MX2011005851A - Composiciones y metodos para la inhibicion selectiva de isoformas vegf proangiogenicas. - Google Patents

Abstract

Se describen aquí métodos y composiciones de siARN útiles para inhibir la expresión de isoformas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Tales métodos y composiciones adicionalmente implican que el siARN es capaz de tener acción selectiva hacia isoformas VEGF angiogénicas, mientras que al mismo tiempo se reducen selectivamente las isoformas antiangiogénicas. Las enfermedades que implican la angiogénesis estimulada por la sobreexpresión de VEGF, como retinopatía diabética, degeneración vascular relacionada con la edad y muchos tipos de cáncer, pueden someterse a tratamiento administrando ARN interferentes pequeños como se describen aquí.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA LA INHIBICIÓN SELECTIVA DE ISOFORMAS VEGF PROANGIOGÉNICAS Remisión a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad con Solicitud Provisional de E.U. núm. 61/119,779 "Compositions and Methods for Selective Inhibition of VEGF" presentada el 4 de diciembre de 2008, Núm. Provisional de E.U. "61/171,571 titulada "Compositions and Methods for Selective Inhibition of VEGF" presentada el 22 de abril de 2009, y Solicitud Provisional de E.U. Núm. 61/219,808 titulada "Compositio'ns and Methods for Selective Inhibition of VEGF" presentada el 24 de junio de 2009, cada una de los cuales se incorpora aquí por referencia y en su totalidad.

Breve Descripción de la Invención La angiogénesis , definida como el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos capilares o "neovascularización" , desempeña un papel fundamental en crecimiento y desarrollo. En humanos maduros, la capacidad de iniciar la angiogénesis se encuentra en todos los tejidos, pero es mantenida bajo el control estricto. Un regulador clave de la angiogénesis es el factor del crecimiento endotelial vascular ("VEGF"), también llamado factor de permeabilidad vascular ("VPF") . La angiogénesis es iniciada cuando secretado VEGF se une con el Flt-1 y Flk- 1/KDR receptores (también llamado receptor VEGF 1 y receptor VEGF 2), que se expresan en la superficie de células endoteliales .. Flt-1 y Flk-l/KDR son tirosina cinasa protéicas transmembranales , y la unión de VEGF inicia una cascada de señal celular dando como resultado la neovascularización última en el tejido circundante.

Hay tres diferentes formas de empalme alternativas VEGF principales (es decir, isoformas) en humanos (VEGF121, VEGFl65, y VEGF189), mientras varias otras variantes también existen (VEGF206 , VEGF183 , VEGF148 , VEGF165b y VEGF145) .

Notablemente, no todas las isoformas son proangiogénicas . Se ha demostrado que al menos VEGFl65b tiene capacidad de contrarrestar los efectos de VEGF165 angiogénesis inducida. Sin limitaciones teóricas, parece que VEGF165b tiéne capacidad de prevenir la señalización de Receptor 2 de VEGF.

Ya que la secreción de VEGF165b puede ser capaz de prevenir o retardar la angiogénesis en estados patológicos .

La angiogénesis aberrante, o el crecimiento patógeno de recipientes de sangre nueva, es implicada ¡ en varias condiciones. Entre estas condiciones son la retinopatía diabética, la psoriasis, degeneración macular relacionada con la edad exudativa o "húmeda" ("ARMD"), artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias, y la mayor parte de cánceres. Los tejidos enfermos o tumores asociados con estas condiciones expresan para anormalmente altos niveles de VEGF, y muestran un elevado grado de vascularización o permeabilidad vascular.

El ARMD en particular, es una enfermedad angiogénica clínicamente importante. Esta condición se caracteriza por la neovascularización coroidea en uno o ambos ojos en pacientes que envejecen, y es la causa principal de la ceguera en países industrializados.

La interferencia de ARN (a continuación "ARNi"), es un método de la regulación génica posttranscripcional que es conservada en muchos organismos eucarióticos . El ARNi es inducido por moléculas de ARN bicatenarias cortas (es decir, <30 nucleótido) ( "ARNbc " ) , que se encuentran en la célula. Estas moléculas de ARNbc cortas, llamado "ARN corto de interferencia" o "siARN", causan la destrucción de ARN mensajeros ("ARNm") que comparten la homología de secuencia con siARN a dentro de una resolución nucleotídica . Se piensa esto siARN y el ARNm con especificidad de objetivo se unen con un "complejo de silenciamiento inducido por ARN" o WRISC, por sus siglas en inglés", que escinde el ARNm con especificidad de objetivo. SiARN es por lo visto reciclado mucho como una enzima de volumen de ventas múltiple, con 1 molécula de siARN capaz de inducir la escisión de aproximadamente 1000 moléculas de ARNm. la degradación de ARNi regulada por siARN de un ARNm es por lo tanto más efectiva que tecnologías actualmente disponibles para inhibir la expresión de un gen objetivo. Sin embargo, los métodos no son directamente capaces de ser traducidos a agentes terapéuticos para el tratamiento de la enfermedad.

Lo que es necesario, por lo tanto, son agentes que selectivamente inhiben la expresión de VEGF proangiogénico en cantidades catalíticas o subestequiométricas en mamíferos, al inducir o manteniendo la secreción de isoformas VEGF antiangiogénicas .

La presente descripción concierne a siARN que específicamente apuntan con acción selectiva hacia y causan la degradación inducida por el ARNi del ARNm de VEGF y sus isoformas. Los compuestos de siARN y las composiciones de la descripción se utilizan inhiben la angiogénesis , particularmente para el tratamiento de tumores cancerosos, degeneración vascular relacionada con la edad, y otras enfermedades angiogénicas .

.Así, la descripción proporciona siARN aislado que apunta con acción selectiva hacia el ARNm VEGF de humano, o una forma de empalme alternativa, el mutante o cognado de lo mismo. Por ejemplo, en una modalidad, siARN apunta con acción selectiva hacia isoformas de ARNm VEGF proangiogénicas , como el VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206, VEGF183 , VEGF148, y/ó VEGF145, al reducir selectivamente el ARNm VEGFl65b antiangiogénico . En ciertas modalidades, siARN comprende una hebra de ARN homosentido y una hebra de ARN antisentido que forman un dúplex de ARN. La hebra de ARN homosentido comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 nucleótidos contiguos en el ARNm con especificidad de objetivo.

La descripción también proporciona plásmidos recombinantes y vectores virales que expresan para siARN composiciones descritas aguí, así como farmacéuticas que comprenden siARN y un portador farmacéuticamente aceptable.

La descripción adicionalmente proporciona un método de inhibir la expresión del ARNm VEGF proangiogénico de humano, o una forma de empalme alternativa, el mutante o cognado de lo mismo, al reducir el ARNm VEGF antiangiogénico, que comprende la administración a un paciente una cantidad efectiva de siARN el que el ARNm con especificidad de objetivo es degradado.

La descripción adicionalmente proporciona un método de inhibir la angiogénesis en un paciente, que comprende para administrar a un paciente una cantidad efectiva de siARN con especificidad de objetivo a ARNm VEGF de humano proangiogénico o una forma de empalme alternativa, mutante o cognado de lo mismo, al reducir el ARNm antiangiogénico.

La descripción adicionalmente proporciona un método para tratar una enfermedad angiogénica, que comprende para administrar a un paciente en la necesidad del tratamiento una cantidad efectiva de siAR con especificidad de objetivo a ARNm VEGF proangiogénico de humano o una forma de empalme alternativa, mutante o cognado de lo mismo, el que la angiogénesis asociada con la enfermedad angiogénica se inhibe, mientras los efectos del ARNm VEGF antiangiogénico no son afectados .

Descripción Detallada de las Figuras El archivo de esta patente contiene al menos una fotografía o figura ejecutada en color. Las copias de esta patente con figura (s) en color o fotografía (s) se proporcionarán por la Oficina de Patentes y Marcas mediante solicitan y el pago de honorarios necesarios .

Para una comprensión más llena de la naturaleza y las ventajas de la presente invención, la referencia debería obtenerse a la siguiente descripción detallada obtenida en relación con las figuras acompañantes, donde: Las Figuras 1A y IB son unos histogramas de la concentración VEGF (en pg/ml) en células 293 hipóxicas y células HeLa sometidas a tratamiento sin siARN (" - "); siARN no específico ("no específico"); o siARN ARNm VEGF de humano con acción selectiva hacia el objetivo ("VEGF"). La concentración de VEGF (en pg/ml) en 293 no hipóxicos y células HeLa se muestra también. Cada barra representa el promedio de cuatro experimentos, y el error es la desviación estándar de la media.

La Figura 2 es un histograma del murino concentración de VEGF (en pg/ml) en células de NIH 3T3 hipóxicas sometidas a tratamiento sin siARN (" - "); siAR no específico ("no específico"); o siARN ARNm VEGF de humano con acción selectiva hacia el objetivo ("VEGF"). Cada barra representa el promedio de seis experimentos y el error es la desviación estándar de la media.

La Figura 3 es un histograma de la concentración VEGF de humano (pg/total proteína) en retinas de ratones inyectados con el adenovirus que expresa para VEGF de humano ("AdVEGF") en la presencia de cualquiera siARN GFP (barra gris oscuro) o siARN VEGF de humano (encienda la barra gris) . Cada barra representa el promedio de 5 ojos y las barras de error representan la desviación estándar de la media muestral .

La Figura 4 es un histograma mostrando el área de media (en mm2) de CNV inducido por el láser en ojos de control inyecciones subretinales determinadas de siARN GFP (N=9; "siARN de GFP"), y en ojos inyecciones subretinales determinadas de siARN de VEGF de ratón (N=7; "SiARN de VEGF de ratón"). Las barras de error representan la desviación estándar de la media muestral.

La Figura 5 es una representación esquemática de pAAVsiRNA, un plásmido que actúa la CEI usado para generar un vector viral AAV recombinante de la invención. "ITR": AAV repeticiones terminales invertidas; WU6": promotores de ARN de U6; "Sentido": secuencia codificadora de sentido de siARN; "Anti": siARN secuencia codificadora antisentido; "PolyT": señales de terminación de politimidina .

La Figura 6A-6C muestra histogramas del área de media (en mm2) de CNV inducido por el láser en el tratamiento en ojos de ratón inyectados (A) subretinalmente o (B) intravitrealmente con un anti-VEGF siRNA de ratón ( "mVEGFl . siR A" ) o siARN de control ( "GFP1. siRNA" ) . Las barras de error representan la desviación estándar de la media muestral. (El C) es un histograma del área de media (en mm2 ) de CNV inducido por el láser en ojos de ratón inyectados intravitrealmente con: solución salina amortiguada con fosfato sin siARN a inducción de postláser de 1 día (WPBS"; área de CNV cuantificada a inducción de postláser de 14 días); controlar siARN a inducción de postláser de 14 días ( "GFPl . siRNA" ; área de CNV cuantificada a inducción de postláser de 21 días); o un anti-VEGF siRNA de ratón a inducción de postláser de 14 días ( "mVEGFl . siRNA" ; área de CNV cuantificada a inducción de postláser de 21 días) . Las barras de error representan la desviación estándar de la media muestral.

La Figura 7 es un gráfico del por ciento de VEGF ( B %VEGF") proteína en ojos de ratón inyectados subretinalmente con anti-VEGF siRNA de humano ("Cand5") y siARN de control ("GFPl.siRNA") a O (n=2; inyección de presiAR ) , 6 (n=3), 10 (n=3) y 14 postinyección de días (n=3). %VEGF = ( [VEGF] en el ojo Cand5 / [VEGF] en el ojo GFPl.siR A) *100.

La Figura 8 es un gráfico de niveles protéicos hVEGF en células 293 transfectadas con el transfectado con siARN VEGF de humano, siARN no específico (siARN de EGFP) o transfecciones simuladas sin siARN.' La Figura 9 es un gráfico de los estudios de respuesta a la dosis con Cand5 (bevasrianib) , hVEGF#l, hVEGF#2 , hVEGF#3 , hVEGF#4 , hVEGF#6 y hVEGF#7.

La Figura 10 es una esquemática de diversas isoformas de VEGF y su uso de exón.

La Figura 11 es un diagrama que compara la homología de VEGF165 y VEGFl65b en el exón en la unión 7/8.

La Figura 12 representa la cantidad de la proteína VEGF expresada para diversos siARN que apuntan con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8.

La Figura 13 representa el porcentaje de reducción de la expresión de la proteína VEGF de humano para diversos siARN que apuntan con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8.

La Figura 14 representa la cantidad de la proteína VEGF expresada para una detección secundaria de siARN que apuntan con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión La Figura 15 representa el porcentaje de reducción de la expresión de la proteína VEGF de humano para una detección secundaria de siARN que apuntan con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8.

La Figura 16 representa el porcentaje de reducción de la expresión de la proteína VEGF de humano para una detección secundaria de siARN que apuntan con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8 a diversas concentraciones.

La Figura 17 representa el porcentaje de reducción de la expresión de la proteína VEGF de humano más de siete días para una detección secundaria de siARN que apuntan con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8.

La Figura 18 representa el efecto de siARN que apunta con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8 según la expresión de ARNm de GAPDH usando RT-PCR.

La Figura 19 representa el efecto de siARN que apunta con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 7/8 en la unión según la expresión de ARNm de VEGF165 usando RT-PCR.

La Figura 20 representa el efecto de siARN que apunta con acción selectiva hacia el exón VEGF en la unión 7/8 según la expresión de ARNm VEGF189 usando RT-PCR.

La Figura 21 representa el efecto de siARN que apunta con acción selectiva hacia el exón VEGF en la unión 7/8 según la expresión de ARNm VEGF121 usando RT-PCR.

La Figura 22 representa el efecto de siARN que apunta con acción selectiva hacia el exón de VEGF165 en la unión 7/8 según la expresión de ARNm VEGF165b usando RT-PCR. La doble banda en aproximadamente 600bp es producida artificialmente.

La Figura 23 representa el perfil de citocina de células ARPE19 después del tratamiento con siARN seleccionados.

La Figura 24 representa el efecto de siARN en la secreción de proteína VEGF total por células ARPE19.

La Figura 25 representa el efecto de siARN en la secreción de proteína VEGF total por células ARPE19.

La Figura 26 representa el efecto de siARN en la secreción de proteína VEGF total por células ARPE19.

La Figura 27 representa el efecto de siARN en la secreción de proteína VEGF total por células ARPE19.

La Figura 28 representa lá estabilidad de bevasiranib bajo diferentes condiciones de temperatura durante un período de tiempo .

La Figura 29 representa la estabilidad de bevasiranib bajo diferentes condiciones de temperatura durante un período de tiempo .

La Figura 30 representa la estabilidad de OPK-HVB-004 bajo diferentes condiciones de temperatura durante un período de tiempo.

La Figura 31 representa la estabilidad de OPK-HVB-009 bajo diferentes condiciones de temperatura durante un período de tiempo.

La Figura 32 representa la estabilidad de OPK-HVB-010 bajo diferentes condiciones de temperatura durante un período de tiempo La Figura 33 representa la homología entre humano, rata y secuencias de VEGF de ratón al 3 ' extremo terminal .

La Figura 34 representa el efecto de siARN en la rata secreción de VEGF por células C6.

La Figura 35 representa el efecto de siARN en la secreción de VEGF de ratón por células NIH3T3.

La Figura 36 representa el efecto de siARN en la secreción VEGF por células ARPE19.

La Figura 37 representa el efecto de siARN en la secreción VEGF por células ARPE19.

La Figura 38 representa el efecto de siARN en. la secreción VEGF por células ARPE19.

La Figura 39 representa el efecto de siARN en la secreción de VEGF de ratón por células NIH3T3 Descripción Detallada de la Invención Antes de que las presentes composiciones y métodos se describan, hay que entender que esta invención no está limitada por los procesos , composiciones, o metodologías particularesdescritas , ya que pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en la descripción es para la descripción de las versiones particulares o modalidades sólo, y no es conceptualizada para limitar el alcance de la presente invención que sólo será limitada por las reivindicaciones anexadas. A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados aquí tienen los mismos significados que comúnmente entendido por el experto común en la técnica. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí puedan usarse en la práctica o las pruebas de las modalidades de la presente invención, los métodos preferidos, dispositivos, y los materiales son descritos ahora. Todas las publicaciones mencionadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad. Nada aquí debe ser interpretado como una admisión que la invención no tiene derecho a antedatar la descripción en virtud de la invención previa.

También debe observarse que como se utiliza aquí y en las reivindicaciones anexadas, las formas singulares "a", "un", y "el" incluyen referencia plural a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a una "molécula" es una referencia a uno o más moléculas y equivalentes de lo mismo conocido por los expertos en la técnica, etcétera. Como se utiliza aquí, el término "sobre" significa más o menos el 10 % del valor numérico de la cantidad con la cual esto se usa. Por lo tanto, aproximadamente el 50 % significa en el intervalo del 45-55%.

Como se utiliza aquí, un "paciente" incluye a un ser humano o animal no humano. En ciertas modalidades, el paciente es un ser humano.

Como se utiliza aquí, una "cantidad efectiva" de siARN es una cantidad suficiente para causar la degradación regulada por el ARNi del AR m con especificidad de objetivo en la célula. El término clínicamente la cantidad efectiva es una cantidad que cuando administrado a un paciente, inhibirá la progresión de angiogénesis en un paciente por el silenciamiento de ARN.

Como se utiliza aquí, medios "aislados" alterados o retirados del estado natural intervención a través de humano. Por ejemplo, siARN naturalmente presentan en un animal vivo no es "aislado", pero siARN sintético, o siARN parcialmente o completamente separado de los materiales que coexisten de su estado natural es "aislado". SiARN aislado puede existir en la forma sustancialmente purificada, o puede existir en un ambiente no natural el como, por ejemplo, una célula hacia donde siARN se ha administrado.

Como se utiliza aquí, "apuntan con acción selectiva hacia el ARNm" significa un ARNm que comprende una secuencia homosentido complementaria a siARN hebra antisentido. Un ARNm con especificidad de objetivo no tiene que ser el 100 % homólogo a siARN la hebra antisentido, mientras las funciones de siARN para silenciar o formar otra cosa un RISC se forman en comlpejos con el ARNm con especificidad de objetivo. Los ARNm con especificidad de objetivo del uso particular en los métodos de la descripción incluyen, por ejemplo, isoformas de ARNm VEGF proangiogénicas , como VEGF121 , . VEGF165 , y VEGF189, VEGF206, VEGF183 , VEGF148, y VEGF145 y combinaciones de lo mismo. En ciertas otras modalidades, el ARNm con especificidad de objetivo no comprende el ARNm VEGF165b antiangiogénico, pero apunta con acción selectiva hacia otras al menos una isoformas VEGF.

Como se utiliza aquí el término "parcialmente no complementario" pretende significar una secuencia de siARN que aunque, quizás compartiendo alguna homología de secuencia a una secuencia sin especificidad de objetivo todavía se diferencie suficientemente el que el silenciamiento de ARN no ocurre para la secuencia sin especificidad de objetivo.

Parcialmente no complementario incluyen secuencias que son el 90 % homologas, 85 %, homologas, 80 % homologas, 75 % homologas, 70 % homologas, 65 % homologas, 60 %, homologas, 55 % homologas, 50 % homologas, 45 % homologas, 40 % homologas, 35 %, homologas, 30 % homologas, 25 % homologas, 20 % homologas, 15 % homologas, 10 %, homologas, 5% homologas, 2% homologas, y 1% homologas a una secuencia sin especificidad de objetivo. Una secuencia que es completamente no homologa a una secuencia sin especificidad de objetivo se considera no complementaria a la secuencia.

Como se utiliza aquí, un gen o ARNm que es "cognado" a VEGF de humanó o ARNm de otra especie de mamífero que es homologa a VEGF de humano. Por ejemplo, el ARNm VEGF cognado del ratón se les proporciona en SEQ ID NO: 1.

Al menos que se indique otra cosa, todas las secuencias nucleoacídicas aquí se les proporcionan en los 5' a 3' dirección. También, todos los desoxirribonucleótidos en una secuencia nucleoacídica son representados por mayúsculas (p.ej, la desoxitimidina es "T"), y los. ribonucleótidos en una secuencia nucleoacídica son representados por letras de letra minúscula (p.ej, la uridina es "u").

Las composiciones y métodos que comprenden siARN con especificidad de objetivo a VEGF y sus diversas isoformas poderse usar para inhibir la' angiogénesis, particularmente para el tratamiento de la enfermedad angiogénica. Se cree que siARN causa la degradación regulada por el ARNi de estos ARNm, de modo que el producto protéico del VEGF y sus isoformas no sea producido o se produce en cantidades reducidas. Como VEGF que liga al Flt-1 o Flk-1/KDR los receptores se requieren para iniciar y mantener la angiogénesis, la degradación regulada por siARN de VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR el ARNm también puede utilizarse inhiben el proceso angiogénico.

Un aspecto de la presente descripción por lo tanto proporciona siARN aislado que comprende AR bicatenario corto de aproximadamente 17 nucleótidos hasta aproximadamente 29 nucleótidos de longitud, y en ciertas modalidades de aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 nucleótidos de longitud, que son apuntados con acción selectiva hacia al ARNm con especificidad de objetivo. SiARN comprende una hebra de ARN homosentido y una hebra de ARN antisentido complementaria fijada conjuntamente por interacciones de apareamiento de bases de Watson-calambre convencionales (a continuación "formado pares por la base"). Como se describe más detalladamente después, la hebra homosentido comprende una secuencia nucleoacídica que es idéntica o estrechamente homologa a una secuencia objetivo contenida dentro del ARNm con especificidad de objetivo.

Las hebras sentido y antisentido de siARN pueden comprender . dos moléculas de ARN complementarias, monocatenarias o pueden comprender una molécula individual donde dos porciones complementarias son formadas pares por la base y se enlazan covalentemente por un área "de horquilla" monocatenaria . Sin desear ser ligado por cualquier teoría, se piensa esto el área de horquilla del último tipo de la molécula de siARN es escindida intracelularmente por la proteína "de Dicer" (o su equivalente) para formar siARN de dos paciente moléculas de ARN formadas pares por la base.

Las variantes de empalme de VEGF de humano se conocen, incluyendo isoformas de ARNm VEGF proangiogénicas , como el VEGF121 (SEQ ID NO: 2), VEGF165 (SEQ ID NO: 3), y VEGF189 (SEQ ID NO: 4), VEGF206 (SEQ ID NO: 5; Número de acceso de GenBank CS245579), VÉGF183 (Número de acceso de GenBank AJ010438), VEGF148 (Número de acceso de GenBank AF091352), y VEGF145 (Número de acceso de GenBank CS245578), así como ARNm VEGF165b antiangiogénico (Número de acceso de GenBank AF430806) . El ARNm transcrito de VEGF de humano y sus isoformas, así como Flt-1 (SEQ ID NO: 6) o Flk-l/KDR (SEQ ID NO: 7) los genes pueden analizarse para formas de empalme alternativas adicionales usando métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos incluyen la reacción en cadena de la polimerasa por transcripción inversa (RT-PCR) , ensuciamiento del norte e hibridación in situ. Los métodos para analizar secuencias de ARNm se describen, por ejemplo, en Busting SA (2000), J. Mol. Endocrinol. 25: 169-193, la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia. Los métodos representativos para identificar ARNm alternativamente empalmados se describen también después .

Por ejemplo, bases de datos que contienen secuencias nucleotídicas relacionadas con un gen de enfermedad determinado poderse usar para identificar el ARNm alternativamente empalmado. Las bases de datos incluyen GenBank, Embase, y el Proyecto de Anatomía de Genoma de Cáncer (CGAP) base de datos. La base de datos CGAP, por ejemplo, contiene etiquetas de secuencia expresadas para (ESTs) de diversos tipos de cánceres de humano. Un ARNm o secuencia génica del VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR genes poderse usar para preguntar una base de datos para determinar si ESTs que representan ARNm alternativamente empalmados se descubren para unos estos genes.

Un método la llamada "protección de ARNasa" también puede utilizarse identifica VEGF alternativamente empalmado y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR ARNm. La protección de ARNasa implica la traducción de una secuencia génica en ARN sintético, que es hibridado a ARN derivado de otras células; por ejemplo, células de tejido a o cerca del sitio de neovascularización. ARN hibridado es incubado entonces con enzimas que reconocen apareamientos erróneos híbridos RNA : RNA . Más pequeño que fragmentos previstos indican la presencia de ARNm alternativamente empalmados. Los ARNm putativos alternativamente empalmados pueden ser clonados y secuenciados por métodos conocidos a los expertos en la técnica.

RT-PCR también puede utilizarse identifican VEGF alternativamente empalmado y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR ARNm. En RT-PCR, el ARNm de tejido o células se convierte en el ADNc por la transcriptasa inversa enzimática, usando métodos bien conocidos para aquellos de la habilidad ordinaria en la técnica. La secuencia codificadora del ADNc es amplificada entonces vía el PCR usando un cebador directo ubicado en la 5' región traducida, y cebador inverso ubicado en la 3' región traducida. En algunas modalidades, todas las bases que codifican para el ADNc son amplificadas. Los productos amplificados pueden analizarse para formas de empalme alternativas, por ejemplo al comparar el tamaño de los productos amplificados con el tamaño del producto previsto del ARNm normalmente empalmado, p.ej, por la electroforésis en gel de agarosa. Cualquier cambio del tamaño del producto amplificado puede indicar el empalme alternativo.

El ARNm producido del mutante VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR genes también puede ser fácilmente identificado a través de los métodos descritos antes para identificar formas de empalme . alternativas . Como se utiliza aquí, "mutante" VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk- 1/KDR los genes o el ARNm incluyen VEGF de humano y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR genes o ARNm que se diferencian en secuencia del VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR secuencias establecidas aquí. Así, las formas alélicas de estos genes, y el ARNm producido de ellos, se consideran "imitantes" con objetivos de esta invención.

Se entiende que VEGF de humano y sus isoformas, así como Flt-1. o Flk-l/KDR el ARNm puede contener secuencias objetivo en común con sus formas de empalme alternativas respectivas, cognados o mutantes . SiARN individual que comprende una secuencia con acción selectiva hacia el objetivo común puede inducir por lo tanto la degradación regulada por el ARNi de diferentes tipos de ARN que contienen la secuencia con acción selectiva hacia el objetivo común. Por ejemplo, como ,se muestra en la Figura 10, todas las isoformas VEGF comparten exones 1-5. Sin embargo, en VEGF121 (SEQ ID NO: 2) los exones 6 y 7 (7a y 7b) son suprimidos. En VEGF165 (SEQ ID NO: 3) el exón 6 (6a y 6b) es suprimido. En VEGF189 (SEQ ID NO: 4) el exón 6b es suprimido. En VEGF183 una porción de exón 6a es suprimida así como el exón completo 6b secuencia. VEGF148 tiene una eliminación de exón 6 (6a y 6b) así como exón 7b y una porción del exón 8. En exón VEGF145 6b y exón 7 (7a y 7b) son suprimidos . La única isoforma antiangiogenica conocida de VEGF, VEGF165b, carece del exón 6 (6a y 6b), pero además comprende un pseudoexón 9. El pseudoexón 9 es un resultado de un cambio de marco de lectura causado por la eliminación de un codón finalizador, así permitiendo una porción del 3'UTR ser. traducido como la proteína. Ver por ejemplo, Bates et al., Puede. Res. 62:4123 (2002), aquí incorporado por referencia en su totalidad. VEGF206 (SEQ ID NO: 5) es la secuencia de cadena completa VEGF sin la eliminación. Así, en ciertas modalidades, siARN apunta con acción selectiva hacia uno o más isoformas, como el VEGF121 (SEQ ID NO: 2), VEGF165 (SEQ ID NO: 3), y VEGF189 (SEQ ID NO: 4), VEGF206 (SEQ ID NO: 5; CS245579 de Número de acceso de GenBank) , VEGF183 (Número de acceso de GenBank AJ010438) , VEGF148 (Número de acceso de GenBank AF091352), y/o VEGF145 (Número de acceso de GenBank CS245578) , pero otros de piezas pieza, como el VEGFl65b, porque siARN apunta con acción selectiva hacia un exón compartido entre ciertas isoformas, pero no otros.

En una modalidad, proporcionada es siARN aislado que comprende de un dúplex de una primera hebra de ARN y una segunda hebra de ARN, la primera hebra de ARN que comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 nucleótidos contiguos a un factor del crecimiento endotelial vascular (VEGF) isoforma seleccionada del grupo que comprende VEGF121 de humano, VEGF165 VEGF189, VEGF206, VEGF183 , VEGF148, VEGF145 y combinaciones de lo mismo; adicionalmente donde siARN es al menos parcialmente no complementario a VEGFl65b, con la condición que el ARNm VEGF de humano no es SEQ ID NO. 42. Otras modalidades incluyen métodos de usar siARN para inhibir la angiogénesis y composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de siARN para inhibir la angiogénesis. .

SiARN puede comprender ARN parcialmente purificado, ARN sustancialmente puro, ARN sintético, o ARN producido mediante técnica^ de recombinación genética, así como ARN alterado que se diferencia de ARN de origen natural mediante la adición, eliminación, substitución y/o modificación de uno o más nucleótidos. Las modificaciones pueden incluir la adición del material no nucleot dico, tal en cuanto al extremo (s) de siARN o a uno o más nucleótidos internos de siARN, incluyendo modificaciones que elaboran siARN resistente a la digestión de nucleasa.

Una o ambas hebras de siARN también pueden comprender una 3' saliente. Como se utiliza aquí, una "saliente 3'" se refiere con al menos un nucleótido sin formar pares que se extiende del extremo 3' de una hebra de ARN en dúplex. En algunas modalidades, siARN no comprende una saliente y tiene un extremo romo . En algunas modalidades , ambos extremos de siARN comprenden un extremo romo. En algunas modalidades, siARN comprende un 17mer de que contiguo con un ARNm con especificidad de objetivo y dTdT sobresalen por encima. En algunas modalidades, siARN es siARN que puede inhibir la secreción o la producción de VEGF de células de diferentes especies. Por ejemplo, en algunas modalidades, siARN puede inhibir la secreción VEGF o la inhibición de una célula humana, una célula de rata, y/o una célula de ratón. En algunas modalidades, siARN puede inhibir la secreción o la producción de VEGF de una célula de ratón y una célula humana, pero no de una célula de rata. En algunas modalidades, siARN puede inhibir la secreción o la producción de VEGF de una célula de rata y una célula humana, pero no de una célula de ratón. En algunas modalidades, siARN puede inhibir la secreción o la producción de VEGF de una célula humana, una célula de ratón, y una célula de rata. La selectividad de siARN puede basarse mediante la homología entre las diferentes secuencias. Por ejemplo, la Figura 33 muestra la homología entre los codones terminales que codifican para al humano, el ratón y la rata VEGF. Estas diferencias pueden ser explotadas para producir siARN que pueden inhibir selectivamente la producción de VEGF de uno o más especies .

En algunas modalidades, los siARN que comprenden menos que 21 nucleótidos, p.ej 17, 18, 19, o 20, se pueden usar para evitar cualquier respuesta in vivo no específica potencial. (Ver, Ambati, Naturaleza, 452, 591-597 (el 3 de abril de 2008)). Por ejemplo, siARN que comprenden menor que 21 nucleótidos poderse usar para evitar potencialmente activar respuesta TLR3 in vivo.

Así en una modalidad, siARN comprende al menos una saliente 3' de 1 hasta aproximadamente 6 nucleótidos (que incluye ribonucleótidos o desoxinucleótidos) de longitud, preferentemente de 1 hasta aproximadamente 5 nucleótidos de longitud, más preferentemente de 1 hasta aproximadamente 4 nucleótidos de longitud, y particularmente preferentemente de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 4 nucleótidos de longitud.

En la modalidad donde ambas hebras de la molécula de siARN comprenden una saliente 3 ' , la longitud de las salientes puede ser el igual o diferente para cada hebra. En la modalidad más preferida, la saliente 3' está presente en ambas hebras de siARN, y es 2 nucleótidos de longitud. Por ejemplo, cada hebra de siARN puede comprender salientes 3' de ácido ditimidílico ("TT") o ácido diuridílico ("uu") .

A fin de potenciar la estabilidad de presente siARN, las 3' salientes pueden también ser estabilizadas contra la degradación; En una modalidad, las salientes son estabilizadas por el incluyendo de nucleótidos de purina, como nucleótidos de guanosina o adenosina. Alternativamente, la substitución de nucleótidos de pirimidina los análogos modificados, p.ej, la substitución de nucleótidos de uridina en las salientes 3' con 2 ' -desoxitimidina, son tolerados y no afectan la eficacia de la degradación de ARNi . En términos particulares, la ausencia de un 2' hidroxilo en la 2 desoxitimidina considerablemente potencia la resistencia a nucleasa del 31 overhang en el medio de cultivó tisular.

En ciertas modalidades, siARN comprende la secuencia AA (N19) TT o NA (N21) , donde N es cualquier nucleótido. Éstos siARN comprende GC aproximadamente del 30-70 %, y preferentemente comprende G/C aproximadamente del 50 %. La secuencia de la hebra de siARN homosentido corresponde a (N19) TT o N21 (es decir, posiciones 3 á 23), respectivamente. En el último caso, el extremo 3 ' de siARN homosentido se convierte a T. La razón fundamental para esta conversión de secuencia debe generar un dúplex simétrico con respecto a la composición de secuencia de la hebra sentido y antisentido salientes 3'. La hebra de ARN antisentido es sintetizada entonces como el complemento a posiciones 1 a 21 de la hebra homosentido.

Como la posición 1 de la hebra homosentido 23-nt en estas modalidades no es reconocida en una manera específica para la secuencia por la hebra antisentido, el 3 residuo nucleotídico '-most de la hebra antisentido puede seleccionarse deliberadamente. Sin embargo, el nucleótido penúltimo de la hebra antisentido (complementario para colocar 2 de la hebra homosentido 23-nt en la una o la otra modalidad) es generalmente complementario a la secuencia con especificidad de objetivo.

En otra modalidad, siAR comprende la secuencia NAR (N17) YNN, donde R es una purina (p.ej, A o G) y Y es una pirimidina (p.ej, C o U/T) . Las hebras de ARN sentido y antisentido 21-nt respectivas de esta modalidad por lo tanto generalmente comienzan con un nucleótido de purina. SiARN puede expresarse de vectores de expresión polín sin un cambio del sitio con acción selectiva hacia el objetivo, como la expresión de ARN de pol sólo se cree que los promotores III son eficientes cuando el primer nucleótido transcrito es una purina.

En otra modalidad, siARN comprende una secuencia que tiene no más que cinco (5) purinas consecutivas o pirimidinas . En otra modalidad, siARN comprende una secuencia que tiene no más que cinco (5) nucleótidos consecutivos que tienen la misma nucleobase (es decir, A, C, G, o U/T) .

SiARN puede ser apuntado con acción selectiva hacia a cualquier extensión de aproximadamente 19-25 nucleótidos contiguos en cualquiera de las secuencias de ARNm con especificidad de objetivo (la "secuencia objetivo"). Los métodos para secuencias objetivo de selección para siARN se les proporcionan, por ejemplo, en Tuschl T et al., "La Guía del usuario de siARN," revisado el 11 de octubre de 2002, la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia. "La Guía del usuario de siARN" está disponible en el World wide web a un sitio web mantenido por el doctor Thomas Tuschl, Department of Cellular Biochemistry, AG 105, Max-Planck-Institute para la .Química Biofísica, 37077 Gottingen, Alemania, y puede encontrarse teniendo acceso al sitio web del Instituto de Max Planck y buscando con la palabra clave "siARN." Así, la hebra homosentido de presente siARN comprende una secuencia nucleotídica idéntica a cualquier extensión contigua de aproximadamente 19 hasta aproximadamente 25 nucleótidos en el ARNm con especificidad de objetivo.

En algunas modalidades, siARN es 19 nucleótidos y comprende 17 nucleótidos que son idénticos a un ARNm con especificidad de objetivo. En algunas modalidades, siARN es 19 nucleótidos de longitud que comprende al menos un extremo romo. En algunas modalidades, cada extremo del 19mer tiene un extremo romo. En algunas modalidades, el 19mer comprende al menos una saliente de dT. En algunas modalidades, el 19mer comprende dos salientes de dT.

En términos generales, una secuencia objetivo en el ARNm con especificidad de objetivo puede seleccionarse a partir de una secuencia de ADNc determinada correspondiente al ARNm con especificidad de objetivo, preferentemente comenzando 50 a 100 nt en dirección 3' (es decir, en la 3' dirección) del codón iniciador. La secuencia objetivo puede ubicarse, sin embargo, en los 5' o 3' regiones no traducidas, o en la región cerca el codón iniciador (ver, p.ej, las secuencias objetivo de SEQ ID NÚMEROS : 73 y 74 en la Tabla 1 después, que se incluyen dentro de 100 nt del 5 '-extremo del ADNc VEGF121.

En otra modalidad de la presente invención, la secuencia de ARNm con especificidad de objetivo comprende no más que cinco (5) purinas consecutivas o pirimidinas . Por ejemplo, una secuencia objetivo adecuada en la secuencia de ADNc VEGF121 es: TCATCACGAAGTGGTGAAG (SEQ ID NO : 8) Así, siARN que apunta con acción selectiva hacia esta secuencia, y que tiene 3' uu salientes en cada hebra (salientes mostradas en el negrito), es: 5 ' -ucaucacgaaguggugaaguu-3 ' (SEQ ID NO: 9) 3 ' -uuaguagugcuucaccacuuc-5 ' (SEQ ID NO: 10) SiARN que apunta con acción selectiva hacia esta misma secuencia, pero que tiene salientes 3' de TT en cada hebra (salientes mostradas en el negrito) es: 5 ' -ucaucacgaaguggugaagTT-3 ' (SEQ ID NO: 11) 3 ' -TTaguagugcuucaccacuuc-5 ' (SEQ ID NO: 12) Otras secuencias objetivo VEGF121 de las cuales siARN puede derivarse se les proporcionan en la Tabla 1. Se entiende que todas las secuencias objetivo VEGF121 enumeradas en la Tabla 1 se incluyen dentro de que la porción de la forma de empalme alternativa VEGF121 que es común para todas las formas de empalme alternativas VEGF de humano. Así, las secuencias objetivo VEGF121 en la Tabla 1 también pueden apuntar con acción selectiva hacia VEGF165, VEGF189 y ARNm VEGF206. Las secuencias objetivo que apuntan con acción selectiva hacia una isoforma VEGF específica también pueden ser fácilmente identificadas. Por ejemplo, una secuencia objetivo que apunta con acción selectiva hacia el. ARNm de VEGF165, pero no el ARNm de VEGF121 es AACGTACTTGCAGATGTGACA (SEQ ID NO: 13 ) . A la inversa, las secuencias objetivo que apuntan con acción selectiva hacia isoformas de ARNm VEGF proangiogénicas, como VEGF121, VEGF165, y VEGF189 , VEGF206, VEGF183, VEGF148, y VEGF145 y combinaciones de lo mismo, pero no apuntan con acción selectiva hacia el AR m VEGF165b antiangiogénico incluyen las secuencias encontradas en la Tabla 2, con la condición que el ARNm VEGF no es SEQ ID núm. 42. En ciertas modalidades , el ARNm VEGF de humano se selecciona a partir del grupo que comprende SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, y SEQ ID NO: 118. En ciertas modalidades, el ARNm VEGF de humano se selecciona a partir de SEQ ID NO. .88 y SEQ ID NO. 94.

Apuntando con acción selectiva hacia selectivamente las isoformas angiogénicas de VEGF, al reducir la isoforma antiangiogénica, es posible potenciar los efectos antiangiogénicos del tratamiento de siARN. como se muestra en la Figura 11, la región entre el exón 7 y 9 se diferencian entre las secuencias angiogénicas y antiangiogénicas . Según diversas modalidades, es posible apuntar con acción selectiva hacia selectivamente esta región donde siARN es al menos parcialmente complementario a las isoformas angiogénicas , pero al menos parcialmente o completamente no complementario a la isoforma antiangiogénica. Por consiguiente, en ciertas modalidades, siARN no inhibiría la expresión de la isoforma antiangiogénica, VEGFl65b con la condición que el ARNm VEGF no es SEQ ID núm. 42. En ciertas modalidades, el ARNm VEGF de humano se selecciona a partir del grupo que comprende SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ . ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117, y SEQ ID NO: 118. En ciertas modalidades, el ARNm VEGF de humano se selecciona a partir de SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 94.

Las secuencias objetivo ejemplificantes para el Flt-1 humano para Flk-l/KDR humano se les proporcionan en PCT/US2003/0022444 presentado el 18 de julio de 2003, aquí incorporado por referencia en su totalidad.

Tabla 1 - Secuencias objetivo de VEGF Secuencia objetivo SEQ Secuencia objetivo SEQ ID ID NO: NO: Secuencia de ARNm VEGF 1 GATAGAGCAAGACAAGAAA 26 cognada Empalmar secuencia de 2 GACAAGAAAATCCCTGTGG 27 VEGF121 variante Empalmar secuencia de 3 GAAAATCCCTGTGGGCCTT 28 VEGF165 variante Empalmar secuencia de 4 AATCCCTGTGGGCCTTGCT 29 VEGF189 variante Empalmar secuencia de 5 TCCCTGTGGGCCTTGCTCA 30 VEGF206 variante TCATCACGAAGTGGTGAAG 8 GCATTTGTTTGTACAAGAT 31 ucaucacgaaguggugaaguu 9 GATCCGCAGACGTGTAAAT 32 uuaguagugcuucaccacuuc 10 ATGTTCCTGCAAAAACACA 33 ucaucacgaaguggugaagTT 11 TGTTCCTGCAAAAACACAG 34 TTaguagugcuucaccacuuc 12 AAACACAGACTCGCGTTGC 35 AACGTACTTGCAGATGTGACA 13 AACACAGACTCGCGTTGCA 36 GTTCATGGATGTCTATCAG 14 ACACAGACTCGCGTTGCAA 37 TCGAGACCCTGGTGGACAT 15 CACAGACTCGCGTTGCAAG 38 TGACGAGGGCCTGGAGTGT 16 GGCGAGGCAGCTTGAGTTA 39 TGACGAGGGCCTGGAGTGT 17 ACGAACGTACTTGCAGATG 40 CATCACCATGCAGATTATG 18 CGAACGTACTTGCAGATGT 41 ACCTCACCAAGGCCAGCAC 19 CGTACTTGCAGATGTGACA 42 GGCCAGCACATAGGAGAGA 20 GTGGTCCCAGGCTGCACCC 43 CAAATGTGAATGCAGACCA 21 GGAGGAGGGCAGAATCATC 44 ATGTGAATGCAGACCAAAG 22 GTGGTGAAGTTCATGGATG 45 TGCAGACCAAAGAAAGATA 23 AATCATCACGAAGTGGTGAAG 46 AGAAAGATAGAGCAAGACA 24 AAGTTCATGGATGTCTATCAG 47 GAAAGATAGAGCAAGACAA 25 AATCGAGACCCTGGTGGACAT 48 AATGACGAGGGCCTGGAGTGT 49 AATGTTCCTGCAAAAACACAGAC 65 AACATCACCATGCAGATTATG 50 AAAAACACAGACTCGCGTTGCAA 66 AAACCTCACCAAGGCCAGCAC 51 AAAACACAGACTCGCGTTGCAAG 67 AAGGCCAGCACATAGGAGAGA 52 AAACACAGACTCGCGTTGCAAGG 68 AACAAATGTGAATGCAGACCA 53 AACACAGACTCGCGTTGCAAGGC 69 AAATGTGAATGCAGACCAAAG 54 AAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAA 70 AATGCAGACCAAAGAAAGATA 55 AAACGAACGTACTTGCAGATGTG 71 AAAGAAAGATAGAGCAAGACA 56 AACGAACGTACTTGCAGATGTGA 72 AAGAAAGATAGAGCAAGACAA 57 AAGTGGTCCCAGGCTGCACCCAT 73 AAGATAGAGCAAGACAAGAAAAT 58 AAGGAGGAGGGCAGAATCATCAC 74 AAGACAAGAAAATCCCTGTGGGC 59 AAGTGGTGAAGTTCATGGATGTC 75 AAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGC 60 AAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCA 76 AATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGA 61 accucaccaaggccagcacTT 77 AAGCATTTGTTTGTACAAGATCC 62 gugcuggccuuggugagguTT 78 AAGATCCGCAGACGTGTAAATGT 63 GGCTACGTCCAGCGCACC 79 AAATGTTCCTGCAAAAACACAGA 64 AAACCUCACCAAAGCCAGCAC 80 Secuencias objetivo de VEGF excluyendo selectivamente VEGFl65b Nombre de siARN Secuencia objetivo (5 '-3') OPK-HVB-001 AACGTACTTGCAGATGTGA (SEQ ID NO: 86) OPK-HVB-002 ACGTACTTGCAGATGTGAC (SEQ ID NO: 87) OPK-HVB-003 CGTACTTGCAGATGTGACA (SEQ ID NO: 42) OPK-HVB-004 GTACTTGCAGATGTGACAA (SEQ ID NO: 88) OP -HVB-005 TACTTGCAGATGTGACAAG (SEQ ID NO : 89) OP -HVB-006 ACTTGCAGATGTGACAAGC (SEQ ID NO: 90) OPK-HVB-007 CTTGCAGATGTGACAAGCC (SEQ ID NO: 91) OPK-HVB-008 TTGCAGATGTGACAAGCCG (SEQ ID NO: 92) OPK-HVB-009 TGCAGATGTGACAAGCCGA (SEQ ID NO: 93) OP -HVB-010 GCAGATGTGACAAGCCGAG (SEQ ID NO: 94) OPK-HVB-011 CAGATGTGACAAGCCGAGG (SEQ ID NO: 95) OPK-HVB-012 AGATGTGACAAGCCGAGGC (SEQ ID NO : 96) OPK-HVB-013 GATGTGACAAGCCGAGGCG (SEQ ID NO : 97) OPK-HVB-014 ATGTGACAAGCCGAGGCGG (SEQ ID NO : 98) OPK-HVB-004be GTACTTGCAGATGTGACAA (SEQ ID NO: 99) OPK-HVB-009be TGCAGATGTGACAAGCCGA (SEQ ID NO: 100) OPK-HVB-010be GCAGATGTGACAAGCCGAG ( SEQ ID NO: 101) OPK-HVB-012be AGATGTGACAAGCCGAGGC (SEQ ID NO: 102) OPK-HVB-001a AACGTACTTGCAGATGT (SEQ ID NO: 103) OPK-HVB-002a ACGTACTTGCAGATGTG (SEQ ID NO: 104) OPK-HVB-003a CGTACTTGCAGATGTGA (SEQ ID NO: 105) OPK-HVB-004a GTAC TGCAGATGTGAC (SEQ ID NO : 106) OPK-HVB-005a TACTTGCAGATGTGACA (SEQ ID NO : 107) OPK-HVB-006a ACTTGCAGATGTGACAA (SEQ ID NO : 108) OPK-HVB-007a CTTGCAGATGTGACAAG (SEQ ID NO: 109) OPK-HVB-008a TTGCAGATGTGACAAGC (SEQ ID NO: 110) OPK-HVB-009a TGCAGATGTGACAAGCC (SEQ ID NO: 111) OPK-HVB-010a GCAGATGTGACAAGCCG (SEQ ID NO : 112) OPK-HVB-Olla CAGATGTGACAAGCCGA (SEQ ID NO : 113) OPK-HVB-012a AGATGTGACAAGCCGAG (SEQ ID NO: 114) OPK-HVB-013a GATGTGACAAGCCGAGG (SEQ ID NO : 115) OPK-HVB-014a ATGTGACAAGCCGAGGC (SEQ ID NO : 116) OPK-HVB-015a TGTGACAAGCCGAGGCG (SEQ ID NO: 117) OPK-HVB-016a GTGACAAGCCGAGGCGG (SEQ ID NO: 118) Las secuencias con los nombres "OPK-HVB-XXXbe" se refieren a secuencias que son 19mer los ejemplares de extremo romos del similar 21mers. Las secuencias con los nombres wOPVHVB-XXXa" se refieren a 19 mers donde hay una 17 secuencia nucleotídica de pares de bases con una saliente de dTdT. Otras secuencias no específicamente ejemplificadas aquí pero apuntando con acción selectiva hacia VEGF al reducir VEGFl65b también pueden elaborarse con propiedades similares.

SiARN puede obtenerse usando varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, siARN puede ser sintetizado químicamente o producido mediante técnicas de recombinación genética usando métodos conocidos en la técnica, como Drosophila sistema in vitro descrito en el E.U. solicitud publicada 2002/0086356 de Tuschl et al., la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia.

En ciertas modalidades, siARN es sintetizado químicamente usando fosforamiditas ribonucleoside apropiadamente protegidas y un sintetizador de ADN/ARN convencional. SiARN puede sintetizarse como dos moléculas de ARN separadas, complementarias, o como una molécula de ARN individual con dos regiones complementarias . Los proveedores comerciales de moléculas de ARN sintéticas o reactivos de síntesis incluyen Proligo (Hamburgo, Alemania) , Investigación de Dharmacon (Lafayette, CO, EE. UU) , Perforan Químico (la parte de la Ciencia Perbio, Rockford, Illinois, EE . UU) , Investigación de Cañada (Libra esterlina, VA, EE. UU) , ChemGenes (Ashland, Massachusetts, EE. UU) y Cruachem (Glasgow, el Reino Unido) .

Alternativamente, siARN también puede expresarse de plásmidos de ADN circulares o lineales recombinantes usando a cualquier promotor adecuado. Los promotores adecuados para expresar para siARN de un plásmido incluyen, por ejemplo, el U6 o ARN Hl pol III secuencias promotoras y el promotor de citomegalovirus . La selección de otros promotores adecuados se incluye dentro de la habilidad en la técnica. Los plásmidos recombinantes de la invención también pueden comprender a promotores inducibles o regulables para la expresión de siARN en un tejido particular o en un ambiente intracelular particular.

SiAR expresado para de plásmidos recombinantes puede ser o aislado de sistemas de expresión celulares cultivados por métodos convencionales, o puede expresarse intracelularmente a o cerca del área de neovascularización in vivo. Hacen una exposición de motivos del uso de plásmidos recombinantes para administrar siAR a células in vivo más detalladamente después. siARN puede expresarse de un plásmido recombinante como dos moléculas de ARN separadas, complementarias, o como una molécula de ARN individual con dos regiones complementarias .

. La selección de plásmidos adecuados para expresar para siARN, métodos para insertar secuencias nucleoacídicas para expresar para siARN en el plásmido, y métodos de administrar el plásmido recombinante a las células de interés se incluye dentro de la habilidad en la técnica, ver, por ejemplo Tuschl, T. (2002) , Nat . Biotechnol, 20: 446-448; Brummelkamp TR et al. (2002) , Ciencia 296: 550-553; Miyagishi M et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Paddison PJ et al. (2002), Genes Dev. 16: 948-958; Sotavento NS et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20: 500-505; y Paul CP et al. (2002) , Nat. Biotechnol. 20: 505-508, las descripciones completas de que se incorporan aquí como referencia.

Un plásmido que comprende secuencias nucleoacídicas para expresar para siARN se describe en el Ejemplo 7 después. Aquel plásmido, llamado pAAVsiRNA, comprende una secuencia codificadora de hebra de ARN homosentido en conexión operable con una secuencia de terminación polyT bajo el control de un promotor de ARN de humano U6, y una secuencia codificadora de hebra de ARN antisentido en conexión operable con una secuencia de terminación polyT bajo el control de un promotor de ARN de humano U6. El plásmido pAAVsiRNA es por último conceptualizado para el uso en producir un vector viral adeno-asociado recombinante que comprende las mismas secuencias nucleoacídicas para expresar para siARN.

Como se utiliza aquí, "en conexión operable con una secuencia de terminación polyT" significa que las secuencias nucleoacídicas que codifican para el sentido o las hebras antisentido son inmediatamente adyacentes a la señal de terminación polyT en la 5' dirección. Durarite la transcripción del sentido o secuencias antisentido del plásmido, las señales de terminación polyT actúan para terminar la transcripción.

Como se utiliza aquí, "bajo el control" de un promotor significa que las secuencias nucleoacídicas que codifican para el sentido o las hebras antisentido se ubican 3' del promotor, de modo que el promotor pueda iniciar la transcripción de las secuencias codificadoras homosentido o antisentido .

SiARN también puede expresarse de vectores virales recombinantes intracelularmente a o cerca del área de neovascularización in vivo. Los vectores virales recombinantes de la invención comprenden secuencias que codifican para siARN y cualquier promotor adecuado para expresar para las secuencias de siARN. Los promotores adecuados incluyen, por ejemplo, el U6 o ARN Hl pol III secuencias promotoras y el promotor de citomegalovirus . La selección de otros promotores adecuados se incluye dentro de la habilidad en la técnica. Los vectores virales recombinantes de la invención también pueden comprender a promotores inducibles o regulables para la expresión de siARN en un tejido particular o en un ambiente intracelular particular. Hacen una exposición de motivos del uso de vectores virales recombinantes para administrar siARN a células in vivo más detalladamente después. siARN puede expresarse de un vector viral recombinante como dos moléculas de ARN separadas) complementarias, o como una molécula de ARN individual con dos regiones complementarias .

Cualquier vector viral capaz de aceptar que las secuencias codificadoras para la molécula (s) de siARN se expresan puede usarse, por ejemplo vectores derivados del adenovirus (AV) ; virus adeno-asociado (AAV) ; retrovirus (p.ej, lentivirus (LV) , Rhabdoviruses , virus de leucemia de murino) ; virus del herpes, y lo similar. El tropismo de los vectores virales también puede modificarse pseudotipificando los vectores con proteínas de envoltura u otros antígenos de superficie de otros virus. Por ejemplo, un vector AAV de la invención puede ser pseudotipificado con proteínas de superficie de virus de estomatitis vesicular (VSV) , rabia, Ebola, Mokola, y lo similar.

La selección de vectores virales recombinantes adecuados para usarlos en la invención, métodos para insertar •secuencias nucleoacídicas para expresar para siAR en el vector, y métodos de administrar el vector viral a las células de interés se incluye dentro de la habilidad en la técnica. Ver, por ejemplo, Dornburg R (1995), Gene Therap. 2: 301-310; MAMÁ de Eglitis (1988), Biotechniques 6: 608-614; AD de molinero (1990), Hum Gene Therap. 1: 5-14; y Anderson WF (1998), Nature 392: 25-30, las descripciones completas de que se incorporan aquí como referencia.

Los vectores virales preferidos los son derivados de AV y AAV. En una modalidad particularmente preferida, siARN se expresa como dos moléculas de ARN monocatenarias separadas, complementarias de un vector AAV recombinante que comprende, por ejemplo, el U6 o promotores de ARN Hl, o el citomegalovirus (CMV) promotor.

Un vector AV adecuado para expresar para siAR , un método para construir el vector AV recombinante, y un método para administrar el vector en células con especificidad de objetivo, se describe en Xia H et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.

Los vectores AAV adecuados para expresar para siARN, métodos para construir el vector AAV recombinante, y métodos para administrar los vectores en células con especificidad de objetivo se describen en Samulski R et al. (1987), J. Virol . 61: 3096-3101; Fisher KJ et al. (1996), J. Virol., 70: 520- 532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; Patente Estadounidense Número 5 252 479; Patente Estadounidense Número 5 139 941; Número de Solicitud de Patente Internacional O 94/13788; y el Número de Solicitud de Patente Internacional WO 93/24641, las descripciones completas de que se incorporan aquí como referencia. Un método ejemplificante para generar un vector AAV recombinante de la invención se describe en el Ejemplo 7 después.

La capacidad de siARN que contiene una secuencia objetivo determinada para causar la degradación regulada por el ARNi del ARNm con especificidad de objetivo puede ser evaluada usando métodos convencionales para medir los niveles de ARN o proteína en células. Por ejemplo, siARN puede administrarse a células cultivadas, y los niveles del ARNm con especificidad de objetivo pueden cuantificarse por Northern blot o métodos de transferencia en mancha, o por RT-PCR cuantitativo. Alternativamente, los niveles de VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR proteína de receptor en las células cultivadas pueden cuantificarse por ELISA o Western blot (transferencia Western) . Un sistema de cultivo celular adecuado para medir el efecto de presente siAR en ARNm con especificidad de objetivo o niveles protéicos se describe en el Ejemplo 1 después.

La degradación regulada por el ARNi del ARNm con especificidad de objetivo por siARN que contiene una secuencia objetivo determinada también puede ser evaluada con modelos experimentales en animal de la neovascularización, como el ROP o modelos de ratón CNV. Por ejemplo, las áreas de la neovascularización en un ROP o ratón CNV pueden cuantificarse antes y después de la administración de siARN y, en algunas modalidades, comparado con un animal no tratado. Una reducción de las áreas de neovascularización en estos modelos mediante la administración de siARN indica, en algunas modalidades, la regulación lentificadora del ARNm con especificidad de objetivo (ver el Ejemplo 6 después) .

Como se menciona anteriormente, siARN tiene capacidad de la acción selectiva y causar la degradación regulada por el ARNi de VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR ARNm, o formas de empalme alternativas, mutantes o cognados de lo mismo, preferentemente VEGF, y VEGF más preferentemente de humano. La degradación del ARNm con especificidad de objetivo por presente siARN reduce la producción de un producto génico funcional del VEGF y sus isoformas así como Flt-1 o Flk-l/KDR genes. Así, otra modalidad de la presente invención proporciona un método de inhibir la expresión de VEGF y sus isoformas, como el VEGF121 (SEQ ID NO: 2), VEGF165 (SEQ ID NO: 3), y VEGF189 (SEQ ID NO: 4), VEGF206 (SEQ ID NO: 5; Número de acceso de GenBank CS245579), VEGF183 (Número de acceso de GenBank AJ010438) , VEGF148 (Número de acceso de GenBank AF091352), y/o VEGF145 (Número de acceso de GenBank CS245578), así como Flt-1 o Flk-l/KDR en un paciente, que comprende la administración de una cantidad efectiva de siARN al paciente, el que el ARNm con especificidad de objetivo es degradado. Como los productos del VEGF y sus isoformas así como Flt-1 y Flk-l/KDR los genes se requieren para iniciar y mantener la angiogénesis , otra modalidad de la presente invención proporciona un método de inhibir la angiogénesis en un paciente por la degradación regulada por el ARNi del ARNm con especificidad de objetivo por presente siARN.

La degradación regulada por el ARNi del ARNm con especificidad de objetivo puede detectarse midiendo niveles del ARNm con especificidad de objetivo o proteína en las células de un paciente, usando métodos convencionales para aislar y cuantificar el ARNm o la proteína como se describe antes.

La inhibición de la angiogénesis puede ser evaluada midiendo directamente el progreso de la angiogénesis patógena o no patógena en un paciente; por ejemplo, observando el tamaño de un área neovascularizada antes y después de tratamiento con siAR . Una inhibición de angiogénesis se indica si el tamaño del área neovascularizada se queda el mismo o se reduce. Los métodos para observar y medir el tamaño de áreas neovascularizadas en un paciente se incluyen dentro de la habilidad en la técnica; por ejemplo, las áreas de la neovascularización de coroide pueden observarse, por ejemplo, por la angiografía de fluoresceína.

La inhibición de la angiogénesis también puede deducirse a través de la observación de un cambio o inversión en una condición patógena asociada con la angiogénesis. Por ejemplo, en ARMD, una disminución, parada o inversión de la pérdida de visión indica una inhibición de angiogénesis en la coroide. Para tumores, una disminución, parada o la inversión del crecimiento tumoral, o una disminución o la parada de la metástasis tumoral, indica una inhibición de angiogénesis a o cerca del sitio tumoral. La inhibición de la angiogénesis no patógena también puede deducirse de, por ejemplo, pérdida gorda o una reducción de niveles de colesterol mediante la administración de siARN.

Se entiende que siARN puede degradar el ARNm con especificidad de objetivo (y así inhibir la angiogénesis) en cantidades subestequiométricas . Sin desear ser ligado por cualquier teoría, se piensa esto siARN causa la degradación del ARNm con especificidad de objetivo en una manera catalítica. Así, comparado con terapias antiangiogénicas convencionales, siARN considerablemente menos tiene que administrarse a o cerca del sitio de neovascularización para tener un efecto terapéutico.

Un experto en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad efectiva de siARN para administrarse a un paciente determinado, teniendo en cuenta factores, como el tamaño y el peso del paciente; el grado de la neovascularización o penetración de enfermedad; la edad, salud y sexo del paciente; la ruta de administración; y si la administración es localizada o sistémica. En términos generales, una cantidad efectiva de siARN comprende una concentración intercelular a o cerca del sitio de neovascularización de aproximadamente 1 nanomolar (nM) hasta aproximadamente ?????, preferentemente de aproximadamente 2nM hasta aproximadamente 50n , más preferentemente de aproximadamente 2.5nM hasta aproximadamente. ????. Se contempla que cantidades mayores o menores de siARN puede administrarse.

Los métodos actuales poderse usar para inhibir la angiogénesis que es no patógeno; es decir, la angiogénesis que resulta a partir de procesos normales en el paciente. Los ejemplos de la angiogénesis no patógena incluyen neovascularización endometrial , y procesos implicados en la producción de tejidos grasos o colesterol. Así, la invención proporciona un método a inhibir la angiogénesis no patógena, p.ej, a controlar el peso o promover la pérdida gorda, para reducir niveles de colesterol, o como un abortivo.

Los métodos actuales también pueden inhibir la angiogénesis que se asocia con una enfermedad angiogénica; es decir, una enfermedad donde la patogenicidad se asocia con la angiogénesis inadecuada o incontrolada. Por ejemplo, la mayor parte de tumores sólidos cancerosos generan un suministro de sangre adecuado para ellos induciendo la angiogénesis en y alrededor del sitio tumoral . Esta angiogénesis inducida por tumor a menudo se requiere para el crecimiento tumoral, y también permite que células metastásicas ingresen en la corriente sanguínea.

Otras enfermedades angiogénicas incluyen la retinopatía diabética, degeneración vascular relacionada con la edad (ARMD) , psoriasis, artritis reumatoide y otras enfermedades inflamatorias. Estas enfermedades se caracterizan por la destrucción de tejido normal por vasos sanguíneos recién conformados en el área de neovascularización. Por ejemplo, en ARMD, la coroide es invadida y destruida por tubos capilares. La destrucción activada por la angiogénesis de la coroide en ARMD finalmente da como resultado a la ceguera parcial o llena .

Preferentemente, siAR se utiliza inhiben el crecimiento o la metástasis de tumores sólidos asociados con cánceres; por ejemplo cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer hepático, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiple; cáncer dérmico (p.ej, melanoma) , linfomas y cáncer de sangre.

Más preferentemente, siARN se utiliza la inhibición neovascularización coroidea en la degeneración vascular relacionada con la edad.

Para tratar enfermedades angiogénicas , siARN puede administrado a un paciente combinado con un agente farmacéutico que es diferente de presente siARN. Alternativamente, siARN puede administrarse a un paciente combinado con otro método terapéutico diseñado para tratar la enfermedad angiogénica. Por ejemplo, siARN puede administrarse combinado con métodos terapéuticos actualmente empleados para tratar cáncer o prevenir la metástasis tumoral (p.ej, terapia de radiación, quimioterapia, y cirugía). Para tratar tumores, siARN es preferentemente administrado a un paciente combinado con la terapia de radiación, o combinado con agentes quimioterapéuticos , como cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, adriamicina, daunorubicina o tamoxifeno.

En los métodos actuales, presente siARN puede administrarse al paciente como siARN desnudo, junto con un reactivo de administración, o como un vector plásmido o viral recombinante que expresa para siAR .

Los reactivos de administración adecuados para la administración junto con presente siARN incluyen, entre otros, el Mirus Transit TKO reactivo lipofílico; lipofectina; lipofectamina; celfectina; o policationes (p.ej, polilisina) , o liposomas. En algunas modalidades la administración 'el reactivo es Ribojuice (Novagen) , un reactivo de transfección de siARN, que comprende amina y reactivos con base lipidíeos. Un reactivo de administración preferido es un liposoma. En algunas modalidades, siARN se administra sin un agente de administración liposomal.

Los liposomas pueden ayudar en la administración de siARN a un tejido particular, como el tejido retinal o tumoral, y también pueden aumentar la semivida de sangre de siARN. Los liposomas adecuados para usarlos en la invención se forman de lípidos convencionales que forman la vesícula, que generalmente incluyen fosfolípidos neutros o negativamente cargados y un esterol, como el colesterol. La selección de lípidos es generalmente guiada por la consideración de factores, como el tamaño de liposoma deseado y la semivida de los liposomas en el flujo sanguíneo. Una variedad de métodos se conoce para preparar liposomas, por ejemplo como se describe en el Szoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467; and U.S. Pat. Nos. 4,235,871, 4,501,728, 4,837,028, y 5,019,369, las descripciones completas de que se incorporan aquí como referencia.

Preferentemente, los liposomas que encapsulan presente siARN comprenden una molécula de ligando que puede apuntar con acción selectiva hacia el liposoma a una célula particular o tejido a o cerca del sitio de angiogénesis. Los ligandos que se unen con receptores frecuentes en células endoteliales tumorales o vasculares, como anticuerpos monoclónicos que se unen con antígenos tumorales o antígenos de superficie de célula endotelial, se prefieren.

Particularmente preferentemente, los liposomas que encapsulan presente SÍARN se modifican para evitar la depuración por el macrofago mononuclear y sistemas reticuloendoteliales , por ejemplo por tener porciones de inhibición de la opsonización unidas a la superficie de la estructura. En una modalidad, un liposoma de la invención puede comprender tanto porciones de inhibición de la opsonización como un ligando.

Las porciones que inhiben la opsonización para usarlos para preparar los liposomas de la invención son los polímeros hidrofílicos por lo común mayores que se unen con la membrana de liposoma. Como se utiliza aquí, una porción de inhibición de opsonización es "ligada" a una membrana de liposoma cuando es químicamente o físicamente unida a la membrana, p.ej, por la intercalación de una ancla liposoluble en la membrana sí mismo, o ligando directamente a grupos activos de lípidos de la membrana. Estos polímeros hidrofílieos que inhiben la opsonización forman una capa de superficie protectora que considerablemente disminuye la absorción de los liposomas por el sistema de monocito del macrofago (" MS") y sistema reticuloendotelial ("RES"); p.ej, como se describe en la Patente Estadounidense Número el 4 , 920 , 016 , la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia. Los liposomas modificados con porciones de inhibición de la opsonización así permanecen en la circulación mucho más larga que liposomas no modificados. Por esta razón, los liposomas son a veces llamados liposomas "de cautela": Los liposomas de cautela se conocen para acumularse en tejidos alimentados por la microvasculatura porosa o "parcial". Así, el tejido con especificidad de objetivo caracterizado por los defectos de microvasculatura, tumores por ejemplo sólidos, acumulará eficazmente estos liposomas; ver Gabizon, et al. ( 1988 ) , P.N.A.S., EE. UU, 18 : 6949-53 . Además, la absorción reducida por el RES disminuye la toxicidad de liposomas de cautela previniendo la acumulación significativa en el hígado y bazo. Así, los liposomas de la invención que se modifican con porciones de inhibición de la opsonización pueden administrar presente siARN a células tumorales .

Las porciones de inhibición de opsonización adecuadas para modificar liposomas son polímeros preferentemente hidrosolubles con un peso molecular promedio numérico de aproximadamente 500 hasta aproximadamente 40 000 daltons, y más preferentemente de aproximadamente' 2 000 hasta aproximadamente 20 000 daltons. Los polímeros incluyen el polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicol (PPG) derivados; p.ej, PEG de metoxilo o PPG, y PEG o estearato PPG; · polímeros sintéticos, como poliacrilamida o poli N-vinil pirrolidona; poliamidoaminas lineales, ramificadas, o dendriméricas ; poliácidos acrílieos; los polialcoholes , p.ej, el alcohol polivinílico y el polixilitol al cual carboxílico o grupos amino se enlazan químicamente, así como gangliosidos, como el gangliósido GMl . Los copolímeros de PEG, PEG de metoxilo, o metoxilo PPG, o derivados de lo mismo, también son adecuados. Además, el polímero de inhibición de opsonización puede ser un copolímero en bloque de PEG y un poliaminoácido, polisacárido, poliamidoamina, polietilenamina, o polinucleótido . Los polímeros de inhibición de opsonización también pueden ser polisacáridos naturales que contienen aminoácidos o ácidos carboxílieos , p.ej, ácido galacturónico, ácido glucurónico, ácido manurónico, ácido hialurónico, ácido péctico, ácido neuramínico, ácido algínico, carragenina; polisacáridos aminados u oligosacáridos (lineal o ramificado) ; o los polisacáridos u oligosacáridos carboxilados , p.ej, reaccionaron con derivados de ácidos carbónicos con la unión de resultado de grupos carbox licos .

Preferentemente, la porción que inhibe la opsonización es PEG, PPG, o derivados de lo mismo. Los liposomas modificados con PEG o derivados de PEG son a veces llamados "Liposomas pegilados . " La porción de inhibición de opsonización puede unirse con la membrana de liposoma por cualquiera de diversos métodos bien conocidos. Por ejemplo, éster de N-hidroxisuccinimida de PEG puede unirse con una ancla liposoluble de fosfatidiletanolamina, y luego ligar en una membrana. De forma similar, un polímero de dextrán puede ser derivatizado con una ancla liposoluble de estearilamina vía la aminación reductiva usando Na (CN) BH3 y una mezcla solvente, como tetrahidrofurano y agua en un 30:12 proporción a 60 °C.

Hacen una exposición de motivos de plásmidos recombinantes que expresan para siAR antes. Los plásmidos recombinantes también pueden administrarse directamente o junto con un reactivo de administración adecuado, incluyendo el Mirus Transit LTl reactivo lipofílico; lipofectina; lipofectamina; celfectina; policationes (p.ej, polilisina) o liposomas . Los vectores virales recombinantes que expresan para siAR también son hechos una exposición de motivos antes, y los métodos para administrar los vectores a un área de neovascularizacion en un paciente se incluyen dentro de la habilidad en la técnica.

SiARN puede administrarse al paciente por cualesquiera medios adecuados para administrar siARN a las células del tejido a o cerca del área de neovascularizacion. Por ejemplo, siARN puede administrarse por arma génico, electroporación, o por otras rutas de administración parenterales o entéricas adecuadas .

Las rutas de administración entéricas adecuadas incluyen la administración oral, rectal, o intranasal.

Las rutas de administración parenteral adecuadas incluyen la administración intravascular (inyección en bolo p.ej intravenosa, infusión intravenosa, inyección en bolo intraarterial , infusión intraarterial e instilación de catéter en la vasculatura) ; peri-y administración intratisular (p.ej, inyección peri-tumoral e intratumoral , inyección intraretinal o inyección subretinal) ; inyección subcutánea o deposición que incluye infusión subcutánea (tal como por bombas osmóticas); directo (p.ej, tópico) solicitud al área a o cerca del sitio de neovascularización, por ejemplo por un catéter u otro dispositivo de colocación (p.ej, un comprimido córneo o un supositorio, cuentagotas, o un implante que comprende un material poroso, no poroso, o gelatinoso); e inhalación. Los dispositivos de colocación adecuados incluyen los implantes oculares descritos en Patentes de EE.UU. Números 5 , 902 , 598 y 6 , 375 , 972 , y los implantes oculares biodegradables descritos en la Patente de EE.UU. Ningún 6 , 331 , 313 , las descripciones completas de que se incorporen aquí como referencia. Los implantes oculares están disponibles del Control Delivery Systems, Inc. (Waterto n, A) y Oculex Pharmaceuticals , Inc. (Sunnyvale, California) .

En una modalidad preferida, las inyecciones o las infusiones de siARN se les proporcionan a o cerca del sitio de neovascularización. Más preferentemente, siARN se administra tópicamente al ojo, p.ej en líquido o forma de gel al párpado inferior o fondo de saco de la conjuntiva, como se incluye dentro de la habilidad en la técnica (ver, p.ej, el Acheampong AA et al, 2002 , Drug Metabol. and Disposition 30 : 421-429 , la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia) .

Por lo común, siARN se administra tópicamente al ojo en cantidades de aproximadamente 5 microlitros hasta aproximadamente 75 microlitros, por ejemplo de aproximadamente 7 microlitros hasta aproximadamente 50 microlitros, preferentemente de aproximadamente 10 microlitros hasta aproximadamente 30 microlitros. Se entiende que la instilación tópica en el ojo de siAR en volúmenes mayores que 75 microlitros puede dar como resultado la pérdida de siARN del ojo a través de derramamiento y avenamiento. Así, es preferible administrar elevada concentración de siARN (p.ej, 100-lOOOnM) en un volumen tan pequeño como sea posible.

Una ruta de administración parenteral particularmente preferida es la administración intraocular. Se entiende que la administración intraocular de presente siARN puede llevarse a cabo por la inyección o directo (p.ej, tópico) administración al ojo, mientras la ruta de administración permite que siARN ingrese en el ojo. Además de las rutas de administración tópicas al ojo descrito antes, las rutas de administración intraoculares adecuadas incluyen la administración intravítrea, intraretinal, subretinal, subtenoniana, peri-orbital y retro-orbital, transcorneal y transescleral'. Las rutas de administración intraoculares se incluyen dentro de la habilidad en la técnica; ver, p.ej, el Acheampong AA et al, 2002, supra; y Bennett et al. (1996), Hum. Gene Ther. EL 7: 1763-1769 y Ambati J et al., 2002, Progress in Retinal and Eye Res. 21: 145-151, las descripciones completas de que se incorporan aquí como referencia. En otra modalidad preferida, siARN se administra por la inyección intravítrea.

SiARN puede administrarse en una dosis única o en dosis múltiples. Donde la administración de siAR es por la infusión, la infusión puede ser una dosis prolongada individual o puede administrarse por infusiones múltiples. La inyección del agente directamente en el tejido es a o cerca del sitio de neovascularización preferida. Inyecciones múltiples del agente en el tejido a o cerca del sitio de neovascularización son particularmente preferidas.

Un experto en la técnica también puede determinar fácilmente una pauta posológica adecuada para administrar siARN a un paciente determinado. Por ejemplo, siARN puede administrarse al paciente una vez, tal como por una inyección individual o deposición a o cerca del sitio de neovascularización. Alternativamente, siARN puede administrarse a períodos de tiempo múltiples sometidos diariamente o cada semana. Por ejemplo, siARN puede administrarse a un paciente una vez cada semana durante un período de aproximadamente tres hasta aproximadamente veintiocho semanas, y alternativamente de aproximadamente siete hasta aproximadamente diez semanas . En una cierta pauta posológica, siARN se inyecta a o cerca del sitio de neovascularización (p.ej, intravitrealmente) una vez por semana durante siete semanas . Se entiende que las administraciones periódicas de siARN durante un tiempo indefinido pueden ser necesarias para pacientes padeciendo de una enfermedad de neovascularización crónica, tal como humedecido ARMD o retinopatía diabética.

Donde una pauta posologica comprende administraciones múltiples, se entiende que la cantidad efectiva de siARN administrado al paciente puede comprender la cantidad total de siARN administrado sobre la pauta posologica completa.

SiARN es preferentemente formulado como composiciones farmacéuticas antes de la administración a un paciente, según métodos conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se caracterizan como al menos estéril y libre de pirógenos. Como se utiliza aquí, "las formulaciones farmacéuticas" incluyen formulaciones para el uso de humano y veterinario. Los métodos para preparar composiciones farmacéuticas de la invención se incluyen dentro de la habilidad en la técnica, por ejemplo como se describe en el Remington's Pharmaceutical Science, 17va ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985), la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia.

En una modalidad, las formulaciones farmacéuticas comprenden siARN (p.ej, 0.1 al 90 % en peso), o una sal fisiológicamente aceptable de lo mismo, mezclada con un medio portador fisiológicamente aceptable. Los medios portadores preferidos fisiológicamente aceptables son el agua, agua amortiguado, soluciones salinas (p.ej, solución salina normal o equilibró soluciones salinas, como las soluciones de sal equilibradas de Hank o Earle) , solución salina del 0.4 %, glicina del 0.3 %, ácido hialurónico y lo similar.

Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender excipientes farmacéuticos convencionales y/o aditivos. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen estabilizadores, antioxidantes, agentes de regulación de osmolalidad, amortiguadores, y agentes reguladores del pH. Los aditivos adecuados incluyen amortiguadores fisiológicamente biocompatibles (p.ej, clorhidrato de trometamina) , adiciones de quelantes (el como, por e emplo, D PA o DTPA-bisamida) o complejos de quelato de calcio (en cuanto al calcio de ejemplo DTPA, CaNaDTPA-bisamida) , o, opcionalmente, adiciones de calcio o sales sódicas (por ejemplo, cloruro de calcio, ascorbato de calcio, gluconato de calcio o lactato de calcio) . Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden ser envasadas para usarlos en la forma líquida, o pueden liofilizarse.

Para la administración tópica al ojo, los reactivos de administración intraoculares convencionales pueden usarse. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la invención para la administración intraocular tópica pueden comprender soluciones salinas como se describe antes, potenciadores de penetración córneos, partículas insolubles, vaselina u otros ungüentos basados en el gel, polímeros que experimentan a un aumento de viscosidad mediante instilación en el ojo, o polímeros de mucoadhesivo . Preferentemente, los aumentos de reactivo de administración intraoculares penetración córnea, o prolonga la retención preocular de siAR a través de efectos de viscosidad o estableciendo interacciones fisicoquímicas con la capa de mucina que cubre el epitelio córneo.

Las partículas insolubles adecuadas para la administración intraocular tópica incluyen las partículas de fosfato de calcio descritas en la Patente Estadounidense Número el 6,355,271 de la Campana et al., la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia. Los polímeros adecuados que experimentan a un aumento de viscosidad mediante instilación en el ojo incluyen copolímeros en bloque de polietilenpolioxipropileno, como el poloxámero 407 (p.ej, a una concentración del 25 %) , acetoftalato de celulosa (p.ej, a una concentración del 30 %) , o una goma gellan con bajo contenido de acetilo, como Gelrite ® (disponible de CP Kelco, Wilmington, DE). Los polímeros de mucoadhesivo adecuados incluyen hidrocoloides con grupos funcionales hidrofílieos múltiples, como carboxilo, hidroxilo, amida y/o grupos de sulfato; por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, poliácido acrílico, polietilenglicoles de elevado peso molecular (p.ej,> 200 000 peso molecular promedio numérico), dextránes, ácido hialurónico, poliácido galacturónico, y xilocán. Los potenciadores de penetración córneos adecuados incluyen ciclodextrinas, cloruro de benzalconio, éter de laurilo de glicol de polioxietileno (p.ej, Brij ® 35), éter de estearilo de glicol de polioxietileno (p.ej, Brij ® 78), glicol de polioxietileno oleil éter (p.ej, Brij ® 98), ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , digitonina, taurocolato de sodio, saponinas y aceite de ricino polioxietilado, como el Cremaphor EL .

Para composiciones sólidas, los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden usarse; por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y lo similar.

Por ejemplo, una composición farmacéutica sólida para la administración oral puede comprender a cualquier de los portadores y excipientes enumerados antes y el 10-95 %, preferentemente el 25 el %-75 %, de uno o más siARN. Una composición farmacéutica para el aerosol la administración (de inhalación) puede comprender el 0.01-20 % en peso, preferentemente el 1 el %-10 % en peso, de uno o más siARN encapsulado en un liposoma como se describe antes, y propelente. Un portador también puede incluirse según se prefiera; p.ej, lecitina para administración intranasal.

La invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1 - Transfección de siARN· e Inducción de Hipoxia In Vitro Diseño de siARN - Una secuencia 19nt ubicada a 329nt del extremo 5 ' del ARNm VEGF de humano se selecciona como una secuencia objetivo: AAACCTCACCAAGGCCAGCAC (SEQ ID NO: 51).

Para asegurar de que no está contenido en el ARNm de ningún otro gen, esta secuencia objetivo es entrada en el motor de búsqueda de BLAST proporcionado por NCBI . El uso del algoritmo de BLAST se describe en Altschul et al. (1990), J. Mol. Biol. 215: 403-410 y Altschul et al. (1997), Ácidos nucleicos Res. 25: 3389-3402, las descripciones de que se incorporan aquí como referencia en su totalidad. Como ningún otro ARNm se encuentra que contuvo la secuencia objetivo, un dúplex de siARN se sintetiza para apuntar con acción selectiva hacia esta secuencia (Dharmacon Research, Inc., Lafayette, CO) .

El dúplex de siARN tiene las siguientes hebras sentido y antisentido : Sentido : 5' -accucaccaaggccagcacTT-3 ' (SEQ ID NO: 77).

Antisentido : 5 ' -gugcuggccuuggugagguTT-3 ' (SEQ ID NO: 78).

Conjuntamente, siARN hebras sentido y antisentido conformadas 19 siARN bicatenario nt con TT salientes 3' (mostrado en negrito) en cada hebra. Este siARN es el "Candidato conocido como 5" o, "Cand5". Otro siARN que apuntan con acción selectiva hacia el ARNm VEGF de humano es diseñado y analizado como se describe para Cand5 (bevasiranib) .

SiARN que apunta con acción selectiva hacia la siguiente secuencia en la proteína verde fluorescente (GFP) ARNm se usa como un control no específico: GGCTACGTCCAGCGCACC (SEQ ID NO: 79). SiARN es adquirido de Dharmacon (Lafayette, CO) .

Transfección de siARN e Inducción de Hipoxia In Vitro -procesos de Célula humana (293; Hela y ARPE19) son por separado sembrados en placas de 24 pocilios en 250 microlitros del medio DMEM completo un día antes de la transfección; de modo que las células sean el -50 % confluentes en el período de tiempo de transfección. Las células son transíectadas con 2.5nM siARN de Cand5, y con ningún siARN o con 2.5nM siARN no específico (apuntando con acción selectiva hacia GFP) como controles . Las transíecciones se llevan a cabo en todas las líneas celulares con el reactivo "de Transit TKO Transíection" , como recomendado por el fabricante (Mirus) .

Veinticuatro horas después de la transfección, la hipoxia es inducida en las células mediante la adición del mesilato de deferoxamina a una concentración final de 130 micromuela en cada pozo. Posttransfección de veinticuatro horas, el medio de cultivo celular se elimina de todos los pozos, y un ELISA VEGF de humano (R&D sistemas, Minneapolis, Minnesota) se lleva a cabo en el medio de cultivo como se describe en el humano de Quantikine VEGF protocolo de ELISA disponible del fabricante, la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia.

Como se puede observar en la Figura 1, la degradación de ARNi inducida por siARN Cand5 considerablemente reduce la concentración de VEGF producido por células 293 hipóxicas y células HeLa. No hay esencialmente ninguna diferencia en cantidad de VEGF producido por células hipóxicas sometidas a tratamiento con ningún siARN o con el control de siARN no específico. Los resultados similares también son observados con células ARPE19 de humano sometidas a tratamiento en las mismas condiciones. Así, la interferencia de ARN con siARN VEGF-con-especificidad-de-objetivo interrumpe regulación por incremento patógena de VEGF en el humano células cultivadas in vitro.

El experimento detallado antes se repite en células de NIH 3T3 de ratón usando siARN VEGF de ratón y específico (ver el Ejemplo 6 después), y la producción VEGF se cuantifica con VEGF de ratón ELISA (R&D sistemas, Minneapolis, Minnesota) como se describe en el ratón de Quantikine VEGF protocolo de ELISA disponible del fabricante, la descripción completa de que se incorpora aquí como referencia. Los resultados similares a los mencionados en la Figura 1 para los procesos de célula humana se obtienen.

Ejemplo 2 - Efecto de Concentración de siARN Cada vez mayor en Producción VEGF en Células Cultivadas de Humano El experimento detallado en el Ejemplo 1 se repite con 293 de humano, HeLa y células ARPE19 usando un intervalo de concentraciones de siARN de lOhM a 50nM. La capacidad de siARN Cand5 de lentificar la producción VEGF mayor moderadamente hasta aproximadamente 13nM siARN, pero un efecto de meseta se observa antes de esta concentración.

Estos resultados destacan la naturaleza catalítica de la degradación de ARNi regulada por siARN del ARNm, ya que el efecto de meseta parece reflejar la producción VEGF de las pocas células no transíectadas con siARN. Para la mayoría de células que tenidas sido transfectado con siARN, la mayor producción de ARNm VEGF inducida por la hipoxia es superada por la degradación inducida por siARN del ARNm con especificidad de objetivo a concentraciones de siARN mayores que sobre 13nM.

Ejemplo 3 - Especificidad de Acción selectiva de siARN Los fibroblastos de ratón de NIH 3T3 se cultivan en placas de 24 pocilios en condicionés convencionales, de modo que las células sean el -50 % confluentes un día antes de la transíección . SiARN VEGF de humano Cand5 es transfectado en unos fibroblastos de ratón de NIH 3T3 como en el Ejemplo 1. La hipoxia es inducida entonces en las células transíectadas , y murino las concentraciones de VEGF se cuantifican por ELISA como en el Ejemplo 1.

La secuencia con especificidad de objetivo por siARN VEGF de humano Cand5 diferencia del murino el ARNm de VEGF por un nucleótido. Como se puede observar en la Figura 2, siARN VEGF de humano no tiene afectan en la capacidad de las células de ratón de regular aceleradamente VEGF de ratón después de la hipoxia. Estos resultados muestran que siARN degradación de ARNi inducida es especifico para la secuencia para dentro de una resolución nucleotídica .

Ejemplo 4 - administración in Vivo de siARN a Murino Pigmento Retinal Células Epiteliales VEGF es regulado aceleradamente en el pigmento retinal las células (RPE) epiteliales de los pacientes humanos con la degeneración vascular relacionada con la edad (ARMD) . Para mostrar que siARN funcional puede administrarse a células RPE in vivo, GFP se expresa en retinas de ratón con un adenovirus recombinante, y la expresión GFP se silencia con siARN. El experimento se lleva a cabo como sigue.

Un ojo de cada uno de cinco ratones de adulto C57/Black6 (Laboratorios de Jackson, Puerto de Barra, Maine) se inyecta subretinalmente como se describe en Bennett et al. (1996), supra., con una mezcla que contiene -1x108 partículas de adenovirus que contiene eGFP activado por el promotor CMV y 20 picomoles de siAR que apunta con acción selectiva hacia eGFP conjugado con tránsito reactivo de TKO (Mirus) .

Como el control positivo, los ojos contralateráles se inyectan con una mezcla que contiene -1x108 las partículas del adenovirus que contiene eGFP activado por el promotor CMV y 20 picomoles de siARN VEGF de humano con acción selectiva hacia el objetivo conjugado con el tránsito reactivo de TKO (Mirus) . La expresión de GFP se detecta por la oftalmoscopía de fondo 48 horas y 60 horas después de la inyección. Los animales son sacrificados a 48 horas o postinyección de 60 horas. Los ojos son enucleados y fijados en paraformaldehído del 4 %, y se preparan ya que la llanura monta o se procesa en 10 micrones cryosections para la microscopía fluorescente.

Ninguna fluorescencia GFP es detectable por la oftalmoscopía en los ojos que recibieron siARN con especificidad de objetivo al ARNm GFP en 4 de 5 ratones, mientras que la fluorescencia GFP es detectable en el ojo contralateral que recibió siARN de control no específico. Un soporte plano representativo analizado por la microscopía de fluorescencia mostró una falta de la fluorescencia GFP en el ojo que recibió siARN GFP, comparando con un ojo que recibió siARN de control no específico. Cryosections de otra retina mostró que el adenovirus recombinante eficazmente apunta con acción selectiva hacia las células RPE, y cuando el adenovirus es acompañado por siARN con especificidad de objetivo al ARNm GFP, la expresión del transgen GFP se detiene .

Mientras hay alguna fluorescencia GFP detectable por la microscopía de fluorescencia en ojos que recibieron siARN con especificidad de objetivo al ARNm GFP, la fluorescencia es enormemente suprimida comparando con controles que recibieron siARN no específico. Estos datos demuestran que siARN funcional puede administrarse in vivo a células RPE.

Ejemplo 5 - Expresión in Vivo y Degradación de ARNi inducida por siARN de VEGF humano en Retinas de Murino A fin de demostrar que siARN con especificidad de objetivo a VEGF funcionó in vivo, un cásete de expresión VEGF de humano exógeno se administra a células de RPE de ratón vía un adenovirus por la inyección subretinal, como en el Ejemplo 4. Un ojo siARN Cand5 recibido, y el ojo contralateral siARN recibido con especificidad de objetivo a ARNm GFP. Los animales son sacrificados postinyección de 60 horas, y los ojos inyectados se eliminan y se cierran a presión congelados en N2 líquido después de la enucleación. Los ojos son homogeneizados entonces en el amortiguador de lisis, y dan un total la proteína se cuantifica usando un patrón ensayo de proteína de Bradford (Roche, Alemania) . Las muestras son normalizadas para la proteína total antes de realizar ensayos de evaluación para VEGF de humano por ELISA como se describe en el Ej emplo 1.

La expresión de VEGF es algo variable del animal al animal. La variabilidad de niveles VEGF pozo correlacionado a los observados en los experimentos GFP del Ejemplo 4, y puede ser atribuida a un poco de error de la inyección a la inyección, y. la capacidad diferencial del adenovirus a la administración el gen objetivo en cada animal. Sin embargo, hay una atenuación significativa de la expresión VEGF en cada ojo que recibió siAR VEGF, comparando con los ojos que reciben siARN de control no específico (Figura 4) . Estos datos indican que siARN Cand5 es potente y efectivo en el silenciamiento de la expresión de VEGF de humano en el murino células de RPE in vivo.

Ejemplo 6 - Inhibición de Neovascularización Coroidea en el Modelo CNV de ratón Hay pruebas que la neovascularización coroidea en ARMD es debido a regulación por incremento de VEGF en las células RPE. Esta condición patológica de humano puede ser modelada en el ratón usando un láser para incinerar una mancha en la retina ( "fotocoagulación de láser" o "inducción de láser"). Durante el proceso de curación, se cree que VEGF es regulado aceleradamente en las células RPE de la región incinerada, dando como resultado a la nueva vascularización de la coroide. Este modelo se llama la neovascularización coroidea de ratón ("CNV") modelo.

Para el rescate del modelo de CNV de ratón, siARN de ratón es diseñado que incorporó un cambio nucleotídico de siARN "Cand5" de humano del Ejemplo 1. SiARN de ratón ARNm de VEGF de ratón específicamente con especificidad de objetivo en la secuencia AAACCUCACCAAAGCCAGCAC (SEQ ID NO: 80). Otro siARN lo que apunta con acción selectiva hacia VEGF de ratón también es diseñado y analizado. SiARN GFP usado como un control no específico en el Ejemplo 1 se usa también como un control no específico aquí.

Veinticuatro horas después de la inducción de láser, un ojo de cada uno de once ratones de adulto C57/Black6 (Laboratorios de Jackson, Puerto de Barra, aine) se inyecta subretinalmente con una mezcla que contiene -1x108 partículas del adenovirus que contiene LacZ activado por el promotor CMV y 20 picomoles de siARN VEGF de ratón con acción selectiva hacia el objetivo conjugado con el tránsito reactivo de TKO (Mirus) , como en el Ejemplo 4. Como un control, ojos contralaterales recibidos una mezcla que contiene -1x108 partículas de adenovirus que contiene LacZ activado por el promotor CMV y 20 picomoles de siARN que apunta con acción selectiva hacia GFP conjugado con tránsito reactivo de TKO (Mirus) .

Quincena después del tratamiento de láser, los ratones son perfundidos con la fluoresceína y el área de neovascularización se cuantifica alrededor de las manchas de quemadura. Las áreas de las manchas de quemadura en el ojo contralateral se usan como un control. El sitio de neovascularización alrededor de la quemadura se mancha en animales que recibieron siARN VEGF de ratón con acción selectiva hacia el objetivo es, por término medio, 1/4 el área de las áreas de control. Éstos apoyo informático el uso de siARN VEGF-dirigido (también llamado "anti-VEGF siRNA") para terapia de ARMD.

Ejemplo 7 - Generación de un Vector Viral Adeno-asociado para Expresión de siARN Un plásmido "que actúa en CEI" para generar un vector AAV recombinante para administrar siARN se genera por el PCR la subclonación con base, esencialmente como se describe en Samulski R et al. (1987), supra. El plásmido de accuión al CEI se llama "pAAVsiRNA" .

El representante y los genes de corona de psub201 son sustituidos por las siguientes secuencias en este orden: una 19 secuencia codificadora de hebra de ARN homosentido nt en conexión operable con una secuencia de terminación polyT bajo el control de un promotor de ARN de humano U6, y una 19 secuencia codificadora de hebra de ARN antisentido nt en conexión operable con una secuencia de terminación polyT bajo el control de un promotor de ARN de humano U6. Una representación esquemática de pAAVsiRNA se les proporciona si Figura 5.

Un vector de siARN AAV recombinante se obtiene transíectando el pAAVsiRNA en células 293 de humano previamente infectadas por el adenovirus con El suprimido, como se describe en el Fisher KJ et al. (1996), supra. El representante AAV y las funciones de gorra se proporcionan por un plásmido que tramita pAAV/Ad como se describe en Samulski R et al. (1989), supra. Los lotes de producción del vector de siARN AAV recombinante son titulados según la cantidad de copias genómicas / mi, como se describe en el Fisher KJ et al. (1996), supra.

Ejemplo 8 - siARN dirigido al VEGF inhibie la Neovascularizacion Coroidea Experimental La capacidad de murino siARN VEGF-dirigido para inhibir la neovascularización coroidea inducida por el láser experimental (CNV) en ratones se analiza como sigue.

Las retinas de ratones C57BL/6 hembras adultos son el láser usar fotocoagulado un 810nm láser de diodo (75 um, 140 mw, 0.10 segundos) (OcuLight Seis; LIRIO Médico, Vista de Montaña, California) . Tres manchas de láser se aplican a ambos ojos de cada ratón. Treinta y seis horas después de la fotocoagulación de láser, siARN con especificidad de objetivo al ratón VEGF ( "mVEGFl . siRNA" ) se administra subretinalmente o intravitrealmente a un ojo de cada ratón. Para la inyección subretinal, siARN es conjugado con el Tránsito reactivo de transfección de TKO (Mirus) y mezclado con el adenovirus recombinante (rAdenovirus ) . Para la inyección intravitrea, siARN se administra en ausencia del reactivo de transfección y rAdenovirus. Ya que un control, los ojos contralaterales de cada ratón las inyecciones subretinales o intravítreas recibidas de las formulaciones idénticas con siARN con especificidad de objetivo a GFP ( "GFP1. siRNA" ) , no que tiene ninguna homología a VEGF de ratón: Quincena después del tratamiento de láser, todos los animales son perfundidos con el FITC-dextrán de elevado peso molecular, los soportes planos coroideos se preparan como se describe antes, y los soportes planos son fotografiados y analizados microscópicamente de una forma disimulada. El área de CNV en cada soporte plano se cuantifica con el software de Openlab ( Improvision, Boston, Massachusetts ) . Las áreas de media de CNV en ojos sometidos a tratamiento con mVEGFl . siRNA son considerablemente más pequeñas que aquellas áreas de ojos GFPl . siRNA-tratados para ambos subretinales (Figura 6A; P <0.003) e intravítreo (Figura 6B; P <0.04) administración.

En un segundo experimento, las retinas de ratones C57BL/6 hembras adultos son el láser fotocoagulado como se describe antes, y los animales se dividen en el control y analizan grupos. Un día después de la fotocoagulación de láser, la solución salina amortiguada con fosfato se administra intravitrealmente a los animales del grupo control, que son perfundidos con la fluoresceína del dextrán 14 días después del tratamiento de láser. Los soportes planos coroideos son preparados entonces y las áreas de CNV en cada soporte plano se cuantifican como antes.

Quincena después de la fotocoagulación de láser, el mVEGFl.siRNA se administra . por la inyección intravítrea en un ojo de cada ratón en el grupo de prueba. Los ojos contralaterales se inyectan con GFPl.siR A como un control. Los animales de grupo de prueba son perfundidos con la fluoresceína del dextrán de elevado peso molecular 21 días después . del tratamiento de láser. Los soportes planos coroideos son preparados entonces y las áreas de CNV en cada soporte plano se cuantifican, como antes.

En este último experimento, el anti-VEGF siRNA se administra durante el crecimiento CNV, a diferencia de antes del crecimiento de CNV, y así es más representativo de la condición de la presentación de pacientes humanos con AMD húmedo. Como se puede observar de la Figura 6, las áreas de media de CNV en ojos mVEGFl . siRNA-tratados son considerablemente más pequeñas que aquellas áreas cuantificadas en ojos GFPl . siRNA-tratados (Figura 6C; P <0.05). Las áreas de media de CNV en ojos mVEGFl . siRNA-tratados a día 21 y control ("PBS") ojos a día 14 no son considerablemente diferentes (Figura 6C; P=0.469).

Los resultados de estos experimentos indican que la degeneración vascular relacionada con la edad puede someterse a tratamiento con anti-VEGF siRNA.

Ejemplo 9 - Interferencia de AR in Vivo · de VEGF de humano Inducido por anti-VEGF siRNA en Murino Células de RPE La capacidad de siARN Cand5 de inducir el ARNi del VEGF in vivo con el tiempo es evaluada como sigue.

AAV.CM .VEGF, que expresa para VEGF de humano de un vector viral adeno-asociado, es generosamente proporcionado por el doctor A. Auricchio. AAV. CMV.VEGF se inyecta subretinalmente y bilateralmente en ojos de cinco ratones C57B1/6. Veintiocho días después de la inyección de AAV.CMV.VEGF, siARN de Cand5 se administra por la inyección intravítrea en un ojo y GFPl. siRNA de control se administra por la inyección intravítrea en el ojo contralateral de cada animal.

En día 0 (inyección de presiARN) , y a 6, 10 y 14 días después de la inyección de siARN, los ratones son sacrificados y los ojos son rápidamente congelados en el nitrógeno líquido después de la enucleación. Los ojos son homogeneizados entonces en el amortiguador de lisis (Roche, Basilea, Suiza) , y dan un total la proteína se cuantifica usando un ensayo de Bradford, como en el Ejemplo 5 antes. Dos ratones se usan para el 0 punto de día (n-2), y tres ratones cada uno se usa para los 6, 10 y 14 puntos de día (n=3) . Las muestras son normalizadas para la proteína total antes de realizar ensayos de evaluación para VEGF de humano por ELISA, según las recomendaciones del fabricante (R&D sistemas, Minneapolis, Minnesota) . El por ciento de VEGF (%VEGF) para cada ratón se calcula como la concentración de VEGF ( " [VEGF]") en el ojo inyectado con Cand5 dividido en [VEGF] en el ojo inyectado con GFPl.siRNA, multiplicado por 100.

Como se puede observar de Figura 7 , una inyección individual de Cand5 inducido una disminución regulada por el AR i en niveles VEGF aproximadamente del 70 % durante el día 6 inyección de postsiAR , con una reducción de producción VEGF aproximadamente del 35 % que sigue a través de al menos día 14 inyección de postsiARN. Estos resultados indican que siARN dirigido con especificidad de objetivo contra VEGF de humano tiene capacidad de inducir el ARNi del de humano VEGF in vivo durante un período de tiempo prolongado.

Ejemplo 10 - Interferencia de ARN in Vivo de VEGF en Monos con siARN Anti-VEGF Los objetivos de este estudio son determinar la seguridad y la eficacia de Cand5 cuando administrado por la inyección intravítrea individual a monos cynomolgus masculinos después de la inducción de CNV. Cand5 se administra en el artículo de vehículo control con monos cynomolgus masculinos sin tratamiento previo determinado en las siguientes concentraciones de dosis: 0 mg./ojos (control), 0.07 mg./ojos, 0.18 mg./ojos, 0.35 mg./ojos y, y 0.70 mg./ojos.

CNV es inducido por el tratamiento de láser a la mácula de ambos ojos de cada animal, y las dosis de Cand5 se les proporcionan poco después del tratamiento de láser. Los animales son evaluados para cambios de signos clínicos, peso corporal y condición ocular (exámenes oftálmicos extensos, electroretinopatía y tonometría) . La angiografía de fluoresceína se lleva a cabo y las muestras sanguíneas se recolectan, al extremo del estudio (Día 44) , todos los animales son sometidos a eutanasia y una autopsia gruesa completa se lleva a cabo. Los tejidos seleccionados se recolectan y conservado para la evaluación histopatologica.

Ningunos efectos (oculares) sistémicos o locales adversos de Cand5 se detectan cuando los monos se administran una inyección intravítrea individual en ambos ojos a dosis hasta 0.70 mg. / ojo después de la lesión de láser de la mácula y durante el desarrollo subsecuente de CNV.

Ejemplo 11 - Interferencia de ARN In Vitro de VEGF con siARN Anti-VEGF en células 293 de Riñon embrionario de Humano Células 293 de riñon embrionario de humano (obtenido de ATCC, Manassas, VA) son cultivadas en el Medio de Águila Modificado de Dulbecco (DMEM; obtenido de Cellgro, Herndon, VA) con suero fetal de bovino del 10 % (suero fetal de bovino; de JRH Biosciences, Lenexa, Kansas) y un reactivo de-antibiótico-antimycotic, usado para la prevención de contaminantes de crecimiento de cultivo celular (de Gibco, Carlsbad, California) . siARN se sintetizan con Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) . Las secuencias objetivo de siARN se muestran en la Tabla 2. SiARN adicional se usa en este estudio que apunta con acción selectiva hacia el gen de la proteína verde fluorescente potenciada (EGFP) como un control negativo .

Tabla 2 Nombre Contenido Sitio de Secuencia objetivo de GC Inicio 5 '-3' nucleotídico hVEGF#l 58 % 92 aaggaggagggcagaatca te (SEQ ID NO: 81) hVEGF#2 42 % 124 aagttcatggatgtctatc ag (SEQ ID NO: 47) hVEGF#3 58 % 162 aatcgagaccctggtggac at (SEQ ID NO: 48) hVEGF#4 42 % 301 aacatcaccatgcagatta tg (SEQ ID NO: 50) hVEGF#5 58 % 338 aaggccagcacataggaga ga (SEQ ID NO: 52) hVEGF#6 42 % 380 aatgtgaatgcagaccaaa ga (SEQ ID NO: 82) hVEGF#7 37 % 396 aaagaaagatagagcaaga ca (SEQ ID NO: 56) hVEGF#8 32 % 450 aaagcatttgtttgtacaa ga (SEQ ID NO: 83) hVEGF#9 42 % 467 aagatccgcagacgtgtaa at (SEQ ID NO: 84) hVEGF#10 53 % 498 aaacacacactcgcgttgc aa (SEQ ID NO : 85) Cand5 63 % 328 aaacctcaccaaggccagc ac (SEQ ID NO: 51) Transfección de siARN e Inducción de Hipoxia In Vitro. Células 293 de humano son cultivadas en placas de 24 pocilios a 37°C con C02 del 5 % durante la noche. Al día siguiente, las transfecciones se llevan a cabo cuando las células son aproximadamente del 50 el %-70 % confluente. Las células son transfectadas con siARN dirigidos con especificidad de objetivo contra siARN VEGF. de humano se mezclan en un reactivo de CaPi y añadió a 20µ1 de la solución de CaC12 de 250 mm. La mezcla siRNA/CaC12 se agrega gota a gota a 20µ1 de 2X Madejas Solución de Sal Equilibrada (HBS) , mientras mezclado por el vórtice. El complejo de si NA/CaCl2/HBS se agrega directamente al medio en cada pozo (300µ1/????) .

Después de una incubación de 4 horas a 37°C, el medio se elimina, y las células son incubadas adicionalmente con el 10 % que DMSO-contiene el medio sin suero (300µ1/???? a temperatura ambiente durante 1-2 minutos) . Este medio es retirado entonces, y las células se alimentan nuevamente con el medio de cultivo (500 µ? / pozo) . Controles negativos siARN de carencia de reactivo de transfección incluido y siAR no especifico (siARN de EGFP1) . Para detectar siARN de experimentos se usan a una concentración de 25nM. Para experimentos de respuesta a la dosis, siARN se usan a concentraciones de InM, 5nM y 25nM. La hipoxia es inducida con desferrioxamina a una concentración final de 130 uM 4 horas después de que la transfección se lleva a cabo. Desferrioxamina imita un estado hipóxico, ya que se propone interrumpir vías normales que perciben el oxígeno en células de mamífero inhibiendo las interacciones de heme-Fe2+.

Cuantificación de Proteína VEGF. Aproximadamente 48 horas franquean la transfección, el sobrenadante se elimina de todos los pozos y un ELISA VEGF de humano (Sistemas de investigación y construcción experimental, Minneapolis, Minnesota) se lleva a cabo en células 293 como se describe en el humano de Quantikine VEGF protocolo de ELISA. El anticuerpo VEGF-específico se agrega a cada pozo que causa el desarrollo en color en la proporción hasta un total del VEGF unido a la placa, los resultados de ELISA se leen en un lector de placa AD340 a 450nm (Beckman Coulter) .

Resultados . SiARN VEGF de humano Suprimen Regulación por incremento inducida por la Hipoxia de la Prote na VEGF de Humano en células 293. VEGF de humano es regulado aceleradamente por la inducción regulada por desferrioxamina de la hipoxia. Las lecturas de OD 450nm reflejaron los niveles proteicos VEGF de humano en muestras celulares. El aumento inducido por la hipoxia de niveles protéicos hVEGF es considerablemente reducido en células transíectadas con todos siAR VEGF de humano (Figura 8) . Ningún efecto en niveles hVEGF se observa con transíecciones con siARN no específico (siARN de EGFP) o transíecciones simuladas sin siARN. Los estudios de respuesta a la dosis se llevan a cabo en Cand5, hVEGF#l , hVEGF#2, hVEGF#3 , hVEGF#4, hVEGF#6 y hVEGF#7 (Figura 9) .

Ejemplo 12 - Interferencia de ARN In Vitro de isoformas VEGF VEGFl65b se ha identificado como una isoforma VEGF antiangiogénica endógena. siARN es diseñado para inhibir selectivamente ciertas isoformas VEGF, como VEGF165, pero reducir VEGF165b.

Métodos: las células de ARPE19 se siembran en placas de 24 pocilios (50 000 células por pozo) . Postsiembra de dieciocho a veinticuatro horas, las células son el 50-75 % confluentes y usadas paira la transíección . Catorce siARN específicos VEGF-A de humano son diseñados y analizados. Las células son transfectadas con siARN (25nM) usando Ribojuice ™ Reactivo de Transfección de siARN (Novagen) después del protocolo del fabricante. Específicamente, para un pozo individual de células, 40.5µ1 OPTI-MEM libre sérico se transfiere con pipeta en un tubo eppendorf entonces 2µ1 de Ribojuice se agrega al OPTI-MEM. La solución se mezcla por centrifugar suave y centrifugado brevemente para recolectar el contenido al fondo del tubo e incubado a temperatura ambiente para siARN de 5 minutos (7.5µ1 de un ?µ? reserva) se agrega a la mezcla de Ribojuice/medio y suavemente mezclado y brevemente centrifugado para recolectar el contenido en el fondo del tubo. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, los medios se eliminan de células y sustituido por 250DL de medios de cultivo ARPE19 completos recientemente preparados (DMEM/F12; suero fetal de bovino del 10 %, penicilina/estreptomicina del 1 %) . Después de la incubación de 15 minutos la mezcla de siRNA/Ribojuice/medio (50QL) se agrega gota a gota a las células. La concentración final de siAR en el 300DL volumen es 25nM. Las células se mantienen a 37oC, C02 del 5 % durante 24 horas.. En experimentos adicionales, las reacciones se ponen a escala hasta transfectan células, por triplicado pozos con cada siARN. Posttransfección de 24 horas, la mezcla de transfección se elimina y las células se someten a tratamiento con 500µ1e de DMEM/F12 libre sérico, DMEM/F12 que contiene 10ng/mL de TGF(_.II recombinante de humano o DMEM/F12 que contiene lOng/mL de TGF iI y 5 ug/mL de cycloheximide . Las células son regresadas a 37oC y C02 del 5 % durante adicionales 24 horas. Después, los medios se elimina de las células y analizado para la expresión protéica por ELISA (humano de Quantikine VEGF kit de ELISA (R&D Sistemas)). Los medios se eliminan de células y recolectado en tubos eppendorf y colocado en hielo e inmediatamente analizado para la proteína VEGF vía ELISA, o almacenado a-80oC y analizado para la proteína VEGF a un punto temporal posterior.

Con base en estos resultados, una cantidad selecta de candidatos de siARN es puesta a través de una detección de transfección adicional. Las células se recolectan, ARN RT-PCR extraído, y semicuantitativo se lleva a cabo para determinar el efecto inhibitorio de siARN en VEGF165, VEGF165b, VEGF121 y VEGF189. la expresión génica de gobierno de la casa de GAPDH se usa como un control. Específicamente, después de retirar los medios de los pozos, 200uls de la solución de lisis/unión de Kit RNAqueous (Ambion) se agrega a cada pozo. ARN se cuantifica vía la espectrofotometría (OD 260nM) . Las células Usadas se recolectan y ARN se extrae llevando a cabo el protocolo del fabricante. ARN es inverso transcrito usando SuperScriptTM III Transcriptasa inversa (Invitrogen) según el protocolo del fabricante, el ADNc se analiza para GAPDH, VEGF165 , VEGF165b, VEGF121 y VEGF189 usando el PCR. Los cebadores usados para el PCR se muestran en la Tabla 3.

TABLA 3 Nombre del Descripción Secuencia 5 '-3' cebador P121 Cebador inverso GGCTTGTCACATTTTTCT VEGF121 TG P165 Cebador inverso CCCACAGGGATTTTCTTG VEGF165 TC P189 Cebador inverso CTTTCCCTTTCCTCGAAC VEGF189 TG hVEGF-E Cebador directo GCTACTGCCATCCAATCG usado para AG VEGF121, VEGF165 & VEGF 189 P165bR Cebador inverso GTCTTTCCTGGTGAGAGA para VEGF165b TC hVEGF-A Cebador directo CTGTCTTGGGTGCATTGG para VEGF165b AG GAPDH-B Cebador inverso GAGGCAGGGATGATGTTC GAPDH TG GAPDH-A Cebador directo CATGGCAAATTCCATGGC GAPDH AC Para el análisis de PCR, 3µ1 el ADNc se combina con ?µ? de cada uno adecuado avanzado (??µ?) y cebador inverso (10u ) cebador y 45µ1 de la Supermezcla de PCR Platino (Invitrogen) el que la concentración final de cada cebador es 20ÓnM. El ADNc es amplificado en un termociclizador con las siguientes condiciones de PCR: Etapa 1: 94°C durante 2 minutos Etapa 2 : 94°C durante 15 segundos Etapa 3: 55°C durante 30 segundos Etapa 4: 72°C durante 30 segundos Etapa 5: Repetir etapas 2-4 30 veces para GAPDH, VEGF165, VEGF121 y VEGF189 o 35 veces para VEGF165b Etapa 6: 72°C durante 10 minutos Etapa 7: 4°C El producto de PCR es visualizado entonces en un gel de agarosa del 2 % preparado en IX amortiguador de TAE.

Resultados: el Tratamiento de células ARPE19 con GF II producción VEGF inducida en células ARPE19 y resultados de ELISA varios candidatos de siARN demostrados inhibidos la producción de VEGF inducida por TGF iI en células ARPE19. El RT-PCR confirmó que 2 candidatos producción inhibida de VEGF165, VEGF121 y VEGF189 , pero VEGFl65b reducido, como se muestra en la Figura 12 (pg/mL hVEGF) y 13 (% reducen la expresión hVEGF) , los candidatos de siARN de VEGF (la Tabla 2) se detectan para la capacidad de inhibir la producción protéica VEGF por células ARPE19 como analizado por ELISA. Las células se someten a tratamiento con 10 ng/mL de TGF ÍI para regular aceleradamente la producción VEGF. ELISA proteina VEGF total cuantificada y no es selectivo para ninguna variante de empalme particular. Varios candidatos (OPK-HVB-004, OPK-HVB-010, y OPK-HVB-011) demuestran un efecto inhibitorio y garantizaron el estudio adicional, como se muestra en la Figura 14 (pg/mL hVEGF) y 15 (% reducen la expresión hVEGF) , una detección secundaria de la producción VEGF usando los mismos métodos que en la Figura 12 y 13 demostró que OPK-HVB-004 y OPK-HVB-010 producción protéica VEGF inhibida y garantizaron la investigación adicional.

Las Figuras 16, 24 y 27 demuestran una eficacia de respuesta a la dosis de la reducción de la expresión de VEGF de humano con varios candidatos (OPK-HVB-004, OPK-HVB-010, y OPK-HVB-012) a diversas concentraciones.

La Figura 17 demuestra la regulación lentificadora de VEGF de humano más de una semana (7 días) de varios candidatos (OPK-HVB-004 , OPK-HVB-010, y OPK-HVB-012) .

Como un control, GAPDH RT-PCR se lleva a cabo en células diversamente tratadas como se muestra en la Figura 18. Aunque la cantidad actual del presente de ARN no sea cuantificada, los procedimientos son semicuantitativos cuando comparado con la referencia controlan la división 3. Específicamente, la regulación lentificadora de la producción de ARN es demostrada cuando una banda parece más débil. En este experimento, las muestras en Divisiones 2-11 se someten a tratamiento con 10 ng/mL de TGFpiI para regular aceleradamente la producción de VEGF. El mensaje de GAPDH lentificado de siARN FAM-GAPDH (división 4) , mientras los otros tratamientos no tienen ningún efecto en el ARNm de GAPDH, así confirmando que no hay ninguna variabilidad en la producción de ARN total en las células tratadas .

RT-PCR de isoforma de VEGF165 también es llevado a cabo en las células tratadas como se muestra en la Figura 19. Las muestras en Divisiones 2-11 se someten a tratamiento con 10 ng/mL TGF iI para regular aceleradamente la producción de VEGF. 25nM bevasiranib (división 6), que se conoce para lentificar todas las isoformas VEGF, 25nM OPK-HVB-004 (división 7) y 25nM OPK-HVB-010 (división 8), lentificó la producción del ARNm de VEGF165 llevando a cabo la inducción con TGF iI (división 2), como demostrado por las bandas son más ligeros que el control en la división 3.

. RT-PCR de isoforma de VEGF189 también es llevado a cabo como se muestra en la Figura 20. Las muestras en Divisiones 2-11 se someten a tratamiento con 10 ng/mL TGF iI para regular aceleradamente la producción de VEGF. 25nM bevasiranib (división 6) , 25nM OPK-HVB-004 (división 7) y 25nM OP -HVB-010 (división 8) lentificó la producción del ARNm VEGF189 llevando a cabo la inducción con ??ß?? (división 2) como demostrado por las bandas que son más ligeras que el control en la división 3.

RT-PCR de isoforma de VEGF121 es llevado- a cabo entonces como se muestra en la Figura 21. Las muestras en Divisiones 2-11 se someten a tratamiento con 10 ng/mL de TGF II para regular aceleradamente la producción de VEGF.

El ARNm de VEGF121 es lentificado en la división 6 (25nM bevasiranib) como demostrado por las bandas que son más ligeras que el control en la división 3.

Finalmente, isoforma de VEGFl65b RTPCR se lleva a cabo como se muestra en la Figura 22.

Las muestras en Divisiones 2-11 se someten a tratamiento con 10 ng/mL TGFpII para regular aceleradamente la producción de VEGF. Como una materia inicial, la doble banda> 600bp se determina para ser artificial. Sin embargo, el ARNm de VEGFl65b es lentificado por bevasiranib (división 6) como se muestra por las bandas que son más débiles que el control de la división 3. A diferencia, las bandas para OPK-HVB-004 (división 7) y OPK-HVB-010 (división 8) no son más débiles lo que controla en la división 3.. Así, estos constructos de siAR expresión VEGF165b conservada también siendo capaz de inhibir diversas otras isoformas VEGF . Así, siARN que reducen VEGFAl65b pueden sintetizarse y pueden ser más eficaces entonces siARN que reducen la expresión todas las isoformas VEGF-A. SiARN de reducción de VEGFl65b pueden ser potentes candidatos terapéuticos por el tratamiento de la neovascularización ocular.

Ejemplo 13 - Perfil de Citocina llevando a cabo Tratamiento con siARN El perfil de secreción de citocina de células ARPE19 después del tratamiento con la sal sódica de ácido poliinosínico-policitidílico [Poli (I:C)], un análogo de AR bc se determina. Las pruebas adicionales al determinado si siARN se comportaron como el Poli (I:C) e hicieron que las células produjeran las mismas citocinas se llevan a cabo.

Métodos. Las células de ARPE19 se siembran en placas de 24 pocilios (50 000 células por pozo) . Veinticuatro horas más tarde, medios se elimina y las células se someten a tratamiento con el Poli (I:C); 0-1000 mg/mL (Sigma, San Louis, . Misuri) o sal sódica de ácido poli-deoxiinosinico-deoxicitidílico [Poli (dI:dC); 50mU/mL-800mU/mL] (Sigma), preparado en DMEM/F12 libre sérico (1:1) (Invitrogen, Carlsbad, California) . Posttratamiento de cuarenta y ocho horas, los medios se recolectan de células y analizado para IFN-A, IFN-B, IFN-a, IL-8, IL-6, TNFa, ICAM, IL-12 y MCP-1 vía ELISA (Quantikine ® párrafo de Inmunoensayos IFN-D, IL-8, IL-6, TNFa, ICAM, IL-12 y MCP-1, R&D Sistemas, Minneapolis, Minnesota) ; Verikine ® párrafo de kits de ELISA IFN-A e IFN-B, PBL Laboratorios Biomédicos, Piscataway, Nueva Jersey) según los protocolos de los fabricantes.

Las células de ARPE19 son transfectadas con bevasiranib, OP -HVB-004, OPK-HVB-009, OPK-HVB-010 y OPK-HVB-012 (Dhamacon/Thermo Científico, Chicago, Illinois) . Las células se siembran en placas de 24 pocilios (40 000 células por pozo) . 24 horas más tarde, las células son transfectadas con 25nM siARN usando el Ribojuice™ Transfection Reagent (Novagen/EMD, San Diego, California) según el protocolo del fabricante. 24 horas franquean-ransfection, las células se someten a tratamiento con 10 ?T?ß?? . recombinantes de humano ng/mL (R&D Sistemas) . A 48 horas de la posttransfección (es decir 24 horas post-TGFblI tratamiento) , los medios se recolectan y los niveles de citocina se analizan, como se describe antes. Además, medios se analiza para hVEGF vía ELISA (R&D Sistemas) . Los resultados se muestran en la Figura 23.

Conclusiones. Con base mediante el anterior se sugiere que (ii) las células ARPE19 produzcan varias citocinas inflamatorias en respuesta al Poli (I:C), un análogo de ARNbc , pero no produzcan .a tres mediadores claves, IFN-a, lFN-ß o IFN-? (ii) células ARPE19 poderse usar para estudiar los efectos potenciales y específicos inflamatorios de ARNbc, como siARN; y (iii) OPK-HVB-009 un OPK-HVB-010 no hizo que células ARPE19 secretaran cualquiera de las citocinas analizadas, sugiriendo que éstos pueden tener un potencial inflamatorio bajo.

Ejemplo 14: Curvas de Respuesta a la Dosis Muestran Especificidad de siARN.

Una curva de respuesta a la dosis se genera usando diversos siARN, .21-mers, como se muestra en la Figura 26 y 27. Una respuesta a la dosis se observa con ciertos siARN que indican respuesta específica a siARN usados. Una curva de respuesta a la dosis también es generada para OPK-HVB-009 como se muestra en Figuras 25 y 26. Las células se someten a tratamiento y transfectado como se describe en Ejemplos 12 y 13. Las células se siembran en placas de 24 pocilios (40 000 células/pozo) . Además, las diferentes concentraciones se usan-, y por lo tanto, los volúmenes de OPTI-MEM, Ribojuice, y siARN es ajustado en consecuencia al preparar el 50.µ? mezcla de transíección.

Ejemplo 15: Estabilidad de siARN Las células de ARPE19 son transfectadas con siARN que tienen almacenado en diversas condiciones como se muestra en Figuras 28, 29, 30 31, y 32. Las células son transfectadas como se describe en Ejemplos 12 y 13. Se descubre esto las moléculas de siARN son estables en diversas condiciones' como se muestra en Figuras 28, 29, 30, 31, y 32. Por ejemplo, 7.5µ? siARN es repartido en partes alícuotas en 3 tubos y cada tubo se almacena a una diferente temperatura (37oC, temperatura ambiente, 4oC) durante hasta 8 semanas. Las partes alícuotas de cada tubo se recolectan puntos temporales a predeterminados (24 horas, 48 horas y luego cada semana) . Mediante las partes alícuotas de recolección se almacenan a-80oC. Cada parte alícuota es analizada posteriormente de la eficacia en células ARPE19 para observar si siARN mantenidos su estabilidad bajo las diferentes condiciones meteorológicas. siARN son transfectados en células ARPE19 usando los métodos descritos en el Ejemplo 12 donde 40 000 células se siembran por pozo.

Ejemplo 16: regulación lentificadora de especies reticuladas de VEGF.

Las células de C6 se siembran en placas de 24 pocilios (P12, 40 000 células por pozo). Postsiembra de dieciocho a veinticuatro horas, las células son el 50-70 % confluentes y usadas para la transfección. Las células son transfectadas con OPK-HVB-004, OPK-HVB-009 , OPK-HVB-010 y OPK-HVB-012 usando Ribojuice ™ Reactivo de Transfección de siAR (Novagen) llevando a cabo el protocolo del fabricante. Brevemente, para un pozo individual OPTI-MEM sin suero (40.5µ1-47µ1) se transfiere con pipeta en un tubo eppendorf y luego 2µ1 de Ribojuice se agregan al OPTI-MEM (Gibco) . La solución se mezcla por centrifugar suave y centrifugado brevemente para recolectar el contenido en el fondo del tubo e incubado a temperatura ambiente para siARN de 5 minutos (0.3µ1-7.5µ1 de un ????? o ?µ? reserva) se agrega a la mezcla de Ribojuice/medio y suavemente mezclado y brevemente centrifugado para recolectar el contenido en el fondo del tubo. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, los medios se eliminan de células y sustituido por 250µ1 de medios de cultivo C6 recientemente preparados (F-12 Kaighn, suero fetal de ternera del 2.5 %; suero de caballo del 15 %, penicilina/estreptomicina del 1 %) . Después de la 15 incubación de minuto, la mezcla de siRNA/Ribojuice/medio (50µ1) se agrega gota a gota a las células. La placa es suavemente mecida para asegurar que los complejos son regularmente dispersados durante todo el pozo. La concentración final de siARN en el 300µ1 volumen es 250pM, 500pM, InM, 5nM o 25nM. Las células se mantienen a 37oC, C02 del 5 % durante 24 horas. Todos los volúmenes se ponen a escala el que cada siAR se analiza a cada concentración por triplicado. Posttransfección de 24 horas, la mezcla de transfección se elimina y las células se someten a tratamiento con 500µ1e de medios de cultivo C6 recientemente preparados o con medios de cultivo C6 recientemente preparados complementados con 10 TGFpiI recombinantes de humano ng/mL. Las células son regresadas a 37oC, C02 del 5 % durante adicionales .24 horas. Después los medios se eliminan de las células y analizado para la expresión protéica por ELISA (rata de Quantikine VEGF kit de ELISA, R&D Sistemas) .

Las células de NIH3T3 se siembran en placas de 24 pocilios (P2-P6, 40 000 células por pozo) . Postsiembra de dieciocho a veinticuatro horas, las células son el 50-70 % confluentes y usadas para la transfección. Las células son transíectadas con siARN usando la Lipofectamina ™ Reactivo 2000 (Invitrogen) llevando a cabo el protocolo del fabricante. Brevemente para un pozo individual, siARN (?µ? o 7.5µ?) se diluye en 50µ1 OPTI-MEM en un tubo eppendorf y suavemente mezclado y centrifugado. En un segundo tubo eppendorf ?µ? de la Liopfectamina 2000 se combina con 49µ1 de OPTI-MEM. La. mezcla es suavemente mezclada y centrifugada e incubada durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de los 5 minutos, siARN diluido (50µ1 volumen) se agrega a la Liopfectamina 2000 diluida (50µ1) . El contenido se mezcla suavemente e incubado a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante la incubación de 20 minutos, los medios se eliminan de las células y sustituido por 500µ1e de medios de cultivo NIH3T3 recientemente preparados (DMEM, suero fetal de ternera del 10 %) . Después de los 20 minutos el complejo de Liopfectamina 2000 de siARN (???µ?) se agrega gota a gota a las células . La placa es suavemente mecida para asegurar que los complejos son regularmente dispersados durante todo el pozo. Las células son incubadas entonces a 37oC, C02 del 5 % durante 24 horas. La concentración final de siARN en el 500µ1 volumen es In , 5nM o 25nM. Posttransfección de 24 horas, la mezcla de transfección se elimina y las células se someten a tratamiento con 500uls de DMEM recientemente preparado o con DMEM recientemente preparado complementado con 10 TGFpiI recombinantes de humano ng/mL. Las células son regresadas a 37oC, C02 del 5' % durante adicionales 24 horas. Después los medios se eliminan de las células y analizado para la expresión protéica por ELISA (ratón de Quantikine VEGF kit de ELISA, R&D Sistemas) .

Los resultados de los experimentos se muestran en Figuras 34, 35 y 39. OPK-HVB-004 y OPK-HVB-009 son capaces de inhibir la secreción VEGF por células C6 como se muestra en la Figura 34. Los experimentos similares se llevan a cabo en células de ratón (NIH3T3) y OPK-HVB-004, OPK-HVB-009, y OPK-HVB-010 son capaces de inhibir la secreción de VEGF de ratón como se muestra en Figuras 35 y 39.

Ejemplo 17: Comparación de diferentes siAR 21mer siARN que comprenden una saliente se comparan a un 19mer ejemplar de extremo romo. Las células de ARPE19 son transíectadas con diferentes siARN como se describe en Ejemplos 12, 13, y 14 y la producción VEGF se cuantifica. El ejemplar de extremo romo se encuentra para reducir la expresión la producción VEGF en células ARPE19 igualmente efectivas como el 21mer como se muestra en la Figura 36.

Ejemplo 18: La detección de 19mers que comprenden 17bp y una saliente puede inhibir la producción de VEGF.

SiARN que comprenden un 17mer y una saliente de dTdT son transfectados en células ARPE19 como se describe en Ejemplos 12, 13, y 14. Varios siARN se encuentran para inhibir la producción VEGF como se muestra en la Figura 37.

Ejemplo 19: Respuesta a la dosis de siARN El 19mers que comprenden un extremo romo o una saliente 19mer (17bp +dTdT) son transfectados en células ARPE19 a diversas dosis como se muestra en la Figura 38. ,Una curva de respuesta a la dosis se genera midiendo la secreción de VEGF como se describe en Ejemplos 12, 13 y 16. La respuesta a la dosis observada indica que respuesta a siARN es específica para siARN y no generada por respuesta de siARN no específica. Los resultados pueden observarse en la Figura 38. SiARN de extremo romos analizados en células NIH3T3 mostraron una respuesta a la dosis específica. (Ver la Figura 39).

Claims (60)

REIVINDICACIONES

1. Un siARN aislado que comprende un dúplex de una primera hebra de ARN y una segunda hebra de ARN, la primera hebra de ARN comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una · secuencia objetivo de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 25 nucleótidos contiguos a una isoforma del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) seleccionada del grupo que comprende VEGF121 , VEGF165 VEGF189 , VEGF206 , VEGF183, VEGF148, VEGF145 de humano y combinaciones de lo mismo; adicionalmente donde siARN es al menos parcialmente no complementario a VEGF165b, siempre que el ARNm VEGF de humano no sea SEQ ID NO. 42.

2. El siARN según la reivindicación 1, donde el ARNm VEGF de humano se selecciona a partir del grupo que comprende SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO : 116, SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 118.

3. El siARN según la reivindicación 1, donde las primeras y segundas hebras de ARN que forman el dúplex de ARN se enlazan covalentemente mediante una horquilla monocatenaria .

4. El siARN según la reivindicación 1, donde el siAR adicionalmente comprende el material no nucleotídico .

5. El siARN según la reivindicación 1, donde las primeras y segundas hebras de ARN son estabilizadas contra la degradación por nucleasa.

6. El siARN según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende una saliente 3 ' .

7. El siARN según la reivindicación 6, donde la saliente 3' comprende de 1 hasta aproximadamente 6 nucleotidos.

8. El siARN según la reivindicación 6, donde la saliente 3 ' comprende aproximadamente 2 nucleotidos .

9. El siARN según la reivindicación 1, donde la hebra de ARN homosentido comprende una primera saliente 3', y la hebra de ARN antisentido comprende una segunda saliente 3 ' .

10. El siARN según la reivindicación 9, donde las primeras y segundas salientes 3 ' comprende cada una de 1 hasta aproximadamente 6 nucleotidos.

11. El siARN según la reivindicación 9, donde la primera saliente 3 ' comprende un dinucleotido y la segunda saliente 3' comprende un dinucleotido.

12. El siARN según la reivindicación 11, donde el dinucleotido que comprende las primeras y segundas salientes 3 ' es el ácido ditimidílico (TT) o el ácido diurid lico (uu) .

13. El siAR según la reivindicación 6, donde la saliente 3 ' es estabilizada contra la degradación por nucleasa .

14. El siARN según la reivindicación 1, donde el siARN , comprende al menos un extremo romo .

15. El siARN según la reivindicación 14, donde el siARN tiene 19 nucleótidos.

16. El siARN según la reivindicación 1, donde el siARN puede inhibir la producción o secreción de VEGF de una célula humana y una célula de rata.

17. El siARN según la reivindicación 1, donde el siARN puede inhibir la producción o secreción de VEGF de una célula humana, una célula de ratón y una célula de rata.

18. El siARN aislado que comprende un dúplex de una primera hebra de ARN y una segunda hebra de ARN, la primera hebra de ARN comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 25 nucleótidos contiguos a una isoforma VEGF seleccionada del grupo que comprende VEGF121, VEGF165, y VEGF189, VEGF206, VEGF183 , VEGF148, VEGF145 de humano y combinaciones de lo mismo; adicionalmente donde siARN no es complementario a VEGF165b, siempre que el ARNm VEGF de humano no sea SEQ ID NO. 42.

19. Una composición farmacéutica que comprende siARN y un portador farmacéuticamente aceptable, el siARN comprende un dúplex de una primera hebra de ARN y una segunda hebra de ARN, la primera hebra de ARN comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 25 nucleótidos contiguos a una isoforma VEGF seleccionada del grupo que comprende VEGF121 , VEGF165, VEGF189, VEGF206 , VEGF183, VEGF148, VEGF145 de humano y combinaciones de lo mismo; adicionalmente donde siARN es al menos parcialmente no complementario a VEGFl65b, siempre que el ARNm VEGF de humano no sea SEQ ID NO. 42.

20. La composición farmacéutica según la reivindicación 19 , donde el ARNm VEGF de humano se selecciona a partir del grupo que comprende SEQ ID NO: 86; SEQ ID NO: 87; SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 89; SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 91; SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 93; SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 95; SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 97; SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO 99, SEQ ID NO 100, SEQ ID NO 101, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 117 y SEQ ID NO: 118.

21. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde las primeras y segundas hebras de ARN son estabilizadas contra la degradación por nucleasa.

22. La composición farmacéutica según la reivindicación 19 , donde adicionalmente comprende al menos una saliente 3 ' .

23. La composición farmacéutica según la reivindicación 22 , donde la al menos una saliente 3 ' comprende aproximadamente 2 nucleótidos .

24. La composición farmacéutica según la reivindicación 22 , donde la al menos una saliente 3 ' comprende un ácido ditimidílico (TT) o ácido diurid lico (uu) .

25. La composición farmacéutica según la reivindicación 19 , donde la hebra de ARN homosentido comprende una primera saliente 3 ' , y la hebra de ARN antisentido comprende una segunda saliente 3'.

26. La composición farmacéutica según la reivindicación 19, donde el siARN comprende al menos un extremo romo.

27. El siARN según la reivindicación 26, donde el siARN tiene 19 nucleótidos.

28. El siARN según la reivindicación 19, donde el siARN puede inhibir la producción o secreción de VEGF de una célula humana y una célula de rata.

29. El siARN según la reivindicación 19, donde el siARN puede inhibir la producción o secreción de VEGF de una célula humana, una célula de ratón y una célula de rata.

30. Un método para tratar una enfermedad angiogénica en un paciente, que comprende: administrarle a un paciente una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende siARN y un portador farmacéuticamente aceptable, el siARN comprende un dúplex de una primera hebra de ARN y una segunda hebra de ARN, la primera hebra de ARN comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 25 nucleotidos contiguos a una isoforma VEGF seleccionada del grupo que comprende VEGF121, VEGF165, VEGF189 , VEGF206, VEGF183 , VEGF148 , VEGF145 de humano y combinaciones de lo mismo; adicionalmente donde siARN es al menos parcialmente no complementario a VEGF165b, con la condición que el ARNm VEGF de humano no sea SEQ ID NO. 42.

31. El método según la reivindicación 30, donde la enfermedad angiogénica comprende un tumor asociado con cáncer.

32. El método según la reivindicación 31, donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que comprende el cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer cerebral, cáncer abdominal, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de esófago, cáncer gastrointestinal, glioma, cáncer hepático, cáncer de lengua, neuroblastoma, osteosarcoma, cáncer ovárico, cáncer pancreático, cáncer de próstata, retinoblastoma, tumor de Wilm, mieloma múltiple, cáncer dérmico, linfoma y cáncer de sangre.

33. El método según la reivindicación 30, donde la enfermedad angiogénica se selecciona a partir del grupo que comprende retinopatía diabética, degeneración vascular relacionada con la edad y enfermedades inflamatorias.

34 . El método según la reivindicación 33 , donde la enfermedad inflamatoria es psoriasis o artritis reumatoide.

35 . El método según la reivindicación 33 , donde la enfermedad angiogénica es la degeneración vascular relacionada con la edad.

36 . El método según la reivindicación 30 , donde la composición farmacéutica se administra combinada con un agente farmacéutico para tratar la enfermedad angiogénica, donde el agente farmacéutico es diferente al ácido ribonucleico interférente corto (siAR ) .

37 . El método según la reivindicación 36 , donde la enfermedad angiogénica es cáncer, y el agente farmacéutico comprende a un agente quimioterapéutico .

38 . El método según la reivindicación 37 , donde el agente quimioterapéutico se selecciona a partir del grupo que comprende cisplatino, carboplatino, ciclofosfamida, 5-fluorouracilo, adriamicina, daunorubicina y tamoxifeno.

39 . El método según la reivindicación 30 , donde la composición farmacéutica se administra a un paciente combinada con otro método terapéutico diseñado para tratar la enfermedad angiogénica.

40 . El método según la reivindicación 39 , donde la enfermedad angiogénica es cáncer, y . la composición farmacéutica se administra combinada con una terapia de radiación, quimioterapia o cirugía.

41. Un método para inhibir la expresión del factor del crecimiento endotelial vascular de humano (VEGF) que comprende la administración a un paciente de una cantidad efectiva de una composición farmacéutica que comprende siARN y un portador f rmacéuticamente aceptable, el siARN comprende un dúplex de una primera hebra de ARN y una segunda hebra de ARN, la primera hebra de ARN comprende una secuencia nucleotídica idéntica a una secuencia objetivo de aproximadamente 17 hasta aproximadamente 25 nucleótidos contiguos a una isoforma VEGF seleccionada del grupo que comprende VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206, VEGF183, VEGF148, VEGF145 de humano y combinaciones de lo mismo; adicionalmente donde siARN es al menos parcialmente no complementario a VEGF165b, con la condición de que el ARNm VEGF de humano no sea SEQ ID NO. 42.

42. El método según la reivindicación 41, donde la cantidad efectiva comprende de aproximadamente InM hasta aproximadamente ????? de ácido ribonucleico interferente corto (siARN) .

43. El método según la reivindicación 41, donde la composición farmacéutica adicionalmente comprende un reactivo de administración.

44. El método según la reivindicación 41, donde el agente de administración se selecciona a partir del grupo que comprende lipofectina, lipofectamina, celfectina, policationes y liposomas.

45. El método según la reivindicación 44, donde el agente de administración es un liposoma.

46. El método según la reivindicación 45, donde el liposoma comprende un ligando que apunta con acción selectiva el liposoma a células en o cerca del sitio de la angiogénesis .

47. El método según la reivindicación 46, donde el ligando se une con receptores en células tumorales o células endoteliales vasculares.

48. El método según la reivindicación 46, donde el ligando comprende un anticuerpo monoclónico.

49. El método según la reivindicación 45, donde el liposoma se modifica con una porción de inhibición de la opsonización.

50. El método según la reivindicación 49, donde la porción que inhibe la opsonización comprende PEG, PPG, o derivados de lo mismo.

51. El método según la reivindicación 41, donde el ácido ribonucleico interferente corto (siARN) se expresa de un plásmido recombinante .

52. El método según la reivindicación 41, donde el ácido ribonucleico interferente corto (siARN) se expresa de un vector viral recombinante.

53 . El método según la reivindicación 52 , donde el vector viral recombinante comprende un vector adenovírico, un vector viral adeno-asociado, un vector lentiv rico, un vector retrovírico, o un vector de virus del herpes.

54 . El método según la reivindicación 53 , donde el vector viral recombinante es pseudotipificado con proteínas de superficie del virus de estomatitis vesicular, virus de rabia, virus del Ebola, o virus de okola.

55 . El método según la reivindicación 52 , donde el vector viral recombinante comprende un vector viral adeno-asociado .

56 . El método según la reivindicación 41 , donde la composición farmacéutica se administra por una ruta de administración entérica.

57 . El método según la reivindicación 56 , donde la ruta de administración entérica se selecciona a partir del grupo que comprende la ruta oral, rectal e intranasal .

58 . El método según la reivindicación 41 , donde la composición farmacéutica se administra por una ruta de administración parenteral.

59 . El método según la reivindicación 58 , donde la ruta de administración parenteral se selecciona a partir del grupo que comprende la administración intravascular, inyección peri-tisular e intratisular, inyección subcutánea o deposición, infusión subcutánea, y la aplicación directa en o cerca del sitio de neovascularizacion.

60. El método según la reivindicación 59, donde la administración intravascular se selecciona a partir del grupo que comprende inyección en bolo intravenosa, infusión intravenosa, inyección en bolo intraarterial , infusión intraarterial y la instilación de catéter en la vasculatura.