MX2008008302A - Composiciones y metodos para regular el sistema de complemento. - Google Patents

Abstract

La descripción que aquí se proporciona, suministra métodos y composiciones para modular la ruta de complemento humano al reducir la expresión o producción de una o más proteínas de ruta de complemento y usos para estos métodos para tratar enfermedades incluyendo enfermedad ocular y enfermedad relacionada a degeneración macular. La invención también incluye agentes activos para mediar la modulación de la ruta de complemento incluyendo ARNip diseñada para provocar la degradación mediada por ARNi de proteínas de ruta de complemento.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA REGULAR EL SISTEMA DE COMPLEMENTO REFERENCIA CRUZADA La solicitud reclama prioridad de la solicitud provisional de patente de los E.U.A. Número de serie 60/753,041 presentada en diciembre 22, 2005, aquí incorporada por referencia en su totalidad. ANTECEDENTES El sistema de complemento incluye algunas 30 proteínas que circulan en el fluido extracelular capaces de lanzar una respuesta inmune no específica de antígeno contra patógenos virales y bacterianos invasores. Las proteínas de sistema de complemento circulan en una forma inactiva y se activan cuando un patrón molecular en la superficie de un microorganismo invasor es reconocido por los primeros componentes del sistema. Los primeros componentes activados del sistema de complemento reclutan a otras proteínas complemento a la superficie del invasor formando complejos activados que actúan como proteinazas escindiendo proteolíticamente a otros miembros del sistema de complemento y activándolos. Lo que sigue es una cascada de activación proteolítica , reclutamiento y co-ligado de miembros del sistema de complemento que resultan en la formación de un complejo de ataque de membrana (MAC= membrane attack complex) un poro en la pared celular del invasor resultando en cistólosis . El sistema de complemento se activa por 3 rutas diferentes: la ruta clásica, la ruta alterna, y la ruta de lectina. Cada ruta culmina en una formación de MAC pero se inicia por un estimulo diferente. La ruta clásica se inicia cuando un anticuerpo (múltiples moléculas IgG o una sola molécula IgM) se ligan a la superficie de patógeno. El enlace permite que el» componente Fe del anticuerpo interactúe con la subunidad Clq del factor Cl llevando a la activación de la subunidad Clr. Clr, una enzima proteolitica rompe la subunidad Cls y activa su función proteasa. Cls rompe el factor C4 para generar C4a y C4b. C4a permanece biológicamente activo en el sitio de reacción mediando la inflamación. C4b ya puede volverse un subproducto inactivo, ligado covalentemente con una molécula de IgG o conectado covalentemente a la superficie celular del microbio ligado al anticuerpo. En la presencia de Mg+2, C4b ligado a la superficie celular recluta C4 a la superficie celular en donde se escinde por Cls para generar C2b y C2a. C2b se difunde desde la superficie de la célula. C2a forma un complejo con C4b para formar C3 convertasa (C4b2a) una proteasa especifica C3. C3 convertasa rompe C3 para generar los fragmentos C3a y C3b. C3a es una anafilatoxina potente que se difunde lejos de la superficie celular y actúa como un quimioatrayente para leucocitos. Como C4b, C3b puede volverse un subproducto inactivo, pero en forma alterna hasta 10% de C3b permanece ligado covalentemente a la membrana de plasma del patógeno. Mientras que se liga la membrana de plasma C3b puede servir como una opsonina o puede combinarse con C3 convertasa (C4b2a) para formar C5 convertasa (C4b2a3b) . C5 convertasa se liga a y escinde C5 generando C5a y C5b. C5a se difunde lejos de la superficie celular y actúa como una anafilatoxina potente y quimioatrayente que media la inflamación. C5b permanece ligado a la pared celular del patógeno e inicia el armado de MAC. MAC se forma de los componentes tardíos del sistema de complemento. C5b ligado a la pared celular del patógeno recluta C6 para formar un complejo C5bC6 que a su vez recluta C7 para formar un complejo C5b67 que se inserta en la membrana celular del patógeno. C8 después se liga a C5b67 formando un complejo C5b678 y este complejo inicia polimerización C9 resultando en la inserción de C9 en la bicapa lípida del patógeno y la formación de MAC. MAC crea un poro en la membrana celular del patógeno resultando en un flujo de ingreso de pequeñas moléculas, iones y agua en la célula finalmente llevando a lisis celular osmótica. La activación de la ruta lectina se basa en reconocimiento de carbohidratos. Lectina de enlace de mañosa (MBL= Mannose binding lectin) y ficolinas, que semejan estructuralmente Clq, ligan a carbohidratos específicos en la superficie celular del patógeno y se asocia con serina proteasas asociadas con MLB (MASPs= MBL-associated serine proteases) que semejan Clr y Cls. MASP-2, como Cls, escinde componentes de complemento C4 y C2 iniciando la formación de C3 convertasa. MASP-1 estimula la ruta alterna al escindir C3 directamente. La escisión de C3 resulta en la formación de C5 convertasa y eventualmente la formación de MAC como se describió anteriormente. La ruta alterna se activa en la ausencia de enlace de anticuerpo por escisión de bajo grado de C3 en plasma. Un C3b producido en el plasma liga covalentemente a grupos hidroxilo en carbohidratos de superficie celular y proteínas. C3b ligado a la superficie celular del patógeno recluta factor B a la superficie celular. Factor D, que primordialmente se produce por células adiposas, escinde el factor B ligado para generar Ba y Bb. Ba se libera en la circulación. Bb liga C3b para formar la ruta alterna C3 convertasa, C3bBb. Properdina, estabiliza C3 convertasa y permite que el complejo continúe rompiendo C3. Una proporción de C3b producido liga C3bBb formando la ruta alterna C5 convertasa, C3bBb3b. Como las otras C5 convertasas, la ruta alterna C5 convertasa rompe C5 iniciando el armado de MAC. Enlace receptor media la actividad de varios componentes del sistema de complemento. iC3b, un fragmento generado por ruptura mediada por factor I de C3b y C4b liga el receptor de complemento tipo I (CR1, CD35) con alta afinidad. CR1 es una proteina membrana integral que se encuentra en eritrocitos, macrófagos, monocitos, leucocitos polimorfonucleares , células B y células dendriticas foliculares que promueven la fagocitosis de partículas revestidas con C3b- y C4b- y media la liberación de complejos inmunes de la circulación. Complemento receptor tipo 2 (CR2, receptor C3d, CD21) una glicoproteína de membrana que se encuentra en linfocitos B, células dendriticas foliculares y células epiteliales, liga específicamente el producto de ruptura de escisión Cb3 mediada por factor I. Complemento receptor tipo 3 (CR3, Macl, CDllbCD18) se encuentra en macrófagos, monocitos, leucocitos polimorfonucleares y células dendriticas y se considera que estimula la fagocitosis de microorganismos revestidos con iC3b y partículas al ligar iC3b. El receptor de complemento tipo 4 (CR4, pl50, 95, CDllcCD18) liga iC3b así como C3dg (otro producto de escisión de C3b) y promueve fagocitosis. Su distribución celular es similar a la de CR3. Finalmente, el receptor C5a (C5aR) y el receptor C3a/4a se encuentran en células endoteliales , matocitos y fagocitos y ligan C5a y C3a o C4a, respectivamente para promover las actividades anafilatóxicas y quimiotácticas de estos fragmentos de proteína .

El sistema de complemento esta fuertemente regulado para evitar activación errónea o ataque inmune en células anfitrionas. La ruta clásica es regulada por al menos 6 diferentes proteínas. Inhibidor de esterasa Cl (Cl INH) se combina con e inactivá Clr y Cls así como MASP-1 y MASP-2 proteasas de ' la ruta lectina para inhibir la ruptura de C2 y C4 y la formación de C3 convertasa. La mayoría de Cl que se encuentra en la sangre se liga a Cl INH evitando activación espontánea; sin embargo Cl se libera de Cl INH cuando se liga a un complejo antígeno-anticuerpo activando la ruta clásica. Otro regulador, factor I de la ruta clásica, escinde proteolíticamente C4b y proteína de enlace C4b (C4bBP) inactiva el factor I utilizando CR1 o la proteína de cofactor de membrana (MCP, CD46) como cofactores. Además de servir como cofactores para factor I, C4bBP y CR1 ligan a C4b e inhiben en forma competitiva el enlace de C2a, que inhibe la producción de la ruta clásica C3 convertasa al promover su disociación. El factor de aceleración de deterioro (DAF) , una glicoproteína de transmembrana que se encuentra en células de sangre periférica, endotelio y algunas células epiteliales de mucosa, promueven la disociación de la ruta clásica C3 convertasa y ligan C4b para evitar que ligue C2. La ruta alterna también se regula firmemente. El factor H compite con el factor B y Bb para enlace de C3b que inhibe la producción de la ruta alterna C3 convertasa. El enlace de factor B se favorece en superficies con alto contenido de ácido siálico y ya que la mayoría de las células bacterianas tienen bajas cantidades de ácido siálico de superficie en comparación con células de mamífero, el factor de B liga células bacterianas fácilmente activando el sistema de complemento. En contraste, el factor H liga moléculas polianiónicas como glicosaminoglicanos o polisacáridos sulfatados tales como heparina, que se ubican en la superficie de células de mamífero. El factor H por lo tanto liga a células de mamífero protegiéndolas del sistema de complemento. Adicionalmente, MCP y CR1 aumentan la afinidad de C3b ligada a superficie por factor H e inactiva la ruta alterna C3 convertasa al promover la disociación de Bb. El factor I tiene un efecto similar en la ruta alterna C3 convertasa utilizando el factor H, CR1 y MCP como cofactores. La regulación de complemento también ocurre en MAC. Inserción de complejo C5b67 en la membrana de lipidos se inhibe por enlace de vitronectina (protéína S) en el suero, e inhibidor de membrana de lisis reactiva (CD 59, MRL) y factor de restricción homólogo (HRF= homologous restriction factor) son proteínas ligadas a membrana que se encuentran en eritrocitos, linfocitos, monocitos, neütrófilos y plaquetas que evitan que C7 y C8 liguen a C5b6 e interfieran con enlace de C9 con C8, respectivamente. Finalmente, clusterina (SP- 40/40) otra proteína de suero, modula la formación de MAC al evitar el ensamblado C9 en C5b-8 y C5b-9 y al evitar C5b67 ligado se conecte a la membrana. Deficiencias de complemento también promueven enfermedad al aumentar la susceptibilidad a infecciones bacterianas y de levadura. Pacientes con defectos en producción de anticuerpos o función fagocitica, o que tienen proteínas de complemento de la ruta clásica defectuosas tienen alto riesgo por desarrollar infecciones de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae. Similarmente, pacientes con deficiencias heredadas en componentes de MAC son susceptibles a enfermedad de neiseria, en especial Neisseria meningitides , y reducidos niveles de MBL se han ligado con infecciones piogénicas recurrentes (formación de pus) y una falla para crecimiento en niños jóvenes. De manera interesante, adultos con una deficiencia de opsonina similar son sanos sugiriendo que la ruta MBL juega un papel crítico durante el periodo cuando anticuerpos maternales adquiridos en forma pasiva se pierden y el sistema inmune maduro se desarrolla . Muchos microorganismos han aprovechado el sistema de complemento para evitar la respuesta inmune mediada por anfitrión y promover su virulencia. Varios patógenos ligan C4bBP y/o factor H. La glicoproteína envolvente del virus Epstein-Barr gp350/220, liga CR2 y el virus de inmunodeficiencia humano (HIV= human immunodeficiency virus) , y micobacterias patogénicas ligan C3b y utilizan receptores C3 para lograr entrada a la célula. Otras bacterias expresan proteínas que inhiben la activación del complemento y todavía otras han desarrollado cápsulas gruesas que forman barreras físicas contra formación de MAC. Los virus evitan complemento al incorporar proteínas regulatorias de complemento en su envolvente (por ejemplo, HIV) , produciendo proteínas que limitan estructuralmente las proteínas reguladoras de complemento o producen proteínas que no poseen homología estructural con proteínas de reconocimiento de complemento pero poseen propiedades funcionales similares. El virus vaccinia es de interés específico debido a que secreta proteína de control de complemento vaccinia (VCP= vaccinia complement control protein) , un inhibidor de complemento cuya secuencia de aminoácidos semeja los anfitriones C4bBP (38%), MCP (35%) y DAF (31%) . Mientras que VCP es más estructuralmente similar a C4bBP, su perfil funcional es más similar a CR1. VCP bloquea la activación de complemento en diversas etapas de la ruta al ligar a C4b o C3b. También es capaz de ligar heparina que puede conferir la habilidad de VCP para ligar con células endoteliales y bloquear la conexión de citosinas quimioatrayentes pequeñas que regulan la localización y migración de leucocitos en los tejidos. Con base en estas propiedades, VCP tiene un fuerte potencial como un agente terapéutico para enfermedades que involucran activación de complemento aberrante. VCP bloquea la activación de complemento por proteina -amiloide haciéndolo un tratamiento potencialmente útil de la enfermedad de Alzheimer y que representa un tratamiento promisorio para rechazo hiper-agudo después de xenotransplante . Estudios han mostrado que VCP puede prolongar la supervivencia de órganos xenotransplantados in vivo el bloquear la activación de complemento. VCP también puede ser útil para el tratamiento de disfunción de múltiples órganos asi como el cerebro y lesión de médula espinal. Deficiencias en cualquier componente de proteina sencillo pueden llevar a activación de complemento anormal, resultando en formación MAC limitada y en una falta de respuesta mediada por complemento. Adicionalmente , la activación aberrante puede resultar en enfermedad humana, y miembros de la cascada de complementos se han implicado en el desarrollo de un grupo diverso de enfermedades, por ejemplo lupus sistémico eritematoso (SLE= systemic lupus eryt ematosus ) , sepsis, enfermedad de complejo inmune, inflamación, fibrosis pulmonar y hepática, asma, aterosclerosis , diabetes y enfermedad de Alzheimer. Estímulos anormales, tales como la presencia de microorganismos persistentes o respuestas humorales autoinmunes a autoantígenos , pueden disparar la activación del sistema de complemento anormal. De esta manera, una meta principal de investigación ha sido el identificar agentes efectivos para hacer blanco a los componentes de complemento específicos en activar la ruta, y el diseño de agentes terapéuticos novedosos para enfermedad mediada por complemento. La escisión enzimática de C5 inicia el armado de MAC. Un antagonista C5aR de molécula pequeña (AcF-OPdChaWR) ha producido efectos favorables en múltiples modelos in vivo incluyendo actividad anti-inflamatoria significante en un modelo de roedor de sepsis y prevención de deterioro progresivo de función renal e infiltración reducida de neutrofilos y macrófagos en un modelo de nefritis lupus murino. Además, AcF-OPdChaWR significativamente reduce la extravasación de neutrofilos en el modelo de lesión de cerebro traumático, y la administración intravenosa de inhibidores C5aR de molécula pequeña significantemente reduce los niveles de colágeno en el hígado y fibrosis en un modelo de in a fibrogénesis hepática murina. Otro inhibidor C5, la sal de sodio de ácido monocarboxilico K-76 (K-76COONa) evita la generación de C5b y facilita su deterioro. La administración oral de su compuesto a ratas diabéticas resulto en una reducción en proteinuria y expansión mesangial en los glomérulos. C5 también se ha sido el blanco utilizando anticuerpos. Pexelizumab, un anticuerpo monoclonal, reduce significantemente la mortalidad después de infarto al miocardio agudo (MI) cuando se administra como terapia auxiliar con intervención coronaria percutanea primaria y reducida mortalidad o MI en pacientes después de cirugía de injerto de derivación de arteria coronaria, en la presencia o ausencia de cirugía de válvulas. Pexelizumab ha completado una prueba clínica fase III ( PRIMO-CABG) . Mientras que el punto extremo primario del estudio no se logró, hubo una disminución total en mortalidad y mordidez del paciente post-operativa. Eculizumab, otro anticuerpo monoclonal, se ha probado en pacientes con artritis reumatoide, nefropatía membranosa idiopática, SLE, dermatomiositis y hemoglobinuria nocturnal paroxismal, y evidencia de mejora clínica en estas condiciones se ha observado. La inhibición C3 también ha sido el foco de investigación. N2- [2 , 2-difeniletoxi ) acetil ] -L-arginina (SB 290157), un antagonista no péptido de bajo peso molecular de C3aR, disminuye el edema de pata en modelo de artritis de roedor e inhibe el reclutamiento de neutrofilos en un modelo de neutrofilia de vía respiratoria de conejillo de indias. Compstatina, un péptido de 13 residuos cíclico, que es específico de especie para primates C3, liga C3 e inhibe la activación de complemento en el suero. Además, el péptido se ha mostrado que extiende la vida de un xeno injerto porcino- a-humano con perfusión de sangre humana.

Los investigadores han explorado la posibilidad de hacer blanco en Factores B y D con anticuerpos monoclonales para inhibir específicamente la ruta alterna. mAbl379 se dirige contra un epítopo del factor B de ratón e inhibe la ruta alterna en 'suero de ratones, ratas, humanos, monos, cerdos y caballos. En un modelo de síndrome anti-fosfolípido murino, una enfermedad autoinmune caracterizada por pérdida fetal recurrente, trombosis vascular y trombocitopenia en la presencia de anticuerpos anti-fosfolípidos , la administración intraperitoneal del anticuerpo proporciona protección de activación de complemento y pérdida fetal, sugiriendo un potencial terapéutico para la inhibición de Factor B. 166-32 es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el Factor D humano que inhibe exitosamente la activación de complemento, leucocitos y plaquetas en un modelo de derivación o desviación cardiopulmonar . Anticuerpos alternos dirigidos contra el Factor D también han sido efectivos in vitro y in vivo. El uso de proteínas regulatorias de complemento nativas y modificadas también se explora como terapéuticos potenciales. Cl INH se ha utilizado clínicamente por más de 25 años para el tratamiento de angioedema hereditario, una condición dominante autosomal que se provoca por deficiencia Cl INH, y ha mostrado resultados promisorios en una cantidad de otros modelos de enfermedad incluyendo sepsis, lesión de repercusión-isquemia al miocardio y cerebro, rechazo de transplante hiperagudo, choque traumático y síndromes de fuga vascular asociados con lesión térmica, terapia IL-2, y derivación cardiopulmonar. Los efectos cardio-protectores de Cl INH se han demostrado en pruebas clínicas en humanos para lesión de repercusión-isquemia al miocardio; sin embargo, son dependientes de dosis, y el exceso Cl INH ha demostrado ser fatal a recién nacidos durante la derivación cardiopulmonar. TP10 es una forma soluble de CRl (sCRl) que se ha sometido a una prueba clínica para derivación cardiopulmonar. Mientras que los primeros resultados mostraron TP10 fue bien tolerado y benéfico, los resultados de fase II fallaron en cumplir con su punto extremo primario. Sin embargo, adicionales análisis de subgrupo de datos de pacientes masculinos en una población de alto riesgo que se somete a procedimientos de corazón abierto, reveló una disminución significante a tamaño de infarto y mortalidad, de esta manera se planean pruebas adicionales. TP20 una forma alterna glicosilada de TP10 también se ha evaluado in vivo y in vitro. APT070 (Mirococept) es una droga derivada de una región expresada bacterialmente de CRl combinado con un péptido que hace blanco en membrana que ha sido eficaz en modelos de animales en choque vascular, artritis reumatoide, transplante renal y síndrome de Guillain-Barre . Se ha administrado sistemáticamente a pacientes sanos y localmente a pacientes con artritis reumatoide y que se someten a transplante renal. Una estrategia dirigida a membrana similar a la de APT070 también se ha aplicado a CD59 y DAF.

La habilidad para hacer blanco a un inhibidor de complemento a un sitio de lesión es particularmente atractiva ya que esto habrá de mejorar la eficacia y evitar la inhibición sistémica de complemento. Una estrategia posible para hacer blanco a inhibidores se demostró en forma efectiva en un modelo de rata de nefrosis inducida por puromicina, con el uso de un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Un fragmento de anticuerpo especifico para células epiteliales tubulares próximas y glomerulares de rata se ligo a Crry, un regulador de C3 convertasa que se encuentra en roedores, y CD59. Inyección intraperitoneal ya sea de cualquier inhibidor modificado, resulto en protección contra lesión tubulointersticial y disfunción renal. Estudios han demostrado que la presencia de' drusen (depósitos amarillentos ubicados por debajo del EPR o membrana de Bruch del ojo) maculares es un factor de fuerte riesgo para el desarrollo tanto de AMD atrófica como neovascular. Los drusen provocan una estirado lateral de la mono capa RPE y desplazamiento físico de RPE de su suministro vascular inmediato, los coriocapilares . Este desplazamiento crea una barrera física que puede impedir metabolito normal y difusión de deshechos entre los coriocapilares y la retina. Es probable que los deshechos puedan concentrarse cerca de RPE y que la difusión de oxigeno, glucosa y otras moléculas asociadas con suero regulatorio y nutritivas requieran mantener la salud de la retina y RPE se inhiba. También se ha sugerido que los drusen perturban la función celular de fotorreceptor al imponer presión en las varillas y conos y/o al distorsionar el alineamiento de células fotorreceptoras . Recientes estudios han ligado proteínas de complemento con drusen en el ojo. La presencia de factores de complemento en drusen proporciona evidencia de que el complemento puede jugar un papel en AMD. Por lo tanto, la capacidad en regular la actividad de complemento puede ser benéfica para tratar AMD. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Modalidades de la invención aquí presentada en general se dirigen a ARN int.erférente pequeño aislado, ARNip (siRNA = short interfering RNA) que tiene una hebra ARN sentido substancialmente idéntica con una ARNm de proteína de ruta de complemento o ARNm de proteína regulatoria de sistema de complemento. En algunas modalidades, la ARNip puede incluir una hebra ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de un ARNm de proteina de ruta de complemento o ARNm de proteina regulatoria de sistema de complemento y una hebra ARN antisentido que tiene una secuencia substancialmente complementaria a la hebra ARN sentido en donde la hebra ARN sentido y la hebra ARN antisentido forman un dúplex de ARN. En diversas modalidades, el ARNip puede incluir una hebra ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de proteínas de ruta de complemento humana clásica alterna y de lectina, Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I o vitronectina, clusterina, C4bBP, MCP y DAF. En modalidades preferidas, el ARNip puede incluir una hebra ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de un ARNm de proteína C3 humana. En algunas modalidades, la hebra de ARN sentido puede ser una molécula ARN y la hebra de ARN antisentido puede ser una molécula de ARN y en otras modalidades, las hebras ARN sentido y antisentido del ARNip pueden estar enlazadas covalentemente . En ciertas modalidades, las hebras ARN sentido y antisentido pueden estabilizarse contra degradación de nucleasa, y el ARNip ademas puede incluir material no nucleótido.

La hebra de ARN sentido puede incluir un primer protuberante o extensión 3' y/o la hebra ARN antisentido puede incluir un segundo 3' protuberante o extensión en algunas modalidades, y en ciertas modalidades, el primer y/o el segundo 3' protuberante comprende de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos. En modalidades particulares, los primeros y/o segundos 31 protuberantes pueden ser de aproximadamente 2 nucleótidos, y en modalidades preferidas, el primer y/o el segundo 3' protuberantes pueden ser un dinucleótido ditimidina (TT) o diuridina (uu) . El ARNip de ciertas modalidades, puede tener una hebra ARN sentido que tiene una secuencia correspondiente a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 56. Otras modalidades de la invención incluyen una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de un ARNip aislado que tiene una hebra de ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos una ARNm de proteina de ruta de complemento o ARNm de proteina regulatoria de sistema de complemento y una hebra ARN antisentido que tiene una secuencia substancialmente complementaria con la hebra ARN sentido en donde la hebra ARN sentido y la hebra ARN antisentido forman un dúplex ARN y un portador farmacéuticamente aceptable. En diversas modalidades, el ARNip puede incluir una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de proteínas de ruta de complemento humana clásica alternativa y de lectina, Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I o vitronectina, heparina, clusterina, C4bBP, CP y DAF y un portador farmacéuticamente aceptable. En modalidades preferidas, el ARNip puede incluir una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de ARNm de proteína C3 humana y un portador farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la composición farmacéutica puede incluir un reactivo de suministro, y el reactivo de suministro puede ser lipofectina, lipofectamina, celfectina, policationes o liposomas y combinaciones de los mismos. En modalidades particulares, el agente de suministro puede ser un liposoma. El liposoma de algunas modalidades además puede incluir un ligando de blanco que hace blanco de liposoma en células en o cerca del sitio de una drusa, y en ciertas modalidades, el ligando puede ser un anticuerpo. El liposoma de otras modalidades puede ser modificado con una porción de inhibición-opsonización, y en modalidades particulares, la porción de inhibición de opsonización puede incluir PEG, PPG, o sus derivados. En diversas modalidades, la hebra de ARN sentido puede tener una secuencia que corresponde a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 56, y en las modalidades, la hebra de ARN sentido puede tener una primer 3' extensión o protuberante y/o la hebra ARN antisentido puede tener una segunda 3' extensión. En algunas modalidades, la primer y/o la segunda 3' extensión pueden incluir de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos, y en otras la primer y/o la segunda 3' extensión pueden ser de aproximadamente 2 nucleótidos. En modalidades particulares, la primer y/o las segundas 3' extensiones pueden ser un dinucleótido de ditimidina (TT) o diuridina (uu) . Todavía otras modalidades de la invención incluyen métodos para inhibir expresión de ARNm regulador de sistema de complemento o sistema de complemento humano, los métodos incluyen administrar a un sujeto que lo requiere una cantidad efectiva , de un ARNip aislado que tiene una hebrea ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de una ARNm de proteína de ruta de complemento o ARNm de proteína regulatoria de sistema de complemento y una hebra ARN anti sentido que tiene una secuencia substancialmente complementaria con una hebra ARN sentido en donde la hebra ARN sentido y la hebra ARN anti sentido forman un dúplex ARN, el ARN regulatorio del sistema de complemento o sistema de complemento humano en donde la degradación inhibe expresión del ARNm regulatorio del sistema de complemento o sistema de complemento humano. En diversas modalidades, el ARNip puede incluir una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de proteínas de ruta de complemento humana clásica, alternativa y lectina, Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, o vitronectina , clusterina, C4bBP, MCP y DAF. En modalidades preferidas, el ARNip puede incluir hebra ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a la secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de ARNm de proteina C3 humana, y ARN de proteina C3 humana se degrada en donde la degradación del ARNm proteina C3 humana inhibe la expresión de ARNm de proteina C3 humana e inhibe el inicio y/o proliferación de una respuesta de sistema de complemento. En modalidades, el sujeto que lo requiere puede ser un ser human, y en ciertas modalidades, la cantidad efectiva del ARNip puede ser de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM. En algunas modalidades, el ARNip puede expresarse de un plásmido recombinante, y en otras, el ARNip se expresa de un virus recombinante que puede ser un vector adenoviral, un vector viral adeno-asociado, un vector lentiviral, un vector retroviral, o un vector de virus de herpes. En modalidades particulares, el vector viral recombinante comprende un vector viral adeno-asociado. Todavía en otras modalidades, el virus recombinante puede expresar proteínas de superficie de otros virus tales como virus de estomatitis vesiculares, virus de rabia, virus Ébola, o virus Mokola. El ARNip aislado de modalidades puede administrarse en forma enteral por métodos incluyendo administración oral, rectal e intranasal. En otras modalidades, el ARNip puede ser administrado en forma parenteral, por métodos que incluyen administración intravascular , inyección peri- e intra-tej ido, inyección o deposición sucutánea, o administración de infusión subcutánea, y administración directa en o cerca de un sitio de formación de drusen. En modalidades particulares, la administración intravascular puede incluir inyección de bolo intravenoso, infusión intravenosa, inyección de bolo intra-arterial , infusión intra-arterial e instilación de catéter en una vasculatura, y en otras modalidades, inyección peri- e intra-tejido puede incluir inyección intra-retinal , inyección subretinal e intra-vítrea . En ciertas modalidades, el ARNip puede ser administrado en o cerca del sitio de formación de drusen por un método que incluye administración por catéter, gránulo retinal, supositorio, un implante que comprende un material poroso, un implante que comprende un material no poroso, o un implante que comprende un material gelatinoso, y en modalidades particulares, el ARNip puede ser administrado por gotas de ojos o inyección intraorbital . Adicionales modalidades de la invención incluyen métodos para tratar una enfermedad en un sujeto, incluyendo administración al sujeto en una cantidad efectiva de un ARNip aislado que tiene una hebra ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de una ARNm de proteina de ruta de complemento o ARNm de proteina regulatoria de sistema de complemento y una hebra ARN anti-sentido que tiene una secuencia substancialmente complementaria a la hebra de ARN sentido en donde la hebra ARN sentido y la hebra ARN antisentido forman un dúplex de ARN, y degradar el sistema de complemento humano o ARNm regulatorio del sistema de complemento en donde degradar la expresión inhibe el ARNm regulatorio del sistema de complemento o sistema de complemento humano. En diversas modalidades, el ARNip puede incluir una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de proteínas de rutas de complemento humana clásica, alternativa y lectina, Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, o vitronectina , heparina, clusterina, C4bBP, CP y DAF. En modalidades preferidas, el ARNip puede incluir una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica' a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contínugos de ARNm proteína C3 humana, y ARN de proteína C3 humana se degrade en donde la degradación del ARNm de proteína C3 humana inhibe la expresión de ARNm de proteína C3 humana e inhibe el inicio y/o proliferación de una respuesta de sistema de complemento. En diversas modalidades, la enfermedad puede seleccionarse de desorden relacionado a degeneración macular, desorden macular relacionado a la edad, distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia de fondo de Sorsby, enfermedad de Stargardt, distrofia de patrón, enfermedad de Best, drusen dominantes, retinopatía diabética y malattia leventinese, y desorden relacionado a degeneración macular pueden incluir desprendimiento retinal, degeneraciones corioretinales, degeneraciones retínales, degeneraciones de fotoreceptor, degeneraciones RPE, mucopolisacaridosos, distrofia de varillas conos, distrofias de conos-varillas y degeneraciones de conos. En modalidades particulares, la enfermedad puede ser degeneración macular relacionada a la edad o retinopatia diabética . En ciertas modalidades, el método para tratar una enfermedad además puede incluir detectar el nivel de expresión de un ARNm del sistema de complemento humano o ARNm regulatorio del sistema de complemento con orina, plasma de sangre, suero, sangre entera o fluido ocular del sujeto. Modalidades aún adicionales de la invención incluyen métodos para tratar un desorden ocular asociado con drusen incluyendo administración ocular cuando menos a un ojo de un sujeto de una cantidad efectiva de una ARNip aislado que tiene una hebra ARN sentido que incluye una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de una ARNm de proteina de ruta de complemento o ARNm de proteína regulatoria de sistema de complemento y una hebra ARN anti-sentido que tiene una secuencia substancialmente complementaria con una hebra ARN sentido en donde la hebra ARN sentido y la hebra ARN anti-sentido forman un dúplex ARN, y degradar el ARNm regulatorio de sistema de complemento o sistema de complemento humano en donde degradar inhibe la expresión del ARNm regulatorio del sistema de complemento o sistema de complemento humano. En diversas modalidades, el ARNip puede incluir una hebra ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotidos contiguos de proteínas de ruta de complemento humana clásica, alterna y de lectina, Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I, o vitronectina , clusterina, C4bBP, MCP y DAF. En modalidades preferidas, el ARNip puede incluir una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótido substancialmente idéntica a una secuencia objetivo desde aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleotidos contiguos de ARNm de proteína C3 humana, y ARN de proteína C3 humana se degrada en donde la degradación de ARNm de proteína C3 humana inhibe la expresión de mARN de proteína C3 humana e inhibe la iniciación y/o de una respuesta de proliferación de sistema de complemento En diversas modalidades, el desorden ocular puede ser desorden relacionado a degeneración macular, desorden macular relacionado a la edad, distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia del fondo Sorsby, enfermedad de Stargardt, distrofia de patrón, enfermedad Best, drusen dominantes, retinopatía diabética y malattia leventinese, y en modalidades particulares, la enfermedad puede ser degeneración macular relacionada a la edad o retinopatia diabética . La administración ocular de modalidades puede ser tópica, inyección intra-retinal , inyección subretinal, inyección intravitrea, e inyección intraorbital , y en algunas modalidades, la administración ocular se elige de gotas de ojos o inyección intraorbital. En ciertas modalidades, la hebra ARN sentido puede tener una secuencia que corresponde a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 56, y en modalidades particulares, el ARNip puede tener una primera extensión 3' y/o una segunda extensión 3' seleccionada de ditimidina (TT) o diuridina (uu) . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Para una más completa compresión de la naturaleza y ventajas de la presente invención, habrá de hacerse referencia a la siguiente descripción detallada que se toma en conexión con los dibujos acompañantes, en donde: La Figura 1 ilustra la expresión C3 de complemento humano en células humanas tratadas con citocinas. La Figura 2 ilustra una pantalla ARNip C3 de complemento en células ARPE19. La Figura 3 ilustra la respuesta de dosis de ARNips C3 de complemento en células ARPE19.

La Figura 4 ilustra la citotoxicidad de ARNips C3 en células ARPE19. I. Descripción Detallada Antes que se describan las presentes composiciones y métodos, habrá de entenderse que esta invención no se limita a los procesos, composiciones o metodologías particulares descritas, ya que estas pueden variar. También se entiende que la terminología empleada en la descripción es con el propósito de describir las versiones particulares o modalidades solamente, y no se pretende que limite el alcance de la presente invención que será solo limitado por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos aquí empleados tienen los mismos significados como se entiende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica. Aunque cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos aquí descritos pueden ser empleados en la práctica o prueba de modalidades de la presente invención, los métodos, dispositivos y materiales preferidos ahora se describen. Todas las publicaciones aquí mencionadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad. Nada aquí habrá de considerarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a ante-fecha de esta descripción por virtud de invención previa.

También habrá de notarse que como se emplea aquí y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un/a", y "el/la" incluyen referencias en plural a menos de que el contexto claramente lo dicte de otra forma. De esta manera, por ejemplo referencia a un "ojo" es una referencia a uno o más ojos y sus equivalentes conocidos por aquellos con destreza en la técnica, y así en adelante. Como se emplea aquí, el término "aproximadamente" significa más o menos 10% del valor numérico del número con el cual se utiliza. Por lo tanto, aproximadamente 50% significa en el intervalo de 45-55%. Como se emplea aquí, un "sujeto" puede incluir cualquier animal o mamífero humano o no humano. . De preferencia, el sujeto es un ser humano. "Administrar" cuando se emplea en conjunto con un medio terapéutico para administrar un agente terapéutico directamente en o sobre un tejido objetivo o administrar un agente terapéutico a un paciente con lo que el agente terapéutico impacte en forma positiva el tejido al cual se dirige. De esta manera, como se emplea aquí, el término "administrar", cuando se emplea en conjunto con un agente regulatorio de complemento, puede incluir, pero no está limitado a, proporcionar un agente regulatorio de complemento en o sobre el tejido objetivo; proporcionar un agente regulatorio de complemento en forma sistemática a un paciente por, por ejemplo inyección intravenosa, con lo que el agente terapéutico alcanza el tejido objetivo; proporciona un agente regulatorio de complemento en la forma de la secuencia de codificación del mismo al tejido objetivo (por ejemplo, por las asi denominadas técnicas de terapia de genes) . "Administrar" una composición puede lograrse por inyección, administración tópica, o por cualquier método en combinación con otras técnicas conocidas. El término "mejora" se utiliza para transportar o para dar a entender que la presente invención cambia ya sea la apariencia, forma, características y/o atributos físicos del tejido al cual se proporciona, aplica o administra. El cambio en forma puede demostrarse por cualquiera de lo siguiente solo o en combinación: disminución en tamaño de drusen; mejorada visión; disminuida vascularización RPE; mejora en síntomas relacionados a AMD en húmedo y/o seco; formación de drusen retardada; inicio retardado de ADM húmedo y/o seco. Como se emplea aquí, el término "terapéutico" significa un agente que se utiliza para tratar, combatir, mejorar o evitar una condición o enfermedad indeseada de un paciente. En parte, modalidades de la presente invención se dirigen a mejorar la funcionalidad del ojo. Como aplica a daño provocado por formación de drusen y AMD.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" de la composición es una cantidad predeterminada que se calcula para lograr el efecto deseado, es decir para efectivamente inhibir, evitar o disminuir formación de drusen, tratar AMD y/o seco o sus síntomas. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente regulatorio de complemento de esta invención típicamente es una cantidad tal que cuando se administra en una composición excipiente fisiológicamente tolerable, es suficiente para lograr una concentración local efectiva en el tejido. Cantidades efectivas de compuestos de la presente invención pueden medirse por mejoras en visión, disminución en tamaño y número de drusen, o formación retrasada de drusen e inicio retrasado de AMD o síntomas de AMD. Hablando en general, el término "tejido" se refiere a cualquier agregación de células similarmente especializadas que se unen en el desempeño de una función particular. Como se emplea aquí, "tejido", a menos que se indique de otra forma, se refiere a tejido que incluye, pero no está limitado a la mácula del ojo. Por ejemplo, la mácula comprende el tejido coroide, la membrana Bruch, epitelio de pigmento retinal (RPE = retinal pigment epithelium) , y células fotoreceptoras (células de varilla y cono) . Como se emplea aquí, el término "agonista" es un agente que mejora o regula a la alta (por ejemplo, potencia o suplementa) la producción o actividad de un producto de gen. Un agonista también puede ser un compuesto que aumenta la interacción de un producto de gen, molécula o célula con otro producto de gen, molécula o célula, por ejemplo, el agente puede substituir un producto de gen con otro producto de gen homólogo o heterólogo, o el agente puede substituir un producto de gen con su receptor. En ciertas modalidades, un agonista puede ser un compuesto que mejora o incrementa el enlace o activación de un factor de- transcripción a una región corriente arriba de un gen de esta manera activando al gen. Cualquier agente que activa la expresión de gen, por ejemplo al incrementar la síntesis de proteína o ARN o disminuir el ciclo de proteína o ARN, o generar la activar de productos de gen puede ser un agonista en donde el agente actúa directamente en el gen o producto de gen o actúa indirectamente, por ejemplo actúando corriente arriba en la ruta de regulación de gen. Ejemplos de agonistas de modalidades pueden ser ARNs, péptidos, anticuerpos y moléculas pequeñas, o una combinación de los mismos. El término "antagonista", como se emplea aquí, es un agente que regula a la baja, suprime o inhibe la producción o actividad de un gen o producto de gen. Por ejemplo, un antagonista puede ser un agente que inhibe o disminuye la interacción entre un producto de gen, molécula o célula y otro producto de gen, molécula o célula. En ciertas modalidades, un antagonista puede ser un compuesto que inhibe o disminuye el enlace o activación de un factor de transcripción a una región corriente arriba de un gen de esta manera bloqueando la activación del gen. Cualquier agente que inhibe la expresión de gen o activida de producto de gen puede ser un antagonista en donde el 'agente actúa directamente en el gen o producto de gen o actúa indirectamente, por ejemplo al actuar corriente arriba en la ruta de regulación del gen. Un antagonista también puede ser un compuesto que regula a la baja la expresión de un gen o que reduce la cantidad del producto de gen presente, por ejemplo al disminuir la síntesis de proteína o ARN o incrementar el ciclo de proteína ARN. En diversas modalidades, un antagonista puede ser ARNs, péptidos, anticuerpos y moléculas pequeñas o una combinación de los mismos . El término "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se emplea para incluir anticuerpos intactos y ligar sus fragmentos. Típicamente, fragmentos compiten con el anticuerpo intacto del cual se derivan para enlace específico a un fragmento de antígeno incluyendo cadenas pesadas separadas, cadenas ligeras Fab, Fab 1 , F(ab')2, Fabc, y Fv. Fragmentos de anticuerpo pueden producirse por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por técnicas de ADN recombinante , o por separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas. El término "anticuerpo" también incluye una o más cadenas inmunoglobulina que se conjugan químicamente con o expresan como proteínas de fusión con otras proteínas. El término "anticuerpo" también incluye anticuerpo específico o biespecífico, y un anticuerpo específico o bifuncional es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas pesadas/ligeras diferentes y dos sitios de enlace diferentes. Anticuerpos biespecífieos pueden producirse por una variedad de métodos incluyendo, pero no limitados a, fusión de hibridomas o enlace de fragmentos Fab. Ver, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). El término "moléculas antisentido" incluyen oligonucleótidos antisentido o sentido que comprenden una secuencia de ácido nucleico de una sola hebra (ya sea ARN o ADN) capaz de ligar secuencias de ARNm (sentido) o DNA (antisentido) objetivo para una proteína específica (por ejemplo, una molécula de ruta de complemento). La capacidad para derivar un oligonucleótido antisentido o sentido, con base en una secuencia ADNc que codifica una proteína determinada se describe por ejemplo en Stein and Cohén (Cáncer Res. 48: 2659, 1988) and van der Krol et al.

(BioTechniques 6: 958, 1988) .

Como se emplea aqui, una secuencia de ácido nucleico " substancialmente idéntica" a una secuencia objetivo contenida dentro del ARNm objetivo es una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a la secuencia objetivo, o que difiere de ser idéntica a la secuencia objetivo por uno o más nucleótidos. Hebras sentido de la invención que comprenden secuencias de ácido nucleico substancialmente idénticas a una secuencia objetivo se caracterizan porque el ARNip que comprende dichas hebras sentido induce degradación mediada por RNAi de ARNm que contiene la secuencia objetivo. Por ejemplo, un ARNip de la invención puede comprender una hebra sentido que comprende secuencias de ácido nucleico que difieren de una secuencia objetivo por uno, dos o tres o más nucleótidos, siempre que la degradación mediada por RNAi del ARNm objetivo se induzca por el ARNip. El sistema de complemento está constantemente activo a bajos niveles en el ojo normal y es cerradamente regulado por proteínas regulatorias de complemento intraoculares . Humor acuoso y vitreo de ojos humanos normales contiene formas solubles de MCP, DAF y CD59. MCP se considera que interactúa con (51 integrina y puede involucrarse en la adhesión del epitelio de pigmento retinal (RPE) con su membrana base y membrana de Bruch. La Vitronectina se produce por fotoreceptores , y el ARN retinal promedio es cerca del 50% del medido en el hígado. El mensaje C3 y C5 se ha identificado en RPE, y transcripciones C3, C5, y C9 se han detectado en retina neural y/o coroide. Niveles de ARNm C5 en células RPE cultivadas es casi equivalente al encontrado en células derivadas del hígado, y casi 60% del hígado humano, sugiriendo que RPE probablemente es la fuente principal de C5. Componentes y reguladores de complemento también se han localizado en drusen. Los drusen son depósitos focales de material extracelular , que se localizan entre la lámina basal de RPE y la capa colágeno e interior de la membrana de Bruch. Su presencia en el ojo es un factor de riesgo significante e indicador tanto de formas secas y húmedas de degeneración macular relacionada a la edad (AMD = age-related macular degeneration) . Los drusen están compuestas de componentes lípidos, de carbohidrato, de proteína y celulares, que son más probablemente de origen RPE. El análisis inmunohistoquímico de drusen reveló la presencia de vitronectina, clusterina, IgG, MAC, C5, MCP y CR1. Además, se observó etiquetado robusto con anticuerpos desarrollados contra C3/C3d y los fragmentos de activación C3 (C3b, iC3b, C3dg) . Similarmente , tejido que circunda drusen también exhibe inmunoreactividad para factores de complemento. C5, IgG, vitronectina, clusterina, componentes de MAC y MCP se han localizado en células RPE que están en proximidad cercana con drusen. Además, se observó inmunotinción coroidal intensa con anticuerpos contra C3; sin embargo, se encontró poco etiquetado en el resto de la coroide. Adicionalmente, estructuras desconocidas que generalmente se depositan en sitios de activación de complemento también mostraron fuerte inmunoreactividad para fragmentos proteoliticos de C3. Se ha sugerido que estas estructuras y desechos residuales de células RPE degeneradas que se han sometido a citólisis. Esta hipótesis es además soportada por estudios en animales. Ratones deficientes en proteina quimioatrayente de monocitos-1 (Ccl-2, MCP-1) o su receptor de quimiocina C-C cognato-2 (Ccr-2) desarrollan lipofuscina en RPE, drusen tras RPE, atrofia de fotoreceptor y neovascularización coroidal (CNV = choroidal neovascularization) . Además, depósitos de IgG y complementos se encuentran en RPE y coroide, sugiriendo componentes inmunológicos son responsables por el fenotipo AMD. El papel de complemento se examinó en un modelo de ratón de CNV inducido por láser. La fotocoagulación con láser en ratones C57BL6 resultó en deposición de C3 y MAC en el sitio de formación de drusen. En contraste, la fotocoagulación de láser no induce CNV en ratones deficientes C3 o produce deposición de MAC. Administración sistémica de anticuerpos policlonales anti-C6 reduce significativamente el desarrollo de CNV y deposición de MAC en el sitio de puntos láser. Además, cuando ratones C57BL6 se agotaron sistemáticamente de complemento con factor de veneno de cobra (CVF = cobra venom factor) y trataron con láser, no se observó inmunoreactividad C3 o MAC en los puntos láser y el desarrollo de CNV se redujo significativamente. CVF es un análogo estructural de C3 que semeja funcionalmente C3b y liga el Factor B para formar CVFBb, una C3 y C5 convertasa. CVF es resistente a inactivación por los Factores H e I. Consecuentemente, C3 y C5 se hidrolizan continuamente hasta que el sistema de complemento se agota por completo. Estos hallazgos sugieren que la activación de complemento es necesaria para el desarrollo de CNV inducida por láser en ratones y también puede ser necesario para el desarrollo de CNV en AMD. Sin duda, se ha confirmado que una mutación (Y402H) en el Factor H se asocia significativamente con el desarrollo de AMD. Esta mutación se localiza en heparina y sitios de enlace de proteina C-reactivo del Factor H, y la asociación es prominente en casos tanto de AMD y CNV tempranos. Esta mutación puede alterar el comportamiento de la proteina de manera tal que no pueda más regular la ruta de complemento. Por ejemplo, un cambio en sus capacidades de enlace puede evitar que interactúe adecuadamente con microbios o fragmento de complemento C3b, y esta disfunción puede resultar eventualmente en daño de tejido local. Además de la mutación Y402H, al menos 7 otras variantes de Factor H se han vinculado con AMD. La tinción de tejido de pacientes con AMD reveló inmunoreactividad intensa y especifica para Factor H en drusen, en el espacio subRPE y alrededor de los capilares coroidales y no fue prominente en la mácula. La distribución de Factor H en mácula se correlaciona con la distribución de MAC. En ciertas instancias elementos sub-estructurales dentro de los drusen también reaccionan con anticuerpos dirigidos contra fragmentos C3. Ubicaciones fuera de la mácula tuvieron menos inmunoreactividad de Factor H y C5b-9, y muy poca o nada de inmunoreactividad C5b-9 se observó en RPE o coroide de pacientes con menos de 50 años de edad y sin AMD. Análisis de ARNm de complejo coroide/RPE y RPE recientemente aislados, pero sin retina neural, derivada de ojos de donador, con y sin AMD, reveló que el Factor H y su isoforma truncada se expresan abundantemente en RPE, con niveles que se aproximan a los del hígado. El reciente hallazgo de Factor H proporciona conocimientos de los papeles de algunos factores de riesgo establecidos para AMD. Por ejemplo, se ha reportado que hay una fuerte asociación entre infección de Chlamydia pneumoniae y AMD. Este patógeno se ha identificado en tejido neovascular que se retira quirúrgicamente de ojos con AMD y tiene alta afinidad para tejido vascular, en donde establece la infección. En un escenario en donde no se tiene la capacidad para regular el complemento, dicho patógeno puede estimular una inflamación crónica que finalmenten lleva a daño de tejido. Otro riesgo para AMD es el fumar. El fumar cigarrillos puede activar la ruta alterna al modificar C3 in vitro. De esta manera, en la ausencia de Factor H funcional, el fumar cigarrillos puede llevar a una activación descontrolada de complemento. De manera interesante, hay otra enfermedad provocada por una deficiencia en Factor H que tiene un fenotipo tipo AMD. Glomerulonefritis membranoproliferativa tipo II (MPGNII), que también puede ser provocada por una mutación punto en Factor H, resulta en severa glomerulonefritis y formación de drusen de inicio temprano. Los drusen son indistinguibles en forma estructural y por composición de aquellas encontradas en AMD. Aspectos de la presente invención incluyen composiciones y métodos para tratar o evitar enfermedad al regular activación de la ruta de complemento. En algunas modalidades, la enfermedad es una enfermedad ocular, y en modalidades particulares, la enfermedad es desórdenes relacionados a degeneración macular incluyendo por ejemplo, desorden macular relacionado a la edad (AMD) , distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia de fondo de Sorsby, enfermedad Stargardt, distrofia de patrón, enfermedad de Best, drusen dominantes, retinopatia diabética y malattia leventinese. Otras enfermedades o desórdenes incluyen desprendimiento retinal, degeneraciones corioretinales , degeneraciones retínales, degeneraciones de fotoreceptor , degeneraciones RPE, mucopolisacáridos, distrofias de varilla-cono, distrofias de cono-varilla, y degeneraciones de cono.

Una modalidad de la presente invención proporciona métodos para tratar o evitar el desarrollo de una degeneración macular en un sujeto que sufre de o que tiene riesgo de desarrollar un desorden relacionado a degeneración macular. Estos métodos pueden incluir administrar al sujeto de una cantidad efectiva de un agente terapéutico que modula una actividad de al menos un una molécula asociada con ruta de complemento, , o una actividad celular mediada por la ruta de complemento. En modalidades del método, el sujeto puede tener un desorden relacionado a degeneración macular, o el sujeto puede estar en riesgo de ser desarrollar un desorden relacionado a degeneración macular. En algunas modalidades, el sujeto puede estar libre de enfermedades diferentes a desordenes relacionaos a degeneración macular. En modalidades de los métodos, el agente terapéutico puede modular la actividad de una molécula asociada con ruta complemento al modular el nivel del la molécula asociada con ruta de complemento o un regulador corriente arriba de la molécula asociada con ruta de complemento y en ciertas modalidades el agente terapéutico puede modular el nivel de proteina de la molécula asociada con ruta de complemento. Ejemplos no limitantes, de molécula asociada con ruta de complemento que puede modularse utilizando métodos de modalidades incluye anafilatoxina C3a, anafilatoxina C5a, C6, clusterina, haptoglobina , cadena kappa Ig, cadena lambda Ig o cadena gamma Ig. En otras modalidades, el agente terapéutico puede modular una actividad enzimática de una proteina de complemento o una molécula asociada ruta de complemento. Por ejemplo, el agente terapéutico puede modular la catálisis o conversión de C3 en C3a y C3b, conversión de C5 en C5a y C5b, o escisión o ruptura de Factor B en Ba y Bb. En algunas modalidades, el método además puede incluir detectar el nivel de molécula asociada de ruta de complemento modulado utilizando el agente terapéutico, y el nivel de molécula asociada con ruta de complemento puede determinarse antes, durante o después de tratamiento con el agente terapéutico. El nivel de molécula asociada con ruta de complemento puede detectarse en cualquier forma conocida en la especialidad, por ejemplo el nivel puede ser determinado de fluidos corporales tales como, orina, plasma de sangre, suero, sangre entera, o fluido ocular del sujeto.

Agentes terapéuticos de las diversas modalidades pueden incluir cualquier sustancia, molécula, elemento, compuesto, entidad o combinación de los mismos, incluyendo, pero no limitados a, proteina, péptido, oligopéptido , molécula orgánica pequeña, polisacárido y polinucleótido tales como ARNip y semejantes. El agente puede ser un producto natural, compuesto sintético o un compuesto químico o una combinación de dos o más sustancias. En modalidades preferidas, ARNip aislado dirigido a ARNm de proteínas complemento de las rutas clásica, alterna o de Lectina puede ser el agente terapéutico que se proporciona a una paciente que lo requiere. Por ejemplo, ARNip de modalidades puede administrarse a un paciente que exhibe síntomas de enfermedades que involucran activación de complemento inadecuada y puede ser utilizado para inhibir la activación de complemento. En particular, proteínas de complemento que pueden dirigirse incluyen pero no están limitadas a proteínas de ruta de complemento clásica, alterna y de lectina tal como por ejemplo Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I y proteínas que modulan la formación MAC en la superficie celular tales como vitronectina , heparina, clusterina, C4bBP, MCP y DAF se dirigen o son el objetivo. En modalidades preferidas, C3, C5, y vitronectina pueden ser dirigidas, de preferencia C3.

Modalidades de la invención por lo tanto se dirigen a una ARNip aislado que tienen una hebra ARN sentido que incluye una secuencia substancialmente idéntica a una ARNm de sistema de complemento humano o ARNm de proteina regulatoria de sistema de complemento y una hebra de ARN antisentido substancialmente complementaria con la hebra ARN sentido. En modalidades preferidas, la hebra ARN sentido puede ser substancialmente idéntica a ARNm C3 humano. Sin desear estar ligados por teoría, ARNip de la invención puede provocar la degradación mediada por ARNi de ARNms objetivos, de esta manera reduciendo o eliminando la producción de la proteina de complemento dirigida o blanco. Por ejemplo, degradación mediada por ARNip de ARNm C3 o C5 puede inhibir la formación de MAC y actividad de sistema de complemento debido a que C3 es necesario para la formación de C3C5 convertasa y la activación subsecuente de C5 que se requiere para iniciar formación MAC. Similarmente, la inactivación de vitronectina puede impedir la formación de MAC en la superficie de RPE evitando o invirtiendo formación de drusen. Como se emplea aquí, "ARNm objetivo" significa el ARN mensajero que una molécula ARNip específica ha sido diseñada para eliminar. Por ejemplo, en modalidades de la invención, el ARNm objetivo puede ser una proteína humana tal como, por ejemplo, proteínas de ruta de complemento clásica, alterna y de lectina que incluyendo pero no limitadas a Cl, C2, C3, C4, C5, C6, C7 , C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I y proteínas que modulan la formación MAC en la superficie de la célula tales como vitronectina, clusterina, C4bBP, MCP y DAF formas de combinación mutantes o alternas de genes incluyendo pero no limitadas a proteínas de ruta de complemento clásica, alterna y de lectina Cl, C2 , C3, C4, C5, C6, C7, . C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I y proteínas que modulan la formación MAC en la superficie celular tales como vitronectina, clusterina, C4bBP, MCP y DAF. Como se emplea aquí, un gen o ARNm que es "conato" a gen humano es un gen o ARNm de otra especie de mamífero que es homologa al gen humano. Por ejemplo, el ARNm humano C5 conato puede ser el ARNm C5 de un ratón. Como se emplea aquí, "aislado" significa alterado o retirado del estado natural a través intervención humana. Por ejemplo, un ARNip naturalmente presente en un animal vivo no esta "aislado", pero un ARNip sintético o un ARNip parcial o completamente separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado". Una ARNip aislado puede existir en forma substancialmente purificada, o puede existir en un ambiente no nativo tal como, por ejemplo, una célula en la cual el ARNip se ha suministrado. En modalidades, la invención puede proporcionar ARNip aislado que comprende ARN de doble hebra corto de aproximadamente 17 nucleótidos a aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, o en algunas modalidades, de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, que se dirigen a un ARNm particular. En general, un ARNip puede incluir una hebra ARN sentido y una hebra ARN antisentido substancialmente complementaria hibridizada en conjunto por interacciones de apareamiento base Watson-Crick estándar (a continuación "apareado de base"). Como se describe con más detalle a continuación, la hebra sentido puede incluir una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o casi idéntica a una secuencia de contenido dentro del ARNm objetivo. Modalidades de la invención por lo tanto se dirigen a ARNip aislado que tiene una hebra ARN sentido que incluye una secuencia substancialmente idéntica a 19 a 25 nucleótidos contiguos de un ARNm de sistema de complemento humano o ARNm de proteina regulatoria de sistema de complemento y una hebra de ARN antisentido substancialmente complementaria con la hebra ARN sentido. En modalidades preferidas, la hebra ARN sentido puede ser substancialmente idéntica a 19 a 25 nucleótidos contiguos de ARNm C3 humano.

Las hebras sentido y antisentido del ARNip presente pueden consistir de dos moléculas de ARN de una sola hebra complementarias separada o incluir una sola molécula en conde dos porciones complementarias se aparea en base y se ligan covalentemente por un área de "horquilla" de una sola hebra. Sin desear estar ligados por cualquier teoría, la orquilla de esta última molécula ARNip puede escindirse intracelularmente por la proteína "Dicer" (o su equivalente) para formar un ARNip de dos moléculas ARN de apareamiento bases individuales. El ARNip de la invención puede comprender ARN parcialmente purificado, ARN substancialmente puro, ARN sintético o ARN recombinantemente producido, así como ARN alterado que difiere de ARN de origen natural por la adición, eliminación, substitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Estas alteraciones pueden incluir adición de material no nucleótido, tal como uno o más extremos del ARNip o a uno o más nucleótidos internos del ARNip. Estas alteraciones pueden incluir, peor no están limitadas a, modificaciones que hacen al ARNip resistente a digestión con nucleasa. Una o ambas hebras del ARNip de la invención también pueden tener una extensión 3'. Como se emplea aquí, una "extensión 3'" se refiere a cuando menos un nucleótido no apareado, incluyendo ribonucleotidos, deoxinucleotidos o sus combinaciones que se extienden desde el extremo 3'- de una hebra ARN. Por ejemplo en una modalidades, ARNip dirigido a ARNm de complemento puede incluir al menos una extensión 3' desde 1 a aproximadamente 6 nucleótidos o de 1 a aproximadamente 5 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, la extensión puede ser de 1 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud y en al menos una modalidad, la extensión puede ser de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 nucleótidos de longitud. Todavía en otras modalidades, ambas hebras de la molécula ARNip tienen una extensión 3'. La longitud de esta puede ser igual o diferente para cada hebra. Todavía en otras modalidades, la extensión 3' esta presente en ambas hebras del ARNip y puede ser de dos nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra del ARNip de la invención puede comprender extensiones 3' de ditimidina ("TT") o diuridina ("uu") . Modalidades de la invención por lo tanto se dirigen a ARNip aislado que tiene una hebra ARN sentido incluyendo una secuencia substancialmente idéntica a 19 a 25 nucleótidos contiguos de un ARNm de sistema de complemento humano o ARNm de proteína regulatoria de sistema de complemento y una hebra de ARN antisentido substancialmente complementaria con la hebra ARN sentido en donde la hebra ARN sentido y/o la hebra ARN antisentido tienen extensiones 3' . En modalidades preferidas, la hebra ARN sentido puede ser substancialmente idéntica a 19 a 25 nucleótidos contiguos de ARNm C3 humano y la hebra ARN sentido y/o la hebra ARN antisentido tienen extensiones 3' . En modalidades particularmente preferidas, el ARNip puede tener una hebra ARN sentido substancialmente idéntica a ARNm C3 humano y la hebra ARN sentido y/o la hebra ARN antisentido pueden tener extensiones 3' de 2 nucleótidos con los nucleótidos cada uno que son deoxitimidina o deoxiuridina . A fin de mejorar la estabilidad del ARNip presente, las extensiones 3' pueden estabilizarse contra degradación. En una modalidad, las extensiones se estabilizan al incluir nucleótidos purina, tales como nucleótidos adenosina o guanosina. En forma alterna, la substitución de pirimidina nucleótidos por análogos modificados, por ejemplo, substitución de nucleótidos uridina en las extensiones 3' con 21 -deoxitimidina , se tolera y no afecta la eficiencia de degradación de ARNi. En particular, la ausencia de un 2' hidroxilo en la 2 ' -deoxitimidina significantemente mejora la resistencia nucleasa de la extensión 3' en medio de cultivo de tejido. En ciertas modalidades, el ARNip de la invención puede incluir la secuencia AA (NI 9 ) TT o NA(N21), en donde N es cualquier nucleótido. Estos ARNip pueden incluir aproximadamente 30-70% de G/C, y de preferencia comprenden aproximadamente 50% G/C. La secuencia de la hebra ARNip sentido corresponde a (N19)TT o N21 (posiciones 3 a 23), respectivamente. En este ultimo caso, el extremo 3' del ARNip sentido se convierte a TT . El raciocinio para esta conversión de secuencia es generar un dúplex simétrico respecto a la composición de secuencia de las extensiones 3' de hebra sentido y antisentido. La hebra ARN antisentido después se sintetiza como el complemento a posiciones 1 a 21 de la hebra sentido. Debido a que la posición 1 de la hebra sentido 23-nt en estas modalidades puede no ser reconocida en una forma especifica de secuencia por la hebra antisentido, el residuo 3' -más nucleótido de la hebra antisentido puede seleccionarse en forma deliberada. Sin embargo, el nucleótido penúltimo de la hebra antisentido (complementaria a la posición 2 de la hebra sentido 23-nt en cualquier modalidad) en general puede ser complementario a la secuencia objetivo. En otra modalidad, el ARNip de la invención puede incluir la secuencia NAR(N17)YNN, en donde R es una purina (por ejemplo, A o G) e Y es una pirimidina (por ejemplo, C o U/T) . Las hebras ARN sentido y antisentido 21-nt respectivas de esta modalidad, por lo tanto, en general pueden empezar con un nucleótido purina. Esta ARNip puede expresarse de vectores de expresión pol III sin un cambio en los sitios de blanco, como expresión de ARNs de los promotores pol III se considera que solo es eficiente cuando el primer nucleótido trascrito es una purina. El ARNip de la invención puede ser dirigido a cualquier tramo de aproximadamente 19-25 nucleótidos contiguos en cualquiera de las secuencias ARNm objetivo (la "secuencia objetivo"). Técnicas para seleccionar secuencias objetivo para ARNip se dan por ejemplo en Tuschl T. et al., "The siRNA User Guide, " revisada en mayo, 2004, toda la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia. "The siRNA User Guide" (Guia de Usuario ARNip) está disponible en la red mundial en un sitio de la red mantenida por el Dr. Thomas Tuschl, Department of Cellular Biochemistry, AG 105, Max-Planck-Institute for Biophysical Chemistry, 37077 Gottingen, Alemania y puede ser encontrado accesando al sitio de la red del Max Planck Institute y buscar con la clave "siRNA" (ARNip) . De esta manera, la hebra sentido del ARNip presente comprenden una secuencias de nucleótidos idéntica a cualquier tramo contiguo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos en el ARNm objetivo. En general, una secuencias objetivo en el ARNm objetivo puede seleccionarse de una secuencias ADNc determinada correspondiente al ARNm objetivo, de preferencia empezando 50 a 100 nt corriente abajo (es decir en la dirección 3') del codón de inicio. La secuencia objetivo sin embargo puede estar ubicada en las regiones sin introducción 5' o 3' o en la región cercana al codón de inicio. Por ejemplo, las secuencias objetivo SEQ ID NOS: 1 a 26 y 57 en la Tabla 1, que están dentro de 100 nt del extremo 5' del ADNc C3 humano SEQ ID NO. 4 y corresponde con las secuencias objetivo SEQ ID NO. 27 a 41 y las secuencias ARNip correspondientes SEQ ID NOS. 42 a 56. Tabla 1 ID NO. Fuente ID NO. uente ID NO. Fuente 1 Cl r Humano 20 Vitronectina Humana 39 Blanco C3 13 2 Cl s Humano 21 Clusterina Humana (Retinal ) 40 Blanco C3 14 3 C2 Humano 22 Clusterina-1 Humana 41 Blanco C3 15 4 C3 Humano 23 Clusterina-2 Humana 42 ARNip C3 1 5 C4a Humano 24 C4bBP Humana (alfa) 43 ARNip C3 2 6 C4b Humano 25 MCP Humana 44 ARNip C3 3 7 C5 Humano 26 DAF Humana 45 ARNip C3 4 8 C6 Humano 27 C3 Blanco 1 46 ARNip C3 5 9 C7 Humano 28 C3 Blanco 2 47 ARNip C3 6 10 C8 Humano (alfa) 29 C3 Blanco 3 48 ARNip C3 7 11 C8 Humano (beta) 30 C3 Blanco 4 49 ARNip C3 8 12 C8 Humano (gama) 31 C3 Blanco 5 50 ARNip C3 9 13 C9 Humano 32 C3 Blanco 6 51 ARNip C3 10 14 Factor Humano B 33 C3 Blanco 7 52 ARNip C3 11 15 Factor Humano B 34 C3 Blanco 8 53 ARNip C3 12 16 Factor Humano H-2 35 C3 Blanco 9 54 ARNip C3 13 17 Factor Humano H-4 36 C3 Blanco 10 55 ARNip C3 14 18 Factor Humano H-5 37 C3 Blanco 11 56 ARNip C3 15 19 Factor Humano I 38 C3 Blanco 12 57 C4bBP Humano (beta) Variantes de combinación de proteínas de sistema de complemento humano se han identificado para factores C2 y MCP y se ha identificado un mej orador de combinación exónico. ARNip dirigido a estos y otros variantes de combinación todavía no identificadas a proteínas de sistema de complemento, se abarcan por la presente invención. Variantes de combinación de proteínas del sistema de complemento humano en forma alterna pueden ser identificadas como se conoce en la técnica, por ejemplo al utilizar una técnica denominada "protección de ARNsa"'. La protección ARNsa involucra transcripción de una secuencia de gen en ARN sintético, que se hibridiza en ARN derivado de otras células; por ejemplo células de tejido en o cerca del sitio de activación del complemento. El ARN hibridizado después incuba con enzimas apareamientos incorrectos híbridos ARN: ARN. Fragmentos además pequeños que lo esperado indican la presencia de ARNms combinados en forma alterna. En modalidades, ARNms combinados en forma alterna putativa pueden clonarse y secuenciarse por métodos bien conocidos por aquellos con destreza en la técnica y utilizados para desarrollar ARNip. En forma alterna, proteínas de ruta de complemento combinadas pueden ser identificadas utilizando RT-PCR. En RT-PCR, ARNm del tejido enfermo se convierte en ADNc utilizando métodos bien conocidos por aquellos con destreza ordinaria la especialidad, por ejemplo al utilizar la enzima transcriptasa inversa. Toda la secuencia de codificación del ADNc puede ser entonces amplificada mediante PCR utilizando un cebador o iniciador hacia adelante ubicado en la región 3' sin traducir, y un iniciador hacia atrás ubicado en la región 5' sin traducir. Los productos amplificados pueden analizarse para formas de combinación alterna, por ejemplo al comparar el tamaño de los productos amplificados dentro del tamaño del producto esperado a partir de ARNm normalmente combinado, por ejemplo por electroforesis en gel de agarosa. Cualquier cambio en tamaño del producto amplificado puede indicar combinación alterna. Variantes de combinación alterna pueden entonces secuenciarse y utilizarse para desarrollar ARNip. ARNm producido a partir de genes mutantes también puede ser identificada a través de las técnicas descritas anteriormente para identificar formas de combinación alterna. Como se emplea aquí, proteínas de ruta de complemento "mutante" se producen a partir de un gen que tiene una secuencia que difiere en secuencia de las secuencias de proteínas de ruta de complemento que se establecen aquí por ejemplo en SEQ ID NOS en 1 o más pares base. De esta manera, formas alélicas de estos genes y el ARNm producido de ellas se consideran "mutantes" para los propósitos de esta invención.

Bases de datos que contienen secuencias de nucleótido relacionadas a un gen de enfermedad determinado, pueden emplearse para identificar ARNms mutante o combinado en forma alterna. Por ejemplo, la base de datos GenBank, Embase, y Cáncer Genome Anatomy Project (CGAP) . La bases de datos CGAP por ejemplo contiene etiquetas de secuencia expresadas (ESTs = expressed sequence tags) de diversos tipos de cánceres humanos. Una secuencia de gen o RNAm que incluye pero no está limitada a proteínas de ruta de complemento clásica alterna nativa y de lectina Cl, C2, C3, C4 , C5, C6, C7, C8, C9, Factor B, Factor D, Factor H, Factor I y proteínas que modulan la formación de MAC en la superficie celular, tales como genes de vitronecti a, clusterina, C4bBP, MCP y DAF pueden utilizarse para consultar a esta base de datos para determinar si ESTs representan ARNms combinados en forma alterna se han encontrado para estos genes. El ARNip de la invención puede obtenerse utilizando una cantidad de técnicas conocidas por aquellos con destreza en la técnica, incluyendo . pero no limitadas a síntesis química o producidos en forma recombinante utilizando métodos. Por ejemplo, ARNip puede producirse empleando el sistema Drosophila in vitro descrito en la Solicitud publicada de los E.U.A. Número 2002/0086356 de Tuschl et al., toda la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia o ARNip puede ser sintetizado químicamente utilizando fosforamiditas ribonucleótido apropiadamente protegidas y un sintetizador ADN/ARN convencional. En modalidades, ARNip puede sintetizarse como dos moléculas de ARN separadas, complementarias que se combinan después de síntesis, o una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias pueden sintetizarse que sea capaz de ligarse a sí misma para formar una estructura de "orquillas". Moléculas de ARN sintéticas o reactivos de síntesis comercialmente disponibles también se abarcan por las modalidades de la invención. En forma alterna, ARNip puede expresarse a partir de plásmidos de ADN lineales o circulares recombinantes utilizando un promotor conveniente. Promotores convenientes para expresar ARNip de la invención de un plásmido, son bien conocidos en la técnica y pueden incluir por ejemplo la secuencia promotora U6 o Hl ARN pol III y el promotor citomegalovirus . La selección de otros promotor los convenientes está dentro de la destreza en la especialidad. Los plásmidos recombinantes de la invención también pueden incluir promotores inducibles o regulables para expresión del ARNip en un tejido particular o en un ambiente intracelular particular . ARNip expresado de plásmidos recombinantes puede aislarse de sistemas de expresión de células cultivadas empleando técnicas estándar o expresado intracelularmente en el tejido enfermo, por ejemplo en o cerca del ojo, en o cerca de la cavidad ocular o en o cerca de la formación de drusen in vivo. El uso de plásmidos recombinantes para suministrar ARNip de la invención a células in vivo, se discute con más detalle a continuación. En diversas modalidades, un solo ARNip puede expresarse a partir de un plásmido recombinante ya sea como dos moléculas de ARN recombinante separadas o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias . La selección del plásmidos adecuados para expresar ARNip de la invención, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNip en el plásmido y métodos para suministrar el plásmido recombinante a células de interés, varían en modalidades y pueden seleccionarse de cualquier plásmido conocido la técnica o subsecuentemente desarrollado. Por ejemplo, ver Tuschl, T. (2002), Nat . Biotechnol, 20: 446-448; Brum elkamp T R et al. (2002), Science 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison P J et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Lee N S et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; y Paul C P et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 505- 508, todas las descripciones de las cuales aquí se incorporan por referencia. Como se emplea aquí, "en conexión operable con una secuencia de terminación poliT" significa que las secuencias de ácido nucleico que codifican las hebras sentido o anti sentido son inmediatamente adyacentes a la señal de terminación poliT en la dirección 5'. Durante transcripción de las secuencias sentido o anti sentido del plásmido, las señales de terminación poliT actúan para terminar la transcripción . Como se emplea aquí, "de . bajo control" de un promotor significa que la secuencias de ácido nucleico que codifican las hebras sentido o anti sentido, se ubican 3' de promotor, de manera tal que el promotor pueda iniciar la transcripción de la secuencias de codificación sentido o anti sentido. Vectores virales recombinantes de modalidades pueden incluir secuencias que codifican el ARNip de la invención, cualquier promotor conveniente para expresar las secuencias ARNip y señales de terminación conocidas en la especialidad, por ejemplo una señal de terminación poliT. La selección de otros promotores convenientes está dentro de la destreza en la especialidad, y promotores convenientes pueden incluir, por ejemplo las secuencias promotoras U6 o Hl ARN pol III o el promotor citomegalovirus . En algunas modalidades, vectores virales recombinante pueden incluir promotores inducibles o regulables para expresión del ARNip en un tejido particular, en un ambiente intracelular particular o en respuesta a una señal extracelular o intracelular particular. ARNip de la invención puede expresarse de un vector viral recombinante ya sea como dos moléculas de ARN complementarias separadas, o como una sola molécula de ARN con dos regiones complementarias. La selección de los vectores virales recombinante adecuados para utilizar en la invención, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNip en el vector y métodos para suministrar el vector viral a las células de interés, estando dentro de la destreza en la especialidad. Ver por ejemplo, Domburg R (1995) , Gene Therap. 2: 301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6: 608- 614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; y Anderson W F (1998), Nature 392: 25-30, todas las descripciones de lo cual aquí se incorporan por referencia. Cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias de codificación para la o las moléculas de ARNip a expresarse, podrán emplearse, por ejemplo vectores derivados de adenovirus (AV) ; virus adeno-asociado (AAV) ; retrovirus (por ejemplo lentivirus (LV) , Rabdovirus, virus de leucemia murino) ; virus de herpes y semejantes. El tropismo de los vectores virales también puede modificarse por pseudo tipado de los vectores con proteínas envolventes u otros antígenos de superficie de otros virus. Por ejemplo, un vector AAV de la invención puede ser pseudo tipado con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VSV = vesicular stomatitis virus), rabia, ébola, mocóla y semejantes. En diversas modalidades, vectores virales son aquellos derivados de AV y AAV. En una modalidad particular, el ARNip de la invención se expresa como dos moléculas de ARN de hebra sencilla complementaria separadas de un vector AAV recombinante que comprende por ejemplo ya sea los promotores U6 o HI ARN o el promotor citomegalovirus (CMV) . Métodos para expresar ARNip, construir vectores virales recombinantes y suministrar vectores virales en celdas objetivo son bien conocidos en la especialidad. Por ejemplo, un vector AV conveniente para expresar el ARNip, un método para construir el vector AV recombinante y un método para suministrar el, vector en células blanco, se describe en Xia H et al. (2002), Nat . Biotech. 20: 1006-1010 toda la descripción de la cual aquí se incorporan por referencia, y vectores AAV convenientes para expresar el ARNip de la invención, métodos para construir el vector AV recombinante y métodos para suministrar los vectores en celdas objetivo se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol . 61: 3096- 3101; Fisher K J et al. (1996), J. Virol., 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patentes de los E.U.A. Número 5,252,479; Patentes de los E.U.A. Número 5,139,941; Solicitud de Patente Internacional Número WO 94/13788; y Solicitud de Patente Internacional Número WO 93/24641, todas las descripciones de las cuales aqui se incorporan por referencia. En algunas modalidades, la capacidad de un ARNip que contiene una secuencia objetivo determinado para provocar degradación mediada por ARNi del ARNm objetivo o blanco puede devaluarse utilizando técnicas estándar para medir los niveles de ARN o proteínas en células. Por ejemplo, ARNip de la invención puede suministrarse a células cultivadas y los niveles de ARNm objetivo pueden ser medidos por técnicas de transferencia Northern o transferencia punto, o por RT-PCR cuantitativa. En forma alterna, los niveles de proteínas de ruta de complemento o proteínas que modulan en las células cultivadas, pueden medirse por ELISA o transferencia Western. En otras modalidades, degradación mediada por ARNi del ARNm objetivo por un ARNip que contiene una secuencia objetivo determinada, también puede ser evaluada con modelos de animales. Por ejemplo, la efectividad de un ARNip específico para tratar AMD puede evaluarse utilizando modelos de ratón CNV, y arias de lesión macular en un ratón CNV puede medirse antes y después de administración de un ARNip. Una reducción en la activación del complemento en estos modelos ante administración del ARNip indica la regulación a la baja del ARNm objetivo o mejora en la lesión macular. Como se discutió anteriormente, el ARNip de la invención es objetivo y provoca degradación mediada por ARNi del ARNm de ruta de complemento o moduladores de ARNm de activación de sistema de complemento, o formas de combinación alternas mutantes o conatos. Degradación del ARNm objetivo por ARNip de la invención puede reducir la producción de un producto de gen funcional en proteínas de ruta de complemento, o proteínas que modulan la activación del sistema de complemento en la superficie celular. De esta manera, la invención proporciona un método para inhibir expresión de proteínas de ruta de complemento, o proteínas que modulan la activación del sistema de complemento en la superficie celular en un sujeto, en donde el ARNip de la invención se administra en una cantidad efectiva a un sujeto de manera tal que el ARNm objetivo se degrada. Ya que los productos de la ruta de complemento o moduladores de los genes del sistema de complemento se requieren para iniciar la activación del sistema de complemento, la invención también proporciona un método para inhibir la activación del sistema de complemento en un sujeto por la degradación mediada por ARNi del ARNm objetivo utilizando a ARNip de la invención. Inhibición de activación de sistema de complemento puede ser evaluada, por ejemplo por medición directa del avance de formación de drusen relacionadas a AMD en un sujeto, por ejemplo pueden observarse drusen por oftalmoscopia o al observar el número de proteínas de complemento en los drusen antes y después de tratamiento con el ARNip de la invención. Una inhibición de formación de drusen se indica si las proteínas del complemento de número en los drusen permanecen iguales, se reduce o se retrasa. Técnicas para observar y medir las proteínas de complemento de número en muestras de tejido de un sujeto están dentro de la destreza de la especialidad como se discutió anteriormente, por ejemplo degradación mediada por ARNi de ARNm objetivo puede ser detectada al medir niveles del ARNm objetivo: o proteína de las células de un sujeto utilizando técnicas estándar para aislar y cuantificar ARNm o proteína como se describió anteriormente. La inhibición de activación de sistema de complemento también puede inferirse a través de observación de un cambio o inversión en una condición patogénica asociada con activación de sistema de complementos controlada. Por ejemplo, en AMD, un frenado, parada o inversión de pérdida de visión indica una inhibición de formación de drusen en la coroide. Se entiende que el ARNip puede degradar el ARNm objetivo (y de esta manera inhibir activación de sistema de complemento) en cantidades subestequiométricas . Sin desear estar ligados por alguna teoría, se considera que le ARNip de la invención provoca degradación del ARNm objetivo en una forma catalítica. De esta manera, comparado con terapias de sistema anti-complemento estándar, significativamente menos ARNip requiere ser suministrado en o cerca del sitio de activación de sistema de complementos controlada para tener un efecto terapéutico. En modalidades, ARNip aislado se administra a un sujeto en una cantidad efectiva. Una persona con destreza en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad efectiva del ARNip de la invención para administrarse a un sujeto determinado, al tomar en cuenta factores tales como el tamaño y peso del sujeto; la extensión de activación del sistema de complemento o penetración de la enfermedad; la edad, salud y sexo del sujeto; la ruta de administración y si la administración es regional o sistémica. En general, una cantidad efectiva del ARNip de la invención comprende una concentración intercelular en o cerca de la activación del sistema de complemento descontrolada de sitio desde aproximadamente 1 nanomolar (nM) a aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 2 nM a aproximadamente 50 nM, o desde aproximadamente 2.5 nM a aproximadamente 10 nM. En modalidades particulares, de aproximadamente 0.01 mg a aproximadamente 10 mg de un ARNip puede ser una cantidad efectiva. Sin embargo, en ciertas modalidades, cantidades mayores o menores de ARNip pueden ser administradas. En algunas modalidades, métodos de la invención pueden emplearse para inhibir formación de activación de sistema de complemento que no es patogénica tal como activación de sistema de complemento que resulta de procesos normales en el sujeto. Ejemplos de activación de sistema de complemento no patogénica incluyen inmuno-respuesta especifica no antigénica contra bacterias y virus. De esta manera, la invención proporciona un método para inhibir activación del sistema de complemento no patogénica para controlar inmuno-respuesta en relación a transplante de -órganos, xenotransplante y MI . En otras modalidades, métodos de la invención pueden emplearse para inhibir activación de complemento asociada con enfermedad con patogenicidad asociada con activación de sistema de complemento inapropiada o descontrolada, tal como por ejemplo activación de sistema de complemento descontrolada ligada a enfermedades autoinmunes. Otras enfermedades sistemas de complemento descontroladas incluyen retinopatia diabética, degeneración macular relacionada a la edad (AMD = age-related macular degeneration) , lupus sistémico aritematoso (SLE = systemic lupus erythematosus ) , sépsis, enfermedad de complejo inmune, inflamación, fibrosis pulmonar y hepática, asma, ateroesclerosis diabetes y enfermedad de Alzheimer. Estas enfermedades en general se caracterizan por la destrucción de tejido normal por activación de complemento descontrolada. Por ejemplo, en AMD, la coroide es invadida y destruida por drusen en RPE inhibiendo la visión del paciente y destrucción dirigida por drusen de la coroide en AMD eventualmente lleva a ceguera parcial o completa. Por lo tanto, en ciertas modalidades, ARNip puede emplearse para inhibir formación de drusen en AMD. Para el tratamiento de enfermedades relacionadas al sistema de complemento, ARNip de la invención puede administrarse a un sujeto en combinación con un agente farmacéutico que es diferente del presente ARNip. En forma alterna, el ARNip de la invención puede administrarse a un sujeto en combinación con otro método' terapéutico diseñado para tratar la enfermedad relacionada al sistema de complemento. Por ejemplo, el ARNip de la invención puede administrarse en combinación con métodos terapéuticos actualmente empleados para tratar enfermedades autoinmunes (por ejemplo, Cl INH) . En modalidades, ARNip de ¦ la invención puede administrarse al sujeto ya sean como ARNip desnudo, en conjunto con un reactivo de suministro, o como un plásmido recombinante o vector viral que expresa el ARNip. Reactivos de suministro convenientes para administración en conjunto con el presente ARNip incluyen el reactivo lipofilico Mirus Transit TKO; lipofectina; lipofectamina ; celfectina; o policationes (por ejemplo, polilisina) , o liposomas. En modalidades particulares, el reactivo de suministro es un liposoma . Los liposomas pueden ayudar en el suministro del ARNip a un tejido particular, tal como tejido retinal o enfermo y puede aumentarse la vida media en sangre del ARNip. Liposomas adecuados para utilizar en la invención pueden formarse utilizando lipidos formadores de vesículas estándar, que pueden incluir fosfolípido de carga neutral o negativa y un esterol, tal como colesterol. La selección de lipidos en general puede ser guiada por consideración de factores tales como el tamaño y vida media de deseados de los liposomas en la corriente sanguínea. Una variedad de métodos se conocen para preparar liposomas, por ejemplo como se describe en Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; y en las Patentes de los E.U.A. Números 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369, todas las descripciones de las cuales aquí se incorporan por referencia. En algunas modalidades, liposomas que encapsulan el ARNip de la invención además pueden incluir una molécula ligando que puede hacer blanco al liposoma en una célula particular o tejido en o cerca del sitio de activación del sistema de complemento. Los ligandos pueden incluir proteínas que ligan a receptores predominantes en células endoteliales vasculares o tumor tales como por ejemplo anticuerpos que ligan a antígenos de tumor o antígenos de superficie celular endotelial. En otras modalidades, liposomas que encapsulan ARNip de la invención pueden ser modificados para evitar liberación por los sistemas reticuloendoteliales y macrófago mononuclear. Por ejemplo, en modalidades, el liposoma puede incluir porciones de opsonizacion-inhibición ligadas a la superficie de liposoma. Porciones de opsonizacion-inhibición para utilizar en preparar los liposomas, típicamente son grandes polímeros hidrofílicos que se ligan a la membrana de liposoma. Como se emplea aquí, una porción de inhibición de opsonización se "liga" a una membrana de liposoma cuando se conecta en forma química o física a la membrana, por ejemplo por intercalación de un ancla soluble en lípido en la propia membrana o al. ligar directamente a grupos activos de lípidos de membrana. Estos polímeros hidrofílicos inhibidores de opsonización forman una capa superficial protectora que disminuye significativamente la absorción de los liposomas por el sistema de monocito-macrófago ("M S" = macrophage-monocyte system) y sistema reticuloendotelial ("RES" = reticuloendothelial system) como se describe en la Patente de los E.U.A. Número 4,920,016, toda la descripción de la cual aquí se incorpora por referencia. Porciones que inhiben la opsonización adecuadas para modificar liposomas de preferencia son polímeros solubles en agua con un peso molecular de aproximadamente 500 a aproximadamente 40,000 daltons, y más preferible de aproximadamente 2,000 a aproximadamente 20,000 daltons. Estos polímeros incluyen polietilen glicol (PEG) o derivados de polipropilen glicol (PPG); por ejemplo, metoxi PEG o PPG, y PEG o PPG estearato; polímeros sintéticos tales como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas o dendriméricas ; ácidos poliacrílicos ; polialcoholes , por ejemplo, polivinilalcohol y polixilitol a los cuales grupos carboxilico o amino se ligan químicamente así como gangliosidos, tales como gangliosido GMX . Copolímeros de PEG, metoxi PEG, o metoxi PPG, o sus derivados, también son convenientes. Además, el polímero inhibidor de opsonización puede ser un copolímero de bloque de PEG y ya sea el poliaminoácido, polisacárido, poliamidoamina, polietilenamina o polinucleótido . Los polímeros inhibidores de opsonización también pueden ser polisacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílieos , por ejemplo ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido mannurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico, caragenina; polisacáridos u oligosacáridos laminados (lineales o ramificados); o polisacáridos u oligosacáridos carboxilados , por ejemplo, reaccionados con derivados de ácidos carbónicos con enlace resultante de grupos carboxílicos . En modalidades particulares, la porción inhibidora de opsonización es un PEG, PPG, o sus derivados. Liposomas modificados con PEG o derivados PEG, en ocasiones se denominan "liposomas modificados con PEG o PEG-ilados". La porción inhibidora de opsonización puede ligarse a la membrana de liposoma por cualquiera de numerosas técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un N-hidroxisuccinimida éster de PEG puede ligarse a un ancla soluble en lipidos de fosfatidil-etanolamina y después ligarse a una membrana. Similarmente, un polímero de dextrano puede derivarse con un ancla soluble en lípido de esterilamina mediante aminación reductiva utilizando Na(CN)BH3 y una mezcla de solvente tal como tetrahidrofurano y agua en una proporción 30:12 a 60°C. Liposomas modificados con porciones de inhibición de opsonización permanecen en la circulación mucho más tiempo que los liposomas no modificados. Por esta razón, estos' liposomas en ocasiones se denominan liposomas "furtivos o invisibles". Los liposomas furtivos se conoce que se acumulan en tejidos alimentados por la microvasculatura porosa o "con fuga". De esta manera, tejidos objetivo caracterizado por estos efectos de microvasculatura, por ejemplo tumores sólidos, acumulará eficientemente estos liposomas; ver Gabizon, et al. (1988), P.N.A.S., USA, 18: 6949-53. Además, la absorción reducida por RES reduce la toxicidad de liposomas furtivos al evitar acumulación significante en el hígado y el bazo. De esta manera, liposomas de la invención que se modifican con porciones de inhibición de opsonización, pueden suministrar el presente ARNip a células de tumor. En una modalidad, un lipsoma de la invención puede comprender tanto porciones de inhibición de opsonización como un ligando.

Todavía en otras modalidades, el ARNip de la invención puede administrarse al sujeto por cualesquiera medios adecuados para suministrar mecánicamente el ARNip a las células del tejido en o cerca del área de activación del sistema de complemento no controlada. Por ejemplo, el ARNip puede administrarse por una pistola de genes o electroporación . ARNip y composiciones farmacéuticas de la invención pueden suministrarse por cualquier ruta conocida en la especialidad. Por ejemplo, rutas de administración enteral convenientes pueden incluir gotas de ojos, oral, rectal o suministro intranasal. Rutas de administración parenterales convenientes pueden incluir administración intravascular (por ejemplo, inyección de bolo intravenosa,- infusión intravenosa, inyección de bolo intra-arterial , infusión intra-arterial e instilación de catéter en la vasculatura) ; inyección de peri- e intra-tejido (por ejemplo, inyección intra-retinal, inyección subretinal o intra-vítrea ) ; inyección o deposición subcutánea incluyendo infusión subcutánea (tal como por bombas osmóticas) ; aplicación directa al área en o cerca del sitio de activación de sistema de complementos controlado, por ejemplo por un catéter u otro dispositivo de colocación (por ejemplo, un precipitado retinal o un supositorio o un implante que comprende un material poroso, no poroso o gelatinoso) ; e inhalación. En ciertas modalidades, inyecciones o infusiones de ARNip de la invención pueden proporcionarse en o cerca del sitio de activación de sistema de complemento. En diversas modalidades, ARNip de la invención puede administrarse en una sola dosis o múltiples dosis. Una persona con destreza en la técnica también puede determinar fácilmente un régimen de dosis apropiado para administrar el ARNip de la invención a un sujeto dado. Por ejemplo, el ARNip puede administrarse al sujeto una vez, por ejemplo como una sola inyección o deposición en o cerca del sitio de activación de sistema de complemento no controlado. En forma alterna, el ARNip puede administrarse una o dos veces diariamente a un sujeto por un periodo desde aproximadamente tres a aproximadamente veintiocho dias, o de aproximadamente siete a aproximadamente diez dias. Por ejemplo, en algunas modalidades, el ARNip puede inyectarse en o cerca del sitio de activación del sistema de complemento no controlado, una vez al día por siete dias. Cuando un régimen de dosis comprende múltiples administraciones, se entiende que la cantidad efectiva del ARNip administrado al sujeto puede comprender una cantidad la total de ARNip administrado sobre todo el régimen de dosis. El ARNip de la invención de preferencia se formula como composiciones farmacéuticas antes de administrar a un sujeto, de acuerdo con técnicas conocidas en la especialidad.

Composiciones farmacéuticas de la presente invención se caracterizan por ser al menos estériles y libres de pirógenos. Como se emplea aquí, "formulaciones farmacéuticas" incluyen formulaciones para uso humano y veterinario. Métodos para preparar composiciones farmacéuticos de la invención están dentro de la destreza en la especialidad, por ejemplo como se describe en Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa . (1985), toda la descripción de lo cual aqui se incorpora por referencia. Las presentes formulaciones farmacéuticas comprenden un ARNip de la invención (por ejemplo, 0.1 a 90% en peso) , o su sal fisiológicamente aceptable, en mezcla con un medio portador fisiológicamente aceptable tal como por ejemplo, agua, agua amortiguada, salino normal, salino al 0.4%, glicina al 0.3%, ácido hialurónico y semejantes. Composiciones farmacéuticas de la invención también pueden incluir excipientes y/o aditivos farmacéuticos convencionales. Excipientes farmacéuticos convenientes incluyen estabilizantes, antioxidantes, agentes para ajuste de osmolalidad, amortiguadores, y agentes de ajuste de pH. Aditivos convenientes incluyen amortiguadores fisiológicamente biocompatibles (por ejemplo, hidrocloruro de trometamina) , adiciones de quelantes (tales como, por ejemplo, DTPA o DTPA-bisamida) o complejos de quelato de calcio (tales como por ejemplo DTPA de calcio, CaNaDTPA-bisamida) , u opcionalmente adiciones de sales calcio o sodio (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio) . Composiciones farmacéuticas de la invención pueden empacarse para utilizar en forma liquida, o pueden ser liofili zadas . Para composiciones sólidas, pueden emplearse portadores sólidos no tóxicos convencionales; por ejemplo, grados farmacéuticos de mannitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y semejantes. Por ejemplo, una composición farmacéutica sólida para administración oral puede comprender cualquiera de los portadores y excipientes citados anteriormente y por ejemplo aproximadamente 10-95%, en un ejemplo adicional 25%-75%, de uno o más ARNip de la invención. Una composición farmacéutica para administración en aerosol (inhalación) puede comprender 0.01-20% en peso, en un ejemplo adicional 1%-10% en peso, de uno o más ARNip de la invención encapsulados en un liposoma como se describió anteriormente, y un propulsor. Un portador también puede incluirse según se desee; por ejemplo, lecitina para suministro intranasal. La invención ahora se ilustrará con los siguientes ejemplos no limitantes. EJEMPLOS MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo Celular Células 293 (células de riñon embriónico humano) , células ARPE19 (células epiteliales de retina humana) , y células A549 (células de carcinoma de pulmón humano) se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA) y cultivaron en medio Eagle modificado con Dulbecco (DMEM, Gibco, Carlsbad, CA) medio DMEM/F12 (Gibco) o medio F12-K (ATCC) respectivamente, con suero bovino fetal al 10% (FBS; JRH Biosciences, enexa, KS) y un reactivo antimicótico-antibiótico (Gibco) . ARNips Quince ARNips que hacen blanco en complemento humano C3 se sintetizaron por Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) . Las secuencias objetivo ARNip se citan en la Tabla 2. Tabla 2 : Secuencias Objetivo ARNip C3 Nombre ARNip Secuencia Obj etivo 5'-3' SEQ. ID. NO. 27 AAT CCG AGC CGT TCT CTA CAA SEQ. ID. NO. 28 AAC AAG CTC TGC CGT GAT GAA SEQ. ID. NO. 29 AAT GGA CAA AGT CGG CAA GTA SEQ. ID. NO. 30 AAC TAC ATG AAC CTA CAG AGA SEQ. ID. NO. 31 AAA AAG CGG CCA GTC AGA AGA SEQ. ID. NO. 32 AAT GAT TGG TGG ATT ACG GAA SEQ. ID. NO. 33 AAG TCC TCG TTG TCC GTT CCA SEQ. ID. NO. 34 AAA TGA TTG GTG GAT TAC GGA SEQ. ID. NO. 35 AAT TAC CGG CAG AAC CAA GAG SEQ. ID. NO. 36 AAA TGG AAT CTC TAC GAA GCT SEQ . ID. NO. 37 AAT GAA CAG AGA TAC TAC GGT SEQ. ID. NO. 38 AAG CCT TGG CTC AAT ACC AAA SEQ. ID. NO. 39 AAG CGC ATT CCG ATT GAG GAT SEQ . ID. NO. 40 AAT GGA ATC TCT ACG AAG CTC SEQ. ID. NO. 41 AAC CTC ATC GCC ATC GAC TCC Un ARNip adicional, que hace blanco u objetivo en proteina fluorescente verde mejorada (EGFP = enhanced green fluorescent protein) , sirvió como un control negativo (Dharmacon, Lafayette, CO) . La secuencia de hebras sentido del ARNip fue 5'- GGC UAC GUC CAG GAG CGC AdTdT 3' y la secuencia de hebra antisentido fue 5'- U GCG CUC CUG GAC GUA GCCdTdT -3' . Tratamientos con Citocina y Análisis de Transferencia Western Células 293, células ARPE19 y células A549 se cultivaron en placas de 24 pozos a 37 grados C con C02 al 5% durante la noche. El dia siguiente, las células se trataron con las siguientes citocinas (R & D Systems, Minneapolis, MN) : interleucina 1ß (IL-?ß; 100 ng/mL), interleucina 6 (IL- 6; 250 ng/mL) e interferona ? (IFN-?; 500 ng/mL) . Dos días post-tratamiento, se recolectaron sobrenadantes celulares de cada pozo, y se realizó una transferencia Western C3 de complemento humano. Brevemente, los sobrenadantes (25 pLs) se sometieron a elect roforésis en un gel NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La proteína se transfirió a membrana de nitrocelulosa y C3 se detectó con un anticuerpo primario C3 de complemento anti-humano pollo (100 ng/mL) (Chemicon, Temecula, CA) , un anticuerpo secundario IgY anti-pollo conejo conjugado con fosfatasa alcalina (1:10,000, Chemicon) y reactivo de detección de fosfatasa alcalina (Novagen, Madison, WI) . Criba de ARNip de Complemento Humano y Ensayo de Respuesta de Dosis Células ARPE19 se cultivaron en placas de 24 pozos a 37 grados C con C02 al 5% durante la noche. Al día siguiente, se realizaron transíecciones cuando las células fueron aproximadamente 70% confluentes. Las células se transfectaron con ARNip 5 nM, 25 nM, 125 nM o 625 nM mezcladas en un reactivo de fosfato de calcio (CaPi) . Controles incluyen reactivo de transfección que carece ARNip y ARNip no específico (EGFPl ARNip) . Brevemente, ARNip se agrega a 20 pL de solución de CaCl2 de 250 mM. La mezcla ARNip/CaCl2 se agregó por gotas a 20 iL de Solución de Sal Balanceada de Hanks 2X (HBS = Hanks Balanced Salt Solution) , mientras que se mezcla con torbellino. El complejo ARNip/CaCl2/HBS se agregó directamente al medio (300 L/pozo) . Después de 4 horas de incubación a 37 grados C, el medio se retiró, y las células fueron incubadas adicionalmente con medio libre de suero que contiene DMSO al 10% (300 µ]_,/????) a temperatura ambiente por 1-2 minutos. Este medio después se retiró y las células se alimentaron de nuevo con 200 L/de medio de crecimiento por pozo. Estimulo C3 de complemento se realizó por cuatro horas después de transfección con IL-?ß a una concentración final de 100 ng/mL. 48 horas post-transfección, el sobrenadante se recolectó de cada pozo, y las muestras se analizaron por transferencia Western. Ensayo de Citotoxicidad Después de que el sobrenadante se retiró de las células,- un ensayo de citotoxicidad se realizó. Medio de crecimiento completo que contiene 10% alamarBlue™ (Biosource, Camarillo, CA) se agrega a cada poozo, y las células se incubaron a 37 grados C con C02 al 5% por 3 horas. La citotoxicidad se determinó espectrofotométricamente a 570 nm utilizando un lector de placas AD340 (Beckman Coulter) . El ensayo alamarBlue™ incorpora un indicador de oxidación- reducción (REDOX) que responde a la reducción química del medio de crecimiento que resulta de crecimiento celular. En la presencia de células de crecimiento cambia de la forma oxidada (no-fluorescente, color azul) a la forma reducida (fluorescente, color rojo). EJEMPLO 1 Citocinas Regulan a la Alta Expresión C3 en Células Expresión C3 de complemento humano se probó en células después de 2 días de tratamiento con citocina (Referencia a la Figura 1 del Ejemplo 1) . Las citocinas empleadas incluyen 100 ng/mL IL-?ß (2), 250 ng/ml IL-6 (3), o 500 ng/mL IFN-? (4). Niveles de C3 generados por las células tratadas con las citocinas se compararon con niveles de C3 en células sin tratar (1) . No hubo cambio evidente en expresión C3 de complemento en células 293 y A549 tratadas con cualquier citocina o en células ARPE19 tratadas con 500 ng/mL de IFN-? (4) . Sin emgargo, dé expresión C3 fue significativamente regulada a la alta en células ARPE19 tratadas con 100 ng/mL de IL-?ß (2) o 250 ng/ml de IL-6 (3) . EJEMPLO 2 ARNips C3 de Complemento Humano Suprime la Regulación a la Alta inducida por IL-?ß de Proteina C3 de Complemento en Células ARPE19 Expresión de proteina C3 de complemento se reguló a la alta al tratar células ARPE19 con 100 ng/mL de tratamiento IL-?ß. Las células asi tratadas se transfectaron con ARNip C3 de complemento 25 nM o con un ARNip de control negativo (NC) y niveles de proteina C3 se evaluaron por análisis de transferencia Western. Como se ilustra en la Figura 2, el aumento inducido por citocina de los niveles de proteina C3 de complemento se redujeron significativamente en células transfectadas con ARNips C3 de complemento humano SEQ. ID.

NOS. 43, 45, 48, 49, 51, 53 y 56. Transfecciones con el ARNip de control negativo o transfecciones simuladas sin ARNip no tuvieron efecto en los niveles C3 de complemento. Estudios de respuesta de dosis se realizaron en ARNips C3 de complemento (Figura 3). Las células ARPE19 tratadas con 100 ng/ml de IL-?ß se transfectaron con ARNips C3 de complemento 5 nM, 25 nM, 125 nM o 625 nM, SEQ. ID. NOS. 43, 45, 48 y 51 o ARNip de control negativo (NC) . Proteina C3 después se detectó por análisis de transferencia Western. Los ARNips C3 de complemento SEQ. ID. NOS. 45 y 51 mostraron la dosis de respuesta más significante. EJEMPLO 3 Ensayo de Citotoxicidad ARNips se probaron por citotoxicidad (Figura 4). Células ARPE19 tratadas con 100 ng/mL IL-?ß se transfectaron con ARNips C3 de complemento 5 nM, 25 nM, 125 nM o 625 nM o con ARNip de control negativo (NC) . Un ensayo de citotoxicidad se realizó 48 horas después de transfección y tratamiento IL-?ß utilizando alamarBlue™. Los ARNips (5 nM- 625 nM) no fueron citotóxicos a las células ARPE19. Aunque la presente invención se ha descrito en detalel considerable con referencia a ciertas modalidades preferidas de la misma, son posibles otras versiones. Por lo tanto, el espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas no habrán de limitarse a la descripción y las versiones preferidas contenidas dentro de esta especificación.

Claims (53)

1. REIVINDICACIONES 1. Un ARNip aislado, caracterizado porque comprende: una hebra de ARN sentido que tiene una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos de ARNm de proteina C3 humana; y una hebra ARN antisentido que tiene una secuencia substancialmente complementaria a la hebra de ARN sentido; en donde la hebra de ARN sentido y la hebra ARN antisentido forman un dúplex de ARN.
2. 2. El ARNip de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hebra de ARN sentido comprende una molécula de ARN, y la hebra de ARN antisentido comprende una molécula de ARN.
3. 3. El ARNip de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las hebras de ARN sentido y antisentido del ARNip se enlazan covalentemente.
4. 4. El ARNip de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ARNip además comprenden material no nucleótido.
5. 5. El ARNip de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las hebras de ARN sentido y antisentido se estabilizan contra degradación de nucleasa.
6. 6. El ARNip de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hebra de ARN sentido comprende una primer extensión 3' y/o la hebra ARN antisentido comprende una segunda extensión 3' .
7. 7. El ARNip de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la primer y/o la segunda extensión 3' comprenden de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos.
8. 8. El ARNip de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque la primer y/o segunda extensión 3' comprende aproximadamente 2 nucleótidos.
9. 9. El ARNip de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el dinucleótido que comprende la primer y/o segunda extensión 3' es ditimidina (TT) o diuridina (uu) .
10. 10. El ARNip de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la hebra de ARN sentido tiene una secuencia que corresponde a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 56.
11. 11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende: una cantidad efectiva de un ARNip aislado, que tiene una hebra de ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos en ARNm C3 humano y una hebra ARN antisentido complementaria con la hebra ARN sentido, en donde las hebras ARN sentido y antisentido forman un dúplex ARN, y un portador farmacéuticamente aceptable.
12. 12. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque además comprende un reactivo de suministro.
13. 13. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque el agente de suministro se elige de lipofectina, lipofectamina , cellfectina, policationes , liposomas y sus combinaciones.
14. 14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el agente de suministro es un liposoma.
15. 15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el liposoma además comprende un ligando de blando que hace blanco al liposoma en células en o cerca del sitio de un druse.
16. 16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el ligando comprende un anticuerpo.
17. 17. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque el liposoma se modifica con una porción de inhibición de opsonización .
18. 18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la porción de inhibición de opsonización comprende un PEG, PPG, o sus derivados .
19. 19. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la hebra de ARN sentido tiene una secuencia que corresponde a la secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 y SEQ ID NO: 56.
20. 20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la hebra de ARN sentido comprende una primer extensión 3' y/o la hebra ARN antisentido comprende una segunda extensión 3' .
21. 21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la primera y/o segunda extensión 3' comprenden de 1 a aproximadamente 6 nucleótidos.
22. 22. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la primera y/o la segunda extensiones 3' comprenden aproximadamente 2 nucleótidos.
23. 23. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la primera y/o la segunda extensiones 3' son un dinucleótido que comprende ditimidina (TT) o diuridina (uu) .
24. 24. Un método para inhibir expresión de ARNm regulador de sistema de complemento o sistema de complemento humano, caracterizado porque comprende: administrar a un sujeto que lo requiere, una cantidad efectiva de un ARNip aislado que tiene una hebra de ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a 25 nucleótidos contiguos en ARNm de proteina C3 humana y una hebra ARN antisentido substancialmente complementaria a la hebra ARN sentido, en donde las hebras ARN sentido y antisentido forman un dúplex de ARN; y degradar el ARNm regulatorio C3 humano en donde degradar el ARNm regulatorio C3 humano inhibe la expresión del ARNm regulatorio C3 humano e inhibe inicio y/o proliferación de una respuesta de sistema de complemento.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el sujeto que lo requiere es un ser humano .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la cantidad efectiva del ARNip es de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 100 nM.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ARNip se expresa de un plásmido recombinante .
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ARNip se expresa de un virus recombinante .
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el virus recombinante comprende un vector adenoviral, un vector viral adeno-asociado, un vector lentiviral, un vector retroviral, o un vector de virus de herpes .
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el vector viral recombinante comprende un vector viral adeno-asociado .
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el virus recombinante expresa proteínas de superficie de un virus seleccionado de virus de estomatitis vesicular, virus de rabias, virus de Ébola, o virus de Mokola.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ARNip se administra enteralmente .
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque administrar enteralmente se elige de administración oral, rectal, o intranasal.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ARNip se administra en forma parenteral .
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porqueadministración parenteral se elige de administración intravascular , inyección peri- e intra-tej ido, injección o deposición subcutánea ó administración por infusión subcutánea, y administración directa en o cerca de un sitio de formación de drusen.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la administración intravascular se eliqe de inyección de bolo intravenoso, infusión intravenosa, inyección de bolo intra-arterial , infusión intra-arterial e instilación de catéter en una vasculatura.
37. 37. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la inyección peri- e intra-tejido se elige de inyección intra-retinal , inyección subretinal e inyección intra-vitrea .
38. 38. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque la administración directa en o cerca del sitio de formación de drusen comprende administración por catéter, gránulo retinal, supositorios, un implante que comprende un material poroso, un implante que comprende un material no poroso, o un implante que comprende un material gelatinoso.
39. 39. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el ARNip se administrar por gotas de ojos o inyección intraorbital .
40. 40. Un método para tratar una enfermedad en un sujeto, caracterizado porque comprende: administrar al sujeto una cantidad efectiva de un ARNip aislado que tiene una hebra de ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos en ARNm de proteina C3 humana y una hebra de ARN antisentido substancialmente complementaria a la hebra de ARN sentido, en donde las hebras de ARN sentido y antisentido forman un dúplex de ARN; y degradar ARNm C3 en el sujeto.
41. 41. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la enfermedad se elige de desorden relacionada a degeneración macular, desorden macular relacionado a la edad, distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia de fondo Sorsby, enfermedad Stargardt, distrofia de patrón, enfermedad Best, drusen dominantes, retinopatia diabética y malattia leventinese.
42. 42. El método de conformidad con la reivindicación 41, caracterizado porque el desorden relacionado a degeneración macular se elige de desprendimiento retinal, degeneraciones corioretinales , degeneraciones retínales, degeneraciones de fotoreceptor, degeneraciones RPE, mucopolisacaridosis , distrofias de varilla-cono, distrofias de cono-varilla, y degeneraciones de cono.
43. 43. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la enfermedad es una degeneración macular relacionada a la edad.
44. 44. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la enfermedad es retinopatia diabética .
45. 45. El método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque además comprende detectar el nivel de expresión del ARNm regulatorio del sistema de complemento o sistema de complemento humano con orina, plasma de sangre, suero, sangre entera, o fluido ocular del sujeto.
46. 46. Un método para tratar un desorden ocular asociado con drusen, caracterizado porque comprende: administrar ocularmente a cuando menos un ojo de un sujeto como una cantidad efectiva de un ARNip aislado que tiene una hebra ARN sentido incluyendo una secuencia de nucleótidos substancialmente idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 a aproximadamente 25 nucleótidos contiguos en ARNm de proteina C3 humana y una hebra ARN antisentido substancialmente complementaria con la hebra de ARN sentido, en donde las hebras ARN sentido y antisentido forman un dúplex de ARN; y degradar ARNm C3 en al menos un ojo del suj eto .
47. 47. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el desorden ocular se elige de desorden relacionado a degeneración macular, desorden macular relacionado a la edad, distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia de fondos Sorsby, enfermedad Stargardt, distrofia de patrón, enfermedad Best, drusen dominantes, retinopatia diabética y malattia leventinese.
48. 48. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la enfermedad es degeneración macular relacionada a la edad.
49. 49. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la enfermedad es retinopatia diabética .
50. 50. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la administración ocular se elige de inyección tópica, intra-retinal , inyección subretinal, inyección intravitrea, e inyección intraorbital .
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la administración ocular se elige de gotas de ojos o inyección intraorbital.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque la hebra de ARN sentido tiene una secuencia que corresponde a una secuencia seleccionada de SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, y SEQ ID NO: 56.
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el ARNip comprende una primer extensión 3' y/o una segunda extensión 3' seleccionada de ditimidina (tt) o diuridina (uu) .