JP2002507391A5 - - Google Patents

Description

【書類名】 明細書
【発明の名称】 ファイバーノブのＨＩループに異種ペプチドエピトープを含有するアデノウイルスベクター
【特許請求の範囲】
【請求項１】 ファイバーノブのＨＩループドメインにおいて修飾されたファイバー遺伝子を含むことを特徴とする組換えアデノウイルス。
【請求項２】 ＣＡＲ−非依存性遺伝子導入を達成できることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】 前記ファイバーノブに対する付加的な修飾をさらに含み、それにより、該アデノウイルスの天然の屈性が除去されていることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】 前記修飾されたファイバーノブが、トリマー化する能力を保持しており、さらに、その天然の生合成プロフィールを保持することを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５】 前記ファイバー遺伝子が、前記ファイバーノブのＨＩループドメインにリガンドを導入することによって修飾されていることを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】 前記リガンドが、生理学的リガンド、抗−受容体抗体および細胞特異的ペプチドよりなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】 前記リガンドが、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項５記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】 前記リガンドが、配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣを有するペプチドを含むことを特徴とする請求項７記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】 前記アデノウイルスをコードするアデノウイルスベクターが、治療遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１０】 前記治療遺伝子が、単純疱疹ウイルス−チミジンキナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項９記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】 腫瘍細胞を殺すための組成物であって、請求項１０記載の組換えアデノウイルスを含有し、該組成物を個体に投与した後、該個体にガンシクロビールが投与されることを特徴とする組成物。
【請求項１２】 全身投与されることを特徴とする請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】 請求項９記載の組換えアデノウイルスを含有することを特徴とする遺伝子治療のための組成物。
【請求項１４】 全身投与されることを特徴とする請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】 癌、嚢胞性線維症およびデュシェーヌ筋ジストロフィーよりなる群から選択される病気に罹っている個体に投与されることを特徴とする請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】 アデノウイルスのファイバーノブのＨＩループドメインにおいてファイバー遺伝子を修飾する工程を含むことを特徴とする、細胞に形質導入するアデノウイルスの能力を高める方法。
【請求項１７】 前記ファイバー遺伝子が、前記ファイバーノブのＨＩループドメインにリガンドを導入することによって修飾されることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】 前記リガンドが、生理学的リガンド、抗−受容体抗体および細胞特異的ペプチドよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】 前記リガンドが、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有するポリペプチドを含むことを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項２０】 前記リガンドが、配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣを有するペプチドを含むことを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】 前記細胞が腫瘍細胞であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項２２】 前記腫瘍細胞が、イン・ビトロ、イン・ビボおよびイクス・ビボよりなる群から選択されることを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】 前記アデノウイルスをコードするアデノウイルスベクターが、治療遺伝子をさらに含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
関連出願の説明
本出願は現在放棄されている１９９８年２月６日に出願された米国仮特許出願第６０／０７３，９４７号および現在放棄されている１９９８年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６０／０９９，８０１号の特恵を主張する。
【０００２】
連邦基金の説明
本出願は、部分的には、補助金ＲＯ１−ＨＬ５０２５５、ＲＯ１−ＣＡ６８２４５、ＲＯ１−ＣＡ７４２４２、Ｒ２１−ＣＡ６９３４３、Ｔ３２−ＣＡ７５９３０およびＤＡＭＤ１７−９４−Ｊ４３９８の下で国立衛生研究所からの基金を用いて創作された。連邦政府は、従って、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般に、ウイルス学および遺伝子治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は内因性屈性の同時排除のさらなる利点を伴う細胞特異的標的化を目的とした修飾されたファイバーでの組換えアデノウイルスベクターの産生に関する。
【０００４】
関連技術の説明
組換えアデノウイルスベクターは多数の遺伝子治療用途（２１、３５、３８）で使用される。この事実は、主として、イン・ビトロ、イン・ビボ双方においてこのベクターアプローチで達成できる高レベルの遺伝子導入に由来した。組換えアデノウイルスベクターは、種々の器官の環境において分化した標的細胞へのイン・サイチュ遺伝子送達を達成するそのユニークな能力によって他の利用可能な系から区別される（５、６、９、１０、１２、２０、２５、２７、２９、３１）。
【０００５】
遺伝子治療のための組換えアデノウイルスの使用に対する１つの不利な点は、高レベルの遺伝子導入を達成するためにコクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）の存在に対してウイルスが頼っていることに関する。ある状況においては、この結果、真の標的細胞がもしＣＡＲにおいて低いならば貧弱にしか形質導入されないが、非標的のしかし高いＣＡＲ−発現性細胞による組換えビリオンの隔離となり得る。この隔離を補うには、投与されるベクターの用量のかなりの上昇が必要であり、ベクターに対する直接的な毒性および免疫応答を共に誘導する危険性を増大させ、さらに治療の総じての効果をだめにする。従って、遺伝子治療のためのアデノウイルスの現在の創製の利用性は、ウイルスによる特異的細胞タイプの標的化形質導入を達成することによってかなり改良され得る。
【０００６】
この特性にもかかわらず、アデノウイルス生物学の特別な態様はかかるベクターの能力の十分な実現を妨げてきた。この点に関し、多様な組織の細胞についての親ウイルスの広い屈性プロフィールは潜在的に制限されない遺伝子送達を可能とする。かくして、標的化細胞特異的遺伝子送達を必要とする多くの遺伝子治療用途では、アデノウイルスベクターの無差別な屈性は混同する因子を表す。この概念に基づき、アデノウイルスの天然屈性を修飾する戦略が、標的化遺伝子送達をできるベクターの誘導を可能とするために開発されてきた。
【０００７】
この目的を達成するための戦略は、アデノウイルス感染経路において特定の過程を修飾することに向けられる。血清型２および５のアデノウイルスは、通常、ファイバー蛋白質のカルボキシ末端ノブドメインおよび一次受容体（４、１７、３６）の間の相互作用によって初期認識および標的細胞への結合を達成する。結合後ペントンベース中のＲＧＤモチーフはαｖβ３およびαｖβ５タイプの細胞インテグリンと相互作用する（１−３、３７、３９、４０）。この相互作用は細胞の内部化を誘発し、それにより、ビリオンはエンドソーム内の局所化を達成する。エンドソームの酸性化はキャプシド蛋白質において立体配座の変化を誘導し、小胞破壊および粒子の逃避を達成するようなエンドソーム膜とのその相互作用を可能とする。
【０００８】
エンドソーモリシスに続き、ビリオンは核に移動し、そこでウイルス生活環の引き続いての工程が起こる。ウイルス感染経路におけるキャプシド蛋白質によって演じられる鍵となる役割のこの理解は、これらの蛋白質の修飾を介してこのプロセスを変更する戦略を示唆した。
【０００９】
この点に関し、外皮蛋白質をコードするウイルス遺伝子の修飾を介するアデノウイルスベクターの遺伝的再標的化は、もし成功すれば、これらの遺伝子送達ビヒクルの本世代において重要な改良を達成する簡単な方法を提供する。この目的で、いくつかのグループが、アデノウイルスファイバー蛋白質のノブドメインに対する遺伝的修飾およびかかるキメラファイバーのビリオンへの取込みを報告している。例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎらおよびその他の者は、各々、Ａｄ５ファイバーのテイルおよびシャフトドメインおよびＡｄ３のノブドメインよりなるファイバーを含有するＡｄ５ビリオンの成功した創製を報告している。加えて、Ｍｉｃｈａｅｌらは組換えＡｄ５ファイバーのカルボキシ末端へのガストリン放出ペプチドの組込みを示した。この知見は、かかるファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターの救済を達成したＬｅｇｒａｎｄらによって拡大された。Ｗｉｃｋｈａｍらはカルボキシ末端ポリリシン配列を含むファイバーを含有する組換えウイルスの創製を記載した。これらの研究はこの遺伝的アプローチに関して鍵となる可能性の論点を確立したが、多数の限定的要素も示した。
【００１０】
アデノウイルスファイバーのこれらの修飾の全ては蛋白質のカルボキシ末端に向けられた。加えて、これらの努力はファイバーノブの三次元（３Ｄ）構造の先行知識なくして開始された。かくして、該ファイバーのカルボキシ末端の使用は全ての関連する考慮を十分には取り込んでいない選択を表した。明らかに、３Ｄ構造の情報は、標的化目的のノブ内の異種蛋白質配列の置換に対して重要な関係を有する。標的化リガンドのかかる局所化は、その表面提示を可能とし、ファイバーの四次構造を最小限にしか混乱させないように理想的に達成されるであろう。
【００１１】
アデノウイルス感染ＣＡＲ−非依存性によって課される制限を克服するには、アデノウイルスファイバー蛋白質のカルボキシ末端への受容体結合特異性を保有する小ペプチドモチーフの取込みが提案され、かくして、新規な細胞表面受容体を介してウイルスが付着し感染することを可能とした。この考えは、ファイバー分子のカルボキシ末端に位置する標的化リガンドを持つファイバーを含有するいくつかの組換えアデノウイルスを創製することによってこのアプローチの可能性を証明したＷｉｃｋｈａｍによって開発された。
【００１２】
いくつかの場合においては、アデノウイルスファイバーのカルボキシ末端の遺伝的修飾はベクターの再標的化に関するその利用性を証明したが、いくつかの他の場合においてそれは失敗し、これは、ファイバー分子におけるこの場所が標的化蛋白質部位の取込み用最適部位ではないことを示唆する。公表された知見は、ファイバー分子のカルボキシ末端への異種蛋白質配列の２５−３０を超えるアミノ酸残基の付加がファイバートリマーの安定性に対して劇的な負の効果を有し、従って、ファイバー機能に適合しないことを強く示唆する。加えて、ファイバーノブの三次元構造は、ファイバーのカルボキシ末端がビリオンに向けられ、すなわち、細胞表面から離れ、それにより、標的化リガンドの取込みのための最適下環境を提供することを示す。
【００１３】
先行技術は、再標的化の目的でのアデノウイルスのファイバーノブ蛋白質への異種蛋白質配列の取込みの効果的な手段の欠如において欠陥がある。本発明は、当該分野におけるこの長い間存在した要望および望みを満たすものである。
【００１４】
（発明の概要）
遺伝子治療用途のための組換えアデノウイルスベクターの本創製の利用性は、潜在的には、イン・ビボでの選択された細胞型への遺伝子送達が可能な標的化ベクターを設計することによって改良し得る。かかる標的化を達成するには、アデノウイルスファイバー蛋白質にリガンドを取り込むことができ、これは、その細胞表面受容体へのアデノウイルスの主要な結合を媒介する。ファイバーの細胞結合ドメインの提案されている構造に基づき、ファイバーノブのＨＩループは異種リガンドの取込みのための場所として利用することができる。本明細書で記載したごとく、バクロウイルス感染昆虫細胞で発現されたファイバー蛋白質を利用して、ファイバートリマー化を除去せず、ＨＩループへのＦＬＡＧオクタペプチドの取込みがノブに位置した細胞結合部位の形成を乱さないことを示した。次いで、この修飾されたファイバーを含有する組換えアデノウイルスを創製させ、ノブ中に作成された短いペプチド配列はファイバーの生物学的機能に適合した。加えて、リガンド特異的抗体を用いることによって、ノブに取り込まれたペプチドは、修飾されたファイバーを含有する成熟ビリオンの働きにおいて結合するのに依然として利用できる。これらの知見は、異種リガンドがファイバーノブのＨＩループに取り込むことができ、この位置がアデノウイルス再標的化戦略におけるその使用と合致する目的を有することを示唆する。
【００１５】
組換えアデノウイルスベクター（ＡＤ）の利用性は、かろうじてのレベルのアデノウイルスファイバー受容体ＣＡＲを発現する細胞へのアデノウイルス媒介遺伝子導入の低い効率のため制限されている。臨床的に重要な意味でアデノウイルスベクターによるＣＡＲ−非依存性遺伝子導入を達成するためにウイルスファイバー蛋白質に対する遺伝的改変を介するウイルス屈性の修飾がここに提案される。ファイバーノブドメインのＨＩループ中へのＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）含有ペプチドの取込みの結果、細胞侵入プロセスの間に別の受容体を利用するウイルスの能力が得られることがここに示される。また、その拡大された組織屈性のため、この新規なベクターは、主要な腫瘍細胞の効果的な導入が可能であることも示す。卵巣癌細胞への２ないし３桁の大きさの増大した遺伝子導入がベクターによって示される、これは、ＲＧＤペプチドが取り込まれたファイバーを含有する組換えアデノウイルスが主要なＡｄ５受容体の欠陥によって特徴付けられる新生物の治療用で大いに有用であり得ることを示唆する。
【００１６】
本発明の実施の形態において、組換えアデノウイルスが提供され、ここに該アデノウイルスがファイバーノブのＨＩループドメインで修飾されたファイバー遺伝子を含む。もう１つの実施の形態において、ファイバーノブのＨＩループドメインで修飾されたファイバー遺伝子および単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼをコードする遺伝子を含む有効量の組換えアデノウイルスを個体に投与し；次いで、該個体をガンシクロビールで該個体を治療する工程を含むことを特徴とするかかる治療を必要とする個体において腫瘍細胞を殺す方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらにもう１つの実施の形態において、ファイバーノブのＨＩループドメインで修飾されたファイバー遺伝子および治療遺伝子を含む有効量の組換えアデノウイルスを個体に投与する工程を含むことを特徴とするかかる治療を必要とする個体に遺伝子治療を供する方法が提供される。
【００１８】
本発明のなおさらにもう１つの実施の形態において、アデノウイルスのファイバーノブのＨＩループドメイン中のファイバー遺伝子を修飾する工程を含むことを特徴とする細胞を形質導入するアデノウイルスの能力を増加させる方法が提供される。
【００１９】
本発明の他のおよびさらなる態様、特徴および利点は、開示目的で与えられた本発明の現在の好ましい実施の形態の以下の記載から明らかである。
【００２０】
（図面の簡単な説明）
本発明の前記特徴、利点および目的ならびに明らかになるであろうその他のものが達成される事項が詳細に理解できるように、前記で概要が簡単に述べられた本発明のより具体的な記載が、添付の図面で説明されたそのある実施の形態を参照することによって持たれる。これらの図面は明細書の一部を形成する。しかしながら、本発明の好ましい実施の形態を添付の図面が説明し、従って、その範囲を限定するものと考えられるべきではないことに注意されたし。
【００２１】
図１は、Ａｄ５ファイバーノブの３Ｄモデルを示す。該トリマーは、それを上方から三要素対称軸によって眺めるとプロペラ様構造を形成する。ノブの外側に露出されたＨＩループは、細胞結合部位の形成に関与するβ−ストランドＨおよびＩを連結する。（許可により文献４７から転載）
図２はファイバーノブのＨＩループの修飾を示す。ＰＣＲ−ベースの突然変異誘発を使用して、ＨＩループの超可変領域をコードするファイバー遺伝子の一部を欠失した。欠失の代わりにユニークなＥｃｏＲＶ制限部位を取り込んで、異種蛋白質配列につきコードするＤＮＡのセグメントのクローニングを可能とした。ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質において、ＨＩループの欠失されたアミノ酸を回復し、ＦＬＡＧオクタペプチドをトレオニン−５４６およびプロリン−５４７の間に取り込んだ。欠失の部位は塗り潰した三角形によって示す。
【００２２】
図３はポリアクリルアミドゲル電気泳動による組換えファイバー蛋白質の分析を示す。昆虫細胞で発現されたファイバー蛋白質をゲル電気泳動によって分析してそのトリマー立体配置を確認した。トリマーをモノマーに解離させるため、それを７．５％ポリアクリルアミドゲルに負荷するに先立ってそれを試料緩衝液中で沸騰させることによって蛋白質を変性させた。クーマシーブルー染色によってバンドを可視化した。図３ＡはＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製した６−ヒスチジン−タッグドファイバー蛋白質を示す。レーン１、野生型ファイバー、沸騰；レーン２、野生型ファイバー、非沸騰；レーン３、ファイバー−ＦＬＡＧ、沸騰；レーン４、ファイバー−ＦＬＡＧ、非沸騰；レーンＭ、広い範囲の蛋白質標準。図３Ｂは抗−ＦＬＡＧ Ｍ２アフィニティーゲルでの免疫沈殿によって精製したファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質を示す。レーン１、非沸騰蛋白質；レーン２、沸騰蛋白質；レーンＭ、広い範囲の蛋白質標準。左側の数字はキロダルトンで表したマーカー蛋白質の分子量を示す。
【００２３】
図４は組換えファイバー蛋白質によるアデノウイルスの感染性の阻害を示す。ＨｅＬａ細胞を、室温にて１０分間、示した濃度で野生型（ｗｔ）ファイバー（図４Ａ）またはファイバー−ＦＬＡＧ（図４Ｂ）いずれかと共にプレインキュベートした。次いで、ＡｄＣＭＶＬｕｃ１０の感染の多重度で添加し、室温にてさらに３０分間インキュベーションを継続した。未結合ウイルスを吸引し、完全培地を添加し、細胞を３７℃に移した。３０時間後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性はブロッキングファイバー蛋白質の不存在下での活性のパーセンテージとして与える。各点は１つの実験で得られた４つの測定の平均を表す。
【００２４】
図５はＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの創製を示す。マスタープラスミドｐＴＧ３６０２を修飾してユニークなＳｗａＩ制限部位をファイバー遺伝子に取り込み、それにより、ファイバー修飾に適したプラスミドｐＶＫ５０を創製する。Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧのゲノムは、ファイバー−ＦＬＡＧ遺伝子を含有するＤＮＡ断片およびＳｗａＩ消化によって線状化された。プラスミドＰｖｋ５０の間のＥ．ｃｏｌｉにおける相同ＤＮＡ組換えによって創製した。ウイルスを救済するために、修飾されたファイバー遺伝子と共に完全なアデノウイルスゲノムを含有する得られたプラスミドｐＶＫ３００をＰａｃＩで切断し、次いで、それを用いて２９３細胞をトランスフェクトした。
【００２５】
図６、7はアデノウイルス結合アッセイを示す。試料当たり１０^５細胞を含有するＡ５４９細胞のアリコットを、野生型（ｗｔ）Ａｄ５ファイバーまたはファイバー−ＦＬＡＧいずれかの系列希釈と共に４℃で１時間インキュベートした。１２５Ｉで標識したＡｄ５ＣＭＶＬａｃＺ（図６）およびＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧ（図7）を試料に添加し、インキュベーションをさらに１時間継続した。０．１％ＢＳＡを含有する４ｍｌのＰＢＳで細胞を洗浄し、低速遠心によってペレット化した。試料の放射能をガンマカウンターで測定した。各点は１つの実験で得られた２つの実験の測定の平均を表す。
【００２６】
図8は無傷Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧビリオンの意味でＦＬＡＧペプチドの接近性を示す。ＣｓＣｌグラジエントで精製したＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧのビリオンを透析し、後記するごとき抗−ＦＬＡＧ Ｍ２−アフィニティーゲルで免疫沈殿させ、遊離ＦＬＡＧペプチドでゲルから溶出させた。未修飾ファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターＡｄ５ＣＭＶＬｕｃを結合についての陰性対照として用いた。精製手法を通じて収集された画分の全てのアリコットをＤＮａｓｅＩで処理して微量の細胞ＤＮＡを消化し、次いで、ＳＤＳ、ＥＤＴＡおよびプロテイナーゼＫで処理してビリオンからアデノウイルスＤＮＡを放出させた。得られた試料を０．８％アガロースゲルで分析し、臭化エチジウム染色によってＤＮＡを検出した。レーン１ないし３、各々、未結合物質、緩衝液洗液およびＦＬＡＧ−溶出物を含有する上澄み中のＡｄＣＭＶＬｕｃ；レーン４ないし６、各々、上澄み、緩衝液洗液およびＦＬＡＧ−溶出物中のＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧレーンＭ、ＤＮＡ分子量標準（３ないし１２ｋｂの範囲のマーカー断片に対応するバンドがゲル状に観察される）。
【００２７】
図９〜１２は２つのヒト卵巣細胞系（ＳＫＯＶ３．ｉｐｌおよびＯＶ−４）および２つの初代ヒト卵巣細胞系を感染させるためのノブのＨＩループ中の標的化エピトープＲＧＤを含有する遺伝的に修飾されたアデノウイルスの能力並びに組換えノブ蛋白質の存在による導入の阻害の結果を示す。各点は１つの実験で得られた４つの測定の平均を表す。誤差棒は標準偏差を示す。
【００２８】
図１３は組換えファイバー蛋白質およびαｖβ３インテグリンの間の相互作用の分析を示す。ＥＬＩＳＡプレートに吸収されたバクロウイルス発現ファイバー蛋白質を種々の濃度の精製インテグリンαｖβ３とともにインキュベートした。次いで、ファイバー蛋白質に結合したインテグリンを抗−α−サブユニットモノクローナル抗体ＶＮＲ１３９で検出した。各点は１つの実験で得られた３つの読みの平均を表す。いくつかのＳＤは記号よりも小さい。
【００２９】
図１4は固定化Ａｄ５ＣＭＶｌｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤビリオンに結合するαｖβ３インテグリンのＥＬＩＳＡアッセイを示す。ＥＬＩＳＡプレートのウェル中に固定化されたＡｄ５ＣＭＶｌｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤのＣｓＣｌ精製ビリオンをアフィニティー精製したαｖβ３インテグリンと共にインキュベートし、続いてモノクローナル抗体ＶＮＲ１３９と共にインキュベーションした。示されたデータは三連で行った実験からの平均±ＳＤである。
【００３０】
図１５〜２０は２９３、ＨＵＶＥＣおよびＲＤ細胞におけるＣＡＲおよびインテグリン発現のフローサイトメトリー分析を示す。細胞を抗−ＣＡＲ（ＲｍｃＢ）、抗−αｖβ３（ＬＭ６０９）または抗−αｖβ５（Ｐ１Ｆ６）インテグリンモノクローナル抗体と共にインキュベートし、ＳＭで洗浄して未結合モノクローナルを除去し、二次ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ血清と共にインキュベートした。ＦＩＴＳ−標識抗体の除去後、１０^４細胞のアリコットをフローサイトメトリーによって分析した。２９３（１５）、ＨＵＶＥＣ（１７）およびＲＤ（１９）細胞におけるＣＡＲ発現。２９３（１６）、ＨＵＶＥＣ（１８）およびＲＤ（２０）細胞におけるαｖβ３（細い線）およびαｖβ５（太い線）インテグリンの発現。点線は陰性対照を示す。
【００３１】
図２１は種々のヒト細胞系へのアデノウイルス−媒介遺伝子導入を示す。次いで、１００μｇ／ｍｌにて組換えＡｄ５ファイバーノブを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭ／Ｆ１２いずれか中で室温にて１０分間プレインキュベートした２９３（２１Ａ、ＨＵＶＥＣ（２１Ｂ）またはＲＤ（２１Ｃ）細胞を室温で３０分間、１、１０または１００ｐｆｕ／細胞のＤＭＥＭ／Ｆ１２中のＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤに暴露した。未結合ウイルスを吸引し、完全な媒体を添加した。３７℃における３０時間のインキュベーションの後、細胞を溶解し、相対的光単位（ＲＬＵ）でのルシフェラーゼ活性を測定した。モック感染細胞で検出されたバックグラウンドルシフェラーゼ活性は、各々、２９３、ＨＵＶＥＣおよびＲＤ細胞につき２６１、２２３および１６３であった。対応する細胞系で得られた全ての読みからこれらの活性を差し引いた。各点は３つの測定の平均±ＳＤを表す。
【００３２】
図２２は¹²⁵Ｉ−標識アデノウイルスの２９３、ＨＵＶＥＣまたはＲＤ細胞への結合の比較を示す。ＤＭＥＭ−ＡＤ媒体（ＤＭＥＭ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．５％ＢＳＡ）中の細胞の１００μｌアリコット、アリコット当たり１０^６細胞、を５０μｌの¹²⁵Ｉ−標識アデノウイルス（試料あたり１０^５ｃｐｍ）と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、０．１％ＢＳＡを含有する４ｍｌのＰＢＳで試料を希釈し、遠心によって細胞をペレット化した。細胞ペレットの放射能をガンマカウンターで測定した。示されたデータは三連で行った実験からの平均±ＳＤである。
【００３３】
図２３は標識されたＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの２９３およびＨＵＶＥＣ細胞への結合の阻害を示す。２９３（２３Ａ）またはＨＵＶＥＣ（２３Ｂ）細胞を、Ａｄ５ファイバーノブ（１００μｇ／ｍｌ）、Ａｄ２ペントンベース（１００μｇ／ｍｌ）またはその組合せを含有するＤＭＥＭ−ＡｄまたはＤＭＥＭ−Ａｄと共に４℃で１時間インキュベートした。次いで、１２５Ｉ−標識ウイルスの５０μｌアリコットを試料に添加した。該手法の残りは図２２の脚注に記載した通りである。
【００３４】
図２４〜２７はヒト卵巣癌細胞のフローサイトメトリー分析を示す。ＳＫＯＶ３．ｉｐ１またはＯＶ−４細胞におけるＣＡＲαｖβ３およびαｖβ５インテグリンの発現を、図１１の脚注に実質的に記載したごとくフローサイトメトリーによって分析した。ＳＫＯＶ３．ｉｐ１．図２４、およびＯＶ−４細胞、図２６、図２５および図２７におけるＣＡＲ発現は、各々、ＳＫＯＶ３．ｉｐ１およびＯＶ−４細胞における発現αｖβ３（細い線）およびαｖβ５（太い線）インテグリンを示す。陰性対照は点線によって示される。
【００３５】
図２８はＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤによって媒介された培養卵巣癌細胞に対する遺伝子導入効率の比較を示す。２９３、ＨＵＶＥＣおよびＲＤ細胞につき実質的に記載されたごとく１または１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度にて、ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３．ｉｐ１（２８Ａ）およびＯＶ−４（２８Ｂ）をＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで形質導入した。ウイルスでの感染に先立ち、組換えＡｄ５ファイバーノブ蛋白質を細胞に添加した。各データポイントは１つの実験で得られた３つの独立した測定の平均を表す。
【００３６】
図２９は卵巣癌患者から得られた腹水から単離した初代細胞を示す。二人（図２９Ａおよび図２９Ｂ）の卵巣癌患者の腹水から単離した細胞を、ブロッキングＡｄ５ファイバーノブ蛋白質の存在または不存在において、１または１０の感染多重度で、ＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで形質導入した。データ点は３つの独立した測定の平均を表す。
【００３７】
図３０〜３２はヒト卵巣癌細胞系へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す。ＳＫＯＶ３．ｉｐ１（図３０）、ＣａＯＶ−３（図３１）およびＵＣＩ−１０１（図３２）細胞を、各々、正常培地（灰色ボックス）および（ハッチングを付けたボックス）中での、または組換えＡｄ５ファイバーノブ（黒色ボックス）および（斜めのハッチングを付したボックス）を含有する培地中でのプレインキュベーション後に、１または１０ｐｆｕ／細胞にてＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで感染させた。３７℃での３０時間のインキュベーション後、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を測定した。蛋白質濃度について正規化したデータを示す。また、モック感染細胞におけるバックグラウンドルシフェラーゼ活性も提示される（塗り潰していないボックス）。各点は３つの測定の平均±標準偏差を表す。
【００３８】
図３３、３４は卵巣癌患者からのヒト腹水細胞へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す。腹水から得られた初代細胞を、各々、正常培地（灰色ボックス）および（ハッチングを付したボックス）中での、または組換えＡｄ５ファイバーノブ（黒色ボックス）および（斜めにハッチングを付したボックス）を含有する培地中でのプレインキュベーション後に、１または１０ｐｆｕ／細胞にてＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで感染させた。３７℃での３０時間のインキュベーション後に、細胞を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を測定した。蛋白質濃度につき正規化したデータを示す。また、モック感染細胞におけるバックグラウンドルシフェラーゼ活性も提示する（塗り潰していないボックス）。各点は３つの測定の平均±標準偏差を表す。２つの代表的な試料からのデータ、（図３３）および（図３４）を示す。
【００３９】
図３５は初代卵巣腫瘍外植体へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す。卵巣癌患者から直接的に得られた腫瘍外植体を、各々、ＡｄＣＭＶＬｕｃ（灰色ボックス）および（黒色ボックス）、またはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ（ハッチングを付したボックス）および（斜めにハッチングを付したボックス）で３×１０^５または３×１０^６ｐｆｕの用量で感染させた。３７℃での３０時間のインキュベーション後、組織を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を測定した。蛋白質濃度につき正規化したデータを示す。また、モック−感染腫瘍外植体におけるバックグラウンドルシフェラーゼ活性も示す（塗り潰していないボックス）。各点は同一患者からの３つの外植体における測定の平均±標準偏差を表す。３人の代表的な患者からのデータを示す。
【００４０】
図３６は腹腔中皮−対−卵巣腫瘍における遺伝子導入のレベルの異なる増加を示す。良性状態で手術した患者から採取した中皮片をファイバーノブと共にインキュベートし、３×１０^５または３×１０^６ｐｆｕの用量にてＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで感染させた。３７℃での３０時間のインキュベーション後、組織を溶解させ、ルシフェラーゼ活性を測定した。腫瘍外植体における同様の感染の結果が提示される。蛋白質濃度につき正規化されたデータを示す。各点は同一患者からの３つの中皮外植体における測定の平均±標準偏差を表す。４つの代表的な患者からのデータを示す。
【００４１】
図３７は、ルシフェラーゼ発現複製−欠陥アデノウイルスベクターＡｄＣＭＶＬｕｃを介するヒト細胞系への遺伝子導入を示す。ヒトＳＣＣＨＮ細胞系ＦａＤｕ、ＳＣＣ−４およびＳＣＣ−２５、および陽性対照頸部癌腫細胞系ＨｅＬａを細胞当たり１０ベクター粒子の感染多重度で感染させ、４８時間後にルシフェラーゼ遺伝子の産物につき分析した。また、ブロッキング実験を組換えファイバーノブ（Ｋ）で行った。結果は平均±ＳＥＭを表し、全細胞蛋白質１ミリグラム当たりのルシフェラーゼの相対的光単位（ＲＬＵ）を表す。
【００４２】
図３８はヒトＳＣＣＨＮ腫瘍細胞系へのＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤでの遺伝子導入の相対的効率の比較を示す。Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤは特異的インテグリンへの標的化に対するファイバーのＨＩループにおけるＲＧＤモチーフを含有する。分析は図３７についてのごとく行った。結果は平均±ＳＥＭを表す。
【００４３】
図３９はＳＣＣＨＮ細胞系についてのＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの相対的遺伝子導入頻度の分析を示す。標的細胞の感染は細胞当たり２５０粒子の感染多重度におけるものであった。感染の４０時間後、細胞をルシフェラーゼｍＲＮＡについてのプローブでのイン・サイチュハイブリダイゼーションによるレポーター遺伝子の生成物につき分析した。
【００４４】
図４０は初代ＳＣＣＨＮ腫瘍および正常口腔粘膜についてのＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの異なる遺伝子導入効率の分析を示す。新鮮な組織（１０−２０ｍｇ）を患者から調製し、アデノウイルスベクターで感染させた（１０^６ベクター粒子／ｍｇ組織）。２４時間後、細胞をルシフェラーゼ遺伝子産物の発現につき分析した。
【００４５】
図４１〜４３はベクターの全身投与後の種々の器官における遺伝子発現を示す。２００μｌ容量のｈｅｐｅｓ緩衝化セーライン中の１０^９ｐｆｕのＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤいずれかを８−１０週齢の雌Ｃ５７ｂｌａｃｋ６マウスの側方尾静脈に注入した。３日後、マウスを犠牲にし、器官を収穫し、エタノールおよびドライアイスに浸漬したポリプロピレンチューブにスナップ凍結させた。凍結器官（各場合において全器官）を、エタノール／ドライアイス中で冷却した乳鉢および乳棒を用いて微粉末まで粉砕した。室温にて溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用い器官粉末を２０分間で溶解させた。溶解物を３回の凍結−解凍サイクルに付し、次いで、ミクロ遠心管中にて１４，０００ｒｐｍにて１５分間遠心した。製造業者の指示に従って、ルシフェラーゼアッセイ系キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて上清ルシフェラーゼ活性を評価した。Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを用いて相対的光単位（ＲＬＵ）を測定した。製造業者指示に従って、ＢｉｏＲａｄ ＤＣ蛋白質アッセイキットを用いて溶解物の蛋白質含有量を測定した。結果は蛋白質ｍｇ当たりのＲＬＵとして表し、各点は１つのマウス、および棒によって示される５マウスの平均を表す。統計的分析は対数変換されたデータの偏差分析によって行い、有意性はｐ＜０．０５によって許容される。示されるデータは３つの別々の実験の代表である。
【００４６】
図４４は肝臓発現と比較した種々の器官におけるルシフェラーゼ発現の比率を示す。種々の器官におけるルシフェラーゼ発現は図４１〜４３におけるごとく測定し、次いで、各個々のマウスにつき、発現の示された器官／肝臓比率を測定した。データは比率の平均（±ＳＤ）である。
【００４７】
（発明の詳細な記載）
図１はファイバーノブ蛋白質の模式的３Ｄモデルを示す。ＨＩループはノブにおける分子内相互に寄与せず、従って、さらなる蛋白質配列の組込みはファイバーのトリマー化に影響しないはずである。加えて、ループはほとんど親水性アミノ酸残基よりなり、ノブの外部に露出される。それは高度の柔軟性を示し、リガンド取込みについての最適環境を創製する。さらに、ＨＩループの長さは異なるアデノウイルス血清型のノブにおいて有意に変化する。この事実は、挿入および欠失のごときループの外来の構造の改変が全ノブドメインの正しい折畳みに適合すべきことを示唆する。最後に、ＨＩループはノブに局所化する推定細胞結合部位の形成に寄与しない。
【００４８】
ノブのＨＩループを操作することによってアデノウイルスファイバー蛋白質を修飾する１つのアプローチが開発されている。ファイバーポリペプチドの正しい折畳みおよびその生物学的機能に影響することなく異種アミノ酸配列にＨＩループを取り込むことが可能である。さらに、これらの結果は、ノブ位置のＨＩループがキャプシド蛋白質の遺伝的改変に基づいて屈性修飾を達成するように設計された戦略につき利点を供することを示唆する。
【００４９】
本発明は、アデノウイルス屈性の修飾を可能とする標的化リガンド組込みためのＨＩループの利用性を証明する。具体的には、ファイバーノブへのＲＧＥモチーフペプチドの取込みはウイルスが代替感染経路としてのＲＧＤ／インテグリン相互作用を利用することを可能としＡｄ感染に対して非常に困難である細胞のいくつかのタイプをウイルスが形質導入する能力を劇的に改良した。修飾されたビリオンの利用性を示すために、初代卵巣癌細胞への効果的な遺伝子導入のための手段としてこのウイルスベクターを使用した。具体的には、ＨＩループ中にＲＧＤ−モチーフを持つファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターは、ＣＡＲ−非依存性細胞侵入メカニズムを介して細胞を標的化する遺伝子送達を劇的に増加させることができた。
【００５０】
本発明において、ファイバー遺伝子変異体を含有する修飾されたアデノウイルスベクターを含む組成物が提供された。
【００５１】
本発明は組換えアデノウイルスに指向され、ここに、該アデノウイルスはファイバーノブのＨＩループドメインで修飾されたファイバー遺伝子を含む。好ましくは、組換えアデノウイルスはＣＡＲ−非遺伝子導入を達成することができる。加えて、該アデノウイルスはさらにファイバーノブに対するさらなる修飾を含み、それによりアデノウイルスの天然屈性を排除する。所望により、修飾されたファイバーノブはトリマー化するその能力を保持し、その天然生合成プロフィールを保持する。例えば、ファイバー遺伝子は、ファイバーノブのＨＩループドメインにリガンドを導入することによって修飾することができ、かかるリガンドの代表的な例は生理学的リガンド、抗−受容体抗体および細胞特異的ペプチドである。好ましいリガンドは配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）、より好ましくは配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣである。さらに、アデノウイルスをコードするアデノウイルスベクターはさらに単純疱疹−チミジンキナーゼ遺伝子のごとき治療遺伝子を含む。
【００５２】
また、本発明はファイバーノブのＨＩループドメインで修飾されたファイバー遺伝子および単純疱疹ウイルス−チミジンキナーゼ遺伝子を含む有効量の組換えアデノウイルスを個体に投与し；次いで、該個体をガンシクロビールで処理する工程を含むことを特徴とするかかる治療を必要とする個体において腫瘍細胞を殺す方法に指向される。好ましくは、該投与は全身投与である。
【００５３】
本発明は、さらに、ファイバーノブのＨＩループドメインで修飾されたファイバー遺伝子および治療遺伝子を含む有効量の組換えアデノウイルスを個体に投与する工程を含むことを特徴とするかかる治療を必要とする個体に対して遺伝子治療を供する方法に指向される。好ましくは、該投与は全身投与である。個体に影響する代表的な病気は癌、嚢胞性線維症およびデユシェーヌ筋ジストロフィーである。
【００５４】
本発明は、なおさらに、アデノウイルスのファイバーノブＨＩループドメインにおいてファイバー遺伝子を修飾する工程を含むことを特徴とする細胞を形質導入するアデノウイルスの能力を増加させる方法に指向される。好ましくは、ファイバー遺伝子は、ファイバーノブのＨＩループドメインにリガンドを導入することによって修飾され、代表的なリガンドは生理学的リガンド、抗−受容体抗体および細胞特異的ペプチドである。好ましくは、該リガンドは配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を有し、なおさらに好ましくは、該リガンドは配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣを有する。一般に、該細胞は腫瘍細胞であり、イン・ビトロ、イン・ビボおよび半・ビボであり得る。最適には、アデノウイルスをコードするアデノウイルスベクターは治療遺伝子を含む。
【００５５】
本発明によると、当業者の技量内にある慣用的な分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。かかる技術は文献に十分に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ， “Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）； “Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８４）］； “Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ．（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）参照。従って、もし本明細書中に現れれば、以下の用語は後記する定義を有するべきである。
【００５６】
「ＤＮＡ分子」とはその一本鎖形態または二本鎖ラセンのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミジンまたはシトシン）のポリマー形態をいう。この用語は分子の一次および二次構造のみをいい、それをいずれかの特定の三次形態に限定するものではない。かくして、この用語は、とりわけ線状ＤＮＡ分子（例えば、制限断片）ウイルス、プラスミドおよび染色体で見いだされる二本鎖ＤＮＡを含む。本明細書中で構造を議論するにおいて、ＤＮＡの非転写ストランドに沿って５’ないし３’方向の配列のみを与える通常の約束に従う（すなわち、ｎＲＮＡに相同な配列を有するストランド）。
【００５７】
「ベクター」は、付着されたセグメントの複製を行うようにそれにもう１つのＤＮＡセグメントが付着されてもよい、プラスミド、ファージまたはコスミドのごときレプリコンである。「レプリコン」はイン・ビボでＤＮＡ複製の自律単位として機能する；すなわち、それ自体の制御下で複製できるいずれの遺伝的要素（例えば、プラスミド、染色体、ウイルス）でもある。「複製起点」とはＤＮＡ合成に参加するＤＮＡ配列をいう。「発現制御配列」はもう１つのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し調節するＤＮＡ配列である。暗号配列は、ＲＮＡポリメラーゼが暗号配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそれが暗号配列によってコードされる蛋白質に翻訳される場合、細胞中の転写および翻訳制御配列に「作動可能に連結し」、その「制御した」にある。
【００５８】
一般に、挿入されたＤＮＡ断片の効果的な転写および翻訳を促進するプロモート配列を含有する発現ベクターが宿主細胞で使用される。発現ベクターは、典型的には、複製起点プロモーター、ターミネーター、形質転換された細胞において表現型選択を供することができる特異的遺伝子を含有する。形質転換された宿主を発酵させ、当該分野で知られている手段に従って培養して最適な細胞増殖を達成することができる。
【００５９】
ＤＮＡ「暗号配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、イン・ビボでポリペプチドに転写され翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。暗号配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端における翻訳停止コドンによって形成される。暗号配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核細胞（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列を含むことができる。ポリアデニル化シグナルおよび転写停止配列は、通常、暗号配列の３’側に位置するであろう。「ｃＤＮＡ」はコピー−ＤＮＡまたは相補的−ＤＮＡと定義され、これはｍＲＮＡ転写体からの逆転写反応の産物である。「エクソン」は遺伝子座から転写された発現配列であり、他方、「イントロン」は遺伝子座からの非発現配列である。
【００６０】
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞において暗号配列の発現を供する、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のごときＤＮＡ調節配列である。「シス−要素」は、特異的遺伝子座の発現を上昇調節または下降調節できる他の蛋白質と相互作用する、「コンセンサス配列」または「モチーフ」ともいうヌクレオチド配列である。また、「シグナル配列」が暗号配列と共に含むことができる。この配列は、シグナルペプチドをコード化する。この配列は、宿主細胞に連絡し、ポリペプチドを適当な細胞位置に仕向けるポリペプチドのＮ末端側のシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、原核生物および真核生物に対して天然の種々の蛋白質に関して見いだすことができる。
【００６１】
「プロモーター配列」は細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、下流（３’方向）暗号配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的では、プロモーター配列は転写開始部位によってその３’末端で境界となり、上流（５’方向）に伸びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含ませる。プロモーター配列内には、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担う蛋白質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見いだされるであろう。真核生物プロモーターは常ではないがしばしば「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核生物プロモーターはマイナス１０およびマイナス３５コンセンサス配列に加えてシャインダルガノ配列を含む。
【００６２】
用語「オリゴヌクレオチド」は２以上のデオキシビボヌクレオチド、好ましくは３を超えるデオキシリボヌクレオチドよりなる分子と定義される。その正確なサイズは、究極的な機能およびオリゴヌクレオチドの使用に依存する多くの因子に依存するであろう。本明細書で用いる用語「プライマー」は、生成された制限消化物におけるごとく天然に生じるかあるいは合成により生じるかを問わず、核酸ストランドに相補的なプライマー延長産物の合成が誘導される条件下に置かれた場合に、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡポリメラーゼのごとき誘導剤の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨにて、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖または二本鎖であってよく、誘導剤の存在下で所望の伸長産物の合成の起点となるのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは温度、プライマー源および使用方法を含めた多くの因子に依存するであろう。例えば、診断適用では、標的配列の複雑性に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５ないし２５またはそれ以上のヌクレオチドを含有するが、それはより少ないヌクレオチドを含有することもできる。
【００６３】
プライマーは特定の標的ＤＮＡ配列の異なるストランドに対して「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーがそれぞれのストランドとハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片はプライマーの５’末端に付着することができ、プライマー配列の残りは当該ストランドに相補的である。別法として、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに介在させることができ、但し、プライマー配列は当該配列との十分な相補性を有するか、あるいはそれとハイブリダイズし、それにより、伸長産物の合成用の鋳型を形成するものとする。
【００６４】
本明細書で用いるごとく、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」とは特異的ヌクレオチド配列においてまたはその近くで二本鎖ＤＮＡを切断する酵素をいう。
【００６５】
「組換えＤＮＡ技術」とは、通常は異なる生物からのＤＮＡのイン・ビトロ連結の結果として、２つの異種ＤＮＡ分子を統合するための技術をいう。組換えＤＮＡ分子は、通常は、遺伝子工学における実験によって生じる。同意義の用語は「遺伝子スプライシング」、「分子クローニング」および「遺伝子工学」を含む。これらの操作の生成物の結果、「組換え体」または「組換え分子」が得られる。
【００６６】
かかるＤＮＡを細胞の内部に導入すると、細胞は外因性または異種ＤＮＡで「形質転換」されているかまたは「トランスフェクト」されている。形質転換ＤＮＡは細胞のゲノムに組み込まれていてもよく（共有結合）、あるいはそうされていなくてもよい。原核生物、酵母、および哺乳動物細胞において、例えば、形質転換ＤＮＡをベクターまたはプラスミドのごときエピソーム要素に維持することができる。真核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、それが染色体複製を介して娘細胞によって受け継がれるように、染色体に組み込まれるようになるものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含有する娘細胞の集団よりなる細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって証明される。「クローン」は有糸分裂によって単一の細胞または先祖に由来する細胞の集団である。「細胞系」は何世代もイン・ビトロで安定に増殖できる初代細胞のクローンである。外因性ＤＮＡで形質転換されている植物または動物のごとき生物は「トランスジェニック」という。
【００６７】
本明細書で用いるごとく、用語「宿主」とは原核細胞のみならず酵母、植物および動物細胞のごとき真核細胞も含める意味である。組換えＤＮＡ分子または遺伝子を用いて、当業者に通常知られた技術のいずれかを用い宿主を形質転換することができる。原核生物宿主はＥ． ｃｏｌｉ．Ｓ．ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ．Ｓ．ｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを含むことができる。真核生物宿主はＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓのごとき酵母、哺乳動物細胞および昆虫細胞、より好ましくはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａおよびＴｏｂａｃｃｕｍ ｎｉｃｏｔｉａｎａのごとき植物細胞を含む。
【００６８】
ヌクレオチドの少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％または９５％）がＤＮＡ配列の定義された長さにわたって一致する場合、２つのＤＮＡ配列は「実質的に相同」である。実質的に相同である配列は、配列データバンクで入手可能な標準的ソフトウェアを用いて、あるいは例えば特定の系について定義したごときストリンジェントな条件下でのサザーンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することによって同定することができる。適当なハイブリダイゼーションを規定することは当業者の技量の範囲内のことである。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら， 前掲；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ＆ＩＩ，前掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前掲参照。
【００６９】
ＤＮＡ構築体の「異種」領域は天然でより大きい分子と会合しては見いだされないより大きいＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。かくして、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、該遺伝子は通常は源生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに近接しないＤＮＡに近接される。もう１つの例において、前記暗号配列は、該暗号配列自体が天然では見いだされない構築体である（例えば、ゲノム暗号配列がイントロン、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を含有するｃＤＮＡ）。対立遺伝子変異または天然に生じる突然変異事象はここに定義されるＤＮＡの異種領域を生じさせない。
【００７０】
本明細書で用いるごとく、ポリペプチドに適用される「断片」は通常は長さが少なくとも１０残基、より典型的には少なくとも２０残基、好ましくは少なくとも３０（例えば、５０）残基であるが、完全な無傷配列よりは短い。断片は、当業者に知られた方法によって、例えば、天然に生じるまたは組換え蛋白質の酵素消化によって、所望の断片をコードする発現ベクターを用いる組換えＤＮＡ技術によって、あるいは化学的合成によって、生じさせることができる。酵素の特徴を呈する候補断片の能力（例えば、特異的抗体への結合、または部分的酵素的もしくは触媒的活性の提示）は本明細書に記載する方法によって評価することができる。精製された断片または抗原性断片を用い、異なる酵素からの多重機能断片を用いて新しい調節酵素を生じさせることができ、ならびに当業者に知られた標準的なプロトコルを使用することによって抗体を生じさせることができる。
【００７１】
標準的なノーザンブロットアッセイを用いて、当業者に知られた慣用的ノーザンハイブリダイゼーション技術に従い、植物または他のトランスジェニック組織から得られた細胞または組織におけるｍＲＮＡ相対的量を確認することができる。別法として、標準的なサザーンブロットアッセイを用いて、当業者に知られた慣用的サザーンハイブリダイゼーション技術に従い、トランスジェニック系における遺伝子の存在およびコピー数を確認することができる。ノーザンブロットおよびサザーンブロットは共にハイブリダイゼーションプローブ、例えば、全長の一本鎖ＤＮＡまたは少なくとも２０（サイズが好ましくは少なくとも３０、より好ましくは少なくとも５０、最も好ましくは少なくとも１００の連続ヌクレオチド）のＤＮＡ配列の断片を含有する放射標識されたｃＤＮＡを用いる。該ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブは、当業者に知られた多くの異なる方法のいずれかによって標識することができる。
【００７２】
これらの実験で最も通常に使用される標識は、放射性元素、酵素、紫外線その他に暴露した場合に蛍光を発する化学物質である。多数の蛍光物質が知られており、標識として利用することができる。これらは、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシフェールイエローを含む。特別の検出物質は、ヤギ中で調製され、イソチオシアネートを介してフルオレセインに結合された抗−ウサギ抗体である。また、蛋白質は放射性元素または酵素で標識することもできる。放射性標識は現在利用可能な計数手法のいずれかによって検出することができる。好ましいアイソトープは^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３６Ｃｌ、^５１Ｃｒ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^９０Ｙ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、および^１８６Ｒｅから選択されることができる。
【００７３】
酵素標識は同様に有用であり、現在利用される比色、分光分析、蛍光分光分析、電流滴定、ガス定量技術のいずれかによって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のごとき架橋分子との反応によって選択された粒子に結合される。これらの手法で用いることができる多くの酵素は公知であり、利用することができる。好ましいものはペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウリカーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号、第３，８５０，７５２号および第４，０１６，０４３号を別の標識物質および方法の開示につき例として引用する。
【００７４】
本明細書で用いるごとく、天然生合成プロフィールとは修飾に引き続いて保持されたファイバーノブの望ましい特徴（例えば、ビリオンへの修飾ファイバーの取り込み、修飾ファイバーノブとアデノウイルスキャプシド蛋白質との正しい構造的会合等）をいう。
【００７５】
以下の実施例は本発明の種々の実施の形態を説明する目的で掲げるが、断じて本発明を限定する意図のものではない。
【００７６】
実施例１
細胞
Ａｄ５ ＤＮＡで形質転換した２９３ヒト腎臓細胞系はＭｉｃｒｏｂｉｘ（Ｔｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ， カナダ国）から購入した。ＨｅＬａヒトアデノウイルス細胞、Ａ５４９ヒト肺癌腫細胞、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびヒト胚横紋筋肉腫細胞（ＲＤ）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓｉｓ ＶＡ）から得た。ヒト卵巣癌腫細胞系ＳＫＯＶ３．ｉｐ１およびＯＶ−４は、各々、Ｊａｎｅｔ Ｐｒｉｃｅ（Ｍ．Ｄ． Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ）およびＴｉｍｏｔｈｙ Ｊ． Ｅｂｅｒｌｅｉｎ （Ｂｒｉｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｏｍｅｎ‘ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）から入手し、３７℃および５％ＣＯ２にて１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、１００単位 ＭＬペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＭｅｄｊａｔｅｃｈ（Ｈｅｒｎｄｏｎ， ＶＡ）からのダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）−ハムのＦ１２中に維持した。初代卵巣癌腫細胞を以下のごとくに単離した：ＢｉｒｍｉｎｇｈａｍのＨｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ， Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙでの外科手術の間に上皮卵巣癌腫の悪性腹水を収集し、病理学者によって分類された。外科的手法を適用して赤血球細胞および死細胞を除去した後に材料を得た。略言すると、溶解緩衝液を小さくアリコットした初代材料に添加し、室温での２分間のインキュベーション後に、完全培地を添加し、遠心し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁し、Ｆｉｃｏｌｌ４００溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）と混合し、遠心後に細胞のバンドを収集した。死細胞を除去するために、５％ＦＢＳを含有する培地に収集細胞を再懸濁し、Ｆｉｃｏｌｌ溶液を重ね、遠心後に、生細胞を収穫し、もう１つのチューブに移し、マイナス１５０℃において２％ジメチルスルホキシド（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したＦＢＳに貯蔵した。３つのヒト頭部および首腫瘍細胞系およびＨｅＬａ細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓｉｓ， ＶＡ）から得た。実験した細胞系はＦａＤｕ（咽頭偏平細胞癌腫）、ＳＣＣ−４およびＳＣＣ−２５（舌偏平細胞癌腫）およびＨｅＬａであった。ＦａＤｕ細胞は、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏｂｒｌ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸および１．０ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充した最小必須培地中で増殖させた。ＳＣＣ−４およびＳＣＣ−２５細胞は１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミンおよび４００ｎｇ／ｍｌヒドロコルチゾン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む１：１重量比（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）のハムのＦ１２／ダルベッコの修飾イーグル培地中で増殖させた。全ての細胞は５％ＣＯ_２雰囲気中で３７℃で培養した。外科手術（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、 ＡＬ）の間に得られた初代ヒトＳＣＣＨＮ腫瘍試料を研究所に移し、実験のために加工した。略言すれば、腫瘍または正常組織を細かく認知し、ほぼ等しいアリコットに分配し、秤量し、次いで１００μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（ＧｉｂｃｏＢＲＭ）を重ねた。全ての実験で、１０−２０ｍｇ／組織の試料を用いた。
【００７７】
実施例２
酵素、蛋白質アッセイおよび抗体
制限エンドヌクレアーゼ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびプロテイナーゼＫはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ （Ｂｅｖｅｒｌｙ， Ｍａｓｓ．）またはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， Ｉｎｄ．）のいずれかからのものであった。
【００７８】
精製蛋白質の濃度は標準としてウシガンマグロブリンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， Ｃａｌｉｆ．）によって測定された。
【００７９】
抗−ファイバーモノクローナル抗体４Ｄ２（１９）および１Ｄ６．１４（１４）はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ ａｔ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ で生じさせた。抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体Ｍ２およびＭ２−アフィニティーゲルはＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， Ｃｏｎｎ．）から購入した。抗−αｖβ３インテグリンモノクローナル抗体ＬＭ６０９および抗−αｖβ５でインテグリンモノクローナル抗体Ｐ１Ｆ６は、各々、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， Ｃａｌ．）およびＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）から購入した。抗−ＣＡＲモノクローナル抗体ＲｍｃＢはＲ．Ｗ． Ｆｉｎｂｅｒｇ（Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ， Ｂｏｓｔｏｎ， Ｍａｓｓ．）から得た。
【００８０】
腹水液として調製したマウス抗−ＣＡＲモノクローナル抗体（ＲｍｃＢ）はＲ．Ｌ． Ｃｒｏｗｅｌｌ（Ｈａｈｎｅｍａｎｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ＰＡ）（Ｌｅｅら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６２：１６４７， １９８８）から得た。抗−αｖβ３ｍＡｂ、ＬＭ６０９、抗−αｖβ３複合体ｍＡｂ、ＰＩＦ６、抗−α２β１ ｍＡｂ、ＢＨＡ２．１および抗−α３β１、ＭＡＢ１９９２はＣｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩＮＣ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。対照マウスＩｇＧおよび抗−マウスＩｇＧのＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドＦ（ａｂ’）２断片はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。
【００８１】
実施例３
フローサイトメトリーおよび間接フローサイトメトリー
Ｔ７５フラスコ中で増殖させた細胞をベルセネ放出させ、２×１０^６細胞／ｍｌにてＳＭ緩衝液（Ｈｅｐｅｓ緩衝化セーライン、０．１％アジ化ナトリウム、１％ＢＳＡ）に再懸濁させた。２０万細胞を４℃にて２時間、２００μｌ中のＳＭ中にて、５μｇ／ｍｌ ＬＭ６０９、ＰＩＦ６、ＲｍｃＢと共に、または初代ｍＡｂ（陰性対照）なしにインキュベートした。次いで、細胞をＳＭで洗浄し、４℃で１時間、５μｌ／ｍｌ二次ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ， Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ， ＰＡ）で洗浄した。ＳＭ洗浄後、試料当たり１０^４細胞をＵＡＢ ＰＡＣＳ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにてフローサイトメトリーによって分析した。
【００８２】
培養した細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｖｅｒｓｅｎｅ （ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で１５分間収穫した。脱着した細胞を遠心し、１０^５細胞／ｍｌの濃度にて、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．１％アジ化ナトリウム（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を含有するＰＢＳに再懸濁した。次いで、細胞を氷上で１時間初代抗体と共にインキュベートした。引き続いて、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッド抗−マウスＩｇＧと共にさらに１時間インキュベートした。１％ＢＳＡ−ＰＢＳで洗浄した後、細胞をフローサイトメトリーによって分析した。
【００８３】
実施例４
６−Ｈｉｓ−タッグド組換え蛋白質の発現および精製
組換えＡｄ５ファイバーノブ蛋白質をＥ． ｃｏｌｉにおいて発現させ、製造業者によって推奨されているごとく、Ｎｉ−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ （Ｑｉａｇｅｎ， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）上の固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によって精製した。Ｐ． Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｍｏｎｐｅｌｌｉｅｒ， フランス国）によって提供された組換えバクロウイルスＡｃＮＰＶ−Ｐｂｗｔ（１８）によって、ヒトアデノウイルス血清型２ペントンベース蛋白質をＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞において発現させた。ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を利用する２工程イオン交換クロマトグラフィーによって、該ペントンベース蛋白質を精製し、続いてＰＯＲＯＳ Ｈ９カラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＡ）上で精製した。バクロウイルス−感染Ｓｆ９細胞で発現された組換えファイバー蛋白質を、Ｎｉ−ＮＴＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上のクロマトグラフィーによって精製した。蛋白質濃度は標準としてウシガンマグロブリンでのＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）によって測定した。
【００８４】
実施例５
ＥＬＩＳＡ
６−ＨｉｓタッグドファイバーをＱｉａｇｅｎマニュアルに実質的に記載されているごとくにＮｉ−ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ Ｓｔｒｉｐｓ （Ｑｉａｇｅｎ）上に固定化した。略言すると、濃度１μｇ／ｍｌの２００μｌのファイバー蛋白質溶液をＮｉ−ＮＴＡ ＨｉｓＳｏｒｂ Ｓｔｒｉｐの各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの後に、該ウェルをリン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で４回洗浄し、２００μｌの抗−ファイバー抗体（１：２０００希釈）または抗−ＦＬＡＧ抗体（１：１４０希釈）を添加した。室温での２時間のインキュベーション後、ウェルを再度洗浄し、ホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヤギ抗−マウス免疫グロブリンＧの１：１００００希釈と共に４５分間インキュベートした。次いで、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液で４回洗浄し、２’，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）（ジアンモニウム塩）で展開した。ＡＢＴＳ−ＨＲＰ反応を４０５ｎｍに設定したマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
【００８５】
また、固相結合アッセイを以下の方法によって行った（Ｓｈａｒｍａら， １９９７、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２３９：１５０−７）。略言すれば、精製されたファイバー蛋白質またはアデノウイルスビリオンを１ｍｌ当たり１０μｇ蛋白質の濃度まで５０ｍＭカーボネート−ビカーボネート、ｐＨ９．６緩衝液中に希釈し、１００μｌアリコットを９６−ウェルＮｕｎｃ−Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加した。プレートを４℃にて一晩インキュベートし、次いで、２００μｌのブロッキング緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％カゼイン）で室温にて２時間ブロックした。次いで、ウェルを洗浄緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。０．０４ないし０．５μｇ／ｍｌの範囲の濃度まで結合緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＭｎＣｌ_２、０．５％カゼイン）中に希釈した精製インテグリンαｖβ３（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．， Ｔｅｍｅｃｕｌａ， ＣＡ）を１００μｌアリコットにてウェルに添加した。４℃にての一晩のインキュベーション後２ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、および１ｍＭ ＭｎＣｌ_２を含有する洗浄緩衝液で３回ウェルを洗浄した。結合したインテグリンを、マウスモノクローナル抗体抗−ヒトインテグレインαｖ−サブユニット抗体ＶＮＲ１３９（ＧｉｂｃｏＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で検出した。結合緩衝液中に１：３０００希釈したＶＮＲ１３９抗体を１００μｌアリコットにてウェルに添加し、室温にて１時間インキュベーションを継続し、次いで、ウェルを再度洗浄した。次いで、ＥＬＩＳＡプレートを製造業者によって推奨されているごとくＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）で展開した。１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４の添加によって発色を停止させ、プレートを４９０ｎＭに設定したマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
【００８６】
実施例６
組換えプラスミドの構築
各々、ホタルルシフェラーゼおよび細菌β−ガラクトシダーゼ（１８）を発現するＥ１−欠失Ａｄ５ベクター、ＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄＣＭＶＬａｃＺはＲ．Ｄ． Ｇｅｒａｒｄ， Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｄａｌｌａｓ， Ｔｅｘａｓから得た。
【００８７】
ＨＩループが欠失したＡｄ５ファイバーノブドメインをコードする遺伝子を生じさせるため、ＰＣＲ技術を使用した。以下の２つのプライマーの対を使用した：
Ｆ１：（５’ＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＣＡＴＴＡＣＡＧＴＡＧＧＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡ３’）（配列番号１）
Ｒ１：（５’ＣＡＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧ３’）（配列番号２）；
Ｆ２：（５’ＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ３’）（配列番号３）；および
Ｒ２：（５’ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＣＧＴＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＣ３’）（配列番号４）
を用いて、各々、位置１１５９ないし１４５１および１６４２ないし１７４７に対応するファイバー遺伝子の一部を増幅した。加えて、第２の断片はウイルスゲノム中のファイバー遺伝子の３’末端に隣接した４３ｂｐのＡｄ５ＤＮＡを含有する。次いで、生じた断片をゲル精製し、混合し、プライマーＦ１およびＲ２を用いて第３のＰＣＲによって結合した。得られた精製物はＨＩループをコードする配列の欠失した一部の代わりにユニークなＥｃｏＲＶ制限部位を含有し、ならびに当該分子の末端にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を挿入して引き続いてのクローニングを容易とした。この ＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−消化した細菌発現ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ， Ｃａｌｉｆ．）にクローン化し、その結果プラスミドＰＱＥ．ＫＮＯＢΔＨＩが得られた。
【００８８】
ファイバーのＨＩループに取り込まれたＦＬＡＧ配列を持つ発現プラスミドを構築するために、オリゴヌクレオチドＴＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧＣＣ（配列番号５）およびＧＧＣＴＴＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＴＡＧＴＣＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＡ（配列番号６）をアニールしてデュプレックスを形成し、ＥｃｏＲＶ−消化ｐＱＥ．ＫＮＯＢΔＨＩにクローン化した。正しい向きのデュプレックスを含有するプラスミドをｐＱＥ．ＫＮＯＢＨＩＦＬＡＧと命名した。
【００８９】
キメラファイバーを発現する組換えバクロウイルスの創製のための導入プラスミドを以下のごとくに作成した：ｐＱＥ．ＫＮＯＢＨＩＦＬＡＧからのＢｇＬＩＩ−ＭｆｅＩ断片を利用して従前に記載されている（２５）ベクターｐＢＳ．Ｆ５．ＵＴＲ中のＢｇＬＩＩ−ＭｆｅＩ断片を置き換え、それによりｐＢＳ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧを得た。次いで、ｐＢＳ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧからのＢｓｓＨＩＩ−ＸｈｏＩ断片をＢｓｓＨＩＩ−ＸｈｏＩ−消化バクロウイルス導入ベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， Ｍｄ．）にクローン化し、その結果ｐＦＢ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧが得られた。キメラファイバーのアミノ末端に６−Ｈｉｓ精製タグを導入するために、ｐＦＢ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧのＢａｍＨＩ−ＢｓｓＨＩＩ断片を、ＭｅｔＨＩＳ６Ｌｙｓをコードする、オリゴヌクレオチドＧＡＴＣＣＡＴＧＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＧ（配列番号７）およびＣＧＣＧＣＴＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＣＡＴＧ（配列番号８）で作成した合成デュプレックスで置き換えた。得られたプラスミドｐＦＢ６Ｈ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧはＨＩループに挿入されたアミノ末端６−ＨｉｓタグおよびＦＬＡＧペプチドを持つファイバーにつきコードする遺伝子を含有する。未修飾ＨＩループ暗号配列を持つファイバー遺伝子を含有する同様のプラスミドを誘導するために、ｐＦＢ６Ｈ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧ中のＢｓｓＨＩＩ−ＭｆｅＩ断片をｐＮＥＢ．ＰＫ３．６（２５）からの相同断片で置き換え、ｐＦＢ６Ｈ．Ｆ５を得た。ファイバーシャトルベクターｐＮＥＢ．ＰＫ３．６へＨＩループ中のＦＬＡＧ配列を持つファイバーをコードする遺伝子をクローン化するために、このプラスミドに含有された野生型ファイバー遺伝子のＢｓｔＸＩ−ＭｆｅＩ断片をｐＱＥ．ＫＮＯＢＨＩＦＬＡＧからのＢｓｔＸＩ−ＭｆｅＩ断片で置き換え、それにより、ＰＮＥＢ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧを得た。
【００９０】
Ｅｓｃｈｅｒｅｃｉａ ｃｏｌｉにおける相同組換えによる組換えアデノウイルスゲノムの創製を容易とするために、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ， フランス国）から得たプラスミドｐＴＧ３６０２（７）を作成して、ファイバー遺伝子の修飾に適した特殊化ベクターを創製した。この目的を達成するために、ファイバー遺伝子に局所化したＮｄｅＩ部位を使用した。プラスミドｐＴＧ３６０２を部分的にＮｄｅＩで消化し、ＮｄｅＩ−ＳｗａＩリンカー、ＴＡＣＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＧＧＧ（配列番号９）で連結した。ファイバー遺伝子中にＳｗａＩ部位を含有するこのプラスミドをｐＶＫ５０と命名した。
【００９１】
Ｃｈａｒｔｉｅｒら（７）に記載されているごとくに、ＳｗａＩで線状化されたｐＶＫ５０と注目する遺伝子を含有するｐＮＥＢ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧからの３−ｋｂのＥｃｏＲＩ断片との間のＥ． ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３における相同ＤＮＡ組換えによって、ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質をコードする遺伝子を含有する組換えアデノウイルスゲノムを創製した。次いで、新しく創製したゲノムを得られたプラスミドｐＶＫ３００から切り出し、当該ウイルスを救済するのに使用した。
【００９２】
ノブドメインのＨＩループ内のＲＧＤ−４Ｃペプチドを持つファイバーをコードする組換えＡｄ５ファイバー遺伝子を創製するために、オリゴＣＡＣ ＡＣＴ ＡＡＡ ＣＧＧ ＴＡＣ ＡＣＡ ＧＧＡ ＡＡＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＡＣ ＡＡＣ ＴＴＧ ＴＧＡ ＣＴＧ ＣＣＧ ＣＧＧ ＡＧＡ ＣＴＧ ＴＴＴ ＣＴＧ ＣＣＣ （配列番号１０）およびＧＧＧ ＣＡＧ ＡＡＡ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＧ ＣＧＧ ＣＡＧ ＴＣＡ ＣＡＡ ＧＴＴ ＧＴＧ ＴＣＴ ＣＣＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＴＴ ＡＧＴ ＧＴＧ（配列番号１１）で作成したデュプレックスを従前に命名されたプラスミドｐＱＥ．ＫＮＯＢΔＨＩのＥｃｏＲＶ部位（２１）にクローン化し、それにより、ｐＱＥ．ＫＮＯＢ．ＲＧＤＨＩを得た。
【００９３】
注目するウイルスゲノムの創製に適したシャトルベクターを作成するために、ＲＧＤ−４Ｃ暗号配列を含有する修飾されたファイバー遺伝子のＢｓｔＸＩ−ＭｕｎＩ−断片をｐＱＥ．ＫＭＯＢ．ＲＧＤＩＨＩからＢｓｔＸＩおよびＭｕｎＩで切断したファイバーシャトルベクターｐＮＥＢ．ＰＫ３．６ （Ｋｒａｓｎｙｋｈら， １９９６， Ｊ． Ｖｏｒｏｌ． ７０：６８３９−４６）にサブクローンした。ファイバー−ＲＧＤ遺伝子を含有するＡｄ５ゲノムを得るために、次いで、従前に記載されているごとくＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３におけるＳｗａＩ−消化ｐＶＫ５０での相同ＤＮＡ組換えのためにｐＮＥＢ．ＰＫ．ＦＨＩＲＧＤを利用した。この組換えの結果として得られたプラスミドをｐＶＫ５０３と命名した。
【００９４】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を１．７ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−断片としてプラスミドｐＧＥＭＲ−ｌｕｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ａａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃ．）から切り出し、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ−消化ｐｃＤＮＡ３ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）にクローン化し、その結果ｐｃＤＮＡ．Ｌｕｃが得られた。ルシフェラーゼＯＲＦ中のＰａｃＩおよびＣｌａＩ部位を破壊するために、オリゴＣＡＡ ＡＴＡ ＣＡＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＴＣＡ ＧＧＴ ＧＧＣ ＣＣＣ ＣＧＣ ＴＧＡ ＡＴＴ ＧＧＡ ＧＴ （配列番号１２）およびＣＧＡ ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＧＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＣＡＣ ＣＴＧ ＡＴＡ ＴＣＣ ＴＴＴ ＧＴＡ ＴＴＴ ＧＡＴ （配列番号１３）よりなる合成デュプレックスを用いてｐｃＤＮＡ．Ｌｕｃ中の４１ｂｐのＰａｃＩ−ＣｌａＩ−断片を置き換え、それによりｐｃＬｕｃＰＣ１を得た。
【００９５】
発現カセット中にこの修飾されたルシフェラーゼ遺伝子を含有するシャトルベクターを作成するために、遺伝子をｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡ（Ｂｅｃｋｅｒら， １９９４， Ｍｅｔｈ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ４３：１６１−８９）に以下のごとくクローン化した。プラスミドｐｃＬｕｃｐｃ１をＢａｍＨＩで切断し、クレノウ酵素で処理して末端を満たし、次いで、ＸｈｏＩで切断した。クローンニングベクターｐＡＣＣＭＶｐＬｐＡをＥｃｏＲＩで切断し、クレノウ酵素で処理し、次いでＳａｌＩで切断した。これらの２つのＤＮＡ分子の連結の結果、ｐＡＣＣＭＶ．ＬｕｃΔＰＣを得た。次いで、ＣｌａＩ−線状化ｐＶＫ５０３での相同ＤＮＡ組換えのためにこのプラスミドを用いて、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤのゲノムを含有するｐＶＫ７０３を得た。
【００９６】
ファイバー−ＲＧＤを発現する組換えバクロウイルスを誘導するために、導入ベクターｐＦＢ．Ｆ５ＨＩＦＬＡＧを以下のように修飾した。まず、ＥｃｏＲＩリンカー、ＣＧＧ ＣＧＡ ＡＴＴ ＣＧＣをｐＦＢ． Ｆ５ＨＩＦＬＡＧのＣｌａＩ部位に取り込み、ｐＦＢ．Ｆ５．ＲＩを得た。次いで、ファイバー−ＲＧＤ遺伝子の３’部分を含有するｐＮＥＢ．ｐｋ．ＦＨＩＲＧＤのＮｃｏＩ−ＭｕｎＩ−断片を用いて、ｐＦＢＦ５．ＲＩ中のＮｃｏＩ−ＭｕｎＩ−断片を置き換え、ｐＦＢ．Ｆ５ＨＩＲＥＧを得た。次いで、このプラスミドを用いて、製造業者の推奨に従い、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）を利用することによって部位特異的転位を介して組換えバクロウイルスゲノムを創製した。
【００９７】
標準的なプロトコル（１５）に従い、アデノウイルスを２９３細胞で増殖させ、ＣｓＣｌグラジエントでの遠心によって精製した。ウイルス粒子の力価の測定は、Ｍａｉｚｅｌら（２８）によって記載されている方法によって分光学的に達成され、２６０ｎｍにおいて吸光度単位当たり１．１×１０^１２ ウイルス粒子の変換率であった。２９３細胞での感染ウイルス粒子の激化を測定するために、Ｍｉｔｔｔｒｔｅｅｒら（３２）によって記載されているごとくにプラークアッセイを使用した。キメラファイバーを発現する組換えバクロウイルスを、製造業者のプロトコルに従い、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からＢａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現ユニットで生成させた。
【００９８】
実施例７
アデノウイルス感染アッセイ
アデノウイルス感染を評価するために１ｍｌの培養培地の存在下で、各細胞系の１０^５細胞を１２−ウェルプレートの各ウェルに三連で平板培養した。次いで、細胞を一晩インキュベートして接着させた。最初に、２０μｇ／ｍｌ最終濃度にてノブ蛋白質の有りまたは無しにて、２％ＦＢＳを含有する３００μｌ／ウェルの培地中で細胞を１５分間インキュベートした。次いで、ａ）１０−２５０ｐｆｕ／細胞のＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ、またはｂ）２０μｇ／ｍｌのＡｄＣＭＶＬｕｃ／ノブ蛋白質またはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ／ノブ蛋白質を含有する３００μｌの最終容量に混合された感染複合体を各ウェルに添加した。５％ＣＯ_２中３７℃にて細胞を１時間インキュベートし、次いで、リン酸緩衝化セーラインｐＨ７．４（ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、１ｍｌの完全培地を補充した。感染から４８時間後、細胞をＰＢＳですすぎ、酵素アッセイまたはルシフェラーゼｍＲＮＡのイン・サイチュハイブリダイゼーションによってルシフェラーゼ発現につきアッセイした。全てのルシフェラーゼ酵素アッセイでは、細胞を２００μｌのＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）溶解緩衝液に溶解した。引き続いて、製造業者の指示に従って１０μｌの各試料を５０μｌのＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、Ｂｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターにて三連試料の二重測定をアッセイした。主要な組織では、組織のミンチしたアリコットを２０μｇ／ｍｌのノブ蛋白質の有りまたは無しにて１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ中で３０分間インキュベートし、次いで、ＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ（５×１０^７ｐｆｕ／１０ｍｇ組織）によって１時間形質導入した。培地（抗生物質を含有するＯｐｔｉＭＥＭ）を置き換えた後、組織をさらに２４時間インキュベートした。次いで、組織を均質化し、遠心した。次いで、収集した上澄みをルシフェラーゼアッセイおよび蛋白質濃度の測定のために使用した。
【００９９】
実施例８
ルシフェラーゼｍＲＮＡのイン・サイチュハイブリダイゼーション
イン・サイチュハイブリダイゼーション技術についてのプロトコルは記載されている（Ｂｕｃｙら、 Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．１８０：１２５１， １９９４；Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍａｒｔａｒｉ＆Ｂｕｃｙ， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑ， １８：３００ １９９５）。略言すれば、１ｍｌの培養培地の存在下で、細胞を１２−ウェルプレートの各ウェルに平板培養した。細胞が密集下に到達した後、それを２５０ｐｆｕ／細胞においてＡｄＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤによって１時間形質導入した。さらなる４８時間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳですすぎ、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に再懸濁した。遠心後、細胞を１０６細胞／ｍｌの濃度にてＤＥＰＣ／処理ＰＢＳに再懸濁した。１００μｌの各試料中の細胞をサイトスピンによってスライドグラスに付着させた。次いで、細胞をＰＢＳですすぎ、室温にて３％パラホルムアルデヒド中で１時間固定した。固定された細胞を０．２Ｍ ＨＣｌで処理して内因性アルカリ性ホスファターゼ活性を阻害し、０．１Ｍトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化してバックグラウンド染色を減少させ、ハイブリダイジング溶液中で４００ｐｇ／ｍｌ／ｋｂの関連リボプローブと５０℃にて一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション溶液は５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、１×デンハルト溶液（Ｓｉｇｍａ）、５００ｍｇ／ｍｌ加熱変性ニシン精子ＤＮＡ、２５０ｍｇ／ｍｌ酵母導入ＲＮＡおよび１０％硫酸デキストランよりなるものであった。ハイブリダイゼーションの後、細胞を２×ＳＳＣ、続いて塩化ナトリウム−トリス−ＥＤＴＡ緩衝液ですすぎ、３７℃にてＲＮａｓｅＡ（塩化ナトリウム−トリス−ＥＤＴＡ中の２０ｍｇ／ｍｌ）で３０分間処理して過剰の非ハイブリダイズプローブを除去した。次に、一連の順次のストリンジェンシー洗浄を、正常なウマ血清を含む２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよびトリス−ＮａＣｌ（０．１５Ｍ）、ｐＨ７．５で行った。次いで、細胞を１：５０００の濃度にてアルカリ性ホスファターゼ−コンジュゲーテェド抗−ジゴキシゲニン抗体で１時間染色した。次に、細胞をトリス−ＮａＣｌで洗浄し、ＭｇＣｌ_２を含む塩基性トリス緩衝液（ｐＨ９．５）に移した。最後に、４℃の暗い湿潤チャンバー中、スライドを酵素基質溶液（ニトロブルーテトラゾリウム／ＢＣＩＰ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ）と共に一晩インキュベートした。トリス−ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ８．０）中でスライドをすすぐことによって、発色反応を定置させた。
【０１００】
実施例９
ＦＬＡＧ接近性アッセイ
Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの無傷ビリオンに取り込まれたＦＬＡＧ−タッグドファイバー蛋白質の抗−ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体への結合を証明するために、免疫沈殿アッセイを使用した。ＣｓＣｌグラジエントで精製したＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧまたはＡｄＣＭＶＬｕｃをＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０％グリセロール、［ｐＨ７．４］）に対して透析し、以下のごとくにＭ２−アフィニティーゲル（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）に吸収させた。１０^１１ ウイルス粒子を含有する透析ウイルスの５０μｌを、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．５％ウシ血清アルブミン（ＤＳＡ）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液で平衡化させた１００μｌのＭ２−アフィニティーゲルと混合し、次いで、回転するホイール上で４℃にて一晩インキュベートした。インキュベーションに続き、ミクロ遠心管中の簡単な遠心によってゲルを回転させた。上澄みをさらなる分析のために収集し、ゲルを０．５ｍｌのトリス−緩衝化セーライン（ＴＢＳ）で洗浄した。ウイルスを、４℃にて１ｍｌ当たり４００μｇのＦＬＡＧペプチドを含有する５０μｌ ＴＢＳで溶出させた。未結合物質、洗液および溶出物を含有する上澄みを次いで使用してウイルスの存在を検出した。このために、各々、１％、１０ｍＭおよび１００μｇ／ｍｌの最終濃度にてドデシル硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡおよびプロテイナーゼＫにてこれらの画分のアリコットを３７℃で１時間処理した。試料をアガロースゲル電気泳動によって分析してウイルスＤＮＡを検出した。
【０１０１】
実施例１０
免疫沈殿によるファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質の精製
組換えファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質を以下のごとくバクロウイルス感染Ｓｆ９細胞中で発現させた。ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質の大規模な発現のために、Ｔ７５フラスコ中のＳｆ９細胞の単層を５ないし１０の感染多重度にて組換えバクロウイルスで感染させ、次いで、完全な細胞病理学的効果が観察されるまで２８℃でインキュベートした。感染後２ないし３日で、細胞を掻き取り、低速遠心によってペレット化し、溶解緩衝液（１ｍｌ当たり５０ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０，１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０，０．１％ＳＤＳ、０．０２％アジ化ナトリウム、１００μｇ／ｍｌでフッ化フェニルメチルスルホニル、１μｇのアプロチミン）に再懸濁した。次いで、氷上で細胞を３０分間インキュベートした。ミクロ遠心管中で１２０００×ｇでの５分間の遠心によって溶解物を清澄化した。清澄化された溶解物をＭ２アフィニティーゲルのスラリーと混合し、該手法の残りはＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの免疫沈殿につき記載したごとく行った。
【０１０２】
実施例１１
組換え蛋白質のトリマー化アッセイ
バクロウイルス感染昆虫細胞で発現されたファイバー蛋白質がトリマーを形成し得るか否かを判断するために、これらの蛋白質を記載されているごとくに（３０）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析した。電気泳動に先立って蛋白質を沸騰させてトリマーを解離させるか、あるいは変性することなくゲルに負荷した。これらの分子のトリマーまたはモノマーの立体配座はゲル中のその移動性に基づいてかく測定された。
【０１０３】
実施例１２
組換えファイバー蛋白質によるウイルス媒介遺伝子導入の阻害
アデノウイルス媒介遺伝子導入をブロックするファイバー−ＦＬＡＧキメラの能力を、従前に記載されているのと同様の（１７、２４，３４、３６）感染阻害実験で評価した。略言すれば、２４−ウェルプレートで増殖させたＨｅＬａ細胞を、ホタルルシフェラーゼＡｄＣＭＶＬｕｃを発現する複製欠陥組換えアデノウイルスでの感染に先立って、野生型ファイバーまたはファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質いずれかの系列１０倍希釈と共に室温にてプレインキュベートした。未結合ウイルスを洗浄し、３７℃で細胞をインキュベートして、ＡｄＣＭＶＬｕｃの内部化およびルシフェラーゼ遺伝子の発現を可能とさせた。感染細胞の溶解物のルシフェラーゼアッセイは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）からのルシフェラーゼアッセイ系にて感染後３０時間に行った。
【０１０４】
実施例１３
ウイルス結合アッセイ
Ｗｉｃｋｈａｍら（４５）に記載されているごとく、ヒト肺癌腫Ａ５４９細胞をＴ７５フラスコ中で増殖させ、次いで、ＥＤＴＡで収穫し、ＰＢＳで１回洗浄し、ペレット化し、ＤＭＥＭ−Ａｄ培地（ＤＭＥＭ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．５％ＢＳＡ）中の１０７細胞／ｍｌの最終濃度まで再懸濁した。細胞の１００μｌアリコットを５ｍｌ試験管に移し、ＤＭＥＭ−Ａｄ培地中に希釈した１００μｌの組換えファイバーと共に４℃で１時間インキュベートした。
【０１０５】
組換えアデノウイルスＡｄＣＭＶｌａｃＺおよびＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧをＣｓｃｌグラジエントで精製し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール［ｐＨ７．４］を含有する緩衝液に対して透析した。５０ｍｇのウイルス蛋白質を含有する両ウイルスのアリコットを、記載されているごとく（２０）ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳヨード化試薬（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＩＩ）を用いて¹²⁵Ｉで標識した。ＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．）上のゲル濾過によって、標識ウイルスを未取込み¹²⁵Ｉから精製した。次いで、１０^５ｃｐｍの全放射能を持つ標識ビリオンの５０μｌでアリコットを、ファイバー希釈物またはＰＢＳと共にプレインキュベートしたＡ５４９細胞に添加し、４℃でさらに１時間インキュベートした。０．１％ＢＳＡを含有する４ｍｌのＰＢＳで試料を希釈し、細胞を遠心によってペレット化した。未結合ウイルスを含有する上澄みを吸引し、細胞ペレットの放射能をガンマカウンターで測定した。
【０１０６】
実施例１４
バクロウイルス感染昆虫細胞において発現された組換えファイバー
異種蛋白質配列の取込み用のファイバーノブのＨＩループの使用の適当性を証明するために、バクロウイルス発現系で発現された組換えファイバー蛋白質をまず使用した。この系は機能的Ａｄ２、Ａｄ３、およびＡｄ５ファイバー蛋白質、ならびにＡｄ３−Ａｄ５およびＡｄ５−Ａｄ３ファイバーキメラの発現のためのその有用性を証明した（１３，２６、３３、３７）。
【０１０７】
この目的を達成するために、ＰＣＲアプローチを用いて、ＨＩループ中の部分的欠失を持つＡｄ５ファイバーノブをコードする遺伝子を誘導した。この欠失を作成してファイバーノブドメインのＨＩループからのアミノ酸ＴＬＮＧＴＱＥＴＧＤＴＴＰ（配列番号１４）を除去し、欠失された配列の代わりにユニークなＥｃｏＲＶ部位を導入し、それにより、この領域における別の配列のクローニングを容易とした（図２）。該欠失は、ヒトアデノウイルスの異なる血清型のファイバーノブにおいて最も有意に変化するＨＩループの一部を除去した。ＰＣＲによって生じた配列は、アミノ酸グリシン−３８７ないしイソロイシン−５３４およびセリン−５４８ないしグルタミン−５８１を含めたファイバー蛋白質の２つのセグメントに対応するオープンリーディングフレームを含有した（与えられた座標は野生型Ａｄ５ファイバー蛋白質配列のものに従う）。この配列をプラスミドベクターｐＱＥ３０にクローン化した。
【０１０８】
次いで、新しく生成したプラスミドｐＱＥ．ＫＮＯＢΔＨＩを、検出および精製タグとして広く用いられてきたＦＬＡＧオクタペプチド（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１５））をコードするＤＮＡの断片に取り込むためのクローニングベクターとして利用した。かくして、このＦＬＡＧペプチドを、ノブのＨＩループに取り込まれた異種ペプチド配列がトリマーファイバー分子に接近可能であるか否かを決定するためのプローブとしてファイバー構築体中に開発した。ノブのオープンリーディングフレームにこの配列を取り込むことによって従前に欠失させたコドンを回復した。従って、新しく生じたプラスミドｐＱＥ．ＫＮＯＢＨＩＦＬＡＧにおいて、ＦＬＡＧ暗号配列をトレオニン−５４６およびプロリン−５４７の間の挿入として導入した。次いで、このプラスミドを使用して、バクロウイルス導入ベクター中に全サイズ組換えファイバー遺伝子を構築した。野生型ファイバー遺伝子を含有する同様の導入プラスミドを対照目的で設計した。発現産物の引き続いての精製を容易とするために、アミノ末端６−Ｈｉｓタグをコードする配列を両遺伝子のデザインに導入した。次いで、これらのプラスミドを利用して、野生型Ａｄ５ファイバーおよびノブドメインのＨＩループ中にＦＬＡＧペプチドを含有するファイバー蛋白質をコードするファイバー遺伝子を含有する２つの組換えバクロウイルスを創製した。
【０１０９】
６−Ｈｉｓ−タッグド蛋白質の精製のために設計したＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにてバクロウイルス−感染昆虫細胞の溶解物から組換えファイバーを回復した。精製したファイバーの収率は１０^６感染細胞当たり１０μｇの蛋白質の範囲であった。両組換え蛋白質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は、ゲル負荷緩衝液中で沸騰すると、６３ｋＤａの予測された分子量のモノマーに解離する安定なトリマーをそれらが形成することを示した（図３Ａ）。この結果は、ノブのＨＩループへの短いペプチド配列の取込みがファイバーのトリマー化を排除しないことを示した。従って、バクロウイルス発現系を用いることによって、引き続いてのアッセイに適した、分取量の組換え細胞を得ることができる。
【０１１０】
実施例１５
トリマーファイバーの意味でのＦＬＡＧペプドの接近性
ファイバーのＨＩループに導入されたＦＬＡＧペプチドが結合用に利用できるか否かを見いだすために、ＦＬＡＧ−タッグド蛋白質と抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体を含有するアフィニティーマトリックスとの特異的相互作用に基づいたアッセイを使用した。これらの実験では、ＨＩループ中のＦＬＡＧ配列を持つ組換えファイバー蛋白質（ファイバー−ＦＬＡＧ）をＮｉ−ＮＴＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムで精製し、次いで、Ｍ２−アフィニティーゲルで免疫沈殿させた。次いで、マトリックスに結合した蛋白質をＦＬＡＧペプチドで特異的に溶出させ、ＳＤＳ含有ポリアクリルミドゲルで分析した（図３Ｂ）。この分析によると、ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質はＭ２−アフィニティーゲルに効果的に結合し、トリマーファイバー分子の意味において抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体との相互作用につきＦＬＡＧエピトープの利用可能性を示す。重要なことには、この相互作用はトリマーの安定性に影響せず、これは、ファイバーノブのＨＩループに取り込まれた新規リガンドを含有する組換えビリオンが感染の結合工程を通じて構造的統合性を維持するであろうことを示唆する。
【０１１１】
実施例１６
組換えファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質によるアデノウイルス感染阻害
ＦＬＡＧペプチドがアデノウイルスを新規細胞受容体に標的化する能力を有するか否かは知られていなかったので、ＨＩループへのこのペプチドの取込みがファイバーノブに位置した細胞結合部位の適切な折畳みに影響するか否かを判断する必要があった。ＨＩループがこの部位の形成にもし関与すれば、およびもしファイバー−ＦＬＡＧが細胞表面上のファイバー受容体に結合できれば、この組換えファイバーを含有するウイルスを救済しようとするさらなる試みは必然的に失敗するであろう。これらの論点を追求するために、ファイバー−ＦＬＡＧ組換え体蛋白質を使用してイン・ビトロ条件において感染をブロックした。この確立されたアッセイは、組換えアデノウイルスファイバー蛋白質がそれらが由来するアデノウイルスによる感染をブロックできるという事実に基づいたものであった。加えて、ウイルス感染のこの阻害は用量依存的に起こる。
【０１１２】
ホタルルシフェラーゼをレポーターとして発現する組換えＡｄ５ベクターＡｄＣＭＶＬｕｃでの感染に先立って、１２−ウェル組織培養プレートに接種したＨｅＬａ細胞を、種々の濃度の野生型Ａｄ５ファイバーまたはファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質と共にプレインキュベートした。以前は、ウイルスベクターによる遺伝子導入に基づいて、このアッセイは放射標識ウイルスで達成された古典的結合アッセイ（２４）とよく相関するデータを生じる。感染後３０時間において、細胞を溶解させ、溶解物をルシフェラーゼ活性アッセイにつき利用した（図４）。このアッセイによると、両蛋白質は用量依存的にＡｄＣＭＶＬｕｃによる感染をブロックし、感染阻害の同一プロフィールを示した。ファイバーノブのＨＩループへの異種ペプチド配列の取込みは、ファイバー蛋白質のカルボキシ末端部分によって形成された細胞結合部位の正しい折畳みに影響しない。
【０１１３】
実施例１７
ＥＬＩＳＡによるファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質の特徴付け
ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質の機能的利用性を支持するさらなる証拠を得るために、ＦＬＡＧエピトープにつき特異的ないくつかのモノクローナル抗体およびＡｄ５ファイバーの異なる立体配座を使用するＥＬＩＳＡによってこの組換え蛋白質を分析した。この目的を達成するために、昆虫細胞で発現された野生型ファイバーおよびファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質を、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ）で被覆したＨｉｓＳｏｒｂ ＥＬＩＳＡ片上に吸収させ、抗−ファイバー抗体４Ｄ２または１Ｄ６．１４または抗−ＦＬＡＧ抗Ｍ２でプローブした。抗体４Ｄ２はＡｄ５ファイバーモノマーおよびトリマーと反応し、これを本アッセイで陽性対照として用い、他方、抗体１Ｄ６．１４はファイバーノブ中の未だ同定されていない立体配座エピトープに結合し、トリマー特異的である。次いで、ＥＬＩＳＡ片をヤギ抗−マウス抗体−ＨＲＰコンジュゲートで開発した。
【０１１４】
両ファイバー蛋白質は抗−ファイバー抗体４Ｄ２および１Ｄ６．１４と効果的に反応し、それにより、ファイバー−ＦＬＡＧ分子におけるノブの３Ｄ構造が野生型ファイバーのそれと同一であることを示唆する。加えて、ファイバー−ＦＬＡＧキメラは抗−ＦＬＡＧ抗体Ｍ２と特異的に反応し、トリマーファイバー分子の意味において結合のためのエピトープの利用性が確認された。かくして、これらの結果は、Ｎｉ−ＮＴＡ−またはＭ２−アフィニティーゲル精製ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質のゲル電気泳動分析によるデータを有効なものとし、さらなる特徴付けのためにアデノウイルスビリオンへのファイバー−ＦＬＡＧキメラの取込みの合理的理由を提供する。
【０１１５】
実施例１８
Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの創製
組換えファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質で得られたデータがアデノウイルスビリオンの意味においてその機能的利用性の概念を支持したという事実にもかかわらず、組換えウイルスの成功した創製は、ファイバーノブのＨＩループの修飾のウイルス機能との適合性に関する仮説を支持する。従って、ファイバー−ＦＬＡＧキメラをアデノウイルスビリオンに取り込んだ。このウイルスを誘導するために、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞における相同ＤＮＡ組換えに基づく新規な遺伝的方法を利用した（７）。略言すれば、この方法は、細菌細胞に共形質転換された２つの線状ＤＮＡ分子の間で組換えを行って組換えアデノウイルスゲノムを含むことができる。これらの分子の１つは、細菌ベクターにクローン化され、２つのＰａｃＩ部位が近接する全サイズアデノウイルスゲノムを含有するプラスミドｐＴＧ３６０２またはその誘導体である。この組換えスキームにおける第２のパートナーは、組換えの結果として生じたアデノウイルスゲノム中でのこの構築体の局所化を指令するアデノウイルスゲノムＤＮＡの２つのセグメントが近接する注目する遺伝的構築体である。このＤＮＡ配列は、小さな組換えプラスミドにおいて遺伝子工学の方法によって修飾されたトランスジーンまたは元のＡｄ５遺伝子であり得る。
【０１１６】
ｐＴＧ３６０２によって生じた非組換えバックグラウンドを減少させるために、形質転換に先立って、最終構築体が挿入されようとしているゲノムの領域内またはその近くでこのプラスミドを制限酵素で切断した。この方法は哺乳動物細胞における相同組換えによる組換えアデノウイルスゲノムの伝統的な創製と比較して多数の利点を有するものの、それは、修飾されるべきアデノウイルスゲノムの領域内のユニークな制限部位の存在を必要とする。しかしながら、ｐＴＧ３６０２におけるＡｄ５ゲノムＤＮＡは、ファイバーの修飾につきその利用性を限定する、ファイバー遺伝子中にいずれのユニークな制限部位も含有しない。かくして、この制限を克服するために、制限エンドヌクレアーゼＳｗａＩのためのユニークな切断部位をファイバー遺伝子に挿入することによってこのプラスミドを修飾した。この目的のために、Ａｄ５ ＤＮＡに存在し、ファイバー遺伝子の５’末端から４７ｂｐ下流に位置する２つのＮｄｅＩ部位の１つを、ＳｗａＩ−リンカーの挿入によってＳｗａＩ部位に変換した（図５）。次いで、生じたプラスミドｐＶＫ５０を、ＡＤ５ゲノム中のファイバー遺伝子に隣接するウイルスＤＮＡが近接するファイバー−ＦＬＡＧをコードする遺伝子を含有するＤＮＡの断片での相同組換えで利用した。この組換えの結果、完全なアデノウイルスゲノムの内容に修飾されたファイバー遺伝子を含有するプラスミドｐＶＫ３００を誘導した。アデノウイルスＤＮＡはＰａｃＩ消化によってｐＶＫ３００から放出され、前記したごとくウイルスを救済するために２９３細胞のトランスフェクションで用いた（７）。新しく生成したウイルスのＣｓＣｌグラジエント−精製ビリオンから単離されたＤＮＡ、Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧをＰＣＲ分析およびサイクル配列決定に付して、ゲノムに取り込まれたファイバー遺伝子中でのＦＬＡＧ暗号配列の存在を確認した。両分析によると、Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧは、事実、注目するファイバー遺伝子を含有した。
【０１１７】
実施例１９
細胞結合アッセイによるＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの特徴付け
２９３細胞で増殖したこのウイルスの収率、２０７５ｃｍ^２組織培養フラスコから得られた調製当たりほぼ１０^１１ＰＦＵは、野生型Ａｄ５を増殖させた場合に通常に得られたものと匹敵した。また、ウイルスを救済する場合かあるいはそれを拡大する場合にプラーク形成の動力学に遅れはなかった。これらの観察は、ノブのＨＩループ中へのＦＬＡＧペプチドの導入が、ファイバー分子の正しい折畳みおよびその生物学的機能に有意に影響しないことを示唆した。
【０１１８】
これを証明するために、放射標識Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧを使用して、細胞表面のファイバー受容体に結合するその能力を調べた。このアッセイにおいて、¹²⁵Ｉ−標識Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧを、高レベルのＡｄ５ファイバー受容体を発現することが知られているＡ５４９ヒト肺癌腫に結合させた。バクロウイルスが発現した野生型Ａｄ５ファイバーおよびファイバー−ＦＬＡＧを細胞受容体を選択的にブロックし、ウイルス結合を阻害するコンペティターとして用いた。野生型ファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターＡｄ５ＣＭＶＬａｃＺを対照として用いた。図６および図７は、予測されるごとく、いずれかのタイプのファイバーと競合する場合、両ウイルスは同一の用量依存性を示すことを明瞭に示す。かくして、ファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質のＨＩループに異種ペプチドを取り込むと、ノブに位置する細胞結合部位の形成に対していずれの負の効果も有さず、従って、ウイルス感染性に影響しなかった。
【０１１９】
実施例２０
Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧビリオンの内容におけるＦＬＡＧ接近性
標的化リガンドのノブへの挿入が望まれるので、かかるリガンドがアデノウイルスビリオンへの取込みの後にその標的細胞表面受容体との相互作用に利用可能か否かを決定する必要があった。この目的で、Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧのファイバーに取り込まれたＦＬＡＧ配列を使用して、無傷アデノウイルス粒子におけるノブのＨＩループの接近性をテストした。これは、昆虫細胞で発現された組換えファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質におけるＦＬＡＧ接近性を評価するのに用いたのと同様のアッセイで活性された。
【０１２０】
ＣｓＣｌグラジエントで精製したビリオンをＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析し、Ｍ２−アフィニティーゲルと共にインキュベートして、ＦＬＡＧペプチドとゲルマトリックスに結合させた抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体との間の相互作用を行わせた。野生型ファイバーを含有するＡｄＣＭＶＬｕｃの同様に調製されたビリオンを本実験で陰性対照として利用した。インキュベーション後、未結合物質を含有する緩衝液を収集し、ゲルを緩衝液で洗浄して微量の遊離ウイルスを除去した。最後に、ウイルスを可溶性ＦＬＡＧペプチドでゲルから溶出させた。収集された試料のアリコットをプロテイナーゼＫで処理して、ビリオンからウイルスＤＮＡを放出させ、次いで、これをアガロースゲル電気泳動によって可視化した（図８）。予測されたごとく、ＡｄＣＭＶＬｕｃのビリオンはＭ２抗体と反応させ、未結合ウイルスを含有する画分および洗液でのみ検出された。顕著に対称的には、Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧ粒子はＭ２−アフィニティーゲルに効果的に結合した。というのはウイルスＤＮＡはＦＬＡＧペプチド溶出物に主として存在したからである。かくして、これらの発見は、無傷Ａｄ５ビリオンに取り込まれたファイバーのノブドメインのＨＩループに作成された異種リガンド配列が関連する受容体構造との相互作用のために依然として接近可能であり、それにより、これに基づいた遺伝的に標的化されたアデノウイルスベクターの創製の合理的理由を供することを確立した。
【０１２１】
実施例２１
組換え体−ファイバー−蛋白質アデノウイルスの形質導入効率
適当な対照を含む完全培地中、２×１０^５細胞ウェルの密度にて、使用した細胞系を１２−ウェル組織培養プレートに平板培養した。接種した細胞を３７℃にて一晩付着させた。第２日に、細胞を一度１×ＰＢＳで洗浄し、室温にて１０分間、１×ＰＢＳ中で２５０μｌのＰＢＳ（対照）または２５０μｌの組換えＡｄ５ノブ（１００μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートした。次いで、感染の２の多重度：各々、１ＰＦＵ／細胞または１０ＰＦＵ／細胞（４％ＰＢＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２中２５０μｌ／ウェル）にてＡｄ５ＣＭＶＬｕｃまたはＡｄ５ＬｕｃＲＧＤによって細胞を感染させた。３７℃における３０分間のインキュベーション後、ノブ溶液および感染性培地を各ウェルから除去した。ウェルを１×ＰＢＳで洗浄し、次いで、１ｍｌの新鮮な完全培地を各ウェルに添加した。細胞を４８時間培養しその時、ルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１２２】
２つの初代細胞を解凍し、１５ｍｌ遠心管に等分した。ＰＢＳノブ処理およびウイルス感染手順を懸濁液中で行った。感染細胞懸濁液を遠心した後、培地を吸引し、細胞を完全培地に再懸濁し、１２ウェルプレートのウェルに平板培養し、３７℃で４８時間インキュベートした。ルシフェラーゼ活性アッセイでは、Ａｄ−形質導入した細胞の溶解物を調製し、Ｐｒｏｍｅｇａの「Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ」についての推奨に従ってルシフェラーゼアッセイを行った。
【０１２３】
遺伝子治療用途のためのベクターとしてアデノウイルスを改良しようとする多数の試みにもかかわらず、それは依然として多数の不利に煩わされており、その１つはこのウイルスの乱雑な屈性である。新規な細胞表面受容体を標的化するアデノウイルス外皮蛋白質の遺伝的修飾は、最もラジカルであり、もし成功すれば、この制限を克服するための潜在的には最も効果的な方法である。この点に関し、ファイバー、ペントンベース、およびヘキソン蛋白質はかかる遺伝的修飾のための候補である。ペントンベース(４２、４６）ヘキソン（８、１１）の修飾は報告されているが、これらの改変は、アデノウイルスビリオンのこれらの成分の外部ドメインへの短いペプチド配列の導入に制限された。対称的に、より多数の研究がファイバー蛋白質の機能的修飾を試みた。ファイバー蛋白質を修飾しようとするこれらの試みは明らかな説明を有する：ヘキソンおよびペントンベース蛋白質とは対照的には、ファイバー蛋白質はウイルス等その同族細胞受容体との主たる相互作用を媒介し、従って、ウイルスの屈性を指令する。加えて、その竿−様構造のため、該ファイバーは最適にはその構造に作成された新規な結合リガンドを露出させ、かくして、別の細胞受容体への効果的な結合を供する。かくして、細胞結合部位を通常は含有するファイバーのカルボキシ末端ノブドメインに対する改変はウイルス屈性を修飾することに対する論理的アプローチである。
【０１２４】
このアイデアが元々使用された時点以来（３１）、研究者のいくつかのグループがその利用性を証明した。この目的で、キメラＡｄ５−Ａｄ３（２５、３７）ファイバーを含有する組換えアデノウイルスが誘導され、機能的ファイバーキメラを創製する可能性を示す。加えて、ファイバーのノブドメインを置き換えることによってウイルスの受容体特異性を改変できることが示された。さらに、Ｗｉｃｋｈａｍら（４５）は、ファイバーポリペプチドへのカルボキシ末端ポリリシン配列の負荷の結果、アデノウイルスベクターの拡大された屈性となることが示された。最近、カルボキシ−末端ガストリン放出ペプチド（３０ａ）ソマトスタチン、Ｅ−セレクチン結合ペプチドおよび６−Ｈｉｓ配列（２４ａ）を含有するファイバーを持つ組換えアデノウイルスが創製された。しかしながら、これらの努力のいずれもアデノウイルスベクターの天然屈性を排除することには関係しなかった；これらのアプローチでは、ベクターの予め存在する天然屈性とは区別される新規な屈性が作成された。
【０１２５】
最近まで、再度標的化されたアデノウイルスベクターの現実的な設計を達成する能力は２つの主要な問題：ファイバーノブドメインの構造の知識の欠如およびアデノウイルスゲノムにおけるファイバー遺伝子の操作の困難性によって制限された。この点に関しＸｉａら（４７，４８）によるＡｄ５ファイバーノブの３Ｄモデルの公表およびＣｈａｒｔｉｅｒら（７）による遺伝的方法の開発（これは、アデノウイルスゲノムの実質的にいずれの領域の修飾も可能とする）は、ファイバーのノブドメインに対する改変を介してアデノウイルスを再標的化する努力を促進する。現在の研究は、組換えアデノウイルスゲノムを創製し、新規なペプチドリガンドを含有する修飾されたファイバーを持つアデノウイルスベクターを誘導するユニークな試みである。
【０１２６】
本発明の方法は、異種ペプチド配列の取込み用の部位としてのファイバーノブのＨＩループの利用を記載する。Ａｄ５ファイバーノブの３ＤモデルによるとＨＩループは、そのトリマー立体配置を安定化させ、受容体結合部位の形成には関与しないノブ内での相互作用に寄与しない。重要なことには、その主要な配列における親水性アミノ酸残基の優位性のため、ＨＩループはノブの外側に露出され、それにより、潜在的リガンドと細胞受容体との相互作用を容易にする。
【０１２７】
この概念の証明のため、ＦＬＡＧ暗号配列をＨＩループに対応するファイバー遺伝子の領域に取り込み、この修飾された遺伝子をバクロウイルス感染昆虫細胞で発現させた。該デザインに取り込まれたアミノ末端の６−Ｈｉｓタグを、組換えファイバー蛋白質の単純なクロマトグラフィー精製で使用した。この全サイズファイバーのバクロウイルス−指向性発現は効果的であり、トリマー−特異的抗−ファイバーモノクローナル抗体でのゲル分析およびＥＬＩＳＡによると、発現の産物はトリマーであった。
【０１２８】
昆虫細胞で生成されたファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質をさらに特徴付けるため、ファイバートリマーの内容におけるＦＬＡＧ接近性を証明した。ＦＬＡＧ−タッグド蛋白質と抗−ＦＬＡＧモノクローナル抗体を含有するＭ２−アフィニティーゲルとの特異的相互作用に基づくアッセイを使用した。この分析により、ＦＬＡＧペプチドがトリマーノブの表面に局所し、結合で利用でき、それにより、ＨＩループの表面局所化についての仮説を支持することが確認された。アデノウイルス感染をブロックするためにファイバー−ＦＬＡＧキメラを使用することによって、ノブのＨＩループへのＦＬＡＧペプチドの挿入はノブに極在する細胞結合ドメインの正しい折畳みに影響しないことも示された。これは、細胞受容体への結合に関与すると仮定される（４７，４８）β−ストランドＨおよびＩをＨＩループが結合することを考慮する重要な発見である。
【０１２９】
アデノウイルスビリオンにファイバー−ＦＬＡＧキメラを取り込むために、最近記載された方法（７）を用いることによって組換えアデノウイルスゲノムを創製した。この目的を達成するために、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅから得られたマスタープラスミドｐＴＧ３６０２を修飾して、アデノウイルスゲノム中のファイバー遺伝子の修飾を大いに促進するベクターが発見された。このプラスミドを用いることによって、組換え体ゲノムを創製し、注目するウイルスＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧを救済した。重要なことには、この新しいウルスは高収率で産生され、野生型Ａｄ５と同一の感染の動力学を示した。Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの成功した救済、ならびにビリオンの引き続いての特徴付けにより、バクロウイルス−感染昆虫細胞で発現されたファイバー−ＦＬＡＧ蛋白質で得られた結果に基づく結論が確認され、それによりバクロウイルスをさらなるファイバー−モデリング実験のための選択された発現系とする。
【０１３０】
該概念をさらに証明するために、ＲＧＤペプチド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１６））暗号配列をＨＩループ内ファイバー遺伝子の領域に取り込み、アミノ酸ＴＬＮＧＴＱＥＴＧＤＴＴＰ（配列番号１７）を置き換える。ＲＧＤペプチドはインテグリンに対して親和性を有する。アデノウイルスビリオンにファイバー−ＲＧＤキメラを取り込むために、最近記載された方法（７）を用いることによって組換えアデノウイルスゲノムを創製した。ＲＧＤペプチドは、αｖβ５およびαｖβ３を含めた種々のタイプのインテグリンの公知のリガンドである（Ｒｕｏｓｌａｂｔｉ， Ｅ． １９９６ ＲＧＤ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ， Ａｎｎｕ． ＲｅＶ．Ｃｅｌｌ． Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．１２：６９７−７１５）。ＨＩループ内にＲＧＤペプチドを含有するアデノウイルスを、卵巣癌細胞系および初代卵巣癌細胞を感染させるその能力につきテストした。ＲＧＤペプチドを含有するアデノウイルスは卵巣細胞系および初代卵巣癌細胞を共に感染することが見いだされ、野生型アデノウイルスはそうすることは不可能である。さらに、ＨＩループ内にＲＧＤペプチドを含有するアデノウイルスを、２９３細胞を感染させるその能力につきテストした。修飾されたアデノウイルスはこれらの細胞を感染させることができず、他方、野生型アデノウイルスは感染した。かくして、ＨＩループの挿入および置換は新規な屈性を導入すると共に野生型屈性を排除した。
【０１３１】
本発明は、ファイバーノブのＨＩループが、遺伝子治療適用のためにアデノウイルスベクターを標的化するのに首尾よく利用することができる異種ペプチドリガンドの取込みのための便宜な部位であることを示す。ノブにおけるこの位置は、代替部位をして、あるいはファイバー蛋白質のカルボキシ−末端修飾に加えて使用することができ、いくつかリガンド配列の適切な生物学的機能に必要であり得るユニークなループ−様環境を提供する。例えば、この構造は、ジスルフィド架橋を形成する２つのシステイン残基が近接するランダムペプチド配列を含有するファージディスプレイライブラリーから得られたペプチドリガンドで役に立ち得る（２３，２４）。加えて、ループ−様立体配置を持つリガンドは、ファイバーのカルボキシ末端に位置するリガンドよりも細胞カルボキシペプチダーゼによる分解に対して感受性は低くなり得る。リガンド取込みのためのＨＩループの十分な能力を実現するためには、この位置において異なる標的化部位を含有する組換えアデノウイルスを作成することができる。ノブのＨＩループに取り込まれた標的化リガンドを持つファイバーを含有する組換えアデノウイルスの創製は、遺伝子治療適用のための改良されたアデノウイルスベクターに向けての努力を促進するであろう。アデノウイルスの精製のための新規方法の開発は焦点ではなかったが、結合実験におけるＦＬＡＧエピトープの成功した使用は、このまたは同様の精製タグをアデノウイルスビリオンに取り込んでその精製を容易とすることができることを示唆する。この単純な精製技術は、超遠心または高圧液体クロマトグラフィー系のごとき高価な実験設備を必要とせず、要すれば容易にスケールアップすることができる。
【０１３２】
実施例２２
アデノウイルス−媒介遺伝子導入アッセイ
細胞系を利用するアデノウイルス−媒介形質導入実験は前記したごとくに行った。卵巣癌患者から得た腹水からの初代細胞を以下のごとくにこの分析のために調製した。まず、試料中に存在する赤血球細胞を、１５０ｍＭ／ＮＨ_４Ｃｌ、１ｍＭ ＫＨＣＯ_３および０．１ｍＭ Ｎａ_２ＥＤＴＡを含有する緩衝液の添加によって溶解させた。次いで、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ （Ｍｅｄｉａ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｈａｒｅｄ Ｆａｃｉｌｉｔｙ， ＵＡＢ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， Ａｌ．）の段階グラジエントでの低速遠心によって生細胞から細胞夾雑物および死細胞を分離した。１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）、１００単位／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコの修飾イーグル培地／Ｆ１２ （ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（Ｃｅｌｌｇｒｏ， Ｈｅｒｎｄｏｎ， ＶＡ）で細胞を２回洗浄した。¹²⁵Ｉ−標識アデノウイルスの２９３、ＨＵＶＥＣまたはＲＤ細胞の結合をアッセイした。
【０１３３】
実施例２３
ファイバー−ＲＧＤ蛋白質はＲＧＤトリペプチドを介してインテグリンと相互作用する
前記で示されたごとく、Ａｄ５ファイバーのＨＩループに取り込んだＦＬＡＧオクタペプチドはノブに局所する細胞−結合部位の正しい折畳みに干渉せず、免疫沈殿アッセイにおいてＦＬＡＧ−特異的抗体への結合に利用できる。アデノウイルス再標的化の目的でこれらの知見を利用するために、哺乳動物細胞の表面に存在するいくつかのタイプのインテグリンに高い親和性を持って結合することが知られているＲＧＤ−４Ｃペプチド、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号１６）をファイバーノブのＨＩループに導入した。ファイバー−ＲＧＤ／インテグリン相互作用を利用することによって細胞に結合することができるであろうアデノウイルスベクターを生じさせる試みにおいてこの努力を行った。従って、かかるウイルスによる感染は、細胞膜上のＣＡＲ受容体の存在に依存しないであろう。
【０１３４】
このため、ファイバー蛋白質、ファイバー−ＲＧＤを含有するＲＧＤ−４Ｃをバクロウイルス発現系で発現させて、標的化機能を行うその能力に関して蛋白質を特徴づけた。アミノ末端６Ｈｉｓタグをコードする配列をファイバー−ＲＧＤ遺伝子に取り込んで、生成物の下流精製を促進した。
【０１３５】
ＩＭＡＣ−精製ファイバー−ＲＧＤ蛋白質の電気泳動は、該ファイバーが、ビリオン組立ての間にファイバーとペントンベースとの会合に非常に重要であることが知られている。その天然トリマー構造を保持することを示した（データは示さず）。ファイバー−ＲＧＤがインテグリンに結合する能力を評価するために、精製されたインテグリンαｖβ３を利用するＥＬＩＳＡアッセイでこのファイバー蛋白質を使用した。このアッセイは、陰性対照として使用した野生型ファイバー蛋白質とは対照的に、ファイバー−ＲＧＤは非常に効果的にαｖβ３インテグリンに結合することを示した（図１３）。従って、これらの実験は、修飾されたファイバーの機能的利用性を確認し、かかるファイバーを含有する組換えアデノウイルスの創製のための合理的理由を供した。
【０１３６】
該ウイルスはＣｈａｒｔｉｅｒらによって記載されている方法によって誘導された。下流遺伝子導入アッセイを単純化するために、サイトメガロウイルスプロモーターによって駆動されたホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する発現カセットをアデノウイルスゲノムのＥ１領域の代わりに導入した。プラスミドｐＶＫ５０と、各々、ファイバー遺伝子およびアデノウイルスＤＮＡ配列に近接したルシフェラーゼ発現カセットを含有する、２つのシャトルベクターｐＮＥＢ．ＰＫ．ＦＨＩＲＧＤおよびＰＡＣＣＭＶ．ＬｕｃΔＰＣから単離されたＤＮＡの断片との間の相同ＤＮＡ組換えを利用する２工程プロトコルを介して、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤと命名された新しいウイルスのゲノムをＥ． ｃｏｌｉで生じさせた。
【０１３７】
この方法の利用は、プラスミド骨格からＡｄ５ＤＮＡの逆位末端反復（ＩＴＲ）を放出するのに、新しく生じたアデノウイルスゲノムを含有する得られた組換えプラスミドの制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩでの消化を要する。この方法の意味において内部ＰａｃＩ部位を含有するホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いることができるために、当該遺伝子にサイレント突然変異を導入することによってこの部位を排除した。次いで、前記ＤＮＡ組換えの結果として得られたプラスミド、ｐＶＫ７０３を２９３細胞のトランスフェクションのために利用して、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤを救済した。ウイルスの同一性は、ＰＣＲによって、ならびにＡｄ５ｌｕｃＲＧＤのＣｓＣｌ−精製ビリオンから単離したウイルスＤＮＡのサイクル配列決定によって確認した。
【０１３８】
Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤのファイバーに取り込まれたＲＧＤトリペプチドの接近性を証明するために、精製されたファイバー蛋白質につき従前に使用されたものと類似のＥＬＩＳＡアッセイでこのウイルスを利用した。この分析は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤの固定化された粒子へのαｖβ３でインテグリンの効果的な結合を明瞭に示し、他方、対照ウイルスに対するαｖβ３の結合は使用したインテグリンの全ての濃度においてバックグラウンドレベルにおけるものであった（図１４）。これらの結果に基づき、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤはイン・ビトロおよびイン・ビボで種々のタイプのＲＧＤ−結合インテグリンと相互作用することができ、それにより、標的細胞に付着するために感染の初期工程でこの相互作用を利用するようである。
【０１３９】
実施例２４
Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤはＣＡＲ−非依存性遺伝子送達を媒介することができる
次に、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤのファイバーへのＲＧＤ−モチーフの導入の結果、細胞に感染するこのウイルスの能力に関して何らかの変化が生じるか否かを調べた。Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤによって利用された感染経路を調べるために、種々のレベルのＣＡＲならびにインテグリンαｖβ３およびαｖβ３を発現するいくつかの細胞系への遺伝子導入のためにこのウイルスを使用した。このため、２９３ヒト腎臓細胞、ヒト臍帯内皮細胞、ＨＵＶＥＣ，およびヒト胚性横紋筋肉腫細胞、ＲＤを含めた細胞系のパネルを一連のフローサイトメトリーアッセイで使用した。２９３細胞は容易にアデノウイルス感染を指示し、ＨＵＶＥＣはあまりアデノウイルスに結合しないが、他方、ＲＤ細胞におけるＣＡＲ発現は継代依存性である。
【０１４０】
フローサイトメトリーアッセイは、２９３細胞が高レベルのＣＡＲ（図１５）およびαｖβ３インテグリンを発現するが、αｖβ３の発現は中程度である（図１６）ことを示した。ＨＵＶＥＣは中程度のレベルのＣＡＲ発現を示し（図１７）、他方、インテグリンはかなり多量に細胞表面に存在した（図１８）。横紋筋肉腫細胞ＲＤはＣＡＲ−陰性であり（図１９）、他方、高いαｖβ３および中程度のαｖβ３発現体であった（図２０）。従って、引き続いての遺伝子導入実験では、その細胞質膜に存在する中ないし高レベルのインテグリンαｖβ３およびαｖβ３を有しつつ、全範囲のＣＡＲ発現プロフィールをカバーする細胞系の組が確立した。次いで、ＣＡＲ受容体へのウイルス結合を効果的にブロックすることが知られている、組換えＡｄ５ファイバーノブ蛋白質によるアデノウイルス−媒介遺伝子送達の競合阻害に基づくアッセイでＡｄ５ｌｕｃＲＧＤを利用した。
【０１４１】
図２１Ａで示されるごとく、対照ウイルスＡｄＣＭＶＬｕｃによって媒介される２９３細胞におけるルシフェラーゼ発現は組換えノブ蛋白質によって効果的にブロックされた。使用した感染多重度に応じて、ノブ蛋白質はＡｄＣＭＶＬｕｃ−形質導入細胞においてルシフェラーゼ活性の８５％ないし９３％をブロックした。
【０１４２】
顕著に対照的に、同一濃度のノブは、２９３細胞においてＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ−媒介遺伝子発現の４０％ないし６０％のみをブロックすることができ、それにより、野生型Ａｄ５によって利用されるよく特徴づけられたファイバー−ＣＡＲ相互作用に加えて、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤは別のＣＡＲ−非依存性細胞エントリー経路を用いることができることを示す。注目すべきことには、細胞結合のその代替メカニズムの寄与はかなり重要であり、２９３細胞への総じての遺伝子導入の４０％ないし６０％を提供する。
【０１４３】
Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤに向けられた遺伝子送達の現象をさらに調査するために、同一戦略を用いてＨＵＶＥＣの形質導入を調べた。これらの細胞は野生型ファイバーを含有するアデノウイルスベクターで形質導入するのが比較的困難である。これらの知見は、ＨＵＶＥＣにおけるＣＡＲ発現の中程度のレベルを示すフローサイトメトリーデータと一致した。重要なことには、これらの細胞で検出されたむしろ高いレベルのαｖβ３およびαｖβ３インテグリンは、ＨＵＶＥＣがＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで容易に形質導入されるべきであることを示唆した。いずれかのウイルスによって媒介されるＨＵＶＥＣ細胞におけるルシフェラーゼ活性のレベルは２９３細胞におけるものよりもかなり低かったが、実験は、これらの２つのウイルスによって示された形質導入プロフィールの間の驚くべき差異を明らかとした（図２１Ｂ）。まず、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤ−トランスフェクト細胞におけるルシフェラーゼ発現はＡｄＣＭＶＬｕｃで形質導入された細胞におけるよりも３０倍高かった。第２に、ＡｄＣＭＶｌｕｃ−媒介形質導入に対するＡｄ５ファイバーノブの効果は２９３細胞での実験におけるよりも劇的ではなく、ＨＵＶＥＣにおけるＣＡＲの相対的欠如と合致した。最も重要には、組換えノブ蛋白質がＡｄ５ｌｕｃＲＧＤによって指示されたルシフェラーゼ発現のレベルに対して阻害効果を有しなかった。
【０１４４】
次いで、非常に似た結果が、ＣＡＲ受容体を発現しないＲＤ細胞で生じた。ＡｄＣＭＶｌｕｃ−形質導入ＲＤ細胞の溶解物で検出されたルシフェラーゼ活性は極端に低く：１ｐｆｕ／細胞の感染多重度においては、それはモック−感染細胞で得られたバックグラウンド読みとほとんど同等であった（図２１Ｃ）。再度、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤは、ＡｄＣＭＶＬｕｃによって媒介されたものよりも１６ないし４７倍高いトランスジーン発現のレベルを指令することができた。この発現はファイバーノブによる阻害に応答性はなかった。これらの実験は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤのファイバーへのＲＧＤ−４Ｃペプチドの取込みの結果、恐らくは、代替細胞付着経路を創製することによって、ウイルス−対−細胞相互作用の初期段階において劇的な変化がもたらされることを明瞭に示した。
【０１４５】
実施例２５
Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤはＲＧＤ／インテグリン相互作用の利用により細胞結合の効率を増加させた
Ａｄ５ＣＭＶｌｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤが遺伝子送達の異なる効率ならびに形質導入のファイバーノブ−媒介阻害の異なるプロフィールを示すことが確立されたので、これらの２つのウイルスの細胞結合プロフィールを比較した。この論点に向けるため、両方のウイルスを¹²⁵Ｉで標識し、２９３、ＨＵＶＥＣおよびＲＤ細胞でのウイルス結合アッセイで使用した。このアッセイを、ウイルスを細胞に結合させるがウイルスの内部化を妨げる条件下（４℃）で行った。
【０１４６】
図２２に示すごとく、ＣＡＲ−陽性２９３細胞でのＡｄ５ｌｕｃＲＧＤおよびＡｄ５ＣＭＶｌｕｃによって示された結合効率は同様であり、他方、ＨＵＶＥＣおよびＲＤ細胞に結合した標識Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤビリオンのパーセンテージはＡｄ５ＣＭＶｌｕｃビリオンのものよりもかなり高かった。ファイバー分子内にＲＧＤ−含有ペプチドを取り込む目標はウイルスが代替受容体として細胞インテグリンを利用することを可能としたので、アッセイを行い、ここに、細胞への放射標識ウイルスの結合を組換えＡｄ２ペントンベース蛋白質存在下で達成した。その分子内で同定された高度に移動性のループ突出におけるＲＧＤモチーフの存在のため、ペントンベースはαｖβ３およびαｖβ３インテグリンに結合することができ、従って、これらの細胞受容体への結合につきＲＧＤ−モチーフを含有する他の分子またはマクロ分子複合体と競合する。
【０１４７】
２９３細胞へのウイルスの結合をアッセイすると（図２３Ａ）、ペントンベース蛋白質はいずれのウイルスの細胞結合も阻害しなかった。ファイバーノブ蛋白質は単独でならびにペントンベースと一緒になって、Ａｄ５ＣＭＶｌｕｃの９４％およびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ結合の７５％をブロックした。ＨＵＶＥＣ細胞で行った同一実験は、再度、ノブ蛋白質がＡｄ５ｌｕｃＲＧＤビリオンのそれよりもかなりＡｄ５ＣＭＶｌｕｃ粒子の結合を阻害したことを示した（図２３Ｂ）。加えて、ペントンベースは２５％だけこれらの細胞に結合したＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ−関連放射能を減少させることができ、他方、Ａｄ５ＣＭＶｌｕｃ結合に対する効果はわずかであった。一緒に用いると、両ブロッキング剤はＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ結合において４０％減少を引き起こした。同様の結果が、これらのウイルスをＲＤ細胞での結合アッセイで使用した場合に得られた。ペントンベースは対照ウイルスの結合をノブ蛋白質がブロックしたのと同程度に効率的にＡｄ５ｌｕｃＲＧＤのＨＵＶＥＣ細胞への結合をブロックしなかったが、インテグリン特異的阻害剤としてのその利用は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤが感染プロセスの間に代替受容体として細胞インテグリンを使用することができたのを示した。
【０１４８】
実施例２６
卵巣癌細胞へのＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ媒介増強遺伝子導入
直接的イン・ビボ遺伝子送達を介して癌患者を治療するためにアデノウイルスベクターを利用する多数の臨床的トライアルは途中であるので、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤの拡大された屈性がそれをこのタイプの臨床的適用で有用なものとするか否かを調べた。まず、遺伝子を培養されたヒト卵巣癌細胞に送達するこの組換えベクターの能力を調べた。フローサイトメトリーによる２つの細胞系ＳＫＯＶ３．ｉｐｌおよびＯＶ−４の特徴付けは、それらが共に中ないし高レベルのインテグリンαｖβ３およびαｖβ３を発現し（図２５および２７）、ＳＫＯＶ３．ｉｐｌが高レベルのＣＡＲを発現し（図２４）、他方、ＯＶ−４は中程度のＣＡＲ発現体である（図２６）ことを示した。
【０１４９】
ＳＫＯＶ３．ｉｐｌおよびＯＶ−４を利用する遺伝子導入実験は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤビリオンへの組換えＲＧＤ−含有ファイバー蛋白質の取込みが、これらの遺伝子を効果的に形質導入するウイルスの能力を劇的に改良したことを示した（図２８Ａ）。テストした異なる感染多重度では、ＳＫＯＶ３．ｉｐｌ細胞のＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ−形質導入培養が対照ウイルスで形質導入した細胞と比較してルシフェラーゼ活性の３０ないし６０倍増加を示した。興味深いことには、ファイバーノブはＡｄ５ＣＭＶｕｃ−媒介遺伝子導入の９０％を超えてブロックしたが、それはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ−処理細胞ではルシフェラーゼ活性の１５ないし２０％のみをブロックできた。
【０１５０】
これらの２つのウイルスベクターによって示された形質導入効率の差異は、ＯＶ−４細胞を使用した場合、３００ないし６００倍大きかった（図２８Ｂ）。前記したごとく、ＣＡＲ−媒介細胞エントリーの阻害剤として使用したファイバーノブはＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ−媒介遺伝子送達に対していずれの有意な効果も有さず、これは、ウイルスがＯＶ−４細胞に結合するのにＲＧＤ−インテグリン相互作用を主として利用することを強く示唆する。
【０１５１】
次に、ヒト卵巣癌初代細胞の意味におけるＡｄ５ｌｕｃＲＧＤベクターの利用性を評価した。この点に関し、最近のヒト臨床トライアルは種々のモデル系におけるおよび臨床的意味におけるアデノウイルスベクターの効率の間の不一致を強調し、他方、むしろ低い形質導入効率が記載されている。これらの知見は、癌遺伝子治療戦略の治療指標を増大する一般的アプローチとしてのベクターデザインを改良する必要性を示唆する。インテグリンは種々の上皮腫瘍によって頻繁に過剰発現されることが示されているので、これらの細胞表面受容体に標的化されるベクターはＣＡＲ−非依存性遺伝子導入を達成する手段を提供することができる。
【０１５２】
実験において、２人の患者から得られた卵巣癌細胞を、ブロッキングノブ蛋白質の存在下または不存在下でＡｄ５ｌｕｃＲＧＤおよびＡｄ５ＣＭＶＬｕｃで処理した。得られた結果は、培養細胞で生じた以前の知見を確証した。注目すべきことには、ＡｄＣＭＶＬｕｃで処理した細胞の溶解物でのルシフェラーゼの読みは極端に低く（図２９Ａおよび２９Ｂ）、それにより、未修飾ファイバーを含有するアデノウイルスベクターが卵巣癌細胞を効果的に感染できないことを示す。ＡｄＣＭＶＬｕｃ−媒介ルシフェラーゼ発現に対するファイバーノブによる強力な阻害は、ファイバー−ＣＡＲ相互作用が、このウイルスを用いてこのタイプの細胞を感染することができる唯一の経路であることを示唆する。顕著に対照的に、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤは、トランスジーン発現のレベルを、ＡｄＣＭＶＬｕｃ−形質導入細胞で検出されたものよりも高い２ないし３オーダーの大きさに指令した。ノブは１ｐｆｕ／細胞の感染多重度にて遺伝子導入の２０％をブロックし、１０ｐｆｕ／細胞の感染多重度では効果が観察されなかった。かくして、ＣＡＲ−非依存性経路を介する遺伝子送達の有意な増強を達成する能力は、効果的な腫瘍形質導入のためのアデノウイルスベクターの遺伝的標的化の一般的利用性を示唆する。
【０１５３】
実施例２７
遺伝的に修飾されたアデノウイルスを介するヒト卵巣癌細胞系に対するベクター−媒介遺伝子導入
ヒト卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ３．ｉｐｌ、ＣａＯＶ−３およびＵＣＩ−１０１をＡｄ５ｌｕｃＲＧＤまたはＡｄ５ＣＭＶＬｕｃいずれかで感染させた。これらの遺伝子導入実験において、ルシフェラーゼ活性の劇的な増加が修飾されたＲＧＤ Ａｄベクターで認められた（図３０〜３２）。３×１０^５および３×１０^６ＰＦＵにおいて、ＳＫＯＶ３．ｉｐｌ細胞のＡｄ５ｌｕｃＲＧＤ−感染培養は、対照ウイルスで感染させた細胞と比較して、ルシフェラーゼ活性で４．７および７．６倍増加を示した。ＣａＯＶ−３細胞では、２４４．２および４７１．６倍の増加が観察され、ＵＣＩ−１０１細胞では増加は２．５および４．２倍であった。
【０１５４】
遺伝子導入のこれらの増加したレベルのメカニズムを決定するために、天然エントリー経路を介するアデノウイルス内部化のブロックを、組換えファイバーノブ蛋白質でのインキュベーションによって達成した。細胞へのベクターの結合と過剰のノブ蛋白質との競合は、ＳＫＯＶ３．ｉｐｌ細胞におけるＡｄＣＭＶＬｕｃ−媒介ルシフェラーゼ活性の８２％および９１％をブロックした。しかしながら、対照的には、この策略はＡｄ５ｌｕｃＲＧＤルシフェラーゼ活性の２７％および３９％をブロックしたに過ぎなかった。これらの結果は、一緒にすると、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤベクターが感染のための別の細胞エントリー経路を利用することを示す。ＡｄＣＭＶＬｕｃルシフェラーゼ活性の５５％が３×１０^６ＰＦＵの用量でのファイバーノブブロックで観察されたが、ＣａＯＶ−３細胞を、３×１０^５ＰＦＵの用量での有意なブロッキングを観察するのに余りにも低いレベルで感染された。比較すると、ルシフェラーゼ活性の０．１％および４２％ブロックが、各々、３×１０^５および３×１０^６ＰＦＵのＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの用量での感染後に観察された。また、ＵＣＩ−１０１培養は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤ−コードのルシフェラーゼ活性の２８％および３９％のかなり小さい減少と比較して、ファイバーノブブロックによるＡｄＣＭＶＬｕｃルシフェラーゼ活性の９４％および９７％減少を示した。かくして、ＣＡＲ−非依存性遺伝導入の結果、ヒト卵巣癌細胞への遺伝子導入の劇的な増加がもたらされた。
【０１５５】
実施例２８
遺伝的に修飾されたアデノウイルスを介するヒト卵巣腹水試料へのベクター−媒介遺伝子導入
本ベクターを、より臨床的に関連するヒト卵巣腹水試料でテストした（Ｓｔｅｒｍａｎら， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ９：１０８３， １９９８）。この点で注目すべきことには、インテグリンはいくつかの上皮腫瘍によって過剰発現されることが示され（Ｋｅｅｌｙら， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ８：１０１， １９９８；Ｓａｎｄｅｒｓら， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．， １６：３２９， １９９８：Ｌｉａｐｉｓら， Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ． ２８：４４３， １９９７：Ｎａｔａｌｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５７：１５５４， １９９７；Ｐｉｇｎａｔｅｌｌｉら， Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ． ２３：１１５９， １９９２）、ＲＧＤモチーフを介するこれらの受容体の開発を、かなり効果的なＣＡＲ−非依存性遺伝導入を容易とする活動的な別の経路とする。
【０１５６】
卵巣癌腹水試料を、３×１０^５および３×１０^６ＰＦＵの用量のＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤベクターで感染させ、試料のサブセットはブロッキングファイバーノブを摂取した。これらの感染の結果は、培養した細胞系実験で見いだされたものと同様であった（図３３、３４）。ＡｄＣＭＶＬｕｃ感染細胞のルシフェラーゼ活性は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤ感染細胞と比較して極端に低かった。腹水試料＃１におけるルシフェラーゼ活性の増加のレベルは、各々、６４および５０倍、４４および２６．１％の腹水試料＃２であった。ＡｄＣＭＶＬｕｃによって誘導されたルシフェラーゼ活性は、過剰のファイバーノブの存在下で９０％だけブロックされ、再度、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤによる遺伝子送達の有意な増強がＣＡＲ−非依存性細胞エントリー経路を介して観察されることを示唆した。従前の研究（Ｄｍｉｔｒｉｅｖら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７２：９７０６， １９９８）において、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤでの遺伝子導入の同様の増加が卵巣癌細胞に対して示された。しかしながら、本研究で認められた増加の大きさは異なる患者に由来する初代組織の間の差異を反映し得る。加えて、先に凍結させた細胞を前者の研究で用い、他方、新鮮な細胞をここに記載する実験で用いた。両研究の結果は、臨床的に関連する組織試料における別の細胞エントリー経路を介するアデノウイルス−媒介遺伝子導入の有意な増強に適合する。
【０１５７】
実施例２９
初代卵巣腫瘍外植体に対するアデノウイルスベクター媒介遺伝子導入
臨床的使用のためのベクター効果スコアの有効性を確立するための最もストリンジェントな実験基質は、遺伝子導入に対するその合致する高い困難性を仮定すると、新鮮な外植体である。この点に関し、３つの新鮮な初代卵巣腫瘍試料を、ブロッキングファイバーノブでの３×１０^５および３×１０^６ＰＦＵの用量でＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで感染させた。再度、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤベクターは、ＡｄＣＭＶＬｕｃベクターと比較して、増大したルシフェラーゼ活性を生じた（図３５）。腫瘍＃１試料は、各々、示されたＡｄの用量にて１１．１倍および５．７倍の増強されたルシフェラーゼ活性を有した。腫瘍＃２はルシフェラーゼ活性において１．６倍および２．４倍の増加を示し，腫瘍＃３は３．６倍および５．３倍の増加を有した。ファイバーノブはＡｄＣＭＶＬｕｃ感染事象の大部分をブロックしたが、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤ感染をわずかにブロックしたのみであり、これは、遺伝子導入効率において観察された増加の基礎をＣＡＲ−非依存性遺伝子導入が提供することを確認する。かくして、高レベルのストリンジェンシーでのこの短期間培養系において、遺伝子導入の有意な増加が認められた。
【０１５８】
実施例３０
中皮組織試料へのアデノウイルスベクター媒介遺伝子導入
正常組織と比較した腫瘍組織を形質導入するベクターの効率の分析は、ヒト臨床的使用に関連し得る感染の差異について情報を与えるはずである。この点に関し、ヒトにおける特性および効率は、腫瘍および非腫瘍組織の間の異なるベクター感染性で予測されるであろう。従って、良性婦人科学疾患につき操作した患者から得られた４つの中皮組織試料を、感染をブロックするファイバーノブを用い、３×１０^５および３×１０^６ＰＦＵの用量にてＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで感染させた。興味深いことには、中皮組織試料はＡｄ５ｌｕｃＲＧＤベクター（図３６）およびＡｄＣＭＶｌｕｃ双方にて低いルシフェラーゼ活性を発現した。これらのデータは、正常組織遺伝子導入に対する腫瘍での好都合な比率はこの新規なアデノウイルス遺伝子導入ベクターの治療指標を改良するであろうことを示唆する。
【０１５９】
実施例３１
ヒトＳＣＣＨＮ細胞系へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入
その高いイン・ビボ効率に基づき、アデノウイルスベクターは種々の癌遺伝子治療アプローチで使用されてきた（Ｈｕｂｅｒ＆Ｌａｚｏ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ， Ａｎｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｖｏｌ７１６）。それにも拘わらずヒトトライアルにおける用量関連毒性および貧弱なイン・サイチュ形質導入率は、その現在の形態において、アデノウイルスベクターがこの適用では最適下であり得る（Ｒｏｔｈ＆Ｃｒｉｓｔｉａｎｏ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔ． ８９：２１， １９９７）。この論点を追求するために、本発明者らは、この病気におけるその有用性のゲージとしてヒトＳＣＣＨＮ系につきアデノウイルスベクターの効率を評価した。これらの実験では、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードする複製欠陥アデノウイルスベクターＡｄＣＭＶＬｕｃを使用した。１０粒子／細胞の固定化された感染多重度にてウイルスベクターを培養中の細胞に送達し、４８時間後、細胞をルシフェラーゼ遺伝子発現につき評価した。加えて、組換えファイバーノブ蛋白質の存在下で平行実験を行った。この戦略はアデノウイルベクターのその標的受容体ＣＡＲとの相互作用のブロックを達成し、観察された遺伝子導入がそのＣＡＲ経路を介して媒介される程度の指標を与える。対照として、高度に感染性ヒト細胞系ＨｅＬａを使用した。
【０１６０】
これらの実験において対照ＨｅＬａ細胞系は、予測されたごとく、アデノウイルスベクター−媒介遺伝子送達に対して高度に感受性であった。しかしながら、注意すべきは、ヒトＳＣＣＨＮ細胞系は対照ＨｅＬａ細胞よりもアデノウイルスベクター−媒介感染に対してかなり感受性が低かった（図３７）。この点に関し、ＦａＤｕについての観察されたルシフェラーゼ活性は４．８×１０^５であり、ＳＣＣ−２５では６．９×１０^５ＲＬＵ／ｍｇ蛋白質であった。これらのレポーター遺伝子の大きさは、ＨｅＬａにつき観察されたレベルの、各々、４．０％および５．７％であった。ＳＣＣＨＮ細胞系ＳＣＣ−４はわずかに高い程度の感受性を呈し、ＨｅＬａにつき観察されたものの３８％であるルシフェラーゼレベルを示した。ノブ競合で行った実験は、ＨｅＬａ細胞およびＳＣＣＨＮ細胞系双方の場合において９０％を超えるブロックを呈した。かくして、形質導入の観察されたレベルはＣＡＲ−依存性経路を介して達成された。これらの実験に基づき、ＳＣＣＨＮ細胞はアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入に対してＨｅＬａよりも感受性がかなり低いようであった。さらに、これらの実験は、ヒトＳＣＣＨＮ系のアデノウイルスベクター感染に関与する主要な細胞因子が主要なアデノウイルス受容体ＣＡＲであることを示唆した。
【０１６１】
遺伝的に修飾されたアデノウイルス、ルシフェラーゼ遺伝子をコードするＡｄ５ｌｕｃＲＧＤを、ヒトＳＣＣＨＮ細胞系の形質導入で使用した。この実験において、直接的比較を非修飾対照ウイルスＡｄＣＭＶＬｕｃに対して行った。Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤのＨｅＬａ細胞への適用の結果、制御ウイルスＡｄＣＭＶＬｕｃと比較して遺伝子導入の４倍増加がもたらされた（図３８）。組換えノブの添加は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤを介する遺伝子導入に対して有意な阻害効果は有さず、増大したレベルのトランスジーン発現が非−ＣＡＲ経路を介して起こった形質導入を表すことが確認される。次に、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤをヒトＳＣＣＨＮ細胞系に適用した。これらの実験において、遺伝子導入における非常に劇的な増加がこれらの他のアデノウイルスで制御できない細胞で認められた。具体的には、ＦａＤｕ、ＳＣＣ−４およびＳＣＣ−２５細胞は、各々、遺伝子導入において３５、１８および７７倍増強を示す。重要なことには、ノブ競合は、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤベクターを介して達成されたこれらの細胞への遺伝子導入に対して効果を有しなかった。かくして、ＳＣＣＨＮ細胞へのＣＡＲ−非依存性遺伝子導入の達成は、ＳＣＣＨＮにおいてＣＡＲ欠陥を克服する手段を提供し、かなり増大したレベルの遺伝子導入を増強させた。
【０１６２】
実施例３２
アデノウイルス−感染ＳＣＣＨＮ細胞系におけるイン・サイチュハイブリダイゼーション
イン・サイチュハイブリダイゼーションを使用してルシフェラーゼ遺伝子のｍＲＮＡ転写体を検出した。この目的で、ルシフェラーゼｍＲＮＡをジゴキシゲニン−標識リボプローブでハイブリダイズさせ、酵素細胞化学技術によって検出した。対照として、ＳＣＣＨＮ細胞系ＳＣＣ−２５の未感染細胞は陰性シグナルを示した（図３９）。２５０ｐｆｕ／細胞の感染多重度にてのこれらの細胞のＡｄＣＭＶＬｕｃでの感染は限定された陽性染色を誘導した。対照的に、同一感染多重度にてＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで感染させた細胞は増強されたシグナルを示し、これは＞８０％の感染頻度を示す。これらのベクターによって達成された相対的ルシフェラーゼ活性、各々、４．１×１０^７および３．３×１０^９はイン・サイチュハイブリダイゼーションの結果に適合した。これらの実験に基づき、かくして、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤは標的腫瘍細胞のかなり大きな割合を感染させることは明らかである。かくして、ＣＡＲ−非依存性遺伝子導入は両遺伝子導入レベル、ならびにヒトＳＣＣＨＮ細胞での形質導入頻度での劇的な増加を可能とする。この後者のパラメーターは、いずれかの癌遺伝子治療アプローチの最終的有用性を予測する鍵となる因子である。
【０１６３】
実施例３３
ヒトＳＣＣＨＮの初代外植体への遺伝子導入
細胞系は遺伝子導入に関する組織特異的パラメーターの指標を与えるが、ヒト腫瘍に対する類似性は不正確である。この点に関し、主要な物質におけるベクター効率は細胞系で得られたものとは頻繁に区別される。加えて、ヒト細胞系／ネズミ異種移植片モデルにおける遺伝子導入頻度は、ヒト臨床遺伝子治療トライアルの意味において最終的に得ることができる感染率を頻繁に過剰評価する（Ｈｅｓｄｏｒｆｆｅｒら、 Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １６：１６５、 １９８８；Ｂｅｌｌｏｎら、 Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８：１５， １９９７）。これに基づき、初代ヒト物質は、開発されたベクターアプローチの有効性を確立するための実験で鍵となる基質を表す。加えて、腫瘍および対応する正常組織における標的化ベクターの平行分析は、ヒト臨床的使用で達成され得る感染の差異に関して洞察を与える。この差異は、所与の遺伝子治療アプローチの治療指標を指令する鍵となる因子であり得る。従って、屈性−修飾アデノウイルスベクターは、正常な口腔粘膜、ＳＣＣＨＮに関連する正常組織基材の意味で開発された。
【０１６４】
これらの実験において、初代腫瘍細胞は、ヒトＳＣＣＨＮ細胞系と比較して、アデノウイルスベクターＡｄＣＭＶＬｕｃに対して比較的抵抗性を呈した（図４０）。これらの知見は、初代および細胞系データにおいて頻繁に認識された食い違いを有効なものとし、イン・サイチュにてヒト腫瘍に対して有意義な形質導入を達成する困難性を強調する。次に、これらの知見をＡｄ５ｌｕｃＲＧＤウイルスと比較した。注意すべきは、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤはこのそうでなければ制御できない腫瘍標的に対して増大した遺伝子導入を達成した。具体的には、２．４倍および５．８倍の増加が初代腫瘍の２つの独立した単離体で認められた。ノブでの競合実験により、観察された増加がＣＡＲ−非依存性遺伝子導入の達成を介して起こることが確認された。かくして、ベクター分析のための臨床的に関連する実験基質を表す新鮮な初代腫瘍物質では、ＣＡＲ−非依存性遺伝子導入はヒトＳＣＣＨＮ腫瘍に対する遺伝子導入の有意な増加を可能とする。さらに注意すべきは、正常口腔粘膜では、ＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの間に差異は認められなかった（図４０）。この重要な知見は、このＣＡＲ−非依存性アプローチが改良された腫瘍−対正常遺伝子導入差異、およびかくして、潜在的に改良された治療研究を可能とすることを予測する。
【０１６５】
実施例３４
Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤの全身標的化可能性
次の論理工程としてＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの全身標的可能性を評価し、本データは、ＨＩループ中のＲＧＤモチーフが全身血管送達（標的化アデノウイルスベクターにつき従前には示されていない鍵となる特性）の意味において感染を容易とすることができるのを示す。
【０１６６】
Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤの全身形質導入特性を評価するために、このウイルスを、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤとしてのＥｌにおいて同一のＣＭＶ−駆動ルシフェラーゼカセットを有しないが、ファイバー蛋白質のＲＧＤ修飾を有しない第１世代アデノウイルスベクター（ＡｄＣＭＶｌｕｃ）と比較した。これらのウイルスのプラーク力価測定を同一オペレーターによって同時に、かつ２つの別の場合において独立に行って、（プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）ベースで）２つのベクターの同等の用量が比較されつつあるのを確認した。側方尾静脈注射によっていずれかのベクター（１０^９ｐｆｕ）をＣ５７ｂｌａｃｋ６マウス（群当たり５匹マウス）に投与した。３日後、マウスを犠牲とし、器官（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）を収穫し、ルシフェラーゼ活性につき分析した。各分析では、全器官をスナップ凍結し、乳鉢および乳棒を用いて粉砕し、次いで、細胞を溶解緩衝液中で溶解させ、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＢｅｒｔｈｏｌｄルミノメーターを用いて上澄み中のルシフェラーゼ活性を測定した。溶解物の蛋白質含有量につきデータを正規化した。
【０１６７】
器官ルシフェラーゼ発現の分析は、肝臓、肺、脾臓および腎臓におけるＡｄＣＭＶＬｕｃと比較してＡｄ５ｌｕｃＲＧＤでの統計学的に有意な増強を明らかとし、これは後者の例において最も顕著な知見であり、ここに発現の５０倍大きな増強があった（図４１）。注目すべきには、イン・ビボでのこの高レベルでの増強はこのベクターでのイン・ビトロでの知見に匹敵する。対照的に、心臓では増強は観察されなかった。両ベクターでは、最高レベルのトランスジーン測定が肝臓で観察された。肝臓でのウイルスの摂取は、非特異的およびＣＡＲ特異的メカニズム双方と組み合わせた循環因子と関係し得る（Ｚｉｎｎら、 Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：７９８， １９９８）。この点に関し、ｍＣＡＲ（ヒトＣＡＲのネズミ同族体）のレベルがマウス肝臓で見いだされるという証拠がある（Ｔｏｍｋｏら、 ＰＮＡＳ， ９４：３３５２、 １９９７）。そのインテグリン結合特性に加えて、ＡｄｌｕｃＲＧＤは天然屈性を保持するので、このベクターでの肝臓摂取が支配的であったのは恐らくは驚くべきことではない。事実、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤでのルシフェラーゼ発現の中程度の増強がこの部位で起こった。しかしながら、重要なことには、各個々のマウスについての肝臓での発現に対する他の器官におけるルシフェラーゼ発現の比率の評価はＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの異なる形質導入プロフィールを明らかにした（図４４）。この異なるプロフィールは、これらの知見が２つのベクターの異なる生物学によるものであり、ベクター調製物の力価における変異をモニターするのに帰すことができないことを示す。かくして、これらのデータは、アデノウイルスファイバーの遺伝的修飾が全身血管投与の高度にストリンジェントな意味においてトランスジーン発現の選択的増強に導き得るという最初の証拠を提供する。
【０１６８】
幾人かの研究者は、アデノウイルスの全身投与に続いてのレポーター遺伝子発現の細胞局所化がこの器官におけるベクターの支配的隔離のため肝臓よりも他の器官で困難であることを見いだしている（Ｗｏｒｇａｌｌら、 Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ８：３７， １９９７）。この理由では、ここに報告した実験において、ルシフェラーゼレポーター遺伝子、続いての光単位検出を選択した。この技術の高い感度は、器官レベルにおいて修飾されたベクターのトランスジーン発現プロフィールの再現可能な評価を可能とした。細胞レベルの分解能におけるトランスジーン発現を説明する努力において、種々の器官におけるルシフェラーゼｍＲＮＡにつきイン・サイチュハイブリダイゼーションを行った。両ベクターでは、ルシフェラーゼｍＲＮＡは肝臓細胞で検出することができ（１０^９ｐｆｕのウイルス用量を用いて細胞の１５％まで）、２つのベクター間で明白な定性的区別はなかった。しかしながら、他の細胞検出系では（例えば、β−ガラクトシダーゼレポーターの使用）、ハイブリダイゼーションアプローチによって提供される感度の限界は、ルシフェラーゼｍＲＮＡについてのシグナルが肝臓以外の器官で検出できないことを意味する。肝臓隔離を低下させるためのベクターのさらなる修飾が、現在利用可能な技術を用いる非肝臓トランスジーン発現の適当な細胞分解を可能とするのに必要であろうと考えられた。重要なことには、アデノウイルスファイバーの遺伝的改変が全身投与後にある非肝臓部位でのトランスジーン発現を大いに改良できるという刺激になる証明は、天然屈性をなくするためのさらなる技巧を作り出すための刺激を提供する。
【０１６９】
ここに提示したデータは、標的化アデノウイルスベクターの開発において鍵となる論点を追求する。従前には、全身投与される標的化ベクターの特性の報告は無かった。本研究においては、ＲＧＤモチーフのＨＩループへの付加が全身投与されるベクターのトランスジーン発現プロフィールを改変することが示され、これは、ベクターのこの領域が標的化モチーフの挿入のための潜在的に理想的位置であり、ベクターの属性が血清因子または限定されたモチーフの接近性によって害されないことを示す。従って、このアプローチは、さらなる修飾による天然屈性の消失と首尾よく組み合わせれば、全身経路によって投与可能な真に細胞特異的なベクターの産生を可能とすることができる。
【０１７０】
本発明は、カルボキシ末端ノブドメインのＨＩループ内に遺伝的に取り込まれたＲＧＤ−４Ｃ配列を持つファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターの創製および特徴付けを記載する。かかるウイルスを創製するための努力がなされて、短いペプチドリガンドの取込みが行われ、最適な部位としてのファイバーノブのＨＩループの有用性を示し、これはリガンド−特異的細胞受容体にウイルスが結合することを可能とし、それにより、ベクターの改変されたまたは拡大された屈性がもたらされた。
【０１７１】
細胞インテグリンおよびＲＧＤトリペプチドを含有する種々の蛋白質の間の相互作用はマクロ分子の間の最良に特徴付けされた相互作用のうちの１つである。この相互作用は、細胞接着およびウイルス感染を含めた種々の基本的な生物学的プロセスで重要な役割を演じる。この点に関し、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン、トロンボスポンジン、フィブリノーゲン、ラミニンおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子のごとき接着蛋白質に含有されたＲＧＤモチーフがこれらの蛋白質およびインテグリン分子の間の効果的かつ特異的相互作用を可能とすることが示されている。また、ＲＧＤモチーフは、コックスサキウイルスおよびフットアンドマウス病ウイルスのＶＰ１蛋白質、公知のアデノウイルスの大部分のペントンベース蛋白質、アフリカウマ病ウイルスおよびブルータングウイルスのＶＰ７蛋白質、ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔ蛋白質、および単純疱疹ウイルスの糖蛋白質Ｈを含めたいくつかのウイルス蛋白質に存在することが示されている。これらの例のいくつかにおいて、このトリペプチドは、ビリオンおよび細胞表面局所化インテグリンの間の一次または二次相互作用を媒介することによってウイルス感染のプロセスにおいて重要な役割を演じることが示されている。さらに、キメラＢ型肝炎コア、ポリオウイルス粒子、バクテリオファージｆｄおよびヒトアデノウイルスビリオンへのＲＧＤ含有配列の遺伝的取込みは、これらのウイルス粒子と細胞インテグリンとの特異的相互作用を可能とし、それにより、細胞表面への全構造の結合がもたらされる。
【０１７２】
本発明は、通常はアデノウイルス感染が困難な細胞型に対して組換えアデノウイルスベクターの屈性を拡大するための遺伝的戦略を記載する。ここに開示した知見に基づき、ＨＩループ局所化ＦＬＡＧペプチドの接近性につき、Ａｄ５ファイバー蛋白質のノブ内に局在化した推定細胞結合ドメインに密に接近させてＲＧＤ−４Ｃペプチドを位置付けると、このリガンドを、細胞膜上のインテグリンとの効果的な相互作用に利用できるようにする。ＥＬＩＳＡ−ベースの結合アッセイを用いることによって、精製されたインテグリンαｖβ３を持つファイバー−ＲＧＤ蛋白質のＲＧＤモチーフ間の直接的相互作用が示された。この鍵となる知見は、かかるファイバー−ＲＧＤ蛋白質を含有する組換えアデノウイルスベクターＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの創製の基礎を提供した。いくつかの細胞系でＡｄ５ｌｕｃＲＧＤで創製されたデータは、このウイルスが、未修飾ファイバーを持つウイルスによるものと有意に異なる。遺伝子導入のプロフィールを証明することを示した。ＣＡＲ−陰性細胞を遺伝子送達実験で利用した場合、この差異は特に劇的であった。イン・ビトロでの細胞への放射標識ウイルス結合の調査は、遺伝子導入実験を平行させ、それにより、ウイルスおよび標的細胞の間のより効果的な一次相互作用の結果としてトランスジーン発現の増加した効率の概念を支持する。
【０１７３】
遺伝子治療の意味において臨床的適用のための新たに創製されたウイルスベクターの有用性を証明するために、卵巣癌患者から得た腹水から単離した細胞への遺伝子送達のためにＡｄ５ｌｕｃＲＧＤを使用した。このモデルでは、Ａｄ５ｌｕｃＲＧＤは、未修飾ファイバーを含有する対照ビリオンによって媒介されたものよりも２ないし３桁高いトランスジーン発現のレベルを指令することができた。これらの結果は、遺伝的に取り込まれたＲＧＤペプチドを持つファイバーを含有する組換えアデノウイルスベクターが、イン・ビボ遺伝子送達に基づいて癌遺伝子治療アプローチの意味で大いに有用であり得ることを強く示唆する。加えて、腫瘍血管系におけるいくつかのタイプのインテグリンのよく記載された過剰発現は、治療遺伝子を発現するＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの誘導体がその血液供給の停止を介する腫瘍の根絶で利用することができるのを示唆する。
【０１７４】
ベクター再標的化を目的とするアデノウイルスファイバー蛋白質のＨＩループに取り込まれたＲＧＤトリペプチドの成功した利用は、他のペプチドリガンドがファイバー分子の意味において丁度同様に働き得ることを示唆する。この点に関し、ファージディスプレイライブラリーの迅速に出現する技術は、ペプチドを同定する手段としてのその利用性を証明し、これは、イン・ビボで細胞表面上のある分子に特異的に結合する能力を示す。この高いスループット方法は、細胞膜上の従前に特徴付けられたならびに未知の構造にバクテリオファージ粒子を標的化する小ペプチドリガンドの能力に基づく。イン・ビボの意味においてのファージバイオパンニングにおける最近の成功は、この技術が、組換えアデノウイルスベクターの内因性屈性の修飾で使用されるべき標的化ペプチドの源を提供することができることを強く示唆する。
【０１７５】
ファイバーノブのＨＩループに取り込まれる小ペプチドの利用性が示されたが、この位置のサイズ制限は十分には定義されていない。この点に関し、ＨＩループ構造と例えば、単一鎖抗体（ｓｃＦｖ）のごときより大きなサイズの蛋白質リガンドとの適合性は、潜在的標的化アプローチの範囲をかなり拡大するであろう。さらに、細胞結合部位の形成に関与するβ−ストランドＨおよびＩを結合する、ＨＩループへの大きなポリペプチドリガンドの取込みは立体障害を生じさせ、それにより、ファイバーノブとＣＡＲの直接的相互作用を妨げ、ウイルスの内因性屈性の排除をもたらす。これは、今度は、ＣＡＲ−非依存性メカニズムを専ら介する細胞特異的遺伝子導入が可能な真に再標的化されたアデノウイルスベクターの新しい創製がもたらされるであろう。
【０１７６】
【参考文献】

本明細書中で言及した全ての特許または刊行物は、本発明が属する分野の当業者のレベルを示すものである。あたかもかく個々の刊行物が引用により一体化されるように個々に示されるごとく、これらの特許および刊行物は同程度に引用により一体化される。
【０１７７】
当業者であれば、本発明を十分に適合させて、目的を達成し、述べられた目的および利点、ならびにここに固有のものが得られることは当業者が容易に認識するであろう。ここに記載された方法、手法、処理および分子と共に本実施例は好ましい実施の形態の代表であり、例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。ここにおける変形および他の使用が当業者に起こり、これは請求の範囲によって定義される本発明の精神内で行われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ａｄ５ファイバーノブの３Ｄモデルを示す
【図２】
図２はファイバーノブのＨＩループの修飾を示す
【図３】
図３はポリアクリルアミドゲル電気泳動による組換えファイバー蛋白質の分析を示す
【図４】
図４は組換えファイバー蛋白質によるアデノウイルスの感染性の阻害を示す
【図５】
図５はＡｄ５ＦＨＩＦＬＡＧの創製を示す
【図６】
図６はアデノウイルス結合アッセイを示す
【図７】
図７はアデノウイルス結合アッセイを示す
【図８】
図８は無傷Ａｄ５ＦＨＩＦＬＡＧビリオンの意味でＦＬＡＧペプチドの接近性を示す
【図９】
図９はヒト卵巣細胞系（ＳＫＯＶ３．ｉｐｌ）を感染させるためのノブのＨＩループ中の標的化エピトープＲＧＤを含有する遺伝的に修飾されたアデノウイルスの能力並びに組換えノブ蛋白質の存在による導入の阻害の結果を示す
【図１０】
図１０はヒト卵巣細胞系（ＯＶ−４）を感染させるためのノブのＨＩループ中の標的化エピトープＲＧＤを含有する遺伝的に修飾されたアデノウイルスの能力並びに組換えノブ蛋白質の存在による導入の阻害の結果を示す
【図１１】
図１１は初代ヒト卵巣細胞系を感染させるためのノブのＨＩループ中の標的化エピトープＲＧＤを含有する遺伝的に修飾されたアデノウイルスの能力並びに組換えノブ蛋白質の存在による導入の阻害の結果を示す
【図１２】
図１２は初代ヒト卵巣細胞系を感染させるためのノブのＨＩループ中の標的化エピトープＲＧＤを含有する遺伝的に修飾されたアデノウイルスの能力並びに組換えノブ蛋白質の存在による導入の阻害の結果を示す
【図１３】
図１３は組換えファイバー蛋白質およびαｖβ３インテグリンの間の相互作用の分析を示す
【図１４】
図１4は固定化Ａｄ５ＣＭＶｌｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤビリオンに結合するαｖβ３インテグリンのＥＬＩＳＡアッセイを示す
【図１５】
図１５は２９３におけるＣＡＲのフローサイトメトリー分析を示す
【図１６】
図１６は２９３におけるインテグリン発現のフローサイトメトリー分析を示す
【図１７】
図１７はＨＵＶＥＣにおけるＣＡＲのフローサイトメトリー分析を示す
【図１８】
図１８はＨＵＶＥＣにおけるインテグリン発現のフローサイトメトリー分析を示す
【図１９】
図１９はＲＤ細胞におけるＣＡＲインテグリン発現のフローサイトメトリー分析を示す
【図２０】
図２０はＲＤ細胞におけるインテグリン発現のフローサイトメトリー分析を示す
【図２１】
図２１は種々のヒト細胞系へのアデノウイルス−媒介遺伝子導入を示す
【図２２】
図２２は¹²⁵Ｉ−標識アデノウイルスの２９３、ＨＵＶＥＣまたはＲＤ細胞への結合の比較を示す
【図２３】
図２３は標識されたＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの２９３およびＨＵＶＥＣ細胞への結合の阻害を示す
【図２４】
図２４はヒト卵巣癌細胞のフローサイトメトリー分析を示す
【図２５】
図２５はヒト卵巣癌細胞のフローサイトメトリー分析を示す
【図２６】
図２６はヒト卵巣癌細胞のフローサイトメトリー分析を示す
【図２７】
図２７はヒト卵巣癌細胞のフローサイトメトリー分析を示す
【図２８】
図２８はＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤによって媒介された培養卵巣癌細胞に対する遺伝子導入効率の比較を示す
【図２９】
図２９は卵巣癌患者から得られた腹水から単離した初代細胞を示す
【図３０】
図３０はヒト卵巣癌細胞系へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す
【図３１】
図３１はヒト卵巣癌細胞系へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す
【図３２】
図３２はヒト卵巣癌細胞系へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す
【図３３】
図３３は卵巣癌患者からのヒト腹水細胞へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す
【図３４】
図３４は卵巣癌患者からのヒト腹水細胞へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す
【図３５】
図３５は初代卵巣腫瘍外植体へのアデノウイルスベクター−媒介遺伝子導入を示す
【図３６】
図３６は腹腔中皮−対−卵巣腫瘍における遺伝子導入のレベルの異なる増加を示す
【図３７】
図３７は、ルシフェラーゼ発現複製−欠陥アデノウイルスベクターＡｄＣＭＶＬｕｃを介するヒト細胞系への遺伝子導入を示す
【図３８】
図３８はヒトＳＣＣＨＮ腫瘍細胞系へのＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤでの遺伝子導入の相対的効率の比較を示す
【図３９】
図３９はＳＣＣＨＮ細胞系についてのＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの相対的遺伝子導入頻度の分析を示す
【図４０】
図４０は初代ＳＣＣＨＮ腫瘍および正常口腔粘膜についてのＡｄＣＭＶＬｕｃおよびＡｄ５ｌｕｃＲＧＤの異なる遺伝子導入効率の分析を示す
【図４１】
図４１はベクターの全身投与後の種々の器官における遺伝子発現を示す
【図４２】
図４２はベクターの全身投与後の種々の器官における遺伝子発現を示す
【図４３】
図４３はベクターの全身投与後の種々の器官における遺伝子発現を示す
【図４４】
図４４は肝臓発現と比較した種々の器官におけるルシフェラーゼ発現の比率を示す

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