BR112015026417B1

BR112015026417B1 - Usos de um vetor adenoviral oncolítico que codifica pelo menos uma citocina, e uma composição terapêutica de célula adotiva separada, kit farmacêutico, vetores adenovirais oncolíticos, composição farmacêutica

Info

Publication number: BR112015026417B1
Application number: BR112015026417-4A
Authority: BR
Inventors: Akseli HEMMINKI; Markus Vähä-Koskela; Siri Tähtinen; Vincenzo Cerullo
Original assignee: Tilt Biotherapeutics Oy
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2014-04-16
Publication date: 2024-02-27
Also published as: JP6580555B2; KR20160002971A; WO2014170389A8; ZA201507790B; AU2019216631B2; RU2015148920A3; EP2986311A1; JP7114532B2; US20150232880A1; US20170137786A1; ES2708749T3; KR20210084651A; KR102502974B1; CA2909432A1; RU2703438C2; AU2014255733B2; CN105307671B; AU2014255733A1; EP3461491A1; US10787645B2

Abstract

VETOR ADENOVIRAL ONCOLÍTICO, SEUS USOS, KIT, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se aos campos de ciências biológicas e medicina. Especificamente, a invenção refere-se a terapias contra câncer de seres humanos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a vetores adenovirais oncolíticos sozinhos ou juntamente com composições terapêuticas para usos terapêuticos e métodos terapêuticos para câncer. Em um aspecto, a pre sente invenção refere-se à administração separada de composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos. Além disso, a presente invenção refere-se a um kit farmacêutico e a uma composição farmacêutica, em que ambas utilizam vetores adenovirais oncolíticos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se aos campos de ciências e medicina de vida. Especificamente, a invenção refere-se a terapias contra câncer de humanos. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a vetores adenovirais oncolíticos isoladamente ou junto com composições terapêuticas para usos terapêuticos e métodos terapêuticos para câncer. Em um aspecto, a presente invenção refere- se a administração separada de composição terapêutica de célula adotiva e vetores adenovirais oncolíticos. Ademais, a presente invenção refere-se a um kit farmacêutico e a uma composição farmacêutica, em que ambas utilizam vetores adenovirais oncolíticos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] As terapias inovadoras são desenvolvidas constantemente para tratamento contra o câncer. As terapias adotivas de células (ACT) são uma abordagem potente para tratar câncer, mas também para tratar outras doenças como infecções e enxerto contra doença hospedeira. A transferência de célula adotiva é a transferência passiva de células cultivadas ex vivo, as células geralmente derivadas de imunidade, em um hospedeiro com o alvo de transferir a funcionalidade imunológica e características do transplante. A transferência de célula adotiva pode ser autóloga, como é comum em terapias adotivas de células T ou alogênica como típica para o tratamento de infecções ou enxerto contra doença hospedeira. Clinicamente, as modalidades comuns dessa abordagem incluem transferência de cada célula promotora de imunidade ou tolerogênica como linfócitos para pacientes tanto para melhorar a imunidade contra viroses e câncer como promover a tolerância na configuração de doença autoimune, como diabetes tipo I ou artrite reumatoide.

[003] Com relação à terapia contra câncer, a abordagem de ACT approach foi concebida na década de 80 por um pequeno número de grupos que trabalhou nos U.S., em que um dos grupos principais é Steven Rosenberg e colegas que trabalham na NCI. A transferência adotiva de linfócitos infiltrantes de tumor autólogo (TILs) ou células mononucleares de sangue periférico geneticamente redirecionadas foram usadas para tratar de forma sucedida pacientes com tumores sólidos avançados como melanoma, bem como pacientes com malignidades hematológicas que expressam CD19. Em ACT, os tipos de célula mais geralmente usados são as células T, às vezes, classificadas por CD8+, mas outras variações incluem células CD4+, células NK, células T delta-gama, células T reguladoras e células mononucleares de sangue periférico. As células podem ser não modificadas como na terapia de TIL ou podem ser geneticamente modificadas. Há duas maneiras comuns para alcançar o alvo genético das células T para alvos específicos de tumor. Um é transferir de um receptor de célula T com especificidade conhe3cida (terapia de TCR) e com antígeno de leucócito humano compatível (HLA, conhecido como tipo mais complexo de histocompatibilidade em roedores). O outro é a modificação de células com moléculas artificiais como receptores de antígeno quimérico (CAR). Essa abordagem não depende de HLA e é mais flexível com relação a moléculas-alvo. Por exemplo, os anticorpos de cadeia única podem ser usados e os CARs também podem incorporar domínios coestimulatórios. No entanto, os alvos de células de CAR precisam estar na membrana das células-alvo, embora as modificações de TCR possam utilizar alvos intracelulares.

[004] Durante a primeira década de desenvolvimento de ACT, o foco estava em TILs. Os TILs são encontrados in em tumores, sugerindo que os tumores estimulam uma resposta imune no hospedeiro. Esta chamada imunogenicidade de tumor é mediada por antígenos de tumor. Esses antígenos distinguem o tumor das células saudáveis, fornecendo, assim, um estímulo imunológico.

[005] Por exemplo, o Documento no US2003194804 A1 descreve um método para melhorar a reatividade de uma célula T em direção a uma célula com tumor utilizando TILs. No documento no US2003194804 A1, as células T são expostas a um agente e reintroduzidas no paciente. O agente pode reduzir ou prevenir a expressão ou interação de um Notch endógeno ou ligante Notch na célula T.

[006] O Documento no US5126132 A descreve um método para tratar câncer, em que uma quantidade de TILs autóloga eficaz e uma citocina são usadas.

[007] O Documento Diaz RM et al. (Cancer Res. 2007 Mar 15;67(6):2840-8) descreve um aumento dos níveis de circulação de células T de tumor de específico de antígeno com uso de terapia de transferência adotiva de célula T em combinação com viroterapia intratumoral de vírus de estomatite vesicular. O Documento Diaz et al. usou células OT1, isto é, uma linha celular monoclonal artificial na terapia de transferência adotiva de célula T.

[008] Embora mesmo em ensaios precoces de ACTs, houve exemplos dramáticos de benefícios de tratamento e até mesmo curas, a maioria dos pacientes não teve benefício e vários pacientes vivenciaram efeitos colaterais severos. Durante as primeiras duas décadas de terapia adotiva celular, a segurança da transferência celular por si foi boa, geralmente, mas toxidades significativas e mesmo a mortalidade foi associada aos tratamentos concomitantes usados para melhorar a terapia, incluindo quimioterapia de pré-condição e radiação e o IL-2 usado após a transferência. A pré-condição é usada para matar células supressoras como células T reguladoras e supressores derivados de mieloide no hospedeiro, para modular o microambiente de tumor e "abrir espaço" para o enxerto. O IL2 é usado após a transferência para reduzir anergia do enxerto e propagá-la.

[009] Com relação à eficiência, deixa-se espaço para o aprimoramento. A especificidade aumentada e a capacidade de matar tumor suficiente de terapias celulares, em geral, são autorizadas. Em particular, no ACT da técnica anterior, as células transferidas falharam no tráfego de tumores e mesmo quando falham, muitas vezes, tornam- se rapidamente anérgicas, são incapacitadas de outra forma para matar células com tumor ou falham na propagação resultando em um declínio rápido de números de célula. Ademais, os cânceres, frequentemente, regulam para baixo o antígeno de leucócito humano (HLA) - conhecido como maior complexo de histocompatibilidade em animais - em células com tumor, resultam na incapacidade de células T para matar, como HLA é necessário para apresentação de epítopos de tumor para o receptor de célula T.

[0010] A presente invenção fornece ferramentas e métodos eficientes para terapias contra o câncer que utilizam transferências adotivas de células.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

[0011] Um alvo da presente invenção é fornecer métodos e ferramentas simples para superar os problemas acima de terapias contra o câncer ineficientes, não seguras e imprevisíveis. Mais especificamente, a invenção fornece métodos inovadores e meios para terapia celular. Os objetivos da invenção são alcançados por vetores virais, métodos e disposições que são caracterizados pelo que é estabelecido nas reivindicações independentes. As modalidades específicas da invenção são reveladas nas reivindicações dependentes.

[0012] O presente pedido descreve a construção de vetores virais recombinantes, métodos relacionados aos vetores virais e seus usos nas linhas de células com tumor, modelos animais e pacientes com câncer.

[0013] A invenção é baseada na ideia de combinar a codificação de vetores adenovirais oncolíticos para citocinas ou vetores adenovirais com terapias adotivas de célula para tratamento contra o câncer de uma maneira inovador e inventiva. A invenção é baseada em efeitos surpreendentes, isto é, os seguintes aprimoramentos na terapia adotiva de célula T: i) recrutamento de células transferidas para o tumor, ii) propagação de células transferidas no tumor, iii) reatividade melhorada de células transferidas no tumor (Figura 20). De fato, a dita combinação de vetores virais e citocinas com terapias adotivas de célula fornece resultados mais eficazes em alvos mais amplos do que se poderia pressupor. Os efeitos da dita combinação de vetores virais que compreende transgene de citocina com transferência de célula adotiva são sinérgicos comparados aos efeitos apenas de vetores virais que compreendem transgene de citocina ou apenas transferências adotivas de células.

[0014] É um objetivo adicional da presente invenção fornecer uma combinação de linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) e interleucina-2 (IL- 2) transgênica (produzida a partir de um transgene entregue de modo viral) para o tratamento de malignidade em humanos. Os objetivos acima e vários outros objetivos e vantagens da presente invenção são alcançados por um método para tratar malignidade em humanos que compreendem administrar uma quantidade eficaz de TIL e IL-2, com ou sem quimioterapia de pré-condição e/ou radioterapia, a um paciente acometido com câncer para causar regressão ou estabilização do câncer.

[0015] A presente invenção refere-se a um método para tratar câncer em um sujeito, em que o método compreende separar a administração da composição terapêutica de célula adotiva e codificação de vetores adenovirais oncolíticos (=replicação competente em tumor, mas não em células normais) para pelo menos uma citocina a um sujeito.

[0016] A presente invenção refere-se, adicionalmente, a uma codificação de vetor adenoviral oncolítico para pelo menos uma citocina junto com composição terapêutica de célula adotiva separada para uso no tratamento contra o câncer.

[0017] A presente invenção refere-se, adicionalmente, a um uso de uma codificação de vetor adenoviral oncolítico para pelo menos uma citocina junto com composição terapêutica de célula adotiva separada na fabricação de um medicamento para tratar câncer em um sujeito.

[0018] A presente invenção também se refere a um vetor adenoviral oncolítico para uso no aumento da eficácia de terapia adotiva celular ou terapia de célula T em um sujeito.

[0019] Também, a presente invenção refere-se a um uso de um vetor adenoviral oncolítico na fabricação de um medicamento para aumentar a eficácia da terapia de célula T em um sujeito.

[0020] Também, a presente invenção refere-se a um método para aumentar a eficácia de terapia adotiva celular ou terapia de célula T em um sujeito administrando um vetor adenoviral oncolítico a um sujeito que precisa do mesmo.

[0021] A presente invenção também se refere a um kit farmacêutico que compreende uma composição terapêutica de célula adotiva e codificação de vetores adenovirais oncolíticos para pelo menos uma citocina, em que a composição terapêutica de célula adotiva é formulada em uma primeira formulação e a codificação de vetores adenovirais oncolíticos para pelo menos uma citocina são formuladas em uma segunda formulação.

[0022] Ademais, a presente invenção refere-se a um vetor adenoviral oncolítico que compreende:

[0023] uma cadeia principal de ácido nucleico de serotipo de adenovírus 5 (Ad5) que compreende um 5/3 de região globular de fibra quimérica:

[0024] promotor de E2F1 para expressão específica de tumor de E1A;

[0025] uma eliminação de 24 bp (D24) na região constante de ligação de Rb 2 de adenoviral E1;

[0026] uma eliminação de sequência de ácido nucleico de cadeias de leitura virais gp19k e 6,7k; e

[0027] uma codificação de sequência de ácido nucleico pelo menos um transgene de citocina no lugar do gp19k/6.7K eliminado na região E3 resultante em controle associado à replicação de expressão de transgene sob o promotor viral E3, em que a citocina é selecionado a partir de um grupo que consiste em alfa interferon, beta interferon, gama interferon, complemento C5a, IL-2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25- 2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2.

[0028] Ademais, a presente invenção refere-se a um vetor adenoviral oncolítico de serotipo 3 (Ad3) que compreende: uma eliminação na área E3 e um tumor específico de E3 para expressão de um transgene no lugar da área eliminada de E3.

[0029] Ainda, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um vector oncolítico da invenção.

[0030] Também, a presente invenção refere-se a um método para tratar câncer em um sujeito, em que o método compreende administração do vetor adenoviral oncolítico da presente invenção a um sujeito que precisa do mesmo. Também, a presente invenção refere-se a um vetor adenoviral oncolítico da presente invenção para uso no tratamento contra o câncer.

[0031] Também, a presente invenção refere-se a um uso de um vetor adenoviral oncolítico da presente invenção na fabricação de um medicamento para tratar câncer em um sujeito.

[0032] As vantagens das disposições da presente invenção são efeito terapêutico acentuado e efeitos colaterais reduzidos. Vários eventos adversos severos, até mesmo mortes são impedidas, por causa das melhorias na eficácia e os efeitos anti-supressores dessa abordagem podem reduzir a necessidade de quimioterapia de pré- condição e/ou radiação usada nos métodos da técnica anterior para "das espaço a" células transferidas e reduzir imunossupressão de tumor. Também, os eventos adversos severos, até mesmos mortes são impedidas, pois a adição separada de IL2 usada nos métodos da técnica anterior para propagar e sustentar células transferidas após transferi-las para um paciente não é necessária caso o vírus a produza enquanto se replica no tumor. A produção local no tumor também pode melhorar os efeitos vistos posteriormente de IL-2 (estimulação e propagação do enxerto) enquanto reduz exposição sistêmica que é a causa de eventos adversos. A presente invenção fornece tratamentos seletivos, com menos toxicidade ou danos aos tecidos saudáveis.

[0033] Também, a presente invenção fornece efeitos terapêuticos surpreendentes: i) fornecer sinais de tráfego para o tumor, por exemplo, injetando os vetores de vírus que compreendem citocinas recombinantes em tumor. Os resultados de injeção de vírus na produção de citocinas relevantes para esse efeito (na reação à ligação de vírus aos receptores de reconhecimento padrão associados a patógeno), mas efeitos muito maiores podem ser alcançados por produção adicional da citocina mais relevante como um transgene a partir do vírus. ii) reduzir tolerância aumentando sinais de perigo. A injeção de vírus por si pode alcançar isso se ligando aos receptores de reconhecimento padrão moleculares associados, mas o efeito pode ser acentuado por produção adicional de uma citocina como um transgene a partir do vírus. iii) induzir expressão de HLA. A infecção por vírus aumenta a expressão de HLA, visto que as células tentam apresentar epítopos virais para montar uma resposta de célula T anti-viral. Inesperadamente, isso pode ser usado para melhorar a terapia de célula T contra epítopos de tumor, o que requer que o HLA funcione. O efeito do vírus em HLA é mediado em parte por citocinas; produção da dita citocina a partir do vírus pode induzir, por conseguinte, a expressão de HLA também em células com tumor próximas em uma modalidade surpreendente da invenção. iv) induzir propagação de células elevando a imunossupressão, mediada pela presença do vírus por si (novamente, através dos receptores de reconhecimento padrão molecular de patógeno associados), mas acentuada pela produção de citocinas (Figura 48). Dessa forma, essa abordagem pode solucionar os obstáculos críticos que impedem atualmente terapias celulares adaptáveis.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0034] A seguir, a invenção será descrita em maiores detalhes por meio de modalidades específicas com referência aos desenhos fixados, nos quais:

[0035] a Figura 1 mostra que o tratamento com Ad5/3 adenovírus oncolítico quimérico aumentou secreção de citocina e quimiocina em tumores B16-OVA. Interferon-Y pode regular para cima a expressão de HLA (=MHC) classe I, gerando, assim, um fenótipo de célula com tumor que pode ser reconhecido de maneira eficaz por TILs. Várias quimiocinas induzíveis por IFN-Y (como RANTES, MIP-1α e MCP-1) estão envolvidas em recrutamento de célula imune, o que promove a ativação e proliferação de TIL. Também, o tráfego de TILs pode ser acentuado por regulação para cima dessas quimiocinas.

[0036] A Figura 2 mostra controle de crescimento de tumor seguindo múltiplas injeções de 5/3 adenovírus oncolítico quimérico com ou sem transferência de célula adotiva. O tratamento com adenovírus isoladamente (A) surtiu pouco efeito no crescimento de tumor de B16- OVA comparado ao tratamento com PBS. A transferência adotiva de 500.000 (B) ou 2.000.000 (C) linfócitos específicos de tumor OT-I em combinação com injeções de vírus resultaram em controle de crescimento de tumor significativo. O efeito terapêutico pobre em crescimento de tumor com uso de adenovírus isoladamente ou células OT-I em combinação com PBS destaca as maiores desvantagens de vírus oncolítico e terapias de transferência de célula adotiva usadas como agentes únicos, sustentando a finalidade da invenção para melhorar a eficácia da terapia adotiva celular com uso de adenovírus.

[0037] A Figura 3 mostra que as injeções de adenovírus induzem a célula T que trafega em tumores e aumenta a proliferação de células T transferidas adoptivamente em tumores. A) Quantidade de células transferidas adoptivamente CD8+ CFSE+ aumentada em tumores e diminuída no sangue, linfonodos de drenagem e baço de Ad camundongos tratados no dia 1 pós-tratamento, aparentemente, devido a tráfego de linfócitos. A conta de célula T CD8+ global permanece alta nos tumores de adenovírus tratados por todo o experimento, sugerindo resistência dessas células ao microambiente de tumor deletério e/ou proliferação aumentada das células T CD8+. B) Nos dias 6 e 14, a proliferação de célula OT-I foi acentuada nos Ad tumores tratados quando comparados ao grupo de PBS, visto como uma fração maior de células que tem divisão celular realizada (se movem em direção a M7) do que no grupo de PBS. Consequentemente, o tratamento com adenovírus oncolítico induz o tráfego e a proliferação de TILs transferidas adoptivamente. C) Exemplo de como o acoplamento de células positivas CFSE foi feito. M0 indica células que não se dividiram, M7 mostra células que se dividiram o suficiente para diluir CFSE para abaixar os limites detectáveis (mais de 7 vezes).

[0038] A Figura 4 revela dados a partir de humanos tratados com adenovírus oncolítico em dias indicados por setas. A injeção de vírus no tumor resultou em uma diminuição de linfócitos no sangue, refletindo seu tráfego para tumores.

[0039] A Figura 5 revela dados que injeção de adenovírus oncolítico em um tumor de um paciente com câncer humano causou influxo de células T CD8+. A injeção intratumoral de adenovírus oncolítico resultou na acumulação de células T CD8+ no tumor avaliadas a partir de biópsias com agulhas antes e após o tratamento.

[0040] A Figura 6 mostra resultados de injeções de adenovírus combinadas com transferência adotiva de células T. os camundongos com tumores subcutâneos B16-Ova foram transferidos adoptivamente com linfócitos 5x105 OT1 intraperitonealmente e tumores foram deixados sem tratamento ou injetados com PBS ou Ad5/3 (consulte os Materiais e Métodos Exemplificativos). Em um modelo imunossupressor de B16-OVA semelhante a melanoma humano, transferência adotiva de células anti-OVA OT1 é pequena. Adicionar injeções de vírus aumenta a eficácia drasticamente (a). As células T CD8+ aumentam (b). Essas células não são células T anti-Ova (c).

[0041] A Figura 7 revela aumento dramático no número de células T anti-tumor "naturais" devido à transferência adotiva e injeção de vírus. Os camundongos com tumores subcutâneos B16-Ova foram transferidos adoptivamente com linfócitos de 5x105 OT1 intraperitonealmente e os tumores foram deixados sem tratamento ou foram injetados com PBS ou Ad5/3 (consulte os Materiais e Métodos Exemplificativos). A transferência adotiva + injeções de vírus atuam como catalisador para propagação de "outras" células T em tumor e linfonodos locais. (a) Trp2 células CD8+ no sítio de tumor. (b) gp100 Anti-célula CD8+ no sítio de tumor.

[0042] A Figura 8 mostra células CD8+ ativadas em tumor e expressão TIM-3 no tumor no dia 14. Os camundongos com tumores subcutâneos B16-Ova foram transferidos adoptivamente com 5x105 OT1 linfócitos intraperitonealmente e os tumores foram deixados sem tratamento ou injetados com PBS ou Ad5/3 (consulte os Materiais e Métodos Exemplificativos). A imunossupressão em imunoterapia: aumento no número de célula T não é suficiente, caso a imunossupressão não seja removida. Há mais células T ativadas em tumores tratados com vírus e menos imunossupressão.

[0043] A Figura 9 mostra que o aumento em células T anti-tumor e a redução de imunossupressão resultam na imunidade sistêmica contra antígenos de tumor. Os camundongos com tumores subcutâneos B16- Ova foram transferidos adoptivamente com 5x105 OT1 (a) ou 2x106 (b) OT1 linfócitos intraperitonealmente e os tumores foram deixados sem tratamento ou injetados com PBS ou Ad5/3 (consulte Materiais e Métodos Exemplificativos). A apresentação de antígeno é acentuada por vírus: a células T funcionam melhor. A imunidade sistêmica contra vários resultados de epítopos de tumor. (a) expressão de moléculas coestimulatórias em células dendríticas (CD11c+ CD80+ CD86+) no tumor no dia 14. (b) IFNg ELISPOT com esplenócitos no dia 14.

[0044] A Figura 10 mostra distribuição de OTI células T seguindo a injeção de vírus: tendência para trafegar, mas não o suficiente para explicar a eficácia. (a) diagrama, (b) modelo de animal, (c) tumor.

[0045] A Figura 11 revela que elevar a imunossupressão pode induzir a propagação de células. Os tumores tratados com adenovírus continham mais linfócitos específicos de tumor (células OT-I). Nos tumores tratados com PBS, as células OTI ficaram presas na fase M5 (seta esquerda), enquanto no grupo Ad continuaram a proliferar (seta direita).

[0046] A Figura 12 mostra a eficácia de citocinas recombinantes (no vírus) em combinação com células OT1.

[0047] A Figura 13 mostra a eficácia antitumor de adenoviroses armada com citocina combinada com transferência adotiva de célula T. Os camundongos C57BL/6 sofrem com tumores de melanoma subcutâneos B16-OVA foram tratados com 1,5 x 10e6 OT-1 células T enriquecidas com CD8+ intraperitonealmente no dia 1. As adenoviroses de codificação de citocina ou vírus de controle Ad5-Luc1 foram injetados dentro do tumor no dia 1 e semanalmente doravante (1 x 10e9 partículas virais por tumor). O volume de tumor foi calculado conforme descrito anteriormente (Bramante et al. Serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for GM-CSF for treatment of sarcoma in rodents and humans. Int J Cancer. 2013 Dec 24) e os tamanhos de tumor são indicados como porcentagem respectiva ao Dia 1 que foi ajustada para 100%. Figura de número em risco: Número de animais restantes em cada grupo experimental em um determinado ponto de tempo. Os animais foram sacrificados humanamente quando os tumores excederam o tamanho máximo aceitável ou quando quaisquer sinais de dor ou sofrimento estavam evidentes.

[0048] A Figura 14 mostra efeitos de viroses diferentes no tamanho do tumor.

[0049] A Figura 15 mostra resultados excelentes de vetores adenovirais que compreendem transgene mTNFa em combinação com células T OT1 na redução do tamanho de tumor.

[0050] A Figura 16 mostra resultados excelentes de vetores adenovirais que compreendem transgene mIL3 em combinação com células T OT1 na redução do tamanho de tumor.

[0051] A Figura 17 mostra uma esquemática de C5a ou TNF-α que expressa adenoviroses oncolíticos. Alguns recursos importantes mostrados das viroses, incluindo o local em que os transgenes são inseridos.

[0052] A Figura 18 mostra expressão de TNF-α por adenovírus oncolíticos em células A549. As células foram infectadas com 10 VP/célula, os meios foram coletados nos pontos de tempo indicados e ELISA foi usado para avaliar a quantidade de TNF-α nos meios. O vírus induz a expressão e secreção de TNF-α a partir de células infectadas.

[0053] A Figura 19 mostra atividade biológica de TNF-alfa produzida por adenovírus oncolítico armado com TNF-alfa oncolítica. Nesse ensaio, sobrenadante de células infectadas foi usado para testar células WEHI-13VAR sensíveis a TNF, o que corrobora que adenovírus oncolítico dirige a expressão de citocinas funcionais.

[0054] A Figura 20 mostra extermínio dependente de dose de células cancerígenas humanas através do adenovírus oncolítico. Como exceção, em células de tumor PC3 ou A549 humanas permissivas à oncólise e insensíveis a TNF-alfa, nenhuma diferença foi observada entre vírus controle não armado e o adenovírus oncolítico que expressa TNF-alfa, já que mera oncólise foi suficiente para exterminar células. Contudo, devido ao fato de TNF-alfa humana ser parcialmente ativa em células de rato, as quais não são permissivas à oncólise por adenovírus humano, a TNF-alfa contribuiu para a citotoxicidade mais forte do vírus vista em células B16-OVA de rato comparadas a vírus não armados. Vírus com replicação defeituosa mostra capacidade de exterminar células negligenciável.

[0055] A Figura 21 mostra que terapia de radiação sinergiza com vírus que expressa TNF-alfa. A) Um esquema da agenda de tratamento nesse experimento. Radiação (XRT) foi irradiação por todo o corpo em uma dose de 2 X 2Gy e vírus foi 1 x 108 VP/tumor, em que cada rato pelado carregava dois xenoenxertos A549. B) Vírus TNF-alfa possui maior potência antitumoral do que vírus parental não armado. Devido ao fato de o vírus com defeito de replicação (RD) não exterminar células A549 em cultura (Figura 20), o efeito antitumoral proporcionado pelo vírus RD in vivo é provável devido às respostas imunes inatas, o que inclui citocinas, células NK e macrófagos, obtidos por injeções de vírus. C) Vírus que expressa TNF-alfa causa maiores efeitos antitumoral quando combinado com doses clinicamente relevantes de irradiação de feixe externo, o que dá suporte à capacidade de translação clínica de vírus armados com citocina. De maneira importante, esses e prévios experimentos indicam que adenovírus oncolítico que expressa TNF-alfa tem capacidade de replicar e exterminar células, com o argumento de que TNF-alfa não manifesta efeitos antivírus contra o adenovírus.

[0056] A Figura 22 mostra eficácia antitumoral de adenovírus que codifica alfa-TNFh em tumores B16-OVA. Esse experimento é análogo ao demonstrado na Figura 26 com vírus C5a, o que demonstra que expressão de TNF-alfa confere mais vantagem terapêutica em comparação com os vírus não armados.

[0057] A Figura 23 mostra expansão/indução aprimorada de células CD8+ específicas de tumor em tumores tratados com vírus armado com citocina (II). Tumores no experimento demostrado na Figura 20 foram extirpados e processados para análise citométrica de fluxo, similar ao experimento 11. Um maior número/indução de células CD8+ T específicas de OVA foi detectado em tumores tratados com o vírus que codifica TNF em comparação com vírus controle não armado, o que sugere junto com dados C5a que selecionadas racionalmente citocinas expressas pelo adenovírus oncolítico junto com a inflamação induzida por vírus produz um meio de tumor único que suporta fortemente a expansão e ativação das células T específicas de tumor - por inferência e comparação com as Figuras 2B,C também d células T transferidas por adoção.

[0058] A Figura 24 mostra expressão de C5a em células A549. As células foram infectadas por 10 VP/célula, meio foi coletado em pontos no tempo indicados e ELISA foi usado para avaliar a quantidade de C5a no meio. Os resultados de dois experimentos individuais são mostrados.

[0059] A Figura 25 mostra resultados de um ensaio de quimiotaxia in vitro. A quantidade de monócitos humanos THP1 que passam através de uma membrana semipermeável para a câmara inferior, conforme atraídos por quimosinas nos sobrenadantes-teste, foi quantificada de acordo com as instruções do fabricante (Millipore QCM kit). Vírus que expressa C5a possui fatores quimioatrativos mais fortes a partir de células infectadas do que o vírus controle. Os resultados argumentam a favor do uso do vírus armado com citocina no lugar dos vírus não armados.

[0060] A Figura 26 mostra eficácia antitumoral de AdD24-C5a in vivo. Tumores subcutâneos estabelecidos foram injetados no dia 0, 2 e 4 com 1 x 109 VP de cada vírus ou com 50 ul PBS e volumes de tumor foram medidos por calibre. O vírus que expressa C5a permite controle de tumor superior em comparação com o vírus controle. Como o adenovírus não se replica ou células de rato, isto é, o mesmo é não citolítico nesse modelo (Young AM et al. Mol Ther. 2012 Sep;20(9):1676-88, PMID: 22735379), esses resultados sublinham a robusta habilidade do vírus armado com citocina de aprimorar efeitos antitumoral imunológicos, dando suporte fortemente ao conceito de usar o mesmo para aprimorar a eficácia da terapia da célula adotiva.

[0061] A Figura 27 mostra a expansão/indução aprimorada de células CD8+ específicas de tumor em tumores tratados com vírus armado com citocina (I). Os tumores no experimento demostrado na Figura 26 foram extirpados e processados pela citométrica de fluxo. Suspensões de célula única foram coradas com anticorpo contra CD8 e com pentâmero contra antiova TCR. Expressão de C5 por adenovírus não citolítico induz maiores números de célula T CD8 específica de OVA em tumores em comparação com vírus controles, adenovírus não armado ou vírus que expressa antagonista de C5a, o que dá suporte a uso de vírus armado com citocina para aumentar os números de células T transferidas por adoção em tumores . Consulte também o experimento 13.

[0062] A Figura 28 mostra um esquema da resposta da célula T adaptativa.

[0063] A Figura 29 mostra que células T transferidas de modo adaptativo atuam como um catalisador ("faísca") para células T pré- existentes.

[0064] A Figura 30 mostra que "faísca" adaptativa resulta em aumento nas células T antitumorais "naturais".

[0065] A Figura 31 mostra o método de transferência de célula adotiva.

[0066] A Figura 32 mostra que com tecnologia TILT da presente invenção, precondicionamento tóxico (quimo + radiação) e pós- condicionamento (IL2 sistêmico) podem ser evitados (para mecanismos de tecnologia TILT consulte a Figura 48).

[0067] A Figura 33 mostra um esquema dos novos construtos de vírus que expressam uma única citocina. A cadeia principal do vírus é adenovírus humano serotipo 5, além da região globular da fibra, a qual é do serotipo 3. Transgenes duplos e singulares estão sobre controle transcricional do promotor do vírus E3. Ambos os transgenes são colocados na região E3 a qual é excluída para gp19k e 6,7k. A proteína E1A é excluída por 24 aminoácidos ("D24"), na região constante 2, rendendo ligação Rb defeituosa. A expressão E1A está sobre a regulação do promotor de E2F. Algumas regiões genéticas de vírus são mostradas por referência.

[0068] A Figura 34 mostra um esquema dos novos construtos de vírus que expressam duas citocinas. Em uma versão, "sítio de derivação ribossômica" /"sítio de desvio ribossômico"/"elemento de hidrolise atuando cis" (CHYSEL) é colocado como fusões em estrutura entre cada citocina. Os insertos de citocina serão sintetizados como uma única poliproteína que é cotranslacionalmente clivada para gerar ambas as citocinas, o que resulta na adição de diversos aminoácidos adicionais na extremidade 3’ da primeira citocina e uma única prolina na 5’ da última citocina, IL2). Em outra versão, um elemento IRES separa as duas citocinas, o que resulta em sínteses de citocinas sem nenhum aminoácido adicional.

[0069] A Figura 35 mostra sequências de nucleotídeo e aminoácido de 2A.

[0070] A Figura 36 mostra tecnologia de distribuição de adenovírus intravenosa TILT Biotherapeutics. Adenovírus TILT descritos acima serão dados intratumoralmente aos pacientes para aprimorar terapia de célula T (marcados 4a, 5a). Contudo, nem todos os tumores podem ser alcançados através da rota intratumoral. Portanto, foi desenvolvido um veículo de entrega com base em Ad3 o qual pode alcançar tumores através da rota intravenosa (marcados as 4b, 5b).

[0071] A Figura 37 mostra a estrutura do vetor Ad3-hTERT-E3del- CMV-CD40L. Sequência de nucleotídeos do vetor viral Ad3-hTERT- E3del-CMV-CD40L é mostrada em SEQ ID NO 30.

[0072] A Figura 38 mostra a estrutura do vetor Ad3-hTERT-E3del- E2F-CD40L. Sequência de nucleotídeos do vetor viral Ad3-hTERT- E3del-E2F-CD40L é mostrada em SEQ ID NO 31.

[0073] A Figura 39 mostra um gel agarose do corte de vetor pWEA- Ad3-hTERT-CMV-CD40L cortado com enzimas de restrição. Análises de restrição corretas dos vetores de vírus clonados sugerem sequência de DNA correta para o vírus.

[0074] A Figura 40 mostra um gel agarose do corte de vetor pWEA- Ad3-hTERT-E2F-CD40L com enzimas de restrição. Análises de restrição corretas dos vetores de vírus clonados sugerem sequência de DNA correta para o vírus.

[0075] A Figura 41 mostra a funcionalidade dos vetores E2F- CD40L e CMV-CD40L in vitro. No eixo geométrico vertical a escala logarítmica da concentração visual relativa que o TCID50 gera (PFU/ml). No eixo horizontal os dias após a infecção (d). Isso mostrou que os vírus são funcionais e capazes de infectar pelo menos algumas linhas de células de tumor. As diluições de vírus não foram feitas de acordo com as concentrações de VP. TCID50 progressivo: Os vírus que acabaram de ser produzidos foram primeiro testados com TCID50 progressivo para determinar se os mesmos têm propriedades oncolíticas. Depois de nove (9) dias de incubação, as infecções se tornaram visíveis em todas as placas de cultura das células A549, o que indicou que todos os novos vírus eram funcionais. Durante os dias seguintes, as infecções continuaram a se espalhar de acordo com a quantidade de vírus pipetados por célula. Pequenas diferenças foram detectadas na quantidade e velocidade de lise celular.

[0076] As Figuras 42 a 44 revelam que todos os vírus de serotipo 3 oncolíticos mostraram significativamente (P<0,05) melhor extermínio celular do que o vírus controle Ad3eGFP não replicante em células cancerígenas de pulmão A549, células cancerígenas de próstata PC3- MM2 e células cancerígenas de ovário SKOV3. Nenhuma diferença significativa entre os vírus oncolíticos Ad3 pode ser vista que sugerisse que todos os construtos de vírus são totalmente funcionais e que a deleção de área E3, os promotores inseridos (CMV ou E2F) ou os transgenes inseridos (CD40L) não afetassem a potência oncolítica in vitro.

[0077] A Figura 45 mostra eficácia antitumoral de vírus com base em Ad3 in vivo: modelo de câncer de ovário intraperitoneal ortotópico. Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L teve a melhor eficácia antitumoral. ELISA confirmou liberação de CD40L no fluxo sanguíneo.

[0078] A Figura 46 mostra uma janela terapêutica de codificação de adenovírus oncolítico para murino CD40L em ratos imunocompetentes. DOSE 5: 1 x 1011 VP/rato; DOSE 4: 3 x 1010 VP/rato; DOSE 3: 1 x 1010 VP/rato; DOSE 2: 1 x 109 VP/rato; DOSE 1: 1 x 108 VP/rato; Controle Positivo (DOSE 2 intratumoralmente). Com dose, 5,67% de ratos tiveram sinais de toxicidade do fígado. Dose 4 teve capacidade de atingir boa transdução de tumor e em seguida entrega i.v., sem sinais de toxicidade do fígado.

[0079] A Figura 47 mostra liberação de enzima de fígado em ratos tratados através de rota intravenosa com codificação de adenovírus oncolítico para murino CD40L em ratos imunocompetentes. Não houve muita toxicidade do fígado, conforme medido pela liberação de enzimas de fígado, em qualquer grupos de tratamento intravenoso (DOSE 1-5). A última barra indica DOSE 2 dada intratumoralmente. Contudo, na DOSE 5 houve toxicidade de fígado em inspeção visual -> DOSE 4 é o máxima dose tolerada para entrega intravenosa (as doses da simulada até dose 2 são representadas como barras da esquerda para a direita).

[0080] A Figura 48 mostra mecanismos de aprimoramento da terapia da célula adotiva por vírus que expressam citocina duplos. Infecção por vírus e sensibilidade inata às partículas virais induz sinais de perigo, o que inclui aumento de produção de moléculas de classe I HLA/MHC em células cancerígenas, ativação e maturação de antígeno que apresenta células e secreção de citocinas recrutadoras de célula imunes. Sinais de perigo são também amplificados por extermínio de célula de tumor com vírus oncolíticos, o que também libera antígenos de tumor e aumenta reconhecimento de tecido tumoral pelo sistema imunológico. Vírus expressam duas citocinas: a citocina recrutadora de células T atrai células T transferidas por adoção para o tumor e as células T que expandem citocina, em uma modalidade específica interleucina 2, aumenta e mantém a proliferação das mesmas.

[0081] A Figura 49 mostra esquemas do experimento de rastreio com citocinas de rato recombinantes. B16-OVA carregando C57BL/6 de ratos-fêmea são transferidos de modo adotivo com linfócitos OT-I enriquecidos com 2.0*106 de CD8a+ (caixa) i.p. no dia 0 e tratados com injeções intratumorais de citocinas de murino recombinantes (triângulos) em dias úteis. Crescimento de tumor é monitorado e gravado três vezes na semana (círculos) pelo uso de calibres eletrônicos. Ratos são sacrificados (X) em dois pontos no tempo diferentes (SAC1 e SAC2), tumores são colhidos e amostras são analisadas pelo uso de análise FACS de célula T e OT-I qPCR.

[0082] A Figura 50 mostra esquemas do experimento de rastreio com adenovírus para citocinas de rato. B16-OVA carregando C57BL/6 de ratos fêmea são transferidos de modo adotivo com linfócitos OT-I enriquecidos com 2,0*106 de CD8a+ (caixa) i.p. no dia 0 e tratados intratumoralmente com adenovírus armados com diferentes citocinas de rato (triângulos vermelhos) em dias úteis. Crescimento de tumor é monitorado e gravado três vezes na semana (círculos) pelo uso de calibres eletrônicos. Ratos são sacrificados (X) em diferentes pontos no tempo (SAC1 e SAC2), tumores são colhidos e amostra analisadas pelo uso de análises FACS de célula T e OT-I qPCR.

[0083] A Figura 51 mostra esquemas do experimento de rastreio com o uso de células OT-I radiomarcadas 111In e imageamento SPECT/CT. B16-OVA carregando C57BL/6 de ratos fêmea são intratumoralmente injetados com 1e9 VP de 5/3 vírus quimérico (triângulos) em seis dias consecutivos. O primeiro grupo de ratos receberá transferência adotiva de linfócitos OT-I marcados com oxinato de índio enriquecida com 2.0*106 CD8a+ (caixa) i.v. no dia 0 e outro grupo de ratos no dia 7. A acumulação de células OT-I em tumores é quantificada pelo imageamento SPECT/CT (círculos). Ratos são sacrificados (X) em diferentes pontos no tempo (SAC1 e SAC2), tumores são colhidos e a radioatividade final dos mesmos é medida.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO TERAPIA DA CÉLULA ADOTIVA

[0084] A abordagem geral da presente invenção é o desenvolvimento de um tratamento para pacientes com câncer que usa a transferência de linfócitos imunes que são capazes de reagir com e destruir o câncer. Linfócitos infiltrados de tumor isolados são cultivados em grande número e infundidos no paciente. Na presente invenção, codificação de vetores adenovirais para pelo menos uma citocina são utilizados para aumentar o efeito dos linfócitos. Administrações separadas de uma composição terapêutica de célula adotiva e vetores adenovirais são frequentemente precedidas por quimioterapia de precondicionamento por mieloablação ou não mieloablação e/ou radiação . O tratamento de terapia de célula adotiva pretende reduzir ou eliminar o câncer no paciente. (Figura 21)

[0085] Essa invenção refere-se a terapias com uma composição terapêutica de célula adotiva, por exemplo, linfócitos que infiltram tumor, linfócitos modificados por TCR ou linfócitos modificados por AR. Essa invenção se refere a terapias de célula T em particular, mas também a outras terapias adotivas tais como terapias de célula NK ou outras terapias celulares. De fato, de acordo com a presente invenção a composição terapêutica de célula adotiva pode compreender tal como na terapia TIL ou células modificadas geneticamente. Há dois caminhos para alcançar alvo genético de células T para alvos específicos de tumor. Um é transferência de um receptor de célula T com especificidade conhecida (terapia TCR) e com antígeno de leucócito humano compatibilizado (HLA, conhecido como o maior tipo de complexo de histocompatibilidade em roedores). O outro é a modificação de células com moléculas artificiais tais como receptores antígeno quimérico (CAR). Essa abordagem não depende de HLA e é mais flexível com relação às moléculas alvo. Por exemplo, anticorpos de cadeia única podem ser usados e CARs podem também incorporar domínios costimulatórios. Contudo, os alvos de células CAR precisam ser na membrana de células alvo, enquanto modificações de TCR podem utilizar alvos intracelulares.

[0086] Conforme usado no presente documento, "composição terapêutica de célula adotiva" se refere a qualquer composição que compreende células adequadas para transferência de célula adotiva. Em uma modalidade da invenção, a composição terapêutica de célula adotiva compreende um tipo de célula selecionado dentre um grupo que consiste em um linfócito que infiltra tumor (TIL), linfócitos modificados por TCR (isto é, receptores das células T heterólogos) e linfócitos modificados por CAR (isto é, receptores de antígeno quiméricos). Em outra modalidade da invenção, a composição terapêutica de célula adotiva compreende um tipo de célula selecionada dentre um grupo que consiste em células T , células CD8+, células CD4+, células NK, células T delta-gama, células T regulatórias e células mononucleares do sangue periférico. Em uma outra modalidade, TILs, células T, células CD8+, células CD4+, células NK, células T delta-gama, células T regulatórias ou células monocelulares de sangue periférico formam a composição terapêutica de célula adotiva. Em uma modalidade específica da invenção a composição terapêutica de célula adotiva compreende células T. Conforme usado no presente documento, "linfócitos que infiltram tumor" ou TILs se referem a células sanguíneas brancas que saíram da corrente sanguínea e migraram para um tumor. Linfócitos podem ser divididos em três grupos o que inclui células B, células T e células "natural killer". Em uma outra modalidade da invenção a composição terapêutica de célula adotiva compreende células T as quais foram modificadas com receptores de antígeno quiméricos específicos de alvo ou receptores de célula T especificamente selecionados. Conforme usado no presente documento, "células T" se refere a células CD3+, as quais incluem células auxiliares CD4+, células T citotóxica CD8+ e células T Yδ .

[0087] Adicionalmente às células adequadas, a composição terapêutica de célula adotiva usada na presente invenção pode compreender quaisquer outros agentes tais como carreadores, tampões, excipientes, adjuvantes, aditivos, antissépticos, preenchedores, agentes estabilizadores e/ou espessantes farmaceuticamente aceitáveis e/ou quaisquer componentes normalmente encontrados em produtos correspondentes. A seleção de ingredientes adequados e apropriados para métodos de fabricação para formular as composições pertence ao conhecimento geral de uma pessoa versada na técnica.

[0088] A composição terapêutica de célula adotiva pode ter qualquer forma, tal como sólida, semissólida ou líquida, adequadas à administração. Uma formulação pode ser selecionada a partir do grupo que consiste de, mas não se limita a soluções, emulsões, suspensões, tabletes, péletes e cápsulas. As composições não se limitam a uma certa formulação, no lugar disso a composição pode ser formulada em qualquer formulação farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas podem ser produzidas por qualquer processo convencional conhecido na técnica.

VETORES VIRAIS

[0089] Os vetores adenovirais oncolíticos usados na presente invenção podem ser vetores adenovirais adequados para o tratamento de um ser humano ou animal. Em uma modalidade da invenção, os vetores adenovirais são vetores de vírus de seres humanos e podem ser selecionados a partir de um grupo que consiste nos vetores Ad5, Ad3 e Ad5/3. Em uma outra modalidade, o vetor é Ad5 ou Ad5/3.

[0090] Conforme usado no presente documento "um vetor adenoviral oncolítico" se refere a um vetor adenoviral com capacidade de infectar e exterminar células cancerígenas pela replicação seletiva em células normais versus tumor.

[0091] Os vetores podem ser modificados de qualquer modo conhecido na técnica, por exemplo pela deleção, inserção, mutação ou modificação de quaisquer áreas virais. Os vetores são produzidos específicos para tumor com relação à replicação. Por exemplo, o vetor adenoviral pode compreender modificações em E1, E3 e/ou E4 tais como inserção de promotores específicos de tumor (por exemplo, para acionar E1), exclusões de áreas (por exemplo, a região constante 2 de E1 conforme usado em "D24", E3/gp19k, E3/6,7k) e inserção de transgenes. Além disso, as áreas da região globular da fibra do vetor podem ser modificadas. Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral é Ad5/3 que compreende uma cadeia principal de ácido nucleico Ad5 e região globular da fibra Ad3 ou região globular da fibra quimérica Ad5/3.

[0092] Conforme usado no presente documento, a expressão "cadeia principal de ácido nucleico (Ad5) serotipo 5 adenovírus" se refere ao genoma de Ad5. De modo similar, "cadeia principal de ácido nucleico (Ad3) serotipo 3 adenovírus" se refere a genoma de Ad3. "Vetor Ad5/3" se refere a um vetor quimérico que tem partes de vetores Ad5 e Ad3. Em uma modalidade específica da invenção, a modificação de capsídeo do vetor é quimérica Ad5/3. Conforme usado neste documento, "região globular da fibra quimérica Ad5/3" se refere a um quimerismo, sendo que a parte de região globular da fibra é de serotipo 3 Ad e o resto da fibra é de serotipo 5 Ad. Especificamente, em uma modalidade, o construto tem a região globular da fibra de Ad3 enquanto o restante do genoma é de Ad5. (Consulte Figuras 17, 33 e 34)

[0093] Uma abordagem para geração de um adenovírus oncolítico específico de tumor é produzir uma deleção de par de bases 24 (D24) que afeta a região constante 2 (CR2) de E1. No tipo selvagem de adenovírus CR2 é responsável pela ligação do supressor tumoral Rb celular/proteína regulação do ciclo celular para indução da fase de síntese (S), isto é, síntese de DNA ou fase de replicação. A interação entre pRb e E1A exige oito aminoácidos 121 a 127 da região conservada da proteína E1A, os quais são deletados na presente invenção. O vetor da presente invenção compreende uma deleção de nucleotídeos correspondente aos aminoácidos 122 a 129 do vector de acordo com Heise C. et al. (2000, Nature Med 6, 1134-1139). Vírus com o D24 são conhecidas por ter capacidade reduzida de superar o ponto de verificação G1-S e replicar eficientemente nas células onde essa interação não é necessária, por exemplo em células tumorais defeituosas na trajetória Rb-p16, o que inclui a maioria se não todos os tumores humanos. (Consulte Figuras 17, 33 e 34)

[0094] É também possível substituir promotor viral endógeno E1A por exemplo por um promotor específico de tumor. Em uma modalidade específica da invenção promotor hTERT é usado no lugar do promotor viral endógeno E1A.

[0095] A região E3 não é essencial para a replicação viral in vitro, mas as proteínas E3 têm um importante papel na regulação da resposta imune do hospedeiro, isto é, na inibição das respostas imunológicas específicas e inatas. A deleção de gp19k/6,7K em E3 se refere a uma deleção de 965 pares de base da região E3A adenoviral. Em um construto adenoviral resultante, gp19k e 6,7K genes são deletados (Kanerva A et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94). O produto do gene gp19k é conhecido por ligar e sequestrar a maior parte das moléculas do complexo de histocompatibilidade I (MHC1, conhecido como HLA1 em humanos) no retículo endoplásmico e evitar o reconhecimento de células infectadas por linfócitos T citotóxicos. Uma vez que muitos tumores são deficientes em HLA1/MHC1, a deleção de gp19k aumenta a seletividade do tumor de vírus (vírus é apagado mais rápido do que o vírus do tipo selvagem, mas não há diferença em células tumorais). Proteínas 6,7K são expressas em superfícies celulares e as mesmas tomam parte na diminuição de produção de apoptose relacionada a TNF o que induz receptor de ligante (TRAIL) 2. (Consulte Figuras 17, 33 e 34)

[0096] Ambas essas deleções fornecem uma vantagem surpreendente em relação à presente invenção. Uma vez que há tentativa de recuperar a expressão de HLA/MHC para a apresentação de epítopos de tumor para as células T transferidas de modo adotivo, a expressão da proteína gp 19k é contraproducente e, de fato o aumento de produção de HLA/MHC exige a deleção de gp19k. Em relação à 6,7k, uma vez que uma modalidade da presente invenção é a produção de TNFalfa a partir do vírus, e uma de suas atividades antitumor é um efeito de proapoptótico antitumor direto (em ambas as células de espectador transduzidas e não transduzidas), a presença de 6,7k é contraproducente.

[0097] Em uma modalidade da invenção, o transgene ou transgenes de citocina são colocados em uma região de E3 deletada por gp19k/6,7k, sob o promotor de E3. Isso restringe a expressão de transgene às células de tumor que permitem a replicação do vírus e subsequente ativação do promotor de E3. O promotor de E3 pode ser qualquer promotor exógeno (por exemplo, promotor CMV ou E2F) ou endógeno conhecidos na técnica, especificamente o promotor de E3 endógeno. Embora o promotor de E3 seja principalmente ativado por meio de replicação, alguma expressão ocorre quando E1é expresso. À medida que a seletividade de vírus do tipo D24 ocorre pós expressão de E1 (quando E1 for incapaz de ligar Rb), esses vírus expressam E1 também em células normais transduzidas. Assim, é de importância crítica regular também a expressão de E1 para restringir a expressão de transgene mediada por promotor de E3 às células de tumor.

[0098] Em uma outra modalidade da invenção E3 gp19k/6,7k é mantido no vetor, mas uma ou muitas outras áreas de E3 foram deletadas (por exemplo, E3 9-kDa, E3 10,2 kDa, E3 15,2 kDa e/ou E3 15,3 kDa).

[0099] Em uma modalidade específica da invenção, o vetor adenoviral oncolítico se baseia em uma cadeia principal de ácido nucleico de serotipo de adenovírus 5 (Ad5) que compreende um 5/3 região globular de fibra quimérica, e que compreende o seguinte: O promotor de E2F1 para a expressão específica a tumor de E1A, uma deleção de 24 bp (D24) na região constante de ligação de Rb 2 de E1 adenoviral, uma deleção de sequência de ácido nucleico de viral gp19k e 6,7k que lê cadeias, com uma inserção de transgene na região de deleção, resultando no controle associado à replicação de expressão de transgene sob o promotor de E3 viral e uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos um transgene de citocina no lugar dos genes adenovirais deletados gp19k/6,7k na região de E3 (Figura 17). Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral se baseia em um adenovírus humano. (Consulte Figuras 17, 33 e 34)

[00100] Em outra modalidade específica da invenção, o vetor adenoviral oncolítico se baseia em uma cadeia principal de ácido nucleico de serotipo de adenovírus 3 (Ad3), e compreende o seguinte: uma deleção na área de E3, e um promotor específico a tumor (por exemplo, CMV ou E2F) para a expressão de um transgene (por exemplo, CD40L) no lugar da área deletada de E3. Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral se baseia em um adenovírus humano. (Consulte Figuras 37 e 38, as sequências de nucleotídeo correspondentes dos vetores virais Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L e Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L são mostradas em SEQ ID NOs 30 e 31)

[00101] As funções exatas das proteínas da Região Precoce (E3) em adenovírus 3 não são conhecidas. Em geral, em adenovírus não parece prejudicar a replicação quando deletados e parecem afetar a resposta de hospedeiro antiviral para os adenovírus (Wold et al., 1999). A E3 do genoma de adenovírus humano contém o mais alto nível de diversidade genética dentre as seis espécies (A-F) de adenovírus encontradas em humanos. Essa diversidade em conteúdo genético se localiza principalmente entre as cadeias abertas de leitura (ORFs) E3-gp19K e E3-RIDα altamente conservadas em que as matrizes de gene específicas a espécie são codificadas (Burgert e Blusch, 2000).

[00102] O extermínio mediado por células T citotóxicas de células infetadas por vírus é modulado por E3-gp19K. Isso é alcançado bloqueando-se o transporte de MHC classe I para a membrana plasmática e inibindo-se a formação complexa de TAP-MHC classe I (Andersson et al., 1985; Andersson et al., 1987; Burgert e Kvist, 2002, Bennet et al., 1999).

[00103] Assim, em um aspecto da invenção, a molécula importante E3-gp19K é compreendida no vetor adenoviral para tornar a replicação viral discreta e permitir mais tempo para a oncólise e seus efeitos benéficos. Também, a retenção de E3-gp19K pode reduzir a introdução de células T citotóxicas antiadenovírus, resultando em mais células T antitumor.

[00104] Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral oncolítico se baseia em uma cadeia principal de ácido nucleico de serotipo de adenovírus 3 (Ad3), e compreende o seguinte: um promotor (por exemplo, hTERT) para a expressão específica a tumor de E1A, uma deleção na área de E3 (por exemplo, uma deleção que afeta E3 9- kDa, E3 10,2 kDa, E3 15,2 kDa e E3 15,3 kDa) e um promotor específico a tumor (por exemplo, CMV ou E2F) para a expressão de um transgene (por exemplo, CD40L) no lugar da área deletada de E3. Em uma modalidade da invenção, a cadeia principal de ácido nucleico do vetor é completamente serotipo de adenovírus 3. Em uma modalidade da invenção, em vírus Ad3 delE3, os recursos seguintes foram deletados: E3 9-kDa, E3 10,2-kDa, E3 15,2-kDa, E3 15,3-kDa e ademais, CD40L com um promotor (CMV ou E2F) foi inserido em seu lugar. Esses vírus induzem a apoptose de células de tumor e despertam diversos mecanismos imunes, inclusive uma resposta célula T reguladora tipo 1 (TH1), que leva à ativação de células T citotóxicas e à redução de imunossupressão.

[00105] As citocinas participam da resposta imune ao agir através de vários mecanismos inclusive recrutamento de células T no sentido do tumor. A sequência de nucleotídeo que codifica um transgene de citocina pode ser de qualquer animal como um humano, macaco, rato, camundongo, hamster, cachorro ou gato, mas especificamente é codificada por uma sequência humana. A sequência de nucleotídeo que codifica o transgene pode ser modificado a fim de aprimorar seus efeitos ou não modificado, isto é, de um tipo selvagem.

[00106] As modalidades específicas da presente invenção incluem codificações de vetores virais para pelo menos uma citocina. As citocinas usadas na presente invenção podem ser selecionadas a partir de quaisquer citocinas conhecidas na técnica. Em uma modalidade da invenção, a citocina é selecionada a partir de um grupo que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, C5a complementar, IL- 2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2. Em uma modalidade específica da invenção, a citocina é IL-2 ou TNFalfa. Em outra modalidade da invenção, a citocina ou citocinas é/são selecionadas a partir de um grupo quimiocina que consiste em CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2.

[00107] Os vetores virais da invenção podem codificar uma, duas, três, quatro, cinco ou mais citocinas. Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral oncolítico codifica duas ou mais citocinas, mais especificamente duas. Essas duas citocinas podem ser quaisquer citocinas conhecidas, por exemplo, inclusive, mas sem limitação, aquelas listadas acima, com a adição de GMCSF. As duas citocinas podem ser citocinas diferentes. Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral oncolítico codifica quaisquer duas ou mais citocinas selecionadas a partir de um grupo citocina que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, C5a complementar, GMCSF, IL- 2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2, ou o vetor adenoviral oncolítico codifica IL-2 e uma citocina ou citocinas selecionadas a partir de um grupo citocina que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, C5a complementar, GMCSF, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2. Em uma modalidade específica da invenção, as citocinas são IL-2 e TNFalfa. A outra citocina funciona atraindo-se e ativando-se as células T e reduzindo-se a imunossupressão de tumor, enquanto IL-2 induz a propagação do enxerto de célula T. Assim, IL-2 é produzido localmente no tumor onde é necessário, em vez de sistematicamente injetado conforme é tipicamente feito na terapia de célula T, o que pode causar efeitos colaterais e, portanto, um grande problema das terapias da técnica anterior (isto é, toxicidade de IL-2 sistêmico) pode ser impedido por essa modalidade.

[00108] A sinalização perigosa fornecida através de replicação do vírus oncolítico e a ativação de receptores de reconhecimento de padrão molecular associado a patógeno através de DNA viral, juntamente com a ação do(s) transgene(s) pode reduzir a imunossupressão de tumor até certo grau que a terapia de pré-condicionamento pode ser omitida. Consequentemente, e uma questão importante na técnica anterior, a toxicidade devido à quimioterapia de pré-condicionamento e radiação podem ser evitadas.

[00109] Em uma modalidade da invenção, o vetor vírus compreende um sítio de entrada ribossômica interna (IRES) ou opcionalmente um sítio de derivação ribossômica 2A entre os dois transgenes. Assim, o IRES ou um sítio de derivação ribossômica 2A pode estar entre quaisquer citocinas, como IL-2 e qualquer outra citocina selecionada a partir do grupo citocina listado acima. Conforme usado no presente documento, "IRES" se refere a uma sequência de nucleotídeo que possibilita a inibição da tradução no meio de uma sequência de RNA mensageiro em síntese de proteína. O IRES pode ser de qualquer vírus, mas em uma modalidade da invenção, o IRES é do vírus encefalomiocardite (EMCV). Conforme usado no presente documento, "um sítio de derivação ribossômica 2A" se refere a um sítio de iniciação de tradução em que os ribossomas desviam fisicamente as partes da região não traduzida 5' para alcançar o códon de iniciação. Tanto o IRES quanto o A2 possibilita que os vírus produzam dois transgenes a partir de um promotor (o promotor de E3).

[00110] Os esquemas dos leiautes gerais dos genomais virais, que podem ser usados na presente invenção, são mostrados nas Figuras 17, 33, 34, 37 e 38. A sequências de nucleotídeo dos vetores virais que compreende transgenes C5a, hCD40L, hIFNa2, hIFNb1, hIFNg1, hIL2 ou TNFalfa são mostrados em SEQ ID NOs 1 a 7, respectivamente (Ad5/3-E2F-D24-transgene). As sequências de nucleotídeo dos vetores virais que compreende CD40L também são mostradas em SEQ ID NOs 30 e 31 (Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L e Ad3-hTERT-E3del-E2F- CD40L). Ademais, as sequências de nucleotídeo dos vetores virais que compreendem dois transgenes, sendo que o outro é IL-2 e o outro é C5a, CD40L, IFNa2, IFNb, IFNg, GMCSF ou TNFalfa, são mostrados em SEQ ID NOs 8 a 21 (SEQ ID NO: 8 C5a-2A-IL2, SEQ ID NO: 9 IFNa- 2A-IL2, SEQ ID NO: 10 TNFalfa-2A-IL2, SEQ ID NO: 11 CD40L-2A-IL2, SEQ ID NO: 12 IFNb-2A-IL2, SEQ ID NO: 13 GMCSF-2A-IL2, SEQ ID NO: 14 IFNg-2A-IL2, SEQ ID NO: 15 C5a-IRES-IL2, SEQ ID NO: 16 IFNa-IRES-IL2, SEQ ID NO: 17 TNFalfa-IRES-IL2, SEQ ID NO: 18 CD40L-IRES-IL2, SEQ ID NO: 19 IFNb-IRES-IL2, SEQ ID NO: 20 GMCSF-IRES-IL2, SEQ ID NO: 21 IFNg-IRES-IL2) (Ad5/3-E2F-D24- transgene-IRES/2A-transgene).

[00111] Em suma, as vantagens chave da presente invenção que utilizam vetores virais que compreendem pelo menos um transgene de citocina são: i) citocinas e vírus per se causam um sinal de perigo que recruta células T e outras células imunes para os tumores, ii) as citocinas induzem a proliferação de células T tanto no tumor quanto em órgãos linfoides locais, iii) citocinas e vírus per se são capazes de induzir células T (tanto o enxerto de célula T adotiva quanto células T antitumor inatas, naturais) para se propagarem no tumor, iv) citocina e/ou vírus induzem o aumento de produção de moléculas de apresentação de antígeno (HLA) em células cancerígenas, tornando-as sensíveis ao reconhecimento e extermínio através de células T, e v) a replicação de citocinas e vírus altera favoravelmente o microambiente do tumor reduzindo-se a imunossupressão e anergia celular.

[00112] Os vetores virais utilizados nas presentes invenções também podem compreender outras modificações além daquelas descritas acima. Quaisquer componentes adicionais ou modificações podem ser opcionalmente usados, mas não são obrigatórios para a presente invenção.

[00113] A inserção de elementos exógenos pode intensificar os efeitos de vetores em células-alvo. O uso de tecido exógeno ou promotores específicos a tumor é comum em vetores recombinantes e os mesmos também podem ser utilizados na presente invenção.

[00114] Em suma, a presente invenção revela que a replicação viral oncolítico pode recrutar células T e induzir sinais de perigo no tumor, reduzindo a imunosupressão e anergia celular. Esses efeitos são mediados através de receptores de reconhecimento de padrão molecular associado a patógeno, de um mecanismo conservador de modo evolutivo para induzir a imunidade e não submeter à tolerância. A presente invenção também revela que um benefício adicionado da plataforma oncolítica, capaz de replicação em tumores, mas não células normais, é a autoamplificação no tumor. Além disso, o efeito oncolítico per se pode somar ao efeito antitumor geral em seres humanos.

CÂNCER

[00115] Os vetores recombinantes da presente invenção são a replicação competente em células de tumor. Em uma modalidade da invenção, os vetores são a replicação competente em células, que tem defeitos na trajetória de Rb, especificamente trajetória de Rb-p16. Essas células defeituosas incluem todas as células de tumor em animais e seres humanos. Conforme usado no presente documento "defeitos na trajetória de Rb" se refere a mutações e/ou alterações epigenéticas em quaisquer genes ou proteínas da trajetória. Devido a esses defeitos, as células de tumor expressam excessivamente E2F e, então, a ligação de Rb por E1A CR2, que é normalmente necessária para a replicação eficaz, é desnecessária. A seletividade adicional pelo promotor de E2F, que se ativa apenas na presença de E2F livre, conforme visto em células defeituosas da trajetória de Rb/p16. Na ausência de E2F livre, nenhuma transcrição de E1A ocorre e o vírus não se replica. A inclusão do promotor de E2F é importante para impedir a expressão de E1A em tecidos normais, o que pode causar a toxicidade tanto direta quanto indiretamente através da permissão da expressão de transgene do promotor de E3.

[00116] A presente invenção se refere às abordagens para tratar câncer em um indivíduo. Em uma modalidade da invenção, o indivíduo é um ser humano ou um animal, especificamente um paciente animal ou humano, mais especificamente um ser humano ou animal que sofre de câncer.

[00117] A abordagem pode ser usada para tratar quaisquer cânceres ou tumores, inclusive tanto tumores malignos quanto benignos, tanto tumores primários quanto metástases podem ser alvos da abordagem. Em uma modalidade da invenção, o câncer representa os linfócitos infiltrantes em tumor. As ferramentas de formação da presente invenção são particularmente atraentes para o tratamento de tumores sólidos metastáticos que retratam os linfócitos infiltrantes em tumor. Em uma outra modalidade, o enxerto de célula T foi modificado por um receptor de célula T específico a tumor ou tecido de receptor de antígeno quimérico.

[00118] Conforme usado no presente documento, o termo "tratamento" ou "que trata" se refere à administração de pelo menos vetores adenovirais oncolíticos ou pelo menos vetores adenovirais oncolíticos e composição terapêutica de célula adotiva a um indivíduo, preferencialmente um mamífero ou indivíduo humano, para fins que incluem não apenas a cura completa como também profilaxia, melhora ou alívio de distúrbios ou sintomas relacionados a um câncer ou tumor. O efeito terapêutico pode ser avaliado monitorando-se os sintomas de um paciente, os marcadores de tumor no sangue ou, por exemplo, um tamanho de um tumor ou a duração da sobrevivência do paciente.

[00119] Em uma modalidade da invenção, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer nasofaríngeo, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer de pulmão, câncer do intestino, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer cerebral, câncer de garganta, câncer bucal, câncer de fígado, câncer ósseo, câncer de pâncreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia célula T / linfoma, neuroma, doença de von Hippel-Lindau, Síndrome de Zollinger-Ellison, o câncer de adrenal, câncer anal, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga, câncer de uréter, câncer cerebral, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor medular, câncer ósseo, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, o câncer de sítio primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrosarcoma, câncer de mama, Doença de Paget, o câncer cervical, câncer colorretal, câncer retal, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de cabeça, câncer de olho, câncer de pescoço, câncer do rim, tumor de Wilms, câncer do fígado, sarcoma de Kaposi, o câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não-Hodgkin, câncer bucal, câncer de pele, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer de pâncreas endócrino, glucagonoma, câncer pancreático, câncer da paratireóide, câncer de pênis, câncer da pituitária, sarcoma de tecido mole, retinoblastoma, câncer do intestino delgado, câncer de estômago, câncer do timo, câncer da tireoide, câncer trofoblástica, mola hidatiforme, câncer uterino, câncer de endométrio, câncer de vagina, câncer da vulva, neuroma acústico, MF, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer de goma, câncer de coração, câncer de lábio, câncer de meninge, câncer de boca, câncer de nervo, câncer de boca, câncer da glândula parótida, câncer de peritônio, câncer de faringe, câncer pleural, câncer da glândula salivar, câncer de língua e câncer de amígdalas.

[00120] Antes de classificar um paciente humano ou animal como adequado para a terapia da presente invenção, o médico pode examinar um paciente. Com base nos resultados que se afastam do normal e revela um tumor ou câncer, o médico pode sugerir o tratamento da presente invenção para um paciente.

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA

[00121] Uma composição farmacêutica da invenção compreende pelo menos um tipo dos vetores virais da invenção. Ademais, a composição pode compreender pelo menos dois, três ou quatro vetores diferentes. Além do vetor, uma composição farmacêutica também pode compreender outros agentes terapeuticamente eficazes, quaisquer outros agentes como carreadores farmaceuticamente aceitáveis, tampões, excipientes, adjuvantes, aditivos, antissépticos, enchimento, agentes estabilizantes e/ou espessantes e/ou quaisquer componentes normalmente encontrados nos produtos correspondentes. A seleção de ingredientes adequados e métodos de fabricação apropriados para formular as composições pertence ao conhecimento geral de um indivíduo versado na técnica.

[00122] A composição farmacêutica pode estar em qualquer forma, como forma sólida, semissólida ou líquida, adequada para a administração. Uma formulação pode ser selecionada a partir de um grupo que consiste em, mas sem limitação, soluções, emulsões, suspensões, tabletes, péletes e cápsulas. As composições da presente invenção não são limitadas a uma determinada formulação, em vez disso, a composição pode ser formulada para qualquer formulação farmaceuticamente aceitável conhecida. As composições farmacêuticas podem ser produzidas por quaisquer processos convencionais conhecidos na técnica.

[00123] Em uma modalidade da invenção, o vetor viral ou a composição farmacêutica age como um veículo in situ para o recrutamento de células T, intensificando seu efeito terapêutico e permitindo sua propagação no tumor.

[00124] Um kit farmacêutico da presente invenção compreende uma composição terapêutica de célula adotiva e os vetores adenovirais oncolíticos que codificam para pelo menos uma citocina. A composição terapêutica de célula adotiva é formulada em uma primeira formulação e os vetores adenovirais oncolíticos que codificam para pelo menos uma citocina são formulados em uma segunda formulação. Em uma outra modalidade da invenção, a primeira e a segunda formulações são para a administração simultânea ou sequencial, em qualquer ordem, a um indivíduo.

ADMINISTRAÇÃO

[00125] O vetor ou a composição farmacêutica da invenção pode ser administrada a qualquer indivíduo eucariótico selecionado a partir de um grupo que consiste em plantas, animais e seres humanos. Em uma modalidade específica da invenção, o indivíduo é um ser humano ou um animal. Um animal pode ser selecionado a partir de um grupo que consiste em animais de estimação, animais domésticos e animais de produção.

[00126] Qualquer método convencional pode ser usado para a administração do vetor ou a composição a um indivíduo. A rota de administração depende da formulação ou forma da composição, a doença, local dos tumores, o paciente, a comorbidez e outros fatores.

[00127] Em uma modalidade da invenção, a(s) administração(ões) separada(s) da composição terapêutica de célula adotiva e de vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina a um indivíduo é(são) conduzidos simultânea ou consecutivamente, em qualquer ordem. Conforme usado no presente, a "administração separada" ou "separado" se refere a uma situação, em que a composição terapêutica de célula adotiva e vetores adenovirais oncolíticos são dois produtos diferentes ou composições distintas entre si.

[00128] Apenas uma administração de composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina da invenção ou apenas vetores virais oncolíticos ou não oncolíticos podem ter efeitos terapêuticos. Pode haver qualquer período entre as administrações dependendo, por exemplo, do paciente e do tipo, grau ou localização do câncer. Em uma modalidade da invenção, há um período de tempo de um minuto a quatro semanas, especificamente 1 a 10 dias, mais especificamente 1 a 5 dias, entre a administração consecutiva de composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos um citocina e/ou há diversas administrações de composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos. Os números de vezes de administração de composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos podem também ser diferentes durante o período de tratamento. Os vetores adenovirais oncolíticos ou as composições farmacêuticas ou de células adotivas podem ser administrados, por exemplo, de 1 a 10 vezes nas primeiras 2 semanas, 4 semanas, mensalmente ou durante o período de tratamento. Em uma modalidade da invenção, a administração de vetores ou quaisquer composições é realizada três a sete vezes nas primeiras 2 semanas, então, em 4 semanas e, então, mensalmente. Em uma modalidade específica da invenção, a administração é realizada quatro vezes nas primeiras 2 semanas, então, em 4 semanas e, então, mensalmente. A extensão do período de tratamento pode variar e, por exemplo, pode durar de 2 a 12 meses ou mais.

[00129] Em uma modalidade específica da invenção, uma composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos são administrados no mesmo dia e, posteriormente, vetores adenovirais oncolíticos são administrados a cada semana, suas semanas, três semanas ou a cada mês, durante um período de tratamento que pode durar, por exemplo, de 1 a 6 ou 12 meses ou mais.

[00130] Em uma modalidade da invenção, a administração de vírus oncolítico é conduzida através de uma injeção intratumoral, intra-arterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitária ou peritoneal ou uma administração oral. Qualquer combinação de administrações é também possível. A abordagem pode gerar eficácia sistêmica a despeito da injeção local. A composição terapêutica de células adotivas pode ser administrada por via intravenosa ou intratumoral. Em uma modalidade, a administração da composição terapêutica de células adotivas e/ou vetores virais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina é conduzida através de uma injeção intratumoral, intra-arterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavidade ou peritoneal ou uma administração oral. Em uma modalidade específica da invenção, TILs ou células T são administrados por via intravenosa e vetores virais por via intratumoral e/ou por via intravenosa. Destaca-se que o vírus é entregue ao tumor separadamente da administração de células T; o vírus não é usado para modificar o enxerto de células T ex vivo. Em essências, o vírus modifica o tumor de tal forma que o enxerto de células T possa funcionar melhor.

[00131] A dose eficaz de vetores depende pelo menos do indivíduo que precisa do tratamento, do tipo de tumor, da localização do tumor e do estágio do tumor. A dose pode variar, por exemplo, de cerca de 1 x 108 partículas virais (VP) a cerca de 1 x 1014 VP, especificamente de cerca de 5 x 109 VP a cerca de 1 x 1013 VP e mais especificamente de cerca de 8 x 109 VP a cerca de 1 x 1012 VP. Em uma modalidade, os vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina são administrados em uma quantidade de 1 x 1010 a 1 x 1014 partículas virais. Em outra modalidade da invenção, a dose está na faixa de cerca de 5 x 1010 a 5 x 1011 VP.

[00132] A quantidade de células transferidas também dependerá do paciente, mas as quantidades típicas estão na faixa de 1 x 109 a 1 x 1012 células por injeção. O número de injeções também varia, mas as modalidades típicas incluem 1 ou 2 ciclos de tratamento com diversas (por exemplo, 2 a 4) semanas de diferença.

[00133] Qualquer outro tratamento ou combinação de tratamento pode ser usado adicionalmente às terapias da presente invenção. Em uma modalidade específica, o método ou uso da invenção compreende, ainda, a administração concomitante ou sequencial de radioterapia, anticorpos monoclonais, quimioterapia ou outros fármacos ou intervenções anticâncer (incluindo cirurgia) a um indivíduo.

[00134] Os termos "tratar" ou "aumentar", assim como termos derivados dos mesmos, conforme usados no presente documento, não implicam necessariamente tratamento ou aumento de 100% ou completo. Em vez disso, há graus variáveis dos quais uma pessoa com habilidade comum na técnica reconhece como tendo um benefício ou efeito terapêutico potencial. Nesse aspecto, os presentes métodos inventivos podem fornecer qualquer quantidade de aumento na eficácia de terapia com células T ou qualquer grau de tratamento ou prevenção de uma doença.

[00135] As Figuras 28 a 32, 36 e 48 ilustram os métodos e os mecanismos da presente invenção.

[00136] Será óbvio para uma pessoa versada na técnica que, conforme a tecnologia avança, o conceito inventivo pode ser implantado de várias formas. A invenção e suas modalidades não são limitadas aos exemplos descritos acima, mas podem variar dentro do escopo das reivindicações.

EXEMPLOS MATERIAIS E MÉTODOS

[00137] Modelo animal B16-OVA: células B16 que expressam ovalbumina (B16-OVA) foram mantidas em RPMI, 10% de FBS, 5 mg/ml de G418, 20 mM de L-Glutamina, 1x solução Pen/Strep (GIBCO). Camundongos fêmeas imunocompetentes C57BL/6 com 4 a 7 semanas de vida foram implantados por via subcutânea com 2,5 x 105 células B16-OVA em 50 ul de RPMI, 0% de FBS, no flanco direito, um tumor por camundongo. Aproximadamente dez dias após a implantação do tumor (quando os tumores tornaram-se injetáveis, diâmetro mínimo de aproximadamente 3 mm), os camundongos foram divididos em grupos e tratados em alguns experimentos em seis dias consecutivos com injeções intratumorais de ou 50 ul de PBS ou 1 x 109 partículas virais (VPs) de adenovírus oncolítico em 50 ul de PBS. Em outros experimentos, três injeções foram dadas nos dias 0, 2 e 4. Como as células murinas não são permissivas a adenovírus humano, múltiplas injeções de vírus intratumorais foram usadas para simular a inflamação induzida por replicação viral (Blair et al., 1989).

[00138] Transferência adotiva: No primeiro dia do tratamento i.t., os camundongos também receberam por transferência adotiva na cavidade intraperitoneal 5 x 105 a 2 x 106 esplenócitos expandidos e enriquecidos com CD8a em repouso de um dia para o outro de camundongos C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J (OT-1) com 4 a 8 semanas de vida, modificados geneticamente para ter apenas receptores de célula CD8 T específicos para ovalbumina (OVA), em 100 ul de RPMI, 0% de FBS. O enriquecimento com CD8a foi realizado por microesferas de CD8a (Ly-2) de camundongo 5 dias após a transferência, por instruções do fabricante (Miltenyi Biotech, EUA, número de catálogo 130-049-401). As células enriquecidas foram expandidas em números por cinco dias em meio de linfócito (RPMI, 10 % de FBS, 20 mM de L-Glutamina, solução 1x Pen/Strep, 15 mM de HEPES, 50 μM de 2-mercaptoetanol, 1 mM de pivurato de Na) na presença de IL-2 murina recombinante (160 ng/ml) e anticorpo CD3ε anticamundongo solúvel (0,3 ug/ml, Abcam, clone 145-2C11).

[00139] Processamento de tecido para citometria de fluxo: Os camundongos sofreram eutanásia e baços, nodos linfáticos de drenagem e tumores foram colhidos em 1 a 10 ml de RPMI, 10% de FBS, e sangue foi coletado por sangramento cardíaco terminal na cavidade pleural e transferido por seringa descartável em tubos de microcentrífuga contendo EDTA, e processados para análise: tecidos sólidos foram grosseiramente dissociados por bisturi e triturados em uma ponta de pipeta estéril descartável de 10 ml em 5 a 10 ml de tampão de lise ACK (150 mM de NH4Cl, 10 mM de KHCO3, 0,1 mM de EDTA, pH 7,2) e incubados à temperatura ambiente (TA) por aproximadamente 20 minutos, após o qual as células foram peletizadas a 1.200 rpm 5 min +4 °C, após o qual as células foram ressuspensas em 1 a 10 ml de RPMI, 10% de FBS, dependendo da quantidade estimada de células, e passadas através de um filtro estéril de 40 μm para criar uma solução de célula única. Em alguns experimentos, o tecido tumoral foi, em vez disso, processado diretamente após o corte com bisturi (antes da adição de ACK) em 1 ml de volume total de coquetel de protease (RPMI suplementado com colagenase tipo A, H ou P, Roche, a 1 mg/ml e benzonase, 125 unidades/ml de concentração final, Sigma, E1014- 25KU) por 1 a 2 horas a 37 °C, 5% de CO2, após o qual 10 ml de tampão de lise ACK foram adicionados e as células foram tratadas conforme acima. 200 μl de sangue inteiro foram pipetados em 5 ml de tampão de lise ACK e tratados como acima. As células foram ou incubadas de um dia para o outro a 37 °C, 5% de CO2, ou analisadas diretamente por imunomanchamento e citometria de fluxo.

[00140] Processamento de tecido para análise de citocina: Os camundongos sofreram eutanásia e pedaços de tumor de aproximadamente 2 a 10 mm3 foram congelados em tubos de microcentrífuga de 2 ml em gelo seco e armazenados a -80 °C. Os pedaços de tumor foram pesados e 200 μl de PBS resfriado em gelo adicionados. Os pedaços foram homogeneizados por rotor Tissue Master 125, coquetel de protease 1x (Sigma) e concentração final de BSA a 0,1 % foi adicionada e os tubos foram mantidos em gelo. O homogenato de tumor foi centrifugado a 2.000 rpm 10 min +4 °C e o sobrenadante foi analisado com esferas de citocina CBA Flex Set (BD, EUA) em BD FACSArray, por instruções do fabricante.

EXPERIMENTOS QUE APOIAM A INVENÇÃO EXPERIMENTO 1 (CITOCINAS E QUIMIOCINAS INDUZIDAS POR INJEÇÃO INTRATUMORAL DE ADENOVÍRUS):

[00141] Para estudar de a infecção por adenovírus poderia resultar em expressão de citocina e quimiocina, injetou-se camundongos que portam tumores B16-OVA subcutâneos com ou PBS ou adenovírus oncolítico quimérico 5/3 nos dias 0, 1, 2, 3, 4 e 5. Os tumores de três camundongos por grupo de tratamento foram extraídos e processados para análise de citocina no dia 0 (antes da injeção de vírus = controle de linha de base), e de três outros camundongos por ponto no tempo nos dias 6, 10, 14 e 18.

[00142] De modo extraordinário, os resultados mostraram um aumento induzido por vírus em secreção de IFN-Y e aumento de produção de quimiocinas induzíveis por IFN-Y RANTES, MIP-1α e MCP- 1 no dia 10 (Figura 1).

[00143] Para aprimorar a eficácia terapêutica de terapia celular adotiva, essas conclusões são importantes.

[00144] Com base nesses dados, o tratamento com adenovírus dotado de citocina oncolítica resulta em alteração favorável do microambiente tumoral, quimiotaxia aumentada de células imunológicas transferidas de modo adotivo e reconhecimento de célula tumoral aprimorado por células T CD8+ citotóxicas.

EXPERIMENTO 2 (APRIMORAMENTO MEDIADO POR ADENOVÍRUS DE TERAPIA ADOTIVA COM CÉLULAS T):

[00145] Para estudar o impacto de tratamento com adenovírus sobre a terapia adotiva com células T, tumores de melanoma B16-OVA murino foram tratados com adenovírus oncolítico quimérico 5/3 sozinho ou em combinação com transferência adotiva de células OT-I tumor- específicas e comparados a camundongos que receberam injeções de PBS intratumorais. Os resultados de três experimentos independentes sumarizados na Figura 2 revelam, por um lado, que as injeções de vírus por si só (mantendo em mente que o adenovírus humano não replica produtivamente em células de camundongo) resultaram em controle de crescimento de tumor menor, durante até o dia 14 após o tratamento e diminuindo após o mesmo (Figura 2A). Por outro lado, quando os camundongos tratados foram transferidos de modo adotivo com 5 x 105 ou 2 x 106 células OT-I, diferenças estatisticamente significativas entre os grupos de PBS e Ad foram obtidas em dois experimentos separados (Figura 2B e 2C, respectivamente).

[00146] Portanto, a presença de vírus no tumor teve um efeito de aprimoramento forte sobe a terapia celular adotiva. Seis injeções de vírus intratumorais, a 1 x 109 VPs cada, geraram, em combinação com transferência adotiva de células OT-I, eficácia antitumoral igual ou superior em comparação ao que foi relatado por Song et al. (2011, Mol Ther) para uma única injeção de 1 x 1010 VP de adenovírus com replicação defeituosa que expressa OVA (Ad-OVA) misturado por adição com uma quantidade igual de adenovírus que coexpressa um RNA de hairpin curto A20-específico e uma forma secretória de flagelina que estimula o receptor 5 do tipo toll (Ad-shAF) no modelo de melanoma B16.OVA (Song XT et al. Mol Ther. Janeiro de 2011;19(1):211 a 217, PMID: 20959814). À luz desses resultados, um aspecto inovador da presente invenção é direcionar a injeção de vírus ao tumor, em que se pode atingir, mesmo com vírus desarmado, controle de tumor superior a vírus armado com múltipla funcionalidade imunológica administrado por via intramuscular.

EXPERIMENTO 3 (ALTERAÇÕES MEDIADAS POR ADENOVÍRUS EM QUANTIDADE E QUALIDADE DE POPULAÇÕES DE CÉLULAS IMUNOLÓGICAS IN VIVO):

[00147] Para estudar o tráfego e a proliferação de células transfectadas de modo adotivo do experimento 2, células OT-I foram manchadas ex vivo com 5 μM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE). Esse corante de manchamento de célula fluorescente é diluído com cada divisão celular e, portanto, possibilita rastrear a proliferação de linfócitos por citometria de fluxo por análise de redução fracionária de aproximadamente 1/2 de intensidade de sinal de fluorescência em cada divisão celular (até 7 divisões, aqui identificadas como M0-7). No dia 1 após a transferência, os resultados mostraram acumulação induzida por vírus de células OT-I transferidas (população duplo positivo CD8+ CFSE+) nos tumores, concomitante com redução dessas células no sangue (Figura 3A). Em pontos no tempo posteriores, também a contagem total de células T CD8+ T pareceu mais alto nos tumores tratados com vírus em comparação a tumores injetados com PBS e, no dia 14, a contagem geral de células T CD8+ era aumentada em órgãos linfoides de camundongos tratados com vírus.

[00148] As quantidades de divisões de célula OT-I em diferentes pontos no tempo são retratadas na Figura 3B. Como a situação de proliferação de células OT-I foi a mesma entre ambos os grupos no dia 1, as diferenças em contagem de células CD8+ em vários órgãos foram devidas ao tráfego de células imunológicas induzido por adenovírus. Em pontos no tempo posteriores, no entanto, a situação mudou e o aumento de células OT-I no tumor tratado com adenovírus foi devido á proliferação de linfócitos aumentada. No dia 6, a maioria das células OT- I em tumores tratados com PBS foram capturadas em fase M5, enquanto as células transferidas em grupo de adenovírus continuaram a proliferar (divisões M6 a M7). Esses dados sugerem que a viroterapia oncolítica ou infecção por vírus não oncolítico resulta em tráfego e proliferação aprimorados de linfócitos transferidos de modo adotivo através da ruptura da supressão imunológica nos tumores, atraindo células imunológicas que contribuem para a ativação de células CD8+ e/ou através de alguns outros mecanismos importantes que ajudam a superar a anergia de células T.

[00149] Como apoio às presentes conclusões em modelos de animal, foi observada depressão transiente de contagens de linfócitos no sangue durante o primeiro dia após a administração de vírus oncolítico a pacientes com câncer avançado (Figura 4), sugerindo mobilização de células T em circulação em resposta à infecção aguda por adenovírus no tumor.

[00150] Além disso, em apoio à infecção por adenovírus que recruta células T em tumores, foram detectados números aumentados de células T CD8+ em seções de tecido de biopsia de tumor após o tratamento do que antes (Figura 5).

[00151] A Figura 6 mostra os resultados de injeções de adenovírus combinadas com transferência adotiva de células T.

[00152] A Figura 7 revela aumento drástico no número de células T antitumorais "naturais" devido à transferência adotiva e injeção de vírus.

[00153] A Figura 8 mostra células CD8+ ativadas em tumor e expressão de TIM-3 no tumor no dia 14.

[00154] A Figura 9 mostra que aumento em células T antitumorais e redução em imunossupressão resultam em imunidade sistêmica contra antígenos tumorais.

[00155] A Figura 10 mostra a distribuição de células OTI T após a injeção de vírus.

[00156] A Figura 11 revela que elevar a imunossupressão pode induzir a propagação de células.

[00157] A Figura 12 mostra a eficácia de citocinas recombinantes (sem vírus) em combinação com células OT1. EXPERIMENTO 4 (CÉLULAS T TRANSFECTADAS DE MODO ADOTIVO + ADENOVÍRUS AD5 ARMADO COM CITOCINA DE MURINO): Modelo: C57BL/6 com B16-OVA (0,25 x 10e6 células por animal) Grupos: Sem injeção Ad5-Luc Ad5-CMV-mTNFa Ad5-CMV-mIFNg Ad5-CMV-mIL2 Ad5-CMV-mIFNb1 Sem injeção + OT1 Ad5-Luc + OT1 Ad5-CMV-mTNFa + OT1 Ad5-CMV-mIFNg + OT1 Ad5-CMV-mIL2 + OT1 Ad5-CMV-mIFNb1 + OT1 O vetor Ad5 é um vetor de adenovírus humano não replicativo que codifica transgene de camundongo. Os construtos foram produzidos com tecnologia AdEasy (Agilent Inc); o cassete de transgene (induzido por um promotor CMV) está na região E1 deletada (consulte, por exemplo, Diaconu I et al. Cancer Res. 1 de maio de 2012;72(9):2.327 a 2.338). TAMANHO DE GRUPO: n = 7, 12 x 7 = 84 (+ extra 20% = 100)

PROGRAMAÇÃO DE TRATAMENTO:

[00158] Células OT1: 2 x 10e6 por animal i.p. no Dia 1

[00159] Injeções de vírus: 1 x 10e9 partículas virais (OD260) no Dia 1 e semanalmente em seguida

PONTO FINAL:

[00160] Volume de tumor (medido a cada 2 dias pela primeira semana e, então, a cada 3 dias).

[00161] Coleta de tumores e baços quando os camundongos morrem ou são mortos; para FACS e/ou ELISPOT (foco em ensaios mais relevantes de acordo com dados de Siri).

[00162] Os melhores transgenes em combinação com terapia com células T foram TNFalfa ja IL2 (Figura 13). Reforçando os dados, as mesmas citocinas foram implicadas no experimento sem vírus.

[00163] A Figura 14 mostra os resultados de diferentes vírus (sem terapia com células T) sobre o tamanho do tumor (Figura 14).

[00164] A Figura 15 mostra os resultados excelentes de terapia com células T em combinação com vetor Ad5-CMV-mTNFalfa.

[00165] A Figura 16 mostra os resultados excelentes de terapia com células T em combinação com vetor Ad5-CMV-mIL2.

CONSTRUTOS VIRAIS INOVADORES

[00166] Os novos construtos virais a seguir são apresentados como exemplos da presente tecnologia proposta:

Vírus oncolíticos que expressam C5a E TNF-α

[00167] Foram gerados novos adenovírus oncolíticos Ad5/3 que portam a porção ativa de componente de complemento C5a ou TNF-α humano como transgenes em vez de regiões de gene 6.7K/gp19 (Figura 17).

EXPERIMENTO 5 (EXPRESSÃO DE TRANSGENE A PARTIR DE VETOR ADENOVIRAL QUE CODIFICA C5A):

[00168] A fim de confirmar — como as prova de conceito — que os adenovírus oncolíticos têm capacidade para expressar as citocinas escolhidas propostas para aumentar a terapia celular adotiva, infectaram-se células A549 humanas em cultura a 10 VP / células de adenovírus que codifica C5a (Figura 24), e avaliaram-se os níveis de C5a em sobrenadante de cultura celular em diferentes pontos no tempo após a infecção por ELISA. Os resultados, de fato, validam a hipótese e apoiam a geração de construtos adenovirais patenteados que portam as citocinas selecionadas.

EXPERIMENTO 6 (EFEITO SOBRE MIGRAÇÃO DE MONÓCITO POR VETORES ADNOVIRAIS INOVADORES):

[00169] Testou-se a capacidade de C5a de recrutar monócitos com o uso de um ensaio de quimiotaxia in vitro: As células A549 foram infectadas ou com adenovírus que expressa C5a ou com vírus de controle desarmado (10 VP / células - unidades infecciosas entre vírus similares) ou foram tratadas com PBS, e o meio foi coletado 48 h após a infecção e foi usado para recrutar a linhagem de células monocíticas humanas THP1 em um ensaio de quimiotaxia transcavidade por instruções do fabricante (Millipore QCM, número de catálogo ECM512). Os resultados revelam atração significativamente maior de monócitos por sobrenadante de células infectadas com vírus que expressa C5a do que por meio de células não infectadas ou células infectadas com vírus de controle desarmado (Figure 25).

EXPERIMENTO 7 (EFICÁCIA ANTITUMORAL DE ADENOVÍRUS ARMADO COM C5A):

[00170] Para avaliar a potência antitumoral de C5a no contexto de infecção de tumor não citolítico, trataram-se tumores B16-OVA estabelecidos em camundongos C57BL/6 nos dias 0, 2 e 4 com PBS, vírus que expressam C5a ou com vírus de controle desarmados. Os resultados revelam forte efeito antitumoral pelo vírus que expressa C5a (Figura 26).

EXPERIMENTO 8 (EXPANSÃO DE CÉLULAS T ANTITUMORAIS AUMENTADA POR VÍRUS COM C5A):

[00171] Para avaliar se o aumento observado em eficácia antitumoral de vírus que expressa C5a (Figura 24) estava relacionado às células T, tumores forma analisados por citometria de fluxo por células T CD8+ ovalbumina-específicas, detectadas por manchamento com pentâmero conjugado a APC específico para TCR que reconhece MHC I carregado com peptídeo de ovalbumina imunodominante SIINFEKL (ProImmune, EUA). De fato, os tumores no grupo de vírus com C5a continham uma fração significativamente maior de células T CD8 tumor específicas do que tumores injetados com vírus de controle ou PBS (Figura 27).

EXPERIMENTO 9 (EXPRESSÃO DE TRANSGENE A PARTIR DE ADENOVÍRUS QUE CODIFICA TNF-α):

[00172] Similarmente ao vírus com C5a (Figura 24 e Experimento 5), foi testada a capacidade de adenovírus que expressa hTNF-α de mediar a secreção do transgene de escolha. Os resultados confirmam a expressão (Figura 18).

EXPERIMENTO 10 (EFEITO BIOLÓGICO DE TRANSGENE EXPRESSO É MANTIDO EM ADENOVÍRUS ONCOLÍTICO):

[00173] A fim de avaliar se o transgene expresso por adenovírus mantém seus efeitos biológicos, sobrenadante sem vírus (100 kD filtrados) de células A549 infectadas com vírus desarmado de controle ou com vírus que expressa TNF-alfa (VPs variáveis / célula, 72 h p.i.) foi aplicado em células WEHI-13VAR (ATCC CRL-2148), que são sensíveis a TNF-alfa, e essas células foram avaliadas por viabilidade 72 horas após a exposição do sobrenadante. (por exemplo, Espevik T et al. J Immunol Methods. 1986; 95(1): 99 a 105 descreve o método). Os resultados revelam que TNF-alfa expresso a partir de adenovírus oncolíticos mantém os efeitos biológicos potenciais (Figura 19).

EXPERIMENTO 11 (VÍRUS QUE EXPRESSAM CITOCINA ONCOLÍTICA MANTÊM CAPACIDADE DE EXTERMÍNIO DE CÉLULA IN VITRO):

[00174] Devido ao fato de que TNF-alfa pode ser efeitos antivirais, era importante confirmar que o efeito oncolítico de adenovírus que expressa TNF-α mantém sua capacidade de infectar e exterminar células cancerígenas. Diversas linhagens celulares de câncer em cultura foram infectadas com vírus que expressam TNF-alfa ou com vírus de controle e avaliadas por viabilidade por ensaio CelltiterGlo AQ MTS, de acordo com instruções do fabricante (Promega, EUA). Os resultados mostram que o vírus é oncolítico in vitro (Figuras 19 a 20).

EXPERIMENTO 12 (SINERGIA ENTRE RADIOTERAPIA E VÍRUS ONCOLÍTICO QUE EXPRESSA TNF ALFA):

[00175] Trataram-se camundongos pelados que portam xenoenxertos subcutâneos de A549 com vírus com ou sem radiação de feixe externo focado concomitante (XRT) (Figura 21). RD indica replicação vírus com replicação deficiente e vírus desarmado é um vírus oncolítico sem TNFalfa.

EXPERIMENTO 13 (EFICÁCIA ANTITUMORAL AUMENTADA DE ADENOVÍRUS QUE EXPRESSA TNF-ALFA EM HOSPEDEIROS IMUNOCOMPETENTES):

[00176] Para testar se adenovírus oncolítico, que não replica em células murinas, pode ser ainda capaz de efeitos antitumorais in vivo em camundongos imunocompetentes, camundongos com tumores B16.OVA estabelecidos foram injetados por via intratumoral com vírus que expressa TNF-alfa ou vírus de controle desarmado ou PBS, de uma maneira similar àquela na Figura 26. Os resultados mostram controle geral de tumor maior com vírus que expressa TNF-alfa em comparação a controles (Figura 22), sugerindo que TNF-alfa humano está parcialmente ativo em camundongos e apoiando a noção de armar vírus para atingir efeitos antitumorais maiores.

EXPERIMENTO 14 (EXPANSÃO DE CÉLULAS T ANTITUMORAIS POR VÍRUS COM TNFα):

[00177] Similarmente ao Experimento 11, quis-se testar se o efeito antitumoral observado do vírus que expressa tTNF-alfa estava associado à indução de respostas de células T tumor-específicas. Tumores foram extraídos e processados por análise citométrica de fluxo, como no Experimento 11. Os resultados (Figura 23), de fato, confirmam que também a expressão de TNF-alfa facilita a expansão de células T tumor-específicas no sítio de tumor, argumentando fortemente a favor da tecnologia proposta.

[00178] As Figuras 28 a 32, 36 e 48 ilustram os métodos e os mecanismos da presente invenção. EXPERIMENTO 15 (EXPERIMENTO DE COMBINAÇÃO COM DOIS VETORES ADENOVIRAIS DIFERENTES E OT1(Ad-mTNFa/Ad-mIL2 + OT1)): Modelo: C57BL/6 com B16-OVA (0,25 x 10e6 células por animal) Grupos: Ad5-CMV-mTNFa (1 x 10e9 VP) Ad5-CMV-mIL2 (1 x 10e9 VP) Ad5-CMV-mTNFa + Ad5-CMV-mIL2 (0,5 + 0,5 x 10e9 VP) Ad5-CMV-mTNFa + OT1 Ad5-CMV-mIL2 + OT1 Ad5-CMV-mTNFa + Ad5-CMV-mIL2 + OT1 Ad5Luc1 + OT1

SEM INJEÇÃO (SIMULADO-SIMULADO)

[00179] O vetor Ad5 é um vetor de adenovírus humano não replicativo que codifica transgene de camundongo. Os construtos foram produzidos com tecnologia AdEasy (Agilent Inc); o cassete de transgene (induzido por um promotor CMV) está na região E1 deletada (consulte, por exemplo, Diaconu I et al. Cancer Res. 1 de maio de 20121;72(9):2.327 a 2.338). TAMANHO DE GRUPO: n= 9 100 ordenados

PROGRAMAÇÃO DE TRATAMENTO:

[00180] Células OT1: 1,5 x 10e6 por animal i.p. no Dia 1 (mesma quantidade que no experimento anterior, não 2 x 10e6)

[00181] Injeções de vírus: para agentes únicos: 1 x 10e9 partículas virais (OD260) no Dia 1 e semanalmente em seguida; para combinação: 0,5 x 10e9 VP + 0,5 x 10e9 VP no Dia 1 e semanalmente em seguida

[00182] Ponto Final: Volume de tumor (medido a cada 2 dias pela primeira semana e, então, a cada 3 dias)

EXPERIMENTOS ADICIONAIS QUE APOIAM A INVENÇÃO:

[00183] Diversos experimentos em animais apoiam a invenção. Primeiramente, triaram-se candidatos de citocina ideais para combinar com transferência adotiva de células T com o uso de formas murinas recombinantes de citocinas (Figura 49). A(s) citocina(s) é(são) selecionada(s) a partir do grupo a seguir: interferon alfa, interferon beta, interferon gama, complemento C5a, GMCSF, IL-2, TNFalfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2. Um esquema da disposição geral do genoma viral que compreende o transgene de citocina ou dois transgenes é mostrado nas Figuras 33 e 34. A Figura 35 mostra sequências de nucleotídeos e aminoácidos de 2A. As sequências de nucleotídeos dos vetores virais que compreendem C5a, hCD40L, hIFNa2, hIFNb1, hIFNg1, hIL2 ou TNFa são mostradas nas SEQ ID NOs 1 a 7, respectivamente (Ad5/3- E2F-D24-transgene). Além disso, as sequências de nucleotídeos dos vetores virais que compreendem dois transgenes, em que um é IL-2 e o outro C5a, CD40L, IFNa2, IFNb, IFNg, GMCSF ou TNFa, são mostradas nas SEQ ID NOs 8 a 21 (SEQ ID NO: 8 C5a-2A-IL2, SEQ ID NO: 9 IFNa- 2A-IL2, SEQ ID NO: 10 TNFa-2A-IL2, SEQ ID NO: 11 CD40L-2A-IL2, SEQ ID NO: 12 IFNb-2A-IL2, SEQ ID NO: 13 GMCSF-2A-IL2, SEQ ID NO: 14 IFNg-2A-IL2, SEQ ID NO: 15 C5a-IRES-IL2, SEQ ID NO: 16 IFNa-IRES-IL2, SEQ ID NO: 17 TNFa-IRES-IL2, SEQ ID NO: 18 CD40L- IRES-IL2, SEQ ID NO: 19 IFNb-IRES-IL2, SEQ ID NO: 20 GMCSF- IRES-IL2, SEQ ID NO: 21 IFNg-IRES-IL2) (Ad5/3-E2F-D24-transgene- IRES/2A-transgene).

[00184] Diversos dos melhores candidatos foram escolhidos para um experimento de combinação de citocina/vírus, em que p regime permanece aproximadamente o mesmo e todos os camundongos recebem injeção intraperitoneal de linfócitos OT-I enriquecidos com CD8a+ e tratamentos intratumorais de citocina escolhida misturada com adenovírus. Adicionalmente, um experimento de tráfego separado foi conduzido com o uso dos adenovírus com replicação deficiente existentes que codificam citocinas de camundongo e humano com atividade comprovada em camundongos (Figura 50). RD indica vírus com replicação deficiente. Com base nesses experimentos, um candidato ou candidatos de citocina finais podem ser escolhidos e adicionalmente analisados, mesmo na clínica.

[00185] Os resultados dos experimentos indicam que a) a injeção de vírus em tumores resulta em tráfego aprimorado de células T para o tumor, b) a injeção de vírus resulta em expressão de MHC1 aprimorada em tumores, c) a sinalização de perigo é ativada, resultando em menos tolerância e imunossupressão, d) as células T propagam-se no tumor após as injeções de vírus. De modo importante, adicionar uma citocina como um transgene aprimorou cada um desses efeitos. Destaca-se que transgenes duplos aprimoram adicionalmente o efeito. Portanto, a injeção intratumoral de adenovírus oncolítico armado com citocina aprimorou o efeito de transferência celular adotiva de maneira sinergética, sobre o que poderia ser atingido com ou vetores virais ou transferência celular adotiva sozinhos.

[00186] Para estudar o tráfego e a biodistribuição de células T após a transferência adotiva, um experimento de imageamento SPECT/CT foi conduzido (Figura 51). Linfócitos OT-I enriquecidos com CD8a+ foram radiomarcados com 111In e transferidos de modo adotivo em camundongos receptores.

[00187] Como a meia-vida de oxina de índio é relativamente curta (2,83 dias), o período de inspeção máximo para o imageamento foi limitado a 7 dias. Devido a essa restrição, as células foram identificadas em dois lotes e transferidas para os camundongos em dois pontos no tempo diferentes. Os dados de imageamento do primeiro lote abrangem eventos de tráfego dos dias 0 a 7, enquanto o segundo lote permite que se observe eventos em tumores durante os dias 8 a 14 após o vírus.

[00188] Vírus Ad3 oncolíticos (Figuras 37 a 40, SEQ ID NOs 30 e 31 (Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L e Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L))

ESTRATÉGIA DE CLONAGEM:

[00189] Construção de plasmídeo de extremidade 3’ de Ad3 contendo cassete de expressão correspondente, em que esse plasmídeo contém 3’ITR de genoma de Ad3, em que a região E3 de 29.892 a 30.947 do genoma de Ad3 foi substituída pelo cassete de expressão. (Observação: Tira-se vantagem do sítio de restrição EcoRI no genoma de Ad3 próximo à extremidade 3’)

[00190] Construção de plasmídeo de extremidade 5’ de Ad3, em que esse plasmídeo contém 5’ITR e hTERT-E1. (Observação: Tira-se vantagem do sítio de restrição único NotI em genoma de Ad3 e sítio de restrição NheI próximo à extremidade 5’)

[00191] Construção de pWEA-Ad3-hTERT-CMV-CD40L e pWEA- Ad3-hTERT-E2F-CD40L (Observação: Tira-se vantagem do sistema de empacotamento de fago)

[00192] Construção de plasmídeo de extremidade 3’ de Ad3 contendo cassete de expressão correspondente:

[00193] Amplificar por PCR promotor E2F, iniciador direto: 5’AAAttaattaatggtaccatccggacaaagc3’ (SEQ ID NO: 22), iniciador reverso 5’ TTTgctagcggcgagggctcgatcc3’ (SEQ ID NO: 23). Clonado em vetor de TA pGEM-T (promega)^pGemT-E2F

[00194] Amplificar por PCR fragmento CD40L, iniciador direto: 5’TAGCTGCTAGCATGATCGAAACATACAAC3’ (SEQ ID NO: 26), iniciador reverso: 5’GTCAATTTGGGCCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCAA3’ (SEQ ID NO: 27). Clonado em pGEM-T ^pGemT-CD40L

[00195] O presente plasmídeo de extremidade 3’ de Ad3 contendo CMV-GFP(pWEA-Ad3-3’end-CMVGFP) foi digerido com NheI /ApaI para remover GFP, pGemT-CD40L foi digerido com NheI /ApaI ^ pWEA-Ad3-3’end-CMV-CD40L.

[00196] O promotor CMV em pWEA-Ad3-extremidade 3’-CMV- CD40L foi substituído por promotor E2F (pGemT-E2F foi digerido com PacI /NheIHpWEA-Ad3-3end-E2F-CD40L

[00197] Construção de plasmídeo de extremidade 5’ de Ad3 contendo hTERT-E1:

[00198] Amplificar por PCR extremidade 5’ de genoma de Ad3 a partir de pKBS2-hTERT (plasmídeo de papel de Ad3-hTERT-E1A ), iniciador direto 5’ gtcagtttaaacttaggccggccctatctatataatataccttatagatggaatgg3’ (SEQ ID NO: 28), iniciador reverso 5’ CTTCATCAGCAGCTAGCAGCATAGAATCAG3’ (SEQ ID NO: 29). Clonado em pGem-T^pGemT-Ad3-5’end-hTERT.

[00199] O plasmídeo pWEA-Ad3 (que contém todo o genoma de ad3) foi digerido com FseI/NotI, em que o fragmento 13,2 kb que contém a extremidade 5’ do genoma de Ad3 foi clonado em um vetor modificado a partir de pBluescript KS(-) (os sítios de restrição entre SacI e XbaI foram modificados como SacI-PmeI-MluI-FseI-SalI-NotI-XbaI)^pBS- Ad3-5’end

[00200] O plasmídeo pBS-Ad3-5’end foi digerido com PmeI/NheI, em que o fragmento de aproximadamente 800 pb que contém 5’ITR foi substituído pelo fragmentos de PmeI/NheI correspondente a partir de pGemT-Ad3-5’end-hTERT ^pBS-Ad3-5’end-hTERT

[00201] pWEA-Ad3-hTERT-CMV-CD40L e pWEA-Ad3-hTERT-E2F- CD40L:

[00202] O plasmídeo pWEA-Ad3-hTERT-E2F- foi digerido com EcoRI para remover o genoma de extremidade 3’ e ligado com o fragmento correspondente contendo cassete de expressão de pWEA- Ad3-3’end-CMV-, pWEA-Ad3-3’end-CMV-CD40L e pWEA-Ad3-3’end- E2F-CD40L

[00203] A ligação foi empacotada em falos com o uso de Gigapack III mais extrato de empacotamento (Stratagen) e propagada (mancha azul Xl1)

[00204] A funcionalidade de vírus Ad3 foi testada in vitro e os resultados são mostrados na Figura 41. Todos os novos vírus eram funcionais e capazes de infectar linhagens celulares de tumor.

[00205] Os vírus foram também testados em CHO-K7, mas não mostraram efeito na viabilidade dessas células durante o TCID50. Isso se deve provavelmente à falta de desmogleina-2 do tipo humano na superfície dessas células de hamster.

RESULTADOS IN VIVO DE VETORES AD3

[00206] Todos os experimentos em animais foram aprovados pelo Experimental Animal Committee da Universidade de Helsinki e pelo Governo Provincial da Finlândia Meridional. Os camundongos foram monitorados frequentemente por seu estado de saúde e sofreram eutanásia assim que sinais de dor ou sofrimento foram percebidos. Camundongos com imunodeficiência combinada severa fox chase fêmeas (Charles River) foram usados.

[00207] Um modelo ortotópico de câncer de ovário disseminado de modo peritoneal foi desenvolvido por injeção de 5 x 10e6 células SKOV3-luc por via intraperitoneal em 300 ml de meio de Eagle modificado por Dulbecco puro em camundongos com munodeficiência combinada severa (n=5 por grupo). Após 3 dias, os camundongos foram imageados de modo não invasivo e tratados por via intraperitoneal por injeção de PBS ou 109 VP em PBS por camundongos. Os camundongos foram imageados no dia 3, 7, 14, 21 e 25 com o uso de IVIS 100 (Xenogen, Alameda, CA) para estimar o número de células tumorais nos camundongos. Para imageamento por bioluminescência, 150 mg/kg de D-luciferina (Promega) foram injetados por via intraperitoneal e capturados 10 min após com tempo de exposição de 10 s, 1f/parada, armazenamento de meio e filtro aberto. Durante o imageamento, os camundongos estavam em anestesia por gás isoflurano. As imagens foram sobrepostas com Living Image 2.50 (Xenogen). O fluxo total (fótons/s) foi medido por desenho de regiões de interesse em torno da área peritoneal dos camundongos. O plano de fundo foi subtraído.

[00208] A Figura 45 mostra a eficácia antitumoral de vírus à base de Ad3 in vivo.

ENSAIO DE PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS MTS (FIGURAS 42 A 44)

[00209] No dia um, 105 células por poço (A549, PC3-MM2 ou SKOV3-luc) foram semeadas em placas com 96 cavidades em 100 μl de meio de crescimento (GM), que continha 5% de FBS. No dia dois, a monocamada foi lavada uma vez com GM contendo 5% de FBS. Então, as células foram infectadas com diferentes vírus em doses de 100, 10, 1, 0,1 e 0 partículas virais por célula. Em seguida, as células foram incubadas por uma hora em uma máquina de balanço e, então, lavadas com GM. Após adição de novos 5% de GM, as células foram deixadas no incubador e o GM foi substituído a cada quatro dias. O teste foi finalizado por adição de reagente mts (Promega) após o efeito citopático de um dos vírus testados ter atingido 100% com a concentração mais alta. Após duas horas de incubação, a absorbância foi medida em filtro de 490 nm. O plano de fundo foi, então, subtraído e os resultados analisados.

INTERVALO TERAPÊUTICO DE ADENOVÍRUS ONCOLÍTICO QUE CODIFICA CD40L MURINO EM CAMUNDONGOS IMUNOCOMPETENTES

[00210] Em animais imunocompetentes, os genomas virais estão presentes em tumores após injeções i.v. (Figura 46). Camundongos C57 albinos foram inoculados s.c. com células B16-ova de camundongo e tratados por via intravenosa com 5 doses virais diferentes de vírus à base de Ad5 que codifica CD40L de camundongo (consulte os experimentos 4 e 15). Os tumores de 3 animais por grupo foram coletados e armazenados a -80 °C. O DNA total foi extraído e a carga de DNA viral foi estudada com PCR quantitativa. Os números de cópias de E4 viral foram normalizados para o DNA genômico com iniciadores de B-actina de camundongo. Na Figura 46, cada ícone representa um tumor; a linha horizontal indica a mediana do grupo. Simulação: n=5; Dose 5: n=4; Dose 4: n=4; Dose 3: n=4; Dose 2: n=6; Dose 1: n=2; Dose 2 i.t.: n=4. DOSE 5: 1 x 1011 VP/camundongo; DOSE 4: 3 x 1010 VP/camundongo; DOSE 3: 1 x 1010 VP/camundongo; DOSE 2: 1 x 109 VP/camundongo; DOSE 1: 1 x 108 VP/camundongo; Controle positivo (DOSE 2 por via intratumoral).

[00211] Com a dose 5, 67% dos camundongos tiveram sinais de toxicidade hepática. A dose 4 teve capacidade de atingir boa transdução de tumor após entrega i.v., sem sinais de toxicidade hepática.

[00212] Os resultados do experimento de liberação de enzima hepática são mostrados na Figura 47. O experimento de liberação de enzima hepática foi executado conforme segue. Todos os protocolos de animal foram analisados e aprovados pelo Experimental Animal Committee da Universidade de Helsinki e pelo Governo Provincial da Finlândia Meridional. Camundongos C57 albinos fêmeas com três a quatro semanas de vida (Harlan Laboratories, Holanda) foram injetados com 2,5 x 105 células B16-ova por via subcutânea em ambos os flancos e randomizados em 7 grupos (3 camundongos/grupo). Vírus Ad5/3 CMV-mCD40L diluído em solução salina tamponada por fosfato (PBS) foi injetado por via intravenosa a 108 a 1011 partículas virais (VP)/camundongo(dose 1 a dose 5). Um grupo de tratamento recebeu dose 2 (109 VP/célula) por via intratumoral como controle positivo. Os animais sofreram eutanásia antes de quaisquer procedimentos e o estado de saúde foi monitorado diariamente. 48 h após a injeção de vírus, os camundongos foram sacrificados e o sangue foi coletado por punção cardíaca. O soro foi separado por centrifugação de amostras de sangue a 5.000 rpm por 10 minutos. Os níveis de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) (unidade/litro) nas amostras de soro foram quantificados no Núcleo de Química Clínica da Universidade de Helsinki com o uso do analisador de química clínica Siemens ADVIA 1650. As amostras hemolíticas foram excluídas da análise, já que a hemólise sérica pode interferir nos ensaios (altos níveis de ALT e AST falsos). As barras mostram médias + SEM. REFERÊNCIAS Blair GE, Dixon SC, Griffiths SA, Zajdel ME. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. Dezembro de 1989;14(4):339 a 346. Ekkens MJ, Shedlock DJ, Jung E, Troy A, Pearce EL, Shen H, Pearce EJ. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect Immun. Maio de 2007;75(5):2.291 a 2.296. Kratky W, Reis e Sousa C, Oxenius A, Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 18 de outubro de 2011;108(42):17.414 a 17.419. Lugade AA, Sorensen EW, Gerber SA, Moran JP, Frelinger JG, Lord EM. Radiation-induced IFN-gamma production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 1 de março de 2008;180(5):3.132 a 3.139. Propper DJ, Chao D, Braybrooke JP, Bahl P, Thavasu P, Balkwill F, Turley H, Dobbs N, Gatter K, Talbot DC, Harris AL, Ganesan TS. Low-dose IFN-gamma induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin Cancer Res. Janeiro de 2003;9(1):84 a 92. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferongamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. Fevereiro de 2004;75(2):163 a 189. Street D, Kaufmann AM, Vaughan A, Fisher SG, Hunter M, Schreckenberger C, Potkul RK, Gissmann L, Qiao L. Interferon-gamma enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. Maio de 1997;65(2):265 a 272. REFERÊNCIAS PARA CONSTRUTOS VIRAIS Blair GE, Dixon SC, Griffiths SA, Zajdel ME. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. Dezembro de 1989;14(4):339 a 346. Ekkens MJ, Shedlock DJ, Jung E, Troy A, Pearce EL, Shen H, Pearce EJ. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect Immun. Maio de 2007;75(5):2.291 a 2.296. Kratky W, Reis e Sousa C, Oxenius A, Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc Natl Acad Sci U S A. 18 de outubro de 2011;108(42):17.414 a 17.419. Lugade AA, Sorensen EW, Gerber SA, Moran JP, Frelinger JG, Lord EM. Radiation-induced IFN-gamma production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 1 de março de 20081;180(5):3.132 a 3.139. Propper DJ, Chao D, Braybrooke JP, Bahl P, Thavasu P, Balkwill F, Turley H, Dobbs N, Gatter K, Talbot DC, Harris AL, Ganesan TS. Low-dose IFN-gamma induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin Cancer Res. Janeiro de 2003;9(1):84 a 92. Schroder K, Hertzog PJ, Ravasi T, Hume DA. Interferongamma: an overview of signals, mechanisms and functions. J Leukoc Biol. Fevereiro de 2004;75(2):163 a 189. Street D, Kaufmann AM, Vaughan A, Fisher SG, Hunter M, Schreckenberger C, Potkul RK, Gissmann L, Qiao L. Interferon-gamma enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. Maio de 1997;65(2):265 a 272.

Claims

1. Uso de um vetor adenoviral oncolítico que codifica pelo menos uma citocina, e uma composição terapêutica de célula adotiva separada, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo, sendo que o referido vetor adenoviral oncolítico é: (i) um vetor de adenovírus sorotipo 5 (Ad5) compreendendo - uma região globular quimérica 5/3, - promotor E2F1 para a expressão de E1A específica para tumor, - uma deleção de 24 pb (D24) na região 2 constante de ligação a Rb de E1 adenoviral, - uma deleção de sequência de ácido nucleico de quadros de leitura virais gp19k e 6,7k, e - uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos um transgene de citocina no lugar do gp19k/6,7K deletado na região E3, resultando em um controle associado à replicação da expressão de transgene sob o promotor de E3 viral; ou (ii) um vector de adenovírus do serotipo 3 (Ad3) compreendendo - um promotor para a expressão específica para tumor, - uma deleção na área E3 que afeta E3 9 kDa, E3 10,2 kDa, E3 15,2 kDa e E3 15,3 kDa e - um promotor específico para tumor ou exógeno para a expressão de pelo menos uma citocina no lugar da área deletada de E3.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a composição terapêutica de células adotivas compreende (a) um tipo celular selecionado dentre o grupo que consiste em um linfócito infiltrante de tumor (TIL), linfócitos modificados em receptor de célula T e linfócitos modificados em receptor a antígeno quimérico; e/ou (b) um tipo celular selecionado dentre o grupo que consiste em células T, células CD8+, células CD4+, células NK, células T delta- gama, células T reguladoras e células mononucleares de sangue periférico; e/ou (c) células T.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do um grupo que consiste em câncer de nasofaringe, câncer sinovial, câncer hepatocelular, câncer renal, câncer de tecidos conjuntivos, melanoma, câncer de pulmão, câncer de intestino, câncer de cólon, câncer retal, câncer colorretal, câncer de cérebro, câncer de garganta, câncer oral, câncer de fígado, câncer de osso, câncer pancreático, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia/linfoma de células T, neuroma, doença de von Hippel-Lindau, síndrome de Zollinger-Ellison, câncer adrenal, câncer anal, câncer do duto biliar, câncer de bexiga, câncer de uretra, câncer de cérebro, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor na medula espinhal, osteocondroma, condrossarcoma, sarcoma de Ewing, câncer de sítio primário desconhecido, carcinoide, carcinoide do trato gastrointestinal, fibrossarcoma, câncer de mama, doença de Paget, câncer cervical, câncer colorretal, câncer retal, câncer de esôfago, câncer de vesícula biliar, câncer de cabeça, câncer de olho, câncer de pescoço, câncer de rim, tumor de Wilms, sarcoma de Kaposi, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer testicular, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer de pele, mesotelioma, mieloma múltiplo, câncer de ovário, câncer pancreático endócrino, glucagonoma, câncer pancreático, câncer da paratireoide, câncer de pênis, câncer da pituitária, sarcoma de tecido mole, retinoblastoma, câncer do intestino delgado, câncer de estômago, câncer de timo, câncer de tireoide, câncer trofoblástico, mola hidatidiforme, câncer uterino, câncer endometrial, câncer de vagina, câncer de vulva, neuroma acústico, micose fungoide, insulinoma, síndrome carcinoide, somatostatinoma, câncer de gengiva, câncer de coração, câncer de lábio, câncer de meninges, câncer de boca, câncer de nervo, câncer de palato, câncer de glândula parótida, câncer do peritônio, câncer de faringe, câncer pleural, câncer de glândula salivar, câncer de língua e câncer de amídala.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a(s) administração(ões) de composição terapêutica de células adotivas e vetores virais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina para um indivíduo é(são) conduzida(s) (a) de modo simultâneo ou consecutivo, em qualquer ordem, preferencialmente em que há um período de tempo de um minuto a quatro semanas entre a administração consecutiva de composição terapêutica de células adotivas e vetores virais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina e/ou há diversas administrações de composição terapêutica de células adotivas e vetores virais oncolíticos; e/ou (b) através de uma injeção intratumoral, intra-arterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavidade ou peritoneal ou uma administração oral.

5. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a citocina é selecionada do grupo que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, complemento C5a, IL-2, TNF-alfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2.

6. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o vetor viral oncolítico codifica duas ou mais citocinas, preferencialmente em que as duas ou mais citocinas são selecionadas dentre um grupo de citocinas que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, complemento C5a, GMCSF, IL-2, TNF-alfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2, ou o vetor viral oncolítico codifica IL-2 e uma citocina ou citocinas são selecionadas a partir de um grupo de citocinas que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, complemento C5a, GMCSF, TNF-alfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14- 1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL22.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral compreende um sítio de entrada ribossômica interna (IRES) ou opcionalmente um sítio de derivação ribossômica 2A entre dois transgenes.

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que os vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina são administrados em uma quantidade de 1 x 1010 a 1 x 1014 partículas virais.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a composição terapêutica de células adotivas e os vetores adenovirais oncolíticos são administrados de modo simultâneo ou sequencial, em qualquer ordem, a um indivíduo.

10. Uso de um vetor adenoviral oncolítico, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para aumentar a eficácia de terapia de células adotivas ou terapia com células T em um tumor de um indivíduo, sendo que o referido vetor adenoviral oncolítico é: (i) um vetor de adenovírus sorotipo 5 (Ad5) compreendendo - uma região globular quimérica 5/3, - promotor E2F1 para a expressão de E1A específica para tumor, - uma deleção de 24 pb (D24) na região 2 constante de ligação a Rb de E1 adenoviral, - uma deleção de sequência de ácido nucleico de quadros de leitura virais gp19k e 6,7k, e - uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos um transgene de citocina no lugar do gp19k/6,7K deletado na região E3, resultando em um controle associado à replicação da expressão de transgene sob o promotor de E3 viral; ou (ii) um vector de adenovírus do serotipo 3 (Ad3) compreendendo - um promotor para a expressão específica para tumor, - uma deleção na área E3 que afeta E3 9 kDa, E3 10,2 kDa, E3 15,2 kDa e E3 15,3 kDa e - um promotor específico para tumor ou exógeno para a expressão de pelo menos uma citocina no lugar da área deletada de E3.

11. Kit farmacêutico, caracterizado pelo fato de que compreende uma composição terapêutica de células adotivas e vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina, em que a composição terapêutica de células adotivas é formulada em uma primeira formulação e os vetores adenovirais oncolíticos que codificam pelo menos uma citocina são formulados em uma segunda formulação, sendo que o referido vetor adenoviral oncolítico é: (i) um vetor de adenovírus sorotipo 5 (Ad5) compreendendo - uma região globular quimérica 5/3, - promotor E2F1 para a expressão de E1A específica para tumor, - uma deleção de 24 pb (D24) na região 2 constante de ligação a Rb de E1 adenoviral, - uma deleção de sequência de ácido nucleico de quadros de leitura virais gp19k e 6,7k, e - uma sequência de ácido nucleico que codifica pelo menos um transgene de citocina no lugar do gp19k/6,7K deletado na região E3, resultando em um controle associado à replicação da expressão de transgene sob o promotor de E3 viral; ou (ii) um vector de adenovírus do serotipo 3 (Ad3) compreendendo - um promotor para a expressão específica para tumor, - uma deleção na área E3 que afeta E3 9 kDa, E3 10,2 kDa, E3 15,2 kDa e E3 15,3 kDa e - um promotor específico para tumor ou exógeno para a expressão de pelo menos uma citocina no lugar da área deletada de E3.

12. Kit farmacêutico, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda formulações são para administração simultânea ou sequencial, em qualquer ordem, a um indivíduo.

13. Vetor adenoviral oncolítico, caracterizado pelo fato de que compreende: (1) uma cadeia principal de ácidos nucleicos de adenovírus sorotipo 5 (Ad5) que compreende uma região globular quimérica 5/3: (2) promotor E2F1 para expressão tumor-específica de E1A; (3) uma deleção de 24 pb (D24) na região 2 constante de ligação de Rb de E1 adenoviral; (4) uma deleção de sequência de ácidos nucleicos de quadros de leitura virais gp19k e 6.7k; e (5) uma sequência de ácidos nucleicos, que codifica pelo menos um transgene de citocina no lugar do gp19k/6.7K deletado na região E3, que resulta em controle associado à replicação de expressão de transgene sob o promotor viral E3, em que a citocina é selecionada a partir de um grupo que consiste em interferon alfa, interferon beta, interferon gama, complemento C5a, IL-2, TNF-alfa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14- 3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25- 2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 e XCL2.

14. Vetor adenoviral oncolítico de sorotipo 3 (Ad3), caracterizado pelo fato de que compreende: um promotor para expressão tumor-específica, uma deleção na área E3 afetando E3 9 kDa, E3 10.2 kDa, E3 15.2 kDa e E3 15.3 kDa e um promotor tumor- específico ou exógeno para a expressão de um transgene no lugar da área deletada de E3.

15. Vetor adenoviral oncolítico, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o transgene é uma citocina selecionada dentre o grupo de citocinas, como definido na reivindicação 5, preferencialmente em o transgene é CD40L.

16. Vetor adenoviral oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que codifica duas ou mais citocinas, preferencialmente em que as duas ou mais citocinas são selecionadas dentre o primeiro grupo de citocinas, como definido na reivindicação 5, ou o vetor adenoviral oncolítico codifica IL-2, e uma citocina ou citocinas selecionadas dentre o segundo grupo de citocinas, como definidas na reivindicação 5.

17. Vetor adenoviral oncolítico, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o mesmo compreende um sítio de entrada ribossômica interna (IRES) ou opcionalmente um sítio de derivação ribossômica 2A entre dois transgenes.

18. Vetor adenoviral oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o promotor para expressão de um transgene na região E3 é o promotor CMV ou E2F.

19. Vetor adenoviral oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 18, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende o promotor hTERT para expressão de E1A e o promotor CMV para a expressão de CD40L na região E3.

20. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor oncolítico, como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 19.

21. Uso do vetor adenoviral oncolítico, como definido em qualquer uma das reivindicações 13 a 19, caracterizado pelo fato de que é na fabricação de um medicamento para tratar câncer em um indivíduo.

22. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, 10 ou 21, caracterizado pelo fato de que compreende, ainda, a administração concomitante ou sequencial de radioterapia, anticorpos monoclonais, quimioterapia ou outros fármacos anticâncer ou intervenções a um indivíduo.