, 추가의 약어 및 그의 의미는 본 문서 전반에 걸쳐 찾아볼 수 있다.
요약 서열 표 - 표 5
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
Figure pct00076
Figure pct00077
Figure pct00078
Figure pct00079
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
SEQUENCE LISTING <110> Silence Therapeutics GmbH <120> Nucleic acids for inhibiting expression of C3 in a cell <130> 007714884 <150> EP19193840.6 <151> 2019-08-27 <150> EP19219497.5 <151> 2019-12-23 <150> EP20176947.8 <151> 2020-05-27 <160> 425 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 uuucauagua ggcucggau 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 2 auccgagccu acuaugaaa 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 3 uuucucugua ggcuccacu 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 4 aguggagccu acagagaaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 5 uuauagaugu aguagaauu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 6 aauucuacua caucuauaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 7 augacaaagg caguucccu 19 <210> 8 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Sequence <220> <223> siRNA <400> 140 cagacaagac caucuacaa 19 <210> 141 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 141 acaagaccau cuacaccca 19 <210> 142 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 142 cgugcugccc aguuucgaa 19 <210> 143 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 143 agauccacuu caccaagaa 19 <210> 144 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 144 uccacuucac caagacaca 19 <210> 145 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 145 ccuuugaccu cauggugua 19 <210> 146 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 146 cuuugaccuc augguguua 19 <210> 147 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 147 accucauggu guucgugaa 19 <210> 148 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 148 acaagaaagg gaucuguga 19 <210> 149 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 149 agggaucugu guggcagaa 19 <210> 150 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 150 aaugcaggac uucuucaua 19 <210> 151 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 151 ccagaauucu ccugcaaga 19 <210> 152 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 152 uggucaaggu cuucucuca 19 <210> 153 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 153 accucaucgc caucgacua 19 <210> 154 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 154 ccuucauggu guuccaaga 19 <210> 155 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 155 acacccucau caucuacca 19 <210> 156 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 156 ggucuacgcc uauuacaaa 19 <210> 157 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 157 gacuaugugu acaagacca 19 <210> 158 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 158 ucaucagccc caucaagua 19 <210> 159 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 159 uuucauagua ggcucggau 19 <210> 160 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 160 auccgagccu acuaugaaa 19 <210> 161 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 161 uuucucugua ggcuccacu 19 <210> 162 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 162 aguggagccu acagagaaa 19 <210> 163 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 163 uuauagaugu aguagaauu 19 <210> 164 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 164 aauucuacua caucuauaa 19 <210> 165 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 165 augacaaagg caguucccu 19 <210> 166 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 166 agggaacugc cuuugucau 19 <210> 167 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 167 aucugguagg gagagguca 19 <210> 168 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 168 ugaccucucc cuaccagau 19 <210> 169 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 169 uguguguuga ugcugaguu 19 <210> 170 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 170 aacucagcau caacacaca 19 <210> 171 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 171 uaauuguugg aguugccca 19 <210> 172 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 172 ugggcaacuc caacaauua 19 <210> 173 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 173 aggaaguuga cguugaggg 19 <210> 174 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 174 cccucaacgu caacuuccu 19 <210> 175 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 175 augaagucgg uggugaugg 19 <210> 176 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 176 ccaucaccac cgacuucau 19 <210> 177 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 177 uuuaccacca gcgagccca 19 <210> 178 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 178 ugggcucgcu ggugguaaa 19 <210> 179 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 179 ucuaucuuca gggucaucu 19 <210> 180 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 180 agaugacccu gaagauaga 19 <210> 181 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 181 auguaguugc agcagucca 19 <210> 182 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 182 uggacugcug caacuacau 19 <210> 183 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 183 aauauauuca ugagcuucg 19 <210> 184 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 184 cgaagcucau gaauauauu 19 <210> 185 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 185 aaauauauuc augagcuuc 19 <210> 186 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 186 gaagcucaug aauauauuu 19 <210> 187 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 187 uccugcauua cugugaccu 19 <210> 188 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 188 aggucacagu aaugcagga 19 <210> 189 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 189 caacagagua ggguagccg 19 <210> 190 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 190 cggcuacccu acucuguug 19 <210> 191 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 191 ucgaacaaca gaguagggu 19 <210> 192 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 192 acccuacucu guuguucga 19 <210> 193 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 193 uuucgaacaa cagaguagg 19 <210> 194 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 194 ccuacucugu uguucgaaa 19 <210> 195 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 195 guuucaucca gguaaugca 19 <210> 196 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 196 ugcauuaccu ggaugaaac 19 <210> 197 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 197 uuaucuuugg cugugguca 19 <210> 198 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 198 ugaccacagc caaagauaa 19 <210> 199 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 199 uguucauuga gccaacgca 19 <210> 200 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 200 ugcguuggcu caaugaaca 19 <210> 201 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 201 aacaccauga agguggccu 19 <210> 202 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 202 aggccaccuu caugguguu 19 <210> 203 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 203 uugguauuga gccaaggcu 19 <210> 204 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 204 agccuuggcu caauaccaa 19 <210> 205 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 205 uuuauuacag gugaguuga 19 <210> 206 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 206 ucaacucacc uguaauaaa 19 <210> 207 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 207 uuucuguuuc cggugcugg 19 <210> 208 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 208 ccagcaccgg aaacagaaa 19 <210> 209 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 209 ucaaggauca uaguguucu 19 <210> 210 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 210 agaacacuau gauccuuga 19 <210> 211 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 211 aucucaagga ucauagugu 19 <210> 212 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 212 acacuaugau ccuugagau 19 <210> 213 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 213 ucauacuugg agauguauc 19 <210> 214 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 214 gauacaucuc caaguauga 19 <210> 215 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 215 uaucggagaa ggcuuuguc 19 <210> 216 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 216 gacaaagccu ucuccgaua 19 <210> 217 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 217 augaugaggg uguuccuau 19 <210> 218 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 218 auaggaacac ccucaucau 19 <210> 219 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 219 uauuggugaa cuuugaaag 19 <210> 220 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 220 cuuucaaagu ucaccaaua 19 <210> 221 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 221 agcuuguuca gcuuuccau 19 <210> 222 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 222 auggaaagcu gaacaagcu 19 <210> 223 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 223 uuuguaugaa gcaauucuc 19 <210> 224 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 224 gagaauugcu ucauacaaa 19 <210> 225 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 225 gucuuguaca cauagucca 19 <210> 226 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 226 uggacuaugu guacaagac 19 <210> 227 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 227 ugcucaaugg ccaugaugu 19 <210> 228 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 228 acaucauggc cauugagca 19 <210> 229 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 229 uuggcauucg uccuccucg 19 <210> 230 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - modified_base, modified as per summary sequence table at the end of the description <400> 230 cgaggaggac gaaugccaa 19 <210> 231 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA - 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Claims (16)

  1. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하며, 여기서 제1 가닥 서열은 서열식별번호: 370, 364, 365, 366, 368, 372, 377 또는 416의 서열 중 어느 하나와 3개 이하의 뉴클레오티드만큼 상이한 적어도 15개의 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 것인, 보체 성분 C3의 발현을 억제하기 위한 이중-가닥 핵산.
  2. 제1 가닥 및 제2 가닥을 포함하는, 의약으로서 사용하기 위한 보체 성분 C3의 발현을 억제할 수 있는 이중-가닥 핵산.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 가닥 및 제2 가닥이 17-25개의 뉴클레오티드 길이의 듀플렉스 영역을 형성하는 것인 핵산.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, RNA 간섭을 매개하는 핵산.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 가닥의 적어도 1개의 뉴클레오티드가 변형된 뉴클레오티드이고, 바람직하게는 변형된 뉴클레오티드는 비-자연 발생 뉴클레오티드, 예컨대 2'-F 변형된 뉴클레오티드인 핵산.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가닥의 적어도 뉴클레오티드 2 및 14가 제1 변형에 의해 변형되고, 뉴클레오티드는 제1 가닥의 5' 단부에서 뉴클레오티드 번호 1로 시작하여 연속적으로 넘버링된 것인 핵산.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가닥이 그의 5' 단부에 말단 5' (E)-비닐포스포네이트 뉴클레오티드를 갖는 것인 핵산.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 제1 및/또는 제2 가닥의 말단 2 또는 3개의 3' 뉴클레오티드 및/또는 5' 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 연결을 포함하고, 바람직하게는 여기서 나머지 뉴클레오티드 사이의 연결은 포스포디에스테르 연결인 핵산.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 가닥의 3' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고/거나 제2 가닥의 3' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결 및/또는 제2 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 각각의 사이에 포스포로디티오에이트 연결을 포함하고, 제1 가닥의 5' 단부의 2, 3 또는 4개의 말단 뉴클레오티드 사이에 포스포로디티오에이트 연결 이외의 연결을 포함하는 핵산.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드에 접합된 핵산.
  11. 제10항에 있어서, 리간드가 (i) 1개 이상의 N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 모이어티 또는 그의 유도체, 및 (ii) 링커를 포함하며, 여기서 링커는 적어도 1개의 GalNAc 모이어티 또는 그의 유도체를 핵산에 접합시키는 것인 핵산.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산, 및 용매 및/또는 전달 비히클 및/또는 생리학상 허용되는 부형제 및/또는 담체 및/또는 염 및/또는 희석제 및/또는 완충제 및/또는 보존제 및/또는 올리고뉴클레오티드, 소분자, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택된 추가의 치료제를 포함하는 조성물.
  13. 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 핵산 또는 조성물.
  14. 제1항 및 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에 사용하기 위한 핵산 또는 조성물이며, 여기서 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 보체-매개 질환, 장애 또는 증후군인 핵산 또는 조성물.
  15. 질환, 장애 또는 증후군의 예방, 그를 앓을 위험의 감소, 또는 치료에서의 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제12항의 조성물의 용도이며, 여기서 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 C3 사구체병증 (C3G), 저온 응집소 질환 (CAD) 및 IgA 신병증 (IgA N)을 포함하는 군으로부터 선택된 것인 용도.
  16. 제약 유효량의 제1항 및 제3항 내지 제11항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제12항의 조성물을 치료를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함하는 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 그를 앓을 위험을 감소시키거나, 또는 치료하는 방법이며, 여기서 질환, 장애 또는 증후군은 바람직하게는 C3 사구체병증 (C3G), 저온 응집소 질환 (CAD) 및 IgA 신병증 (IgA N)을 포함하는 군으로부터 선택된 것인, 질환, 장애 또는 증후군을 예방하거나, 그를 앓을 위험을 감소시키거나, 또는 치료하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL9201440A (nl) 1992-08-11 1994-03-01 Univ Leiden Triantennaire clusterglycosiden, hun bereiding en toepassing.
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US20030096775A1 (en) 2001-10-23 2003-05-22 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of complement component C3 expression
WO2006006948A2 (en) 2002-11-14 2006-01-19 Dharmacon, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR SELECTING siRNA OF IMPROVED FUNCTIONALITY
AU2005248147A1 (en) * 2004-05-11 2005-12-08 Alphagen Co., Ltd. Polynucleotides for causing RNA interference and method for inhibiting gene expression using the same
CN103898110A (zh) * 2007-10-03 2014-07-02 夸克制药公司 新siRNA结构
EA201591707A1 (ru) * 2013-03-14 2016-03-31 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ иРНК КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА C5 И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
AU2014362262B2 (en) * 2013-12-12 2021-05-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component iRNA compositions and methods of use thereof
EP3105331B1 (en) * 2014-02-11 2021-06-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ketohexokinase (khk) irna compositions and methods of use thereof
EP3307316A1 (en) * 2015-06-12 2018-04-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
EP3228326A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
AU2018360697A1 (en) * 2017-11-01 2020-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component C3 iRNA compositions and methods of use thereof
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