CN114981430A - 用于抑制细胞中的c3表达的核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干扰补体组分C3基因表达或抑制其表达的核酸产物。核酸优选用作补体组分C3相关疾病、病症或综合征的治疗、预防或减少患有所述疾病、病症或综合征的风险，所述疾病、病症或综合征特别是C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)和原发性膜性肾病。

Description

用于抑制细胞中的C3表达的核酸
技术领域
本发明涉及干扰或抑制补体组分C3基因表达的核酸产物。本发明进一步涉及此类抑制例如用于治疗疾病和病症的治疗用途，所述疾病和病症与补体途径失调和/或过度激活相关、或者与补体组分C3在体内的异位表达或定位或累积相关。
背景技术
能够通过互补碱基配对与表达的mRNA结合的双链RNA (dsRNA)已显示通过已被称为“RNA干扰(RNAi)”的机制阻断基因表达(Fire等人，1998，Nature. 1998年2月19日；391(6669):806-11以及Elbashir等人，2001，Nature. 2001年5月24日；411(6836):494-8)。短dsRNA在许多生物体包括脊椎动物中指导基因特异性的转录后沉默，并且已成为用于研究基因功能的有用工具。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导，所述RISC是序列特异的多组分核酸酶，其降解与装载到RISC复合物内的沉默触发剂具有足够互补性或同源性的信使RNA。干扰RNA如siRNA、反义RNA和微小RNA是通过基因沉默来阻止蛋白质形成的寡核苷酸，即通过降解mRNA分子来抑制蛋白质的基因翻译。基因沉默剂对于医学中的治疗应用正变得越来越重要。
根据Watts和Corey，Journal of Pathology (2012；第226卷，第365-379页)，存在可以用于设计核酸沉默触发剂的算法，但所有这些都具有严重的局限性。可能需要各种实验方法来鉴定有效力的siRNA，因为算法并未考虑到因素如靶mRNA的三级结构或RNA结合蛋白的牵涉。因此，具有最低限度脱靶效应的有效力核酸沉默触发剂的发现是复杂的过程。对于这些高度荷电分子的药物开发，必要的是它们可以经济地合成，分布到靶组织，进入细胞并在可接受的毒性限度内发挥功能。
补体系统或途径是针对入侵病原体的宿主防御的先天免疫系统的部分。它主要由以前体形式在血液中循环的许多蛋白质组成。形成补体系统的大多数蛋白质，包括补体组分蛋白C3 (在本文中也简称为C3)，在很大程度上由肝脏中的肝细胞合成并分泌到血流内。该系统的激活导致炎症应答，导致吞噬细胞的吸引和调理作用，并且因而清除病原体、免疫复合物和细胞碎片(Janeway的Immunobiology第9版)。补体系统由3个途径(经典途径、凝集素途径和旁路途径)组成，所述3个途径全部在所谓的补体组分3转换酶复合物的形成处会聚。这些酶复合物将补体组分C3蛋白切割成C3a和C3b。一旦切割，C3b就形成复合物的部分，所述复合物依次又将C5切割成C5a和C5b。在切割后，C5b是主要补体途径效应物，膜攻击复合物的关键组分之一。因此，C3是补体系统激活途径的关键组分。
几种疾病与补体途径的异常获得性或遗传性激活以及C3的异常表达或过表达相关。其中包括C3肾小球病(C3G)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、免疫复合物介导的肾小球肾炎(IC介导的GN)、感染后肾小球肾炎(PIGN)、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、缺血/再灌注损伤和IgA肾病(IgA N；在Ricklin等人，Nephrology，2016及其它中综述)。这些疾病中的大多数与肾脏相关，因为这个器官对补体诱导的损害特别敏感。然而，其它器官的疾病也已知与补体功能障碍有关，如年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎(RA)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、菌群失调性牙周病、疟疾性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和脓毒症。
在C3G中，C3在肾脏的肾小球中累积并且使其堵塞。C3的累积也导致肾脏损害。在非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)中，补体系统靶向红血细胞，其导致红血细胞的裂解。
目前仅存在用于补体系统介导的疾病、病症和综合征的少数治疗。单克隆人源化抗体依库珠单抗是其中之一。它已知结合补体蛋白C5，从而阻断在补体级联的结束时的膜攻击复合物(Hillmen等人，2006 NEJM)。然而，仅患有上文列出疾病的患者子集响应依库珠单抗疗法。因此，对于补体介导或相关疾病的医学治疗，存在高度未满足需求。C3是补体途径激活中的关键因子。因此，抑制C3表达呈现了用于许多补体介导的疾病的有希望的治疗策略。
发明内容
本发明的一个方面是用于抑制补体组分C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列包含与以下序列中的任何一个相差不多于3个核苷酸的、至少15个核苷酸的序列：SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416。
一个方面涉及优选在细胞中能够抑制补体组分C3表达的双链核酸，其用作药物或者用于相关的诊断或治疗方法中，其中所述核酸优选包含第一链和第二链或由第一链和第二链组成，并且优选地其中所述第一链包含与补体组分C3 mRNA充分互补的序列，以便介导RNA干扰。
一个方面涉及组合物，其包含如本文公开的核酸和溶剂(优选水)和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。
一个方面涉及组合物，其包含如本文公开的核酸和选自例如寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的进一步治疗剂。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物，其用作药物或用于相关方法中。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物，其用于预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物在预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征中的用途，其中所述疾病、病症或综合征优选为C3肾小球病(C3G)。
一个方面涉及预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征的方法，其包括向需要治疗的个体施用药学有效剂量或量的如本文公开的核酸或包含所述核酸的组合物，优选地其中所述核酸或组合物皮下、静脉内或者通过经口、直肠、肺、肌内或腹膜内施用而施用于受试者。
具体实施方式
本发明涉及核酸及其组合物，所述核酸是双链的，并且包含与补体组分C3所表达的RNA转录物同源的序列。这些核酸或其缀合物或组合物可以用于治疗和预防其中期望C3基因产物的表达减少的各种疾病、病症和综合征。
本发明的第一个方面是优选在细胞中用于抑制C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列包含与选自以下的序列中的任何一个相差不多于3个核苷酸的、至少15个核苷酸的序列：SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416。这些核酸尤其具有在对于临床前和临床开发有关的各个物种中是活性的和/或具有很少的有关脱靶效应的优点。具有很少的有关脱靶效应意指核酸特异性抑制预期靶，而不显著抑制其它基因，或者在治疗可接受的水平上仅抑制一种或几种其它基因。
优选地，第一链序列包含与选自以下的序列中的任何一个相差不多于3个核苷酸，优选不多于2个核苷酸，更优选不多于1个核苷酸，且最优选不相差任何核苷酸的、至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有19个核苷酸的序列：SEQ ID NO:370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416。
优选地，核酸的第一链序列由选自以下的序列之一组成：SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416。然而，该序列可以通过并不改变核苷酸身份的许多核酸修饰进行修饰。例如，核酸的主链或糖残基的修饰并不改变核苷酸的身份，因为碱基本身保持与参考序列中的相同。
包含根据本文的参考序列的序列的核酸意指核酸包含按如参考序列中限定的次序的邻接核苷酸序列。
当本文提及包含核苷酸或由核苷酸组成的参考序列时，这种提及并不限于具有未修饰的核苷酸的序列。相同提及还涵盖这样的同一核苷酸序列，其中一个，几个例如两个、三个、四个、五个、六个、七个或更多个，包括所有核苷酸通过修饰进行修饰，所述修饰例如2’-OMe、2’-F、配体、接头、3’端或5’端修饰或任何其它修饰。它还指其中两个或更多个核苷酸通过天然的磷酸二酯键合或者通过任何其它键合例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合彼此连接的序列。
双链核酸是这样的核酸，其中第一链和第二链在其长度的至少部分上彼此杂交，并且因此能够在生理条件下例如在PBS中在37℃下，在每条链1 μM的浓度下形成双链体区域。第一链和第二链优选能够彼此杂交，并且因此能够在至少15个核苷酸，优选16、17、18或19个核苷酸的区域上形成双链体区域。该双链体区域包含在两条链之间的核苷酸碱基配对，优选基于沃森-克里克碱基配对和/或摇摆碱基配对(如GU碱基配对)。在双链体区域内的两条链的所有核苷酸不必彼此碱基配对，以形成双链体区域。在两条链的核苷酸序列之间的一定数目的错配、缺失或插入是可接受的。在第一链或第二链的任一端上的突出端或者在双链核酸的任一端处的未配对核苷酸也是可能的。双链核酸优选在生理条件下稳定的双链核酸，并且优选在每条链1 μM的浓度下，例如在PBS中具有45℃或更高，优选50℃或更高，且更优选55℃或更高的解链温度(Tm)。
在生理条件下稳定的双链核酸是在每条链1 μM的浓度下，例如在PBS中具有45℃或更高，优选50℃或更高，且更优选55℃或更高的Tm的双链核酸。
第一链和第二链优选能够在i)其长度的至少一部分，优选在其长度两者的至少15个核苷酸上，ii)在第一链的整个长度上，iii)在第二链的整个长度上，或iv)在第一链和第二链两者的整个长度上，形成双链体区域(即彼此互补)。链在一定的长度上是彼此互补的意指在该长度上，链能够经由沃森-克里克或摇摆碱基配对彼此碱基配对。只要在生理条件下可以形成稳定的双链核苷酸，该长度的每个核苷酸不一定必须能够在整个给定长度上与其在另一条链上的配对物碱基配对。然而，在某些实施方案中，如果该长度的每个核苷酸可以在整个给定长度上与其在另一条链上的配对物碱基配对，则它是优选的。
在第一链和靶序列之间或在第一链和第二链之间，一定数目的错配、缺失或插入在siRNA的背景下可以是容许的，并且在某些情况下甚至具有增加RNA干扰(例如抑制)活性的潜力。
根据本发明的核酸的抑制活性依赖第一链的全部或一部分与靶核酸的一部分之间的双链体区域形成。与第一链形成双链体区域的靶核酸的一部分(其定义为以第一链和靶序列之间形成的第一个碱基对开始，且以第一链和靶序列之间形成的最后一个碱基对结束，包含端点在内)是靶核酸序列或简单地靶序列。在第一链和第二链之间形成的双链体区域无需与在第一链和靶序列之间形成的双链体区域相同。即，第二链可以具有与靶序列不同的序列；然而，至少在生理条件下，第一链必须能够与第二链和靶序列两者形成双链体结构。
在第一链和靶序列之间的互补性可能是完全的(即，与靶序列相比，在第一链中100%的同一性，没有核苷酸错配或插入或缺失)。
在第一链和靶序列之间的互补性可能是不完全的。互补性可以为约70%至约100%。更具体而言，互补性可以为至少70%、80%、85%、90%或95%以及中间值。
在第一链和靶序列的互补序列之间的同一性的范围可以为约75%至约100%。更具体而言，互补性可以为至少75%、80%、85%、90%或95%以及中间值，条件是核酸能够减少或抑制补体组分C3的表达。
在第一链和靶序列之间具有小于100%互补性的核酸可能能够将补体组分C3的表达减少到与在第一链和靶序列之间具有完全互补性的核酸相同的水平。可替代地，它可能能够将补体组分C3的表达减少到由具有完全互补性的核酸所达到的减少水平15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的水平。
在一个方面，本公开内容的核酸是这样的核酸，其中
(a)第一链序列包含与表1的任何一个第一链序列相差不多于3个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列包含与该表的同一行中的第二链序列相差不多于3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列包含与表1的任何一个第一链序列相差不多于2个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列包含与该表的同一行中的第二链序列相差不多于2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列包含与表1的任何一个第一链序列相差不多于1个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列包含与该表的同一行中的第二链序列相差不多于1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列包含对应于从表1的任何一个第一链序列的5’端开始的核苷酸2至17的序列，并且任选地其中第二链序列包含对应于从该表的同一行中的第二链序列的5’端开始的核苷酸2至17的序列；
(e)第一链序列包含对应于从表1的任何一个第一链序列的5’端开始的核苷酸2至18的序列，并且任选地其中第二链序列包含对应于从该表的同一行中的第二链序列的5’端开始的核苷酸2至18的序列；
(f)第一链序列包含对应于从表1的任何一个第一链序列的5’端开始的核苷酸2至19的序列，并且任选地其中第二链序列包含对应于从该表的同一行中的第二链序列的5’端开始的核苷酸2至19的序列；
(g)第一链序列包含对应于从表1的任何一个第一链序列的5’端开始的核苷酸2至19的序列，并且任选地其中第二链序列包含对应于从该表的同一行中的第二链序列的5’端开始的核苷酸1至18的序列；
(h)第一链序列包含表1的任何一个第一链序列的序列，并且任选地其中第二链序列包含该表的同一行中的第二链序列的序列；或
(i)第一链序列由表1的任何一个第一链序列组成，并且任选地其中第二链序列由该表的同一行中的第二链序列的序列组成；
其中表1是：
表1
第一链序列(SEQ ID NO:) 第二链序列(SEQ ID NO:)
364 363或375
365 363
366 367或376
368 369
370 379或371，优选379
372 373
362 374
377 378
361 112
95 96
111 112
125 126
131 132
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11 12
13 14
15 16
17 18
19 20
21 22
23 24
25 26
27 28
29 30
31 32
33 34
35 36
37 38
39 40
41 42
43 44
45 46
47 48
49 50
51 52
53 54
55 56
57 58
59 60
61 62
63 64
65 66
67 68
69 70
71 72
73 74
75 76
77 78
79 80
81 82
83 84
85 86
87 88
89 90
91 92
93 94
97 98
99 100
101 102
103 104
105 106
107 108
109 110
113 114
115 116
117 118
119 120
121 122
123 124
127 128
129 130
133 134
416 26
在一个方面，核酸是这样的核酸，其中：
(a)第一链序列包含SEQ ID NO 361的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQID NO: 112的序列；或
(b)第一链序列包含SEQ ID NO 95的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQID NO: 96的序列；或
(c)第一链序列包含SEQ ID NO 111的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQID NO: 112的序列；或
(d)第一链序列包含SEQ ID NO 125的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQID NO: 126的序列；或
(e)第一链序列包含SEQ ID NO 131的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQID NO: 132的序列；或
(f)第一链序列由SEQ ID NO: 361组成，并且任选地其中第二链序列由SEQ IDNO: 112组成；或
(g)第一链序列由SEQ ID NO: 95组成，并且任选地其中第二链序列由SEQ ID NO:96组成；或
(h)第一链序列由SEQ ID NO: 111组成，并且任选地其中第二链序列由SEQ IDNO: 112组成；或
(i)第一链序列由SEQ ID NO: 125组成，并且任选地其中第二链序列由SEQ IDNO: 126组成；或
(j)第一链序列由SEQ ID NO: 131组成，并且任选地其中第二链序列由SEQ IDNO: 132组成；或
(k)第一链序列包含SEQ ID NO 364的序列或由SEQ ID NO 364的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 363或375的序列或者由SEQ ID NO: 363或375的序列组成；或
(l)第一链序列包含SEQ ID NO 365的序列或由SEQ ID NO 365的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 363的序列或由SEQ ID NO: 363的序列组成；或
(m)第一链序列包含SEQ ID NO 366的序列或由SEQ ID NO 366的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 367或376的序列或者由SEQ ID NO: 367或376的序列组成；或
(n)第一链序列包含SEQ ID NO 368的序列或由SEQ ID NO 368的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 369的序列或由SEQ ID NO: 369的序列组成；或
(o)第一链序列包含SEQ ID NO 370的序列或由SEQ ID NO 370的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 371或379优选379的序列或者由SEQ ID NO: 371或379优选379的序列组成；或
(p)第一链序列包含SEQ ID NO 372的序列或由SEQ ID NO 372的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 373或380的序列或者由SEQ ID NO: 373或380的序列组成；或
(q)第一链序列包含SEQ ID NO 362的序列或由SEQ ID NO 362的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 374的序列或由SEQ ID NO: 374的序列组成；或
(r)第一链序列包含SEQ ID NO 377的序列或由SEQ ID NO 377的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 378的序列或由SEQ ID NO: 378的序列组成；或
(s)第一链序列包含SEQ ID NO 416的序列或由SEQ ID NO 416的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 26的序列或由SEQ ID NO: 26的序列组成。
在一个方面，如果第一链的最5'核苷酸是除A或U外的核苷酸，则该核苷酸由A或U替换。优选地，如果第一链的最5'核苷酸是除U外的核苷酸，则该核苷酸由U替换，且更优选由具有5'乙烯基膦酸酯的U替换。
当本发明的核酸并不包含如例如表1中给出的参考第一链和/或第二链序列的整个序列，或者一条链或两条链与相应的参考序列相差一个、两个或三个核苷酸时，与包含整个第一链和第二链参考序列的相应核酸在可比较实验中的抑制活性相比，该核酸优选保留至少30%，更优选至少50%，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，还更优选至少95%，且最优选至少100%的C3抑制活性。
在一个方面，核酸是这样的核酸，其中第一链序列包含SEQ ID NO: 361的序列或优选由SEQ ID NO: 361的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 112的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 95的序列或优选由SEQ ID NO:95的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 96的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 111的序列或优选由SEQ ID NO: 111的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 112的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 125的序列或优选由SEQ ID NO: 125的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 126的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO:131的序列或优选由SEQ ID NO: 131的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ IDNO: 132的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 364的序列或优选由SEQ ID NO: 364的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 363或375的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 365的序列或优选由SEQ ID NO:365的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 363的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 366的序列或优选由SEQ ID NO: 366的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 367或376的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 368的序列或优选由SEQ ID NO: 368的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 369的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ IDNO: 370的序列或优选由SEQ ID NO: 370的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQID NO: 371或379优选379的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO:372的序列或优选由SEQ ID NO: 372的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ IDNO: 373或380的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 362的序列或优选由SEQ ID NO: 362的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 374的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 377的序列或优选由SEQ ID NO:377的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 378的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成；或者其中第一链序列包含SEQ ID NO: 416的序列或优选由SEQ ID NO: 416的序列组成，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 26的序列的至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的序列或由其组成。
在一个方面，核酸是优选在细胞中用于抑制C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一核酸链和第二核酸链，其中所述第一链能够在生理条件下与选自以下的核酸序列杂交：SEQ ID NO: 379、363、375、367、376、369、371、373、380、374、378、112、96、126、132、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、98、100、102、104、106、108、110、114、116、118、120、122、124、128、130或134；和
其中所述第二链能够在生理条件下与第一链杂交，以形成双链体区域。
能够在生理条件下杂交的核酸是这样的核酸，其能够在链中的相对核苷酸的至少一部分之间形成碱基对，优选沃森-克里克或摇摆碱基对，以便形成至少一个双链体区域。此类双链核酸优选在生理条件下(例如在PBS中，在37℃下，在每条链1 μM的浓度下)稳定的双链核酸，意指在此类条件下，两条链保持彼此杂交。双链核苷酸的Tm优选为45℃或更高，优选为50℃或更高，且更优选为55℃或更高。
本发明的一个方面涉及用于抑制补体组分C3表达的核酸，其中所述核酸包含与表5的任何序列相差不多于3个核苷酸，优选不多于2个核苷酸，更优选不多于1个核苷酸，且最优选不相差任何核苷酸的、至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的第一序列，所述第一序列能够在生理条件下与靶基因转录物(例如mRNA)杂交。优选地，核酸进一步包含与表5的任何序列相差不多于3个核苷酸，优选不多于2个核苷酸，更优选不多于1个核苷酸，且最优选不相差任何核苷酸的、至少15个，优选至少16个，更优选至少17个，还更优选至少18个，且最优选所有核苷酸的第二序列，所述第二序列能够在生理条件下与第一序列杂交，并且优选地所述核酸是能够经由RNAi途径抑制C3表达的siRNA。
一个方面涉及优选用于抑制补体组分C3表达的如表3中公开的任何双链核酸，条件是所述双链核酸能够抑制补体组分C3的表达。这些核酸全部是具有各种核苷酸修饰的siRNA。其中一些是包含GalNAc部分的缀合物，其可以特异性靶向具有GalNAc受体的细胞例如肝细胞。
一个方面涉及优选在细胞中能够抑制补体组分C3表达的双链核酸，其用作药物或者用于相关的诊断或治疗方法中，其中所述核酸优选包含第一链和第二链或由第一链和第二链组成，并且优选地其中所述第一链包含与补体组分C3 mRNA充分互补的序列，以便介导RNA干扰。
本文所述的核酸可能能够抑制补体组分C3的表达。抑制可以为完全的，即0%的剩余表达。C3表达的抑制可以为部分的，即它可以为在不存在本发明的核酸的情况下的C3表达水平的15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多或中间值的抑制。抑制水平可以通过将治疗的样品与未治疗的样品或用对照(例如并非靶向C3的siRNA)治疗的样品相比较进行测量。抑制可以通过测量C3 mRNA和/或蛋白质水平或者与C3的存在或活性相关联的生物标记物或指标的水平进行测量。抑制可以在已用本文所述的核酸在体外进行治疗的细胞中进行测量。可替代地或另外，抑制可以在已从先前用本文公开的核酸治疗的受试者中获取的细胞如肝细胞、或组织如肝组织、或器官如肝脏中，或者在体液如血液、血清、淋巴或者任何其它身体部位或流体中进行测量。优选地，C3表达的抑制通过以下进行确定：将在理想条件下(关于适当的浓度和条件，参见实施例)用本文公开的双链RNA的24或48小时体外治疗后在C3表达细胞中测量的C3 mRNA水平，与在相同条件下未治疗或模拟治疗或用对照双链RNA治疗的对照细胞中测量的C3 mRNA水平相比较。
本发明的一个方面涉及核酸，其中所述第一链和第二链存在于核酸的单链上，所述单链形成环，使得第一链和第二链能够彼此杂交，且从而形成具有双链体区域的双链核酸。
优选地，核酸的第一链和第二链是分开的链。两条分开的链优选各自为长度17-25个核苷酸，更优选为长度18-25个核苷酸。两条链可以具有相同或不同的长度。第一链的长度可以为17-25个核苷酸，优选地，它的长度可以为18-24个核苷酸，它的长度可以为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。最优选地，第一链的长度为19个核苷酸。第二链的长度可以独立地是17-25个核苷酸，优选地，它的长度可以为18-24个核苷酸，它的长度可以为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。更优选地，第二链的长度为18或19或20个核苷酸，且最优选地，它的长度为19个核苷酸。
优选地，核酸的第一链和第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。更优选地，双链体区域的长度为18-24个核苷酸。双链体区域的长度可以为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在最优选的实施方案中，双链体区域的长度为18或19个核苷酸。双链体区域在此处定义为在与第二链的核苷酸碱基配对的第一链的最5'核苷酸至与第二链的核苷酸碱基配对的第一链的最3'核苷酸之间，并且包括该最5'核苷酸和该最3'核苷酸的区域。双链体区域可以包含任一链或两条链中与另一条链中的核苷酸并非碱基配对的核苷酸。它可以包含在第一链和/或第二链上的一个、两个、三个或四个此类核苷酸。然而，优选地，双链体区域由17-25个连续的核苷酸碱基对组成。即，它优选包含在两条链上的17-25个连续的核苷酸，所述核苷酸全部与另一条链中的核苷酸碱基配对。更优选地，双链体区域由18或19个，最优选18个连续的核苷酸碱基对组成。
在本文公开的每个实施方案中，核酸可以在两端处是平端；具有在一端处的突出端和在另一端处的平端；或具有在两端处的突出端。
核酸可以具有在一端处的突出端和在另一端处的平端。核酸可以具有在两端处的突出端。核酸可以在两端处是平端。核酸可以在具有第一链的5’端和第二链的3’端的端部处，或在第一链的3’端和第二链的5’端处是平端。
核酸可以包含在3'或5’端处的突出端。核酸可以具有在第一链上的3'突出端。核酸可以具有在第二链上的3'突出端。核酸可以具有在第一链上的5'突出端。核酸可以具有在第二链上的5'突出端。核酸可以具有在第一链的5’端和3’端两者处的突出端。核酸可以具有在第二链的5’端和3’端两者处的突出端。核酸可以具有在第一链上的5'突出端和在第二链上的3'突出端。核酸可以具有在第一链上的3'突出端和在第二链上的5'突出端。核酸可以具有在第一链上的3'突出端和在第二链上的3'突出端。核酸可以具有在第一链上的5'突出端和在第二链上的5'突出端。
在第二链或第一链的3’端或5’端处的突出端的长度可以由1、2、3、4和5个核苷酸组成。任选地，突出端可以由1或2个核苷酸组成，所述核苷酸可以进行修饰或可以不进行修饰。
在一个实施方案中，第一链的5’端是具有一个、两个或三个核苷酸，优选一个核苷酸的单链突出端。
优选地，核酸是siRNA。siRNA是短干扰或短沉默RNA，其能够通过RNA干扰(RNAi)途径抑制靶基因的表达。抑制通过在转录后的靶基因的mRNA转录物的靶向降解而发生。siRNA形成RISC复合物的部分。RISC复合物通过第一(反义)链与靶序列的序列互补性而特异性靶向靶RNA。
优选地，核酸介导RNA干扰(RNAi)。优选地，核酸介导RNA干扰，其功效为至少50%的抑制，更优选至少70%，更优选至少80%，甚至更优选至少90%，还更优选至少95%且最优选100%的抑制。抑制功效优选通过在可比较实验中，将用C3特异性siRNA治疗的细胞如肝细胞中的C3 mRNA水平与用对照治疗的细胞中的C3 mRNA水平相比较进行测量。对照可以为用非C3靶向siRNA的治疗或不使用siRNA的治疗。因此，核酸或至少核酸的第一链优选能够掺入RISC复合物内。结果，核酸或至少核酸的第一链能够将RISC复合物引导到特异性靶RNA，所述核酸或至少核酸的第一链与所述特异性靶RNA是至少部分互补的。然后，RISC复合物特异性切割该靶RNA，并且结果导致RNA所来源的基因的表达抑制。
核酸修饰
本文讨论的核酸包括未修饰的RNA，以及已进行修饰例如以改善功效或稳定性的RNA。未修饰的RNA指这样的分子，其中核酸的组分，即糖、碱基和磷酸酯部分，与自然界中存在的，例如如在人体中天然存在的组分相同或基本上相同。如本文使用的，术语“修饰的核苷酸”指这样的核苷酸，其中所述核苷酸的一种或多种组分，即糖、碱基和磷酸酯部分，与自然界中存在的组分不同。在某些情况下，术语“修饰的核苷酸”也指在该术语的严格意义上并非核苷酸的分子，因为它们缺乏核苷酸的基本组分或具有核苷酸的基本组分的取代，所述核苷酸的基本组分例如糖、碱基或磷酸酯部分。包含此类修饰的核苷酸的核酸仍被理解为核酸，即使核酸的一个或多个核苷酸已由修饰的核苷酸替换，所述修饰的核苷酸缺乏核苷酸的基本组分或具有核苷酸的基本组分的取代。
本发明的核酸的修饰一般提供了在克服潜在局限性方面的有力工具，所述潜在局限性包括但不限于天然RNA分子固有的体外和体内稳定性和生物利用度。根据本发明的核酸可以通过化学修饰进行修饰。修饰的核酸还可以使在人中诱导干扰素活性的可能性降到最低。修饰可以进一步增强核酸对靶细胞的功能性递送。本发明的修饰的核酸可以包含第一链或第二链中任一或两者的一个或多个化学修饰的核糖核苷酸。核糖核苷酸可以包含碱基、糖或磷酸酯部分的化学修饰。核糖核酸可以通过用核酸或碱基的类似物的取代或插入进行修饰。
在本发明的说明书自始至终，“相同或共同的修饰”意指对任何核苷酸的相同修饰，所述任何核苷酸是用基团例如甲基(2’-OMe)或氟基(2’-F)修饰的A、G、C或U。例如，2´-F-dU、2´-F-dA、2´-F-dC、2´-F-dG全部视为相同或共同的修饰，2’-OMe-rU、2’-OMe-rA；2’-OMe-rC；2’-OMe-rG也是如此。相比之下，与2’-OMe修饰相比，2’-F修饰是不同的修饰。
优选地，核酸的第一链和/或第二链的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸，优选非天然存在的核苷酸，例如优选2’-F修饰的核苷酸。
修饰的核苷酸可以为具有糖基的修饰的核苷酸。2’羟基(OH)可以用许多不同的“氧基”或“脱氧”取代基进行修饰或替换。
“氧基”-2’羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R═H、烷基(如甲基)、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2’羟基例如通过亚甲基桥与相同核糖的4′碳连接；O-AMINE (AMINE=NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)nAMINE (例如AMINE=NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。
“脱氧”修饰包括氢、卤素、氨基(例如NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE (AMINE=NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、—NHC(O)R (R=烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)，氰基；巯基；烷基-硫代烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可以任选地由例如氨基官能团取代。某些实施方案的其它取代基包括2’-甲氧基乙基、2’-OCH3、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基和2’-氟。
糖基还可以含有一个或多个碳，其具有与核糖中的相应碳相反的立体化学构型。因此，修饰的核苷酸可以含有糖例如阿拉伯糖。
修饰的核苷酸还可以包括“脱碱基”糖，其缺乏在C - 1′处的核碱基。这些脱碱基糖可以进一步含有在一个或多个组成成分的糖原子处的修饰。
2’修饰可以与一个或多个磷酸酯核苷间接头修饰(例如，硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)组合使用。
本发明的核酸的一个或多个核苷酸可以是修饰的。核酸可以包含至少一个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可以在第一链中。修饰的核苷酸可以在第二链中。修饰的核苷酸可以在双链体区域中。修饰的核苷酸可以在双链体区域外，即在单链区域中。修饰的核苷酸可以在第一链上，并且可以在双链体区域外。修饰的核苷酸可以在第二链上，并且可以在双链体区域外。第一链的3’末端核苷酸可以为修饰的核苷酸。第二链的3’末端核苷酸可以为修饰的核苷酸。第一链的5’末端核苷酸可以为修饰的核苷酸。第二链的5’末端核苷酸可以为修饰的核苷酸。
本发明的核酸可以具有1个修饰的核苷酸，或者本发明的核酸可以具有约2-4个修饰的核苷酸，或者核酸可以具有约4-6个修饰的核苷酸、约6-8个修饰的核苷酸、约8-10个修饰的核苷酸、约10-12个修饰的核苷酸、约12-14个修饰的核苷酸、约14-16个修饰的核苷酸、约16-18个修饰的核苷酸、约18-20个修饰的核苷酸、约20-22个修饰的核苷酸、约22-24个修饰的核苷酸、约24-26个修饰的核苷酸或约26-28个修饰的核苷酸。在每种情况下，与不含所述修饰核苷酸的相同核酸相比，包含所述修饰核苷酸的核酸保留其活性的至少50%，或反之亦然。与不含所述修饰核苷酸的相同核酸相比，核酸可以保留其活性的55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%以及中间值，或者可以具有不含所述修饰核苷酸的相同核酸的活性的多于100%。
修饰的核苷酸可以为嘌呤或嘧啶。至少一半的嘌呤可以是修饰的。至少一半的嘧啶可以是修饰的。所有嘌呤都可以是修饰的。所有嘧啶都可以是修饰的。修饰的核苷酸可以选自以下：3’末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰的核苷酸、2’修饰的核苷酸、2’脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2’氨基修饰的核苷酸、2’烷基修饰的核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、包含5'-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物的核苷酸、以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
核酸可以包括包含修饰碱基的核苷酸，其中所述碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如5-溴尿苷)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、辫苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5'-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基辫苷、尿苷-5-氧基乙酸和2-硫代胞苷。
在本文中描述且在核酸内发生的许多修饰将在多核苷酸分子内重复，所述修饰例如碱基、或磷酸酯部分或磷酸酯部分的非连接O的修饰。在一些情况下，修饰将在多核苷酸中的所有可能的位置/核苷酸处发生，但在许多情况下，它将不发生。修饰可能仅在3’或5’末端位置处发生，可能仅在末端区域中，例如在末端核苷酸上的某个位置处或者在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中发生。修饰可能在双链区域、单链区域或两者中发生。修饰可能仅在本发明的核酸的双链区域中发生，或可能仅在本发明的核酸的单链区域中发生。在非连接O位置处的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰可能仅在一个或两个末端处发生，可能仅在末端区域中，例如在末端核苷酸上的某个位置处或者在链的最后2、3、4或5个核苷酸中发生，或者可能在双链体和/或单链区域中，特别是在末端处发生。5’端和/或3’端可能是磷酸化的。
可以通过在突出端中包括特定的碱基，或者通过在单链突出端中，例如在5’或3’突出端或两者中包括修饰的核苷酸，来增加本发明的核酸的稳定性。嘌呤核苷酸可以包括在突出端中。3’或5’突出端中的所有或一些碱基可以是修饰的。修饰可以包括使用在核糖的2’ OH基团处的修饰，使用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸，以及在磷酸基中的修饰例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰。突出端无需与靶序列同源。
核酸酶可以水解核酸磷酸二酯键。然而，对核酸的化学修饰可以赋予改善的性质，并且可以致使寡核糖核苷酸对核酸酶更稳定。
如本文使用的，修饰的核酸可以包括以下中的一种或多种：
(i)一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧(即使在本发明的核酸的5'和3’末端处，也被称为连接)的改变，例如替换；
(ii)核糖的组成成分，例如核糖上的2’羟基的改变，例如替换；
(iii)用“去磷酸”接头替换磷酸酯部分；
(iv)天然存在的碱基的修饰或替换；
(v)核糖-磷酸酯主链的替换或修饰；和
(vi)第一链和/或第二链的3’端或5’端的修饰，例如末端磷酸基的去除、修饰或替换，或者部分例如荧光标记的部分与一条链或两条链的3’或5’端的缀合。
术语替换、修饰和改变指示与天然存在的分子的差异。
具体的修饰在下文中更详细地讨论。
核酸可以包含在第二链和/或第一链上的修饰的一个或多个核苷酸。交替的核苷酸可以是修饰的，以形成修饰的核苷酸。
如本文所述的交替意指以规律方式一个接一个地发生。换言之，交替意指重复地依次发生。例如，如果一个核苷酸是修饰的，则下一个邻接核苷酸不是修饰的，并且接下来的邻接核苷酸是修饰的，依此类推。一个核苷酸可以用第一修饰进行修饰，下一个邻接核苷酸可以用第二修饰进行修饰，并且接下来的邻接核苷酸用第一修饰进行修饰，依此类推，其中所述第一修饰和第二修饰是不同的。
本发明的一些代表性的修饰的核酸序列显示于实例中。这些实例意欲是代表性而不是限制性的。
在核酸的一个方面，第一链的至少核苷酸2和14优选通过第一共同修饰进行修饰，所述核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。第一修饰优选为2’-F。
在一个方面，第一链的至少一个、几个或优选所有偶数编号的核苷酸优选通过第一共同修饰进行修饰，所述核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。第一修饰优选为2’-F。
在一个方面，第一链的至少一个、几个或优选所有奇数编号的核苷酸是修饰的，所述核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。优选地，它们通过第二修饰进行修饰。如果核酸还包含例如第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸的第一修饰，则该第二修饰优选与第一修饰不同。第一修饰优选在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯糖核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的2’核糖修饰可以例如为2’-F、2’-H、2’-卤素或2’-NH2。第二修饰优选在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可以例如为2’-OMe、2’-O-MOE (2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少到至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一修饰优选为2’-F，和/或第二修饰优选为2’-OMe。
在本公开内容的上下文中，取代基如2’核糖修饰的大小或体积优选测量为范德华体积(van der Waals volume)。
在一个方面，在对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或优选所有核苷酸优选通过第三修饰进行修饰。优选地，在同一核酸中，第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸用第一修饰进行修饰。另外或可替代地，第一链的奇数编号的核苷酸用第二修饰进行修饰。优选地，第三修饰与第一修饰不同和/或第三修饰与第二修饰相同。第一修饰优选在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯糖核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的2’核糖修饰可以例如为2’-F、2’-H、2’-卤素或2’-NH2。第二修饰和/或第三修饰优选在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可以例如为2’-OMe、2’-O-MOE (2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少到至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一修饰优选为2’-F，和/或第二修饰和/或第三修饰优选为2’-OMe。在第一链上的核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
第二链在例如对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中的核苷酸是与第一链的偶数编号的核苷酸碱基配对的第二链的核苷酸。
在一个方面，在对应于第一链的奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或优选所有核苷酸优选通过第四修饰进行修饰。优选地，在同一核酸中，第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸用第一修饰进行修饰。另外或可替代地，第一链的奇数编号的核苷酸用第二修饰进行修饰。另外或可替代地，在对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸都用第三修饰进行修饰。第四修饰优选与第二修饰不同，且优选与第三修饰不同，并且第四修饰优选与第一修饰相同。第一修饰和/或第四修饰优选在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯糖核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的2’核糖修饰可以例如为2’-F、2’-H、2’-卤素或2’-NH2。第二修饰和/或第三修饰优选在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可以例如为2’-OMe、2’-O-MOE (2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少到至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一修饰和/或第四修饰优选为2’-OMe修饰，和/或第二修饰和/或第三修饰优选为2’-F修饰。在第一链上的核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
在核酸的一个方面，在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中，第二链的一个或多个核苷酸通过第四修饰进行修饰。优选地，除在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中的一个或多个核苷酸外，第二链的所有核苷酸都通过第三修饰进行修饰。优选地，在同一核酸中，第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸用第一修饰进行修饰。另外或可替代地，第一链的奇数编号的核苷酸用第二修饰进行修饰。第四修饰优选与第二修饰不同，且优选与第三修饰不同，并且第四修饰优选与第一修饰相同。第一修饰和/或第四修饰优选在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯糖核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同的大小或相对更小的2’核糖修饰可以例如为2’-F、2’-H、2’-卤素或2’-NH2。第二修饰和/或第三修饰优选在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可以例如为2’-OMe、2’-O-MOE (2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少到至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一修饰和/或第四修饰优选为2’-OMe修饰，和/或第二修饰和/或第三修饰优选为2’-F修饰。在第一链上的核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
在核酸的一个方面，第一链的所有偶数编号的核苷酸都通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数编号的核苷酸都通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸都通过第三修饰进行修饰，在对应于第一链的奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸都通过第四修饰进行修饰，其中第一修饰和/或第四修饰是2’-F，和/或第二修饰和/或第三修饰是2’-OMe。
在核酸的一个方面，第一链的所有偶数编号的核苷酸都通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数编号的核苷酸都通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链的核苷酸11-13的位置中，第二链的所有核苷酸都通过第四修饰进行修饰，除对应于第一链的核苷酸11-13的核苷酸外，第二链的所有核苷酸都通过第三修饰进行修饰，其中第一修饰和第四修饰是2’-F，并且第二修饰和第三修饰是2’-OMe。在这方面的一个实施方案中，第二链的3'末端核苷酸是倒置的RNA核苷酸(即，该核苷酸通过其3'碳，而不是如通常的情况通过其5'碳与链的3’端连接)。当第二链的3'末端核苷酸是倒置的RNA核苷酸时，在它与天然核苷酸配对物相比并不包含任何修饰的意义上，倒置的RNA核苷酸优选为未修饰的核苷酸。具体地，倒置的RNA核苷酸优选为2’-OH核苷酸。优选地，在这方面，当第二链的3'末端核苷酸是倒置的RNA核苷酸时，核酸至少在包含第一链的5’端的端部处是平端。
本发明的一个方面是优选在细胞中用于抑制C3基因表达的如本文公开的核酸，其中所述第一链包括在多个位置处修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸，以便促进RISC对核酸的加工。
在一个方面，“促进RISC的加工”意指核酸可以通过RISC进行加工，例如，存在的任何修饰将允许核酸通过RISC进行加工，并且优选地，有益于通过RISC的加工，适当地使得siRNA活性可以发生。
如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸并未用2’ OMe修饰进行修饰，并且在第二链上对应于第一链的位置11或位置13或位置11和13或位置11、12和13的一个或多个核苷酸并未用2’-OMe修饰进行修饰(换言之，它们并未进行修饰或用除2’-OMe外的修饰进行修饰)。
在一个方面，在第二链上对应于第一链的位置13的核苷酸是与第一链的位置13(从5’端开始)形成碱基对的核苷酸。
在一个方面，在第二链上对应于第一链的位置11的核苷酸是与第一链的位置11(从5’端开始)形成碱基对的核苷酸。
在一个方面，在第二链上对应于第一链的位置12的核苷酸是与第一链的位置12(从5’端开始)形成碱基对的核苷酸。
例如，在双链且平端的19聚体核酸中，第一链的位置13 (从5’端开始)将与第二链的位置7 (从5’端开始)配对。第一链的位置11 (从5’端开始)将与第二链的位置9 (从5’端开始)配对。这一命名法可以应用于第二链的其它位置。
在一个方面，在第一链和第二链部分互补的情况下，在第二链上“对应于”第一链上的某个位置的核苷酸不一定形成碱基对，如果该位置是其中存在错配的位置，但命名法的原则仍适用。
一个方面是如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸并未用2’-OMe修饰进行修饰，并且在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2’-F修饰进行修饰。
一个方面是如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸用2’-F修饰进行修饰，并且在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸并未用2’-OMe修饰进行修饰。
一个方面是如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸用2’-F修饰进行修饰，并且在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸用2’-F修饰进行修饰。
一个方面是如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50%的核苷酸包含2’-OMe修饰，例如第一链和/或第二链的大于55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%或更多包含2’-OMe修饰，优选作为第一链和第二链两者的总核苷酸的百分比进行测量。
一个方面是如本文公开的核酸，其中第一链和/或第二链的大于50%的核苷酸包含天然存在的RNA修饰，例如其中第一链和/或第二链的大于55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%或更多包含此类修饰，优选作为第一链和第二链两者的总核苷酸的百分比进行测量。合适的天然存在的修饰包括除2’-OMe之外的其它2’糖修饰，特别是导致DNA核苷酸的2’-H修饰。
一个方面是如本文公开的核酸，其包含不多于20%，例如不多于15%，例如不多于10%的核苷酸，所述核苷酸在第一链和/或第二链上具有并非2’-OMe修饰的2’修饰，优选作为第一链和第二链两者的总核苷酸的百分比。
一个方面是如本文公开的核酸，其中在第一链和/或第二链中具有并非2’-OMe修饰的2’-修饰的核苷酸数目不多于7，更优选不多于5，且最优选不多于3。
一个方面是如本文公开的核酸，其包含在第一链和/或第二链上的不多于20% (例如不多于15%或不多于10%)的2’-F修饰，优选作为两条链的总核苷酸的百分比。
一个方面是如本文公开的核酸，其中在第一链和/或第二链中具有2’-F修饰的核苷酸数目不多于7，更优选不多于5，且最优选不多于3。
一个方面是如本文公开的核酸，其中所有核苷酸都用2’-OMe修饰进行修饰，除了从第一链的5’端开始的位置2和14，以及在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸之外。优选地，并未用2’-OMe进行修饰的核苷酸在2’位置处用氟进行修饰(2’-F修饰)。
优选的是如本文公开的核酸，其中所述核酸的所有核苷酸都在糖的2’位置处进行修饰。优选地，这些核苷酸用2’-F修饰进行修饰，其中所述修饰不是2’-OMe修饰。
在一个方面，核酸在第一链上用交替的2’-OMe修饰和2-F修饰进行修饰，并且位置2和14 (从5’端开始)用2’-F进行修饰。优选地，第二链在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的核苷酸处用2’-F修饰进行修饰。优选地，第二链在从互补(双链)区域的第一个位置处开始的3’端计算的位置11-13处用2’-F修饰进行修饰，并且剩余的修饰是天然存在的修饰，优选2’-OMe。至少在这种情况下，互补区从第二链的第一个位置处开始，所述第一个位置在第一链中具有相应核苷酸，不管这两个核苷酸是否能够彼此碱基配对。
在核酸的一个方面，第一链和第二链的每个核苷酸都是修饰的核苷酸。
如本文所述的，术语“奇数编号的”意指不可被2整除的编号。奇数编号的实例是1、3、5、7、9、11等等。如本文所述的，术语“偶数编号的”意指可被2整除的编号。偶数编号的实例是2、4、6、8、10、12、14等等。
除非另有特别说明，否则在本文中第一链的核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。第二链的核苷酸从在第二链的3’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
在第一链和/或第二链上的一个或多个核苷酸可以是修饰的，以形成修饰的核苷酸。第一链的一个或多个奇数编号的核苷酸可以是修饰的。第一链的一个或多个偶数编号的核苷酸可以通过至少第二修饰进行修饰，其中所述至少第二修饰与一个或多个奇数核苷酸上的修饰不同。一个或多个修饰的偶数编号的核苷酸中的至少一个可以与一个或多个修饰的奇数编号的核苷酸中的至少一个相邻。
第一链中的多个奇数编号的核苷酸在本发明的核酸中可以是修饰的。第一链中的多个偶数编号的核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。第一链可以包含通过共同修饰进行修饰的相邻核苷酸。第一链还可以包含通过不同的第二修饰进行修饰的相邻核苷酸(即第一链可以包含彼此相邻并且通过第一修饰进行修饰的核苷酸，以及彼此相邻并且通过与第一修饰不同的第二修饰进行修饰的其它核苷酸)。
第二链的一个或多个奇数编号的核苷酸(其中核苷酸从在第二链的3’端处的核苷酸编号1开始连续编号)可以通过与第一链上的奇数编号的核苷酸(其中核苷酸在从第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号)的修饰不同的修饰进行修饰，和/或第二链的一个或多个偶数编号的核苷酸可以通过第一链的奇数编号的核苷酸的相同修饰进行修饰。第二链的一个或多个修饰的偶数编号的核苷酸中的至少一个可以与一个或多个修饰的奇数编号的核苷酸相邻。第二链的多个奇数编号的核苷酸可以通过共同修饰进行修饰，和/或多个偶数编号的核苷酸可以通过存在于第一链的奇数编号的核苷酸上的相同修饰进行修饰。第二链上的多个奇数编号的核苷酸可以通过与第一链的奇数编号的核苷酸的修饰不同的修饰进行修饰。
第二链可以包含通过共同修饰进行修饰的相邻核苷酸，所述共同修饰可以为与第一链的奇数编号的核苷酸的修饰不同的修饰。
在本发明的核酸中，第一链中的每个奇数编号的核苷酸和第二链中的每个偶数编号的核苷酸可以用共同修饰进行修饰，并且每个偶数编号的核苷酸可以在第一链中用不同的修饰进行修饰，并且每个奇数编号的核苷酸可以在第二链中用不同的修饰进行修饰。
本发明的核酸可以具有相对于第二链的未修饰或不同修饰的核苷酸移位至少一个核苷酸的第一链的修饰的核苷酸。
一个或多个或每个奇数编号的核苷酸可以在第一链中进行修饰，并且一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可以在第二链中进行修饰。任一链或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可以在第一链中进行修饰，并且一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可以在第二链中进行修饰。任一链或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。一个或多个或每个奇数编号的核苷酸可以在第一链中进行修饰，并且一个或多个奇数编号的核苷酸可以在第二链中通过共同修饰进行修饰。任一链或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可以在第一链中进行修饰，并且一个或多个或每个奇数编号的核苷酸可以在第二链中通过共同修饰进行修饰。任一链或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可以通过第二修饰进行修饰。
本发明的核酸可以包含单链或双链构建体，其包含在一条链或两条链中的至少两个交替修饰的区域。这些交替区域可以包含至多约12个核苷酸，但优选包含约3至约10个核苷酸。交替核苷酸的区域可以定位于本发明的核酸的一条链或两条链的末端处。核酸可以包含在每个末端(3'和5')处的交替核苷酸的4至约10个核苷酸，并且这些区域可以由约5至约12个邻接的未修饰的或不同修饰的或共同修饰的核苷酸分开。
第一链的奇数编号的核苷酸可以是修饰的，并且偶数编号的核苷酸可以用第二修饰进行修饰。第二链可以包含用共同修饰进行修饰的相邻核苷酸，所述共同修饰可以与第一链的奇数编号的核苷酸的修饰相同。第二链的一个或多个核苷酸还可以用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以彼此相邻，并且与具有与第一链的奇数编号的核苷酸的修饰相同的修饰的核苷酸相邻。第一链还可以包含在3’端处和在5’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，或在3’端处的两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合。第二链可以包含在5’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。第二链还可以在5’端处与配体缀合。
本发明的核酸可以包括包含相邻核苷酸的第一链，所述相邻核苷酸用共同修饰进行修饰。一个或多个此类核苷酸可以与可以用第二修饰进行修饰的一个或多个核苷酸相邻。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以是相邻的。第二链可以包含用共同修饰进行修饰的相邻核苷酸，所述共同修饰可以与第一链的一个或多个核苷酸的修饰之一相同。第二链的一个或多个核苷酸还可以用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以是相邻的。第一链还可以包含在3’端处和在5’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，或在3’端处的两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合。第二链可以包含在3’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。第二链还可以在5’端处与配体缀合。
在第一链上从5'到3'以及在第二链上从3'到5'编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸可以通过第一链上的修饰进行修饰。编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可以通过第一链上的第二修饰进行修饰。编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可以通过第二链上的修饰进行修饰。编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可以通过第二链上的第二修饰进行修饰。为了本发明的核酸起见，核苷酸在第一链上从5'到3'进行编号，并且在第二链上从3'到5'进行编号。
编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可以通过第一链上的修饰进行修饰。编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可以通过第一链上的第二修饰进行修饰。编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可以通过第二链上的修饰进行修饰。编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可以通过第二链上的第二修饰进行修饰。
明确的是，如果第一链和/或第二链的长度短于25个核苷酸，例如长度为19个核苷酸，则不存在待修饰的编号为20、21、22、23、24和25的核苷酸。技术人员理解上文描述也相应地应用于更短的链。
第一链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与第二链上具有共同修饰的修饰的核苷酸配对。第一链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与第二链上具有不同修饰的修饰的核苷酸配对。第一链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与第二链上的未修饰的核苷酸配对。第二链上的一个或多个修饰的核苷酸可以与第一链上的未修饰的核苷酸配对。换言之，交替核苷酸可以在两条链上对齐，例如，第二链的交替区域中的所有修饰与第一链中的等同修饰配对，或可替代地，修饰可以偏移一个核苷酸，其中一条链的交替区域中的共同修饰与另一条链中的不同修饰(即第二修饰或进一步修饰)配对。另一个选项是在每条链中具有不同的修饰。
第一链上的修饰可以相对于第二链上的修饰的核苷酸移位一个核苷酸，使得共同修饰的核苷酸并不彼此配对。
一种或多种修饰可以各自且个别地选自3’末端脱氧胸腺嘧啶、2’-OMe、2’脱氧修饰、2’氨基修饰、2’烷基修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5'-硫代磷酸酯基团修饰、5'磷酸酯或5'磷酸酯模拟物修饰、以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰，和/或修饰的核苷酸可以为锁核苷酸、脱碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任何一种。
至少一种修饰可以为2’-Ome，和/或至少一种修饰可以为2’-F。如本文所述的进一步修饰可以存在于第一链和/或第二链上。
本发明的核酸可以包含在一个或几个链端部处的倒置的RNA核苷酸。此类倒置核苷酸对核酸提供稳定性。优选地，核酸包含在第一链和/或第二链的3’端处和/或在第二链的5’端处的至少一个倒置核苷酸。更优选地，核酸包含在第二链的3’端处的倒置核苷酸。最优选地，核酸包含在第二链的3’端处的倒置的RNA核苷酸，并且该核苷酸优选为倒置的A。倒置核苷酸是通过其3'碳而不是如通常的情况通过其5'碳与核酸的3’端连接的核苷酸，或者通过其5'碳而不是如通常的情况通过其3'碳与核酸的5’端连接的核苷酸。倒置核苷酸优选并非作为突出端，而是与另一条链中的相应核苷酸相对存在于一条链的端部处。相应地，核酸优选在包含倒置的RNA核苷酸的端部处是平端。存在于链的端部处的倒置的RNA核苷酸，优选意指在链的该端部处的最后一个核苷酸是倒置的RNA核苷酸。具有此类核苷酸的核酸是稳定且易于合成的。在它与天然核苷酸配对物相比并不包含任何修饰的意义上，倒置的RNA核苷酸优选为未修饰的核苷酸。具体地，倒置的RNA核苷酸优选为2’-OH核苷酸。
本发明的核酸可以包含在2’位置处用2’-H修饰的一个或多个核苷酸，并且因此在核酸内具有DNA核苷酸。本发明的核酸可以包含在从第一链的5’端开始计算的第一链的位置2和/或14处的DNA核苷酸。核酸可以包含在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的DNA核苷酸。
在一个方面，存在不多于一个DNA核苷酸/本发明的核酸。
本发明的核酸可以包含一个或多个LNA核苷酸。本发明的核酸可以包含在从第一链的5’端开始计算的第一链的位置2和/或14处的LNA核苷酸。核酸可以包含在第二链上对应于第一链的位置11、或13、或11和13、或11-13的LNA。
本发明的一些代表性的修饰的核酸序列显示于实例中。这些实例意欲是代表性而不是限制性的。
优选地，核酸可以包含第一修饰和第二修饰或进一步修饰，所述修饰各自且个别地选自2’-OMe修饰和2’-F修饰。核酸可以包含2’-OMe的修饰，所述2’-OMe可以为第一修饰，以及2’-F的第二修饰。本发明的核酸还可以包括硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰和/或脱氧修饰，其可以存在于每条链或两条链的每个端部或任何端部的末端2或3个核苷酸中或其间。
在核酸的一个方面，第一链和/或第二链的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸，其中如果第一链包含至少一个修饰的核苷酸，则：
(i)第一链的核苷酸2和14中的至少一个或两个通过第一修饰进行修饰；和/或
(ii)第一链的至少一个、几个或所有偶数编号的核苷酸通过第一修饰进行修饰；和/或
(iii)第一链的至少一个、几个或所有奇数编号的核苷酸通过第二修饰进行修饰；和/或
其中如果第二链包含至少一个修饰的核苷酸，则：
(iv)在对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第三修饰进行修饰；和/或
(v)在对应于第一链的奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第四修饰进行修饰；和/或
(vi)在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第四修饰进行修饰；和/或
(vii)在除对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置外的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第三修饰进行修饰；
其中所述第一链上的核苷酸从在第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号；
其中所述修饰优选为下述中的至少一种：
(a)第一修饰优选与第二修饰和第三修饰不同；
(b)第一修饰优选与第四修饰相同；
(c)第二修饰和第三修饰优选为相同修饰；
(d)第一修饰优选为2’-F修饰；
(e)第二修饰优选为2’-OMe修饰；
(f)第三修饰优选为2’-OMe修饰；和/或
(g)第四修饰优选为2’-F修饰；和
其中任选地所述核酸与配体缀合。
一个方面是优选在细胞中用于抑制C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列包含与以下序列中的任何一个相差不多于3个核苷酸的、至少15个核苷酸的序列：SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416，优选SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377或416，其中所述第一链的所有偶数编号的核苷酸都通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数编号的核苷酸都通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸都通过第三修饰进行修饰，在对应于第一链的奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸都通过第四修饰进行修饰，其中所述第一修饰和第四修饰是2’-F，并且所述第二修饰和第三修饰是2’-OMe。
一个方面是优选在细胞中用于抑制C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列包含与以下序列中的任何一个相差不多于3个核苷酸的、至少15个核苷酸的序列：SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416，优选SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377或416，其中所述第一链的所有偶数编号的核苷酸都通过第一修饰进行修饰，第一链的所有奇数编号的核苷酸都通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链的核苷酸11-13的位置中，第二链的所有核苷酸都通过第四修饰进行修饰，除对应于第一链的核苷酸11-13的核苷酸外，第二链的所有核苷酸都通过第三修饰进行修饰，其中第一修饰和第四修饰是2’-F，并且第二修饰和第三修饰是2’-OMe。
寡核苷酸的3’和5’端可以是修饰的。此类修饰可以在分子的3’端或5’端或两端处。它们可以包括整个末端磷酸酯或者磷酸基的一个或多个原子的修饰或替换。例如，寡核苷酸的3’和5’端可以与其它功能性分子实体缀合，所述功能性分子实体例如标记部分，例如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)、或保护基团(例如基于硫、硅、硼或酯)。功能性分子实体可以通过磷酸基和/或接头附着到糖。接头的末端原子可以连接到或替换磷酸基的连接原子或者糖的C-3’或C-5’ O、N、S或C基团。可替代地，接头可以连接到或替换核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。这些间隔物或接头可以包括例如—(CH2)n—、—(CH2)nN—、—(CH2)nO—、—(CH2)nS—、—(CH2CH2O)nCH2CH2O— (例如n=3或6)、脱碱基糖、酰胺、羧基、胺、氧胺、氧亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺或吗啉代、或生物素和荧光素试剂。3’端可以为—OH基。
末端修饰的其它实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、texaphyrin、Sapphyrin)、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶、EDTA、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、双氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如触角肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG (例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)。
末端修饰还可以用于监测分布，并且在这种情况下，待添加的基团可以包括荧光团，如荧光素或Alexa染料。末端修饰还可以用于增强摄取，关于这一点有用的修饰包括胆固醇。末端修饰还可以用于将RNA试剂与另一个部分交联。
末端修饰可以为了多种原因而添加，包括调节活性或调节对降解的抗性。可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物的5’端修饰。在第一链或第二链上，本发明的核酸可以为5’磷酸化的，或包括在5’末端处的磷酰基类似物。5’-磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些修饰。合适的修饰包括：5’-单磷酸酯((HO)2(O)P—O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)2(O)P—O—P(HO)(O)—O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)2(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化的) (7m-G-O-5’-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)，以及任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N—O-5’-(HO)(O)P—O—(HO)(O)P—O—P(HO)(O)—O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P—O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P—O-5’)，5’-硫代磷酸酯((HO)2(O)P—S-5’)；氧/硫替换的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何另外组合(例如5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯等)，5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P—NH-5’、(HO)(NH2)(O)P—O-5’)，5’-烷基膦酸酯(烷基=甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)—O-5’- (其中R是烷基)、(OH)2(O)P-5’-CH2-)、5'乙烯基膦酸酯、5’-烷基醚膦酸酯(烷基醚=甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)—O-5’- (其中R是烷基醚))。
某些部分可以连接到第一链或第二链的5’端。这些包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、包括2’-O烷基修饰的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分的修饰；倒置的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及其修饰，C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5’ OMe核苷酸；以及核苷酸类似物，包括4′,5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4′-硫代核苷酸，碳环核苷酸；5’-氨基烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯，3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环的3’,4′-开环核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸，5’-5’-倒置的脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；以及桥接或非桥接甲基膦酸酯和5’-巯基部分。
在本文描述的每个序列中，C末端的“–OH”部分可以取代C末端的“–NH2”部分，且反之亦然。
本发明还提供了根据本文所述的本发明的任何方面的核酸，其中所述第一链具有在其5’端处的末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。该末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。
核酸的第一链可以包含式(I)：
(vp)-N(po)[N(po)]n- (I)
其中‘(vp)-’是5’ (E)-乙烯基膦酸酯，‘N’是核苷酸，‘po’是磷酸二酯键合，并且n是1至(第一链中的核苷酸总数– 2)，优选地其中n是1至(第一链中的核苷酸总数- 3)，更优选地其中n是1至(第一链中的核苷酸总数- 4)。
优选地，末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是RNA核苷酸，优选(vp)-U。
末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸是这样的核苷酸，其中在5’端处的天然磷酸基已由E-乙烯基膦酸酯替换，其中5'磷酸化链的末端核苷酸的桥接5'-氧原子由甲炔基(-CH=)替换：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
5’ (E)-乙烯基膦酸酯是5'磷酸酯模拟物。生物模拟物是能够执行与被模拟的原始分子相同的功能且结构上非常相似的分子。在本发明的上下文中，5’ (E)-乙烯基膦酸酯模仿正常5'磷酸酯的功能，例如致使有效的RISC装载。另外，由于其轻微改变的结构，5’(E)乙烯基膦酸酯能够通过保护5’端核苷酸不受通过酶例如磷酸酶的去磷酸化而使其稳定。
在一个方面，第一链具有在其5’端处的末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，所述末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接，并且所述第一链包含a)多于一个磷酸二酯键合；b)在至少末端三个5'核苷酸之间的磷酸二酯键合，和/或c)在至少末端四个5'核苷酸之间的磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含在两个核苷酸之间的至少一个硫代磷酸酯(ps)键合和/或至少一个二硫代磷酸酯(ps2)键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含多于一个硫代磷酸酯键合和/或多于一个二硫代磷酸酯键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含在末端两个3'核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合、或者在末端三个3'核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。优选地，第一链和/或第二链中的其它核苷酸之间的键合是磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含在末端两个5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合或在末端三个5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合。
在一个方面，本发明的核酸包含在第一链和/或第二链的一个或多个末端端部上的一个或多个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰。任选地，第一链的每一端或任一端可以包含一个或两个或三个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰的核苷酸(核苷间键合)。任选地，第二链的每一端或任一端可以包含一个或两个或三个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰的核苷酸(核苷间键合)。
在一个方面，核酸包含在第一链和/或第二链的末端两个或三个3'核苷酸和/或5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合。优选地，核酸包含在第一链和第二链的末端三个3'核苷酸和末端三个5'核苷酸各自之间的硫代磷酸酯键合。优选地，在第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合都是磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸包含在第一链的3’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，和/或包含在第二链的3’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，和/或在第二链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在第一链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸之间的除二硫代磷酸酯键合外的键合。
在一个方面，核酸包含在第一链和第二链的末端三个3'核苷酸和末端三个5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合。优选地，在第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合都是磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸：
(i)具有在第一链的末端三个3'核苷酸和末端三个5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合；
(ii)与在第二链的3’端核苷酸或5’端核苷酸上的三触角配体缀合；
(iii)具有在与缀合到三触角配体的端部相反的端部处，第二链的末端三个核苷酸之间的硫代磷酸酯键合；和
(iv)任选地，在第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合都是磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸：
(i)具有在第一链的5’端处的末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；
(ii)具有在第一链和第二链上的末端三个3'核苷酸之间以及在第二链上的末端三个5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，或者它具有在第一链和第二链上的末端两个3'核苷酸之间以及在第二链上的末端两个5'核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合；和
(iii)任选地，在第一链和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合都是磷酸二酯键合。
在本发明的核酸中的二硫代磷酸酯键合的使用，与在该同一位置中包含硫代磷酸酯的分子相比，减少了核酸分子群体的立体化学变化。硫代磷酸酯键合引入手性中心，并且难以控制哪一个非连接氧取代硫。二硫代磷酸酯的使用确保该键合中不存在手性中心，并且因此减少或消除核酸分子群体中的任何变化，这取决于核酸分子中使用的二硫代磷酸酯和硫代磷酸酯键合的数目。
在一个方面，核酸包含在第一链的3’端处的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合、以及在第二链的3’端处的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合、以及在第二链的5’端处的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在第一链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸之间的除二硫代磷酸酯键合外的键合。优选地，第一链具有在其5’端处的末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。该末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。优选地，除在第一链的3’端处的两个末端核苷酸之间的键合、以及在第二链的3’端和5’端处的两个末端核苷酸之间的键合外，两条链的核苷酸之间的所有键合都是磷酸二酯键合。
在一个方面，当在该端部处不存在二硫代磷酸酯键合时，核酸包含在第一链上的三个末端3'核苷酸各自之间和/或在三个末端5'核苷酸各自之间、和/或在第二链的三个末端3'核苷酸各自之间和/或在三个末端5'核苷酸各自之间的硫代磷酸酯键合。在端部处不存在二硫代磷酸酯键合意指在所讨论的核酸端部的两个末端核苷酸之间，或优选在三个末端核苷酸之间的键合是除二硫代磷酸酯键合外的键合。
在一个方面，除在第一链的3’端处的两个末端核苷酸之间的键合、以及在第二链的3’端和5’端处的两个末端核苷酸之间的键合外，核酸在两条链的核苷酸之间的所有键合都是磷酸二酯键合。
其它磷酸酯接头修饰是可能的。
磷酸酯接头还可以通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换连接氧进行修饰。替换可以在末端氧处发生。用氮替换非连接氧是可能的。
磷酸基还可以个别地由不含磷的连接物替换。
可以替换磷酸基的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基肼、亚甲基二甲基肼和亚甲基氧甲基亚氨基。在某些实施方案中，替换可以包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
磷酸酯接头和核糖可以由核酸酶抗性核苷酸替换。实例包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。在某些实施方案中，可以使用PNA替代物。
在一个方面，优选为siRNA (其优选经由RNAi且优选在细胞中抑制补体组分C3的表达)的核酸包含以下中的一种或多种或全部：
(i)修饰的核苷酸；
(ii)在从第一链的5’端开始的位置2和14处，除2’-OMe修饰的核苷酸外的修饰的核苷酸，优选2’-F修饰的核苷酸；
(iii)如在第一链的5’端处从一开始编号的第一链的每个奇数编号的核苷酸是2’-OMe修饰核苷酸；
(iv)如在第一链的5’端处从一开始编号的第一链的每个偶数编号的核苷酸是2’-F修饰核苷酸；
(v)对应于第一链的位置11和/或13或11-13的第二链核苷酸通过除2’-OMe修饰外的修饰进行修饰，优选地其中这些位置中的一个或两个或全部包含2’-F修饰；
(vi)在第二链的3’端处的倒置核苷酸，优选3’-3’键合；
(vii)一个或多个硫代磷酸酯键合；
(viii)一个或多个二硫代磷酸酯键合；和/或
(ix)第一链具有在其5’端处的末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，在这种情况下，所述末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选为尿苷，并且优选通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。
核酸的所有特征都可以与本文公开的本发明的所有其它方面组合。
配体
本发明的核酸可以与配体缀合。寡核苷酸，特别是本发明的双链核酸，有效递送至体内细胞是重要的，并且需要特异性靶向以及不受细胞外环境，特别是血清蛋白影响的基本保护。实现特异性靶向的一种方法是将配体与核酸缀合。在一些实施方案中，配体帮助将核酸靶向靶细胞，所述靶细胞具有与缀合配体结合并使其内化的细胞表面受体。在此类实施方案中，需要缀合对于所需受体分子的适当配体，以便使缀合分子通过机制例如不同受体介导的内吞作用途径或功能上类似的过程由靶细胞吸收。在其它实施方案中，可以通过除受体介导的内吞作用外的机制介导核酸内化到靶细胞内的配体，可以可替代地与本发明的核酸缀合用于细胞或组织特异性靶向。
介导受体介导的内吞作用的缀合物的一个实例是去唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)，其对本文所述的GalNAc部分具有高亲和力。ASGP-R复合物由不同比率的膜ASGR1和ASGR2受体的多聚体组成，所述受体在肝细胞上是高度丰富的。三触角簇糖苷作为缀合配体使用的首个公开内容之一是在美国专利号US 5,885,968中。具有三个GalNAc配体并包含磷酸基的缀合物是已知的，并且在Dubber等人(Bioconjug. Chem. 2003 Jan-Feb；14 (1):239-46.)中进行描述。ASGP-R复合物对于N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)显示的亲和力是D-Gal的50倍。
ASGP-R复合物特异性识别糖基化蛋白质或其它寡糖的末端β-半乳糖基亚基(Weigel，P.H.等人，Biochim. Biophys. Acta. 2002年9月19日；1572(2-3):341-63)，并且可以通过半乳糖或半乳糖胺与原料药的共价偶联，用于将药物递送到肝脏的表达受体复合物的肝细胞(Ishibashi,S.；等人，J Biol. Chem. 1994年11月11日；269(45):27803-6)。此外，结合亲和力可以通过多价效应得到显著增加，所述多价效应通过靶向部分的重复来实现(Biessen EA等人，J Med Chem. 1995年4月28日；38(9):1538-46)。
ASGP-R复合物是含有末端β-半乳糖基的糖蛋白主动摄取到细胞的内体的介质。因此，ASGPR高度适合于与此类配体缀合的药物候选物如例如核酸靶向递送到表达受体的细胞内(Akinc等人，Mol Ther. 2010年7月；18(7):1357-64)。
更一般地，配体可以包含糖，其选择为对于靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。特别地，受体在哺乳动物肝脏细胞的表面上，例如，之前描述的肝脏无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)。
糖可以选自N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和岩藻糖。糖可以为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
因此，用于本发明中的配体可以包含(i)一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分及其衍生物，以及(ii)接头，其中所述接头将GalNAc部分与如任何先前方面定义的核酸缀合。接头可以为单价结构或者二价或三价或四价分支结构。核苷酸可以如本文定义的进行修饰。
因此，配体可以包含GalNAc。
在一个方面，核酸与包含式(II)的化合物的配体缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
其中：
S代表糖，优选地其中所述糖是N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；
X2是亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n = 1- 6；
A是分支单元；
X3代表桥接单元；
其中根据本发明的核酸经由磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯与X3缀合。
在式(II)中，分支单元“A”优选分支成三个，以便容纳三个糖配体。分支单元优选与配体的剩余栓系部分和核酸共价附着。分支单元可以包括包含选自烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基的分支脂肪族基团。分支单元可以包含选自烷基和醚基的基团。
分支单元A可以具有选自以下的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
和
Figure DEST_PATH_IMAGE003
其中每个A1独立地代表O、S、C=O或NH；并且每个n独立地代表1至20的整数。
分支单元可以具有选自以下的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
和
Figure DEST_PATH_IMAGE005
其中每个A1独立地代表O、S、C=O或NH；并且每个n独立地代表1至20的整数。
分支单元可以具有选自以下的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE006
和
Figure DEST_PATH_IMAGE007
其中A1是O、S、C=O或NH；并且每个n独立地代表1至20的整数。
分支单元可以具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE008
。
分支单元可以具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE009
。
分支单元可以具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE010
。
可替代地，分支单元A可以具有选自以下的结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE011
其中：
R1是氢或C1-C10亚烷基；
并且R2是C1-C10亚烷基。
任选地，分支单元仅由一个碳原子组成。
“X3”部分是桥接单元。桥接单元是线性的，并且与分支单元和核酸共价结合。
X3可以选自-C1-C20亚烷基-、-C2-C20亚烯基-、式-(C1-C20亚烷基)–O–(C1-C20亚烷基)-的亚烷基醚、-C(O)-C1-C20亚烷基-、-C0-C4亚烷基(Cy)C0-C4亚烷基-(其中Cy代表取代或未取代的5或6元环亚烷基、亚芳基、亚杂环基或亚杂芳基环)、-C1-C4亚烷基-NHC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)NH-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-SC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)S-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-OC(O)-C1-C4亚烷基-、-C1-C4亚烷基-C(O)O-C1-C4亚烷基-和-C1-C6亚烷基-S-S-C1-C6亚烷基-。
X3可以为式-(C1-C20亚烷基)–O–(C1-C20亚烷基)-的亚烷基醚。X3可以为式-(C1-C20亚烷基)–O–(C4-C20亚烷基)-的亚烷基醚，其中所述(C4-C20亚烷基)与Z连接。X3可以选自-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，尤其是-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，其中在每种情况下，-CH2-基团与A连接。
在一个方面，核酸缀合到包含式(III)的化合物的配体：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
其中
S代表糖，优选GalNAc；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；
X2是C1-C8亚烷基；
A是选自以下的分支单元：
Figure DEST_PATH_IMAGE012
X3是桥接单元；
其中根据本发明的核酸经由磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯与X3缀合。
分支单元A可以具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE013
。
分支单元A可以具有以下结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE014
，其中X3与氮原子附着。
X3可以为C1-C20亚烷基。优选地，X3选自-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-，尤其是-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-。
在一个方面，核酸与包含式(IV)的化合物的配体缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (IV)
其中：
S代表糖，优选GalNAc；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；
X2是式-C3H6-O-CH2-的亚烷基醚；
A是分支单元；
X3是具有选自-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-的式的亚烷基醚，其中在每种情况下，-CH2-基团与A连接，
并且其中X3通过磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯与根据本发明的核酸缀合。
分支单元可以包含碳。优选地，分支单元是碳。
X3可以选自-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-。优选地，X3选自-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16。
X1可以为(-CH2-CH2-O)(-CH2)2-。X1可以为(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。X1可以为(-CH2-CH2-O)3 (-CH2)2-。优选地，X1是(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。可替代地，X1代表C3-C6亚烷基。X1可以为亚丙基。X1可以为亚丁基。X1可以为亚戊基。X1可以为亚己基。优选地，烷基是线性亚烷基。特别地，X1可以为亚丁基。
X2代表式-C3H6-O-CH2-的亚烷基醚，即C3烷氧基亚甲基或–CH2CH2CH2OCH2-。
对于上述任何方面，当P代表修饰的磷酸基时，P可以由以下表示：
Figure DEST_PATH_IMAGE015
其中Y1和Y2各自独立地代表=O、=S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx和–ORx，其中Rx代表C1-C6烷基，其中
Figure DEST_PATH_IMAGE016
指示附着到化合物的剩余部分。
修饰的磷酸酯意指其中一个或多个非连接氧被替换的磷酸基。修饰的磷酸酯的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸基、硼烷磷酸酯、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有由硫替换的两个非连接氧。磷酸基中的一个、每个或两个非连接氧可以独立地是S、Se、B、C、H、N或OR (R是烷基或芳基)中的任何一个。
磷酸酯还可以通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换连接氧进行修饰。替换可以在末端氧处发生。用氮替换非连接氧是可能的。
例如，Y1可以代表-OH，且Y2可以代表=O或=S；或
Y1可以代表-O-，且Y2可以代表=O或=S。
Y1可以代表=O，且Y2可以代表–CH3、-SH、-ORx或–BH3
Y1可以代表=S，且Y2可以代表–CH3、ORx或–SH。
技术人员应理解，在某些情况下，在Y1和Y2之间存在离域。
优选地，修饰的磷酸基是硫代磷酸酯基团。硫代磷酸酯基团包括二硫代磷酸酯(即其中Y1代表=S且Y2代表–S-)和单硫代磷酸酯(即其中Y1代表-O-且Y2代表=S，或其中Y1代表=O且Y2代表–S-)。优选地，P是单硫代磷酸酯。本发明人已发现，具有硫代磷酸酯基团替换磷酸基的缀合物具有在体内改善的效力和持续时间。
P还可以为乙基磷酸酯(即其中Y1代表=O且Y2代表OCH2CH3)。
糖可以选择为对于靶细胞上的至少一种类型的受体具有亲和力。特别地，受体在哺乳动物肝脏细胞的表面上，例如肝脏无唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)。
对于上文或下文的任何方面，糖可以选自具有半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和果糖中的一种或多种的N-乙酰。通常，待用于本发明中的配体可以包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。优选地，本发明的化合物可以具有3个配体，其各自优选包括N-乙酰半乳糖胺。
"GalNAc"指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常被称为N-乙酰半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰半乳糖胺”包括β-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖。在某些实施方案中，β-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可以互换使用。优选地，本发明的化合物包含β-形式，2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖。
Figure DEST_PATH_IMAGE017
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
Figure DEST_PATH_IMAGE018
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
Figure DEST_PATH_IMAGE019
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
在一个方面，核酸是缀合核酸，其中所述核酸与具有下述结构之一的三触角配体缀合：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
Figure DEST_PATH_IMAGE021
Figure DEST_PATH_IMAGE022
Figure DEST_PATH_IMAGE023
Figure DEST_PATH_IMAGE024
其中Z是如本文定义的任何核酸。
优选地，核酸是缀合核酸，其中所述核酸与具有下述结构的三触角配体缀合：
Figure DEST_PATH_IMAGE025
其中Z是如本文定义的任何核酸。
式(II)、(III)或(IV)的配体或者本文公开的任何一种三触角配体可以在第一(反义)链的3’端处和/或在第二(有义)链的3'和/或5’端中任一个处附着。核酸可以包含多于一个式(II)、(III)或(IV)的配体或者本文公开的任何一种三触角配体。然而，式(II)、(III)或(IV)的单一配体或者本文公开的任何一种三触角配体是优选的，因为单一此类配体足以将核酸有效靶向靶细胞。优选地，在这种情况下，在配体与之附着的核酸端部处的至少最后两个，优选至少最后三个，且更优选至少最后四个核苷酸通过磷酸二酯键合进行连接。
优选地，第一(反义)链的5’端并未附着到式(II)、(III)或(IV)的配体或者本文公开的任何一种三触角配体，因为在这个位置中的配体可以潜在地干扰核酸的生物活性。
在链的5’端处具有式(II)、(III)或(IV)的单一配体或者本文公开的任何一种三触角配体的核酸比在3’端处具有相同配体的相同核酸更容易合成，且因此更便宜。因此，优选地，将式(II)、(III)或(IV)中任一个的配体或者本文公开的任何一种三触角配体与核酸的第二链的5’端共价附着(与之缀合)。
在一个方面，核酸的第一链是式(V)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE026
(V)
其中b优选为0或1；和
第二链是式(VI)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE027
(VI)；
其中：
c和d独立地优选为0或1；
Z1和Z2分别为核酸的第一链和第二链；
Y独立地是O或S；
n独立地是0、1、2或3；和
L1是配体与之附着的接头，其中L1在式(V)和(VI)中是相同或不同的，并且当L1在同一式内出现多于一次时，在式(V)和(VI)内是相同或不同的，其中L1优选具有式(VII)；
并且其中b + c + d优选为2或3。
优选地，式(V)和(VI)中的L1具有式(VII)：
Figure DEST_PATH_IMAGE028
(VII)
其中：
L选自包含以下或优选由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r = 2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s = 1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；和
其中如果存在的话，则末端C(O)附着到式(VII)的X，或者如果X不存在，则附着到式(VII)的W1，或者如果W1不存在，则附着到式(VII)的V；
W1、W3和W5个别地不存在，或者选自包含以下或优选由以下组成的组：
-(CH2)r-，其中r = 1-7；
-(CH2)s-O-(CH2)s-，其中s独立地是0-5；
-(CH2)t-S-(CH2)t-，其中t独立地是0-5；
X不存在或者选自包含以下或优选由以下组成的组：NH、NCH3或NC2H5；
V选自包含以下或优选由以下组成的组：
CH、N,
Figure DEST_PATH_IMAGE029
、
Figure DEST_PATH_IMAGE030
、
Figure DEST_PATH_IMAGE031
、
Figure DEST_PATH_IMAGE032
或
Figure DEST_PATH_IMAGE033
；
其中如果存在的话，则B是修饰的或天然的核碱基。
在一个方面，第一链是式(VIII)的化合物
Figure DEST_PATH_IMAGE034
(VIII)
其中b优选为0或1；和
第二链是式(IX)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE035
(IX)；
其中c和d独立地优选为0或1；
其中：
Z1和Z2分别为核酸的第一链和第二链；
Y独立地是O或S；
R1是H或甲基；
n独立地优选为0、1、2或3；和
L在式(VIII)和(IX)中是相同或不同的，并且当L在同一式内出现多于一次时，在式(VIII)和(IX)中是相同或不同的，并且选自包含以下或优选由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r = 2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s = 1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；和
其中如果存在的话，则末端C(O)附着到(接头的，而不是靶向配体的) NH基团；
并且其中b + c + d优选为2或3。
在一个方面，核酸的第一链是式(X)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE036
(X)
其中b优选为0或1；和
第二链是式(XI)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE037
(XI)；
其中：
c和d独立地优选为0或1；
Z1和Z2分别为核酸的第一RNA链和第二RNA链；
Y独立地是O或S；
n独立地优选为0、1、2或3；和
L2在式(X)和(XI)中是相同或不同的，并且在通过b、c和d括起来的部分中是相同或不同的，并且选自包含以下或优选由以下组成的组：
Figure DEST_PATH_IMAGE038
；
Figure DEST_PATH_IMAGE039
；和
Figure DEST_PATH_IMAGE040
；或
N是0且L2是：
Figure DEST_PATH_IMAGE041
且末端OH基团不存在，使得形成下述部分：
Figure DEST_PATH_IMAGE042
；
其中：
F是饱和的分支或未分支(例如未分支)的C1-8烷基(例如C1-6烷基)链，其中碳原子之一任选地由氧原子替换，条件是所述氧原子与另一个杂原子(例如O或N原子)通过至少2个碳原子分开；
L在式(X)和(XI)中是相同或不同的，并且选自包含以下或优选由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r = 2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s = 1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；和
其中如果存在的话，则末端C(O)附着到(接头的，而不是靶向配体的) NH基团；
并且其中b + c + d优选为2或3。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的任何核酸中，b是0，c是1且d是1；b是1，c是0且d是1；b是1，c是1且d是0；或者b是1，c是1且d是1。优选地，b是0，c是1且d是1；b是1，c是0且d是1；或者b是1，c是1且d是1。最优选地，b是0，c是1且d是1。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的任何核酸中，Y是O。在另一个方面，Y是S。在一个优选方面，Y在式的不同位置中独立地选自O或S。
在一个方面，在式(VIII)和(IX)的任何核酸中，R1是H或甲基。在一个方面，R1是H，在另一个方面，R1是甲基。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的任何核酸中，n是0、1、2或3。优选地，n是0。
在式(X)和(XI)的任何核酸中，F部分的实例包括(CH2)1-6例如(CH2)1-4例如CH2、(CH2)4、(CH2)5或(CH2)6，或CH2O(CH2)2-3例如CH2O(CH2)CH3。
在一个方面，式(X)和(XI)中的L2是：
Figure DEST_PATH_IMAGE043
。
在一个方面，L2是：
Figure DEST_PATH_IMAGE044
。
在一个方面，L2是：
Figure DEST_PATH_IMAGE045
。
在一个方面，L2是：
Figure DEST_PATH_IMAGE046
。
在一个方面，n是0且L2是：
Figure DEST_PATH_IMAGE047
且末端OH基团不存在，使得形成下述部分：
Figure DEST_PATH_IMAGE048
；
其中Y是O或S。
在一个方面，式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的核酸中的L选自包含以下或优选由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r = 2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s = 1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地是1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地是1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v是2-12；
其中末端C(O)附着到NH基团。
优选地，L是-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12，更优选r＝2-6，甚至更优选r＝4或6例如4。
优选地，L是：
Figure DEST_PATH_IMAGE049
。
在由b、c和d括起来的部分内，式(X)和(XI)的核酸中的L2通常是相同的。在由b、c和d括起来的部分之间，L2可能是相同或不同的。在一个实施方案中，由c括起来的部分中的L2与由d括起来的部分中的L2是相同的。在一个实施方案中，由c括起来的部分中的L2与由d括起来的部分中的L2是不同的。在一个实施方案中，例如当接头部分是丝氨醇衍生的接头部分时，由b、c和d括起来的部分中的L2是相同的。
丝氨醇衍生的接头部分可以基于以任何立体化学的丝氨醇，即衍生自L-丝氨酸异构体、D-丝氨酸异构体、外消旋丝氨酸或异构体的其它组合。在本发明的一个优选方面，丝氨醇-GalNAc部分(SerGN)具有下述立体化学：
Figure DEST_PATH_IMAGE050
即基于衍生自L-丝氨酸异构体的(S)-丝氨醇-amidite或(S)-丝氨醇琥珀酸酯固体支持的构件单元。
在一个优选方面，核酸的第一链是式(VIII)的化合物，且核酸的第二链是式(IX)的化合物，其中：
b是0；
c和d是1，
n是0，
Z1和Z2分别为核酸的第一链和第二链，
Y是S，
R1是H，和
L是-(CH2)4-C(O)-，其中L的末端C(O)附着到接头的N原子(即不是靶向配体的可能N原子)。
在另一个优选方面，核酸的第一链是式(V)的化合物，且核酸的第二链是式(VI)的化合物，其中：
b是0，
c和d是1，
n是0，
Z1和Z2分别为核酸的第一链和第二链，
Y是S，
L1是式(VII)，其中：
W1是-CH2-O-(CH2)3-，
W3是-CH2-，
W5不存在，
V是CH，
X是NH，和
L是-(CH2)4-C(O)-，其中L的末端C(O)附着到式(VII)中的X的N原子。
在另一个优选方面，核酸的第一链是式(V)的化合物，且核酸的第二链是式(VI)的化合物，其中：
b是0，
c和d是1，
n是0，
Z1和Z2分别为核酸的第一链和第二链，
Y是S，
L1是式(VII)，其中：
W1、W3和W5不存在，
V是
Figure DEST_PATH_IMAGE051
，
X不存在，和
L是-(CH2)4-C(O)-NH-(CH2)5-C(O)-，其中L的末端C(O)附着到式(VII)中的V的N原子。
在一个方面，核酸与具有下述结构的三触角配体缀合：
Figure DEST_PATH_IMAGE052
其中核酸经由配体的磷酸基与配体缀合，所述配体缀合至a)在第二链的5’端处的最后一个核苷酸；b)在第二链的3’端处的最后一个核苷酸；或c)在第一链的3’端处的最后一个核苷酸。
在核酸的一个方面，具有配体的核酸靶向的细胞是肝细胞。
在其中存在GalNAc的上文配体的任何一种中，GalNAc可以取代任何其它靶向配体，例如本文提到的那些配体，特别是甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和岩藻糖。
一个特别优选的实施方案是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 409或由SEQ ID NO: 409组成，并且所述第二链任选地包含SEQ ID NO: 423或由SEQ ID NO: 423组成。这种核酸可以进一步与配体缀合。甚至更优选的是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 409或由SEQ ID NO: 409组成，并且所述第二链任选地包含SEQ ID NO: 410或由SEQ ID NO: 410组成。最优选的是由SEQ ID NO: 409和SEQ ID NO: 410组成的siRNA。本发明的一个方面是EJ0020。
一个替代的特别优选的实施方案是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO:420或由SEQ ID NO: 420组成，并且所述第二链任选地包含SEQ ID NO: 424或由SEQ IDNO: 424组成。这种核酸可以进一步与配体缀合。甚至更优选的是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 420或由SEQ ID NO: 420组成，并且所述第二链任选地包含SEQ IDNO: 421或由SEQ ID NO: 421组成。最优选的是由SEQ ID NO: 420和SEQ ID NO: 421组成的siRNA。本发明的一个方面是EV0212。
一个替代的特别优选的实施方案是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO:417或由SEQ ID NO: 417组成，并且所述第二链任选地包含SEQ ID NO: 425或由SEQ IDNO: 425组成。这种核酸可以进一步与配体缀合。甚至更优选的是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 417或由SEQ ID NO: 417组成，并且所述第二链任选地包含SEQ IDNO: 418或由SEQ ID NO: 418组成。最优选的是由SEQ ID NO: 417和SEQ ID NO: 418组成的siRNA。本发明的一个方面是EV0210。初步的NHP数据显示，这种siRNA在高等物种体内是惊人地有效力的。
在一个方面，核酸与包含脂质的配体，且更优选包含胆固醇的配体缀合。
组合物、用途和方法
本发明还提供了包含本发明的核酸的组合物。核酸和组合物可以单独或与其它试剂组合用作药物或诊断剂。例如，本发明的一种或多种核酸可以与递送媒介物(例如脂质体)和/或赋形剂例如载体、稀释剂组合。还可以添加其它试剂例如防腐剂和稳定剂。本发明的任何核酸的药学上可接受的盐或溶剂化物同样在本发明的范围内。用于核酸递送的方法是本领域已知的，并且在本领域技术人员的知识内。
本文公开的组合物特别是药物组合物。此类组合物适合于施用于受试者。
在一个方面，组合物包含本文公开的核酸、或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及溶剂(优选水)和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。
生理学上可接受的载体或稀释剂包括用于制剂中的那些载体或稀释剂，所述制剂适合于经口、直肠、鼻或肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和经皮)施用。制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。皮下或经皮施用模式可能特别适合于本文所述的化合物。
本发明的核酸的治疗有效量将取决于施用途径、待治疗的哺乳动物类型、以及处于考虑下的具体哺乳动物的物理特性。这些因素及其与确定该量的关系对于医学领域的熟练从业者是众所周知的。该量和施用方法可以进行定制，以达到最佳功效，并且可能取决于医学领域的技术人员众所周知的此类因素如重量、饮食、同时用药和其它因素。最适合于人使用的剂量大小和给药方案可以由通过本发明获得的结果指导，并且可以在适当设计的临床试验中进行确认。
有效剂量和治疗方案可以通过常规手段进行确定，以实验室动物中的低剂量开始，然后在监测效应的同时增加剂量，并且还系统地改变剂量方案。在确定给定受试者的最佳剂量时，众多因素可以由临床医生加以考虑。这种考虑是技术人员已知的。
本发明的核酸或其盐可以配制为制备用于贮存或施用的药物组合物，其通常包含在药学上可接受的载体中的治疗有效量的本发明的核酸或其盐。
本发明的核酸或缀合核酸还可以与其它治疗性化合物组合施用，分开或同时施用，例如作为组合的单位剂量。本发明还包括组合物，其包含在生理学上/药学上可接受的赋形剂例如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等等中的根据本发明的一种或多种核酸。
在一个方面，组合物包括本文公开的核酸，以及选自寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的进一步治疗剂。优选地，进一步治疗剂是靶向，优选抑制补体组分C3或免疫系统或更具体而言补体途径的另一种要素如蛋白质的表达或活性的药剂。优选地，进一步治疗剂是下述之一：a)抑制补体途径的组分之一，优选C3或C5或其亚基之一的表达或活性的肽；b)在生理条件下与补体途径的组分之一，优选C3或C5或其亚基之一特异性结合的抗体；c)依库珠单抗或其抗原结合衍生物。
依库珠单抗是与补体组分C5特异性结合的人源化单克隆抗体，并且以商品名SOLIRIS®商业化。它以高亲和力特异性结合补体组分C5，并且抑制C5切割为C5a和C5b。该抗体例如在专利EP 0 758 904 B1及其家族成员中进行描述。
在某些实施方案中，可以同时或序贯地施用具有不同序列的本发明的两种或更多种核酸。
在另一个方面，本发明提供了组合物，例如药物组合物，其包含本发明的不同核酸之一或组合和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的药物和组合物的剂量水平可以由本领域的技术人员通过实验进行确定。在一个方面，单位剂量可以含有约0.01 mg/kg至约100 mg/kg体重的核酸或缀合核酸。可替代地，剂量可以为10 mg/kg至25 mg/kg体重、或1 mg/kg至10 mg/kg体重、或0.05 mg/kg至5mg/kg体重、或0.1 mg/kg至5 mg/kg体重、或0.1 mg/kg to1 mg/kg体重、或0.1 mg/kg至0.5mg/kg体重、或0.5 mg/kg至1 mg/kg体重。可替代地，剂量可以为约0.5 mg/kg至约10 mg/kg体重、或约0.6 mg/kg至约8 mg/kg体重、或约0.7 mg/kg至约7 mg/kg体重、或约0.8 mg/kg至约6 mg/kg体重、或约0.9 mg/kg至约5.5 mg/kg体重、或约1 mg/kg至约5 mg/kg体重、或约1 mg/kg体重、或约3 mg/kg体重、或约5 mg/kg体重，其中“约”是与指示值至多30%，优选至多20%，更优选至多10%，还更优选至多5%，且最优选0%的偏差。剂量水平还可以经由其它参数，例如体表面积进行计算。
一个特别优选的实施方案是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 409或由SEQ ID NO: 409组成，并且所述第二链任选地包含SEQ ID NO: 423或由SEQ ID NO: 423组成。这种核酸可以进一步与配体缀合。甚至更优选的是这样的核酸，其中所述第一链包含SEQ ID NO: 409或由SEQ ID NO: 409组成，并且所述第二链任选地包含SEQ ID NO: 410或由SEQ ID NO: 410组成。最优选的是由SEQ ID NO: 409和SEQ ID NO: 410组成的siRNA。本发明的一个方面是EJ0020。这些核酸的剂量单位优选包含约1 mg/kg至约5 mg/kg体重、或约1 mg/kg至约3 mg/kg体重、或约1 mg/kg体重、或约3 mg/kg体重、或约5 mg/kg体重。与在可比较的条件下未用核酸治疗或用对照核酸治疗的对照相比，通过核酸的剂量单位治疗的受试者的肝脏中的C3 mRNA水平和/或血浆或血液中的C3蛋白水平，优选在最大效应的时间点降低至少30%、至少40%、至少50%、至少60%或至少70%。
施用的剂量和频率可以根据治疗是治疗性还是预防性(例如，预防)而变，并且可以在治疗过程期间进行调整。在某些预防性应用中，在相对长的时间段内以相对较不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些受试者可能在其一生中持续接受治疗。在某些治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔的相对高的剂量，直到疾病的进展减少，或者直到患者显示疾病症状的部分或完全改善。此后，患者可以转换到合适的预防性给药方案。
单独或者与本发明的药物组合物中的一种或多种其它活性成分组合的本发明核酸的实际剂量水平可以变化，以便获得这样的活性成分的量，其有效实现对于特定患者、组合物和施用模式的所需治疗应答，而不对受试者或患者造成有害的副作用。选择的剂量水平将取决于各种因素，例如药代动力学因素，包括所采用的特定核酸或组合物的活性，施用途径，施用时间，所采用的特定核酸的排泄率，治疗的持续时间，与所采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，待治疗的受试者或患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
药物组合物可以为无菌可注射的水性悬浮液或溶液，或者为冻干形式。
药物组合物可以为单位剂型。在这种形式中，组合物被分成含有适当数量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以为包装的制剂，所述包装含有不连续数量的制剂，例如，包装的片剂、胶囊和小瓶或安瓿中的粉末。单位剂型还可以为胶囊、扁囊剂或片剂本身，或者它可以为适当数目的这些包装形式中的任一种。它可以以单一剂量的可注射形式，例如以笔的形式提供。组合物可以配制用于任何合适的施用途径和手段。
本发明的药物组合物和药物可以以药学有效剂量施用于哺乳动物受试者。哺乳动物可以选自人、非人灵长类动物、类人猿或原猴、犬、猫、马、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠、刺猬和豚鼠、或其它有关物种。在此基础上，如本文使用的，“C3”表示上文提到的任何物种中的核酸或蛋白质，如果在其中天然或人工表达，但优选地这种措辞表示人核酸或蛋白质。
本发明的药物组合物可以单独或者与一种或多种其它治疗剂或诊断剂组合施用。组合疗法可以包括与至少一种其它治疗剂组合的本发明的核酸，所述治疗剂基于待治疗的特定患者、疾病或病况加以选择。其它此类药剂的实例尤其包括治疗上活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段、或调节一种或多种另外基因的基因表达的核酸分子、以及在治疗性或预防性治疗方案中可能补充或以其它方式有益的类似调节性治疗剂。
药物组合物通常在制造和贮存条件下是无菌且稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载体可以为溶剂或分散介质，其含有例如水、醇例如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)或任何合适的混合物。例如，适当的流动性可以通过以下得到维持：使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下维持所需的粒度、以及根据本领域众所周知的配制化学使用表面活性剂。在某些实施方案中，等渗剂例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠，在组合物中可能是期望的。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以达到可注射组合物的延长吸收。
本发明的一个方面是用作药物的本文公开的核酸或组合物。核酸或组合物优选用于预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征。
本发明提供了单独或者与一种或多种另外的治疗剂组合用于药物组合物中的核酸，其用于治疗或预防响应C3表达的抑制的病况、疾病和病症。
本发明的一个方面是如本文公开的核酸或组合物在预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征中的用途。
本发明的核酸和药物组合物可以用于治疗各种病况、病症或疾病。用本发明的核酸的治疗优选导致优选在肝脏和/或血液中的体内C3耗尽。因此，本发明的核酸和包含其的组合物可用于治疗其中抑制C3的表达可能是有益的各种病理性病症的方法中。本发明提供了用于治疗疾病、病症或综合征的方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明核酸的步骤。
因此，本发明提供了治疗或预防疾病、病症或综合征的方法，该方法包括向需要的受试者(例如患者)施用治疗有效量的核酸或包含本发明核酸的药物组合物的步骤。
最期望的治疗有效量是将产生通过本领域技术人员对于有需要的给定受试者选择的特定治疗的所需功效的量。该量将根据由熟练工作人员理解的各种因素而变，所述因素包括但不限于治疗性化合物的特性(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段，一般身体状况，对给定剂量的应答性和药物治疗类型)、制剂中的药学上可接受的一种或多种载体的性质以及施用途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对化合物施用的应答并且相应地调整剂量。参见例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy第21版，Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP)，Lippincott Williams &Wilkins，Philadelphia，PA，2005。
在某些实施方案中，本发明的核酸和药物组合物可以用于治疗或预防疾病、病症或综合征。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗哺乳动物受试者例如人中的疾病、病症或综合征的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如本文公开的核酸的步骤。
本发明的核酸的“治疗有效剂量”的施用可以导致疾病症状的严重性的降低，疾病无症状期的频率和持续时间的增加，或者由于疾病折磨的损害或残疾的预防。
本发明的核酸可能有益于治疗或诊断可以使用本文所述的方法诊断或治疗的疾病、病症或综合征。其它疾病、病症或综合征的治疗和诊断也被视为落入本发明的范围内。
本发明的一个方面是预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征的方法，其包括向需要治疗的个体施用药学有效剂量或量的本文公开的核酸或组合物，优选地其中所述核酸或组合物皮下、静脉内或者通过经口、直肠、肺、肌内或腹膜内施用而施用于受试者。优选地，它是皮下施用的。
待用本文公开的核酸或组合物预防或治疗的疾病、病症或综合征，优选是补体介导的疾病、病症或综合征，或者与补体途径相关的疾病、病症或综合征。
待用本文公开的核酸或组合物预防或治疗的疾病、病症或综合征优选与补体途径的异常激活和/或过度激活(超激活)和/或补体组分C3的过表达或异位表达或定位或累积相关。涉及C3累积的疾病的一个实例是C3肾小球病(C3G)。在这种疾病中，C3在肾小球中累积。待预防或治疗的补体途径的异常激活或过度激活可以具有遗传原因，或可以是获得性的。优选地，待预防或治疗的疾病、病症或综合征是C3肾小球病(C3G)。
待用本文公开的核酸或组合物预防或治疗的疾病、病症或综合征优选a)选自包含以下且优选由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)、原发性膜性肾病、免疫复合物介导的肾小球肾炎(IC介导的GN)、感染后肾小球肾炎(PIGN)、系统性红斑狼疮(SLE)、缺血/再灌注损伤、年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎(RA)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、菌群失调性牙周病、疟疾性贫血、视神经脊髓炎、HCT/实体器官移植后(TMA)、格巴二氏综合征、膜性肾小球肾炎、血栓性血小板减少性紫癜和脓毒症；或b)选自包含以下或优选由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)和原发性膜性肾病；或c)选自包含以下或优选由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)、IgA肾病(IgA N)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；d)选自包含以下或优选由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)、视神经脊髓炎、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、IgA肾病(IgA N)、HCT/实体器官移植后(TMA)、格巴二氏综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、膜性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和血栓性血小板减少性紫癜；e) C3肾小球病(C3G)、冷凝集素病(CAD)和IgA肾病(IgA N)，或f)它是C3肾小球病(C3G)。待用根据本发明的核酸或组合物治疗的受试者优选是患有这些疾病、病症或综合征之一的受试者。
本文公开的核酸或组合物可以用于包含每周一次或两次、每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周、每十二周、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月治疗一次的方案中，或者用于具有不同给药频率例如之前提到的间隔组合的方案中。核酸或组合物可以用于皮下、静脉内使用或者使用任何其它应用途径例如经口、直肠、肺或腹膜内。优选地，它用于皮下使用。
在用如本文公开的核酸或组合物治疗或接受如本文公开的核酸或组合物的细胞和/或受试者中，与未治疗的细胞和/或受试者相比，C3的表达可以被抑制15%直到100%的范围，但至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或100%或中间值。抑制水平可以允许治疗与C3表达或过表达或补体过度激活相关的疾病，或者可以用于进一步调查C3基因产物的功能和生理作用。抑制水平优选在用核酸或组合物治疗的受试者的肝脏或血液或肾脏中，优选在血液中进行测量。
一个方面是如本文公开的核酸或组合物在制造药物或其中需要抑制C3表达的另外治疗方法中的用途，所述药物用于治疗疾病、病症或综合征例如上文列出的那些疾病、病症或综合征，或者与优选在血液或肾脏中的C3水平升高、或补体途径的过度激活相关的另外的病理状况。药物是药物组合物。
本发明的每种核酸及其药学上可接受的盐和溶剂化物构成本发明的各个实施方案。
本发明还包括的是治疗或预防疾病、病症或综合征，例如上文列出的那些疾病、病症或综合征的方法，其包括向需要治疗的个体施用包含如本文所述的核酸或组合物的组合物(以改善此类病理状况)。核酸或组合物可以在包含每周两次、每周一次、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周至十二周或更多周治疗一次的方案中施用，或者在具有不同给药频率例如之前提到的间隔组合的方案中施用。核酸或缀合核酸可以用于皮下或静脉内或者其它应用途径例如经口、直肠或腹膜内使用。
本发明的核酸可以通过本领域已知的任何适当的施用途径进行施用，所述施用途径包括但不限于气溶胶、肠、鼻、眼科、经口、肠胃外、直肠、阴道或经皮(例如，局部施用的乳膏、凝胶或软膏，或者借助于经皮贴剂)。“肠胃外施用”通常与在预期作用部位处或与之联系的注射有关，包括眶内、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管施用。
核酸的化学修饰模式的使用赋予血清中的核酸酶稳定性，并且使得例如皮下应用途径可行。
用于皮内或皮下应用的溶液或悬浮液通常包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和/或张力调节剂，例如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠，或者用具有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等等的缓冲液来调整pH。此类制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
无菌可注射溶液可以通过将以所需量的核酸与根据需要的上述成分之一或组合一起掺入适当的溶剂中，随后为灭菌微滤进行制备。分散体可以通过将活性化合物掺入无菌媒介物内进行制备，所述媒介物含有分散介质和任选地其它成分，如上述成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其无菌过滤的溶液获得活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
当治疗有效量的本发明的核酸通过例如静脉内注射、皮肤注射或皮下注射进行施用时，核酸将采取无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等等，用于制备肠胃外可接受的溶液的方法在本领域的技术内。除核酸之外，用于静脉内注射、皮肤注射或皮下注射的优选药物组合物还含有等渗媒介物，例如氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸林格氏注射液、或本领域已知的其它媒介物。本发明的药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员众所周知的其它添加剂。
可以与载体材料组合以产生单一剂型的核酸的量将取决于各种因素而变，所述因素包括待治疗的受试者和特定的施用模式。一般而言，它将是在特定情况下产生适当疗效的组合物的量。一般地，在百分之一百中，该量范围为与药学上可接受的载体组合的约0.01%至约99%核酸、约0.1%至约70%、或约1%至约30%核酸。
核酸可以与保护化合物免于快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备这类制剂的许多方法已获得专利，或者是本领域技术人员一般已知的。参见例如，Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems，J. R. Robinson，编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
可以调整剂量方案以提供最佳的所需应答(例如，治疗应答)。例如，可以施用剂量，可以在一段时间内施用几个分份剂量，或根据具体情况，如通过治疗情形的特定情况指示的，按比例减少或增加剂量。当施用于受试者或患者时，将肠胃外组合物配制成剂量单位形式用于施用的容易性和剂量的均匀性是尤其有利的。如本文使用的，剂量单位形式指适合作为待治疗受试者的单元剂量的物理上不连续的单位；每个单位含有预先确定数量的活性化合物，其计算为产生所需的疗效。本发明的剂量单位形式的规格取决于活性化合物的具体特性和待实现的特定疗效，以及任何个别患者的治疗和敏感性。
本发明的核酸或组合物可以使用本领域的常规方法生产，所述方法包括化学合成例如固相化学合成。
本发明的核酸或组合物可以用本领域已知的各种医疗装置中的一种或多种进行施用。例如，在一个实施方案中，本发明的核酸可以用无针皮下注射装置进行施用。可用于本发明中的众所周知的植入物和模块的实例在本领域中，包括例如用于控制速率递送的可植入的微量输液泵；用于通过皮肤施用的装置；用于以精确输注速率递送的输液泵；用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；以及渗透性药物递送系统。这些和其它此类植入物、施用系统和模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的核酸或组合物可以配制为确保在体内的所需分布。为了将本发明的治疗性化合物或组合物靶向特定的体内定位，它们可以例如在可以包含一个或多个部分的脂质体中进行配制，所述部分选择性转运到特定的细胞或器官内，因此增强靶向药物递送。
本发明的特征在于在分子和组织定向递送水平下的高特异性。本发明的核酸序列对于其靶是高度特异性的，这意味着它们并不抑制它们并非设计为靶向其的基因的表达，或仅最低限度地抑制它们并非设计为靶向其的基因的表达，和/或仅抑制它们并非设计为靶向其的低数目基因的表达。当核酸与由特定细胞类型特异性识别且内化的配体连接时，实现进一步的特异性水平。例如，当核酸与包含GalNAc部分的配体连接时就是这种情况，所述GalNAc部分由肝细胞特异性识别且内化。这导致核酸仅在被核酸与之连接的配体靶向的细胞中抑制其靶的表达。这两个特异性水平潜在地赋予比目前可用的治疗更好的安全性概况。在某些实施方案中，本发明因此提供了与配体连接的本发明的核酸，所述配体包含一个或多个GalNAc部分、或者包含一个或多个其它部分，所述其它部分赋予核酸的细胞类型或组织特异性内化，从而赋予通过RNA干扰的靶基因敲减的另外特异性。
如本文所述的核酸可以用以脂质体形式的脂质进行配制。此类制剂在本领域可以被描述为脂质体复合物(lipoplex)。具有脂质/脂质体的组合物可以用于帮助本发明的核酸递送到靶细胞。本文所述的脂质递送系统可以用作缀合配体的替代物。当将本发明的核酸与脂质递送系统或与配体缀合物递送系统一起使用时，可以存在本文所述的修饰。
此类脂质体复合物可以包含脂质组合物，其包含：
i)阳离子脂质，或其药学上可接受的盐；
ii)类固醇；
iii)磷脂酰乙醇胺磷脂；和/或
iv) PEG化的脂质。
阳离子脂质可以为氨基阳离子脂质。
阳离子脂质可以具有式(XII)：
Figure DEST_PATH_IMAGE053
(XII)
或其药学上可接受的盐，其中：
X代表O、S或NH；
R1和R2各自独立地代表C4-C22线性或分支烷基链、或者具有一个或多个双键的C4-C22线性或分支烯基链，其中所述烷基链或烯基链任选地含有插入的酯、酰胺或二硫化物；
当X代表S或NH时，R3和R4各自独立地代表氢、甲基、乙基、单胺或多胺部分，或R3和R4一起形成杂环基环；
当X代表O时，R3和R4各自独立地代表氢、甲基、乙基、单胺或多胺部分，或R3和R4一起形成杂环基环，或R3代表氢，且R4代表C(NH)(NH2)。
阳离子脂质可以具有式(XIII)：
Figure DEST_PATH_IMAGE054
(XIII)
或其药学上可接受的盐。
阳离子脂质可以具有式(XIV)：
Figure DEST_PATH_IMAGE055
(XIV)
或其药学上可接受的盐。
阳离子脂质组分的含量可以为组合物的总体脂质含量的约55摩尔%至约65摩尔%。特别地，阳离子脂质组分为组合物的总体脂质含量的约59摩尔%。
组合物可以进一步包含类固醇。类固醇可以为胆固醇。类固醇的含量可以为脂质组合物的总体脂质含量的约26摩尔%至约35摩尔%。更特别地，类固醇的含量可以为脂质组合物的总体脂质含量的约30摩尔%。
磷脂酰乙醇胺磷脂可以选自1,2-二植酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLoPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、1,2-二角鲨烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSQPE)和1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SLPE)。磷脂的含量可以为组合物的总体脂质含量的约10摩尔%。
PEG化脂质可以选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)和C16-神经酰胺-PEG。PEG化脂质的含量可以为组合物的总体脂质含量的约1至5摩尔%。
组合物中的阳离子脂质组分含量可以为脂质组合物的总体脂质含量的约55摩尔%至约65摩尔%，优选为脂质组合物的总体脂质含量的约59摩尔%。
组合物可以具有选自55:34:10:1；56:33:10:1；57:32:10:1；58:31:10:1；59:30:10:1；60:29:10:1；61:28:10:1；62:27:10:1；63:26:10:1；64:25:10:1；和65:24:10:1的i):ii):iii):iv)组分的摩尔比。
组合物可以包含具有以下结构的阳离子脂质
Figure DEST_PATH_IMAGE056
具有以下结构的类固醇
Figure DEST_PATH_IMAGE057
具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂
Figure DEST_PATH_IMAGE058
和具有以下结构的PEG化脂质
Figure DEST_PATH_IMAGE059
。
中性脂质体组合物可以由例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物可以由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体可以主要由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物可以由磷脂酰胆碱(PC)例如大豆PC和卵PC形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
带正电的合成阳离子脂质，N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-Ν,Ν,Ν-三甲基氯化铵(DOTMA)可以用于形成小脂质体，所述小脂质体与核酸自发相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述脂质-核酸复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电的脂质融合。DOTMA类似物还可以用于形成脂质体。
本文所述脂质的衍生物和类似物还可以用于形成脂质体。
含有核酸的脂质体可以通过各种方法进行制备。在一个实例中，将脂质体的脂质组分溶解于去污剂中，使得胶束由脂质组分形成。例如，脂质组分可以为两性阳离子脂质或脂质缀合物。去污剂可以具有高临界胶束浓度，并且可以为非离子型的。示例性的去污剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、去氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后，将核酸制剂加入包括脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与核酸相互作用，并且在核酸周围凝聚，以形成脂质体。在凝聚后，例如通过透析去除去污剂，以得到核酸的脂质体制剂。
需要时，可以例如通过控制添加在凝聚反应过程中加入帮助凝聚的载体化合物。例如，载体化合物可以为除核酸外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。还可以调整pH以促进凝聚。
本发明的核酸制剂可以包括表面活性剂。在一个实施方案中，核酸配制为包括表面活性剂的乳状液。
并未电离的表面活性剂是非离子表面活性剂。实例包括非离子酯例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯等，非离子烷醇酰胺，以及醚例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。
当在水中溶解或分散时携带负电荷的表面活性剂是阴离子表面活性剂。实例包括羧酸盐例如皂，酰基乳酸盐，氨基酸的酰基酰胺，硫酸酯例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸盐例如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙基磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐，以及磷酸盐。
当在水中溶解或分散时携带正电荷的表面活性剂是阳离子表面活性剂。实例包括季铵盐和乙氧基化胺。
具有携带正电荷或负电荷的能力的表面活性剂是两性表面活性剂。实例包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
“胶束”在本文中定义为特定类型的分子组装，其中两亲分子排列在球形结构中，使得分子的所有疏水部分都指向内部，留下亲水部分与周围的水相接触。如果环境是疏水性的，则存在相反的排列。可以通过将核酸的水溶液、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成化合物混合来形成胶束。
示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸单甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆甾烷基(cholanyl)甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇(polidocanol)烷基醚及其类似物、鹅去氧胆酸盐、去氧胆酸盐及其混合物。
苯酚和/或间甲酚可以加入混合胶束组合物中，以充当稳定剂和防腐剂。还可以加入等渗剂例如丙三醇。
核酸制剂可以掺入颗粒例如微粒内。微粒可以通过喷雾干燥、冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些方法的组合进行生产。
定义
如本文使用的，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“减少”意指基因的表达、或者编码一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的RNA分子或等价RNA分子(例如mRNA)的水平、或者一种或多种蛋白质或蛋白质亚基的活性，减少到低于在不存在本发明的核酸或缀合核酸的情况下观察到的，或与用与人转录物没有已知同源性的siRNA分子(在本文中称为非沉默对照)获得的相比是减少的。此类对照可以以与本发明分子的类似方式进行缀合且修饰，并且通过相同的途径递送到靶细胞内。在用本发明的核酸治疗后的表达可以减少到95%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%或0%或中间值，或小于在不存在核酸或缀合核酸的情况下观察到的表达。表达可以在核酸应用于其的细胞中进行测量。可替代地，尤其是如果核酸施用于受试者，则水平可以在不同组的细胞中或者在组织或器官中或者在体液如血液或血浆中进行测量。抑制水平优选在已选择的条件下进行测量，因为它们在体外用核酸治疗的细胞中显示核酸对靶mRNA水平的最大效应。例如，抑制水平可以在用浓度为0.038nM – 10 µM，优选1 nM、10 nM或100 nM的核酸治疗24小时或48小时后进行测量。这些条件对于不同的核酸序列或不同类型的核酸，例如对于未修饰的或修饰的或与配体缀合的或未缀合的核酸可能是不同的。用于确定抑制水平的适当条件的实例在实施例中进行描述。
核酸意指包括包含核苷酸的两条链的核酸，其能够干扰基因表达。抑制可以为完全的或部分的，并且导致基因表达以靶向方式的下调。核酸包含两条分开的多核苷酸链；也可以为引导链的第一链；以及也可以为过客链的第二链。第一链和第二链可以为自互补的同一多核苷酸分子的部分，所述多核苷酸分子向后‘折叠’以形成双链分子。核酸可以为siRNA分子。
核酸可以包含核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核苷酸类似物非核苷酸，其能够模仿核苷酸，使得它们可以与靶序列或互补链上的相应碱基‘配对’。核酸可以进一步包含由第一链(在本领域中也称为引导链)的全部或一部分和第二链(在本领域中也称为过客链)的全部或一部分形成的双链核酸部分或双链体区域。双链体区域定义为以第一链和第二链之间形成的第一个碱基对开始，并且以第一链和第二链之间形成的最后一个碱基对结束，包含端点在内。
双链体区域意指两种互补或基本上互补的寡核苷酸中的区域，其通过沃森-克里克碱基配对或任何其它方式彼此形成碱基对，所述任何其它方式允许互补或基本上互补的寡核苷酸链之间的双链体。例如，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可以与具有21个核苷酸单元的另一种寡核苷酸碱基配对，但每条链上的仅19个核苷酸是互补或基本上互补的，使得“双链体区域”由19个碱基对组成。剩余的碱基对可以作为5’和3’突出端存在，或作为单链区域存在。进一步地，在双链体区域内，不要求100%的互补性；基本互补性在双链体区域内是允许的。基本互补性指各条链之间的互补性，使得它们能够在生物条件下退火。凭经验确定两条链是否能够在生物条件下退火的技术是本领域众所周知的。可替代地，可以合成两条链，并且在生物条件下一起添加，以确定它们是否彼此退火。形成至少一个双链体区域的第一链和第二链的一部分可以是彼此完全互补的，并且是至少部分互补的。取决于核酸的长度，不一定要求在第一链和第二链之间的碱基互补性方面的完全匹配。然而，第一链和第二链必须能够在生理条件下杂交。
如本文使用的，术语“非配对核苷酸类似物”意指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，其包括但不限于：6去氨基腺苷(Nebularine)、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me ribo U、N3-Me riboT、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-ethyl-dC和N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对的核苷酸类似物是核糖核苷酸。在其它实施方案中，它是脱氧核糖核苷酸。
如本文使用的，术语“末端官能团”包括但不限于卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮和醚基。
如本文使用的，“突出端”具有其在本领域中的正常和习惯的含义，即核酸的单链部分，其在双链核酸中延伸超出互补链的末端核苷酸。术语“平端”包括由此两条链在同一位置处终止的双链核酸，不管末端核苷酸是否碱基配对。第一链和第二链在平端处的末端核苷酸可以是碱基配对的。第一链和第二链在平端处的末端核苷酸可以是不配对的。第一链和第二链在平端处的末端两个核苷酸可以是碱基配对的。第一链和第二链在平端处的末端两个核苷酸可以是不配对的。
术语“丝氨醇衍生的接头部分”意指接头部分包含下述结构：
Figure DEST_PATH_IMAGE061
所述结构的O原子通常与RNA链连接，并且N原子通常与靶向配体连接。
术语“患者”、“受试者”和“个体”可以互换使用，并且指人或非人动物。这些术语包括哺乳动物，例如人、灵长类动物、牲畜动物(例如牛、猪)、伴侣动物(例如犬、猫)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
如本文使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”及其语法变体指用于获得有益或所需临床结果的方法。该术语可以指减缓病况、病症或疾病的发作或发展速率，减少或减轻与之相关的症状，生成病况的完全或部分消退，或上述任何的某种组合。为了本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于无论是可检测还是不可检测的症状减少或减轻，疾病程度的缩小，疾病状态的稳定(即不恶化)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)。“治疗”还可以意指相对于未接受治疗时的预计存活时间的延长存活。因此，需要治疗的受试者(例如人)可以是已经受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“治疗”包括相对于不存在治疗时，在病理状态或症状的严重性方面的增加的抑制或减少，而不一定意味着暗示有关疾病、病症或病况的完全停止。
如本文使用的，术语“预防”及其语法变体指用于预防病况、疾病或病症的发展，或者改变病况、疾病或病症的病理状况的方法。相应地，“预防”可以指预防性或预防措施。为了本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于无论是可检测还是不可检测的疾病的症状、进展或发展的预防或减缓。因此，需要预防的受试者(例如人)可以是尚未受所讨论的疾病或病症折磨的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗时，减缓疾病的发作，而不一定意味着暗示有关疾病、病症或病况的永久预防。因此，在某些背景下，病况的“预防(preventing)”或“预防(prevention)”可能指减少发展病况的风险，或者预防或延迟与病况相关的症状的发展。
如本文使用的，“有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”是这样的组合物(例如，治疗性组合物或药剂)的量，其在受试者中产生至少一种所需疗效，例如预防或治疗目标病况或者有益地减轻与病况相关的症状。
如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”指对被施用所讨论的盐的患者或受试者无害的盐。它可以是例如在酸加成盐和碱性盐中选择的盐。酸加成盐的实例包括氯化物盐、柠檬酸盐和乙酸盐。碱性盐的实例包括这样的盐，其中阳离子选自碱金属阳离子如钠或钾离子，碱土金属阳离子如钙或镁离子，以及取代的铵离子如类型N(R1)(R2)(R3)(R4)+的离子，其中R1、R2、R3和R4通常独立地指定氢、任选取代的C1-6-烷基或任选取代的C2-6-烯基。有关的C1-6-烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。可能有关的C2-6-烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基和2-丙烯基。药学上可接受的盐的其它实例在 “Remington’sPharmaceutical Sciences”，第17版，Alfonso R. Gennaro (编辑)，Mark PublishingCompany，Easton，PA，USA，1985 (及其最新版本)，“Encyclopaedia of PharmaceuticalTechnology”，第3版，James Swarbrick (编辑)，Informa Healthcare USA (Inc.)，NY，USA，2007，以及 J. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)中进行描述。“药学上可接受的盐”在性质上保留了母体化合物的所需生物活性，而不赋予相对于化合物的任何不希望有的效应。药学上可接受的盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生自无毒无机酸例如盐酸、硝酸、亚磷酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸等等的盐，或者衍生自无毒有机酸例如脂肪族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳香族酸、脂肪族和芳香族磺酸等等的盐。碱加成盐包括衍生自碱土金属例如钠、钾、镁、钙等等的盐，以及衍生自无毒有机胺例如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等等的盐。
术语“药学上可接受的载体”包括任何标准的药物载体。用于治疗用途的药学上可接受的载体是制药领域众所周知的，并且例如在Remington's Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro编辑1985)中进行描述。例如，可以使用在微酸性或生理pH下的无菌盐水以及磷酸盐缓冲盐水。示例性的pH缓冲剂包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三/羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其为优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸、或乙酸盐或其混合物。该术语进一步涵盖美国药典中列出的用于动物包括人中的任何试剂。“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理学上可接受的，即相容的溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。在某些实施方案中，载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(例如，通过注射或输注)。取决于所选的施用途径，核酸可以在一种或多种材料中进行包被，当通过特定的施用途径施用于受试者时，所述材料预期保护化合物不受核酸可能暴露的酸及其它天然失活条件的作用。
在本发明的上下文中，术语“溶剂化物”指溶质(在这种情况下，根据本发明的核酸化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的具有确定化学计量学的复合物。在这方面的溶剂可以例如是水或另一种药学上可接受的、通常为小分子的有机种类，例如但不限于乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂是水时，此类溶剂化物通常被称为水合物。
现在将参考下述非限制性附图和实施例来描述本发明。
Figure DEST_PATH_IMAGE063
图1A、1B和1C显示了所选siRNA的浓度应答曲线。
图2A和2B显示了所选siRNA GalNAc缀合物在人原代肝细胞中的浓度应答曲线。
图3A和3B显示了所选siRNA GalNAc缀合物在小鼠原代肝细胞中的浓度应答曲线。
图4A、4B和4C分别显示了所选siRNA GalNAc缀合物在原代小鼠、人和食蟹猴肝细胞中的浓度依赖性C3 mRNA抑制。
图5显示了DMT-丝氨醇(GalNAc)-CEP和CPG的可能合成途径。
图6A和6B显示了响应用所选siRNA GalNAc缀合物sc治疗小鼠，在体内肝细胞中的C3 mRNA水平以及血清中的C3蛋白水平。
图7A、7B和7C显示了在与所选siRNA GalNac缀合物(1nM、10nM和100nM)一起温育后，针对ACTIN mRNA标准化的原代小鼠(A)、食蟹猴(B)和人(C)肝细胞中的相对C3 mRNA表达。
图8A和8B显示了在GalNAc缀合的siRNA EV0201、EV0203、EV0204、EV0205和EV0207的单次给药后14天(A)或42天(B)，在鼠肝脏中以%表示的相对C3 mRNA表达。数据在条形图中显示为平均值± SD (n=4/组)。
图9A-E显示了来自小鼠血清样品的以%表示的相对C3蛋白血清水平，所述血清样品在5或10 mg/kg siRNA的给药前(BL)、在给药后在研究的第4天、第10天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天获取。数据点描绘了使用标准C3 ELISA确定的各个动物的血清C3水平。数据针对每组的基线平均值进行标准化，然后针对设定为100%的时间匹配的PBS对照进行标准化。标绘的线连接了在分别时间点的各个组的平均值。
A)在5和10 mg/kg EV0201给药后的标准化的C3血清水平
B)在5和10 mg/kg EV0203给药后的标准化的C3血清水平
C)在5 mg/kg EV0204给药后的标准化的C3血清水平
D)在5和10 mg/kg EV0205给药后的标准化的C3血清水平
E)在5和10 mg/kg EV0207给药后的标准化的C3血清水平。
图10显示了在体外各种siRNA的C3 mRNA敲减效率。
图11显示了在体外各种siRNA的人C3 mRNA敲减效率。
图12显示了在体外各种siRNA的小鼠C3 mRNA敲减效率。
图13显示了在小鼠肝细胞中，各种siRNA缀合物的C3 mRNA敲减效率。
图14显示了在食蟹猴肝细胞中，各种siRNA缀合物的C3 mRNA敲减效率。
图15显示了在小鼠肝细胞中，siRNA缀合物变体的C3 mRNA敲减效率。
图16显示了在食蟹猴肝细胞中，siRNA缀合物变体的C3 mRNA敲减效率。
图17显示了在GalNAc缀合的C3 siRNA EJ0020的单次给药后43天，在鼠肝脏中以%表示的相对C3 mRNA表达。
图18显示了来自小鼠血清样品的以%表示的相对C3蛋白血清水平，所述血清样品在1或3 mg/kg GalNAc缀合的C3 siRNA EJ0020的给药前、在给药后在研究的第7天、第14天、第28天和第43天获取。
图19显示了在与以1、10和100nM的GalNAc siRNA缀合物EV0210、EV0211、EV0212和EV0213一起温育后，原代人肝细胞中的C3 mRNA表达。
图20显示了在治疗后10天，在野生型和C3G疾病模型小鼠中，用不同剂量的缀合C3siRNA的治疗对C3肾小管沉积的作用。
图21显示了在治疗后10天，在野生型和C3G疾病模型小鼠中，用不同剂量的缀合C3siRNA的治疗对补体因子B片段化的作用。
图22A和22B显示了在C3G疾病模型小鼠中，用多重剂量的缀合C3 siRNA的治疗对C3α链和C3α链片段水平的作用。
图23显示了在C3G疾病模型小鼠中，用多重剂量的缀合C3 siRNA的治疗对补体因子B片段化的作用。
实施例
实施例1
在HepG2细胞中的体外研究，显示在10 nM siRNA的转染后，所测试的siRNA的C3mRNA敲减功效。
在HepG2细胞中10 nM siRNA的转染后，确定siRNA EV0001-EV0100的C3敲减功效。结果显示于下表2中。在敲减后剩余的C3 mRNA水平在6至83%的范围内。最有效力的siRNA是EV0001、EV0007、EV0008、EV0009、EV0012、EV0013、EV0018、EV0020、EV0030、EV0033和EV0004。
对于用siRNA转染HepG2细胞，将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种到胶原包被的96孔组织培养板(#655150，GBO，德国)内。直接在接种后根据制造商的说明书，用Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen/Life Technologies，Karlsruhe，德国)进行siRNA的转染。用C3 siRNA以10 nM一式四份执行筛选，其中靶向Aha1、萤火虫-萤光素酶和因子VII的siRNA作为非特异性对照和模拟转染。在与siRNA一起温育24小时后，去除培养基，并且在150 µl培养基-裂解混合物(1体积裂解混合物，2体积细胞培养基)中裂解细胞，然后在53℃下温育30分钟。根据制造商的说明书，执行bDNA测定法。在黑暗中在RT下温育30分钟后，使用1420发光计数器(WALLAC VICTOR Light，Perkin Elmer，Rodgau-Jügesheim，德国)读取发光。对于每个孔，C3 mRNA水平针对分别的GAPDH mRNA水平进行标准化。相对于各对照孔的平均C3 mRNA浓度(针对GAPDH mRNA标准化)，给定C3 siRNA的活性表示为在治疗的细胞中剩余的C3 mRNA浓度百分比(针对GAPDH mRNA标准化)。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE064
Figure DEST_PATH_IMAGE065
表2：C3 siRNA的筛选结果 – 形成每种siRNA双链体的单链的身份以及其序列和修饰将在说明书末尾的表中找到。
实施例2
在HepG2细胞中的体外研究，显示在0.01 pM – 100 nM siRNA的转染后，所测试的siRNA的C3 mRNA敲减功效(浓度应答曲线实验)。
在HepG2细胞中0.01 pM - 100 nM siRNA的转染后，确定siRNA EV0001、EV0008、EV0013、EV0030、EV0033、EV0039、EV0043、EV0053、EV0054、EV0059、EV0060、EV0061、EV0066、EV0072、EV0075、EV0081、EV0091和EV0098的C3敲减功效。形成每种siRNA双链体的单链的身份及其序列将在说明书末尾的表中找到。结果呈现于图1A、1B和1C中。所有siRNA在转染后都显示了C3 mRNA的剂量依赖性敲减。最有效力的siRNA是EV0008、EV0033和EV0081，在100nM siRNA下，具有分别为4.3、5.3和5.3%的残留C3表达。
对于用siRNA转染HepG2细胞，将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种到胶原包被的96孔组织培养板(#655150，GBO，德国)内。直接在接种后根据制造商的说明书，用Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen/Life Technologies，Karlsruhe，德国)进行siRNA的转染。浓度应答实验用以一式四份转染的10个浓度的C3 siRNA完成，在6倍的稀释步骤中，以100 nM开始，降至0.01 pM。模拟转染的细胞充当CRC实验中的对照。在与siRNA一起温育24小时后，去除培养基，并且在150 µl培养基-裂解混合物(1体积裂解混合物，2体积细胞培养基)中裂解细胞，然后在53℃下温育30分钟。根据制造商的说明书，执行bDNA测定法。在黑暗中在RT下温育30分钟后，使用1420发光计数器(WALLAC VICTOR Light，Perkin Elmer，Rodgau-Jügesheim，德国)读取发光。对于每个孔，C3 mRNA水平针对分别的GAPDH mRNA水平进行标准化。相对于各对照孔的平均C3 mRNA浓度(针对GAPDH mRNA标准化)，给定C3 siRNA的活性表示为在治疗的细胞中剩余的C3 mRNA百分比(针对GAPDH mRNA标准化)。浓度应答曲线用GraphPad Prism版本7.05，使用四参数逻辑(4PL)模型进行拟合，没有进一步的限制。
实施例3
在原代人肝细胞中的体外研究，显示以浓度应答曲线形式的所测试的siRNA-GalNAc缀合物(0.038 nM - 10 µM siRNA缀合物)的C3 mRNA敲减功效。
在与GalNAc siRNA缀合物EV0101、EV0102、EV0103、EV0104、EV0105、EV0106、EV0107、EV0108、EV0109、EV0110、EV0111和EV0312一起温育后的C3 mRNA表达以浓度应答形式进行分析。形成每种siRNA双链体的单链的身份及其序列将在说明书末尾的表中找到。结果显示于图2A和2B中。管家基因GAPDH的mRNA水平充当所有实验的对照。所有siRNA GalNAc缀合物都能够以浓度依赖性方式降低C3 mRNA水平，其中在10 µM下最大抑制分别为32至70%。最有效力的siRNA是在10 µM 下具有61%的C3 mRNA水平减少的EV0102，具有67%的C3mRNA水平减少的EV0109，具有69%的C3 mRNA水平减少的EV0111，以及具有70%的C3 mRNA水平减少的EV0312。
冷冻保存的人原代肝细胞购自Primacyt (Schwerin，德国，目录#GuCPI，Lot#BHum16061-P)。直接在治疗前，将细胞解冻，转移到具有解冻培养基(Primacyt，目录#HTM)的管中，离心且用洗涤培养基(Primacyt，目录#HWM)洗涤。在胶原包被的96孔板(Greiner-Bio-One，#655150)上，在铺平板培养基(Primacyt，目录#MPM-cryo)中，以90,000个细胞/孔的密度接种细胞。直接在接种后，当细胞在铺平板培养基中作为单层粘附时，用siRNA治疗细胞。每种siRNA应用于细胞用于浓度应答曲线，其浓度以10 µM开始，以4倍的稀释步骤序贯稀释，降至38 pM。每个浓度作为一式四份应用。在5小时后，将培养基更换为维持培养基(Primacyt目录#HHMM)。每24小时更换培养基，并且在接种48小时后收获细胞，用于通过Quantigene bDNA测定法的分析。C3 mRNA浓度针对GAPDH mRNA进行标准化。浓度应答曲线用GraphPad Prism版本7.05，使用四参数逻辑(4PL)模型进行拟合，没有进一步的限制。
实施例4
在原代小鼠肝细胞中的体外研究，显示以浓度应答曲线形式的所测试的siRNA-GalNAc缀合物 (0.038 nM - 10 µM siRNA缀合物)的C3 mRNA敲减功效。
在与GalNAc siRNA缀合物EV0104、EV0105、EV0107、EV0108、EV0109、EV0110、EV0111和EV0312一起温育后的C3 mRNA表达以浓度应答形式进行分析。形成每种siRNA双链体的单链的身份及其序列将在说明书末尾的表中找到。管家基因GAPDH的mRNA水平充当对照。siRNA GalNAc缀合物能够以浓度依赖性方式降低C3 mRNA水平，其中在10 µM下最大抑制为56至72%。最有效力的siRNA是在10 µM 下具有68%的C3 mRNA水平减少的EV0104，具有67%的C3 mRNA水平减少的EV0109，以及具有72%的C3 mRNA水平减少的EV0111。
冷冻保存的鼠肝细胞购自Thermo Fisher (#MSCP10，Lot#MC817)，并且在铺平板培养基(Thermo Fisher Sci，目录号CM3000补充包加入不含酚红的William’s E培养基中至总共500 ml，Thermo Fisher Sci，目录号A12176-01)中铺平板。在接种当天时，将细胞解冻，并且以60,000个细胞/孔的密度接种到胶原包被的96孔板(Greiner-Bio-One，#655150)内。直接在接种后，当细胞在铺平板培养基中作为单层粘附时，用siRNA治疗细胞。每种siRNA应用于细胞作为浓度应答曲线，其浓度以10 µM开始，以4倍的稀释步骤序贯稀释，降至0.038 nM。每个浓度作为一式四份应用。在5小时后，将培养基更换为维持培养基(ThermoFisher Sci，目录号CM4000补充包加入不含酚红的William’s E培养基中至总共500 ml，Thermo Fisher Sci，目录号A12176-01)。每24小时更换培养基，并且在接种48小时后收获细胞，用于通过Quantigene bDNA测定法的分析。
结果显示于图3A和3B。它们描绘了在与siRNA GalNAc缀合物(0.038 nM - 10 µM)一起温育后，针对GAPDH mRNA标准化的原代小鼠肝细胞中的%剩余的C3 mRNA表达。浓度应答曲线用GraphPad Prism版本7.05，使用四参数逻辑(4PL)模型进行拟合，没有进一步的限制。
实施例5
在原代小鼠、人和食蟹猴肝细胞中的体外研究，显示以1、10和100nM的所测试的siRNA-GalNAc缀合物的C3 mRNA敲减功效。
分析了在与以1、10和100nM的GalNAc siRNA缀合物EV0312 和EV0313一起温育后的C3 mRNA表达。形成每种siRNA双链体的单链的身份及其序列将在说明书末尾的表中找到。管家基因肌动蛋白的mRNA水平充当对照。
将40,000个(人)、30,000个(小鼠)或45,000个(食蟹猴)细胞接种到胶原包被的96孔板上。紧在接种后加入以指示浓度的siRNA。治疗后24小时，使用InviTrap RNA CellHTS96 Kit/C (Stratec)裂解细胞。使用针对C3和肌动蛋白的mRNA特异性引物和探针执行qPCR。
结果显示于图4A、4B和4C中。
实施例6 –构件单元的合成
图5中概述了如下所述的DMT-丝氨醇(GalNAc)-CEP和CPG的合成途径。根据文献公开的方法(Hoevelmann等人Chem. Sci.，2016,7，128-135)，从商购可得的L-丝氨酸制备原材料DMT-丝氨酸(H) (1)。根据文献公开的方法(Nair等人J. Am. Chem. Soc.，2014，136(49)，第16958–1696页)，以商购可得的全乙酰化半乳糖胺开始制备GalNAc(Ac3)-C4H8-COOH(2)。亚磷酰化(Phosphitylation)试剂2-氰乙基-N,N-二异丙基氯代亚磷酰胺(4)是商购可得的。(vp)-mU-phos的合成如Prakash，Nucleic Acids Res. 2015，43 (6)，2993-3011和Haraszti，Nucleic Acids Res. 2017，45(13)，7581-7592中所述执行。ST43 (ST43-phos)以及ST23 (ST23-phos)的亚磷酰胺衍生物的合成可以如WO2017/174657中所述执行。
DMT-丝氨醇(GalNAc) (3)
将HBTU (9.16 g，24.14 mmol)加入GalNAc(Ac3)-C4H8-COOH (2) (11.4 g，25.4mmol)和DIPEA (8.85 ml，50.8 mmol)的搅拌溶液中。在2分钟的活化时间后，将DMT-丝氨醇(H) (1) (10 g，25.4 mmol)的乙腈(无水) (200 ml)溶液加入搅拌混合物中。在1小时后，LCMS显示良好的转换。使反应混合物在真空中浓缩。使残余物溶解于EtOAc中，随后用水(2x)和盐水洗涤。使有机层在Na2SO4上干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过柱层析(在CH2Cl2 + 1% Et3N中的3% MeOH，700g二氧化硅)进一步纯化。将含有产物的级分合并，浓缩并用CH2Cl2 (2x)剥离，以得到作为灰白色泡沫的10.6g (51%)的DMT-丝氨醇(GalNAc) (3)。
DMT-丝氨醇(GalNAc)-CEP (5)
在氩气氛下，在0℃下，将2-氰乙基-N，N-二异丙基氯代亚磷酰胺(4) (5.71 ml，25.6 mmol)缓慢加入DMT-丝氨醇(GalNAc) (3) (15.0 g，17.0 mmol)、DIPEA (14.9 ml，85mmol)和4Å分子筛在二氯甲烷(无水) (150 ml)中的搅拌混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。TLC指示完全转换。将反应混合物过滤，且在真空中浓缩，以给出稠油。使残余物溶解于二氯甲烷中，并且通过快速层析(0-50%丙酮的甲苯1%Et3N溶液，220 g二氧化硅)进一步纯化。将含有产物的级分合并，且在真空中浓缩。所得到的油用MeCN (2x)剥离，以得到13.5g (77%)的无色DMT-丝氨醇(GalNAc)-CEP (5)泡沫。
DMT-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酸酯(6)
在氩气氛下，将DMAP (1.11 g，9.11 mmol)加入DMT-丝氨醇(GalNAc) (3) (7.5g，9.11 mmol)和琥珀酸酐(4.56 g，45.6 mmol)在二氯甲烷(50 ml)和吡啶(50 ml)的混合物中的搅拌溶液中。在搅拌16小时后，使反应混合物在真空中浓缩，并且使残余物在EtOAc中吸收，并且用5%柠檬酸(含水)洗涤。用EtOAc提取水层。合并的有机层随后用饱和NaHCO3(含水)和盐水洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤且在真空中浓缩。通过快速层析(在CH2Cl2 +1%Et3N中的0-5% MeOH，120g二氧化硅)实现进一步纯化。将含有产物的级分合并，且在真空中浓缩。残余物用MeCN (3x)剥离，以得到5.9g (70%) DMT-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酸酯(6)。
DMT-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酰-lcaa-CPG (7)
将DMT-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酸酯(6) (1当量)和HBTU (1.1当量)溶解于CH3CN(10 ml)。向溶液中加入二异丙基乙胺(2当量)，并且使混合物涡旋2分钟，随后加入天然氨基-lcaa-CPG (500 A，88µmol/g，1当量)。悬浮液在室温下在腕式振荡器上轻轻振荡16小时，然后过滤且用乙腈洗涤。使固体支持物在减压下干燥2小时。在室温下通过用Ac2O/2,6-二甲基吡啶/NMI搅拌(2x15分钟)，使支持物上的未反应胺封端。支持物的洗涤如上文进行重复。使固体在真空下干燥，以得到DMT-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酰-lcaa-CPG (7) (装载：34µmol/g，通过脱三苯甲基化测定法确定)。
实施例7 - 寡核苷酸合成
实施例化合物根据下文描述和本领域技术人员已知的方法进行合成。寡核苷酸链和接头构件单元的组装通过应用亚磷酰胺方法的固相合成来执行。
下游切割、脱保护和纯化遵循本领域已知的标准程序。
寡核苷酸合成在AKTA oligopilot 10上，使用商购可得的2´O-甲基RNA和2´氟-2´脱氧RNA碱基装载的CPG固体支持物执行，并且使用亚磷酰胺(所有标准保护，ChemGenes，LinkTech)。DMT-(S)-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酰lcaa CPG (7)和DMT-(S)-丝氨醇(GalNAc)-CEP (5)的合成在实施例6中进行描述。
辅助试剂购自EMP Biotech。合成使用亚磷酰胺在无水乙腈(<20 ppm H2O)中的0.1 M溶液执行，并且使用苄硫基四唑(BTT)作为激活剂(0.3M的乙腈溶液)。偶联时间为10分钟。应用Cap/OX/Cap或Cap/Thio/Cap循环(Cap：Ac2O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化剂：0.05M I2的吡啶/H2O溶液)。硫代磷酸酯使用商购可得的硫醇化试剂50mM EDITH的乙腈溶液(Link technologies)引入。DMT切割通过用3%二氯乙酸的甲苯溶液的处理来实现。在程序化合成循环完成后，执行二乙胺(DEA)洗涤。所有寡核苷酸都在DMT关闭模式下合成。
丝氨醇(GalNAc)部分的附着通过使用装载碱基的(S)-DMT-丝氨醇(GalNAc)-琥珀酰-lcaa-CPG (7)或(S)-DMT-丝氨醇(GalNAc)-CEP (5)来实现。三触角GalNAc簇(ST23/ST43)通过分支trebler amidite衍生物(C6XLT-phos)，随后为GalNAc amidite(ST23-phos)的相继偶联而引入。(vp)-mU部分的附着通过在最后一个合成循环中使用(vp)-mU-phos来实现。(vp)-mU-phos并不提供适合于进一步合成延长的羟基，并且因此，并不具有DMT基团。因此，(vp)-mU-phos的偶联导致合成终止。
为了去除掩盖乙烯基膦酸酯的甲酯，使携带完全组装的寡核苷酸的CPG在减压下干燥，并且转移到配备有圆盘熔块(disc frit) (Carl Roth GmbH)的用于固相肽合成的20ml PP注射器反应器内。然后在室温下，使CPG与250 µL TMSBr和177 µL吡啶的CH2Cl2溶液(0.5 ml/µmol固体支持物结合的寡核苷酸)接触，并且用鲁尔帽密封反应器。将反应容器在2x15分钟的时期内略微搅动，弃去过量试剂，并且用10 ml乙腈将残留CPG洗涤2x。进一步的下游处理与任何其它实施例化合物没有不同。
通过40%含水甲胺处理(90分钟，RT)，从CPG中切下单链。所得到的粗制寡核苷酸通过在AKTA Pure HPLC System上的离子交换层析(Resource Q，6 ml，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度进行纯化。将含有产物的级分合并，在尺寸排除柱(Zetadex，EMP Biotech)上脱盐并冻干，直到进一步使用。
所有最终的单链产物都通过AEX-HPLC进行分析，以证明其纯度。各单链产物的身份通过LC-MS分析来证明。
实施例8 - 双链形成
将各条单链以60 OD/ml的浓度溶解于H2O中。将两种个别寡核苷酸溶液一起加入反应容器中。为了更容易的反应监测，执行滴定。第一链以超过第二链的25%过量加入，如通过在260 nm处的UV吸收确定的。将反应混合物加热到80℃，共5分钟，然后缓慢冷却到RT。通过离子配对反相HPLC监测双链形成。根据残留单链的UV区域，计算第二链的所需量并加入反应混合物中。将反应再次加热到80℃，并且缓慢冷却到RT。重复这一程序，直到检测到少于10%的残留单链。
实施例9
体内研究，显示在1或5 mg/kg GalNAc缀合的siRNA的单次皮下给药后，在鼠肝脏组织中的C3 mRNA和血清蛋白敲减。
8周龄的雌性C57BL/6N小鼠得自CHARLES RIVER，Sulzfeld，德国。动物实验根据2013年7月版本的德国动物保护法(German Protection of Animals)的伦理指导原则来执行。小鼠根据重量随机化到4只小鼠的组内。在研究的第0天时，动物接受溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1或5 mg/kg siRNA、或作为对照的仅PBS的单次皮下剂量。在研究期间监测小鼠的生存力、体重和行为，没有病理发现。在应用前、第4天、第10天和第14天获取血清样品。在第14天，终止研究，对动物实施安乐死，并且将肝脏样品快速冷冻并贮存在– 80°C下，直到进一步分析。为了分析，根据制造商的方案，使用来自Stratec的InviTrap SpinTissue RNA Mini Kit分离RNA。以单重384孔形式，在来自Applied Biosystems的QuantStudio6装置上，使用C3和肌动蛋白特异性引物探针组和Takyon™ One-Step LowRox Probe 5X MasterMix dTTP执行QPCR。表达差异使用ΔΔCt法进行计算，并且针对PBS对照实验标准化的C3相对于管家基因肌动蛋白的相对表达用于不同siRNA的比较。EV0107、EV0313和EV0110诱导肝脏C3 mRNA的剂量依赖性敲减。使用5 mg/kg siRNA，使用EV0107(57%)和EV0110 (61%)分别观察到所实现的最大敲减。结果显示于图6A。该图显示了在GalNAc缀合的siRNA EV0107、EV0313和EV0110的单次给药后14天，在鼠肝脏中以%表示的相对C3 mRNA表达。形成每种siRNA双链体的单链的身份及其序列将在说明书末尾的表中找到。数据在条形图中显示为平均值± SD (n=4/组)。
血清样品使用商购可得的C3 ELISA Kit进行分析。分析根据制造商的方案进行，并且C3血清水平相对于分别的给药前水平进行计算。结果显示于图6B中。该图显示了来自小鼠血清样品的以%表示的相对C3蛋白血清水平，所述血清样品在5mg/kg EV0313、EV0110和EV0107 GalNAc缀合的siRNA给药前、在给药后在研究的第4天、第10天和第14天获取。数据显示为平均值± SD (n=3或4/组)。
实施例10
在原代小鼠、人和食蟹猴肝细胞中的体外研究，显示以1、10和100nM的所测试的siRNA-GalNAc缀合物的C3敲减功效。
测量了在与以1、10和100nM的GalNAc siRNA缀合物EV0201、EV0203、EV0204、EV0205和EV0207一起温育后的C3 mRNA表达(图7)。siRNA序列和修饰在表3和表5中列出。管家基因肌动蛋白的mRNA水平充当管家对照。人和食蟹猴原代肝细胞以40,000个细胞/孔的密度接种到胶原I包被的96孔板(Life Technologies)内。小鼠肝细胞以25,000个细胞/孔的密度接种。紧在先前定义的培养基中铺平板后，加入GalNAc缀合的siRNA至100、10和1 nM的最终siRNA浓度。然后，使板在37℃下在5% CO2气氛中温育24小时。随后，使细胞裂解，并且使用InviTrap RNA Cell HTS96 Kit/C (Stratec)分离RNA。
10 µl RNA溶液用于通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的基因表达分析，所述反应分别用ACTB (Eurogentec)和C3 (BioTez GmbH，Berlin，德国)的扩增子组/序列执行。RT-qPCR反应用ABI StepOne Plus (Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific的分公司，Massachusetts，USA)，使用RT-PCR的标准方案(48℃ 30分钟，95℃ 10分钟，以95℃ 15秒随后为60℃ 1分钟的40个循环)进行。数据通过使用也称为2-ΔΔCt法的比较CT法进行计算。siRNA EV0201、EV0203、EV0204、EV0205和EV0207显示原代肝细胞中的C3 mRNA表达的剂量依赖性抑制。
实施例11
体内研究，显示在5或10 mg/kg GalNAc缀合的修饰siRNA的单次皮下给药后，在鼠肝脏组织中的C3 mRNA和血清蛋白敲减。
siRNA序列和修饰在表3和表5中列出。管家基因肌动蛋白的mRNA水平充当管家对照。约8周龄的雄性C57BL/6N小鼠得自CHARLES RIVER，Sulzfeld，德国。动物实验遵照1998年匈牙利法案(Hungarian Act)：XXVIII规范动物保护的原则(由2011年CLVIII法案最新修改)和关于动物实验的政府法令(Government Decree) 40/2013进行。将小鼠分配到4只小鼠的组内。在研究的第0天时，动物接受溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5或10 mg/kgsiRNA、或作为对照的仅PBS的单次皮下剂量。在研究期间监测小鼠的生存力、体重和行为，没有病理发现。在应用前、第4天、第10天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天获取血清样品。在第14天和第42天，分别终止一半的组，对动物实施安乐死，并且将肝脏样品快速冷冻并贮存在– 80°C下，直到进一步分析。
为了分析，根据制造商的方案，使用来自Stratec的InviTrap Spin Tissue RNAMini Kit分离RNA。以单重384孔形式，在来自Applied Biosystems的QuantStudio6装置上，使用C3和肌动蛋白特异性引物探针组和Takyon™ One-Step Low Rox Probe 5XMasterMix dTTP执行RT-qPCR。表达差异使用ΔΔCt法进行计算，并且针对PBS组标准化的C3相对于管家基因肌动蛋白的相对表达用于不同siRNA的比较。
所有测试的siRNA (EV0201、EV0203、EV0204、EV0205和EV0207)在5或10 mg/kg的单一剂量后14天后，将C3 mRNA表达抑制多于70% (图8A)。在42天后，对于10 mg/kg siRNA剂量，EV0203、EV0204、EV0205和EV0207对C3表达的抑制仍多于80%的敲减(图8B)。
对于C3蛋白水平分析，使用商购可得的C3 ELISA Kit测量血清样品。分析根据制造商的方案进行，并且% C3血清水平相对于在基线时/在应用前的组平均值和相对于时间匹配的PBS对照组的平均值进行计算。关于C3蛋白分析的数据映射来自RNA分析的结果(图9)。EV0203、EV0204、EV0205和EV0207能够诱导长效C3血清降低。对于EV0203获得在10 mg/kg的单次应用后的42天，高达80%的减少(图9B)。
实施例12
靶向C3的各种siRNA在体外是活性的。
在Hep3B细胞中0.1 - 10 nM siRNA的转染后，确定siRNA EJ0001、EJ0002、EJ0003和EJ0004的C3敲减功效。结果在图10中进行描绘。在用EJ0001转染后，观察到C3 mRNA水平的剂量依赖性减少，具有最大约90%的敲减。EJ0002、EJ0003和EJ0004处于相似的活性范围。
对于用siRNA转染Hep3B细胞，将细胞以12,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内。在接种后24小时，用Atufect脂质体转染试剂进行siRNA的转染。用靶向C3的siRNA以0.1、1和10 nM一式三份执行筛选。靶向萤火虫萤光素酶(“Luc”)的siRNA用作对照。在与siRNA一起温育24小时后，去除培养基，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过TaqMan qRT-PCR确定C3和ApoB mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值± SD。
实施例13
靶向人C3的各种siRNA在体外是活性的。
在Hep3B细胞中0.01 - 1 nM siRNA的转染后，确定siRNA EJ0001、EJ0005、EJ0006和EJ0007的C3敲减功效。结果在图11中进行描绘。在用1 nM转染后，C3 mRNA敲减对于所有测试的siRNA为90%左右，并且在0.1 nM下，敲减对于EJ0001、EJ0006和EJ0007为50%左右。EJ0005表现更好，具有在0.1 nM下80%的敲减。
对于用siRNA转染Hep3B细胞，将细胞以8,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内。在接种后24小时，用Atufect脂质体转染试剂进行siRNA的转染。在0.01、0.1和1 nM的siRNA浓度下，一式三份执行筛选。靶向萤火虫萤光素酶(“Luc”)的siRNA用作对照。在与siRNA一起温育24小时后，去除培养基，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过TaqMan qRT-PCR确定C3和PTEN mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值± SD。
实施例14
靶向小鼠C3的各种siRNA在体外是活性的。
在AML12细胞中0.01 - 10 nM siRNA的转染后，确定siRNA EJ0001、EJ005、EJ0006和EJ0007的C3敲减功效。结果在图12中进行描绘。在siRNA转染后，达到剂量依赖性的C3mRNA敲减，具有60%左右的最大值。
对于AML12细胞的转染，将细胞以6,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内。在接种后24小时，用Atufect脂质体转染试剂进行siRNA的转染。用靶向C3的siRNA以0.01、0.1、1和10 nM一式三份执行筛选。靶向萤火虫萤光素酶(“Luc”)的siRNA用作对照。在与siRNA一起温育24小时后，去除培养基，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过TaqMan qRT-PCR确定C3和PTEN mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值± SD。
实施例15
靶向小鼠C3的各种GalNAc缀合的siRNA在体外是活性的。
在小鼠原代肝细胞中的受体介导的摄入后，确定GalNAc siRNA缀合物EV0201、EJ0010、EJ0011、EJ0012、EJ0014和EJ0015的C3 mRNA敲减效率。结果在图13中进行描绘。实现了剂量依赖性敲减，具有75%左右的最大值。
小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内，并且在铺平板后直接用100、10、1和0.1 nM GalNAc缀合的siRNA进行治疗。GalNAc缀合的乱序序列用作非靶向对照(NTC)。在与GalNAc缀合物一起温育24小时后，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过Taqman qRT-PCR确定C3和APOB mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值± SD。
实施例16
靶向食蟹猴C3的各种GalNAc缀合的siRNA在体外是活性的。
在食蟹猴原代肝细胞中的受体介导的摄入后，确定GalNAc siRNA缀合物EV0201、EJ0010、EJ0011、EJ0012、EJ0014和EJ0015的C3 mRNA敲减效率。结果在图14中进行描绘。实现了剂量依赖性敲减，具有90%左右的最大值。
食蟹猴原代肝细胞以36,500个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内，并且在铺平板后直接用100和10 nM GalNAc缀合的siRNA进行治疗。GalNAc缀合的乱序序列用作非靶向对照(NTC)。在与GalNAc缀合物一起温育24小时后，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过Taqman qRT-PCR确定C3和APOB mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值±SD。
实施例17
GalNAc缀合的siRNA的变体阻遏原代小鼠肝细胞中的C3。
在小鼠原代肝细胞中的受体介导的摄入后，确定GalNAc-siRNA缀合物EV0201及其变体(EJ0009、EV0203)、EJ0014及其变体(EJ0019、EJ0020)、EJ0015及其变体(EJ0021-23)、以及EJ0012及其变体(EJ0016-18)的C3 mRNA敲减效率。结果在图15中进行描绘。用一些变体实现了剂量依赖性敲减，具有85%左右的最大值。
小鼠原代肝细胞以25,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内，并且在铺平板后直接用100、10和1 nM GalNAc缀合的siRNA进行治疗。GalNAc缀合的乱序序列用作非靶向对照(NTC)。在与GalNAc缀合物一起温育24小时后，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过Taqman qRT-PCR确定C3和APOB mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值±SD。
实施例18
GalNAc缀合的siRNA的变体阻遏原代食蟹猴肝细胞中的C3
在食蟹猴原代肝细胞中的受体介导的摄入后，确定GalNAc-siRNA缀合物EV0201及其变体(EJ0009、EV0203)、EJ0014及其变体(EJ0019、EJ0020)、EJ0015及其变体(EJ0021-23)、以及EJ0012及其变体(EJ0016-18)的C3 mRNA敲减效率。结果在图16中进行描绘。用一些变体实现了剂量依赖性敲减，具有90%左右的最大值。
食蟹猴原代肝细胞以40,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板内，并且在铺平板后直接用100、10和1 nM GalNAc缀合的siRNA进行治疗。GalNAc缀合的乱序序列用作非靶向对照(NTC)。在与GalNAc缀合物一起温育24小时后，使细胞裂解，并且提取总RNA。通过Taqman qRT-PCR确定C3和ACTB mRNA水平。各个条状物代表来自三个技术重复的平均值± SD。
实施例19
体外研究，显示在1或3 mg/kg GalNAc缀合的C3 siRNA EJ0020的单次皮下给药后，在鼠肝脏组织中的C3 mRNA和血清蛋白敲减。
8周龄的雄性C57BL/6N小鼠得自Janvier，法国。动物实验根据2013年7月版本的德国动物保护法的伦理指导原则来执行。小鼠根据重量随机化到4只小鼠的组内。在研究的第0天时，动物接受溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1或3 mg/kg siRNA、或作为对照的仅PBS的单次皮下剂量。在研究期间监测小鼠的生存力、体重和行为，没有病理发现。在应用前、第7天、第14天、第28天和第43天获取血清样品。在第43天，终止研究，对动物实施安乐死，并且将肝脏样品快速冷冻并贮存在– 80°C下，直到进一步分析。
为了分析，根据制造商的方案，使用来自Stratec的InviTrap Spin Tissue RNAMini Kit分离RNA。以单重384孔形式，在来自Applied Biosystems的QuantStudio6装置上，使用C3和肌动蛋白特异性引物探针组和Takyon™ One-Step Low Rox Probe 5XMasterMix dTTP执行qPCR。表达使用ΔΔCt法进行计算，并且针对PBS标准化的C3相对于管家基因的相对表达用于比较。使用1 mg/kg siRNA EJ0020观察到38%的C3 mRNA敲减，并且使用3 mg/kg的同一siRNA观察到73%的C3敲减。结果显示于图17中(数据在条形图中显示为平均值± SD (n=4/组))。
血清中的C3蛋白水平使用商购可得的C3 ELISA Kit获得。分析根据制造商的方案进行，并且C3血清水平相对于分别的给药前水平进行计算。结果显示于图18中(数据显示为平均值± SD (n=3或4/组))。
实施例20
在原代人肝细胞中的体外研究，显示以1、10和100nM的所测试的siRNA-GalNAc缀合物的C3敲减功效。
在与以1、10和100nM的GalNAc siRNA缀合物EV0210、EV0211、EV0212和EV0213一起温育后的C3 mRNA表达显示于图19中。siRNA GalNAc缀合物在表3中列出。基因APOB的mRNA水平充当管家对照。
人原代肝细胞以40,000个细胞/孔的密度接种到胶原I包被的96孔板(LifeTechnologies)内。紧在铺平板后，加入GalNAc缀合的siRNA至100、10和1 nM的最终siRNA浓度。然后，使板在37℃下在5% CO2气氛中温育24小时。随后，使细胞裂解，并且使用InviTrapRNA Cell HTS96 Kit/C (Stratec)分离RNA。
10 µl RNA溶液用于通过逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)的基因表达分析，所述反应分别用APOB (Eurogentec)和C3 (BioTez GmbH，Berlin，德国)的扩增子组/序列执行。RT-qPCR反应用ABI StepOne Plus (Applied Biosystems，Thermo Fisher Scientific的分公司，Massachusetts，USA)，使用RT-PCR的标准方案(48℃ 30分钟，95℃ 10分钟，以95℃ 15秒随后为60℃ 1分钟的40个循环)进行。数据通过使用也称为2-ΔΔCt法的比较CT法进行计算。
siRNA EV0210、EV0211、EV0212和EV0213能够以剂量依赖方式抑制原代人肝细胞中的C3 mRNA表达。
实施例21
C3 siRNA GalNAc缀合物在C3肾小球病(C3G)的鼠疾病模型中的功效的体内研究。
EV0203在C3肾小球病的鼠疾病模型和野生型小鼠中进行测试。杂合补体因子H缺陷小鼠(Cfh def.)用作C3肾小球病疾病模型。用单一剂量的EV0203或对照(PBS或非靶向siRNA)治疗动物。在治疗10天后处死小鼠，并且通过用抗C3抗体的C3染色，在小鼠的肾脏中测量C3的肾小管沉积，并进行定量(结果显示于图20中)。确定为Ba片段/全长FB的比率的补体因子B (FB)片段化，也通过蛋白质印迹在血浆中进行测量，并进行定量 - 结果显示于图21中。C3染色的结果显示，通过用缀合的C3 siRNA的治疗，肾小管C3沉积以剂量依赖性方式显著降低。FB片段化数据显示，与野生型小鼠相比，Cfh def.小鼠具有增加的FB片段化水平，但这种增加的片段化水平可以通过用缀合的C3 siRNA的治疗而减少。因此，缀合的C3siRNA预计成为用于C3有关疾病，且特别是用于C3肾小球病和/或至少其症状的有力治疗。
实施例22
多重剂量的C3 siRNA GalNAc缀合物在C3肾小球病(C3G)的鼠疾病模型中的功效的体内研究。
EV0203在C3肾小球病的鼠疾病模型中进行测试。杂合补体因子H缺陷小鼠(Cfhdef.)用作C3肾小球病疾病模型。7至8月龄的小鼠在研究的第一天时进行治疗，然后用5mg/kg的EV0203或者作为对照的PBS或非靶向siRNA每月治疗一次。用PBS治疗的野生型小鼠也用作对照。在研究开始后三个月(即，在用缀合的C3 siRNA或对照的三次治疗后)处死小鼠。通过蛋白质印迹测量血浆中的C3α链和C3α链片段(活化的C3片段)水平，并进行定量(结果显示于图22A和22B中)。确定为Ba片段/全长FB的比率的补体因子B (FB)片段化，也通过蛋白质印迹在血浆中进行测量，并进行定量 - 结果显示于图23中。这些数据确认，缀合的C3 siRNA有效地减少老年小鼠中的C3片段水平和FB片段化。
肾小球C3d沉积也通过C3d染色进行测量。三个剂量的缀合的C3 siRNA能够将Cfhdef.小鼠的肾小球C3d沉积减少到与年龄匹配的野生型小鼠相似的水平。因此，缀合的C3siRNA预计成为用于C3有关疾病，且特别是用于C3肾小球病和/或至少其症状的有力治疗。
实施例23
来自上述实施例的缀合的C3 siRNA，包括EV0210、EV0212和EJ0020，在健康的食蟹猴体内进行测试。用不同剂量的缀合的C3 siRNA，将动物治疗一次或多次。来自用测试的缀合C3 siRNA治疗的猴的初步数据显示血清中减少的C3蛋白水平。这些体内实验目前正在进行中。计划缀合的C3 siRNA在健康的食蟹猴体内的另外测试。在用不同剂量的缀合的C3siRNA治疗一次或多次后，测量血清中的C3蛋白水平，并且测量肝脏组织中的C3 mRNA水平。在用有效剂量的缀合C3 siRNA的治疗后，血清中的C3蛋白水平和肝脏中的C3 mRNA水平两者均预计是减少的。
声明
下述声明代表了本发明的各方面。
1. 一种用于抑制补体组分C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列包含至少15个核苷酸的序列，其与以下序列中的任何一个相差不多于3个核苷酸：SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377、361、95、111、125、131、1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、97、99、101、103、105、107、109、113、115、117、119、121、123、127、129、133或416。
2. 声明1的核酸，其中
(a)第一链序列包含与表1的任何一个第一链序列相差不多于3个核苷酸的、至少18个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列包含与该表的同一行中的第二链序列相差不多于3个核苷酸的、至少18个核苷酸的序列；
(b)第一链序列包含与表1的任何一个第一链序列相差不多于1个核苷酸的、至少18个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列包含与该表的同一行中的第二链序列相差不多于1个核苷酸的、至少18个核苷酸的序列；
(c)第一链序列包含表1的任何一个第一链序列的、至少18个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列包含该表的同一行中的第二链序列的、至少18个核苷酸的序列；或
(d)第一链序列由表1的任何一个第一链序列组成，并且任选地其中第二链序列由该表的同一行中的第二链序列的序列组成；
其中表1是：
第一链序列(SEQ ID NO:) 第二链序列(SEQ ID NO:)
364 363或375
365 363
366 367或376
368 369
370 379或371，优选379
372 373
362 374
377 378
361 112
95 96
111 112
125 126
131 132
1 2
3 4
5 6
7 8
9 10
11 12
13 14
15 16
17 18
19 20
21 22
23 24
25 26
27 28
29 30
31 32
33 34
35 36
37 38
39 40
41 42
43 44
45 46
47 48
49 50
51 52
53 54
55 56
57 58
59 60
61 62
63 64
65 66
67 68
69 70
71 72
73 74
75 76
77 78
79 80
81 82
83 84
85 86
87 88
89 90
91 92
93 94
97 98
99 100
101 102
103 104
105 106
107 108
109 110
113 114
115 116
117 118
119 120
121 122
123 124
127 128
129 130
133 134
416 26
3. 前述声明中任一个的核酸，其中第一链序列包含SEQ ID NO: 361的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 112的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 95的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 96的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 125的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 126的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 131的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 132的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 364的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 363或375的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 365的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 363的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 366的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 367或376的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 368的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 369的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 370的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 371或379，优选379的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 372的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 373或380的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 362的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 374的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 377的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 378的序列的至少15个核苷酸的序列；或其中第一链序列包含SEQ ID NO: 416的序列，并且任选地其中第二链序列包含SEQ ID NO: 26的序列的至少15个核苷酸的序列。
4. 一种用作药物的能够抑制补体组分C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链。
5. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链和第二链是分开的链，并且各自为长度18-25个核苷酸。
6. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链和第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。
7. 前述声明中任一个的核酸，其中所述双链体区域由17-25个连续的核苷酸碱基对组成。
8. 前述声明中任一个的核酸，其中所述核酸：
a)在两端处是平端；
b)具有在一端处的突出端和在另一端处的平端；或
c)具有在两端处的突出端。
9. 前述声明中任一个的核酸，其中所述核酸是siRNA。
10. 前述声明中任一个的核酸，其中所述核酸介导RNA干扰。
11. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链和/或第二链的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸。
12. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链的至少核苷酸2和14通过第一修饰进行修饰，所述核苷酸从在所述第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
13. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链的每个偶数编号的核苷酸都通过第一修饰进行修饰，所述核苷酸从在所述第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
14. 声明12-13中任一个的核酸，其中所述第一链的奇数编号的核苷酸通过第二修饰进行修饰，其中所述第二修饰与第一修饰不同。
15. 声明12-14的核酸，其中所述第二链在对应于第一链的偶数编号的核苷酸的位置中的核苷酸通过第三修饰进行修饰，其中所述第三修饰与第一修饰不同。
16. 声明12-15的核酸，其中所述第二链在对应于第一链的奇数编号的核苷酸的位置中的核苷酸通过第四修饰进行修饰，其中当存在第二修饰和/或第三修饰时，所述第四修饰与第二修饰不同，并且与第三修饰不同。
17. 声明12-14的核酸，其中所述第二链在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中的一个或多个核苷酸通过第四修饰进行修饰，并且优选地，其中未通过第四修饰进行修饰的第二链的核苷酸通过第三修饰进行修饰。
18. 声明12-17的核酸，其中如果两种修饰均存在于核酸中，则第一修饰与第四修饰相同，并且优选地，如果两种修饰均存在于核酸中，则第二修饰与第三修饰相同。
19. 声明12-18的核酸，其中所述第一修饰是2’-F修饰；如果存在于核酸中，则所述第二修饰优选为2’-OMe修饰；如果存在于核酸中，则所述第三修饰优选为2’-OMe修饰；并且如果存在于核酸中，则所述第四修饰优选为2’-F修饰。
20. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链和第二链的每个核苷酸都是修饰的核苷酸。
21. 前述声明中任一个的核酸，其中所述第一链具有在其5’端处的末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，其中所述末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。
22. 前述声明中任一个的核酸，其中所述核酸包含在第一链和/或第二链的末端两个或三个3'核苷酸和/或5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，并且优选地其中在剩余的核苷酸之间的所述键合是磷酸二酯键合。
23. 声明1-21中任一个的核酸，其包含在所述第一链的3’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，和/或包含在所述第二链的3’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，和/或在所述第二链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在所述第一链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸之间的除二硫代磷酸酯键合外的键合。
24. 声明23的核酸，其中当在所述端部处不存在二硫代磷酸酯键合时，所述核酸包含在所述第一链上的三个末端3'核苷酸各自之间和/或在三个末端5'核苷酸各自之间、和/或在所述第二链的三个末端3'核苷酸各自之间和/或在三个末端5'核苷酸各自之间的硫代磷酸酯键合。
25. 声明23的核酸，其中除在所述第一链的3’端处的两个末端核苷酸之间的键合、以及在所述第二链的3’端和5’端处的两个末端核苷酸之间的键合外，在两条链的核苷酸之间的所有键合都是磷酸二酯键合。
26. 前述声明中任一个的核酸，其中所述核酸与配体缀合。
27. 声明26的核酸，其中所述配体包含(i)一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分或其衍生物，以及(ii)接头，其中所述接头将所述至少一种GalNAc部分或其衍生物与所述核酸缀合。
28. 声明1-27中任一个的核酸，其中所述核酸与包含式(II)的化合物的配体缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
其中：
S代表糖，优选地其中所述糖是N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m是1、2或3；
P是磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯；
X2是亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n = 1- 6；
A是分支单元；
X3代表桥接单元；
其中如声明1至27中任一个定义的核酸经由磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选硫代磷酸酯与X3缀合。
29. 声明1-27中任一个的核酸，其中所述核酸的第一链是式(V)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE066
(V)
其中b是0或1；和
其中所述第二链是式(VI)的化合物：
Figure DEST_PATH_IMAGE067
(VI)；
其中：
c和d独立地是0或1；
Z1和Z2分别为所述核酸的第一链和第二链；
Y独立地是O或S；
n独立地是0、1、2或3；和
L1是配体与之附着的接头，其中L1在式(V)和(VI)中是相同或不同的，并且当L1在同一式内出现多于一次时，在式(V)和(VI)内是相同或不同的；
并且其中b + c + d是2或3。
30. 一种组合物，其包含前述声明中任一个的核酸和溶剂和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。
31. 一种组合物，其包含声明1-29中任一个的核酸以及选自寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的进一步治疗剂。
32. 声明1-3或5-29中任一个的核酸或者声明30-31中任一个的组合物，其用作药物。
33. 声明1-29中任一个的核酸或声明30-32中任一个的组合物，其用于预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征。
34. 声明33的核酸或组合物，其中所述疾病、病症或综合征是补体介导的疾病、病症或综合征。
35. 声明33-34中任一个的核酸或组合物，其中所述疾病、病症或综合征与补体途径的异常激活或过度激活和/或C3的过表达或异位表达或定位或累积相关。
36. 声明33-35中任一个的核酸或组合物，其中所述疾病、病症或综合征：
a)选自C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)、原发性膜性肾病、免疫复合物介导的肾小球肾炎(IC介导的GN)、感染后肾小球肾炎(PIGN)、系统性红斑狼疮(SLE)、缺血/再灌注损伤、年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎(RA)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、菌群失调性牙周病、疟疾性贫血、视神经脊髓炎、HCT/实体器官移植后(TMA、格巴二氏综合征、膜性肾小球肾炎、血栓性血小板减少性紫癜和脓毒症；
b)选自C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)和原发性膜性肾病；
c)选自C3肾小球病(C3G)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)、IgA肾病(IgA N)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；
d)选自C3肾小球病(C3G)、冷凝集素病(CAD)、重症肌无力(MG)、视神经脊髓炎、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、IgA肾病(IgA N)、HCT/实体器官移植后(TMA)、格巴二氏综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、膜性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和血栓性血小板减少性紫癜；
e)选自C3肾小球病(C3G)、冷凝集素病(CAD)和IgA肾病(IgA N)；或
f) C3肾小球病(C3G)。
37. 声明1-29中任一个的核酸或声明30-31中任一个的组合物在预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征中的用途，其中所述疾病、病症或综合征优选为C3肾小球病(C3G)。
38. 一种预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征的方法，其包括向需要治疗的个体施用药学有效剂量的声明1-29或32-36中任一个的核酸或者声明30-36中任一个的组合物，优选地其中所述核酸或组合物皮下、静脉内或者通过经口、直肠或腹膜内施用而施用于受试者。
概括表
概括双链体表 - 表3
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Figure DEST_PATH_IMAGE069
Figure DEST_PATH_IMAGE070
概括缩写表 - 表4
Figure DEST_PATH_IMAGE071
Figure DEST_PATH_IMAGE072
如上文缩写表中所示的缩写可以在本文中使用。缩写列表可能并非详尽的，并且进一步的缩写及其含义可以在本文件各处找到。
概括序列表 - 表5
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Claims (16)

1. 一种用于抑制补体组分C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列包含至少15个核苷酸的序列，其与序列SEQ ID NO: 370、364、365、366、368、372、377或416中的任何一个相差不多于3个核苷酸。
2.一种用作药物的能够抑制补体组分C3表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链。
3.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述第一链和第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。
4.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸介导RNA干扰。
5.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述第一链和/或第二链的至少一个核苷酸是修饰的核苷酸，优选地所述修饰的核苷酸是非天然存在的核苷酸，例如2’-F修饰的核苷酸。
6.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述第一链的至少核苷酸2和14通过第一修饰进行修饰，所述核苷酸从在所述第一链的5’端处的核苷酸编号1开始连续编号。
7. 前述权利要求中任一项的核酸，其中所述第一链在其5’端处具有末端5’ (E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。
8.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸包含在第一链和/或第二链的末端两个或三个3'核苷酸和/或5'核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，并且优选地其中在剩余的核苷酸之间的所述键合是磷酸二酯键合。
9.前述权利要求中任一项的核酸，其包含在所述第一链的3’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，和/或包含在所述第二链的3’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，和/或在所述第二链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在所述第一链的5’端处的两个、三个或四个末端核苷酸之间的除二硫代磷酸酯键合外的键合。
10.前述权利要求中任一项的核酸，其中所述核酸与配体缀合。
11.权利要求10的核酸，其中所述配体包含(i)一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分或其衍生物，以及(ii)接头，其中所述接头将所述至少一种GalNAc部分或其衍生物与所述核酸缀合。
12.一种组合物，其包含前述权利要求中任一项的核酸和溶剂和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂和/或选自寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的进一步治疗剂。
13.权利要求1和3-11中任一项的核酸或权利要求12的组合物，其用作药物。
14.权利要求1和3-11中任一项的核酸或权利要求12的组合物，其用于预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征，其中所述疾病、病症或综合征优选补体介导的疾病、病症或综合征。
15. 权利要求1和3-11中任一项的核酸或权利要求12的组合物在预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征中的用途，其中所述疾病、病症或综合征优选地选自C3肾小球病(C3G)、冷凝集素病(CAD)和IgA肾病(IgA N)。
16. 预防疾病、病症或综合征，降低患有疾病、病症或综合征的风险，或者治疗疾病、病症或综合征的方法，其包括向需要治疗的个体施用药学有效量的权利要求1和3-11中任一项的核酸或权利要求12的组合物，其中所述疾病、病症或综合征优选地选自C3肾小球病(C3G)、冷凝集素病(CAD)和IgA肾病(IgA N)。
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