CN110650745A - 武装复制型溶瘤腺病毒 - Google Patents

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Abstract

公开了复制型溶瘤腺病毒，其包含嵌合人/小鼠CD40配体。溶瘤腺病毒可以是复制型的。嵌合人/小鼠CD40配体可以是MEM40。还公开了包括向患有癌症的患者给予具有至少一种嵌合人/小鼠CD40配体(例如MEM40)的复制型溶瘤腺病毒的方法。

Description

武装复制型溶瘤腺病毒
本发明的背景
本申请要求于2016年12月21日提交的美国临时申请62/437,474，2017年11月9日提交的美国临时申请62/584,008的优先权，两者通过引用并入本文。
技术领域
本发明总体涉及病毒学、免疫学和医学领域。更具体地，它涉及用于治疗癌症的溶瘤腺病毒载体的组合物。
背景技术
溶瘤病毒是一类具有双重作用机制的癌症治疗剂：1)通过肿瘤细胞中的选择性病毒复制杀死肿瘤细胞，导致肿瘤直接溶解；2)通过释放被破坏的肿瘤细胞中的抗原诱导全身抗肿瘤免疫。原生和转基因病毒都在开发中。美国FDA于2015年批准了第一种溶瘤病毒，talimogene laherparepvec(
Figure BDA0002174099080000011
Amgen Inc.,Thousand Oaks,CA)，一种编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的转基因疱疹病毒，用于局部治疗黑色素瘤，如Kohlhapp et al.2016Clinical Cancer Research所述。然而，黑色素瘤只是众多癌症中的一种。此外，GM-CSF只是研究中用于癌症治疗的众多化合物中的一种。此外，疱疹病毒只是其研究中涉及其溶瘤特性的许多病毒中的一种。
因此，仍然需要用于治疗癌症的溶瘤病毒载体。
背景技术部分中讨论的所有主题不一定是现有技术，并且不应仅仅因为其在背景技术部分中的讨论而认为是现有技术。除此之外，除非明确说明为现有技术，否则对背景技术部分中讨论的或与这些主题相关的现有技术中的任何问题的识别都不应视为现有技术。相反，对背景技术部分中任何主题的讨论应视为发明人对特定问题的处理方法的一部分，而这个问题本身也可能具有创造性。
发明内容
以下呈现了本公开的简化概述，以便提供对本公开的一些方面的基本理解。该概述不是本公开的详尽概述。其并不旨在标识本公开的关键或重要元素或描绘本公开的范围。其唯一目的是以简化形式呈现一些概念，作为稍后讨论的更详细描述的序言。
在一些实施例中，本公开涉及包含嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒。溶瘤腺病毒可以是复制型的。
在一些实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向患有肿瘤的患者给予包含溶瘤腺病毒的组合物，所述溶瘤腺病毒包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体。
在任一实施例中，嵌合人/小鼠CD40配体可选自ISF30-ISF41，其中MEM40(ISF35)是其成员。
编码选自ISF30-ISF41的嵌合人/小鼠CD40配体的转基因，包括MEM40(ISF35)，先前已插入到非溶瘤性非复制型腺病毒中。然而，这些转基因从未设计成溶瘤和/或复制型腺病毒。
提供本概述是为了以简化的形式介绍某些概念，这些概念将在下面的具体实施方式中进一步详细描述。除非另有明确说明，否则本概述不旨在标识所要求保护的主题的关键或必要特征，也不旨在限制所要求保护的主题的范围。
在下面的描述中阐述了一个或多个实施例的细节。结合一个示例性实施例示出或描述的特征可以与其他实施例的特征组合。因此，可以组合本文描述的任何各种实施例以提供进一步的实施例。如果需要，可以修改实施例的各方面以采用如本文所标识的各种专利、申请和出版物的概念，以提供更进一步的实施例。根据说明书、附图和权利要求，其他特征、目的和优点将显而易见。
附图说明
通过参考以下结合附图的描述可以理解本公开，其中：
图1示意性地表示表达MEM40的新型复制型腺病毒Delta-24-RGD-MEM40(DNX-MEM40)的构建体。
图2示意性地表示表达MEM40的新型复制型腺病毒Delta-24-MEM40的构建体。
具体实施方式
以下描述本公开的各种说明性实施例。为了清楚起见，在本说明书中并未描述实际实现的所有特征。当然可以理解，在开发任何这样的实际实施例时，必须做出许多特定于实施方式的决定以实现开发者的特定目标，例如，遵守与系统相关的和与业务相关的约束，这些约束因实施方式而变化。此外，应当理解的是，这种开发努力可能是复杂且耗时的，但是对于受益于本公开的本领域普通技术人员来说仍然是常规任务。
现在将参考附图描述本主题。在附图中示意性地描绘了各种结构，仅用于解释的目的，并且不会用本领域技术人员公知的细节模糊本公开。然而，包括附图以描述和解释本公开的说明性示例。本文使用的词语和短语应该理解和解释为具有与相关领域的技术人员对那些词语和短语的理解一致的含义。术语或短语的特殊定义，即与本领域技术人员所理解的普通和惯用含义不同的定义，旨在通过本文中术语或短语的一致使用来表明。如果术语或短语旨在具有特殊含义，即除本领域技术人员所理解的含义之外的含义，那么这种特殊定义将在说明书中以含义的方式明确阐述，其直接且明确地提供该术语或短语的特殊定义。
虽然本文公开的主题易于进行各种修改和替换形式，但是其具体实施例已经通过附图中的示例示出并且在本文中详细描述。然而，应该理解的是，本文对特定实施例的描述并非旨在将本公开限制于所公开的特定形式，而是相反，本发明的目的是涵盖落入由所附权利要求限定的本公开的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。
癌症概述
“癌症”是指一种疾病大家族，其特征在于体内细胞的不受控制的生长。癌症的代表性形式包括癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和上述的混合类型。进一步的示例包括但不限于下面更详细讨论的那些。
腺病毒概述
“腺病毒”(Ad)是一种感染人类的大型(约36kb)DNA病毒，但也显示出广泛的宿主范围。在物理上，腺病毒是含有双链线性DNA基因组的二十面体病毒。大约有50种人腺病毒血清型，根据分子、免疫学和功能标准将它们分为6个家族。到成年时，几乎每个人都已经感染过更常见的腺病毒血清型，主要影响是感冒样症状。
宿主细胞的腺病毒感染导致腺病毒DNA被游离维持，这降低了与整合载体相关的潜在遗传毒性。此外，腺病毒在结构上是稳定的，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。无论细胞周期阶段，腺病毒都能感染大多数上皮细胞。到目前为止，腺病毒感染似乎仅与轻度疾病相关，例如人类的急性呼吸道疾病。
腺病毒的感染周期分两步进行：在启动腺病毒基因组复制之前的早期阶段，其允许产生调节蛋白和参与病毒DNA复制和转录的蛋白，以及导致结构蛋白合成的晚期阶段。早期基因分布在分散在腺病毒基因组中的4个区域中，命名为E1至E4(“E”表示“早期”)。早期区域包含至少六个转录单元，每个转录单元具有其自身的启动子。早期基因的表达本身受到调节，一些基因在其他基因之前表达。E1、E2和E4三个区域对于病毒的复制至关重要。因此，如果腺病毒对这些功能中的一个有缺陷，则该蛋白必须以反式提供，或者病毒不能复制。
E1早期区域位于腺病毒基因组的5'末端，含有2个病毒转录单元E1A和E1B。该区域编码在病毒周期的很早期参与的蛋白，并且对于腺病毒的几乎所有其他基因的表达是必需的。特别地，E1A转录单元编码一种蛋白，该蛋白反式激活其他病毒基因的转录，从启动子诱导E1B、E2A、E2B、E3和E4区域和晚期基因的转录。
腺病毒通过细胞表面受体进入允许的宿主细胞，然后内化。与复制周期的第一步所需的某些病毒蛋白相关的病毒DNA进入受感染细胞的细胞核，其中开始转录。腺病毒DNA的复制发生在受感染细胞的细胞核中，不需要细胞复制。组装新的病毒颗粒或病毒粒子，之后它们从感染的细胞中释放出来，并且可以感染其他允许的细胞。
腺病毒是一种有吸引力的递送系统。本公开的实施例可以利用制造方法，具有最大产量每个细胞1×105个病毒颗粒。该方法可以不含或基本上不含蛋白、血清和动物来源的组分，使其适用于广泛的预防性和治疗性疫苗产品。
如果腺病毒已突变以使其具有条件复制性(在某些条件下具有复制能力)，则病毒复制可能需要辅助细胞。需要时，辅助细胞系可以衍生自人细胞，例如人胚肾细胞、肌细胞、造血细胞或其他人胚胎间充质细胞或上皮细胞。或者，辅助细胞可以衍生自允许人腺病毒的其他哺乳动物物种的细胞。此类细胞包括例如Vero细胞或其他猴胚胎间充质细胞或上皮细胞。在某些方面，辅助细胞系是293。培养宿主细胞和辅助细胞的各种方法可以在本领域中找到，例如(Racher,A.J.,Fooks,A.R.&Griffiths,J.B.Biotechnol Tech(1995)9:169.)。
可以使用不同的方法分离腺病毒。最常见的是，在转染Ad基因组后，从琼脂糖覆盖的细胞中分离腺病毒噬菌斑，并扩展病毒颗粒用于分析。对于详细的方案，本领域技术人员参考(Graham,F.L.,and Prevec,L.(1991).Manipulation of adenovirusvectors.Methods Mol Biol 7,109-128.)。
用于产生腺病毒载体的替代技术包括利用细菌人工染色体(BAC)系统，利用含有互补腺病毒序列的两种质粒的recA+细菌菌株的体内细菌重组，以及酵母人工染色体(YAC)系统(PCT出版物95/27071和96/33280，其通过引用并入本文)。
适用于本公开内容的腺病毒载体的代表性示例包括美国公开号2009/0175830、2014/0377221、2014/0377294、2015/0306160、2016/0289645和2016/0143967以及美国专利号6,210,946、6,284,742、6,312,699、6,555,368、6,649,396、6,815,200、6,824,771、6,841,540、6,955,808、7,045,348、7,297,542、8,168,168和9,061,055中描述的那些，所有这些都通过引用整体并入本文。
溶瘤病毒概述
正在开发广泛的溶瘤病毒类型作为抗癌剂，包括腺病毒(参见Russell et al.,2014Nature Biotechnology and Lawler et al.,2017JAMA Oncology)。
在选择或设计用于所需治疗活性的治疗性溶瘤腺病毒时可考虑多种生物学特性，包括：通过细胞表面蛋白的天然趋向或通过工程化腺病毒直接靶向癌细胞来选择性靶向癌细胞进行感染；癌细胞中的选择性复制；病毒发病机制减弱；增强溶解活性；修饰抗病毒免疫反应，其可以导致腺病毒的快速清除；以及通过腺病毒的遗传修饰来修饰全身抗肿瘤免疫以掺入细胞因子、免疫激动剂或免疫检查点阻断剂。
复制型溶瘤腺病毒载体具有多种特性，该特性使其成为用于治疗应用的理想选择，包括广泛的细胞和肿瘤类型的感染性、非非分裂细胞的感染、基因组掺入的缺乏、高滴度、携带转基因的能力、体外和体内稳定性以及转基因的高水平表达。腺病毒表达载体包括含有腺病毒序列的构建体，所述腺病毒序列足以(a)支持构建体的包装和(b)最终表达已克隆在其中的重组基因构建体。
调节溶瘤腺病毒的生物学特性可以影响一系列免疫相互作用，这些免疫相互作用对癌症治疗可能是有益的或有害的。相互作用取决于特定的肿瘤、疾病的部位和程度、免疫抑制性肿瘤微环境、溶瘤病毒平台、剂量、时间和递送条件，以及个体患者的反应(通常参见Aurelian L.“Oncolytic viruses as immunotherapy:progress and remainingchallenges”Onco.Targets Ther.2016；9:2627-2637)。例如，据报道，腺病毒E3基因的存在可增加条件复制型腺病毒的体外和体内溶瘤效力(参见Suzuki K,Alemany R,Yamamoto M,and Curiel DT“The presence of the adenovirus E3region improves the oncolyticpotency of conditionally replicative adenoviruses”Clin.Cancer Res.2002Nov；8(11):3348-59)。具体地，E3-11.6kDa腺病毒死亡蛋白(ADP)认为是有效细胞死亡所必需的(参见Tollefson A,Ryerse J,and Scaria A,et al.,“The E3-11.6-kDa AdenovirusDeath Protein(ADP)is required for efficient cell death:characterization ofcells infected with adp mutants,”Virology 1996；220:152-162)。然而，对于治疗癌症的免疫治疗方法，平衡快速细胞死亡与免疫调节蛋白的充分表达以最佳诱导抗癌免疫应答可能是重要的。本公开提供了这样的溶瘤腺病毒。
根据本公开，57种人腺病毒血清型(HAdV-1至57)中任一种的成员可以掺入编码免疫细胞刺激性受体激动剂的异源核酸。人Ad5在遗传和生物化学上良好表征了(GenBankM73260；AC 000008)。因此，在具体实施例中，溶瘤腺病毒是复制型Ad5血清型或包含Ad5组分的杂合血清型。腺病毒可以是野生型菌株，但可以进行遗传修饰以增强肿瘤选择性，例如通过减弱病毒在正常静止细胞内复制的能力而不影响病毒在肿瘤细胞中复制的能力。本公开包括的复制型溶瘤腺病毒的非限制性示例包括Delta-24、Delta-24-RGD、ICOVIR-5、ICOVIR-7、ONYX-015、ColoAd1、H101以及AD5/3-D24-GMCSF。Onyx-015是病毒血清型Ad2和Ad5的杂合体，其在E1B-55K和E3B区域中具有缺失以增强癌症选择性。H101是Onyx-015的修改版本。ICOVIR-5和ICOVIR-7包含E1A的Rb结合位点缺失和由E2F启动子取代E1A启动子。ColoAd1是一种嵌合Add11p/Ad3血清型。AD5/3-D24-GMCSF(CGTG-102)是编码GM-CSF的血清型5/3衣壳修饰腺病毒(Ad5衣壳蛋白旋钮(knob)被血清型3的旋钮结构域取代)。
注射到肿瘤中的溶瘤腺病毒诱导细胞死亡并释放新的腺病毒后代，其通过感染邻近细胞产生治疗波，如果不停止，可以导致肿瘤的完全破坏。在细胞培养系统和恶性神经胶质瘤异种移植模型中已经显示出Delta-24的显著抗肿瘤作用。Delta-24-RGD在I期临床试验中已经显示出抗肿瘤作用，目前是其他临床试验的主题。虽然肿瘤细胞溶解是Delta-24-RGD溶瘤腺病毒的主要抗癌机制，但是来自复发性胶质瘤和其他观察的患者的I期临床试验的数据表明，由腺病毒介导的抗肿瘤免疫应答的触发可以增强直接溶瘤作用。
在本公开的一些实施例中，可以将一种或多种异源序列掺入腺病毒的非必需区域。在本公开的一个具体实施例中，可以掺入一个或多个异源序列代替E3区的全部或部分。代表性示例包括细胞因子、趋化因子和检查点抑制剂。在一些实施例中，所述异源序列编码OX40激动剂(例如，OX40L)、GITRL、抗PD-1和/或抗-CTLA-4。在另一个实施例中，异源核酸序列编码免疫检查点蛋白的抑制剂，所述检查点蛋白选自由CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR和/或BTLA组成的组。在另一个实施例中，异源核酸序列编码免疫共刺激受体的激动剂，所述免疫共刺激受体选自由CD28、OX40(CD134)、糖皮质激素诱导的TNF受体(GITR)、CD137(4-1BB)、疱疹病毒进入介质A(HVEM)、诱导型T细胞共刺激分子(ICOS或CD278)、CD27、CD40和/或CD226组成的组。在2016年5月27日提交的PCT/US2014/066920和美国临时号62/342482中更详细地公开了代表性示例，这两个专利的全部内容通过引用并入本文。
DNX-2401
在一些实施例中，复制型溶瘤腺病毒是Delta-24或Delta-24-RGD(DNX-2401)。Delta-24描述于美国专利申请公开号20030138405和20060147420中，其各自通过引用并入本文。Delta-24腺病毒衍生于5型腺病毒(Ad-5)，在E1A基因的CR2部分含有24碱基对缺失，其包含负责结合编码的E1A蛋白中对应于氨基酸122-129的Rb蛋白(核苷酸923-946)的区域(Fueyo J等，Oncogene，19：2-12(2000))。Delta-24-RGD进一步包含RGD-4C序列(其与αvβ3和αvβ5整联蛋白强烈结合)插入纤维钮扣蛋白的HI环中(Pasqualini R.等，NatBiotechnol，15：542-546(1997))。E1A缺失增加了病毒对癌细胞的选择性；RGD-4C序列增加了病毒对胶质瘤和其他几种表达低水平腺病毒受体的肿瘤的感染性。
CD40激动剂概述
尽管不受理论束缚，但癌症免疫疗法的成功可能取决于增强肿瘤特异性CD8+T细胞免疫，因为CD8+T细胞与直接肿瘤杀伤和患者存活密切相关。因此，促进CD8+T细胞应答的治疗方式是癌症免疫治疗药物开发的目标。CD40受体是肿瘤坏死因子受体家族的成员，并且由B细胞、专职抗原呈递细胞和非免疫细胞和肿瘤表达(van Kooten et al.,2000Journal of Leukocyte Biology)。肿瘤特异性T细胞应答的激活需要激活抗原呈递细胞上的CD40受体。CD4+T细胞通过CD40-CD154相互作用准许树突状细胞(DC)来增强CD8+T细胞引发。此外，CD40-CD154相互作用可防止CD8+T细胞应答过早减少。因此，通过CD154的CD40激活是诱导针对病原体和肿瘤的有效抗原特异性CD8T细胞免疫的必需步骤(Singh etal.,2017Nature Communications)。在这方面，CD40-激动剂疗法，例如抗体或同源CD40配体(CD40L)蛋白，似乎是癌症免疫疗法的有希望的策略。
ISF35概述
ISF35(其在本文中也可称为“MEM40”)是嵌合人/小鼠CD40配体，其与人CD40L具有92％的氨基酸序列同源性。参见美国专利号7,495,090，其通过引用并入本文)。(“CD40配体”和“CD40L”在本文中可互换使用，也可称为“CD154”)。具体而言，结构域I、II和III--分别包含该分子的细胞内、膜内和近端细胞外结构域的区域-已经完全人源化。在含有分子的CD40结合部分的结构域IV中，仅保留了细胞中最佳CD40配体表达所必需的那些鼠结构域。ISF35(MEM40)在分子的3'末端完全人源化，其中抗体结合当给予人时中和鼠CD154(CD40配体)的活性。除MEM40外，还有一系列嵌合CD40配体构建体(ISF30至ISF41)，MEM40是该组中特异性嵌合CD40配体，具有最多临床前和临床经验。
说明性实施例
在一些实施例中，本公开涉及包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒。
在一些实施例中，本公开涉及包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的复制型溶瘤腺病毒。在一个具体实施例中，可以对复制型溶瘤腺病毒进行遗传修饰以掺入嵌合人/小鼠CD40配体转基因。
在一些实施例中，本公开涉及复制型溶瘤腺病毒，其包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列。
在其他实施例中，本公开涉及包含嵌合人/小鼠CD40配体和一种或多种另外的免疫调节或治疗基因的复制型溶瘤腺病毒，所述基因例如细胞因子(例如GM-CSF、TNF)、白细胞介素(例如IL-2、IL-12)、趋化因子(例如RANTES)、巨噬细胞炎性蛋白(例如，MIP-3)、检查点抑制剂(例如，抗PD-1、抗-CDTA4和抗-PD-L1)，或另一种免疫调节蛋白(例如，OX40配体)。
可以为了多种目的改变溶瘤腺病毒的基因组区域以赋予所需的治疗性质。治疗性质的非限制性示例可包括增强的病毒复制和扩散、增强的溶瘤作用、肿瘤细胞相对于正常细胞的优先靶向、增强的免疫激活和保护腺病毒免受宿主免疫系统。用于上述目的的病毒区域可以被消除(完全或部分缺失)、使得失去功能、被修饰以减弱功能、或被其他序列取代。
在一些实施例中，本公开提供了具有改善的肿瘤细胞免疫介导和病毒破坏能力的腺病毒。
在一些实施例中，本公开涉及一种方法，其包括向患有肿瘤的患者给予包含溶瘤腺病毒的组合物，所述溶瘤腺病毒包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体。
任何溶瘤腺病毒株都可以用作掺入嵌合人/小鼠CD40配体转基因的起始点。在一些实施例中，溶瘤腺病毒是复制型人5型腺病毒。
可以使用本领域普通技术人员已知的技术进行溶瘤腺病毒的遗传修饰以掺入嵌合人/小鼠CD40配体转基因。溶瘤腺病毒包含具有必需调节元件的嵌合人/小鼠CD40配体转基因(巨细胞病毒(CMV)启动子或替代启动子；多腺苷酸化结构域)以允许嵌合人/小鼠CD40配体基因转录和嵌合人/小鼠CD40配体多肽在感染细胞中的表达。
在一些实施例中，嵌合人/小鼠CD40配体可以选自由ISF30(SEQ ID NO：1)、ISF31(SEQ ID NO：2)、ISF32(SEQ ID NO：3)、ISF33(SEQ ID NO：4)、ISF34(SEQ ID NO：5)、ISF35(MEM40)(SEQ ID NO：6)、ISF36(SEQ ID NO：7)、ISF37(SEQ ID NO：8)、ISF38(SEQ ID NO：9)、ISF39(SEQ ID NO：10)、ISF40(SEQ ID NO：11)和ISF41(SEQ ID NO：12)组成的组。
编码ISF30、ISF32、ISF34、ISF36、ISF38和ISF40的多肽序列的多核苷酸序列公开在美国专利号7,928,213中，其通过引用并入本文。编码ISF31、ISF33、ISF35、ISF37、ISF39和ISF41的多肽序列的多核苷酸序列公开在美国专利号7,495,090中，其通过引用并入本文。
在特定实施例中，掺入复制型溶瘤腺病毒中的嵌合人/小鼠CD40配体可以是ISF35(MEM40)(SEQ ID NO：6)。
异源嵌合人/小鼠CD40配体可以插入溶瘤腺病毒的任何非必需位置。在一些实施例中，溶瘤腺病毒保持具有复制能力。在特定实施例中，将异源嵌合人/小鼠CD40配体核酸插入复制型腺病毒骨架的E3区域。E3区域对于病毒复制不是必需的。具有复制能力的腺病毒可包含全部或部分E3缺失。在相关方面，从复制型腺病毒骨架中删除全部E3区域，并将嵌合人/小鼠CD40配体核酸插入含有全部E3缺失的位置。
可以进一步遗传修饰溶瘤腺病毒以改善用于治疗癌症的一种或多种性质，包括在癌细胞中的选择性复制；病毒发病机制减弱；增强溶解活性；修饰可以导致腺病毒的快速清除的抗病毒免疫应答；以及病毒诱导的全身抗肿瘤免疫的修饰。
在特定实施例中，本公开提供了Delta-24或Delta-24-RGD腺病毒，其包含插入的嵌合人/小鼠CD40配体核酸代替部分或完全缺失的E3区域，其中异源核酸包含编码嵌合人/小鼠CD40配体转基因的序列。
在一些实施例中，本公开涉及一种方法，该方法包括向患有肿瘤的患者给予包括复制型溶瘤腺病毒的组合物，所述组合物包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体。在特地实施例中，溶瘤腺病毒和至少一种嵌合人/小鼠CD40配体可以如上所述。
在一些实施例中，包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒可以是Delta-24-MEM40复制型腺病毒。
在另一个实施例中，包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒可以是Delta-24-RGD-MEM40复制型腺病毒。
无论如何选择复制型溶瘤腺病毒和嵌合人/小鼠CD40配体，包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的复制型溶瘤腺病毒可用于治疗癌症，其中腺病毒通过肿瘤内注射给药。然而，也可以考虑其他递送途径，包括静脉内、腹膜内、气管内、肌肉内、颅内、经内窥镜、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注。
尽管不受理论束缚，但是包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的复制型溶瘤腺病毒可具有双重作用机制：1)通过癌细胞中溶瘤腺病毒的选择性病毒复制杀伤肿瘤细胞，以及2)诱导由病毒免疫诱导和CD40配体免疫激活产生的全身性抗肿瘤免疫。
调节元件
包含在本公开中有用的载体中的表达盒含有(以5'至3'方向)与蛋白编码序列可操作地连接的转录启动子，包含插入序列的剪接信号和转录终止/多腺苷酸化序列。控制真核细胞中蛋白编码基因转录的启动子和增强子由多种遗传元件组成。细胞机器收集并整合每个元件递送的调节信息，允许不同的基因进化出不同的，通常是复杂的转录调节模式。在本公开的上下文中使用的启动子包括组成型、诱导型和组织特异性启动子。
启动子/增强子
嵌合人/小鼠CD40配体核酸表达可以在哺乳动物细胞优选人肿瘤细胞中起作用的启动子的控制下。嵌合人/小鼠CD40配体核酸表达可以在非腺病毒启动子的控制下。在一个实施例中，指导嵌合人/小鼠CD40配体表达的启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
本文提供的表达构建体包含驱动编程基因表达的启动子。启动子通常包含用于定位RNA合成的起始位点的序列。最好的示例是TATA盒子，但在一些缺少TATA盒子的启动子中，例如哺乳动物末端脱氧核苷酸转移酶基因的启动子和SV40晚期基因的启动子，覆盖起始位点的离散元件本身有助于固定起始位置。另外的启动子元件调节转录起始的频率。这些通常位于起始位点上游30至110bp的区域，尽管已经显示启动子也包含起始位点下游的功能元件。为了使编码序列“在启动子的控制下”，将转录阅读框的转录起始位点的5'端定位于所选启动子的“下游”(即3')。“上游”启动子刺激DNA的转录并促进编码的RNA的表达。
启动子元件之间的间隔通常是柔性的，因此当元件相对于彼此反转或移动时保持启动子功能。在tk启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隔可以增加到50bp。取决于启动子，似乎单个元件可以协同或独立地起作用以激活转录。启动子可以或可以不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列转录激活的顺式作用调节序列。
启动子可以与核酸序列天然相关，并通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5'非编码序列而获得。这种启动子可称为“内源性”。类似地，增强子可以与位于该序列的下游或上游的核酸序列天然相关。或者，通过将编码核酸区段定位在重组或异源启动子的控制下，将获得某些优点，所述重组或异源启动子是指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的启动子。重组或异源增强子还指在其天然环境中通常不与核酸序列相关的增强子。此类启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，以及从任何其他腺病毒或原核或真核细胞分离的启动子或增强子，以及非“天然存在的”启动子或增强子，即，含有不同转录调节区的不同元件，和/或改变表达的突变。
使用启动子和/或增强子可能是重要的，所述启动子和/或增强子有效地指导DNA片段在选择用于表达的细胞器、细胞类型、组织、器官或生物体中的表达。分子生物学领域的技术人员通常知道用于蛋白表达的启动子、增强子和细胞类型组合的用途。所用的启动子可以是组成型的、组织特异性的、可诱导的和/或在适当条件下有用的，以指导引入的DNA片段的高水平表达，例如，有利于大规模生产重组蛋白和/或肽。启动子可以是异源的或内源的。
启动子的非限制性示例包括早期或晚期病毒启动子，例如SV40早期或晚期启动子、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)早期启动子；和真核细胞启动子。
起始信号和链接表达
特定的起始信号也可以用于本公开中提供的表达构建体中，用于编码序列的有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子或相邻序列。可能需要提供外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。本领域普通技术人员将能够容易地提供必要的信号。众所周知，起始密码子必须在所需编码序列的阅读框“框内”，以确保整个插入的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可以增强表达效率。
在某些实施例中，内部核糖体进入位点(IRES)元件的使用用于产生多基因或多顺反子信息。IRES元件可以绕过5'甲基化帽依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier et al.,1988Molecular and Cellular Biology)。已经描述了来自小核糖核酸病毒家族的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier et al.,1988Molecular and Cellular Biology)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak etal.,1991Nature)。IRES元件可以与异源开放阅读框相连接。多个开放阅读框可以一起转录，每个都由IRES分隔，创建多顺反子信息。IRES元件使核糖体可以接近每个开放阅读框以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子可以有效表达多个基因以转录单个信息(参见美国专利号5,925,565和5,935,819，各自通过引用并入本文)。
病毒修饰方法
所提及的各种基因可通过本领域熟知的几种技术在功能上失活，包括基因缺失、取代或插入。类似地，可以通过本领域技术人员熟知的方法将免疫调节基因(包括MEM40)插入病毒基因组中。腺病毒中的这些类型的修饰可以通过同源重组方法进行。例如，腺病毒基因组DNA可以与包含侧翼为同源腺病毒序列的突变序列的质粒载体一起转染，导致DNA重组和用新的突变序列区域取代亲本腺病毒基因组DNA区域。
包含嵌合人/小鼠CD40配体的复制型溶瘤腺病毒的示例性构建体示于图1-2中。
图1示意性地表示Delta-24-RGD-MEM40(DNX-MEM40)的构建体，其是表达MEM40的复制型腺病毒。显示了DNX-MEM40。简言之，从E1区域删除24个核苷酸的序列。此外，删除E3区域。编码RGD肽CDCRGDCFC的27个核苷酸序列也插入腺病毒纤维序列的H1旋钮结构域。最后，将包含MEM40cDNA的MEM40表达盒插入缺失的E3区域，所述MEM40cDNA上游侧翼为CMV启动子并且下游侧翼为牛生长激素多腺苷酸化信号。
图2示意性地表示Delta-24-MEM40的构建体，Delta-24-MEM40是表达MEM40的复制型腺病毒。显示了Delta-24-MEM40。构建体类似于DNX-MEM40(图1)，不同之处在于它使用野生型腺病毒纤维而不插入编码RGD肽的核苷酸序列。
筛选用于治疗效用的腺病毒的方法
本公开的溶瘤腺病毒或其变体或衍生物可通过检查其在肿瘤细胞中的溶解潜力来评估其治疗效用。肿瘤细胞可包括衍生自患者活组织检查或手术切除的原发性肿瘤细胞。或者，肿瘤细胞可包括肿瘤细胞系。通过用连续稀释的腺病毒感染细胞并测定细胞溶解效力(例如IC50)，可以在体外肿瘤细胞系中测定本公开的腺病毒的细胞溶解活性。确定细胞溶解活性的具体方法可包括但不限于MTS、MTT和ATP比色测定。
本公开的溶瘤腺病毒的治疗指数(引起治疗效果的治疗剂的量与引起毒性的量的比较)可以通过比较肿瘤细胞系中腺病毒的细胞溶解效力的效力与匹配的正常细胞中的细胞溶解效力来计算。
本公开的溶瘤腺病毒可以通过评估它们感染肿瘤细胞和/或正常细胞以及表达由溶瘤腺病毒编码的功能性嵌合人/小鼠CD40配体多肽的能力来进一步评估治疗效用。可以使用特异性识别人或小鼠CD40抗体结合区的抗体通过流式细胞术评估在感染细胞的细胞表面上表达的嵌合人/小鼠CD40配体。还可以使用体外生物测定来检查嵌合人/小鼠CD40配体功能活性，其中用编码嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒感染的肿瘤细胞或正常细胞与稳定表达与下游荧光素酶反应元件融合的CD40受体的效应细胞混合，并测量诱导的荧光素酶表达。
本公开的溶瘤腺病毒可进一步评估其靶向肿瘤细胞生长的能力和在小鼠的同源或异种肿瘤模型中具有天然衍生或移植肿瘤的小鼠中减少肿瘤发生或肿瘤细胞负荷的能力。通过肿瘤尺寸测量的肿瘤负荷、对肿瘤再激发的免疫保护和动物存活都是治疗效用和动物肿瘤模型的可能测量。
药物组合物
如上所述，提供了药物组合物，其包含腺病毒(如本文所述)，以及一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。在本公开的一些实施例中，腺病毒是复制型溶瘤腺病毒。在进一步的实施例中，腺病毒是Delta-24-MEM40或Delta-24-RGD-MEM40。
在本公开的某些实施例中，本文提供的组合物可含有药学上可接受的浓度的缓冲剂、盐、防腐剂以及其他相容的稀释剂或载剂。选择药学上可接受的稀释剂的比例和特性以在生理学上相容，并且在特定的实施例中，以维持腺病毒的生存力。将特定的药物组合物缓冲至合适的pH并与生理流体等渗。
本文提供的药物组合物可通过多种方法制备，以制备适于给予患者的组合物，使得有效量的活性物质与药学上可接受的载剂混合成混合物。合适的载剂描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)中。
可以在生理学上合适的缓冲液中制备病毒溶液。代表性的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物可以以总组合物重量的约0.001％至约10％的量存在。
用于选择和制备合适制剂的代表性程序和成分描述于例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy，Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(May 1,2005和The United States PharmacopE1A:The National Formulary(USP 40–NF 35andSupplements)。
在不同实施例中，组合物通过直接在疾病部位(例如肿瘤部位)注射(皮下、静脉内、肌肉内等)给药，或者通过口服给药，或者通过透皮给药。
适于注射使用的药物组合物的形式包括无菌水溶液或分散液(其中术语'无菌'并不意味着表明腺病毒已被杀死，实际上，在如上所述的特定实施例中腺病毒是具有复制能力的。在所有情况下，该形式应该是无菌的并且在某种程度上必须是流动的，以便通过注射器或导管展开。
此外，药物组合物可含有防腐剂(在某种程度上这些防腐剂不会干扰病毒的作用。防腐剂的代表性示例可包括，例如，苯扎氯铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲酸钠。在进一步的实施例中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物可以以总组合物重量的约0.0001至约2％的量存在。
包含腺病毒的腺病毒或药物组合物可以包装为单个小瓶或包装用于给药。含有病毒或药物组合物的试剂盒还可以包括制备和给予病毒或药物组合物的说明书。
治疗和给药方法
在本公开的各种实施例中，还提供了用于治疗癌症的方法，包括向患有本文所述的癌症腺病毒的受试者给药。在进一步的实施例中，腺病毒是Delta-24-MEM40或Delta-24-RGD-MEM40。无论选择的溶瘤腺病毒和嵌合人/小鼠CD40配体如何，包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒可用于治疗癌症，由此通过肿瘤内注射给予病毒。然而，也可以考虑其他递送途径，包括静脉内、腹膜内、气管内、肌肉内、颅内、经内窥镜、病灶内、经皮、皮下、局部或通过直接注射或灌注。
在特定实施例中，使用如本文所述的组合物(例如，药物组合物)治疗癌症。如上所述，本文所用的术语“癌症”是指一种疾病大家族，其特征在于体内细胞的不受控制的生长。癌症的代表性形式包括癌、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤和上述的混合类型。进一步的示例包括但不限于胆管癌、膀胱癌、脑胶质瘤如胶质母细胞瘤、乳腺癌、宫颈癌、CNS肿瘤(如胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、血管瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、结肠直肠癌、子宫内膜癌、包括白血病和淋巴瘤的造血细胞癌、肝细胞癌、肾癌、喉癌、肺癌、黑素瘤、口腔癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、鳞状细胞癌和甲状腺癌。癌症可能是弥散性的(例如，白血病)，包括实体瘤(例如，肉瘤，诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤和成骨肉瘤)，或这些的某些组合(例如，具有实体瘤和播散性或弥散性癌细胞的转移性癌症)。例如，任何有资格接受自体或同种异体干细胞移植的癌症患者将认为是该疗法的候选者。
在一些实施例中，给药可以通过直接给予于肿瘤或肿瘤的原位(例如，在手术切除或消融治疗后)来完成。可以通过直接注射或通过在选定的一段时间内输注来进行给药。可以通过细导管或套管直接注射到肿瘤中(肿瘤内注射)。对于某些实施例，本文提供的药物组合物可以在MR程序内指导下通过微机电(MEMS)系统递送。特别地，通过使用诸如AlcyoneLifesciences的Alcyone MEMS Cannula(AMC)之类的套管，在没有显著的回流或回流的情况下实现肿瘤内注射。装置的代表性示例描述于美国专利8,992,458和美国专利公开2013/0035660、2013/0035574和2013/0035560中，其各自通过引用整体并入本文。
当给予受试者时，给予有效量的如本文所述的组合物以治疗(例如，缓和、改善、缓解、减轻、稳定、预防癌症的扩散、减缓或延缓癌症的进展或治愈)。例如，它可以是足以实现减少数量或破坏癌细胞或肿瘤细胞的效果或通过抑制这些细胞的生长和/或增殖的量。为了临床有效，取决于治疗方案，可以给予本文提供的组合物一次或多次。
使用包含编码至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的基因的溶瘤腺病毒进行治疗的方案可包括单次给药或多次给药。可以对重复的时间表和/或响应一个或多个先前给药的一个或多个功效指标或一个或多个先前给药的副作用进行多次给药，其中，对于受益于本公开的本领域普通技术人员来说，这是显而易见的。
本文提供的组合物可以多种浓度提供。例如，可以提供的腺病毒的剂量，其范围从大于约109个噬斑形成单位(“pfu”)的剂量，在约102至109pfu之间，在约102至约107pfu之间，在约103至约106pfu之间，或在约104至约105pfu之间变化。
在一些实施例中，溶瘤腺病毒以106-1013噬斑形成单位(pfu)的剂量给药。
要使用的药物组合物的剂量可取决于所治疗的具体病症、病症的严重程度、个体患者参数，包括年龄、身体状况、大小和体重、治疗的持续时间、同时治疗的性质(如果有的话)，特定的给药途径以及健康从业者的知识和专业知识范围内的其他类似因素。此外，剂量可取决于产品的可用性。
尽管不受理论束缚，但包含至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒可具有双重作用机制：1)通过癌细胞中溶瘤腺病毒的选择性病毒复制杀死肿瘤细胞，2)诱导由病毒免疫诱导和CD40配体免疫激活产生的全身性抗肿瘤免疫。
在一些实施例中，组合物还包含药学上可接受的载体。“药学上可接受的”是指载体适合于用于给予患者的药物。药学上可接受的载体可以根据给药途径、特定溶瘤腺病毒株所需的储存条件以及对于受益于本公开的本领域普通技术人员显而易见的其他考虑因素而变化。在一些实施例中，药学上可接受的载体可以是盐水。
在一些实施例中，组合物可进一步包含佐剂，例如肿瘤细胞的病毒侵入增强子，诱导构建体中编码至少一种嵌合人/小鼠CD40配体的基因的转录的诱导分子，其中所述基因受诱导物分子激活的启动子等的控制。
另外的疗法
在一些实施例中，所述方法可以进一步包括用编码嵌合人/小鼠CD40的溶瘤腺病毒联合一种或多种另外的疗法进行治疗。另外的疗法可以是放射疗法、手术(例如，乳房肿瘤切除术或乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法，生物疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。另外的疗法可以是佐剂或新辅助疗法的形式。
一旦将组合物给予于受试者(例如人)，可以通过多种方法测量组合物的生物活性。可以评估的代表性参数包括例如成像，和/或通过例如在例如Kochenderfer et al.,J.Immunotherapy,32(7):689-702(2009),和Herman et al.,J.Immunological Methods,285(1):25-40(2004)中描述的细胞毒性测定。在某些实施例中，本文提供的组合物的生物活性还可以通过测定某些细胞因子(例如γ-IFN、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量。在本公开的其他实施例中，可以通过评估临床结果(例如肿瘤负担或负荷的减少)来评估生物活性。
可以在给予溶瘤腺病毒之前、同时或之后给予一种或多种另外的疗法中的任何一种或全部。
制品或试剂盒
本文还提供了包含编码嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒的制品或试剂盒。所述制品或试剂盒可进一步包含包装插页，其包含使用编码嵌合人/小鼠CD40配体的溶瘤腺病毒来治疗或延迟个体癌症进展或增强患有癌症的个体的免疫功能的说明。编码本文所述的嵌合人/小鼠CD40配体的任何溶瘤腺病毒株可包括在制品或试剂盒中。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。容器可以由多种材料形成，例如玻璃、塑料(例如聚氯乙烯或聚烯烃)，或金属合金(例如不锈钢)。在一些实施例中，容器容纳制剂，并且容器上的或与容器相关联的标签可指示使用说明。制品或试剂盒可以进一步包括从商业和用户角度所需的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器和具有使用说明的包装插页。在一些实施例中，制品还包括一种或多种另一种药剂(例如化学治疗剂和抗肿瘤剂)。用于一种或多种药剂的合适容器包括例如瓶子、小瓶、袋子和注射器。
示例
示例1
pShuttlE3.2-MEM40的构建和表征
使用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen)按照制造商的说明分离腺病毒-ISF35的DNA(批号MEM-ADV-FP-009)。通过PCR扩增含有巨细胞病毒启动子、MEM40编码序列和牛生长激素聚腺苷酸化序列的1.86kb PCR片段。将分离的DNA用作模板，并分别使用在5'和3'末端含有BglII和MfeI限制酶位点的引物对。将得到的PCR产物用BglII和MfeI消化，并连接到用BamHI和EcoRI消化的pShutt1E3.2中，以逆时针方向将MEM40表达盒插入E3的位置。用连接反应转化DH5细胞(Life Technologies)以产生含有MEM40表达盒(pShutt1E3.2-MEM40)的穿梭载体。对pShutt1E3.2-MEM40克隆进行测序以确认插入的MEM40表达盒的完整性。
示例2
Delta-24-RGD-MEM40的构建体
用NaeI消化pShutt1E3.2-MEM40以产生含有MEM40盒和卡那霉素抗性基因的转移片段以及左侧和右侧翼区以进行重组。为了构建重组Delta-24-RGD-MEM40，将BJ5138细胞(Agilent Technologies)与转移片段和含有Delta-24-RGD腺病毒骨架的质粒pVK526共转化，产生pVK526-MEM40/Kan。用得到的pVK526-MEM40/Kan转化DH10B细胞(LifeTechnologies)以分离更浓缩的质粒DNA。将从DH10B细胞分离的pVK526-MEM40/Kan进行HindIII限制酶消化，然后在1％琼脂糖凝胶上分析，以验证Delta-24-RGD-MEM40基因组的完整性。然后用SwaI消化pVK526-MEM40/Kan以除去卡那霉素抗性基因并通过连接重新环化以产生pVK526-MEM40。
为了拯救Delta-24-RGD-MEM40病毒，用PacI消化pVK526-MEM40，并按照制造商的说明使用Lipofectamine 3000(Life Technologies)转染到A549细胞中。当观察到细胞质效应时，收获转染的A549细胞单层，并使用细胞裂解物感染新鲜的A549细胞以扩增病毒。验证所得病毒在E1A基因中24bp缺失的存在，在纤维基因中的RGD插入，以及在E3基因位置的MEM40表达盒插入。
示例3
Delta-24-RGD-MEM40的表征
为了表征Delta-24-RGD-MEM40，将A549细胞用Delta-24-RGD-MEM40感染24小时，并通过使用PE标记的特异于小鼠CD154的抗体(克隆号MR-1)的流式细胞仪分析以确认MEM40的细胞表面表达。另外，使用CD40生物测定试剂盒(Promega Corporation)确认MEM40的生物活性。
以上公开的特定实施例仅是说明性的，因为本公开可以以受益于本文教导的本领域技术人员显而易见的不同但等同的方式进行修改和实践。例如，可以以不同的顺序执行上述处理步骤。此外，除了在下面的权利要求中描述的之外，对于本文所示的结构或设计的细节没有限制。因此显而易见的是，可以改变或修改上面公开的特定实施例，并且所有这些变化都认为在本公开的范围和精神内。
因此，本文寻求的保护如下面的权利要求中所述。
参考文献
以下参考文献，在一定程度上它们提供了补充本文所述的那些的示例性程序或其他细节，通过引用具体地并入本文。
Aurelian 2016Onco.Targets Ther.9:2627-2637
Fueyo et al.,2000Oncogene,19:2-12
Graham et al.,1991Methods Mol Biol 7:109-128
Herman et al.,2004J.Immunological Methods,285(1):25-40
Kochenderfer et al.,2009J.Immunotherapy 32(7):689-702
Kohlhapp et al.2016Clinical Cancer Research 22(5):1048-1054
Lawler et al.,2017JAMA Oncology 3(6):841-849
Macejak et al.,1991Nature 353:90-93
Pasqualini et al.,1997Nat Biotechnol,15:542-546
PCT公开专利申请WO 95/27071
PCT公开专利申请WO 96/33280
Pelletier et al.,1988Molecular and Cellular Biology 8(3):1103-1112
Racher et al.,1995Biotechnol Tech 9:169
Remington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(May 1,2005and in The United States Pharmacopeia:The NationalFormulary(USP 40–NF 35and Supplements).
Remington's Pharmaceutical Sciences 1985(Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA)
Roizman 1996PNAS 93:11307-11312
Russell et al.,2014Nature Biotechnology 30(7):658-670
Singh et al.,2017Nature Communications 8(1447):1-10
Suzuki et al.,2002Clin.Cancer Res.8(11):3348-59
Tollefson et al.,1996Virology 220:152-162
美国专利号5,925,565
美国专利号6,210,946
美国专利号6,284,742
美国专利号6,312,699
美国专利号6,555,368
美国专利号6,649,396
美国专利号6,815,200
美国专利号6,824,771
美国专利号6,841,540
美国专利号6,955,808
美国专利号7,045,348
美国专利号7,223,593
美国专利号7,297,542
美国专利号7,495,090
美国专利号7,928,213
美国专利号8,168,168
美国专利号8,992,458
美国专利号9,061,055
美国专利号5,935,819
美国专利申请号2003/0138405
美国专利申请号2006/0147420
美国专利申请号2009/0175830
美国专利申请号2013/0035574
美国专利申请号2013/0035660
美国专利申请号2014/0377221
美国专利申请号2014/0377294
美国专利申请号2015/0306160
美国专利申请号2016/0143967
美国专利申请号2016/0289645
美国专利申请号2013/0035560
van Kooten et al.,2000Journal of Leukocyte Biology 67:2-17
序列表（SEQUENCE LISTING）
<110> 曼珍有限责任公司（Memgen, L.L.C.）
德那翠丝有限公司（DNAtrix）
<120> 武装复制型溶瘤腺病毒（ARMED REPLICATION-COMPETENT ONCOLYTICADENOVIRUSES）
<130> 2176.000700
<150> US 62/584,008
<151> 2017-11-09
<150> US 62/437,474
<151> 2016-12-21
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
<400> 1
atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60
atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180
gaagattttg tattcataaa aaagctaaag agatgcaaca aaggagaagg atctttatcc 240
ttgctgaact gtgaggagat gagaaggcaa tttgaagacc ttgtcaagga tataacgtta 300
aacaaagaag agaaaaaaga aaacagcttt gaaatgcaaa gaggtgatga ggatcctcaa 360
attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420
aagaaaggat attataccat gaaaagcaac ttggtaaccc tggaaaatgg gaaacagctg 480
acggttaaaa gacaaggact ctattatatc tatgctcaag tcaccttctg ctctaatcgg 540
gagccttcga gtcaacgccc attcatcgtc ggcctctggc tgaagcccag cagtggatct 600
gagagaatct tactcaaggc ggcaaatacc cacagttcct cccagctttg cgagcagcag 660
tctgttcact tgggcggagt gtttgaatta caaccaggtg cttcggtgtt tgtcaatgtg 720
actgatccaa gccaagtgag ccatggcact ggcttcacgt cctttggctt actcaaactc 780
tga 783
<210> 2
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
<400> 2
atgatcgaaa catacaacca aacttctccc cgatctgcgg ccactggact gcccatcagc 60
atgaaaattt ttatgtattt acttactgtt tttcttatca cccagatgat tgggtcagca 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaaggctg gacaagatag aagatgaaag gaatcttcat 180
gaagattttg tattcatgaa aacgatacag agatgcaaca caggagaaag atccttatcc 240
ttactgaact gtgaggagat taaaagccag tttgaaggct ttgtgaagga tataatgtta 300
aacaaagagg agacgaagaa agatgaggat cctcaaattg cagcacacgt tgtaagcgaa 360
gccaacagta atgcagcatc cgttctacag tgggccaaga aaggatatta taccatgaaa 420
agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480
tatatctatg ctcaagtcac cttctgctct aatcgggagc cttcgagtca acgcccattc 540
atcgtcggcc tctggctgaa gcccagcagt ggatctgaga gaatcttact caaggcggca 600
aatacccaca gttcctccca gctttgcgag cagcagtctg ttcacttggg cggagtgttt 660
gaattacaac caggtgcttc ggtgtttgtc aatgtgactg atccaagcca agtgagccat 720
ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759
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<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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attgcagcac acgttgtaag cgaagccaac agtaatgcag catccgttct acagtgggcc 420
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
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<211> 783
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
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<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
<400> 6
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<220>
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<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
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<220>
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<211> 783
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
<400> 11
atgatagaaa catacagcca accttccccc agatccgtgg caactggact tccagcgagc 60
atgaagattt ttatgtattt acttactgtt ttccttatca cccaaatgat tggatctgtg 120
ctttttgctg tgtatcttca tagaagattg gataaggtcg aagaggaagt aaaccttcat 180
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<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 嵌合人/小鼠CD40配体（chimeric human/mouse CD40 ligand）
<400> 12
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agcaacttgg taaccctgga aaatgggaaa cagctgacgg ttaaaagaca aggactctat 480
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ggcactggct tcacgtcctt tggcttactc aaactctga 759

Claims (38)

1.一种组合物，包括：
复制型溶瘤腺病毒，其含有插入腺病毒基因组的非必需区域的异源核酸，所述核酸包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，复制型溶瘤腺病毒包含部分或全部E3基因区域的缺失。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中，将包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列的核酸插入缺失E3的基因区域。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，将包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列的核酸以与天然E3基因相反的方向插入。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中，CD40激动剂是至少一种CD40配体(CD40L)。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中，至少一种CD40L是嵌合人/小鼠CD40配体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中，至少一种嵌合人/小鼠CD40配体选自由ISF30(SEQ ID NO：1)、ISF31(SEQ ID NO：2)、ISF32(SEQ ID NO：3)、ISF33(SEQ ID NO：4)、ISF34(SEQ ID NO：5)、ISF35(MEM40)(SEQ ID NO：6)、ISF36(SEQ ID NO：7)、ISF37(SEQ ID NO：8)、ISF38(SEQ ID NO：9)、ISF39(SEQ ID NO：10)、ISF40(SEQ ID NO：11)和ISF41(SEQ IDNO：12)组成的组。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中，至少一种嵌合人/小鼠CD40配体是MEM40。
9.根据权利要求6所述的组合物，其中，至少一种嵌合人/小鼠CD40配体与选自由ISF30(SEQ ID NO：1)、ISF31(SEQ ID NO：2)、ISF32(SEQ ID NO：3)、ISF33(SEQ ID NO：4)、ISF34(SEQ ID NO：5)、ISF35(MEM40)(SEQ ID NO：6)、ISF36(SEQ ID NO：7)、ISF37(SEQ ID NO：8)、ISF38(SEQ ID NO：9)、ISF39(SEQ ID NO：10)、ISF40(SEQ ID NO：11)和ISF41(SEQ IDNO：12)组成的组的配体具有至少90％的同一性。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中，与CD40激动剂可操作地连接的转录控制元件是转录启动子。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，转录启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
12.根据权利要求1所述的组合物，其中，复制型溶瘤腺病毒是人5型腺病毒。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，复制型溶瘤腺病毒是Delta 24腺病毒或Delta-24-RGD腺病毒。
14.根据权利要求1所述的组合物，还包含药学上可接受的载体。
15.一种方法，包括：
向患有癌症的患者给予复制型溶瘤腺病毒，所述溶瘤腺病毒具有插入到腺病毒基因组的非必需区域的异源核酸，所述核酸包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，复制型溶瘤腺病毒包含部分或全部E3基因区域的缺失。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，将包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列的核酸插入缺失E3的基因区域。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，将包含编码与转录控制元件可操作地连接的CD40激动剂的序列的核酸以与天然E3基因相反的方向插入。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，复制型溶瘤腺病毒是Delta 24腺病毒或Delta-24-RGD腺病毒。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，CD40激动剂是至少一种CD40配体(CD40L)。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，至少一种CD40L是嵌合人/小鼠CD40配体。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，至少一种嵌合人/小鼠CD40配体选自由ISF30(SEQ ID NO：1)、ISF31(SEQ ID NO：2)、ISF32(SEQ ID NO：3)、ISF33(SEQ ID NO：4)、ISF34(SEQ ID NO：5)、ISF35(MEM40)(SEQ ID NO：6)、ISF36(SEQ ID NO：7)、ISF37(SEQ ID NO：8)、ISF38(SEQ ID NO：9)、ISF39(SEQ ID NO：10)、ISF40(SEQ ID NO：11)和ISF41(SEQ IDNO：12)组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，至少一种嵌合人/小鼠CD40配体是MEM40。
24.根据权利要求21所述的方法，其中，至少一种嵌合人/小鼠CD40配体与选自由ISF30(SEQ ID NO：1)、ISF31(SEQ ID NO：2)、ISF32(SEQ ID NO：3)、ISF33(SEQ ID NO：4)、ISF34(SEQ ID NO：5)、ISF35(MEM40)(SEQ ID NO：6)、ISF36(SEQ ID NO：7)、ISF37(SEQ ID NO：8)、ISF38(SEQ ID NO：9)、ISF39(SEQ ID NO：10)、ISF40(SEQ ID NO：11)和ISF41(SEQ IDNO：12)组成的组的配体具有至少90％的同一性。
25.根据权利要求15所述的方法，其中，与CD40激动剂可操作地连接的转录控制元件是转录启动子。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，转录启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。
27.根据权利要求15所述的方法，其中，溶瘤腺病毒作为包含药学上可接受的载体的组合物给予。
28.根据权利要求15所述的方法，其中，患者患有选自原发性或转移性癌症的癌症。
29.根据权利要求15所述的方法，其中，患者患有脑癌或膀胱癌。
30.根据权利要求15所述的方法，其中，溶瘤腺病毒通过肿瘤内、静脉内、腹膜内、气管内、肌肉内、颅内、内窥镜、病灶内、经皮、皮下、区域或通过直接注射或灌注给予。
31.根据权利要求15所述的方法，其中，溶瘤腺病毒给予一次或多次。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，复制型溶瘤腺病毒以106-1013噬斑形成单位(pfu)的剂量给予。
33.根据权利要求15所述的方法，还包括：
给予至少一种另外的治疗剂。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，至少一种另外的治疗剂是化学疗法、免疫疗法、手术、放射疗法、病毒疗法或生物疗法。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，在给予复制型溶瘤腺病毒之前将至少一种另外的治疗剂给予于患者。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，在给予复制型溶瘤腺病毒的同时将至少一种另外的治疗剂给予于患者。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，在给予复制型溶瘤腺病毒后将至少一种另外的治疗剂给予于患者。
38.根据权利要求15所述的方法，其中，患者是人。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017212713B2 (en) 2016-01-27 2023-01-19 Oncorus, Inc. Oncolytic viral vectors and uses thereof
RU2758007C2 (ru) 2016-06-30 2021-10-25 Онкорус, Инк. Доставка терапевтических полипептидов посредством псевдотипированных онколитических вирусов
SG11202000691XA (en) 2017-07-26 2020-02-27 Oncorus Inc Oncolytic viral vectors and uses thereof
WO2019133847A1 (en) 2017-12-29 2019-07-04 Oncorus, Inc. Oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
WO2019226445A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Corning Incorporated Vacuum slow cooling device for optical fiber draw
EP3853369A1 (en) * 2018-09-17 2021-07-28 Erasmus University Medical Center Rotterdam Adenosomes
CA3156880A1 (en) * 2019-11-06 2021-05-14 Memgen, Inc. Replication-enhanced oncolytic adenoviruses
EP4210724A1 (en) * 2020-09-11 2023-07-19 Memgen, Inc. Enhancing immunity using chimeric cd40 ligand and coronavirus vaccine

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030220473A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 Prussak Charles E. Novel chimeric CD154
CN103221423A (zh) * 2010-09-24 2013-07-24 昂克斯治疗有限公司 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4228457A1 (de) 1992-08-27 1994-04-28 Beiersdorf Ag Herstellung von heterodimerem PDGF-AB mit Hilfe eines bicistronischen Vektorsystems in Säugerzellen
US6312699B1 (en) 1994-03-28 2001-11-06 Uab Research Foundation Ligands added to adenovirus fiber
US7252989B1 (en) 1994-04-04 2007-08-07 Board Of Regents, The University Of Texas System Adenovirus supervector system
FR2722208B1 (fr) 1994-07-05 1996-10-04 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau site interne d'entree des ribosomes, vecteur le contenant et utilisation therapeutique
DE69628744D1 (de) 1995-04-17 2003-07-24 Univ Texas System Austin Board Adenovirus helfervirus system
EP1053013A4 (en) 1998-02-06 2004-12-22 Uab Research Foundation ADENOVIRUS VECTOR CONTAINING A HETEROLOGICAL PEPTIDEPITOP IN THE HI LOOP OF THE FIBER BUTTON
CA2321135A1 (en) 1998-02-17 1999-08-19 Uab Research Foundation Modified adenovirus containing a fiber replacement protein
US6815200B1 (en) 1998-02-17 2004-11-09 The Uab Research Foundation Modified adenovirus containing a fiber replacement protein
US6841540B1 (en) 1998-09-29 2005-01-11 The Uab Research Foundation Immunomodulation by genetic modification of dendritic cells and B cells
CA2344655A1 (en) 1998-09-29 2000-04-06 The Uab Research Foundation Immunomodulation by genetic modification of dendritic cells and b-cells
AU2869300A (en) 1999-02-05 2000-08-25 Uab Research Foundation, The Fiber receptor-independent system for the propagation of adenoviral vectors
ATE540686T1 (de) 1999-05-12 2012-01-15 Uab Research Foundation Adenovirus mit erhöhter infektiosität und konditionaler replikationsfähigkeit und deren verwendungen
US20040175362A1 (en) 1999-05-12 2004-09-09 Curiel David T. Infectivity-enhanced conditionally-replicative adenovirus and uses thereof
DE60031994T2 (de) 1999-09-24 2007-09-20 The Uab Research Foundation, Birmingham Kapsidmodifiziertes rekombinantes Adenovirus und Verfahren zu dessen Anwendung
US6955808B2 (en) 1999-09-24 2005-10-18 Uab Research Foundation Capsid-modified recombinant adenovirus and methods of use
DE60107203T3 (de) 2000-01-21 2009-07-23 Biovex Ltd. Herpes-virusstämme für die gentherapie
US20030138405A1 (en) 2001-04-17 2003-07-24 Juan Fueyo Conditionally replicative adenovirus to target the Rb and Rb-related pathways
US20060147420A1 (en) 2004-03-10 2006-07-06 Juan Fueyo Oncolytic adenovirus armed with therapeutic genes
US7045348B2 (en) 2002-07-22 2006-05-16 Vectorlogics, Inc. Adenoviral vector incorporating zipper peptide-modified fiber protein and uses thereof
US20050079158A1 (en) * 2003-06-05 2005-04-14 Shenzhen Allucks Biotech Co., Ltd. Construct of anti-cancer recombinant adenovirus, method for preparing the same and use thereof
EP2114432B1 (en) * 2006-12-05 2014-07-30 Memgen LLC Methods of increasing cancer sensitivity to chemotherapeutic agents using chimeric isf35
US20130035660A1 (en) 2011-08-01 2013-02-07 Alcyone Lifesciences, Inc. Multidirectional microfluidic drug delivery devices with conformable balloons
CA2862390A1 (en) 2012-01-25 2013-08-01 Dnatrix, Inc. Biomarkers and combination therapies using oncolytic virus and immunomodulation
JP6325459B2 (ja) 2012-02-02 2018-05-16 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 腫瘍関連異種抗原を発現するアデノウイルス
AU2013361601B2 (en) 2012-12-18 2018-04-19 Alcyone Therapeutics, Inc. Systems and methods for reducing or preventing backflow in a delivery system
BR112015026417B1 (pt) * 2013-04-18 2024-02-27 Tilt Biotherapeutics Oy Usos de um vetor adenoviral oncolítico que codifica pelo menos uma citocina, e uma composição terapêutica de célula adotiva separada, kit farmacêutico, vetores adenovirais oncolíticos, composição farmacêutica
AU2014281826B2 (en) 2013-06-18 2019-10-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Treatment of brain cancer with oncolytic adenovirus
EP3653714A1 (en) * 2013-11-22 2020-05-20 DNAtrix, Inc. Adenovirus expressing immune cell stimulatory receptor agonist(s)
US11594135B2 (en) * 2015-11-02 2023-02-28 Memgen, Inc. Methods of CD40 activation and immune checkpoint blockade
WO2017079297A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 Memgen Llc Methods for treatment of cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030220473A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 Prussak Charles E. Novel chimeric CD154
CN103221423A (zh) * 2010-09-24 2013-07-24 昂克斯治疗有限公司 溶瘤腺病毒载体及与其相关的方法和用途

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