CN118234861A - 用于抑制细胞中的补体因子b(cfb)表达的核酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干扰补体因子B(CFB)基因表达或抑制其表达的核酸产物。核酸优选地用于补体相关疾病、障碍或综合征特别是C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgAN)、重症肌无力(MG)和原发性膜性肾病的预防或治疗。

Description

用于抑制细胞中的补体因子B(CFB)表达的核酸
发明领域
本发明涉及干扰或抑制补体因子B(CFB)基因表达的核酸产物。其进一步涉及此种抑制比如用于治疗与补体途径失调(特别是旁路途径)和/或与CFB在体内的过度激活或与其异位表达或定位或累积相关的疾病和障碍的治疗用途。
背景
能够通过互补碱基配对与表达的mRNA结合的双链RNA(dsRNA)已显示通过被称为“RNA干扰(RNAi)”的机制阻断基因表达(Fire等人1998,Nature.1998Feb 19；391(6669):806-11和Elbashir等人2001,Nature.2001 May 24；411(6836):494-8)。短dsRNA在许多生物体(包括脊椎动物)中指导基因特异性的转录后沉默，并且已成为用于研究基因功能的有用工具。RNAi由RNA诱导的沉默复合物(RISC)介导，所述RISC为序列特异的多组分核酸酶，其降解与加载到RISC复合物中的沉默触发剂具有足够互补性或同源性的信使RNA。干扰RNA比如siRNA、反义RNA和微小RNA为通过基因沉默来阻止蛋白形成即通过降解mRNA分子来抑制蛋白的基因翻译的寡核苷酸。基因沉默剂对于医学中的治疗应用正变得越来越重要。
根据Watts和Corey在Journal of Pathology(2012；第226卷，第365-379页)，存在可用于设计核酸沉默触发剂的算法，但所有这些均具有严重的局限性。可能需要各种实验方法来鉴定有效的siRNA，因为算法并未考虑到诸如靶mRNA的三级结构或RNA结合蛋白的牵涉等因素。因此，具有最小脱靶效应的有效核酸沉默触发剂的发现为一个复杂过程。对于这些高度荷电分子的药物开发，必要的是它们可经济地合成，分布到靶组织，进入细胞并在可接受的毒性限度内发挥功能。
补体系统或途径为针对入侵病原体的宿主防御的先天免疫系统的部分。其主要地由以前体形式在血流中循环的许多蛋白组成。形成补体系统的大多数蛋白，包括补体组分蛋白C3(在本文中也简称为C3)，在很大程度上由肝脏中的肝细胞合成并分泌到血流中。该系统的激活导致炎症反应，导致吞噬细胞的吸引和调理作用和因此的病原体、免疫复合物和细胞碎片的清除(Janeway的Immunobiology第9版)。补体系统由3个途径(经典的、瘦素和旁路途径)组成，其全部在所谓的补体组分3转化酶复合物的形成处会聚。这些酶复合物将补体组分C3蛋白切割成C3a和C3b。一旦被切割，C3b就形成复合物的一部分，后者依次又将C5切割成C5a和C5b。在切割之后，C5b为主要补体途径效应物——膜攻击复合物的关键组分之一。因此，C3为补体系统激活途径的关键组分。
补体因子B(CFB或“因子B”)参与旁路途径的激活。CFB与C3b的结合(例如在细胞表面上)使CFB易于被因子D切割，形成丝氨酸蛋白酶C3Bb，其本身为C3转化酶，导致C3激活的扩增环。CFB主要地在肝脏以及以低水平在几个肝外部位合成。
几种疾病与补体途径的异常获得性或遗传性激活以及与C3的异常或过度表达相关。其中包括C3肾小球病(CFBG)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、免疫复合物介导的肾小球肾炎(IC介导的GN)、感染后肾小球肾炎(PIGN)、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎(LN；SLE的肾脏并发症)、缺血/再灌注损伤和IgA肾病(IgA N；在Ricklin等人Nephrology,2016等中综述)。这些疾病中的大多数与肾脏相关，因为该器官对补体诱导的损害特别敏感。然而，其它器官的疾病也已知与补体功能障碍有关，比如年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎(RA)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、菌群失调性牙周病、疟疾性贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)和脓毒症。
目前仅存在用于补体系统介导的疾病、障碍和综合征的少数治疗。单克隆人源化抗体依库珠单抗为其中之一。其已知结合补体蛋白C5，由此阻断在补体级联末尾的膜攻击复合物(Hillmen等人2006NEJM)。然而，仅患有以上所列疾病的患者子集响应依库珠单抗疗法。因此，对于补体介导或相关疾病的医学治疗存在高度未满足的需求。C3为补体途径激活中的关键因子。因此，抑制诸如参与C3激活的CFB等因子的表达呈现出用于许多补体介导的疾病的有希望的治疗策略。靶向CFB表达或活性，例如经反义寡核苷酸或小分子抑制剂，已推荐作为各种补体介导的病症包括AMD(Grossman等人Molecular Vision 2017；23:561-571)和狼疮性肾炎(Grossman等人Immunobiology 2016；221:701-708)的潜在治疗策略。
WO200404554、WO2007089375、WO2015089368、WO2019027015、WO2019089922和WO2021222549描述了双链siRNA，WO2015038939、WO2015168635描述了靶向于CFB的单链反义寡核苷酸(＝ASO)。
发明概述
本发明的一个方面为用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸，其中核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰等价物包含与表5a所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。
第一链序列的未修饰等价物可例如包含与表1所列的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。
因此，本文所述的核酸为能够抑制CFB表达(优选地在细胞中)的双链核酸，并且可用作治疗剂或诊断剂，例如在相关的诊断或治疗方法中。核酸包含第一链和第二链或由其组成，并且第一链一般包含与CFB mRNA充分地互补以便介导RNA干扰的序列。
一个方面涉及组合物，其包含如本文公开的核酸和溶剂(优选地水)和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。
一个方面涉及组合物，其包含如本文公开的核酸和选自例如寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的另一治疗剂。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含它的组合物，其用作治疗剂或诊断剂，例如在相关方法中。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含它的组合物，其用于预防或治疗疾病、障碍或综合征。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含它的组合物在预防或治疗疾病、障碍或综合征中的用途。
一个方面涉及如本文公开的核酸或包含它的组合物在制备用于预防或治疗疾病、障碍或综合征的药物中的用途。
一个方面涉及预防或治疗疾病、障碍或综合征的方法，包括给予需要治疗的个体药学上有效剂量或量的如本文公开的核酸或包含它的组合物，优选地其中核酸或组合物皮下、静脉内或者通过口服、直肠、肺、肌内或腹膜内给予来给予受试者。
发明详述
本发明涉及核酸及其组合物，所述核酸为双链的并且其包含与CFB的表达的RNA转录本同源的序列。这些核酸、其缀合物和包含它们的组合物可用于预防和治疗其中CFB基因产物的表达减少为合乎期望的各种疾病、障碍和综合征。
本发明的第一方面为用于抑制CFB表达的双链核酸，优选地在细胞中，其中核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰等价物包含与表5a所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。这些核酸除其他外具有在对于临床前和临床开发相关的各种物种中为活性的和/或具有很少相关脱靶效应的优点。具有很少相关脱靶效应意指核酸特异性地抑制预期靶标而不显著抑制其它基因，或者在治疗可接受的水平上仅抑制一种或很少其它基因。
例如，第一链序列的未修饰等价物可包含与表1所列的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。
优选地，第一链序列的未修饰等价物包含与表5a所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸，优选地不超过2个核苷酸，更优选地不超过1个核苷酸，和最优选地不相差任何核苷酸的至少16个，更优选地至少17个，仍然更优选地至少18个和最优选地全部19个核苷酸的序列。
例如，第一链序列的未修饰等价物可包含与表1所列的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸，优选地不超过2个核苷酸，更优选地不超过1个核苷酸，和最优选地不相差任何核苷酸的至少16个，更优选地至少17个，仍然更优选地至少18个和最优选地全部19个核苷酸的序列。
优选地，核酸第一链序列的未修饰等价物由表5a所示的第一链序列之一组成。然而，该序列可通过并不变化核苷酸身份的许多核酸修饰进行修饰。例如，核酸的主链或糖残基的修饰并不变化核苷酸的身份，因为碱基本身保持与参考序列中相同。
例如，核酸第一链序列的未修饰等价物可由表1所示的第一链序列之一组成，任选地通过所述核酸修饰中的一种或多种进行修饰。
包含根据本文参考序列的序列的核酸意指核酸包含按如参考序列限定的顺序的邻接核苷酸序列。
当本文提及包含核苷酸或由其组成的参考序列时，这种提及并不限于具有未修饰核苷酸的序列。相同提及还涵盖其中一个，几个比如二、三、四、五、六、七或更多个(包括全部)核苷酸通过修饰比如2’-OMe、2’-F、配体、接头、3’端或5’端修饰或任何其它修饰进行修饰的同一核苷酸序列。其还指其中两个或更多个核苷酸通过天然磷酸二酯键合或通过任何其它键合比如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合彼此连接的序列。
双链核酸为这样的核酸，其中第一链和第二链在其长度的至少一部分上彼此杂交并因此能够在生理条件下，比如在PBS中于37℃下以每条链1μM的浓度形成双链体区域。第一和第二链优选地能够彼此杂交并因此在至少15个核苷酸，优选地16、17、18或19个核苷酸的区域上形成双链体区域。该双链体区域包含在两条链之间的核苷酸碱基配对，优选地基于Watson-Crick碱基配对和/或摇摆碱基配对(比如GU碱基配对)。在双链体区域内两条链的所有核苷酸不必彼此碱基配对以形成双链体区域。在两条链的核苷酸序列之间一定数目的错配、缺失或插入为可接受的。在第一或第二链任一端上的突出端或者在双链核酸任一端处的未配对核苷酸也是可能的。双链核酸优选地在生理条件下为稳定的双链核酸，并且优选地例如在PBS中于每条链1μM的浓度下具有45℃或更高，优选地50℃或更高，和更优选地55℃或更高的解链温度(Tm)。
在生理条件下稳定的双链核酸为例如在PBS中于每条链1μM的浓度下具有45℃或更高，优选地50℃或更高，和更优选地55℃或更高的Tm的双链核酸。
第一链和第二链优选地能够在i)其长度的至少一部分上，优选地在其长度两者的至少15个核苷酸上，ii)在第一链的整个长度上，iii)在第二链的整个长度上或iv)在第一和第二链两者的整个长度上，形成双链体区域(即彼此互补)。链在一定长度上彼此互补意指该链能够在该长度上经由Watson-Crick或摇摆碱基配对彼此碱基配对。只要在生理条件下可形成稳定的双链核苷酸，则该长度的每个核苷酸不一定必须能够在整个给定长度上与其在另一条链上的对应物(counterpart)碱基配对。然而，在某些实施方案中，如果该长度的每个核苷酸可在整个给定长度上与其在另一条链上的对应物碱基配对，则其为优选的。
在第一链和靶序列之间或在第一链和第二链之间一定数目的错配、缺失或插入在siRNA的情况下可为容许的，并且在某些情况下甚至具有增加RNA干扰(例如抑制)活性的潜力。
根据本发明核酸的抑制活性依赖于第一链的全部或一部分和靶核酸的一部分之间双链体区域的形成。与第一链形成双链体区域的靶核酸部分为靶核酸序列或简称为靶序列，所述双链体区域被定义为以第一链和靶序列之间形成的第一个碱基对开始并以第一链和靶序列之间形成的最后一个碱基对结束，包含起止碱基对在内。在第一链和第二链之间形成的双链体区域无需与在第一链和靶序列之间形成的双链体区域相同。即，第二链可具有与靶序列不同的序列；然而，至少在生理条件下，第一链必须能够与第二链和靶序列两者都形成双链体结构。
在第一链和靶序列之间的互补性可为完全的(即与靶序列相比较100％的同一性，在第一链中没有核苷酸错配或插入或缺失)。
在第一链和靶序列之间的互补性可为不完全的。互补性可为约70％-约100％。更具体地讲，互补性可为至少70％、80％、85％、90％或95％以及中间值。
在第一链和靶序列的互补序列之间的同一性可在约75％-约100％的范内围。更具体地讲，互补性可为至少75％、80％、85％、90％或95％以及中间值，条件是核酸能够减少或抑制CFB的表达。
在第一链和靶序列之间具有小于100％互补性的核酸可以能够将CFB的表达减少至与在第一链和靶序列之间具有完全互补性的核酸相同的水平。备选地，其可以能够将CFB的表达减少至由具有完全互补性的核酸达到的减少水平的15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的水平。
本公开的核酸可为这样的核酸，其中：
(a)第一链序列的未修饰等价物包含与表5a的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列的未修饰等价物包含与表5a的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列的未修饰等价物包含与表5a的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列的未修饰等价物包含表5a的第一链序列中任何一种的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含相应第二链序列的序列；
(i)第一链序列的未修饰等价物由表5a的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物由相应第二链序列的序列组成；
(j)第一链序列的未修饰等价物基本上由表5a所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物基本上由表5a所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列组成；
(k)第一链序列的未修饰等价物由对应于从表5a所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列的未修饰等价物进一步地由表5a所示的具有给定SEQ IDNo.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，
并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含表5a所示的具有给定SEQ IDNo.的相应第二链序列的序列或者基本上由其组成或由其组成；
(l)第一链序列的未修饰等价物由对应于从表5a所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列的未修饰等价物进一步地由表5a所示的具有给定SEQ IDNo.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
其中所述第一链序列的未修饰等价物由与SEQ ID NO.758的CFB转录本互补的，长度为17-25个核苷酸、优选地长度为18-24个核苷酸的邻接区域组成；和
任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含表5a所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或者基本上由其组成或由其组成；
(m)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物存在于单链上，其中第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸；或
(n)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物在两条单独的链上，这两条链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸。
例如，本公开的核酸可为这样的核酸，其中：
(a)第一链序列的未修饰等价物包含与表1的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列的未修饰等价物包含与表1的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列的未修饰等价物包含与表1的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列的未修饰等价物包含表1的第一链序列中任何一种的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含相应第二链序列的序列；
(i)第一链序列的未修饰等价物由表1的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物由相应第二链序列的序列组成；
(j)第一链序列的未修饰等价物基本上由表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物基本上由表1所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列组成；
(k)第一链序列的未修饰等价物由对应于从表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列的未修饰等价物进一步地由表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，
并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含表1所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或者基本上由其组成或由其组成；
(l)第一链序列的未修饰等价物由对应于从表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列的未修饰等价物进一步地由表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
其中所述第一链序列的未修饰等价物由与SEQ ID NO.758的CFB转录本互补的长度为17-25个核苷酸、优选地长度为18-24个核苷酸的邻接区域组成；和
任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含表1所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或者基本上由其组成或由其组成；
(m)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物存在于单链上，其中第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸；或
(n)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物在两条单独的链上，这两条链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸。
“对应的”第二链意指存在于与表5a、5b或5c中给定的第一链同一双链体中的，或者视情况而定，作为表1或表2中作为相应第二链序列所列的第二链。也就是说，在表5a、5b或5c中，第一链及其对应的第二链分别被指定为具有给定双链体ID的双链体的“A”和“B”链，或者在表1和2中如此描述。
表1：
在一个方面，如果第一链的最5’核苷酸为除A或U以外的核苷酸，则该核苷酸由A或U替代。优选地，如果第一链的最5’核苷酸为除U以外的核苷酸，则该核苷酸由U并且更优选地由具有5’乙烯基膦酸酯的U替代。
当本发明的核酸不包含参考第一链和/或第二链序列的整个序列(如例如表1、2、5a、5b或5c中给出的)，或者一条或两条链与相应的参考序列相差一、二或三个核苷酸时，与包含整个第一链和第二链参考序列的相应核酸在可比较实验中的抑制活性相比较，该核酸优选地保留至少30％，更优选地至少50％，更优选地至少70％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％，仍然更优选地至少95％和最优选地至少100％的CFB抑制活性。
能够在生理条件下杂交的核酸为这样的核酸，其能够在链中的相对核苷酸的至少一部分之间形成碱基对，优选地Watson-Crick或摇摆碱基对，以便形成至少一个双链体区域。此种双链核酸优选地为在生理条件下(例如在PBS中，于37℃下，在每条链1μM的浓度下)稳定的双链核酸，意指在此类条件下，两条链保持彼此杂交。双链核苷酸的Tm优选地为45℃或更高，优选地为50℃或更高和更优选地为55℃或更高。
本发明的一个方面涉及用于抑制CFB表达的核酸，其中核酸包含与表5a或表1的第一链未修饰等价物序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸，优选地不超过2个核苷酸，更优选地不超过1个核苷酸和最优选地不相差任何核苷酸的至少15个，优选地至少16个，更优选地至少17个，仍然更优选地至少18个和最优选地所有核苷酸的第一序列，第一序列能够在生理条件下与靶基因转录本(比如mRNA)杂交。优选地，核酸进一步地包含与表5a或表1的相应第二链未修饰等价物序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸，优选地不超过2个核苷酸，更优选地不超过1个核苷酸和最优选地不相差任何核苷酸的至少15个，优选地至少16个，更优选地至少17个，仍然更优选地至少18个和最优选地所有核苷酸的第二序列，第二序列能够在生理条件下与第一序列杂交并且优选地核酸为能够经由RNAi途径抑制CFB表达的siRNA。
一个方面涉及优选地用于抑制CFB表达的如表5a、5b或5c中公开的任何双链核酸，其每一个可通过给定的双链体ID来指代，条件是双链核酸能够抑制CFB的表达。这些核酸全部为siRNA。一些(表5a)由未修饰的核苷酸序列组成。其他的(表5b)包含各种核苷酸和/或主链修饰。仍然其他的(表5c)为包含GalNAc部分的缀合物，其可特异性地靶向具有GalNAc受体的细胞，比如肝细胞。
一个方面涉及能够抑制CFB表达的双链核酸，优选地在细胞中，用作治疗或诊断剂，例如在相关的治疗或诊断方法中，其中核酸优选地包含第一链和第二链或由其组成并且优选地其中第一链包含与CFB mRNA充分地互补以便介导RNA干扰的序列。
本文所述的核酸可以能够抑制CFB的表达。抑制可为完全的，即0％的剩余表达。CFB表达的抑制可为部分的，即其可为在不存在本发明核酸的情况下的CFB表达水平的15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多或中间值的抑制。抑制水平可通过将处理样品与未处理样品或与用对照(比如不靶向CFB的siRNA)处理的样品相比较进行测量。抑制可通过测量CFB mRNA和/或蛋白水平或者与CFB的存在或活性相关联的生物标记物或指标的水平来测量。其可在已用本文所述的核酸体外处理的细胞中进行测量。备选地或另外，抑制可在已从先前用本文公开的核酸治疗的受试者获取的细胞比如肝细胞，或组织比如肝脏组织，或器官比如肝脏中，或者在体液比如血液、血清、淋巴或任何其它身体部分或流体中进行测量。优选地，CFB表达的抑制通过以下进行确定：将在理想条件下(关于适当的浓度和条件参见实施例)用本文公开的双链RNA进行24或48小时体外处理之后于CFB表达细胞中测量的CFB mRNA水平，与在相同条件下未处理或模拟处理或用对照双链RNA处理的对照细胞中测量的CFB mRNA水平相比较。
本发明的一个方面涉及核酸，其中第一链和第二链存在于绕圈的核酸单链上，使得第一链和第二链能够彼此杂交并由此形成具有双链体区域的双链核酸。
优选地，核酸的第一链和第二链为单独的链。两条单独的链优选地各自为长度17-25个核苷酸，更优选地为长度18-25个核苷酸。两条链可具有相同或不同的长度。第一链的长度可为17-25个核苷酸，优选地其长度可为18-24个核苷酸，其长度可为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。最优选地，第一链的长度为19个核苷酸。第二链的长度可独立地为17-25个核苷酸，优选地，其长度可为18-24个核苷酸，其长度可为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸。更优选地，第二链的长度为18或19或20个核苷酸，和最优选地其长度为19个核苷酸。
优选地，核酸的第一链和第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。更优选地，双链体区域的长度为18-24个核苷酸。双链体区域的长度可为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在最优选的实施方案中，双链体区域的长度为18或19个核苷酸。双链体区域在此定义为在与第二链的核苷酸碱基配对的第一链的最5’核苷酸至与第二链的核苷酸碱基配对的第一链的最3’核苷酸之间并且包括其的区域。双链体区域可包含任一或两条链中不与另一条链中的核苷酸碱基配对的核苷酸。其可包含在第一链和/或第二链上的一、二、三或四个此类核苷酸。然而，优选地，双链体区域由17-25个连续核苷酸碱基对组成。也就是说其优选地包含全部与另一条链中的核苷酸碱基配对的两条链上的17-25个连续核苷酸。更优选地，双链体区域由18或19个连续核苷酸碱基对组成，最优选地由18个组成。
在本文公开的每个实施方案中，核酸可在两端处为平端的；具有在一端处的突出端和在另一端处的平端；或具有在两端处的突出端。
核酸可具有在一端处的突出端和在另一端处的平端。核酸可具有在两端处的突出端。核酸可在两端处为平端的。核酸可在具有第一链的5’端和第二链的3’端的端部处或在第一链的3’端和第二链的5’端处为平端的。
核酸可包含在3’或5’端处的突出端。核酸可具有第一链上的3’突出端。核酸可具有第二链上的3’突出端。核酸可具有第一链上的5’突出端。核酸可具有第二链上的5’突出端。核酸可具有第一链的5’端和3’端两者处的突出端。核酸可具有第二链的5’端和3’端两者处的突出端。核酸可具有第一链上的5’突出端和第二链上的3’突出端。核酸可具有第一链上的3’突出端和第二链上的5’突出端。核酸可具有第一链上的3’突出端和第二链上的3’突出端。核酸可具有第一链上的5’突出端和在第二链上的5’突出端。
在第二链或第一链的3’端或5’端处的突出端的长度可由1、2、3、4和5个核苷酸组成。任选地，突出端可由1或2个核苷酸组成，核苷酸可以修饰或可以不修饰。
在一个实施方案中，第一链的5’端为一、二或三个核苷酸、优选一个核苷酸的单链突出端。
优选地，核酸为siRNA。siRNA为短干扰或短沉默RNA，其能够通过RNA干扰(RNAi)途径抑制靶基因的表达。抑制通过在转录之后靶基因mRNA转录本的靶向降解而发生。siRNA形成RISC复合物的一部分。RISC复合物通过第一(反义)链与靶序列的序列互补性而特异性地靶向靶RNA。
优选地，核酸介导RNA干扰(RNAi)。优选地，核酸介导RNA干扰，其效力为至少50％的抑制，更优选地至少70％，更优选地至少80％，甚至更优选地至少90％，仍然更优选地至少95％和最优选地100％的抑制。抑制效力优选地通过在可比较实验中，将用CFB特异性siRNA处理的细胞比如肝细胞中的CFB mRNA水平与用对照处理的细胞中的CFB mRNA水平相比较而进行测量。对照可为用非CFB靶向siRNA或不用siRNA的处理。因此，核酸或至少核酸的第一链优选地能够掺入到RISC复合物中。结果，核酸或至少核酸的第一链因此能够将RISC复合物引导至核酸或至少核酸的第一链与其至少部分地互补的特异性靶RNA。然后，RISC复合物特异性地切割该靶RNA并且结果导致RNA源于的基因的表达抑制。
核酸修饰
本文讨论的核酸包括未修饰的RNA以及已进行修饰例如以改善效力或稳定性的RNA。未修饰的RNA是指其中核酸的组分，即糖、碱基和磷酸酯部分，与自然界中存在的例如如在人体中天然存在的那些相同或基本上相同的分子。如本文使用的，术语“修饰的核苷酸”是指其中核苷酸的一种或多种组分，即糖、碱基和磷酸酯部分，与自然界中存在的那些不同的核苷酸。在某些情况下，术语“修饰的核苷酸”也指因为它们缺乏核苷酸的基本组分比如糖、碱基或磷酸酯部分或具有其取代而在该术语的严格意义上并非为核苷酸的分子。包含此类修饰的核苷酸的核酸仍然被理解为核酸，即使核酸的一个或多个核苷酸已由缺乏核苷酸的基本组分或具有其取代的修饰的核苷酸替代。
本发明核酸的修饰通常提供在克服潜在限制方面的有力工具，所述潜在限制包括但不限于天然RNA分子固有的体外和体内稳定性和生物利用度。根据本发明的核酸可通过化学修饰进行修饰。修饰的核酸还可使在人类中诱导干扰素活性的可能性最小化。修饰可进一步增强核酸至靶细胞的功能性递送。本发明修饰的核酸可包含第一链或第二链中任一或两者的一个或多个化学修饰的核糖核苷酸。核糖核苷酸可包含碱基、糖或磷酸酯部分的化学修饰。核糖核酸可通过用核酸或碱基的类似物的取代或其插入进行修饰。
在本发明的整个说明书中，“相同或共通的修饰”意指对任何核苷酸的相同修饰，其为用基团比如甲基(2’-OMe)或氟基(2’-F)修饰的A、G、C或U。例如，2’-F-dU、2’-F-dA、2’-F-dC、2’-F-dG全部视为相同或共通的修饰，2’-OMe-rU、2’-OMe-rA；2’-OMe-rC；2’-OMe-rG也是如此。相比之下，与2’-OMe修饰相比较，2’-F修饰为不同的修饰。
优选地，核酸的第一和/或第二链的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，优选地非天然存在的核苷酸，比如优选地2’-F修饰的核苷酸。
修饰的核苷酸可为具有糖基修饰的核苷酸。2’羟基(OH)可用许多不同的“氧基”或“脱氧”取代基进行修饰或替代。
“氧基”-2’羟基修饰的实例包括烷氧基或芳氧基(OR，例如R＝H、烷基(比如甲基)、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2CH2O)nCH2CH2OR；“锁”核酸(LNA)，其中2’羟基例如通过亚甲基桥与相同核糖的4’碳连接；O-AMINE(AMINE＝NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)nAMINE(例如AMINE＝NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。
“脱氧”修饰包括氢、卤素、氨基(例如NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINE(AMINE＝NH2、烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基)、-NHC(O)R(R＝烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷基-硫代-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，其可任选地由例如氨基官能团取代。某些实施方案的其它取代基包括2’-甲氧基乙基、2’-OCH3、2’-O-烯丙基、2’-C-烯丙基和2’-氟。
糖基还可含有一个或多个碳，其具有与核糖中的相应碳相反的立体化学构型。因此，修饰的核苷酸可含有糖比如阿拉伯糖。
修饰的核苷酸还可包括“脱碱基”糖，其缺乏在C-1’处的核碱基。这些脱碱基糖可进一步含有在一个或多个成分糖原子处的修饰。
2’修饰可与一个或多个磷酸酯核苷间接头修饰(例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯)组合使用。
本发明核酸的一个或多个核苷酸可为修饰的。核酸可包含至少一个修饰的核苷酸。修饰的核苷酸可在第一链中。修饰的核苷酸可在第二链中。修饰的核苷酸可在双链体区域中。修饰的核苷酸可在双链体区域外面，即在单链区域中。修饰的核苷酸可在第一链上并且可在双链体区域外面。修饰的核苷酸可在第二链上并且可在双链体区域外面。第一链的3’-末端核苷酸可为修饰的核苷酸。第二链的3’-末端核苷酸可为修饰的核苷酸。第一链的5’-末端核苷酸可为修饰的核苷酸。第二链的5’-末端核苷酸可为修饰的核苷酸。
本发明的核酸可具有1个修饰的核苷酸或者本发明的核酸可具有约2-4个修饰的核苷酸，或者核酸可具有约4-6个修饰的核苷酸、约6-8个修饰的核苷酸、约8-10个修饰的核苷酸、约10-12个修饰的核苷酸、约12-14个修饰的核苷酸、约14-16个修饰的核苷酸、约16-18个修饰的核苷酸、约18-20个修饰的核苷酸、约20-22个修饰的核苷酸、约22-24个修饰的核苷酸、约24-26个修饰的核苷酸或约26-28个修饰的核苷酸。在每种情况下，包含所述修饰核苷酸的核酸与不含所述修饰核苷酸的相同核酸相比较保留其活性的至少50％或反之亦然。该核酸与相同但不含所述修饰核苷酸的核酸相比较，可保留其活性的55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％以及中间值，或者可具有不含所述修饰核苷酸的相同核酸活性的多于100％。
修饰的核苷酸可为嘌呤或嘧啶。至少一半的嘌呤可为修饰的。至少一半的嘧啶可为修饰的。所有嘌呤均可为修饰的。所有嘧啶都均可为修饰的。修饰的核苷酸可选自：3’末端脱氧胸腺嘧啶(dT)核苷酸、2’-O-甲基(2’-OMe)修饰的核苷酸、2’修饰的核苷酸、2’脱氧修饰的核苷酸、锁核苷酸、脱碱基核苷酸、2’氨基修饰的核苷酸、2’烷基修饰的核苷酸、2’-脱氧-2’-氟(2’-F)修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯、包含非天然碱基的核苷酸、包含5’-硫代磷酸酯基团的核苷酸、包含5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物的核苷酸以及与胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。
核酸可包含含有修饰碱基的核苷酸，其中碱基选自2-氨基腺苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、吡啶-4-酮、吡啶-2-酮、苯基、假尿嘧啶、2,4,6-三甲氧基苯、3-甲基尿嘧啶、二氢尿苷、萘基、氨基苯基、5-烷基胞苷(例如5-甲基胞苷)、5-烷基尿苷(例如核糖胸苷)、5-卤代尿苷(例如5-溴尿苷)、6-氮杂嘧啶、6-烷基嘧啶(例如6-甲基尿苷)、丙炔、辫苷(quesosine)、2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、怀丁苷、怀丁氧苷(wybutoxosine)、4-乙酰胞苷、5-(羧基羟甲基)尿苷、5’-羧甲基氨甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨甲基尿苷、β-D-半乳糖基辫苷(galactosylqueosine)、1-甲基腺苷、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟苷、3-甲基胞苷、2-甲基腺苷、2-甲基鸟苷、N6-甲基腺苷、7-甲基鸟苷、5-甲氧基氨甲基-2-硫代尿苷、5-甲基氨甲基尿苷、5-甲基羰基甲基尿苷、5-甲氧基尿苷、5-甲基-2-硫代尿苷、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺苷、β-D-甘露糖基辫苷、尿苷-5-氧基乙酸和2-硫代胞苷。
本文所述且在核酸内发生的许多修饰将在多核苷酸分子内重复，比如碱基，或磷酸酯部分，或磷酸酯部分的非连接O的修饰。在一些情况下，修饰将发生在多核苷酸中的所有可能位置/核苷酸处，但在许多情况下其将不发生。修饰可能仅发生在3’或5’末端位置处，可仅发生在末端区域中，比如在末端核苷酸上的某个位置处或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可发生在双链区域、单链区域或两者中。修饰可仅发生在本发明核酸的双链区域中或可仅发生在本发明核酸的单链区域中。在非连接O位置处的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰可仅发生在一个或两个末端处，可仅发生在末端区域中，例如在末端核苷酸上的某个位置处或在链的最后2、3、4或5个核苷酸中，或者可发生在双链体和/或单链区域中，特别是在末端处。5’端和/或3’端可为磷酸化的。
可通过在突出端中包括特定碱基，或者通过在单链突出端中，例如在5’或3’突出端或两者中包括修饰的核苷酸，来增加本发明核酸的稳定性。嘌呤核苷酸可被包括在突出端中。3’或5’突出端中的所有或一些碱基可为修饰的。修饰可包括使用在核糖2’OH基团处的修饰、使用脱氧核糖核苷酸代替核糖核苷酸，以及在磷酸酯基中的修饰比如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰。突出端无需与靶序列同源。
核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。然而，对核酸的化学修饰可赋予改善的性质，并且可使寡核糖核苷酸对核酸酶更稳定。
如本文使用的，修饰的核酸可包括以下中的一种或多种：
(i)一个或两个非连接磷酸酯氧和/或一个或多个连接磷酸酯氧(即使在本发明核酸的5’和3’末端处也称为连接)的改变，例如替代；
(ii)核糖的成分例如核糖上2’羟基的改变，例如替代；
(iii)用“脱磷酸”接头替代磷酸酯部分；
(iv)天然存在的碱基的修饰或替代；
(v)核糖-磷酸酯主链的替代或修饰；和
(vi)第一链和/或第二链的3’端或5’端的修饰，例如末端磷酸酯基的去除、修饰或替代，或者部分例如荧光标记的部分与一条或两条链的3’或5’端的缀合。
术语“替代”、“修饰”和“改变”指示与天然存在的分子的差异。
具体修饰在以下更详细地讨论。
核酸可包含在第二和/或第一链上修饰的一个或多个核苷酸。交替的核苷酸可为修饰的，以形成修饰的核苷酸。
如本文所述的，“交替”意指以规律方式一个接一个地发生。换言之，交替意指重复地依次发生。例如，如果一个核苷酸为修饰的，则下一个邻接核苷酸并非为修饰的并且接下来的邻接核苷酸为修饰的，依此类推。一个核苷酸可用第一修饰进行修饰，下一个邻接核苷酸可用第二修饰进行修饰和接下来的邻接核苷酸用第一修饰进行修饰，依此类推，其中第一和第二修饰为不同的。
本发明一些代表性的修饰的核酸序列显示于实例中。这些实例意指为代表性而非限制性的。
在核酸的一个方面，第一链的至少核苷酸2和14优选地通过第一共通修饰进行修饰，核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。第一修饰优选地为2’-F。
在一个方面，第一链的至少一个、几个或优选地所有偶数编号的核苷酸优选地通过第一共通修饰进行修饰，核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。第一修饰优选地为2’-F。
在一个方面，第一链的至少一个、几个或优选地所有奇数编号的核苷酸为修饰的，核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。优选地，它们通过第二修饰进行修饰。如果核酸还包含例如第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸的第一修饰，则该第二修饰优选地与第一修饰不同。第一修饰优选地为在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的2’核糖修饰可例如为2’-F、2’-H、2’-卤代或2’-NH2。第二修饰优选地为在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可例如为2’-OMe、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少至至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一修饰优选地为2’-F和/或第二修饰优选地为2’-OMe。
在本公开的上下文中，取代基比如2’核糖修饰的大小或体积优选地测量为范德华体积。
在一个方面，在对应于第一链偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或优选地所有核苷酸优选地通过第三修饰进行修饰。优选地，在同一核酸中，第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸用第一修饰进行修饰。另外或备选地，第一链奇数编号的核苷酸用第二修饰进行修饰。优选地，第三修饰与第一修饰不同和/或第三修饰与第二修饰相同。第一修饰优选地为在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的2’核糖修饰可例如为2’-F、2’-H、2’-卤代或2’-NH2。第二和/或第三修饰优选地为在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可例如为2’-OMe、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少至至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一修饰优选地为2’-F和/或第二和/或第三修饰优选地为2’-OMe。第一链上的核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。
第二链在对应于例如第一链偶数编号的核苷酸的位置中的核苷酸为与第一链偶数编号的核苷酸碱基配对的第二链的核苷酸。
在一个方面，在对应于第一链奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或优选地所有核苷酸优选地通过第四修饰进行修饰。优选地，在同一核酸中，第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸用第一修饰进行修饰。另外或备选地，第一链奇数编号的核苷酸用第二修饰进行修饰。另外或备选地，在对应于第一链偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸均用第三修饰进行修饰。第四修饰优选地与第二修饰不同和优选地与第三修饰不同并且第四修饰优选地与第一修饰相同。第一和/或第四修饰优选地为在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的2’核糖修饰可例如为2’-F、2’-H、2’-卤代或2’-NH2。第二和/或第三修饰优选地为在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可例如为2’-OMe、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少至至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一和/或第四修饰优选地为2’-OMe修饰和/或第二和/或第三修饰优选地为2’-F修饰。第一链上的核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。
在核酸的一个方面，在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中，第二链的一个/多个核苷酸通过第四修饰进行修饰。优选地，除在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中的一个/多个核苷酸以外，第二链的所有核苷酸均通过第三修饰进行修饰。优选地，在同一核酸中，第一链的核苷酸2和14或所有偶数编号的核苷酸用第一修饰进行修饰。另外或备选地，第一链的奇数编号的核苷酸用第二修饰进行修饰。第四修饰优选地与第二修饰不同和优选地与第三修饰不同并且第四修饰优选地与第一修饰相同。第一和/或第四修饰优选地为在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的任何2’核糖修饰，或锁核酸(LNA)，或非锁核酸(UNA)，或2’-氟阿拉伯核酸(FANA)修饰。在体积方面与2’-OH基团具有相同大小或更小的2’核糖修饰可例如为2’-F、2’-H、2’-卤代或2’-NH2。第二和/或第三修饰优选地为在体积方面大于2’-OH基团的任何2’核糖修饰。在体积方面大于2’-OH基团的2’核糖修饰可例如为2’-OMe、2’-O-MOE(2’-O-甲氧基乙基)、2’-O-烯丙基或2’-O-烷基，前提是在可比较条件下，核酸能够将靶基因的表达减少至至少与不含修饰的相同核酸相同的程度。第一和/或第四修饰优选地为2’-OMe修饰和/或第二和/或第三修饰优选地为2’-F修饰。第一链上的核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。
在核酸的一个方面，第一链所有偶数编号的核苷酸均通过第一修饰进行修饰，第一链所有奇数编号的核苷酸均通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸均通过第三修饰进行修饰，在对应于第一链奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸均通过第四修饰进行修饰，其中第一和/或第四修饰为2’-F和/或第二和/或第三修饰为2’-OMe。
在核酸的一个方面，第一链所有偶数编号的核苷酸均通过第一修饰进行修饰，第一链所有奇数编号的核苷酸均通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链的核苷酸11-13的位置中，第二链的所有核苷酸均通过第四修饰进行修饰，除对应于第一链的核苷酸11-13的核苷酸以外，第二链的所有核苷酸均通过第三修饰进行修饰，其中第一和第四修饰为2’-F并且第二和第三修饰为2’-OMe。在该方面的一个实施方案中，第二链的3’末端核苷酸为反向的RNA核苷酸(即核苷酸通过其3’碳而不是如通常情况将会是的那样通过其5’碳与链的3’端连接)。当第二链的3’末端核苷酸为反向的RNA核苷酸时，在其与天然核苷酸对应物相比较不包含任何修饰的意义上，反向的RNA核苷酸优选地为未修饰的核苷酸。具体地讲，反向的RNA核苷酸优选地为2’-OH核苷酸。优选地，在这方面，当第二链的3’末端核苷酸为反向的RNA核苷酸时，核酸至少在包含第一链的5’端的端部处为平端的。
本发明的一个方面为用于抑制CFB基因表达的如本文公开的核酸，所述抑制CFB基因表达优选地在细胞中，其中所述第一链包括在多个位置处修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸以促进核酸通过RISC的加工。
在一个方面，“促进通过RISC的加工”意指核酸可通过RISC进行加工，例如存在的任何修饰将允许核酸通过RISC进行加工，并且优选地将有益于通过RISC的加工，适当地使得siRNA活性可以发生。
如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸并未用2’OMe修饰进行修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11或位置13或位置11和13或位置11、12和13的一个或多个核苷酸并未用2’-OMe修饰进行修饰(换言之，它们并未进行修饰或用除2’-OMe以外的修饰进行修饰)。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置13的核苷酸为与第一链的位置13(从5’端开始)形成碱基对的核苷酸。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置11的核苷酸为与第一链的位置11(从5’端开始)形成碱基对的核苷酸。
在一个方面，第二链上对应于第一链的位置12的核苷酸为与第一链的位置12(从5’端开始)形成碱基对的核苷酸。
例如，在为双链和平端的19聚体核酸中，第一链的位置13(从5’端开始)将与第二链的位置7(从5’端开始)配对。第一链的位置11(从5’端开始)将与第二链的位置9(从5’端开始)配对。该命名法可适用于第二链的其它位置。
在一个方面，在第一和第二链部分地互补的情况下，第二链上“对应于”第一链上某个位置的核苷酸可不一定形成碱基对，如果该位置为其中存在错配的位置，但命名法的原则仍适用。
一个方面为如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸并未用2’-OMe修饰进行修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的核苷酸用2’-F修饰进行修饰。
一个方面为如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸用2’-F修饰进行修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的核苷酸并未用2’-OMe修饰进行修饰。
一个方面为如本文公开的核酸，其中在从第一链的5’端开始的位置2和14处的核苷酸用2’-F修饰进行修饰，并且第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的核苷酸用2’-F修饰进行修饰。
一个方面为如本文公开的核酸，其中第一和/或第二链的大于50％的核苷酸包含2’-OMe修饰，比如第一和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含2’-OMe修饰，优选地作为第一和第二链两者总核苷酸的百分比进行测量。
一个方面为如本文公开的核酸，其中第一和/或第二链的大于50％的核苷酸包含天然存在的RNA修饰，比如其中第一和/或第二链的大于55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％或更多包含此种修饰，优选地作为第一和第二链两者总核苷酸的百分比进行测量。合适的天然存在的修饰包括除2’-OMe之外的其它2’糖修饰，特别是导致DNA核苷酸的2’-H修饰。
一个方面为如本文公开的核酸，其在第一和/或第二链上包含不多于20％，比如不多于15％，比如不多于10％的具有并非2’-OMe修饰的2’修饰的核苷酸，优选地作为第一和第二链两者总核苷酸的百分比。
一个方面为如本文公开的核酸，其中第一和/或第二链中具有并非2’-OMe修饰的2’-修饰的核苷酸数目不多于7，更优选地不多于5，和最优选地不多于3。
一个方面为如本文公开的核酸，其在第一和/或第二链上包含不多于20％(比如不多于15％或不多于10％)的2’-F修饰，优选地作为两条链总核苷酸的百分比。
一个方面为如本文公开的核酸，其中第一和/或第二链中具有2’-F修饰的核苷酸数目不多于7，更优选地不多于5，和最优选地不多于3。
一个方面为如本文公开的核酸，其中所有核苷酸均用2’-OMe修饰进行修饰，除从第一链的5’端开始的位置2和14以及第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的核苷酸之外。优选地，并未用2’-OMe进行修饰的核苷酸在2’位置处用氟进行修饰(2’-F修饰)。
在某些实施方案中，一个优选的方面为如本文公开的核酸，其中核酸的所有核苷酸均在糖的2’位置处进行修饰。优选地，这些核苷酸用2’-F修饰进行修饰，其中修饰不为2’-OMe修饰。
在一个方面，核酸在第一链上用交替的2’-OMe修饰和2-F修饰进行修饰，并且位置2和14(从5’端开始)用2’-F进行修饰。优选地，第二链在第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的核苷酸处用2’-F修饰进行修饰。优选地，第二链在从互补(双链)区域的第一个位置处开始的3’端计数的位置11-13处用2’-F修饰进行修饰，并且剩余的修饰为天然存在的修饰，优选地2’-OMe。至少在这种情况下，互补区域从在第一链中具有相应核苷酸的第二链的第一个位置处开始，不管这两个核苷酸是否能够彼此碱基配对。
在核酸的一个方面，第一链和第二链的每个核苷酸均为修饰的核苷酸。
如本文所述的，术语“奇数编号的”意指不可被2除尽的编号。奇数编号的实例为1、3、5、7、9、11等等。如本文所述的术语“偶数编号的”意指可被2整除的编号。偶数编号的实例为2、4、6、8、10、12、14等等。
除非另外特别地说明，否则在本文中第一链的核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始邻接地编号。第二链的核苷酸以第二链3’端处的核苷酸编号1开始邻接地编号。
第一和/或第二链上的一个或多个核苷酸可为修饰的，以形成修饰的核苷酸。第一链的一个或多个奇数编号的核苷酸可为修饰的。第一链的一个或多个偶数编号的核苷酸可通过至少第二修饰进行修饰，其中至少第二修饰与一个或多个奇数核苷酸上的修饰不同。一个或多个修饰的偶数编号的核苷酸中的至少一个可与一个或多个修饰的奇数编号的核苷酸中的至少一个相邻。
第一链中的多个奇数编号的核苷酸在本发明的核酸中可为修饰的。第一链中的多个偶数编号的核苷酸可通过第二修饰进行修饰。第一链可包含通过共通修饰进行修饰的相邻核苷酸。第一链还可包含通过不同的第二修饰进行修饰的相邻核苷酸(即第一链可包含彼此相邻并通过第一修饰进行修饰的核苷酸以及彼此相邻并通过与第一修饰不同的第二修饰进行修饰的其它核苷酸)。
第二链的一个或多个奇数编号的核苷酸(其中核苷酸以第二链3’端处的核苷酸编号1开始邻接地编号)可通过与第一链上奇数编号的核苷酸(其中核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始邻接地编号)的修饰不同的修饰进行修饰和/或第二链的一个或多个偶数编号的核苷酸可通过第一链奇数编号的核苷酸的相同修饰进行修饰。第二链的一个或多个修饰的偶数编号的核苷酸中的至少一个可与一个或多个修饰的奇数编号的核苷酸相邻。第二链的多个奇数编号的核苷酸可通过共通修饰进行修饰和/或多个偶数编号的核苷酸可通过存在于第一链奇数编号的核苷酸上的相同修饰进行修饰。第二链上的多个奇数编号的核苷酸可通过与第一链奇数编号的核苷酸的修饰不同的修饰进行修饰。
第二链可包含通过共通修饰进行修饰的相邻核苷酸，所述共通修饰可为与第一链奇数编号的核苷酸的修饰不同的修饰。
在本发明核酸的一些方面，第一链中每个奇数编号的核苷酸和第二链中每个偶数编号的核苷酸可用共通修饰进行修饰，并且在第一链中每个偶数编号的核苷酸可用不同的修饰进行修饰以及在第二链中每个奇数编号的核苷酸可用不同的修饰进行修饰。
本发明的核酸可具有相对于第二链的未修饰或不同修饰的核苷酸移位至少一个核苷酸的第一链修饰的核苷酸。
在某些方面，在第一链中一个或多个或每个奇数编号的核苷酸可被修饰以及在第二链中一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可被修饰。任一或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可通过第二修饰进行修饰。在第一链中一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可被修饰以及在第二链中一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可被修饰。任一或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可通过第二修饰进行修饰。在第一链中一个或多个或每个奇数编号的核苷酸可被修饰以及在第二链中一个或多个奇数编号的核苷酸可通过共通修饰进行修饰。任一或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可通过第二修饰进行修饰。在第一链中一个或多个或每个偶数编号的核苷酸可被修饰以及在第二链中一个或多个或每个奇数编号的核苷酸可通过共通修饰进行修饰。任一或两条链上的一个或多个或每个交替的核苷酸可通过第二修饰进行修饰。
本发明的核酸可包含单链或双链构建体，其包含在一条或两者链中的至少两个交替修饰的区域。这些交替区域可包含至多约12个核苷酸，但优选地包含约3-约10个核苷酸。交替核苷酸的区域可位于本发明核酸的一条或两者链的末端处。核酸可包含在每个末端(3’和5’)处交替核苷酸中的4-约10个核苷酸，并且这些区域可由约5-约12个邻接未修饰的或者不同或共通修饰的核苷酸分开。
第一链奇数编号的核苷酸可为修饰的和偶数编号的核苷酸可用第二修饰进行修饰。第二链可包含用共通修饰进行修饰的相邻核苷酸，所述共通修饰可与第一链奇数编号的核苷酸的修饰相同。第二链的一个或多个核苷酸还可用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可以彼此相邻和与具有与第一链奇数编号的核苷酸的修饰相同的修饰的核苷酸相邻。第一链还可包含在3’端处和5’端处两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键合或在3’端处两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合。第二链可包含在5’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。第二链还可在5’端处与配体缀合。
本发明的核酸可包含含有用共通修饰进行修饰的相邻核苷酸的第一链。一个或多个此类核苷酸可与可用第二修饰进行修饰的一个或多个核苷酸相邻。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可为相邻的。第二链可包含用可与第一链一个或多个核苷酸的修饰之一相同的共通修饰进行修饰的相邻核苷酸。第二链的一个或多个核苷酸还可用第二修饰进行修饰。具有第二修饰的一个或多个核苷酸可为相邻的。第一链还可包含在3’端处和5’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯键合或在3’端处的两个核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合。第二链可包含在3’端处的两个核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。第二链还可在5’端处与配体缀合。
在第一链上从5’到3’以及在第二链上从3’到5’编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23和25的核苷酸可通过第一链上的修饰进行修饰。编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可通过第一链上的第二修饰进行修饰。编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可通过第二链上的修饰进行修饰。编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可通过第二链上的第二修饰进行修饰。为了本发明的核酸，核苷酸在第一链上从5’到3’和在第二链上从3’到5’进行编号。
编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可通过第一链上的修饰进行修饰。编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可通过第一链上的第二修饰进行修饰。编号为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23的核苷酸可通过第二链上的修饰进行修饰。编号为2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24的核苷酸可通过第二链上的第二修饰进行修饰。
明确的是，如果第一和/或第二链的长度短于25个核苷酸，比如长度为19个核苷酸，则不存在待修饰的编号为20、21、22、23、24和25的核苷酸。技术人员理解以上描述相应地适用于更短的链。
第一链上一个或多个修饰的核苷酸可与第二链上具有共通修饰的修饰的核苷酸配对。第一链上一个或多个修饰的核苷酸可与第二链上具有不同修饰的修饰的核苷酸配对。第一链上一个或多个修饰的核苷酸可与第二链上未修饰的核苷酸配对。第二链上一个或多个修饰的核苷酸可与第一链上未修饰的核苷酸配对。换言之，交替的核苷酸可在两条链上对齐，比如，第二链交替区域中的所有修饰与第一链中的相同修饰配对，或者备选地修饰可偏移一个核苷酸，其中一条链交替区域中的共通修饰与另一条链中的不同修饰(即第二或进一步修饰)配对。另一个选项为在每条链中具有不同修饰。
第一链上的修饰可相对于第二链上修饰的核苷酸移位一个核苷酸，使得共通修饰的核苷酸并不彼此配对。
一种和/或多种修饰可各自且个别地选自3’末端脱氧胸腺嘧啶、2’-OMe、2’脱氧修饰、2’氨基修饰、2’烷基修饰、吗啉代修饰、氨基磷酸酯修饰、5’-硫代磷酸酯基团修饰、5’磷酸酯或5’磷酸酯模拟物修饰以及胆固醇基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基团修饰，和/或修饰的核苷酸可为锁核苷酸、脱碱基核苷酸或包含非天然碱基的核苷酸中的任何一种。
至少一种修饰可为2’-OMe和/或至少一种修饰可为2’-F。如本文所述的进一步修饰可存在于第一和/或第二链上。
本发明的核酸可包含在一个或几个链端部处的反向的RNA核苷酸。这种反向的核苷酸提供给核酸稳定性。优选地，核酸包含在第一和/或第二链的3’端处和/或在第二链的5’端处的至少一个反向的核苷酸。更优选地，核酸包含在第二链的3’端处的反向核苷酸。最优选地，核酸包含在第二链的3’端处的反向RNA核苷酸并且该核苷酸优选地为反向的A。反向的核苷酸为通过其3’碳而不是如通常情况将会的那样通过其5’碳与核酸的3’端连接或者通过其5’碳而不是如通常情况将会的那样通过其3’碳与核酸的5’端连接的核苷酸。反向的核苷酸优选地并非作为突出端，而是与另一条链中的相应核苷酸相对存在于一条链的一端。相应地，核酸优选地在包含反向的RNA核苷酸的端部处为平端的。存在于链端部处的反向的RNA核苷酸优选地意指在链的该端部处的最后一个核苷酸为反向的RNA核苷酸。具有此种核苷酸的核酸为稳定的且易于合成。在其与天然核苷酸对应物相比较并不包含任何修饰的意义上，反向的RNA核苷酸优选地为未修饰的核苷酸。具体地讲，反向的RNA核苷酸优选地为2’-OH核苷酸。
本发明的核酸可包含在2’位置处用2’-H修饰的一个或多个核苷酸，并且因此在核酸内具有DNA核苷酸。本发明的核酸可包含在从第一链的5’端开始计数的第一链的位置2和/或14处的DNA核苷酸。核酸可包含在第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的DNA核苷酸。
在一个方面，每个本发明的核酸存在不多于一个DNA核苷酸。
本发明的核酸可包含一个或多个LNA核苷酸。本发明的核酸可包含在从第一链的5’端开始计数的第一链的位置2和/或14处的LNA核苷酸。核酸可包含在第二链上对应于第一链的位置11，或13，或11和13，或11-13的LNA。
本发明一些代表性的修饰的核酸序列显示于实例中。这些实例旨在为代表性而非限制性的。
在某些优选的实施方案中，核酸可包含第一修饰和第二或进一步修饰，所述修饰各自且个别地选自2’-OMe修饰和2’-F修饰。核酸可包含为2’-OMe可作为第一修饰的修饰以及为2’-F的第二修饰。本发明的核酸还可包括硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰和/或脱氧修饰，其可存在于每条链或两条链的每一端或任何一端的末端2或3个核苷酸中或之间。
在核酸的一个方面，第一和/或第二链的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸，其中如果第一链包含至少一个修饰的核苷酸，则：
(i)第一链的核苷酸2和14中的至少一个或两者通过第一修饰进行修饰；和/或
(ii)第一链的至少一个、几个或所有偶数编号的核苷酸通过第一修饰进行修饰；和/或
(iii)第一链的至少一个、几个或所有奇数编号的核苷酸通过第二修饰进行修饰；和/或
其中如果第二链包含至少一个修饰的核苷酸，则：
(iv)在对应于第一链偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第三修饰进行修饰；和/或
(v)在对应于第一链奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第四修饰进行修饰；和/或
(vi)在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第四修饰进行修饰；和/或
(vii)在除对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置以外的位置中，第二链的至少一个、几个或所有核苷酸通过第三修饰进行修饰；
其中第一链上的核苷酸以在第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号；
其中修饰优选地为以下中的至少一种：
(a)第一修饰优选地与第二和第三修饰不同；
(b)第一修饰优选地与第四修饰相同；
(c)第二和第三修饰优选地为相同修饰；
(d)第一修饰优选地为2’-F修饰；
(e)第二修饰优选地为2’-OMe修饰；
(f)第三修饰优选地为2’-OMe修饰；和/或
(g)第四修饰优选地为2’-F修饰；和
其中任选地核酸与配体缀合。
一个方面为用于抑制CFB表达的双链核酸，优选地在细胞中，其中核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰等价物包含与表5a或表1所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列，其中第一链所有偶数编号的核苷酸均通过第一修饰进行修饰，第一链所有奇数编号的核苷酸均通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链偶数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸均通过第三修饰进行修饰，在对应于第一链奇数编号的核苷酸的位置中，第二链的所有核苷酸均通过第四修饰进行修饰，其中第一和第四修饰为2’-F并且第二和第三修饰为2’-OMe。
一个方面为用于抑制CFB表达的双链核酸，优选地在细胞中，其中核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰等价物包含与表5a或表1所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列，其中第一链所有偶数编号的核苷酸均通过第一修饰进行修饰，第一链所有奇数编号的核苷酸均通过第二修饰进行修饰，在对应于第一链的核苷酸11-13的位置中，第二链的所有核苷酸均通过第四修饰进行修饰，除对应于第一链的核苷酸11-13的核苷酸以外的第二链的所有核苷酸均通过第三修饰进行修饰，其中第一和第四修饰为2’-F并且第二和第三修饰为2’-OMe。
寡核苷酸的3’和5’端可为修饰的。此类修饰可在分子的3’端或5’端或两端处。它们可包括整个末端磷酸酯或者磷酸酯基的一个或多个原子的修饰或替代。例如，寡核苷酸的3’和5’端可与其它功能性分子实体比如标记部分，例如荧光团(例如芘、TAMRA、荧光素、Cy3或Cy5染料)或保护基团(基于例如硫、硅、硼或酯)缀合。功能性分子实体可通过磷酸酯基和/或接头附接于糖。接头的末端原子可连接于或替代磷酸酯基的连接原子或者糖的C-3’或C-5’O、N、S或C基团。备选地，接头可连接于或替代核苷酸替代物(例如PNA)的末端原子。这些间隔子或接头可包括例如-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、-(CH2CH2O)nCH2CH2O-(例如n＝3或6)、脱碱基糖、酰胺、羧基、胺、氧胺、氧亚胺、硫醚、二硫化物、硫脲、磺酰胺或吗啉代或者生物素和荧光素试剂。3’端可为-OH基团。
末端修饰的其它实例包括染料、插层剂(intercalating agent)(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、得克萨卟啉(texaphyrin)、噻呋啉(Sapphyrin))、多环芳烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶、EDTA、亲脂性载体(例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如触角肽(antennapedia peptide)、Tat肽)、烷化剂、磷酸酯、氨基、巯基、PEG(例如PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代烷基、放射性标记的标记物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)。
末端修饰还可用于监测分布，并且在此类情况下待添加的基团可包括荧光团，例如荧光素或Alexa染料。末端修饰还可用于增强摄取，关于这一点的有用修饰包括胆固醇。末端修饰还可用于将RNA剂与另一个部分交联。
末端修饰可由于多种原因而添加，所述原因包括调节活性或调节对降解的抗性。可用于调节活性的末端修饰包括用磷酸酯或磷酸酯类似物的5’端修饰。在第一或第二链上，本发明的核酸可为5’磷酸化的，或包括在5’撇末端处的磷酰基类似物。5’-磷酸酯修饰包括与RISC介导的基因沉默相容的那些。合适的修饰包括：5’-单磷酸酯((HO)2(O)P-O-5’)；5’-二磷酸酯((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-三磷酸酯((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-鸟苷帽(7-甲基化或非甲基化的)
(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-腺苷帽(Appp)，以及任何修饰或未修饰的核苷酸帽结构(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’)；5’-单硫代磷酸酯(硫代磷酸酯；(HO)2(S)P-O-5’)；5’-单二硫代磷酸酯(二硫代磷酸酯；(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-硫醇式磷酸酯(phosphorothiolate)
((HO)2(O)P-S-5’)；氧/硫替代的单磷酸酯、二磷酸酯和三磷酸酯的任何另外组合(例如5’-α-硫代三磷酸酯、5’-γ-硫代三磷酸酯等)、5’-氨基磷酸酯((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-烷基膦酸酯(烷基＝甲基、乙基、异丙基、丙基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-(其中R为烷基)、(OH)2(O)P-5’-CH2-)、5’乙烯基膦酸酯、5’-烷基醚膦酸酯(烷基醚＝甲氧基甲基(MeOCH2-)、乙氧基甲基等，例如RP(OH)(O)-O-5’-(其中R为烷基醚))。
某些部分可连接于第一链或第二链的5’末端。这些包括脱碱基核糖部分、脱碱基脱氧核糖部分、包括2’-O烷基修饰的修饰脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分；反向的脱碱基核糖和脱碱基脱氧核糖部分及其修饰、C6-亚氨基-Pi；镜像核苷酸，包括L-DNA和L-RNA；5’OMe核苷酸；以及核苷酸类似物，包括4’,5’-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4’-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5’-氨基烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；12-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-失水己糖醇核苷酸；α-核苷酸；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环的3’,4’-开环核苷酸；3,4-二羟基丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸，5’-5’-反向的脱碱基部分；1,4-丁二醇磷酸酯；5’-氨基；以及桥接或非桥接甲基膦酸酯和5’-巯基部分。
在本文所述的每个序列中，C末端的“-OH”部分可取代C末端的“-NH2”部分，且反之亦然。
本发明还提供本文所述的根据本发明任何方面的核酸，其中第一链具有在其5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。该末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选地通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。优选地，末端5’(E)-乙烯基膦酸酯(“vp”)核苷酸为尿苷(“vp-U”)。
核酸的第一链可包含以下式(I)：
(vp)-N(po)[N(po)]n-(I)
其中‘(vp)-’为5’(E)-乙烯基膦酸酯，‘N’为核苷酸，‘po’为磷酸二酯键合，和n为1至(第一链中的核苷酸总数-2)，优选地其中n为1至(第一链中的核苷酸总数-3)，更优选地其中n为1至(第一链中的核苷酸总数-4)。
优选地，末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸为RNA核苷酸，优选地(vp)-U。
末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸为这样的核苷酸，其中5’端处的天然磷酸酯基已由E-乙烯基膦酸酯替代，其中5’磷酸化链末端核苷酸的桥接5’-氧原子由甲炔基(-CH＝)替代：
5’(E)-乙烯基膦酸酯为5’磷酸酯模拟物。生物模拟物为能够执行与所模拟的初始分子相同的功能且结构上与其非常相似的分子。在本发明的上下文中，5’(E)-乙烯基膦酸酯模仿正常5’磷酸酯的功能，例如使得可有效加载RISC。另外，由于其略微改变的结构，5’(E)乙烯基膦酸酯能够通过保护5’端核苷酸免受通过酶比如磷酸酶的脱磷酸化而使其稳定。
在一个方面，第一链具有在其5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接并且第一链包含a)多于一个磷酸二酯键合；b)在至少末端三个5’核苷酸之间的磷酸二酯键合和/或c)在至少末端四个5’核苷酸之间的磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含在两个核苷酸之间的至少一个硫代磷酸酯(ps)和/或至少一个二硫代磷酸酯(ps2)键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含多于一个硫代磷酸酯和/或多于一个二硫代磷酸酯键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含在末端两个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合，或者在末端三个3’核苷酸之间的硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键合。优选地，第一链和/或第二链中其它核苷酸之间的键合为磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸的第一链和/或第二链包含在末端两个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合或在末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合。
在一个方面，本发明的核酸包含在第一和/或第二链的一个或多个末端端部上的一个或多个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰。任选地，第一链的每端或任一端可包含一个或两个或三个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰的核苷酸(核苷间键合)。任选地，第二链的每端或任一端可包含一个或两个或三个硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯修饰的核苷酸(核苷间键合)。
在一个方面，核酸包含在第一和/或第二链的末端两个或三个3’核苷酸和/或5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合。优选地，核酸包含在第一链和第二链的末端三个3’核苷酸和末端三个5’核苷酸各自之间的硫代磷酸酯键合。优选地，在第一和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合均为磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸包含在第一链3’端处的二、三或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合和/或包含在第二链3’端处的二、三或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合和/或在第二链5’端处的二、三或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在第一链5’端处的二、三或四个末端核苷酸之间除二硫代磷酸酯键合以外的键合。
在一个方面，核酸包含在第一链和第二链的末端三个3’核苷酸和末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合。优选地，在第一和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合均为磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸：
(i)具有在第一链的末端三个3’核苷酸和末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合；
(ii)与第二链的3’端核苷酸或5’端核苷酸上的三触角配体缀合；
(iii)具有在与缀合于三触角配体的端部相反的端部处的第二链的末端三个核苷酸之间的硫代磷酸酯键合；和
(iv)任选地，在第一和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合均为磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸：
(i)具有在第一链5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸；
(ii)具有在第一和第二链上的末端三个3’核苷酸之间以及在第二链上的末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，或者其具有在第一和第二链上的末端两个3’核苷酸之间以及在第二链上的末端两个5’核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合；和
(iii)任选地，在第一和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合均为磷酸二酯键合。
在一个方面，核酸具有在第一链5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸和具有在第一链上的末端三个3’核苷酸之间以及在第二链上的末端三个5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合；并且任选地，在第一和/或第二链的核苷酸之间的所有剩余键合均为磷酸二酯键合。
本发明核酸中二硫代磷酸酯键合的使用，与在该同一位置中包含硫代磷酸酯的分子相比较，减少核酸分子群体的立体化学变化。硫代磷酸酯键合引入手性中心并且难以控制哪一个非连接氧取代硫。二硫代磷酸酯的使用确保该键合中不存在手性中心并因此减少或消除核酸分子群体中的任何变化，这取决于核酸分子中使用的二硫代磷酸酯和硫代磷酸酯键合的数目。
在一个方面，核酸包含在第一链3’端处的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合以及在第二链3’端处的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合以及在第二链5’端处的两个末端核苷酸之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在第一链5’端处的两、三或四个末端核苷酸之间除二硫代磷酸酯键合以外的键合。优选地，第一链具有在其5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。该末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选地通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。优选地，除在第一链3’端处的两个末端核苷酸之间的键合以及在第二链的3’端和5’端处的两个末端核苷酸之间的键合以外，两条链的核苷酸之间的所有键合均为磷酸二酯键合。
在一个方面，当在该端部处不存在二硫代磷酸酯键合时，核酸包含在第一链上的三个末端3’核苷酸各自之间和/或三个末端5’核苷酸各自之间，和/或在第二链的三个末端3’核苷酸各自之间和/或三个末端5’核苷酸各自之间的硫代磷酸酯键合。在端部处不存在二硫代磷酸酯键合意指在所讨论的核酸端部的两个末端核苷酸之间，或优选地在三个末端核苷酸之间的键合为除二硫代磷酸酯键合以外的键合。
在一个方面，除在第一链3’端处的两个末端核苷酸之间的键合以及在第二链的3’端和5’端处的两个末端核苷酸之间的键合以外，核酸在两条链的核苷酸之间的所有键合均为磷酸二酯键合。
其它磷酸酯键合修饰为可能的。
磷酸酯接头还可通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替代连接氧进行修饰。替代可发生在末端氧处。用氮替代非连接氧为可能的。
磷酸酯基还可个别地由非含磷的连接子替代。
可替代磷酸酯基的部分的实例包括硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧甲基亚氨基。在某些实施方案中，替代可包括亚甲基羰基氨基和亚甲基甲基亚氨基。
磷酸酯接头和核糖可由核酸酶抗性核苷酸替代。实例包括吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。在某些实施方案中，可使用PNA替代物。
在一个方面，优选地为抑制CFB表达的siRNA(优选地经由RNAi，和优选地在细胞中)的核酸包含以下中的一种或多种或全部：
(i)修饰的核苷酸；
(ii)在从第一链的5’端开始的位置2和14处的除2’-OMe修饰的核苷酸以外的修饰的核苷酸，优选地为2’-F修饰的核苷酸；
(iii)如在第一链的5’端处从一开始编号的第一链每个奇数编号的核苷酸为2’-OMe修饰的核苷酸；
(iv)如在第一链的5’端处从一开始编号的第一链每个偶数编号的核苷酸为2’-F修饰的核苷酸；
(v)对应于第一链的位置11和/或13或11-13的第二链核苷酸通过除2’-OMe修饰以外的修饰进行修饰，优选地其中这些位置中的一个或两个或全部包含2’-F修饰；
(vi)反向核苷酸，优选地在第二链3’端处的3’-3’键合；
(vii)一个或多个硫代磷酸酯键合；
(viii)一个或多个二硫代磷酸酯键合；和/或
(ix)第一链具有在其5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸，在其情况下末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选地为尿苷并且优选地通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。
本公开的核酸可包含第一链和第二链，其中第一链序列包含与表5b所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。
本公开的核酸可为这样的核酸，其中：
(a)第一链序列包含与表5b的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列包含与表5b的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列包含与表5b的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列包含表5b的第一链序列中任何一种的序列，和任选地其中第二链序列包含相应第二链序列的序列；
(i)第一链序列由表5b的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列由相应第二链序列的序列组成；
(j)第一链序列基本上由表5b所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列基本上由表5b所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列组成；或
(k)第一链序列由对应于从表5b所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列进一步地由表5b所示的具有给定SEQ IDNo.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
任选地其中第二链序列包含表5b所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或基本上由其组成或由其组成；
(l)第一链序列由对应于从表5b所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列进一步地由表5b所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
其中所述第一链序列由与SEQ ID NO.758的CFB转录本互补的长度为17-25个核苷酸、优选地长度为18-24个核苷酸的邻接区域组成；和
任选地其中第二链序列包含表5b所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或基本上由其组成或由其组成；
(m)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链和第二链存在于单链上，其中第一链和第二链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸；或
(n)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链和第二链在两条单独的链上，这两条链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸。
本公开的核酸可包含第一链和第二链，其中第一链序列包含与表2所示的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。
例如，本公开的核酸可为这样的核酸，其中：
(a)第一链序列包含与表2的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列包含与表2的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列包含与表2的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列包含表2的第一链序列中任何一种的序列，和任选地其中第二链序列包含相应第二链序列的序列；
(i)第一链序列由表2的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列由相应第二链序列的序列组成；
(j)第一链序列基本上由表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列基本上由表2所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列组成；或
(k)第一链序列由对应于从表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19组成，
其中所述第一链序列进一步地由表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
任选地其中第二链序列包含表2所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或基本上由其组成或由其组成；
(l)第一链序列由对应于从表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列进一步地由表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
其中所述第一链序列由与SEQ ID NO.758的CFB转录本互补的长度为17-25个核苷酸、优选地长度为18-24个核苷酸的邻接区域组成；和
任选地其中第二链序列包含表2所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或基本上由其组成或由其组成；
(m)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链和第二链存在于单链上，其中第一链和第二链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸；或
(n)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链和第二链在两条单独的链上，这两条链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸。
表2：
核酸的所有特征均可与本文公开的发明的所有其它方面组合。
异源部分
本发明的核酸可与异源部分缀合。异源部分为其不是能够抑制CFB表达的核酸分子的任何部分。异源部分可为或可包含肽(或多肽)、糖(或多糖)、脂质、不同核酸或任何其他合适的分子。
任何给定的核酸均可与多个异源部分缀合，所述多个异源部分可为相同或不同的。
单个异源部分本身可包含一个或多个功能性部分(比如如以下更详细描述的靶向剂)，每个任选地经由接头与核酸共价缔合。
异源部分或其功能性组分可用于例如调节生物利用度或药代动力学。例如，其可增加体内半衰期。
或者，异源部分(或其功能性组分)可包含靶向剂。将寡核苷酸，特别是本发明的双链核酸向细胞的体内有效递送是重要的，并且需要特异性靶向和免受细胞外环境特别是血清蛋白的实质性保护。实现特异性靶向的一种方法为将靶向剂与核酸缀合，其中靶向剂助于将核酸靶向于具有与靶向剂结合的细胞表面受体的靶细胞。
在该上下文中，术语“受体”用于包括靶细胞表面上能够与靶向剂结合的任何分子，并且不应被视为意指细胞表面受体的任何特定功能。靶向剂可被视为细胞表面受体的“配体”。术语“靶向剂”和“配体”可互换地使用。同样，该术语不应被视为暗示靶向剂或细胞表面受体的任何特定功能，或两个分子之间除一个分子与另一个分子结合的能力以外的任何特定关系。
因此，靶向剂可为对选择的受体具有亲和力的任何部分。例如，其可为亲和蛋白(比如对选择的受体具有亲和力的抗体或其片段)、适体或任何其他合适的部分。在一些实施方案中，靶向剂可为受体的生理配体。
靶向剂和受体之间的结合可促进缀合核酸被靶细胞的摄取，例如经由受体的内化或任何其他合适的机制。因此所期望受体分子的适当配体可用作靶向剂以便缀合的核酸通过机制比如不同受体介导的内吞途径或功能上类似的过程被靶细胞摄取。在其他实施方案中，可通过除受体介导的内吞以外的机制介导核酸内化到靶细胞中的配体可备选地与本发明的核酸缀合用于细胞或组织特异性靶向。
介导受体介导的内吞的配体的一个实例为本文所述的GalNAc部分，其对去唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)具有高亲和力。ASGP-R复合物由不同比率的膜ASGR1和ASGR2受体的多聚体组成，所述受体在肝细胞上为高度丰富的。三触角簇糖苷作为缀合配体使用的首个公开之一在美国专利号US 5,885,968中。具有三个GalNAc配体并包含磷酸酯基的缀合物为已知的，并且在Dubber等人(Bioconjug.Chem.2003Jan-Feb；14(1):239-46.)中进行描述。ASGP-R复合物显示对于N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)的亲和力比D-Gal高50倍。
ASGP-R复合物特异性地识别糖基化蛋白的末端β-半乳糖基亚基或其它寡糖(Weigel,P.H.等人，Biochim.Biophys.Acta.2002Sep 19；1572(2-3):341-63)，并且可用于通过半乳糖或半乳糖胺与原料药的共价偶联将药物递送至肝脏的表达受体复合物的肝细胞(Ishibashi,S.；等人，J Biol.Chem.1994Nov 11；269(45):27803-6)。此外，结合亲和力可通过经靶向部分的重复来实现的多价效应而显著增加(Biessen EA,等人J MedChem.1995Apr 28；38(9):1538-46)。
ASGP-R复合物为用于含有末端β-半乳糖基的糖蛋白主动摄取到细胞内体的介质。因此，ASGPR高度适合于与此类配体缀合的药物候选物的靶向递送，如例如核酸向表达受体的细胞内的靶向递送(Akinc等人Mol Ther.2010Jul；18(7):1357-64)。
更通常地，配体可包含糖，其被选择为对于靶细胞上至少一种类型的受体具有亲和力。特别是，受体在哺乳动物肝脏细胞的表面上，例如之前描述的肝去唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)。
糖可选自N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和岩藻糖。糖可为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。异源部分可包含多个此类糖，例如两个或尤其是三个此类糖，例如三个GalNAc基团。
因此，异源部分可包含(i)一个或多个功能性组分，以及(ii)接头，其中接头将功能性组分与如任何前述方面定义的核酸缀合。接头可为单价结构或者二价或三价或四价分支结构。核苷酸可如本文定义的那样进行修饰。
因此，功能性组分可为配体(或靶向剂)。在存在多个功能性组分的情况下，它们可为相同或不同的。在功能性组分为配体的情况下，它们可为糖，并且因此可为(或包含)GalNAc。
在一个方面，核酸与包含以下式(II)化合物的异源部分缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
其中：
S代表功能性组分，例如配体，比如糖，优选地其中糖为N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P为磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地为硫代磷酸酯；
X2为亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n＝1-6；
A为分支单元；
X3代表桥接单元；
其中根据本发明的核酸经由磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地硫代磷酸酯与X3缀合。
在式(II)中，分支单元“A”优选地分支成三个，以便容纳三个糖配体。分支单元优选地与配体的剩余栓系部分和核酸共价附接。分支单元可包含含有选自烷基、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚和羟基氨基的基团的分支脂肪族基团。分支单元可包含选自烷基和醚基的基团。
分支单元A可具有选自以下的结构：
其中每个A1独立地代表O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地代表1-20的整数。
分支单元可具有选自以下的结构：
其中每个A1独立地代表O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地代表1-20的整数。
分支单元可具有选自以下的结构：
其中A1为O、S、C＝O或NH；并且每个n独立地代表1-20的整数。
分支单元可具有以下结构：
分支单元可具有以下结构：
分支单元可具有以下结构：
或者，分支单元A可具有选自以下的结构：
其中：
R1为氢或C1-C10亚烷基；
和R2为C1-C10亚烷基。
任选地，分支单元仅由一个碳原子组成。
“X3”部分为桥接单元。桥接单元为线性的并且与分支单元和核酸共价结合。
X3可选自-C1-C20亚烷基-；-C2-C20亚烯基-；式-(C1-C20亚烷基)-O-(C1-C20亚烷基)-的亚烷基醚；-C(O)-C1-C20亚烷基-；-C0-C4亚烷基(Cy)C0-C4亚烷基-，其中Cy代表取代或未取代的5或6元亚环烷基、亚芳基、亚杂环基或亚杂芳基环；-C1-C4亚烷基-NHC(O)-C1-C4亚烷基-；-C1-C4亚烷基-C(O)NH-C1-C1-C4亚烷基-；-C1-C4亚烷基-SC(O)-C1-C4亚烷基-；-C1-C4亚烷基-C(O)S-C1-C4亚烷基-；-C1-C4亚烷基-OC(O)-C1-C4亚烷基-；-C1-C4亚烷基-C(O)O-C1-C4亚烷基-；和-C1-C6亚烷基-S-S-C1-C6亚烷基-。
X3可为式-(C1-C20亚烷基)-O-(C1-C20亚烷基)-的亚烷基醚。X3可为式-(C1-C20亚烷基)-O-(C4-C20亚烷基)-的亚烷基醚，其中所述(C4-C20亚烷基)与Z连接。X3可选自-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，尤其是-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-，其中在每种情况下-CH2-基团与A连接。
在一个方面，核酸与以下式(III)的异源部分缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (III)
其中：
S代表功能性组分，例如配体，比如糖，优选地GalNAc；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P为磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地为硫代磷酸酯；
X2为C1-C8亚烷基；
A为选自以下的分支单元：
X3为桥接单元；
其中根据本发明的核酸经由磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地硫代磷酸酯，与X3缀合。
分支单元A可具有以下结构：
分支单元A可具有以下结构：
其中X3与氮原子附接。
X3可为C1-C20亚烷基。优选地，X3选自-C3H6-、-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-，尤其是-C4H8-、-C6H12-和-C8H16-。
在一个方面，核酸与包含以下式(IV)化合物的配体缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (IV)
其中：
S代表功能性组分，例如配体，比如糖，优选地GalNAc)；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P为磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地为硫代磷酸酯；
X2为式-C3H6-O-CH2-的亚烷基醚；
A为分支单元；
X3为选自-CH2-O-CH2-、-CH2-O-C2H4-、-CH2-O-C3H6-、-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-的式的亚烷基醚，其中在每种情况下-CH2-基团与A连接，
和其中X3通过磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地硫代磷酸酯，与根据本发明的核酸缀合。
分支单元可包含碳。优选地，分支单元为碳。
X3可选自-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C5H10-、-CH2-O-C6H12-、-CH2-O-C7H14-和-CH2-O-C8H16-。优选地，X3选自-CH2-O-C4H8-、-CH2-O-C6H12-和-CH2-O-C8H16-。
X1可为(-CH2-CH2-O)(-CH2)2-。X1可为(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。X1可为(-CH2-CH2-O)3(-CH2)2-。优选地，X1为(-CH2-CH2-O)2(-CH2)2-。或者，X1代表C3-C6亚烷基。X1可为亚丙基。X1可为亚丁基。X1可为亚戊基。X1可为亚己基。优选地烷基为线性亚烷基。特别是，X1可为亚丁基。
X2代表式-C3H6-O-CH2-的亚烷基醚，即C3烷氧基亚甲基或-CH2CH2CH2OCH2-。
对于以上方面中的任何一个，当P代表修饰的磷酸酯基时，P可由以下表示：
其中Y1和Y2各自独立地代表＝O、＝S、-O-、-OH、-SH、-BH3、-OCH2CO2、-OCH2CO2Rx、-OCH2C(S)ORx和-ORx，其中Rx代表C1-C6烷基和其中指示对化合物的剩余部分的附接。
修饰的磷酸酯意指其中一个或多个非连接氧被替代的磷酸酯基。修饰的磷酸酯基的实例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯(phosphoroselenate)、硼烷磷酸基(borano phosphate)、硼烷磷酸酯(borano phosphate ester)、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯具有由硫替代的两个非连接氧。磷酸酯基中的一个、每个或两个非连接氧可独立地为S、Se、B、C、H、N或OR(R为烷基或芳基)中的任何一个。
磷酸酯还可通过用氮(桥接的氨基磷酸酯)、硫(桥接的硫代磷酸酯)和碳(桥接的亚甲基膦酸酯)替代连接氧进行修饰。替代可发生在末端氧处。用氮替代非连接氧为可能的。
例如，Y1可代表-OH和Y2可代表＝O或＝S；或
Y1可代表-O-和Y2可代表＝O或＝S；
Y1可代表＝O和Y2可代表-CH3、-SH、-ORx或-BH3；
Y1可代表＝S和Y2可代表-CH3、-ORx或-SH。
技术人员应当理解，在某些情况下，在Y1和Y2之间存在离域(delocalisation)。
优选地，修饰的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。硫代磷酸酯基包括二硫代磷酸酯(即其中Y1代表＝S和Y2代表-S-)和单硫代磷酸酯(即其中Y1代表-O-和Y2代表＝S，或者其中Y1代表＝O和Y2代表-S-)。优选地，P为单硫代磷酸酯。本发明人已经发现，具有硫代磷酸酯基替代磷酸酯基的缀合物具有在体内改善的效力和作用持续时间。
P还可为乙基磷酸酯(即其中Y1代表＝O和Y2代表OCH2CH3)。
配体例如糖可被选择为对于靶细胞上至少一种类型的受体具有亲和力。特别是，受体在哺乳动物肝脏细胞的表面上，例如肝去唾液酸糖蛋白受体复合物(ASGP-R)。
对于以上或以下方面中的任何一个，糖可选自具有半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和果糖中的一种或多种的N-乙酰基。一般待用于本发明的配体可包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。优选地，本发明的化合物可具有3个配体，其将各自优选地包括N-乙酰半乳糖胺。
“GalNAc”是指2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖，在文献中通常称为N-乙酰半乳糖胺。提及“GalNAc”或“N-乙酰半乳糖胺”包括β-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者。在某些实施方案中，β-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖和α-形式：2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖两者可互换地使用。优选地，本发明的化合物包含β-形式，2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖。
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-β-D-吡喃半乳糖
2-(乙酰氨基)-2-脱氧-α-D-吡喃半乳糖
在一个方面，核酸为缀合核酸，其中核酸与具有以下结构之一的异源部分缀合，所述异源部分为便于参考可称为“三触角配体”：
/>
/>
/>
/>
其中Z为如本文定义的任何核酸。在某些实施方案中，异源部分(“三触角配体”)与Z的第二(有义)链(在表5a、5b、5c中也称为链“B”)的5’端缀合。
在某些实施方案中，核酸Z经由磷酸酯或硫代磷酸酯基与三触角配体缀合，所述磷酸酯或硫代磷酸酯基将三触角配体连接于所述核酸Z的末端核苷酸的糖的3’或5’位置，特别是核糖的3’或5’位置。
在某些实施方案中，异源部分(“三触角配体”)与Z的第二(有义)链(在表5a、5b、5c中也称为链“B”)的末端核苷酸的核糖的3’位置缀合。
在其他实施方案中，异源部分(“三触角配体”)与Z的第二(有义)链(在表5a、5b、5c中也称为链“B”)的末端核苷酸的核糖的5’位置缀合。
在其他实施方案中，异源部分(“三触角配体”)与Z的第一(反义)链(在表5a、5b、5c中也称为链“A”)的末端核苷酸的核糖的3’位置缀合。
优选地，核酸为缀合核酸，其中核酸与具有以下结构之一的三触角配体缀合：
其中Z为如本文定义的任何核酸。优选地，异源部分(“三触角配体”)与Z的第二(有义)链(在表5a、5b、5c中也称为链“B”)的5’端缀合。
在优选实施方案中，核酸Z经由磷酸酯或硫代磷酸酯基与三触角配体缀合，所述磷酸酯或硫代磷酸酯基将三触角配体连接于所述核酸Z的末端核苷酸的核糖的3’或5’位置。
优选地，“三触角配体”与Z的第二(有义)链(在表5a、5b、5c中也称为链“B”)的末端核苷酸的核糖的5’位置缀合。
式(II)、(III)或(IV)的异源部分或者本文公开的三触角配体中的任何一种可在第一(反义)链的3’端处和/或在第二(有义)链的3’和/或5’端中的任何一个处附接。核酸可包含式(II)、(III)或(IV)的多于一个异源部分或者本文公开的三触角配体中的任何一种。然而，式(II)、(III)或(IV)的单个异源部分或者本文公开的三触角配体中的任何一种为优选的，因为单个此种部分足以将核酸有效靶向于靶细胞。优选地在这种情况下，在配体与之附接的核酸端部处的至少最后两个，优选地至少最后三个和更优选地至少最后四个核苷酸通过磷酸二酯键合进行连接。
优选地，第一(反义)链的5’端并未附接于异源部分，因为在该位置处的附接可潜在地干扰核酸的生物活性。
在链的5’端处具有单个异源部分(例如式(II)、(III)或(IV)的或者本文公开的三触角配体中的任何一种)比在3’端处具有相同基团的相同核酸更易于并且因此更便宜地合成。优选地，因此将单个异源部分(例如式(II)、(III)或(IV)的任何一种的或者本文公开的三触角配体中的任何一种)与核酸第二链的5’端共价附接(与之缀合)。
在一个方面，核酸的第一链为以下式(V)的化合物：
其中b优选地为0或1；和
第二链为以下式(VI)的化合物：
其中：
c和d独立地优选地为0或1；
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二链；
Y独立地为O或S；
n独立地为0、1、2或3；和
L1为配体与之附接的接头，其中L1在式(V)和(VI)中为相同或不同的，并且当L1在同一式内出现多于一次时，在式(V)和(VI)内为相同或不同的，其中L1优选地具有式(VII)；
并且其中b+c+d优选地为2或3。
优选地，式(V)和(VI)中的L1具有式(VII)：
其中：
L选自包含以下或优选地由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地为1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地为1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v为2-12；和
其中如果存在的话，则末端C(O)附接于式(VII)的X，或者如果X不存在，则附接于式(VII)的W1，或者如果W1不存在，则附接于式(VII)的V；
W1、W3和W5个别地不存在或者选自包含以下或优选地由以下组成的组：
-(CH2)r-，其中r＝1-7；
-(CH2)s-O-(CH2)s-，其中s独立地为0-5；
-(CH2)t-S-(CH2)t-，其中t独立地为0-5；
X不存在或者选自包含以下或优选地由以下组成的组：NH、NCH3或NC2H5；
V选自包含以下或优选地由以下组成的组：
CH、N、
其中如果存在的话，则B为修饰的或天然核碱基。
在一个方面，第一链为以下式(VIII)的化合物
其中b优选地为0或1；和
第二链为以下式(IX)的化合物：
其中c和d独立地优选地为0或1；
其中：
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二链；
Y独立地为O或S；
R1为H或甲基；
n独立地优选地为0、1、2或3；和
L在式(VIII)和(IX)中为相同或不同的，并且当L在同一式内出现多于一次时，在式(VIII)和(IX)内为相同或不同的，并且选自包含以下或优选地由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地为1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地为1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v为2-12；和
其中如果存在的话，则末端C(O)附接于NH基团(接头的，而不是靶向配体的)；
并且其中b+c+d优选地为2或3。
在一个方面，核酸的第一链为以下式(X)的化合物：
其中b优选地为0或1；和
第二链为以下式(XI)的化合物：
其中：
c和d独立地优选地为0或1；
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二RNA链；
Y独立地为O或S；
n独立地优选地为0、1、2或3；和
L2在式(X)和(XI)中为相同或不同的并且在通过b、c和d括起来的部分中为相同或不同的，并且选自包含以下或优选地由以下组成的组：
或n为0和L2为：
并且末端OH基团不存在，使得形成以下部分：
其中：
F为饱和的分支或未分支(比如未分支)的C1-8烷基(例如C1-6烷基)链，其中碳原子之一任选地由氧原子替代，条件是所述氧原子与另一个杂原子(例如O或N原子)通过至少2个碳原子分开；
L在式(X)和(XI)中为相同或不同的并且选自包含以下或优选地由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地为1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地为1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v为2-12；和
其中如果存在的话，则末端C(O)附接于NH基团(接头的，而不是靶向配体的)；
并且其中b+c+d优选地为2或3。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的任何核酸中，b为0，c为1和d为1；b为1，c为0和d为1；b为1，c为1和d为0；或者b为1，c为1和d为1。优选地，b为0，c为1和d为1；b为1，c为0和d为1；或者b为1，c为1和d为1。最优选地，b为0，c为1和d为1。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的任何核酸中，Y为O。在另一个方面，Y为S。在优选方面，Y在式的不同位置中独立地选自O或S。
在一个方面，在式(VIII)和(IX)的任何核酸中，R1为H或甲基。在一个方面，R1为H，在另一个方面，R1为甲基。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的任何核酸中，n为0、1、2或3。优选地，n为0。
在式(X)和(XI)的任何核酸中，F部分的实例包括(CH2)1-6例如(CH2)1-4例如CH2、(CH2)4、(CH2)5或(CH2)6，或CH2O(CH2)2-3，例如CH2O(CH2)CH3。
在一个方面，式(X)和(XI)中的L2为：
/>
在一个方面，L2为：
在一个方面，L2为：
在一个方面，L2为：
在一个方面，n为0和L2为：
并且末端OH基团不存在，使得形成以下部分：
其中Y为O或S。
在一个方面，在式(V)和(VI)或(VIII)和(IX)或(X)和(XI)的核酸中，L选自包含以下或优选地由以下组成的组：
-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12；
-(CH2-CH2-O)s-CH2-C(O)-，其中s＝1-5；
-(CH2)t-CO-NH-(CH2)t-NH-C(O)-，其中t独立地为1-5；
-(CH2)u-CO-NH-(CH2)u-C(O)-，其中u独立地为1-5；和
-(CH2)v-NH-C(O)-，其中v为2-12；
其中末端C(O)附接于NH基团。
优选地，L为-(CH2)r-C(O)-，其中r＝2-12，更优选地r＝2-6，甚至更优选地r＝4或6例如4。
优选地，L为：
/>
在由b、c和d括起来的部分内，在式(X)和(XI)的核酸中L2一般为相同的。在由b、c和d括起来的部分之间，L2可为相同或不同的。在一个实施方案中，由c括起来的部分中的L2与由d括起来的部分中的L2相同。在一个实施方案中，由c括起来的部分中的L2与由d括起来的部分中的L2不同。在一个实施方案中，例如当接头部分为丝氨醇衍生的接头部分时，在由b、c和d括起来的部分中L2为相同的。
丝氨醇衍生的接头部分可基于呈任何立体化学的丝氨醇，即衍生于L-丝氨酸异构体、D-丝氨酸异构体、外消旋丝氨酸或异构体的其它组合。在本发明的优选方面，丝氨醇-GalNAc部分(SerGN)具有以下立体化学：
即基于衍生于L-丝氨酸异构体的(S)-丝氨醇-亚酰胺(amidite)或(S)-丝氨醇琥珀酸酯固体支持的砌块。
在优选方面，核酸的第一链为式(VIII)的化合物和核酸的第二链为式(IX)的化合物，其中：
b为0，
c和d为1，
n为0，
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二链，
Y为S，
R1为H，和
L为-(CH2)4-C(O)-，其中L的末端C(O)附接于接头的N原子(即不为靶向配体的可能N原子)。
在另一个优选方面，核酸的第一链为式(V)的化合物和核酸的第二链为式(VI)的化合物，其中：
b为0，
c和d为1，
n为0，
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二链，
Y为S，
L1属于式(VII)，其中：
W1为-CH2-O-(CH2)3-，
W3为-CH2-，
W5为不存在，
V为CH，
X为NH，和
L为-(CH2)4-C(O)-，其中L的末端C(O)附接于式(VII)中X的N原子。
在另一个优选方面，核酸的第一链为式(V)的化合物和核酸的第二链为式(VI)的化合物，其中：
b为0，
c和d为1，
n为0，
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二链，
Y为S，
L1属于式(VII)，其中：
W1、W3和W5为不存在，
V为
X为不存在，和
L为-(CH2)4-C(O)-NH-(CH2)5-C(O)-，其中L的末端C(O)
附接于式(VII)中V的N原子。
在一个方面，核酸与具有以下结构的三触角配体缀合：
其中核酸经由配体的磷酸酯基与三触角配体缀合，所述配体针对a)第二链5’端处的最后一个核苷酸；b)第二链3’端处的最后一个核苷酸；或c)第一链3’端处的最后一个核苷酸。
在核酸的一个方面，由具有配体的核酸靶向的细胞为肝细胞。
在其中存在GalNAc的以上配体的任何一种中，GalNAc可取代任何其它靶向配体，比如本文提及的那些，特别是甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡糖胺和岩藻糖。
在一个方面，核酸与包含脂质并且更优选地包含胆固醇的异源部分缀合。
在一个方面，用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸为表5c所示的双链体之一，其可通过其双链体ID号来指代。
在一个优选方面，用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸为具有由表5c所示的以下双链体ID之一定义的结构的双链体：EV2181、EV2182、EV2184、EV2185、EV2186、EV2189、EV2195、EV2196、EV2197、EV2198、EV2201、EV2204。
在一个优选方面，用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸为这样的核酸，其中第一链序列包含(vp)-mU fC mA fC mA fA mA fC mA fG mA fG mC fU mU fU mG(ps)fA(ps)mU(SEQ ID No.740)和任选地其中第二链序列包含[ST23(ps)]3ST41(ps)mA mU mC mAmA mA fG fC fU mC mU mG mU mU mU mG mU(ps)mG(ps)mU(SEQ ID No:730)。
在一个优选方面，用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸为这样的核酸，其中第一链序列由(vp)-mU fC mA fC mA fA mA fC mA fG mA fG mC fU mU fU mG(ps)fA(ps)mU(SEQ ID No.740)组成和任选地其中第二链序列由[ST23(ps)]3ST41(ps)mA mU mC mAmA mA fG fC fU mC mU mG mU mU mU mG mU(ps)mG(ps)mU(SEQ ID No:730)组成。
在一个优选方面，用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸为这样的核酸，其中第一链序列包含(vp)-mU fU mA fU mC fC mU fU mG fA mC fU mU fU mG fA mA(ps)fC(ps)mA(SEQ ID No.742)和任选地其中第二链序列包含[ST23(ps)]3ST41(ps)mU mG mU mUmC mA fA fA fG mU mC mA mA mG mG mA mU(ps)mA(ps)mU(SEQ ID No:729)。
在一个优选方面，用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸为这样的核酸，其中第一链序列由(vp)-mU fU mA fU mC fC mU fU mG fA mC fU mU fU mG fA mA(ps)fC(ps)mA(SEQ ID No.742)组成和任选地其中第二链序列由[ST23(ps)]3ST41(ps)mU mG mU mUmC mA fA fA fG mU mC mA mA mG mG mA mU(ps)mA(ps)mU(SEQ ID No:729)组成。
组合物、用途和方法
本发明还提供包含本发明核酸的组合物。核酸和组合物可单独或与其它试剂组合用作治疗或诊断剂。例如，本发明的一种或多种核酸可与递送媒介物(例如脂质体)和/或赋形剂比如载体、稀释剂组合。还可添加其它试剂比如防腐剂和稳定剂。本发明任何核酸的药学上可接受的盐或溶剂化物同样地在本发明的范围内。用于核酸递送的方法为本领域已知的并且在本领域技术人员的知识内。
本文公开的组合物特别是为药用组合物。此类组合物适合于给予受试者。
在一个方面，组合物包含本文公开的核酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物，以及溶剂(优选地水)和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。
药学上可接受的载体或稀释剂包括用于适合于口服、直肠、鼻或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内、皮内和经皮)给予的制剂中的那些。制剂可便利地以单位剂型呈现，并且可通过药学领域众所周知的任何方法进行制备。皮下或经皮给予模式可特别适合于本文所述的化合物。
本发明核酸的预防或治疗有效量将取决于给予途径、所治疗哺乳动物的类型以及处于考虑下的具体哺乳动物的物理特性。这些因素及其与确定该量的关系为医学领域的熟练从业者众所周知的。该量和给予方法可进行定制以达到最佳效力，并且可取决于医学领域的技术人员众所周知的因素比如重量、饮食、同时用药和其它因素。最适合于人类使用的剂量大小和给药方案可由通过本发明获得的结果来指导，并且可在适当设计的临床试验中进行证实。
有效剂量和治疗方案可通过常规手段进行确定，以实验室动物中的低剂量开始并然后在监测效应的同时增加剂量，并且还系统地改变剂量方案。当确定用于给定受试者的最佳剂量时，许多因素可由临床医师加以考虑。此类考虑为技术人员已知的。
本发明的核酸或其盐可被配制为制备用于储存或给予的药用组合物，其一般包含在药学上可接受的载体中的预防或治疗有效量的本发明核酸或其盐。
本发明的核酸或缀合核酸还可与其它治疗性化合物组合给予，分开或同时地给予，例如作为组合的单位剂量。本发明还包括包含在生理学上/药学上可接受的赋形剂比如稳定剂、防腐剂、稀释剂、缓冲剂等中的一种或多种中的根据本发明的核酸的组合物。
在一个方面，组合物包含本文公开的核酸以及选自寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的另一治疗剂。优选地，所述另一治疗剂为靶向、优选地抑制CFB或免疫系统或更具体地讲补体途径的另一种要素比如蛋白的表达或活性的药物。优选地，所述另一治疗剂为以下之一：a)抑制补体途径的组分之一优选地CFB、C3、C5或其亚基之一或蛋白水解切割产物的表达或活性的肽；b)在生理条件下与补体途径的组分之一优选地CFB、C3、C5或其亚基之一或蛋白水解切割产物特异性地结合的抗体；c)依库珠单抗或其抗原结合衍生物。
依库珠单抗为与补体组分C5特异性地结合并以商品名商业化的人源化单克隆抗体。其以高亲和力特异性地结合补体组分C5并抑制C5切割为C5a和C5b。抗体例如在专利EP 0 758904B1及其家族成员中进行描述。
在某些实施方案中，可同时或依序地给予具有不同序列的两种或更多种本发明核酸。
在另一个方面，本发明提供组合物，例如药用组合物，其包含本发明的不同核酸之一或组合和至少一种药学上可接受的载体。
本发明的治疗剂和组合物的剂量水平可由本领域的技术人员通过实验进行确定。在一个方面，单位剂量可含有在约0.01mg/kg-约100mg/kg体重之间的核酸或缀合核酸。或者，剂量可为10mg/kg-25mg/kg体重，或1mg/kg-10mg/kg体重，或0.05mg/kg-5mg/kg体重，或0.1mg/kg-5mg/kg体重，或0.1mg/kg-1mg/kg体重，或0.1mg/kg-0.5mg/kg体重，或0.5mg/kg-1mg/kg体重。或者，剂量可为约0.5mg/kg-约10mg/kg体重，或约0.6mg/kg-约8mg/kg体重，或约0.7mg/kg-约7mg/kg体重，或约0.8mg/kg-约6mg/kg体重，或约0.9mg/kg-约5.5mg/kg体重，或约1mg/kg-约5mg/kg体重，或约1mg/kg体重，或约3mg/kg体重，或约5mg/kg体重，其中“约”为与指示值至多30％，优选地至多20％，更优选地至多10％，仍然更优选地至多5％和最优选地0％的偏差。剂量水平还可经由其它参数比如体表面积进行计算。
这些核酸的剂量单位优选地包含约1mg/kg-约5mg/kg体重，或约1mg/kg-约3mg/kg体重，或约1mg/kg体重，或约3mg/kg体重，或约5mg/kg体重。与在可比较条件下未用核酸治疗或用对照核酸治疗的对照相比较，通过剂量单位的核酸治疗的受试者肝脏中的CFB mRNA水平和/或血浆或血液中的CFB蛋白水平，优选地在最大效应的时间点降低至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％。
给予的剂量和频率可取决于治疗为治疗性还是预防性(prophylactic)(例如预防(preventative))而变化，并且可在治疗过程期间进行调整。在某些预防性应用中，在相对长的时间段内以相对较不频繁的间隔给予相对低的剂量。一些受试者可能在其一生内持续接受治疗。在某些治疗性应用中，有时需要以相对短间隔的相对高剂量直至疾病的进展减少或直至患者显示疾病症状的部分或完全改善。之后，患者可转换为合适的预防性给药方案。
单独或者与本发明药用组合物中的一种或多种其它活性成分组合的本发明核酸的实际剂量水平可以变化，以便获得有效实现对于特定患者、组合物和给予模式期望的治疗反应而不对受试者或患者造成有害的副作用的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于各种因素，比如药代动力学因素，包括采用的特定核酸或组合物的活性，给予途径，给予时间，所采用特定核酸的排泄率，治疗的持续时间，与采用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料，所治疗受试者或患者的年龄、性别、重量、状况、一般健康和既往病史，以及医学领域众所周知的类似因素。
药用组合物可为无菌可注射的水性混悬液或溶液，或者呈冻干形式。
药用组合物可呈单位剂型。在此种形式中，组合物被分成含有适当数量活性组分的单位剂量。单位剂型可为包装的制剂，所述包装含有离散数量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和小瓶或安瓿中的粉剂。单位剂型还可为胶囊剂、扁囊剂或片剂本身，或者其可为适当数目的这些包装形式中的任何一种。其可以单一剂量的可注射形式，例如以笔的形式提供。组合物可被配制用于任何合适的给予途径和手段。
本发明的治疗剂和药用组合物可以药用有效剂量给予哺乳动物受试者。哺乳动物可选自人类、非人灵长类动物、猿或原猴、狗、猫、马、牛、猪、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、仓鼠、刺猬和豚鼠或其它相关物种。在此基础上，如本文使用的“CFB”表示任何以上提及物种中的核酸或蛋白，如果在其中天然或人工表达，但优选地这种措辞表示人类核酸或蛋白。
本发明的药用组合物可单独或者与一种或多种其它治疗或诊断剂组合给予。组合疗法可包括与基于待治疗的特定患者、疾病或病症选择的至少一种其它治疗剂组合的本发明核酸。其它此类药物的实例尤其包括治疗上活性的小分子或多肽、单链抗体、经典抗体或其片段，或者调节一种或多种另外基因的基因表达的核酸分子，以及在治疗性或预防性治疗方案中可能补充或以其它方式有益的类似调节性治疗剂。
药用组合物一般在制造和储存条件下为无菌和稳定的。组合物可被配制为溶液剂、微乳剂、脂质体或适合于高药物浓度的其它有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、醇比如乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)或任何合适的混合物。适当的流动性可例如通过以下得到维持：使用包衣比如卵磷脂、在分散体的情况下维持所需的粒度以及根据本领域众所周知的配制化学使用表面活性剂。在某些实施方案中，等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇、山梨醇或氯化钠在组合物中可为合乎期望的。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，可达到可注射组合物的延长吸收。
本发明的一个方面为用作治疗剂的本文公开的核酸或组合物。核酸或组合物优选地用于预防或治疗疾病、障碍或综合征。
本发明提供单独或者与一种或多种另外的治疗剂组合用于药用组合物中，用于治疗或预防响应于CFB表达抑制的病症、疾病和障碍的核酸。
本发明的一个方面为如本文公开的核酸或组合物在预防或治疗疾病、障碍或综合征中的用途。
本发明的核酸和药用组合物可用于治疗各种病症、障碍或疾病。用本发明核酸的治疗优选地导致体内CFB耗尽，优选地在肝脏和/或血液中。因此，本发明的核酸和包含其的组合物可用于治疗其中抑制CFB的表达可为有益的各种病理性障碍的方法中。本发明提供用于治疗疾病、障碍或综合征的方法，其包括给予需要它的受试者预防或治疗有效量的本发明核酸的步骤。
因此，本发明提供预防或治疗疾病、障碍或综合征的方法，该方法包括给予需要它的受试者(例如患者)治疗有效量的核酸或包含本发明核酸的药用组合物的步骤。
最合乎期望的治疗有效量为将产生由本领域技术人员对于需要它的给定受试者选择的特定治疗的期望效力的量。该量将根据由熟练工作人员理解的各种因素而变化，所述因素包括但不限于治疗性化合物的特性(包括活性、药代动力学、药效学和生物利用度)、受试者的生理状况(包括年龄、性别、疾病类型和阶段、一般身体状况、对给定剂量的反应性和药物类型)、制剂中药学上可接受的一种或多种载体的性质以及给予途径。临床和药理学领域的技术人员将能够通过实验确定治疗有效量，即通过监测受试者对化合物给予的反应并相应地调整剂量。参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy21stEd.,Univ.of Sciences in Philadelphia(USIP),Lippincott Williams&
Wilkins,Philadelphia,PA,2005。
在某些实施方案中，本发明的核酸和药用组合物可诶用于治疗或预防疾病、障碍或综合征。
在某些实施方案中，本发明提供用于在哺乳动物受试者比如人类中预防或治疗疾病、障碍或综合征的方法，该方法包括给予需要它的受试者预防或治疗有效量的如本文公开的核酸的步骤。
给予“治疗有效剂量”的本发明核酸可导致疾病症状的严重性降低、疾病无症状期的频率和持续时间增加或者由于疾病折磨所致的损害或残疾的预防。
本发明的核酸可有益于治疗或诊断可使用本文所述的方法诊断或治疗的疾病、障碍或综合征。其它疾病、障碍或综合征的治疗和诊断也视为落入本发明的范围内。
本发明的一个方面为预防或治疗疾病、障碍或综合征的方法，其包括给予需要治疗的个体药用有效剂量或量的本文公开的核酸或组合物，优选地其中核酸或组合物皮下、静脉内或者通过口服、直肠、肺、肌内或腹膜内给予而给予受试者。优选地，其为皮下给予的。
相关疾病、障碍或综合征优选地为补体介导的疾病、障碍或综合征或者与补体途径并且特别是补体旁路途径相关的疾病、障碍或综合征。
疾病、障碍或综合征一般与补体途径(特别是旁路途径)的异常激活和/或过度激活(超激活)和/或与CFB或补体组分C3的过度表达或异位表达或定位或累积有关。涉及C3累积的疾病的一个实例为C3肾小球病(C3G)。在这种疾病中，CFB在肾小球中累积。补体途径的异常或过度激活可具有遗传原因或者可为获得性的。
疾病、障碍或综合征可以a)选自包含以下并且优选地由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)、重症肌无力(MG)、原发性膜性肾病、免疫复合物介导的肾小球肾炎(IC介导的GN)、感染后肾小球肾炎(PIGN)、系统性红斑狼疮(SLE)、缺血/再灌注损伤、年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎(RA)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、菌群失调性牙周病、疟疾性贫血、视神经脊髓炎、HCT/实体器官移植后(TMA)、吉兰-巴雷综合征、膜性肾小球肾炎、血栓性血小板减少性紫癜和脓毒症；或b)选自包含以下或优选地由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)和原发性膜性肾病；或c)选自包含以下或优选地由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、重症肌无力(MG)、IgA肾病(IgA N)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；d)选自包含以下或优选地由以下组成的组：C3肾小球病(C3G)、重症肌无力(MG)、视神经脊髓炎、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、IgA肾病(IgA N)、HCT/实体器官移植后(TMA)、吉兰-巴雷综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、膜性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和血栓性血小板减少性紫癜；e)C3肾小球病(C3G)和IgA肾病(IgA N)；或f)其为C3肾小球病(C3G)。待用根据本发明的核酸或组合物治疗的受试者优选地为受到这些疾病、障碍或综合征之一影响或处于受到其影响风险下的受试者。
本文公开的核酸或组合物可用于以包含每周治疗一次或两次、每周、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八周、每九周、每十周、每十一周、每十二周、每三个月、每四个月、每五个月、每六个月的方案，或者以具有不同给药频率比如之前提及间隔的组合的方案使用。核酸或组合物可用于皮下、静脉内使用或者使用任何其它应用途径比如口服、直肠、肺或腹膜内使用。优选地，其用于皮下使用。
在用如本文公开的核酸或组合物处理或接受其的细胞和/或受试者中，与未处理的细胞和/或受试者相比较，CFB的表达可被抑制15％直到100％的范围，但至少约30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或100％或中间值。抑制水平可允许治疗与CFB表达或过度表达或补体过度激活相关的疾病，或者可用于进一步研究CFB基因产物的功能和生理作用。抑制水平优选地在用核酸或组合物治疗的受试者的肝脏或血液或肾脏中，优选地在血液中进行测量。
一个方面为如本文公开的核酸或组合物在制造用于治疗疾病、障碍或综合征的药物中的用途，所述疾病、障碍或综合征比如以上所列的那些或与优选地在血液或肾脏中的CFB水平升高或补体途径的过度激活相关的另外病理学，或者其中期望抑制CFB表达的另外治疗方法。药物为药用组合物。
本发明的每种核酸及其药学上可接受的盐和溶剂化物构成本发明的各个实施方案。
本发明还包括的为预防或治疗疾病、障碍或综合征比如以上所列的那些的方法，其包括给予需要它的个体包含如本文所述的核酸或组合物的组合物。可例如以包含每周治疗两次、每周一次、每两周、每三周、每四周、每五周、每六周、每七周、每八至十二或更多周的方案，或者以具有不同给药频率比如之前提及间隔的组合的方案，给予核酸或组合物。核酸或缀合核酸可用于皮下或静脉内或者其它应用途径比如口服、直肠或腹膜内使用。
本发明的核酸可通过本领域已知的任何适当给予途径进行给予，所述给予途径包括但不限于气溶胶、肠、鼻、眼科、口服、胃肠外、直肠、阴道或经皮(例如局部给予的乳膏剂、凝胶剂或软膏剂，或者通过经皮贴剂)。“胃肠外给予”一般与在预期作用部位处或与之联系的注射有关，包括眶下、输注、动脉内、囊内、心内、皮内、肌内、腹膜内、肺内、脊柱内、胸骨内、鞘内、子宫内、静脉内、蛛网膜下、囊下、皮下、经粘膜或经气管给予。
核酸的化学修饰模式的使用赋予血清中的核酸酶稳定性并使得例如皮下应用途径可行。
用于皮内或皮下应用的溶液或混悬液一般包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，比如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，比如乙二胺四乙酸；缓冲剂，比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和/或张力调节剂，比如氯化钠或右旋糖。pH可用酸或碱，比如盐酸或氢氧化钠，或者用具有柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐等的缓冲液来调整。此类制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
无菌可注射溶液剂可通过将所需量的核酸根据需要与上述成分之一或组合一起掺入适当的溶剂中，然后为灭菌微滤进行制备。分散体可通过将活性化合物掺入到无菌媒介物内进行制备，所述媒介物含有分散介质和任选地其它成分，比如上述那些。在用于制备无菌可注射溶液剂的无菌粉剂的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥(冻干)，从其无菌过滤的溶液产生除任何另外期望的成分之外的活性成分的粉末。
当预防或治疗有效量的本发明核酸通过例如静脉内、皮肤或皮下注射进行给予时，核酸将呈无热原、胃肠外可接受的水溶液形式。考虑到适当的pH、等渗性、稳定性等，用于制备胃肠外可接受的溶液剂的方法在本领域的技术内。除核酸之外，用于静脉内、皮肤或皮下注射的优选药用组合物还含有等渗媒介物，比如氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、乳酸盐林格氏注射液或如本领域已知的其它媒介物。本发明的药用组合物还可含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员众所周知的其它添加剂。
可与载体材料组合以产生单一剂型的核酸的量将取决于各种因素而变化，包括所治疗的受试者和特定的给予模式。通常，其将为在特定情况下产生适当治疗作用的组合物的量。通常地，在百分之一百中，该量范围为与药学上可接受的载体组合的约0.01％-约99％核酸、约0.1％-约70％或约1％-约30％核酸。
核酸可与保护化合物免于快速释放的载体一起制备，比如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂和微囊化递送系统。可使用可生物降解的生物相容性聚合物，比如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或者通常为本领域技术人员已知的。参见例如Sustained and Controlled ReleaseDrug Delivery Systems,J.R.Robinson,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可调整剂量方案以提供最佳期望的反应(例如治疗反应)。例如，可给予剂量，可随着时间的推移给予几个分剂量，或者视情况而定，如通过治疗情形的特定情况指示的，按比例减少或增加剂量。尤其有利的是当给予受试者或患者时将胃肠外组合物配制成易于给予和剂量均匀的剂量单位形式。如本文使用的，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有计算为产生期望的治疗作用的预定数量的活性化合物。本发明剂量单位形式的规格取决于活性化合物的具体特性和待实现的特定治疗和预防作用以及任何个别患者的治疗和敏感性。
本发明的核酸或组合物可使用包括化学合成比如固相化学合成的本领域常规方法产生。
本发明的核酸或组合物可用本领域已知的各种医疗装置中的一种或多种进行给予。例如，在一个实施方案中，本发明的核酸可用无针皮下注射装置进行给予。可用于本发明的众所周知的植入物和模块的实例在本领域中，包括例如用于控制速率递送的可植入微量输液泵；用于通过皮肤给予的装置；用于以精确输注速率递送的输液泵；用于连续药物递送的可变流量可植入输注装置；以及渗透性药物递送系统。这些和其它此类植入物、递送系统和模块为本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的核酸或组合物可被配制为确保期望的体内分布。为将本发明的治疗性化合物或组合物靶向于特定的体内定位，它们可例如被配制为可包含选择性地转运到特定细胞或器官中因此增强靶向药物递送的一个或多个部分的脂质体。
本发明的特征为在分子和组织定向递送水平下的高特异性。本发明核酸的序列对于其靶标为高度特异性的，这意味着它们并不抑制它们并非设计为靶向的基因的表达，或仅最低限度地抑制它们并非设计为靶向的基因的表达和/或仅抑制低数目的它们并非设计为靶向的基因的表达。当核酸与由特定细胞类型特异性地识别和内化的配体连接时，实现进一步的特异性水平。例如，当核酸与包含由肝细胞特异性地识别和内化的GalNAc部分的配体连接时就是这种情况。这导致核酸仅在被其所连接的配体靶向的细胞中抑制其靶标的表达。这两个特异性水平潜在地赋予比目前可用的治疗更好的安全性概况。在某些实施方案中，本发明因此提供与配体连接的本发明核酸，所述配体包含一个或多个GalNAc部分，或者包含赋予核酸的细胞类型或组织特异性内化从而赋予通过RNA干扰的靶基因敲减的另外特异性的一个或多个其它部分。
如本文所述的，核酸可用呈脂质体形式的脂质进行配制。此种制剂在本领域中可描述为脂质体复合物(lipoplex)。具有脂质/脂质体的组合物可用于助于本发明的核酸递送到靶细胞。本文所述的脂质递送系统可用作缀合配体的替代物。当将本发明的核酸与脂质递送系统或与配体缀合物递送系统一起使用时，可存在本文所述的修饰。
此种脂质体复合物可包含脂质组合物，其包含：
i)阳离子脂质或其药学上可接受的盐；
ii)类固醇；
iii)磷脂酰乙醇胺磷脂；和/或
iv)PEG化脂质。
阳离子脂质可为氨基阳离子脂质。
阳离子脂质可具有以下式(XII)或其药学上可接受的盐：
其中：
X代表O、S或NH；
R1和R2各自独立地代表C4-C22线性或分支烷基链或者具有一个或多个双键的C4-C22线性或分支烯基链，其中烷基或烯基链任选地含有插入的酯、酰胺或二硫化物；
当X代表S或NH时，R3和R4各自独立地代表氢、甲基、乙基、单-或多胺部分，或者R3和R4一起形成杂环基环；
当X代表O时，R3和R4各自独立地代表氢、甲基、乙基、单-或多胺部分，或者R3和R4一起形成杂环基环；或者R3代表氢和R4代表C(NH)(NH2)。
阳离子脂质可具有以下式(XIII)或其药学上可接受的盐：
阳离子脂质可具有以下式(XIV)或其药学上可接受的盐：
阳离子脂质组分的含量可为组合物总体脂质含量的约55mol％-约65mol％。特别是，阳离子脂质组分为组合物总体脂质含量的约59mol％。
组合物可进一步包含类固醇。类固醇可为胆固醇。类固醇的含量可为脂质组合物总体脂质含量的约26mol％-约35mol％。更特别地，类固醇的含量可为脂质组合物总体脂质含量的约30mol％。
磷脂酰乙醇胺磷脂可选自1,2-二植酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPhyPE)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DLoPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(POPE)、1,2-二芥酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DEPE)、1,2-二角鲨烯酰(Disqualeoyl)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DSQPE)和1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(SLPE)。磷脂的含量可为组合物总体脂质含量的约10mol％。
PEG化脂质可选自1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG)和C16-神经酰胺-PEG。PEG化脂质的含量可为组合物总体脂质含量的约1-5mol％。
组合物中阳离子脂质组分的含量可为脂质组合物总体脂质含量的约55mol％-约65mol％，优选地为脂质组合物总体脂质含量的约59mol％。
组合物可具有选自55:34:10:1；56:33:10:1；57:32:10:1；58:31:10:1；59:30:10:1；60:29:10:1；61:28:10:1；62:27:10:1；63:26:10:1；64:25:10:1；和65:24:10:1的i):ii):iii):iv)的组分摩尔比。
组合物可包含具有以下结构的阳离子脂质
具有以下结构的类固醇
具有以下结构的磷脂酰乙醇胺磷脂
和具有以下结构的PEG化脂质
中性脂质体组合物可由例如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)形成。阴离子脂质体组合物可由二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体可主要地由二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)形成。另一种类型的脂质体组合物可由磷脂酰胆碱(PC)比如大豆PC和卵PC形成。另一种类型由磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。
荷正电的合成阳离子脂质，N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-Ν,Ν,Ν-三甲基氯化铵(DOTMA)可用于形成小脂质体，后者与核酸自发地相互作用以形成脂质-核酸复合物，所述脂质-核酸复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的荷负电脂质融合。DOTMA类似物还可用于形成脂质体。
本文所述脂质的衍生物和类似物还可用于形成脂质体。
含有核酸的脂质体可通过各种方法进行制备。在一个实例中，将脂质体的脂质组分溶解于去污剂中，使得胶束由脂质组分形成。例如，脂质组分可为两性阳离子脂质或脂质缀合物。去污剂可具有高临界胶束浓度并且可为非离子型的。示例性的去污剂包括胆酸盐、CHAPS、辛基葡糖苷、去氧胆酸盐和月桂酰肌氨酸。然后将核酸制剂加入到包括脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与核酸相互作用并在核酸周围凝聚以形成脂质体。在凝聚之后，例如通过透析去除去污剂，以产生核酸的脂质体制剂。
必要时，可例如通过受控添加在凝聚反应期间加入助于凝聚的载体化合物。例如，载体化合物可为除核酸以外的聚合物(例如精胺或亚精胺)。还可调整pH以利于凝聚。
本发明的核酸制剂可包括表面活性剂。在一个实施方案中，核酸被配制为包括表面活性剂的乳剂。
并未电离的表面活性剂为非离子型表面活性剂。实例包括非离子型酯，比如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油酯等，非离子型烷醇酰胺，以及醚比如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇和乙氧基化/丙氧基化嵌段聚合物。
当在水中溶解或分散时携带负电荷的表面活性剂为阴离子表面活性剂。实例包括羧酸盐，比如皂、酰基乳酸盐、氨基酸的酰基酰胺，硫酸的酯，比如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸盐，比如烷基苯磺酸盐、酰基羟乙磺酸盐、酰基牛磺酸盐和磺基琥珀酸盐，以及磷酸盐。
当在水中溶解或分散时携带正电荷的表面活性剂为阳离子表面活性剂。实例包括季铵盐和乙氧基化胺。
具有携带正或负电荷的能力的表面活性剂为两性表面活性剂。实例包括丙烯酸衍生物、取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱和磷脂。
“胶束”在本文中定义为特定类型的分子组装，其中两性分子排列在球形结构中，使得分子的所有疏水部分均指向内部，留下亲水部分与周围的水相接触。如果环境为疏水性的，则存在相反排列。可通过将核酸的水溶液、碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成化合物混合来形成胶束。
示例性的胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸的药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、洋甘菊提取物、黄瓜提取物、油酸、亚油酸、亚麻酸、单油酸甘油酯、单油酸酯、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧代胆甾烷基(cholanyl)甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘油、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧乙烯醚及其类似物、聚多卡醇(polidocanol)烷基醚及其类似物、鹅去氧胆酸盐、去氧胆酸盐及其混合物。
可将苯酚和/或间甲酚加入到混合胶束组合物中以充当稳定剂和防腐剂。还可加入等渗剂比如甘油。
可将核酸制剂掺入到颗粒比如微粒中。微粒可通过喷雾干燥、冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些方法的组合进行生产。
定义
如本文使用的，关于基因表达的术语“抑制”、“下调”或“减少”意指基因的表达，或者编码一种或多种蛋白或蛋白亚基的RNA分子或等价RNA分子(例如mRNA)的水平，或者一种或多种蛋白或蛋白亚基的活性，减少到低于在不存在本发明的核酸或缀合核酸的情况下观察到的，或与用与人类转录本没有已知同源性的siRNA分子(在本文中称为非沉默对照)获得的相比较是减少的。此种对照可以与本发明分子以类似的方式进行缀合和修饰并通过相同的途径递送到靶细胞中。在用本发明的核酸治疗之后表达可减少到95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、15％、10％、5％或0％或中间值，或小于在不存在核酸或缀合核酸的情况下观察到的。表达可在核酸所应用的细胞中进行测量。备选地，尤其是如果将核酸给予受试者，则水平可在不同组的细胞中或者在组织或器官中或者在体液比如血液或血浆中进行测量。抑制水平优选地在已选择的条件下进行测量，因为它们在体外用核酸处理的细胞中显示核酸对靶mRNA水平的最大效应。例如，抑制水平可在用浓度在0.038nM-10μM之间，优选地为0.5nM、1nM、10nM或100nM的核酸治疗24小时或48小时之后进行测量。这些条件对于不同的核酸序列或对于不同类型的核酸，比如对于未修饰或修饰的或者与配体缀合或未缀合的核酸可为不同的。用于确定抑制水平的合适条件的实例在实施例中进行描述。
核酸意指包含含有核苷酸的两条链的核酸，其能够干扰基因表达。抑制可为完全或部分的并且导致基因表达以靶向方式的下调。核酸包含两条分开的多核苷酸链；也可为引导链的第一链；以及也可为乘客链的第二链。第一链和第二链可为自互补的向后‘折叠’以形成双链分子的同一多核苷酸分子的部分。核酸可为siRNA分子。
核酸可包含核糖核苷酸、修饰的核糖核苷酸、脱氧核苷酸、脱氧核糖核苷酸或能够模仿核苷酸以使得它们可与靶序列或互补链上的相应碱基‘配对’的核苷酸类似物非核苷酸。核酸可进一步包含由第一链(在本领域中也称为引导链)的全部或一部分和第二链(在本领域中也称为乘客链)的全部或一部分形成的双链核酸部分或双链体区域。双链体区域被定义为以第一链和第二链之间形成的第一个碱基对开始并以第一链和第二链之间形成的最后一个碱基对结束，包含起止碱基对在内。
双链体区域意指两种互补或基本上互补的寡核苷酸中的区域，其通过Watson-Crick碱基配对或者允许互补或基本上互补的寡核苷酸链之间双链体的任何其它方式彼此形成碱基对。例如，具有21个核苷酸单元的寡核苷酸链可与21个核苷酸单元的另一种寡核苷酸碱基配对，然而每条链上仅19个核苷酸为互补或基本上互补的，使得“双链体区域”由19个碱基对组成。剩余的碱基对可作为5’和3’突出端存在，或作为单链区域存在。进一步地，在双链体区域内，不要求100％的互补性；基本互补性在双链体区域内为可允许的。基本互补性是指链之间的互补性，使得它们能够在生物条件下退火。凭经验确定两条链是否能够在生物条件下退火的技术为本领域众所周知的。备选地，可合成两条链并在生物条件下一起添加，以确定它们是否彼此退火。形成至少一个双链体区域的第一链和第二链的部分可为彼此完全互补的并且为至少部分地彼此互补的。取决于核酸的长度，在第一链和第二链之间的碱基互补性方面不一定要求完全匹配。然而，第一和第二链必须能够在生理条件下杂交。
如本文使用的，术语“非配对核苷酸类似物”意指包括非碱基配对部分的核苷酸类似物，其包括但不限于：6去氨基腺苷(水粉蕈素(Nebularine))、4-Me-吲哚、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、Ds、Pa、N3-Me ribo U、N3-Me riboT、N3-Me dC、N3-Me-dT、N1-Me-dG、N1-Me-dA、N3-乙基-dC和N3-Me dC。在一些实施方案中，非碱基配对核苷酸类似物为核糖核苷酸。在其他实施方案中，其为脱氧核糖核苷酸。
如本文使用的，术语“末端官能团”非限制性地包括卤素、醇、胺、羧酸、酯、酰胺、醛、酮和醚基。
如本文使用的，“突出端”具有其在本领域中的正常和习惯含义，即核酸的单链部分，其在双链核酸中延伸超出互补链的末端核苷酸。术语“平端”包括由此两条链在同一位置处终止的双链核酸，不管末端核苷酸是否碱基配对。第一链和第二链在平端处的末端核苷酸可为碱基配对的。第一链和第二链在平端处的末端核苷酸可为不配对的。第一链和第二链在平端处的末端两个核苷酸可为碱基配对的。第一链和第二链在平端处的末端两个核苷酸可为不配对的。
术语“丝氨醇衍生的接头部分”意指接头部分包含以下结构：
所述结构的O原子一般与RNA链连接和N原子一般与靶向配体连接。
术语“患者”、“受试者”和“个体”可互换地使用并且是指人类或非人动物。这些术语包括哺乳动物，比如人类、灵长类动物、牲畜动物(例如牛、猪)、伴侣动物(例如犬、猫)和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
如本文使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”及其语法变体是指用于获得有益或期望的临床结果的方法。该术语可指减缓病症、障碍或疾病的发作或发展速率，减少或减轻与之相关的症状，产生病症的完全或部分消退，或任何以上的某种组合。为本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于症状减少或减轻，疾病程度的降低，疾病状态的稳定(即不恶化)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或缓和，以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测的。“治疗”还可意指相对于未接受治疗时的预期存活时间的延长存活。因此，需要治疗的受试者(例如人类)可为已受所讨论的疾病或障碍折磨的受试者。术语“治疗”包括相对于不存在治疗时，在病理状态或症状的严重性方面的增加的抑制或减少，而不一定意指暗示相关疾病、障碍或病症的完全停止。
如本文使用的，术语“预防”及其语法变体是指用于抑制或预防病症、疾病或障碍的发展、进展或者发作的时间或速率的方法，并且可与病理学和/或症状相关。为本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于疾病的症状、进展或发展的预防、抑制或减缓，无论是可检测还是不可检测的。因此，需要预防的受试者(例如人类)可为尚未受所讨论的疾病或障碍折磨的受试者。术语“预防”包括相对于不存在治疗时，减缓疾病的发作，而不一定意指暗示相关疾病、障碍或病症的永久预防。因此在某些情况下，病症的“预防”可指减少发展病症的风险，或者预防、抑制或延迟与病症相关的症状的发展。将会理解，预防可被视为治疗或疗法。
如本文使用的，“有效量”、“预防有效量”、“治疗有效量”或“有效剂量”为组合物(例如治疗性组合物或药物)的量，其在受试者产生至少一种期望的治疗作用，比如预防或治疗目标病症或者有益地减轻与病症相关的症状。
如本文使用的，术语“药学上可接受的盐”是指对给予所讨论的盐的患者或受试者无害的盐。其可为例如在酸加成盐和碱性盐中选择的盐。酸加成盐的实例包括氯化物盐、柠檬酸盐和乙酸盐。碱性盐的实例包括这样的盐，其中阳离子选自碱金属阳离子比如钠或钾离子、碱土金属阳离子比如钙或镁离子以及取代的铵离子比如类型N(R1)(R2)(R3)(R4)+，其中R1、R2、R3和R4独立地一般指定为氢、任选取代的C1-6-烷基或任选取代的C2-6-烯基。相关的C1-6-烷基的实例包括甲基、乙基、1-丙基和2-丙基。可能相关的C2-6-烯基的实例包括乙烯基、1-丙烯基和2-丙烯基。药学上可接受的盐的其他实例在“Remington’sPharmaceutical Sciences”,第17版,Alfonso R.Gennaro(编辑),Mark PublishingCompany,Easton,PA,USA,1985(及其更新版本)，“Encyclopaedia ofPharmaceuticalTechnology”,第3版,James Swarbrick(编辑)，Informa Healthcare USA(Inc.),NY,USA,2007，以及J.Pharm.Sci.66:2(1977)中进行描述。“药学上可接受的盐”在性质上保留母体化合物期望的生物活性而不赋予相对于化合物的任何不期望的效应。药学上可接受的盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括衍生于非毒性无机酸比如盐酸、硝酸、亚磷酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸等，或者衍生于非毒性有机酸比如脂肪族单-和二羧酸、苯基取代的烷酸、羟基烷酸、芳香酸、脂肪族和芳族磺酸等的盐。碱加成盐包括衍生于碱土金属比如钠、钾、镁、钙等，以及衍生于非毒性有机胺比如N,N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等的盐。
术语“药学上可接受的载体”包括标准药用载体中的任何一种。用于治疗用途的药学上可接受的载体为制药领域众所周知的，并且例如在Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro编辑1985)中进行描述。例如，可使用在微酸性或生理pH下的无菌盐水以及磷酸盐缓冲盐水。示例性的pH缓冲剂包括磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氢铵、二乙醇胺、组氨酸(其为优选的缓冲剂)、精氨酸、赖氨酸或乙酸盐或其混合物。该术语进一步涵盖美国药典中所列的用于动物(包括人类)的任何试剂。“药学上可接受的载体”包括任何和所有生理学上可接受的(即相容性的)溶剂、分散介质、包衣、抗微生物剂、等渗和吸收延迟剂等。在某些实施方案中，载体适合于静脉内、肌内、皮下、胃肠外、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。取决于选择的给予途径，核酸可在当通过特定给予途径给予受试者时预期保护化合物免受核酸可能暴露于的酸及其它天然失活条件作用的一种或多种材料中进行包衣。
在本发明的上下文中，术语“溶剂化物”是指在溶质(在这种情况下(in casu)，根据本发明的核酸化合物或其药学上可接受的盐)和溶剂之间形成的具有确定化学计量学的复合物。在这方面的溶剂可例如为水或另一种药学上可接受的、一般为小分子的有机种类，比如但不限于乙酸或乳酸。当所讨论的溶剂为水时，这种溶剂化物通常称为水合物。
现将参考以下非限制性附图和实施例来描述本发明。
附图简述
图1显示在与GalNAc缀合的siRNA一起温育之后，归一化至PPIB mRNA的原代食蟹猴肝细胞中的相对CFB mRNA表达。Ut表示未处理细胞中的靶标表达，和Ctr表示与非靶向对照siRNA一起温育之后的靶标表达。
图2显示在与GalNAc缀合的siRNA一起温育之后，归一化至PPIB mRNA的原代人类肝细胞中的相对CFB mRNA表达。Ut表示未处理细胞中的靶标表达，和Ctr表示与非靶向对照siRNA一起温育之后的靶标表达。
图3显示在与siRNA GalNAc缀合物一起温育之后，归一化至APOB mRNA的原代鼠肝细胞中的相对CFB mRNA表达。Ut表示未处理细胞中的靶标表达，和Ctr表示与非靶向对照siRNA一起温育之后的靶标表达。
图4显示在与GalNAc缀合的siRNA一起温育之后，对于ApoB(A)或PPIB(B,C)mRNA，原代小鼠(A)、人类(B)和食蟹猴(C)肝细胞中的相对CFB mRNA表达。
图5A显示1或5mg/kg的GalNAc缀合的siRNA EV2184、EV2185、EV2187、EV2188和EV2195的单次给药之后14天，在鼠肝脏中以％表示的相对CFB mRNA表达。一组用PBS给药充当对照。数据在条形图中显示为平均值±SD(n＝5/组)。图5B显示1或5mg/kg的GalNAc缀合的siRNA EV2184、EV2197、EV2185和EV2200的单次给药之后21和42天，在鼠肝脏中以％表示的相对CFB mRNA表达。一组用PBS给药充当对照。数据在条形图中显示为平均值±SD(n＝4/组)。
图6显示单次皮下给药GalNAc缀合的siRNA EV2196、EV2204和EV2198后4周和8周时的CFB mRNA减少。
实施例
实施例1
HepG2细胞中的体外研究显示在0.5nM和10nM siRNA的转染之后，受试siRNA的CFB敲减效力。
在HepG2细胞中0.5或10nM siRNA的转染之后，确定siRNA EV2001-EV2180(表5b)的CFB敲减效力。结果如以下表3所示。在敲减之后于10nM下剩余的CFB水平在6％-83％的范围内，于0.5nM下在14％-95％之间。于10nM下最有效的siRNA为EV2160、EV2159、EV2167、EV2050、EV2036、EV2101和EV2042。
对于用siRNA转染HepG2细胞，将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种于96孔组织培养板(TPP,Cat.92096,瑞士)中。直接地在接种之前根据制造商的说明书，用Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen/Life Technologies,Cat.13778-500,德国)进行siRNA的转染。用CFB siRNA以10nM和0.5nM一式三份分别进行双剂量筛选，其中扰乱siRNA和靶向萤光素酶的siRNA作为非特异性对照。在与siRNA一起温育24h之后，去除培养基，并在250μl裂解缓冲液(InviTrap RNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec,Cat.7061300400,德国))中裂解细胞且然后于-80℃下冷冻。使用InviTrap RNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec,Cat.7061300400,德国)分离RNA。使用CFB和PPIB特异性引物探针组和TakyonTMOne-Step Low Rox Probe 5X MasterMix dTTP在来自Applied Biosystems的QuantStudio6装置上以单重(single-plex)384孔格式进行RT-qPCR。使用ΔΔCt方法计算表达差异并测定归一化至管家基因PPIB的CFB相对表达。结果在表3中表示为siRNA转染之后％剩余的CFB mRNA。
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表3：靶向CFB的siRNA的双剂量筛选(10nM和0.5nM)的结果。
形成每种siRNA双链体的单链的身份及其序列和修饰将在说明书末尾的表中找到。
实施例2
在原代食蟹猴肝细胞中的体外研究显示受试siRNA-GalNAc缀合物的CFB敲减效力。
在与100nM、10nM、1nM、0.1nM和0.01nM的GalNAc siRNA缀合物一起温育之后评价CFB mRNA的表达。siRNA缀合物列于表5c中。管家基因PPIB的mRNA水平充当对照。
为测试GalNac缀合的siRNA在原代食蟹猴肝细胞中对CFB的敲减效力，将每孔45,000个细胞(供应商：Life Technologies and Primacyt)接种于胶原蛋白包被的96孔板(Life Technologies)上。在接种之后立即加入浓度在100nM-0.01nM之间的siRNA。处理后24小时，使用InviTrap RNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec)裂解细胞。使用针对CFB和PPIB的mRNA特异性引物和探针进行RT-qPCR。使用ΔΔCt方法计算表达差异并测定归一化至管家基因PPIB的CFB相对表达。结果表示为CFB对PPIB mRNA相对于未处理水平的比率并可如图1所示。
对所有受试GalNAc缀合物均观察到CFB mRNA的剂量依赖性敲减，其中对EV2181、EV2182、EV2185、EV2186、EV2190和EV2195观察到最强的剂量依赖性靶标敲减。
实施例3
在原代人类肝细胞中的体外研究显示受试siRNA-GalNAc缀合物的敲减效力。
在与100nM、20nM、4nM、0.8nM和0.16nM的GalNAc-siRNA缀合物一起温育之后评价CFB mRNA的表达。受试siRNA缀合物列于表5c中。管家基因PPIB的mRNA水平用作对照。
为测试GalNac缀合的siRNA在原代人类肝细胞中对CFB的敲减效力，将每孔35000个细胞(供应商：Life Technologies)接种于胶原蛋白包被的96孔板(Life Technologies)上。在接种之后立即加入浓度在100nM-0.16nM之间的siRNA。处理后24小时，使用InviTrapRNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec)裂解细胞。使用针对CFB和PPIB的mRNA特异性引物和探针进行RT-qPCR。使用ΔΔCt方法计算表达差异并将CFB的相对表达归一化至管家基因PPIB的表达。结果表示为CFB对PPIB mRNA相对于未处理水平的比率并可如图2所示。
对所有受试GalNAc缀合物均观察到CFB mRNA的剂量依赖性敲减，对EV2181、EV2182、EV2184、EV2185、EV2186、EV2190和EV2193观察到最强的剂量依赖性靶标敲减。
实施例4
在原代小鼠肝细胞中的体外研究显示受试siRNA-GalNAc缀合物的敲减效力。
在与100nM、10nM、1nM、0.1nM和0.01nM的GalNAc siRNA缀合物一起温育之后评价CFB mRNA的表达。siRNA缀合物列于表5c中。管家基因ApoB的mRNA水平用作对照。
为测试GalNac缀合的siRNA在原代小鼠肝细胞中对CFB的敲减效力，将每孔25,000个细胞(供应商：Life Technologies and Primacyt)接种于胶原蛋白包被的96孔板(LifeTechnologies)上。在接种之后立即加入浓度在100nM-0.01nM之间的siRNA。处理之后24小时，使用InviTrap RNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec)裂解细胞。使用针对CFB和ApoB的mRNA特异性引物和探针进行qPCR。使用ΔΔCt方法计算表达差异并将CFB的相对表达归一化至管家基因ApoB的表达。结果表示为CFB与ApoB mRNA相对于未处理水平的比率并可如图3所示。
对所有受试GalNAc缀合物均观察到CFB mRNA的剂量依赖性敲减，对EV2184、EV2185和EV2188观察到最强的剂量依赖性靶标敲减。
实施例5
在原代小鼠、人类和食蟹猴肝细胞中的体外研究显示受试siRNA-GalNAc缀合物的敲减效力。
在与GalNAc siRNA缀合物EV2196、EV2197、EV2198、EV2199,、EV2200、EV2201、EV2202、EV2203、EV2204、EV2205和EV2206siRNA缀合物一起温育之后CFB mRNA的表达。siRNA缀合物列于表5c中。管家基因PPIB(对于食蟹猴和人类细胞)或APOB(对于小鼠细胞)的mRNA水平用作对照。
将小鼠、人类或食蟹猴原代肝细胞以每孔25,000、30,000或40,000个细胞的密度分别接种到胶原蛋白I包被的96孔板上。在预先确定的培养基中铺板之后将GalNAc缀合的siRNA立即加入至最终siRNA浓度为100nM-0.01nM。然后在5％ CO2气氛中于37℃下使板温育24小时。随后，裂解细胞并使用InviTrap RNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec)分离RNA。使用10μl RNA溶液通过逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)对CFB和PPIB或ApoB的扩增子组/序列进行基因表达分析。通过使用也称为2-ΔΔCt方法的比较性CT方法计算数据。
所有受试GalNAc缀合的siRNA均浓度依赖性地减少CFB mRNA表达。
结果显示于图4，其中小图(A)、(B)和(C)分别显示在原代小鼠(A)、人类(B)以及食蟹猴(C)肝细胞中的相对CFB mRNA表达。
实施例6
体内研究显示在不同时间点单次皮下给药1或5mg/kg GalNAc缀合的siRNA之后鼠肝脏组织中CFB mRNA的敲减。
siRNA缀合物列于表5c中。管家基因ACTB的mRNA水平充当管家对照。
8周龄的雄性C57BL/6小鼠得自Janvier，法国。动物实验根据德国动物保护法的伦理指导原则(ethical guidelines of the German Protection of Animals Act)以其2013年7月版本来进行。小鼠根据重量随机化到4或5只小鼠的组中。在研究的第0天，动物接受溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1或5mg/kg siRNA或者作为对照的仅PBS的单次皮下剂量。在研究期间监测小鼠的生存力、体重和行为而没有病理发现。
在第14天(图5A)，或在第21天和第42天(图5B)终止研究，对动物实施安乐死，并将肝脏样品快速冷冻且储存于-80℃下直至进一步分析。总之，为了分析，根据制造商的说明书，用RNeasy Fibrous Tissue Mini试剂盒(QIAGEN,Venlo,Netherlands)制备总RNA。为评价所分离RNA的完整性，使用2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Inc.,SantaClara,USA)进行自动化电泳。每次反应100纳克的总RNA用于RT-qPCR，扩增子组对小鼠CFB和ACTB具有特异性。
使用ΔΔCt方法计算表达差异并将归一化至PBS的CFB相对于管家基因ACTB的相对表达用于比较不同的siRNA。EV2184、EV2185、EV2187、EV2188和EV2195诱导肝脏CFB mRNA的剂量依赖性敲减。使用5mg/kg siRNA的EV2184、EV2187和EV2188在14天之后观察到最大实现的敲减，分别为90％、89％和87％(图5A)。
siRNA缀合物EV2184、EV2197、EV2185和EV2200在第二个实验中也诱导肝脏CFBmRNA的剂量依赖性敲减。使用5mg/kg siRNA的siRNA EV2197和EV2200在21天之后观察到最大实现的敲减(分别为94％和88％)。使用5mg/kg siRNA的EV2197和EV2200在42天之后最大实现的敲减分别为88％和77％(图5B)。
实施例7
如在Prakash,Nucleic Acids Res.2015,43(6),2993-3011和Haraszti,NucleicAcids Res.2017,45(13),7581-7592中所述进行(vp)-mU-phos的合成。如在WO2017/174657中所述进行ST41(ST41-phos)以及ST23(ST23-phos)的亚磷酰胺衍生物合成。如在Caruthers,J.Org.Chem.1996,61,4272-4281中所述进行硫代亚磷酰胺的合成。
实施例8
根据以下所述和本领域技术人员已知的方法合成实例化合物。寡核苷酸链和接头砌块的组装通过应用亚磷酰胺方法的固相合成进行。
按照本领域众所周知的标准程序进行下游切割、脱保护和纯化。
寡核苷酸合成在AKTA oligopilot 10上，使用市售可获得的2’O-甲基RNA和2’氟-2’脱氧RNA碱基加载的CPG固体支持物进行，并且使用亚磷酰胺(所有标准保护，ChemGenes,LinkTech)。
辅助试剂购自EMP Biotech和Biosolve。使用亚磷酰胺在干燥乙腈(<20ppm H2O)中的0.1M溶液进行合成，并且苄硫基四唑(BTT)被用作激活剂(0.3M在乙腈中)。偶联时间为10min。如果硫代亚磷酰胺被用于引入硫代磷酸酯键合(PS2)，则进行60min以上的重复偶联洗涤循环。应用Cap/OX/Cap或Cap/Thio/Cap循环(Cap：Ac2O/NMI/二甲基吡啶/乙腈，氧化剂：0.05M I2在吡啶/H2O中)。使用乙腈中的市售可获得的硫醇化试剂50mM EDITH(Linktechnologies)引入硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯。通过用甲苯中的3％二氯乙酸处理来实现DMT切割。在程序化合成循环完成后，进行二乙胺(DEA)洗涤。以DMT-脱除模式合成所有寡核苷酸。
通过先后为分支三聚体亚酰胺(trebler amidite)衍生物(C4XLT-phos)和GalNAc亚酰胺(amidite)(ST23-phos)的相继偶联而引入三触角GalNAc簇(ST23/ST41)。(vp)-mU部分的附接通过在最后一个合成循环中使用(vp)-mU-phos来实现。(vp)-mU-phos并不提供适合于进一步合成延长的羟基，并且因此并不具有DMT基团。因此，(vp)-mU-phos的偶联导致合成终止。
为去除掩蔽乙烯基膦酸酯的甲酯，使携带完全组装的寡核苷酸的CPG在减压下干燥并转移到配备有圆盘熔块(Carl Roth GmbH)的用于固相肽合成的20ml PP注射器反应器中。然后在室温下使CPG与250μL TMSBr和177μL在CH2Cl2中的吡啶的溶液(0.5ml/μmol固体支持物结合的寡核苷酸)接触，并用鲁尔帽密封反应器。将反应容器在2x15min的时间段内略微搅动，弃去过量试剂，并将残留CPG用10ml乙腈洗涤2x。进一步的下游处理与任何其它实施例化合物没有改变。
在RT下于90min内通过40％水性甲胺处理(在存在20mM DTT的情况下，如果存在二硫代磷酸酯键合)将CPG切下单链。所得粗品寡核苷酸通过AKTA Pure HPLC系统上的离子交换色谱(Resource Q，6ml，GE Healthcare)，使用氯化钠梯度进行纯化。将含有产物的级分汇集，在尺寸排阻柱(Zetadex,EMP Biotech)上脱盐并冻干直至进一步使用。
所有最终单链产物通过AEX-HPLC进行分析以证明其纯度。各单链产物的身份通过LC-MS分析来证明。
实施例9
将单个单链以60OD/ml的浓度溶解于H2O中。将两种单个寡核苷酸溶液一起加入反应容器中。为更易于反应监测，进行滴定。第一链以超过第二链的25％过量加入，如通过260nm处的UV吸收确定的。将反应混合物加热到80℃持续5min并然后缓慢冷却至RT。通过离子配对反相HPLC监测双链形成。根据残留单链的UV区域，计算第二链的所需量并将其加入到反应混合物中。将反应再次加热至80℃并缓慢冷却至RT。重复该程序直至检测到少于10％的残留单链。
实施例10
在HepG2细胞中的体外研究显示在20、4、0.8、0.16或0.032nM siRNA的转染之后，受试siRNA的CFB敲减效力。
在HepG2细胞中的20、4、0.8、0.16nM siRNA转染之后，测定选择的siRNA(表5b)的CFB敲减效力。结果显示于以下表6。在20nM下，敲减之后剩余的CFB水平达到32％的最小值和在4nM下达到43％的最小值。
对于用siRNA转染HepG2细胞，将细胞以40,000个细胞/孔的密度接种于96孔组织培养板(TPP,Cat.92096,瑞士)中。直接地在接种之前根据制造商的说明书，用Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen/Life Technologies,Cat.13778-500,德国)进行siRNA的转染。用CFB siRNA分别以20、4、0.8、0.16或0.032nM一式三份进行剂量-反应筛选，其中扰乱siRNA和靶向萤光素酶的siRNA作为非特异性对照。在与siRNA一起温育24h之后，去除培养基，并在250μL裂解缓冲液(InviTrap RNA Cell HTS96试剂盒/C(Stratec,Cat.7061300400,德国))中裂解细胞且然后于-80℃下冷冻。使用InviTrap RNA CellHTS96试剂盒/C(Stratec,Cat.7061300400,德国)分离RNA。使用CFB和PPIB特异性引物探针组和TakyonTMOne-Step Low Rox Probe 5X MasterMix dTTP在来自Applied Biosystems的QuantStudio6装置上以单重384孔格式进行RT-qPCR。使用ΔΔCt方法计算表达差异并测定归一化至管家基因PPIB的CFB的相对表达。结果在表6中表示为siRNA转染之后％剩余的CFBmRNA。
表6：靶向CFB的siRNA的剂量-反应筛选(20、4、0.8、0.16、0.032nM)结果.
形成每种siRNA双链体的单链身份及其序列和修饰将显示于表5b。
实施例11
在非人灵长类动物(NHP)中的体内研究显示CFB mRNA的敲减.
该实验的目的为测定siRNA-GalNAc缀合物在非人灵长类动物(NHP)体内靶向CFB的mRNA敲减效力。
将有意培育的食蟹猴(24-48个月大，雄性和雌性)分配到不同的治疗组(每组4只动物)。在第1天，每组通过皮下注射用3mg GalNAc siRNA/kg体重的单剂量进行治疗，而对照动物通过皮下注射接受媒介物0.9％盐水。给药前、4周之后和8周之后，通过存活活组织检查和快速冷冻从每只动物采集肝脏样品。从肝脏样品提取RNA并通过Taqman-qRT-PCR测定CFB和ApoB mRNA水平。将对CFB mRNA获得的值归一化至对管家基因ApoB产生的值。将每个个体在给药前时间点相对于ApoB表达的CFB mRNA表达设定为1倍靶基因表达。
GalNAc缀合的siRNA EV2196、EV2204和EV2198的单次皮下剂量后4和8周CFB mRNA减少的结果显示于图6。用EV2196单次治疗之后4周采集的食蟹猴肝脏组织中的CFB水平平均降低61％和8周之后降低55％。用EV2204单次治疗之后4周采集的食蟹猴肝脏组织中的CFB水平平均降低22％和8周之后未观察到降低。用EV2198单次治疗之后4周采集的食蟹猴肝脏组织中的CFB水平平均降低57％和8周之后降低32％。
声明
以下声明代表本发明的方面。
1.用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸，其中核酸包含第一链和第二链，其中第一链序列的未修饰等价物包含与表5a所示或表1的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的至少15个核苷酸的序列。
2.声明1的核酸，其中第一链和第二链为单独的链并且各自为长度18-25个核苷酸。
3.声明1或声明2的核酸，其中第一链和第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。
4.前述声明中任何一个的核酸，其中双链体区域由17-25个连续核苷酸碱基对组成。
5.前述声明中任何一个的核酸，其中所述核酸：
a)在两端处为平端的；
b)具有在一端处的突出端和在另一端处的平端；或
c)具有在两端处的突出端。
6.前述声明中任何一个的核酸，其中核酸为siRNA。
7.前述声明中任何一个的核酸，其中核酸介导RNA干扰。
8.前述声明中任何一个的核酸，其中：
(a)第一链序列的未修饰等价物包含与表5a的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列的未修饰等价物包含与表5a的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列的未修饰等价物包含与表5a的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表5a的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列的未修饰等价物包含表5a的第一链序列中任何一种的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含相应第二链序列的序列；或
(i)第一链序列的未修饰等价物由表5a的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物由相应第二链序列的序列组成。
9.声明8的核酸，其中：
(a)第一链序列的未修饰等价物包含与表1的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列的未修饰等价物包含与表1的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列的未修饰等价物包含与表1的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列的未修饰等价物包含对应于从表1的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列的未修饰等价物包含表1的第一链序列中任何一种的序列，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含相应第二链序列的序列；
(i)第一链序列的未修饰等价物由表1的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物由相应第二链序列的序列组成；
(j)第一链序列的未修饰等价物基本上由表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中的任何一种组成，并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物基本上由表1所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列组成；
(k)第一链序列的未修饰等价物由对应于从表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列的未修饰等价物进一步地由表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，
并且任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含表1所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或者基本上由其组成或由其组成；
(l)第一链序列的未修饰等价物由对应于从表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列的未修饰等价物进一步地由表1所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
其中所述第一链序列的未修饰等价物由与SEQ ID NO.758的CFB转录本互补的长度为17-25个核苷酸、优选地长度为18-24个核苷酸的邻接区域组成；和
任选地其中第二链序列的未修饰等价物包含表1所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或者基本上由其组成或由其组成；
(m)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物存在于单链上，其中第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸；或
(n)以上子段(a)至(l)的核酸分中任何一种的第一链的未修饰等价物和第二链的未修饰等价物在两条单独的链上，这两条链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸。
10.前述声明中任何一个的核酸，其中第一和/或第二链的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。
11.声明10的核酸，其中第一链的至少核苷酸2和14通过第一修饰进行修饰，所述核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。
12.声明10或声明11的核酸，其中第一链偶数编号的核苷酸各自通过第一修饰进行修饰，所述核苷酸以第一链5’端处的核苷酸编号1开始连续地编号。
13.声明11或声明12的核酸，其中第一链奇数编号的核苷酸通过第二修饰进行修饰，其中第二修饰与第一修饰不同。
14.声明11-13中任何一个的核酸，其中第二链在对应于第一链偶数编号的核苷酸的位置中的核苷酸通过第三修饰进行修饰，其中第三修饰与第一修饰不同。
15.声明11-14中任何一个的核酸，其中第二链在对应于第一链奇数编号的核苷酸的位置中的核苷酸通过第四修饰进行修饰，其中当存在第二和/或第三修饰时，第四修饰与第二修饰不同并且与第三修饰不同。
16.声明11-13中任何一个的核酸，其中第二链在对应于第一链的核苷酸11或核苷酸13或核苷酸11和13或核苷酸11-13的位置中的一个或多个核苷酸通过第四修饰进行修饰，并且优选地其中未通过第四修饰进行修饰的第二链的核苷酸通过第三修饰进行修饰。
17.声明11-16中任何一个的核酸，其中如果两种修饰均存在于核酸中，则第一修饰与第四修饰相同，并且优选地其中如果两种修饰均存在于核酸中，则第二修饰与第三修饰相同。
18.声明11-17中任何一个的核酸，其中第一修饰为2’-F修饰；如果存在于核酸中，则第二修饰优选地为2’-OMe修饰；如果存在于核酸中，则第三修饰优选地为2’-OMe修饰；和如果存在于核酸中，则第四修饰优选地为2’-F修饰。
19.任何一个声明10-18的核酸，其中第一链和第二链的每个核苷酸均为修饰的核苷酸。
20.任何一个声明10-18的核酸，所述第一链具有在其5’端处的末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸和其中末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸优选地通过磷酸二酯键合与第一链中的第二核苷酸连接。
21.前述声明中任何一个的核酸，其中核酸包含在第一和/或第二链的末端二或三个3’核苷酸和/或5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合，并且优选地其中在剩余核苷酸之间的键合为磷酸二酯键合。
22.声明1-20中任何一个的核酸，其包含在第一链3’端处的二、三或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合和/或包含在第二链3’端处的二、三或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合和/或在第二链5’端处的二、三或四个末端核苷酸各自之间的二硫代磷酸酯键合，并且包含在第一链5’端处的二、三或四个末端核苷酸之间除二硫代磷酸酯键合以外的键合。
23.声明22的核酸，其中当在所述端部处不存在二硫代磷酸酯键合时，核酸包含在第一链上三个末端3’核苷酸各自之间和/或在三个末端5’核苷酸各自之间和/或在第二链的三个末端3’核苷酸各自之间和/或在三个末端5’核苷酸各自之间的硫代磷酸酯键合。
24.声明22的核酸，其中除在第一链3’端处的两个末端核苷酸之间的键合以及在第二链的3’端和5’端处的两个末端核苷酸之间的键合以外，两条链的核苷酸之间的所有键合均为磷酸二酯键合。
25.声明10-24中任何一个的核酸，其中
(a)第一链序列包含与表5b的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列包含与表5b的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列包含与表5b的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列包含对应于从表5b的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列包含表5b的第一链序列中任何一种的序列，和任选地其中第二链序列包含相应第二链序列的序列；或
(i)第一链序列由表5b的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列由相应第二链序列的序列组成。
26.声明25的核酸，其中：
(a)第一链序列包含与表2的第一链序列中的任何一种相差不超过3个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过3个核苷酸的序列；
(b)第一链序列包含与表2的第一链序列中的任何一种相差不超过2个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过2个核苷酸的序列；
(c)第一链序列包含与表2的第一链序列中的任何一种相差不超过1个核苷酸的序列，和任选地其中第二链序列包含与相应的第二链序列相差不超过1个核苷酸的序列；
(d)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-17的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-17的序列；
(e)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-18的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-18的序列；
(f)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸2-19的序列；
(g)第一链序列包含对应于从表2的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸2-19的序列，和任选地其中第二链序列包含对应于从相应第二链序列的5’端开始的核苷酸1-18的序列；
(h)第一链序列包含表2的第一链序列中任何一种的序列，和任选地其中第二链序列包含相应第二链序列的序列；
(i)第一链序列由表2的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列由相应第二链序列的序列组成；
(j)第一链序列基本上由表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中的任何一种组成，和任选地其中第二链序列基本上由表2所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列组成；或
(k)第一链序列由对应于从表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19组成，
其中所述第一链序列进一步地由表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
任选地其中第二链序列包含表2所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或基本上由其组成或由其组成；
(l)第一链序列由对应于从表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的5’端开始的核苷酸1-19的序列组成，
其中所述第一链序列进一步地由表2所示的具有给定SEQ ID No.的第一链序列中任何一种的3’端处的1(从5’端开始计数的核苷酸20)、2(核苷酸20和21)、3(核苷酸20、21和22)、4(核苷酸20、21、22和23)、5(核苷酸20、21、22、23和24)或6(核苷酸20、21、22、23、24和25)个另外的核苷酸组成，和
其中所述第一链序列由与SEQ ID NO.758的CFB转录本互补的长度为17-25个核苷酸、优选地长度为18-24个核苷酸的邻接区域组成；和
任选地其中第二链序列包含表2所示的具有给定SEQ ID No.的相应第二链序列的序列或基本上由其组成或由其组成；
(m)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链和第二链存在于单链上，其中第一链和第二链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸；或
(n)以上子段(a)至(l)的核酸分子中任何一种的第一链和第二链在两条单独的链上，这两条链能够彼此杂交并由此形成具有长度为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸的双链体区域的双链核酸。
27.前述声明中任何一个的核酸，其中核酸与异源部分缀合。
28.声明27的核酸，其中异源部分包含(i)一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分或其衍生物，以及(ii)接头，其中接头将至少一个GalNAc部分或其衍生物与核酸缀合。
29.声明27或声明28的核酸，其中核酸与包含以下式(II)化合物的异源部分缀合：
[S-X1-P-X2]3-A-X3- (II)
其中：
S代表功能性组分，例如配体，比如糖，优选地其中糖为N-乙酰半乳糖胺；
X1代表C3-C6亚烷基或(-CH2-CH2-O)m(-CH2)2-，其中m为1、2或3；
P为磷酸酯或修饰的磷酸酯，优选地为硫代磷酸酯；
X2为亚烷基或式(-CH2)n-O-CH2-的亚烷基醚，其中n＝1-6；
A为分支单元；
X3代表桥接单元；
其中如声明1-27中的任何一个定义的核酸经由磷酸酯或修饰的磷酸酯、优选地硫代磷酸酯与X3缀合。
30.声明27-29中任何一个的核酸，其中核酸的第一链为以下式(V)的化合物：
其中b为0或1；和
其中第二链为以下式(VI)的化合物：
其中：
c和d独立地为0或1；
Z1和Z2分别为核酸的第一和第二链；
Y独立地为O或S；
n独立地为0、1、2或3；和
L1为配体与之附接的接头，其中L1在式(V)和(VI)中为相同或不同的，并且当L1在同一式内出现多于一次时，在式(V)和(VI)
内为相同或不同的；
并且其中b+c+d优选地为2或3。
31.声明27-30中任何一个的核酸，其为表5c所示的双链体之一。
32.组合物，其包含先前声明中任何一个的核酸和溶剂和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂。
33.组合物，其包含声明1-31中任何一个的核酸以及选自以下的另一治疗剂：寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽。
34.声明1-31中任何一个的核酸或者声明32或33的组合物，其用作治疗剂。
35.声明1-31中任何一个的核酸或者声明32或33的组合物，其用于预防或治疗疾病、障碍或综合征。
36.用于根据声明35的用途的核酸或组合物，其中疾病、障碍或综合征为补体介导的疾病、障碍或综合征。
37.用于根据声明35或36的用途的核酸或组合物，其中疾病、障碍或综合征与补体途径的异常激活或过度激活相关和/或与CFB的过度表达或异位表达或定位或累积相关。
38.用于根据声明35-37中任何一个的用途的核酸或组合物，其中疾病、障碍或综合征为：
a)选自C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)、重症肌无力(MG)、原发性膜性肾病、免疫复合物介导的肾小球肾炎(IC介导的GN)、感染后肾小球肾炎(PIGN)、系统性红斑狼疮(SLE)、缺血/再灌注损伤、年龄相关性黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎(RA)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、菌群失调性牙周病、疟疾性贫血、视神经脊髓炎、HCT/实体器官移植后(TMA)、吉兰-巴雷综合征、膜性肾小球肾炎、血栓性血小板减少性紫癜和脓毒症；
b)选自C3肾小球病(C3G)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、狼疮性肾炎、IgA肾病(IgA N)和原发性膜性肾病；
c)选自C3肾小球病(C3G)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、重症肌无力(MG)、IgA肾病(IgA N)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)；
d)选自C3肾小球病(C3G)、重症肌无力(MG)、视神经脊髓炎、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、抗中性粒细胞胞浆自身抗体相关性血管炎(ANCA-AV)、IgA肾病(IgA N)、HCT/实体器官移植后(TMA)、吉兰-巴雷综合征、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、膜性肾小球肾炎、狼疮性肾炎和血栓性血小板减少性紫癜；
e)选自C3肾小球病(C3G)和IgA肾病(IgA N)；或
f)C3肾小球病(C3G)。
39.声明1-31中任何一个的核酸或者声明32或33的组合物在制备用于预防或治疗疾病、障碍或综合征的药物中的用途。
40.预防或治疗疾病、障碍或综合征的方法，其包括给予需要治疗的个体药用有效剂量的声明1-31中任何一个的核酸或者声明23或33的组合物，优选地其中核酸或组合物皮下、静脉内或者通过口服、直肠或腹膜内给予而给予受试者。
概括缩写表-表4
/>
如以上缩写表所示的缩写可在本文中使用。缩写列表可能并非详尽的，并且进一步的缩写及其含义可在整个该文件找到。
概括序列表
表5a-未修饰的双链体
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SEQ ID No.758
>NM_001710.6智人补体因子B(CFB)，mRNA
GGGAAGGGAATGTGACCAGGTCTAGGTCTGGAGTTTCAGCTTGGACACTGAGCCAAGCAGACAAGCAAAG
CAAGCCAGGACACACCATCCTGCCCCAGGCCCAGCTTCTCTCCTGCCTTCCAACGCCATGGGGAGCAATC
TCAGCCCCCAACTCTGCCTGATGCCCTTTATCTTGGGCCTCTTGTCTGGAGGTGTGACCACCACTCCATG
GTCTTTGGCCCGGCCCCAGGGATCCTGCTCTCTGGAGGGGGTAGAGATCAAAGGCGGCTCCTTCCGACTT
CTCCAAGAGGGCCAGGCACTGGAGTACGTGTGTCCTTCTGGCTTCTACCCGTACCCTGTGCAGACACGTA
CCTGCAGATCTACGGGGTCCTGGAGCACCCTGAAGACTCAAGACCAAAAGACTGTCAGGAAGGCAGAGTG
CAGAGCAATCCACTGTCCAAGACCACACGACTTCGAGAACGGGGAATACTGGCCCCGGTCTCCCTACTAC
AATGTGAGTGATGAGATCTCTTTCCACTGCTATGACGGTTACACTCTCCGGGGCTCTGCCAATCGCACCT
GCCAAGTGAATGGCCGATGGAGTGGGCAGACAGCGATCTGTGACAACGGAGCGGGGTACTGCTCCAACCC
GGGCATCCCCATTGGCACAAGGAAGGTGGGCAGCCAGTACCGCCTTGAAGACAGCGTCACCTACCACTGC
AGCCGGGGGCTTACCCTGCGTGGCTCCCAGCGGCGAACGTGTCAGGAAGGTGGCTCTTGGAGCGGGACGG
AGCCTTCCTGCCAAGACTCCTTCATGTACGACACCCCTCAAGAGGTGGCCGAAGCTTTCCTGTCTTCCCT
GACAGAGACCATAGAAGGAGTCGATGCTGAGGATGGGCACGGCCCAGGGGAACAACAGAAGCGGAAGATC
GTCCTGGACCCTTCAGGCTCCATGAACATCTACCTGGTGCTAGATGGATCAGACAGCATTGGGGCCAGCA
ACTTCACAGGAGCCAAAAAGTGTCTAGTCAACTTAATTGAGAAGGTGGCAAGTTATGGTGTGAAGCCAAG
ATATGGTCTAGTGACATATGCCACATACCCCAAAATTTGGGTCAAAGTGTCTGAAGCAGACAGCAGTAAT
GCAGACTGGGTCACGAAGCAGCTCAATGAAATCAATTATGAAGACCACAAGTTGAAGTCAGGGACTAACA
CCAAGAAGGCCCTCCAGGCAGTGTACAGCATGATGAGCTGGCCAGATGACGTCCCTCCTGAAGGCTGGAA
CCGCACCCGCCATGTCATCATCCTCATGACTGATGGATTGCACAACATGGGCGGGGACCCAATTACTGTC
ATTGATGAGATCCGGGACTTGCTATACATTGGCAAGGATCGCAAAAACCCAAGGGAGGATTATCTGGATG
TCTATGTGTTTGGGGTCGGGCCTTTGGTGAACCAAGTGAACATCAATGCTTTGGCTTCCAAGAAAGACAA
TGAGCAACATGTGTTCAAAGTCAAGGATATGGAAAACCTGGAAGATGTTTTCTACCAAATGATCGATGAA
AGCCAGTCTCTGAGTCTCTGTGGCATGGTTTGGGAACACAGGAAGGGTACCGATTACCACAAGCAACCAT
GGCAGGCCAAGATCTCAGTCATTCGCCCTTCAAAGGGACACGAGAGCTGTATGGGGGCTGTGGTGTCTGA
GTACTTTGTGCTGACAGCAGCACATTGTTTCACTGTGGATGACAAGGAACACTCAATCAAGGTCAGCGTA
GGAGGGGAGAAGCGGGACCTGGAGATAGAAGTAGTCCTATTTCACCCCAACTACAACATTAATGGGAAAA
AAGAAGCAGGAATTCCTGAATTTTATGACTATGACGTTGCCCTGATCAAGCTCAAGAATAAGCTGAAATA
TGGCCAGACTATCAGGCCCATTTGTCTCCCCTGCACCGAGGGAACAACTCGAGCTTTGAGGCTTCCTCCA
ACTACCACTTGCCAGCAACAAAAGGAAGAGCTGCTCCCTGCACAGGATATCAAAGCTCTGTTTGTGTCTG
AGGAGGAGAAAAAGCTGACTCGGAAGGAGGTCTACATCAAGAATGGGGATAAGAAAGGCAGCTGTGAGAG
AGATGCTCAATATGCCCCAGGCTATGACAAAGTCAAGGACATCTCAGAGGTGGTCACCCCTCGGTTCCTT
TGTACTGGAGGAGTGAGTCCCTATGCTGACCCCAATACTTGCAGAGGTGATTCTGGCGGCCCCTTGATAG
TTCACAAGAGAAGTCGTTTCATTCAAGTTGGTGTAATCAGCTGGGGAGTAGTGGATGTCTGCAAAAACCA
GAAGCGGCAAAAGCAGGTACCTGCTCACGCCCGAGACTTTCACATCAACCTCTTTCAAGTGCTGCCCTGG
CTGAAGGAGAAACTCCAAGATGAGGATTTGGGTTTTCTATAAGGGGTTTCCTGCTGGACAGGGGCGTGGG
ATTGAATTAAAACAGCTGCGACAACA

Claims (15)

1.用于抑制补体因子B(CFB)表达的双链核酸，其中所述核酸包含第一链和第二链，其中所述第一链序列的未修饰等价物包含来自SEQ ID No.721、57、71、295、201、47、319、249、295、722、723、724的第一链序列中任何一种的序列。
2.根据权利要求1所述的核酸，其中所述第二链序列的未修饰等价物包含来自相应的48、58、72、296、202、48、320、250、296、202、72、58的第二链序列中任何一种的序列。
3.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述第一链和所述第二链形成长度为17-25个核苷酸的双链体区域。
4.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述核酸介导RNA干扰。
5.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述第一链序列包含SEQ IDNo.721并且其中所述第二链包含SEQ ID No:48。
6.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述第一链序列由SEQ ID No.721组成并且任选地其中所述第二链由SEQ ID NO:48组成。
7.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述第一和/或第二链的至少一个核苷酸为修饰的核苷酸。
8.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述第一链在其5’端处具有末端5’(E)-乙烯基膦酸酯核苷酸。
9.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述核酸包含在所述第一和/或所述第二链的末端两或三个3’核苷酸和/或5’核苷酸之间的硫代磷酸酯键合并且优选地其中在剩余核苷酸之间的键合为磷酸二酯键合。
10.根据权利要求1-5中任何一项或根据权利要求7-9中任何一项所述的核酸，其中所述第一链序列包含(vp)-mU fC mA fC mA fA mA fC mA fG mA fG mC fU mU fU mG(ps)fA(ps)mU(SEQ ID No.740)和任选地其中所述第二链序列包含mA mU mC mA mA mA fG fC fUmC mU mG mU mU mU mG mU(ps)mG(ps)mU(SEQ ID No:759)。
11.根据前述权利要求中任何一项所述的核酸，其中所述核酸与异源部分缀合。
12.根据权利要求11所述的核酸，其中所述异源部分包含(i)一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)部分或其衍生物，以及(ii)接头，其中所述接头将所述至少一个GalNAc部分或其衍生物与所述核酸缀合。
13.根据权利要求11或12所述的核酸，其中所述第一链序列包含(vp)-mU fC mA fC mAfA mA fC mA fG mA fG mC fU mU fU mG(ps)fA(ps)mU(SEQ ID No.740)和任选地其中所述第二链序列包含[ST23(ps)]3ST41(ps)mA mU mC mA mA mA fG fC fU mC mU mG mU mUmU mG mU(ps)mG(ps)mU(SEQ ID No:730)。
14.组合物，其包含根据前述权利要求中任何一项所述的核酸和溶剂和/或递送媒介物和/或生理学上可接受的赋形剂和/或载体和/或盐和/或稀释剂和/或缓冲剂和/或防腐剂和/或选自寡核苷酸、小分子、单克隆抗体、多克隆抗体和肽的另一治疗剂。
15.根据权利要求1-13中任何一项所述的核酸或根据权利要求14所述的组合物，其用作治疗剂。
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