JP2003531609A - 目に関する形質導入用ベクターおよび遺伝子治療を目的とするその用途 - Google Patents

目に関する形質導入用ベクターおよび遺伝子治療を目的とするその用途

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JP2003531609A JP2001580337A JP2001580337A JP2003531609A JP 2003531609 A JP2003531609 A JP 2003531609A JP 2001580337 A JP2001580337 A JP 2001580337A JP 2001580337 A JP2001580337 A JP 2001580337A JP 2003531609 A JP2003531609 A JP 2003531609A
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ダニエル・ジェイ・ボン・セガーン
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Abstract

(57)【要約】 眼科疾患を処置するためのアデノウイルスベクターに基く遺伝子治療方法が提供される。眼科疾患処置用アデノウイルスベクターおよびベクターを用いた処置方法が提供される。遺伝子治療用ベクターの組成物、キット、および製造および使用方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 ここに記載されている研究は、ＮＩＨ助成金ＥＹ１１４３１およびＨＬ５４３
５２により支援された。政府は、上記対象に対しある種の権利を有する。
【０００２】 （関連出願） この出願は、「目に関する形質導入用ベクターおよび遺伝子治療を目的とする
その用途」と題する、Glen R．Nemerow、Daniel Von Seggern、Martin Friedlan
derによる、２０００年５月１日出願のアメリカ合衆国特許出願第５６２９３４
号について優先権を主張する。
【０００３】 この出願は、１９９９年１１月１２日付アメリカ合衆国特許出願０９／４２３
７８３の一部継続出願であり、１９９９年１月１４日付アメリカ合衆国仮出願６
０／１１５９２０の出願日を主張している、「アデノウイルスベクター、パッケ
ージングセルライン、組成物および製造方法および用途」と題する、２０００年
１月１４日付の、Daniel Von Seggern、Glen R.Nemerow、Paul Hallenbeck、Sus
an Stevenson、Yelena Skripchenkoによる、同時係属中のアメリカ合衆国特許出
願第０９／４８２６８２号（これはまた２０００年１月１４日付で国際ＰＣＴ出
願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５号として出願された）と関連している。認め
られる場合、各出願および仮出願の内容および対象は、出典明示により本明細書
の一部とする。
【０００４】 （発明の分野） 本発明は、遺伝子治療、特にアデノウイルスベクターに基く遺伝子治療に関す
るものである。特に、眼病治療用のアデノウイルスベクターおよびベクターを用
いた処置方法が提供されている。遺伝子治療用ベクターの組成物、キットおよび
製造方法および用途も提供されている。
【０００５】 （発明の背景） 網膜ジストロフィー 目は、若干の遺伝的および／または加齢性変性疾患に罹りやすい。合衆国にお
いて、不可逆的失明または深刻な視力喪失の一般的誘因は網膜ジストロフィーで
ある（例、Cotlierら（１９９５）Surv.Ophthalmology ４０：５１−６１、Bird
（１９９５）Am.J.Ophthal．１１９：５４３−５６２、およびAdler（１９９６
）Arch Ophthal １１４：７９−８３参照）。網膜は、別々の層で構成された、
光感受性受容体、ニューロンの複合体および色素上皮層を含む目の感覚層である
。ヒトの場合、黄斑は、水晶体の直後にある網膜の一部分である。網膜錐体、す
なわち中心視力に関与する光受容体細胞は、黄斑に大きく集中している。黄斑を
冒す中心ジストロフィーには、ベスト病、加齢性黄斑変性、およびシュタルガル
ト黄斑ジストロフィーがある。周辺部網膜は主として桿状体により構成され、そ
れらは側面および夜間視力に関与している。周辺部変性網膜疾患には、網膜色素
変性症、コロイデレミア(choroidemia)およびビエッチ結晶性ジストロフィーが
ある。
【０００６】 黄斑変性症は、進行性中心視力喪失および黄斑および基礎をなす網膜色素上皮
層の変性を特徴とする、異種群の病気である。加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）は
、年齢が７５歳を越える人の２０％が罹患していると推定される、最もありふれ
た病気形態である。ＡＲＭＤは、病因および病原に関してあまり解明されていな
い。病気の始まりが非常に遅いため、遺伝地図作成が特に困難となっている。明
確な遺伝的基礎を有するある種の黄斑変性状態、例えばシュタルガルト病および
ベスト病は、ＡＲＭＤと多くの特徴を共有するが、分子および遺伝子解析が行な
われやすい。
【０００７】 遺伝的周辺網膜症もまた比較的ありふれている。網膜色素変性症（ＲＰ）の場
合、例えば、世界中で約１５０万人の人々が罹患している。かなりの遺伝子異質
性がこの状態で観察されており、２０を越える染色体遺伝子座が同定されている
。網膜色素変性症に対する素因は、常染色体優性、常染色体劣性、Ｘ−連鎖また
は二遺伝子モードにより遺伝し得る。突然変異は７遺伝子で確認されており、そ
のうち４つは、桿状体光導入カスケードにおけるタンパク質：ロドプシン、桿状
体ｃＧＭＰホスホジエステラーゼのアルファおよびベータサブユニット、および
桿状体ｃＧＭＰカチオンゲートチャンネルタンパク質・アルファ・サブユニット
をコード化する。ペリフェリン／ＲＤＳ遺伝子における突然変異は、網膜色素変
性症および黄斑変性症に関連付けられている。単一ペリフェリン／ＲＤＳ突然変
異が、異なるファミリー構成員において網膜色素変性症、パターンジストロフィ
ーおよび黄色斑眼底を誘発するのは明らかであった。
【０００８】 原因となる異質性にもかかわらず、ＲＰサブタイプの間には顕著な臨床的類似
性がある。共通の徴候および症状としては、早期の網膜電図記録異常、検眼鏡検
査による発見、および黄斑に向かって突出した輪状暗点の連続的拡大があり、こ
れはトンネル視の進行性悪化に至る。これらの遺伝的に明確な疾患に特有なもの
である、能動的な光受容体細胞死は、アポトーシスの一般的誘導により伝達され
るというのが最近の仮説である。光受容体におけるアポトーシスの導入を遮断す
る薬剤、例えば神経栄養因子を投与することによりこれらの状態を処置すること
は可能であり得る。
【０００９】 アデノウイルス送達ベクター アデノウイルスは、３６キロ塩基（ｋｂ）ゲノムを有するＤＮＡウイルスであ
って、非常に詳細に特性確認されており、その遺伝的性質および遺伝機構も解明
されている。アデノウイルスの遺伝機構により、外来ＤＮＡによるウイルスＤＮ
Ａの大きなフラグメントの置換は可能となっている。さらに、組換えアデノウイ
ルスは構造的に安定しており、大規模な増幅後でも転位ウイルスは全く観察され
ていない。
【００１０】 アデノウイルスは、目的遺伝子を真核生物細胞へ導入するための送達（デリバ
リー）ビークルとして使用されてきた。アデノウイルスは、細胞受容体に結合後
インターナリゼーションすることにより上記遺伝子を真核生物細胞へ送達する。
アデノウイルスファイバータンパク質は、細胞への結合に関与している。ファイ
バータンパク質は２つのドメイン、すなわち杆状シャフト部分および受容体結合
領域を含む球状ヘッド部分を有する。ファイバースパイクはホモ三量体であり、
１ビリオン当たり１２のスパイクがある。ヒトアデノウイルスは、異なる種から
の広範囲の培養セルラインおよび一次組織培養物に結合し、感染する。
【００１１】 アデノウイルス２型の３５０００塩基対(ｂｐ)ゲノムは配列決定されており、
主要コートタンパク質の予測的アミノ酸配列（ヘキソン、ファイバーおよびペン
トン塩基）が報告されている（例、Neumannら、Gene ６９：１５３−１５７（１
９８８）、Herisseら、Nuc.Acids Res.９：４０２３−４０４１(１９８１)、Rob
ertsら、J.Biol.Chem.２５９：１３９６８−１３９７５（１９８４）、Kinloch
ら、J.Biol.Chem.２５９：６４３１−６４３６（１９８４）、およびChroboczek
ら、Virol.１６１：５４９−５５４、１９８７、参照）。
【００１２】 Ａｄ５ ＤＮＡの３５９３５ｂｐ配列もまた公知であり、多くの他のアデノウ
イルスゲノムの一部分が配列決定された。アデノウイルスビリオンに関する上部
パッケージング限界は、野生型ゲノム長の約１０５％である（例、Bettら、J.Vi
rol.６７(１０)：５９１１−２１、１９９３、参照）。すなわち、Ａｄ２および
Ａｄ５の場合、これは約３８ｋｂのＤＮＡの上部パッケージング限界となる。
【００１３】 アデノウイルスＤＮＡはまた、血清型により、サイズ範囲が約１００〜１５０
ｂｐである逆方向末端反復塩基配列（ＵＴＲ）を含む。逆方向反復により、ウイ
ルスＤＮＡの一本鎖がそれらの末端配列の塩基対合により環状にされ、ウイルス
ＤＮＡの複製に要求される塩基対合「パンハンドル」構造が形成され得る。
【００１４】 有効なパッケージングのために、ＩＴＲおよびパッケージングシグナル（長さ
数百ｂｐ）は、ゲノム核酸の複製およびアデノウイルス粒子へのパッケージング
に関する「最低必要条件」を含む。全ウイルスＯＲＦを欠くがこれらの必須シス
エレメント（ＩＴＲおよび連続的パッケージング配列）を含むヘルパー依存的ベ
クターが構築された。
【００１５】 Ａｄベクターは、遺伝子送達ビークルとして幾つかの独特な利点を有する。例
えば、上記ベクターの組換えは稀である。アデノウイルスによるありふれたヒト
感染症にもかかわらずアデノウイルス感染とヒト悪性疾患の関連は全く知られて
いない。ゲノムに遺伝子操作を行うことにより、かなり大きなサイズの外来遺伝
子を適応させ得るため、宿主増殖はアデノウイルスタンパク質の発現には要求さ
れない。アデノウイルス（Ａｄ）に基く遺伝子送達ベクターは、多くの異なる細
胞および組織に効率的に感染する。しかしながら、この広い屈性(tropism)は、
遺伝子送達が特異的標的細胞に指向され得ないことを意味する。静脈内投与され
たアデノウイルスの大きなフラクションが肝臓により保持されることにより、望
ましくない副作用が誘発され得る。アデノウイルスは、免疫応答を増強し得る。
例えば、アデノウイルス５型（Ａｄ５）はまた、非常に効率的に抗原を提示する
樹状細胞に形質導入することにより、ベクターに対する免疫応答を増悪させる可
能性がある。異なるターゲッティング効率を有するベクターであればこれらの問
題点が排除されるため、総粒子用量は低減化され、より特異的なターゲッティン
グが可能となることが提案されている（例えば、アメリカ合衆国特許出願第０９
／４８２６８２号参照）。
【００１６】 アデノウイルス構造および感染機構に関する豊富な情報、非分裂細胞へのその
有効な感染性、およびその大きな遺伝的受容力故に、アデノウイルスは一般的に
普及した遺伝子治療ベクターとなっている。アデノウイルスが結合する受容体が
広範に発現されるため、アデノウイルスベクターによるターゲッティングが困難
となっている。
【００１７】 このため、アデノウイルスベクターの送達およびターゲッティングの改良およ
びまた眼病に関する治療法の提供が要望されている。従って、目の細胞を特異的
または選択的にターゲッティングするアデノウイルスベクターを提供することが
本発明における目的である。また、眼科疾患の処置を目的とするこれらのベクタ
ーを提供することも本発明における目的である。
【００１８】 （発明の要約） 変性眼科疾患、限定されるわけではないが、例えば網膜色素変性症、シュタル
ガルト病、糖尿病性網膜症、網膜血管新生および他の眼病（例えば、下表参照）
は遺伝的基礎を有する。網膜の後部にある光受容体細胞で発現される遺伝子は、
これらの疾患に関与している。ここでは、治療的産物をこれらの細胞にターゲッ
ティングするための組換えウイルスベクターが提供されている。
【００１９】 これらの光受容体への特異的結合を可能にする核酸を含む組換えアデノウイル
スベクターが提供されている。特に、ベクター粒子は、Ａｄ３７のファイバータ
ンパク質またはその修飾形態を含む。ここに示されている通り、Ａｄ３７からの
ファイバータンパク質により光受容体細胞の有効な感染が可能となる。他のアデ
ノウイルスＤ血清型からのファイバータンパク質もまた使用され得る。さらに、
ファイバータンパク質の一部分、特に他のウイルス構造タンパク質と相互作用す
るもの、例えばペントンは、他の構造タンパク質のウイルス供給源と類似するよ
うに修飾され得る。ここで例証されている通り、ここに提供されている組換えウ
イルスは、Ａｄ５構造成分を含む。ペントンタンパク質と相互作用するＡｄ３７
ファイバータンパク質のＮ末端は、Ａｄ５ファイバータンパク質Ｎ−末端と類似
するように修飾され、それによってウイルス粒子の生産が確実なものとなる。
【００２０】 組換えアデノウイルスベクターは、光受容体で発現される遺伝子が関与する疾
患の遺伝子治療を意図したものである。上記疾患には、限定されるわけではない
が、変性眼科疾患、例えば網膜色素変性症およびシュタルガルト病がある。これ
らのベクターはまた、同じくＡｄ３７および関連血清型からのファイバーが結合
する受容体をもつ他の眼細胞、例えば結膜細胞へのターゲッティングに有用であ
る。
【００２１】 ベクターは、様々な疾患(例えば下表３および４参照)を処置するためターゲッ
ティングされた細胞へ治療剤を送達する。治療剤は、光受容体における発現およ
び光受容体細胞からの分泌が意図されており、これらが一方は脈絡膜血管系によ
り他方は網膜血管系により囲まれていることによって、上記産物の送達手段が提
供される。さらに、成長因子、例えばＶＥＧＦおよびその他の発現性を用いるこ
とにより、網膜への血流が促進され、変性が阻止または緩慢にされ得る。
【００２２】 組換えアデノウイルスベクターによりコード化される治療剤は、ある種の遺伝
的疾患に欠けている遺伝子をコード化する核酸分子、網膜疾患、例えば網膜芽細
胞腫処置用の抗血管形成剤および抗腫瘍剤をコード化する核酸分子、栄養因子、
例えば神経膠セルライン由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）および毛様体神経栄養
因子（ＣＮＴＦ）、成長因子および成長因子阻害剤、抗アポトーシス因子、例え
ばＢｃｌ−２（ＣＮＴＦ）をコード化する核酸分子、抗腫瘍剤、抗血管形成剤、
および遺伝子置換または欠陥遺伝子修復用の遺伝子またはその一部分を含むが、
これらに限定されるわけではない。このため、新生血管および血管変性を伴う疾
患を含む、遺伝的および後天的網膜疾患の処置方法が提供されている。
【００２３】 光受容体細胞において発現される遺伝子を伴う病気の処置方法がここでは提供
されている。ここに提供されている方法は、光受容体への送達に適した何らかの
手段による組換えウイルスベクターの投与により実践される。好ましい投与方式
は、硝子体内および網膜下注射を含む眼内注射である。他の投与方式には、強膜
内、眼窩骨膜および静脈内投与があるが、これらに限定されるわけではない。ベ
クターはまた、光受容体特異的プロモーターを含み得、それによってこれらの細
胞における発現の特異的ターゲッティングだけでなく光受容体限定導入遺伝子発
現を目的とする手段が提供され得る。
【００２４】 発明の詳細な説明 Ａ．定義 特記しない場合、ここで使用されている技術および科学用語は全て、この発明
が属する技術分野における熟練者が一般的に理解しているものと同じ意味を有し
ている。全ての特許、出願、公開出願および他の出版物およびジェンバンクから
の配列およびこの開示におけるいずれかの箇所で示されている他のデータベース
は、出典明示により本明細書の一部とする。
【００２５】 ここで使用されているアミノ酸は、ここに出てくる様々なアミノ酸配列に見出
されるもので、それらの３文字または１文字省略法に従い識別される。様々なＤ
ＮＡフラグメントから見出されるヌクレオチドは、当業界で常用されている標準
１文字名称により示されている（表１参照）。
【００２６】 ここで使用されているアミノ酸残基は、ポリペプチドにおけるそのペプチド結
合での化学的消化（加水分解）時に形成されるアミノ酸を指す。ここに記載され
ているアミノ酸残基は、好ましくは「Ｌ」異性体形態である。しかしながら、「
Ｄ」異性体形態の残基は、所望の機能特性がポリペプチドにより保持されている
場合、いずれのＬ−アミノ酸残基についても置換され得る。ＮＨ２は、ポリペプ
チドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドの
カルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。J．Biol.Chem.、２４３
：３５５２−５９（１９６９）に記載され、３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§§１.８２１−１.
８２２で採用されている標準ポリペプチド命名法に従い、アミノ酸残基に関する
省略形を下表に示す。
【００２７】
【表１】
【００２８】 ここで式により表されているアミノ酸残基配列は全て、アミノ末端〜カルボキ
シル末端の慣用的方向で左〜右の配向を有することに留意すべきである。さらに
、「アミノ酸残基」の表現は、対応表に列挙されたアミノ酸および修飾および普
通にはないアミノ酸、例えば３７Ｃ.Ｆ.Ｒ.§§１.８２１−１.８２２に示され
、本明細書の一部として引用されたものを包含するものとして広範に定義される
。さらに、アミノ酸残基配列の初めまたは終わりのダッシュは、１個またはそれ
以上のアミノ酸残基のさらに別の配列またはアミノ末端基、例えばＮＨ２または
カルボキシル−末端基、例えばＣＯＯＨへのペプチド結合を示すことに留意すべ
きである。
【００２９】 ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の適当な保存的置換が当技術分
野の熟練者には知られており、一般的に生成する分子の生物活性を改変すること
なく為され得る。当技術分野における熟練者であれば、一般に、ポリペプチドの
非必須領域における単一アミノ酸置換が生物活性を実質的に改変することはない
ことを認めるはずである（例えば、Watsonら、Molecular Biology of the Gene
、第４版、１９８７、ザ・ベジャクミン／カミングス・パブリッシング・カンパ
ニー、２２４頁参照）。
【００３０】 上記置換は、好ましくは次の表２に示されたものに従い行なわれる。
【表２】
【００３１】 他の置換もまた許容されており、経験的にまたは既知の保存的置換に従い決定
され得る。
【００３２】 ここで使用されている相補性プラスミドは、細胞ゲノムにおける染色体への安
定した組込みを目的としてパッケージングセルラインへ核酸を送達するプラスミ
ドベクターを包含する。
【００３３】 ここで使用されている送達プラスミドは、治療的遺伝子またはを治療的産物ま
たはその前駆体をコード化する遺伝子または調節遺伝子またはインビボでまたは
セルライン、例えば限定されるわけではないがパッケージングセルラインへ送達
されたとき治療効果をもたらすことにより、治療的ウイルスベクターを増殖させ
る他の因子をコード化する核酸を担持するかまたは送達するプラスミドベクター
である。
【００３４】 ここで使用されている通り、異なる必要条件をもつ様々なベクターが報告され
ている。例えば、あるベクターは、染色体への安定した組込みを目的として特定
核酸分子をパッケージングセルラインへ送達するのに使用される。これらのタイ
プのベクターは、一般に相補性プラスミドとしてここでは識別される。ここに記
載されているさらに別のタイプのベクターは、治療的ウイルスベクターの増殖を
目的として核酸分子をセルライン（例、パッケージングセルライン）において担
持または同セルラインへ送達する。このため、これらのベクターは、通常ここで
は送達プラスミドと称される。ここに記載されている第３「タイプ」のベクターは
、処置を必要とする対象における特異的細胞または細胞型に対し治療タンパク質
またはポリペプチドまたは調節タンパク質または調節配列をコード化する核酸分
子を担持するのに使用される。これらのベクターは、通常ここでは治療的ウイル
スベクターまたは組換えアデノウイルスベクターまたはウイルスＡｄ誘導ベクタ
ーとして識別され、治療的遺伝子を発現させるための発現カセットを含むウイル
ス核酸を封入するウイルス粒子の形態をしている。
【００３５】 ここで使用されているＤＮＡまたは核酸相同体は、予め選択された保存ヌクレ
オチド配列、例えば治療的ポリペプチドをコード化する配列を含む核酸を包含す
る。「実質的に相同性である」の語は、少なくとも８０％、好ましくは少なくと
も９０％、最も好ましくは少なくとも９５％相同性またはそれより低パーセンテ
ージの相同性または同一性および保存された生物活性または機能を有することを
意味する。
【００３６】 「相同性」および「同一性」の語は、互換的に使用されることが多い。この点
について、相同性または同一性パーセントは、例えば、ＧＡＰコンピュータープ
ログラムを用いて配列情報を比較することにより決定され得る。ＧＡＰプログラ
ムは、Smithおよび Waterman（Adv.Appl.Math.２：４８２(１９８１)）により改
訂された要領で、Needlemanおよび Wunsch（J.Mol.Biol.４８：４４３（１９７
０））のアラインメント方法を利用する。簡単に述べると、ＧＡＰプログラムは
、２配列の短い方における記号（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の総
数により類似している整列した記号の数を除したものとして類似性を定義する。
ＧＡＰプログラムにとって好ましいデフォルトパラメーターは、（１）単一項目
から成る比較マトリックス(同一性の場合には１および非同一性の場合には０の
値を含む)および Gribskovおよび Burgess、Nucl.Acids Res.１４：６７４５(１
９８６)の加重比較マトリックス（Schwartzおよび Dayhoff編、ATLAS OF PROTEI
N SEQUENCE AND STRUCTURE、ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウ
ンデーション、３５３−３５８頁（１９７９）に記載)、（２）各ギャップに関
して３.０のペナルティーおよび各ギャップにおける各記号に関して追加の０.１
０ペナルティー、および（３）末端ギャップについてはペナルティー無し、を含
み得る。
【００３７】 ２つの核酸分子が少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７
％、９８％または９９％「同一性」であるヌクレオチド配列を有するか否かは、
例えば、Pearsonおよび Lipman、Proc.Natl.Acad.Sci.USA８５：２４４４（１９
８８）における場合と同様のデフォルトパラメーターを用い、公知コンピュータ
ーアルゴリズム、例えば「ＦＡＳＴ Ａ」プログラムを用いて決定され得る。別
法として、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメー
ションのデータベースのＢＬＡＳＴ機能を使用することにより同一性が測定され
得る。
【００３８】 一般に、配列は最高序列のマッチが達成されるように並べられる。「同一性」
それ自体は、当業界で容認されている意味を有し、公表された技術を用いて計算
され得る。（例えば、Computational Molecular Biology、Lesk,A.M.編、オクス
フォード・ユニバーシティー・プレス、ニューヨーク、１９８８、Biocomputing
:Informatics and Genome Projects、Smith,D.W.編、アカデミック・プレス、ニ
ューヨーク、１９９３、Computer Analysis of Sequence Deta、Part I、Griffi
n,A.M.、および Griffin,H.G.編、ヒューマナ・プレス、ニュージャージー、１
９９４、Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje,G.、アカデミ
ック・プレス、１９８７、およびSequence Analysis Primer、Gribskov,M.およ
びDevereux,J.編、Ｍストックトン・プレス、ニューヨーク、１９９１、参照）
。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性を測定する方法が
若干存在しており、「同一性」の語は当技術分野の熟練技術者には熟知されてい
る（Carillo,H.および Lipton,D.、SIAM J Applied Math４８：１０７３（１９
８８））。２つの配列間における同一性または類似性の常用的測定方法には、限
定されるわけではないが、Guide to Huge Computers、Martin J.Bishop編、アカ
デミック・プレス、サンディエゴ、１９９４、および Carillo,H.& Lipton,D.、
SIAM J Applied Math ４８：１０７３（１９８８）に開示されたものがある。同
一性および類似性の測定方法は、コンピュータープログラムでコード化されてい
る。２つの配列間における同一性および類似性を測定する好ましいコンピュータ
ープログラム方法には、限定されるわけではないが、ＧＣＣプログラムパッケー
ジ（Devereux,J.ら、Nucleic Acids Research １２(１)：３８７（１９８４））
、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul,S.F.ら、J Molec Biol
２１５：４０３(１９９０)）がある。
【００３９】 従って、ここで使用されている「同一性」の語は、試験およびレファレンス(
基準)ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間における比較を表す。例えば、試
験ポリペプチドは、レファレンスポリペプチドと９０％またはそれ以上の同一性
を示すポリペプチドとして定義され得る。ここで使用されている少なくとも「９
０％同一性である」の語は、レファレンスポリペプチドに対して９０〜９９.９
９の同一性パーセントであることを指す。９０％またはそれ以上のレベルである
同一性は、例証を目的として仮定すると、１００アミノ酸の試験およびレファレ
ンスポリヌクレオチド長が比較されているという事実の指標である。試験ポリペ
プチドにおける僅か１０％（すなわち１００のうち１０）アミノ酸が、レファレ
ンスポリペプチドの場合と異なっている。同様の比較は、試験およびレファレン
スポリヌクレオチド間においても為され得る。上記差異は、アミノ酸配列の全長
にわたって無作為に分布した点突然変異として表され得るか、またはそれらは最
大許容範囲、例えば１０／１００アミノ酸差異（約９０％同一性）以下の様々な
長さの１箇所またはそれ以上の位置で集中した状態であり得る。差異は、核酸ま
たはアミノ酸置換または欠失として定義される。
【００４０】 ここで使用されている遺伝子療法は、上記療法が求められている疾患または病
状を呈する哺乳類、特にヒトのある種の細胞、標的細胞へ異種ＤＮＡを移入する
ことを伴う。ＤＮＡは、異種ＤＮＡが発現され、それによりコード化された治療
的産物が生産されるという方法で選択された標的細胞へ導入される。別法として
、異種ＤＮＡは、治療的産物をコード化するＤＮＡの発現を何らかの形で仲介し
得、それは何らかの形で直接的または間接的に治療的産物の発現を仲介する生成
物、例えばペプチドまたはＲＮＡをコード化し得る。また遺伝子療法を用いるこ
とにより、遺伝子産物をコード化する核酸が送達され、欠陥遺伝子が置換される
かまたはそれが導入されている哺乳類または細胞により生産される遺伝子産物が
補充され得る。導入された核酸は、哺乳類宿主において通常では生産されないか
または治療有効量で、または治療上有用な時点では生産されない治療的化合物、
例えばその成長因子阻害剤、または腫瘍壊死因子またはその阻害剤、例えばそれ
に対する受容体をコード化し得る。治療的産物をコード化する異種ＤＮＡは、罹
患宿主の細胞への導入前に修飾されることにより、生成物またはその発現を向上
させるかまたは他の形で改変させ得る。
【００４１】 ここで使用されている異種ＤＮＡは、それが発現される細胞によりインビボで
は通常生産されないＲＮＡおよびタンパク質をコード化するかまたは、転写、翻
訳または他の調節可能な生化学プロセスに作用することにより内在ＤＮＡの発現
を改変する伝達物質を仲介またはコード化するＤＮＡである。異種ＤＮＡはまた
、外来ＤＮＡとも称され得る。当業界の熟練者が、それが発現されている細胞に
とって異種または外来であると認識または見なすＤＮＡは全て、ここでは異種Ｄ
ＮＡに包含される。異種ＤＮＡの例には、追跡可能なマーカータンパク質、例え
ば薬剤耐性を賦与するタンパク質をコード化するＤＮＡ、治療有効物質、例えば
抗癌剤、酵素およびホルモンをコード化するＤＮＡ、および他のタイプのタンパ
ク質、例えば抗体をコード化するＤＮＡがあるが、これらに限定はされない。異
種ＤＮＡによりコード化される抗体は、異種ＤＮＡが導入された細胞表面で分泌
または発現され得る。
【００４２】 この故、ここで異種ＤＮＡまたは外来ＤＮＡは、対応する野生型アデノウイル
スにおいて見出される対応物質のＤＮＡ分子として正確な配向および位置では存
在しないＤＮＡ分子を包含する。それはまた、別の生物体または種(すなわち外
性)または別のＡｄ血清型からのＤＮＡ分子も包含し得る。
【００４３】 ここで使用されている治療有効産物は、異種ＤＮＡによりコード化される生成
物であって、宿主へのＤＮＡの導入時、遺伝的または後天的疾患の症状、徴候を
有効に改善または排除するかまたは上記疾患を治癒させる生成物が発現される。
【００４４】 典型的には、所望の異種ＤＮＡをコード化するＤＮＡは、プラスミドベクター
へクローン化され、常用方法、例えばリン酸カルシウム仲介ＤＮＡ取込み（(１
９８１)Somat.Cell.Mol.Genet.７：６０３−６１６参照）または顕微注入により
生産細胞、例えばパッケージング細胞へ導入される。生産細胞における増幅後、
異種ＤＮＡを含むベクターは、選択された標的細胞へ導入される。
【００４５】 ここで使用されている発現または送達ベクターは、適当な宿主細胞で発現させ
るため、すなわちＤＮＡによりコード化されるタンパク質またはポリペプチドを
宿主細胞系で合成させるため、外来または異種ＤＮＡが挿入され得るプラスミド
またはウイルスを全て包含する。１種またはそれ以上のタンパク質をコード化す
るＤＮＡセグメント（遺伝子）の発現を指令し得るベクターは、ここでは「発現
ベクター」と称される。また、逆転写酵素を用いて製造されるｍＲＮＡからのｃ
ＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）のクローニングを可能にするベクターも包含される。
【００４６】 ここで使用されている遺伝子は、そのヌクレオチド配列がＲＮＡまたはポリペ
プチドをコード化する核酸分子である。遺伝子はＲＮＡまたはＤＮＡであり得る
。遺伝子は、コーディング領域に先行および後続する領域（リーダーおよびトレ
ーラー）並びに個々のコーディングセグメント（エキソン）間における介在配列
（イントロン）を含み得る。
【００４７】 ここで使用されているアデノウイルスに関する屈性は、ファイバータンパク質
、例えばノブを含むＣ−末端部分により粒子上に付与される選択的感染性または
結合性を指す。
【００４８】 ここで使用されている、核酸分子またはポリペプチドまたは他の生物分子に関
して「単離された」とは、ポリペプチドまたは核酸が得られる遺伝的環境から核
酸またはポリペプチドが分離されたことを意味する。それはまた自然状態から改
変されたことを意味し得る。例えば、生きている動物に天然に存在するポリヌク
レオチドまたはポリペプチドは「単離されて」いないが、この語がここで使用さ
れているように、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドでもその自然状態の
共存物質から分離された場合は「単離されて」いる。すなわち、組換え宿主細胞
内で製造および／または包含されているポリペプチドまたはポリヌクレオチドは
単離されていると見なされる。また、組換え宿主細胞または天然供給源から部分
的または実質的に精製されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、「単離ポ
リペプチド」または「単離ポリヌクレオチド」として考えられる。例えば、化合
物の組換えにより製造されたバージョンは、Smithおよび Johnson、Gene６７：
３１−４０(１９８８)に記載された一段階方法により実質的に精製され得る。「
単離された」および「精製された」の語は、互換的に使用される場合もある。
【００４９】 すなわち、「単離された」とは、核酸が、生物体の天然ゲノムにおいて（ある
としても）興味の対象である核酸をコード化する遺伝子の両端に隣接する遺伝子
のコーディング配列を含まないことを意味する。単離ＤＮＡは一本鎖または二本
鎖であり得、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えハイブリッドＤＮＡまたは合成Ｄ
ＮＡであり得る。それは天然ＤＮＡ配列と同一であり得るか、または１個もしく
はそれ以上のヌクレオチドの欠失、付加または置換により上記配列とは異なり得
る。
【００５０】 「単離された」または「精製された」が生物学的細胞または宿主から製造され
た製品について用いられている場合、興味の対象であるＤＮＡまたはタンパク質
の粗抽出物を含め示されたＤＮＡまたはタンパク質を含むあらゆる細胞抽出物を
意味する。例えば、タンパク質の場合、精製製品は個々の技術または一連の調製
的または生化学的技術に従って得られ、興味の対象であるＤＮＡまたはタンパク
質はこれらの製品において様々な純度で存在し得る。これらの方法には、限定さ
れるわけではないが、例えば硫酸アンモニウム分画、ゲル濾過、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心分離および
電気泳動が含まれ得る。
【００５１】 「実質的に純粋な」または「単離された」ＤＮＡまたはタンパク質の製品は、
上記ＤＮＡまたはタンパク質が通常は実際に随伴している天然物質を含まない製
品を意味するものと理解されるべきである。「本質的に純粋な」は、興味の対象
であるＤＮＡまたはタンパク質の少なくとも９５％を含む「高度に」精製された
製品を意味するものと理解されるべきである。
【００５２】 興味の対象であるＤＮＡまたはタンパク質を含む細胞抽出物は、興味の対象で
あるタンパク質を発現するかまたは同ＤＮＡを含む細胞から得られたホモジネー
ト製品または細胞不含有製品を意味するものと理解されるべきである。「細胞抽
出物」の語は、培養培地、特に細胞が除去された後の消費された培養培地を含む
ものとする。
【００５３】 ここで使用されているパッケージングセルラインは、欠落している遺伝子産物
またはその均等内容物を提供するセルラインである。
【００５４】 ここで使用されているアデノウイルスのウイルス粒子は、ウイルスの最小構造
または機能単位である。ウイルスは、単一粒子、粒子のストックまたはウイルス
ゲノムを包含し得る。アデノウイルス（Ａｄ）粒子は比較的複雑であり、様々な
下部構造に分解され得る。
【００５５】 ここで使用されている「ペントン」または「ペントン複合体」は、ペントン基
部およびファイバーの複合体を示す場合にここでは優先的に使用されている。「
ペントン」の語はまた、ペントン基部およびペントン複合体を示すのに使用され
得る。単独での「ペントン」という語の意味は、それが使用されている文脈から
当然明らかになるはずである。
【００５６】 ここで使用されているプラスミドは、自律性自己複製染色体外環状核酸分子、
代表的にはＤＮＡを指す。
【００５７】 ここで使用されている転写後調節エレメント（ＰＲＥ）は、スプライシングさ
れていないウイルスまたは細胞メッセンジャーＲＮＡ、すなわちイントロンの無
いメッセージから見出される調節エレメントである。例としては、ヒト肝炎ウイ
ルス、ウッドチャック肝炎ウイルス、ＴＫ遺伝子およびマウスヒストン遺伝子が
あるが、これらに限定されるわけではない。ＰＲＥは、ポリＡ配列前および異種
ＤＮＡ配列後に置かれ得る。
【００５８】 ここで使用されている、シュードタイピングは、修飾キャプシドタンパク質ま
たはベクター自体の血清型とは異なる血清型からのキャプシドタンパク質を有す
るアデノウイルスベクターの製造を示す。一例は、Ａｄ３７ファイバータンパク
質を含むアデノウイルス５ベクター粒子の製造である。これは、異なるファイバ
ータンパク質を発現するパッケージングセルラインにおいてアデノウイルスベク
ターを製造することにより達成され得る。
【００５９】 ここで使用されている、この場合興味の対象であるプロモーターは、誘導性ま
たは構成的であり得る。誘導性プロモーターは、追加的分子の存在下でのみ転写
を開始させる。構成的プロモーターは、遺伝子発現を調節するのに追加的分子の
存在を全く必要とはしない。調節可能または誘導性プロモーターはまた、ＲＮＡ
ポリメラーゼ結合および開始の速度または範囲が外的刺激因子により変調される
場合のプロモーターとして説明され得る。上記刺激因子には、様々な化合物また
は組成物、光線、熱、ストレスおよび化学エネルギー供給源があるが、これらに
限定はされない。誘導性、抑圧的および抑制性プロモーターは、調節可能なプロ
モーターと考えられる。ここで好ましいプロモーターは、眼の細胞、特に光受容
体細胞において選択的に発現されるプロモーターである。
【００６０】 ここで使用されている、受容体(レセプター)は、他の分子に（または分子と）
特異的または選択的に結合する生物活性分子を包含する。「受容体タンパク質」
の語は、特異的受容体のタンパク質性をさらに具体的に示すのに使用され得る。
【００６１】 ここで使用されている、組換え体は、遺伝子工学技術の結果として形成された
あらゆる子孫を包含する。これはまた、パッケージング細胞におけるプラスミド
の組換えにより形成されるウイルスを示すのに使用され得る。
【００６２】 ここで使用されている、導入遺伝子または治療核酸分子は、ＲＮＡまたはポリ
ペプチドをコード化するＤＮＡおよびＲＮＡ分子を包含する。上記分子は、「天
然」または自然誘導配列であり得る。それらはまた、自然にまたは組換え的に誘
導された「非天然」または「外来」であり得る。「導入遺伝子」の語は、ここで
は「治療核酸分子」の語と互換的に使用され得るもので、ウイルスベクターによ
り担持され、宿主細胞に形質導入される異種または外来（外性）遺伝子を示すの
に使用されることが多い。
【００６３】 従って、治療ヌクレオチド核酸分子は、アンチセンス配列またはアンチセンス
配列へ転写され得るヌクレオチド配列を含む。治療ヌクレオチド配列(または導
入遺伝子)は全て、治療配列が送達される細胞または細胞核において所望の効果
を生み出すべく機能する核酸分子を含む。例えば、治療核酸分子は、機能性タン
パク質を製造し得ない細胞への送達を意図した機能性タンパク質をコード化する
ヌクレオチドの配列を含み得る。
【００６４】 ここで使用されている、目の硝子体は、水晶体後部の眼房を満たす物質（すな
わち、硝子体液または硝子体）を指す。
【００６５】 ここで使用されている、プロモーター領域は、それが機能し得るように結合し
ているＤＮＡの転写を制御する遺伝子のＤＮＡの一部分を指す。プロモーター領
域は、ＲＮＡポリメラーゼ認識、結合および転写開始に充分なものであるＤＮＡ
の特異的配列を含む。プロモーター領域のこの部分は、プロモーターと称される
。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転
写開始活性を変調する配列を含む。これらの配列は、シス作用性であり得るかま
たはトランス作用性因子に対し応答性であり得る。プロモーターは、調節の性質
により、構成的であるかまたは調節され得る。
【００６６】 すなわち、プロモーターは、プロモーターの３’または下流に位置する遺伝子
の発現を制御するＤＮＡ配列を含む核酸フラグメントである。プロモーターは、
ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するＤＮＡ配列であり、典型的にはプロモー
ターの３'に位置する、その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始させる。プロモ
ーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合するものを含め、転写の開始
を指令するＤＮＡ配列を包含する。特定ポリペプチドまたはタンパク質をコード
化する複数の核酸配列が治療ウイルスベクターまたはヌクレオチド配列に含まれ
る場合、特に発現効率が高めるものである場合に複数のプロモーターまたはエン
ハンサーエレメントが含まれ得る。
【００６７】 調節可能または誘導性プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼ結合および開始速
度が外的刺激因子により変調されるプロモーターとして説明され得る（例えば、
アメリカ合衆国特許第５７５０３９６および５９９８２０５号参照）。上記刺激
因子には、様々な化合物または組成物、光線、熱、ストレス、化学エネルギー供
給源などがある。誘導性、抑圧的および抑制性プロモーターは、調節可能なプロ
もモーターと考えられる。
【００６８】 調節可能なプロモーターはまた、組織特異的プロモーターを含み得る。組織特
異的プロモーターは、それらが特異的細胞型に機能し得るように結合している遺
伝子の発現を指令する。組織特異的プロモーターは、プロモーターがその内在性
遺伝子を発現させた特異的細胞において、排他的ではないとしても、主としてそ
の３'に位置する遺伝子の発現を誘発する。典型的には、組織特異的プロモータ
ーが実際にそれの３'に位置する遺伝子を発現させる場合、それは正しい細胞型
で好適に発現されると思われる（例えば、Palmiterら(１９８６)Ann.Rev.Genet.
２０：４６５−４９９参照）。
【００６９】 ここで使用されている、「機能し得るように結合された」の表現は、一般的に
、配列またはセグメントが、一本鎖または二本鎖のいずれの形態であろうと、一
片のＤＮＡに共有結合的に結合されたことにより、一セグメントにおける制御配
列が発現または複製または制御し、他のセグメントの他の上記制御配列について
も同様であることを意味する。２つのセグメントは必ずしも連続していない。
【００７０】 ここで使用されている「外性の」とは、ここに提供されている治療方法により
投与されるあらゆる治療組成物を包含する。すなわち、「外性の」はまた、ここ
では外来または非天然または他の均等内容の発現を示し得る。
【００７１】 Ｂ．Ａｄ３７ファイバー屈性 アデノウイルスファイバータンパク質は、アデノウイルス屈性の主たる決定因
子である（Gallら(１９９６)J.Virol.７０：２１１６−２１２３、Stevensonら(
１９９５)J.Virol.６９：２８５０−２８５７）。ファイバータンパク質は、カ
プシドから伸長し、特異的細胞受容体に結合することにより細胞表面へのウイル
ス結合を仲介する（Philipsonら(１９６８)J.Virol.２：１０６４−１０７５）
。ファイバーは、アデノウイルスペントン基部と相互作用するＮ−末端尾部ドメ
イン、様々な長さを有する中心シャフトドメイン、および細胞受容体結合部位を
含むＣ−末端ノブドメインを含む三量体タンパク質である（Chroboczekら(１９
９５)Curr.Top.Microbiol.Immunol.１９９：１６３−２００、Riurokら(１９９
０)J.Mol.Biol.２１５：５８９−５９６、Stevensonら(１９９５)J.Virol.６９
：２８５０−２８５７）。大部分のアデノウイルスサブグループのファイバータ
ンパク質は、４６ｋＤａのコクサッキーウイルス‐アデノウイルス受容体（ＣＡ
Ｒ）に特異的または選択的に結合することが示された（Bergelsonら(１９９７)S
cience ２７５：１３２０−１３２３、Roelvinkら(１９９８)J.Virol.７２：７
９０９−７９１５）。ＣＡＲは、様々なレベルで肺を含む様々なヒト組織におい
て発現されると思われる（Bergelsonら(１９９７)Science２７５：１３２０−１
３２３）が、Ａｄ３７は肺上皮細胞にはあまり結合しない（Huangら(１９９９)J
.Virol.７３：２７９８−２８０２）。これは、この血清型の屈性がＣＡＲ発現
とは関係無い因子により影響され得ることを示している。
【００７２】 構造および生化学データはまた、異なる受容体結合部位がＡｄ５およびＡｄ３
７ファイバーノブの異なる領域に位置することを示している。Xiaら(Xiaら(１９
９４)Structure２：１２５９−１２７０)の命名法を採用すると、Ａｄ５に対す
る受容体結合部位は、ファイバーノブ側におけるＡＢ−ループに位置する（Bewl
eyら(１９９９)Science ２８６：１５７９−１５８３、Roelvinkら(１９９９)Sc
ience ２８６：１５６８−１５７１）。ＣＤループに位置する、Ａｄ３７ファイ
バーの２４０位にあるリシン残基が受容体結合にとって重要であることは知られ
ている（Huangら(１９９９)J.Virol.７３：２７９８−２８０２）。Ａｄ１２ノ
ブおよびＣＡＲのＮ−末端ドメインの共結晶構造（Bewleyら(１９９９)Science
２８６：１５７９−１５８３）は、ＣＤループがＣＡＲとは接触していないこと
を示している。すなわち、Ａｄ５およびＡｄ３７ファイバーノブの異なる領域が
異なる細胞受容体を認識すると思われる。
【００７３】 コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス（ＣＡＲ）に関する４６ｋＤａ受
容体は、多くのアデノウイルス血清型に関する結合を仲介する。ＣＡＲは広範に
分布しているため、ある種のアデノウイルス血清型（すなわちＡｄ３７）が深刻
な眼の感染症、例えば流行性角結膜炎（ＥＫＣ）に多大に関連している理由は説
明できない。Ａｄ３７はＣＡＲを使用しないが、代わりにその一次受容体として
シアル酸を含む糖蛋白質を使用する（Arnbergら(２０００)J.Virol.７４：４２
−４８）。また、一細胞当たりのＡｄ３７結合部位数が多くはないこと（Huang
ら(１９９９)J.Virol.７３：２７９８−２８０２）は、Ａｄ３７が、結膜細胞へ
の結合に関するその一次受容体として特異的糖蛋白質を認識することを示してい
る。
【００７４】 アデノウイルス３７型（サブグループＤ）は、目および生殖器系の感染症に関
連している。Ａｄ３７の屈性は、そのファイバータンパク質の結合優先性に由来
しており、チャングＣ、結膜上皮セルラインを含む細胞の表面に位置する受容体
に結合する（Huangら(１９９９)J.Virology７３：２７９８−２８０２）。
【００７５】 Ａｄ３７ファイバーが結合する結膜細胞で優先的に発現されるタンパク質受容
体がここでは示されている。結膜細胞におけるＡｄ３７受容体タンパク質の優先
的発現は、この受容体がＡｄ３７屈性に影響すると思われ、当然眼の発病の鍵を
握る役割を演じるはずであることを示唆している。Ａｄ３７は、結膜細胞で選択
的に発現される独特なタンパク質受容体を使用することがここでは示されている
。Ａｄ３７は、結膜（チャングＣ）には強く結合するが、肺癌細胞（Ａ５４９）
にはあまり結合しないことが示されている。感染が細胞結合性と相関関係を示す
か否かを測定するため、Ａｄ３７ファイバータンパク質を含むＡｄ５ベクターを
構築した。「シュードタイプ」ベクターは、導入遺伝子をＡ５４９細胞よりもチ
ャングＣ細胞の方へ送達した。Ａｄ３７結合性がチャングＣ細胞のプロテアーゼ
処理により破壊されたことから、受容体は膜タンパク質であることが示されてい
る。結膜細胞へのＡｄ３７結合性は、カルシウム依存的であることがここでは示
されている。また、Ａｄ３７感染は機能遮断性抗ＣＡＲモノクローナル抗体によ
り阻害されなかったことが示されており、これはＣＡＲとのＡｄ５ファイバー相
互作用とは異なる特徴である。ウイルスオーバーレイタンパク質ブロット検定法
（ＶＯＰＢＡ）を用いることにより、Ａ５４９細胞ではなくチャングＣ細胞にお
ける５０ｋＤａ膜タンパク質へのカルシウム依存的Ａｄ３７結合性が検出された
。Ａｄ１９ｐ、すなわち結膜細胞に結合し得ない密接に関連した血清型は、５０
ｋＤａタンパク質を認識しない。これらのデータを考え合わせると、５０ｋＤａ
タンパク質は結膜細胞でのＡｄ３７に関する候補受容体であることを示される。
【００７６】 重要なことに、ここではまた、硝子体液にベクターを投与すると、Ａｄ３７フ
ァイバーを伴う組換えアデノウイルスは、光受容体細胞に優先的および選択的に
結合することが示されている。このため、Ａｄ３７ファイバータンパク質を有す
る組換えアデノウイルス送達ビークルは、遺伝的および後天的疾患を含む眼科疾
患の処置を目的として目に治療剤を送達するためのベクターとしての役割を果た
し得る。Ａｄ３７に関する受容体が同定され、その結果Ａｄ３７屈性が認識され
ることにより、特異的ヒト眼細胞へのアデノウイルスベクターのターゲッティン
グが可能となる。
【００７７】 注目されている通り、ファイバーは、細胞表面の特異的受容体へウイルスを結
合させることによりアデノウイルス感染において重大な役割を演じている。ヘキ
ソン、ペントンおよびファイバーキャプソマーは、ビリオン表面における主要成
分である。ファイバーは、５８２アミノ酸長を有する３つの同一ポリペプチド（
ポリペプチドIV）の三量体として存在する細長いタンパク質である。アデノウイ
ルスベクターは３つのドメイン：ペントン基部と相互作用するＮ−末端尾部ドメ
イン、ベータ‐シートおよびベータベンドを形成する１５アミノ酸セグメントの
可変数の反復単位から成るシャフト、および型特異的抗原を含み細胞表面受容体
への結合に関与するＣ−末端のノブ（「ヘッドドメイン」）を含む。Ａｄ２から
のファイバータンパク質をコード化する遺伝子は、ヒト細胞で発現され、三量体
に正確に組立てられ、グリコシル化され、核へ輸送されることが示された（例え
ば、Hongおよび Engler、Virology １８５：７５８−７６１、１９９１、参照）
。すなわち、組換えＡｄベクターにおけるファイバーの改変により、遺伝子送達
の改変が誘導され得る。
【００７８】 ここに示されている通り、ファイバーがＡｄ３７または別のアデノウイルス血
清型Ｄから誘導されるように組換えＡｄベクターにおいてファイバーが改変され
ると、結膜細胞、および最も重要である光受容体を含む眼の特定細胞への組換え
ウイルスの選択的送達手段が提供され、それによって光受容体細胞へターゲッテ
ィングされた送達手段が提供される。
【００７９】 光受容体細胞は、若干の遺伝的および後天的網膜変性疾患に関与している。さ
らに、光受容体細胞は、そこで製造された生成物が、光受容体細胞付近の血流に
より、およびまた網膜色素上皮（ＲＰＥ）および他の網膜細胞へ光受容体が近接
していることにより目の他領域へ送達され得るような形で位置している。
【００８０】 このため、組換えウイルスベクターは、少なくとも複製およびパッケージング
のための最少エレメント、所望の遺伝子産物、典型的には一治療産物または複数
の同産物、例えば幾つかの栄養因子であって、その活性を合わせると疾患、例え
ば網膜変性疾患の処置に有効であるものをコード化する異種ＤＮＡを含むパッケ
ージされた組換えアデノウイルスゲノムを含むとここでは考えられる。そして生
成したビリオン粒子は、組換えウイルス粒子が哺乳類、好ましくはヒトの目の房
水へ導入されているかまたは他の形で光受容体細胞と接触しているとき光受容体
細胞への特異的ターゲッティングを付与するのに充分な部分を有するファイバー
を含む。ファイバーは、他のコート構造タンパク質、例えばペントンと有効に相
互作用するように修飾されたキメラタンパク質であり得る。さらに、ファイバー
は、その屈性を改変することにより他細胞への結合をも可能にする他のエレメン
トを含むように修飾され得る（例えば、アメリカ合衆国特許第５７５６０８６号
および同５５４３３２８号、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９５／２６４１２号および同
ＷＯ９８／４４１２１号および Krasnykhら、J.Virol.７０：６８３９−４６(１
９９６)参照）。
【００８１】 Ｃ.ウイルス粒子の構築 １．ウイルスゲノムおよびファイバータンパク質の選択 遺伝子産物送達用の組換えアデノウイルスベクターの製造方法は熟知されてい
る。それらの中でも好ましいのは、ここに例として挙げられ（「実施例」参照）
、また同時係属中のアメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８２号（２０００
年１月１４日付、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５号としても出
願されており、アメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８２号と同様、アメリ
カ合衆国仮出願第６０／１１５９２０号について優先権を主張している）に記載
された方法である。
【００８２】 注目されている通り、ウイルスゲノムが、光受容体細胞への選択的結合性を提
供するファイバータンパク質の少なくとも一部分を含むカプシドにパッケージさ
れているのであれば、いかなる所望の組換えアデノウイルスでも本方法で使用さ
れるものと考えられる。このファイバータンパク質は、好ましくはアデノウイル
スＤ型血清型に由来し、好ましくはＡｄ３７ファイバーである。ファイバータン
パク質は、型特異的抗原を含み、細胞表面受容体への結合に関与しているサブグ
ループＤのＡｄウイルスからのＣ末端にノブ領域（「ヘッドドメイン」）を保持
しているべきである。このため、ファイバータンパク質が光受容体細胞への特異
的または選択的結合にとってＤ型血清型の充分な部分を保持しているのであれば
、それはキメラファイバータンパク質であり得る。一般的に保持されている部分
は、ノブ領域の全部または一部分である。必要とされるノブ領域の正確な量は、
その部分を含ませ、パッケージしたビリオンを房水中へ導入した時点で目の光受
容体に対する上記ファイバーと共にパッケージされたビリオンの選択的ターゲッ
ティングを遂行させるために、ＡｄＤ型血清型、好ましくはＡｄ３７からの最小
限の残基を同定することにより経験的に決定され得る。
【００８３】 所望の産物、例えば遺伝的欠陥を正す遺伝子をコード化する異種核酸を含む組
換えアデノウイルスは、当業界の熟練者にはよく知られた方法により製造され得
る。ウイルスは、目の細胞に対しウイルス粒子を特異的、選択的または優先的に
ターゲッティングする（結合し、インターナリゼーションを誘発する）粒子上の
ファイバーの発現をもたらすセルラインにパッケージされなければならない。Ａ
ｄ３７および目に感染する血清型Ｄの他のアデノウイルスからのファイバータン
パク質は、上記ターゲッティングを遂行する。上記ファイバーを発現する生成さ
れたアデノウイルス粒子は、眼内注射、網膜下注射、特に硝子体注射、または光
受容体細胞での優先的蓄積を導く何らかの手段により投与される。
【００８４】 アデノウイルス科は、少なくとも４７種の既知血清型のヒトアデノウイルス（
Ａｄ１−Ａｄ４７）をもつ多くの構成員（Shenk、Virology、６７章、Fieldsら
、Lippincott-Raven編、フィラデルフィア、１９９６）、並びにヒト、サル、ウ
シ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌおよびオポッサムウイルスを含むマストアデノウ
イルス(Mastadenovirus)属の構成員およびトリウイルス、例えばＣＥＬＯを含む
アヴィアデノウイルス(Aviadenovirus)属の構成員を含む。
【００８５】 すなわち、ここに記載された方法は、アデノウイルス種から誘導されたあらゆ
る組換えウイルスベクターに適用され得ると考えられる。当業界の熟練者であれ
ば、異なるアデノウイルス（例えば、Shenk、Virology、６７章、Fieldsら、Lip
pincott-Raven編、フィラデルフィア、１９９６、参照）の知識を有し、上記ウ
イルスのゲノムの一部分を含む組換えウイルスを構築し得るはずである。
【００８６】 例として示された態様では、Ａｄ３７ファイバーをもつウイルス粒子が製造さ
れた。部位特異的変異をＡｄ３７ファイバー遺伝子に導入して、尾部配列をＡｄ
５のそれとさらに密接にマッチさせることにより、Ａｄ５ペントン基部へのＡｄ
３７ファイバーの結合が容易にされた。Ａｄ３７ファイバータンパク質発現用プ
ラスミド、ｐＤＶ８０は、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス５型三連リーダ
ー（ＴＰＬ）、および修飾Ａｄ３７ファイバー遺伝子配列を含む。興味の対象で
ある遺伝子、例えばｃＧＭＰホスホジエステラーゼのβサブユニット（βＰＤＥ
）、β−グルクロニダーゼ、ロドプシン、成長因子、抗癌剤、成長因子受容体お
よび他の抗血管形成剤、および抗アポトーシス剤をコード化する核酸は、当業界
の熟練者に公知であり、ここに例として挙げられた方法を用いてこれらのベクタ
ーに組込まれ得る。
【００８７】 先に眼内治療用に構築された公知アデノウイルスベクター（例えば、Bennett
ら（１９９６）Nature Medicine ２：６４９−６５４、網膜色素変性症処置用の
βＰＤＥをコード化するＡｄウイルスを提供、Cayouetteら（１９９８）Human G
ene Therapy ８：４２３−４３０、網膜色素変性症および他の網膜変性疾患処置
用のＣＮＴＦを発現するＡｄベクターを提供、および Liら（１９９５）Proc.Na
tl.Acad.Sci.U.S.A.９２：７７００−７７０４、β‐グルクロニダーゼ欠損によ
り誘発されるリソソーム蓄積症処置用のヒトβ‐グルクロニダーゼコード化する
Ａｄウイルスベクターを提供、参照）は、Ａｄ３７ファイバーまたは他のＤ血清
型ファイバーを発現するパッケージング株を用いて組換えゲノムを再パッケージ
ングすることにより修飾され得る。
【００８８】 実例を示すため、ＧＦＰをコード化する核酸を、それらの局在性を視覚化する
手段としてこれらのベクターに組込んだ。他の遺伝子、例えば治療産物をコード
化する遺伝子も、ＧＦＰの代わりにまたはそれに加えて含まれ得る。
【００８９】 プラスミドｐＤＶ８０をＥ１−２ａ Ｓ８細胞へ電気穿孔し、安定したライン
を選択した。ファイバー欠失ベクターＡｄ５.βgal.ΔＦおよびＡｄ５.ＧＦＰ.
ΔＦを７０５と命名された、生成したセルラインにおける細胞で培養することに
より、Ａｄ３７ファイバー（Ａｄ５.βgal.ΔＦ／３７ＦおよびＡｄ５.ＧＦＰ.
ΔＦ／３７Ｆ）を発現するビリオンを製造し、ＣｓＣｌ精製した。これらのビリ
オンは、硝子体液中へ眼内注射されたとき、光受容体細胞を選択的に形質導入す
る。
【００９０】 ２．パッケージング 組換えアデノウイルスベクターは、一般的に、Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域を含む
、Ｅ１と称される第一ウイルス初期遺伝子領域に少なくとも一欠失を有する。ウ
イルスＥ１領域が欠失していることにより、組換えアデノウイルスは複製能力に
欠陥があり、後続感染標的細胞において感染性ウイルス粒子を製造することがで
きない。すなわち、Ｅ１欠失アデノウイルスゲノム複製を作製し、ウイルス粒子
を製造するには、欠落しているＥ１遺伝子産物を供給する相補のシステムが必要
とされる。Ｅ１相補性は、一般的にはＥ１を発現するセルライン、例えばヒト胚
性腎臓パッケージングセルライン、すなわち上皮セルライン、いわゆる２９３に
より提供される。セルライン２９３は、セルラインにおけるＥ１欠失ウイルスの
増殖を「支える」ためのＥ１遺伝子領域産物を提供する、アデノウイルスのＥ１
領域を含む（例えば、Grahamら、J.Gen.Virol.３６：５９−７１、１９７７、参
照）。さらに、アデノウイルスＥ４領域の一部分を有する欠陥アデノウイルスの
製造に使用され得るセルラインが報告されている（ＷＯ９６／２２３７８）。
【００９１】 多様に欠陥アデノウイルスベクターおよび相補性セルラインについても報告さ
れている（ＷＯ９５／３４６７１、アメリカ合衆国特許第５９９４１０６号）。
【００９２】 同時係属中のアメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８２号（２０００年１
月１４日付で、国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５号としても出願
されている）は、ヘルパーウイルスを必要とせず、ウイルスゲノムの主要部分の
欠失を伴うウイルスベクターを支えるパッケージングセルラインを提供し、また
ヘルパー依存性ベクターにより使用されるセルラインおよびヘルパーウイルスを
提供する。パッケージングセルラインは、細胞ゲノムの染色体に安定した状態で
組込まれた異種ＤＮＡを有する。異種ＤＮＡ配列は、複製およびパッケージング
されるアデノウイルスベクターゲノムにおいて欠失または突然変異した遺伝子を
相補する１個またはそれ以上のアデノウイルス調節および／または構造ポリペプ
チドをコード化する。パッケージングセルラインは、例えば、１種またはそれ以
上のアデノウイルス構造タンパク質、ポリペプチドまたはそのフラグメント、例
えばペントン基部、ヘキソン、ファイバー、ポリペプチドIIIa、ポリペプチドＶ
、ポリペプチドVI、ポリペプチドVII、ポリペプチドVIIIおよびそれらの生物活
性フラグメントを発現する。発現は構成的であるかまたは調節可能プロモーター
の制御下であり得る。これらのセルラインは、治療的産物送達が意図された組換
えアデノウイルスの発現用に設計されている。
【００９３】 特定パッケージングセルラインは、アデノウイルス構造タンパク質、調節ポリ
ペプチドＥ１ＡおよびＥ１Ｂ、および／または次の調節タンパク質またはポリペ
プチド：Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｌ４またはそのフラグメントの１種また
はそれ以上をコード化するＤＮＡ配列の欠失または突然変異を有するウイルスベ
クターを相補する。
【００９４】 パッケージングセルラインは、各ＤＮＡ分子を別々の相補性プラスミドにより
細胞へ、次いでゲノムへ導入することにより製造されるか、または相補性タンパ
ク質をコード化する複数のＤＮＡ分子は、単一相補性プラスミドにより導入され
得る。ここで興味の対象となるのは、相補性プラスミドが、サブグループＤのＡ
ｄウイルス、例えばＡｄ３７、ポリペプチドまたはそのフラグメントからのアデ
ノウイルスファイバータンパク質（またはそのキメラまたは修飾変異型）をコー
ド化するＤＮＡを含む変異型である。
【００９５】 治療適用を目的とする場合、送達プラスミドは、さらに外来ポリペプチドをコ
ード化するヌクレオチド配列を含む。送達プラスミドの例には、ｐＤＶ４４、ｐ
ΔＥ１Ｂβ−galおよびｐΔＥ１sp１Ｂを含み、これらに限定されるわけではな
い。類似または同様の方法で、治療遺伝子は導入され得る。
【００９６】 細胞は、さらにここで予測されるようにファイバーをコード化する相補性プラ
スミドを含む。すなわち、プラスミドまたはその一部分は、細胞の細胞ゲノムの
染色体（複数も可）に組込まれる。
【００９７】 一態様において、組成物は、第一および第二送達プラスミドを含む細胞を含み
、その場合、第一送達プラスミドは、ファイバーをコード化するヌクレオチド配
列を欠き、第二送達プラスミドの不存在下では新規ウイルス粒子のパッケージン
グを指令できないアデノウイルスゲノムを含み、そして第二送達プラスミドは、
第一送達プラスミドの存在下で新規ウイルス粒子のパッケージングを指令できる
アデノウイルスゲノムを含む。
【００９８】 一変異形において、パッケージングセルラインは、サブグループＤのＡｄウイ
ルス、好ましくはＡｄ３７血清型からのファイバータンパク質またはそのキメラ
変異型を発現するか、またはそれは、哺乳類、好ましくはヒトの目の硝子体液へ
の導入時における光受容体への選択的ターゲッティングに関与する、サブグルー
プＤのＡｄウイルス、例えばＡｄ３７の一部分を含むように修飾が加えられたも
の以外のいかなるファイバータンパク質でもあり得る。さらにファイバータンパ
ク質は、追加の特異的受容体をターゲッティングする非天然アミノ酸残基配列を
含むように修飾され得る。どの場合でも、修飾により三量体形成または核へのフ
ァイバーの輸送が破壊されるべきではない。別の変異形では、非天然アミノ酸残
基配列により、ターゲッティングされた細胞型に関してファイバーの結合特異性
が改変される。構造タンパク質であるファイバーは、複数のアデノウイルス血清
型からのアミノ酸残基配列を含み得る。ファイバータンパク質またはポリペプチ
ドをコード化するヌクレオチド配列は、一方または両方の末端でのみ修飾される
必要は無い。ファイバータンパク質は、「内的に」および末端で修飾され得る。
【００９９】 追加の核酸フラグメントは、ファイバータンパク質へ付加されるポリペプチド
をコード化し得る。一変異形では、非天然アミノ酸残基配列は、ファイバーのカ
ルボキシル末端に結合される。別の場合には、非天然アミノ酸残基配列は、さら
にリンカー配列を含む。別法として、ファイバータンパク質は、さらにリンカー
に結合されたリガンドを含む。適当なリガンドには、細胞表面受容体に特異的ま
たは選択的に結合するリガンドおよび他のタンパク質または核酸分子の結合に使
用され得るリガンドがあるが、これらに限定されるわけではない。典型的には、
パッケージングセルラインは、細胞ゲノムにおける一染色体または複数の染色体
に安定して組込まれたファイバータンパク質または修飾タンパク質をコード化す
る核酸を含む。
【０１００】 パッケージングセルラインは、原核生物セルラインまたは真核生物セルライン
から誘導され得る。様々な態様では哺乳類細胞、および特に上皮セルラインの使
用が示唆されているが、多様な他の非上皮セルラインも様々な態様で使用されて
いる。すなわち、様々な態様では、２９３、Ａ５４９、Ｗ１６２、ヒーラ、ベロ
、２１１および２１１Ａセルラインから選択されたセルラインの使用が開示され
ており、上記用途に適したものであれば他のセルラインも同様にここでは包含さ
れる。
【０１０１】 ３．粒子に含まれる核酸分子の成分 本方法で使用される組換えウイルスベクターまたは治療ウイルスベクターは、
一般的にタンパク質またはポリペプチド分子をコード化する核酸フラグメント、
またはその生物活性フラグメント、または治療適用での使用が意図された他の調
節配列を含む。
【０１０２】 ウイルス粒子にパッケージされる核酸分子はまた、３'〜５'に位置し、生成物
がタンパク質である場合治療的産物エンコーディング核酸分子の発現を制御する
エンハンサーエレメントおよび／またはプロモーターを含み得る。さらに、ここ
での目的の場合、プロモーターおよび／または生成物の発現を制御する他の転写
および翻訳調節配列は、好ましくはターゲッティングされた細胞で特異的に発現
されるもの、例えば光受容体特異的プロモーター、例えばロドプシン遺伝子プロ
モーターである。
【０１０３】 ウイルスカプシドにパッケージされる核酸分子は、少なくとも２つの異なる機
能し得るように結合されたＤＮＡセグメントを含む。ＤＮＡは、ここに記載され
た要領で、そして標準技術、例えばMolecular Cloning:A Laboratory Manual、
第２版、Sambrookら編、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(１９８９)
に記載された技術を用いることにより操作および増幅され得る。一般的には、上
記分子を製造するため、選択されたポリペプチドをコード化する配列およびプロ
モーターまたはエンハンサーは、インビボまたはインビトロでの細胞において自
律的に複製し得るＤＮＡ分子に機能し得るように結合される。エンハンサーエレ
メントまたはプロモーターおよび核酸分子をベクターに機能し得るように結合す
ることにより、結合されたセグメントはベクター配列と一緒に複製される。
【０１０４】 すなわち、組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）は、通常実際に一緒には見出されな
い少なくとも２個のヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。様
々な好ましい態様において、配列の一つは、Ａｄ由来のポリペプチド、タンパク
質またはそのフラグメントをコード化する配列である。パッケージングが意図さ
れた核酸分子の長さは、約２０塩基対〜約４００００塩基対、好ましくは約５０
ｂｐ〜約３８０００ｂｐである。様々な態様において、核酸分子は、１種または
それ以上のアデノウイルスタンパク質またはその機能性ポリペプチド部分をコー
ド化するのに充分な長さを有する。そのため個々のＡｄポリペプチドは、治療的
産物エンコーディング核酸分子によりウイルスベクターで「置換」される個々の
ポリペプチド‐エンコーディング配列の数およびサイズによって、約１９アミノ
酸残基〜約９６７アミノ酸残基の範囲で長さが変化し、約５０ｂｐ〜約３０００
ｂｐ以下の核酸分子をコード化する。
【０１０５】 好ましくは、分子は、パッケージングセルラインでの発現に適したＲＮＡプロ
セッシングシグナル（例えば、スプライス供与またはスプライス受容部位）を含
むイントロンに機能し得るように結合したアデノウイルス三連リーダー（ＴＰＬ
）核酸配列を含む。最も好ましくは、イントロンは、スプライス供与部位および
スプライス受容部位を含む。別法として、ＴＰＬヌクレオチド配列は、イントロ
ンを含まない場合もあり得る。イントロンは、パッケージングセルラインで機能
することにより、ＲＮＡプロセッシングシグナル、例えばスプライシングシグナ
ルを提供するヌクレオチドの配列を含む。イントロンは、多数の構造遺伝子から
充分に特性確認されており、限定するわけではないが、アデノウイルスからの天
然イントロン１、例えばＡｄ５'のＴＰＬイントロン１がある。他にはＳＶ４０
ＶＰイントロン、ウサギβ−グロビンイントロンおよび合成イントロン構築物が
ある（例、Petitclercら（１９９５）J.Biothechnol.、４０：１６９、およびCh
oiら（１９９１０ Mol.Cell.Biol.、１１：３０７０参照）。
【０１０６】 ＴＰＬをコード化する核酸分子は、(a)第一および第二ＴＰＬエキソンまたは(
ｂ)第一、第二および第三ＴＰＬエキソンを含み、その場合配列における各ＴＰ
Ｌエキソンは、完全ＴＰＬエキソン１、部分的ＴＰＬエキソン１、完全ＴＰＬエ
キソン２および完全ＴＰＬエキソン３から選択される。完全エキソンは、野生型
ウイルスゲノムから見出される配列に基いた完全核酸配列を含むものである。好
ましくは、ＴＰＬエキソンは、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ５、Ａｄ７などに由来する
が、しかしながら、それらはここで記載されている通り、いずれかのＡｄ血清型
に由来し得る。好ましい部分的ＴＰＬエキソン１は、実施例に記載されている。
部分的エキソン１を伴うＴＰＬの用途については報告されている（国際ＰＣＴ出
願第ＷＯ９８／１３４９９号）。
【０１０７】 イントロンおよびＴＰＬエキソンは、様々な立体配置で機能し得るように結合
されることにより、機能的ＴＰＬヌクレオチド配列を提供し得る。イントロンは
構築物の一部ではないこともあり得る。例えば、イントロンは、ＴＰＬエキソン
１、２または３のいずれかの間に配置され得、そしてエキソンは第一および第二
、または第一／第二／第三のいずれかの順序であり得る。イントロンはまた、第
一ＴＰＬエキソンに先行して、または最後のＴＰＬエキソンの後に配置され得る
。好ましい態様において、完全ＴＰＬエキソン１は、完全ＴＰＬエキソン３に機
能し得るように結合された完全ＴＰＬエキソン２に機能し得るように結合されて
いる。好ましい変異形において、アデノウイルスＴＰＬイントロン１は、完全Ｔ
ＰＬエキソン１および完全ＴＰＬエキソン２の間に位置している。また、他のウ
イルス系、例えば狂犬病ウイルスからの類似翻訳レギュレーターを使用すること
も可能であり得る。
【０１０８】 アデノウイルスイントロン１がエキソン１および２間に挿入されている完全Ｔ
ＰＬエキソン１、２および３を含む好ましい「完全」ＴＰＬ核酸分子は、配列番
号３２に示されたヌクレオチド配列を有する。部分的ＴＰＬエキソン１および完
全ＴＰＬエキソン２および３をその順序で含む好ましい「部分的」ＴＰＬ核酸分
子は、配列番号２６に示されたヌクレオチド配列を有する。これらの好ましいＴ
ＰＬヌクレオチド配列の構築については、実施例に記載されている。
【０１０９】 すなわち、アデノウイルス構造遺伝子、特にファイバータンパク質を発現させ
るのに好ましい発現カセットおよび相補性プラスミドは、ここに記載されている
アデノウイルスＴＰＬヌクレオチド配列を含む。
【０１１０】 ４．相補性プラスミド また、典型的にはＤＮＡプラスミドベクターの形態であり、アデノウイルス構
造タンパク質または調節タンパク質を発現させ得る、核酸分子の用途も考えられ
る。これらの発現プラスミドは組換えアデノウイルスベクターゲノムの欠陥遺伝
子を相補するのに使用されるため、プラスミドは相補性または相補プラスミドと
称される。
【０１１１】 相補性プラスミドは、発現カセット、核酸分子によりコード化されるタンパク
質産物を発現し得るヌクレオチド配列を含む。発現カセットは、一般的にはプロ
モーターおよびプロモーターに機能し得るように結合された構造遺伝子を含む。
さらに相補性プラスミドは、ＴＰＬヌクレオチドをコード化するヌクレオチドの
配列を含むことにより、アデノウイルスゲノム複製およびパッケージングに関連
して使用された場合に構造遺伝子産物の発現を促進させ得る。
【０１１２】 相補性プラスミドは、アデノウイルス構造ポリペプチド、限定されるわけでは
ないが、例えばペントン基部、ヘキソン、ファイバー、ポリペプチドIIIａ、ポ
リペプチドＶ、ポリペプチドVI、ポリペプチドVII、ポリペプチドVIIIおよびそ
れらの生物活性フラグメントをコード化するヌクレオチドの配列に機能し得るよ
うに結合されたプロモーターを含み得る。別の変異形では、相補性プラスミドは
また、第一アデノウイルス調節ポリペプチド、第二調節ポリペプチド、および／
または第三調節ポリペプチド、および前述のものの組み合わせをコード化するヌ
クレオチドの配列を含み得る。
【０１１３】 プラスミドｐＤＶ８０は、ここでは好ましいプラスミドである。また、修飾フ
ァイバータンパク質およびキメラファイバータンパク質をコード化すべく同様の
方法で構築された他のプラスミドもこの場合に包含される。
【０１１４】 ５．核酸分子合成 合成オリゴヌクレオチドを含む核酸分子は、適当な方法、例えばホスホトリエ
ステルまたはホスホジエステル方法（例、Narang（１９７９）ら、Meth.Enzymol
.、６８：９０、アメリカ合衆国特許第４３５６２７０号、および Brownら（１
９７９）Meth.Enzymol.、６８：１０９参照）を用いて製造され得る。オリゴヌ
クレオチドの場合、ファミリー構成員の合成は、単一反応容器で同時に行われ得
るか、または独立して合成された後に予め選択されたモル比で混合され得る。同
時合成の場合、ファミリー構成員の配列の予め選択された位置で保存されている
ヌクレオチド残基は、その位置番号のオリゴヌクレオチドが増大しているオリゴ
ヌクレオチドポリマーに化学的に付加されているときに固相オリゴヌクレオチド
反応混合物へ単一の予め選択されたヌクレオチド前駆体を加えることにより化学
合成プロトコルで変異体に導入され得る。変化する配列中のそれらの位置へのヌ
クレオチド残基の付加は、化学合成中において固相オリゴヌクレオチド反応混合
物へ多様な予め選択されたヌクレオチド前駆体の適量、好ましくは当モル量を加
えることにより同時に導入され得る。例えば、４種の可能な天然ヌクレオチド（
Ａ、Ｔ、ＧおよびＣ）全てが予め選択された位置に付加される場合、それらの前
駆体はその段階でオリゴヌクレオチド合成反応に付加され、同時に４種の変異型
が形成される（例えば、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology
、補遺８、ｐ.２.１１.７、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、インコーポレ
イテッド、ニューヨーク、１９９１、参照）。
【０１１５】 ４種の共通ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、ＧまたはＣ）以外のヌクレオチド塩基、ま
たはＲＮＡ均等ヌクレオチドのウラシル（Ｕ）もまた使用され得る。例えば、イ
ノシン(Ｉ)がＣではなくＡ、ＴおよびＧとハイブリダイズし得ることはよく知ら
れている。他の有用なヌクレオチド類似体の例は当業界では公知であり、３７Ｃ
.Ｆ.Ｒ.§１.８２２において示されているのが見出され得る。
【０１１６】 すなわち、４種の共通ヌクレオチドが全て一ファミリーのオリゴヌクレオチド
の単一位置を占めることになる場合、つまり、予め選択されたヌクレオチド配列
が、一つの位置で変化する４配列とハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを
含むように設計されている場合、幾つかの異なるオリゴヌクレオチド構造が考え
られる。組成物は４種の構成員を含み得、その場合予め選択された位置はＡ、Ｔ
、ＧまたはＣを含む。別法として、組成物は、２種のヌクレオチド配列構成員を
含み得、その場合、予め選択された位置はＩまたはＣを含み、４種の可能な共通
ヌクレオチド全てとその位置でハイブリダイズする受容力を有する。最後に、他
のヌクレオチドは、イノシンに対する場合と同様に複数の共通ヌクレオチドと非
不安定化的方法でハイブリダイズする受容力を有する予め選択された位置に含ま
れ得る。
【０１１７】 同様に、よく知られている通り、大きな核酸分子は合成オリゴヌクレオチド片
で構築され、相補的ハイブリダイゼーションおよび連結反応により組立てられ得
る。
【０１１８】 Ｄ．アデノウイルス発現ベクター系 ウイルス粒子に封入されており、遺伝子治療環境で外性遺伝子を発現するアデ
ノウイルスベクターゲノムは、この系の鍵を握る成分である。すなわち、組換え
アデノウイルスベクターゲノムの成分は、選択されたアデノウイルス構造遺伝子
を発現し、所望の外性タンパク質を発現し、ゲノムが遺伝子送達ベクター粒子へ
パッケージングされるのに充分な複製およびパッケージングシグナルを含む能力
を含む。よく知られており、ここに記載されている通り、好ましい複製シグナル
は、アデノウイルス複製起点を含むアデノウイルス逆方向末端反復である。
【０１１９】 アデノウイルスは多くのタンパク質を含むが、必ずしも全てのアデノウイルス
タンパク質が組換えアデノウイルス粒子（ベクター）の組立に要求されるとは限
らない。すなわち、組換えＡｄベクターから適当な遺伝子が欠失していることに
より、大きな「外来」ＤＮＡセグメントでも適応し得る。
【０１２０】 好ましい組換えアデノウイルスベクターゲノムは「ヘルパー非依存的」である
ため、第二の相補性ヘルパーウイルスの助けが無くてもゲノムは複製し、パッケ
ージングされ得る。相補性はパッケージング細胞により提供される。
【０１２１】 好ましい態様において、アデノウイルスベクターゲノムは、機能的アデノウイ
ルスファイバータンパク質をコード化しない。非機能的ファイバー遺伝子とは、
アデノウイルスファイバー遺伝子に欠失、突然変異または他の修飾を行なうこと
により、遺伝子がアデノウイルスファイバータンパク質を全く発現しないかまた
は発現しても不充分であるためファイバー含有アデノウイルス粒子をパッケージ
ングし得ず、かつ相補性プラスミドまたはパッケージングセルラインによるファ
イバー遺伝子の相補作用を伴わない場合を意味する。かかるゲノムは「ファイバ
ーレス(fiberless)」ゲノムと称されるもので、ファイバーレス粒子と混同すべ
きではない。別法として、ファイバータンパク質はコード化され得るが、その発
現が不充分であるためファイバー含有粒子を生じ得ない。
【０１２２】 すなわち、（ａ）全てのアデノウイルス構造遺伝子産物を発現するが、ファイ
バー遺伝子の相補を伴わず、かつアデノウイルスファイバータンパク質の発現に
ついては不充分であるためファイバー含有アデノウイルス粒子をパッケージング
し得ず、（ｂ）外性タンパク質を発現し、そして（ｃ）アデノウイルスパッケー
ジングシグナルおよびアデノウイルス複製起点を含む逆方向末端反復を含む遺伝
子を含むヘルパー非依存的ファイバーレス組換えアデノウイルスベクターゲノム
を使用することが考えられる。
【０１２３】 アデノウイルスベクターゲノムは、研究室でゲノムを含むｒＤＮＡプラスミド
の形態で増殖され、そして適当な宿主へ導入されると、ウイルス遺伝エレメント
により、プラスミドに基く増殖ではなくウイルスゲノム複製およびパッケージン
グが行なわれる。Ａｄベクターゲノムの製造方法の例については、実施例に記載
されている。
【０１２４】 ここでのベクターは、細胞において自律複製し得、ＤＮＡセグメント、例えば
遺伝子またはポリヌクレオチドが機能し得るように結合することにより、結合さ
れたセグメントの複製を誘発し得る核酸（好ましくはＤＮＡ）分子を含む。ここ
での目的の場合、ベクター配列に機能し得るように結合されるヌクレオチドセグ
メントの一つが、治療的核酸分子の少なくとも一部分をコード化する。上記で示
された通り、治療的核酸分子には、タンパク質をコード化するものおよびターゲ
ッティングされた細胞において遺伝子産物の発現または阻止または発現の改変を
誘導し得る調節因子をコード化するものが含まれる。
【０１２５】 １．核酸遺伝子発現カセット 様々な態様において、治療的遺伝子のペプチドコーディング配列は、発現ベク
ターに挿入され、発現される。しかしながら、同様にある程度の非コーディング
配列も含む発現ベクターを構築することもまた可能である。しかしながら、好ま
しくは、非コーディング配列は排除される。別法として、ポリペプチドの可溶性
形態に関するヌクレオチド配列が使用され得る。別の好ましい治療的ウイルスベ
クターには、治療ヌクレオチド配列におけるコーディング配列の発現を目的とす
る発現ベクターに機能し得るように結合された治療的ヌクレオチド配列の少なく
とも一部分をコード化するヌクレオチド配列が含まれる。
【０１２６】 治療的核酸分子が機能し得るように結合されるウイルスベクターの選択は、当
業界ではよく知られている通り、所望の機能的特性、例えばベクター複製および
タンパク質発現、および形質転換される宿主細胞により直接左右されるが、これ
らは組換えＤＮＡ分子構築技術固有の限界である。ある種のアデノウイルス血清
型が具体例の形でここに挙げられているが、ハイブリッドおよびその誘導体を含
めあらゆるアデノウイルス血清型の使用が考えられるものと理解すべきである。
【０１２７】 翻訳可能なヌクレオチド配列は、一つの読み枠でポリペプチドをコード化する
少なくとも８コドンから成る中断の無い連続配列を提供する一連の直線ヌクレオ
チドである。好ましくは、ヌクレオチド配列はＤＮＡ配列である。ベクター自体
は適当であればいかなるタイプのものでもあり得、例えばウイルスベクター（Ｒ
ＮＡまたはＤＮＡ）、裸の直鎖または環状ＤＮＡ、または核酸物質および細胞へ
挿入されるべきポリペプチドを含む小胞またはエンベロープがある。
【０１２８】 ２．プロモーター 本明細書の他の箇所で示されている通り、Ａｄ由来のベクターにおける発現核
酸はまた、プロモーター、特に組織または細胞特異的プロモーター、好ましくは
目の細胞、特に光受容体で発現されるものを含み得る。
【０１２９】 この場合での使用が考えられるプロモーターには、調節可能（誘導性）および
構成的プロモーターが含まれ、それらは別々のベクターまたは同じベクターで使
用され得る。有用な調節可能なプロモーターの中には、ＣＲＥＢ−調節遺伝子群
のものがあり、インヒビン、ゴナドトロピン、チトクロームｃ、グルカゴンなど
が含まれる。（例えば、国際ＰＣＴ出願第ＷＯ９６／１４０６１号参照）。好ま
しくは選択されるプロモーターは、光受容体特異的遺伝子、ロドプシン遺伝子ま
たはロドプシン発現を調節するタンパク質をコード化する遺伝子由来のものであ
る。
【０１３０】 Ｅ．製剤および投与 治療有効濃度の組換えアデノウイルス送達ベクターを含む組成物が提供される
。これらは細胞への治療遺伝子産物の送達を目的としており、特に細胞は特定の
５０ｋＤａ受容体またはベクターが相互作用する他の受容体を発現する。これら
の細胞は、目および生殖器系の細胞を含む。特に興味深いのは、目の光受容体細
胞である。投与は、光受容体との接触が果たされる手段により行われる。好まし
い投与方法には、限定されるわけではないが、網膜下注射、特に硝子体内注射が
含まれ、光受容体細胞への接近が果たされる。
【０１３１】 組換えウイルス組成物はまた、持続放出製剤、コラーゲンスポンジを含む、例
えば生物分解性支持体に吸着させたもの、またはリポソームで、前眼房または後
眼房、好ましくは硝子体腔への移植用に製剤化され得る。持続放出製剤は、多重
用量投与用に製剤化され得るため、選択された期間、例えば１ヶ月〜約１年まで
の間、数回の用量が投与される。すなわち、例えば、リポソームは、全部で約２
〜約５回以下またはそれ以上の回数で単一用量が一注射で投与されるように製造
され得る。
【０１３２】 ベクターは、約０.０５ｍｌおよび０.１５０ｍｌ、好ましくは約０.０５およ
び０.１００ｍｌの間の量で眼内、好ましくは硝子体内投与用に眼科学的に許容
し得る担体で製剤化される。
【０１３３】 組成物は、眼内投与時、体積約５０〜１５０μｌで、上記体積中少なくとも約
１０７、さらに好ましくは少なくとも約１０８プラーク形成単位を含む、光受容
体へ充分な量のウイルス粒子を送達する量の式Ｉの化合物を含有する密閉滅菌バ
イアルとして提供され得る。典型的には、バイアルは、すなわち約０.１５０ｍ
ｌの組成物を含む。
【０１３４】 組成物を製造するため、ウイルス粒子を適当な眼科学的に許容し得る担体中に
透析するか、または例えばウイルス粒子は濃縮および／またはそれと混合され得
る。生成した混合物は溶液、懸濁液またはエマルジョンであり得る。さらに、ウ
イルス粒子は、組成物中唯一の医薬的有効成分として製剤化され得るか、または
特定疾患の処置用に他の活性剤と組み合わされ得る。
【０１３５】 眼内注射または点眼液による投与の場合、適当な担体には、生理食塩水、燐酸
緩衝食塩水（ＰＢＳ）、平衡塩溶液（ＢＳＳ）、乳酸リンゲル溶液、および増粘
剤および可溶化剤を含む溶液、例えばグルコース、ポリエチレングリコールおよ
びポリプロピレングリコールおよびそれらの混合物があるが、これらに限定され
るわけではない。リポソーム懸濁液はまた、医薬的に許容し得る担体としても好
適であり得る。これらは、当業界の熟練者によく知られた方法に従い製造され得
る。適当な眼科学的に許容し得る担体は公知である。眼科用途を意図した溶液ま
たは混合物は、適当な塩類によるｐＨ約５−７の０.０１％〜１０％等張液とし
て製剤化され得る［例えば、眼科洗浄溶液および局所適用溶液の典型的組成物を
記載している、アメリカ合衆国特許第５１１６８６８号参照］。ｐＨが約７.４
に調節された上記溶液は、例えば、９０−１００ミリモルの塩化ナトリウム、４
−６ミリモルの二塩基性リン酸カリウム、４−６ミリモルの二塩基性リン酸ナト
リウム、８−１２ミリモルのクエン酸ナトリウム、０.５−１.５ミリモルの塩化
マグネシウム、１.５−２.５ミリモルの塩化カルシウム、１５−２５ミリモルの
酢酸ナトリウム、１０−２０ミリモルのＤ.Ｌ.−ナトリウム・β−ヒドロキシブ
チレートおよび５−５.５ミリモルのグルコースを含む。
【０１３６】 組成物は、体からの急速な排出から組成物を保護する担体、例えば徐放性製剤
またはコーティングにより製造され得る。上記担体には、放出制御製剤、例えば
、限定されるわけではないが、マイクロカプセル化デリバリー系、および生物分
解性、生物適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリ
コール酸、ポリオルトエステル、ポリ酪酸および目の前眼房または後眼房または
硝子体腔へ直接設置され得る他のタイプの移植体がある。組成物はまた、ペレッ
ト、例えばエルバックスペレット（エチレン‐酢酸ビニルコポリマー樹脂）で投
与され得る。
【０１３７】 組織ターゲッティング化リポソームを含め、リポソーム懸濁液はまた、医薬的
に許容し得る担体として好適であり得る。例えば、リポソーム製剤は、当業界の
熟練者に公知の方法により製造され得る［例えば、Kimmら（１９８３）Bioch.Bi
oph.Acta ７２８：３３９−３９８、Assilら（１９８７）Arch Ophthalmol.１０
５：４００、およびアメリカ合衆国特許第４５２２８１１号参照］。ウイルス粒
子は、リポソーム系の水相に封入され得る。
【０１３８】 活性物質はまた、所望の作用を損なわない他の活性物質、または所望の作用を
補うかまたは他の作用を有する物質、例えば粘弾性物質、例えばヒアルロン酸、
すなわちヘアロン(HEALON)という商標名で販売されており、約３００万フラクシ
ョンのヒアルロン酸ナトリウムという高分子量(ＭＷ)の溶液であるもの［ファル
マシア、インコーポレイテッドにより製造、例えばアメリカ合衆国特許第５２９
２３６２、５２８２８５１、５２７３０５６、５２２９１２７、４５１７２９５
および４３２８８０３号参照］、ＶＩＳＣＯＡＴ［フッ素含有(メタ)アクリレー
ト、例えば１Ｈ,１Ｈ,２Ｈ,２Ｈ−ヘプタ−デカフルオロデシルメタクリレート
、例えばアメリカ合衆国特許第５２７８１２６、５２７３７５１および５２１４
０８０号参照、アルコン・サージカル、インコーポレイテッドから市販されてい
る］、ＯＲＣＯＬＯＮ［例えば、アメリカ合衆国特許第５２７３０５６号参照、
オプティカル・ラディエーション・コーポレーションから市販されている］、メ
チルセルロース、メチルヒアルロネート、ポリアクリルアミドおよびポリメタク
リルアミド［例えばアメリカ合衆国特許第５２７３７５１号参照］と混合され得
る。粘弾性物質は、一般的にコンジュゲート物質の約０.５〜５.０重量％、好ま
しくは１〜３重量％の範囲の量で存在し、処置された組織をコーティングおよび
保護する役割を果たす。組成物はまた、染料、例えばメチレンブルーまたは他の
不活性染料を含み得ることにより、目に注射されたとき組成物を見ることができ
る。追加の活性剤も含まれ得る。
【０１３９】 組成物は、ガラス、プラスティックまたは他の適当な材料でできたアンプル、
使い捨て注射器または多重もしくは単一用量バイアルに封入され得る。上記の封
入組成物はキットで提供され得る。特に、バイアル、アンプルまたは他の容器、
好ましくは使い捨てバイアルを、その約０.１００ｍｌを送達するのに充分な量
の組成物、および使い捨て針、好ましくは自己密閉式（セルフシール）の２５−
３０ゲージ針と共に含むキットがここでは提供される。
【０１４０】 最後に、化合物は、パッケージング物質、典型的にはバイアル、ウイルス粒子
を含む眼科学的に許容し得る組成物および組成物の治療用途を示す標識を含む製
品としてパッケージされ得る。
【０１４１】 また、この場合の方法を実践するためのキットも提供されている。キットは、
単一用量投与に充分な組成物を含む、１個またはそれ以上の容器、例えば密閉バ
イアル、および１本またはそれ以上の針、例えば自己密閉式の２５−３３ゲージ
針、好ましくは３３ゲージまたはそれより小さい針、硝子体内注射に適した、精
密に目盛を定めた注射器または精密に目盛を定めた他の送達装置を含む。
【０１４２】 組成物の投与は好ましくは眼内注射により行なわれるが、充分な量の化合物が
硝子体腔との接触を果たすのであれば他の投与方法も有効であり得る。眼内注射
は、硝子体内注射、眼房水注射または目の外部層への注射、例えば結膜下注射ま
たは腱下(subtenon)注射により、または浸透性製剤が使用される場合、角膜への
局所適用により実施され得る。
【０１４３】 投与 化合物を含む組成物は、眼内または他の手段により、例えば浸透性点眼液の形
態で投与され、それによって眼房水と組換えベクターの接触が行なわれる。眼内
投与は、硝子体内注射、眼房水注射、眼の外部層への注射、例えば結膜下注射ま
たは腱下注射により、好ましくは遊離形態で、ただし別法として、リポソームま
たは他の持続性薬剤送達装置で実施され得る。投与は、好ましくは自己密閉式の
２５−３０ゲージ針または他の適当に目盛を定めた送達装置を通して、好ましく
は硝子体内注射により行なわれる。目への注射は、自己密閉式針を介して毛様体
輪から行われ得る。
【０１４４】 さらに、特定対象について、具体的な用量摂取法は、個々の必要性および組換
えウイルスの投与を管理または監督する者の専門的判断に従い調節されるべきで
あること、およびここで設定されている濃度範囲は例に過ぎず、主張された方法
の範囲または実践を制限する意図はないことがわかる。
【０１４５】 Ｆ．病気、障害および治療的産物 １．病気および障害 網膜色素変性症 遺伝子産物、特に治療的産物の送達を目的とする組換えアデノウイルスベクタ
ーを特異的または選択的にターゲッティングする方法がここでは提供されている
。これらの方法は、サブグループＤウイルスのＡｄウイルス、特にＡｄ３７によ
り選択的に認識される受容体を発現する細胞をターゲッティングするのに特に適
している。これらのウイルスが、他のアデノウイルスにより認識されない細胞、
例えば結膜細胞および光受容体における受容体を選択的に認識することがここで
は示されている。このため、これらの受容体への結合に充分な分量でこれらのＡ
ｄ血清型の１種に由来するファイバータンパク質を含むウイルス粒子にパッケー
ジされたベクターを提供することによりこれらの細胞型に対してターゲッティン
グする方法が提供される。これらの方法は、光受容体に対するターゲッティング
および限定されるわけではないが、遺伝的および後天的網膜、新生血管変性疾患
を含む眼科障害（下表参照）の処置に有用である。
【０１４６】 合衆国では３５００人に１人が色素性網膜症の一種に罹患していると見積もら
れている。一般に網膜色素変性症と呼ばれている網膜疾患のこの群は、末梢およ
び夜間視力の進行性喪失を特徴としている。患者はほぼいかなる年齢でも罹患し
得、ある種の遺伝形態では幼少期に徴候を経験することも珍しくはない。これら
の疾患に関与すると思われるロドプシン遺伝子および経路における遺伝子を含め
、光受容体で発現される遺伝子に様々な突然変異があることが示された。ロドプ
シンにおける突然変異に加えて、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞における変化もま
た、変性的変化を被り、ＲＰ患者に見られる特有の色素変化を生じさせる色素の
集塊を形成し得る。
【０１４７】 血管形成および眼科疾患および障害 視力の破滅的喪失を誘発する病気の大多数は、眼の新生血管形成の結果として
そのような事態になる。加齢性黄斑変性（ＡＲＭＤ）には、年齢が６５歳を越え
る１２００−１５００万人のアメリカ人が罹患しており、脈絡膜(網膜下)新生血
管形成の直接的影響として彼らの１０−１５％において視力喪失が誘発される。
年齢６５歳未満のアメリカ人に関する視力喪失の主たる原因は糖尿病である。合
衆国では１６００万人が糖尿病であって、年間４００００人がこの病気の眼の合
併症を患い、それらは網膜の新生血管形成の結果であることが多い。レーザー光
凝固術は、危険度の高い糖尿病患者のサブグループにおける深刻な視力喪失を阻
止する上で有効であるが、網膜症の全般的な１０年発病率は本質的には変わらな
いままである。ＡＲＭＤまたは炎症性眼病、例えば眼ヒストプラスマ症による脈
絡膜新生血管形成に罹った患者の場合、ほとんど例外なく光凝固術は視力喪失の
阻止において有効ではない。最近開発された非破壊的光力学的療法は、以前の処
置不能の脈絡膜新生血管形成に罹った患者において個々の喪失を一時的に低減化
する見込みがあり、３−４ヶ月毎に処置された患者の６１.４％のみ、プラセボ
処置群の４５.９％と比べて視力が改善または安定化された。
【０１４８】 正常な成人では、新脈管形成は厳重に調節されており、創傷治癒、妊娠および
子宮循環周期に限られている。新脈管形成は、特異的脈管形成分子、例えば塩基
性および酸性ファイバー芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧ
Ｆ）、アンギオゲニン、トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子
−α（ＴＮＦ−α）および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）により誘発される。
新脈管形成は、阻害性分子、例えばインターフェロン−α、トロンボスポンジン
−１、アンギオスタチンおよびエンドスタチンにより抑制され得る。正常な静止
毛細管血管系を制御するのは、これらの天然に存する刺激因子および阻害剤の均
衡である。ある種の病状における場合のようにこの均衡が狂うと、毛細管内皮細
胞は増殖、移動および最後に分化が誘導される。
【０１４９】 新脈管形成は、限定されるわけではないが、癌および眼の新生血管形成を含む
様々な病気において中心的役割を演じる。また、様々な腫瘍の持続的増殖および
転移は、腫瘍由来の血管形成誘導因子に応答した腫瘍への新規宿主血管の成長に
依存的であることが示された。様々な刺激因子に応答した新生血管の増殖は、失
明に至る眼病、限定されるわけではないが例えば増殖性糖尿病網膜症(ＰＤＲ)、
ＡＲＭＤ、血管新生緑内障、角膜実質炎および未熟児網膜症の大多数における主
たる所見として見出される。これらの病気の場合、組織損傷が血管形成誘導因子
の放出を刺激し得、その結果毛細管の増殖が誘発され得る。ＶＥＧＦは、虹彩新
生血管形成および新生血管網膜症において支配的な役割を演じる。報告によると
眼内ＶＥＧＦレベルおよび虚血性網膜症眼新生血管形成間の相関関係が明らかに
示されており、ＦＧＦはある一定の役割を演じると思われる。検出可能なレベル
が新生血管形成と必ずしも一貫した相関関係を示しているわけではないが、塩基
性および酸性ＦＧＦは、正常成人網膜に存在することが知られている。これは、
ＦＧＦが細胞外マトリックスの荷電成分と非常に堅固に結合しており、眼水の標
準検定法により検出される自由分散性形態では容易に利用できるものではないと
いう事実に大きく起因し得る。
【０１５０】 血管形成応答における最終共通経路は、増殖性血管内皮細胞および細胞外マト
リックス間におけるインテグリン伝達による情報交換を伴う。インテグリン類と
呼ばれるこの種の接着性受容体は、全細胞においてαおよびβサブユニットを有
するヘテロ二量体として発現される。上記の一インテグリンαＶβ３は、この群
の最も不規則な構成員であり、内皮細胞を広く多様な細胞外マトリックス成分と
相互作用させ得る。このインテグリンのペプチドおよび抗体アンタゴニストは、
増殖性血管内皮細胞のアポトーシスを選択的に誘導することにより血管形成を阻
止する。２種のサイトカイン依存的血管形成経路が存在し、異なる血管細胞イン
テグリン類、αＶβ３およびαＶβ５に対するそれらの依存性により特定され得
る。具体的には、各インテグリンの抗体アンタゴニストはウサギ角膜およびひよ
こ漿尿膜（ＣＡＭ）モデルにおいてこれらの血管形成経路の一つを選択的に遮断
するため、塩基性ＦＧＦ−およびＶＥＧＦ−誘導性血管形成は、それぞれインテ
グリンαＶβ３およびαＶβ５に依存する。全てのαＶインテグリン類を遮断す
るペプチドアンタゴニストは、ＦＧＦ−およびＶＥＧＦ−刺激血管形成を阻止す
る。正常なヒトの眼の血管はいずれのインテグリンも示さず、αＶβ３およびαＶ β５インテグリンは、活動性新生血管眼病患者からの組織における血管では選
択的に示される。αＶβ３のみＡＲＭＤ患者からの組織では一貫して観察されて
おり、αＶβ３およびαＶβ５はＰＤＲ患者からの組織に存在していた。全身投
与されたインテグリンのペプチドアンタゴニストは、網膜脈管形成のマウスモデ
ルにおいて新生血管形成を遮断した。
【０１５１】 上記接着事象に加えて、細胞外マトリックスを通した細胞移動はまた、タンパ
ク質分解に依存する。マトリックス金属プロテイナーゼは、コラゲナーゼ、ゲラ
チナーゼおよびストロメリシンを含む亜鉛要求性マトリックス分解性酵素の一群
であり、列挙した酵素は全て侵襲性細胞行動に関係している。侵襲性細胞プロセ
ス、例えば腫瘍転移および新脈管形成は、インテグリンおよびＭＭＰ−２の発現
に随伴して見出されており、ＭＭＰ−２は全て眼全体から見出され、そこでそれ
らが相互作用することにより均衡が崩れるまで静態脈管構造が維持され、その結
果病的新脈管形成が誘発され得る。ＭＭＰ−２の非触媒性Ｃ−末端ヘモペキシン
様ドメイン(ＰＥＸ)は、インテグリンαＶβ３との相互作用を通して侵襲性細胞
の表面へのＭＭＰ−２の局在化を阻止することにより細胞表面膠原溶解活性を遮
断し、ＣＡＭモデルにおける新脈管形成を阻止し得る。
【０１５２】 このため、抗血管形成剤は、網膜変性の処置においてこれらの栄養および成長
因子の有害な作用を阻止するという役割を有する。また血管形成剤は、望ましい
血管形成の促進において細胞への血流を高めることにより網膜変性を遅らせると
いう役割を有する。
【０１５３】 アデノウイルスサブグループＤ、Ａｄ８、１９Ａおよび３７の構成員は、特に
重症の流行性角結膜炎（ＥＫＣ）を誘発する感染源である（Arnbergら(１９９８
)Virology ２２７：２３９−２４４、Curtisら（１９９８）J.Med.Microbiol.
４７：９１−９４、Ritterbandら（１９９８）Rev.Med.Virol.８：１８７−２０
１、およびTakeuchiら(１９９９)J.Clin.Microbiol. ３７：３３９２−３３９４
）。この消耗性の接触伝染病については有効な処置法が全く無く、ＥＫＣは世界
中の眼科診療所において問題であり続けている（Curtisら(１９９８)J.Med.Micr
obiol. ４７：９１−９４、Lukashokら(１９９８)Curr.Clin.Top.Infec.Dis. １
８：２８６−３０４）。このため、本発明ベクターは、この病気の処置に使用さ
れ得る。
【０１５４】
【表３】 ＊「コロイデレミア遺伝子のＭＳＲ６−酵母相同体」、Nature Genetics ３：１
９３−４（１９９３）参照。
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
【表１２】
【表１３】
【表１４】
【表１５】
【表１６】
【表１７】
【表１８】
【表１９】
【表２０】
【表２１】
【表２２】
【表２３】 複写元：Stereoscopic Atlas of Ocular Diseases Diagnosis and Treatment
、第２版、Ｊ.Donald O.Gass、第１および２巻、C.V.モズレイ・カンパニー（１
９８７）、および Retina 第２巻、編集者、Stephen J.Ryan、Medical Retina、
C.V.モズレイ・カンパニー（１９８９）。
【０１５５】 ２．治療的産物 治療的産物には、限定されるわけではないが、眼科疾患に欠損している野生型
遺伝子、例えばロドプシン、または遺伝的欠損を正すのに充分なそのフラグメン
ト、トロフィック（栄養）因子、例えば成長因子、トロフィック因子の阻害剤お
よびアゴニスト、抗アポトーシス因子およびここに記載されているかまたは眼の
病気または光受容体により発現される産物により処置され得る疾患の処置に有用
であることが当業界の熟練者に公知である他の産物が含まれる。
【０１５６】
【表２４】 *Allikmetsら（１９９７）Science ２７７：１８０５−１８０７参照。
【０１５７】 例えば、網膜色素変性症を処置する場合、アデノウイルスベクターは、野生型
ロドプシン遺伝子または成長因子またはトロフィック因子、例えば毛様体神経栄
養因子ＣＮＴＦを送達し得る。シュタルガルト病を処置する場合、ベクターは、
野生型ＡＢＣＲ（ＳＴＧＤ１とも呼ばれる）または成長因子または抗血管形成剤
を送達し得る。糖尿病性網膜症、網膜血管新成の場合、ベクターは、成長因子、
例えばＴＧＦ(ＴＧＦβ)を送達することにより、変性を阻止し得る。
【０１５８】 以下の実施例は説明を目的としているに過ぎず、本発明の範囲を制限する意図
はないものとする。 実施例１ アデノウイルスパッケージングセルラインの製造 アデノウイルスの増殖に常用されるセルラインは、アデノウイルスパッケージ
ングセルラインの製造用の宿主細胞として有用である。好ましい細胞には、２９
３細胞、受託番号ＣＲＬ１５７３を有する、ＡＴＣＣから入手されたアデノウイ
ルス形質転換ヒト胚性腎臓セルライン、ヒーラ、すなわちヒト上皮癌セルライン
（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−２）、Ａ５４９、すなわちヒト肺癌セルライン（Ａ
ＴＣＣ受託番号ＣＣＬ１８８９）、および他の上皮由来のセルラインがある。ア
デノウイルス形質転換の結果として、２９３細胞は、Ｅ１初期領域調節遺伝子を
含む。細胞は全て、特記しない場合、完全ＤＭＥＭ＋１０％胎児牛血清で維持さ
れた。
【０１５９】 これらのセルラインは、予め選択された遺伝子領域に欠失を有し、アデノウイ
ルス遺伝子の細胞相補性により得られるアデノウイルスに基く遺伝子送達ベクタ
ーの製造および増殖を可能にする。上記欠失アデノウイルスゲノムの所望の相補
性を提供することによりウイルスベクターを作製するために、予め選択された機
能性単位を含むプラスミドベクターが設計された。上記単位には、Ｅ１初期領域
、Ｅ４およびウイルスファイバー遺伝子があるが、これらに限定されるわけでは
ない。上記相補性を提供することにより、宿主細胞染色体へ安定して挿入される
「相補性プラスミドまたは構築物」であるプラスミドの製造は、下記に記載され
ている。
【０１６０】 Ａ．Ｅ４遺伝子欠失アデノウイルスの相補用Ｅ４発現性プラスミドの製造 ウイルスＥ４調節領域は、オルターナティブ・スプライシングされることによ
り幾つかの異なるｍＲＮＡ産物を生産する単一転写単位を含む。ここの記載に従
い製造され、２９３セルラインをトランスフェクションするのに使用されるＥ４
発現性プラスミドは、全Ｅ４転写単位を含む。天然Ｅ４プロモーターを含むＥ４
転写開始部位の上流１７５ヌクレオチドから、天然Ｅ４ターミネーターシグナル
を含むＥ４ポリアデニル化シグナルの１５３ヌクレオチド下流に伸びるＤＮＡフ
ラグメントは、Chroboczekら（Virol.、１８６：２８０−２８５(１９９２)、ジ
ェンバンク受託番号Ｍ７３２６０）により記載されたアデノウイルス５型（以後
、Ａｄ５と称す）ゲノムのヌクレオチド３２６６７−３５７８０に対応するもの
で、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により、ＡＴＣＣから入手されたＡｄ５ゲノ
ムＤＮＡから増幅された。使用されたプライマーの配列は、５'ＣＧＧＴＡＣＡ
ＣＡＧＡＡＴＴＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＣＣ３'（フォワードまたはＥ４
Ｌと称される５'プライマー）(配列番号１)および５'ＧＣＣＴＧＧＡＴＣＣＧＧ
ＧＡＡＧＴＴＡＣＧＴＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＡＡＣ３'（配列番号２）（バック
ワードまたはＥ４Ｒと称される３'プライマー）であった。ＰＣＲフラグメント
のクローニングを容易にするため、これらのオリゴヌクレオチドは、下線部のヌ
クレオチドにより示されている通り、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩに関する新規部位を作製するように設計された。ＤＮＡは、１分間９２℃、
１分間５０℃および３分間７２℃の３０周期を用いてＰＣＲにより増幅され、増
幅された完全長Ｅ４遺伝子産物が生成された。
【０１６１】 次いで、増幅ＤＮＡ Ｅ４産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより消化して
、標準技術によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ/ＳＫ＋の融和性部位へクローニング
すると、プラスミドｐＢＳ／Ｅ４が作製された。単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼプロモーター、ハイグロマイシン耐性遺伝子、およびチミジンキナーゼ
ポリアデニル化シグナルを含む２６０３塩基対(ｂｐ)カセットをプラスミドｐＭ
ＥＰ４（インビトロゲン、サンディエゴ、カリフォルニア）から切除し、Ｆｓｐ
Ｉにより消化した後、ＢａｍＨＩリンカー（５'ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＧ３'）
（配列番号３）を付加し、ＢａｍＨＩにより後続消化すると、ハイグロマイシン
含有フラグメントが単離された。
【０１６２】 次いで、単離されたＢａｍＨＩ−修飾フラグメントを、Ｅ４領域を含むｐＢＳ
／Ｅ４のＢａｍＨＩ部位へクローン化することにより、８７１０ｂｐを含むプラ
スミドｐＥ４／Ｈｙｇｒｏが作製された。ｐＥ４／Ｈｙｇｒｏプラスミドは、受
託番号９７７３９としてＡＴＣＣに寄託されている。ｐＥ４／Ｈｙｇｒｏの完全
ヌクレオチド配列は、配列番号４に示されている。線状ベクターの位置番号１は
、ｐＢＳ／ＳＫ＋バックボーンのほぼ中間部分に対応する。Ｅ４遺伝子の５'お
よび３'末端は、配列番号４の各ヌクレオチド位置３８２０および７０７に位置
し、ハイグロマイシン挿入体の５'および３'末端は、各ヌクレオチド位置３８３
０および６４７０に位置する。使用するために選択されたクローンにおいて、Ｅ
４およびハイグロマイシン耐性遺伝子は分岐転写された。
【０１６３】 Ｂ．ファイバー遺伝子欠失アデノウイルスの相補を目的とするファイバー発現
性プラスミドの製造 ファイバーエンコーディング構築物を製造するため、それぞれフラグメントの
５'および３'末端における特有なＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位の付加を伴いＡ
ｄ５ゲノムＤＮＡからファイバーコーディング領域を増幅するプライマーを設計
した。Ａｄ５ヌクレオチド配列は、ジェンバンク受託番号Ｍ１８３６９により入
手可能である。５'および３'プライマーは、５'ＡＴＧＧＧＡＴＣＣＡＡＧＡＴ
ＧＡＡＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＧ３'（配列番号５）および５'ＣＡＴＡＡＣＧ ＣＧＧＣＣＧＣ ＴＴＣＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＣ３'（配列番号６）の各ヌク
レオチド配列を有しており、挿入されたＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位は下線に
より示されている。５'プライマーはまた、開始部位である第２ＡＴＧコドン（
Ｃ〜Ａ）のヌクレオチド置換３ヌクレオチド５'を含んでいた。ヌクレオチド置
換を含ませることにより、ファイバータンパク質翻訳の開始に関する共通性が改
善された。
【０１６４】 増幅ＤＮＡフラグメントをｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン）のＢａｍＨＩおよ
びＮｏｔＩ部位へ挿入することにより、７１４８ｂｐを有するｐＣＤＮＡ３／Ｆ
ｉｂｅｒと称されるプラスミドが作製された。親プラスミドは、ＣＭＶプロモー
ター、牛成長ホルモン（ＢＨＧ）ターミネーターおよびネオマイシン耐性を付与
する遺伝子を含んでいた。この構築物に含まれるウイルス配列は、Ａｄ５ゲノム
のヌクレオチド３１０４０−３２７９１に対応する。
【０１６５】 ｐＣＤＮＡ３／Ｆｉｂｅｒの完全ヌクレオチド配列は配列番号７に列挙されて
おり、ヌクレオチド１位は、ｐｃＤＮＡ３ベクター配列のほぼ中間に対応する。
ファイバー遺伝子の５'および３'末端は、ＡＴＧを伴う９１６位およびＴＡＡを
伴う２６６１位の各ヌクレオチドに位置する。
【０１６６】 ｐｃＤＮＡベクターにより提供された構成的ＣＭＶプロモーターによりファイ
バータンパク質の発現を高めるため、アデノウイルス５型の三連リーダー（ＴＰ
Ｌ）を含むＢｇｌIIフラグメントをｐＲＤ１１２ａ（Sheayら、Bio Techniques
、１５：８５６−８６２(１９９３)）から切除し、ｐＣＤＮＡ３／Ｆｉｂｅｒの
ＢａｍＨＩ部位に挿入すると、７４６９ｂｐを有するプラスミドｐＣＬＦが作製
された。アデノウイルス三連リーダー配列は、Loganら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A、８１：３６５５−３６５９(１９８４)および Berkner、Bio Techniques、６
：６１６−６２９(１９８８)により記載された通り全主要後期アデノウイルスｍ
ＲＮＡの５'末端に存在し、それが部分的エキソン１を含むことから「部分的Ｔ
ＰＬ」とも称されるもので、ヌクレオチド６０８１−６０８９位（第１リーダー
セグメントの３'末端）、７１１１−７１８２位（第２リーダーセグメント全体
）、および９６４４−９８４５位（第３リーダーセグメントおよびそのセグメン
トの下流配列）に対応する３つの空間的に分離したエキソンを有するＡｄ５リー
ダー配列との一致を示す。ｐＣＬＦに存在する部分的三連リーダー配列の対応す
るｃＤＮＡ配列は、９０７−９１２位〜１２２８−１２３３位の各ヌクレオチド
位置におけるＢａｍＨＩ／ＢｇｌII５'および３'部位と接する配列番号８に含ま
れる。単離された部分的ＴＰＬのヌクレオチド配列はまた配列番号２２として別
々に列挙されており、５'および３'制限部位が示され、次のヌクレオチド領域が
同定された：１−６ｎｔ ＢｇｌII部位、１−１８ｎｔポリリンカー、１９−２
７ｎｔ 第１リーダーセグメント（エキソン１）の最後の９ｎｔ、２８−９９ｎ
ｔ 第２リーダーセグメント（エキソン２）、１００−１８７ｎｔ 第３リーダー
セグメント（エキソン３）、１８８−３０１ｎｔは未知機能を伴うゲノムにおけ
る第３リーダー直後のｎｔ配列を含有、そして３２２−３２７ｎｔ ＢｇｌII部
位。
【０１６７】 ｐＣＬＦプラスミドは、実施例４で記載された通りＡＴＣＣに寄託されている
。ｐＣＬＦの完全ヌクレオチド配列は配列番号８に列挙されており、ヌクレオチ
ド１位はｐｃＤＮＡ３親ベクター配列のほぼ中間に対応する。Ａｄ５ファイバー
遺伝子の５'および３'末端は、ＡＴＧを伴う１２３７−１２３９位およびＴＡＡ
を伴う２９８０−２９８２位の各ヌクレオチドに位置する。
【０１６８】 Ｃ．機能的Ｅ４およびファイバータンパク質をコード化するプラスミドを伴う
アデノウイルスパッケージングセルラインの生成 ２９３セルラインは、それがGrahamら、J.Gen.Virol.、３６：５９−７４（１
９７７）により製造された通りＥ１遺伝子を既に含み、Spector、Virol.、１３
０：５３３−５３８（１９８３）によりさらに特性確認されているため、第１ア
デノウイルスパッケージングラインを製造するために選択された。電気穿孔前、
２９３細胞をＲＰＭＩ培地＋１０％胎児牛血清中で培養した。バイオラド・ジー
ンパルサーおよび３００Ｖ、２５μＦの設定値を用いて各々２０μｇのｐＥ４／
ＨｙｇｒｏＤＮＡおよびｐＣＬＦ ＤＮＡにより４×１０６細胞を電気穿孔した
。電気穿孔用ＤＮＡは、製造者の使用説明書（バイオ‐ラド、リッチモンド、カ
リフォルニア）に従いキアゲンシステムを用いて製造された。
【０１６９】 電気穿孔後、２００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢ（シグマ、セントルイス
、ミズーリ）を含む新鮮な完全ＤＭＥＭ＋１０％胎児牛血清中へ細胞を分離させ
た。
【０１７０】 拡大したコロニーから、製造者の使用説明書に従い「ＭＩＣＲＯＴＵＲＢＯＧ
ＥＮ」システム（インビトロゲン）を用いてゲノムＤＮＡを単離した。組込まれ
たＥ４ ＤＮＡの存在は、プライマー対Ｅ４ＲおよびＯＲＦ６Ｌ（５'ＴＧＣＴＴ
ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＡＧＧＡＧＡ ＡＧＴＣＣ３'）（配列番号９）（ただ
し、後者はアデノウイルス５読み枠６に近い５'フォワードプライマーである）
を用いるＰＣＲにより評価された。
【０１７１】 親セルライン２９３で見られるものに対して改変された成長特性を呈する２１
１と命名された一クローンが選択された。２１１クローンが生成物を含んでいた
ことから、ｐＥ４／Ｈｙｇｒｏプラスミドに含まれるＥ４フラグメントの全部で
はないにせよ大部分に対応する挿入ＤＮＡの存在が示された。２１１セルライン
は、実施例４に記載されている通りＡＴＣＣに寄託されている。このラインは、
上記プライマー対Ｅ４Ｌ／Ｅ４Ｒを用いる増幅によりさらに評価され、完全長Ｅ
４挿入体に対応する生成物が検出された。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩにより制
限されたＤＮＡにおいてゲノムサザーンブロッティングが遂行された。次いで、
製造業者の使用説明書（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、イン
ディアナ）に従いジーニアスシステムにより標識プローブとして使用するためｐ
ＢＳ／Ｅ４へクローン化されたＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ Ｅ４フラグメントによ
る標準と比べると約１コピー／ゲノムでＥ４フラグメントが検出された。２１１
セルラインからのＤＮＡにおいて、標識内部フラグメントｐＥ４／Ｈｙｇｒｏは
単離Ｅ４配列とハイブリダイズした。さらに、プローブは、第２挿入事象の結果
であり得るさらに大きなフラグメントとハイブリダイズした。
【０１７２】 ２１１セルラインはネオマイシン耐性により選択されないことから、ファイバ
ー遺伝子の不存在が示され、ファイバー遺伝子の欠乏が確認されたが、２１１セ
ルラインは、抗ファイバーポリクローナル抗体および２次としてＦＩＴＣ標識抗
ウサギＩｇＧ（ＫＰＬ）による間接的免疫蛍光法によりファイバータンパク質の
発現について分析された。免疫反応性は全く検出されなかった。従って、組換え
ファイバー遺伝子を含む２１１クローンを生成するため、ＲＰＭＩ培地で培養す
ることにより２１１クローンを拡大させ、上記と同様ファイバーエンコーディン
グｐＣＬＦプラスミドによりさらなる電気穿孔にかけた。
【０１７３】 電気穿孔後、細胞をＤＭＥＭ＋１０％胎児牛血清中で培養し、２００μｇ／ｍ
ｌのＧ４１８（ギブコ、ガイザーズバーグ、メリーランド）によりコロニーを選
択した。陽性セルラインはハイグロマイシン耐性のままであった。次いで２１１
のこれらの候補サブラインを、上記要領で間接的免疫蛍光法によりファイバータ
ンパク質発現についてスクリーニングした。スクリーニングされた３種のサブラ
イン、２１１Ａ、２１１Ｂおよび２１１Ｒは、若干の他のサブラインに加えて、
全て、ＡｄＲＳＶβｇａｌ（１ｐｆｕ／細胞）により感染させ、感染の２４時間
後に染色した２９３細胞の陽性対照と定量的に同等の核染色を呈した。
【０１７４】 次いで、この検定法での核染色に関する陽性ラインを、同抗体を用いる変性条
件下ウエスタンブロット分析にかけた。抗体により予測された分子量（Ａｄ５フ
ァイバータンパク質については６２ｋｄ）のタンパク質が検出された幾つかのラ
インが、２１１Ａ、２１１Ｂおよび２１１Ｒを含めさらなる試験用に選択された
。２１１Ａセルラインは、実施例４に記載された通りＡＴＣＣに寄託されている
。
【０１７５】 これら３種のセルラインからの可溶性核抽出物を用いる免疫沈降分析および半
自然電気泳動系は、発現されたファイバータンパク質が天然ファイバータンパク
質に特有な機能的三量体形態であることを立証していた。三量体化ファイバーの
予測された分子量は１８６ｋｄである。変性条件下、三量体形態が破壊されるこ
とにより、検出可能なファイバー単量体が生成された。内在性Ｅ１、新たに発現
された組換えＥ４およびファイバータンパク質を含むクローンは、実施例２に記
載された通り欠失された対応するアデノウイルス遺伝子を有するアデノウイルス
遺伝子送達ベクターの相補に使用すべく選択された。
【０１７６】 Ｄ．Ｅ１遺伝子欠失アデノウイルスの相補用Ｅ１発現性プラスミドの製造 上記実施例１Ｃに記載された通りＥ１遺伝子含有２９３セルラインに基くもの
以外のアデノウイルスパッケージングセルラインを製造するため、Ｅ１を単独で
含むかまたはＥ４およびファイバー遺伝子との様々な組み合わせを含むプラスミ
ドベクターが下記要領で構築される。
【０１７７】 Ｅ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を含むアデノウイルスゲノムの領域を前記要領でＰ
ＣＲによりウイルスゲノムＤＮＡから増幅する。使用されるプライマーは、Ｅ１
Ｌ、５'またはフォワードプライマー、およびＥ１Ｒ、３'またはバックワードプ
ライマーであり、各々ヌクレオチド配列５'ＣＣＧ ＡＧＣＴＡＧＣ ＧＡＣＴＧ
ＡＡＡＡＴＧＡＧ３'(配列番号１０)および５'ＣＣＴＣＴＣＧＡＧ ＡＧＡＣＡ
ＧＣ ＡＡＧＡＣＡＣ３'（配列番号１１）を有する。Ｅ１ＬおよびＥ１Ｒプライ
マーは、下線により示された各制限部位ＮｈｅＩおよびＸｈｏＩを含む。これら
の部位を使用することにより、クロンテク（パロアルト、カリフォルニア）から
市販されているｐＭＡＭにおけるＮｈｅＩ／ＸｈｏＩ部位へ増幅Ｅ１遺伝子フラ
グメントがクローン化され、１１１５２ｂｐを有するプラスミドｐＤＥＸ／Ｅ１
が形成される。
【０１７８】 ｐＤＥＸ／Ｅ１の完全ヌクレオチド配列は配列番号１２に列挙されており、ヌ
クレオチド１位は、ｐＭＡＭバックボーンベクター配列の３'末端からの約１４
５４ヌクレオチドに対応する。ｐＤＥＸ／Ｅ１プラスミドは、ｐＭＡＭのグルコ
コルチコイド誘導性マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターの下流（ｐＤ
ＥＸ／Ｅ１プラスミドにおけるヌクレオチド１４６０位から始まり、４９９８位
で終る）に位置するアデノウイルスゲノムのヌクレオチド５５２〜４０９０を含
む。ｐＭＡＭベクターは、ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ
）選択法を用いて安定した形質転換体を単離させ得るエシェリキア・コリ(E.col
i)ｇｐｔ遺伝子を含む。ｐＭＡＭバックボーンは、配列番号１２のヌクレオチド
１−１４５４位および５００５−１１１５２位を占める。
【０１７９】 Ｅ．機能的Ｅ１およびファイバータンパク質をコード化するプラスミドを伴う
アデノウイルスパッケージングセルラインの生成 実施例１Ｃに記載された通り、２１１サブラインの場合と均等内容の別々のア
デノウイルスパッケージングセルライン、２１１Ａ、２１１Ｂおよび２１１Ｒを
作製するため、アデノウイルスゲノムを欠く代替的セルラインが下記の通りプラ
スミド構築物によるトランスフェクション用に選択される。許容し得る宿主細胞
には、Ａ５４９、ヒーラ、ベロおよび実施例１に記載された同様のセルラインが
ある。選択されたセルラインは、それぞれＥ１およびファイバー相補性タンパク
質を発現させるため、別々のプラスミドｐＤＥＸ／Ｅ１およびｐＣＬＦによりト
ランスフェクションされる。前記要領によるトランスフェクション方法後、２プ
ラスミドの安定した挿入体を含むクローンがネオマイシンおよびＨＡＴによる選
択により単離される。Ｅ１遺伝子の完全長コピーの組込みは、上記と同様、プラ
イマーセットＥ１Ｌ／Ｅ１Ｒを用いてゲノムＤＮＡからのＰＣＲ増幅により評価
される。ファイバー遺伝子の機能的挿入は、前記要領に従い抗ファイバー抗体に
よる染色法により検定される。
【０１８０】 次いで、上記の安定して組込まれたセルラインは、パッケージング細胞系とし
て、実施例２に記載された通り対応するアデノウイルス遺伝子欠失を有するアデ
ノウイルス遺伝子送達ベクターを相補するために使用される。
【０１８１】 Ｆ．遺伝子欠失アデノウイルス相補用の２種またはそれ以上のアデノウイルス
遺伝子を含むプラスミドの製造 先行実施例に記載された方法は、アデノウイルス細胞パッケージング系の製造
を目的とする、２種のプラスミドｐＥ４／ＨｙｇｒｏおよびｐＣＬＦ、またはｐ
ＣＬＦおよびｐＤＥＸ／Ｅ１の使用に基くものである。別の態様では、コード化
タンパク質の様々な組み合わせを発現させるための２種またはそれ以上のアデノ
ウイルス遺伝子を含む相補性プラスミドも下記要領で製造される。次いで、生成
したプラスミドは、対応するアデノウイルス遺伝子欠失を有する送達プラスミド
を伴う様々な細胞系で使用される。すなわち、組換えアデノウイルス（ウイルス
性）ベクターの作製に使用されるパッケージング細胞の選択、送達プラスミドの
含有量および相補性プラスミドの含有量は、他のアデノウイルス遺伝子がアデノ
ウイルスファイバー遺伝子と一緒に欠失しているか否か、そしてその場合どれが
欠失しているかにより異なる。
【０１８２】 １．ファイバーおよびＥ１アデノウイルス遺伝子を含む相補性プラスミドの製
造 ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス三連リーダー、ファイバー遺伝子および
牛成長ホルモンターミネーターに関する配列を含むＤＮＡフラグメントは、ｐＣ
ＬＦにおけるｐＣＤＮＡ３ベクターバックボーンのヌクレオチド１−１９にアニ
ーリングするフォワードプライマー５'ＧＡＣＧＧＡＴＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＣ
Ｃ３'（配列番号１３）、およびｐＣＤＮＡ３ベクターバックボーンのヌクレオ
チド１２７８−１２５７にアニーリングするバックワードプライマー５'ＣＣＧ
ＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＡＴＡＧＡＧＣＣ３'（配列番号１４）を用いて実施例
１Ｂで製造されたｐＣＬＦから増幅される。フラグメントは、前記要領で増幅さ
れ、次いで実施例１Ｄで製造された、ｐＤＥＸ／Ｅ１プラスミドへクローン化さ
れる。ＤＮＡフラグメントでクローニングするため、まずｐＤＥＸ／Ｅ１ベクタ
ーを、ｐＤＥＸ／Ｅ１におけるｐＭＡＭベクターバックボーンの特有部位を切断
するＮｄｅＩで消化し、次いでバクテリオファージＴ４ポリメラーゼおよびｄＮ
ＴＰ処理により末端を修復する。
【０１８３】 ｐＥ１／Ｆｉｂｅｒと命名された、Ｅ１およびファイバー遺伝子を含む生成し
たプラスミドは、ＤＥＸ／Ｅ１に関して記載されたデキサメタゾン誘導性Ｅ１機
能性および上記Ａｄ５ファイバータンパク質の発現性をもたらす。
【０１８４】 ｐＥ１／Ｆｉｂｅｒの完全ヌクレオチド配列は、配列番号１５に列挙されてお
り、その場合ヌクレオチド１位は親ベクターｐＭＡＭ配列の３'末端から約１４
５９ヌクレオチドに相当する。Ａｄ５ Ｅ１遺伝子の５'および３'末端は、１４
６０および４９９８位の各ヌクレオチドに位置し、次にｐＭＡＭバックボーンが
続き、次いで補充された平滑末端化ＮｄｅＩ部位によりｐＣＬＦからのＡｄ５フ
ァイバーから分離される。ｐＣＬＦファイバー遺伝子フラグメントの５'および
３'末端は、ｐＣＬＦについて先に記載されたエレメントを含む１０９２２−１
４２２３位の各ヌクレオチドに位置する。
【０１８５】 次いで、生成されたｐＥ１／Ｆｉｂｅｒプラスミドは、Ｅ１およびファイバー
を発現する１種またはそれ以上の送達プラスミドを相補するのに使用される。
【０１８６】 次いで、ｐＥ１／Ｆｉｂｅｒ構築物を用いて実施例１Ｅ記載の選択された宿主
細胞をトランスフェクションすることにより、前記要領で前形成された安定した
染色体挿入体が生成され、次いでＨＡＴ培地で選択される。次いで安定した細胞
は、実施例２で記載されている通りパッケージング細胞として使用される。
【０１８７】 ２．Ｅ４およびファイバーアデノウイルス遺伝子を含む相補性プラスミドの製
造 実施例１Ｂの記載に従い製造されたプラスミドｐＣＬＦをＢｇｌIIで部分消化
することにより、ｐＣＤＮＡ３バックボーンにおける部位のみが切断される。実
施例１Ａで製造されたｐＥ４／ＨｙｇｒｏプラスミドをＢａｍＨＩで消化すると
、Ｅ４含有フラグメントが製造される。次いで、Ｅ４フラグメントをｐＣＬＦの
ＢａｍＨＩ部位に挿入すると、プラスミドｐＥ４／Ｆｉｂｅｒが形成される。生
成されたプラスミドは、ｐＣＬＦに関して記載されたファイバー遺伝子の発現性
およびｐＥ４／Ｈｙｇｒｏについて記載されたＥ４機能性をもたらす。
【０１８８】 １０６１０ｂｐを有する、ｐＥ４／Ｆｉｂｅｒの概略的プラスミド地図。ｐＥ
４／Ｆｉｂｅｒの完全ヌクレオチド配列は配列番号１６に列挙されており、そこ
でヌクレオチド１位は親ベクターｐＣＤＮＡ３バックボーン配列の３'末端から
約１４ｂｐに対応する。Ａｄ５ Ｅ４遺伝子の５'および３'末端は、２１および
３１４９位の各ヌクレオチドに位置し、次に融合されたＢｇｌII／ＢａｍＨＩ部
位およびＣＭＶプロモーターを含むｐＣＤＮＡ３バックボーンが続き、再びＢｇ
ｌII／ＢａｍＨＩ部位が続く。アデノウイルスリーダー配列は、ヌクレオチド４
０５１位から始まり、４３６６位まで伸長し、次いで融合ＢａｍＨＩ／ＢｇｌII
部位が続き、ファイバー遺伝子の５'および３'末端は４３７２および６１２４位
の各ヌクレオチドに位置する。
【０１８９】 宿主細胞におけるｐＥ４／Ｆｉｂｅｒの安定した染色体挿入体は、上記要領で
得られる。
【０１９０】 実施例２ アデノウイルスパッケージングセルラインを用いるアデノウイルス遺伝子送達
ベクターの製造 アデノウイルス送達ベクターは、Ｅ１／ファイバーおよびＥ４／ファイバーの
組み合わせを別々に欠くように製造される。上記ベクターは、多重ウイルス遺伝
子の不存在故に以前使用されていたものより複製能欠損性が高い。好ましいアデ
ノウイルス送達ベクターは複製受容能があり、非ファイバー手段を介するだけな
のは、ファイバー遺伝子を欠くのみで残りの機能性アデノウイルス調節および構
造遺伝子を含むものである。さらに、これらのアデノウイルス送達ベクターは、
外来ＤＮＡの挿入に関して高い受容力を有する。
【０１９１】 Ａ．特異的遺伝子欠失を有するアデノウイルス遺伝子送達ベクターの製造およ
び使用方法 ＬａｃＺリポーター遺伝子構築物を含むＥ１／ファイバー欠失ウイルスベクタ
ーを構築するため、２種の新規プラスミドが構築された。プラスミドｐΔＥ１Ｂ
βｇａｌは次の要領で構築された。ＳＶ４０調節配列およびエシェリキア・コリ
(E.coli)β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを、ＶｓｐＩで
消化し、ｄＮＴＰの存在下ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処
理により突出末端を満たし、ＢａｍＨＩで消化することによりｐＳＶβｇａｌ（
プロメガ）から単離した。生成されたフラグメントを、ｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（ミク
ロビックス・バイオシステムズ、ハミルトン、オンタリオ）のポリリンカーにお
けるＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ部位へクローン化すると、その結果Ｅｌａ領域
がｐＳＶβｇａｌのＬａｃＺカセット（ヌクレオチド６６９０−４１５１）によ
り置換されたアデノウイルスゲノムの左端を含むｐΔＥ１Ｂβｇａｌが形成され
た。プラスミドＤＮＡは、Birnboimおよび Doly、Nucl.Acids Res.、７：１５１
３−１５２３（１９７８）に記載されたアルカリ溶解方法または製造業者の使用
説明書に従いキアゲン方法により、その拡大に使用される形質転換細胞から製造
され得、次いでプラスミドＤＮＡはＣｓＣｌ‐臭化エチジウム密度勾配遠心分離
により精製された。別法として、プラスミドＤＮＡは、当業界公知の標準方法に
よりエシェリキア・コリから精製され得る（例、Sambrookら参照）。
【０１９２】 ここでの記載に従い製造された第２プラスミド（ｐＤＶ４４）は、当業界の熟
練者に熟知されている方法を用いて、ｐＢＨＧ１０、すなわちBettら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA、９１：８８０２−８８０６(１９９４)（また、国際ＰＣＴ出願
第９５／００６５５号も参照）による記載に従い製造されたベクターから誘導さ
れる。このベクターはまた、ミクロビックスから市販されており、左端にあるパ
ッケージングシグナルが欠失され、Ｅ３領域（ヌクレオチド２８１３３：３０８
１８）が制限酵素ＰａｃＩに関する特有部位をもつリンカーにより置換されたＡ
ｄ５ゲノムを含む。アデノウイルスゲノムの右端を含む１１.９ｋｂのＢａｍＨ
Ｉフラグメントを、ｐＢＨＧ１０から単離し、ｐＢＳ／ＳＫ(＋)のＢａｍＨＩ部
位へクローン化することにより、約１４６５８ｂｐを有するプラスミドｐ１１.
３が作製される。次いで、ｐ１１.３プラスミドをＰａｃＩおよびＳａｌＩで消
化することにより、ファイバー、Ｅ４および逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が除
去された。
【０１９３】 このフラグメントは、次のオリゴヌクレオチド配列：５'ＴＧＴＡＣＡＣＣＧ
ＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＡＣＡＣＣ３'（配列番号１７）および５'ＣＡＣＡＡＣＧ
ＡＧＣＴＣ ＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＣＣＡＣＡＴＣＣＴＣ３'（配列番号１
８）を用いてｐＢＨＧ１０からのＰＣＲ増幅により生成されるＩＴＲセグメント
およびＥ４遺伝子を含む３.４ｋｂフラグメントにより置換された。これらのプ
ライマーにはＰａｃＩおよびＢａｍＨＩに関する部位が組込まれていた。このフ
ラグメントをｐ１１.３バックボーンのＰａｃＩおよび平滑末端化ＳａｌＩ部位
へクローン化することにより、ｐＢＨＧ１０に存在する融合ＩＴＲ、Ｅ４領域お
よびファイバー遺伝子がＩＴＲおよびＥ４領域のみにより置換された。次いで、
生成されたＩＴＲおよびＥ４領域を含むｐ１１.３プラスミド、すなわちｐＤＶ
４３ａと命名されたプラスミドをＢａｍＨＩにより消化した。このＢａｍＨＩフ
ラグメントを用いてｐＢＨＧ１０におけるＢａｍＨＩフラグメントを置換するこ
とにより、ｐＢＨＧ１０バックボーンにおいてｐＤＶ４４が作製された。
【０１９４】 制限クローニング部位の組込みを容易にするための追加的サブクローニング段
階を伴うｐＤＶ４４の別の製造方法では、次のクローニング手順が遂行された。
ファイバー遺伝子およびｐＢＨＧ１０（ミクロビックス・バイオシステムズ）か
らの残留Ｅ３配列の一部を除去することにより、上記ｐＤＶ４４を構築した。上
記の通り、操作を簡易化するため、Ａｄ５ゲノムの最も右側の部分を含む１１.
９ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントをｐＢＨＧ１０から除去し、ｐＢＳ／ＳＫへ挿
入した。生成したプラスミドはｐ１１.３と命名された。Ｅ４領域およびアデノ
ウイルス５型の両ＩＴＲに対応する３.４ｋｂのＤＮＡフラグメントを、上記列
挙のオリゴヌクレオチドを用いてｐＢＨＧ１０から上記要領で増幅し、ベクター
ｐＣＲ２.１（インビトロゲン）へサブクローニングすることにより、ｐＤＶ４
２が作製された。この段階は、ＳａｌＩ制限部位の組込みを容易にするための追
加的クローニング段階である。次いで、ｐＤＶ４２を、ＰＣＲプライマーの一つ
における特有部位（ボールド型）を切断するＰａｃＩ、およびｐＣＲ２.１ポリ
リンカーにおける特有部位を切断するＳａｌＩで消化した。このフラグメントを
用いて、ｐ１１.３の対応するＰａｃＩ／ＸｈｏＩフラグメント（Ａｄ ＤＮＡフ
ラグメントに隣接するｐＢＳポリリンカーは特有のＸｈｏＩ部位を含む）を置換
することにより、ｐＤＶ４３が作製された。
【０１９５】 ｐＤＶ４４と命名されたプラスミドは、ｐＤＶ４３の類似ＢａｍＨＩフラグメ
ントによりｐＢＨＧ１０の１１.９ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントを置換すること
により構築された。従って、第一方法で生成された通り、ｐＤＶ４４は、Ａｄ５
ヌクレオチド３０８１９：３２７４３（残留Ｅ３配列およびファイバー読み枠の
３'−最大４１ヌクレオチドを除く全て）の欠失によりｐＢＨＧ１０とは異なる
。
【０１９６】 すなわち、要約すると、上記クローニング方法により、ｐＢＨＧ１０からファ
イバー遺伝子および残留Ｅ３配列の一部を除去することにより構築されたファイ
バー欠失Ａｄ５ゲノムプラスミド（ｐＤＶ４４）が製造される。ｐＤＶ４４は、
野生型Ｅ４領域、ただしファイバーＯＲＦの最後の４１ヌクレオチドのみ（この
配列は、隣接Ｅ４転写単位の発現への影響を回避するために保持された）を含む
。プラスミドｐＢＨＧ１０およびｐＤＶ４４は、パッケージング不可能なＡｄ５
ゲノムを含むため、コトランスフェクションおよび後続の機能的パッケージング
シグナルを伴うＤＮＡによる相同的組換えによりレスキュー(救援)されなければ
ならない。リポーター遺伝子によりマークされたベクターを生成するため、ｐＤ
Ｖ４４またはｐＢＨＧ１０を、ＳＶ４０駆動β−ガラクトシダーゼリポーター遺
伝子がＥ１領域の代わりに挿入されたＡｄ５ゲノムの左端を含む、ｐΔＥ１Ｂβ
ｇａｌによりコトランスフェクションした。
【０１９７】 一般に、そして下記の通り、プラスミドの組換え、次いで細胞培養における相
補によるウイルス製造方法は、ウイルス遺伝子送達ベクターに対応する配列を伴
うプラスミドによる、実施例１で製造されたアデノウイルスパッケージング細胞
系、すなわち２１１Ａ、２１１Ｂ、２１１Ｒ、Ａ５４９、ベロ細胞などのいずれ
か一つのコトランスフェクションによる組換えウイルスの単離を含む。
【０１９８】 選択されたセルラインを皿で培養し、Bettら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA、９
１：８８０２−８８０６(１９９４)により記載されたリン酸カルシウム方法を用
いてｐＤＶ４４およびｐΔＥ１Ｂβｇａｌによりコトランスフェクションする。
２種のプラスミドでのオーバーラップアデノウイルス配列間における組換えによ
り、ｐＤＶ４４およびｐΔＥ１Ｂβｇａｌを組換えて多重欠失を有する組換えア
デノウイルスベクターが形成された完全長ウイルス染色体が作製される。ウイル
ス染色体からのＥ１およびファイバー遺伝子の欠失は、パッケージング細胞ゲノ
ムへ組込まれた配列により補われ、感染性ウイルス粒子が製造される。こうして
生成されたプラークを単離し、組換えウイルスのストックを標準方法により製造
する。
【０１９９】 ファイバー欠失故に、ｐＤＶ４４由来のウイルスは複製能欠損性であり、それ
を成長させる細胞はこの欠損を補わなければならない。２１１Ｂセルライン（野
生型（ｗｔ）ＡＤ５ファイバーを発現し、実施例４に記載された通りＡＴＣＣに
寄託された２１１Ａと均等内容である２９３細胞の誘導体）は、ここに記載され
たウイルスのレスキューおよび増殖に使用された。ｐＤＶ４４およびｐΔＥ１β
ｇａｌを２１１Ｂ細胞へコトランスフェクションし、細胞変性作用（ＣＰＥ）の
証拠のついて単層を観察した。簡単に述べると、ウイルス構築の場合、製造業者
の使用説明書に従いギブコのリン酸カルシウムトランスフェクションシステムを
用いて示されたプラスミドにより細胞をトランスフェクションし、ＣＰＥの証拠
について毎日観察した。
【０２００】 合計５８のトランスフェクション皿の一つは、１５日目に拡大細胞死の証拠を
示した。粗凍結解凍リゼイトをこれらの細胞から製造し、生成したウイルス（Ａ
ｄ５.βｇａｌ.ΔＦと呼ばれる）を２回プラーク精製し、次いで拡大させた。精
製ウイルス製品を製造するため、細胞を指示されたＡｄにより感染させ、ＣＰＥ
の完了について観察した。簡単に述べると、０日目、２１１Ｂ細胞を、約１×１
０７細胞／１５０ｃｍ２（フラスコ）または均等内容の密度でＤＭＥＭ＋１０％
胎児牛血清中において培養した。１日目、指示されたＡｄ、この場合Ａｄ５.β
ｇａｌ.ΔＦを約１００粒子／細胞の割合で含む初回量の半分の新鮮なＤＭＥＭ
により培地を置き換えた。２日目、等量の培地を各フラスコに加え、細胞をＣＰ
Ｅについて観察した。感染の２〜５日後、細胞を集め、４回の急速冷凍解凍サイ
クルによる溶解によりウイルスを単離した。次いで、前調製１５−４０％ＣｓＣ
ｌ勾配での遠心分離（１１１０００×ｇ、４℃で３時間）によりウイルスを精製
した。バンドを採取し、貯蔵緩衝液（１０ミリモルのトリス−ｐＨ８.１、０.９
％ＮａＣｌ、および１０％グリセリン）中へ透析し、アリコートに分け、−７０
℃で貯蔵した。ヒトアデノウイルスＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦゲノムを含む精製Ａｄ
５.βｇａｌ.ΔＦウイルス粒子（下記で詳述されている）は、実施例４でさらに
記載されている通り１９９９年１月１５日付けでＡＴＣＣに寄託されている。
【０２０１】 下記実施例で必要に応じて、ウイルス滴定を行うため、２１１Ｂ細胞でのプラ
ーク検定法によりＡｄ製品を滴定した。１.５×１０６細胞／ウェルでポリリシ
ンコーティングした６ウェルプレートにおいて細胞を培養した。ウイルスストッ
クのデュプリケイト希釈液を、１ｍｌ／ウェルの完全ＤＭＥＭにおけるプレート
に加えた。３７℃で５時間インキュベーション後、ウイルスを除去し、ミディア
ム１９９（ギブコ）中０.６％の低融解性アガロース２ｍｌによりウェルの表面
を覆った。追加の１ｍｌのオーバーレイを５日間隔で加えた。
【０２０２】 対照として、ファイバー欠失以外はＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦと同一である第１世
代ウイルスＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔを、ｐＢＨＧ１０およびｐΔＥ１Ｂβｇａｌの
コトランスフェクションにより構築した。ファイバーレスゲノムの低い回収効率
（１／５８皿）とは対照的に、ｐΔＥ１ＢβｇａｌおよびｐＢＨＧ１０によりコ
トランスフェクションされた９皿は全てウイルスを生産した。
【０２０３】 別の態様では、ファイバー遺伝子欠失を有するウイルスベクターを製造するの
に上記組換え事象を必要としない送達プラスミドが製造される。一態様では、パ
ッケージングに必要とされる全アデノウイルスゲノムを含むがファイバー遺伝子
を欠く単一送達プラスミドが、ミクロビックスから市販されている完全長Ａｄ５
含有プラスミドｐＦＧ１４０から製造される。次いで、ｐＦＧ１４０−ｆと称さ
れる生成された送達プラスミドを、上記と同様ｐＣＬＦ安定組込み細胞と共に使
用することにより、ファイバーを欠くウイルスベクターが製造される。遺伝子治
療の場合、ファイバー遺伝子は、治療的送達アデノウイルスベクターを製造する
ため興味の対象である治療遺伝子により置換され得る。完全ＴＰＬを伴うファイ
バーレスベクターの製造方法は実施例３に記載されている。
【０２０４】 所望の遺伝子および好ましくは治療的遺伝子の送達用ベクターは、上記のｐＥ
１Ｂβｇａｌを製造するために行なわれた方法と同様にして、興味の対象である
遺伝子を市販のｐΔＥ１ｓｐ１Ｂ（ミクロビックス・バイオシステムズ）のポリ
リンカーにおける多重クローニング部位へクローニングすることにより製造され
る。次いで、ここに記載されているのと同じコトランスフェクションおよび組換
え方法に従うことにより、後記実施例で更に検討されている通りウイルス遺伝子
送達ベクターが得られる。
【０２０５】 １．Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦゲノムの特性確認 ベクターゲノムが適切な構造を有することおよびファイバー遺伝子がＡｄ５.
βｇａｌ.ΔＦ染色体には存在しないことを確認するため、ウイルス粒子から単
離されたＤＮＡを分析した。簡単に述べると、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌプロテ
イナーゼＫ、４０μｌの０.５モルＥＤＴＡおよび５０μｌの１０％ＳＤＳを８
００μｌのアデノウイルス含有培養上清に加えることにより、精製ウイルスＤＮ
Ａが得られた。次いで、懸濁液を５５℃で６０分間インキュベーションした。次
いで、溶液をクロロホルム：イソアミルアルコールの２４：１混合物４００μｌ
により１回抽出した。次いで、水相を除去し、酢酸ナトリウム／エタノールによ
り沈澱させた。ペレットを７０％エタノールで１回洗浄し、軽く乾燥した。次い
で、ペレットを、４０μｌの１０ミリモルのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１ミ
リモルのＥＤＴＡに懸濁した。Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔおよびＡｄ５.βｇａｌ.Δ
ＦからのゲノムＤＮＡは、ＥｃｏＲＩまたはＮｄｅＩによる消化後に予測された
制限パターンを生じた。プローブとして標識ファイバーＤＮＡを用いて標準方法
により遂行されたサザーンブロッティングは、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ ＤＮＡで
はなくＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔにおけるファイバー配列の存在を立証した。陽性対
照として、ブロットを剥がし、標識Ｅ４配列により再プローブした。それぞれｐ
ＣＬＦおよびｐＥ４／Ｈｙｇｒｏからの標識挿入体を用いることによりファイバ
ーおよびＥ４配列が検出された。Ｅ４シグナルは、等しい強度で両ゲノムから容
易に検出され得た。Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦの完全ヌクレオチド配列は、配列番号
２３に示されており、ＡＴＣＣに寄託されたウイルス粒子に含まれる。
【０２０６】 ２．ファイバーレスアデノウイルスＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦの特性検定 Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦがファイバー欠損性であることを証明するため、２９３
細胞（Ｅ１欠失Ａｄベクターの成長について許容性はあるが、ファイバーを発現
しない）をＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦまたはＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔにより感染させた
。感染の２４時間後、ファイバーまたはペントン基部タンパク質に対して指向し
たポリクローナル抗体により細胞を染色した。いずれかのウイルスに感染した細
胞は抗ペントン基部抗体により染色され、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔ対照ウイルスに
より感染した細胞のみ抗ファイバー抗体と反応した。これにより、ファイバー欠
失Ａｄ突然変異体はファイバータンパク質の合成を指令しないことが確認される
。
【０２０７】 ３．相補性細胞におけるファイバー欠失Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦベクターの成長 Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦは、２１１Ｂ細胞で容易に増殖されることが見出された
。タンパク質濃度により検定したところによると、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦまたは
Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔのＣｓＣｌ精製ストックは、似た数のウイルス粒子を含ん
でいた。粒子は、ＣｓＣｌ勾配で普通にバンド形成すると思われた。Ａｄ５.β
ｇａｌ.ΔＦ粒子の感染力は、高い粒子／ＰＦＵ比により示されたところによる
と、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔ対照より低かった。Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦはまた、対
照ウイルスよりゆっくりとプラーク形成することが見出された。２１１Ｂ細胞で
培養時、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔプラークは５−７日以内に現れ、Ａｄ５.βｇａ
ｌ.ΔＦのプラークは感染の１５−１８日後まで現れ続けた。それらのゆっくり
とした形成にも拘わらず、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦプラークの形態は本質的に正常
であった。
【０２０８】 ４．ファイバーレスＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ粒子の製造 Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦは真のファイバーヌル突然変異を示し、そのストックは
ヘルパーウイルスを含まないため、ファイバー突然変異体表現型は容易に調査さ
れた。ファイバーレスＡｄの均一製品を生成するファイバーを製造しない細胞（
例えば２９３）での単一成長ラウンドにより、上記粒子が安定性および／または
感染性であるか否かの測定が行われ得た。Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔまたはＡｄ５.
βｇａｌ.ΔＦを２９３または２１１Ｂ細胞で成長させ、そして生成された粒子
を前記要領に従いＣｓＣｌ勾配で精製した。Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ粒子は、対照
ウイルスとほぼ同レベルで２９３細胞において容易に製造され、勾配でも同様に
反応したことから、ファイバーレスキャプシドの形態形成に著しい欠陥が無いこ
とが示された。
【０２０９】 いずれかのウイルスの粒子は、それらを成長させた細胞型とは関係無く似た量
のペントン基部を含んでいた。これは、ファイバーがビリオンへのペントン基部
複合体の構築には必要とされないことを立証していた。２９３細胞で製造された
Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ粒子は、ファイバータンパク質を含まなかった。２１１Ｂ
成長Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦはまた、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔ対照ウイルスより含む
ファイバーが少なかった。上皮細胞における種々のウイルス製品の感染力は、存
在するファイバータンパク質の量と相関関係を示した。ファイバーレスＡｄ粒子
は、粒子１個当たりに基くと第一世代ベクター対照より数千倍感染力が弱く、２
１１Ｂ成長Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦの感染力は、Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔの場合より
僅か５０−１００倍低いだけであった。これらの試験により、ＣＡＲ結合を介し
た上皮細胞の感染におけるファイバーの重大な役割が確認された。
【０２１０】 ５．ファイバーレスＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ粒子の組成および構造 ２９３−Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦの粒子に含まれるタンパク質を、Ａｄ５.βｇ
ａｌ.ｗｔの場合と比較することにより、タンパク質分解または粒子構築がこの
ファイバーヌル突然変異体において欠損しているか否かを測定した。ファイバー
レス粒子におけるタンパク質の全体的パターンは、第一世代ベクターの場合と全
く類似していることが観察されたが、ただし、タンパク質IIIａおよびIV(ファイ
バー)から生じる混成帯域の強度は低減化していた。ファイバーレス粒子はまた
、低レベルのタンパク質VIIを有していた。かなりの量のタンパク質VI、VIIおよ
びVIIIの未開裂前駆体が見られたわけではないが、タンパク質VIIの前方に移動
している低分子量帯域は、異常型開裂ウイルスタンパク質またはそれらの崩壊産
物を表す可能性がある。
【０２１１】 低温電子顕微鏡を用いて、２９３成長Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦおよびＡｄ５.β
ｇａｌ.ｗｔの構造をさらに密接に調べた。末端にノブを伴う伸長したストーク
を有するファイバーは、野生型Ａｄ５粒子の好都合な配向では微かに見えたが、
ファイバーレス粒子の画像では見えなかった。遊離ウイルスＤＮＡに対応すると
思われる線維状物質は、ファイバーレス粒子の顕微鏡写真で見られた。この物質
はまた、かなり低レベルではあったが、第一世代対照ウイルスの顕微鏡写真にも
存在した。
【０２１２】 〜２０オングストローム解像能でのファイバーレスおよび野生型粒子の三次元
画像再構成は、類似したサイズおよび全体的特徴を示したが、ただし、ファイバ
ーレス粒子はファイバータンパク質に対応する密度を欠いていた。ペントン基部
およびタンパク質IIIａ、VIおよびIXを含め、他のキャプシドタンパク質に対応
する密度は、２構造では類似していた。これは、ファイバーが存在しなくても、
これらの成分のビリオンへの構築は阻止されないことを確認している。ファイバ
ーの可撓性シャフトの下方部分のみ二十面体対称に従うため、ファイバーは野生
型構造では先端が切除されていた。ファイバーレスペントン基部におけるＲＧＤ
突出は、野生型構造の場合に対してやや内方へ角度をなしていた。２種のペント
ン基部タンパク質間における別の差異は、ファイバーが正常に位置する５倍軸周
囲ではファイバーレスペントン基部において〜３０オングストロームの直径低下
があることであった。Ａｄ５再構成により、頂点へのペントン基部の付加を含む
キャプシド構築はファイバーが完全に存在しなくても進行し得ることが確認され
る。
【０２１３】 ６．ファイバーレスＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ粒子のインテグリン依存的感染力 ウイルスファイバータンパク質による結合は上皮細胞の感染における重大段階
であり、ある種の造血細胞の感染に関する第二経路が報告されている。この場合
、ペントン基部は、細胞への結合（β２インテグリンを介する）およびインター
ナリゼーション（ανインテグリンとの相互作用を通して）を仲介する。従って
、ファイバーを欠く粒子は、粒子１個当たりに基くと、上皮細胞において普通の
Ａｄベクターよりも数千倍感染力が劣るが、それらの粒子はこれらの細胞の感染
について受容能があると予測され得る。
【０２１４】 これを調べるため、ＴＨＰ−１単核細胞をファイバーの不存在下で成長させた
Ａｄ５.βｇａｌ.ｗｔまたはＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦにより感染させた。０.５ｍ
ｌの完全ＲＰＭＩ中示された感染多重度で２×１０５細胞を感染させることによ
り、ＴＨＰ−１細胞の感染力を検定した。感染の４８時間後、細胞をグルタルア
ルデヒドに固定し、Ｘ−ギャルで染色し、染色細胞のパーセンテージを光学顕微
鏡により測定した。感染検定の結果は、ファイバーレス粒子が、ＴＨＰ−１細胞
において第一世代Ａｄよりも数倍感染力が低いだけであることを示していた。上
皮（２１１Ｂ）細胞でのプラーク形成効率では大きな差異が見られた。Ａｄ５.
βｇａｌ.ΔＦまたはＡｄ５.βｇａｌ.ｗｔによるＴＨＰ−１細胞の感染は、過
剰の可溶性組換えファイバータンパク質により遮断されなかったが、組換えペン
トン基部を加えることにより阻止され得た。これらの結果は、ファイバーレスＡ
ｄ粒子が、ファイバー非依存的経路を使用することによりこれらの細胞に感染す
ることを示している。さらに、ファイバータンパク質の欠如により、Ａｄ５.β
ｇａｌ.ΔＦが細胞へインターナリゼーションし、そのゲノムを核へ送達するこ
とは妨げられなかったことから、ファイバーレス粒子は適切に組立てられ、脱外
被し得ることが立証された。
【０２１５】 上記で製造された組換えウイルスによる前述の結果は、実施例で更に詳しく説
明されている通り、それらが培養細胞およびインビボで遺伝子送達手段として使
用され得ることを示している。例えば、多重欠失ベクターの有効性および相対免
疫原性を試験するため、実施例１記載のパッケージングラインで成長させること
によりウイルス粒子を製造し、ＣｓＣｌ勾配遠心分離により精製する。滴定後、
ウイルス粒子を全身または局所注射または肺へのエーロゾル送達によりマウスに
投与する。ＬａｃＺリポーター遺伝子により、有効に形質導入された細胞の数お
よびタイプが評価され得る。導入遺伝子発現の持続時間を評価することにより、
現在までに臨床試験で使用されてきた標準技術に対する多重欠失組換えアデノウ
イルスによる処置の長期有効性を測定する。ここに記載されている改良ベクター
に対する免疫応答は、パラメーター、例えば炎症性、ベクターに対して指向した
細胞傷害性Ｔリンパ球の生産、およびウイルスタンパク質に対して指向した抗体
応答の性質および大きさを評価することにより測定される。
【０２１６】 治療遺伝子、例えば嚢胞性線維症処置用のＣＦＴＲまたは癌治療用の腫瘍サプ
レッサー遺伝子を含むベクターのバージョンは、遺伝子転移および発現の安全性
および有効性について動物系で評価される。この評価に従い、それらはヒト臨床
試験における実験的治療剤として使用される。
【０２１７】 Ｂ．異なるまたは改変されたファイバータンパク質を含むウイルス粒子の製造
によるアデノウイルス遺伝子送達ベクターの再ターゲッティング 標的細胞へのアデノウイルスの結合特異性はファイバータンパク質により大き
く決定されるため、修飾ファイバータンパク質または異なるアデノウイルス血清
型（シュードタイプベクター）からのファイバータンパク質を組込んだウイルス
粒子は異なる特異性を有する。すなわち、上記アデノウイルスパッケージング細
胞における天然Ａｄ５ファイバータンパク質の発現方法はまた、異なるファイバ
ータンパク質の製造にも適用可能である。 キメラファイバータンパク質は、公知方法により製造され得る（例えば、Stev
ensonら(１９９５)J.Virol.、６９：２８５０−２８５７参照）。ファイバー受
容体結合活性に関する決定因子は、ファイバーの頭部ドメインに位置し、単離さ
れた頭部ドメインは三量体を形成および細胞受容体へ結合し得る。アデノウイル
ス３型（Ａｄ３）およびＡｄ５の頭部ドメインを交換することにより、キメラフ
ァイバータンパク質が製造された。ここでの方法で使用されるキメラファイバー
タンパク質をコード化する類似構築物も考えられる。すなわち、アデノウイルス
パッケージング細胞における相補性ウイルスベクターとして上記およびアメリカ
合衆国特許出願第０９／４８２６８２号で製造された無傷のＡｄ５ファイバー‐
エンコーディング構築物を使用する代わりに、本明細書記載の構築物を用いてＥ
４および／またはＥ１エンコーディング構築物と一緒に細胞のトランスフェクシ
ョンを行う。
【０２１８】 簡単に述べると、完全長Ａｄ５およびＡｄ３ファイバー遺伝子を、鋳型として
の精製アデノウイルスゲノムＤＮＡから増幅した。Ａｄ５およびＡｄ３ヌクレオ
チド配列は、Ｍ１８３６９およびＭ１２４１１の各ジェンバンク受託番号により
入手可能である。オリゴヌクレオチドプライマーは、開始コドンＡＴＧから出発
し、終止コドンＴＡＡで終結する完全長ファイバー遺伝子の全コーディング配列
を増幅するように設計される。クローニング目的の場合、５'および３'プライマ
ーは、実施例１Ａに記載されたｐｃＤＮＡプラスミドへクローニングするための
各制限部位ＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩを含む。ＰＣＲは上記要領で遂行される。
【０２１９】 次いで、得られた生成物を用いて、ＰＣＲ遺伝子オーバーラップ伸長法により
キメラファイバー構築物を構築する（Hortonら(１９９０)Bio Techniques、８：
５２５−５３５）。Ａｄ５ファイバー尾部およびシャフト領域（５ＴＳ；アミノ
酸残基１〜４０３位をコード化するヌクレオチド領域）をＡｄ３ファイバー頭部
領域（３Ｈ；アミノ酸残基１３６〜３１９位をコード化するヌクレオチド領域）
に連結することにより、５ＴＳ３Ｈファイバーキメラが形成される。逆に、Ａｄ
３ファイバー尾部およびシャフト領域（３ＴＳ；アミノ酸残基１〜１３５位をコ
ード化するヌクレオチド領域）をＡｄ５ファイバー頭部領域（５Ｈ；アミノ酸残
基４０４〜５８１位をコード化するヌクレオチド領域）に連結することにより、
３ＴＳ５Ｈファイバーキメラが形成される。融合は、ファイバーシャフト‐頭部
連結部で保存されたＴＬＷＴ（配列番号１９）配列において為される。
【０２２０】 次いで、生成されたキメラファイバーＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＮｏｔ
Ｉで消化することにより、同様に消化されたｐｃＤＮＡ３.１へ独立方向的にラ
イゲーションさせる。次いで、ＴＰＬ配列を、実施例１Ａ記載の要領でＢａｍＨ
Ｉへサブクローニングすることにより発現ベクターを製造し、それに続いて上記
２１１細胞または前述の第２パッケージング細胞系へトランスフェクションする
。次いで、生成したキメラファイバー構築物含有アデノウイルスパッケージング
セルラインを、前記と同様アデノウイルス送達ベクターの相補に使用する。他の
ファイバーキメラ構築物も類似方法を用いて様々なアデノウイルス血清型により
得られる。
【０２２１】 別の態様では、修飾タンパク質が修飾エピトープを含めて使用される（例えば
、Michaelら(１９９５)Gene Therapy、２：６６０−６６８および国際ＰＣＴ出
願公開第ＷＯ９５／２６４１２号参照、これらは、内在性ウイルス結合特異性の
破壊と同時にウイルスへ組込まれた新規結合特異性を有する細胞型特異的治療ウ
イルスベクターの構築について記載している）。特に、著者らは、Ａｄ５ファイ
バー遺伝子のコーディング配列の３'末端でガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）
をコード化するアデノウイルスベクターの製造について記載した。生成されたフ
ァイバー‐ＧＲＰ融合タンパク質が発現され、合成後、ヒーラ細胞の核へ正確に
輸送される機能的ファイバー三量体を組立てることが示された。
【０２２２】 ターゲッティング可能で、複製能欠損であり、免疫原性の低い新規アデノウイ
ルス遺伝子送達ベクターを生成するための相補性アデノウイルスパッケージング
細胞系で使用される類似構築物も考えられる。ここでファイバー特異性をリダイ
レクトするための使用が考えられる異種リガンドは、僅か１０アミノ酸サイズか
ら大きな球状構造の範囲であり、それらの中にはファイバーによる異種リガンド
の立体障害を低減化または排除するかまたはファイバータンパク質の三量体形成
を阻止するためにスペーサー領域の付加を必要とするものもある。リガンドは、
リンカー領域の末端またはその中に挿入される。好ましいリガンドには、特異的
細胞受容体をターゲッティングするものまたは他の部分への結合に使用されるも
の、例えばビオチンおよびアビジンがある。
【０２２３】 好ましいスペーサーは、当業界の熟練者に公知の常用手順を用いて各端でプロ
リン残基が両側に隣接する一連のセリンおよびアラニンから成る短い１２アミノ
酸ペプチドリンカーを含む。熟練した専門技術者であれば、リンカーの製造によ
り、充分なタンパク質発現を達成し、ウイルスのインターナリゼーション後に起
こる細胞事象に欠陥を生じさせることなくファイバータンパク質の結合特異性を
改変できるはずである。さらに、この開示の文脈の中で、下記の通りファイバー
タンパク質内部およびカルボキシ末端に位置するリガンドを有する修飾ファイバ
ーの製品は、ここに記載された方法により使用されると考えられる。
【０２２４】 異種結合性リガンドを有するファイバーの製品は、本質的に上記引用文献の記
載に従い製造される。簡単に述べると、選択されたリガンドの場合、部位特異的
変異導入法を用いて、リンカーに関するコーディング配列を実施例１で製造され
たｐＣＬＦにおけるＡｄ５ファイバー構築物の３'末端に挿入する。
【０２２５】 ３'またはアンチセンスまたは突然変異原性オリゴヌクレオチドは、ＰｒｏＳ
ｅｒＡｌａＳｅｒＡｌａＳｅｒＡｌａＳｅｒＡｌａＰｒｏＧｌｙＳｅｒ(配列番
号２０)の好ましいリンカー配列、次いで特有の制限部位および２個の停止コド
ンをそれぞれコード化することにより、選択された異種リガンドに関するコーデ
ィング配列の挿入が行なわれ得、適切な翻訳終結が確実にされる。このリンカー
配列の両端に隣接して、突然変異原性オリゴヌクレオチドは、ベクター配列とオ
ーバーラップし、構築物へそれを組込ませ得る配列を含む。リンカーおよび停止
コドン配列を加えるｐＣＬＦ配列の突然変異誘発後、予め選択されたリガンドを
コード化するヌクレオチド配列が得られ、修飾構築物における特有の制限部位に
対応するリンカーが結合され、次いで配列を線状化された対応する制限部位にク
ローン化する。次いで、生成されたファイバー−リガンド構築物を用いて、２１
１または前述した第２の細胞パッケージング系をトランスフェクションすること
により、相補性ウイルスベクターパッケージング系が製造される。
【０２２６】 さらに別の態様において、異なるＡｄ血清型からの無傷なファイバー遺伝子は
、２１１細胞または前記の第２パッケージング系により発現される。まず、興味
の対象であるファイバータンパク質をコード化する遺伝子をクローン化すること
により、ｐＣＬＦに類似したプラスミドが作製され、ファイバータンパク質を生
産する安定したセルラインは、Ａｄ５ファイバーに関する上記要領に従い生成さ
れる。次いで、ファイバー遺伝子を欠く上記アデノウイルスベクターを、考慮中
の目的に関連性のあるファイバータンパク質を製造するセルラインで増殖させる
。存在する唯一のファイバー遺伝子はパッケージング細胞におけるものであるた
め、製造されたアデノウイルスは興味の対象であるファイバータンパク質のみを
含み、従って相補性タンパク質により付与された結合特異性を有する。上記ウイ
ルス粒子は、例えば上記試験で使用され、実験動物系においてそれらの特性が測
定される。
【０２２７】 実施例３ アデノウイルス遺伝子送達ベクターの製造で使用される、相補性アデノウイル
スタンパク質、特にファイバータンパク質の発現を高めるのに有用な三連リーダ
ー配列（ＴＰＬ）が提供される。完全なＡｄ５ ＴＰＬは、ＰＣＲフラグメント
を組立てることにより構築された。まず、第３ＴＰＬエキソン（エキソン３）（
Ａｄ５ゲノムのｎｔ９６４４−９７３１）は、 合成オリゴヌクレオチドプライマー：
【表２５】 を用いてＡｄ５ゲノムＤＮＡから増幅された。得られた生成物を、プライマー中
の部位（太字で示されている）を用いてｐΔＥ１Ｓｐ１ａ（ミクロビックス・バ
イオシステムズ）のＢａｍＨＩおよびＢｇｌII部位へクローン化することにより
、プラスミドｐＤＶ５２が作製された。次いで、第１ＴＰＬエキソン（エキソン
１）に対応するフラグメント、天然第１イントロン（イントロン１）および第２
ＴＰＬエキソン（エキソン２）(Ａｄ５ nt６０４９−７１８２)を、 プライマー：
【表２６】 を用いて増幅し、そしてｐＤＶ５２のＢａｍＨＩ部位へ（再びプライマー中の部
位を使用）クローン化することによりｐＤＶ５５が作製された。
【０２２８】 このプラスミドは、第１ＴＰＬエキソン、天然第１イントロンおよび融合第２
および第３ＴＰＬエキソンを含む１.２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌIIフラグメン
トを含む。示された５'および３'制限部位を含む完全ＴＰＬのヌクレオチド配列
は、配列番号２８に示されており、次のヌクレオチド領域が同定された：１−６
ｎｔ ＢａｍＨＩ部位、７−４７ｎｔ第１リーダーセグメント（エキソン１）、
４８−１０６８ｎｔ天然第１イントロン（イントロン１）、１０６９−１１４０
ｎｔ第２リーダーセグメント（エキソン２）、１１４１−１１４６ｎｔ融合Ｂａ
ｍＨＩおよびＢｇｌII部位、１１４７−１２３４ｎｔ第３リーダーセグメント（
エキソン３）、および１２３５−１２４０ｎｔＢｇｌII部位。
【０２２９】 実施例４ 材料の寄託 次のセルラインおよびプラスミドは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認
に関するブダペスト条約の規定およびその条約下の規則（ブダペスト条約）によ
りアメリカ合衆国バージニア、マナッサス、１０８０１ユニバーシティ・ブール
バールにある、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に
１９９６年９月２５日付けで寄託された：プラスミドｐＥ４／Ｈｙｇｒｏ(受託
番号９７７３９)、プラスミドｐＣＬＦ（受託番号９７７３７）、２１１セルラ
イン（受託番号ＣＲＬ−１２１９３）および２１１Ａセルライン（受託番号ＣＲ
Ｌ−１２１９４）。
【０２３０】 次のウイルス、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦは、上記ＡＴＣＣに１９９９年１月１５
日に寄託され、受託番号ＶＲ２６３６が提供された。
【０２３１】 さらに、次のプラスミドｐＤＶ６０、ｐＤＶ６７、ｐＤＶ６９、ｐＤＶ８０お
よびｐＤＶ９０は、２０００年１月５日付けでＡＴＣＣに寄託され、各々ＰＴＡ
−１１４４、ＰＴＡ−１１４５、ＰＴＡ−１１４６、ＰＴＡ−１１４７およびＰ
ＴＡ−１１４８の受託番号が提供された。
【０２３２】 実施例５ 別のＴＰＬを含むプラスミドを含むアデノウイルスパッケージングセルライン
の製造および用途 三連リーダー（ＴＰＬ）を含むプラスミドが構築された。次いで、異なる選択
マーカー、例えばネオマイシンおよびゼオシンを含む生成されたプラスミドを用
いることにより、アデノウイルスベクター製造用として使用されるファイバー相
補性安定性セルラインが製造された。
【０２３３】 Ａ．ｐＤＶ６０ プラスミドｐＤＶ６０は、ネオマイシン選択性プラスミドである、ｐｃＤＮＡ
３／Ｆｉｂｅｒ（例えば、アメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８２号（ま
た、２０００年１月１４日付けで国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６
５号としても出願）参照、またVon Seggernら（１９９８）J.Gen.Virol.、７９
：１４６１−１４６８も参照）におけるＡｄ５ファイバー遺伝子のＢａｍＨＩ部
位上流へ配列番号２８のこのＴＰＬカセットを挿入することにより構築された。
ｐＤＶ６０のヌクレオチド配列は配列番号２９に示されている。プラスミドｐＤ
Ｖ６０は、受託番号ＰＴＡ−１１４４でＡＴＣＣに寄託された。
【０２３４】 Ｂ．ｐＤＶ６１ ｐＤＶ６１を構築するため、ＣＭＶプロモーター、部分的Ａｄ５ ＴＰＬ、野
生型Ａｄ５ファイバー遺伝子、および牛成長ホルモンターミネーターを含むＡｓ
ｐ７１８／ＮｏｔＩフラグメントを、ｐＣＬＦ（ＡＴＣＣ受託番号９７７３７、
および同時係属中のアメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８２号(また、２
０００年１月１４日付け国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５号とし
ても出願)に記載されている）から、ｐＣＤＮＡ３.１／Ｚｅｏ(＋)（インビトロ
ゲンから市販されており、その配列は既知である）と称されるゼオシン選択性ク
ローニングベクターへ移入させた。
【０２３５】 Ｃ．ｐＤＶ６７ 類似プロセスで、完全ＴＰＬを含むｐＤＶ６７は、ｐＤＶ６０からのＡｓｐ７
１８／ＸｂａＩフラグメントをｐｃＤＮＡ３.１／Ｚｅｏ(＋)バックボーンへ移
入することにより構築された。ｐＤＶ６７のヌクレオチド配列は、配列番号３０
に示されている。プラスミドｐＤＶ６７は、受託番号ＰＴＡ−１１４５でＡＴＣ
Ｃから入手され得る。
【０２３６】 Ｄ．ｐＤＶ６９ 修飾ファイバータンパク質を含むｐＤＶ６９を製造するため、キメラＡｄ３／
Ａｄ５ファイバー遺伝子を、プライマー５'ＡＴＧＧＧＡＴ ＣＡＡＧＡＴＧＡＡ
ＧＣＧＣＧＣＡＡＧＡＣＣＧ３'（配列番号３１）および５'ＣＡＣＴＡＴＡＧＣ
ＧＧＣＣＧＣＡＴＴＣＴＣＡＧＴＣＡＴＣＴＴ３'（配列番号３２）を用いてｐ
ＧＥＭ５ＴＳ３Ｈ（Stevensonら（１９９５）J.Virol.、６９：２８５０−２８
５７）から増幅させ、プライマーへ遺伝子操作された新規ＢａｍＨＩおよびＮｏ
ｔＩ部位を介してｐｃＤＮＡ３.１／Ｚｅｏ(＋)のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部
位へクローン化することにより、ｐＤＶ６８が作製された。次いで最後に、上記
完全ＴＰＬフラグメントをｐＤＶ６８の特有なＢａｍＨ１へ付加することにより
ｐＤＶ６９が作製された。ｐＤＶ６９のヌクレオチド配列は配列番号３３に示さ
れており、受託番号ＰＴＡ−１１４６でＡＴＣＣに寄託されている。
【０２３７】 Ｅ．安定したアデノウイルスパッケージングセルラインの製造 Ｅ１−２ａ Ｓ８細胞は、それぞれアデノウイルスＥ１およびＥ２ａ機能の相
補性を提供する、プラスミドｐＧＲＥ５−２.Ｅ１（ＧＲＥ５−Ｅ１−ＳＶ４０
−Ｈｙｇｒｏ構築物とも称され、配列番号３４に示されている）およびｐＭＮｅ
ｏＥ２ａ−３.１（ＭＭＴＶ−Ｅ２ａ−ＳＶ４０−Ｎｅｏ構築物とも称され、配
列番号３５に示されている）の染色体挿入体を伴うＡ５４９肺癌ライン(ＡＴＣ
Ｃ＃ＣＣＬ１８５)の誘導体である。このラインおよびその誘導体を、リヒテル
修飾培地（バイオホイティカー）＋１０％ＦＣＳで成長させた。Ｅ１−２ａ Ｓ
８細胞は、ｐＤＶ６１、ｐＤＶ６７またはｐＤＶ６９による前記要領（Von Segg
ernら（１９９８）J.Gen.Virol.、７９：１４６１−１４６８）で電気穿孔され
、安定したラインがゼオシン（６００μｇ／ｍｌ）により選択された。
【０２３８】 ｐＤＶ６１により生成されたセルラインは６０１と称される。ｐＤＶ６７によ
り生成されたセルラインは６３３と称され、ｐＤＶ６９により生成されたものは
６４４と称される。Ａｄ２ファイバーに対して産生したポリクローナル抗体での
免疫蛍光染色法により候補クローンを評価した。最高レベルのファイバータンパ
ク質を発現するラインを更に特性確認した。
【０２３９】 Ｓ８細胞相補性セルラインの場合、Ｅ１発現を誘導するため、最適成長速度論
を目的としてウイルスによる攻撃の１６−２４時間前に０.３マイクロモルのデ
キサメタゾンを細胞培養物に加えた。ウイルスプラークを製造するため、６ウェ
ルプレートにおいて５×１０５細胞／ウェルを調製し、感染前日同濃度のデキサ
メタゾンにより前誘導し、感染後寒天オーバーレイには最終濃度で０.５マイク
ロモルが含まれた。
【０２４０】 Ｆ．Ｅ１／Ｅ２ａベクターの相補用セルラインの開発 アデノウイルス５ゲノムをＳｃａＩ酵素で消化し、アガロースゲルで分離し、
ウイルスゲノムの左端を含む６０９５ｂｐフラグメントを単離した。完全アデノ
ウイルス５ゲノムは、ジェンバンク受託＃Ｍ７３２６０として登録されており（
出典明示により本明細書の一部とする）、ウイルスは、受託番号ＶＲ−５として
、アメリカ合衆国バージニア、マナッサス、アメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクションから入手できる。ＳｃａＩの６０９５ｂｐフラグメントを、ｂｐ９
１７のＣｌａＩおよびｂｐ３３２８のＢｇｌIIによりさらに消化した。生成した
２４１１ｂｐのＣｌａＩ〜ＢｇｌIIフラグメントをアガロースゲルから精製し、
スーパーリンカーシャトルプラスミドｐＳＥ２８０（インビトロゲン、サンディ
エゴ、カリフォルニア）にライゲーションし、これをＣｌａＩおよびＢｇｌIIで
消化すると、ｐＳＥ２８０−Ｅが形成された。
【０２４１】 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を遂行することにより、アデノウイルス５
ＤＮＡ ｂｐ５５２〜９２４と隣接するＸｈｏＩおよびＳａｌＩ制限部位をコー
ド化するＤＮＡを合成した。使用されたプライマーは、次の通りであった： ５'末端、Ａｄ５ ｂｐ５５２−５８５： ５'−ＧＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＴＣ−ＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＧＡＧ
ＡＣＡＴＡＴＴＡＴＣＴＧＣＣＡＣＧＧＡＣＣ−３'（配列番号３６） ３'末端、Ａｄ５ ｂｐ９２２−８９１： ５'−ＣＧＡＧＡＴＣＧＡＴＣＡＣＣＴＣＣＧＧＴＡＣＡＡＧＧＴＴＴＧＧＣＡ
ＴＡＧ−３'（配列番号３７）
【０２４２】 次いで、この増幅されたＤＮＡフラグメント（以後、フラグメントＡと称する
場合もある）を、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩ（天然ＣｌａＩ部位(ｂｐ９１７)で開
裂する）で消化し、ｐＳＥ２８０−ＥのＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位にライゲー
ションすることにより、ＡＴＧコドンの８ｂｐ上流から始まるＥ１領域の５'末
端が再構成された。
【０２４３】 次いで、ＰＣＲを遂行することにより、ＥｃｏＲＩ制限部位と隣接するｂｐ３
３２３〜４０９０のアデノウイルス５ ＤＮＡを増幅した。使用されたプライマ
ーは、次の通りであった： ５'末端、Ａｄ５ ｂｐ３３２３−３３６０： ５'−ＣＡＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＴＧＡＧＧＴＡＣＧＡＴＧＡ
ＧＡＣＣ−３'（配列番号３８）、および ３'末端、Ａｄ５ ｂｐ４０９０−４０６０： ５'−ＧＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＣＴＧ−ＡＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣ
ＡＣＴＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＣＣ−３'（配列番号３９）。
【０２４４】 この増幅されたＤＮＡフラグメント（以後、フラグメントＢと称する場合もあ
る）を、ＢｇｌIIで消化することにより、アデノウイルス５ＢｇｌII部位（ｂｐ
３３８２）およびＥｃｏＲＩが切断され、ｐＳＥ２８０−ＡＥのＢｇｌIIおよび
ＥｃｏＲＩ部位にライゲーションすると、アデノウイルス５ｂｐ ５５２〜４０
９０の完全Ｅ１ａおよびＥ１ｂ領域が再構築された。生成されたプラスミドはｐ
ＳＥ２８０−Ｅ１と称される。
【０２４５】 合成プロモーターＧＲＥ５の制御下無傷のＥ１ａ／ｂ領域を含む構築物は次の
要領で製造された。無傷のＥ１ａ／ｂ領域は、ＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩで消化
することにより、ＢａｍＨＩ部位３'〜Ｅ１遺伝子を含むように予め修飾してお
いたｐＳＥ２８０−Ｅ１から切除された。Ｅ１ａ／ｂフラグメントを含むＸｈｏ
Ｉ〜ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＧＲＥ５−２／ＥＢＶ（Ｕ.Ｓ.バイオケミカ
ルズ、クリーブランド、オハイオ）の特有なＸｈｏＩおよびＢａｍＨＩ部位へク
ローン化すると、ｐＧＲＥ５−Ｅ１が形成された。
【０２４６】 第１構築物を含む細菌性形質転換体が同定された。プラスミドＤＮＡを調製し
、細胞のトランスフェクションに使用する前にＣｓＴＦＡでのバンド形成法によ
り精製した。
【０２４７】 アデノウイルス５ Ｅ２Ａ配列を含むプラスミドの構築。 アデノウイルス５ゲノムを、各々ｂｐ２１５６２および２７０８０を切断する
ＢａｍＨＩおよびＳｐｅＩで消化した。フラグメントをアガロースゲルで分離し
、５５１８ｂｐ ＢａｍＨＩ〜ＳｐｅＩフラグメントを単離した。５５１８ｂｐ
ＢａｍＨＩ〜ＳｐｅＩフラグメントを、ｂｐ２３９１２を切断するＳｍａＩでさ
らに消化した。生成した２３５０ｂｐ ＢａｍＨＩ〜ＳｍａＩフラグメントをア
ガロースゲルから精製し、スーパーリンカーシャトルプラスミドｐＳＥ２８０に
ライゲーションし、ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化すると、ｐＳＥ２８０−Ｅ
２ ＢａｍＨＩ−ＳｍａＩが形成された。
【０２４８】 次いで、ＰＣＲを遂行することにより、ｂｐ２３９１２のＳｍａＩ部位からＮ
ｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位に隣接したｂｐ２４７３０までのアデノウイル
ス５ＤＮＡを増幅した。使用されたプライマーは、次の通りであった： ５'末端、Ａｄ５ ｂｐ ２４７３２−２４７０８： ５'−ＣＡＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＡＧＣＧＣＴＴＣＴＣＧＴＣＧＣＧＴＣＣＡＡ
ＧＡＣＣＣ−３'（配列番号４０）； ３'末端、Ａｄ５ ｂｐ ２３９１２−２３９３４ ５'−ＣＡＣＣＣＣＧＧＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＧＧＡＣＧＧＧ−
３'（配列番号４１）。
【０２４９】 この増幅されたＤＮＡフラグメントをＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐ
ＳＥ２８０−Ｅ２ Ｂａｍ−ＳｍａのＳｍａＩおよびＥｃｏＲＩ部位にライゲー
ションすることにより、Ａｄ５ ｂｐ２４７３０から２１５６２までの完全Ｅ２
ａ領域が再構築された。生成した構築物はｐＳＥ２８０−Ｅ２ａである。
【０２５０】 Ｅ２ａの３'末端にあるＢａｍＨＩ部位をＳａｌＩ部位に変換するため、Ｂａ
ｍＨＩおよびＮｈｅＩで切断することによりＥ２ａ領域をｐＳＥ２８０−Ｅ２ａ
から切除し、そしてｐＳＥ２８０の特有なＢａｍＨＩおよびＮｈｅＩ部位へ再ク
ローン化した。それに続いて、Ｅ２ａ領域をＮｈｅＩおよびＳａｌＩでこの構築
物から切除することにより、それぞれ５'〜３'配向の多重クローニング部位であ
るｐＭＡＭｎｅｏ（クロンテク、パロアルト、カリフォルニア）のＮｈｅＩおよ
びＳａｌＩ部位へクローン化した。生成した構築物はｐＭＡＭｎｅｏ Ｅ２ａで
ある。
【０２５１】 最終ｐＭＡＭｎｅｏ−Ｅ２ａを含む細菌性形質転換体が同定された。プラスミ
ドＤＮＡを調製し、ＣｓＴＦＡでのバンド形成法により精製した。ｐＭＡＭｎｅ
ｏ−Ｅ２ａのアンピシリン耐性遺伝子内のＸｍｎＩ部位で環状プラスミドＤＮＡ
を線状化し、細胞のトランスフェクションに使用する前にフェノール／クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱によりさらに精製した。
【０２５２】 細胞のトランスフェクションおよび選択 一般的に、このプロセスには、各々異なるウイルス遺伝子を伴う２種のプラス
ミド構築物をリン酸カルシウム沈澱法または他のＤＮＡ送達手段により単一組織
培養細胞へ連続導入する段階が含まれた。細胞を第１構築物によりトランスフェ
クションし、安定した組込み体の確立に関連した薬剤耐性遺伝子の発現について
選択した。個々の細胞クローンを確立させ、導入されたウイルス遺伝子の機能に
ついて検定した。次いで、適当な候補クローンを、第２ウイルス遺伝子および第
２選択性マーカーを含む第２構築物によりトランスフェクションした。次いで、
トランスフェクション細胞を選択することにより、第２構築物の安定した組込み
体を確立させ、細胞クローンを確立させた。細胞クローンを両ウイルス遺伝子の
機能的発現について検定した。
【０２５３】 Ａ５４９（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１８５）をトランスフェクションに使用
した。適当な選択条件が、標準殺傷曲線測定法によりＧ４１８およびハイグロマ
イシンＢについて確立された。
【０２５４】 Ｅ１およびＥ２ａ領域を含むプラスミドによるＡ５４９細胞のトランスフェク
ション。 ＡｍｐＲ遺伝子を伴うＸｍｎＩによりｐＭＡＭＮｅｏ−Ｅ２ａを線状化し、ト
ランスフェクションにより細胞へ導入し、そして薬剤耐性コロニーが生じるまで
Ｇ４１８選択によりこのプラスミドの安定した組込みについて細胞を選択した。
クローンを単離し、ポリクローナル抗血清でＥ２ａタンパク質に関して染色し、
免疫蛍光法で視覚化することによりＥ２ａ発現についてスクリーニングした。Ｅ
２ａ遺伝子に温度感受性突然変異を含む温度感受性突然変異体Ａｄ５ｔｓ１２５
ウイルスの相補性によりＥ２ａ機能をスクリーニングした。（Van Der Vlietら
、J.Virology、第１５巻、３４８−３５４頁(１９７５)）。Ｅ２ａ遺伝子を発現
する陽性クローンが同定され、ＧＲＥ５促進Ｅ１ａ／ｂ領域＋ハイグロマイシンＲ 遺伝子を含む、ｐＧＲＥ５−Ｅ１からの７ｋｂ ＥｃｏＲＶ〜ＸｍｎＩフラグ
メントによるトランスフェクションに使用された。細胞をハイグロマイシン耐性
について選択し、Ｅ１タンパク質に関するモノクローナル抗体（オンコジーン・
サイエンシーズ、ユニオンデール、ニューヨーク）での染色によりＥ１ａ／ｂ発
現について検定した。Ｅ１欠失ベクターの相補能力によりＥ１機能を検定した。
この点で、Ｅ２ａの発現および機能が上記要領に従い証明されるため、陽性細胞
クローンにおけるＥ１ａ／ｂおよびＥ２ａの発現が確立された。
【０２５５】 トランスフェクションされたＡ５４９（Ａ５４９(ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−
１８５)）セルラインは、良好なＥ１ａ／ｂおよびＥ２ａ発現性を示し、さらな
る特性検定用に選択された。それはＳ８セルラインと称された。
【０２５６】 Ｇ．Ｓ８改良ファイバー相補性セルラインにおけるＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦゲノ
ム含有アデノウイルスベクターの製造 ファイバータンパク質の発現を高めるためＴＰＬの別形態を含むＳ８細胞にお
いてＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ（Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦは受託番号ＶＲ２６３６でＡ
ＴＣＣに寄託された）含有アデノウイルスベクターを製造するため、２１１Ｂ細
胞でのＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦの製造に関する実施例２記載のプロトコルに従った
が、ただし、上記同様２４時間０.３マイクロモルのデキサメタゾンにより前処
理した。すなわち、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質をその表面に伴い、ファ
イバーレスＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦゲノムを含むウイルス粒子を、６３３細胞で製
造した。６４４細胞で製造された粒子はまた、ファイバーレスＡｄ５.βｇａｌ.
ΔＦゲノムを含んでいたが、Ａｄ３ファイバーノブを伴うキメラ５Ｔ３Ｈファイ
バータンパク質をそれらの表面に有していた。
【０２５７】 すなわち、ここの記載に従い製造されたこれらのウイルス製品は、Ａｄ５.β
ｇａｌ.ΔＦ、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ、または野生型または修飾ファイバーにより
同様に構築された他のファイバーレスゲノムのターゲッティング送達に有用であ
る。ここでの目的に関して好ましいのは、ファイバーがＡｄ血清型Ｄウイルス、
さらに好ましくはＡｄ３７に由来する場合である。
【０２５８】 実施例６ 改良されたファイバー相補性セルラインにより製造された組換えアデノウイル
スベクターのシュードタイピングおよび感染力 Ａ．Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦのシュードタイピング 製造されたアデノウイルスベクターが改変された屈性を有することを証明する
ため、ウイルス粒子を６３３または６４４細胞から精製し、次いでウェスタンブ
ロットにかけ、Ａｄ２ファイバーに対するポリクローナルウサギ抗体（Ａｄ５お
よびキメラ５Ｔ３Ｈファイバータンパク質を検出する）でプローブした。
【０２５９】 Ｂ．６３３または６４４生成ウイルス粒子による細胞の感染力 上記要領で製造されたセルライン６３３または６４４を、指示された数の粒子
／細胞のＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦにより感染させ、ウイルス粒子を製造させた。次
いで、ウイルスを用いることにより、２１１Ｂ、ＭＲＣ−５ヒト線維芽細胞、Ａ
−１０ラット大動脈内皮細胞、およびＴＨＰ−１ヒト単核細胞を含む、選択され
たセルラインを感染させた。非結合ウイルスを細胞の洗浄により除去し、細胞を
さらに３７℃で４８時間インキュベーションした。次いで、細胞をグルタルアル
デヒドで固定し、Ｘ−ギャルで染色した。次いで、光学顕微鏡により染色細胞の
パーセンテージを測定し、この場合実験は全てトリプリケイトで行った。
【０２６０】 結果は、アデノウイルスベクターが、異なるファイバータンパク質を発現する
パッケージングセルラインを用いるシュードタイピングにより再ターゲッティン
グされ得ることを示していた。いずれかのファイバーを含む粒子は２１１Ｂ細胞
で等しく感染性を示し、ＭＲＣ−５線維芽細胞およびＴＨＰ−１細胞は、キメラ
線維を含むウイルスによりさらに容易に感染された。Ａ−１０ラット内皮細胞は
、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質を含む粒子により更に容易に感染された。
【０２６１】 実施例７ 一時的トランス相補作用 アデノウイルス５型（Ａｄ５）が治療遺伝子を細胞へ送達する能力は、アデノ
ウイルスファイバータンパク質とコクサッキーウイルス‐アデノウイルス受容体
（ＣＡＲ）との相互作用により仲介される。広範囲の細胞がＣＡＲを発現するた
め、アデノウイルスを特異的細胞型への遺伝子送達に使用するのは困難であると
考えられていた。興味の対象である屈性を同定するための修飾ファイバー遺伝子
の試験システムについては、同時係属中のアメリカ合衆国特許出願第０９／４８
２６８２号（２０００年１月１４日付け国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０
０２６５号としても出願）に記載されている。ファイバー欠失Ａｄによる組織培
養細胞の感染およびファイバー発現を指令するプラスミドとの一時的コトランス
フェクションを含むインビトロシステムが開発された。このシステムにより、ウ
イルス粒子で発現された修飾ファイバーの製造および評価が行われ得る。このシ
ステムは、修飾ファイバータンパク質を伴うアデノウイルスベクターの治療有用
量の製造に使用され得るもので、上記ファイバーは、ファイバー遺伝子への目的
リガンドの挿入により新規屈性が加えられている。これらのファイバーはまた、
天然屈性（すなわち、ＣＡＲへの結合性）が除去され得る。
【０２６２】 使用されたプラスミドはｐＤＶ６０およびｐＤＶ５５であり、本明細書および
アメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８２号（２０００年１月１４日付け国
際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００２６５号としても出願された）の記載に
従い製造された。ｐＤＶ６０は、ＣＭＶプロモーター、Ａｄ５三連リーダー、イ
ントロン、およびＡｄ５ファイバー遺伝子配列を含むｐｃＤＮＡ３.１に基く発
現プラスミドである。ｐＤＶ５５は、ファイバー遺伝子を全く含まず、自然対照
としての役割を果たす。Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦおよび２１１Ｂは上記の通りであ
る。２９３Ｔ細胞は、それらが組込まれたＳＶ４０大型Ｔ抗原遺伝子を発現する
という点を除いて２９３細胞と同じである。ＨＤＦ細胞は、ヒト二倍体線維芽細
胞である。２９３Ｔ細胞はＣＡＲおよびαｖインテグリンを発現する。ＨＤＦ細
胞はαｖインテグリンを発現するが、ＣＡＲについては全く発現しない。ファイ
バー発現プラスミドによるトランスフェクションは、１５ｃｍ皿１枚につき２０
ｍｇのＤＮＡおよび５０ｍｌのリポフェクタミンを用いてリポフェクタミン（ギ
ブコ‐ＢＲＬ）により遂行された。１０％胎児牛血清を補ったＤＭＥＭにおいて
細胞を維持した。
【０２６３】 Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦのファイバー欠失突然変異は、機能的Ａｄ５ファイバー
を安定して発現するセルラインである、２１１Ｂを通してビリオンを継代するこ
とによりトランスで相補される。本システムは、２９３Ｔ細胞においてトランス
フェクションされたエピソームプラスミドから発現された修飾ファイバーにより
Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦを相補するように設計された。その結果、ウイルスの増殖
を必要としないＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦゲノムを含むウイルス粒子において修飾フ
ァイバーを組込む簡易化かつ迅速な方法が提供された。
【０２６４】 エピソームファイバー発現性プラスミドによるＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦのトラン
ス相補作用の実行可能性は、次の実験で立証された。２９３Ｔ細胞を２種のプラ
スミド：ファイバーを全く発現しないｐＤＶ５５、または野生型Ａｄ５ファイバ
ーを発現するｐＤＶ６０の一方によりトランスフェクションした。ファイバー発
現は、少なくとも６日間持続する。トランスフェクションの２４時間後、これら
の細胞を、２１１Ｂ細胞を通して継代されたＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦにより２００
０粒子／細胞の割合で感染させた。７２時間後、細胞を５回の凍結解凍サイクル
に暴露することにより、粗ウイルスリゼイト（ＣＶＬ）を生成させた。ウイルス
粒子を塩化セシウム勾配遠心分離により精製した。Ａｄ５ファイバーに特異的な
抗体により行なわれたウエスタンブロットにより確認したところによると、生成
されたビリオンは、エピソームプラスミドから発現されたファイバーを組込んで
いた。
【０２６５】 エピソームプラスミドトランス相補作用系は、ウイルス粒子の状況での修飾フ
ァイバーの迅速な発現および特性評価に適している。エピソームプラスミドトラ
ンス相補作用はまた、新規屈性および天然屈性の除去を含む、他の結合特性につ
いて一連の修飾ファイバーを迅速に評価するのに非常に有用である。多数の修飾
ファイバーの迅速な生成および試験に加えて、生産性および安全性という点でＡ
ｄ５.βｇａｌ.ΔＦトランス相補作用系には他の利点もある。エピソームプラス
ミドトランス相補作用は、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦによる相補のために修飾ファイ
バーごとに安定したセルラインを作製する必要が無いという点で他のトランス相
補作用を凌ぐ固有の利点を有する。Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦは、Ｅ１、Ｅ３および
ファイバーでは欠失しているため、追加的な遺伝子欠失があり、当然そのため遺
伝子治療にとって非常に好適なものとなっている。さらに、ファイバー遺伝子欠
失の存在により、パッケージング細胞での組換えによる複製能欠損ウイルスの発
生機会が減少する。単一Ａｄベクター製品により、適当なファイバー発現構築物
で細胞をトランスフェクションするだけで、いかなる数の異なる細胞型でも再タ
ーゲッティングされ得る。
【０２６６】 実施例８ Ａｄ３７ファイバータンパク質を含むアデノウイルス遺伝子送達ベクターの製
造 この実施例は、Ａｄ３７ファイバータンパク質を発現するパッケージングセル
ラインの構築、およびこのファイバータンパク質を含むファイバー欠失Ａｄベク
ター（例えばＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦ）の粒子生成におけるそれらの用途について
記載している。ファイバータンパク質を、ペントン基部タンパク質にそのＮ−末
端を介して結合させることによりウイルスキャプシドに結合させ、そのＮ−末端
配列がＡｄ５タンパク質のそれと更に緊密にマッチするようＡｄ３７ファイバー
を修飾することにより、これらのベクターにおいてそれがＡｄ５ペントン基部と
有効に結合することを確実にした。
【０２６７】 Ａ．材料および方法 セルラインおよび野生型アデノウイルス。ヒトＡ５４９肺癌上皮細胞およびヒ
トチャングＣ結膜細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を、
１０％胎児牛血清含有完全ダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持した
。野生型Ａｄ１９ｐおよびＡｄ３７（ＡＴＣＣ）をＡ５４９細胞で増殖させ、前
記と同様ＣｓＣｌ２密度勾配でのバンド形成法により精製した（Huangら（１９
９９）J.Virol.７３：２７９８−２８０２）。ウイルスタンパク質濃度をバイオ
‐ラドのプロテインアッセイにより測定し、これを用いてＡｄ２ビリオンの既知
分子量に基いたウイルス粒子の数を計算した（１μｇ＝４×１０９粒子）。
【０２６８】 Ｂ．Ａｄ３７ファイバー発現性セルラインおよび組換えＡｄ３７ノブタンパク
質の構築。 １．Ａｄ３７ファイバータンパク質用発現プラスミドの構築（ｐＤＶ８０） 哺乳類細胞におけるＡｄ３７ファイバータンパク質の発現用に製造されたｐＤ
Ｖ８０と称されるプラスミド（配列番号４２参照）は、ｐＶＤ６０、ｐＤＶ６７
およびｐＤＶ６９におけるエレメントと同じ調節エレメントを使用することによ
り、パッケージングラインでＡｄ３７を発現させる。それは２段階で構築された
。
【０２６９】 まず、合成オリゴヌクレオチドプライマー
【表２７】 を用いて、Ａｄ３７ファイバー読み枠をＡｄ３７ゲノムＤＮＡから増幅した。Ｌ
３７は、開始コドン（イタリック体）の前に特有なＢａｎＨ１部位（太字）を加
え、次の通り、ファイバーのＮ−末端配列をＡｄ５ファイバータンパク質のＮ−
末端配列とより緊密にマッチさせる点突然変異を導入するためにＡｄ３７ゲノム
配列とは異なるヌクレオチド（下線部）を含む。
【０２７０】
【表２８】 ３７ＦＲはまた、特有のＮｏｔ１部位（太字）を組込んでいる。ＰＣＲ産物を、
ｐＣＤＮＡ３.１ｚｅｏ(＋)（インビトロゲン）のＢａｍＨ１およびＮｏｔ１部
位へ挿入することによりｐＤＶ７８が作製された。挿入された変化を含め、Ａｄ
３７ファイバータンパク質の正確な配列を配列決定により確認した。
【０２７１】 ７５０ラインにおけるファイバー遺伝子の２つの点突然変異、Ｓ３５６〜Ｐ３
５６およびＩ３６２〜Ｔ３６２が配列決定により発見された。突然変異は、７０
５セルラインのＡｄ３７ファイバー遺伝子における受容体結合ドメインには無い
。それらはノブ三量体界面に埋められている。これらの突然変異が受容体結合に
影響しないことを確認するため、正確な配列をもつＡｄ３７ファイバータンパク
質を再クローン化し、２９３Ｔ細胞をウイルスによりトランスフェクションし、
それに続いてＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦにより感染させると、Ａｄ３７シュードタイプ
ウイルスが製造された。結果は、ライン７０５から製造されたＡｄ３７シュード
タイプウイルスによる実験結果と同じであった（Wuら（２００１）Virology ２
７９：７８−８９参照）。
【０２７２】 第２に、アデノウイルス５型三連リーダーを含む１.２ｋｂのＢａｍＨ１／Ｂ
ｇｌIIフラグメントをｐＤＶ５５から切除し（実施例３参照）、ｐＤＶ７８のＢ
ａｍＨ１部位へ挿入すると、ｐＤＶ８０（配列番号４２）が作製された。プラス
ミドｐＤＶ８０は、受託番号ＰＴＡ−１１４７としてＡＴＣＣに寄託された。
【０２７３】 ２．組換えＡｄ３７ノブタンパク質の構築 Ｎ−末端Ｔ７・Ｔａｇを含む組換えＡｄ３７ノブタンパク質を、ＰＥＴ発現系
（ノヴァゲン）を用いてエシェリキア・コリ（E.coli）で製造した。次のプライ
マー（配列番号４８および４９）：
【表２９】 （下線部はＢａｍＨＩ部位）、および
【表３０】 （下線部はＸｈｏＩ部位）を用いて、Ａｄ３７ファイバーＤＮＡ（ジェンバンク
受託番号Ｕ６９１３２）を野生型Ａｄ３７ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した。
【０２７４】 ＰＣＲ反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（キアゲン）を用いて９４℃（変
性）、５５℃（アニーリング）、７２℃（伸長、３０サイクル）で行なわれた。
Ｎ−末端開始コドン（イタリック体）の付加を伴うＡｄ３７ファイバータンパク
質の残基１７２〜３６５を含む、増幅されたＤＮＡフラグメントを精製し、ＴＡ
−クローニング・キット（インビトロゲン）を用いてｐＣＲ−ＴＯＰＯベクター
へサブクローン化した。ＤＮＡ配列決定の結果、複製エラーは全く見出されなか
った。培養形質転換コロニーからのプラスミドを精製し、ＢａｍＨＩおよびＸｈ
ｏＩで消化した。フラグメントを細菌性発現ベクター、ｐＥＴ２１ａ（ノヴァゲ
ン）のＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ部位へ挿入し、(ＤＥ３)ｐＬＹＳ Ｓ発現細胞
（インビトロゲン）へ形質転換した。３７℃で４時間１ミリモルＩＰＴＧによる
誘導によりノブ発現についてコロニーを選択し、ノブ発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より測定した。最高のノブ発現を示すコロニーを大規模ノブ発現に使用し、４時
間３０℃で０.５ｍｌのＩＰＴＧにより誘導した。
【０２７５】 組換え体Ｔ７・タッグドＡｄ３７ノブタンパク質を、製造業者（ノヴァゲン）
の指示する方法に従いＴ７・標識アフィニティー精製キットを用いて音波処理細
菌から精製した。回収されたタンパク質を、純度についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次
いでクーマシー染色または製造業者（ノヴァゲン）により記載されたＨＲＰ−コ
ンジュゲートα−Ｔ７・タッグモノクローナル抗体もしくはα−Ａｄ３７ファイ
バーウサギ抗体によるウエスタンブロッティングにより分析した。
【０２７６】 ３．Ａｄ３７ファイバータンパク質を発現するセルラインの製造 プラスミドｐＤＶ８０ ＤＮＡを、キアゲン方法を用いて精製し、アデノウイ
ルス相補性セルラインＥ１−２ａ Ｓ８へ電気穿孔した（本明細書実施例参照、
またGorzigliaら（１９９６）J.Virology ７０：４１７３−４１７８、および V
on Seggernら（１９９８）J.Gen.Virol.７９：１４６１−１４６８参照）。安定
したクローンを６００μｇ／ｍｌゼオシン（インビトロゲン）により選択した。
【０２７７】 クローンを拡大させ、ウサギを組換えＡｄ３７ファイバータンパク質で免疫化
することにより産生させたＡｄ３７ファイバーに対して指向したウサギポリクロ
ーナル抗体（α−Ａｄ３７ファイバーウサギ抗体）を用いて間接的免疫蛍光法（
Von Seggernら（１９９８）J.Gen.Virol.７９：１４６１−１４６８）によりフ
ァイバー発現についてスクリーニングした。均一に高レベルでタンパク質を発現
する２種のクローン（７０５および７３１ライン）が選択された。
【０２７８】 実施例９ シュードタイプＡｄベクター粒子の製造 Ａｄ３７ファイバータンパク質を備えた（「シュードタイピングされた」）ベ
クター粒子を生成するため、Ａｄ３７ファイバー発現性７０５細胞を、Ａｄ５.
βｇａｌ.ΔＦまたはＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦにより感染（約１０００粒子／細胞）
させた。
【０２７９】 材料および方法 Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦの構築は、実施例２に記載されている（これは、受託番
号ＶＲ２６３６として上記の通りＡＴＣＣに１９９９年１月１５日付で寄託され
た。また、Von Seggernら（１９９９）J.Virol.７３：１６０１−１６０８、同
時係属中の２０００年１月１４日付アメリカ合衆国特許出願第０９／４８２６８
２号、および２０００年１月１４日付国際ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／００
２６５号参照）。
【０２８０】 Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦは、ＡｄＥａｓｙシステムの修飾形を用いて細菌での組換
えにより構築された（アメリカ合衆国特許第５９２２５７６号参照、またHeら(
１９９８)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９５：２５０９−２５１４参照、このシス
テムは、著者らおよび他の供給源から公的に入手可能である）。
【０２８１】 第一に、ファイバー欠失ゲノムプラスミドは、ｐＡｄＥａｓｙ−１からファイ
バー遺伝子を除去することにより構築された（アメリカ合衆国特許第５９２２５
７６号、および Heら(１９９８)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９５：２５０９−２
５１４参照、このＡｄＥａｓｙシステムおよびベクターは、ジョーンズ・ホプキ
ンス・ユニバーシティーのHeらから公的に入手可能である）。プラスミドｐＡｄ
Ｅｓｙ−１は、Ｅ１遺伝子を含むヌクレオチド１−３５３３、およびＥ３遺伝子
を含むヌクレオチド２８１３０−３０８２０を除く全Ａｄ５ゲノムを含む。
【０２８２】 プラスミドｐＤＶ４３（実施例２参照、またVon Seggernら(１９９９)J.Virol
.７３：１６０１−１６０８も参照）をＰａｃ１で消化し、末端をエシェリキア
・コリ(E.coli)ＤＮＡポリメラーゼの大型フラグメントおよびｄＮＴＰでの処理
により平滑にし、そして生成物を再ライゲーションすることにより、プラスミド
ｐＤＶ７６が製造された。生成したプラスミドｐＤＶ７６は、Ｐａｃ１部位の喪
失以外はｐＤＶ４３と同一であり、Ｅ３およびファイバー欠失を伴うＡｄ５ゲノ
ムの右端を含む。オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号５０および５１：
【表３１】 Ａｄ５ゲノムにおける特有のＳｐｅ１部位（太字）を含む、および
【表３２】 右Ａｄ５ ＩＴＲに隣接した新規Ｐａｃ１部位（太字）を含む）を用いて、ＰＤ
Ｖ７６からの４.２３ｋｂフラグメントを増幅した。このため、生成したＰＣＲ
増幅フラグメントは、ヌクレオチド２８１３３〜３２７４３（Ｅ３およびファイ
バー遺伝子）の欠失を伴うＡｄ５ゲノムのヌクレオチド２７０８２〜３５９３５
を含み、これを用いてｐＡｄＥａｓｙ１（アメリカ合衆国特許第５９２２５７６
号参照）の対応するＳｐｅ１／Ｐａｃ１フラグメントを置換することにより、ｐ
ＤＶ７７が作製された。
【０２８３】 第二に、エシェリキア・コリ（E.coli）株ＢＪ５１８３を、ｐＤＶ７７および
Ｐｍｅ１−線状化ｐＡｄＴｒａｃｋ（アメリカ合衆国特許第５９２２５７６号、
Heら（１９９８）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９５：２５０９−２５１４に記載
）の混合物により電気穿孔し、ＤＮＡをカナマイシン耐性コロニーから単離した
。生成したプラスミドｐＤＶ８３は、Ｅ１−、Ｅ３−およびファイバー‐欠失を
伴う完全Ａｄ５ゲノムを含み、ＣＭＶ駆動ＧＦＰリポーター遺伝子がＥ１欠失部
位に挿入されている。完全長Ａｄ染色体をＰａｃ１消化により単離し、Ｅ１−お
よびファイバー‐相補性６３３細胞へトランスフェクションした（Von Seggern
ら（２０００）J.Virol.７４：３５４−３６２）。６３３細胞は、上記要領で、
ｐＤＶ６７（配列番号３０、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１１４５として寄託され
た）をＥ１−２ａ Ｓ８細胞へ電気穿孔することにより製造された。次いで、回
収されたウイルスＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦを６３３細胞で平板培養することによりプ
ラーク精製し、細胞ペレットを凍結解凍することによりウイルスストックを製造
した。
【０２８４】 Ａｄ５−シュードタイプ粒子製造 Ａｄ５ファイバーを伴う粒子 Ａｄ５シュードタイプ粒子を、野生型Ａｄ５ファイバータンパク質を発現する
６３３細胞でのウイルス培養により生成させた。ウイルス粒子を単離し、ＣｓＣ
ｌ勾配で精製した（Von Seggernら(１９９９)J.Virol.７３：１６０１−１６０
８、１５−４０％ＣｓＣｌ勾配（１１１０００×ｇ、４℃で３時間）で行なわれ
た遠心分離により精製）。ウイルスタンパク質を分析するため、１０μｇの精製
粒子を８−１６％勾配ゲルで電気泳動させ、タンパク質をナイロン膜に移した。
生じたブロットを、バキュロウイルス感染細胞で発現された組換えＡｄ３７ファ
イバーまたはＡｄ５ファイバーまたはペントン基部タンパク質に対して産生した
ウサギポリクローナル抗体によりプローブした。
【０２８５】 Ａｄ３７ファイバーを伴う粒子 Ａｄ３７ファイバー製造セルライン７０５からの細胞を、約１０００粒子／細
胞でＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦまたはＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦにより感染させた。ウイル
ス粒子を単離し、ＣｓＣｌ勾配で精製した。バンドを採取し、貯蔵緩衝液（１０
ミリモルのトリス−ｐＨ８.１、０.９％ＮａＣｌおよび１０％グリセリン）へ透
析し、アリコートに分け、−７０℃で貯蔵した。
【０２８６】 ウイルスタンパク質分析 ウイルスタンパク質の分析のため、ファイバー無し（２９３細胞で増殖）、Ａ
ｄ５ファイバー（６３３細胞で増殖）またはＡｄ３７ファイバー（７０５細胞で
増殖）を伴う精製Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ粒子１０μｇを、８−１６％ポリアクリ
ルアミド勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動させ、タンパク質をナイロン膜へ
移した。次いで、ブロットをα−Ａｄ３７ファイバーウサギ抗体によりプローブ
した。バキュロウイルス感染細胞で発現された組換えタンパク質に対して産生し
たポリクローナル抗体（Wickmanら(１９９３)Cell ２：３０９−３１９）でブロ
ットを再プローブすることにより、Ａｄ５ファイバーおよびペントン基部が検出
された。
【０２８７】 アデノウイルス感染および細胞結合検定法 接着性チャングＣおよびＡ５４９細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中５％ＣＯ２ 、３７℃で３時間、１細胞当たり１００００粒子でＡｄ５ファイバー（Ａｄ５
.ＧＦＰ.ΔＦ／５Ｆ）またはＡｄ３７ファイバー（Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／３７Ｆ
）を含むＧＦＰ発現性Ａｄ５ベクターにより感染させた。細胞を食塩水で２回洗
浄し、次いで一夜３７℃、５％ＣＯ２で培養した。翌日、３７℃で５分間０.０
５％（ｗ／ｖ）トリプシンおよび０.５ミリモルＥＤＴＡ（ベーリンガー・マン
ハイム）を含む緩衝液により細胞を脱離させた。懸濁した細胞をＰＢＳで１回洗
浄し、次いでリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７.４に再懸濁した。ＦＡＣＳ
ｃａｎフローサイトメーターによりＧＦＰ蛍光を測定した。非感染細胞の蛍光に
より確立された閾値を用いて、ＧＦＰを発現する細胞を識別した。Ａｄ感染にお
けるＣＡＲの役割を評価するため、１００００個の結膜細胞を、４℃で１時間完
全ＤＭＥＭ中、１８０μｇ／ｍｌのＲｍｃＢ、機能遮断性抗ＣＡＲモノクローナ
ル抗体（Hsuら（１９８８）J.Virol.６２：１６４７−１６５２）と前インキュ
ベーションした。次いで、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／５ＦまたはＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ
／３７Ｆを含む小量を細胞１個当たり１００００粒子で加えた。細胞を３時間感
染させ、一夜培養し、採取し、そしてＧＦＰ発現について分析した。非感染チャ
ングＣ細胞の蛍光により設定された閾値を越えて検出された細胞のパーセントに
より、ＧＦＰを発現する細胞のパーセントを測定した。
【０２８８】 細胞へのアデノウイルス結合性を測定するため、製造業者の使用説明書に従い
ヨードゲン（ピアス）を用いて125Ｉにより野生型Ａｄ３７を標識し、報告され
た要領（Huangら(１９９９)J.Virol.７３：２７９８−２８０２）でゲル濾過に
より遊離125Ｉから分離した。次いで、チャングＣ細胞における放射性標識野生
型Ａｄ３７の結合性を報告された要領（Huangら（１９９９）J.Virol.７３：２
７９８−２８０２）で定量した。１００倍濃度の非標識Ａｄ３７の存在下細胞お
よび標識Ａｄ３７粒子をインキュベーションすることにより、非特異的結合を測
定した。総結合ｃｐｍから非特異的結合を控除することにより、特異的結合を算
出した。二価カチオンが結合に要求されるか否かを調べるため、１０ミリモルの
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）または様々な濃度のＣａＣｌ２またはＭｇ
Ｃｌ２を細胞に加えた後、標識ウイルスとインキュベーションした。Ａｄ３７に
関する受容体がタンパク質であるか否かを調べるため、３７℃で１時間１０μｇ
／ｍｌのトリプシン（ギブコ）、サチライシン（シグマ）、プロテイナーゼＫ（
ベーリンガー‐マンハイム）およびブロメライン（シグマ）により細胞を前処理
し、次いで完全ＤＭＥＭにより２回洗浄した後、標識ウイルスを加えた。プロテ
アーゼ処理後、細胞は＞９５％生存可能であった。
【０２８９】 結膜細胞へのＡｄ３７結合は、カルシウム依存的である。チャングＣ細胞への
特異的125Ｉ−標識Ａｄ３７結合を、１０ミリモルＥＤＴＡの存在下および様々
な濃度の塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムの存在下で測定した。総数から
１００倍過剰の非標識ウイルスの存在下における非特異的数を控除することによ
り特異的結合を測定した。
【０２９０】 プロテアーゼによる結膜細胞の前処理により、Ａｄ３７結合は阻害される。チ
ャングＣ細胞を、125Ｉ標識Ａｄ３７の細胞結合前に様々なプロテアーゼで１時
間前処理した。125Ｉ標識Ａｄ３７を伴う細胞に１００倍の非標識Ａｄ３７を加
え、特異的結合に関する合計数から控除することにより、非特異的結合を測定し
た。阻害パーセントは、非処理細胞の特異的結合のパーセンテージとして非処理
細胞および前処理細胞の特異的結合における差異を表す。
【０２９１】 ウイルスオーバーレイタンパク質ブロット検定法（ＶＯＰＢＡ） ＥＤＴＡまたは塩化カルシウムの存在下Ａｄ３７でプローブされたヒト結合膜
タンパク質のＶＯＰＢＡのため、チャングＣ膜画分を８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
り分離し、ＰＤＶＦ膜へ移した。それに続いて、ＥＤＴＡまたは塩化カルシウム
の存在下、Ａｄ３７粒子全体を使用または使用せず、Ａｄ３７ファイバーに対す
るポリクローナル抗体、および最後にホースラディッシュペルオキシダーゼコン
ジュゲート抗ウサギ抗体により膜をプローブした。移されたチャングＣ膜タンパ
ク質を、塩化カルシウムの存在下、Ａｄ３７ノブの代わりに、組換えＡｄ３７ノ
ブタンパク質によりプローブした。
【０２９２】 チャングＣおよびＡ５４９細胞の密集単層を、削って脱離させ、遠心分離によ
り沈澱させ、次いで２５０ミリモルのしょ糖、２０ミリモルのＨＥＰＥＳ、ｐＨ
７.０、１ミリモルのＥＤＴＡおよび２μｇ／ｍｌのアプロチニンおよびロイペ
プチンに再懸濁した。細胞をダウンスホモジナイザーに移し、３０ストロークで
崩壊させた。細胞小器官および核を５００ｇで１５分間沈澱させた。次いで、原
形質膜フラグメントを、２０００００ｇで１時間細胞リゼイトの上清から沈澱さ
せ、次いで１０ミリモルのトリス・Ｃｌ、ｐＨ８.１、１０μｇ／ｍｌのアプロ
チニンおよびロイペプチンに再懸濁した。
【０２９３】 チャングＣまたはＡ５４９細胞の細胞膜を、２％ＳＤＳ、非還元性緩衝液とイ
ンキュベーション（１：１）し、沸騰させずに８％ポリアクリルアミドゲルで分
離した。次いで、膜タンパク質をＰＶＤＦ膜（イモビロン−Ｐ）へエレクトロブ
ロッティングし、ＰＢＳ中５％(ｗ／ｖ)牛乳、ｐＨ７.４、０.０２％トウィーン
−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で遮断した。遮断後、膜を、室温で１時間、ＰＢＳ−Ｔ中
０.５％（ｗ／ｖ）牛乳、１ミリモルのＣａＣｌ２において１μｇ／ｍｌの野生
型Ａｄ１９ｐまたはＡｄ３７とインキュベーションした。次いで、膜をリン酸緩
衝食塩水、ｐＨ７.４（ＰＢＳ）、１ミリモルのＣａＣｌ２で１回洗浄し、室温
で３０分間、ＰＢＳ−Ｔ中０.５％（ｗ／ｖ）牛乳、１ミリモルのＣａＣｌ２に
おいて１：５００希釈率のα−Ａｄ３７ファイバーウサギ抗体とインキュベーシ
ョンした。膜をＰＢＳ、１ミリモルＣａＣｌ２で再洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔ中
０.５％（ｗ／ｖ）牛乳、１ミリモルＣａＣｌ２において１：５０００希釈率の
ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートα−ウサギ抗体
（シグマ）とインキュベーションした。膜を、ＰＢＳ、１ミリモルＣａＣｌ２中
で４回、ＰＢＳ−Ｔ、１ミリモルＣａＣｌ２で１回、そして１ミリモルのＣａＣ
ｌ２で１回洗浄した。ブロットを５分間強化化学発光試薬（ピアス）により発現
させ、５秒〜１分間１枚のバイオマックスフィルム（コダック）上に置いた。二
価金属カチオン実験のため、全溶液中１ミリモルのＣａＣｌ２ではなく２ミリモ
ルのＥＤＴＡの存在下で膜をインキュベーションした。細胞膜タンパク質へのフ
ァイバーノブ結合を検定するため、膜フィルターを、室温で１時間、トリス緩衝
食塩水、０.１％トウィーン−２０、１ミリモルＣａＣｌ２中１μｇ／ｍｌの精
製Ｔ７−標識Ａｄ３７ノブタンパク質とインキュベーションした。α−Ａｄ３７
ファイバーウサギ抗体およびＨＲＰ−コンジュゲート抗ウサギ抗体を適用し、膜
を上記と同様基質溶液により発現させた。
【０２９４】 結果：Ａｄ５またはＡｄ３７ファイバータンパク質により再ターゲッティング
されたウイルス粒子を伴うヒト結合および肺上皮細胞のアデノウイルス感染の比
較 Ａｄ３７ファイバータンパク質を製造するパッケージングセルラインを生成さ
せた。Ａｄ５およびＡｄ３７ファイバータンパク質のＮ−末端アミノ酸配列は顕
著に異なるため、そしてＡｄ３７ファイバーがＡｄ５ベクター粒子へ有効に組込
まれることを確実にするため、野生型Ａｄ３７ファイバーにおける幾つかの残基
が、Ａｄ５配列とより緊密にマッチするように突然変異を導入した。次いで、Ｃ
ＭＶプロモーターおよびアデノウイルス５型三連リーダーの制御下でこのファイ
バーを生産する安定したセルラインを生成させ、間接的免疫蛍光法によりファイ
バー発現についてスクリーニングした。Ａｄ３７ファイバーを高レベルで発現す
る一クローン（ライン７０５）がさらなる試験用に選択された。
【０２９５】 野生型Ａｄ５ファイバータンパク質を発現する一セルライン６３３、およびラ
イン７０５からの細胞を、βガラクトシダーゼリポーター遺伝子をもつファイバ
ー欠失Ａｄ５ベクターにより感染させた。生成したベクター粒子は、Ａｄ５ファ
イバータンパク質（Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ／５Ｆ）およびＡｄ３７ファイバータ
ンパク質（Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ／３７Ｆ）をそれぞれ含んでいた。ウイルス粒
子への正しいファイバータンパク質の組込みを、ウエスタン・ブロッティングに
より証明した。ＧＦＰリポーター遺伝子を含むアデノウイルスベクター、Ａｄ５
.ＧＦＰ.ΔＦ／５ＦおよびＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／３７Ｆも同じ方法で作製された
。
【０２９６】 再ターゲッティングされたアデノウイルス粒子を用いて様々な細胞型の感染が
調べられた。ＧＦＰ蛍光により検定したところによると、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／
５Ｆは、肺上皮（Ａ５４９）および結膜細胞（チャングＣ）への良好な遺伝子送
達性を呈した。対照的に、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／３７Ｆは、チャングＣ細胞へＧ
ＦＰを有効に送達したが、Ａ５４９細胞への遺伝子送達性については非常に乏し
いものであった。ＣＡＲはＡ５４９細胞の表面で発現されるが、Ａｄ５.ＧＦＰ.
ΔＦ／５Ｆにより示されたところによると、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／３７Ｆはこれ
らの細胞を有効に感染させることができなかった。この実験は、Ａｄ３７ファイ
バータンパク質が、ＣＡＲ発現性ヒト肺上皮細胞ではなく、ヒト結膜細胞の優先
的感染性を付与し得ることを示している。
【０２９７】 このためＣＡＲはＡｄ３７に関する一次受容体ではない。最近の試験結果によ
ると、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の表面におけるＣＡＲの発現
により、Ａｄ３７結合性は改善されないことが報告されていることから（Arnber
gら(２０００)J.Virol.７４：４２−４８）、Ａｄ３７は一次受容体としてＣＡ
Ｒを使用しないことが示唆されている。ヒト結膜細胞でこれを証明するため、Ａ
５４９およびチャングＣ細胞を、ＲｍｃＢ（Hsuら(１９８８)J.Virol.６２：１
６４７−１６５２）、ＣＡＲに対する機能遮断性モノクローナル抗体により前処
理した。ＲｍｃＢ抗体は、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／５ＦによるＡ５４９細胞の感染
を阻止したが、Ａｄ５.ＧＦＰ.ΔＦ／３７ＦによるチャングＣ細胞の感染に対し
てはほとんど影響を及ぼさなかった。これは、ＣＡＲがチャングＣ結膜細胞にお
いてはＡｄ３７にとって一次受容体ではないことを示している。
【０２９８】 結膜細胞へのＡｄ３７結合は、二価金属カチオンを必要とする。ＣＡＲへのフ
ァイバー結合およびαｖ−インテグリン類へのペントン基部結合の組み合わせに
より、アデノウイルス血清型の中には細胞に結合し得るものもあることが提案さ
れた（Roelvinkら(１９９８)J.Virol.７２：７９０９−７９１５）。アデノウイ
ルスペントン基部のＲＧＤモチーフへのαｖ−インテグリン結合は相対的に低い
親和力を有するが（Wickmanら(１９９３)Cell ２：３０９−３１９）、それにも
かかわらずこれは細胞表面へのウイルス結合に寄与し得る。Ａｄ３７は、インテ
グリンαｖβ５への結合について特に強い親和力を示すことから（Mathiasら(１
９９８)J.Virol.７２：８６６９−８６７５）、インテグリンαｖβ５はＡｄ３
７に関する一次受容体であり得ることが示唆されている。αｖ−インテグリンに
よるＲＧＤモチーフへの結合は、二価カチオン、例えばカルシウムまたはマグネ
シウムの存在を必要とする（Stuiverら（１９９６）J.Cell Physiol.１６８：５
２１−５３１）。対照的に、二価カチオンは、ＣＡＲ−Ａｄ１２ノブ複合体での
結合には全く必要とされなかった（Bewleyら（１９９９）Science ２８６：１５
７９−１５８３）。
【０２９９】 Ａｄ３７受容体結合におけるαｖ−インテグリン類および二価金属カチオンの
潜在的役割を研究するため、チャングＣ細胞への125Ｉ標識Ａｄ３７結合をＥＤ
ＴＡの不存在または存在下で調べた。ＥＤＴＡは、結膜細胞へのＡｄ３７結合を
阻害したが、Ａｄ５結合については改変しなかった。これらの発見は、Ａｄ３７
結合における二価金属についての必要性を示唆している。
【０３００】 カルシウムまたはマグネシウムイオンの存在は、焦点接触においてαｖβ５が
組織化するのを助けること（Stuiverら（１９９６）J.Cell Physiol.１６８：５
２１−５３１）から、カルシウムおよびマグネシウムはインテグリンαｖβ５機
能を助けることが示唆されている。Ａｄ３７細胞結合におけるインテグリンαｖ β５の潜在的役割をさらに試験するため、チャングＣ細胞への125Ｉ標識Ａｄ３
７結合性を、様々な濃度の塩化カルシウムまたはマグネシウムの存在下で測定し
た。マグネシウムイオンは、チャングＣ細胞へのＡｄ３７結合性にはほとんど影
響を及ぼさなかった。対照的に、カルシウムイオンは、チャングＣ細胞へのＡｄ
３７結合性を劇的に高めた。Ａｄ３７結合に関する塩化カルシウムの最適濃度は
１ミリモルであり、カルシウム濃度がそれより高い場合実際に細胞へのウイルス
結合性を減少させた。どちらの金属もインテグリンαｖβ５へのリガンド結合を
助けるため、マグネシウムではなくカルシウムがＡｄ３７結合を促進したという
事実は、細胞へのウイルス結合に関する一次受容体としてのインテグリンαｖβ５ とは一致しない。さらに、Ａ５４９細胞は、豊富なαｖ−インテグリン類を発
現するが（Mathiasら(１９９８)J.Virol.７２：８６６９−８６７５）、Ａｄ３
７の有効な結合を助け得なかった。
【０３０１】 野生型Ａｄ３７粒子は、３種の結膜タンパク質に結合する。最近の試験結果で
は、ＣＨＯ細胞のプロテアーゼ処理によりＡｄ３７結合性が廃されることが報告
されたことから（Arnbergら(２０００)J.Virol.７４：４２−４８）、Ａｄ３７
はＣＨＯ細胞でタンパク質受容体に結合することが示唆された。チャングＣ細胞
へのＡｄ３７結合のスキャッチャード分析は、各細胞が約２４０００のファイバ
ー結合部位を発現することを示した（Huangら(１９９９)J.Virol.７３：２７９
８−２８０２）。ヒト結膜細胞におけるＡｄ３７結合部位もまた一タンパク質で
あるか否かを測定するため、125Ｉ標識Ａｄ３７の結合を測定する前にチャング
Ｃ細胞を異なるプロテアーゼで処理した。4種の全プロテアーゼによる表面タン
パク質の消化により、５０％を越える率でチャングＣ細胞へのＡｄ３７結合が阻
害された。この発見は、Ａｄ３７もまたチャングＣ細胞におけるタンパク質受容
体に結合することを示していた。
【０３０２】 ウイルスオーバーレイタンパク質ブロット検定法（ＶＯＰＢＡ）を用いて、候
補ウイルスタンパク質受容体を同定した。このウエスタン・ブロット技術は、抗
体の代わりに無傷のウイルス粒子を使用することにより、ウイルス‐受容体相互
作用をプローブするものであった。ここではＶＯＰＢＡを用いて、Ａｄ３７に結
合するチャングＣ膜タンパク質を同定した。Ａｄ３７粒子の不存在下では、タン
パク質バンドは全く観察されず、カルシウムの不存在下でウイルスを加えると、
単一４５ｋＤａタンパク質への結合が示された。１ミリモルの塩化カルシウムの
存在下では、Ａｄ３７は、約４５、５０および６０ｋＤａの分子量を有する３種
のタンパク質と反応した。同じ３種のタンパク質が単独の組換えＡｄ３７ファイ
バーノブを用いて検出されたことから、Ａｄ３７‐受容体相互作用はファイバー
伝達され、他のキャプシドタンパク質、例えばペントン基部の相互作用を伴わな
いことが示された。カルシウム非依存的タンパク質（４５ｋＤａ）のサイズは、
ＣＡＲの既知分子量と非常に類似している。Ａｄ３７ ＶＯＰＢＡの直接比較お
よびＣＡＲウエスタン・ブロットは、４５ｋＤａ受容体がＳＤＳ−ＰＡＧＥでＣ
ＡＲと共に移動することを示した。さらに、サブグループＤアデノウイルスに属
する他の２種の構成員Ａｄ９およびＡＤ１５は、ＣＡＲに結合することが示され
た（Roelvinkら(１９９８)J.Virol.７２：７９０９−７９１５）。
【０３０３】 ＣＡＲが、無傷のチャングＣ細胞におけるＡｄ３７結合を伝達するとは思われ
ないため、５０または６０ｋＤａのタンパク質がこの機能に役立つという可能性
を、チャングＣ細胞には結合しないアデノウイルス血清型を調べることにより試
験した。Ａｄ１９、すなわち密接に関連したサブグループＤアデノウイルスは、
チャングＣ細胞とはあまり結合せず（Huangら（１９９９）J.Virol.７３：２７
９８−２８０２）、従って、Ａｄ３７受容体のＡｄ１９ｐ認識はあまり考えられ
ない。Ａｄ１９ｐ粒子は、ＶＯＰＢＡにおいて４５および６０ｋＤａ受容体に結
合したが、５０ｋＤａ受容体には結合しなかった。さらに、５０ｋＤａ受容体は
チャングＣ細胞で発現されるが、Ａ５４９細胞では発現されず、これらはＡｄ３
７結合および感染を低レベルで助けるに過ぎない。まとめて考え合わせると、こ
れらのデータは、５０ｋＤａタンパク質が、ヒト結膜細胞でのＡｄ３７に関する
一次候補受容体であることを示している。
【０３０４】 検討 主要アデノウイルス受容体としてＣＡＲタンパク質が確認されても、ある種の
サブグループＤ構成員、例えばＡｄ３７が優先的に眼の細胞に感染する理由を説
明しているわけではない。５０ｋＤａヒト結膜細胞膜タンパク質は、Ａｄ３７に
関する受容体の一次候補としてここでは同定されている。この５０ｋＤａタンパ
ク質は、Ａ５４９肺上皮細胞には存在しない。この受容体へのＡｄ３７結合はカ
ルシウム依存的であり、これはＡｄ３７結合性および感染性実験と一致する。Ａ
ｄ３７はまた、ヒト結膜および肺上皮細胞に存在する６０ｋＤａタンパク質に結
合した。しかしながら、それが血清型特異的であるとは思われない。Ａｄ５に関
する受容体、およびαｖβ３およびαｖβ５インテグリン類、ペントン基部に関
する受容体として提案された、ＭＨＣクラスＩ重鎖の分子量は、この試験で特性
確認された５０または６０ｋＤａ受容体とは区別される。
【０３０５】 ＶＯＰＢＡを用いるＡｄ３７−受容体相互作用の試験は、サブグループＤアデ
ノウイルスがＣＡＲの細胞外ドメインに結合し得ることを示す以前の試験と一致
している（Roelvinkら(１９９８)J.Virol.７２：７９０９−７９１５）。ノブ−
ＣＡＲ相互作用に関する生化学および構造試験は、ＣＡＲ結合部位がファイバー
ノブのＡＢ−ループに位置することを示している。Ａｄ３７および他のアデノウ
イルスのファイバー配列のアラインメントは、Ａｄ３７のＡＢ−ループがＡｄ１
２およびＡｄ５の場合と類似していることを表す。さらに、アデノウイルスノブ
の系統樹（Roelvinkら(１９９８)J.Virol.７２：７９０９−７９１５）は、サブ
グループＤのファイバータンパク質が、ＣＡＲをそれらの一次受容体として使用
するサブグループＣおよびＥの場合と類似していることを示す。しかしながら、
チャングＣ結膜細胞およびＡ５４９肺上皮細胞に関するウイルス結合性および感
染性試験により立証されたところによると、Ａｄ３７は、一次受容体としてＣＡ
Ｒを有効に使用するとは思われない。
【０３０６】 Ａｄ３７はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびヒト肺癌(Ａ５
４９)細胞における受容体としてシアル酸を使用することが報告されている（Arn
bergら(２０００)J.Virol.７４：４２−４８）。ヒト結膜細胞は試験されなかっ
た。ヒト角膜上皮（ＨＣＥ）細胞は、試験された唯一の眼セルラインであり、Ａ
ｄ３７は、Ａ５４９細胞での結合性と比べて、これらの細胞には比較的弱く結合
する（Arnbergら(２０００)J.Virol.７４：４２−４８）。さらに、シアル酸陽
性ＣＨＯ細胞におけるシアル酸へのＡｄ３７結合を顕著に阻害するのには一細胞
当たり８.４×１０７の小麦胚芽凝集素分子が必要とされ（Arnbergら(２０００)
J.Virol.７４：４２−４８）、チャングＣ結膜細胞におけるＡｄ３７受容体の数
に対し１０００倍（三桁）高かった（Huangら（１９９９）J.Virol.７３：２７
９８−２８０２）。明らかに、シアル酸は細胞表面へのＡｄ３７結合に関与する
唯一の因子ではなく、Ａｄ３７屈性に対するその影響は不確かである。
【０３０７】 ここでの結果は、Ａｄ３７が、結膜細胞への結合について５０ｋＤａ細胞受容
体を選択することを示しているが、シアル酸はまたこの相互作用においても一つ
の役割を演じることが可能である。Ａｄ３７受容体の特性確認および同定は、治
療上の潜在的重要性を有し、またＡｄ３７の異なる屈性を説明してもいる。Ａｄ
３７に関する５０ｋＤａ受容体はまた、ＥＫＣの深刻な症例を誘発する他のサブ
グループＤアデノウイルス、Ａｄ１９ａおよびＡｄ８に関する受容体でもあり得
る。Ａｄ１９ｐは、Ａｄ１９の非病原性変異体であり（Arnbergら(１９９８)Vir
ology２２７：２３９−２４４）、Ａｄ１９Ａは、Ａｄ８およびＡｄ３７と共に
、ＥＫＣの主病因である。Ａｄ１９ａおよびＡｄ３７は、同一のファイバータン
パク質を有し（Arnbergら(１９９８)Virology２２７：２３９−２４４）、イン
ビボで似た屈性を有する。Ａｄ８、Ａｄ１９およびＡｄ３７は、重症度の低い結
膜炎形態に関連した４種の他の血清型よりも有効にイヌおよびモルモット赤血球
を凝集させることから（Arnbergら(１９９８)Virology２２７：２３９−２４４
）、Ａｄ１８、Ａｄ１９およびＡｄ３７の受容体は似た特性を有することが示唆
されている。このため、この５０ｋＤａ受容体は、アデノウイルスにより誘発さ
れるＥＫＣに対する魅力的な薬剤標的であるため、これらのウイルスに関連した
眼科疾患の治療的介入をもたらす。
【０３０８】 実施例１０ 光受容体細胞へのＡｄ５ベクターのターゲッティング ファイバー欠失アデノウイルスベクターＡｄ５.ＧＦＰ.ΔＦを、修飾Ａｄ３７
ファイバータンパク質を発現する７０５細胞で増殖させた。ウイルス粒子（Ａｄ
５.ＧＦＰ.Δｆ／３７Ｆ）を採取し、ＣｓＣｌ精製し、０.９％ＮａＣｌ、１０
ミリモルのトリス、ｐＨ８.１および１０％グリセリン中へ透析した。約１×１
０９粒子／μｌを含む生成した溶液２〜３μｌを、マウス眼の硝子体腔へ注射し
た。感染の７日後、目を摘出し、パラホルムアルデヒドにより固定し、低温切断
した。切片を抗ロドプシン抗体で染色することにより、光受容体細胞を同定し、
同じくＤＡＰＩにより細胞核を示した。得られた切片は、光受容体では赤色の抗
ロドプシン染色、青色のＤＡＰＩ染色核、および形質導入細胞では緑色のＧＦＰ
染色を示した。結果は、実質的に独占的な光受容体の形質導入を表した。ロドプ
シン染色およびＧＦＰ発現の同時局在性は、光受容体細胞の選択的形質導入を示
していた。
【０３０９】 対照として、反対側の眼に同じＡｄ３７ファイバー発現性細胞で成長させたフ
ァイバー欠失ベクターＡｄ５.βｇａｌ.ΔＦのストックを注射した。このウイル
ス（Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ／３７Ｆ）はＧＦＰよりβｇａｌを製造するため、緑
色染色は光受容体には存在しない。
【０３１０】 光受容体細胞へターゲッティングするためのＡＤ３７ファイバーを用いる追加
実験が行われた。網膜下および硝子体内注射がマウスモデルにおいて使用され、
結果は、光受容体へのターゲッティングを立証していた。硝子体内注射された眼
の場合と同様、網膜下投与により感染した主細胞型は光受容体であった。
【０３１１】 上記で示した通り、Ａｄ５.βｇａｌ.ΔＦ／３７ＦはチャングＣ細胞には有効
に感染したが、Ａ５４９細胞については不充分であった。Ａｄ３７ファイバータ
ンパク質は、ＣＡＲ発現性ヒト肺上皮細胞ではなく、ヒト結膜細胞に優先的感染
性を付与する。結膜細胞への結合は二価カチオンを必要とする。
【０３１２】 当業界の熟練者にとって修飾は明らかに理解できることであるため、この発明
は添付の請求の範囲によってのみ限定されるものとする。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ダニエル・ジェイ・ボン・セガーン アメリカ合衆国92122カリフォルニア州サ ンディエゴ、ルイージ・テラス5175番、ア パートメント30 (72)発明者 マーティ・フリードランダー アメリカ合衆国92014カリフォルニア州デ ル・マー、ザポ・ストリート1720番 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 CA04 DA02 DA03 EA01 FA02 GA14 HA17 4C084 AA13 NA14 ZA331 ZA332 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA14 ZA33

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アデノウイルス逆方向末端反復塩基配列、それに機能し得る
    ように結合されたアデノウイルスパッケージングシグナル、および光受容体特異
    的プロモーターを含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 さらにプロモーターに機能し得るように結合された治療的産
    物をコード化する核酸を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
  3. 【請求項３】 プロモーターがロドプシンプロモーターである、請求項１記
    載の単離核酸分子。
  4. 【請求項４】 アデノウイルスゲノムがファイバータンパク質をコード化し
    ないことにより、核酸をパッケージングするのにパッケージング細胞における相
    補作用が必要とされる、請求項１記載の核酸分子。
  5. 【請求項５】 請求項１−４のいずれか記載の核酸分子をパッケージングし
    た状態で含む、組換えアデノウイルスベクター。
  6. 【請求項６】 逆方向末端反復塩基配列（ＩＴＲ）およびパッケージングシ
    グナルが、アデノウイルス２型またはアデノウイルス５型から誘導される、請求
    項５記載の組換えアデノウイルスベクター。
  7. 【請求項７】 ウイルスがファイバータンパク質を含む、請求項５記載の組
    換えアデノウイルスベクター。
  8. 【請求項８】 ファイバータンパク質が哺乳類の目における光受容体に選択
    的に結合する、請求項７記載の組換えアデノウイルスベクター。
  9. 【請求項９】 ファイバーが、アデノウイルス２型または５型からのＮ−末
    端配列、および哺乳類の目における光受容体への選択的結合に充分なアデノウイ
    ルス血清型Ｄファイバーの一部分により構成されるキメラである、請求項７記載
    の組換えアデノウイルスベクター。
  10. 【請求項１０】 遺伝子産物をコード化するかまたは遺伝子産物の発現を誘
    発する異種ＤＮＡを含む組換えアデノウイルスを投与することを含む、哺乳類の
    目への遺伝子産物のターゲッティング化送達方法であって、組換えウイルスが、
    目の細胞で発現される受容体に特異的または選択的に結合するファイバータンパ
    ク質を含むものである方法。
  11. 【請求項１１】 細胞が光受容体である、請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 投与が眼内送達法により行われる、請求項１０記載の方法
    。
  13. 【請求項１３】 投与が、網膜下注射、静脈内投与、眼窩骨膜投与および硝
    子体内投与から選択される方法により行なわれる、請求項１０記載の方法。
  14. 【請求項１４】 組換えウイルスが、アデノウイルスＤ血清型からのファイ
    バータンパク質を含む、請求項１０記載の方法。
  15. 【請求項１５】 ファイバータンパク質がアデノウイルス３７型である、請
    求項１０−１４のいずれか１項記載の方法。
  16. 【請求項１６】 ファイバーが、アデノウイルス２型または５型ペントンと
    の相互作用にとって充分なアデノウイルス２型または５型ファイバータンパク質
    のＮ−末端の一部分、および哺乳類の目における光受容体への選択的結合にとっ
    て充分なファイバーのアデノウイルス血清型Ｄノブ部分の一部分を含むキメラタ
    ンパク質である、請求項１０−１４のいずれかに記載の方法。
  17. 【請求項１７】 組換えウイルスがアデノウイルスＤ型血清型である、請求
    項１０−１６のいずれかに記載の方法。
  18. 【請求項１８】 封入された核酸が、治療的産物を含む核酸に機能し得るよ
    うに結合された光受容体特異的プロモーターを含む、請求項１０−１７のいずれ
    かに記載の方法。
  19. 【請求項１９】 治療的産物が、トロフィック（栄養）因子、抗アポトーシ
    ス因子、ロドプシンタンパク質をコード化する遺伝子、野生型シュタルガルト病
    遺伝子（ＳＴＤＧ１）、抗癌剤および光受容体特異的遺伝子産物の発現を調節す
    るタンパク質から成る群から選択される、請求項１８記載の方法。
  20. 【請求項２０】 送達が、眼病の処置を目的として行われる、請求項１０−
    １９のいずれか１項記載の方法。
  21. 【請求項２１】 病気が網膜変性疾患である、請求項２０記載の方法。
  22. 【請求項２２】 病気が、色素性網膜炎、シュタルガルト病、糖尿病性網膜
    症、網膜血管新生または網膜芽細胞腫である、請求項２０記載の方法。
  23. 【請求項２３】 哺乳類がヒトである、請求項１０−２２のいずれかに記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 ウイルス核酸が、アデノウイルス逆方向末端反復（ＩＴＲ
    ）配列、およびそこに機能し得るように結合したアデノウイルスパッケージング
    シグナルを含む、請求項１０−２２のいずれかに記載の方法。
  25. 【請求項２５】 ＩＴＲおよびパッケージングシグナルが、アデノウイルス
    血清型ＢまたはＣから誘導される、請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 ＩＴＲおよびパッケージングシグナルが、アデノウイルス
    ２または５型から誘導される、請求項２４記載の方法。
  27. 【請求項２７】 ウイルス核酸がさらに光受容体特異的プロモーターを含む
    、請求項２４記載の方法。
  28. 【請求項２８】 アデノウイルス３７型ファイバータンパク質またはその一
    部分を含む組換えウイルスベクターを投与し、それによってベクターが光受容体
    を選択的に形質導入し、組換えウイルスベクターによりコード化される遺伝子産
    物を送達することを含むターゲッティング化遺伝子治療方法であって、上記一部
    分が光受容体への選択的結合にとって充分なものである方法。
  29. 【請求項２９】 ベクターが目に投与される、請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 ベクターが目の硝子体腔へ投与される、請求項２８記載の
    方法。
  31. 【請求項３１】 投与が、網膜下注射、静脈内投与、眼窩骨膜投与または硝
    子体内投与により行なわれる、請求項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 少なくとも約１０７プラーク形成単位のウイルスが投与さ
    れる、請求項１０−３１のいずれかに記載の方法。
  33. 【請求項３３】 約１プラーク形成単位〜約１０１４プラーク形成単位のウ
    イルスが投与される、請求項１０−３１のいずれかに記載の方法。
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