CN107406859A - 编码双特异性抗体的溶瘤腺病毒及与其相关的方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明涉及人的癌症疗法。更具体地，本发明涉及编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体。此外，本发明涉及利用溶瘤腺病毒载体以及连同过继细胞疗法的方法和用途。

Description

编码双特异性抗体的溶瘤腺病毒及与其相关的方法和用途
发明领域
本发明涉及生命科学和医学领域。具体地，本发明涉及人的癌症治疗。更具体地，本发明涉及编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒(oncolytic adenoviral)载体。此外，本发明涉及利用溶瘤腺病毒载体以及连同过继细胞疗法的方法和用途。
发明背景
不断开发用于癌症治疗的新疗法。过继细胞疗法(adoptive cell therapy)(ACT)是用于治疗癌症，而且也用于治疗其它疾病如感染和移植物抗宿主病(graft versus hostdisease)的有效方法。过继细胞转移(Adoptive cell transfer)是将离体生长的细胞(最常见的是免疫来源的细胞)被动地移植到宿主中，目的是转移移植物的免疫学功能和特征。过继细胞转移可以是自体的，如在过继性T细胞疗法中常见的，或是同种异体的(allogeneic)，如对于治疗感染或移植物抗宿主病典型的。临床上，该方法的常见实施方案包括将免疫促进细胞或致耐受性细胞诸如淋巴细胞转移到患者以增加针对病毒和癌症的免疫力，或在自身免疫疾病诸如I型糖尿病或类风湿性关节炎背景中促进耐受性。
已经使用自体肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte)(TIL)或遗传上重新定向的外周血单核细胞的过继转移来成功治疗具有黑色素瘤(melanoma)的患者以及表达CD19的血液恶性肿瘤的患者。在ACT中，最常用的细胞类型为T细胞，有时针对CD8+分选，但其它变化包括CD4+细胞，NK细胞，delta-gamma T细胞，调节性T细胞和外周血单核细胞。细胞可以是未经修饰的，例如在TIL疗法中或经遗传修饰的。在TIL疗法中，使用未分选的多克隆细胞。有两种常见的方法来实现T细胞对肿瘤特异性靶标的遗传靶向。一种是转移具有已知特异性(TCR疗法)并且具有匹配的人白细胞抗原(HLA，被称为啮齿动物中的主要组织相容性复合体)类型的T细胞受体。另一种是用人工分子如嵌合抗原受体(CAR)修饰细胞。这种方法不依赖于HLA，并且在靶向细胞表面分子方面更灵活。例如，可以使用单链抗体，并且CAR也可以掺入共刺激结构域。然而，CAR细胞的靶标需要在靶细胞的膜上，而TCR修饰可以利用细胞内靶标。在TCR和CAR疗法中，从患者的外周血获得T细胞。
尽管过继细胞疗法的发展，过继性T细胞疗法在占超过90％的人类癌症和95％的癌症死亡率的非黑色素瘤实体瘤上的临床结果是令人失望的。其主要原因是肿瘤微环境是高度免疫抑制的，其使T细胞移植物失活并变得无能力(anergize)，抑制移植物的局部增殖，并阻止过继转移的T细胞向肿瘤的运输。目前没有有效的解决此问题的工具。
T细胞衔接剂(T-cell engager)已用于癌症治疗。主要类别是三功能抗体，用化学方法连接的Fab和双特异性T细胞衔接剂(BiTE)，后者是临床上最先进的(Baeuerle PA,Reinhardt C.Cancer Res.2009Jun 15；69(12):4941-4)。虽然已经在临床前研究了几个BiTE，并且已经有两个(blinatumomab，一种抗CD19BiTE，和solitomab，抗EpCAM Bite)存在于临床试验中，但是出现了许多问题。一个主要问题是中靶脱瘤毒性(on-target-off-tumor toxicity)，这导致高的不利事件率，包括在blinatumomab临床试验中12％的毒性死亡率(Topp MS et al.2011,J Clin Oncol.Jun 20；29(18):2493-8)。另一个问题是BiTE在靶标(肿瘤)中的浓度不足，这尤其在实体瘤的背景下是存在问题的，所述实体瘤的肿块形成了对BiTE渗透和集中的障碍。这可能解释了为什么在solitomab的试验中没有看到正式的响应(肿瘤大小的减少，其满足RECIST标准)。最好的响应是暂时稳定疾病，这在38％的患者中达到(Walter M et al.2012,J Clin Oncol 30,(suppl；abstr 2504))。BiTE的另一个问题是在人类中的半衰期短，需要连续输注，这不是常规使用的实用解决方案。
已经提出了将装甲有(armed with)T细胞衔接剂的溶瘤病毒载体用于癌症治疗。WO 2014138314A1(PCT/US2014/020935)和Yu et al.(2014,Mol Ther 22(1):102-11)描述了编码抗EphA2BiTe的溶瘤牛痘病毒。关于BiTE的载体递送(vectored delivery)，包括双重单链构建体诸如BiTE的单链分子不能从哺乳动物细胞自动分泌。事实上，单链分子和构建体诸如BiTE的较差的分泌已经在其基因治疗应用中形成了障碍。抗体通常由B细胞谱系浆细胞产生，并由此不意外的是，其从上皮肿瘤细胞产生和释放是存在问题的。
在单独或与其它疗法一起的溶瘤病毒载体的功效方面，仍有改进的空间。通常保证疗法的增加的特异性和充分的治疗肿瘤杀伤能力。
本发明通过利用特定的病毒载体，例如，与过继细胞疗法一起来提供用于癌症治疗剂的有效工具和方法。
发明概述
本发明的目的是提供用于克服低效，不安全和不可预测的癌症疗法的以上问题的简单方法和工具。在一个实施方案中，本发明提供用于细胞治疗的新的方法和手段。本发明的目的通过特定的病毒载体，方法和排列(arrangement)实现，这些通过独立权利要求中的陈述来表征。在从属权利要求中公开了本发明的具体实施方案。
本发明提出使用特定的溶瘤腺病毒来解决高度免疫抑制性肿瘤微环境的问题，所述肿瘤微环境使T细胞移植物失活且变得无能力，抑制移植物的局部增殖，并阻止过继转移的T细胞向肿瘤的运输。本发明基于令人惊奇的见解：即编码双特异性T细胞衔接剂(BiTE)的溶瘤腺病毒可以解决所述问题(图1)。特别地，与本发明相关的数据指示，腺病毒可以诱导小鼠的肿瘤和人中的危险信号，如通过干扰素gamma产生例示(图2)，这导致TIM3(TIM3是肿瘤免疫抑制的关键指标)表达的减少(图3)。重要的是，即使单独的腺病毒能够在肿瘤中产生危险信号，这不足以将T细胞募集到肿瘤中(图4)。因此，为了过继细胞疗法的最佳增强，需要用BiTE装甲溶瘤腺病毒(图1)
值得注意的是，我们有显示TIM3表达以及溶瘤性腺病毒下调TIM3的能力与患者存活相关的人类数据。这是有力的数据，指示由腺病毒引起的危险信号传递导致肿瘤免疫抑制的下调，其与患者的临床益处相关(图10)。重要的是，不是所有的溶瘤病毒都是一样的，并且事实上牛痘病毒不能在肿瘤中产生危险信号，并因此与通过局部产生BiTE用于肿瘤免疫治疗的腺病毒不相容(图5-6)。
本发明解决了BiTE全身毒性和局部功效差以及半衰期短的问题，即是通过腺病毒载体在肿瘤局部产生BiTE，该特征特别是在实体瘤的背景下是有利的(图9)。
此外，本发明以令人惊讶的方式解决了单链BiTE分子分泌较差的问题：当使用仅在肿瘤细胞中复制的溶瘤腺病毒，并且复制的最后步骤是细胞裂解时，BiTE释放到肿瘤微环境中(图8)。换句话说，本发明以令人惊讶的方式解决了BiTE的分泌问题，通过利用溶瘤(oncolysis)作为释放装置。根据本发明，不需要BiTE的分泌，并且实际上是作为另外的方法不优选将BiTE表达限制于肿瘤(只有肿瘤细胞被病毒裂解)。
在肿瘤处产生BiTE可以募集过继T细胞移植物到肿瘤(图1)。与细胞表面分子受体(例如CD3受体)的结合在肿瘤处激活移植物的细胞。此外，腺病毒溶瘤引起抵消肿瘤免疫抑制的危险信号。这些组分一起实现了单独使用任何组分均无法实现的抗免疫抑制作用。值得注意的是，腺病毒就其通过结合病原体相关的模式识别受体(pattern recognitionreceptor)诱导抗免疫抑制危险信号的能力而言在溶瘤病毒中是独特的。此外，腺病毒对T细胞具有显著的效果，而在这方面，许多其它溶瘤病毒诸如牛痘病毒是相当隐秘(stealthy)的。换句话说，牛痘不能用于增强过继细胞治疗。最后，本说明书呈现了显示牛痘不是用于增强过继细胞疗法的良好平台，而腺病毒是抵消肿瘤免疫抑制的最佳装置的数据。
已经认为抗病毒免疫是对包括溶瘤腺病毒在内的病毒治疗方法限制性的。抗病毒免疫的一个实施方案是抗病毒T细胞。然而，本发明令人惊奇地揭示，当使用溶瘤腺病毒在肿瘤处产生BiTE时，抗病毒T细胞可以重新靶向肿瘤。这种效应在治疗期间放大，因为溶瘤病毒的复制导致其它的抗病毒T细胞，其然后也通过由病毒产生的BiTE靶向肿瘤(图7)。
在一个实施方案中，本发明涉及用编码BiTE的溶瘤腺病毒增强T细胞疗法。溶瘤腺病毒是使用BiTe来增强T细胞疗法的最佳平台，这是因为在肿瘤处溶瘤和BiTE表达的抗免疫抑制效应之间的出乎意料的协同作用。
本说明书描述了重组腺病毒载体的构建，与腺病毒载体相关的方法及其不同用途。此外，本发明的编码T细胞衔接剂的腺病毒载体可以与过继细胞治疗剂组合用于癌症治疗。
本发明的优点是通过治疗恶性肿瘤的方法实现的，其包括将有效量的本发明的腺病毒载体(例如单独或与TIL一起)施用于患有癌症的患者，以导致癌症的消退或稳定。
本申请涉及溶瘤腺病毒载体，其包含
在E3区域中的核酸序列的缺失，和
编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换在E3区域中缺失的核酸序列。
本申请还涉及溶瘤腺病毒载体，其包含
在E3区域中的核酸序列的缺失，和
编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换E3区域中缺失的核酸序列，
其中所述双特异性单克隆抗体包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。
另外，本发明涉及包含溶瘤腺病毒载体的药物组合物，所述溶瘤腺病毒载体包含在E3区域中的核酸序列的缺失，和编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换E3区域中缺失的核酸序列。
此外，本发明涉及溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物(adoptive celltherapeutic composition)的组合，所述溶瘤腺病毒载体包含在E3区域中的核酸序列的缺失，和编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换E3区域中缺失的核酸序列。
此外，本发明涉及本发明的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物的组合，用于治疗癌症。
此外，本发明涉及与用于治疗癌症的过继细胞治疗组合物一起的本发明的溶瘤腺病毒载体。
此外，本发明涉及与过继细胞治疗组合物一起的用于治疗癌症的本发明的溶瘤腺病毒载体。
本发明还涉及治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的溶瘤腺病毒载体。
本发明还涉及溶瘤腺病毒载体，其用于增加过继细胞疗法在受试者中的功效，所述溶瘤腺病毒载体包含在E3区域中的缺失和替换E3缺失区域的编码双特异性单克隆抗体的核酸序列。
本发明还涉及在受试者中增加过继细胞疗法的功效的方法，其通过对有此需要的受试者施用溶瘤腺病毒进行，所述溶瘤腺病毒载体包含在E3区域中的缺失和替换E3缺失区域的编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，其中所述受试者已被施用或要施用过继细胞疗法。
此外，本发明还涉及本发明的溶瘤腺病毒载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。
此外，本发明还涉及本发明的溶瘤腺病毒载体在制备用于增加受试者中过继细胞疗法的功效的药物中的用途。
本发明的排列的优点包括但不限于增强的治疗效果和减少的副作用。防止了严重的不利事件，甚至死亡，原因效力的增强和我们方法的抗抑制作用可以降低对现有技术方法中使用的预处理(preconditioning)化学疗法和/或辐射的需求，以便为转移的细胞“腾出空间”并减少肿瘤免疫抑制。
附图简述
在下文中，将参照附图通过具体实施方案更详细地描述本发明，其中
图1显示具有编码双特异性T细胞衔接剂BiTE的溶瘤腺病毒的T细胞疗法的作用机制。
图2显示用腺病毒治疗在肿瘤中诱导的危险信号。用5/3嵌合腺病毒(具有来自Ad3的纤维结(fiber knob)的基于Ad5的载体)治疗在B16.OVA肿瘤中诱导危险信号，如通过干扰素gamma表达所证明的。腺病毒病原体相关分子模式(PAMP)与宿主细胞上的toll样受体(TLR)的结合可以诱导干扰素-γ的分泌，这导致先天和适应性免疫应答的快速激活。因此，腺病毒可用于产生免疫系统有效识别的免疫原性肿瘤表型。
图3显示腺病毒在肿瘤微环境中具有抗免疫抑制效应。5/3嵌合腺病毒对B16.OVA肿瘤微环境具有抗免疫抑制作用。肿瘤对免疫攻击具有高度抗性，并且甚至大量过继转移的肿瘤特异性OT-I T细胞不能克服肿瘤免疫抑制。然而，如果小鼠同时用5/3嵌合腺病毒处理，则免疫抑制分子(诸如TIM-3)在肿瘤中下调。
图4显示单独的免疫抑制的提升不足以诱导T细胞向肿瘤的运输：需要BiTE。免疫抑制的的提升不足以诱导T细胞向B16.OVA肿瘤的运输。肿瘤内注射5/3嵌合腺病毒可诱导外周血中的CD8+T细胞，但这些细胞不能有效地浸润肿瘤。这种不良的T细胞肿瘤运输突出了用作单一试剂(agent)的溶瘤腺病毒和过继性T细胞疗法的缺点，支持了本发明通过表达BiTe的溶瘤腺病毒增强过继转移的T细胞的运输。
图5揭示腺病毒在诱导细胞抗肿瘤免疫中优于牛痘；这是用于增强过继细胞疗法的关键特征。腺病毒(Ad)和牛痘病毒(VV)免疫原性之间的比较。与使用双缺失的溶瘤西方储备牛痘病毒(Western reserve vaccinia virus)(Yu et al Mol Ther 2014使用该毒株)处理的小鼠相比，5/3嵌合腺病毒处理的小鼠中脾脏和B16.OVA肿瘤浸润性CD8+T细胞的水平更高。因此，溶瘤腺病毒由于其固有的免疫原性，特别是在过继性T细胞疗法的背景下，看起来是BiTe的理想表达平台。
图6显示腺病毒在诱导抗肿瘤免疫中比牛痘更有效。对携带同基因B16.OVA肿瘤的小鼠肿瘤内注射PBS，腺病毒或牛痘病毒。用五聚体-APC(其检测对卵清蛋白的SIINFEKL残基特异性的T细胞受体)染色肿瘤细胞样品，并通过流式细胞术评估(n＝3)。数据指示在腺病毒或牛痘病毒注射后抗肿瘤T细胞中的变化；腺病毒在诱导抗肿瘤免疫方面更有效，而牛痘在抗肿瘤T细胞的背景下实际上是免疫抑制的。
图7揭示了由溶瘤腺病毒递送的BiTE靶向针对肿瘤的所有类型的T细胞，包括抗病毒T细胞。在许多患者中，抗病毒T细胞比抗肿瘤T细胞多得多(Kanerva A et al.ClinCancer Res.2013May 15；19(10):2734-44)。通常在肿瘤治疗的背景下认为它们是起反作用的，原因在于a)它们消耗可用的有限量的免疫应答的主要部分，以及b)它们可以限制溶瘤病毒的复制。相比之下，我们的发明出乎意料地利用了预先存在的且诱导的抗腺病毒T细胞免疫，因为抗病毒T细胞靶向肿瘤(图7)。由于经腺病毒处理的肿瘤的TIL含有抗肿瘤和抗病毒T细胞两者，BiTe的CD3-scFV将激活这些T细胞，而与其内源特异性无关(独立于MHCI)。因此，通过对肿瘤细胞表面抗原(诸如间皮素(mesothelin),EpCAM1,MUC1)特异的scFV实现了这些T细胞的肿瘤特异性杀伤，并且预期不会看到脱肿瘤/脱靶(off-tumor/off-target)的反应性。因此，这种方法通过病毒产生的BiTe的结合使所有CD8+TIL(＝抗肿瘤和抗病毒)重新导向抗肿瘤T细胞。
图8显示编码功能性抗体的溶瘤腺病毒，而不是非复制型腺病毒导致有效的抗体产生和从癌细胞的释放。用指示的腺病毒以100个病毒颗粒(VP)/细胞感染细胞，并且几天后通过人IgG ELISA(A)或Western印迹(B)分析抗体表达。在感染后的每个指定时间点，(A)溶瘤病毒Ad5/3-OV-Ab(灰色和黑色条)显示来自卵巢癌SKOV-3细胞的功能抗体的大量生产：在进行性感染和癌细胞杀伤期间细胞裂解物(LYS)中抗体水平降低，并在上清液(SN)中显示出显著的积累。相比之下，即使细胞裂解物在感染后第7天(白色条)显示出抗体的证据，非复制型病毒Ad5/3-Ab无法在上清液中产生可检测的抗体。值得注意的是，非复制型Ad5/3-Ab病毒处理的细胞在整个实验中是存活的，指示癌细胞缺乏活性抗体分泌。(B)在用指定病毒感染后6天用Western印迹分析乳腺癌BT-474细胞(左)和人胚胎293细胞(右)的上清液。在还原条件下，在两种细胞系的上清液中显现由溶瘤病毒Ad5/3-OV-Ab产生的重链(HC)，轻链(LC)和全长抗体，而非复制型Ad5-Ab和Ad5/3-Ab病毒未能显示来自不允许其复制的BT-474细胞的抗体释放。为了证实非复制型病毒的抗体表达，我们使用也允许E1A缺失腺病毒复制的人胚胎293细胞(右)，随后细胞裂解并释放抗体，所述抗体容易通过Western印迹检测。使用编码萤光素酶的非复制型对照病毒Ad5/3-Luc作为阴性对照。使用多克隆山羊抗人IgG和驴抗山羊IgG-HRP抗体分别检测HC和LC。抗体亲和力针对LC比针对HC更低，导致较弱信号。条表示平均值±SEM。**,P<0.01；*,P<0.05；全部是Student’s T检验。
图9显示编码抗体的溶瘤腺病毒比全身抗体治疗后显示更高的肿瘤内抗体水平，而更低的全身抗体水平。在第0,4,8和15天用肿瘤内注射溶瘤Ad5/3-OV-Ab病毒(2×108VP/肿瘤)或腹膜内注射商业抗体(Ab；0.3μg/g)处理具有皮下N87胃癌异种移植物的裸鼠/NMRI小鼠(每组n＝5)。监测动物的健康并从在第32和40天(全身性Ab)，第46天(全身性Ab和Ad5/3-OV-Ab病毒)和第50天(Ad5/3-OV-Ab病毒)处死的小鼠收集肿瘤和血液样品。A)通过人IgGELISA测量端点肿瘤和血液样品以评估抗体浓度：与在第32,40和46天早期处死的经全身性Ab处理的小鼠相比，处理后第46和50天处死的经Ad5/3-OV-Ab处理的小鼠显示肿瘤中仍然显著更高的抗体浓度(P<0.001，左)，同时呈现低得多的循环水平(P<0.001，右)。B)比较每个单独动物的肿瘤和血液样品中的抗体水平以评估抗体分布。用Ad5/3-OV-Ab病毒处理的小鼠中，肿瘤与血液中抗体的平均比例高于1.0，而全身Ab治疗导致低于0.01的非常低的比例。因此，用表达抗体的溶瘤病毒处理可以实现改进的肿瘤内抗体浓度，同时显著地降低在动物中的全身暴露。值得注意的是，大多数经病毒处理的小鼠存活时间更长(多达50天)，并因此显示了持续的局部抗体产生的证据。误差条代表平均值±SEM。**，P<0.01，Student’sT检验。
图10显示T细胞消耗标志物和免疫抑制性受体TIM3的表达在溶瘤腺病毒处理后降低，并与改善的存活相关。15个具有晚期实体瘤的患者在先进治疗访问程序(AdvancedTherapy Access Program)的背景下用溶瘤腺病毒治疗。通过RNA微阵列(HumanHT-12v4Expression BeadChips array,Illumina)分析基线和治疗后肿瘤生检，并比较基因表达水平以鉴定差异表达的基因。作为肿瘤中先天和适应性免疫应答两者的消耗标志物和负调节因子的T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(T-cell immunoglobulin mucin-3)(TIM3)是顶部的差异表达基因之一：TIM3显示5名患者中的主要下调(相对于1.0的变化，Δ[log2])和4名患者中的次要降低(平均变化0.38，Δ[log2])。同时，6名患者未能显示TIM3下调，其中2名患者出现治疗后上调。当将这些组之间的总存活进行比较时，相对于“TIM3无变化/上调”的患者(n＝6)，具有TIM3下调的患者(n＝9)显示显著改善的存活(P＝0.004，时序检验)。TIM3下调和上调组的中位存活期分别为204天和64天。因此，看起来三分之二的溶瘤腺病毒治疗导致免疫抑制受体和消耗标志物TIM3的降低，其与延长的总存活强相关。
图11显示了用TIL和溶瘤腺病毒组合改善的体外细胞杀伤。在加入HapT1TIL之前，用溶瘤腺病毒(100VP/细胞)感染HapT1细胞3天。在TIL加入后24小时测定靶细胞活力。误差线，SE。****P<0.0001。当用溶瘤腺病毒刺激T细胞时，观察到最好的杀伤。
图12显示了在不存在BiTe分子的情况下，当与溶瘤腺病毒组合时，从HapT1肿瘤提取的TIL不具有对靶细胞杀伤的累加效应(additive effect)。将HapT1细胞接种在96孔板上，并与单独的或装甲有人IL-2的溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24一起温育5天。将从建立的HapT1肿瘤提取的TIL以10：1加入细胞，24小时后用MTS测定法测定细胞的活力。病毒和TIL之间没有观察到协同作用。
图13(A和B)揭示Ad5/3-E2F-d24-E3病毒与人CD3特异性EpCAM靶向性BiTE(抗人EpCam，Cat#CABT-33295MH)和PBMC的组合针对结肠癌细胞系SW480的体外溶解活性(lyticactivity)。图13A：a)用Ad5/3-E2F-d24-E3病毒的增加VP(0,01,0,1,1,10,100,1000VP)和用10ng BiTE感染SW480肿瘤细胞。以效应物比靶标5:1的比例加入效应细胞(PBMC)。使用MTS测定法在感染后48小时测定细胞活力。误差条表示一式三份测量的SEM。病毒+细胞比病毒+PBMC*P＝0.0184，病毒+细胞比病毒+PBMCs+BiTE***P＝0.001。图13B：a)用Ad5/3-E2F-d24-E3病毒的1000个VP和用10ng的BiTE感染SW480肿瘤细胞。以效应物比靶标5:1的比例加入效应细胞(PBMC)。使用MTS测定法在感染后48小时测定细胞活力。误差条表示一式三份测量的SEM。病毒+细胞比病毒+PBMCs*P＝0.0184，病毒+细胞比病毒+PBMCs+BiTE***P＝0.001。
图14显示腺病毒或用IL2装甲的腺病毒不足以在肿瘤中积累T细胞。与过继性T细胞转移组合的腺病毒治疗导致次优T细胞浸润到B16.OVA黑色素瘤肿瘤中。对在治疗开始后18天收集的肿瘤用流式细胞术分析卵清蛋白特异性CD8+T细胞(OVA)和gp100特异性CD8+T细胞。OVA和gp100是在黑色素瘤细胞上表达的表位。不同治疗组之间的差异不是统计学显著的，并且与单独的T细胞疗法(无病毒)无差异。水平线，平均值。
图15揭示仓鼠胰腺肿瘤中的细胞毒性T细胞。溶瘤腺病毒不能将细胞毒性CD8+T细胞募集至肿瘤。在19天中用单独或装甲人IL-2的溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24处理皮下仓鼠胰腺肿瘤(HapT1)共5次。在第25天，处死动物，并用交叉反应性抗大鼠CD8b PE抗体标记肿瘤细胞。(样品数目：模拟和未装甲的n＝5，IL2n＝1)。仅溶瘤腺病毒不能将Cd8细胞募集到肿瘤中。IL2看起来更有希望，但增加并不显著。
图16显示有免疫能力的(immunocompetent)仓鼠中再攻击的结果。以前用未装甲的溶瘤性腺病毒Ad5/3-E2F-d24或者用通过细胞因子(TNFα，IL-2或两者)处理装甲的腺病毒治愈的仓鼠抵抗相同的肿瘤类型(HapT1)而不是不同的肿瘤类型(DDT1-MF2)。将以前没有遭遇到任一种细胞系的幼稚动物用作对照。用能够诱导抗肿瘤免疫的分子(例如BITe)来装甲病毒对于诱导保护性免疫(＝针对肿瘤表位的记忆应答的体征)是必需的。
图17显示伴有或未伴有T细胞疗法的装甲或未装甲的溶瘤腺病毒的体内功效。在第1天和第8天，用溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24(1×107VP/肿瘤)肿瘤内注射建立的HapT1肿瘤。在第2天，肿瘤内施用离体生长的HapT1肿瘤浸润淋巴细胞(1.5×106个TIL/肿瘤)。误差条，SE。*p<0.05,**p<0.01。当用溶瘤病毒处理肿瘤时观察到最好的抗肿瘤功效，并且也给出了TIL。
图18显示了携带B16-OVA肿瘤的有免疫能力的小鼠中组合Ad-BiTE和OT1T细胞转移的体内抗肿瘤效力实验的假设结果。用单次腹膜内注射富含CD8的OT1T细胞，肿瘤内注射Ad-BiTE(1×10e9VP/肿瘤)或两者处理经皮下植入的B16-OVA肿瘤(0.25×10e6个细胞/肿瘤)。病毒注射将每7天重复一次。
图19显示，细胞因子IL2和TNFα的腺病毒递送增强了过继细胞疗法的功效，提供了将细胞因子包括在编码BiTE的溶瘤腺病毒中的原理。在第1天，携带B16-OVA肿瘤的C57小鼠用装甲的腺病毒的1×10e9个病毒颗粒在肿瘤内处理，并用1.5×10e6个富含CD8的OT-1T细胞腹膜内处理。病毒处理每7天继续。
图20显示了本发明的构建体设计。
图21显示了本发明的构建体图。
发明详述
病毒载体
用于本发明的溶瘤腺病毒载体可以是适于治疗人或动物的任何腺病毒载体。如本文所用，“溶瘤腺病毒载体”是指能够通过在肿瘤中相对于正常细胞中的选择性复制感染和杀死癌细胞的腺病毒载体。
在本发明的一个实施方案中，腺病毒载体是人病毒的载体。在一个实施方案中，腺病毒载体选自Ad5，Ad3和Ad5/3载体。如本文所用，表述“腺病毒血清型5(Ad5)核酸主链”是指Ad5的基因组。类似地，“腺病毒血清型3(Ad3)核酸主链”是指Ad3的基因组。“Ad5/3载体”是指包含或具有Ad5和Ad3载体两者的一部分的嵌合载体。在一个具体实施方案中，腺病毒载体的主链是具有特定突变的腺病毒血清型5(Ad5)或腺病毒血清型3(Ad3)核酸主链。例如，可以修饰载体的纤维区域。在一个实施方案中，主链是Ad5核酸主链，其还包含Ad3纤维结。换句话说，构建体具有来自Ad3的纤维结，而基因组的剩余部分或剩余部分中的大部分来自Ad5。(参见例如图20)。
腺病毒载体可以以本领域已知的任何方式进行修饰，例如，通过删除，插入，突变或修饰任何病毒区域。就复制而言，使载体变为肿瘤特异性的。例如，腺病毒载体可以包含E1，E3和/或E4中的修饰，诸如插入肿瘤特异性启动子(例如以驱动E1)，缺失区域(例如E1恒定区2，如“D24”、E3/gp19k、E3/6.7k中使用)和插入转基因。
用于产生肿瘤特异性溶瘤腺病毒的一种方法是工程化改造影响E1的恒定区2(CR2)的24个碱基对的缺失(D24)。在野生型腺病毒中，CR2负责结合用于诱导合成(S)期，即DNA合成或复制期的细胞Rb肿瘤抑制物/细胞周期调节蛋白。pRb和E1A之间的相互作用需要E1A蛋白保守区的氨基酸121至127，其在本发明中是缺失的。本发明的载体包含对应于根据Heise C.et al.(2000,Nature Med 6,1134-1139)的载体的氨基酸122-129的核苷酸的缺失。已知具有D24的病毒具有降低的克服G1-S检查点的能力，并且仅在不必需这种相互作用的细胞中有效地复制，例如，在Rb-p16途径缺陷的肿瘤细胞中，这包括大多数(如果不是全部)的人类肿瘤。在本发明的一个实施方案中，载体包含腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)(参见图20)。
也有可能用例如肿瘤特异性启动子替代E1A内源性病毒启动子。在本发明的具体实施方案中，利用例如E2F1(例如在基于Ad5的载体)或hTERT(例如在基于Ad3的载体中)启动子替换E1A内源性病毒启动子。在一个实施方案中，载体包含用于E1A肿瘤特异性表达的E2F1启动子。
E3区域对于体外病毒复制是非必需的，但E3蛋白质在调节宿主免疫应答，即抑制先天性和特异性免疫应答二者中具有重要作用。在本发明的一个实施方案中，溶瘤腺病毒载体的E3区域中的核酸序列的缺失是病毒gp19k和6.7k阅读框(reading frame)的缺失。E3中的gp19k/6.7K缺失是指从腺病毒E3A区域缺失965个碱基对。在产生的腺病毒构建体中，缺失了gp19k和6.7K基因两者(Kanerva Aet al.2005,Gene Therapy 12,87-94)。已知gp19k基因产物结合并在内质网中隔绝主要组织相容性复合体I(MHC1，在人中称为HLA1)分子，并且防止通过细胞毒性T淋巴细胞对感染细胞的识别。由于许多肿瘤缺乏HLA1/MHC1，gp19k的缺失增加了病毒的肿瘤选择性(病毒比野生型病毒从正常细胞中清除得更快，但在肿瘤细胞中没有差异)。6.7K蛋白质在细胞表面上表达，并且它们参与下调TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体2。(参见图20)。
关于本发明的具体实施方案，缺失gp19k和6.7K两者提供了令人惊讶的优点。由于我们试图重新获得HLA/MHC的表达用于将肿瘤表位呈递至过继转移的T细胞，gp19k蛋白的表达是起反作用的，并且实际上HLA/MHC的上调需要gp19k的缺失。关于6.7k，由于本发明的一个具体实施方案是从病毒中产生TNFalpha，并且其抗肿瘤活性之一是直接的抗肿瘤促凋亡作用(在转导的和非转导的旁观者细胞两者上)，6.7k的存在是起反作用的。
在本发明的一个实施方案中，将一个或多个转基因置于在E3启动子下的gp19k/6.7K缺失的E3区域中。这将转基因表达限制到允许复制病毒和随后激活E3启动子的肿瘤细胞。在具体实施方案中，将编码包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异性的scFv的两分型分子的核酸序列插入病毒gp19k和6.7k阅读框的缺失的核酸序列的位置。在本发明的另一个实施方案中，将E3gp19k/6.7K保留在载体中，但是一个或多个其它E3区域已缺失(例如E3 9-kDa，E3 10.2kDa，E3 15.2kDa和/或E3 15.3kDa)。
E3启动子可以是本领域已知的任何外源(例如CMV或E2F启动子)或内源启动子，特别是内源E3启动子。虽然E3启动子主要通过复制活化，但当E1表达时，会出现一些表达。由于D24型病毒的选择性发生在E1表达后(当E1不能结合Rb时)，这些病毒确实也在转导的正常细胞中表达E1。因此，调节E1表达以将E3启动子介导的转基因表达限于肿瘤细胞也是至关重要的。
本发明的具体实施方案包括溶瘤腺病毒载体(例如Ad5或Ad3载体)，通过以下双重选择性装置将所述载体的复制限制于p16/Rb途径：位于腺病毒E1A基因前面的E2F(例如E2F1)肿瘤特异性启动子，所述腺病毒E1A基因已经在恒定区2中突变，使得所得到的E1A蛋白不能结合细胞中的Rb。此外，纤维通过5/3嵌合(chimerism)修饰以允许有效地进入肿瘤细胞。而且，还将BiTE转基因，任选与其它转基因一起放置于已经缺失了gp19k和6.7k开放阅读框的E3区域。这种装甲方法将转基因表达与病毒复制联系起来，而不需要异源启动子。在具体实施方案中，L(左)-和/或R(右)-ITR序列也可以包含在载体中。反向末端重复(ITR)序列使病毒基因组能够有效增殖，并且给出形成发夹的能力等特性。
在本发明的具体实施方案中，溶瘤腺病毒载体包含：
1)用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子
2)腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)；
3)病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失；和
4)编码两分型分子(bipartite molecule)的核酸序列，替换如在3)点中定义的缺失的核酸序列，所述两分型分子包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。(参见图20)。
双特异性单克隆抗体(BsMAb，BsAb)是由两种不同单克隆抗体的片段组成的人工蛋白，并因此能够结合两种不同类型的抗原。换句话说，双特异性抗体将两个或更多个抗原识别元件组合成能够结合两个或更多个靶标的单个构建体。
双特异性单克隆抗体的实例包括BsMAb，其被工程化以同时结合细胞毒性细胞(使用受体诸如CD3)和待破坏的靶物如肿瘤细胞。已经开发了称为三功能抗体的第一代BsMAb。它由两条重链和两条轻链组成，各一个来自两种不同的抗体。两个Fab区(臂)针对两个抗原。Fc区(足)由两条重链构成并形成第三结合位点；由此得名。其它类型的双特异性抗体包括仅由Fab区组成的化学连接的Fab，以及各种类型的二价和三价单链可变片段(scFv)(即，模拟两种抗体的可变域的融合蛋白)。在本发明的具体实施方案中，双特异性单克隆抗体选自三功能抗体以及二价和三价单链可变片段(scFv)。在本发明的一个实施方案中，双特异性单克隆抗体是二价单链可变片段。二价单链可变片段组包含双特异性T细胞衔接剂(BiTE)和mAb2(即，工程化成含有Fcab抗原结合片段而不是Fc恒定区的抗体)。
双特异性T细胞衔接剂(BiTE)是一类人工双特异性单克隆抗体。它们指导宿主的免疫系统，更具体地是针对癌细胞的T细胞的细胞毒活性。BiTE是在约55千道尔顿的单个肽链上由不同抗体的两个单链可变片段(scFv)或是来自四个不同基因的氨基酸序列组成的融合蛋白。scFv中的一个通过细胞表面分子(例如CD3受体)与T细胞结合，而另一个通过肿瘤特异性分子与肿瘤细胞结合。
在具体实施方案中，双特异性单克隆抗体是包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv的两分型分子。如本文所用，“对细胞表面分子特异的”是指结合特定类型细胞表面分子的能力。也如本文所用，“对肿瘤抗原特异的”指结合特定类型的肿瘤抗原的能力。
在本发明的一个实施方案中，细胞表面分子在免疫效应细胞上。如本文所用，“免疫效应细胞”是指选自T细胞，CD8+细胞，CD4+细胞，NK细胞，delta-gamma T细胞，调节性T细胞和外周血单核细胞的细胞。在一个具体实施方案中，效应细胞是T细胞，即T淋巴细胞。在一个实施方案中，细胞表面分子可以选自CD3，CD8和CD4。
在一个实施方案中，肿瘤抗原选自表1或由间皮素，EpCAM1和MUC1组成的组。
在一个实施方案中，细胞表面分子是CD3，并且肿瘤抗原选自表1或选自间皮素，EpCAM1或MUC1。在另一个实施方案中，细胞表面分子是CD8，并且肿瘤抗原选自表1或选自间皮素，EpCAM1或MUC1。在另外的实施方案中，细胞表面分子是CD4，肿瘤抗原选自表1或选自间皮素，EpCAM1或MUC1。在一个非常具体的实施方案中，肿瘤抗原是间皮素，并且细胞表面分子是CD3；肿瘤抗原为EpCAM1，并且细胞表面分子为CD3；或肿瘤抗原为MUC1，并且细胞表面分子为CD3。实际上，关于BiTe转基因，具体实例包括抗间皮素-接头-抗-CD3，抗EpCAM1-接头-抗-CD3和抗-MUC1-接头-抗-CD3。
表1.适合用于本发明的肿瘤抗原的实例(http://cvc.dfci.harvard.edu/cvccgi/tadb/nomenclature.pl)。
在一个实施方案中，本发明的载体编码双特异性单克隆抗体，但也可以包含其它转基因。在具体的实施方案中，溶瘤腺病毒载体编码两个或更多个转基因。本发明的特定实施方案包括编码双特异性T细胞衔接剂和至少一种细胞因子的腺病毒载体。用于本发明的细胞因子可以选自本领域任何已知的细胞因子。在本发明的具体实施方案中，细胞因子是IL-2，TNFalpha或CD40L。实际上，除了双特异性单克隆抗体之外，溶瘤腺病毒载体还可以包括例如IL-2，TNFalpha和/或CD40L转基因。
细胞因子通过各种机制起作用来参与免疫反应，所述机制包括向肿瘤募集T细胞。编码细胞因子转基因的核苷酸序列可以来自任何动物诸如人，猿，大鼠，小鼠，仓鼠，狗或猫，但具体地它由人序列编码。编码转基因的核苷酸序列可以进行修饰，以改善其作用，或是未经修饰，即野生型的核苷酸序列。
此外，编码BiTE和至少一种细胞因子两者的腺病毒载体与过继细胞治疗剂的组合在比已经假设的结果在更宽的靶标上提供更有效的结果。
通过吸引和激活T细胞并减少肿瘤免疫抑制，其它细胞因子发挥功能，而IL-2诱导T细胞移植物的增殖。因此，IL-2在需要它的肿瘤处局部产生，而不是如通常在T细胞疗法中进行的那样全身注射，这可引起副作用，因此可通过该实施方案来防止现有技术治疗的主要问题(即全身性IL-2的毒性)。实际上，预防严重的不良事件甚至死亡，这是因为如果病毒在肿瘤中复制时产生IL-2，则不需要在将细胞转移至患者后现有技术方法中用于增殖和维持经转移的细胞的IL-2的分开添加。肿瘤处的局部生产也可增强IL-2受欢迎的效果(刺激和增殖移植物)，同时减少全身暴露(这是不良事件的原因)。本发明提供选择性治疗，其具有对健康组织的较低毒性或损害。
通过溶瘤病毒的复制提供的危险信号传导以及通过病毒DNA激活病原体相关分子模式识别受体，连同转基因的作用一起可以将肿瘤免疫抑制降低到使得可以省略预处理治疗的程度。因此，可以避免现有技术中的主要问题，即由于预处理化学疗法和辐射导致的毒性。
在本发明的一个实施方案中，病毒载体包含两个转基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)或任选的核糖体分流位点(ribosome shunt site)2A。因此，IRES或核糖体分流位点2A可以在任何转基因之间，例如双特异性单克隆抗体和任何细胞因子之间。如本文使用的，“IRES”是指能够在蛋白质合成中在信使RNA序列中间起始翻译的核苷酸序列。IRES可以来自任何病毒，但是在本发明的一个实施方案中，IRES来自脑心肌炎病毒(EMCV)。如本文所用，“核糖体分流位点2A”是指翻译起始位点，其中核糖体物理绕开5'非翻译区的部分以达到起始密码子。IRES和A2都能使病毒从一个启动子(E3启动子)产生两个转基因。IRES可用于例如腺病毒构建体中的以下位置(图20)：aMesothelin-aCD3-IRES-IL2(参见SEQ ID NO：1、2、3、5、6、9)；aMesothelin-aCD3-IRES的-TNFa(参见SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7)；aEpCAM-aCD3-IRES-IL2(参见SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6)；aEpCAM-aCD3-IRES-TNFα(参见SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7)；aMUC1-aCD3-IRES-IL2(参见SEQ ID NO：1、2、3、5、6、8)；aMUC1-aCD3-IRES-TNFα(参见SEQ ID NO：1、2、3、5、7、8)。核苷酸序列来自本发明的腺病毒构建体，并呈现于表2中。
可以用于例如本发明的病毒基因组的一般布局的示意图示于图20(Ad5/3-E2F-D24-转基因)。包含转基因aMesothelin-aCD3(例如aMesothelin-aCD3-IRES-IL2，参见SEQID NO：1、2、3、5、6、9；aMesothelin-aCD3-IRES-TNFa，参见SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7)，aEpCAM-aCD3(例如aEpCAM-aCD3-IRES-IL2参见SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6；aEpCAM-aCD3-IRES-TNFα，参见SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7)，aMUC1-aCD3(例如aMUC1-aCD3-IRES-IL2参见SEQ ID NO：1、2、3、5、6、8；aMUC1-aCD3-IRES-TNFa参见SEQ ID NO：1、2、3、5、7、8)的病毒载体的核苷酸序列根据表2中列出的序列构建。构建腺病毒载体的一般方法是本领域技术人员熟知的，且例如描述于Koski等2010，Hemminki等2015。这些方法也可用于构建本发明的腺病毒载体。
除了上述其它优点之外，利用包含至少一种细胞因子转基因的病毒载体的本发明的另外的优点是：i)细胞因子和病毒本身引起将T细胞和其它免疫细胞募集到肿瘤的危险信号，ii)细胞因子诱导在肿瘤和局部淋巴样器官中的T细胞增殖，iii)细胞因子和病毒本身能够诱导T细胞(过继的T细胞移植物和天然的、先天的抗肿瘤T细胞两者)在肿瘤中增殖，iv)细胞因子和/或病毒诱导癌细胞上的抗原呈递分子(HLA)的上调，使其对T细胞的识别和杀伤敏感，以及v)细胞因子和病毒复制通过减少免疫抑制和细胞无反应性有利地改变肿瘤微环境。
在本发明中使用的病毒载体也可以包括除上述以外的其它修饰。任何附加的组分或修饰可以任选地被使用，但对于本发明而言不是强制性的。
插入外源元件可增强载体在靶细胞中的作用。外源组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组载体中是常见的，并且它们也可用于本发明。
过继性细胞疗法
本发明的一种方法是使用能够与癌症反应并破坏癌症的免疫淋巴细胞的转移来开发癌症患者的治疗。分离的肿瘤浸润淋巴细胞在培养物中大量培养并输注入患者体内。在本发明中，编码至少双特异性单克隆抗体的腺病毒载体可用于增加淋巴细胞的作用。如本文所用的，“增加过继细胞疗法的功效”是指这样一种情况，其中本发明的腺病毒载体当与过继细胞治疗组合物一起使用时能够在受试者中产生相比于单独的过继细胞治疗组合物的治疗效果而言更强的治疗效果。图1指通过说明使用编码双特异性T细胞衔接剂BiTE的溶瘤腺病毒的T细胞疗法来提高功效的机制。本发明的具体实施方案是治疗受试者的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用本发明的溶瘤腺病毒载体，所述方法还包括向受试者施用过继细胞治疗组合物。本发明的过继细胞治疗组合物和载体分开施用。过继细胞治疗组合物和腺病毒载体的分开施用之前可以是骨髓消融(myeloablating)或非骨髓消融预处理化学疗法和/或辐射。过继细胞疗法治疗旨在减少或消除患者的癌症。
本发明的具体实施方案涉及用腺病毒载体和过继细胞治疗组合物(例如，肿瘤浸润淋巴细胞、TCR修饰淋巴细胞或CAR修饰淋巴细胞)的疗法。本发明中特别可以采用T细胞疗法，也可以采用任何其它过继疗法，例如NK细胞疗法或其它细胞疗法。实际上，根据本发明，过继细胞治疗组合物可以包含未修饰的细胞，例如在TIL疗法或遗传修饰细胞中。实现T细胞对肿瘤特异性靶标的遗传靶向有两种常见的方法。一种是具有已知特异性(TCR治疗)和具有匹配的人白细胞抗原(HLA，在啮齿动物中称为主要组织相容性复合体)类型的T细胞受体的转移。另一种是用人工分子如嵌合抗原受体(CAR)修饰细胞。这种方法不依赖于HLA，并且在靶向分子方面更灵活。例如，可以使用单链抗体，并且CAR也可以掺入共刺激结构域。然而，CAR细胞的靶标需要在靶细胞的膜上，而TCR修饰可以利用细胞内靶标。
如本文所用的，“过继细胞治疗组合物”是指包含适用于过继细胞转移的细胞的任何组合物。在本发明的一个实施方案中，过继细胞治疗组合物包含选自肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR(即异源T细胞受体)修饰的淋巴细胞和CAR(即嵌合抗原受体)修饰的淋巴细胞的细胞类型。在本发明的另一个实施方案中，过继细胞治疗组合物包含选自T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、Δ-γT细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞的细胞类型。在另一个实施方案中，TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、Δ-γT细胞、调节性T细胞或外周血单核细胞形成过继细胞治疗组合物。在本发明的一个具体实施方案中，过继细胞治疗组合物包含T细胞。如本文所用，“肿瘤浸润淋巴细胞”或TIL指的是已经离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。淋巴细胞可以分为B组、T细胞和自然杀伤细胞三组。在本发明的另一个具体实施方案中，过继细胞治疗组合物包含已经用靶特异性嵌合抗原受体或特异性选择的T细胞受体修饰的T细胞。如本文所用的，“T细胞”是指CD3+细胞，包括CD4+辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞和γδT细胞。
除了合适的细胞之外，本发明中使用的过继细胞治疗组合物可以包含任何其它试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂、和/或通常可见于相应产品中的任何组分。合适的成分的选择和用于配制组合物的合适的制造方法属于本领域技术人员的公知常识。
过继细胞治疗组合物可以是任何适合施用的形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可以选自但不限于溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。组合物不限于某种制剂，而是可以将组合物配制成任何已知的药学上可接受的制剂。药物组合物可以通过本领域已知的任何常规方法制备。
本发明的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物的组合是指将溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物一起，但作为分开的组合物使用。对于本领域技术人员清楚的是，本发明的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物不用作一种组合物。实际上，腺病毒载体不用于修饰过继细胞，而是用于修饰靶肿瘤，使得肿瘤更适合于细胞移植物所需的效果。特别地，本发明增强了过继移植物对肿瘤的募集，并且增加了其在那里的活性。在本发明的具体实施方案中，组合的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物同时或以任何次序顺序地施用于受试者。
癌症
本发明的重组载体在肿瘤细胞中具有复制能力。在本发明的一个实施方案中，载体在细胞中具有复制能力，其在Rb途径，特别是Rb-p16途径中具有缺陷。这些有缺陷的细胞包括动物和人类中的所有肿瘤细胞。如本文使用的，“Rb途径中的缺陷”是指该途径的任何基因或蛋白质中的突变和/或表观遗传学变化。由于这些缺陷，肿瘤细胞过表达E2F，因此通过E1ACR2结合Rb(这通常是有效复制所需要的)是不必要的。本发明的腺病毒载体的进一步选择性由E2F启动子介导，所述E2F启动子仅在游离E2F存在下活化，如在Rb/p16途径缺陷细胞中所见。在没有游离E2F的情况下，不发生E1A的转录并且病毒不复制。包含E2F1启动子对于预防正常组织中E1A的表达是重要的，所述E1A的表达可以通过允许从E3启动子的转基因表达直接和间接地引起毒性。
本发明涉及治疗受试者的癌症的方法。在本发明的一个实施方案中，受试者是人或动物，特别是动物或人患者，更具体地是患有癌症的人或动物。
本发明的方法可以用于治疗任何癌症或肿瘤，包括恶性和良性肿瘤两者，原发性肿瘤和转移都可以是该方法的靶标。在本发明的一个实施方案中，癌症特征在于肿瘤浸润性淋巴细胞。本发明的工具特别适用于治疗特征在于肿瘤浸润性淋巴细胞的转移性实体瘤。在另一个实施方案中，T细胞移植物已被嵌合抗原受体的肿瘤或组织特异性T细胞受体修饰。
如本文所用，术语“治疗”或“处理”是指将至少溶瘤腺病毒载体或至少溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物施用于受试者，优选哺乳动物或人受试者，目的不仅包括完全治愈，还包括预防、改善或缓解与癌症或肿瘤相关的病症或症状。治疗效果可以通过监测患者的症状，例如在血液中的肿瘤标志物或例如肿瘤的大小或患者的存活时间来评估。
在本发明的一个实施方案中，癌症选自鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、滑膜癌(synovial cancer)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、肾癌(renal cancer)、结缔组织癌(cancer of connective tissues)、黑色素瘤(melanoma)、肺癌(lung cancer)、肠癌(bowel cancer)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、结直肠癌(colorectalcancer)、脑癌(brain cancer)、喉癌(throat cancer)、口腔癌(oral cancer)、肝癌(livercancer)、骨癌(bone cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、胃泌素瘤(gastrinoma)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、催乳素瘤(prolactinoma)、T细胞白血病/淋巴瘤(T-cell leukemia/lymphoma)、神经瘤(neuroma)、von Hippel-Lindau病(von Hippel-Lindau disease)、佐林格-埃利森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌(renal cancer)、肛门癌(anal cancer)、胆管癌(bile ductcancer)、膀胱癌(bladder cancer)、输尿管癌(ureter cancer)、脑癌(brain cancer)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、脑膜瘤(meningioma)、脊髓肿瘤(spinal cord tumor)、骨癌(bone cancer)、骨软骨瘤(osteochondroma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、未知原发部位的癌症(cancer of unknown primary site)、类癌(carcinoid)、胃肠道类癌(carcinoid of gastrointestinal tract)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、乳腺癌(breastcancer)、佩吉特氏病(Paget's disease)、宫颈癌(cervical cancer)、结直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌(rectal cancer)、食道癌(esophagus cancer)、胆囊癌(gall bladder cancer)、头癌(head cancer)、眼癌(eye cancer)、颈癌(neck cancer)、肾癌(kidney cancer)、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、肝癌(liver cancer)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、前列腺癌(prostate cancer)、肺癌(lung cancer)、睾丸癌(testicular cancer)、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma)、口腔癌(oral cancer)、皮肤癌(skin cancer)、间皮瘤(mesothelioma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、卵巢癌(ovarian cancer)、内分泌胰腺癌(endocrinepancreatic cancer)、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、胰腺癌(pancreatic cancer)、甲状旁腺癌(parathyroid cancer)、阴茎癌(penis cancer)、垂体癌(pituitary cancer)、软组织肉瘤(soft tissue sarcoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、小肠癌(smallintestine cancer)、胃癌(stomach cancer)、胸腺癌(thymus cancer)、甲状腺癌(thyroidcancer)、滋养层癌(trophoblastic cancer)、葡萄胎(hydatidiform mole)、子宫癌(uterine cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、阴道癌(vagina cancer)、外阴癌(vulva cancer)、听神经瘤(acoustic neuroma)、蕈样真菌病(mycosis fungoides)、胰岛素瘤(insulinoma)、类癌综合征(carcinoid syndrome)、生长抑素瘤(somatostatinoma)、牙龈癌(gum cancer)、心脏癌(heart cancer)、唇癌(lip cancer)、脑膜癌(meningescancer)、口腔癌(mouth cancer)、神经癌(nerve cancer)、腭癌(palate cancer)、腮腺癌(parotid gland cancer)、腹膜癌(peritoneum cancer)、咽癌(pharynx cancer)、胸膜癌(pleural cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、舌癌(tongue cancer)和扁桃体癌(tonsil cancer)。
在将人或动物患者分类为适合本发明的治疗之前，临床医生可以检查患者。基于偏离正常情况并揭示肿瘤或癌症的结果，临床医生可以建议对患者进行本发明的治疗。
药物组合物
本发明的药物组合物包含本发明的至少一种类型的病毒载体。在一个实施方案中，本发明的药物组合物包含溶瘤腺病毒载体，其含有E3区域中的核酸序列缺失和替换E3区域中缺失的核酸序列的编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，其中双特异性单克隆抗体包含对于细胞表面分子特异性的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异性的scFv。此外，组合物可以包含至少两个、三个或四个不同的载体。除了载体之外，药物组合物还可以包含其它治疗有效的试剂，任何其它试剂，例如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂、和/或通常可见于相应产品中的任何组分。合适的成分的选择和用于配制组合物的合适的制造方法属于本领域技术人员的公知常识。
药物组合物可以是任何适合施用的形式，例如固体、半固体或液体形式。制剂可以选自但不限于溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。本发明的组合物不限于某种制剂，而是可以将组合物配制成任何已知的药学上可接受的制剂。药物组合物可以通过本领域已知的任何常规方法制备。
在本发明的一个实施方案中，病毒载体或药物组合物用作募集T细胞、增强其治疗效果并允许其在肿瘤处增殖的原位媒介物。
本发明的药物试剂盒可以包含编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体或过继细胞治疗组合物和编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体。在一个具体实施方案中，将过继细胞治疗组合物配制在第一制剂中，并将溶瘤腺病毒载体配制成在第二制剂中。在本发明的另一个实施方案中，第一和第二制剂同时或以任何次序顺序施用于受试者。
施用
本发明的腺病毒载体或药物组合物可以施用于选自植物、动物和人的任何真核生物受试者。在本发明的具体实施方案中，受试者是人或动物。动物可以选自宠物、家畜和生产动物。
任何常规方法可用于向受试者施用载体或组合物。施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤位置、患者、合并症和其它因素。
在本发明的一个实施方案中，将腺病毒载体和过继细胞治疗组合物两者施用于受试者。将过继细胞治疗组合物和编码至少一种双特异性单克隆抗体溶瘤腺病毒载体施用于受试者可以同时或以任何次序连续地进行。在本发明的一个实施方案中，溶瘤病毒载体和过继细胞治疗组合物分开施用。如本文中使用的，“分开施用”或“分开的”是指这样的情况，其中过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体是彼此不同的两种不同的产品或组合物。
本发明的腺病毒载体仅一次施用或单一施用过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体可以具有治疗作用。溶瘤腺病毒的施用之间或溶瘤腺病毒和过继细胞疗法组合物的施用之间可以存在任何时间段，这取决于例如患者和癌症的类型、程度或位置。在本发明的一个实施方案中，在连续施用过继细胞治疗组合物和编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体之间存在1分钟至4周、特别是1至10天、更具体地1至5天的时间段。过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体的几次施用也是可以的。过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体的施用次数在治疗期间也可以不同。溶瘤腺病毒载体或药物或过继细胞组合物可以在前2周、4周、每月或治疗周期期间施用例如1至10次。在本发明的一个实施方案中，载体或任何组合物的施用在前2周内进行，然后在4周，然后每月进行3至7次。在本发明的具体实施方案中，在前2周、然后在4周、然后每月进行4次施用。治疗期的长度可以变化，例如可以持续2至12个月或更长。
在本发明的一个具体实施方案中，在同一天施用过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体，然后在治疗期间每周、每两周、每三周或每月施用溶瘤腺病毒载体，其可以持续例如1至6至12个月或以上。
在本发明的一个实施方案中，溶瘤病毒的施用通过肿瘤内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜内注射或口服施用进行。施用的任何组合也是可以的。尽管局部注射，但该方法可以提供全身功效。过继细胞治疗组合物可以静脉内或肿瘤内施用。在一个实施方案中，过继细胞治疗组合物和/或编码至少一种双特异性单克隆抗体的溶瘤病毒载体的施用通过肿瘤内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜内注射或口服施用进行。在本发明的具体实施方案中，TIL或T细胞静脉内施用并且病毒载体肿瘤内和/或静脉内施用。值得注意的是，与T细胞的施用分开将病毒递送至肿瘤；病毒不用于离体修饰T细胞移植物。实质上，病毒以使得T细胞移植物能够更好地工作的方式来修饰肿瘤。
载体的有效剂量至少取决于需要治疗的受试者、肿瘤类型、肿瘤的位置和肿瘤的阶段。剂量可以从例如约1×108个病毒颗粒(VP)至约1×1014VP，特别是约5×109VP至约1×1013VP，更具体地约8×109VP至约1×1012VP变化。在一个实施方案中，编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体以1×1011-1×1014个病毒颗粒的量施用。在本发明的另一个实施方案中，剂量在约5×1010-5×1011VP的范围内。
转移的细胞数量还将取决于患者，但通常量的范围为每次注射1×109-1×1012个细胞。注射次数也不同，但通常的实施方案包括间隔数周(例如2-4周)的1或2轮治疗。
除了本发明的治疗之外，可以使用任何其它治疗或治疗组合。在具体实施方案中，本发明的方法或用途还包括对受试者施用同时或连续放射疗法、单克隆抗体、化疗或其它抗癌药物或干预(包括手术)。
如本文所用的，术语“治疗”或“增加”以及由此产生的词并不一定意味着100％或完全治疗或增加。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在的益处或治疗效果的不同程度。在这方面，本发明的方法可以提供T细胞疗法的疗效的增加的任何量或治疗或预防疾病的任何程度。
图1和7示出了本发明的方法和机理。
对于本领域技术人员显而易见的是，随着技术的进步，本发明的概念可以以各种方式实现。本发明及其实施方案不限于上述实例，而是可以在权利要求书的范围内变化。
实施例
材料与方法
B16-OVA动物模型：将表达卵清蛋白的B16细胞(B16-OVA)保持在RPMI、10％FBS、5mg/ml G418、20mM L-谷氨酰胺、1×Pen/Strep溶液(GIBCO)中。将4-7周龄的C57BL/6有免疫能力的雌性小鼠皮下在右体侧植入50μl RPMI、0％FBS中的2.5×105个B16-OVA细胞，每只小鼠一个肿瘤。肿瘤植入后大约十天(当肿瘤变得可注射时，约3mm最小直径)，将小鼠分组，并在一些实验中连续六天用50μl PBS或50μl PBS中的1×109个溶瘤腺病毒的病毒颗粒(VP)肿瘤内注射进行处理。在其它实验中，在第0、2和4天进行了三次注射。由于鼠细胞不允许人腺病毒，使用多个肿瘤内病毒注射来模拟病毒复制诱导的炎症(Blair等，1989)。
过继转移：在i.t.处理的第一天，小鼠也通过在腹腔内过继转移100ul RPMI、0％FBS中的来自4-8周龄C57BL/6-Tg(TcraTcrb)1100Mjb/J(OT-1)小鼠(其遗传工程改造以仅具有卵清蛋白(OVA)特异性CD8T细胞受体)的5×105至2×106过夜静置的CD8a富集和扩增的脾细胞。根据制造商的说明书(Miltenyi Biotech，USA，目录号130-049-401)，在转移前5天通过小鼠CD8a(Ly-2)MicroBeads进行CD8a富集。在重组鼠IL-2(160ng/ml)和可溶性抗小鼠CD3ε抗体(0.3μg/ml，Abcam，克隆145-2C11)的存在下，在淋巴细胞培养基(RPMI、10％FBS、20mM L-谷氨酰胺、1×Pen/Strep溶液、15mM HEPES、50μM 2-巯基乙醇、1mM丙酮酸钠)中将富集的细胞在数量上扩增5天。
用于流式细胞术的组织处理：将小鼠实施安乐死，在1至10ml RPMI、10％FBS中收获脾脏、引流淋巴结和肿瘤，并通过终末心脏放血收集血液至胸腔中，并通过一次性注射器转移到含EDTA的微量离心管中，并进行分析处理：将固体组织通过手术刀大致解离，并在10ml一次性无菌移液管尖中在5至10ml ACK裂解缓冲液(150mM NH4Cl、10mM KHCO3、0.1mMEDTA，pH7.2)中磨碎，并在室温(RT)下温育约20分钟，随后将细胞以1200rpm沉淀5分钟+4℃，随后将细胞重悬浮于1至10ml RPMI、10％FBS中，这取决于估计的细胞数量，并经过40微米无菌过滤器以产生单细胞溶液。在一些实验中，取而代之，在手术刀切割后(加入ACK之前)在1ml总体积的蛋白酶混合物(补充有1mg/ml的胶原酶A、H或P型，Roche，和125单位/ml最终浓度的benzonase，Sigma，E1014-25KU的RPMI)中直接处理肿瘤组织，在37℃、5％CO2下持续1-2小时，然后加入10ml ACK裂解缓冲液，并将细胞如上处理。将200μl全血移液至5ml ACK裂解缓冲液中并如上处理。将细胞在37℃、5％CO2下孵育过夜，或通过免疫染色和流式细胞术直接分析。
用于细胞因子分析的组织处理：将小鼠实施安乐死，并将约2-10mm3肿瘤片在干冰上的2ml微量离心管中冷冻并储存于-80℃。称重肿瘤片，加入200μl冰冷PBS。通过TissueMaster 125转子将片匀浆，加入1x蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)和0.1％BSA终浓度，并将管保持在冰上。将肿瘤匀浆物以2000rpm旋转10分钟+4℃，根据制造商的说明书在BDFACSArray上用CBA Flex Set细胞因子珠(BD，USA)分析上清液。
支持本发明的实验
根据本公开的材料和方法章节以及根据公开WO2014170389(A1)和先前发表的文章(Parviainen等2014,Tahtinen等2015,Tahtinen等2015)中描述的实验部分进行实验。
实验1(用腺病毒处理在肿瘤中诱导危险信号)：
用Ad5/3-d24-GMCSF 5/3嵌合腺病毒处理在B16.OVA肿瘤中诱导危险信号。腺病毒病原体相关分子模式(PAMP)与宿主细胞上的toll样受体(TLR)的结合诱导与免疫细胞活化和T细胞刺激相关的干扰素-γ的分泌，导致先天性和适应性免疫应答的快速激活。因此，腺病毒可用于产生被免疫系统有效识别的免疫原性肿瘤表型(图2)。
实验2(腺病毒在肿瘤微环境中具有抗免疫抑制作用)：
5/3嵌合腺病毒对B16.OVA肿瘤微环境具有抗免疫抑制作用。肿瘤对免疫攻击具有高度抗性，甚至大量的肿瘤特异性OT-I T细胞也未克服肿瘤免疫抑制。然而，如果用5/3嵌合腺病毒同时处理小鼠，则在肿瘤中下调免疫抑制分子(例如TIM-3)(图3)。
实验3(单独提升免疫抑制不足以诱导T细胞向肿瘤的运输：需要BiTE)：
免疫抑制的提升不足以诱导T细胞向B16.OVA肿瘤的运输。肿瘤内注射5/3嵌合腺病毒在外周血中诱导CD8+T细胞，但这些细胞没有有效地渗透肿瘤。T细胞的这种差的肿瘤运输突出了用作单一试剂的溶瘤性腺病毒和过继性T细胞疗法的缺点，支持本发明通过表达BiTe的溶瘤腺病毒增强过继转移的T细胞的运输(图4)。
实验4(腺病毒在诱导细胞抗肿瘤免疫方面优于牛痘；增强过继细胞疗法的关键特征)
腺病毒(Ad)和牛痘病毒(VV)免疫原性之间的比较。与使用双缺失的溶瘤性西储牛痘病毒(Western reserve vaccinia virus)(Yu等Mol Ther 2014使用该毒株)处理的小鼠相比，5/3嵌合腺病毒治疗的小鼠中脾脏和B16.OVA肿瘤浸润性CD8+T细胞的水平更高。因此，溶瘤腺病毒由于其固有的免疫原性，特别是在过继性T细胞疗法的背景下，似乎是BiTe的理想表达平台(图5)。
实验5(腺病毒在诱导抗肿瘤免疫方面比牛痘更有效)
携带同基因B16.OVA肿瘤的小鼠肿瘤内注射PBS、腺病毒或牛痘病毒。肿瘤细胞样品用五聚体-APC(其检测对卵清蛋白的SIINFEKL残基特异性的T细胞受体)进行染色，并通过流式细胞术(n＝3)进行评估。数据显示在腺病毒或牛痘病毒注射后的抗肿瘤T细胞中的变化；腺病毒在诱导抗肿瘤免疫方面有效得多(图6)。
实验6(由溶瘤腺病毒递送的BiTE靶向针对肿瘤的所有类别的T细胞，包括抗病毒T细胞(其通常被认为对肿瘤治疗起反作用))
此外，本发明利用在人群中广泛预先存在的Ad5T细胞免疫，其通常限制了腺病毒载体的临床效用。由于腺病毒处理的肿瘤的TIL含有抗肿瘤和抗病毒T细胞二者，BiTe的CD3-scFV将激活这些T细胞，而与其内源特异性无关(MHC I不依赖性地)。因此，通过对肿瘤细胞表面抗原(例如间皮素、EpCAM1、MUC1)特异性的scFV实现由这些T细胞的肿瘤特异性杀伤，并且预期不会看到脱瘤/脱靶(off-tumor/off-target)反应性。因此，这种方法通过结合病毒生产的BiTe将所有CD8+TILs(＝抗肿瘤和抗病毒)重新导向抗肿瘤T细胞(图7)。
实验7(编码功能性抗体的溶瘤腺病毒而不是非复制型腺病毒导致有效的抗体产生和从癌细胞的释放)
以100个病毒颗粒(VP)/细胞用所示的腺病毒感染SKOV-3、BT-474和293细胞，并且几天后通过人IgG ELISA(A)或Western印迹(B)分析抗体表达。在感染后的每个指定时间点，(A)溶瘤病毒Ad5/3-d24-曲妥珠单抗(灰色和黑色柱)显示从卵巢癌SKOV-3细胞大量产生功能抗体：在进行性感染和癌细胞杀伤过程中细胞裂解物(LYS)中抗体水平降低，并在上清液(SN)中显示出显著的积累。(OV是指Ad5/3-d24，且Ab是指抗体曲妥珠单抗)。相比之下，非复制型病毒Ad5/3-Ab在上清液中不能产生可检测的抗体，即使细胞裂解物在感染后第七天后显示出抗体的证据(白色柱)。值得注意的是，非复制型Ad5/3-Ab病毒处理的细胞在整个实验中是存活的，表示癌细胞缺乏活性抗体分泌。(B)指定病毒感染后6天通过Western印迹分析乳腺癌BT-474细胞(左)和人胚胎293细胞(右)的上清液。在还原条件下，在两种细胞系的上清液中显现由溶瘤病毒Ad5/3-OV-Ab产生的重链(HC)、轻链(LC)和全长抗体，而非复制型Ad5-Ab和Ad5/3-Ab病毒未能显示从不允许其复制的BTB-474细胞的抗体释放。为了证实由非复制型病毒的抗体表达，我们使用人胚胎293细胞(右)，其还允许复制E1A缺失腺病毒，随后允许细胞裂解和释放抗体，这通过Western印迹容易地检测到。使用编码萤光素酶的非复制型对照病毒Ad5/3-Luc作为阴性对照。使用多克隆山羊抗人IgG和驴抗山羊IgG-HRP抗体分别检测HC和LC。抗体亲和力针对LC比针对HC更低，导致较弱的信号。柱表示平均值±SEM。**，P<0.01；*，P<0.05；均为Student’s T检验(图8)。
实验8(编码抗体的溶瘤腺病毒比全身抗体治疗后显示更高的肿瘤内水平，而更低的全身抗体水平)
在第0、4、8和15天用瘤内注射溶瘤Ad5/3-OV-Ab病毒(2×108VP/肿瘤)或腹膜内注射商业抗体(Ab；0.3μg/g)处理携带皮下N87胃癌(Park等1990)异种移植物的裸/NMRI小鼠(每组n＝5)。监测动物的健康，并从在第32和40天(全身性Ab)、第46天(全身性Ab和Ad5/3-OV-Ab病毒)和第50天(Ad5/3-OV-Ab病毒)处死的小鼠收集肿瘤和血液样品。A)通过人IgGELISA测量端点肿瘤和血液样品以评估抗体浓度：与在第32、40和46天较早处死的全身Ab处理的小鼠相比，治疗后第46和50天处死的Ad5/3-OV-Ab处理的小鼠显示肿瘤中仍然显著较高的抗体浓度(P<001，左)，而呈现低得多的循环水平(P<0.001，右)。B)比较每个个体动物的肿瘤和血液样品中的抗体水平以评估抗体分布。在用Ad5/3-OV-Ab病毒处理的小鼠中，肿瘤相比于血液中的抗体的平均比例高于1.0，而全身Ab处理导致低于0.01的非常低的比例。因此，用表达抗体的溶瘤病毒的处理可以实现肿瘤内抗体浓度的改善，同时显著降低动物的全身暴露。值得注意的是，大多数经病毒处理的小鼠存活时间更长(最多至50天)，因此显示持续的局部抗体产生的证据。误差棒代表平均值+SEM。**，P<0.01，Student’s T检验(图9)。
实验9(T细胞耗竭标志物和免疫抑制受体TIM3的表达在溶瘤腺病毒处理后降低且与改善的存活率相关)
在先进治疗访问程序(Taipale等，2016)的背景下，对15名晚期实体瘤患者用溶瘤腺病毒处理。通过RNA微阵列(HumanHT-12v4Expression BeadChips阵列，Illumina)分析基线和处理后肿瘤生检，并比较基因表达水平以鉴定差异表达的基因。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM3)(其是肿瘤中先天性和适应性免疫反应两者的耗竭标志物和负调节物)是顶部的差异表达基因之一：TIM3在5名患者中显示出主要的下调(相对于1.0的变化，Δ[log2])和4名患者中的次要降低(平均变化0.38，Δ[log2])。同时，6名患者未能显示TIM3下调，其中2名患者显示治疗后上调。在这些组之间比较总存活期时，TIM3下调的患者(n＝9)相对于“TIM3无变化/上调”的患者(n＝6)显示出存活率显著改善(P＝0.004，时序检验)。TIM3下调和上调组中的生存中值分别为204天和64天。因此，三分之二的溶瘤腺病毒处理似乎导致免疫抑制受体和耗竭标志物TIM3的降低，其与延长的总存活期强烈相关(图10)。
实验10(用TIL和溶瘤腺病毒组合改善体外细胞杀伤)
在加入HapT1TIL之前，用溶瘤腺病毒Ad5/3-d24(100VP/细胞)感染HapT1细胞3天。TIL加入后24小时测定靶细胞存活力。误差条，SE。****P<0.0001。当用溶瘤腺病毒刺激T细胞时，观察到最佳杀伤(图11)。
实验11(在不存在BiTe分子的情况下，与溶瘤腺病毒组合时，从HapT1肿瘤提取的TIL不具有对靶细胞杀伤的累加效应)
将HapT1细胞接种在96孔板上，并与仅仅溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24，或装甲有人IL-2的溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24一起孵育5天。对细胞添加从建立的HapT1肿瘤提取的TIL，24h后用MTS测定法测量细胞的存活力。在病毒和TIL之间没有观察到协同作用(图12)。
实验12(组合病毒+BiTE+PBMCs的卓越的裂解活性)
在96孔板上以10000个细胞/孔接种SW480肿瘤细胞，并孵育24小时。将细胞用Ad5/3-E2F-d24-E3病毒，每个细胞0.01、0.1、1、10、100和1000个病毒颗粒和10ng人CD3特异性EpCAM靶向性BiTE(Antihuman EpCam，目录号CABT-33295MH)感染，至少三次重复，以在测定培养基(L-15、2％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中50μl/孔。以5:1的效应物：靶标比率加入效应细胞(PBMC)。次日，将50ul 10％的L-15加入细胞。感染后48小时，用含有10％CellTiter 96AQueous One Solution(Promega，Madison，WI，USA)的100μl生长培养基置换感染培养基并孵育2小时。在490nm处读取吸光度。误差条表示一式三份的SEM。病毒+细胞相对于病毒+PBMCs*P＝0.0184，病毒+细胞相对于病毒+PBMCs+BiTE***P＝0.001(图13A)。图13B：用Ad5/3-E2F-d24-E3病毒的1000个VP和用10ng BiTE感染SW480肿瘤细胞。以5:1的效应物：靶标比率加入效应细胞(PBMC)。使用MTS测定法在感染后48小时测定细胞存活力。误差条表示一式三份测量的SEM。病毒+细胞相对于病毒+PBMCs*P＝0.0184，病毒+细胞相对于病毒+BiTE+PBMCs***P＝0.001。
分数乘积法：
使用分数乘积法来评估协同作用，该方法衍生于Webb最初开发的一种方法(WebbJ，1963)。
0,1个VP＝1.245＝协同作用的
1个VP＝1.32＝协同作用的。
10个VP＝1.2＝协同作用的
100个VP＝1.1＝协同作用的
1000个VP＝1.1＝协同作用的
说明：
协同作用的＝比例大于1
累加效应＝等于1
拮抗＝小于1
结果：
这些发现表明BiTE与TILT的溶瘤性腺病毒具有协同作用。
实验13(B16-OVA靶细胞上的组合Ad-BiTE和OT1T细胞的体外细胞存活力实验)
将B16-OVA细胞以1×10e4细胞/孔接种在96孔板上，并用100VP/细胞的Ad-BiTE、T细胞(2:1的效应物：靶标比率)或两者感染。24小时后通过MTS测定法测定细胞存活力。
实验14(腺病毒或装甲有IL2的腺病毒不足以在肿瘤处积累T细胞)
将腺病毒治疗与过继性T细胞转移组合，并且导致进入B16.OVA黑色素瘤肿瘤中的次优T细胞浸润。对在治疗开始后18天后收集的肿瘤用流式细胞术分析卵清蛋白特异性CD8+T细胞(OVA)和gp100特异性CD8+T细胞。OVA和gp100是在黑色素瘤细胞上表达的表位。不同治疗组之间的差异不是统计学显著的，与单独的T细胞疗法(无病毒)无差异。水平线，平均值(图14)。
实验15(溶瘤腺病毒不能募集细胞毒性CD8+T细胞至肿瘤)
将皮下仓鼠胰腺肿瘤(HapT1)用单独的溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24或装甲有人IL-2的溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24在19天期间处理总计五次。在第25天，处死动物，并用交叉反应性抗大鼠CD8b PE抗体标记肿瘤细胞。(样品编号：模拟和未装甲的(unarmed)n＝5，IL2n＝1)。单独的溶瘤腺病毒不能将Cd8细胞募集到肿瘤。IL2似乎更有希望，但增加并不显著(图15)。
实验16(有免疫能力的仓鼠中的再攻击)
之前用未装甲的溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24或用通过细胞因子(TNFα、IL-2或两者)处理装甲的腺病毒治愈的仓鼠抵抗相同的肿瘤类型(HapT1)，但不抵抗不同的肿瘤类型(DDT1-MF2)。以前尚未遭遇任一细胞系的未处理动物用作对照。用能够诱导抗肿瘤免疫的分子(例如BITe)装甲病毒对于诱导保护性免疫(＝针对肿瘤表位的记忆应答的体征)是必需的(图16)。
实验17(在具有或没有T细胞疗法的情况下装甲有或未装甲的溶瘤腺病毒的体内功效)
在第1天和第8天，用溶瘤腺病毒Ad5/3-d25(1×107VP/肿瘤)肿瘤内注射建立的HapT1肿瘤。在第2天，肿瘤内施用离体培养的HapT1肿瘤浸润淋巴细胞(1.5×106个TIL/肿瘤)。误差条，SE。*p<0.05，**p<0.01。当用溶瘤病毒(例如BiTe编码病毒)处理肿瘤并且还给予TIL时，观察到最好的抗肿瘤功效(图17)。
实验18(来自在携带B16-OVA肿瘤的有免疫能力的小鼠中组合Ad-BiTE和OT1T细胞转移的体内抗肿瘤功效实验的假设结果)
皮下植入的B16-OVA肿瘤(0.25×10e6细胞/肿瘤)将用单次腹膜内注射富含CD8的OT1T细胞、肿瘤内注射Ad-BiTE(1×10e9VP/肿瘤)或两者进行处理。病毒注射将每7天重复(图18)。
实验19(细胞因子IL2和TNFα的腺病毒递送增强过继细胞疗法的功效：将细胞因子包括在编码BiTE的溶瘤腺病毒中的原理)
在第1天，携带B16-OVA肿瘤的C57小鼠用装甲的腺病毒的1×10e9个病毒颗粒肿瘤内处理并用1.5×10e6个富含CD8的OT-1T细胞腹膜内处理。每7天继续进行病毒处理(图19)。
实验20(新型病毒构建体)
我们产生了携带以下主链的新的溶瘤Ad5/3腺病毒：Ad5/3-E2F-D24-转基因。转基因在缺失的E3gp19k/6.7K区域中。以下转基因用于载体：
aMesothelin-aCD3
aEpCAM-aCD3
aMUC1-aCD3
aMesothelin-aCD3-IRES-IL2
aMesothelin-aCD3-IRES-TNFα
aEpCAM-aCD3-IRES-IL2
aEpCAM-aCD3-IRES-TNFα
aMUC1-aCD3-IRES-IL2
aMUC1-aCD3-IRES-TNFα
(图20和21)
图20的腺病毒载体或图21的构建体图谱包含含有列于表2中的例如转基因aMesothelin-aCD3(SEQ ID NO:9)、aEpCAM-aCD3(SEQ ID NO:4)或aMUC1-aCD3(SEQ ID NO:8)的核苷酸序列。本发明的病毒载体的核苷酸序列包含以下或由以下组成：例如，SEQ IDNO：1、2、3、5、6、9(aMesothelin-aCD3-IRES-IL2)；SEQ ID NO：1、2、3、5、6、7(aMesothelin-aCD3-IRES-TNFα)；SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6(aEpCAM-aCD3-IRES-IL2)；SEQ ID NO：1、2、3、4、5、7(aEpCAM-aCD3-IRES-TNFα)；SEQ ID NO：1、2、3、5、6、8(aMUC1-aCD3-IRES-IL2)；SEQID NO：1、2、3、5、7、8(aMUC1-aCD3-IRES-TNFα)。腺病毒载体根据表2列出的序列构建。也用于本发明的构建腺病毒载体的一般方法是本领域技术人员公知的且描述于例如Koski等2010，Hemminki等2015。
表2.序列表。
SEQ ID NO： 名称：
1 LITR
2 E2F
3 D24
4 转基因EpCAM_CD3接头
5 5/3扭结(knob)修饰
6 转基因IRES-IL2
7 转基因IRES-TNFα
8 转基因MUC1_CD3接头
9 转基因AntiMesothelin_CD3接头
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序列表
<110> 倾斜生物医疗公司(TILT Biotherapeutics Ltd)
<120> 编码双特异性抗体的溶瘤腺病毒及与其相关的方法和用途
<130> 2150395PC
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 358
<212> DNA
<213> 腺病毒
<400> 1
catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag ggggtggagt 60
ttgtgacgtg gcgcggggcg tgggaacggg gcgggtgacg tagtagtgtg gcggaagtgt 120
gatgttgcaa gtgtggcgga acacatgtaa gcgacggatg tggcaaaagt gacgtttttg 180
gtgtgcgccg gtgtacacag gaagtgacaa ttttcgcgcg gttttaggcg gatgttgtag 240
taaatttggg cgtaaccgag taagatttgg ccattttcgc gggaaaactg aataagagga 300
agtgaaatct gaataatttt gtgttactca tagcgcgtaa tactggtacc gcggccgc 358
<210> 2
<211> 680
<212> DNA
<213> 腺病毒
<400> 2
tggtaccatc cggacaaagc ctgcgcgcgc cccgccccgc cattggccgt accgccccgc 60
gccgccgccc catcccgccc ctcgccgccg ggtccggcgc gttaaagcca ataggaaccg 120
ccgccgttgt tcccgtcacg gccggggcag ccaattgtgg cggcgctcgg cggctcgtgg 180
ctctttcgcg gcaaaaagga tttggcgcgt aaaagtggcc gggactttgc aggcagcggc 240
ggccgggggc ggagcgggat cgagccctcg ccctcgagct agaagcttgt tttctcctcc 300
gagccgctcc gacaccggga ctgaaaatga gacatattat ctgccacgga ggtgttatta 360
ccgaagaaat ggccgccagt cttttggacc agctgatcga agaggtactg gctgataatc 420
ttccacctcc tagccatttt gaaccaccta cccttcacga actgtatgat ttagacgtga 480
cggcccccga agatcccaac gaggaggcgg tttcgcagat ttttcccgac tctgtaatgt 540
tggcggtgca ggaagggatt gacttactca cttttccgcc ggcgcccggt tctccggagc 600
cgcctcacct ttcccggcag cccgagcagc cggagcagag agccttgggt ccggtttcta 660
tgccaaacct tgtaccggag 680
<210> 3
<211> 27458
<212> DNA
<213> 腺病毒
<400> 3
gtgatcgatc cacccagtga cgacgaggat gaagagggtg aggagtttgt gttagattat 60
gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct tgtcattatc accggaggaa tacgggggac 120
ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag 180
tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa 240
tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt 300
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aaatggcgcc tgctatcctg agacgcccga catcacctgt gtctagagaa tgcaatagta 420
gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc 480
cgctgtgccc cattaaacca gttgccgtga gagttggtgg gcgtcgccag gctgtggaat 540
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ggccataagg tgtaaacctg tgattgcgtg tgtggttaac gcctttgttt gctgaatgag 660
ttgatgtaag tttaataaag ggtgagataa tgtttaactt gcatggcgtg ttaaatgggg 720
cggggcttaa agggtatata atgcgccgtg ggctaatctt ggttacatct gacctcatgg 780
aggcttggga gtgtttggaa gatttttctg ctgtgcgtaa cttgctggaa cagagctcta 840
acagtacctc ttggttttgg aggtttctgt ggggctcatc ccaggcaaag ttagtctgca 900
gaattaagga ggattacaag tgggaatttg aagagctttt gaaatcctgt ggtgagctgt 960
ttgattcttt gaatctgggt caccaggcgc ttttccaaga gaaggtcatc aagactttgg 1020
atttttccac accggggcgc gctgcggctg ctgttgcttt tttgagtttt ataaaggata 1080
aatggagcga agaaacccat ctgagcgggg ggtacctgct ggattttctg gccatgcatc 1140
tgtggagagc ggttgtgaga cacaagaatc gcctgctact gttgtcttcc gtccgcccgg 1200
cgataatacc gacggaggag cagcagcagc agcaggagga agccaggcgg cggcggcagg 1260
agcagagccc atggaacccg agagccggcc tggaccctcg ggaatgaatg ttgtacaggt 1320
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aaagggggta aagagggagc ggggggcttg tgaggctaca gaggaggcta ggaatctagc 1440
ttttagctta atgaccagac accgtcctga gtgtattact tttcaacaga tcaaggataa 1500
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ctggctgcag ccaggggatg attttgagga ggctattagg gtatatgcaa aggtggcact 1620
taggccagat tgcaagtaca agatcagcaa acttgtaaat atcaggaatt gttgctacat 1680
ttctgggaac ggggccgagg tggagataga tacggaggat agggtggcct ttagatgtag 1740
catgataaat atgtggccgg gggtgcttgg catggacggg gtggttatta tgaatgtaag 1800
gtttactggc cccaatttta gcggtacggt tttcctggcc aataccaacc ttatcctaca 1860
cggtgtaagc ttctatgggt ttaacaatac ctgtgtggaa gcctggaccg atgtaagggt 1920
tcggggctgt gccttttact gctgctggaa gggggtggtg tgtcgcccca aaagcagggc 1980
ttcaattaag aaatgcctct ttgaaaggtg taccttgggt atcctgtctg agggtaactc 2040
cagggtgcgc cacaatgtgg cctccgactg tggttgcttc atgctagtga aaagcgtggc 2100
tgtgattaag cataacatgg tatgtggcaa ctgcgaggac agggcctctc agatgctgac 2160
ctgctcggac ggcaactgtc acctgctgaa gaccattcac gtagccagcc actctcgcaa 2220
ggcctggcca gtgtttgagc ataacatact gacccgctgt tccttgcatt tgggtaacag 2280
gaggggggtg ttcctacctt accaatgcaa tttgagtcac actaagatat tgcttgagcc 2340
cgagagcatg tccaaggtga acctgaacgg ggtgtttgac atgaccatga agatctggaa 2400
ggtgctgagg tacgatgaga cccgcaccag gtgcagaccc tgcgagtgtg gcggtaaaca 2460
tattaggaac cagcctgtga tgctggatgt gaccgaggag ctgaggcccg atcacttggt 2520
gctggcctgc acccgcgctg agtttggctc tagcgatgaa gatacagatt gaggtactga 2580
aatgtgtggg cgtggcttaa gggtgggaaa gaatatataa ggtgggggtc ttatgtagtt 2640
ttgtatctgt tttgcagcag ccgccgccgc catgagcacc aactcgtttg atggaagcat 2700
tgtgagctca tatttgacaa cgcgcatgcc cccatgggcc ggggtgcgtc agaatgtgat 2760
gggctccagc attgatggtc gccccgtcct gcccgcaaac tctactacct tgacctacga 2820
gaccgtgtct ggaacgccgt tggagactgc agcctccgcc gccgcttcag ccgctgcagc 2880
caccgcccgc gggattgtga ctgactttgc tttcctgagc ccgcttgcaa gcagtgcagc 2940
ttcccgttca tccgcccgcg atgacaagtt gacggctctt ttggcacaat tggattcttt 3000
gacccgggaa cttaatgtcg tttctcagca gctgttggat ctgcgccagc aggtttctgc 3060
cctgaaggct tcctcccctc ccaatgcggt ttaaaacata aataaaaaac cagactctgt 3120
ttggatttgg atcaagcaag tgtcttgctg tctttattta ggggttttgc gcgcgcggta 3180
ggcccgggac cagcggtctc ggtcgttgag ggtcctgtgt attttttcca ggacgtggta 3240
aaggtgactc tggatgttca gatacatggg cataagcccg tctctggggt ggaggtagca 3300
ccactgcaga gcttcatgct gcggggtggt gttgtagatg atccagtcgt agcaggagcg 3360
ctgggcgtgg tgcctaaaaa tgtctttcag tagcaagctg attgccaggg gcaggccctt 3420
ggtgtaagtg tttacaaagc ggttaagctg ggatgggtgc atacgtgggg atatgagatg 3480
catcttggac tgtattttta ggttggctat gttcccagcc atatccctcc ggggattcat 3540
gttgtgcaga accaccagca cagtgtatcc ggtgcacttg ggaaatttgt catgtagctt 3600
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cgggcggagg gtgccagact gcggtataat ggttccatcc ggcccagggg cgtagttacc 3840
ctcacagatt tgcatttccc acgctttgag ttcagatggg gggatcatgt ctacctgcgg 3900
ggcgatgaag aaaacggttt ccggggtagg ggagatcagc tgggaagaaa gcaggttcct 3960
gagcagctgc gacttaccgc agccggtggg cccgtaaatc acacctatta ccgggtgcaa 4020
ctggtagtta agagagctgc agctgccgtc atccctgagc aggggggcca cttcgttaag 4080
catgtccctg actcgcatgt tttccctgac caaatccgcc agaaggcgct cgccgcccag 4140
cgatagcagt tcttgcaagg aagcaaagtt tttcaacggt ttgagaccgt ccgccgtagg 4200
catgcttttg agcgtttgac caagcagttc caggcggtcc cacagctcgg tcacctgctc 4260
tacggcatct cgatccagca tatctcctcg tttcgcgggt tggggcggct ttcgctgtac 4320
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gccaggtagc atttgaccat ggtgtcatag tccagcccct ccgcggcgtg gcccttggcg 4560
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taatcgtata gttcgtgcga gggagcgagg aggtcgggac cgaggttgct acgggcgggc 5940
tgctctgctc ggaagactat ctgcctgaag atggcatgtg agttggatga tatggttgga 6000
cgctggaaga cgttgaagct ggcgtctgtg agacctaccg cgtcacgcac gaaggaggcg 6060
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ttgaggacaa actcttcgcg gtctttccag tactcttgga tcggaaaccc gtcggcctcc 6240
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tgctcccaga gcaaaaagtc cgtgcgcttt ttggaacgcg gatttggcag ggcgaaggtg 6480
acatcgttga agagtatctt tcccgcgcga ggcataaagt tgcgtgtgat gcggaagggt 6540
cccggcacct cggaacggtt gttaattacc tgggcggcga gcacgatctc gtcaaagccg 6600
ttgatgttgt ggcccacaat gtaaagttcc aagaagcgcg ggatgccctt gatggaaggc 6660
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gcgtgagcgc gcgcagcagc agggcaacct gggctccatg gttgcactaa acgccttcct 11820
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ttttttccag accagtagac aaggcctgca gaccgtaaac ctgagccagg ctttcaaaaa 12000
cttgcagggg ctgtgggggg tgcgggctcc cacaggcgac cgcgcgaccg tgtctagctt 12060
gctgacgccc aactcgcgcc tgttgctgct gctaatagcg cccttcacgg acagtggcag 12120
cgtgtcccgg gacacatacc taggtcactt gctgacactg taccgcgagg ccataggtca 12180
ggcgcatgtg gacgagcata ctttccagga gattacaagt gtcagccgcg cgctggggca 12240
ggaggacacg ggcagcctgg aggcaaccct aaactacctg ctgaccaacc ggcggcagaa 12300
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gccgcggcga ttggcgccgt gcccggaatt gcatccgtgg ccttgcaggc gcagagacac 16980
tgattaaaaa caagttgcat gtggaaaaat caaaataaaa agtctggact ctcacgctcg 17040
cttggtcctg taactatttt gtagaatgga agacatcaac tttgcgtctc tggccccgcg 17100
acacggctcg cgcccgttca tgggaaactg gcaagatatc ggcaccagca atatgagcgg 17160
tggcgccttc agctggggct cgctgtggag cggcattaaa aatttcggtt ccaccgttaa 17220
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accgcaggca atggtgataa cttgactcct aaagtggtat tgtacagtga agatgtagat 18780
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tttattggtc taatgtatta caacagcacg ggtaatatgg gtgttctggc gggccaagca 18960
tcgcagttga atgctgttgt agatttgcaa gacagaaaca cagagctttc ataccagctt 19020
ttgcttgatt ccattggtga tagaaccagg tacttttcta tgtggaatca ggctgttgac 19080
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tactgctttc cactgggagg tgtgattaat acagagactc ttaccaaggt aaaacctaaa 19200
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atttgccttt acgccacctt cttccccatg gcccacaaca ccgcctccac gcttgaggcc 19800
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tcgggctacg acccttatta cacctactct ggctctatac cctacctaga tggaaccttt 20040
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aagccattgt caaagatctt ggttgtgggc catatttttt gggcacctat gacaagcgct 20880
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<210> 4
<211> 7258
<212> DNA
<213> 腺病毒
<400> 4
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aaaaggggta tcttttgtct ggtaaagcag gccaaagtca cctacgacag taataccacc 2520
ggacaccgcc ttagctacaa gttgccaacc aagcgtcaga aattggtggt catggtggga 2580
gaaaagccca ttaccataac tcagcactcg gtagaaaccg aaggctgcat tcactcacct 2640
tgtcaaggac ctgaggatct ctgcaccctt attaagaccc tgtgcggtct caaagatctt 2700
attcccttta actaataaaa aaaaataata aagcatcact tacttaaaat cagttagcaa 2760
atttctgtcc agtttattca gcagcacctc cttgccctcc tcccagctct ggtattgcag 2820
cttcctcctg gctgcaaact ttctccacaa tctaaatgga atgtcagttt cctcctgttc 2880
ctgtccatcc gcacccacta tcttcatgtt gttgcagatg aagcgcgcaa gaccgtctga 2940
agataccttc aaccccgtgt atccatatga cacggaaacc ggtcctccaa ctgtgccttt 3000
tcttactcct ccctttgtat cccccaatgg gtttcaagag agtccccctg gggtactctc 3060
tttgcgccta tccgaacctc tagttacctc caatggcatg cttgcgctca aaatgggcaa 3120
cggcctctct ctggacgagg ccggcaacct tacctcccaa aatgtaacca ctgtgagccc 3180
acctctcaaa aaaaccaagt caaacataaa cctggaaata tctgcacccc tcacagttac 3240
ctcagaagcc ctaactgtgg ctgccgccgc acctctaatg gtcgcgggca acacactcac 3300
catgcaatca caggccccgc taaccgtgca cgactccaaa cttagcattg ccacccaagg 3360
acccctcaca gtgtcagaag gaaagctagc cctgcaaaca tcaggccccc tcaccaccac 3420
cgatagcagt acccttacta tcactgcctc accccctcta actactgcca ctggtagctt 3480
gggcattgac ttgaaagagc ccatttatac acaaaatgga aaactaggac taaagtacgg 3540
ggctcctttg catgtaacag acgacctaaa cactttgacc gtagcaactg gtccaggtgt 3600
gactattaat aatacttcct tgcaaactaa agttactgga gccttgggtt ttgattcaca 3660
aggcaatatg caacttaatg tagcaggagg actaaggatt gattctcaaa acagacgcct 3720
tatacttgat gttagttatc cgtttgatgc tcaaaaccaa ctaaatctaa gactaggaca 3780
gggccctctt tttataaact cagcccacaa cttggatatt aactacaaca aaggccttta 3840
cttgtttaca gcttcaaaca attccaaaaa gcttgaggtt aacctaagca ctgccaaggg 3900
gttgatgttt gacgctacag ccatagccat taatgcagga gatgggcttg aatttggttc 3960
acctaatgca ccaaacacaa atcccctcaa aacaaaaatt ggccatggcc tagaatttga 4020
ttcaaacaag gctatggttc ctaaactagg aactggcctt agttttgaca gcacaggtgc 4080
cattacagta ggaaacaaaa ataatgataa gctaacccta 4120
<210> 8
<211> 4954
<212> DNA
<213> 腺病毒
<400> 8
atggactgga tctggagaat cttattcctt gtcggggctg ctaccggcgc acatatggcc 60
caggtccagc ttgttcaatc tggagctgaa gttaagagac cgggcgctag tgtgcaagta 120
tcctgccgag ccagcggata ctcgattaac acgtattaca tgcagtgggt tagacaggct 180
ccgggggcgg gactagaatg gatgggtgta ataaatccct caggggttac tagttacgcc 240
caaaagtttc aaggacgtgt cacgctgact aacgacacga gcactaacac cgtgtatatg 300
cagctgaaca gtttgacgag cgccgacaca gcagtttatt attgtgctcg ttgggcgctg 360
tggggggact tcggaatgga tgtgtggggc aaaggtactt tggtgaccgt tagcagcggg 420
ggaggaggtt ctggaggcgg cggatctggt ggaggggggt ccgacatcca aatgacacag 480
tctccgagta ccttgagtgc gtcaatcgga gatcgcgtca ccatcacgtg cagagcaagc 540
gagggcatat accactggct cgcatggtat caacaaaagc ctgggaaagc gccaaagctc 600
cttatataca aggcctcctc gctggcgtct ggggcgccca gtagattttc cggtagtgga 660
tccggtactg attttacgct taccatcagc agcttacagc cagacgattt cgctacttac 720
tattgtcagc agtactccaa ctacccactc acattcggag gaggtactaa gcttgaaatt 780
aaacgccagg tgcaactcca agaatcgggt ggagggcttg tccagccagg cggctcaatg 840
aaactttcct gtgttgctag cggtttcact ttttcgaatt actggatgaa ctgggtgcgc 900
cagtcgcctg aaaagggttt agaatgggtc gccgagatac ggctaaaaag taacaattat 960
gcgacacact acgcagaatc ggtcaaaggc cggtttacta tatcaaggga cgactctaaa 1020
agctcggtat acttacaaat gaacaactta cgtgcagagg atacaggcat ttattactgt 1080
acaggcgtcg gattcgcgta ctggggccag gggaccaccg taactgtcag cggaggaggt 1140
ggttctggag gggggggtag tggtggtggt ggttcagaca tcgtcgtcac ccaagaatcc 1200
gcactcacga ccagtccagg agaaaccgtt actctcactt gtagatcgtc tactggcgcg 1260
gtgacgacgt cgaattatgc gaactgggtt caggagaagc cggatcacct tttcacaggg 1320
ttaataggag gtacgaataa ccgtgccccc ggggttcccg cgagattcag cggatcattg 1380
ataggcgata aggctgcctt gacaatcacg ggagcccaga ctgaggacga agcaatatac 1440
ttctgcgcgt tgtggtacag caaccattgg gtgtttggag ggggaacgaa actgaccgta 1500
ctaggttccg agggtggcgg tggctctgac atcaaactgt ccggggctga gctagctaga 1560
ccaggtgcat ctgtcaagat gtcgtgtaaa acgagcggat acaccttcac ccgatataca 1620
atgcattggg taaaacagag acccggtcag ggtctagagt ggataggcta cataaacccg 1680
tccagagggt acacaaatta taatcagaag ttcaaagaca aagcgactct gacaacagat 1740
aaatcgagct ccaccgcgta tatgcagttg agtagcttaa catcggagga ctctgcagtc 1800
tactattgcg caagatacta cgacgatcat tactgtctgg actactgggg aggtaccacc 1860
ctgactgtct caagtggtgg cggggggtcg ggaggcggcg gttctggggg ggggggttct 1920
gacatcctta cttctcctgc tattatgtct gcctctccag gcgaaaaggt tactatgacg 1980
tgtagggcgt caagtagtgt tagttacatg aattggtatc aacaaaaatc aggcacatct 2040
cccaagcgct ggatttatga cacctcgaaa gtcgcgtccg gcgtcccgta tcggttctct 2100
ggcagcgggt cgggtactag ttacgtcagc atctgacttt ggccagcacc tgtcccgcgg 2160
atttgttcca gtccaactac agcgacccac cctaacagag atgaccaaca caaccaacgc 2220
ggccgccgct accggactta catctaccac aaatacaccc caagtttctg cctttgtcaa 2280
taactgggat aacttgggca tgtggtggtt ctccatagcg cttatgtttg tatgccttat 2340
tattatgtgg ctcatctgct gcctaaagcg caaacgcgcc cgaccaccca tctatagtcc 2400
catcattgtg ctacacccaa acaatgatgg aatccataga ttggacggac tgaaacacat 2460
gttcttttct cttacagtat gattaaatga gacatgattc ctcgagtttt tatattactg 2520
acccttgttg cgcttttttg tgcgtgctcc acattggctg cggtttctca catcgaagta 2580
gactgcattc cagccttcac agtctatttg ctttacggat ttgtcaccct cacgctcatc 2640
tgcagcctca tcactgtggt catcgccttt atccagtgca ttgactgggt ctgtgtgcgc 2700
tttgcatatc tcagacacca tccccagtac agggacagga ctatagctga gcttcttaga 2760
attctttaat tatgaaattt actgtgactt ttctgctgat tatttgcacc ctatctgcgt 2820
tttgttcccc gacctccaag cctcaaagac atatatcatg cagattcact cgtatatgga 2880
atattccaag ttgctacaat gaaaaaagcg atctttccga agcctggtta tatgcaatca 2940
tctctgttat ggtgttctgc agtaccatct tagccctagc tatatatccc taccttgaca 3000
ttggctggaa acgaatagat gccatgaacc acccaacttt ccccgcgccc gctatgcttc 3060
cactgcaaca agttgttgcc ggcggctttg tcccagccaa tcagcctcgc cccacttctc 3120
ccacccccac tgaaatcagc tactttaatc taacaggagg agatgactga caccctagat 3180
ctagaaatgg acggaattat tacagagcag cgcctgctag aaagacgcag ggcagcggcc 3240
gagcaacagc gcatgaatca agagctccaa gacatggtta acttgcacca gtgcaaaagg 3300
ggtatctttt gtctggtaaa gcaggccaaa gtcacctacg acagtaatac caccggacac 3360
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cccattacca taactcagca ctcggtagaa accgaaggct gcattcactc accttgtcaa 3480
ggacctgagg atctctgcac ccttattaag accctgtgcg gtctcaaaga tcttattccc 3540
tttaactaat aaaaaaaaat aataaagcat cacttactta aaatcagtta gcaaatttct 3600
gtccagttta ttcagcagca cctccttgcc ctcctcccag ctctggtatt gcagcttcct 3660
cctggctgca aactttctcc acaatctaaa tggaatgtca gtttcctcct gttcctgtcc 3720
atccgcaccc actatcttca tgttgttgca gatgaagcgc gcaagaccgt ctgaagatac 3780
cttcaacccc gtgtatccat atgacacgga aaccggtcct ccaactgtgc cttttcttac 3840
tcctcccttt gtatccccca atgggtttca agagagtccc cctggggtac tctctttgcg 3900
cctatccgaa cctctagtta cctccaatgg catgcttgcg ctcaaaatgg gcaacggcct 3960
ctctctggac gaggccggca accttacctc ccaaaatgta accactgtga gcccacctct 4020
caaaaaaacc aagtcaaaca taaacctgga aatatctgca cccctcacag ttacctcaga 4080
agccctaact gtggctgccg ccgcacctct aatggtcgcg ggcaacacac tcaccatgca 4140
atcacaggcc ccgctaaccg tgcacgactc caaacttagc attgccaccc aaggacccct 4200
cacagtgtca gaaggaaagc tagccctgca aacatcaggc cccctcacca ccaccgatag 4260
cagtaccctt actatcactg cctcaccccc tctaactact gccactggta gcttgggcat 4320
tgacttgaaa gagcccattt atacacaaaa tggaaaacta ggactaaagt acggggctcc 4380
tttgcatgta acagacgacc taaacacttt gaccgtagca actggtccag gtgtgactat 4440
taataatact tccttgcaaa ctaaagttac tggagccttg ggttttgatt cacaaggcaa 4500
tatgcaactt aatgtagcag gaggactaag gattgattct caaaacagac gccttatact 4560
tgatgttagt tatccgtttg atgctcaaaa ccaactaaat ctaagactag gacagggccc 4620
tctttttata aactcagccc acaacttgga tattaactac aacaaaggcc tttacttgtt 4680
tacagcttca aacaattcca aaaagcttga ggttaaccta agcactgcca aggggttgat 4740
gtttgacgct acagccatag ccattaatgc aggagatggg cttgaatttg gttcacctaa 4800
tgcaccaaac acaaatcccc tcaaaacaaa aattggccat ggcctagaat ttgattcaaa 4860
caaggctatg gttcctaaac taggaactgg ccttagtttt gacagcacag gtgccattac 4920
agtaggaaac aaaaataatg ataagctaac ccta 4954
<210> 9
<211> 4945
<212> DNA
<213> 腺病毒
<400> 9
atggactgga tctggagaat cttattcctt gtcggggctg ctaccggcgc acatatggcc 60
caggtccagc ttgttcaatc tggagctgaa gttaagagac cgggcgctag tgtgcaagta 120
tcctgccgag ccagcggata ctcgattaac acgtattaca tgcagtgggt tagacaggct 180
ccgggggcgg gactagaatg gatgggtgta ataaatccct caggggttac tagttacgcc 240
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cttatataca aggcctcctc gctggcgtct ggggcgccca gtagattttc cggtagtgga 660
tccggtactg attttacgct taccatcagc agcttacagc cagacgattt cgctacttac 720
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gctcatctgc tgcctaaagc gcaaacgcgc ccgaccaccc atctatagtc ccatcattgt 2400
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ctcagacacc atccccagta cagggacagg actatagctg agcttcttag aattctttaa 2760
ttatgaaatt tactgtgact tttctgctga ttatttgcac cctatctgcg ttttgttccc 2820
cgacctccaa gcctcaaaga catatatcat gcagattcac tcgtatatgg aatattccaa 2880
gttgctacaa tgaaaaaagc gatctttccg aagcctggtt atatgcaatc atctctgtta 2940
tggtgttctg cagtaccatc ttagccctag ctatatatcc ctaccttgac attggctgga 3000
aacgaataga tgccatgaac cacccaactt tccccgcgcc cgctatgctt ccactgcaac 3060
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ataactcagc actcggtaga aaccgaaggc tgcattcact caccttgtca aggacctgag 3480
gatctctgca cccttattaa gaccctgtgc ggtctcaaag atcttattcc ctttaactaa 3540
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attcagcagc acctccttgc cctcctccca gctctggtat tgcagcttcc tcctggctgc 3660
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cactatcttc atgttgttgc agatgaagcg cgcaagaccg tctgaagata ccttcaaccc 3780
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cgaggccggc aaccttacct cccaaaatgt aaccactgtg agcccacctc tcaaaaaaac 4020
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tgtggctgcc gccgcacctc taatggtcgc gggcaacaca ctcaccatgc aatcacaggc 4140
cccgctaacc gtgcacgact ccaaacttag cattgccacc caaggacccc tcacagtgtc 4200
agaaggaaag ctagccctgc aaacatcagg ccccctcacc accaccgata gcagtaccct 4260
tactatcact gcctcacccc ctctaactac tgccactggt agcttgggca ttgacttgaa 4320
agagcccatt tatacacaaa atggaaaact aggactaaag tacggggctc ctttgcatgt 4380
aacagacgac ctaaacactt tgaccgtagc aactggtcca ggtgtgacta ttaataatac 4440
ttccttgcaa actaaagtta ctggagcctt gggttttgat tcacaaggca atatgcaact 4500
taatgtagca ggaggactaa ggattgattc tcaaaacaga cgccttatac ttgatgttag 4560
ttatccgttt gatgctcaaa accaactaaa tctaagacta ggacagggcc ctctttttat 4620
aaactcagcc cacaacttgg atattaacta caacaaaggc ctttacttgt ttacagcttc 4680
aaacaattcc aaaaagcttg aggttaacct aagcactgcc aaggggttga tgtttgacgc 4740
tacagccata gccattaatg caggagatgg gcttgaattt ggttcaccta atgcaccaaa 4800
cacaaatccc ctcaaaacaa aaattggcca tggcctagaa tttgattcaa acaaggctat 4860
ggttcctaaa ctaggaactg gccttagttt tgacagcaca ggtgccatta cagtaggaaa 4920
caaaaataat gataagctaa cccta 4945

Claims (27)

1.溶瘤腺病毒(oncolytic adenoviral)载体，其包含
在E3区域中的核酸序列的缺失，和
编码双特异性单克隆抗体的核酸序列，替换E3区域中缺失的核酸序列，其中所述双特异性单克隆抗体包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。
2.根据权利要求1所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述腺病毒载体的主链是腺病毒血清型5(Ad5)或腺病毒血清型3(Ad3)核酸主链。
3.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体还包含用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子。
4.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体还包含在腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中E3区域中的核酸序列的缺失是病毒gp19k和6.7k阅读框(reading frame)的缺失。
6.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述载体包含：
1)用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子
2)腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)；
3)病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失；和
4)编码两分型分子(bipartite molecule)的核酸序列，替换如在3)点中定义的缺失的核酸序列，所述两分型分子包含对细胞表面分子特异的单链可变片段(scFv)和对肿瘤抗原特异的scFv。
7.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述主链是Ad5核酸主链，并且所述载体还包含Ad3纤维结(fiber knob)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述细胞表面分子在免疫效应细胞上。
9.根据权利要求8所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述效应细胞是T淋巴细胞。
10.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述肿瘤抗原选自表1或由间皮素(mesothelin)、EpCAM1和MUC1组成的组。
11.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述细胞表面分子选自CD3、CD8和CD4。
12.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述肿瘤抗原是间皮素并且所述细胞表面分子是CD3；所述肿瘤抗原为EpCAM1并且所述细胞表面分子是CD3；或所述肿瘤抗原是MUC1并且所述细胞表面分子是CD3。
13.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其中所述溶瘤腺病毒载体编码两个或更多个转基因。
14.根据前述权利要求中任一项所述的溶瘤腺病毒载体，其还包含IL-2、TNFalpha或CD40L转基因。
15.药物组合物，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的溶瘤腺病毒载体。
16.根据权利要求1-14中任一项的溶瘤腺病毒载体，其用于治疗癌症。
17.根据权利要求16中使用的溶瘤腺病毒载体，其与过继细胞治疗组合物(adoptivecell therapeutic composition)一起使用。
18.治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括将权利要求1-14中任一项的溶瘤腺病毒载体施用于受试者。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用过继细胞治疗组合物。
20.根据权利要求17或19所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述过继细胞治疗组合物包含选自下组的细胞类型：肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltratinglymphocyte)(TIL)、T细胞受体修饰的淋巴细胞(T-cell receptor modified lymphocyte)和嵌合抗原受体修饰的淋巴细胞(chimeric antigen receptor modified lymphocyte)。
21.根据权利要求17或19-20中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述过继细胞治疗组合物包含选自下组的细胞类型：T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK细胞、delta-gamma T细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞。
22.根据权利要求17或19-21中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述过继细胞治疗组合物包含T细胞。
23.根据权利要求16-22中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中所述癌症选自下组：鼻咽癌(nasopharyngeal cancer)、滑膜癌(synovial cancer)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、肾癌(renal cancer)、结缔组织癌(cancer of connectivetissues)、黑色素瘤(melanoma)、肺癌(lung cancer)、肠癌(bowel cancer)、结肠癌(coloncancer)、直肠癌(rectal cancer)、结直肠癌(colorectal cancer)、脑癌(brain cancer)、喉癌(throat cancer)、口腔癌(oral cancer)、肝癌(liver cancer)、骨癌(bone cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、胃泌素瘤(gastrinoma)、嗜铬细胞瘤(pheochromocytoma)、催乳素瘤(prolactinoma)、T细胞白血病/淋巴瘤(T-cellleukemia/lymphoma)、神经瘤(neuroma)、von Hippel-Lindau病(von Hippel-Lindaudisease)、佐林格-埃利森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌(renalcancer)、肛门癌(anal cancer)、胆管癌(bile duct cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、输尿管癌(ureter cancer)、脑癌(brain cancer)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、脑膜瘤(meningioma)、脊髓肿瘤(spinal cord tumor)、骨癌(bone cancer)、骨软骨瘤(osteochondroma)、软骨肉瘤(chondrosarcoma)、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、未知原发部位的癌症(cancer of unknown primary site)、类癌(carcinoid)、胃肠道类癌(carcinoid of gastrointestinal tract)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、乳腺癌(breast cancer)、佩吉特氏病(Paget's disease)、宫颈癌(cervical cancer)、结直肠癌(colorectal cancer)、直肠癌(rectal cancer)、食道癌(esophagus cancer)、胆囊癌(gall bladder cancer)、头癌(head cancer)、眼癌(eyecancer)、颈癌(neck cancer)、肾癌(kidney cancer)、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、肝癌(liver cancer)、卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)、前列腺癌(prostate cancer)、肺癌(lung cancer)、睾丸癌(testicular cancer)、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、口腔癌(oral cancer)、皮肤癌(skin cancer)、间皮瘤(mesothelioma)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)、卵巢癌(ovarian cancer)、内分泌胰腺癌(endocrine pancreatic cancer)、胰高血糖素瘤(glucagonoma)、胰腺癌(pancreaticcancer)、甲状旁腺癌(parathyroid cancer)、阴茎癌(penis cancer)、垂体癌(pituitarycancer)、软组织肉瘤(soft tissue sarcoma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、小肠癌(small intestine cancer)、胃癌(stomach cancer)、胸腺癌(thymus cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、滋养层癌(trophoblastic cancer)、葡萄胎(hydatidiform mole)、子宫癌(uterine cancer)、子宫内膜癌(endometrial cancer)、阴道癌(vagina cancer)、外阴癌(vulva cancer)、听神经瘤(acoustic neuroma)、蕈样真菌病(mycosis fungoides)、胰岛素瘤(insulinoma)、类癌综合征(carcinoid syndrome)、生长抑素瘤(somatostatinoma)、牙龈癌(gum cancer)、心脏癌(heart cancer)、唇癌(lip cancer)、脑膜癌(meninges cancer)、口腔癌(mouth cancer)、神经癌(nerve cancer)、腭癌(palatecancer)、腮腺癌(parotid gland cancer)、腹膜癌(peritoneum cancer)、咽癌(pharynxcancer)、胸膜癌(pleural cancer)、唾液腺癌(salivary gland cancer)、舌癌(tonguecancer)和扁桃体癌(tonsil cancer)。
24.根据权利要求16-23中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其中同时或以任何顺序连续地进行将溶瘤病毒载体和所述过继细胞治疗组合物施用于受试者。
25.根据权利要求16-24中任一项所述的方法或使用的溶瘤腺病毒载体，其还包括对受试者施用同时或序贯的放射疗法、单克隆抗体、化学疗法或其它抗癌药物或干预。
26.根据权利要求1-14中任一项的溶瘤腺病毒载体，其用于增加受试者中过继细胞疗法(adoptive cell therapy)的功效。
27.在受试者中增加过继细胞疗法的功效的方法，其通过向有此需要的受试者施用根据权利要求1-14中任一项所述的溶瘤腺病毒载体进行，其中已经或将要对所述受试者施用过继细胞疗法。
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