ES2708749T3 - Terapia celular adoptiva mejorada - Google Patents

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Markus Vähä-Koskela
Siri Tähtinen
Vincenzo Cerullo
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Abstract

Un vector adenovírico oncolítico que codifica al menos una citocina junto con una composición terapéutica celular adoptiva independiente para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde dicho vector adenovírico oncolítico es i) un vector de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende: - un pomo híbrido de fibra 5/3, - activador E2F1 para la expresión tumoral específica de E1A, - una eliminación de 24 pb (D24) en la región constante de unión a Rb 2 de E1 adenovírico, - una eliminación de secuencias de ácido nucleico de los marcos de lectura gp19k y 6,7k víricos, y - una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un transgén de citocina en lugar del gp19k/6,7k eliminado en la región E3 que da como resultado el control asociado a la replicación de la expresión del transgén bajo el activador vírico E3; o ii) un vector de adenovirus serotipo 3 (Ad3) que comprende: - un activador para la expresión tumoral específica de E1A, - una eliminación en el área de E3 que afecta a E3 9 kDa, E3 10,2 kDa, E3 15,2 kDa y E3 15,3 kDa, y - un activador exógeno o específico del tumor para la expresión de al menos una citocina en lugar del área eliminada de E3.

Description

DESCRIPCION
Terapia celular adoptiva mejorada
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a los campos de las ciencias de la vida y la medicina. Espedficamente, la invencion se refiere a terapias contra el cancer en seres humanos.
Antecedentes de la invencion
Se desarrollan nuevas terapias constantemente para el tratamiento del cancer. Las terapias celulares adoptivas (TCA) son un metodo potente para tratar el cancer, pero tambien para tratar otras enfermedades como las infecciones y la enfermedad de injerto contra huesped. La transferencia celular adoptiva es la transferencia pasiva de celulas cultivadas ex vivo, mas frecuentemente celulas inmunoderivadas, en un anfitrion con el objetivo de transferir la funcionalidad inmunologica y las caractensticas del trasplante. La transferencia celular adoptiva puede ser autologa, como es comun en las terapias de linfocitos T adoptivas, o alogenica como es tfpico en el tratamiento de infecciones o enfermedad de injerto contra huesped. Clmicamente, las realizaciones comunes de este metodo incluyen transferencia de inmunoestimulacion o celulas tolerogenas tal como linfocitos a pacientes para aumentar la inmunidad contra virus y cancer o para estimular tolerancia en el marco de las enfermedades autiinmunitarias, tal como la diabetes tipo I o la artritis reumatoide.
Con respecto a la terapia del cancer, en la decada de 1980 fue concebido el metodo TCA por un pequeno numero de grupos que trabajan en los EE. UU., siendo uno de los principales grupos el de Steven Rosenberg y sus colegas que trabajan en el NCI. La transferencia adoptiva de linfocitos infiltrantes de tumores autologos (TlL) o celulas mononucleares de la sangre periferica redirigidas geneticamente se ha utilizado para tratar con exito pacientes con tumores solidos avanzados como el melanoma, asf como pacientes con tumores malignos hematologicos que expresan CD19. En TCA, los tipos de celulas mas comunmente utilizados son los linfocitos T, a veces clasificados por CD8+, pero otras variaciones incluyen celulas CD4+, linfocitos citolfticos, linfocitos T 8-y, linfocitos T reguladores y celulas mononucleares de la sangre periferica. Las celulas pueden estar inalteradas, como en la terapia TIL o modificadas geneticamente. Hay dos formas comunes de conseguir la orientacion genetica de los linfocitos T a objetivos espedficos del tumor. Una es la transferencia de un receptor de linfocitos T con especificidad conocida (terapia con TCR) y con el tipo de antfgeno de leucocitos humanos emparejados (HLA, conocido como complejo de histocompatibilidad principal en roedores). La otra es la modificacion de celulas con moleculas artificiales como los receptores de antfgenos dbridos (CAR). Este metodo no depende de HLA y es mas flexible con respecto a las moleculas de direccionamiento. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monocatenarios y los CAR tambien pueden incorporar dominios coestimuladores. Sin embargo, las dianas de las celulas CAR necesitan estar en la membrana de los dianocitos, mientras que las modificaciones de TCR pueden utilizar dianas intracelulares.
Durante la primera decada del desarrollo de TCA, el planteamiento estaba en los TIL. Los TIL se encuentran en los tumores, lo que sugiere que los tumores desencadenan una respuesta inmunitaria en el anfitrion. Esta llamada inmunogenicidad tumoral esta mediada por antfgenos tumorales. Estos antfgenos distinguen el tumor de las celulas sanas, proporcionando asf un estimulo inmunitario.
Por ejemplo, el documento US2003194804 A1 describe un metodo para mejorar la reactividad de un linfocito T con una celula tumoral utilizando los TIL. En el documento US2003194804 A1, los linfocitos T se exponen a un agente y se reintroducen en el paciente. El agente es capaz de reducir o prevenir la expresion o interaccion de un Notch endogeno o ligando Notch en el linfocito T.
El documento US5126132 A describe un metodo para tratar el cancer, en donde se usa una cantidad eficaz de TIL autologos y una citocina.
Dfaz R. M. et al. (Cancer Res. 15 marzo 2007; 67 (6): 2840-8) describen un aumento de las cantidades circulantes de linfocitos T espedficos de antfgenos tumorales mediante el uso de la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T en combinacion con la viroterapia intratumoral del virus de la estomatitis vesicular. Dfaz et al. utilizaron celulas OT1, es decir, una estirpe celular monoclonal artificial en la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T. Yang Z et al. (PLoS ONE, 1 de sept. de 2012; 7(9): e44802) describen una politerapia con linfocitos citolfticos inducidos por citocinas (CIK) y adenovirus oncolfticos que expresan IL-12 que induce actividad antitumoral mejorada en un modelo de tumor hepatico.
Aunque incluso en los primeros ensayos de TCA, hubo ejemplos drasticos de beneficios de tratamiento e incluso curaciones, la mayona de los pacientes no se beneficiaron y muchos pacientes experimentaron efectos secundarios graves. Durante las dos primeras decadas de terapia celular adoptiva, la seguridad del transferidor de celulas propiamente dicha fue generalmente buena, pero toxicidades significativas e incluso la mortalidad se asociaron a los tratamientos consiguientes utilizados para mejorar la terapia, incluidas la quimioterapia y la radioterapia de preacondicionamiento, y la IL-2 utilizada despues de la transferencia. El preacondicionamiento se usa para destruir celulas supresoras, como los linfocitos T reguladores y los supresores derivados de mieloides en el anfitrion, para modular el microentorno del tumor y "dejar margen" para el injerto. IL2 se utiliza despues de la transferencia para reducir la anergia del injerto y para propagarlo.
Con respecto a la eficacia, queda margen de mejora. Se justifica el aumento de la especificidad y la capacidad suficiente para destruir tumores de las terapias celulares en general. En particular, en la TCA de la tecnica anterior, las celulas transferidas fallan en el trafico hacia los tumores, e incluso si lo hacen, a menudo se vuelven anergicas, de lo contrario no pueden destruir celulas tumorales o no pueden propagarse, dando como resultado un rapido descenso del numero de celulas. Ademas, los canceres con frecuencia reducen el antigeno leucocitario humano (HLA), conocido como complejo principal de histocompatibilidad en animales, en celulas tumorales, produciendo de este modo incapacidad de los linfocitos T para destruir, ya que se requiere HLA para la presentacion de los epftopos tumorales al receptor de linfocitos T.
Breve descripcion de la invencion
Un objeto de la presente invencion es proporcionar metodos sencillos y herramientas para superar los problemas anteriores de terapias ineficientes, inseguras e impredecibles contra el cancer. La invencion se caracteriza por lo que se dice en las reivindicaciones independientes. Las realizaciones espedficas de la invencion se describen en las reivindicaciones dependientes.
La presente solicitud describe el montaje de vectores vfticos biotecnologicos.
La invencion se basa en la idea de combinar vectores adenovfticos oncolfticos que codifican citocinas o vectores adenovfticos con agentes terapeuticos celulares adoptivos para el tratamiento del cancer de una manera novedosa e inventiva. La invencion se basa en efectos sorprendentes, es decir, en las siguientes mejoras en la terapia adoptiva de linfocitos T: i) seleccion de celulas transferidas al tumor, ii) propagacion de celulas transferidas al tumor, iii) reactividad mejorada de las celulas transferidas al tumor (figura 20). De hecho, dicha combinacion de vectores vmcos y citocinas con agentes terapeuticos celulares adoptivos proporciona resultados mas eficaces en objetivos mas amplios de lo que podna haberse supuesto. Los efectos de dicha combinacion de vectores vmcos que comprende transgenes de citocinas con transferencia celular adoptiva son sinergicos comparados con los efectos de solo efectos vmcos que comprenden transgenes de citocinas o solamente transferencias celulares adoptivas.
Las ventajas de las disposiciones de la presente descripcion son efectos terapeuticos mejorados y efectos secundarios reducidos. Se evitan eventos adversos graves, incluso muertes, debido a que las mejoras en la eficacia y los efectos antisupresores del planteamiento de los inventores, pueden reducir la necesidad de preacondicionar la quimioterapia y/o la radiacion utilizadas en los metodos de la tecnica anterior para "dejar margen" para las celulas transferidas y reducir la inmunosupresion tumoral. Ademas, se evitan eventos adversos graves, incluso muertes, porque la adicion independiente de IL2 utilizada en los metodos de la tecnica anterior para propagar y mantener las celulas transferidas despues de transferirlas a un paciente no es necesaria si el virus la produce mientras se replica en el tumor. La produccion local en el tumor tambien puede mejorar los efectos deseados de IL-2 (estimulacion y propagacion del injerto) a la vez que se reduce la exposicion general que es la causa de episodios adversos.
Ademas, la presente descripcion proporciona efectos terapeuticos sorprendentes al: i) Proporcionar senales de trafico al tumor, por ejemplo, inyectando los vectores vmcos que comprenden citocinas biotecnologicas en el tumor. La inyeccion de virus da como resultado la produccion de citocinas adecuadas para este efecto (en reaccion a la union del virus a los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patogenos), pero se pueden conseguir efectos mucho mayores mediante la produccion adicional de la citocina mas adecuada como un transgen del virus. ii) Reducir la tolerancia aumentando las senales de peligro. La inyeccion de virus propiamente dicha puede conseguir esto uniendo a receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patogenos, pero el efecto puede mejorarse mediante la produccion adicional de una citocina como un transgen del virus. iii) Inducir la expresion de HLA. La infeccion por virus aumenta la expresion de HLA, ya que las celulas intentan presentar epftopos vmcos para montar una respuesta de linfocitos T antivfticos. Inesperadamente, esto se puede usar para mejorar la terapia con linfocitos T contra los epftopos tumorales, que requiere HLA para actuar. El efecto del virus sobre HLA esta mediado en parte por citocinas; la produccion de dicha citocina a partir del virus tambien puede inducir la expresion de HLA en celulas tumorales cercanas. iv) Inducir la propagacion de las celulas elevando la inmunosupresion, mediada por la presencia del virus en sf (de nuevo mediante los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patogenos), pero mejorada por la produccion de citocinas (figura 48). Por lo tanto, este metodo puede resolver los obstaculos crfticos que actualmente obstaculizan las terapias celulares adaptativas.
Breve descripcion de los dibujos
A continuacion se describira la invencion con mayor detalle por medio de realizaciones espedficas con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 demuestra que el tratamiento con adenovirus oncolfticos tnbridos Ad5/3 aumento la secrecion de citocinas y quimiocinas en tumores B16-OVA. El interferon-Y puede aumentar la expresion de HLA (= MHC) clase I, lo que genera un fenotipo de celulas tumorales que los TIL pueden reconocer de manera eficaz. Varias quimiocinas inducibles por IFN-y (tales como RANTES, MIP-1a y MCP-1) estan involucradas en la seleccion de inmunocitos, lo que podna favorecer la activacion y proliferacion de TIL. Tambien el trafico de TIL puede mejorarse aumentando estas quimiocinas.
La figura 2 muestra el control del crecimiento del tumor despues de multiples inyecciones de 5/3 adenovirus oncolfticos hforidos con o sin transferencia celular adoptiva. El tratamiento con adenovirus solo (A) tuvo poco efecto sobre el crecimiento del tumor B16-OVA en comparacion con el tratamiento con PBS. La transferencia adoptiva de 500.000 (B) o 2.000.000 (C) linfocitos OT-I espedficos del tumor en combinacion con inyecciones de virus dio como resultado un control significativo del crecimiento del tumor. El escaso efecto terapeutico sobre el crecimiento tumoral usando adenovirus solo o linfocitos OT-I en combinacion con PBS resalta las principales deficiencias del virus oncolftico y las terapias de transferencia celular adoptiva utilizadas como agentes unicos, apoyando el proposito de la invencion para mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva usando adenovirus.
La figura 3 demuestra que las inyecciones de adenovirus inducen el trafico de linfocitos T en tumores y aumentan la proliferacion de linfocitos T transferidos de forma adoptiva en tumores. A) La cantidad de celulas CD8+ CFSE+ transferidas de forma adoptiva aumento en tumores y disminuyo en la sangre, drenando los ganglios linfaticos y el bazo de ratones tratados con Ad el dfa 1 despues del tratamiento, supuestamente debido al trafico de linfocitos. El recuento global de linfocitos T CD8+ se mantuvo elevado en los tumores tratados con adenovirus durante todo el experimento, lo que sugiere una resistencia de estas celulas al microentorno del tumor perjudicial y/o una mayor proliferacion de linfocitos T CD8+. B) Los dfas 6 y 14, la proliferacion de linfocitos OT-I se mejoro en los tumores tratados con Ad en comparacion con el grupo de PBS, visto como una mayor fraccion de celulas que se han sometido a division celular (trasladada hacia M7) que en el grupo de PBS. Por consiguiente, el tratamiento con adenovirus oncolftico induce el trafico y la proliferacion de TIL transferidos de forma adoptiva. C) Ejemplo de como se realizo la seleccion de celulas positivas a CFSE. M0 indica celdas que no se han dividido, M7 muestra celdas que se han dividido lo suficiente como para diluir la CFSE por debajo de los ftmites detectables (mas de 7 veces).
La figura 4 da a conocer datos de seres humanos tratados con adenovirus oncolftico los dfas indicados por flechas. La inyeccion de virus en el tumor provoco una disminucion de linfocitos en la sangre, lo que refleja su trafico hacia los tumores.
La figura 5 da a conocer datos de que la inyeccion de adenovirus oncolftico en un tumor de un paciente humano con cancer produjo la afluencia de linfocitos T CD8+. La inyeccion intratumoral de adenovirus oncolftico produce acumulacion de linfocitos T CD8+ en el tumor evaluado a partir de biopsias con aguja antes y despues del tratamiento.
La figura 6 muestra los resultados de las inyecciones de adenovirus combinadas con la transferencia adoptiva de linfocitos T. Los ratones con tumores B16-Ova subcutaneos se transfirieron adoptivamente con 5x105 linfocitos OT1 por via intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (vease Ejemplos de materiales y metodos). En un modelo inmunosupresor de B16-Ova similar al melanoma humano, la transferencia celular adoptiva anti-Ova OT1 hace poco. Agregar inyecciones de virus aumenta la eficacia drasticamente (a). Aumento de linfocitos T CD8+ (b). Estas celulas no son linfocitos T anti-Ova (c).
La figura 7 da a conocer un aumento drastico en el numero de linfocitos T antitumorales "naturales" debido a la transferencia adoptiva y la inyeccion de virus. Los ratones con tumores B16-Ova subcutaneos se transfirieron adoptivamente con 5xl05 linfocitos OT1 por via intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (vease Ejemplos Materiales y metodos). La transferencia adoptiva las inyecciones de virus funcionan como un catalizador para la propagacion de "otros" linfocitos T en el tumor y los ganglios linfaticos locales. (a) Celulas Trp2 CD8+ en la zona del tumor. (b) Celula CD8+ anti-gp100 en la zona del tumor.
La figura 8 muestra las celulas CD8+ activadas en el tumor y la expresion de TIM-3 en el tumor el dfa 14. Los ratones con tumores B16-Ova subcutaneos se transfirieron de forma adoptiva con 5x105 linfocitos OT1 por via intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (vease Ejemplos Materiales y metodos). Inmunosupresion en inmunoterapia: el aumento en el numero de linfocitos T no es suficiente si no se elimina la inmunosupresion. Hay mas linfocitos T activadas en los tumores tratados con virus y menos inmunosupresion.
La figura 9 demuestra el aumento en linfocitos T antitumorales y la reduccion de los resultados de inmunosupresion en la inmunidad general contra los antfgenos tumorales. Los ratones con tumores B16-Ova subcutaneos se transfirieron de manera adoptiva con 5x105 OT1 (a) o 2x106 (b) linfocitos OT1 por via intraperitoneal y los tumores se dejaron sin tratar, o se inyectaron con PBS o Ad5/3 (vease Ejemplos Materiales y metodos ). La presentacion de antfgenos esta mejorada por virus: los linfocitos T funcionan mejor. Se produce inmunidad general frente a varios resultados de epftopos tumorales. (a) la expresion de moleculas coestimuladoras en celulas dendrfticas (CD11c+ CD80+ CD86+) en el tumor el dfa l4. (b) IFNg ELISPOT con esplenocitos el dfa 14.
La figura 10 muestra la distribucion de linfocitos T OTI despues de la inyeccion del virus: tendencia al trafico, pero no suficiente para explicar la eficacia. (a) diagrama, (b) modelo animal, (c) tumor.
La figura 11 da a conocer que la elevacion de la inmunosupresion puede inducir la propagacion de las celulas. Los tumores tratados con adenovirus conteman mas linfocitos espedficos del tumor (linfocitos OT-I). En los tumores tratados con PBS, las celulas OTI se detuvieron en la fase M5 (flecha izquierda), mientras que en el grupo Ad continuaron proliferando (flecha derecha).
La figura 12 muestra la eficacia de citocinas biotecnologicas (sin virus) en combinacion con celulas OT1.
La figura 13 muestra eficacia antitumoral de los adenovirus armados con citocinas combinados con la transferencia adoptiva de linfocitos T. Ratones C57BL/6 portadores de tumores de melanoma B16-OVA subcutaneos fueron tratados con 1,5 x 106 linfocitos T OT-1 enriquecidos con CD8+ por via intraperitoneal el dfa 1. Los adenovirus que codifican citocinas o el virus Ad5-Luc1 de referencia se inyectaron por via intratumoral el dfa 1 y cada semana despues (1 x 109 partmulas vfticas por tumor). El volumen tumoral se calculo como se describio anteriormente (Bramante et al. Serotype chimeric oncolytic adenovirus coding for GM-CSF for treatment of sarcoma in rodents and humans. Int J. Cancer, 24 dic. 2013) y los tamanos de los tumores se indican como porcentaje correspondiente al dfa 1, que se establecio como 100%. Numero en cifra de riesgo: numero de animales que quedan en cada grupo experimental en un momento dado. Se sacrificaron los animales de forma humanizada cuando los tumores habfan superado el tamano maximo aceptable o cuando eran evidentes algunos signos de dolor o sufrimiento.
La figura 14 muestra los efectos de diferentes virus en el tamano del tumor.
La figura 15 muestra excelentes resultados de vectores adenovfticos que comprenden el transgen mTNFa en combinacion con linfocitos T OT1 para reducir el tamano del tumor.
La figura 16 muestra excelentes resultados de vectores adenovmcos que comprenden el transgen mIL3 en combinacion con linfocitos T OT1 para reducir el tamano del tumor.
La figura 17 muestra un esquema de adenovirus oncolfticos que expresan C5a o TNF-a. Se muestran algunas caractensticas importantes de los virus, incluida la zona donde se insertan los transgenes.
La figura 18 muestra la expresion de TNF-a por adenovirus oncolftico en celulas A549. Las celulas se infectaron con 10 PV/celula, el medio se recogio en los puntos de tiempo indicados y se uso ELISA para evaluar la cantidad de TNF-a en el medio. El virus induce la expresion y la secrecion de TNF-a de las celulas infectadas.
La figura 19 muestra la actividad biologica del TNF-a producido por el adenovirus oncolftico armado con TNF-a oncolftico. En este ensayo, el sobrenadante de las celulas infectadas se utilizo para provocar a las celulas WEHI-13VAR sensibles al TNF, corroborando que el adenovirus oncolftico conduce la expresion de citocinas funcionales. La figura 20 muestra la muerte dependiente de la dosis de celulas cancerosas humanas por adenovirus oncolfticos. Como era de esperar, en las celulas tumorales A549 o PC3 humanas permisivas a la oncolisis insensibles al TNF-a, no se observo diferencia entre el virus de referencia desarmado y el adenovirus oncolftico que expresa TNF-a, ya que la simple oncolisis era suficiente para destruir las celulas. Sin embargo, debido a que el TNF-a humano es parcialmente activo en celulas de raton, que no son permisivas a la oncolisis por el adenovirus humano, el TNF-a contribuyo a la mayor citotoxicidad del virus visto en celulas de raton B16-OVA en comparacion con el virus desarmado. El virus defectuoso para la replicacion muestra una capacidad de destruccion celular insignificante. La figura 21 demuestra que la terapia de radiacion es sinergica con el virus que expresa TNF-a. A) Un esquema del programa de tratamiento en este experimento. La radiacion (XRT) fue la irradiacion de todo el cuerpo a una dosis de 2 X 2Gy y el virus fue 1 x 108 PV/tumor, donde cada raton lampino llevaba dos xenoinjertos A549. B) El virus TNF-a alberga mayor potencia antitumoral que el virus parental desarmado. Debido a que el virus de replicacion defectuosa (RD) no destruyo las celulas A549 en el cultivo (figura 20), el efecto antitumoral provocado por el virus RD in vivo probablemente se deba a respuestas inmunitarias innatas, incluidas las citocinas, los linfocitos citolfticos naturales y macrofagos, provocados por inyecciones de virus. C) El virus que expresa TNF-a produce mayores efectos antitumorales cuando se combina con dosis clmicamente adecuadas de radiacion de haz externo, lo que respalda la traducibilidad clrnica de los virus armados con citocinas.
La figura 22 muestra la eficacia antitumoral del adenovirus que codifica hTNF-a en tumores B16-OVA. Este experimento es analogo al que se muestra en la figura 26 con el virus de C5a, lo que demuestra que la expresion de TNF-a confiere una mayor ventaja terapeutica en comparacion con el virus desarmado.
La figura 23 muestra la induccion/expansion mejorada de linfocitos T CD8+ espedficas de tumores en tumores tratados con virus armado con citocinas (II). Los tumores en el experimento representado en la figura 20 se extirparon y procesaron para analisis citometrico de flujo, similar al del experimento 11. Se detecto una mayor induccion/numero de linfocitos T CD8+ espedficos de OVA en tumores tratados con el virus que codifica TNF en comparacion con virus de referencia desarmado, lo que sugiere junto con datos de C5a que las citocinas seleccionadas racionalmente expresadas por adenovirus oncolfticos junto con la inflamacion producida por el virus forman un entorno tumoral unico que apoya fuertemente la expansion y activacion de linfocitos T espedficos del tumor, por deduccion y comparacion con las figuras 2B, C tambien de linfocitos T transferidos adoptivamente.
La figura 24 muestra la expresion de C5a en celulas A549. Las celulas se infectaron con 10 PV/celula, el medio se recogio en los puntos de tiempo indicados y se uso ELISA para evaluar la cantidad de C5a en el medio. Se muestran los resultados de dos experimentos individuales.
La figura 25 muestra los resultados de un ensayo de quimiotaxia in vitro. Se cuantifico la cantidad de monocitos humanos THP1 que pasan a traves de una membrana semipermeable hacia la camara inferior, como a ^ d o s por las quimiocinas en los sobrenadantes de prueba, segun las instrucciones del fabricante (equipo Millipore QCM). El virus que expresa C5a provoca factores quimiotacticos mas fuertes de las celulas infectadas que el virus de referencia. Los resultados argumentan a favor del uso de virus armados con citocinas en lugar de virus desarmados. La figura 26 muestra la eficacia antitumoral de AdD24-C5a in vivo. Los tumores subcutaneos probados se inyectaron los dfas 0, 2 y 4 con 1 x 109 PV de cada virus o con 50 |jl de PBS y los volumenes de los tumores se midieron con el calibrador. El virus que expresa C5a proporciona un control superior del tumor en comparacion con el virus de referencia. Dado que el adenovirus no se replica ni mata las celulas del raton, es decir, no es citolttico en este modelo (Young A. M. et al. Mol. Ther. Sep 2012; 20(9): 1676-88, PMID: 22735379), estos resultados subrayan la robusta capacidad del virus armado con citocinas para mejorar los efectos antitumorales inmunitarios, apoyando firmemente el concepto de usarlo para mejorar la eficacia de la terapia celular adoptiva.
La figura 27 muestra la induccion/expansion mejorada de linfocitos T CD8+ espedficos de tumores en tumores tratados con virus armados con citocinas (I). Los tumores en el experimento representado en la figura 26 se extirparon y procesaron para analisis de citometna de flujo. Las suspensiones de celulas individuales se tineron con anticuerpo contra CD8 y con pentamero contra TCR anti-ova. La expresion de C5a por un adenovirus no citolftico produce un mayor numero de linfocitos T CD8 CD espedficas de OVA en tumores en comparacion con virus de referencia, adenovirus desarmados o virus que expresan antagonista de C5a, lo que respalda el uso de virus armados con citocinas para aumentar el numero de linfocitos T transferidos de forma adoptiva en tumores. Vease tambien el experimento 13.
La figura 28 muestra un esquema de la respuesta adaptativa de los linfocitos T.
La figura 29 demuestra que los linfocitos T transferidos adaptativamente funcionan como un catalizador ("chispa") para los linfocitos T preexistentes.
La figura 30 muestra que la "chispa" adaptativa produce un aumento en los linfocitos T antitumorales "naturales". La figura 31 muestra el metodo de transferencia celular adoptiva.
La figura 32 demuestra que con la tecnologfa TILT de la presente descripcion, se puede evitar el preacondicionamiento toxico (quimio+radiacion) y el acondicionamiento posterior (IL2 general). (Para los mecanismos de la tecnologfa TILT, vease la figura 48).
La figura 33 muestra un esquema de los nuevos montajes de virus que expresan una sola citocina. El eje central del virus es el serotipo 5 del adenovirus humano, aparte del pomo de fibra, que es del serotipo 3. Tanto los transgenes simples como los dobles estan bajo control de la transcripcion del activador del virus E3. Ambos transgenes se colocan en la region E3 que se elimina para gp19k y 6,7k. La protema E1A se elimina para 24 aminoacidos ("D24"), en la region constante 2, lo que hace que la union de Rb sea defectuosa. La expresion de E1A esta bajo regulacion del activador E2F. Algunas regiones geneticas del virus se muestran para referencia.
La figura 34 muestra un esquema de los nuevos montajes de virus que expresan dos citocinas. En una version, el 'sitio de derivacion del ribosoma'/'sitio de omision del ribosoma'/'elemento de hidrolasa que funciona en cis' (CHYSEL) se coloca como fusiones en el marco entre cada citocina. Las inserciones de citocinas se sintetizaran como una sola poliprotema que se escinde con la traduccion para producir ambas citocinas, dando como resultado la adicion de varios aminoacidos mas en el extremo 3' de la primera citocina, y una sola prolina en el 5' de la ultima citocina, IL2). En otra version, un elemento IRES separa las dos citocinas, lo que da como resultado la smtesis de citocinas sin mas aminoacidos.
La figura 35 muestra secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 2A.
La figura 36 muestra la tecnologfa de administracion de adenovirus intravenoso TILT Biotherapeutics. Los adenovirus TILT descritos anteriormente se administraran por via intratumoral a los pacientes para mejorar la terapia con linfocitos T (marcados como 4a, 5a). Sin embargo, no todos los tumores pueden alcanzarse por la via intratumoral. Por lo tanto, hemos desarrollado un veldculo de administracion a base de Ad3 que puede alcanzar tumores por via intravenosa (marcado como 4b, 5b).
La figura 37 muestra la estructura del vector Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L. La secuencia de nucleotidos del vector vmco Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L se muestra en la SEQ ID n° 30.
La figura 38 muestra la estructura del vector Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L. La secuencia de nucleotidos del vector vmco Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L se muestra en la SEQ ID n° 31.
La figura 39 muestra un gel de agarosa del vector pWEA-Ad3-hTERT-CMV-CD40L cortado con enzimas de restriccion. Los analisis de restriccion correctos de los vectores de virus clonados sugieren la secuencia de ADN correcta para el virus.
La figura 40 muestra un gel de agarosa del vector pWEA-Ad3-hTERT-E2F-CD40L cortado con enzimas de restriccion. Los analisis de restriccion correctos de los vectores de virus clonados sugieren una secuencia de ADN correcta para el virus.
La figura 41 muestra la funcionalidad de los vectores E2F-CD40L y CMV-CD40L in vitro. En el eje vertical, la escala logarftmica del valor visual relativo obtiene el TCID50 (PFU/ml). En el eje horizontal los dfas posteriores a la infeccion (d). Esto demostro que los virus son funcionales y capaces de infectar al menos algunas estirpes de celulas tumorales. Las diluciones de virus no se hicieron segun los valores de PV. TCID50 progresivo: los virus recien producidos se probaron en primer lugar con TCID50 progresivo para determinar si tienen propiedades oncolfticas. Despues de nueve (9) dfas de incubacion, las infecciones se hicieron visibles en todas las placas de cultivo de celulas A549, lo que indicaba que todos los nuevos virus eran funcionales. Durante los dfas siguientes, las infecciones continuaron propagandose segun la cantidad de virus pipeteado por celula. Se detectaron ligeras diferencias en la cantidad y velocidad de lisis celular.
Las figuras 42 a 44 dan a conocer que todos los virus oncolfticos de serotipo 3 mostraron una destruccion celular significativamente mejor (P <0,05) que el virus de referencia Ad3eGFP no replicante en celulas de cancer de pulmon A549, celulas de cancer de prostata PC3-MM2 y celulas de cancer de ovario SKOV3. No se pudieron observar diferencias significativas entre los virus Ad3 oncolfticos, lo que sugiere que todos los montajes de virus son completamente funcionales y que la eliminacion del area E3, los activadores insertados (CMV o E2F) o el transgen insertado (CD40L) no afectan la potencia oncolftica in vitro.
La figura 45 muestra la eficacia antitumoral de los virus basados en Ad3 in vivo: modelo ortotopico de cancer de ovario intraperitoneal. Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L tuvo la mejor eficacia antitumoral. ELISA confirmo la liberacion de CD40L en el torrente sangumeo.
La figura 46 muestra un margen terapeutico de adenovirus oncolfticos que codifican CD40L murino en ratones inmunocompetentes. DOSIS 5: 1 x 1011 PV/raton; DOSIS 4: 3 x 1010 PV/raton; DOSIS 3: 1 x 1010 PV/raton; DOSIS 2: 1 x 109 PV/raton; DOSIS 1: 1 x 108 PV/raton; referencia positiva (DOSIS 2 por via intratumoral). Con la dosis 5, el 67% de los ratones tema signos de toxicidad hepatica. La dosis 4 fue capaz de conseguir una buena transduccion tumoral despues del parto por via intravenosa, sin signos de toxicidad hepatica.
La figura 47 muestra la liberacion de enzimas hepaticas en ratones tratados por via intravenosa con adenovirus oncolfticos que codifican CD40L murino en ratones inmunocompetentes. No hubo mucha toxicidad hepatica, medida por la liberacion de enzimas hepaticas, en ningun grupo de tratamiento intravenoso (DOSIS 1-5). La ultima barra indica la DOSIS 2 administrada por via intratumoral. Sin embargo, en la DOSIS 5 hubo toxicidad hepatica en la inspeccion visual -> la DOSIS 4 es la dosis maxima tolerada para administracion intravenosa. (Las dosis desde la de prueba a la dosis 2 se representan como barras de izquierda a derecha).
La figura 48 muestra los mecanismos de mejora de la terapia celular adoptiva por el virus doble que expresa citocinas. La infeccion por virus y la deteccion innata de partfculas vfticas induce senales de peligro, que incluyen el aumento de las moleculas HLA/MHC de clase I en las celulas cancerosas, la activacion y maduracion de las celulas presentadoras de antfgenos y la secrecion de citocinas que captan inmunocitos. Las senales de peligro se amplifican aun mas por la muerte de celulas tumorales con virus oncolfticos, que tambien liberan antfgenos tumorales y aumentan el reconocimiento del tejido tumoral por parte del sistema inmunitario. Los virus expresan dos citocinas: la citocina captadora de linfocitos T atrae linfocitos T transferidos de forma adoptiva al tumor, y la citocina expansora de linfocitos T, en una realizacion espedfica la interleucina 2, aumenta y mantiene su proliferacion.
La figura 49 muestra esquemas del experimento de trafico con citocinas biotecnologicas de raton. Los ratones hembras C57BL/6 que llevan B16-OVA se transfieren de forma adoptiva con 2,0 x 106 linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ (secuencia) el dfa 0 y se tratan con inyecciones intratumorales de citocinas murinas biotecnologicas (triangulos) en dfas laborables. El crecimiento del tumor se controla y registra tres veces por semana (cftculos) mediante el uso de calibradores electronicos. Los ratones se sacrifican (X) en dos puntos de tiempo diferentes (SAC1 y SAC2), los tumores se recogen y las muestras se analizan utilizando qPCR OT-I y analisis de FACS de linfocitos T.
La figura 50 muestra los esquemas del experimento de trafico con adenovirus que codifican citocinas de raton. Los ratones hembras C57BL/6 que llevan B16-OVA se transfieren de forma adoptiva con 2,0 x 106 linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ (secuencia) por via ip el dfa 0 y se tratan por via intratumoral con adenovirus armados con diferentes citocinas de raton (triangulos rojos) en dfas laborables. El crecimiento del tumor se controla y registra tres veces por semana (cftculos) utilizando calibradores electronicos. Los ratones se sacrifican (X) en dos puntos de tiempo diferentes (SAC1 y SAC2), los tumores se recogen y las muestras se analizan utilizando qPCR OT-I y analisis de FACS de linfocitos T.
La figura 51 muestra los esquemas del experimento de trafico utilizando linfocitos OT-I radiomarcados con 111In y diagnostico por la imagen SPECT/CT. Ratones hembra C57BL/6 que llevan B16-OVA se inyectan por via intratumoral con 1 x 109 PV de 5/3 virus hfbridos (triangulos) en seis dfas seguidos. El primer grupo de ratones recibira una transferencia adoptiva de 2,0 x 106 linfocitos OT-I (secuencia) marcados con indio-oxina y enriquecidos con CD8a+, por via iv en el dfa 0 y el otro grupo de ratones en el dfa 7. La acumulacion de linfocitos OT-I en tumores se cuantifica por diagnostico por la imagen SPECT/CT (drculos). Los ratones se sacrifican (X) en dos puntos temporales diferentes (SAC1 y SAC2), se recogen los tumores y se mide su radioactividad final.
Descripcion detallada de la invencion
Terapia celular adoptiva
El planteamiento general de la presente descripcion es el desarrollo de un tratamiento para pacientes con cancer utilizando la transferencia de inmunolinfocitos que son capaces de reaccionar y destruir el cancer. Los linfocitos infiltrantes de tumores aislados se cultivan en grandes cantidades y se infunden en el paciente. En la presente descripcion, los vectores adenovrncos que codifican al menos una citocina se utilizan para aumentar el efecto de los linfocitos. Las administraciones independientes de una composicion terapeutica celular adoptiva y vectores adenovrncos estan frecuentemente precedidas por el acondicionamiento previo mielosupresor o no mielosupresor de quimioterapia y/o radiacion. El tratamiento de terapia celular adoptiva esta destinado a reducir o eliminar el cancer en el paciente. (Figura 21).
Esta descripcion se refiere a terapias con una composicion terapeutica celular adoptiva, p. ej., linfocitos infiltrantes de tumores, linfocitos modificados con TCR o linfocitos modificados con CAR. Esta descripcion se refiere a terapias de linfocitos T en especial, pero tambien a otras terapias adoptivas como las terapias de linfocitos citolfticos naturales u otras terapias celulares. De hecho, segun la presente descripcion, la composicion terapeutica celular adoptiva puede comprender celulas no modificadas tales como en la terapia de TIL o celulas modificadas geneticamente. Hay dos materias frecuentes de conseguir la orientacion genetica de los linfocitos T a objetivos espedficos del tumor. Una es la transferencia de un receptor de linfocitos T con especificidad conocida (terapia con TCR) y con el tipo de antfgeno leucocitario humano pareado (HLA, conocido como complejo de histocompatibilidad principal en roedores). La otra es la modificacion de celulas con moleculas artificiales tales como los receptores de antfgenos hforidos (CAR). Este metodo no depende del HLA y es mas flexible con respecto a las moleculas de direccionamiento. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monocatenarios y los CAR tambien pueden incorporar dominios coestimuladores. Sin embargo, los objetivos de las celulas CAR deben estar en la membrana de los dianocitos, mientras que las modificaciones de TCR pueden utilizar dianas intracelulares.
Como se emplea en la presente memoria, "composicion terapeutica celular adoptiva" se refiere a cualquier composicion que comprende celulas adecuadas para la transferencia celular adoptiva. En una alternativa, la composicion terapeutica celular adoptiva comprende un tipo de celula seleccionada de un grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumor (TIL), linfocitos modificados con TCR (es decir, receptor heterologo de linfocitos T) y linfocitos modificados con CAR (receptor de antfgeno hforido). En otra alternativa, la composicion terapeutica celular adoptiva comprende un tipo de celula seleccionado de un grupo que consiste en linfocitos T, celulas CD8+, celulas CD4+, linfocitos citolfticos naturales, linfocitos T delta-Y, linfocitos T reguladores y celulas mononucleares de sangre periferica. En otra realizacion, los TIL, los linfocitos T, las celulas CD8+, las celulas CD4+, los linfocitos citolfticos naturales, linfocitos T delta-Y, los linfocitos T reguladores o las celulas mononucleares de sangre periferica forman la composicion terapeutica celular adoptiva. En una alternativa, la composicion terapeutica celular adoptiva comprende linfocitos T. Tal como se emplea en la presente memoria, "linfocitos infiltrantes de tumores" o TIL se refieren a los globulos blancos que han salido del torrente sangumeo y han migrado a un tumor. Los linfocitos se pueden dividir en tres grupos, incluidos los linfocitos B, los linfocitos T y los linfocitos citolfticos naturales. En otra alternativa, la composicion terapeutica celular adoptiva comprende linfocitos T que se han modificado con receptores de antfgenos hfbridos espedficos para diana o receptores de linfocitos T seleccionados espedficamente. Como se emplea en la presente memoria, "linfocitos T" se refiere a celulas CD3+, incluidos linfocitos T cooperadores CD4+, linfocitos T citotoxicos CD8+ y linfocitos T y§.
Ademas de las celulas adecuadas, la composicion terapeutica celular adoptiva usada en la presente descripcion puede comprender cualquier otro agente tal como veldculos farmaceuticamente aceptables, amortiguadores, excipientes, adyuvantes, aditivos, antisepticos, agentes de relleno, estabilizantes y/o espesantes, y/o cualquier componente que se encuentre normalmente en los productos correspondientes. La seleccion de ingredientes adecuados y los metodos de fabricacion apropiados para formular las composiciones pertenece al conocimiento general de un experto en la materia.
La composicion terapeutica celular adoptiva puede estar en cualquier forma, tal como forma solida, semisolida o ftquida, adecuada para la administracion. Una formulacion puede seleccionarse de un grupo que consiste en, pero no se limita a, soluciones, emulsiones, suspensiones, comprimidos, granulados y capsulas. Las composiciones no se limitan a una cierta formulacion, en lugar de ello, la composicion puede formularse en cualquier formulacion farmaceuticamente aceptable conocida. Las composiciones farmaceuticas se pueden producir mediante cualquier procedimiento convencional conocido en la tecnica.
Vectores vmcos
Los vectores adenovrncos oncolfticos utilizados en la presente descripcion pueden ser cualquier vector adenovmco adecuado para el tratamiento de un humano o animal. En una alternativa, los vectores adenovrncos son vectores de virus humanos, y pueden seleccionarse de un grupo que consiste en vectores Ad5, Ad3 y Ad5/3. En otra realizacion, el vector es un vector Ad5 o Ad5/3.
Como se emplea en la presente memoria, un vector adenovrnco oncolftico se refiere a un vector adenovrnco capaz de infectar y destruir celulas cancerosas por replicacion selectiva en celulas tumorales frente a celulas normales. Los vectores se pueden modificar de cualquier forma conocida en la tecnica, p. ej., eliminando, insertando, mutando o modificando cualquiera de las areas vmicas. Los vectores se hacen espedficos de tumores con respecto a la replicacion. Por ejemplo, el vector adenovrnco puede comprender modificaciones en E1, E3 y/o E4, como la insercion de activadores espedficos del tumor (p. ej., para conducir E1), eliminaciones de areas (p. ej., la region constante 2 de E1 como se usa en "D24", E3/gp19k, E3/6,7k) e insercion de transgenes. Ademas, se pueden modificar las areas del pomo de fibra del vector. En una alternativa, el vector adenovrnco es Ad5/3 que comprende un eje central de acido nucleico Ad5 y un pomo de fibra Ad3 o un pomo Idbrido de fibra Ad5/3.
Como se emplea en la presente memoria, la expresion "eje central de acido nucleico de adenovirus serotipo 5 (Ad5)" se refiere al genoma de Ad5. Asimismo, "eje central de acido nucleico de adenovirus serotipo 3 (Ad3)" se refiere al genoma de Ad3. "Vector Ad5/3" se refiere a un vector Idbrido que tiene partes de ambos vectores Ad5 y Ad3. En una alternativa espedfica, la modificacion de la capside del vector es el hibridismo Ad5/3. Como se emplea en la presente memoria, "pomo Idbrido de fibra de Ad5/3" se refiere a un hibridismo, en donde la parte del pomo de fibra es de Ad serotipo 3, y el resto de la fibra es de Ad serotipo 5. Espedficamente, en una realizacion, el montaje tiene el pomo de fibra de Ad3 mientras que el resto del genoma es de Ad5. (Vease las figuras 17, 33 y 34).
Un metodo para la generacion de un adenovirus oncolftico espedfico de tumor esta disenando una eliminacion de 24 pares de bases (D24) que afecta a la region constante 2 (CR2) de E1. En el adenovirus CR2 natural es responsable de la union de la protema supresora del tumor celular Rb/protema reguladora del ciclo celular para la induccion de la fase de smtesis (S), es decir, la fase de smtesis del ADN o de replicacion. La interaccion entre pRb y E1A requiere ocho aminoacidos 121 a 127 de la region conservada de la protema E1A, que se eliminan en la presente descripcion. El vector de la presente descripcion comprende una eliminacion de nucleotidos correspondientes a los aminoacidos 122 a 129 del vector segun Heise C. et al. (2000, Nature Med. 6, 1134-1139). Se sabe que los virus con la D24 tienen una capacidad reducida para superar el punto de control de G1-S y se replican de manera eficiente solo en celulas donde esta interaccion no es necesaria, p. ej., en celulas tumorales defectuosas en la ruta Rb-p16, que incluye la mayoria, si no todos, los tumores humanos. (Veanse las figuras 17, 33 y 34).
Tambien es posible reemplazar el activador vftico endogeno E1A, por ejemplo, por un activador espedfico del tumor. En una alternativa espedfica, se utiliza el activador hTERT en lugar del activador vmco endogeno E1A.
La region E3 no es esencial para la replicacion vftica in vitro, pero las protemas E3 desempenan una funcion importante en la regulacion de la respuesta inmunitaria del anfitrion, es decir, en la inhibicion de las respuestas inmunitarias tanto innatas como espedficas. La eliminacion de gp19k/6,7k en E3 se refiere a una eliminacion de 965 pares de bases de la region E3A adenovmca. En un montaje adenovrnco resultante, se eliminan los genes gp19k y 6,7k (Kanerva A. et al. 2005, Gene Therapy 12, 87-94). Se sabe que el producto genico gp19k se une y retiene las moleculas del complejo de histocompatibilidad principal I (MHC1, conocido como HLA1 en seres humanos) en el redculo endoplasmico, y evita el reconocimiento de celulas infectadas por los linfocitos T citotoxicos. Dado que muchos tumores carecen de HLA1/MHC1, la eliminacion de gp19k aumenta la selectividad tumoral de los virus (el virus se elimina mas rapido que el virus natural de las celulas normales, pero no hay diferencia en las celulas tumorales). Las protemas 6,7k se expresan en las superficies celulares y participan en la disminucion del receptor 2 (TRAIL) del ligando inductor de apoptosis relacionado con TNF (veanse las figuras 17, 33 y 34).
Ambas eliminaciones proporcionan una ventaja sorprendente. Dado que los inventores estan intentando recuperar la expresion de HLA/MHC para la presentacion de epftopos tumorales a los linfocitos T transferidos de forma adoptiva, la expresion de la protema gp19k es contraproducente y, de hecho, la regulacion positiva de HLA/MHC requiere la eliminacion de gp19k. Con respecto a 6,7k, dado que la produccion de TNFa proviene del virus, y una de sus actividades antitumorales es un efecto proapoptotico antitumoral directo (tanto en celulas transeuntes transducidas como en las no transducidas), la presencia de 6,7k es contraproducente.
En una alternativa, el transgen o transgenes de citocinas se colocan en una region E3 eliminada por gp19k/6,7k, bajo el activador E3. Esto restringe la expresion del transgen a las celulas tumorales que permiten la replicacion del virus y la activacion posterior del activador E3. El activador E3 puede ser cualquier activador exogeno (p. ej., activador de CMV o E2F) o endogeno conocido en la tecnica, espedficamente el activador E3 endogeno. Aunque el activador E3 se activa principalmente por replicacion, se produce alguna expresion cuando se expresa E1. Como la selectividad de los virus de tipo D24 se produce despues de la expresion de E1 (cuando E1 no puede unirse a Rb), estos virus expresan E1 tambien en celulas normales transducidas. Por lo tanto, es de importancia crftica regular tambien la expresion de E1 para restringir la expresion del transgen mediada por el activador E3 a celulas tumorales. En otra alternativa, E3 gp19k/6,7k se mantiene en el vector pero una o muchas otras areas de E3 se han eliminado (p. ej., E39-kDa, E310,2 kDa, E315,2 kDa y/o E315,3 kDa).
En una alternativa espedfica, el vector adenovftico oncolftico se basa en un eje central de acido nucleico de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende un pomo dbrido de fibra 5/3, y que comprende lo siguiente: Activador E2F1 para la expresion espedfica de tumor de E1A, una eliminacion de 24 pb (D24) en la region 2 constante que se une a Rb de E1 adenovrnco, una eliminacion de la secuencia de acido nucleico de gp19k vftico y marcos de lectura de 6,7k, con una insercion del transgen en la region eliminada, dando como resultado un control asociado a la replicacion de la expresion del transgen bajo el activador E3 vmco y una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un transgen de citocina en lugar de los genes adenovfticos gp19k/6,7k eliminados en la region E3 (figura 17). En una alternativa, el vector adenovrnco se basa en un adenovirus humano. (Veanse las figuras 17, 33 y 34).
En otra alternativa espedfica, el vector adenovrnco oncolftico se basa en un eje central de acido nucleico de adenovirus serotipo 3 (Ad3), y comprende lo siguiente: una eliminacion en el area E3 y un activador espedfico del tumor (p. ej., CMV o E2F) para la expresion de un transgen (p. ej., CD40L) en el lugar del area eliminada de E3. En una alternativa, el vector adenovftico se basa en un adenovirus humano. (Veanse las figuras 37 y 38, correspondientes a las secuencias de nucleotidos de los vectores vfticos Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L y Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L se muestran en las SEQ ID n° 30 y n° 31).
No se conocen las funciones exactas de las protemas de la region inicial (E3) en el adenovirus 3. En general, en los adenovirus no parecen afectar la replicacion cuando se eliminan y parecen afectar la respuesta del anfitrion antivftico a los adenovirus (Wold et al., 1999). El E3 del genoma del adenovirus humano contiene el nivel mas alto de diversidad genetica entre las seis especies (A-F) de adenovirus que se encuentran en seres humanos. Esta diversidad en el contenido genetico esta localizada principalmente entre los marcos abiertos de lectura (ORF) E3-gp19K y E3-RIDa muy conservados donde se codifican matrices de genes espedficas de cada especie (Burgert y Blusch, 2000).
E3-gp19K modula la muerte de celulas infectadas por virus mediada por linfocitos T citotoxicas. Esto se consigue bloqueando el transporte de MHC clase I a la membrana plasmatica e inhibiendo la formacion del complejo TAP-MHC clase I (Andersson et al., 1985; Andersson et al., 1987; Burgert y Kvist, 2002, Bennet et al., 1999).
Por lo tanto, en una alternativa, la importante molecula E3-gp19K esta comprendida en el vector adenovftico para hacer que la replicacion del virus sea mas robusta y permita mas tiempo para la oncolisis y sus beneficiosos efectos. Ademas, retener E3-gp19K puede reducir la produccion de linfocitos T citotoxicos anti-adenovirus, lo que produce mas linfocitos T antitumorales.
En una alternativa, el vector adenovftico oncolftico se basa en un eje central de acido nucleico de adenovirus serotipo 3 (Ad3), y comprende lo siguiente: un activador (p. ej., hTERT) para la expresion espedfica del tumor de E1A, una eliminacion en el area de E3 (p. ej., una eliminacion que afecta a E39-kDa, E310.2 kDa, E315.2 kDa y E3 15.3 kDa), y un activador espedfico del tumor (p. ej., CMV o E2F) para la expresion de un transgen (p. ej., CD40L) en el lugar del area eliminada de E3 . En una alternativa, el eje central del acido nucleico del vector es el serotipo 3 del adenovirus en su totalidad. En una alternativa en los virus Ad3 delE3, se han eliminado las siguientes caractensticas: E3 9-kDa, E3 10.2-kDa, E3 15.2-kDa, E3 15.3-kDa y ademas, se ha insertado CD40L con un activador (CMV o E2F) en su lugar. Estos virus provocan la apoptosis de las celulas tumorales y desencadenan varios mecanismos inmunitarios, una respuesta de linfocitos T cooperadores tipo 1 (TH1), que conduce a la activacion de linfocitos T citotoxicos y a la reduccion de la inmunosupresion.
Las citocinas participan en la respuesta inmunitaria actuando por diversos mecanismos incluida la seleccion de linfocitos T hacia el tumor. La secuencia de nucleotidos que codifica un transgen de citocina puede ser de cualquier animal como un ser humano, simio, rata, raton, hamster, perro o gato, pero espedficamente esta codificada por una secuencia humana. La secuencia de nucleotidos que codifica el transgen puede modificarse para mejorar sus efectos, o no modificarse, es decir, natural.
Las alternativas particulares descritas incluyen vectores vfticos que codifican al menos una citocina. Las citocinas utilizadas se pueden seleccionar de cualquier citocina conocida en la tecnica. En una alternativa, la citocina se selecciona de un grupo que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25- 1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7, y XCL2. En una alternativa espedfica, la citocina es IL-2 o TNFa. En otra alternativa, la citocina o citocinas se selecciona(n) de un grupo de quimiocinas que consiste en CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2.
Los vectores vfticos de la presente descripcion pueden codificar una, dos, tres, cuatro, cinco o mas citocinas. En una alternativa, el vector adenovftico oncolftico codifica dos o mas citocinas, mas espedficamente dos. Estas dos citocinas pueden ser cualquier citocina conocida, por ejemplo, que incluidas entre otras las enumeradas anteriormente, ademas de GMCSF. Las dos citocinas pueden ser citocinas diferentes. En una alternativa, el vector adenovmco oncolftico codifica dos o mas citocinas seleccionadas de un grupo de citocinas que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, GMCSF, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCl3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2, o el vector adenovftico oncolftico codifica IL-2 y una citocina o citocinas seleccionadas de un grupo de citocinas que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, GMCSF, TNFa, CD40L, IL-12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2. En una alternativa espedfica, las citocinas son IL-2 y TNFa. La otra citocina funciona atrayendo y activando los linfocitos T y reducir la inmunosupresion del tumor, mientras que IL-2 induce la propagacion del injerto de linfocitos T. Por lo tanto, la IL-2 se produce localmente en el tumor donde se necesita, en lugar de inyectarse sistematicamente como se hace normalmente en el tratamiento con linfocitos T, lo que puede producir efectos secundarios, y por lo tanto un problema importante de los tratamientos de la tecnica anterior (es decir, la toxicidad de IL-2 general) puede evitarse mediante esta realizacion.
La senalizacion de peligro proporcionada por la replicacion del virus oncolftico y la activacion de los receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patogenos por el ADN vftico, junto con la accion del transgen o transgenes puede reducir la inmunosupresion del tumor en un grado tal que la terapia de preacondicionamiento se pueda omitir. En consecuencia, y un problema importante en la tecnica anterior, se puede evitar la toxicidad debida a la quimioterapia y la radioterapia de acondicionamiento previo.
En una alternativa, el vector de virus comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) u opcionalmente una sitio de derivacion 2A del ribosoma entre los dos transgenes. Por lo tanto, el IRES o una sitio de derivacion del ribosoma 2A pueden estar entre cualquier citocina, como la IL-2 y cualquier otra citocina seleccionada del grupo de citocinas enumeradas anteriormente. Como se emplea en la presente memoria, "IRES" se refiere a una secuencia de nucleotidos que permite el inicio de la traduccion en medio de una secuencia de ARN mensajero en la smtesis de protemas. El IRES puede ser de cualquier virus, pero en una alternativa, el IRES es del virus de la encefalomiocarditis (EMCV). Como se emplea en la presente memoria, "un sitio de derivacion 2A del ribosoma " se refiere a una secuencia de iniciacion de la traduccion en la que los ribosomas derivan ftsicamente partes de la region no traducida 5' para alcanzar el codon de iniciacion. Tanto los virus con IRES como los 2A permiten producir dos transgenes a partir de un activador (el activador E3).
Los esquemas de los disenos generales de los genomas de virus, que pueden usarse, se muestran en las figuras 17, 33, 34, 37 y 38. Las secuencias de nucleotidos de los vectores vfticos que comprenden los transgenes C5a, hCD40L, hIFNa2, hIFNbl, hIFNgl, hIL2 o TNFa se muestran en las SEQ iD n°s 1-7, respectivamente (transgen Ad5/3-E2F-D24). Las secuencias de nucleotidos de los vectores vfticos que comprenden CD40L tambien se muestran en las SEQ ID n° 30 y n° 31 (Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L y Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L). Ademas, las secuencias de nucleotidos de los vectores vfticos que comprenden dos transgenes, siendo uno IL-2 y el otro C5a, CD40L, IFNa2, IFNb, IFNg, GMCSF o TNFa, se muestran en las SEQ ID n°s 8-21 (SEQ ID n°: 8 C5a-2A-IL2, SEQ ID n°: 9 IFNa-2A-IL2, SEQ ID n°: 10 TNFa-2A-IL2, SEQ ID n°: 11 CD40L-2AIL2, SEQ ID n°: 12 IFNb-2A-IL2, SEQ ID n°: 13 GMCSF-2A-IL2, SEQ ID n°: 14 IFNg-2A-IL2, SEQ ID n°: 15 C5a-IRES-IL2, SEQ ID n°: 16 IFNa-IRES-IL2, ID n°: 17 TNFa-IRES-IL2, SEQ ID n°: 18 CD40L-IRES-IL2, SEQ ID n°: 19 IFNb-IRES-IL2, SEQ ID n°: 20 GMCSF-IRES-IL2, SEQ ID n°: 21 IFNg-IRES-IL2) (Ad5/3-E2F-D24-transgen-IRES/2A-transgen).
En resumen, las ventajas clave de la presente descripcion que utilizan vectores vfticos que comprenden al menos un transgen de citocinas son: i) las citocinas y los virus de por si causan una senal de peligro que atrae linfocitos T y otros inmunocitos a los tumores, ii) las citocinas inducen proliferacion de linfocitos T tanto en el tumor como en los organos linfoides locales, iii) las citocinas y los virus de por sf pueden inducir a que las linfocitos T (tanto el injerto de linfocitos T adoptivos como las linfocitos T naturales, antitumorales innatos) se propaguen en el tumor, iv) las citocinas y/o virus inducen el aumento de las moleculas presentadoras de anftgenos (HLA) en las celulas cancerosas, haciendolas sensibles al reconocimiento y la destruccion por los linfocitos T, y v) la replicacion de citocinas y virus alteran favorablemente el microentorno del tumor al reducir la inmunosupresion y la anergia celular.
Los vectores vfticos utilizados en las presentes descripciones tambien pueden comprender otras modificaciones ademas de las descritas anteriormente. Cualquier componente o modificacion adicional puede usarse opcionalmente pero no es obligatorio para la presente descripcion.
La insercion de elementos exogenos puede potenciar los efectos de los vectores en las celulas diana. El uso de tejido exogeno o activadores espedficos de tumores es frecuente en vectores biotecnologicos y tambien pueden utilizarse en la presente descripcion.
En resumen, la presente descripcion da a conocer que la replicacion del virus oncolftico puede atraer linfocitos T e producir senales de peligro en el tumor, reduciendo la inmunosupresion y la anergia celular. Estos efectos estan mediados por receptores de reconocimiento de patrones moleculares asociados a patogenos, un mecanismo conservado evolutivamente para inducir inmunidad y no sujeto a tolerancia. La presente descripcion tambien da a conocer que un beneficio anadido de la plataforma oncolftica, capaz de replicarse en tumores pero no en celulas normales, es la autoamplificacion en el tumor. Ademas, el efecto oncolftico de por sf, puede sumarse al efecto antitumoral general en los seres humanos.
Cancer
Los vectores biotecnologicos de la presente descripcion son competentes para la replicacion en celulas tumorales. En una alternativa, los vectores son competentes para la replicacion en celulas, que tienen defectos en la ruta Rb, espedficamente la ruta Rb-p16. Estas celulas defectuosas incluyen todas las celulas tumorales en animales y seres humanos. Como se emplea en la presente memoria, "defectos en la ruta de Rb" se refiere a mutaciones y/o cambios epigeneticos en cualquier gen o protema de la ruta. Debido a estos defectos, las celulas tumorales sobreexpresan E2F y, por lo tanto, la union de Rb por E1A CR2, que normalmente se necesita para una replicacion eficaz, es innecesaria. Ademas la selectividad esta mediada por el activador E2F, que solo se activa en presencia de E2F libre, como se ve en las celulas defectuosas de la ruta Rb/p16. En ausencia de E2F libre, no se produce la transcripcion de E1A y el virus no se replica. La inclusion del activador E2F es importante para evitar la expresion de E1A en tejidos normales, que puede producir toxicidad tanto directa como indirectamente al permitir la expresion de transgenes del activador E3.
La presente descripcion se refiere a metodos para tratar el cancer en un sujeto. En una alternativa, el sujeto es un ser humano o un animal, espedficamente un animal o un paciente humano, mas espedficamente un ser humano o un animal que padece cancer.
El metodo puede usarse para tratar cualquier cancer o tumor, incluidos los tumores tanto malignos como benignos, tanto los tumores primarios como las metastasis pueden ser objetivos del metodo. En una alternativa, el cancer presenta linfocitos infiltrantes de tumores. Las herramientas de la presente descripcion son particularmente atractivas para el tratamiento de tumores solidos metastasicos que presentan linfocitos infiltrantes de tumores. En otra realizacion, el injerto de linfocitos T ha sido modificado por un receptor de linfocitos T espedfico para tumores o tejidos del receptor de antfgeno dbrido.
Como se emplea en la presente memoria, el termino "tratamiento" se refiere a la administracion de al menos vectores adenovfticos oncolfticos o al menos vectores adenovfticos oncolfticos y composicion terapeutica celular adoptiva a un sujeto, preferiblemente un sujeto mamfero o humano, para fines que Incluyen no solo la cura completa, sino tambien la profilaxis, la mejora o el alivio de trastornos o smtomas relacionados con un cancer o un tumor. El efecto terapeutico se puede evaluar controlando los smtomas de un paciente, los marcadores tumorales en la sangre o, por ejemplo, el tamano de un tumor o la duracion de la supervivencia del paciente.
En otra alternativa, el cancer se selecciona de un grupo que consiste en cancer nasofarmgeo, cancer sinovial, cancer hepatocelular, cancer renal, cancer de tejidos conectivos, melanoma, cancer de pulmon, cancer intestinal, cancer de colon, cancer rectal, cancer colorrectal, cancer cerebral, cancer de garganta, cancer bucal, cancer de dgado, cancer de huesos, cancer de pancreas, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia de linfocitos T/linfoma, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, smdrome de Zollinger-Ellison, cancer suprarrenal, cancer anal cancer del conducto biliar, cancer de vejiga, cancer de ureter, cancer cerebral, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de la medula espinal, cancer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, cancer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide del aparato digestivo, fibrosarcoma, cancer de mama, enfermedad de Paget, cancer de cuello uterino, cancer colorrectal, cancer rectal, cancer de esofago, cancer de vesmula biliar, cancer de cabeza, cancer de ojo, cancer de cuello, cancer de rinon, tumor de Wilms, cancer de dgado, sarcoma de Kaposi, cancer de prostata, cancer de pulmon, cancer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cancer bucal, cancer de piel, mesotelioma, mieloma multiple, cancer de ovario, cancer endocrino pancreatico, glucagonoma, cancer pancreatico, cancer de paratiroides, cancer de pene, cancer de pituitaria, sarcoma de tejido blando, retinoblastoma, cancer de intestino delgado, cancer de estomago, cancer de timo, cancer de tiroides, cancer trofoblastico, mola hidatiforme, cancer de utero, cancer de endometrio, cancer de vagina, cancer de vulva, neuroma acustico, micosis fungoide, insulinoma, smdrome carcinoide, somatostatinoma, cancer de enda, cancer de corazon, cancer de labios, cancer de meninges, cancer de boca, cancer de nervios, cancer de paladar, cancer de glandula parotida, cancer de peritoneo, cancer de faringe, cancer pleural, cancer glandulas salivales, cancer de lengua y cancer de airftgdalas.
Antes de clasificar a un paciente humano o animal como adecuado para el tratamiento de la presente descripcion, el medico puede examinar a un paciente. En funcion de los resultados que se desvfan de lo normal y ponen de manifiesto un tumor o cancer, el medico puede sugerir el tratamiento de la presente descripcion para un paciente.
Composicion farmaceutica
Una composicion farmaceutica de la presente descripcion comprende al menos un tipo de vectores vfticos. Ademas, la composicion puede comprender al menos dos, tres o cuatro vectores diferentes. Ademas del vector, una composicion farmaceutica tambien puede comprender otros agentes terapeuticamente eficaces, cualesquiera otros agentes tales como vetftculos, amortiguadores, excipientes, adyuvantes, aditivos, antisepticos, cargas, estabilizantes y/o espesantes farmaceuticamente aceptables, y/o cualquier componente normalmente encontrado en los productos correspondientes. La seleccion de ingredientes adecuados y los metodos de fabricacion apropiados para formular las composiciones pertenecen al conocimiento general de un experto en la tecnica.
La composicion terapeutica celular adoptiva puede estar en cualquier forma, tal como forma solida, semisolida o ftquida, adecuada para su administracion. Una formulacion puede seleccionarse de un grupo que consiste en, pero no se limita a, soluciones, emulsiones, suspensiones, comprimidos, granulados y capsulas. Las composiciones de la presente descripcion no se limitan a una determinada formulacion, en lugar de ello, la composicion puede formularse en cualquier formulacion farmaceuticamente aceptable conocida. Las composiciones farmaceuticas se pueden producir por cualquier procedimiento convencional conocido en la tecnica.
En una alternativa, el vector vftico o la composicion farmaceutica funciona como un vetftculo in situ para la captacion de linfocitos T, potenciando su efecto terapeutico y permitiendo su propagacion en el tumor.
Un equipo farmaceutico de la presente descripcion comprende una composicion terapeutica celular adoptiva y vectores adenovfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina. La composicion terapeutica celular adoptiva se formula en una primera formulacion y los vectores adenovmcos oncolfticos que codifican al menos una citocina se formulan en una segunda formulacion. En otra alternativa, la primera y la segunda formulaciones son para administracion simultanea o secuencial, en cualquier orden, a un sujeto.
Administracion
El vector o composicion farmaceutica de la invencion se puede administrar a cualquier sujeto eucariotico seleccionado de un grupo que consiste en plantas, animales y seres humanos. En una realizacion espedfica de la invencion, el sujeto es un ser humano o un animal. Un animal puede seleccionarse de un grupo que consiste en mascotas, animales domesticos y animales de produccion.
Se puede usar cualquier metodo convencional para la administracion del vector o composicion a un sujeto. La via de administracion depende de la formulacion o forma de la composicion, la enfermedad, la localizacion de los tumores, el paciente, las morbilidades asociadas y otros factores.
En una alternativa, la administracion o las administraciones separadas de la composicion terapeutica celular adoptiva y los vectores adenovmcos oncolfticos que codifican al menos una citocina a un sujeto se llevan a cabo de manera simultanea o consecutiva, en cualquier orden. Tal como se emplea en la presente memoria, "administracion separada" o "separada" se refiere a una situacion, en la que la composicion terapeutica celular adoptiva y los vectores adenovmcos oncolfticos son dos productos o composiciones diferentes que se distinguen entre sft Solo una administracion de la composicion terapeutica celular adoptiva y los vectores adenovfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina de la descripcion o solo los vectores de virus oncolfticos o no citolfticos pueden tener efectos terapeuticos. Puede haber cualquier penodo entre las administraciones dependiendo, por ejemplo, del paciente y del tipo, grado o localizacion del cancer. En una alternativa hay un penodo de tiempo de un minuto a cuatro semanas, espedficamente de 1 a 10 dfas, mas espedficamente de 1 a 5 dfas, entre la administracion consecutiva de la composicion terapeutica adoptiva y los vectores adenovfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina y/o existen varias administraciones de composicion terapeutica celular adoptiva y vectores adenovfticos oncolfticos. El numero de tiempos de administracion de la composicion terapeutica celular adoptiva y los vectores adenovfticos oncolfticos tambien puede ser diferente durante el penodo de tratamiento. Los vectores adenovfticos oncolfticos o las composiciones de celulas farmaceuticas o adoptivas pueden administrarse, por ejemplo, de 1 a 10 veces en las primeras 2 semanas, 4 semanas, mensualmente o durante el penodo de tratamiento. En una alternativa, la administracion de vectores o cualquier composicion se realiza de tres a siete veces en las primeras 2 semanas, luego a las 4 semanas y luego mensualmente. En una alternativa espedfica, la administracion se realiza cuatro veces en las primeras 2 semanas, luego a las 4 semanas y a continuacion mensualmente. La duracion del penodo de tratamiento puede variar y, por ejemplo, puede durar de dos a 12 meses o mas.
En una alternativa espedfica una composicion terapeutica celular adoptiva y vectores adenovfticos oncolfticos se administran el mismo dfa y, posteriormente, se administran vectores adenovfticos oncolfticos cada semana, dos semanas, tres semanas o todos los meses durante un penodo de tratamiento que puede durar por ejemplo de uno a 6 o 12 meses o mas.
En una alternativa, la administracion de virus oncolfticos se realiza mediante una inyeccion intratumoral, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administracion oral. Tambien es posible cualquier combinacion de administraciones. El metodo puede dar eficacia general a pesar de la inyeccion local. La composicion terapeutica celular adoptiva se puede administrar por via intravenosa o intratumoral. En una realizacion, la administracion de la composicion terapeutica celular adoptiva y/o los vectores vfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina se realiza a traves de una inyeccion intratumoral, intraarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administracion oral. En una alternativa espedfica los TIL o linfocitos T se administran por via intravenosa y los vectores vmcos por via intratumoral y/o intravenosa. Es de destacar que el virus se administra al tumor por separado de la administracion de linfocitos T; el virus no se utiliza para modificar el injerto de linfocitos T ex vivo. En esencia, el virus modifica el tumor de tal manera que el injerto de linfocitos T puede funcionar mejor.
La dosis eficaz de vectores depende de al menos el sujeto que necesita el tratamiento, el tipo de tumor, la localizacion del tumor y la fase del tumor. La dosis puede variar, por ejemplo, de aproximadamente 1 x 108 partm ulas vmcas (PV) a aproximadamente 1 x 1014 PV, espedficamente de aproximadamente 5 x 109 PV a aproximadamente 1 x 1013 PV y mas espedficamente desde aproximadamente 8 x 109 PV hasta aproximadamente 1 x 1012 PV. En una realizacion, los vectores adenovmicos oncolfticos que codifican al menos una citocina se administran en una cantidad de 1 x 1010 - 1 x 1014 partm ulas vfticas. En otra realizacion de la invencion, la dosis esta comprendida en el intervalo de aproximadamente 5 x 1010 - 5 x 1011 PV.
La cantidad de celulas transferidas tambien dependera del paciente, pero las cantidades tfpicas vanan de 1 x 109 a 1 x 1012 celulas por inyeccion. El numero de inyecciones tambien vana, pero las realizaciones tfpicas incluyen 1 o 2 rondas de tratamiento con varias semanas de diferencia (p. ej., de 2 a 4).
Se puede usar cualquier otro tratamiento o combinacion de tratamientos ademas de las terapias de la presente descripcion. Por ejemplo, radioterapia simultanea o secuencial, anticuerpos monoclonales, quimioterapia u otros farmacos o intervenciones (incluida la cirugfa) a un sujeto.
Los terminos "tratar" o "aumentar", asf como las palabras que se derivan de los mismos, como se emplean en la presente memoria, no implican necesariamente un 100% o un tratamiento completo o un aumento. Mas bien, hay grados variables de los cuales un experto en la tecnica reconoce que tiene un beneficio potencial o efecto terapeutico. A este respecto, los metodos de la presente invencion pueden proporcionar cualquier aumento en la eficacia de la terapia con linfocitos T o cualquier grado de tratamiento o prevencion de una enfermedad.
Las figs. 28-32, 36 y 48 ilustran los metodos y mecanismos de la presente descripcion.
Sera obvio para un experto en la materia que, a medida que avanza la tecnologfa, el concepto de la invencion puede realizarse de varias maneras. La invencion y sus realizaciones no se limitan a los ejemplos descritos anteriormente, sino que pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.
Ejemplos
Materiales y metodos
Modelo animal B16-OVA: las celulas B16 que expresan ovoalbumina (B16-OVA) se mantuvieron en RPMI, FBS al 10%, 5 mg/ml de G418, L-glutamina 20 mM, solucion 1x Pen/Strep (GIBCO). A ratones hembra inmunocompetentes C57BL/6 de 4 a 7 semanas de edad se les implanto por via subcutanea 2,5 x 105 celulas B16-OVA en 50 |jl de RPMI, 0% de FBS, en el costado derecho, un tumor por raton. Aproximadamente diez dfas despues de la implantacion del tumor (cuando los tumores se volvieron inyectables ~3 mm de diametro mmimo), los ratones se dividieron en grupos y se trataron en algunos experimentos en seis dfas consecutivos con inyecciones intratumorales de 50 j l de PBS o 1 x 109 partm ulas vmcas (PV) de adenovirus oncolfticos en 50 j l de PBS. En otros experimentos, se administraron tres inyecciones los dfas 0, 2 y 4. Como las celulas murinas no son permisivas para adenovirus humano, se usaron multiples inyecciones de virus intratumoral para simular la inflamacion inducida por la replicacion del virus (Blair et al., 1989).
Transferencia adoptiva: El primer dfa de tratamiento intratumoral, los ratones tambien recibieron por transferencia adoptiva en la cavidad intraperitoneal 5 x 105 a 2 x 106 esplenocitos enriquecidos con CD8a y expandidos en reposo durante la noche de ratones C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J (OT-1) de 4 a 8 semanas de edad, modificados geneticamente para tener solo receptores de linfocitos T CD8 espedficas de ovalbumina (OVA), en 100 j l de RPMI, 0% de FBS. El enriquecimiento con CD8a se realizo con CD8a de raton (Ly-2) MicroBeads 5 dfas antes de la transferencia, segun las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotech, EE. UU., n° en cat. 130-049-401). Las celulas enriquecidas se expandieron en numeros durante cinco dfas en medio de linfocitos (RPMI, FBS al 10%, L-glutamina 20 mM, solucion 1x Pen/Strep, HEPES 15 mM, 2-mercaptoetanol 50 jM, piruvato Na 1 mM) en presencia de IL-2 murina biotecnologica (160 ng/ml) y anticuerpo anti-CD3e de raton soluble (0,3 jg/ml, Abcam, clon 145-2C11). Tratamiento de tejidos para citometna de flujo: Se sacrificaron ratones y los bazos, los ganglios linfaticos de drenaje y los tumores se recogieron en 1 a 10 ml de RPMI, FBS al 10%, y la sangre se extrajo mediante sangrado cardfaco terminal en la cavidad pleural y se transfirio con una jeringa desechable en tubos de microcentrifugadora que conteman EDTA y se trato para su analisis: los tejidos solidos se disociaron toscamente con bistun y se trituraron en una punta de pipeta esteril desechable de 10 ml en 5 a 10 ml de amortiguador de lisado ACK (NH4O 150 mM, KHCO3 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,2) y se incubaron a temperatura ambiente (TA) durante ~20 minutos, tras lo cual las celulas se sedimentaron a 1200 rpm 5 min 4°C, despues de lo cual las celulas se volvieron a poner en suspension en 1 a 10 ml de RPMI, FBS al 10%, dependiendo en la cantidad estimada de celulas, y se pasaron a traves de un filtro esteril de 40 pm para crear una solucion unicelular. En algunos experimented, el tejido tumoral en su lugar se proceso directamente despues del corte con el bistun (antes de la adicion de ACK) en un volumen total de 1 ml de mezcla de proteasa (RPMI enriquecido con colagenasa tipo A, H o P, Roche, a 1 mg/ml y benzonasa, 125 unidades/ml de conc. final, Sigma, E1014-25KU) durante 1-2 horas a 37°C, 5% de CO2, tras de lo cual se agregaron 10 ml de amortiguador de lisado ACK y las celulas se trataron como anteriormente. Se pipetearon 200 pl de sangre completa en 5 ml de amortiguador de lisado ACK y se trataron como anteriormente. Las celulas se incubaron durante la noche a 37°C, CO2 al 5%, o se analizaron directamente mediante inmunotincion y citometna de flujo.
Preparacion de tejidos para el analisis de citocinas: Se sacrificaron los ratones y las piezas tumorales de ~2-10 mm3 se congelaron en tubos de microcentrifugadora de 2 ml en hielo seco y se almacenaron a -80°C. Las piezas tumorales se pesaron y se anadieron 200 pl de PBS enfriado con hielo. Las piezas se homogeneizaron con un rotor Tissue Master 125, 1x mezcla inhibidora de proteasa (Sigma) y BSA al 0,1% de conc. final se agrego y los tubos se mantuvieron en hielo. El homogeneizado tumoral se centrifugo a 2.000 rpm 10 min a 4°C y el sobrenadante se analizo con perlas Flex Set CBA de citocinas (BD, EE. UU.) en BD FACSArray, segun las instrucciones del fabricante.
Experimentos que apoyan la invencion
Experimento 1 (citocinas y quimiocinas inducidas por inyeccion intratumoral de adenovirus):
Para estudiar si la infeccion por adenovirus podna dar lugar a la expresion de citocinas y quimiocinas, se inyectaron ratones portadores de tumores subcutaneos B16-OVA por via intratumoral con PBS o adenovirus oncolfticos hterido 5/3 los dfas 0, 1, 2, 3, 4 y 5. Se extrajeron los tumores de tres ratones por grupo de tratamiento y se prepararon para el analisis de citocinas el dfa 0 (antes de la inyeccion del virus = control inicial), y de otros tres ratones por punto de tiempo los dfas 6, 10, 14 y 18.
Los resultados mostraron, extraordinariamente, un aumento inducido por el virus en la secrecion de IFN-y y el posterior incremento de quimiocinas inducibles por IFN-y RANTES, MIP-1a y MCP-1 el dfa 10 (figura 1).
Para mejorar la eficacia terapeutica de la terapia celular adoptiva, estos resultados son importantes.
En base a estos datos, el tratamiento con adenovirus armados con citocinas oncolfticas da como resultado una alteracion favorable del microentorno tumoral, un aumento de la quimiotaxia de los inmunocitos transferidos de forma adoptiva y un mayor reconocimiento de las celulas tumorales por las linfocitos T CD8+ citotoxicos.
Experimento 2 (potenciacion mediada por adenovirus de la terapia adoptiva con linfocitos T):
Para estudiar el impacto del tratamiento con adenovirus en la terapia adoptiva con linfocitos T, los tumores de melanoma B16-OVA murinos se trataron con adenovirus oncolfticos hteridos 5/3 solos o en combinacion con la transferencia adoptiva de linfocitos OT-I espedficos de tumores y se compararon con ratones que reciben inyecciones de PBS intratumoral. Los resultados de tres experimentos independientes resumidos en la figura 2 dan a conocer, por un lado, que las inyecciones de virus por sf mismas (teniendo en cuenta que el adenovirus humano no se replica productivamente en celulas de raton) dieron como resultado un menor control del crecimiento tumoral, que se prolongo hasta el dfa 14 despues del tratamiento y disminuyendo despues de este (figura 2A). Por otro lado, cuando los ratones tratados se transfirieron de forma adoptiva con 5 x 105 o 2 x 106 linfocitos OT-I, se obtuvieron diferencias estadfsticamente significativas entre los grupos con PBS y Ad en dos experimentos independientes (figura 2B y 2C, respectivamente).
Por lo tanto, la presencia de virus en el tumor tuvo un fuerte efecto potenciador en la terapia celular adoptiva. Seis inyecciones de virus intratumorales en 1 x 109 PV cada una en manos de los inventores dieron en combinacion con la transferencia adoptiva de linfocitos OT-I una eficacia antitumoral igual o superior en comparacion con lo publicado por Song et al. (2011, Mol. Ther.) para una sola inyeccion intramuscular de 1 x 1010 PV de adenovirus defectuosos de replicacion que expresan OVA (Ad-OVA) mezclados con una cantidad igual de adenovirus que expresan conjuntamente un ARN de horquilla corta espedfico para A20 y una forma secretora de flagelina que estimula el receptor 5 toll-like (Ad-shAF) en el modelo de melanoma B16.o Va (Song X. T. et al. Mol. Ther. enero 2011; 19 (1): 211-7, PMID: 20959814). A la luz de estos resultados, un nuevo aspecto es apuntar a la inyeccion del virus en el tumor, donde los inventores pueden conseguir incluso con virus desarmados un control del tumor superior a los virus armados funcionales multiinmunitarios administrados por via intramuscular.
Experimento 3 (alteraciones mediadas por adenovirus en la calidad y cantidad de poblaciones de inmunocitos in vivo):
Para estudiar el trafico y la proliferacion de celulas transferidas de forma adoptiva del experimento 2, los linfocitos OT-I se tineron ex vivo con ester succinimidflico de carboxifluorescema 5 pM (CFSE). Este colorante fluorescente de tincion de celulas se diluye con cada division celular y, por lo tanto, permite rastrear la proliferacion de linfocitos por citometna de flujo al analizar ~1/2 de la reduccion fraccional de la intensidad de la senal de fluorescencia en cada division celular (hasta 7 divisiones, aqu rotuladas M0-7). El primer dfa despues de la transferencia, los resultados mostraron una acumulacion inducida por el virus de linfocitos OT-I transferidos (doble poblacion positiva de CD8+ CFSE+) en los tumores, simultanea con la reduccion de estas celulas en la sangre (figura 3A). En puntos temporales posteriores, tambien el recuento total de linfocitos T CD8+ aparecio mas alto en los tumores tratados con el virus en comparacion con los tumores inyectados con PBS, y el dfa 14 el recuento de linfocitos T CD8+ aumento en organos linfoides de los ratones tratados con virus.
Las cantidades de divisiones de linfocitos OT-I en diferentes puntos de tiempo se representan en la figura 3B. Dado que el estado de proliferacion de los linfocitos OT-I fue el mismo entre ambos grupos en el dfa 1, las diferencias en el recuento de linfocitos T CD8+ en diversos organos eran debidas al trafico de inmunocitos inducido por adenovirus. En momentos posteriores, sin embargo, la situacion habfa cambiado y el aumento de linfocitos OT-I en el tumor tratado con adenovirus era debido al aumento de la proliferacion de linfocitos. El 6° dfa la mayona de los linfocitos OT-I en tumores tratados con PBS se detuvieron en la fase M5, mientras que las celulas transferidas al grupo de adenovirus continuaron proliferando (divisiones M6-M7). Estos datos sugieren que la infeccion por virus de la viroterapia oncolftica o no citolttica produce aumento de trafico y proliferacion de linfocitos transferidos de forma adoptiva por rotura de la supresion inmunitaria en los tumores, atrayendo inmunocitos que contribuyen a la activacion de linfocitos CD8+ y/o por algunos otros importantes mecanismos que ayudan a superar la anergia de los linfocitos T.
Como apoyo a nuestros resultados en modelos animales, hemos observado una depresion transitoria de los recuentos de linfocitos sangumeos durante el primer dfa despues de la administracion del virus oncolftico a pacientes con cancer avanzado (figura 4), lo que sugiere la movilizacion de linfocitos T circulantes en respuesta a la Infeccion aguda por adenovirus en el tumor.
Ademas, en apoyo de los linfocitos T captadores de la infeccion por adenovirus en tumores, los inventores detectamos un mayor numero de linfocitos T CD8+ en las secciones de tejido de biopsia tumoral despues del tratamiento que antes (figura 5).
La figura 6 muestra los resultados de las inyecciones de adenovirus combinadas con la transferencia adoptiva de linfocitos T.
La figura 7 da a conocer un aumento drastico en el numero de linfocitos T antitumorales "naturales" debido a la transferencia adoptiva y la inyeccion de virus.
La figura 8 muestra linfocitos CD8+ activados en el tumor y la expresion de TIM-3 en el tumor el 14° dfa.
La figura 9 muestra el aumento de linfocitos T antitumorales y la reduccion de los resultados de inmunosupresion en la inmunidad general contra los antfgenos tumorales.
La figura 10 muestra la distribucion de linfocitos T OTI despues de la inyeccion del virus.
La figura 11 da a conocer que la elevacion de la inmunosupresion puede inducir la propagacion de las celulas. La figura 12 muestra la eficacia de citocinas biotecnologicas (sin virus) en combinacion con celulas OTI.
Experimento 4 (Linfocitos T transferidos adoptivamente adenovirus Ad5 armado con citocinas murinas):
Modelo:
[C57BL/6 con B16-OVA (0,25 x 106 celulas por animal)
Grupos:
Sin inyeccion
Ad5-Luc
Ad5-CMV-mTNFa
Ad5-CMV-mIFNg
Ad5-CMV-mIL2
Ad5-CMV-mIFNb1
Sin inyeccion OT1
Ad5-Luc OT1
Ad5-CMV-mTNFa OT1
Ad5-CMV-mIFNg OT1
Ad5-CMV-mIL2 OT1
Ad5-CMV-mIFNb1 OT1
El vector Ad5 es un vector de adenovirus no replicativo humano que codifica un transgen de raton. Los montajes se realizaron con tecnologfa AdEasy (Agilent Inc); el casete de transgen (dirigido por un activador de CMV) esta en la region E1 eliminada (vease, p. ej., Diaconu I et al. Cancer Res. 1 mayo 2012; 72(9): 2327-38).
Tamano del grupo:
n = 7, 12x7 = 84 (+ 20% mas = 100)
Programa de tratamiento:
Celulas OT1: 2 x 106 por animal ip el 1er d^ a
Inyecciones de virus: 1 x 109 partfculas de virus (OD260) en el 1er dfa y semanalmente despues Criterio de valoracion:
Volumen del tumor (medido cada 2 dfas durante la primera semana y luego cada 3 dfas)
Recoleccion de tumores y bazos cuando los ratones mueren o son sacrificados; para FACS y/o ELISPOT (centrarse en los ensayos mas adecuados segun los datos de Siri).
Los mejores transgenes en combinacion con la terapia con linfocitos T fueron TNFa ja IL2 (figura 13). Consolidando los datos, las mismas citocinas estaban implicadas en el experimento sin virus.
La figura 14 muestra los resultados de diferentes virus (sin terapia con linfocitos T) en el tamano del tumor (figura 14).
La figura 15 muestra los excelentes resultados de la terapia con linfocitos T en combinacion con el vector Ad5-CMV-mTNFa.
La figura 16 muestra los excelentes resultados de la terapia con linfocitos T en combinacion con el vector Ad5-CMV-mIL2.
Nuevos montajes de virus
Los nuevos montajes de virus siguientes se presentan como ejemplos de nuestra tecnologfa propuesta:
Virus oncolfticos que expresan C5a y TNF-a
Los inventores generaron nuevos adenovirus Ad5/3 oncolfticos que llevan la porcion activa del componente del complemento C5a o TNF-a humano como transgenes en lugar de las regiones del gen 6,7k/gp19 (figura 17).
Experimento 5 (expresion del transgen del vector de adenovirus que codifica C5a):
A fin de confirmar, como demostracion conceptual, que los adenovirus oncolfticos son capaces de expresar las citocinas elegidas propuestas para aumentar la terapia celular adoptiva, los inventores infectaron celulas A549 humanas en cultivo a 10 PV/celula de adenovirus que codifica C5a (figura 24), y evaluaron las concentraciones de C5a en el sobrenadante de cultivo celular en diferentes puntos de tiempo posteriores a la infeccion por ELISA. De hecho, los resultados validan el supuesto y apoyan la generacion de montajes de adenovirus patentados que albergan citocinas seleccionadas.
Experimento 6 (efecto sobre la migracion de monocitos por nuevos vectores de adenovirus):
Los inventores probaron la capacidad de C5a de captar monocitos utilizando un ensayo de quimiotaxia in vitro: se infectaron celulas A549 con adenovirus que expresan C5a o con el virus de referencia desarmado (10 PV/unidades de celulas infecciosas entre virus similares) o se trataron con PBS y se recogio el medio 48 h despues de la infeccion y se uso para captar la estirpe celular monocftica THP1 humana en un ensayo de quimiotaxia Transwell segun las instrucciones del fabricante (Millipore QCM, n° en cat. ECM512). Los resultados ponen de manifiesto una atraccion significativamente mayor de los monocitos por el sobrenadante de las celulas infectadas por el virus que expresan C5a que por el medio de las celulas no infectadas o las celulas infectadas con el virus de referencia desarmado (figura 25).
Experimento 7 (eficacia antitumoral del adenovirus armado con C5a):
Para evaluar la potencia antitumoral de C5a en el contexto de la infeccion tumoral no citolftica, los inventores trataron tumores B16-OVA creados en ratones C57BL/6 los dfas 0, 2 y 4 con PBS, que expresan C5a o con virus de referencia desarmados. Los resultados dan a conocer un fuerte efecto antitumoral por el virus que expresa C5a (figura 26).
Experimento 8 (aumento de la expansion de linfocitos T antitumorales por el virus de C5a):
Para evaluar si el aumento observado en la eficacia antitumoral del virus que expresa C5a (figura 24) estaba relacionado con linfocitos T, se analizaron los tumores por citometna de flujo para detectar linfocitos T CD8+ espedficos de ovoalbumina, detectados por tincion con pentamero conjugado con APC espedfico para TCR que reconoce MHC I cargado con el peptido de ovoalbumina inmunodominante SIINFEKL (Prolmmune, EE. UU.). De hecho, los tumores en el grupo de virus de C5a conteman una fraccion significativamente mayor de linfocitos T CD8 espedficos para tumores que los tumores inyectados con virus de referencia o PBS (figura 27).
Experimento 9 (expresion del transgen de adenovirus que codifica TNF-a):
En forma similar al virus de C5a (figura 24 y experimento 5), los inventores probaron la capacidad del adenovirus oncolftico que expresa hTNF-a para mediar la secrecion del transgen de eleccion. Los resultados confirman la expresion (figura 18).
Experimento 10 (efecto biologico del transgen expresado se conserva en el adenovirus oncolftico):
Para evaluar si el transgen expresado en adenovirus conserva sus efectos biologicos, el sobrenadante libre de virus (filtrado a 100 kD) de celulas A549 infectadas con el virus de referencia armado o con el virus de expresion de TNF-a (PV variables / celulas, 72 h pi) se aplico a celulas WEHI-13VAR (ATCC CRL-2148), que son sensibles al TNF-a, y se evaluo la viabilidad de estas celulas 72 horas despues de la exposicion al sobrenadante. (Por ejemplo, el metodo de Espevik T. et al. J. Immunol. Methods. 1986; 95 (1): 99-105 describe el metodo). Los resultados dan a conocer que el TNF-a expresado a partir de adenovirus oncolfticos conserva efectos biologicos potentes (figura 19).
Experimento 11 (los virus que expresan citocinas oncolfticas conservan la capacidad de destruir celulas in vitro): Debido a que el TNF-a puede tener efectos antivfticos, era importante confirmar que el efecto oncolftico de los adenovirus que expresan TNF-a retienen su capacidad para infectar y destruir celulas cancerosas. Varias estirpes celulares de cancer en cultivo se infectaron con virus que expresan TNF-a o con virus de referencia y se evaluo su viabilidad mediante el ensayo CelltiterGlo AQ MTS, segun las instrucciones del fabricante (Promega, EE. UU.). Los resultados muestran que el virus es oncolftico in vitro (figuras 19-20).
Experimento 12 (sinergia entre la radioterapia y el virus oncolftico que expresa TNF a):
Se trataron ratones lampinos portadores de xenoinjertos subcutaneos A549 por via intratumoral con virus con o sin radiacion de haz externo enfocado concomitante (XRT) (figura 21). RD indica virus con replicacion defectuosa y el virus desarmado es un virus oncolftico sin TNFa.
Experimento 13 (aumento de la eficacia antitumoral del adenovirus que expresa TNF-a en anfitriones inmunocompetentes):
Para probar si el adenovirus oncolftico, que no se replica en celulas murinas, podna ser capaz de causar efectos antitumorales in vivo en ratones inmunocompetentes, ratones con tumores B16.OVA creados se inyectaron por via intratumoral con virus que expresan TNF-a o virus de referencia desarmado o PBS, de manera similar a como se muestra en la figura 26. Los resultados muestran un mayor control total del tumor con el virus que expresa TNF-a en comparacion con las referencias (figura 22), lo que sugiere que el TNF-a humano es parcialmente activo en ratones y apoya la nocion de virus que se arman para conseguir mayores efectos antitumorales.
Experimento 14 (aumento de la expansion de linfocitos T antitumorales por TNFa-virus):
Al igual que en el experimento 11, los inventores quisimos probar si el efecto antitumoral observado del virus que expresa TNF-a estaba asociado con la induccion de respuestas de linfocitos T citolfticos espedficos para el tumor. Se extrajeron los tumores y se prepararon para el analisis de citometna de flujo, como en el experimento 11. Los resultados (figura 23) confirman de hecho que la expresion de TNF-a facilita la expansion de los linfocitos T espedficos para el tumor en la zona del tumor, argumentando fuertemente a favor de la tecnologfa propuesta.
Las figuras 28-32, 36 y 48 ilustran los metodos y mecanismos de la presente descripcion.
Experimento 15 (experimento de combinacion con dos vectores adenovfticos diferentes y OT1 (Ad-mTNFa/AdmIL2+ OT1)):
Modelo:
C57BL/6 con B16-OVA (0,25 x 106 celulas por animal)
Grupos:
Ad5-CMV-mTNFa (1 x 109 PV)
Ad5-CMV-mIL2 (1 x 109 PV)
Ad5-CMV-mTNFa+ Ad5-CMV-mIL2 (0,5+ 0,5 x 109 PV)
Ad5-CMV- mTNFa+ OT1
Ad5-CMV-mIL2+ OT1
Ad5-CMV-mTNFa+ Ad5-CMV-mIL2+ OT1
Ad5Luc1+ OT1
Sin inyeccion (simulados)
El vector Ad5 es un vector de adenovirus humano no replicativo que codifica un transgen de raton. Los montajes se realizaron con tecnologfa AdEasy (Agilent Inc); el casete de transgen (dirigido por un activador de CMV) esta en la region E1 eliminada (vease, por ejemplo, Diaconu I et al. Cancer Res. 1 mayo 2012; 72(9):2327-38).
Tamano del grupo:
n = 9
100 ordenados
Programa de tratamiento:
Celulas OT1: 1,5 x 106 por animal ip el 1er dfa (la misma cantidad que en el experimento anterior, no 2x106) Inyecciones de virus: para agentes individuales: 1 x 109 partmulas de virus (OD260) el 1er d^ a y semanalmente a partir de entonces; para combinacion: 0,5 x 109 PV+ 0,5 x 109 PV el 1er dfa y semanalmente a partir de entonces Criterio de valoracion: Volumen del tumor (medido cada 2 dfas durante la primera semana y luego cada 3 dfas) Otros experimentos que respaldan la descripcion:
Varios experimentos con animales apoyan la descripcion. En primer lugar, seleccionamos candidatos optimos de citocinas para combinarlos con la transferencia adoptiva de linfocitos T utilizando formas murinas biotecnologicas de citocinas (figura 49). Se selecciona(n) una(s) citocina(s) del siguiente grupo: interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, GMCSF, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4,CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2. En las figuras 33 y 34 se muestra un esquema de la distribucion general del genoma del virus que comprende el transgen o dos transgenes de citocinas. La figura 35 muestra secuencias de nucleotidos y aminoacidos de 2A. Las secuencias de nucleotidos de los vectores vmcos que comprenden los transgenes C5a, hCD40L, hIFNa2, hIFNb1, hIFNg1, hIL2 o TNFa se muestran en las SEQ ID nos 1-7, respectivamente (Ad5/3-E2F-D24-transgen). Ademas, las secuencias de nucleotidos de los vectores vmcos que comprenden dos transgenes, siendo uno IL-2 y el otro C5a, CD40L, IF-Na2, IFNb, IFNg, GMCSF o TNFa, se muestran en las SEQ ID nos 8-21 (SEQ ID ID n°: 8 C5a-2A-IL2, SEQ ID n°: 9 IFNa-2A-IL2, SEQ ID n°: 10 TNFa-2A-IL2, SEQ ID n°: 11 CD40L-2A-IL2, SEQ ID n°: 12 IFNb-2A-IL2, SEQ ID n°: 13 GMCSF-2A-IL2, SEQ ID n°: 14 IFNg-2A-IL2, SEQ ID n°: 15 C5a-IRES-IL2, SEQ ID n°: 16 IFNa-IRES-IL2, SEQ ID n°: 17 TNFa-IRES-IL2, SEQ ID n°: 18 CD40L-IRES-IL2, SEQ ID n°: 19 IFNb-IRES-IL2, SEQ ID n°: 20 GMCSF-IRES-IL2, SEQ ID n°: 21 IFNg-IRES-IL2) (Ad5/3-E2F-D24-transgen-IRES/2A-transgen).
Se eligieron varios de los mejores candidatos para un experimento de combinacion de citocinas/virus, donde el regimen se mantiene aproximadamente igual y todos los ratones reciben inyeccion intraperitoneal de linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ y tratamientos intratumorales de citocinas seleccionadas mezcladas con adenovirus. Ademas, se realizo un experimento de trafico por separado utilizando los adenovirus deficientes en la replicacion de los inventores que codifican citocinas de raton o citocinas humanas con actividad probada en ratones (figura 50). RD indica virus con replicacion deficiente. Sobre la base de estos experimentos, se puede elegir un candidato o candidatos finales de citocinas y analizarlos aun mas, incluso en la clmica.
Los resultados de los experimentos indican que a) la inyeccion del virus en los tumores da como resultado un aumento del trafico de linfocitos T al tumor, b) la inyeccion del virus da como resultado una mayor expresion de MHC1 en los tumores, c) la senalizacion de peligro se activa y produce menos tolerancia e inmunosupresion, d) los linfocitos T se propagan en el tumor despues de las inyecciones de virus. Significativamente, la adicion de una citocina como un transgen mejoro cada uno de estos efectos. A destacar que los transgenes dobles aumentaron el efecto aun mas. Por lo tanto, la inyeccion intratumoral de adenovirus oncolfticos armados con citocinas potencio el efecto de la transferencia celular adoptiva de manera sinergica, sobre lo que podna conseguirse con los vectores de virus o la transferencia celular adoptiva solo.
Para estudiar el trafico de linfocitos T y la biodistribucion despues de la transferencia adoptiva, se realizo un experimento de diagnostico por la imagen SPECT/CT (figura 51). Los linfocitos OT-I enriquecidos con CD8a+ se marcaron con radiactividad con 111In y se transfirieron de forma adoptiva a ratones receptores.
Dado que la vida media de la oxina de indio es relativamente corta (2,83 d^as), el penodo de vigilancia maximo para el diagnostico por la imagen se limito a 7 dfas. Debido a esta restriccion, las celulas se marcaron en dos lotes y se transfirieron a ratones en dos puntos de tiempo diferentes. Los datos de diagnostico por la imagen del primer lote cubren los episodios de trafico de los dfas 0 a 7, mientras que el segundo lote nos permite observar episodios en tumores durante los dfas 8 a 14 posteriores al virus.
Virus Ad3 oncolfticos (figuras 37-40, SEQ ID n° 30 y n° 31 (Ad3-hTERT-E3del-CMV-CD40L y Ad3-hTERT-E3del-E2F-CD40L))
Estrategia de clonacion:
1. Construccion del plasmido del extremo 3' de Ad3 que contiene la casete de expresion correspondiente, este plasmido contiene 3'ITR de genoma de Ad3, la region E3 de 29.892 a 30.947 del genoma Ad3 se sustituyeron por el casete de expresion. (Nota: Los inventores se aprovecharon de la unica secuencia de restriccion EcoRI en el genoma de Ad3 junto al extremo 3')
2. Construccion del plasmido del extremo 5' de Ad3, este plasmido contiene 5'ITR y hTERT-E1. (Nota: Los inventores se aprovecharon de la unica secuencia de restriccion Notl en el genoma de Ad3 y la secuencia de restriccion
de Nhel junto al extremo 5')
3. Construccion de pWEA-Ad3-hTERT-CMV-CD40L y pWEA-Ad3-hTERT-E2F-CD40L (Nota: Los inventores se aprovecharon del sistema de encapsulacion de fagos)
Construccion del plasmido del extremo 3' de Ad3 que contiene la casete de expresion correspondiente:
1. PCR amplifica el activador E2F, cebador directo: 5'AAAttaattaatggtaccatccggacaaagc3' (SEQ ID n°: 22), cebador inverso 5' TTTgctagcggcgagggctcgatcc3' (SEQ ID n°: 23). Clonado en el vector TA pGEM-T (Promega) ^ pGemT-E2F
2. PCR amplifica el fragmento CD40L, cebador directo: 5'TAGCTGCTAGCATGATCGAAACATACAAC3' (SEQ ID n° 26), cebador inverso: 5'GTCAATTTGGGCCCTCAGAGTTTGAGTAAGCCAA3' (SEQ. ID. n°: 27). Clonado en pGEM-T ^ pGemT-CD40L.
3. El plasmido de extremo 3' de Ad3 que contiene CMV-GFP(pWEA-Ad3-3'end-CMVGFP) se digirio con Nhel/Apal para eliminar GFP, pGemT-CD40L se digirio con Nhel/Apal^-pWEA-Ad3-3'end-CMV-CD40L.
4. El activador de CMV en pWEA-Ad3-3'end-CMV-CD40L se reemplazo por el activador E2F (pGemT-E2F se digirio con Pacl/NheIHpWEA-Ad3-3'end-E2F-CD40L
Construccion del plasmido del extremo 3' de Ad3 que contiene hTERT-E1:
1. PCR amplifica el plasmido del extremo 5' del genoma Ad3 de pKBS2-hTERT (plasmido del documento Ad3-hTERT-E1A), cebador directo 5' gtcagtttaaacttaggccggccctatctatataatataccttatagatggaatgg3' (SEQ. ID. n°: 28), cebador inverso 5' CTTCATCAGCAGCTAGCAGCATAGAATCAG3' (SEQ ID NO: 29). Clonado en pGem-T ^ pGemT-Ad3-5'end-hTERT.
2. El plasmido pWEA-Ad3 (que contiene el genoma completo de ad3) se digirio con Fsel/Notl, el fragmento de 13,2 kb que contiene el extremo 5' del genoma de Ad3 se clono en un vector modificado de pBluescript KS(-) (las secuencias de restriccion entre Sacl y Xbal se modificaron como Sacl-PmeI-MluI-FseI-SalI-NotI-XbaI) ^ pBS-Ad3-5'end
3. El plasmido pBS-Ad3-5'end se digirio con Pmel/Nhel, el fragmento de ~800 pb que contiene 5'ITR fue reemplazado por el fragmento Pmel/Nhel correspondiente de pGemT-Ad3-5'end-hTERT ^ pBS-Ad3-5'end-hTERT PWEA-Ad3-hTERT-CMV-CD40L y PWEA-Ad3-hTERT-E2F-CD40L:
1. El plasmido PWEA-Ad3-hTERT-E2F- se digirio con EcoRI para eliminar el genoma del extremo 3', y se liga con el fragmento correspondiente que contiene la casete de expresion de pWEA-Ad3-3'end-CMV-, pWEA-Ad3-3'end-CMV-CD40L y pWEA-Ad3-3'end-E2F-CD40L
2. La ligadura se encapsulo en fagos utilizando extracto de encapsulacion Gigapack III plus (Stratagen) y se propago (cepa XI1 blue)
Se probo in vitro la funcionalidad de los virus Ad3 y los resultados se muestran en la figura 41. Todos los virus nuevos eran funcionales y capaces de infectar estirpes celulares tumorales.
Los virus tambien se probaron en CHO-K7 pero no mostraron ningun efecto sobre la viabilidad de estas celulas durante la DICT50. Esto se debio probablemente a la falta de desmoglein-2 humanoide en la superficie de estas celulas de hamster.
Resultados in vivo de vectores AD3
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Experimental Animal Committee de la Universidad de Helsinki y el Gobierno Provincial del sur de Finlandia. La salud de los ratones fue controlada frecuentemente y se les aplico la eutanasia tan pronto como se notaron signos de dolor o angustia. Se utilizaron ratones con inmunodeficiencia combinada grave para cacena de la hembra del zorro (Charles River).
Se desarrollo un modelo ortotopico de cancer ovarico diseminado peritoneal inyectando 5x106 celulas SKOV3-luc por via intraperitoneal en 300 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco puro en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (n = 5 por grupo). Despues de 3 dfas, se diagnosticaron por la imagen ratones de forma no invasiva y se trataron por via intraperitoneal inyectando PBS o 109 PV en PBS por raton. Se diagnosticaron por la imagen los ratones los dfas 3, 7, 14, 21 y 25 utilizando IVIS 100 (Xenogen, Alameda, CA) para estimar el numero de celulas tumorales en los ratones. Para diagnostico por la imagen por bioluminiscencia, se inyectaron por via intraperitoneal 150 mg/kg de D-luciferina (Promega) y se capturaron 10 minutos mas tarde con un tiempo de exposicion de 10 s, 1 f/parada, compartimiento del medio y filtro abierto. Durante el diagnostico por la imagen, los ratones estaban anestesiados con gas isoflurano. Las imagenes se superpusieron con Living Image 2.50 (Xenogen). El flujo total (fotones/s) se midio dibujando regiones de interes alrededor del area peritoneal de los ratones. Se resto el fondo.
La figura 45 muestra la eficacia antitumoral de los virus basados en Ad3 in vivo.
Ensayo de proliferacion celular MTS (figuras 42-44)
El 1er dfa, se sembraron 105 celulas por pocillo (A549, PC3-MM2 o SKOV3-luc) en placas de 96 pocillos en 100 |jl de medio de crecimiento (GM), que contema 5% de FBS. El 2° dfa, la monocapa se lavo una vez con GM que contema 5% de FBS. Luego, las celulas se infectaron con diferentes virus a dosis de 100, 10, 1, 0,1 y 0 partmulas de virus por celula. Posteriormente, las celulas se incubaron durante una hora en una maquina oscilante y luego se lavaron con GM. Despues de agregar 5% de GM nuevo, las celulas se dejaron en la incubadora y el GM se reemplazo cada cuatro dfas. La prueba se termino agregando el reactivo mts (Promega) despues de que el efecto citopatico de uno de los virus probados alcanzo el 100% con la concentracion mas alta. Despues de dos horas de incubacion, la absorbancia se midio en un filtro de 490 nm. Luego se resto el fondo y se analizaron los resultados. Margen terapeutico de adenovirus oncolfticos que codifican CD40L murino en ratones inmunocompetentes
En animales inmunocompetentes, los genomas vmcos estan presentes en tumores despues de inyecciones iv (figura 46). Se inocularon s.c. ratones Albino C57 con celulas B16-ova de raton y se trataron por via intravenosa con 5 dosis vmcas diferentes de virus a base de Ad5 que codifican CD40L de raton (veanse los experimentos 4 y 15). Se recogieron tumores de 3 animales por grupo y se almacenaron a -80°C. Se extrajo el ADN completo y se estudio la carga de ADN vmco con PCR cuantitativa. Los numeros de copias vmcas de E4 se normalizaron a ADN genomico con cebadores de actina B de raton. En la figura 46, cada icono representa un tumor; la lmea horizontal indica la mediana del grupo. Simulacro: n = 5; Dosis 5: n = 4; Dosis 4: n = 4; Dosis 3: n = 4; Dosis 2: n = 6; Dosis 1: n = 2; Dosis 2 it: n = 4. DOSIS 5: 1 x 1011 PV/raton; DOSIS 4: 3 x 1010 PV/raton; DOSIS 3: 1 x 1010 PV/raton; DOSIS 2: 1 x 109 PV/raton; DOSIS 1: 1 x 108 PV/raton; referencia positiva (DOSIS 2 intratumoral).
Con la dosis 5, el 67% de los ratones teman signos de toxicidad hepatica. La dosis 4 fue capaz de conseguir una buena transduccion tumoral despues de la administracion iv, sin signos de toxicidad hepatica.
Los resultados del experimento de liberacion de enzimas hepaticas se muestran en la figura 47. El experimento de liberacion de enzimas hepaticas se llevo a cabo de la forma siguiente. Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comite Experimental de Animales de la Universidad de Helsinki y el Gobierno Provincial del sur de Finlandia. Se inyecto a ratones C57 albinos hembra de tres a cuatro semanas de edad (Harlan Laboratories, Holanda) con 2,5 x 105 celulas B16-ova por via subcutanea en ambos costados y se mezclaron al azar en 7 grupos (3 ratones/grupo). El virus Ad5/3 CMV-mCD40L diluido en solucion salina amortiguada con fosfato (PBS) se inyecto por via intravenosa a razon de 108 - 1011 partmulas vmcas (PV)/raton (dosis 1 - dosis 5). Un grupo de tratamiento recibio la dosis 2 (109 PV/celula) por via intratumoral como referencia positiva. Los animales se anestesiaron antes de cualquier procedimiento y se controlo el estado de salud diariamente. 48 horas despues de la inyeccion del virus, se sacrificaron los ratones y la sangre se recogio por puncion cardfaca. El suero se separo centrifugando las muestras de sangre a 5.000 rpm durante 10 minutos. Se cuantificaron las concentraciones de alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) (unidades/litro) en unidades de suero en el Clinical Chemistry Core de la Universidad de Helsinki utilizando el analizador de qmmica clmica Siemens ADVIA 1650. Las muestras hemoltticas se excluyeron del analisis, ya que la hemolisis serica puede interferir con los analisis (concentraciones de ALT y AST altas falsas). Las barras muestran promedios SEM.
Referencias
Blair G. E., Dixon S. C., Griffiths S. A., Zajdel M. E. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. Dic. 1989;14(4):339-46.
Ekkens M. J, Shedlock D. J, Jung E., Troy A., Pearce E. L., Shen H., Pearce E. J. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect Immun. mayo de 2007;75(5):2291-6.
Kratky W., Reis e Sousa C., Oxenius A., Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 18 oct. 2011; 108(42):17414-9.
Lugade A. A., Sorensen E. W., Gerber S. A., Moran J. P., Frelinger J. G., Lord E. M. Radiation-induced IFN-y production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 1 mar 2008; 180(5):3132-9. Propper D. J., Chao D., Braybrooke J. P., Bahl P., Thavasu P., Balkwill F., Turley H., Dobbs N., Gatter K., Talbot D. C., Harris A. L., Ganesan T. S. Low-dose IFN-y induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin. Cancer Res. enero 2003; 9(1):84-92.
Schroder K., Hertzog P. J., Ravasi T., Hume D. A. Interferon-Y: an overview of signals, mechanisms and functions. J. Leukoc. Biol. Feb. 2004;75(2):163-89.
Street D., Kaufmann A. M., Vaughan A., Fisher S. G., Hunter M., Schreckenberger C., Potkul R. K., Gissmann L., Qiao L. Interferon-Y enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. Mayo 1997; 65(2):265-72.
Referencias para montajes vmcos
Blair G. E., Dixon S. C., Griffiths S. A., Zajdel M. E. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. dic. 1989;14(4):339-46.
Ekkens M. J, Shedlock D. J., Jung E., Troy A., Pearce E. L., Shen H., Pearce E. J. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect. Immun. Mayo de 2007; 75(5):2291-6.
Kratky W., Reis e Sousa C., Oxenius A., Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 18 oct. 2011; 108(42):17414-9.
Lugade A. A., Sorensen E. W., Gerber S. A., Moran J. P., Frelinger J. G., Lord E. M. Radiation-induced IFN-y production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 1 mar 2008; 180(5):3132-9. Propper D. J., Chao D., Braybrooke J. P., Bahl P., Thavasu P., Balkwill F., Turley H., Dobbs N., Gatter K., Talbot D. C., Harris A. L., Ganesan T. S. Low-dose IFN-y induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin. Cancer Res. Enero 2003; 9(1):84-92.
Schroder K., Hertzog P. J., Ravasi T., Hume D. A. Interferon-Y: an overview of signals, mechanisms and functions. J. Leukoc. Biol. Feb. 2004; 75(2):163-89.
Street D., Kaufmann A. M., Vaughan A., Fisher S. G., Hunter M., Schreckenberger C., Potkul R. K., Gissmann L., Qiao L. Interferon-Y enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. Mayo 1997; 65(2):265-72.
Referencias
Blair G. E., Dixon S. C., Griffiths S. A., Zajdel M. E. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. dic. 1989;14(4):339-46.
Ekkens M. J, Shedlock D. J., Jung E., Troy A., Pearce E. L., Shen H., Pearce E. J. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect. Immun. Mayo de 2007; 75(5):2291-6.
Kratky W., Reis e Sousa C., Oxenius A., Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 18 oct. 2011; 108(42):17414-9.
Lugade A. A., Sorensen E. W., Gerber S. A., Moran J. P., Frelinger J. G., Lord E. M. Radiation-induced IFN-y production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 1 mar 2008; 180(5):3132-9. Propper D. J., Chao D., Braybrooke J. P., Bahl P., Thavasu P., Balkwill F., Turley H., Dobbs N., Gatter K., Talbot D. C., Harris A. L., Ganesan T. S. Low-dose IFN-y induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin. Cancer Res. Enero 2003; 9(1):84-92.
Schroder K., Hertzog P. J., Ravasi T., Hume D. A. Interferon-Y: an overview of signals, mechanisms and functions. J. Leukoc. Biol. Feb. 2004; 75(2):163-89.
Street D., Kaufmann A. M., Vaughan A., Fisher S. G., Hunter M., Schreckenberger C., Potkul R. K., Gissmann L., Qiao L. Interferon-Y enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. Mayo 1997; 65(2):265-72.
References para montajes vmcos
Blair G. E., Dixon S. C., Griffiths S. A., Zajdel M. E. Restricted replication of human adenovirus type 5 in mouse cell lines. Virus Res. dic. 1989;14(4):339-46.
Ekkens M. J, Shedlock D. J., Jung E., Troy A., Pearce E. L., Shen H., Pearce E. J. Th1 and Th2 cells help CD8 T-cell responses. Infect. Immun. Mayo de 2007; 75(5):2291-6.
Kratky W., Reis e Sousa C., Oxenius A., Sporri R. Direct activation of antigen-presenting cells is required for CD8+ T-cell priming and tumor vaccination. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 18 oct. 2011; 108(42):17414-9.
Lugade A. A., Sorensen E. W., Gerber S. A., Moran J. P., Frelinger J. G., Lord E. M. Radiation-induced IFN-y production within the tumor microenvironment influences antitumor immunity. J Immunol. 1 mar 2008; 180(5):3132-9. Propper D. J., Chao D., Braybrooke J. P., Bahl P., Thavasu P., Balkwill F., Turley H., Dobbs N., Gatter K., Talbot D. C., Harris A. L., Ganesan T. S. Low-dose IFN-y induces tumor MHC expression in metastatic malignant melanoma. Clin. Cancer Res. Enero 2003; 9(1):84-92.
Schroder K., Hertzog P. J., Ravasi T., Hume D. A. Interferon-Y: an overview of signals, mechanisms and functions. J. Leukoc. Biol. Feb. 2004; 75(2):163-89.
Street D., Kaufmann A. M., Vaughan A., Fisher S. G., Hunter M., Schreckenberger C., Potkul R. K., Gissmann L., Qiao L. Interferon-Y enhances susceptibility of cervical cancer cells to lysis by tumor-specific cytotoxic T cells. Gynecol Oncol. Mayo 1997; 65(2):265-72.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un vector adenovftico oncolftico que codifica al menos una citocina junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso en el tratamiento del cancer, en donde dicho vector adenovmco oncolftico es i) un vector de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende:
- un pomo hftbrido de fibra 5/3,
- activador E2F1 para la expresion tumoral espedfica de E1A,
- una eliminacion de 24 pb (D24) en la region constante de union a Rb 2 de E1 adenovmco,
- una eliminacion de secuencias de acido nucleico de los marcos de lectura gp19k y 6,7k vfticos, y
- una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un transgen de citocina en lugar del gp19k/6,7k eliminado en la region E3 que da como resultado el control asociado a la replicacion de la expresion del transgen bajo el activador vftico E3; o
ii) un vector de adenovirus serotipo 3 (Ad3) que comprende:
- un activador para la expresion tumoral espedfica de E1A,
- una eliminacion en el area de E3 que afecta a E39 kDa, E310,2 kDa, E315,2 kDa y E315,3 kDa, y - un activador exogeno o espedfico del tumor para la expresion de al menos una citocina en lugar del area eliminada de E3.
2. El vector adenovmco oncolftico junto con la composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun la reivindicacion 1, en donde la composicion terapeutica celular adoptiva comprende un tipo de celula seleccionado de un grupo que consiste en un linfocito infiltrante de tumores (TIL), linfocitos modificados del receptor de linfocitos T y linfocitos modificados del receptor de anftgeno hftbrido.
3. El vector adenovmco oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a 2, en donde la composicion terapeutica celular adoptiva comprende un tipo de celula seleccionado de un grupo que consiste en linfocitos T, celulas CD8+, celulas CD4+, linfocitos citolfticos, linfocitos T 8-y, linfocitos T reguladores y celulas mononucleares de la sangre periferica.
4. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a 3, en donde el cancer se selecciona de un grupo que consiste en cancer nasofarmgeo, cancer sinovial, cancer hepatocelular, cancer renal, cancer de tejidos conectivos, melanoma, cancer de pulmon, cancer de intestino, cancer de colon, cancer de recto, cancer colorrectal, cancer de cerebro, cancer de garganta, cancer bucal, cancer de hftgado, cancer de huesos, cancer pancreatico, coriocarcinoma, gastrinoma, feocromocitoma, prolactinoma, leucemia de linfocitos T/linfoma, neuroma, enfermedad de von Hippel-Lindau, smdrome de Zollinger-Ellison, cancer suprarrenal, cancer anal, cancer de vfas biliares, cancer de vejiga, cancer de ureter, cancer cerebral, oligodendroglioma, neuroblastoma, meningioma, tumor de la medula espinal, cancer de huesos, osteocondroma, condrosarcoma, Sarcoma de Ewing, cancer de sitio primario desconocido, carcinoide, carcinoide del aparato digestivo, fibrosarcoma, cancer de mama, enfermedad de Paget, cancer de cuello uterino, cancer colorrectal, cancer de recto, cancer de esofago, cancer de vesfcula biliar, cancer de cabeza, cancer ocular, cancer de cuello, cancer de rinon, tumor de Wilms, cancer de hftgado, sarcoma de Kaposi, cancer de prostata, cancer pulmonar, cancer testicular, enfermedad de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, cancer bucal, cancer de piel, mesotelioma, mieloma multiple, cancer de ovario, cancer pancreatico endocrino, glucagonoma, cancer pancreatico, cancer de paratiroides, cancer de pene, cancer de pituitaria, sarcoma de tejidos blandos, retinoblastoma, cancer de intestino delgado, cancer de estomago, cancer de timo, cancer de tiroides, cancer trofoblastico, mola hidatiforme, cancer de utero, cancer de endometrio, cancer de vagina, cancer de vulva, neuroma acustico, micosis fungoide, insulinoma, smdrome carcinoide, somatostatinoma, cancer de endas, cancer de corazon, cancer de labios, cancer de meninges, cancer de boca, cancer de nervios, cancer de paladar, cancer de glandula parotida, cancer de peritoneo, cancer de faringe, cancer pleural, cancer de las glandulas salivales, cancer de lengua y el cancer de airftgdalas.
5. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la composicion terapeutica celular adoptiva y los vectores vfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina deben administrarse a un sujeto simultanea o consecutivamente, en cualquier orden.
6. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la composicion terapeutica celular adoptiva y/o los vectores vfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina deben administrarse mediante una inyeccion intratumoral, intrarterial, intravenosa, intrapleural, intravesicular, intracavitaria o peritoneal, o una administracion oral.
7. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a 6, en el que la citocina se selecciona de un grupo que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, iL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (= RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2.
8. El vector adenovmco oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1a 7, en el que el vector vftico oncolftico codifica dos o mas citocinas.
9. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun la reivindicacion 7, en el que el vector vftico oncolftico codifica dos o mas citocinas seleccionadas de un grupo de citocinas que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, GMCSF, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (=RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6,CXCR7 y XCL2, o el vector vftico oncolftico codifica IL-2 y una citocina o citocinas seleccionadas de un grupo de citocinas que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, GMCSF, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2.
10. El vector adenovftico oncolftico junto con La composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun la reivindicacion 8 o 9, en el que el vector adenovftico comprende un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) u opcionalmente un sitio de derivacion 2A del ribosoma entre los dos transgenes.
11. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que los vectores adenovfticos oncolfticos que codifican al menos una citocina se administran en una cantidad de 1x1010 - 1x1014 partfculas de virus.
12. El vector adenovftico oncolftico junto con una composicion terapeutica celular adoptiva independiente para su uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 con radioterapia simultanea o sucesiva, anticuerpos monoclonales, quimioterapia u otros farmacos o intervenciones contra el cancer para un sujeto.
13. Un vector adenovftico oncolftico para su uso en el aumento de la eficacia de la terapia celular adoptiva independiente o la terapia con linfocitos T en un tumor de un sujeto, en donde dicho vector adenovftico oncolftico es i) un vector de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende:
- un pomo hftbrido de fibra 5/3,
- activador E2F1 para la expresion tumoral espedfica de E1A,
- una eliminacion de 24 pb (D24) en la region constante de union a Rb 2 de E1 adenovftico,
- una eliminacion de secuencias de acido nucleico de los marcos de lectura gp19k y 6,7k vfticos, y
- una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un transgen de citocina en lugar del gp19k/6,7k eliminado en la region E3 que da como resultado el control asociado a la replicacion de la expresion del transgen bajo el activador vftico E3; o
ii) un vector de adenovirus serotipo 3 (Ad3) que comprende:
- un activador para la expresion tumoral espedfica de E1A,
- una eliminacion en el area de E3 que afecta a E39 kDa, E310,2 kDa, E315,2 kDa y E315,3 kDa, y
- un activador exogeno o espedfico del tumor para la expresion de al menos una citocina en lugar del area eliminada de E3.
14. Un equipo farmaceutico que comprende una composicion terapeutica celular adoptiva y un vector adenovftico oncolftico que codifica para al menos una citocina, en el que la composicion terapeutica celular adoptiva se formula en una primera formulacion y el vector adenovftico oncolftico que codifica para al menos una citocina se formula en una segunda formulacion, en donde dicho vector adenovrnco oncolftico es
i) un vector de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende:
- un pomo hftbrido de fibra 5/3,
- activador E2F1 para la expresion tumoral espedfica de E1A,
- una eliminacion de 24 pb (D24) en la region constante de union a Rb 2 de E1 adenovrnco,
- una eliminacion de secuencias de acido nucleico de los marcos de lectura gp19k y 6,7k vfticos, y
- una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un transgen de citocina en lugar del gp19k/6,7k eliminado en la region E3 que da como resultado el control asociado a la replicacion de la expresion del transgen bajo el activador vftico E3; o
ii) un vector de adenovirus serotipo 3 (Ad3) que comprende:
- un activador para la expresion tumoral espedfica de E1A,
- una eliminacion en el area de E3 que afecta a E39 kDa, E310,2 kDa, E315,2 kDa y E315,3 kDa, y - un activador exogeno o espedfico del tumor para la expresion de al menos una citocina en lugar del area eliminada de E3.
15. Un vector adenovrnco oncolftico que comprende:
1) un eje central de acido nucleico de adenovirus serotipo 5 (Ad5) que comprende un pomo hftbrido de fibra 5/3; 2) el activador E2F1 para la expresion espedfica de tumor de E1A;
3) una eliminacion de 24 pb (D24) en la region constante de union a Rb 2 de E1 adenovrnco;
4) una eliminacion de la secuencia de acido nucleico de los marcos de lectura gp19k y 6,7k vfticos; y
5) una secuencia de acido nucleico que codifica al menos un transgen de citocina en lugar de gp19k/6,7k eliminados en la region E3 que da como resultado un control asociado a la replicacion de la expresion del transgen bajo el activador E3 vftico, en donde la citocina se selecciona de un grupo que consiste en interferon a, interferon p, interferon y, complemento C5a, IL-2, TNFa, CD40L, IL12, IL-23, IL15, IL17, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14-1, CCL14-2, CCL14-3, CCL15-1, CCL15-2, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23-1, CCL23-2, CCL24, CCL25-1, CCL25-2, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL3L1, CCL4, CCL4L1, CCL5 (= RANTES), CCL6, CCL7, CCL8, CCL9, CCR10, CCR2, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCRL1, CCRL2, CX3CL1, CX3CR, CXCL1, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCR1, CXCR2, CXCR4, CXCR5, CXCR6, CXCR7 y XCL2.16
16. Vector adenovftico oncolftico serotipo 3 (Ad3) que comprende: un activador para la expresion espedfica de tumor de E1A, una eliminacion en el area E3 que afecta a 9 kDa de E3, 10,2 kDa de E3, 15,2 kDa de E3 y 15,3 kDa de E3 y un activador exogeno o tumoral espedfico para la expresion de un transgen en el lugar del area eliminada de E3, en donde el transgen es una citocina seleccionada del grupo de citocinas de la reivindicacion 7.
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Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9724404B2 (en) 2009-04-13 2017-08-08 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) HPV particles and uses thereof
WO2013119877A1 (en) 2012-02-07 2013-08-15 Aura Biosciences, Inc. Virion-derived nanospheres for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents to cancer cells
EP2971008B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Salk Institute for Biological Studies Oncolytic adenovirus compositions
WO2015042325A1 (en) 2013-09-18 2015-03-26 Aura Biosciences, Inc. Virus-like particle conjugates for diagnosis and treatment of tumors
DK3198009T3 (da) * 2014-09-24 2021-11-22 Salk Inst For Biological Studi Onkolytiske tumorvira og anvendelsesfremgangsmåder
CN107406859A (zh) * 2015-03-17 2017-11-28 倾斜生物医疗公司 编码双特异性抗体的溶瘤腺病毒及与其相关的方法和用途
CN108138149A (zh) * 2015-05-19 2018-06-08 不列颠哥伦比亚癌症局分支机构 重组溶瘤病毒及其用途
US20190038727A1 (en) * 2015-09-09 2019-02-07 Tvax Biomedical I, Llc Methods for combining adoptive t cell therapy with oncolytic virus adjunct therapy
US11298413B2 (en) 2015-09-16 2022-04-12 Io Biotech Aps Vaccine compositions comprising C—C motif chemokine 22 (CCL22) or fragments thereof
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
SG11201811600PA (en) 2016-06-30 2019-01-30 Oncorus Inc Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
FI20165814A (fi) 2016-10-27 2018-04-28 Tilt Biotherapeutics Oy Interleukiini 8 (il-8) prognostisena ja ennustavana biomarkkerina ja koostumukset ja vektorit käytettäväksi onkolyyttisessa immunoterapiassa
CA3045892A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
US11298420B2 (en) * 2016-12-21 2022-04-12 Memgen, Llc Armed oncolytic viruses
WO2018118967A1 (en) * 2016-12-21 2018-06-28 Memgen, Llc Armed replication-competent oncolytic adenoviruses
US10232053B2 (en) 2016-12-30 2019-03-19 Trieza Therapeutics, Inc. Immunomodulatory oncolytic adenoviral vectors, and methods of production and use thereof for treatment of cancer
CN108261426B (zh) * 2017-01-04 2019-04-05 杭州康万达医药科技有限公司 药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用
KR20190128634A (ko) * 2017-01-30 2019-11-18 에피센트알엑스, 인코포레이티드 다중 트랜스진 재조합 아데노바이러스
EA201990822A1 (ru) * 2017-04-12 2020-01-09 Эписентарикс, Инк. Иммуномодулирующие слитые белки
AU2018251987A1 (en) * 2017-04-14 2019-12-05 Cg Oncology, Inc. Methods of treating bladder cancer
CN118147137A (zh) * 2017-05-17 2024-06-07 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 生成哺乳动物t细胞活化诱导型合成启动子(syn+pro)以改善t细胞疗法
CN109276580B (zh) * 2017-07-21 2021-08-24 厦门大学 一种用于治疗肿瘤的病毒
KR20200036874A (ko) * 2017-08-03 2020-04-07 타이가 바이오테크놀로지스, 인코포레이티드 암 치료를 위한 방법 및 조성물
KR20200055037A (ko) 2017-09-19 2020-05-20 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 키메라 항원 수용체 t 세포 요법을 위한 조성물 및 그의 용도
CN109554353B (zh) * 2017-09-26 2021-08-06 杭州康万达医药科技有限公司 分离的重组溶瘤痘病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途
CN109576231B (zh) * 2017-09-28 2022-03-25 北京康万达医药科技有限公司 分离的重组溶瘤腺病毒、药物组合物及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途
CN107759701B (zh) * 2017-10-27 2021-07-02 杭州优善生物科技有限公司 嵌合抗原受体、其修饰的NK细胞、编码DNA、mRNA、表达载体、制备方法和应用
CA3081436A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Western Oncolytics Ltd. Platform oncolytic vector for systemic delivery
CN111542601A (zh) * 2017-11-08 2020-08-14 国立大学法人鹿儿岛大学 确保安全并且能够有效地治疗甚至转移性癌症的、具有提供装载的免疫诱导基因的最佳表达水平的表达控制系统的肿瘤溶解性病毒(肿瘤溶解性免疫治疗)
US11975024B2 (en) 2017-12-19 2024-05-07 Musc Foundation For Research Development T regulatory (Treg) cell transplantation in osteogenesis imperfecta (OI)
WO2019133847A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Oncorus, Inc. Oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides
CN108017716B (zh) * 2018-01-02 2021-03-19 赖沛龙 包含C5aR胞内结构域的嵌合抗原受体、慢病毒载体、表达细胞及药物
GB201801067D0 (en) * 2018-01-23 2018-03-07 Price Nicola Kaye Biomarkers predictive of tumour infiltrating lymphocyte therapy and uses thereof
AU2019215031A1 (en) 2018-01-31 2020-08-20 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
CN110101843A (zh) * 2018-02-01 2019-08-09 北京科诺科服生物科技有限公司 一种抗肿瘤蛋白质及其应用
GB201804473D0 (en) * 2018-03-21 2018-05-02 Valo Therapeutics Oy Modified oncolytic adenoviruses
KR20240067973A (ko) 2018-07-11 2024-05-17 액팀 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드 조작된 면역자극성 박테리아 균주 및 이의 용도
CA3113618A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Collagen-localized immunomodulatory molecules and methods thereof
EP3927833A4 (en) * 2019-02-21 2022-11-30 Unleash Immuno Oncolytics, Inc. ONCOLYTIC ADENOVIRAL VECTOR AND METHODS OF USE
CA3176660A1 (en) 2019-02-27 2020-09-03 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
US12024709B2 (en) 2019-02-27 2024-07-02 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria engineered to colonize tumors, tumor-resident immune cells, and the tumor microenvironment
JP2022536929A (ja) 2019-06-14 2022-08-22 ティルト バイオセラピューティクス オサケユキチュア 腫瘍溶解性アデノウイルスとチェックポイント阻害剤の併用療法
EP3990491A1 (en) 2019-06-26 2022-05-04 Massachusetts Institute of Technology Immunomodulatory fusion protein-metal hydroxide complexes and methods thereof
WO2021061648A1 (en) 2019-09-23 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for stimulation of endogenous t cell responses
CN114502736A (zh) 2019-10-11 2022-05-13 蒂尔坦生物制药有限公司 编码白介素-2变体(vIL-2)多肽的溶瘤病毒载体
WO2021097144A2 (en) 2019-11-12 2021-05-20 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria delivery platforms and their use for delivery of therapeutic products
CN115768464A (zh) 2020-03-10 2023-03-07 麻省理工学院 产生工程化记忆样nk细胞及其组合物的方法
BR112022017924A2 (pt) 2020-03-10 2022-12-20 Massachusetts Inst Technology Composições e métodos para imunoterapia de câncer npm1c-positivo
US20230149485A1 (en) * 2020-04-07 2023-05-18 Shenzhen Hua Yao Kang Ming Biopharmaceutical Co., Ltd. Engineered oncolytic adenovirus
US20210340524A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Methods for identifying chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
WO2021221782A1 (en) 2020-05-01 2021-11-04 Massachusetts Institute Of Technology Chimeric antigen receptor-targeting ligands and uses thereof
JP2023539454A (ja) 2020-08-12 2023-09-14 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 免疫刺激細菌ベースのワクチン、治療薬およびｒｎａデリバリープラットフォーム
RU2753742C1 (ru) * 2020-10-16 2021-08-24 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет" (Новосибирский государственный университет, НГУ) Рекомбинантный штамм Ad6-hTERT-GMCSF, содержащий встройку промотора теломеразы человека hTERT, а также гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, обладающий избирательной цитолитической активностью против теломераза-положительных опухолевых клеток и экспрессирующий активный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
CN112481284B (zh) * 2020-12-07 2023-07-25 深圳瑞吉生物科技有限公司 一种编码CAR基因的mRNA、组合mRNA、构建方法、CAR-T细胞和应用
WO2022170219A1 (en) 2021-02-05 2022-08-11 Iovance Biotherapeutics, Inc. Adjuvant therapy for cancer
EP4329786A1 (en) 2021-04-30 2024-03-06 KaliVir Immunotherapeutics, Inc. Oncolytic viruses for modified mhc expression
WO2022246646A1 (zh) * 2021-05-25 2022-12-01 江苏万戎生物医药科技有限公司 一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用
CN113249342B (zh) * 2021-05-25 2023-12-01 江苏万戎生物医药科技有限公司 一款多重机制协同和增效免疫治疗的嵌合型广谱溶瘤腺病毒及其在肿瘤治疗中的应用
CN113398249A (zh) * 2021-07-08 2021-09-17 中国人民解放军空军军医大学 过表达趋化因子ccl14在制备免疫系统参与下治疗肿瘤的药物中的应用
CN113832115A (zh) * 2021-08-25 2021-12-24 居颂光 融合基因ril-7联合ccl19重组溶瘤牛痘病毒及其在制备抗肿瘤药物中的应用
CN118055776A (zh) * 2021-10-04 2024-05-17 蒂尔坦生物制药有限公司 编码白细胞介素-7(il-7)多肽的溶瘤病毒载体
WO2023081715A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Viracta Therapeutics, Inc. Combination of car t-cell therapy with btk inhibitors and methods of use thereof
CA3235418A1 (en) 2021-11-09 2023-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Immunostimulatory bacteria for converting macrophages into a phenotype amenable to treatment, and companion diagnostic for identifying subjects for treatment
CN118234851A (zh) * 2021-11-19 2024-06-21 南开大学 重组武装溶瘤病毒组合物及其在til过继治疗中的用途
WO2023194656A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Tilt Biotherapeutics Oy Monoclonal pd-l1 antibodies
WO2023217072A1 (zh) * 2022-05-09 2023-11-16 杭州微诺迈博生物科技有限公司 包含多特异性抗体的治疗剂及其在肿瘤治疗中的应用
CN115969971B (zh) * 2022-11-24 2023-08-18 珠海恩科生物科技有限公司 组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用
KR102603628B1 (ko) * 2023-06-29 2023-11-16 국방과학연구소 자연살해세포 분화, 증식 또는 활성화용 조성물, 이를이용하여 자연살해세포를 분화, 증식 또는 활성화시키는 방법, 및 이를 통해 생산된 자연살해세포

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1290249C (en) * 1986-04-09 1991-10-08 Cetus Corporation COMBINATION THERAPY USING INTERLEUKIN-2 AND/OR INTERFERON-.beta. AND TUMOR NECROSIS FACTOR
US5126132A (en) 1989-08-21 1992-06-30 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Tumor infiltrating lymphocytes as a treatment modality for human cancer
FR2709309B1 (fr) 1993-08-25 1995-11-10 Centre Nat Rech Scient Compositions cellulaires, préparation et utilisations thérapeutiques.
GB9927328D0 (en) 1999-11-18 2000-01-12 Lorantis Ltd Immunotherapy
EP1191105A1 (en) 2000-09-25 2002-03-27 Galapagos Genomics B.V. Gene delivery vectors provided with a tissue tropism for T-lymphocytes
ITMI20012110A1 (it) * 2001-10-12 2003-04-12 Keryos Spa Vettori multi-cistronici utilizzabili in protocolli di trsferimento genico
US20060062764A1 (en) 2004-08-25 2006-03-23 Seshidar-Reddy Police Fiber-modified adenoviral vectors for enhanced transduction of tumor cells
ES2276623B1 (es) * 2005-12-12 2008-06-01 Proyecto De Biomedicina Cima, S.L Nuevos adenovirus recombinantes de replicacion condicionada (crad).
EP1984007B1 (en) * 2006-02-13 2015-08-19 Oncolytics Biotech Inc. Use of low dose local immune suppression to enhance oncolytic viral therapy
MX340972B (es) 2008-10-08 2016-08-02 Intrexon Corp Celulas manipuladas por ingenieria que expresan multiples inmunomoduladores, y uso de las mismas.
LT2379586T (lt) * 2008-12-22 2017-03-10 Targovax Oy Auglio audinius ardantys adenovirusiniai vektoriai ir su jais susiję būdai ir panaudojimas
FI20090030A0 (fi) * 2009-02-02 2009-02-02 Akseli Eetu Hemminki Onkolyyttiset virukset
US8383099B2 (en) * 2009-08-28 2013-02-26 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Adoptive cell therapy with young T cells
US9487800B2 (en) 2010-09-08 2016-11-08 Chemotherapeutisches Forschunginstitut Georg-Speyer-Haus Interleukin 15 as selectable marker for gene transfer in lymphocytes
RU2013118724A (ru) * 2010-09-24 2014-10-27 Онкос Терапьютикс Ой Онколитические аденовирусные векторы и связанные с ними способы и применения
CN102154213B (zh) * 2011-01-19 2012-07-25 郑骏年 一种运载荷载细胞因子的双调控溶瘤腺病毒的新型cik细胞
CN103476943A (zh) 2011-03-10 2013-12-25 普罗维克图斯药品公司 用于增强治疗癌症的局部和全身性免疫调节疗法的组合
FI123955B (en) 2011-11-25 2014-01-15 Oncos Therapeutics Ltd Oncolytic adenovirus

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