CN113924117A

CN113924117A - 溶瘤腺病毒和检查点抑制剂联合疗法

Info

Publication number: CN113924117A
Application number: CN202080039001.0A
Authority: CN
Inventors: 阿克塞·赫敏基; 艾诺·卡莱尔沃; 维克托·切尔韦拉-卡拉斯孔; 里卡·哈武宁; 若奥·维埃拉·卢伦科·多斯·桑托斯
Original assignee: Tilt Biotherapeutics Oy
Current assignee: Tilt Biotherapeutics Oy
Priority date: 2019-06-14
Filing date: 2020-06-12
Publication date: 2022-01-11
Also published as: US20220251604A1; BR112021025031A2; AU2020292610A1; WO2020249873A1; CA3138834A1; JP2022536929A; EP3983004A1; SG11202111820PA; KR20220024495A

Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的溶瘤病毒特别是溶瘤腺病毒和检查点抑制剂的联合疗法，特别地涉及包括(a)编码肿瘤坏死因子α(TNFα)和/或白介素‑2(IL‑2)作为转基因的溶瘤腺病毒载体以及(b)一种或多种免疫检查点抑制剂的组合用于治疗癌症的用途。

Description

溶瘤腺病毒和检查点抑制剂联合疗法

技术领域

本发明总体上涉及病毒学、免疫学和医学。在某些方面，本发明涉及用于治疗癌症的溶瘤病毒特别是溶瘤腺病毒和检查点抑制剂的联合疗法。

背景技术

检查点抑制剂(CPI)已经彻底改变了癌症疗法并验证了免疫治疗作为一种方法的可行性。不幸的是，只有少数患者有响应。一些患者仅在有限的时间内受益，而大多数患者没有可检测到的益处，特别是当它涉及常见类型的非黑素瘤实体瘤时。因此，CPI作为一种方法确实得到了验证，但由于只有少数患者受益，因此仍有未满足的临床需求。

这种未满足需求的一个实例是肾细胞癌(RCC)，对于肾细胞癌(RCC)，抗PD-1纳武利尤单抗(nivolumab)已被批准用于二线治疗。在随机的3期试验中，CPI组中确认的响应率为21.5％，而依维莫司(everolimus)(雷帕霉素(rapamycine)的哺乳动物靶标的抑制剂)组中为3.9％。中位总生存率(OS)分别为25.0和19.1个月。另一项临床试验将CPI(阿替利珠单抗(atezolizumab)，抗PD-L1)与抗VEGF(舒尼替尼(sunitinib))药物组合使用，将总响应率(ORR)提高至32％(抗PD-L1作为单一疗法为25％，以及舒尼替尼作为单一疗法为29％)²。RCC是先前被描述为“免疫原性”的肿瘤类型，并且一些患者对高剂量IL-2治疗有响应³，但大多数患者示出对免疫疗法没有响应。大多数肿瘤类型中都存在明显的改进空间，因为ORR仍然很低(黑素瘤40％⁴，尿路上皮癌21.1％⁵，非小细胞肺癌症19.4％⁶，肝细胞癌14.3％⁷等)。

WO2014170389涉及溶瘤腺病毒载体单独或连同治疗组合物用于癌症的治疗用途和治疗方法。在发展多年之后，目前开始将溶瘤病毒用作癌症治疗剂。尽管已经有涉及作用机制和影响病毒功效的因素的一些发现，但仍然需要确定决定对病毒疗法的总体响应的途径。在临床试验中，已证明溶瘤病毒具有良好的安全性和有前景的功效。然而，响应仍有改进的空间，特别是在具有显著转移负荷的患者中。与溶瘤病毒活性相关的途径的进一步表征可以揭示改进病毒疗法的功效的潜在靶标。

发明内容

本发明基于以下发现：将编码细胞因子TNFα和/或IL-2的溶瘤腺病毒以及免疫检查点抑制剂抗PD-L1或PD-1共同给药至临床相关的癌症模型，相对于单独给药任一剂，导致针对所治疗癌症的免疫活性的显著转变，并伴随高存活益处。因此，在几个实施方式中，本申请提供了用于在哺乳动物中治疗和/或预防癌症和/或建立转移和/或用于在哺乳动物中启动、增强或延长抗肿瘤响应的联合疗法，包括向哺乳动物共同给药(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂。

在某些方面，与单独的任一种治疗相比，将溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂共同给药至患有癌症的受试者提供了增强的且甚至协同的抗肿瘤免疫。

在其他相关方面，提供了用于优化、加强或延长检查点抑制剂的作用或者使检查点抑制剂的毒性或剂量或治疗次数能够降低的方法，包括向有此需要的哺乳动物给药(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂。

附图说明

图1.尽管T细胞浸润和抑制差异，但泌尿系统癌症患者来源的样品对溶瘤病毒疗法有响应。患者样品1是尿路上皮癌，患者样品2和3是透明细胞肾细胞癌。(A)对石蜡包埋的样品进行苏木精和伊红染色。(B)CD8免疫组织化学。(C)PD-L1免疫组织化学(D)组织培养物经离体治疗后的MTS生存力测定。示出了通过非配对t检验与Welch’s校正计算的7天的统计显著性(**p<0.01；***p<0.001)。示出了平均值的均值标准误差(SEM)。

图2.在7天的治疗中在细胞因子水平下对病毒疗法和检查点抑制剂治疗的响应。将来自三名个体患者来源的肿瘤组织培养物的表达值绘制在一起。(A)IFNg。(B)TNFα。(C)IL-2。(D)IFNb。(E)颗粒酶B。(F)CXCL10。(G)IL-6。(H)TGFb。(I)精氨酸酶。通过双因素方差分析(two-way ANOVA)计算统计显著性。(*p<0.05；**p<0.01)。示出了平均值的均值标准误差(SEM)。

图3.在第7天对病毒疗法和检查点抑制剂治疗的分组细胞因子响应的分析。将来自三名不同患者来源的肿瘤组织培养物的表达值绘制在一起。(A)免疫刺激细胞因子的倍数变化。(B)免疫抑制效应物的倍数变化。(C)总体抑制(包括IL-6、TGF-b和精氨酸酶)与总体刺激(包括IFNg、IFNb、颗粒酶B和CXCL10)。(D)免疫刺激细胞因子表达和肿瘤组织培养物生存力之间的皮尔逊r相关性。

图4.体内测试病毒疗法以实现检查点抑制疗法。(A)实验设计：患有B16.OVA肿瘤的66只动物在第0天开始治疗。在治疗后第7天(灰色虚线)处死其中的30只并收集肿瘤，同时使其余的活着用于生存率实验，进行更多轮治疗直至肿瘤完全消退或死亡(S：同时给药病毒和抗PD-L1，PB：初免和加强(prime and boost))。(B)总生存率(Kaplan-Meier，Logrank Mantel-Cox检验)。(C-G)个体肿瘤生长线。(*p<0.05；**p<0.01,***p<0.001)。

图5.表达单一细胞因子或两种细胞因子的腺病毒构建体的示意图。病毒骨架是人腺病毒血清型5，除了纤毛突起(fiber knob)来自血清型3。单和双转基因(TNFα、IL-2或TNFα和IL-2)均受病毒E3启动子的转录控制。在双转基因的情况下，IRES元件将两种细胞因子分开，导致每种细胞因子独立合成。将转基因置于E3区中，该区缺失gp19k和6.7k。E1A蛋白在恒定区2中缺失24个氨基酸(“D24”)，致使病毒E1A对于Rb结合存在缺陷。E1A表达受E2F启动子的调控。E1B/19k带有禁用缺失(disabling deletion)。

图6.对于抗PD-1难治性的体内模型的开发和验证。(A)实验设计：对17只小鼠皮下植入B16.OVA肿瘤。当这些肿瘤的最大直径达到4mm时，将它们分配至模拟(Mock)组(n＝7)或抗PD-1组(n＝10)。每三天给予0.1mg抗PD-1(或PBS)。当肿瘤进展超过10mm时，处死动物。(B)在它们开始治疗后具有小于10mm肿瘤的动物的百分比。(C)两组的个体肿瘤生长曲线。(Kaplan-Meier，Log rank Mantel-Cox检验；***p<0.001)。

图7.比较治疗初始进展的肿瘤和在抗PD-1疗法后进展的肿瘤的基因表达水平。当认为这些肿瘤是抗PD-1难治性时，处死如图6中所述治疗的动物并收获肿瘤。提取RNA并比较两组的表达谱。(A)样品的热图(Heatmap)和无监督聚类。(B)治疗初始和抗PD-1治疗的肿瘤之间表达水平比较的火山图(Volcano plot)。(C)免疫相关的显著调控基因。(如果倍数变化≤-2或≥2，q值≤0.001，则考虑基因调控的差异)。

图8.使用工程化腺病毒能够在抗PD-1难治性肿瘤中触发肿瘤生长控制。(A)实验设计：对29只小鼠皮下植入B16.OVA肿瘤。当这些肿瘤的最大直径达到4mm时，它们开始每三天腹腔内接受0.1mg的抗PD-1。当肿瘤进展超过8mm时，将动物分配到组，其中将动物用相同的aPD-1方式治疗(n＝8)，用每三天一次瘤内(注射)1x10⁸个病毒颗粒(vp)治疗(n＝8)，或两者(n＝8)。治疗持续直至观察到完全响应或达到处死标准。(B)癌症特异性生存率。(C)各组的个体肿瘤生长曲线。(Kaplan-Meier，Log rank Mantel-Cox检验；***p<0.001)。

图9.生成肿瘤样品并分析以研究治疗的作用机制。(A)实验设计：将携带B16.OVA肿瘤的27只小鼠用aPD-1治疗，直至它们对药物产生难治性，如先前所述。随后，将这些动物分配到组，其中将动物用相同的aPD-1方案治疗(n＝9)，用每三天一次瘤内(注射)1x10⁸个病毒颗粒(vp)治疗(n＝9)，或两者(n＝9)。在认为它们是难治性的之后在第0、1、3和6天给予四轮治疗，并在第7天处死以收集肿瘤。(B)在第0天(当认定它们为难治性时)和第7天(当收获肿瘤时)的平均肿瘤体积(和SEM)。(C)在通过CyTOF分析肿瘤并随后通过FLOWSOM处理数据后的热图，提供了免疫(CD45+)细胞的64个不同的细胞簇。(Mann Whitney检验；****p<0.0001)。

图10.在质谱流式细胞术(mass cytometry)和聚类分析后评估的病毒疗法后关键免疫群体的变化。从CD45+部分无偏的细胞簇生成，呈现与细胞类型或表型相关的多个簇。使用Mann-Whitney检验比较实验组中这些簇的相对百分比。指示了识别簇同一性的关键标志物。(A)簇25。(B)簇41。(C)簇10。(D)簇17。(E)簇6。(F)簇14。(G)簇36。(H)簇5。(I)簇39。(J)簇58。(K)簇32。(L)簇55。

图11.武装有IL-2和TNFα的腺病毒与抗PD-L1的联合改进了弱(MOC2)免疫原性小鼠口腔癌模型中的肿瘤生长控制和生存率。(A)个体肿瘤体积归一化至第0天；样品组：PBS对照(PBS)、用抗PD-L1抗体治疗(aPD-L1)、用病毒Ad5-CMV-IL2+Ad5-CMV-TNFα治疗(病毒)以及用抗PD-L1抗体和病毒Ad5-CMV-IL2+Ad5-CMV-TNFα联合治疗(aPD-L1+病毒)。(B)平均归一化肿瘤体积示出到第30天改进的肿瘤生长控制。(C)总生存率曲线，包括每组的中位生存期。通过混合效应分析与Tukey’s后检验计算肿瘤生长曲线统计(*p<0.05，***p<0.001)。肿瘤体积数据表示为平均值+SEM(平均值的标准误差)。

图12.不限患者来源的卵巢癌样品的组织学，TILT-123和抗PD-L1疗法协同快速杀死肿瘤细胞。在用每细胞100个病毒颗粒(vp)Ad5/3-E2F-D24-TNFa-IRES-IL2(TILT-123)、或20ug/ml的抗PD-L1(aPD-L1)、或两者、或介质(溶媒)离体治疗卵巢癌肿瘤组织培养物后进行MTS生存力测定。OVCA P1为卵巢低级别浆液性癌(IVB期)，OVCA P2为卵巢高级别浆液性癌(IIIC期)，OVCA P3为卵巢透明细胞癌(IVB期)。示出了通过非配对t检验与Welch’s校正计算的1天的统计显著性(**p<0.01；***p<0.001)。所有数据表示为平均值+SEM(平均值的标准误差)。

图13.TILT-123诱导杀死来源于对aPD-1疗法有抗性的患者的肿瘤细胞。在用每细胞100个病毒颗粒(vp)Ad5/3-E2F-D24-TNFa-IRES-IL2(TILT-123)、或Ad5/3-E2F-D24、或介质(无病毒)离体治疗卵巢癌肿瘤组织培养物后进行MTS生存力测定。SCCHN P1为来自抗PD-1疗法难治性头颈部鳞状细胞癌患者的脑转移瘤。示出了通过非配对t检验与Welch’s校正计算的7天的统计显著性(*p<0.05；**p<0.01)。所有数据表示为平均值+SEM(平均值的标准误差)。

具体实施方式

当如下文实验部分中所述一起使用编码细胞因子TNFα和/或IL-2诸如TILT-123(Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2)和CPI的溶瘤腺病毒载体时，观察到向免疫活性(干扰素γ，即IFNg和颗粒酶B)的显著转变和增加的T细胞运输(trafficking)信号(CXCL10)。由于该病毒带有TNFα和IL-2转基因，因此这些细胞因子水平在肿瘤微环境中也有所增加。在体内，我们的病毒使抗PD-L1(CPI)能够达到100％完全响应(相对于单独的抗PD-L1的风险比为0.057[0.007；0.451])或相对于单独的病毒疗法的风险比为0.067[0.011；0.415])，比对照组显著更高(p<0.01)。该组还示出活性CD8 T细胞的显著增加。因此已经发现，使用编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和选择性结合PD-L1的检查点抑制剂的联合疗法导致癌症治疗的出乎意料的改进。当同时或依次给药时，溶瘤病毒和检查点抑制剂合作以及甚至协同相互作用，以相对于单独给药任一组分显著提高生存率，而没有明显的有害作用或病毒滴度的降低。这种出乎意料的效果可以使每种组分的有效剂量降低，导致副作用降低并增强化合物和治疗的临床有效性。

在进一步的实验中(以下实施例2)，示出编码TNFα和IL-2的溶瘤腺病毒连同抗PD-1抗体对CPI难治性肿瘤有效。

在几个实施方式中，提供了用于在哺乳动物中治疗癌症和/或转移的建立的组合疗法，包括向哺乳动物共同给药(i)编码TNFα和/或IL-2的溶瘤腺病毒载体与(ii)免疫检查点抑制剂的组合。在优选的实施方式中，所述检查点抑制剂选择性地结合PD-L1或PD-1。在优选的实施方式中，所述溶瘤腺病毒载体与免疫检查点抑制剂同时或依次给药。

溶瘤病毒

在优选的实施方式中，组合中的溶瘤病毒是溶瘤腺病毒。

如本文所用，“溶瘤腺病毒载体”是指相比于正常细胞，能够通过在肿瘤中选择性复制而感染和杀死癌细胞的腺病毒载体。WO2014170389公开了可用于本发明的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体。

载体可以以本领域已知的任何方式进行修饰，例如通过缺失、插入、突变或修饰任何病毒区域。载体在复制方面具有肿瘤特异性。例如，腺病毒载体可以包括E1、E3和/或E4中的修饰，诸如肿瘤特异性启动子(例如以驱动E1)的插入、区域(例如，如以“D24”使用的E1的恒定区2、E3/gp19k、E3/6.7k)的缺失和转基因的插入。此外，可以修饰载体的纤毛突起(fiber knob)区域。在本发明的一种实施方式中，腺病毒载体是包括Ad5核酸骨架和Ad3纤毛突起或Ad5/3嵌合纤毛突起的Ad5/3。

如本文所用，表达“腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架”是指Ad5的基因组。

“Ad5/3载体”是指具有Ad5和Ad3载体两者的部分的嵌合载体。在本发明的特定实施方式中，载体的衣壳修饰是Ad5/3嵌合体。如本文所用，“Ad5/3嵌合纤毛突起”是指嵌合体，其中，纤毛的突起部分来自Ad血清型3，并且纤毛的其余部分来自Ad血清型5。特别地，在一种实施方式中，构建体具有来自Ad3的纤毛突起，而基因组的剩余部分来自Ad5(SEQ IDNO:5)。

生成肿瘤特异性溶瘤腺病毒的一种方法是工程化影响E1的恒定区2(CR2)的24个碱基对缺失(D24)(SEQ ID NO:4)。在野生型腺病毒中，CR2负责结合细胞Rb肿瘤抑制因子/细胞周期调控子蛋白以诱导合成(S)阶段即DNA合成或复制阶段。Rb和E1A之间的相互作用需要E1A蛋白保守区的8个氨基酸(121至127)，这些氨基酸在本发明中缺失。本发明的载体包括对应于根据Heise C.等人(2000,Nature Med 6,1134-1139)的载体的氨基酸122-129的核苷酸的缺失。已知具有D24的病毒克服G1-S检查点的能力降低，并且仅在不是必须需要此种相互作用的细胞中才有效复制，例如在Rb-p16途径缺陷的肿瘤细胞中，其包括大多数(如果不是全部)人肿瘤。

也可以例如通过肿瘤特异性启动子来替换E1A内源性病毒启动子。在本发明的特定实施方式中，利用hTERT启动子替代E1A内源性病毒启动子。

在特定实施方式中，通常已知支持腺病毒载体复制的E1B 19K基因(SEQ ID NO:1)在本载体中具有禁止性(disabling)缺失dE1B19K(SEQ ID NO：2)。已知E1B 19K的缺失会使癌细胞对TNFα敏感，并因此促进细胞凋亡(7)。

野生型E1B 19K基因的序列如下(可缺失区域加下划线)：

因此，在实施方式中，在本病毒载体中dE1B 19K的序列为

E3区对于体外病毒复制是非必需的，但E3蛋白在调控宿主免疫应答，即抑制先天性和特异性免疫应答两者中具有重要作用。E3中的gp19k/6.7K缺失是指从腺病毒E3A区中缺失965个碱基对。在得到的腺病毒构建体中，缺失gp19k和6.7K基因两者(Kanerva A etal.2005,Gene Therapy 12,87-94)。已知gp19k基因产物结合并螯合内质网中的主要组织相容性复合体I(MHC1，在人中称为HLA1)分子，并且防止细胞毒性T-淋巴细胞识别感染的细胞。由于许多肿瘤缺乏HLA1/MHC1，gp19k的缺失增加了病毒的肿瘤选择性(病毒从正常细胞中被清除的速度比野生型病毒快，但在肿瘤细胞中没有差异)。6.7K蛋白在细胞表面表达，并且它们参与下调TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体2。

这两种缺失都提供了优势。为了重获HLA/MHC的表达以呈递肿瘤表位例如至过继转移的T细胞，gp19k蛋白的表达会适得其反，并且事实上，HLA/MHC的上调需要gp19k的缺失。关于6.7k，由于本发明的实施方式是从病毒产生TNFα，并且其抗肿瘤活性之一是直接抗肿瘤促凋亡作用(对转导和未转导的旁观者细胞(bystander cell)两者)，6.7k的存在会适得其反。

在本发明的一种实施方式中，将一个或多个细胞因子转基因置于E3启动子下的gp19k/6.7k缺失的E3区中。这将转基因表达限制在允许病毒复制和随后激活E3启动子的肿瘤细胞中。E3启动子可以是本领域已知的任何外源性(例如CMV或E2F启动子，SEQ ID NO：3)或内源性启动子，特别是内源性E3启动子。尽管E3启动子主要通过复制被激活，但当表达E1时会发生一些表达。由于D24型病毒的选择性发生在E1表达后(当E1不能结合Rb时)，这些病毒确实也在转导的正常细胞中表达E1。因此，调控E1表达以限制E3启动子介导的转基因表达对肿瘤细胞是至关重要的。

在本发明的另一实施方式中，E3 gp19k/6.7k保留在载体中，但已经缺失一个或多个其他E3区域(例如E3 9-kDa、E3 10.2kDa、E3 15.2kDa和/或E3 15.3kDa)。

在本发明的特定实施方式中，溶瘤腺病毒载体基于腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架，包括5/3嵌合纤毛突起，并且包括以下：用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子，腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)，病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失，具有转基因插入到缺失的区中，导致在病毒E3启动子下对转基因表达的复制相关的控制，以及编码至少一种细胞因子转基因的核酸序列替代E3区中缺失的腺病毒基因gp19k/6.7K。在本发明的一种实施方式中，腺病毒载体基于人腺病毒。

腺病毒3中早期区(E3)蛋白的确切功能尚不清楚。通常在腺病毒中，当缺失时它们似乎不会损害复制，并且它们似乎会影响对腺病毒的抗病毒宿主响应。在人中发现的六种(A-F)腺病毒中，人腺病毒基因组的E3包含最高水平的遗传多样性。这种遗传内容的多样性主要位于高度保守的E3-gp19K和E3-RIDα开放阅读框(ORF)之间，在其中物种特异性基因阵列被编码。

通过E3-gp19K调节细胞毒性T细胞介导的对病毒感染细胞的杀伤。这是通过阻断MHC I类向质膜的转运，并抑制TAP-MHC I类复合物形成来实现的。

因此，在本发明的一个方面中，重要分子E3-gp19K包括在腺病毒载体中，以使病毒复制更隐蔽，并使更多时间能用于溶瘤作用及其有益作用。此外，保留E3-gp19K可以降低抗腺病毒细胞毒性T细胞的诱导，从而产生更多的抗肿瘤T细胞。

细胞因子通过经由包括向肿瘤募集T细胞的各种机制作用来参与免疫应答。编码细胞因子转基因的核苷酸序列可以来自任何动物，诸如人、猿、大鼠、小鼠、仓鼠、狗或猫，但特别地，它由人序列编码。编码转基因的核苷酸序列可以被修饰以改进其作用，或未经修饰，即为野生型。

本发明的特定实施方式包括编码至少一种细胞因子的病毒载体。在本发明的特定实施方式中，细胞因子为IL-2或TNFα，优选地病毒载体编码这两种细胞因子。在本发明的一种实施方式中，病毒载体编码IL-2和/或TNFα以及其他细胞因子，优选地选自由以下组成的组：干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7和XCL2。

细胞因子TNFα(肿瘤坏死因子α)通过吸引和激活T细胞以及降低肿瘤免疫抑制来发挥功能，而IL-2(白细胞介素-2)诱导T细胞移植物的增殖。因此，IL-2在需要其的肿瘤处局部产生，而不是像T细胞疗法中通常进行的那样全身注射，这可能会引起副作用，并因此通过本实施方式可以防止现有技术疗法的主要问题(即全身IL-2的毒性)。

由溶瘤病毒的复制提供的危险信号传导，和由病毒DNA对病原体相关分子模式识别受体的激活，连同一种或多种转基因的作用，可以将肿瘤免疫抑制降低到可以省略预处理疗法的程度。因此，可以避免现有技术中的主要问题——由于预处理化疗和放疗产生的毒性。

在本发明的一种实施方式中，病毒载体包括两个转基因之间的内部核糖体进入位点(IRES)或任选的核糖体分流位点(ribosome shunt site)2A。因此，IRES或核糖体分流位点2A可以位于任何细胞因子之间，诸如IL-2和任何其他细胞因子，优选地选自上文列出的细胞因子组。如本文所用，“IRES”是指能够在蛋白质合成中启动信使RNA序列中间的翻译的核苷酸序列。IRES可以来自任何病毒，但在本发明的一种实施方式中，IRES来自脑心肌炎病毒(EMCV)。如本文所用，“核糖体分流位点2A”是指在其中核糖体物理绕过部分5'非翻译区以到达起始密码子的翻译起始位点。IRES和A2两者都能使病毒从一个启动子(E3启动子)产生两个转基因。

WO2014170389中公开了编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体的详细结构的实例。另参见图5。

总之，利用包括至少一种细胞因子转基因的病毒载体的本发明的主要优点是：i)细胞因子和病毒本身引起将T细胞和其他免疫细胞募集至肿瘤的危险信号，ii)细胞因子诱导在肿瘤和在局部淋巴器官两者处的T细胞增殖，iii)细胞因子和病毒本身能够诱导T细胞(过继T细胞移植物和天然固有的抗肿瘤T细胞两者)在肿瘤处增殖；iv)细胞因子和/或病毒诱导癌细胞上抗原呈递分子(HLA)的上调，使其对T细胞的识别和杀伤敏感，以及v)细胞因子和病毒复制通过降低免疫抑制和细胞失能有利地改变肿瘤微环境。

本发明中使用的病毒载体还可以包括除上述以外的其他修饰。可以任选地使用任何额外的组分或修饰，但对于本发明不是强制性的。

外源性元件的插入可以增强载体在靶细胞中的作用。外源性组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组载体中是常见的，并且它们也可以用于本发明中。

总之，本发明揭示了溶瘤病毒的复制可以在肿瘤处募集T细胞并诱导危险信号，从而降低免疫抑制和细胞失能。这些作用通过病原体相关分子模式识别受体介导，这是一种用于诱导免疫的进化上保守的机制，并且不受耐受性的影响。本发明还揭示了溶瘤平台的附加益处，能够在肿瘤中但不能在正常细胞中复制，其是在肿瘤处的自我扩增。另外，溶瘤作用本身可增加人的整体抗肿瘤作用。

检查点抑制剂

免疫检查点蛋白与特异性配体相互作用，这些配体向T细胞中发送抑制T细胞功能的信号。癌细胞通过驱动其表面上检查点蛋白的高水平表达来利用这一点，从而抑制抗癌免疫应答。

如本文所述的检查点抑制剂(也称为CPI)是能够抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能的降低以及完全阻断。尤其，免疫检查点蛋白是人检查点蛋白。因此，免疫检查点抑制剂优选为人免疫检查点的抑制剂。

检查点蛋白包括但不限于CTLA-4、PD-1(及其配体PD-L1和PD-L2)、B7-H3、B7-H4、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT和/或IDO。涉及LAG3、BTLA、B7-H3、B7-H4、TIM3和KIR的途径在本领域中公认构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径。免疫检查点抑制剂可以是以下的抑制剂：CTLA-4、PD-1(及其配体PD-L1和PD-L2)、B7-H3、B7-H4、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT和/或IDO。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是PD-L1或PD-1的抑制剂。

在一些实施方式中，组合的检查点抑制剂是抗体。如本文所用，术语“抗体”涵盖能够结合例如靶标免疫检查点或表位的天然存在的抗体和工程化抗体以及全长抗体或功能片段或其类似物(例如保留抗原结合部分)。根据本文描述的方法使用的抗体可以来自以下任何来源：包括但不限于人、人源化、动物或嵌合体，并且可以是偏好IgG1或IgG4同种型的任何同种型，并且进一步可以是糖基化的或非糖基化的。术语抗体还包括双特异性或多特异性抗体，只要抗体表现出本文所述的结合特异性。优选地，免疫检查点抑制剂是选择性结合PD-L1的单克隆抗体，更优选地选自由以下组成的组：BMS-936559、LY3300054、阿替利珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和阿维鲁单抗(avelumab)。US 7521051、US 8008449和US 8354509中描述了结合人PD-1的单克隆抗体的实例。在治疗方法中可用作PD-1拮抗剂的特异性抗人PD-1mAb包括：帕博利珠单抗(MK-3475)、纳武利尤单抗(BMS-936558)和人源化抗体h409A11、h409A16和h409A17，其描述于WO20081567中。

人源化抗体是指非人(例如小鼠、大鼠等)抗体，其蛋白序列已被修饰以增加与人抗体的相似性。嵌合抗体是指包括一个物种的一个或多个元件以及另一物种的一个或多个元件的抗体，例如包括人免疫球蛋白的恒定区(Fc)的至少一部分的非人抗体。

可以工程化多种形式的抗体用于本发明的组合中，其代表性实例包括Fab片段(由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段)，F(ab')2片段(包括通过在铰链区的至少一个二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)，Fd片段(由VH和CHI结构域组成)，Fv片段(由抗体单臂的VL和VH结构域组成)，dAb片段(由单个可变结构域片段(VH或VL结构域)组成)，单链Fv(scFv)，其包括融合在一起的Fv片段的两个结构域VL和VH，最终与接头一起形成单蛋白质链。

在一些实施方式中，联合疗法的检查点抑制剂(也称为CPI)是特异性结合免疫检查点蛋白PD-L1或PD-1的抗体或其片段。在特别优选的实施方式中，免疫检查点抑制剂是能够至少部分拮抗PD-L1或PD-1的单克隆抗体、全人抗体、嵌合抗体、人源化抗体或其片段。

癌症

本发明的重组载体在肿瘤细胞中具有复制能力。在本发明的一种实施方式中，载体在具有Rb-途径缺陷特别是Rb-p16途径缺陷的细胞中具有复制能力。这些缺陷细胞包括动物和人中的所有肿瘤细胞。如本文所用，“Rb途径缺陷”是指在该途径的任何基因或蛋白中的突变和/或表观遗传变化。由于这些缺陷，肿瘤细胞过表达E2F，并因此通常有效复制所需的E1A CR2与Rb的结合是不必要的。进一步的选择性是由E2F启动子介导的，它仅在存在游离E2F时激活，如在Rb/p16途径缺陷细胞中所见。在不存在游离E2F时，不会发生E1A的转录且病毒不会复制。包括E2F启动子对于阻止正常组织中E1A的表达是重要的，E1A可以通过允许从E3启动子的转基因表达直接和间接地引起毒性。

本发明涉及用于治疗受试者中癌症的方法。在本发明的一种实施方式中，受试者是人或哺乳动物，特别是哺乳动物或人患者，更特别是患有癌症的人或哺乳动物。

该方法可用于治疗任何癌症或肿瘤，包括恶性和良性肿瘤，原发肿瘤和转移瘤都可以是该方法的靶标。在本发明的一种实施方式中，癌症的特点是肿瘤浸润淋巴细胞。本发明的工具对于治疗以肿瘤浸润淋巴细胞为特点的转移性实体瘤是特别有吸引力的。在另一实施方式中，T细胞移植物已经被嵌合抗原受体的肿瘤或组织特异性T细胞受体修饰。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指向受试者，优选哺乳动物或人受试者，给药至少溶瘤腺病毒载体和选择性结合PD-L1的检查点抑制剂，其目的不仅包括完全治愈还包括预防、改善或减轻与癌症或肿瘤相关的疾患或症状。可以通过监测患者的症状、血液中的肿瘤标志物或例如肿瘤的大小或患者的生存时间来评估治疗作用。

在本发明的另一实施方式中，癌症或肿瘤选自由以下组成的组：鼻咽癌、滑膜癌、肝细胞癌、肾癌、结缔组织癌、黑素瘤、肺癌、肠癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、脑癌、喉癌、口腔癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、冯希佩尔-林道综合征(von Hippel-Lindau disease)、佐林格-埃利森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、输尿管癌、脑癌、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌、佩吉特病(Paget'sdisease)、宫颈癌、结直肠癌、直肠癌、食管癌、胆囊癌、头颈癌、眼癌、肾脏癌、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、肝癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、前列腺癌、肺癌、睾丸癌、霍奇金病(Hodgkin'sdisease)、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌、皮肤癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌、内分泌胰腺癌、胰高血糖素瘤、胰腺癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、垂体癌、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞癌(trophoblastic cancer)、葡萄胎、子宫癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、听神经瘤、蕈样肉芽肿、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌、心脏癌、唇癌、脑膜癌、口癌、神经癌、腭癌(palate cancer)、腮腺癌、腹膜癌、咽癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌和扁桃体癌。优选地，治疗的癌症或肿瘤选自由以下组成的组：肾癌、卵巢癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、结直肠癌、肺癌(诸如小细胞肺癌、非小细胞肺癌和鳞状非小细胞肺癌)、胃癌、经典霍奇金淋巴瘤、间皮瘤和肝癌。在更优选的实施方式中，癌症或肿瘤类型是头颈癌，最优选人头颈癌。

在将人或动物患者分类为适用于本发明的疗法之前，临床医师可以检查患者。基于偏离正常并揭示肿瘤或癌症的结果，临床医师可以建议对患者进行本发明的治疗。

在本发明的实施方式中，受试者或患者之前已经失败过至少一次化学疗法或免疫疗法治疗，诸如CPI治疗，即患者的癌症是检查点抑制剂(CPI)难治性肿瘤。在优选的实施方式中，本发明涉及CPI难治性肿瘤的治疗。不希望受到理论的束缚，本实验结果示出介导CD8+T细胞活性并因此与免疫活性相关的基因，诸如T细胞前体GZMG和GMZF的基因、与其他细胞类型相互作用相关的T细胞蛋白如KLRC2的基因、免疫组分诸如组分CD46的基因、以及尤其是T细胞活性调控子诸如TNFSF18/GITRL和EAR2的基因，相对于对CPI治疗原始的细胞在CPI难治性癌细胞中被下调，并因此基因表达的这种变化可反映难治性表型。因此，在实施方式中，本发明涉及能够介导或引起CD8+T细胞功能障碍和/或无活性的CPI难治性癌症的治疗。

药物组合物

本发明的药物组合物包括本发明病毒载体的至少一种类型。优选地，本发明提供了包含(a)溶瘤病毒与(b)检查点抑制剂组合的药物组合物。本发明还提供了用于治疗癌症的所述药物组合。此外，组合物可以包括至少两种、三种或四种不同的载体。除了载体和检查点抑制剂之外，药物组合物还可以包括其他治疗有效的剂，任何其他剂诸如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、防腐剂、抗菌剂(antiseptics)、填充剂、稳定剂和/或增稠剂和/或相应产品中常见的任何组分。用于配制组合物的合适成分和适当制造方法的选择属于本领域技术人员的一般知识。

药物组合物可以是适用于给药的任何形式，诸如固体、半固体或液体形式。制剂可以选自但不限于由以下组成的组：溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊剂。本发明的组合物不限于某种制剂，而是可以将组合物配制成任何已知的药学上可接受的制剂。药物组合物可以通过本领域已知的任何常规过程来生产。

本发明的药物试剂盒包括编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体以及选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂。将编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体配制在第一制剂中，并将选择性结合PD-L1或PD-1的所述一种或多种免疫检查点抑制剂配制在第二制剂中。在本发明的另一实施方式中，将第一和第二制剂用于向受试者以任何顺序同时或依次给药。在另一实施方式中，所述试剂盒用于癌症或肿瘤的治疗。

给药

本发明的载体或药物组合物可以向任何哺乳动物受试者给药。在本发明的特定实施方式中，受试者是人。哺乳动物可选自由宠物、家畜和生产动物组成的组。

可以使用任何常规方法向受试者给药载体或组合物。给药途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤位置、患者、并存病和其他因素。因此，组合中每种治疗剂的剂量的量和给药频率部分取决于特定治疗剂、所治疗癌症的严重性和患者特征。优选地，剂量方案使递送至患者的每种治疗剂的量最大化，与可接受的副作用水平一致。在优选的实施方式中，以约2mg/kg至50mg/kg、更优选约2mg/kg至25mg/kg的量给药检查点抑制剂。

在本发明的一种实施方式中，向受试者单独给药(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂是以任何顺序同时或相继进行的。这意指(a)和(b)可以以单个单位剂型提供，用于一起或作为单独的实体(例如在单独的容器中)同时给药或以一定的时间差给药。该时间差可以在1小时至1周之间，优选在12小时至3天之间，更优选最长达24或48小时。在优选的实施方式中，在检查点抑制剂的第一次给药之前进行腺病毒载体的第一次给药。另外，可以经由检查点抑制剂以外的其他给药方式给药病毒。在这方面，瘤内和其他全身或口服给药病毒或检查点抑制剂可能是有利的。在特别优选的实施方式中，瘤内给药病毒，并且静脉内给药检查点抑制剂。优选地，将病毒和检查点抑制剂作为单独的化合物给药。也可以用这两种剂联合治疗。

如本文所用，“单独给药”或“单独”是指以下的情况，其中(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂是彼此不同的两种不同产品或组合物。

(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂的仅一次组合给药可能具有治疗作用。取决于例如患者以及癌症的类型、程度或位置，给药之间可以存在任何一段时间。在本发明的一种实施方式中，在相继给药(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂之间存在1分钟至4周，特别地1至10天，更特别地1至5天，最特别地最长达24或48小时的一段时间，和/或存在多次给药(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂。(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂的给药次数的数目在治疗时期期间也可以是不同的。可以在前2周、4周、每月或在治疗时期期间给药溶瘤腺病毒载体或检查点抑制剂例如1至10次。在本发明的一种实施方式中，在前2周，然后4周，并且然后每月进行三至七次载体或任何组合物的给药。在本发明的特定实施方式中，在前2周，然后4周，并且然后每月进行四次给药。在另一特定的实施方式中，在前四周期间实施三次腺病毒载体的给药(在一种实施方式中，第一剂是静脉内施用，第二和第三剂是瘤内施用)并且实施一次或两次检查点抑制剂的给药，然后每月一次给药病毒载体和检查点抑制剂两者。治疗时期的长度可以变化，并且例如可以持续2至12个月或更长。

在本发明的特定实施方式中，(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)优选地选择性结合PD-L1或PD-1的一种或多种免疫检查点抑制剂在同一天给药，并且此后在可能持续例如1至6或12个月或更长的治疗时期期间，每周、每两周、每三周或每月给药溶瘤腺病毒载体。

在本发明的一种实施方式中，通过瘤内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜内注射，或口服给药进行溶瘤病毒的给药。给药的任何组合也是可以的。尽管局部注射，但该方法仍可以提供全身功效。可以静脉内或瘤内给药检查点抑制剂。在一种实施方式中，通过瘤内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜内注射，或口服给药进行检查点抑制剂的给药。

载体的有效剂量至少取决于需要该治疗的受试者、肿瘤类型和肿瘤位置以及肿瘤阶段。剂量可以变化，例如从约1x10⁸个病毒颗粒(VP)至约1x10¹⁴VP，特别地从约5x10⁹VP至约1x10¹³VP，以及更特别地从约3x10⁹VP至约2x10¹²VP。在一种实施方式中，以1x10¹⁰-1x10¹⁴个病毒颗粒的量给药编码至少一种细胞因子的溶瘤腺病毒载体。在本发明的另一实施方式中，剂量在约5x10¹⁰-5x10¹¹VP的范围内。

除了本发明的疗法之外，可以使用任何其他治疗或治疗的组合。在特定的实施方式中，本发明的方法或用途进一步包括向受试者给予并行或依次的放射疗法、化学疗法、抗血管生成剂或靶向疗法诸如烷化剂、核苷类似物、细胞骨架修饰剂、细胞生长抑制剂(cytostatic agent)、单克隆抗体、激酶抑制剂或其他抗癌药物或干预(包括外科手术)。

如本文所用，术语“治疗”或“增加”以及源自其的词语不一定意味着100％或完全治疗或增加。而是，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗作用的不同程度。

其他实施方式

本发明还涉及编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体和(b)一种或多种免疫检查点抑制剂用于治疗癌症或肿瘤的用途。优选地，人癌症或肿瘤。

在整个说明书中引用的“一种实施方式”或“实施方式”意为结合实施方式描述的特定特征、结构或特点包括在本发明的至少一种实施方式中。因此，在整个说明书的各个段落中出现的短语“在一种实施方式中”或“在实施方式中”的表述并不必然全指代同一实施方式。在使用诸如例如约或基本上的术语来引用数值的情况下，还公开了准确的数值。

动词“包含”和“包括”在本文件中用作开放式限制，既不排除也不要求还存在未列举的特征。除非另有明确说明，否则从属权利要求中记载的特征可以相互自由组合。此外，应当理解，贯穿本文件使用“一个(a)”或“一种(an)”，即单数形式并不排除复数形式。

对于本领域技术人员显而易见的是，随着技术的进步，可以以各种方式实施本发明构思。本发明及其实施方式不限于以下描述的实例，而是可以在权利要求的范围内变化。

表1所附序列表中列出的序列。

SEQ ID NO：	名称
		1	E1B 19K
2	dE1B 19K
		3	E2F
4	D24
		5	5/3突起修饰

实施例部分

实施例1

材料和方法

来自泌尿系统肿瘤样品的人肿瘤组织培养物

从手术切除的肾中收集泌尿系统样品，并按照先前描述的方法论将其转化为单细胞悬浮液(9)。用每细胞100个病毒颗粒(vp)Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2、20μg/mL抗人PD-L1(阿替利珠单抗，Roche)或二者一式三份治疗单细胞培养物。在1、3和7天后评估细胞因子产生和细胞生存力。

组织病理学分析

对患者样品进行苏木精和伊红(H&E)和CD8(克隆4B11、CD8-4B11-L-CE-H、Novocastra)染色，并由经训练的病理学家分析。对于PD-L1表达评估，PD-L1 VENTANA(Sp142)测定(Roche)由经训练的病理学家进行。如前所述，由兽医病理学家对小鼠样品实施组织病理学分析(10)。

细胞生存力测定

治疗人肿瘤组织培养物(如前所述)长达7天。按照制造商的说明，用Cell Titer96AQueous One Solution细胞增殖测定(Promega，G3582)评估细胞生存力。将模拟治疗的细胞的生存力设置为100％。

体内实验

为了研究治疗诱导的肿瘤变化，将2.5x 10⁵B16.OVA黑素瘤细胞皮下植入4-6周大的雌性C57BL/6JOlaHsd小鼠(Envigo Labs)。植入后十一天，将动物随机分组(n＝12-14/组)。然后他们在第0、1、3和6天接受0.1mg抗PD-L1(克隆10F.9G2,BE0101,BioXCell)的全身治疗和1x10⁸vp(包括等量的Ad5-CMV-mIL2和Ad5-CMV-mTNFa病毒，在小鼠中非复制)的瘤内注射。对于未接受病毒的组，瘤内注射PBS。在第7天，每组处死6只动物并收集肿瘤以研究免疫细胞表型和细胞因子特征。其余动物(n＝6-8/组)继续进行90天的OS研究，其中，每三天一次继续治疗，直到达到最大肿瘤尺寸(18mm)或肿瘤完全消退。

细胞系和病毒

在推荐条件下培养B16.OVA小鼠黑素瘤细胞系(8)。细胞因子武装的小鼠腺病毒(Ad5-CMV-mIL2和Ad5-CMV-mTNFa)的构建和生产先前已经进行了描述(12)，并被用于体内实验。对于人肿瘤组织培养物实验，使用溶瘤Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2(称为TILT-123)(11)。

细胞因子分析

在1、3和7天后收集来自肿瘤组织培养物的细胞培养基上清液。细胞因子分析的样品大小受限于肿瘤样品的可用性(模拟；n＝4，aPD-L1；n＝6，病毒；n＝3，病毒+aPD-L1(S)；n＝2，病毒+aPD-L1(PB)；n＝0)。用定制的Legendplex panel(Biolegend)和游离活性/总TGF-b1检测试剂盒(740488、740486和740487，Biolegend)评估样品中的细胞因子水平(IFNg、TNFa、IL-2、IFNb、颗粒酶B、CXCL10、IL-6、精氨酸酶和TGF-b1)。将流式珠阵列(Cytometric Bead Array)小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(560485,BD)用于研究小鼠肿瘤样品，如前所述(8)。使用

(BD)分析两种细胞因子珠阵列。将获得的细胞因子值归一化为样品的总蛋白质浓度。

PD-L1/2表达测定

在研究PD-L1表达动力学时，用1000U/mL的小鼠IFNg(315-05,Peprotech)——PD-L1表达的已知诱导物治疗B16.OVA细胞。模拟对照细胞未经治疗。培养24小时后，检查部分细胞的PD-L1表达，并且将其余细胞用PBS洗涤两次并移至一式二份的12孔板。先前用IFNg治疗的部分细胞停止接受治疗(“撤回”组)，并且另一部分继续治疗(“IFNg保持”组)。在铺板后24h和72h分析板。

类似地，IFNg(1000U/mL)、TNFa(1000U/mL和10000U/mL)、IL-2(1000U/mL和10000U/mL)、Ad5-luc(1和100vp/细胞)、Ad5-CMV-mIL2(1和100vp/细胞)、Ad5-CMV-mTNFa(1和100vp/细胞)或者这些的不同组合对B16.OVA细胞上PD-L1和PD-L2表达的作用。在24和72小时的时间点研究这些表达水平。

流式细胞术

如别处所述处理和标记细胞培养物和肿瘤样品(8)。将抗-CD4-FITC(克隆GK1.5,100406,Biolegend)、抗-CD3e-PE(克隆145-2C11,12-0031-82,eBioscience)、抗-CD69-PE-Dazzle(克隆H1.2F3,104536,Biolegend)、抗-CD8-PE-Cy5(克隆53.6-7,100710,Biolegend)、抗-PD-1-PE-Cy-7(克隆29F.1A12,135216,Biolegend)、抗-CD45-FITC(克隆30-F11,103107,Biolegend)、抗-PD-L2-PE(克隆MIH5,558091,BD)、抗-Gr-1-PE-Dazzle(RB6-8C5,108452,Biolegend)、抗-CD11b-PE-Cy5(M1/70,101210,Biolegend)、抗-PD-L1-PE-Cy7(TY-25,107214,Biolegend)在制造商的指示下用于流式细胞分析。用SH800Z细胞仪(SONY)进行分析。

统计分析

通过用SPSS Statistics 25(IBM)对对数变换的肿瘤体积的混合模型分析来研究肿瘤生长演变。将GraphPad软件用于呈现数据，以分析OS(Kaplan-Meier,Log rankMantel-Cox检验)、危险比(HR)和95％置信区间(CI)。另外，将GraphPad用于评价组之间在细胞计数或细胞因子分析(非配对t-检验与Welch’s校正)、变量间相关性分析(皮尔逊相关系数r)、变量随时间的演变(双因素方差分析)和线性回归方面的差异。使用部分肿瘤体积(fractional tumor volume，FTV)方法计算协同。P值<0.05被认为具有统计显着性。

结果

患者来源泌尿系统肿瘤组织培养物中溶瘤腺病毒介导的肿瘤细胞裂解

为了理解溶瘤病毒疗法如何能够对实体瘤中的检查点抑制剂产生响应，在病理分析后研究了手术切除的组织。如苏木精和伊红染色评价的，这些肿瘤为病理分级3(患者样品2)或4(患者样品1和3)(图1A)。由于病毒递送货物(cargo)的主要作用之一影响CD8+T细胞，因此也对其存在进行了评估(图1B)，示出了具有免疫豁免(“冷”)表型的两个样品(患者样品1和2)和具有免疫炎症(“热”)表型的一个样品(患者样品3)。另外，与抗PD-L1靶向相关，还进行了确定PD-L1阳性的测定。这示出所有样品中免疫细胞的PD-L1表达低于5％，根据测试指南使它们呈阴性(图1C)。

样品处理后，进行生存力测定以测量治疗如何影响肿瘤组织培养物的生存率(图1D)。到第7天，当与模拟或抗PD-L1单一疗法相比时，病毒疗法在所有三个样品中均实现了肿瘤生存力的统计学显著降低(p<0.01)。在那时，病毒治疗组的生存力与模拟相比下降了62％(95％CI＝[54.19；69.89])，以及当与抗PD-L1治疗的样品相比时下降了56％(95％CI＝[38.49；73.39])。当一起给予病毒和抗PD-L1时，在第1天，两个样品的细胞生存力已经显著降低。

溶瘤病毒疗法在人泌尿系统肿瘤组织培养物中触发广泛的免疫刺激应答

我们还研究了组织培养物的治疗对细胞因子水平的影响(图2)。由于在实际患者肿瘤中通常存在的异质性，样品之间的细胞因子水平各不相同。尽管如此，接受病毒疗法的组显示出免疫刺激性细胞因子(IFNg、TNFα、IL-2、颗粒酶B和CXCL10)表达增加的明显趋势(图2A-F)。关于IFNg，与“模拟”(p＝0.0182)和单独的“抗PD-L1”组相比，当将Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2连同抗PD-L1一起给药时，获得了增加的产量(p＝0.0181)。单独的“病毒”组具有相似的趋势(p＝0.068)。病毒治疗组的TNFa和IL-2产量也增加了，并且在当单独分析样品时差异显著。另一方面，IFNb产量并没有像其他免疫刺激细胞因子那样明显受到影响，除了用双重治疗在第3天的产量峰值外。

颗粒酶B和CXCL10在病毒治疗组中具有更高的表达值。这两种细胞因子的表达与IFNg表达相关(IFNg/颗粒酶B：r＝0.629[0.376；0.792]，p<0.001。IFNg/CXCL10：r＝0.494[0.198；0.708]，p＝0.002)。当与“模拟”(p＝0.003)和与“抗PD-L1”相比时，“病毒”组的CXCL10表达显著增加(p＝0.002)。与“模拟”组相比，单独用aPD-L1治疗不影响免疫刺激细胞因子的表达。

关于免疫抑制中介物(IL-6、TGF-b和精氨酸酶)，治疗的作用不如对于刺激性物质(图2A-F)的明显。然而，在三分之二的样品中，当与“模拟”或“病毒”相比时，“抗PD-L1”组和“病毒+抗PD-L1”实现了IL-6的统计学显著降低。“病毒+抗PD-L1”组的所有样品都实现了TGF-b显著降低，而“抗PD-L1”组仅在一个样品中观察到了这种情况。尽管精氨酸酶不是细胞因子，而是影响免疫活性的酶，但它也被包括在系列中。对于该酶，当与“模拟”或“病毒”相比时，一个样品在“抗PD-L1”组和“病毒+抗PD-L1”中表现出降低的表达。

治疗诱导的免疫刺激细胞因子产生与实体瘤样品中生存力的降低有关

为了比较第7天肿瘤组织培养物中细胞因子和精氨酸酶的差异表达，并排绘制了与“模拟”相比的平均倍数变化(图3A和B)。在分析的六种刺激细胞因子中，TNFα和IL-2表达的增加可能至少部分与转基因的病毒表达有关，并且无法与内源性产生相区分。值得注意的是，TNFα表达增加了超过1000倍，IL-2增加了约100倍。关于IFNg，与模拟条件相比，病毒治疗组显示出超过100倍增加。有趣的是，向病毒治疗中添加抗PD-L1导致的表达是当与单独病毒相比时的10倍高(是“模拟”的1000倍高)。此外，病毒治疗诱导CXCL10水平平均增加25倍。

治疗对于IL-6、TGF-b和精氨酸酶的表达水平具有不那么强烈的作用(图3B)。抗PD-L1疗法似乎降低了IL-6和TGF-b的量，而只有当病毒和检查点抑制剂两者一起给予时，精氨酸酶表达才会降低。为了比较治疗对内源性产生的免疫抑制因子和免疫刺激因子的作用，将IL-6、TGF-b和精氨酸酶的平均值对比IFNg、IFNb、颗粒酶B和CXCL10的平均值作图(图3C)。两种治疗一起使用会诱导通过检查点抑制剂递送的免疫抑制和经由病毒疗法的免疫刺激的减少。在免疫刺激细胞因子的产生与肿瘤组织培养物细胞生存力之间观察到成反比的相关性(r＝-0.716[-0.914；-0.241],p＝0.009)。在细胞生存力与免疫抑制细胞因子之间未发现相关性。

表达TNFα和IL-2的腺病毒使体内抗PD-L1疗法实现100％的完全应答率

接下来，我们旨在评估由病毒触发的免疫刺激和由抗PD-L1获得的降低的抑制是否在体内是可重现的。另外，我们想研究肿瘤免疫重塑在抗肿瘤功效方面的作用(图4A)。为了理解治疗之间的相互作用，用病毒和检查点抑制剂，但用不同的给药方案治疗两个组；一组同时接受两者的治疗(S)，而另一组仅在两轮病毒治疗后才接受检查点抑制剂，以“初免和加强”的方式(PB)。

接受病毒和抗PD-L1一起的两组在生存率方面表现出更好的结果(图4B)。特别是，当将病毒(瘤内)与抗PD-L1(腹腔内)同时给药时，获得了100％的完全应答率。“病毒+aPD-L1”组比任何其他组具有显著更长的生存率(针对“模拟”p<0.001，针对“aPD-L1”p＝0.007，针对“病毒”p＝0.005，以及针对“病毒+aPD-L1(PB)”p＝0.025)。“病毒+aPD-L1”策略的风险比优于任何其他研究组(针对“模拟”HR＝0.033[0.006；0.181]，针对“aPD-L1”HR＝0.057[0.007；0.451]，针对“病毒”HR＝0.067[0.011；0.415]，以及针对“病毒+aPD-L1(PB)HR＝0.104[0.014；0.752])。

与模拟相比，“初免和加强”方法导致显著更长的总生存率(OS)(p<0.001)和更低的风险比(HR)(0.059[0.012；0.290])。病毒疗法或检查点抑制剂单一疗法导致大约33％的完全应答。与模拟相比，单独用病毒疗法的OS在统计学上有所改进(p＝0.016)，具有更低的HR(0.180[0.044；0.727])。还绘制了个体肿瘤体积图(图4C)，并早在第5天就在双重疗法后观察到了协同效应。在治疗开始后的第90天，已经历完全应答的一些动物在肿瘤周围区域具有瘢痕组织。处死动物后，将瘢痕收集并由病理学家分析，病理学家报告存在噬黑素细胞、浆细胞和淋巴细胞，但不存在恶性肿瘤细胞。

讨论

在此项研究中，我们示出了编码TNFα和IL-2的病毒平台如何对免疫肿瘤微环境具有相当大的影响，该病毒平台在抗PD-L1检查点抑制的情况下导致更高的应答。在人泌尿系统临床样品组织培养物(肾细胞癌和尿路上皮癌)和体内均观察到类似的结果，从而导致改进的肿瘤生长控制和生存率。值得注意的是，两种单一疗法都具有积极的作用。当它们一起使用时，在肿瘤控制方面协同很明显。

在患者中，完全应答非常罕见，部分应答更为常见，但即使综合起来，在大多数实体瘤类型中单一疗法后用CPI的ORR在10-40％之间。然而，已经注意到TIL存在(1,2)和上调的炎性细胞因子特征(3-5)是其中最强的预测因素(6)。在这方面，可能很重要的是，所研究的病毒平台能够使“冷”肿瘤变“热”，以实现有效的CPI疗法，以提高应答率和生存率。

实施例2

材料和方法

体内实验

在开始时在4-6周龄的C57BL/6OlaHsd雌性小鼠中实施体内实验(购自EnvigoLabs，亨廷顿，英国)。将2.5x 10⁵B16.OVA黑素瘤细胞系皮下植入左下腹，并然后检查较长直径为至少4mm的可触知肿瘤的存在。当满足最小肿瘤尺寸标准时，将动物随机分为不同的治疗组。每天测量肿瘤体积并评估总体健康。立即安乐死具有开放性伤口(即注射部位溃疡)的动物。最大允许肿瘤体积为18mm，在此之后立即安乐死动物。将没有可观察到的肿瘤的动物在它们接受第一次治疗后保持存活至少90天，以确保没有肿瘤复发。

抗体和病毒

为每个特定实验提供了治疗图表。抗PD-1抗体(aPD-1)治疗由全身(腹腔内)递送的抗体组成，剂量为0.1mg(克隆10F.9G2,BE0101,BioXCell,Lebanon，新罕布什尔，美国)稀释于PBS中。病毒疗法治疗由1x 10⁸个病毒颗粒组成(包括等量的Ad5-CMV-mIL2和Ad5-CMV-mTNFa病毒，在小鼠中非复制)。

转录物组分析

将从体内实验中收获的肿瘤稳定在RNAlater(R0901,Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里，美国)中并在-20℃储存。按照RNeasy(74104，Qiagen，希尔登，德国)试剂盒制造商的指南，从那些肿瘤样品中纯化RNA，并在用分光光度计(Biophotometer，埃普多夫，韦斯特伯里，纽约，美国)进行测量后调整浓度。将RNA样品的测序外包给BGI Tech Solutions(TaiPo，香港)，他们也以单盲方式进行数据清理和定量分析。

CyTOF

将从体内实验中收获的肿瘤加工成单细胞悬浮液并储存在冷冻介质(包括10％二甲基亚砜)中，直到它们被染色以进行质谱流式细胞术分析。

统计分析

GraphPad Prism 8(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)分析工具用于进行Kaplan-Meier生存率曲线上的Log rank Mantel-Cox检验和Mann-Whitney检验，以及生成数据的图形表示的一种方法。SPSS Statistics 25(IBM，阿蒙克，纽约，美国)是用于基于如前所述的肿瘤直径的日常测量分析肿瘤生长演变的软件⁸。p值低于0.05称为具有统计显著性。

结果

B16.OVA肿瘤模型对于抗PD-1有应答但未获得长期应答

为了研究对aPD-1的抗性机制，选择了B16.OVA，一种对抑制性抗体表现出限制性应答的模型⁸。为了理解是否存在对药物抗性的内在原因，或者肿瘤在药物提供的生存压力后是否适应，采用了肿瘤生长标准(图6)。从这个意义上说，将首次肿瘤最大直径达到至少4mm的动物随机分配到“模拟”或“aPD-1”组。在那之后，“aPD-1”组中的动物每三天一次全身接受PD-1抑制抗体治疗(总计至少5轮)。每天测量所有动物的肿瘤，直到当最大直径为至少10mm的时刻。安乐死具有肿瘤超过该阈值的动物并收集肿瘤用于进一步分析。

虽然在治疗时期开始时和在安乐死时肿瘤的尺寸相同，但它们达到第二阈值的时间显著不同(p＝0.0008)(图6B)。该治疗在肿瘤生长控制中具有显著(p＝0.0002)益处，并且用抗PD-1治疗的动物的十分之一在第30天显示出明显的完全应答。即使治疗减缓了肿瘤进展，但90％的肿瘤最终会复发并达到第二阈值(图6C)。

这些结果证实了PD-1阻断后抗肿瘤功效的存在，但也证实了缺乏长期应答。

停止对抗PD-1应答的肿瘤示出与对治疗原始的肿瘤相比不同的基因表达谱

如图6中所述收集肿瘤，随后处理并提取RNA。进行了总RNA测序并量化了每个样品的基因表达水平。对于该分析，随机选择了属于“模拟”组的四个样品和来自“aPD-1”组的六个样品。清理数据后，将样品排列在热图(图7A)中，并基于样品之间的相似性进行聚类。这种方法以合理的准确度将来自两组的样品分开分组。组之间表达谱的比较暴露了357个基因差异上调或下调(图7B)。在这些基因中，它们中的19个具有明显的免疫性质(图7C)。

在具有已确定功能的下调的免疫相关基因中，它们中的75％可以与T细胞关联。这些基因包括T细胞前体(GZMG和GMZF)、T细胞活性调控子(TNFSF18[又称GITRL]和EAR2)以及与其他细胞类型(KLRC2)和免疫组分诸如补体(CD46)相互作用相关的其他T细胞蛋白。除了T细胞外，其他淋巴细胞群也会在较小程度上受到下调的影响，诸如NK细胞或B细胞。

关于上调基因，B细胞区室是基因数量较多的群体(CD19、CD20、CR2、MMP8和LY6D)，其次是中性粒细胞(NGP、MMP8和CXCL3)。补体相关基因在上调的基因(C1 S2和CR2)中也很明显。与在aPD-1难治性肿瘤中下调的大量T细胞相关基因相反，唯一与此细胞群明显相关的上调基因是FOXP3。

在aPD-1难治性肿瘤中差异表达的基因的整个列表中，存在可观察到的趋势表明T细胞活性的抑制。其他细胞群也受到影响，但结果并不明确。

使用T细胞赋能的病毒疗法使抗PD-1难治性肿瘤对抗PD-1产生应答

为了研究解决aPD-1难治性肿瘤中存在的T细胞下调是否可以导致对疗法的更好应答，腺病毒编码靶向抗肿瘤T细胞活性的两种细胞因子(TNFα和IL-2)。类似地，如图6A中所述，用aPD-1(“初期治疗”)治疗携带皮下肿瘤的动物，直到认为它们是药物难治性的为止。在达到难治性状态后，将动物随机分为“aPD-1”组，其中动物继续接受aPD-1；“病毒”组，其中动物仅接受病毒疗法；或“aPD-1+病毒”组，其中动物接受aPD-1和额外的病毒疗法(“挽救治疗”)。如图8A所述，治疗持续直至伦理上允许的最大肿瘤体积(18mm)或明显的完全应答(在该区域中无视觉可见的病变)。

当研究在那些达到难治性阈值后的肿瘤特异性生存率时(图8B)，其示出T细胞赋能的病毒疗法可以如何显著(p＝0.0009)提高生存率，并且甚至触发50％动物的完全应答。当将单独的病毒疗法与作为单一疗法的aPD-1相比时，生存率没有显著改进，但使用上文提及的病毒获得了一些完全应答。从个体肿瘤生长曲线的分析中可以得出类似的结论(图8C)。

另外，生存率和肿瘤生长数据两者均作为对先前假设的肿瘤的aPD-1难治性状态的验证，因为在此实验中，“aPD-1”组中的动物在达到难治性阈值后继续接受抗体而没有任何额外的益处。

研究了用病毒疗法治疗的aPD-1难治性肿瘤样品，以理解该疗法对免疫细胞的影响

为了生成进行用于肿瘤的免疫表型的研究的样品，遵循如图8A中类似的实验设计，尽管在这种情况下，在获得难治性状态后给予的“挽救治疗”将进行7天(图9A)。之后，收集并处理肿瘤用于分析。即使接受“挽救治疗”的肿瘤是相似的，但到第7天，当比较来自接受病毒疗法与aPD-1治疗的组的动物时，肿瘤体积存在统计学上显著的降低(p<0.001)(图9B)。

将在第7天收集的那些肿瘤用于研究对aPD-1的重新出现的应答是否与在肿瘤微环境中存在的免疫区室的重塑有关联。从这个意义上说，使用28种细胞标志物对样品进行了质谱流式细胞术分析。随后，通过对细胞的CD45+部分使用FlowSOM算法识别了64个细胞簇。然后将那些簇表示在热图(图9C)中，以进一步识别它们所代表的细胞类型和表型。

病毒疗法连同抗PD-1重塑抗PD-1难治性肿瘤中的免疫微环境有利于抗肿瘤应答

单独研究由质谱流式细胞术产生的细胞簇，以确定最可能的细胞类型和表型。图10中示出了与特异性细胞群关联最清楚的那些簇。

在所有64个细胞簇中，它们中29个具有基于CD45、CD3e和TCRb共表达的T细胞表型。在这些T细胞簇中，22个是CD8+(CD4-)，而它们中的4个是CD4+(CD8-)。此外，一个簇(编号4)是CD3e+TCRb+CD8+CD4+，以及另外两个(簇42和43)是CD3e+TCRb+CD8-CD4-。仅在CD8 T细胞簇中观察到显著变化，但在CD4、双阳性或双阴性T细胞簇中未观察到显著变化(图10A-H)。总体而言，当接受aPD-1和病毒疗法两者时，肿瘤中14种不同的CD8 T细胞亚群显著增加。可以观察到在双重疗法后如何出现具有与迁移至发炎部位相关联的表型的更多T细胞(基于CCR2标志物)。不仅有更多的T细胞的运输，而且还增加了广泛的T细胞存在，不仅包括效应物/记忆增殖性CD8 T细胞(基于CD44和Ki-67标志物)、活性和增殖细胞(基于Ki-67和TIM-3标志物)，而且还包括初始T细胞(基于CD44标志物)。虽然aPD-1和病毒疗法的同时使用始终显示出在肿瘤中改进的CD8 T细胞分布，但单独的病毒疗法并不能提供相同程度的功效。

关于相关的髓细胞群，当在治疗中加入病毒疗法时，肿瘤中的M2巨噬细胞和MDSC会减少。虽然对于提及的组合在M1巨噬细胞或树突状细胞中没有观察到显著的变化，但当将病毒疗法与aPD-1作为单一疗法比较时，树突状细胞减少了。

讨论

虽然aPD-1难治性肿瘤中没有一个示出对aPD-1作为单一疗法的应答迹象，但包括具有编码TNFα和IL-2(除了aPD-1)的病毒的病毒疗法触发了明确的肿瘤生长控制，并且甚至显示出完全应答。这些完全应答是引人注目的，因为抵抗这些肿瘤的挑战不仅来自于难治性状态，而且还因为肿瘤体积是用检查点抑制剂初期治疗的肿瘤的约8倍高。更高的初始肿瘤体积涵盖更强的免疫和代谢抑制状态。有趣的是，生存率结果连同对肿瘤样品的生物学分析表明，病毒疗法不是采用不同作用机制来驱动绕过aPD-1抗性的抗肿瘤应答，而是能够解决肿瘤的抑制状态，使它们对PD-1阻断敏感。

实施例3

体内实验

为了研究病毒疗法和检查点抑制在小鼠头颈癌模型中的抗肿瘤功效，将1x10⁵MOC2小鼠口腔癌细胞皮下植入4-6周龄雌性C57BL/6JOlaHsd小鼠(Envigo Labs)。植入后二十天，将动物随机分组(n＝7-8/组)。然后它们每3天(从第0天开始)接受0.1mg抗PD-L1(克隆10F.9G2,BE0101，BioXCell)的全身治疗，并且在第0、1、3、6、9、12、15和18天接受1x 10⁸个病毒颗粒(vp)(包括等量的Ad5-CMV-mIL2和Ad5-CMV-mTNFa病毒，在小鼠中非复制)的瘤内注射。对于未接受病毒的组，瘤内注射PBS。跟踪肿瘤生长直至第30天。跟踪动物生存率直至第90天，其中，每三天一次持续抗PD-L1治疗，直到达到最大肿瘤尺寸(18mm)或肿瘤完全消退。

细胞系和病毒

在推荐条件下培养小鼠口腔鳞状细胞癌细胞系MOC2。细胞因子武装的小鼠腺病毒(Ad5-CMV-mIL2和Ad5-CMV-mTNFa)构建和生产先前已经进行了描述(12)，并被用于体内实验。

统计分析

GraphPad Prism 8(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)分析工具用于进行Kaplan-Meier生存率曲线上的Log rank Mantel-Cox检验和Mann-Whitney检验，以及生成数据的图形表示的一种方法。SPSS Statistics 25(IBM，阿蒙克，纽约，美国)是用于基于如前所述的肿瘤直径的日常测量分析肿瘤生长演变的软件(8)。p值低于0.05称为具有统计显著性。

结果

病毒疗法和抗PD-L1疗法在小鼠头颈癌模型中呈现最佳抗肿瘤功效和生存率

编码TNFa和IL-2的腺病毒与抗PD-L1的治疗协同作用不仅限于黑素瘤。事实上，我们在30天期间跟踪了该组合在小鼠口腔癌模型中的抗肿瘤作用。如预期，个体肿瘤生长曲线示出肿瘤内注射PBS几乎不影响肿瘤体积(图11A)。抗PD-L1(aPD-L1)或Ad5-CMV-mIL2+Ad5-CMV-mTNFa(病毒)的给药为荷瘤小鼠提供了一些额外的治疗益处，有趣的是，aPD-L1随着时间提供了更长的肿瘤体积控制(图11A)。值得注意的是，与任何其他测试的疗法相比，病毒和aPD-L1实现了更少的复发和更长的肿瘤生长控制(图11A)。这显然使联合疗法能够提供比对照或单剂疗法显著更好的抗肿瘤功效(图11B)。重要的是，接受病毒和抗PD-L1的小鼠生存最长，并且比PBS或单剂治疗的小鼠具有更好的生存率(图11C)。

讨论

总体而言，这些结果示出了编码TNFa和IL-2的腺病毒以及抗PD-L1抑制的组合的协同作用，在除黑素瘤之外的其他体内肿瘤模型中提供了令人惊讶且有效的治疗活性。

实施例4

材料和方法

来自卵巢癌样品的人肿瘤组织培养物

按照之前描述的方法论(9)，从经受外科手术的患者中收集卵巢癌样品，转化为单细胞悬浮液，并在包含10％DMSO的冷冻介质中冷冻至-140℃。解冻后，将3.5x10⁵个细胞接种于96孔板中，并用每细胞100个病毒颗粒(vp)Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2、20μg/mL的抗人PD-L1(阿维鲁单抗，Evidentic)或二者一式四份治疗。

细胞生存力测定

治疗人肿瘤组织培养物(如前所述)长达7天。按照制造商的说明，用Cell Titer96AQueous One Solution细胞增殖测定(Promega，G3582)在第1、5和7天评估细胞生存力。将模拟处理的细胞的生存力设置为100％。

病毒

对于人肿瘤组织培养物实验，使用溶瘤Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2(称为TILT-123)(11)。

组织病理学

切除后，对患者来源的卵巢癌组织进行组织病理学分析。由妇科病理学家确认肿瘤组织学。

统计分析

GraphPad Prism 8(GraphPad Software，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)分析工具用于进行未配对t检验与Welch’s校正，以及生成数据的图形表示的一种方法。p值低于0.05称为具有统计显著性。

结果

TILT-123和抗PD-L1疗法的联合使用能够在患者来源的卵巢癌肿瘤组织培养物中快速有效地杀死肿瘤细胞

在从患者来源的卵巢癌样品建立的肿瘤组织培养物中，我们还使用Ad5/3-E2F-D24-TNFa-IRES-IL-2(TILT-123)和抗PD-L1(aPD-L1)测试了联合治疗。这些实验使我们能够在临床相关的肿瘤模型中验证我们的联合策略，同时考虑到人癌症的组织学异质性。在治疗已建立的卵巢癌肿瘤组织培养物(包含肿瘤和免疫细胞)后，我们观察到联合治疗能够比载体和/或单剂治疗更快地杀死肿瘤细胞，如第1天所示(图12)。值得注意的是，在此实验中存在组织学的三种不同类型，即OVCA P1卵巢低级别浆液性癌(IVB期)、OVCA P2卵巢高级别浆液性癌(IIIC期)和OVCA P3卵巢透明细胞癌(IVB期)。

讨论

总体而言，这些结果示出TILT-123连同其他抗PD-L1抑制剂(阿维鲁单抗)并且还在其他适应症诸如卵巢癌中对于促进有效抗肿瘤功效的令人惊讶的能力。重要的是，此治疗作用与组织来源的组织学无关。

实施例5

材料和方法

来自抗PD-1疗法难治性头颈部鳞状细胞癌患者的脑转移瘤的人肿瘤组织培养物

按照之前描述的方法论(9)，从经受手术的抗PD-1疗法难治性头颈部鳞状细胞癌患者收集脑转移瘤样品，将其转化为单细胞悬浮液。将3.5x10⁵个细胞新鲜接种在96孔板中，并用每细胞100个病毒颗粒(vp)Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2或Ad5/3-E2F-d24或介质(无病毒)一式三份治疗。

细胞生存力测定

治疗人肿瘤组织培养物(如前所述)长达7天。按照制造商的说明，用Cell Titer96AQueous One Solution细胞增殖测定(Promega，G3582)在第3、5和7天评估细胞生存力。将模拟处理的细胞的生存力设置为100％。

病毒

对于人肿瘤组织培养物实验，使用溶瘤Ad5/3-E2F-d24-hTNFa-IRES-hIL2(称为TILT-123)或溶瘤Ad5/3-E2F-D24(11)。

组织病理学

在经受切除术之前，已确认患者患有舌底3级原发性肿瘤。由病理学家确认肿瘤组织学。

统计分析

结果

单剂TILT-123诱导杀死来自抗PD-1疗法难治性患者的脑转移瘤细胞

在抗PD-1疗法难治性头颈部鳞状细胞癌的情况下，TILT-123的抗肿瘤活性是中等的(图13)。值得注意的是，与无病毒对照相比，到第7天TILT-123能够显著降低组织培养物的肿瘤细胞含量(图13)。

讨论

总体而言，这些数据示出，单剂TILT-123的抗肿瘤活性很高，但在来自抗PD-1疗法难治性患者的肿瘤细胞中是有限的。后者强调了需要联合TILT-123与检查点抑制剂，以在这样的肿瘤类型中获得改进的治疗功效。

参考文献

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引用专利文件：

WO2014170389。

序列表

<110> 蒂尔坦生物制药有限公司(Tilt Biotherapeutics Oy)

<120> 溶瘤腺病毒和检查点抑制剂联合疗法

<130> PPI21172328FI

<150> US 62/861339

<151> 2019-06-14

<150> US 62/988422

<151> 2020-03-12

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 531

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 1

atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc 60

tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt ctgtggggct catcccaggc aaagttagtc 120

tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag 180

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<213> 腺病毒

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<210> 3

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<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 3

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ccgaagaaat ggccgccagt cttttggacc agctgatcga agaggtactg gctgataatc 420

ttccacctcc tagccatttt gaaccaccta cccttcacga actgtatgat ttagacgtga 480

cggcccccga agatcccaac gaggaggcgg tttcgcagat ttttcccgac tctgtaatgt 540

tggcggtgca ggaagggatt gacttactca cttttccgcc ggcgcccggt tctccggagc 600

cgcctcacct ttcccggcag cccgagcagc cggagcagag agccttgggt ccggtttcta 660

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<210> 4

<211> 27458

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 4

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gtggagcacc ccgggcacgg ttgcaggtct tgtcattatc accggaggaa tacgggggac 120

ccagatatta tgtgttcgct ttgctatatg aggacctgtg gcatgtttgt ctacagtaag 180

tgaaaattat gggcagtggg tgatagagtg gtgggtttgg tgtggtaatt ttttttttaa 240

tttttacagt tttgtggttt aaagaatttt gtattgtgat ttttttaaaa ggtcctgtgt 300

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gtacggatag ctgtgactcc ggtccttcta acacacctcc tgagatacac ccggtggtcc 480

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gtcattcaaa acaatgacta cagcccgggg gaggcaagca cacagaccat caatcttgac 13560

gaccggtcgc actggggcgg cgacctgaaa accatcctgc ataccaacat gccaaatgtg 13620

aacgagttca tgtttaccaa taagtttaag gcgcgggtga tggtgtcgcg cttgcctact 13680

aaggacaatc aggtggagct gaaatacgag tgggtggagt tcacgctgcc cgagggcaac 13740

tactccgaga ccatgaccat agaccttatg aacaacgcga tcgtggagca ctacttgaaa 13800

gtgggcagac agaacggggt tctggaaagc gacatcgggg taaagtttga cacccgcaac 13860

ttcagactgg ggtttgaccc cgtcactggt cttgtcatgc ctggggtata tacaaacgaa 13920

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ctgagcaact tgttgggcat ccgcaagcgg caacccttcc aggagggctt taggatcacc 14040

tacgatgatc tggagggtgg taacattccc gcactgttgg atgtggacgc ctaccaggcg 14100

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cctcagaccg gaatccgctc atggaccctg ctttgcactc ctgacgtaac ctgcggctcg 14520

gagcaggtct actggtcgtt gccagacatg atgcaagacc ccgtgacctt ccgctccacg 14580

cgccagatca gcaactttcc ggtggtgggc gccgagctgt tgcccgtgca ctccaagagc 14640

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atcggaggag tccagcgagt gaccattact gacgccagac gccgcacctg cccctacgtt 14880

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atgtccatcc ttatatcgcc cagcaataac acaggctggg gcctgcgctt cccaagcaag 15000

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gcgcccaggc gacgggtaca gtggaaaggt cgacgcgtaa aacgtgtttt gcgacccggc 15840

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gaggtgtacg gcgacgagga cctgcttgag caggccaacg agcgcctcgg ggagtttgcc 15960

tacggaaagc ggcataagga catgctggcg ttgccgctgg acgagggcaa cccaacacct 16020

agcctaaagc ccgtaacact gcagcaggtg ctgcccgcgc ttgcaccgtc cgaagaaaag 16080

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tgattaaaaa caagttgcat gtggaaaaat caaaataaaa agtctggact ctcacgctcg 17040

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gaactatggc agcaaggcct ggaacagcag cacaggccag atgctgaggg ataagttgaa 17280

agagcaaaat ttccaacaaa aggtggtaga tggcctggcc tctggcatta gcggggtggt 17340

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cctaaatatg ccgataaaac atttcaacct gaacctcaaa taggagaatc tcagtggtac 18540

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gaactaatgg gccaacaatc tatgcccaac aggcctaatt acattgcttt tagggacaat 18900

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tactgctttc cactgggagg tgtgattaat acagagactc ttaccaaggt aaaacctaaa 19200

acaggtcagg aaaatggatg ggaaaaagat gctacagaat tttcagataa aaatgaaata 19260

agagttggaa ataattttgc catggaaatc aatctaaatg ccaacctgtg gagaaatttc 19320

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ttagtggact gctacattaa ccttggagca cgctggtccc ttgactatat ggacaacgtc 19500

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ggtcgctatg tgcccttcca catccaggtg cctcagaagt tctttgccat taaaaacctc 19620

cttctcctgc cgggctcata cacctacgag tggaacttca ggaaggatgt taacatggtt 19680

ctgcagagct ccctaggaaa tgacctaagg gttgacggag ccagcattaa gtttgatagc 19740

atttgccttt acgccacctt cttccccatg gcccacaaca ccgcctccac gcttgaggcc 19800

atgcttagaa acgacaccaa cgaccagtcc tttaacgact atctctccgc cgccaacatg 19860

ctctacccta tacccgccaa cgctaccaac gtgcccatat ccatcccctc ccgcaactgg 19920

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tcgggctacg acccttatta cacctactct ggctctatac cctacctaga tggaaccttt 20040

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gcaactgcgc ctgaaacacc tggtccactg tcgccgccac aagtgctttg cccgcgactc 27000

cggtgagttt tgctactttg aattgcccga ggatcatatc gagggcccgg cgcacggcgt 27060

ccggcttacc gcccagggag agcttgcccg tagcctgatt cgggagttta cccagcgccc 27120

cctgctagtt gagcgggaca ggggaccctg tgttctcact gtgatttgca actgtcctaa 27180

ccctggatta catcaagatc tttgttgcca tctctgtgct gagtataata aatacagaaa 27240

ttaaaatata ctggggctcc tatcgccatc ctgtaaacgc caccgtcttc acccgcccaa 27300

gcaaaccaag gcgaacctta cctggtactt ttaacatctc tccctctgtg atttacaaca 27360

gtttcaaccc agacggagtg agtctacgag agaacctctc cgagctcagc tactccatca 27420

gaaaaaacac caccctcctt acctgccggg aacgtacg 27458

<210> 5

<211> 3712

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 5

tggacaggtc caaaaccaga agccaactgc ataattgaat acgggaaaca aaacccagat 60

agcaaactaa ctttaatcct tgtaaaaaat ggaggaattg ttaatggata tgtaacgcta 120

atgggagcct cagactacgt taacacctta tttaaaaaca aaaatgtctc cattaatgta 180

gaactatact ttgatgccac tggtcatata ttaccagact catcttctct taaaacagat 240

ctagaactaa aatacaagca aaccgctgac tttagtgcaa gaggttttat gccaagtact 300

acagcgtatc catttgtcct tcctaatgcg ggaacacata atgaaaatta tatttttggt 360

caatgctact acaaagcaag cgatggtgcc ctttttccgt tggaagttac tgttatgctt 420

aataaacgcc tgccagatag tcgcacatcc tatgttatga cttttttatg gtccttgaat 480

gctggtctag ctccagaaac tactcaggca accctcataa cctccccatt taccttttcc 540

tatattagag aagatgactg aagaatcgtt tgtgttatgt ttcaacgtgt ttatttttca 600

attgcagaaa atttcaagtc atttttcatt cagtagtata gccccaccac cacatagctt 660

atacagatca ccgtacctta atcaaactca cagaacccta gtattcaacc tgccacctcc 720

ctcccaacac acagagtaca cagtcctttc tccccggctg gccttaaaaa gcatcatatc 780

atgggtaaca gacatattct taggtgttat attccacacg gtttcctgtc gagccaaacg 840

ctcatcagtg atattaataa actccccggg cagctcactt aagttcatgt cgctgtccag 900

ctgctgagcc acaggctgct gtccaacttg cggttgctta acgggcggcg aaggagaagt 960

ccacgcctac atgggggtag agtcataatc gtgcatcagg atagggcggt ggtgctgcag 1020

cagcgcgcga ataaactgct gccgccgccg ctccgtcctg caggaataca acatggcagt 1080

ggtctcctca gcgatgattc gcaccgcccg cagcataagg cgccttgtcc tccgggcaca 1140

gcagcgcacc ctgatctcac ttaaatcagc acagtaactg cagcacagca ccacaatatt 1200

gttcaaaatc ccacagtgca aggcgctgta tccaaagctc atggcgggga ccacagaacc 1260

cacgtggcca tcataccaca agcgcaggta gattaagtgg cgacccctca taaacacgct 1320

ggacataaac attacctctt ttggcatgtt gtaattcacc acctcccggt accatataaa 1380

cctctgatta aacatggcgc catccaccac catcctaaac cagctggcca aaacctgccc 1440

gccggctata cactgcaggg aaccgggact ggaacaatga cagtggagag cccaggactc 1500

gtaaccatgg atcatcatgc tcgtcatgat atcaatgttg gcacaacaca ggcacacgtg 1560

catacacttc ctcaggatta caagctcctc ccgcgttaga accatatccc agggaacaac 1620

ccattcctga atcagcgtaa atcccacact gcagggaaga cctcgcacgt aactcacgtt 1680

gtgcattgtc aaagtgttac attcgggcag cagcggatga tcctccagta tggtagcgcg 1740

ggtttctgtc tcaaaaggag gtagacgatc cctactgtac ggagtgcgcc gagacaaccg 1800

agatcgtgtt ggtcgtagtg tcatgccaaa tggaacgccg gacgtagtca tatttcctga 1860

agcaaaacca ggtgcgggcg tgacaaacag atctgcgtct ccggtctcgc cgcttagatc 1920

gctctgtgta gtagttgtag tatatccact ctctcaaagc atccaggcgc cccctggctt 1980

cgggttctat gtaaactcct tcatgcgccg ctgccctgat aacatccacc accgcagaat 2040

aagccacacc cagccaacct acacattcgt tctgcgagtc acacacggga ggagcgggaa 2100

gagctggaag aaccatgttt ttttttttat tccaaaagat tatccaaaac ctcaaaatga 2160

agatctatta agtgaacgcg ctcccctccg gtggcgtggt caaactctac agccaaagaa 2220

cagataatgg catttgtaag atgttgcaca atggcttcca aaaggcaaac ggccctcacg 2280

tccaagtgga cgtaaaggct aaacccttca gggtgaatct cctctataaa cattccagca 2340

ccttcaacca tgcccaaata attctcatct cgccaccttc tcaatatatc tctaagcaaa 2400

tcccgaatat taagtccggc cattgtaaaa atctgctcca gagcgccctc caccttcagc 2460

ctcaagcagc gaatcatgat tgcaaaaatt caggttcctc acagacctgt ataagattca 2520

aaagcggaac attaacaaaa ataccgcgat cccgtaggtc ccttcgcagg gccagctgaa 2580

cataatcgtg caggtctgca cggaccagcg cggccacttc cccgccagga accatgacaa 2640

aagaacccac actgattatg acacgcatac tcggagctat gctaaccagc gtagccccga 2700

tgtaagcttg ttgcatgggc ggcgatataa aatgcaaggt gctgctcaaa aaatcaggca 2760

aagcctcgcg caaaaaagaa agcacatcgt agtcatgctc atgcagataa aggcaggtaa 2820

gctccggaac caccacagaa aaagacacca tttttctctc aaacatgtct gcgggtttct 2880

gcataaacac aaaataaaat aacaaaaaaa catttaaaca ttagaagcct gtcttacaac 2940

aggaaaaaca acccttataa gcataagacg gactacggcc atgccggcgt gaccgtaaaa 3000

aaactggtca ccgtgattaa aaagcaccac cgacagctcc tcggtcatgt ccggagtcat 3060

aatgtaagac tcggtaaaca catcaggttg attcacatcg gtcagtgcta aaaagcgacc 3120

gaaatagccc gggggaatac atacccgcag gcgtagagac aacattacag cccccatagg 3180

aggtataaca aaattaatag gagagaaaaa cacataaaca cctgaaaaac cctcctgcct 3240

aggcaaaata gcaccctccc gctccagaac aacatacagc gcttccacag cggcagccat 3300

aacagtcagc cttaccagta aaaaagaaaa cctattaaaa aaacaccact cgacacggca 3360

ccagctcaat cagtcacagt gtaaaaaagg gccaagtgca gagcgagtat atataggact 3420

aaaaaatgac gtaacggtta aagtccacaa aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta 3480

cgcccagaaa cgaaagccaa aaaacccaca acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc 3540

acgttacgtc acttcccatt ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg 3600

ccctaaaacc tacgtcaccc gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc 3660

ccctcattat catattggct tcaatccaaa ataaggtata ttattgatga tg 3712

Claims

1.一种用于在需要这样治疗的受试者中治疗癌症的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体以及(b)一种或多种免疫检查点抑制剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂选择性结合PD-L1或PD-1。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述溶瘤腺病毒载体瘤内、静脉内、动脉内或腹腔内给药。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，将所述溶瘤腺病毒载体瘤内给药。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是选择性结合PD-L1的单克隆抗体，优选地选自由以下组成的组：BMS-936559、LY3300054、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗和阿维鲁单抗。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述免疫检查点抑制剂是选择性结合PD-1的单克隆抗体，优选地选自由帕博利珠单抗(MK-3475)和纳武利尤单抗(BMS-936558)组成的组。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述病毒以约10⁶-10¹⁴VP、10⁶-10¹²VP、10⁸-10¹⁴VP、10⁸-10¹²VP或10¹⁰-10¹²VP的量给药。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述检查点抑制剂以约2mg/kg至25mg/kg的量给药。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者患有选自以下的癌症：肝细胞癌、结直肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胃癌、食管癌、肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌和肝癌。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述受试者患有肾细胞癌或头颈癌。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者之前已经失败过至少一次化学疗法或免疫疗法治疗，诸如用检查点抑制剂的治疗。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述受试者患有能够介导CD8+T细胞的功能障碍的癌症。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述受试者患有癌症，在所述癌症中，选自由GZMG、GMZF、KLRC2和CD46组成的组的与免疫活性相关的以及尤其选自由TNFSF18/GITRL和EAR2组成的组的与T细胞活性调控子相关的至少一种基因被下调。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，所述受试者患有抗PD-1难治性癌症，所述癌症优选为黑素瘤。

15.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括向所述受试者给予选自以下的额外疗法：放射疗法、化学疗法、抗血管生成剂或靶向疗法，诸如烷化剂、核苷类似物、细胞骨架修饰剂、细胞生长抑制剂、单克隆抗体、激酶抑制剂。

16.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者是人。

17.根据权利要求1所述的方法，其中，将第一剂所述溶瘤腺病毒载体和第一剂所述免疫检查点抑制剂同时给药至所述受试者。

18.根据权利要求1所述的方法，其中，将第一剂所述溶瘤腺病毒载体和第一剂所述免疫检查点抑制剂在24小时内依次给药。

19.根据权利要求1所述的方法，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体包括

-5/3嵌合纤毛突起，

-用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子，

-腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)，

-病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失，以及

-编码至少TNFα和/或IL-2作为转基因的核酸序列替代E3区中缺失的gp19k/6.7K，导致在病毒E3启动子下对转基因表达的复制相关控制。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体进一步包括E1B19k的缺失。

21.药物组合物，所述药物组合物包括(a)编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体以及(b)一种或多种免疫检查点抑制剂。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中，所述一种或多种免疫检查点抑制剂选择性结合PD-L1或PD-1。

23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体包括

-5/3嵌合纤毛突起，

-用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子，

-腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)，

-病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失，以及

24.一种试剂盒，所述试剂盒包括第一容器、第二容器和包装说明书，其中，所述第一容器包括至少一剂包含编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体的药物组合物，以及所述第二容器包括至少一剂包含检查点抑制剂的药物组合物，以及所述包装说明书包括使用所述药物组合物治疗患有癌症的个体的说明。

25.根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体包括

-5/3嵌合纤毛突起，

-用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子，

-腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)，

-病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失，以及

26.根据权利要求21所述的组合物或根据权利要求24所述的试剂盒，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体进一步包括E1B19k的缺失。

27.编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂用于治疗癌症或肿瘤的用途。

28.根据权利要求27所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述免疫检查点抑制剂选择性结合PD-L1或PD-1。

29.根据权利要求27或28所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，将所述溶瘤腺病毒载体瘤内、静脉内、动脉内或腹腔内给药。

30.根据权利要求27-29中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，将所述溶瘤腺病毒载体瘤内给药。

31.根据权利要求27-30中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述免疫检查点抑制剂是选择性结合PD-L1的单克隆抗体，优选地选自由以下组成的组：BMS-936559、LY3300054、阿替利珠单抗、度伐利尤单抗和阿维鲁单抗。

32.根据权利要求27-30中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述免疫检查点抑制剂是选择性结合PD-1的单克隆抗体，优选地选自由帕博利珠单抗(MK-3475)和纳武利尤单抗(BMS-936558)组成的组。

33.根据权利要求27-32中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，将所述病毒以约10⁶-10¹⁴VP、10⁶-10¹²VP、10⁸-10¹⁴VP、10⁸-10¹²VP或10¹⁰-10¹²VP的量给药。

34.根据权利要求27-33中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，将所述检查点抑制剂以约2mg/kg至25mg/kg的量给药。

35.根据权利要求27-34中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者患有选自以下的癌症：肝细胞癌、结直肠癌、肾细胞癌、膀胱癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胃癌、食管癌、肉瘤、间皮瘤、黑素瘤、胰腺癌、头颈癌、卵巢癌、乳腺癌、宫颈癌和肝癌。

36.根据权利要求35所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者患有肾细胞癌或头颈癌。

37.根据权利要求27-36中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者之前已经失败过至少一次化学疗法或免疫疗法治疗，诸如用检查点抑制剂的治疗。

38.根据权利要求37所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者患有能够介导CD8+T细胞的功能障碍的癌症。

39.根据权利要求37或38所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者患有癌症，在所述癌症中，选自由GZMG、GMZF、KLRC2和CD46组成的组的与免疫活性相关的以及尤其选自由TNFSF18/GITRL和EAR2组成的组的与T细胞活性调控子相关的至少一种基因被下调。

40.根据权利要求37-39中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者患有抗PD-1难治性癌症，所述癌症优选为黑素瘤。

41.根据权利要求27-40中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，包括向所述受试者给予选自以下的额外疗法：放射疗法、化学疗法、抗血管生成剂或靶向疗法，诸如烷化剂、核苷类似物、细胞骨架修饰剂、细胞生长抑制剂、单克隆抗体、激酶抑制剂。

42.根据权利要求27-41中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述受试者是人。

43.根据权利要求27-42中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，将第一剂所述溶瘤腺病毒载体和第一剂所述免疫检查点抑制剂同时给药至所述受试者。

44.根据权利要求27-43中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，将第一剂所述溶瘤腺病毒载体和第一剂所述免疫检查点抑制剂在24小时内依次给药。

45.根据权利要求27-44中任一项所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体包括

-5/3嵌合纤毛突起，

-用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子，

-腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(D24)，

-病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失，以及

46.根据权利要求45所述用途的编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体连同免疫检查点抑制剂，其中，所述编码TNFα和/或IL-2作为转基因的溶瘤腺病毒载体进一步包括E1B19k的缺失。