JP2024508920A - 多武装の粘液腫ウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、組換え粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）と、組換え腫瘍溶解性ウイルスゲノムおよびその一部をコードする核酸構築物とである。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される導入遺伝子（例えば、ＩＬ－１２）とを含む。導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または破壊するためにＭＹＸＶゲノムに挿入される。【選択図】図１Ａ
Description
相互参照
本出願は、２０２１年３月１日出願の米国仮特許出願第６３／１５５，１９５号の利益を主張し、当該文献の全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月１日出願の米国仮特許出願第６３／１５５，１９５号の利益を主張し、当該文献の全体は、引用によって本明細書に組み込まれる。
技術分野
本明細書に開示されるのは、組換え腫瘍溶解性ウイルス、すなわち、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、組換え腫瘍溶解性ウイルスを作成するのに有用な核酸構築物、およびその使用方法である。
本明細書に開示されるのは、組換え腫瘍溶解性ウイルス、すなわち、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）、組換え腫瘍溶解性ウイルスを作成するのに有用な核酸構築物、およびその使用方法である。
種々の種類の癌を処置するために使用される現在の処置は、癌細胞を毒するか、または殺傷することによって作用する傾向にあるが、癌細胞に毒性である処置は、通常健常細胞にも毒性である傾向がある。さらに、腫瘍の不均質性質は、癌の効率的な処置がうまく行われないままである主要な理由の１つである。化学療法および放射線療法などの現在の主流の治療法は、毒性の狭い治療濃度域内で使用される傾向にある。これらの種類の治療法は、変動する種類の腫瘍細胞によって限られた利用可能性を有し、かつ、これらの処置が投与され得る限られた濃度域を有する。
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、インターロイキン１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）をコードする第１の核酸とを含む組換え核酸であって、第１の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または阻害するためにＭＹＸＶゲノムに挿入され、ＩＬ－１２βの発現は、第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、組換え核酸である。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βは、ヒトのＩＬ－１２βである。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、インターロイキン１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする第２の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αは、ヒトＩＬ－１２αである。いくつかの実施形態において、第２の核酸の５’末端は、第１の核酸の３’末端に結合される。いくつかの実施形態において、第１の核酸および第２の核酸は、エラスチンリンカーをコードする第３の核酸を介して結合される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、デコリンをコードする第４の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、デコリンは、ヒトデコリンである。いくつかの実施形態において、デコリンの発現は、第１のｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、第４の核酸の５’末端は、第２の核酸の３’末端に結合される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）ＩＬ－１２βをコードする第１の核酸と、（ｃ）エラスチンリンカーをコードする第３の核酸と、（ｄ）ＩＬ－１２αをコードする第２の核酸と、（ｅ）第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｆ）デコリンをコードする第４の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、レポータータグをコードする第５の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、レポータータグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。いくつかの実施形態において、レポータータグの発現は、第２のｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）ＩＬ－１２βをコードする第１の核酸と、（ｃ）エラスチンリンカーをコードする第３の核酸と、（ｄ）ＩＬ－１２αをコードする第２の核酸と、（ｅ）第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｆ）デコリンをコードする第４の核酸と、（ｇ）第２のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｈ）レポータータグをコードする第５の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０または配列番号１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０または配列番号１１であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）をコードする第６の核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、ヒトＴＮＦ－αである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、可溶性ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現は、第２のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、第６の核酸は、ＩＬ－１２αをコードする第２の核酸とデコリンをコードする第４の核酸との間に位置する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）ＩＬ－１２βをコードする第１の核酸と、（ｃ）エラスチンリンカーをコードする第３の核酸と、（ｄ）ＩＬ－１２αをコードする第２の核酸と、（ｅ）第２のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｆ）ＴＮＦ－αをコードする第６の核酸と、（ｇ）第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｈ）デコリンをコードする第４の核酸と、（ｉ）任意選択で第２のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｊ）任意選択でレポータータグをコードする第５の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－Ｐ１１後期プロモーター－ＴＮＦ－α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－Ｐ１１後期プロモーター－ＴＮＦ－α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰ発現カセットを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２０または配列番号２１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２０または配列番号２１であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
本明細書で開示されるのは、いくつかの態様において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または阻害するためにＭＹＸＶゲノムに挿入された核酸発現カセットとを含む組換え核酸であって、核酸発現カセットは、５’から３’に、ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈＩＬ－１２β－ＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰを含む、組換え核酸である。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
本明細書で開示されるのは、いくつかの態様において、免疫調節活性または抗腫瘍活性が増強された、遺伝子操作されたＭＹＸＶであって、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも８０％は、ノックアウトされ、遺伝子操作されたＭＹＸＶは、前述の実施形態のいずれか１つの組換え核酸を含む、ＭＹＸＶである。
いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた非癌細胞において、ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた非癌細胞と比較して、ＩＬ－１２βの発現が減少する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させたＰＢＭＣにおいて、ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と比較して、ＩＬ－１２βの発現が低下する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた細胞によって、ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた細胞と比較して、ＩＬ－１２βの発現が感染後４時間で低下する。
本明細書で開示されるのは、いくつかの態様において、サイトカインをコードする核酸を含む、遺伝子操作されたＭＹＸＶであって、サイトカインの発現は、ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターによって駆動され、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３の発現または活性を減衰させるように遺伝子操作される、ＭＹＸＶである。
いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＩＬ－１２β、ＩＬ－１２α、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、サイトカインは、ＴＮＦ－αを含む。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３をコードする核酸の少なくとも８０％は、遺伝子操作されたＭＹＸＶのゲノムにおいて欠失している。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた非癌細胞において、サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた非癌細胞と比較して、サイトカインの発現が減少する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させたＰＢＭＣにおいて、サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させたＰＢＭＣと比較して、サイトカインの発現が減少する。いくつかの実施形態において、遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた細胞によって、サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた細胞と比較して、サイトカインの発現が感染後４時間で減少する。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、遺伝子操作されたローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株ＭＹＸＶである。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、前述の実施形態のいずれか１つの組換え核酸または遺伝子操作されたＭＹＸＶによってｅｘ ｖｉｖｏで処置された哺乳動物細胞である。
いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または骨髄（ＢＭ）細胞である。
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、前述の実施形態のいずれか１つの組換え核酸、遺伝子操作されたＭＹＸＶ、または哺乳動物細胞を含む組成物である。
いくつかの実施形態において、組成物は、全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、組成物は、局所投与用に製剤化される。
本明細書に開示されるのは、いくつかの態様において、腫瘍に対する免疫応答を増加させる必要のある対象において腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法であって、該方法は、対象に前述の実施形態のいずれか１つの組成物を投与する工程を含む、方法である。
いくつかの実施形態において、対象は、腫瘍を有するか、腫瘍を有する疑いがある。いくつかの実施形態において、投与は、全身投与である。いくつかの実施形態において、投与する工程は、静脈内である。いくつかの実施形態において、投与する工程は、局所である。いくつかの実施形態において、投与する工程は、腫瘍内である。いくつかの実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は、肺癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、または黒色腫である。いくつかの実施形態において、投与は、対象の生存を改善する。いくつかの実施形態において、投与は、癌細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、投与は、対象の腫瘍において少なくとも２個のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で行われる。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍の体積を少なくとも１０％減少させるのに有効な用量および計画で行われる。いくつかの実施形態において、投与は、腫瘍の増殖を少なくとも１０％減少させるのに有効な用量および計画で行われる。いくつかの実施形態において、対象は、Ｍ１５３を発現させるか、組換え核酸を欠いているか、またはそれらの組み合わせである対応の対照粘液腫ウイルスが１０倍高い用量で投与された対象に比べて少なくとも１０％長く生存する。
本発明のある特定の実施形態の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載している。本発明の特徴および利点をより良く理解するには、本発明の原理が用いられる例示的な実施形態を記載している以下の詳細な説明と添付の図面とを参照されたい。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＨＶ１１）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
組換え核酸と、組換え核酸を含む組換え粘液腫ウイルス（ＨＶ１１）の生成を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＨＶ１４）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
組換え核酸と、組換え核酸を含む組換え粘液腫ウイルス（ＨＶ１４）の生成を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＨＶ１２）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
組換え核酸と、組換え核酸を含む粘液腫ウイルス（ＨＶ１２）の生成を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＭＶ２）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＭＶ４）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＭＶ１）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＭＶ３）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＨＶ１３）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
本明細書に開示される組換え粘液腫ウイルス（ＭＶ５）を生成するのに使用することができる組換え核酸を示す概略図である。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を示すグラフである。
ＨＶ１３またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＴＮＦ－α放出を示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＴＮＦ－α放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＴＮＦ－α放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
レポーター細胞株で測定した場合の、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞による二官能性ＩＬ－１２の発現レベルを示すグラフである。
静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射を介してＨＶ１１またはＨＶ１２を感染させた免疫不全Ａ５４９腫瘍を有するマウスの血清試料において検出されたＩＬ－１２を示すグラフである。
静脈内（ＩＶ）または腫瘍内（ＩＴ）注射を介してＨＶ１１またはＨＶ１２を感染させた免疫不全Ａ５４９腫瘍を有するマウスの腫瘍試料において検出されたＩＬ－１２を示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＴＮＦ－α放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ３またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＴＮＦ－α放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
レポーター細胞アッセイで測定した場合の、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞によって生成された二官能性ＩＬ－１２のレベルを示すグラフである。
ＭＶ１またはＭＶ３で処置した際のＥＭＴ－６乳癌マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。
ＭＶ１またはＭＶ３で処置した際のＥＭＴ－６乳癌マウスモデルの生存プロットである。
記載の粘液腫ウイルスで最初に処置してから５９日後に再投与（ｒｅ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した際のＥＭＴ－６マウス乳癌における腫瘍体積の変化を示すグラフである。
腫瘍内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。
腫瘍内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫モデルの生存プロットである。
静脈内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫における腫瘍体積の変化を示すグラフである。
静脈内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫動物の生存プロットである。
腫瘍内注射によってＭＶ１で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫における腫瘍体積の変化を示すグラフである。
腫瘍内注射によってＭＶ１で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫動物の生存プロットである。
静脈内注射によってＭＶ１で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫における腫瘍体積の変化を示すグラフである。
静脈内注射によってＭＶ１で処置した際のＢ１６－Ｆ１０マウス黒色腫動物の生存プロットである。
静脈内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ播種性黒色腫マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。
静脈内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ播種性黒色腫マウスモデルの生存プロットである。
静脈内注射によってＭＶ１またはＭＶ２で処置した際のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ播種性黒色腫マウスモデルにおける腫瘍体積の変化を示すグラフである。
静脈内注射によってＭＶ１またはＭＶ２で処置した際のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ播種性黒色腫マウスモデルの生存プロットである。
静脈内注射によってＭＶ１またはＭＶ２で処置した際のＫ７Ｍ２－Ｌｕｃ播種性骨肉腫マウスモデルの生存プロットである。
静脈内注射によってＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置した際のＫ７Ｍ２－Ｌｕｃ播種性骨肉腫マウスモデルの生存プロットである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＢ１６－Ｆ１０細胞からのＩＬ－１２放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＢ１６－Ｆ１０細胞からのデコリン放出を用量（ＭＯＩ）応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＶｅｒｏ細胞からのＩＬ－１２放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＢ１６－Ｆ１０細胞からのＩＬ－１２放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＶｅｒｏ細胞からのデコリン放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、またはＨＶ１１を感染させたＢ１６－Ｆ１０細胞からのデコリン放出を時間応答性の様式で示すグラフである。
ＨＶ１１を感染させたヒト固形腫瘍細胞株について、最大増殖阻害％対ＥＣ５０をプロットしたグラフである。
ＨＶ１２を感染させたヒト固形腫瘍細胞株について、最大増殖阻害％対ＥＣ５０をプロットしたグラフである。
ＨＶ１３を感染させたヒト固形腫瘍細胞株について、最大増殖阻害％対ＥＣ５０をプロットしたグラフである。
ＨＶ１４を感染させたヒト固形腫瘍細胞株について、最大増殖阻害％対ＥＣ５０をプロットしたグラフである。
ＨＶ１１を感染させたヒト多発性骨髄腫細胞株について、感染から２４時間後の最大増殖阻害％対ＥＣ５０をプロットしたグラフである。
ＨＶ１１を感染させたヒト多発性骨髄腫細胞株について、感染から７２時間後の最大増殖阻害％対ＥＣ５０をプロットしたグラフである。
ＭＹＸＶ－ＧＦＰ、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生を示すグラフである。
ＭＹＸＶ－ＧＦＰ、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるＩＬ－１２産生を示すグラフである。
ＭＹＸＶ－ＧＦＰ、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるＴＮＦ－α産生を示すグラフである。
ＨＶ１１を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生およびＩＬ－１２産生を示すグラフである。
ＨＶ１２を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生およびＩＬ－１２産生を示すグラフである。
ＨＶ１３を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生およびＩＬ－１２産生を示すグラフである。
ＨＶ１４を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生およびＩＬ－１２産生を示すグラフである。
ＨＶ１３を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生およびＴＮＦ－α産生を示すグラフである。
ＨＶ１４を感染させてから２４時間後のヒト固形腫瘍細胞株によるデコリン産生およびＴＮＦ－α産生を示すグラフである。
ＭＹＸＶ－ＧＦＰまたはＨＶ１１を感染させてから２４時間後のヒト多発性骨髄腫細胞株によるデコリン産生を示すグラフである。
ＭＹＸＶ－ＧＦＰまたはＨＶ１１を感染させてから２４時間後のヒト多発性骨髄腫細胞株によるＩＬ－１２産生を示すグラフである。
本明細書に記載されるのは、腫瘍溶解性ウイルス、具体的には、操作された腫瘍溶解性粘液腫ウイルスなどの腫瘍溶解性ポックスウイルスである。粘液腫ウイルスは、本明細書でＭＹＸＶまたはｖＭｙｘと称される場合がある。
いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶなどの２個または３個の導入遺伝子で武装した腫瘍溶解性ウイルスと、固形癌および／または転移性癌などの癌を処置するためのそれらの使用方法とに関する。いくつかの実施形態は、２個のヒト導入遺伝子、すなわち、抗腫瘍免疫応答を増幅させることができるヒトＩＬ－１２（ｈＩＬ－１２）と、腫瘍床内のＴＧＦ－ベータシグナル伝達を遮断するヒトデコリン（ｈＤｅｃｏｒｉｎ）とを発現するか、あるいは３個のヒト導入遺伝子、すなわち、肺または身体の他の部分に転移する癌の処置の有効性を改善するヒトサイトカイン（ｈＴＮＦ）と、ｈＩＬ－１２と、ｈＤｅｃｏｒｉｎとを発現する、組換えＭＹＸＶ構築物を含む。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子またはタンパク質の発現を不活性化、阻害、または減弱させるように遺伝子操作され、例えば、Ｍ１５３遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰させるように遺伝子操作される。インタクトな野生型Ｍ１５３遺伝子を含む未改変ＭＹＸＶや、別の遺伝子座に改変を有するＭＹＸＶと比較すると、本明細書に記載されるような粘液腫ウイルスは改変によって、ＭＹＸＶの腫瘍溶解活性が予想外に改善した。ＭＹＸＶはまた、Ｍ１５３遺伝子座に改変を有するのに加えて、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、および／またはデコリンなどの非ウイルス分子をコードする１個以上の導入遺伝子を含んでもよく、それによって、腫瘍溶解活性をさらに改善させたり、抗腫瘍免疫応答を増加させたり、あるいはＭＹＸＶの有害な副作用を減少させる。
いくつかの実施形態は、導入遺伝子をコードし、かつ、ＭＹＸＶゲノム、例えばＭ１５３遺伝子座に組み込まれることが可能なウイルス二重導入遺伝子または三重導入遺伝子構築物などの組換え核酸構築物に関する。いくつかの実施形態において、導入遺伝子やＭＹＸＶの他の改変は、癌治療法の有効性を改善する。
定義
本明細書に使用される段落の見出しは、構成上の目的のために過ぎず、記載される主題を制限すると解釈されてはならない。
本明細書に使用される段落の見出しは、構成上の目的のために過ぎず、記載される主題を制限すると解釈されてはならない。
以下の用語の説明は、特定の実施形態および実施例を説明することのみを目的として提示しており、限定することを意図していない。
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、複数の形態も含むことが意図されている。
本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、列挙されている関連物品の１個以上に関して可能な任意の組み合わせおよびすべての組み合わせについて言及し包含するだけでなく、選択肢（「または」）として解釈される場合は組み合わせの欠落についても言及し包含する。
本明細書で使用される場合、「１以上」または少なくとも１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上、任意の数までを意味してもよい。
「有効量」または「治療有効量」は、治療および／または有益な効果であり得る所望の効果を生み出すのに十分である本開示の化合物または組成物の量を指す。
「それを必要とする対象」または「必要とする対象」は、癌などの疾患または疾病を有することが分かっている対象または有する疑いがある対象である。
本明細書で使用される場合、疾患を「阻害すること（ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ）」または「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患または疾病の完全な発症または進行を阻害することを指す。「処置」は、疾患または病態が発症した後で疾患または病態の兆候または症状を改善する、治療的介入を指す。疾患または病態に関して「改善すること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」という用語は、処置の任意の観察可能または検出可能な有益な効果を指す。有益な効果は、例えば、対照対象もしくは対象の対照コホートと比較して、または処置前と比較して、例えば、感染しやすい対象において疾患の臨床症状の発症の遅延、疾患のいくらかもしくはすべての臨床症状の重症度の減少、転移などの疾患の進行の遅延、対象の全体的健康もしくは幸福な状態の改善によって、または特定の疾患に特異的な当技術分野において周知の他のパラメーターによって証明することができる。「予防的」処置は、例えば、転移性癌の病状または疾患の進行を発症するリスクを低減する目的で、疾患の兆候を示さないか、または初期の兆候のみを示す対象に投与される処置である。
ＭＹＸＶは、不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染する可能性がある。本明細書で使用される場合、「不十分な生来の抗ウイルス応答」を有することは、ウイルスに曝露されたとき、またはウイルスに侵入されたときに、ウイルス複製の阻害、インターフェロンの産生、インターフェロン応答経路の誘導、およびアポトーシスを含み得る抗ウイルス防御メカニズムを誘導しないか、実質的に誘導しないか、または抗ウイルス防御メカニズムの減少を表す。この用語は、正常細胞、例えば、非感染細胞または非癌細胞と比較して、ウイルスに曝露されたとき、またはウイルスに感染されたときに、減少したまたは不十分な生来の抗ウイルス応答を有する、癌細胞などの細胞を含む。これには、インターフェロンに反応しない細胞、およびアポトーシス反応の低下もしくは不十分、またはアポトーシス経路の誘導を有する細胞が含まれる。欠乏は、感染症、遺伝的欠陥もしくはエピジェネティクス欠陥、または環境ストレスを含むさまざまな原因による可能性がある。しかしながら、欠乏が既存の感染によって引き起こされる場合、ＭＹＸＶによる重感染は除外される場合があり、当業者はそのような例を容易に特定することができることが理解される。当業者は、任意の所定の細胞型が不十分な生来の抗ウイルス応答を有し、したがってＭＹＸＶによる感染に対して感受性であるかどうかを過度の実験なしに容易に決定することができる。したがって、ある特定の実施形態において、ＭＹＸＶは、不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞に感染することができる。ある特定の実施形態において、細胞は、インターフェロンに対して応答しない。ある特定の実施形態において、細胞は、哺乳動物癌細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、ヒト固形腫瘍細胞を含むヒト癌細胞である。特定の実施形態において、不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞は、癌細胞を含む。
操作された粘液腫ウイルス
本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）である。ＭＹＸＶは、野生型株のＭＹＸＶを含んでもよく、または遺伝子改変株のＭＹＸＶを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＡＴＣＣ ＶＲ－１８２９；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＣＦ＿０００８４３６８５．１、または２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ １７０７２６．２などのローザンヌ株を含むか、それから操作される。野生型ローザンヌ株は、１６１．８ｋｂのサイズのゲノムを有し、ゲノム中に両方向（主鎖および相補鎖）に１７１個の遺伝子を有する。これらの１７１個の遺伝子中、１５９個の遺伝子が予測オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することがわかっている。ＯＲＦはすべて、転写の方向に応じて、文字ＲまたはＬの名称で指定されている。
本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）である。ＭＹＸＶは、野生型株のＭＹＸＶを含んでもよく、または遺伝子改変株のＭＹＸＶを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＡＴＣＣ ＶＲ－１８２９；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＣＦ＿０００８４３６８５．１、または２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ １７０７２６．２などのローザンヌ株を含むか、それから操作される。野生型ローザンヌ株は、１６１．８ｋｂのサイズのゲノムを有し、ゲノム中に両方向（主鎖および相補鎖）に１７１個の遺伝子を有する。これらの１７１個の遺伝子中、１５９個の遺伝子が予測オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有することがわかっている。ＯＲＦはすべて、転写の方向に応じて、文字ＲまたはＬの名称で指定されている。
いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓを移動する南米のＭＹＸＶ株を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂａｃｈｍａｎｉを移動するカリフォルニアのＭＹＸＶ株を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、遺伝子Ｍ００９Ｌ、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ１３５Ｒ、およびＭ１４８Ｒの改変を含む減衰スペイン野外株（例えば、２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ５５２５３０）である６９１８を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、６９１８ＶＰ６０－Ｔ２（２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ５５２５３１）を含む。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、標準実験室株（ＳＬＳ）を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、本明細書に記載されるような核酸構築物またはＭＹＸＶゲノムを含む。
いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓを移動する南米のＭＹＸＶ株ではなく、またその誘導体でもない。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、Ｓｙｌｖｉｌａｇｕｓ ｂａｃｈｍａｎｉを移動するカリフォルニアのＭＹＸＶ株ではなく、またその誘導体でもない。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、遺伝子Ｍ００９Ｌ、Ｍ０３６Ｌ、Ｍ１３５Ｒ、およびＭ１４８Ｒの改変を含む減衰スペイン野外株（例えば、２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ５５２５３０）である６９１８ではなく、またその誘導体でもない。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、６９１８ＶＰ６０－Ｔ２（２０１９年７月１１日に公開されたＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ５５２５３１）ではなく、またその誘導体でもない。いくつかの場合において、ＭＹＸＶは、標準実験室株（ＳＬＳ）ではなく、またその誘導体でもない。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＳＧ３３株、ＣＮＣＭ Ｉ－１５９４株、Ｔｏｕｌｏｕｓｅ １株ではなく、またそれらの誘導体でもない。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ００１遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ１５１遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ１５２遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ１５３遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ１５４遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ１５６遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００８．１遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００８遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００７遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００６遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００５遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００４．１遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００４遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００３．２遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００３．１遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ００２遺伝子の２個のインタクトなまたは機能的なコピーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、インタクトなまたは機能的なＭ１１Ｌ遺伝子を含む。
いくつかの場合において、本明細書に開示されるＭＹＸＶ、または操作されたＭＹＸＶの親株は、こうした開示のために参照によって組み込まれるＣａｍｅｒｏｎら、「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｘｏｍａ Ｖｉｒｕｓ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６４巻：２９８～３１８頁（１９９９）に開示されている配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を含む、９５％から９８％の間、９５％から９９％の間の核酸配列同一性を含む。場合によっては、ＭＹＸＶは、Ｃａｍｅｒｏｎら、「Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｍｙｘｏｍａ Ｖｉｒｕｓ」Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６４巻：２９８～３１８頁（１９９９）に開示されている配列を含む。
本明細書に開示されているような２つの配列間の配列同一性の程度は、例えば、この目的のために通常用いられているコンピュータプログラム、例えばグローバルアラインメントアルゴリズムまたはローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つの配列を比較することによって決定することができる。非限定的な例には、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴｎ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、ＭＡＦＦＴ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ、ＡｌｉｇｎＭｅ、Ｐｒａｌｉｎｅ、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、Ｎｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、ＧＧＥＡＲＣＨ２ＳＥＱ、Ｗａｔｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、Ｍａｔｃｈｅｒ（ＥＭＢＯＳＳ）、ＬＡＬＩＧＮ、ＳＳＥＡＲＣＨ２ＳＥＱ、または別の好適な方法もしくはアルゴリズムが含まれる。２つの配列を全体の長さにわたって整列し、一致の数を最大にしてギャップの数を最小にするために、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを使用してもよい。デフォルト設定を使用してもよい。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ウイルス遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを不活性化または減衰させるように操作される。いくつかの実施形態において、ウイルス遺伝子またはタンパク質は、Ｍ１５３である。いくつかの実施形態において、ウイルス遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを不活性化または減衰させることによって、野生型ＭＹＸＶに対して、あるいはウイルス遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルの不活性化または減衰させていないＭＹＸＶに対して、例えば、野生型Ｍ１５３遺伝子を含むＭＹＸＶ、および／または、野生型（例えば、機能性）Ｍ１５３遺伝子を発現するＭＹＸＶに対して、ＭＹＸＶは、抗癌活性の増強を示す。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１個を超えるウイルス遺伝子またはタンパク質の活性または発現レベルを不活性化または減衰させるように操作される。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子をコードする組換え核酸、例えば、サイトカインまたは細胞外マトリックスタンパク質など、ＭＹＸＶに対して天然ではないタンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、本明細書に記載される導入遺伝子などの導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えばＴＮＦ－α）、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）、またはデコリンをコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、２個以上の導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムにノックインされる。いくつかの実施形態において、導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中の遺伝子を破壊し、例えば、導入遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中の遺伝子内に挿入されるか、または遺伝子の一部もしくはすべてと置き換えられ、それによって、遺伝子および／または遺伝子がコードするタンパク質の発現を破壊する。このような破壊は、ノックアウト（ＫＯ）と称されてもよい。いくつかの実施形態において、２個以上の導入遺伝子は、直列に配列される。導入遺伝子は、本明細書に開示される発現カセットに存在してもよい。
ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶの抗癌効果を増強するいずれかの非ウイルス分子を産生するように改変され（例えば、いずれかの導入遺伝子を保有するように改変され）てもよい。このような非ウイルス分子は、アポトーシスの誘因に関与するか、またはインターフェロンに対する応答を刺激する（例えば、インターフェロンに対する応答の欠如を修復する）非ウイルス分子、もしくは病原体関連分子パターン、例えば、細菌細胞表面抗原などの抗体応答を刺激する細胞表面マーカーの発現をもたらす非ウイルス分子など、免疫破壊について感染細胞を標的にすることに関与してもよい。ＭＹＸＶはまた、新生物細胞または癌細胞の増殖および成長を遮断することに関与する非ウイルス分子を産生するように改変されてもよく、それによって、これら細胞が分裂することを防ぐ。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、化学療法剤の合成に関与する分子などの治療非ウイルス分子を産生するように改変されるか、または、阻害または殺傷されるべき細胞由来の特定の種の細胞、例えば、ヒト細胞の中で複製レベルが増加するように改変されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、２個または３個の別個の非ウイルス分子、例えば、ヒト導入遺伝子（例えば、ヒトＴＮＦ、ヒトデコリン、および／またはヒトＩＬ－１２）、および／または非ヒト哺乳動物導入遺伝子（例えば、マウスＴＮＦ、マウスデコリン、および／またはマウスＩＬ－１２）をコードするか、または発現する組換え構築物を含む。いくつかの実施形態において、組換え構築物は、１個以上のレポータータグ、例えば、ｅＧＦＰおよびｄｓＲｅｄなどの蛍光タンパク質をさらにコードするか、または発現する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、そのＭ１５３遺伝子および／またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰するように遺伝子操作され、例えば、ウイルスＭ１５３遺伝子の破壊を含む（Ｍ１５３ノックアウト：Ｍ１５３ＫＯ）。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３の活性または発現レベルを減衰することによって、ウイルスを感染させた癌細胞に対するＭＨＣ依存性の抗腫瘍免疫応答を改善し、例えば、ウイルスを感染させた癌細胞に対するＣＤ４＋ Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を改善する。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、癌の治療における使用のための腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの実施形態は、Ｍ１５３ＫＯバックボーンを、本明細書に開示される導入遺伝子の免疫増強特性と組み合わせて、ＭＹＸＶの腫瘍溶解特性を増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦ－α）導入遺伝子、ＩＬ－１２導入遺伝子、デコリン導入遺伝子、またはそれらの２つ以上の任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ（例えば、ＴＮＦ－α）導入遺伝子、ＩＬ－１２導入遺伝子、およびデコリン導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ－α導入遺伝子およびＩＬ－１２導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ－α導入遺伝子およびデコリン導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＩＬ－１２導入遺伝子およびデコリン導入遺伝子を含む。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦを発現するＭＹＸＶを対象に投与すると、ＴＮＦは、抗腫瘍免疫系の先天性および適応性アームを活性化およびジャンプスタートさせ、バイスタンダー傍分泌様の方法で癌細胞死を促進する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、生じる抗癌の自然免疫応答および適応性免疫応答を増幅する。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－βによって媒介される局所免疫抑制作用を妨害し、したがって、ＴＮＦとＩＬ－１２の両方の作用を増強し、そして抗癌免疫応答を促進する。いくつかの実施形態において、３個の導入遺伝子の相乗作用に加えて、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＭＹＸＶの効果が、腫瘍溶解性ＭＹＸＶベクターの免疫療法の可能性を高める。いくつかの実施形態において、非ウイルス分子（ｈＴＮＦ、ｈＩＬ－１２、および／またはｈＤｅｃｏｒｉｎ）をコードするヒト導入遺伝子のＭＹＸＶゲノムへの追加は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において強固な抗腫瘍免疫応答を誘発するＭＹＸＶの能力を改善する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ウイルスまたはウイルスを感染させた細胞の検出の容易さを高めるように改変される。例えば、ＭＹＸＶは、位相差顕微鏡、蛍光顕微鏡、またはラジオイメージングによって容易に検出できる、レポータータグなどのマーカーを発現するように遺伝子改変されてもよい。マーカーは、比色反応または放射性標識反応に関与する発現蛍光タンパク質または発現酵素であってもよい。いくつかの実施形態において、マーカーは、試験されている細胞の特定の機能を妨害または阻害する遺伝子産物を含む。
いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、蛍光タンパク質を含む。例示的な蛍光タンパク質には、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、Ｓｉｒｕｓ、またはＳａｐｐｈｉｒｅなどの青色／ＵＶタンパク質、ＥＣＦＰ、セルリアン（ｃｅｒｕｌｅａｎ）、またはｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅなどのシアンタンパク質、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｅｍｅｒａｌｄ、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、またはＣｌｏｖｅｒなどの緑色タンパク質、ＥＹＦＰ、シトリン（ｃｉｔｒｉｎｅ）、ヴィーナス（ｖｅｎｕｓ）、またはＳＹＦＰ２などの黄色のタンパク質、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯ２、またはｍＯｒａｎｇｅなどのオレンジ色タンパク質、ｄｓＲｅｄ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙｍ ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＡｐｐｌｅ、またはｍＲｕｂｙなどの赤色タンパク質、ＰＡ－ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１、ＰＡＴａｇＲＦＰなどの光活性化タンパク質、ならびにＤｒｏｐｎａなどの光スイッチ可能なタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、１個を超える蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、操作されたＭＹＸＶは、蛍光タンパク質をコードしない。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、デコリン、ＩＬ－１２、および、任意選択でＧＦＰをコードする導入遺伝子を含み、（例えば、Ｍ１５３が破壊またはノックアウトされるように）１個以上の導入遺伝子がＭ１５３遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ＴＮＦ－α、デコリン、ＩＬ－１２、および、任意選択でＧＦＰをコードする導入遺伝子を含み、（例えば、Ｍ１５３が破壊またはノックアウトされるように）１個以上の導入遺伝子がＭ１５３遺伝子座に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α、デコリン、ＩＬ－１２、および／またはＧＦＰを含む、本明細書に開示される組換え核酸がＭ１５３遺伝子座に導入され、（例えば、Ｍ１５３が破壊またはノックアウトされるように）本開示のＭＹＸＶが生成される。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、ウサギ細胞向性に関連する１個以上の遺伝子での改変、またはそれに隣接している改変を含む。いくつかの場合において、ウサギ細胞向性に関連する１個以上の遺伝子は、Ｍ１１Ｌ、Ｍ０６３、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、Ｍ－Ｔ２、Ｍ－Ｔ４、Ｍ－Ｔ５、またはＭ－Ｔ７を含む。いくつかの場合において、ウサギ細胞向性に関連する１個以上の遺伝子は、Ｍ１３５Ｒ、Ｍ１３６Ｒ、またはそれらの組み合わせを含む。
ＭＹＸＶは、当該技術分野において公知である標準的な技術を使用して調製することができる。例えば、ウイルスは、培養ウサギ細胞、または不死化許容ヒトまたは霊長類細胞に、使用されるＭＹＸＶ株を感染させることによって調製され、ウイルスが培養細胞内で複製して細胞表面を破壊し、それによってウイルス粒子を放出して採取するための当該技術分野で知られている標準的な方法によって、放出できるように感染を進行させることによって調製することができる。一旦採取されると、ウイルス力価は、許容（例えば、ウサギ）細胞のコンフルエントな菌叢を感染させ、プラークアッセイを行うことによって決定されてもよい。
Ｍ１５３の改変
ＭＹＸＶ Ｍ１５３遺伝子産物は、多様な細胞受容体およびタンパク質のダウンレギュレーション、例えば、ヒト細胞におけるＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４の分解に関与し得るＥ３－ユビキチンリガーゼである。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰を有する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、免疫エピトープの提示、例えば、ウイルスおよび／または癌免疫ペプチドのＭＨＣ依存性の提示を増強することができる。感染させた癌細胞による免疫エピトープの提示の増強は、抗癌ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答などの抗癌Ｔ細胞応答を含むより強い免疫応答を誘発できる。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＭＨＣ－ＩによってＭ１５３ＫＯウイルスを感染させた腫瘍細胞からの直接的な抗原の提示を増加させ、ＭＹＸＶによって媒介される免疫活性化を増強する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＣＤ４の発現または活性を増加させ、それによって、Ｔ細胞の活性および抗癌免疫応答を増強する。
ＭＹＸＶ Ｍ１５３遺伝子産物は、多様な細胞受容体およびタンパク質のダウンレギュレーション、例えば、ヒト細胞におけるＭＨＣクラスＩおよびＣＤ４の分解に関与し得るＥ３－ユビキチンリガーゼである。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰を有する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、免疫エピトープの提示、例えば、ウイルスおよび／または癌免疫ペプチドのＭＨＣ依存性の提示を増強することができる。感染させた癌細胞による免疫エピトープの提示の増強は、抗癌ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答などの抗癌Ｔ細胞応答を含むより強い免疫応答を誘発できる。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＭＨＣ－ＩによってＭ１５３ＫＯウイルスを感染させた腫瘍細胞からの直接的な抗原の提示を増加させ、ＭＹＸＶによって媒介される免疫活性化を増強する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３タンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＣＤ４の発現または活性を増加させ、それによって、Ｔ細胞の活性および抗癌免疫応答を増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、Ｍ１５３遺伝子の改変を含む。いくつかの場合において、改変は、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰させる（例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の機能を損なう）変異である。
いくつかの場合において、変異は、欠失、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰する欠失である。いくつかの実施形態において、変異は、Ｍ１５３遺伝子の核酸配列の少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の欠失である。いくつかの実施形態において、変異は、Ｍ１５３遺伝子全体の欠失である。いくつかの場合において、改変は部分的欠失であり、例えば、Ｍ１５３遺伝子の核酸配列の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも７５０個、少なくとも５００個、少なくとも５５０個、または少なくとも６００個の核酸の欠失である。いくつかの実施形態において、欠失は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。いくつかの実施形態において、欠失は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。
いくつかの場合において、変異は、挿入、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰する挿入である。いくつかの実施形態において、挿入は、非ウイルス分子をコードする導入遺伝子、例えば、ＴＮＦ、デコリン、ＩＬ－１２、レポータータグ、またはそれらの組み合わせをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、２個の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、３個の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、４個の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、５個の導入遺伝子を含む。導入遺伝子は、ウイルスのＭ１５３遺伝子を破壊し（例えば、中断し）、Ｍ１５３転写物および／またはタンパク質の活性または発現レベルを減衰することができる。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＩＬ－１２をコードする導入遺伝子およびデコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子およびＩＬ－１２をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子およびデコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、ＴＮＦをコードする導入遺伝子、ＩＬ－１２をコードする導入遺伝子、およびデコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、挿入は、１個以上の導入遺伝子の発現を駆動する１個以上のプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、１個以上のプロモーター、例えば、ｐ１１プロモーターおよび／またはｓＥ／Ｌプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、挿入は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３遺伝子破壊を導入遺伝子発現と組み合わせることによって、得られる組換えウイルスの抗腫瘍特性を改善する。
いくつかの実施形態において、挿入は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個、少なくとも５００個、少なくとも６００個、少なくとも７００個、少なくとも８００個、少なくとも９００個、少なくとも１０００個、少なくとも１５００個、または少なくとも２０００個の核酸の挿入である。
いくつかの実施形態において、変異は、挿入および欠失を含み、例えば、Ｍ１５３の１個以上のヌクレオチドの欠失、および本明細書に開示される１個以上の導入遺伝子の挿入を含む。
いくつかの実施形態において、挿入は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。いくつかの実施形態において、挿入は、Ｍ１５３遺伝子配列のリーディングフレームを変更し、それによって、Ｍ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を破壊する。
いくつかの場合において、変異は、置換、例えば、Ｍ１５３遺伝子によってコードされるタンパク質の活性または発現レベルを減衰する置換である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個の核酸が置換されている。いくつかの実施形態において、置換は、終止コドン、例えば、完全長のＭ１５３転写物および／またはタンパク質の発現を妨げる時期尚早の終止コドンをＭ１５３遺伝子配列に導入する。いくつかの実施形態において、置換は、プロモーター（例えば、野生型ＭＹＸＶにおいてＭ１５３の発現を駆動するプロモーター）を破壊する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の活性レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードする対応のＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰させる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される改変または変異は、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードする対応のＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰させる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードする対応のＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰されるＭ１５３タンパク質の活性レベルを有する。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、野生型ＭＹＸＶ、または機能的な野生型Ｍ１５３をコードする対応のＭＹＸＶと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％減衰されるＭ１５３遺伝子および／またはタンパク質の発現レベルを有する。
いくつかの実施形態において、例えば、Ｔ細胞増殖または活性化マーカーの発現を測定するフローサイトメトリーアッセイによって決定した場合、Ｍ１５３遺伝子および／またはタンパク質の活性および／または発現レベルの減衰は、ＭＹＸＶを感染させた細胞に応答してＴ細胞の活性化（例えば、ウイルスまたは癌抗原に特異的なＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化）を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％程度、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または少なくとも約１００倍増加させる。
ＴＮＦ
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、ＴＮＦ－αタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は、ヒトＴＮＦ－αタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は、抗腫瘍免疫細胞を活性化するか、または癌細胞死を誘導することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、ＴＮＦ－αタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は、ヒトＴＮＦ－αタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αタンパク質は、抗腫瘍免疫細胞を活性化するか、または癌細胞死を誘導することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
ＴＮＦは、自然炎症性免疫応答の一部であるサイトカインである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦは、後天的な（例えば、適応）免疫応答の増幅に関与する。ＴＮＦは、細胞表面免疫リガンドとして発現することができ、例えば、骨髄系の細胞において高レベルで発現している、可溶性リガンドの切断と放出を触媒する変換タンパク質分解酵素（ＴＡＣＥなど）を発現する特定の細胞で産生されると、切断された可溶性三量体サイトカインとして分泌されることもあり得る。１個のＴＮＦエフェクター経路は、ＴＮＦ受容体－１（ＴＮＦＲ１）経路を通しての細胞死の誘導である。いくつかの実施形態において、ＴＮＦによるＴＮＦＲ１経路の誘導は、アポトーシスまたはネクロトーシスをもたらす。いくつかの実施形態において、ＴＮＦは、例えば、抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞を活性化することによって、自然免疫応答および適応免疫応答を活性化する。
可溶性ＴＮＦの全身投与が強力な抗腫瘍薬としてヒトにおいて機能し得るという初期の希望にもかかわらず、いくつかの臨床試験は、分泌されたサイトカインが可溶性リガンドで全身的に治療された患者において重度の全身毒性を引き起こすことを示した。さらに、全身性ＴＮＦ処置は、前臨床的に報告された患者に劇的な抗腫瘍効果を誘発しなかった。本明細書に開示されるＭＹＸＶを感染させた細胞によって発現するＴＮＦ、例えば、ＴＮＦの分泌膜または細胞表面膜形態は、全身性のＴＮＦを介した有害な毒性作用を最小限に抑えながら、腫瘍微小環境においてより高度なバイスタンダー細胞殺傷を誘発することによって局所癌細胞死を改善し、また同じ腫瘍床内に存在する様々なクラスの免疫細胞の抗癌活性を刺激し得る。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置換するか、またはそれに隣接している遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－ａ遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間に挿入される遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子を置換または破壊する遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α遺伝子は、例えば、本明細書に開示される組換え核酸の挿入の一環として、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子を置換または破壊する。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α遺伝子の発現は、ポックスウイルス合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α遺伝子の発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。
いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－α遺伝子の発現は、Ｐ１１プロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター）によって駆動される。いくつかの実施形態において、後期プロモーターｐ１１の使用によって、ウイルスに対して許容性を示す癌細胞へのＴＮＦ－αの発現を制限するか、または実質的に制限し、末梢血単核細胞などの他の細胞型のウイルスの不稔感染においてＴＮＦ－αの発現を減少させる。いくつかの実施形態において、後期プロモーターｐ１１の使用によって、例えば、感染後の初期の時点での非癌細胞における発現の低下に起因して、他のプロモーターからのＴＮＦ－αの発現に関連する毒性を制限する。ＴＮＦ－αの発現レベルは、本明細書に開示される一例によって決定されるものであってもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、細胞感染の所望の段階においてＴＮＦ－αの発現を促進する組換え核酸を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、細胞感染の初期段階においてＴＮＦ－αの発現を促進する組換え核酸、例えば、測定可能なレベルのＴＮＦ－α、あるいは感染後１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、４時間未満、または２時間未満で感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルのＴＮＦ－αを含む。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、例えば、測定可能なレベルのＴＮＦ－α（例えば、検出限界を上回る）、あるいは感染後約６時間、約１２時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、または約４８時間で、感染細胞（例えば、癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞）の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルのＴＮＦ－αを産生するために、組換え核酸を含むＭＹＸＶによる細胞感染の後期段階においてＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約６時間で、感染細胞（例えば、癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞）の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約１２時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約１８時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約２４時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約３２時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約４８時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのＴＮＦ－αの発現を促進する。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、感染後少なくとも約６時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、感染後少なくとも約１２時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、感染後少なくとも約１８時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、感染後少なくとも約２４時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、感染後少なくとも約３２時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、感染後少なくとも約４８時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１００００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αのレベルは、列挙された時点で検出限界を下回る。感染細胞は、癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞、血液癌細胞、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、黒色腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７（胃癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－１（黒色腫）、ＣＯＬＯ２０５（結腸癌）、ＬｏＶｏ（結腸直腸癌）、ＨＣＣ１８０６（棘融解型平上皮癌／乳癌）、ＨＣＣ１５９９（乳癌）、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＳＷ６２０（結腸直腸癌）、ＨＥＰ３Ｂ（肝細胞癌）、ＭＫＮ－４５（転移性胃腺癌）、ＳＪＳＡ－１（骨肉腫）、ＨＵＨ－７（肝細胞癌）、Ａ６７３（ユーイング肉腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５（転移性黒色腫）、Ｈ１９７５（肺腺癌／非小細胞肺癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（黒色腫）、ＨＴ－２９（結腸直腸腺癌）、Ａ２０４（横紋筋肉腫）、Ａ５４９（肺腺癌）、ＤＬＤ－１（結腸直腸腺癌）、Ａ３７５（黒色腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（転移性乳腺癌）、ＳＫ－ＭＥＳ－１（肺扁平上皮癌）、Ｈ３５８（細気管支肺胞腺癌／非小細胞肺癌）、ＨＥＰ－Ｇ２（肝芽細胞腫／肝細胞癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７（転移性乳癌）、ＫＭＳ－３４（ｒ）、ＬＰ－１、ＲＭＰＩ－８２２６、Ｌ３６３、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ１．ｓ、Ｕ２６６、ＫＭＳ－３４、またはＡＮＢＬ－６細胞であってもよい。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後３時間で非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ－αを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後６時間で非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ－αを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１２時間で非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ－αを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１８時間で非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ－αを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後２４時間で非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ－αを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後３６時間で非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１００００ｐｇ／ｍＬ未満のＴＮＦ－αを誘発する。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αのレベルは、列挙された時点で検出限界を下回る。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。いくつかの実施形態において、誘発されるＴＮＦ－αのレベルは、検出限界を下回る。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに暴露されるか、または感染される、本明細書に開示される癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞の集団によって産生されるＴＮＦ－αのレベル、例えば、感染後６時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに暴露されるか、または感染される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＴＮＦ－αのレベル、例えば、感染後１２時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに暴露されるか、または感染される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＴＮＦ－αのレベル、例えば、感染後１８時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに暴露されるか、または感染される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＴＮＦ－αのレベル、例えば、感染後２４時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに暴露されるか、または感染される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＴＮＦ－αのレベル、例えば、感染後３６時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに暴露されるか、または感染される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＴＮＦ－αのレベル、例えば、感染後４８時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現は、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の検出限界を下回り、かつ、癌細胞の検出限界を上回る。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１２時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後２４時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後３６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後４８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下で産生されるＴＮＦ－αのレベルは、列挙された時点で検出限界を下回り、かつ、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される場合は検出限界を上回る。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１２時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後２４時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後３６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＴＮＦ－αを発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後４８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＴＮＦ－αを発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＴＮＦ－αを発現する。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示される配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示されている配列に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示されている配列に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、２０１９年７月３日に公開されたＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５（エントリーバージョン２４７）に示されている配列を含む。
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ０１３７５の残基７７～２３３を含む。
いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１８または配列番号４１に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１８または配列番号４１に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１８または配列番号４１に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号１８または配列番号４１を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦは、配列番号１８または配列番号４１の配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦをコードする遺伝子は、配列番号１８または配列番号４１の配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、あるいは上述のパーセンテージのいずれか２つによって規定されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含む。
いくつかの場合において、本開示のＭＹＸＶまたは組換え核酸によってコードされるＴＮＦタンパク質は、配列番号３５、配列番号３５の残基７７～２３３、または配列番号４３に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３５、配列番号３５の残基７７～２３３、または配列番号４３に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３５、配列番号３５の残基７７～２３３、または配列番号４３に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦタンパク質は、配列番号３５、配列番号３５の残基７７～２３３、または配列番号４３を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）タンパク質をコードしない。
ＩＬ－１２
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）タンパク質をコードする１個以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、ヒトＩＬ－１２タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、免疫細胞の分化を促進すること、または免疫細胞の細胞毒性を誘発することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、非ウイルス分子を含み（例えば、コードし）、例えば、インターロイキン１２（ＩＬ－１２）タンパク質をコードする１個以上の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、ヒトＩＬ－１２タンパク質である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は可溶性である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２タンパク質は、免疫細胞の分化を促進すること、または免疫細胞の細胞毒性を誘発することによって、ＭＹＸＶの抗癌活性をさらに増強する。
ＩＬ－１２は、サイトカインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）の分化を促進し、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の細胞傷害性を増強する。いくつかの実施形態において、このＩＬ－１２の作用は、抗癌免疫応答を促進するために、自然免疫および適応免疫の要素間の相互接続の改善を作り出す。いくつかの実施形態において、これが自然免疫および適応免疫を橋渡しすることに起因して、ＩＬ－１２は、ＭＹＸＶの抗腫瘍効果を増強する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＦＮ－γ（抗癌防御のメカニズムを調整するサイトカイン）の産生を強力に刺激し、それによって、ＭＹＸＶの抗腫瘍効果を増強する。
組換えＩＬ－１２サイトカイン療法の全身送達の臨床試験は、毒性事象、全身投与されたＩＬ－１２の一過性の性質、および腫瘍誘発性免疫抑制のために、癌患者において満足のいく結果を誘発しなかった。それにもかかわらず、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で局所的にＩＬ－１２を発現するウイルスは、強力な抗腫瘍効果をもたらす可能性があり、例えば、ＩＬ－１２の発現は、適切なプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、導入遺伝子がＴＭＥ内で局所的に発現されるように、腫瘍床に制限される腫瘍溶解性ウイルスからのＩＬ－１２の発現は、このサイトカインの全身送達に関連する毒性効果を低減する。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶによるＩＬ－１２の２個のサブユニットの共発現によって、１個以上の種類の癌に対する武装ＭＹＸＶによって誘導される抗腫瘍免疫が改善される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２α（ｐ３５）サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットは、ＩＬ－１２α遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ヒトＩＬ－１２α遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ＩＲＥＳによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子の発現は、Ｐ１１プロモーターなどのプロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター、ワクシニアウイルス後期プロモーターＰ１１）によって駆動される。いくつかの実施形態において、後期プロモーターＰ１１の使用によって、ウイルスに対して許容性を示す癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞へのＩＬ－１２αの発現を制限するか、または実質的に制限し、末梢血単核細胞などの他の細胞型のウイルスの不稔感染においてＩＬ－１２αの発現を減少させる。いくつかの実施形態において、後期プロモーターＰ１１の使用によって、他のプロモーター（例えば、初期プロモーターまたはｓＥ／Ｌプロモーター）からのＩＬ－１２αの発現に関連する毒性を制限するか、または減少させる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間、例えば、Ｍ１５３の欠失または破壊を伴うＭＹＸＶ中にある。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、Ｍ１５３遺伝子またはその一部を置換または破壊する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２α遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２β（ｐ４０）サブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットは、ＩＬ－１２β遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ヒトＩＬ－１２β遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子の発現は、ＩＲＥＳによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子の発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子の発現は、Ｐ１１プロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター、ワクシニアウイルス後期プロモーターＰ１１）によって駆動される。いくつかの実施形態において、後期プロモーターＰ１１の使用によって、ウイルスに対して許容性を示す癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞へのＩＬ－１２βの発現を制限するか、または実質的に制限し、末梢血単核細胞などの他の細胞型のウイルスの不稔感染においてＩＬ－１２βの発現を減少させる。いくつかの実施形態において、後期プロモーターｐ１１の使用によって、他のプロモーターからのＩＬ－１２βの発現に関連する毒性を制限するか、または減少させる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間、例えば、Ｍ１５３の欠失または破壊を伴うＭＹＸＶ中にある。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ＭＹＸＶのＭ１５３遺伝子を置換または破壊する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２β遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、共有結合している。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、共有結合していない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、１個の転写物として発現される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、異なる転写物として、例えば、別個のプロモーターによって駆動される異なる転写物として発現される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットは、１個のポリペプチドとして、例えば、２個のサブユニットを結合するペプチドリンカーを有する１個のポリペプチドとして発現される。リンカー配列は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸残基の長さであり得る。リンカーは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０アミノ酸残基の長さであり得る。リンカーは、最大４、最大５、最大６、最大７、最大８、最大９、最大１０、最大１５、最大２０、最大２５、最大３０、最大４０、または最大５０アミノ酸残基の長さであり得る。フレキシブルリンカーは、グリシン残基およびセリン残基の伸長を含む配列を有し得る。グリシン残基およびセリン残基は、サイズが小さいため、柔軟性があり、接続された機能ドメインの移動が可能になる。セリンまたはスレオニンの取り込みによって、水分子と水素結合が形成されることによって水溶液中のリンカーの安定性が維持され、それによって、リンカーとタンパク質部分の間の好ましくない相互作用を低下させることができる。フレキシブルリンカーは、柔軟性を維持するためのスレオニンやアラニンなどの追加のアミノ酸、ならびに、溶解性を向上させるためのリジンやグルタミンなどの極性アミノ酸を含むこともできる。リジッドリンカーは、例えば、アルファヘリックス構造を有することができる。アルファヘリックスのリジッドリンカーは、タンパク質ドメイン間のスペーサーとして機能することができる。リンカーは、配列番号３１または５１～６０の配列のいずれか、またはその繰り返しを含むことができる。配列番号５１～６０は、フレキシブルリンカー配列の例を提供する。配列番号５７～６０は、リジッドリンカー配列の例を提供する。リンカーは、エラスチンリンカーまたはエラスチン様リンカーであり得、例えば、配列番号３１に提示される（例えば、配列番号６によってコードされる）リンカー、あるいは配列番号３１に対して１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸挿入、欠失、または置換を有するリンカーであり得る。リンカーは、自己切断リンカーであり得、例えば、適切な比でＩＬ－１２サブユニットの産生を促進するための、例えば、２Ａペプチドリンカーであり得る。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、比較的低レベルのＩＬ－１２を発現する。ＩＬ－１２の比較的低い発現は、例えば、ＩＬ－１２サブユニットをコードする配列間のＩＲＥＳ配列の使用によって達成することができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、比較的高レベルのＩＬ－１２を発現する。ＩＬ－１２の比較的高レベルの発現は、例えば、単一ポリペプチドにおいてＩＬ－１２のサブユニットを結合する適切なリンカー、例えば、配列番号３１のリンカーなどのエラスチンリンカーの使用によって達成することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２発現のレベルは、本明細書に開示される一例、例えば、実施例２のアッセイによって決定されるものであり得る。例えば、Ｖｅｒｏ細胞は、ＭＯＩ１で本開示のＭＹＸＶを感染させてもよく、感染後２４時間で上清は採取されてもよく、ＩＬ－１２の量はＥＬＩＳＡで測定されてもよい。いくつかの実施形態において、低レベルのＩＬ－１２の発現は、実施例２のＥＬＩＳＡアッセイによって決定されるように、５００ｎｇ／ｍＬ未満、４００ｎｇ／ｍＬ未満、３００ｎｇ／ｍＬ未満、２００ｎｇ／ｍＬ未満、１００ｎｇ／ｍＬ未満、５０ｎｇ／ｍＬ未満、４０ｎｇ／ｍＬ未満、３０ｎｇ／ｍＬ未満、２０ｎｇ／ｍＬ未満、１０ｎｇ／ｍＬ未満、または５ｎｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２であり得る。いくつかの実施形態において、高レベルのＩＬ－１２の発現は、実施例２のアッセイによって決定されるように、２０ｎｇ／ｍＬを超える、３０ｎｇ／ｍＬを超える、４０ｎｇ／ｍＬを超える、５０ｎｇ／ｍＬを超える、６０ｎｇ／ｍＬを超える、７０ｎｇ／ｍＬを超える、８０ｎｇ／ｍＬを超える、９０ｎｇ／ｍＬを超える、１００ｎｇ／ｍＬを超える、１５０ｎｇ／ｍＬを超える、２００ｎｇ／ｍＬを超える、２５０ｎｇ／ｍＬを超える、３００ｎｇ／ｍＬを超える、４００ｎｇ／ｍＬを超える、または５００ｎｇ／ｍＬを超えるＩＬ－１２であり得る。いくつかの実施形態において、高レベルのＩＬ－１２の発現は、１５０ｎｇ／ｍＬを超えるＩＬ－１２であり、低レベルのＩＬ－１２の発現は、１５０ｎｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２である。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、細胞感染の所望の段階においてＩＬ－１２の発現を促進する組換え核酸を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、例えば、測定可能なレベルの（例えば、検出限界を上回る）ＩＬ－１２、あるいは感染後１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、４時間未満、または２時間未満で感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、または１００００ｐｇ／ｍＬのレベルのＩＬ－１２を産生するために、細胞感染の初期段階においてＩＬ－１２の発現を促進する組換え核酸を含む。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、例えば、測定可能なレベルのＩＬ－１２（例えば、検出限界を上回る）、あるいは感染後約６時間、約１２時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、または約４８時間で、感染細胞（例えば、癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞）の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルのＩＬ－１２を産生するために、組換え核酸を含むＭＹＸＶによる細胞感染の後期段階におけるＩＬ－１２の発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約６時間で、感染細胞（例えば、癌細胞、または不十分な生来の抗ウイルス応答を有する細胞）の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２の発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約１２時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２の発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約１８時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２の発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約２４時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２の発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約３２時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２の発現を促進する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、感染後約４８時間で、感染細胞の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのＩＬ－１２の発現を促進する。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、感染後少なくとも約６時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、感染後少なくとも約１２時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、感染後少なくとも約１８時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、感染後少なくとも約２４時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、感染後少なくとも約３２時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、感染後少なくとも約４８時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、列挙された時点で検出限界を下回る。感染細胞は、癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞、血液癌細胞、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、黒色腫細胞、多発性骨髄腫細胞、ＮＣＩ－Ｎ８７（胃癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－１（黒色腫）、ＣＯＬＯ２０５（結腸癌）、ＬｏＶｏ（結腸直腸癌）、ＨＣＣ１８０６（棘融解型平上皮癌／乳癌）、ＨＣＣ１５９９（乳癌）、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＳＷ６２０（結腸直腸癌）、ＨＥＰ３Ｂ（肝細胞癌）、ＭＫＮ－４５（転移性胃腺癌）、ＳＪＳＡ－１（骨肉腫）、ＨＵＨ－７（肝細胞癌）、Ａ６７３（ユーイング肉腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５（転移性黒色腫）、Ｈ１９７５（肺腺癌／非小細胞肺癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（黒色腫）、ＨＴ－２９（結腸直腸腺癌）。Ａ２０４（横紋筋肉腫）、Ａ５４９（肺腺癌）、ＤＬＤ－１（結腸直腸腺癌）、Ａ３７５（黒色腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（転移性乳腺癌）、ＳＫ－ＭＥＳ－１（肺扁平上皮癌）、Ｈ３５８（細気管支肺胞腺癌／非小細胞肺癌）、ＨＥＰ－Ｇ２（肝芽細胞腫／肝細胞癌）、ＭＤＡ－ＭＢ－１５７（転移性乳癌）、ＫＭＳ－３４（ｒ）、ＬＰ－１、ＲＭＰＩ－８２２６、Ｌ３６３、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ１．ｓ、Ｕ２６６、ＫＭＳ－３４、またはＡＮＢＬ－６細胞であってもよい。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後６時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１２時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１８時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後２４時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後３６時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のＩＬ－１２を誘発する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、検出限界を下回る。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されたか、または暴露された、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＩＬ－１２のレベル、例えば、感染後６時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２の産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されたか、または暴露された、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＩＬ－１２のレベル、例えば、感染後１２時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２の産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されたか、または暴露された、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＩＬ－１２のレベル、例えば、感染後１８時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２の産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されたか、または暴露された、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＩＬ－１２のレベル、例えば、感染後２４時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２の産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されたか、または暴露された、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＩＬ－１２のレベル、例えば、感染後３６時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２の産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されたか、または暴露された、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるＩＬ－１２のレベル、例えば、感染後４８時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２の産生を誘発する。いくつかの実施形態において、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によって産生されるＩＬ－１２のレベルは、検出限界を下回る。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１２時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後２４時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後３６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後４８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下で産生されるＩＬ－１２のレベルは、列挙された時点で検出限界を下回り、かつ、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される場合は検出限界を上回る。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１２時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後１８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後２４時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後３６時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＩＬ－１２を発現する。いくつかの実施形態において、ｐ１１プロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現するＭＹＸＶに細胞の集団（例えば、本明細書に開示される非癌細胞、ＰＢＭＣ、または癌細胞の集団）を感染させると、感染された細胞の集団は、感染後４８時間で、ｓＥ／Ｌプロモーターの調節制御下でＩＬ－１２を発現する対応のＭＹＸＶに感染させた細胞の集団と比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍高いレベルのＩＬ－１２を発現する。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２サブユニットの一方または両方は、短縮されてもよい。短縮型サブユニットを有するＩＬ－１２の例は、配列番号３６に提示され、これは、マウスＩＬ－１２β（配列番号３７）、エラスチンリンカー（配列番号３１）、および短縮型マウスＩＬ－１２α（配列番号３８）を含む。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号２９、配列番号２９の残基３５～２５３、配列番号２９の残基５７～２５３、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号２９、配列番号２９の残基３５～２５３、配列番号２９の残基５７～２５３、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号２９、配列番号２９の残基３５～２５３、配列番号２９の残基５７～２５３、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号２９、配列番号２９の残基３５～２５３、配列番号２９の残基５７～２５３、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４８、配列番号４９、または配列番号５０を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基２３～３２８、または配列番号３７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基２３～３２８、または配列番号３７に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基２３～３２８、または配列番号３７に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号２８、配列番号２８の残基２３～３２８、または配列番号３７を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２は、配列番号３４に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＩＬ－１２は、配列番号３４に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、ＩＬ－１２は、配列番号３４に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、配列番号３４を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号４または配列番号５に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号４または配列番号５に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号４または配列番号５に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号４または配列番号５を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットは、配列番号４または配列番号５の配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αサブユニットをコードする遺伝子は、配列番号４または配列番号５の配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、あるいは上述のパーセンテージのいずれか２つによって規定されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含む。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットは、配列番号３の配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βサブユニットをコードする遺伝子は、配列番号３の配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、あるいは上述のパーセンテージのいずれか２つによって規定されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含む。
いくつかの場合において、ＩＬ－１２は、配列番号９に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２は、配列番号９に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、ＩＬ－１２は、配列番号９に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、配列番号９を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２は、配列番号９の配列を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２をコードする遺伝子は、配列番号９の配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、あるいは上述のパーセンテージのいずれか２つによって規定されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含む。
デコリン
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、デコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ヒトデコリンタンパク質である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、可溶性である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断または減少させることにより、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、デコリンをコードする導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ヒトデコリンタンパク質である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、可溶性である。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、膜または表面に結合している。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、ＴＧＦ－βシグナル伝達を遮断または減少させることにより、ＭＹＸＶの抗癌活性を増強する。
デコリンは、間質組織および上皮細胞内に存在して機能する細胞外マトリックスプロテオグリカンファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態において、デコリンは、細胞増殖、生存、転移および／または血管新生に関与するシグナル伝達分子を直接的または間接的に標的化することによって、異なる種類の癌の生物学に影響を与える。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－β誘導性シグナル伝達を遮断する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦ－βは、いくつかの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における免疫抑制に寄与するサイトカインである。いくつかの場合において、ＴＧＦ－βは、他の場合では、癌細胞を認識して攻撃する可能性があるエフェクターＴ細胞を、調節（サプレッサー）Ｔ細胞に変換し、この調節Ｔ細胞は、代わりに、癌細胞を認識および排除するために必要な生来の炎症反応および獲得免疫経路をオフにするか、または減少させる。複数の種類の癌では、ＴＧＦ－βシグナル伝達経路の一部が変異しており、このサイトカインはもはや細胞標的の少なくとも一部を制御していない。これらの癌細胞は増殖し、ＴＧＦ－βの内因性産生を増加させる可能性があり、これは周囲の間質細胞、免疫細胞、内皮および平滑筋に作用して、癌組織内の局所免疫抑制および腫瘍床血管新生を引き起こし、これは、癌をより侵襲的にさえする。したがって、いくつかの実施形態において、デコリンを発現する腫瘍溶解性ＭＹＸＶベクターは、ＴＭＥ内で直接ＴＧＦ－βを遮断し、それによって、デコリンを発現しないＭＹＸＶよりも強い抗腫瘍免疫応答を誘導する。
さらに、デコリンは、腫瘍細胞の増殖および成長を阻害することができる。様々な固形腫瘍へのデコリンのウイルス送達は、腫瘍形成を直接打ち消す可能性がある。いくつかの実施形態において、デコリンは、ＴＧＦ－βの局所的な過剰発現によって保護される少なくともいくつかの種類の癌の抗癌標的として使用される。
いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、デコリン遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ヒトデコリン遺伝子である。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ＩＲＥＳによって駆動される。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ｓＥ／Ｌプロモーターなどのプロモーターによって、例えば、感染サイクルの複数の段階において発現させるために駆動される。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子の発現は、Ｐ１１プロモーターなどのプロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター、ワクシニアウイルス後期プロモーターＰ１１）によって駆動される。いくつかの実施形態において、後期プロモーターＰ１１の使用によって、ウイルスに対して許容性を示す癌細胞へのデコリンの発現を制限するか、または実質的に制限し、末梢血単核細胞などの他の細胞型のウイルスの不稔感染においてデコリンの発現を減少させる。いくつかの実施形態において、後期プロモーター Ｐ１１の使用によって、他のプロモーターからのデコリンの発現に関連する毒性を制限するか、または減少させる。
いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、細胞感染の所望の段階においてデコリンの発現を促進する組換え核酸を含む。いくつかの実施形態において、本開示のＭＹＸＶは、例えば、測定可能なレベルのデコリン、あるいは感染後１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、４時間未満、または２時間未満で感染細胞の培養上清中に少なくとも１０ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルのデコリンを産生するために、細胞感染の初期段階においてデコリンの発現を促進する組換え核酸を含む。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、例えば、測定可能なレベルのデコリン（例えば、検出限界を上回る）、あるいは感染後約６時間、約１２時間、約１８時間、約２０時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、または約４８時間で、感染細胞（例えば、癌細胞）の培養上清中に少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルのデコリンを産生するために、組換え核酸を含むＭＹＸＶによる細胞感染の後期段階におけるデコリンの発現を促進する。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、デコリンは、感染後少なくとも約６時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２６時間、または少なくとも約４８時間まで、少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのレベルで発現することはない。感染細胞は、癌細胞、例えば、固形腫瘍細胞、血液癌細胞、肺癌細胞、結腸直腸癌細胞、黒色腫細胞、多発性骨髄腫細胞、または本明細書に開示される別の種類の細胞であってもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後６時間で細胞（例えば、癌細胞、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１２時間で細胞（例えば、癌細胞、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１８時間で細胞（例えば、癌細胞、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後２４時間で細胞（例えば、癌細胞、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後３６時間で細胞（例えば、癌細胞、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって少なくとも１００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５０，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも１００，０００ｐｇ／ｍＬ、少なくとも５００，０００ｐｇ／ｍＬ、または少なくとも１，０００，０００ｐｇ／ｍＬのデコリンを誘発する。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後６時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１２時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後１８時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後２４時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、感染後３６時間で、細胞（例えば、非癌細胞、ＰＢＭＣ）によって１００ｐｇ／ｍＬ未満、５００ｐｇ／ｍＬ未満、１０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０００ｐｇ／ｍＬ未満、１０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５０，０００ｐｇ／ｍＬ未満、１００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、５００，０００ｐｇ／ｍＬ未満、または１，０００，０００ｐｇ／ｍＬ未満のデコリンを誘発する。いくつかの実施形態において、デコリンのレベルは、列挙された時点で検出限界を下回る。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されるか、または暴露される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるデコリンのレベル、例えば、感染後６時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのデコリンの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されるか、または暴露される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるデコリンのレベル、例えば、感染後１２時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのデコリンの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されるか、または暴露される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるデコリンのレベル、例えば、感染後１８時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのデコリンの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されるか、または暴露される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるデコリンのレベル、例えば、感染後２４時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのデコリンの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されるか、または暴露される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるデコリンのレベル、例えば、感染後３６時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのデコリンの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、同一のウイルスに感染されるか、または暴露される、本明細書に開示される癌細胞の集団によって産生されるデコリンのレベル、例えば、感染後４８時間で評価される場合のレベルに比べて、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の集団によって少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍低いレベルのデコリンの産生を誘発する。いくつかの実施形態において、デコリンの産生レベルは、非癌細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の検出限界を下回り、かつ、癌細胞の検出限界を上回る。細胞は、感染多重度１でＭＹＸＶで処置することによって感染させてもよい。細胞は、複製物１個当たりおよそ１～１．５×１０５細胞で播種するか、および／または、およそ７０％コンフルエンスもしくは少なくとも７０％コンフルエンスで感染させてもよい。
いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間、例えば、Ｍ１５３の欠失または破壊を伴うＭＹＸＶ中にある。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、Ｍ１５３遺伝子を置換または破壊する。いくつかの実施形態において、デコリン遺伝子は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間の遺伝子間領域に挿入される。
いくつかの実施形態において、デコリンは、配列番号７の配列を含むか、実質的にそれからなるか、またはそれからなる遺伝子によってコードされる。いくつかの実施形態において、デコリンをコードする遺伝子は、配列番号７の配列と７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、あるいは上述のパーセンテージのいずれか２つによって規定されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含む。いくつかの場合において、デコリンは、配列番号７に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、デコリンは、配列番号７に対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。いくつかの場合において、デコリンは、配列番号７に対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む遺伝子によってコードされる。
いくつかの場合において、デコリンタンパク質は、配列番号３２、配列番号３２の残基３１～３５９、または配列番号４０もしくは４４～４７のいずれか１つに対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、デコリンタンパク質は、配列番号３２、配列番号３２の残基３１～３５９、または配列番号４０もしくは４４～４７のいずれか１つに対して９５％～９８％の間、または９５％～９９％の間の配列同一性を含む。いくつかの場合において、デコリンタンパク質は、配列番号３２、配列番号３２の残基３１～３５９、または配列番号４０もしくは４４～４７のいずれか１つに対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を含む。いくつかの実施形態において、デコリンタンパク質は、配列番号３２、配列番号３２の残基３１～３５９、または配列番号４０もしくは４４～４７のいずれか１つを含む。
組換え核酸
本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、組換え核酸である。いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノムまたはＭＹＸＶゲノムの一部は、Ｍ１５３遺伝子の発現を減少させるように改変される。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３遺伝子の少なくとも一部を欠失またはノックアウトするように改変される。
本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、組換え核酸である。いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶゲノムの少なくとも一部を含む組換え核酸に関する。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶゲノムまたはＭＹＸＶゲノムの一部は、Ｍ１５３遺伝子の発現を減少させるように改変される。いくつかの実施形態において、Ｍ１５３遺伝子は、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３遺伝子の少なくとも一部を欠失またはノックアウトするように改変される。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、Ｍ１５３遺伝子に変異を導入するように操作される。変異は、例えば、挿入、欠失、置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、Ｍ１５３遺伝子が破壊される遺伝子ノックインを含む。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、非ウイルス分子をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、非ウイルス分子またはその成分、例えば、タンパク質をコードする導入遺伝子をコードする１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の核酸を含む。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αは、ヒトＴＮＦ－αである。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子を置換するか、またはそれに隣接している。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１３５Ｒ遺伝子とＭ１３６Ｒ遺伝子との間に挿入される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現は、ポックスウイルス合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現は、Ｐ１１プロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター）などのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子を破壊するか、それを置換するか、もしくはそれに隣接し、ならびに／または、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間にある。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、インターロイキン１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αは、ヒトＩＬ－１２αである。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αの発現は、Ｐ１１プロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター）などのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２αをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊するか、および／または、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間にある。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、インターロイキン１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βは、ヒトＩＬ－１２β遺伝子である。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βの発現は、Ｐ１１プロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター）などのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊するか、および／または、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間にある。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２βをコードする核酸およびＩＬ－１２αをコードする核酸は両方とも、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊するか、および／または、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間にある。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、デコリンをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、デコリンは、ヒトデコリンである。いくつかの実施形態において、デコリンの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、デコリンの発現は、Ｐ１１プロモーター（例えば、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーター）などのプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、デコリンの発現は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、デコリンをコードする核酸を含み、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊するか、および／または、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間にある。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、レポータータグをコードする核酸、例えば、蛍光タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、レポータータグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。いくつかの実施形態において、レポータータグの発現は、ｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、第２のレポータータグをコードする核酸をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグは、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、例えば、ｄｓＲｅｄを含む。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグの発現は、ポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態において、第２のレポータータグをコードする核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を破壊するか、および／または、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５２遺伝子とＭ１５４遺伝子との間にある。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸において第１の導入遺伝子（例えば、ＩＬ－１２）の発現を駆動するためにｐ１１プロモーターを使用することで、予想し得ない驚くべき効果がもたらされ、例えば、第２の導入遺伝子（例えば、デコリン）の発現を駆動するプロモーターに関係なく、第２の導入遺伝子の改変された有益な産生プロファイルがもたらされる。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）ＩＬ－１２βサブユニット、リンカー（例えば、本開示のエラスチンリンカーまたは別のリンカー）、およびＩＬ－１２αサブユニットを含むＩＬ－１２導入遺伝子に機能的に連結しているｐ１１プロモーターと、（ｉｉ）デコリン導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、任意選択で、（ｉｉｉ）レポーター導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このような組換え核酸の非限定的な例が、図１Ａおよび配列番号１０に提示されている。さらなる非限定的な例が、図４Ｆに提示されている。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、配列番号１１に提示されるような粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）ＩＬ－１２βサブユニット、リンカー（例えば、本開示のエラスチンリンカーまたは別のリンカー）、およびＩＬ－１２αサブユニットを含むＩＬ－１２導入遺伝子に機能的に連結しているｐ１１プロモーターと、（ｉｉ）ＴＮＦ－α導入遺伝子に機能的に連結しているｐ１１プロモーターと、（ｉｉｉ）デコリン導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、任意選択で、（ｉｖ）レポーター導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このような組換え核酸の非限定的な例が、図２Ａおよび配列番号２０に提示されている。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、配列番号２１に提示されるような粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）デコリン導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｉｉ）ＩＬ－１２βサブユニット、ＩＲＥＳ、およびＩＬ－１２αサブユニットを含むＩＬ－１２導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、任意選択で、（ｉｉｉ）レポーター導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このような組換え核酸の非限定的な例が、図３Ａおよび配列番号２５に提示されている。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、配列番号２６に提示されるような粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）ＩＬ－１２βサブユニット、ＩＲＥＳ、およびＩＬ－１２αサブユニットを含むＩＬ－１２導入遺伝子に機能的に連結しているｐ１１プロモーターと、（ｉｉ）デコリン導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、任意選択で、（ｉｉｉ）レポーター導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このような組換え核酸の非限定的な例が、図４Ａに提示されている。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む、粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）ＩＬ－１２βサブユニット、ＩＲＥＳ、およびＩＬ－１２αサブユニットを含むＩＬ－１２導入遺伝子に機能的に連結しているｐ１１プロモーターと、（ｉｉ）ＴＮＦ－α導入遺伝子に機能的に連結しているｐ１１プロモーターと、（ｉｉｉ）デコリン導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、任意選択で、（ｉｖ）レポーター導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このような組換え核酸の非限定的な例が、図４Ｂに提示されている。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉｉｉ）または（ｉｖ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む、粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）デコリン導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｉｉ）ＩＬ－１２βサブユニット、リンカー（本開示のエラスチンリンカーまたは別のリンカーなど）、およびＩＬ－１２αサブユニットを含むＩＬ－１２導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、任意選択で、（ｉｉｉ）レポーター導入遺伝子（例えば、ｄｓＲｅｄ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターまたはｐ１１プロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。このような組換え核酸の非限定的な例が、図４Ｃに提示されている。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む、粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’から３’に、（ｉ）ＴＮＦ－α導入遺伝子に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｉｉ）任意選択で、レポーター導入遺伝子（例えば、ＧＦＰ）に機能的に連結しているｓＥ／Ｌプロモーターとを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。組換え核酸は、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、（ｉ）の５’末端に５’組換えアームをさらに含み、（ｉ）または（ｉ）の３’末端に３’組換えアームをさらに含む（例えば、図４Ｄおよび図４Ｅに示されているように、Ｍ１３５とＭ１３６との間の遺伝子間領域）、粘液腫ウイルスゲノム、例えば、配列番号２６に提示されるような粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアームを任意選択で含んでもよい。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号１０、１１、２０、２１、２５、２６、６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号１０、１１、２０、２１、２５、２６、６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４のいずれか１つに対して９５％から９８％の間、または９５％から９９％の間の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号１０、１１、２０、２１、２５、２６、６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４のいずれか１つに対して約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０、１１、２０、２１、２５、または２６である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０、１１、２０、２１、２５、２６、６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４のいずれか１つと７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるか、あるいは上述のパーセンテージのいずれか２つによって規定されたパーセンテージの範囲で同一である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号１０に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号１１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号１１である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号２０に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２０である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号２１に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２１である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号２５に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２５である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号２６に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号２６である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号６３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号６３である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
いくつかの場合において、組換え核酸は、配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４である配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
組換え核酸は、例えば、相同組換えによる粘液腫ウイルスゲノムへの組込み、および／または粘液腫ウイルスゲノムの一部の欠失を標的とするために、粘液腫ウイルスゲノムの領域に対して相同性がある組換えアーム（例えば、１個または２個の組換えアーム）を含んでもよい。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’組換えアームを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、３’組換えアームを含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸は、５’組換えアームおよび３’組換えアームを含む。組換えアームのヌクレオチド配列は、組換え核酸の組込み後にＭＹＸＹのゲノム中に存在したままであってもよい。
５’組換えアームは、配列番号６５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも２００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも４００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも５００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも１５０個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも２００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも４００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５の少なくとも５００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。５’組換えアームは、配列番号６５のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。
３’組換えアームは、配列番号６６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも２００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも４００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも５００個の連続したヌクレオチドに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも１００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも１５０個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも２００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも３００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも４００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６の少なくとも５００個の連続したヌクレオチドを含んでもよい。３’組換えアームは、配列番号６６のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなってもよい。
ある特定の実施形態において、本開示の組換え核酸、導入遺伝子、またはタンパク質は、配列番号１～６６に提示される配列のいずれか１つに対して１つ以上の置換、欠失、または挿入を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはタンパク質は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上から、約１００個、９０個、８０個、７０個、６０個、５０個、４５個、４０個、３５個、３０個、２５個、２０個、１５個までの置換、欠失、または挿入を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはタンパク質は、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくともまたは少なくとも５０個の置換、欠失、または挿入を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはタンパク質は、最大１個、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個、最大１１個、最大１２個、最大１３個、最大１４個、最大１５個、最大１６個、最大１７個、最大１８個、最大１９個、最大２０個、最大２５個、最大３０個、最大３５個、最大４０個、最大４５個、または最大５０個の置換、欠失、または挿入を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはタンパク質は、１個から２個、１個から３個、１個から４個、１個から５個、１個から６個、１個から７個、１個から８個、１個から９個、１個から１０個、１個から１５個、１個から２０個、１個から３０個、１個から４０個、２個から３個、２個から４個、２個から５個、２個から６個、２個から７個、２個から８個、２個から９個、２個から１０個、２個から１５個、２個から２０個、２個から３０個、２個から４０個、３個から３個、３個から４個、３個から５個、３個から６個、３個から７個、３個から８個、３個から９個、３個から１０個、３個から１５個、３個から２０個、３個から３０個、３個から４０個、５個から６個、５個から７個、５個から８個、５個から９個、５個から１０個、５個から１５個、５個から２０個、５個から３０個、５個から４０個、１０個から１５個、１５個から２０個、または２０個から２５個の置換、欠失、または挿入を含む。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはタンパク質は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個の置換、欠失、または挿入を含む。置換は、保存的置換または非保存的置換であってもよい。１つ以上の置換、欠失、または挿入は、配列内のＮ末端、Ｃ末端、５’末端、３’末端、またはそれらの組み合わせにあってもよい。置換、欠失、または挿入は、連続的、非連続的、またはそれらの組み合わせであってもよい。
いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはそれからコードされるタンパク質は、シグナル配列を含むか、またはシグナル配列をコードする。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはそれからコードされるタンパク質は、シグナル配列を欠くか、またはシグナル配列をコードせず、例えば、本明細書で提供される配列と比較して、シグナル配列が除去される。いくつかの実施形態において、組換え核酸、導入遺伝子、またはそれからコードされるタンパク質は、本明細書に開示されるシグナル配列とは異なるシグナル配列を含む。
組成物および投与
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶを含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬組成物であるか、または医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
本明細書に開示されるのは、特定の実施形態において、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶを含む組成物である。いくつかの実施形態において、組成物は、医薬組成物であるか、または医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの注射可能な流体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、粉末、丸薬、錠剤、またはカプセルなどの固形組成物を含む。固形組成物を含むものなどのいくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、マンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体は、生物学的に中性の担体を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含む。
いくつかの実施形態において、薬学的に許容される担体または賦形剤の同一性または割合は、投与経路、生ウイルスとの適合性、または標準的な製薬慣行に基づいて決定される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＭＹＸＶの生物学的特性を著しく損なうことのない成分を配合されている。医薬組成物は、有効量の活性物質または複数の物質が薬学的に許容されるビヒクルと混合して組み合わされるように、対象への投与に適した薬学的に許容される組成物を調製するための既知の方法によって調製することができる。いくつかの実施形態において、組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、ビヒクル、または希釈剤と関連し、適切なｐＨおよび生理学的液体と等浸透圧である緩衝溶液に含まれるＭＹＸＶの溶液を含む。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、対象への投与のために製剤化される。当業者によって理解されるように、医薬組成物は、選択された投与経路に応じて様々な形態で対象に投与されてもよい。いくつかの場合において、医薬組成物は全身投与されるか、または全身投与用に製剤化される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局所的に投与されるか、または局所投与用に製剤化される。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、非経口的に投与されるか、または非経口投与用に製剤化される。非経口投与の例には、静脈内、腫瘍内、腹腔内、皮下、筋肉内、経上皮、鼻、肺内、髄腔内、直腸および局所の投与様式が含まれる。非経口投与は、選択された期間にわたる持続注入によるものであってもよい。非経口投与は、ボーラス注入によるものであってもよい。
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、経口投与されるか、または経口投与用に製剤化される。医薬組成物は、例えば、不活性希釈剤または担体と共に経口投与されてもよく、またはそれは、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入されてもよく、またはそれは錠剤に圧縮されてもよい。経口治療投与の場合、ＭＹＸＶは賦形剤と一緒に組み込まれ、摂取可能な錠剤、口腔内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形で使用されてもよい。
ＭＹＸＶの溶液は、生理学的に適切な緩衝液中で調製されてもよい。いくつかの実施形態において、通常の貯蔵および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための防腐剤を含むが、それは生ウイルスを不活性化しない。いくつかの実施形態において、使用される医薬組成物の用量は、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズおよび体重を含む個々の対象のパラメーター、処置の期間、同時療法（もしあれば）の性質、特定の投与経路、および医療従事者の知識と専門知識の範囲内にある他の同様の要因に依存する。ある特定の実施形態において、治療用ウイルスは、室温での保存のために凍結乾燥され得る。
医薬組成物は、追加の抗癌剤などの追加の治療剤をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、組成物は、化学療法剤を含む。化学療法剤は、例えば、対象の癌細胞または腫瘍性細胞に対して腫瘍溶解効果を示し、ＭＹＸＶの腫瘍殺傷効果を阻害または減少させない実質的に任意の薬剤であってもよい。例えば、化学療法剤は、アントラサイクリン、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン、メチルメラミン、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、抗生物質、代謝拮抗剤、葉酸類似体、プリン類似体、ピリミジン類似体、酵素、ポドフィロトキシン、白金含有剤またはサイトカインであってもよいが、これらに限定されない。好ましくは、化学療法剤は、癌性または腫瘍性である特定の細胞型に対して有効であることが知られているものである。いくつかの場合において、追加の治療剤は、免疫チェックポイントモジュレーターを含む。
いくつかの実施形態において、組成物は、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶによってｅｘ ｖｉｖｏで処置された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄（ＢＭ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせは、自己細胞を含む。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせは、同種異系ドナーから得られる。いくつかの実施形態において、ＰＢＭＣ、ＢＭ細胞、またはそれらの組み合わせは、異種ドナーから得られる。
使用の方法
本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、癌を阻害、軽減、処置、減少、または予防する必要のある対象において癌を阻害、軽減、処置、減少、または予防する方法であって、本明細書に記載されるような組成物または医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法である。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶをヒト対象などの対象に投与する工程を含み、それによって、必要としている対象において癌を処置および／または阻害する。
本明細書に開示されるのは、ある特定の実施形態において、癌を阻害、軽減、処置、減少、または予防する必要のある対象において癌を阻害、軽減、処置、減少、または予防する方法であって、本明細書に記載されるような組成物または医薬組成物を対象に投与する工程を含む、方法である。ある特定の実施形態において、方法は、本明細書に記載されるようなＭＹＸＶをヒト対象などの対象に投与する工程を含み、それによって、必要としている対象において癌を処置および／または阻害する。
いくつかの実施形態は、ＭＹＸＶを用いる予防的治療を含む。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有するか、癌を有する疑いがあるか、または癌を有するリスクがある。いくつかの実施形態は、癌を有する疑いがある対象を選択する工程を含む。いくつかの実施形態は、癌を有するリスクがある対象を選択する工程を含む。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有する。いくつかの実施形態において、方法は、癌を有する対象を選択する工程を含む。
いくつかの実施形態において、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、患者である。いくつかの実施形態において、対象は、動物または非ヒト動物である。非ヒト動物の例には、哺乳動物および非哺乳動物などの脊椎動物が含まれる。哺乳動物のいくつかの例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、およびマウスやラットなどの齧歯動物が含まれる。
いくつかの実施形態において、癌は、固形腫瘍である。肉腫および癌腫などの固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、骨形成性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓癌、乳癌、転移性乳癌／腺癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺腫、髄質癌、気管支癌、腎細胞癌、肝細胞腫、肝芽細胞腫、胆管癌、絨毛腫、ウィルムス腫瘍、頸部癌、精巣腫瘍、膀胱癌、メルケル細胞癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸直腸癌、結腸直腸腺癌、胃癌、胃腺癌、消化管癌、腺様嚢胞癌、神経内分泌腫瘍、棘融解型平上皮癌、細気管支肺胞癌、およびＣＮＳ腫瘍（神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、メナンギオーマ、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫など）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、癌は、骨肉腫、Ｔｒｉｐｌｅネガティブ乳癌、または黒色腫を含む。
いくつかの実施形態において、癌は、対象におけるある場所に転移している。いくつかの実施形態において、場所は、対象の肺、脳、肝臓、および／またはリンパ節を含む。
いくつかの実施形態において、癌は、血液癌を含む。血液癌は、血液癌の非限定的な例には、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞血液癌またはＴ細胞血液癌、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、多発性骨髄腫、混合表現型白血病、骨髄線維症、高リスク骨髄異形成症候群、超高リスク骨髄異形成症候群が含まれる。
いくつかの実施形態において、組成物は、癌細胞の生存率を低下させるか、および／または癌における免疫原性細胞死を活性化する。いくつかの実施形態において、癌は、組成物の投与時に阻害、軽減、または予防される。いくつかの実施形態において、投与は、対象の生存を改善する。
ＭＹＸＶまたはＭＹＸＶを含む組成物は、標準的な投与方法を使用して対象に投与されてもよい。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはウイルスを含む組成物は、全身投与される（例えば、ＩＶ注射）。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはウイルスを含む組成物は、疾患部位への注射によって（例えば、腫瘍内に）投与される。いくつかの実施形態において、ウイルスまたはウイルスを含む組成物は、経口的または非経口的に、または当該技術分野で知られている任意の標準的な方法によって投与される。ある特定の実施形態において、ＭＹＸＶまたはＭＹＸＶを含む組成物は、腫瘍および／または転移の部位に投与される。
ＭＹＸＶは、対象の臨床反応に応じて、必要に応じて調整され得る適切な量で最初に投与されてもよい。ウイルスの有効量は経験的に決定することができ、安全に投与できるＭＹＸＶの最大量、および望ましい結果を生み出すウイルスの最小量に依存する。
投与されるウイルスの濃度は、投与されるＭＹＸＶの特定の株の毒性、および標的とされる細胞の性質に応じて変化してもよい。一実施形態において、「感染性ユニット」とも呼ばれる、約３×１０１０未満のフォーカス形成単位（「ｆｆｕ」）の用量が、様々な実施形態においてヒト対象に投与され、約１０２～約１０９ｐｆｕの間、約１０２～約１０７ｐｆｕの間、約１０３～約１０６ｐｆｕの間、または約１０４～約１０５ｐｆｕの間を単回投与で投与されてもよい。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における免疫細胞（例えば、ＰＢＭＣ）によるサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。免疫細胞によるサイトカインの発現は、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍増加してもよい。いくつかの実施形態において、サイトカインの発現は、検出限界未満から検出可能なレベルまで増加する。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象の免疫細胞による２個、３個、４個、５個、６個、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における免疫細胞による少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。サイトカインは、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の発現が増加する。いくつかの実施形態において、デコリンの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－γの発現が増加する。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における癌細胞によるサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。癌細胞によるサイトカインの発現は、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１０００倍、または少なくとも約５０００倍増加してもよい。いくつかの実施形態において、サイトカインの発現は、検出限界未満から検出可能なレベルまで増加する。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における癌細胞による２、３、４、５、６、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における癌細胞による少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、またはそれ以上のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。サイトカインは、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、ＴＮＦ－αの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２の発現が増加する。いくつかの実施形態において、デコリンの発現が増加する。いくつかの実施形態において、ＩＦＮ－γの発現が増加する。
本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、例えば、機能的なＭ１５３タンパク質を発現する対照粘液腫ウイルス、１個以上の導入遺伝子を欠く対照粘液腫ウイルス、異なる組換え核酸を含む対照粘液腫ウイルス、および／または導入遺伝子発現のために異なるプロモーターを利用する対照粘液腫ウイルスと比較して有利な特性を示すことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含む、Ｍ１５３の活性または発現が減少しているＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに従って、機能的なＭ１５３タンパク質を発現する対照粘液腫ウイルスによって示されるＥＣ５０に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍低い癌（例えば、癌細胞株）の殺傷または増殖阻害に関するＥＣ５０を示す。アッセイは、例えば、およそ７０％コンフルエント、または少なくとも７０％コンフルエントな細胞を用いて行われてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイに従って、導入遺伝子を欠く対照粘液腫ウイルスによって示されるＥＣ５０に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍低い癌（例えば、癌細胞株）の殺傷または増殖阻害に関するＥＣ５０を示す。アッセイは、例えば、およそ７０％コンフルエント、または少なくとも７０％コンフルエントな細胞を用いて行われてもよい。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、ｐ１１プロモーターから導入遺伝子（例えば、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはデコリン）を発現するＭＹＸＶは、異なるプロモーター、例えば、ｓＥ／Ｌプロモーターから導入遺伝子を発現する対応の対照粘液腫ウイルスによって示されるＥＣ５０に比べて、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍低い癌（例えば、癌細胞株）の殺傷または増殖阻害に関するＥＣ５０を示す。
ＥＣ５０は、対照と比較して最大反応阻害の５０％として計算されることができ、例えば、感染から７２時間後にｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ生存率アッセイで発光シグナルから求めることができる。細胞の生存率は、試験薬剤の平均発光値を未処置対照の平均発光値で割ることによって決定することができる。試験薬および対照の有効濃度値は、Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用して、非線形回帰分析を使用して正規化応答データをカーブフィットすることで推定することができる。
本明細書に開示される粘液腫ウイルスは、例えば、機能的なＭ１５３タンパク質を発現する対照粘液腫ウイルス、１個以上の導入遺伝子を欠く対照粘液腫ウイルス、異なる組換え核酸を含む対照粘液腫ウイルス、および／または導入遺伝子発現のために異なるプロモーターを利用する対照粘液腫ウイルスと比較して、癌の処置において有利な特性を示すことができる。
いくつかの実施形態において、Ｍ１５３の活性または発現が減少している、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるアッセイに従って、機能的なＭ１５３タンパク質を発現する対照粘液腫ウイルスに比べて、腫瘍体積を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍多く減少させる。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるアッセイに従って、導入遺伝子を欠く対照粘液腫ウイルスに比べて、腫瘍体積を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍多く減少させる。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、ｐ１１プロモーターから導入遺伝子（例えば、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはデコリン）を発現するＭＹＸＶは、異なるプロモーター、例えば、ｓＥ／Ｌプロモーターから導入遺伝子を発現する対応の対照粘液腫ウイルスに比べて、腫瘍体積を少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍多く減少させる。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、Ｍ１５３の活性または発現が減少している、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるアッセイに従って、機能的なＭ１５３タンパク質を発現する対照粘液腫ウイルスと比較して、癌を有する対象の生存率を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％改善する。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるアッセイに従って、導入遺伝子を欠く対照粘液腫ウイルスと比較して、癌を有する対象の生存率を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％改善する。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、ｐ１１プロモーターから導入遺伝子（例えば、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはデコリン）を発現するＭＹＸＶは、異なるプロモーター、例えば、ｓＥ／Ｌプロモーターから導入遺伝子を発現する対応の対照粘液腫ウイルスと比較して、癌を有する対象の生存率を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％改善する。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、Ｍ１５３の活性または発現が減少している、本明細書に開示されるＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるアッセイに従って、機能的なＭ１５３タンパク質を発現する対照粘液腫ウイルスと比較して、平均生存時間を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍延長する。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、導入遺伝子を発現するＭＹＸＶは、例えば、本明細書に開示されるアッセイに従って、導入遺伝子を欠く対照粘液腫ウイルスに比べて、平均生存時間を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍多く延長する。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組換え核酸を含み、ｐ１１プロモーターから導入遺伝子（例えば、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはデコリン）を発現するＭＹＸＶは、異なるプロモーター、例えば、ｓＥ／Ｌプロモーターから導入遺伝子を発現する対応の対照粘液腫ウイルスに比べて、平均生存時間を少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、または少なくとも約１０００倍多く延長する。いくつかの実施形態において、効果は、より高い用量、例えば、２倍、５倍、または１０倍より高い用量の対照粘液腫ウイルスと比較しても達成される。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における腫瘍体積を減少させるのに有効な用量および計画で投与される。腫瘍体積は、例えば、投与前と比較して、未処置の対象と比較して、または対照ＭＹＸＶを投与した対象と比較して、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％減少することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、対象における腫瘍または癌細胞の増殖速度を低下させるのに有効な用量および計画で投与される。腫瘍または癌細胞の増殖速度は、例えば、投与前と比較して、未処置の対象と比較して、または対照ＭＹＸＶで処理された対象と比較して、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％低下することができる。
いくつかの実施態様において、ＭＹＸＶは、ＭＹＸＶで処置された、癌を有する対象の生存率を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。生存率は、例えば、対照ＭＹＸＶで処置されていない対象、または対照ＭＹＸＶで処置された対象と比較して、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％増加することができる。
いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、癌を有する対象の生存時間（例えば、死までの平均時間）を増加させるのに有効な用量および計画で投与される。生存時間は、例えば、対照ＭＹＸＶで処理されていない対象、または対照ＭＹＸＶで処置された対象と比較して、例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、または少なくとも約１０倍増加することができる。
いくつかの実施形態において、ＩＬ－１２およびデコリンをコードする、本開示の組換え核酸を含む粘液腫ウイルスは、ＴＮＦ－αをさらに発現する対応のウイルスと比較して、予想し得ない驚くべき増強された抗腫瘍有効性を示し、例えば、組換え核酸を含む、ＩＬ－１２およびデコリンを発現するＭＹＸＶを投与された対象について、ＴＮＦ－αをさらに発現する対応の対照ＭＹＸＶと比較して、腫瘍体積のより大きな減少、生存率の増加、または生存時間（例えば、死までの平均時間）の延長を達成する。
ＭＹＸＶは、単独療法として投与されることができ、または化学療法、免疫療法および／または放射線療法を含む他の療法と組み合わせて投与されてもよい。例えば、ＭＹＸＶは、原発腫瘍の外科的除去の前または後で、あるいは放射線療法または従来の化学療法薬物の投与などの処置の前、同時、または後のいずれかに投与されることができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１．５週間、２週間、または３週間前に投与されることができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療の少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１．５週間、２週間、または３週間後に投与されることができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療から１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日以内に投与されることができる。いくつかの実施形態において、ＭＹＸＶは、他の治療と同時に投与されることができる。
いくつかの実施形態は、対象に追加の治療薬を投与する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、免疫チェックポイントモジュレーターである。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物を投与する前に対象に投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物を投与した後に対象に投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、組成物との組み合わせとして対象に投与される。
いくつかの実施形態において、追加の治療薬は、免疫モジュレーター、例えば、免疫チェックポイントモジュレーター、免疫活性化モジュレーター、または免疫チェックポイント阻害剤を含む。例示的な免疫チェックポイントモジュレーターには、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａのデュルバルマブ（Ｉｍｆｉｎｚｉ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈのアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ／Ｐｆｉｚｅｒのアベルマブ、ＣｙｔｏｍＸ ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＣＸ－０７２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＦＡＺ０５３、３Ｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／ＡｌｐｈａｍａｂのＫＮ０３５、Ｅｌｉ ＬｉｌｌｙのＬＹ３３０００５４、またはＥＭＤ ＳｅｒｏｎｏのＭ７８２４（抗ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦベータトラップ）などのＰＤ－Ｌ１阻害剤または活性化モジュレーター、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅのＡＭＰ－２２４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）およびｒＨＩｇＭ１２Ｂ７などのＰＤ－Ｌ２阻害剤または活性化モジュレーター、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのニボルマブ（オプジーボ）、Ｍｅｒｃｋのペムブロリズマブ（キイトルーダ）、ＡｇｅｎｕｓのＡＧＥＮ ２０３４、ＢｅｉＧｅｎｅのＢＧＢ－Ａ３１７、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ－Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢｌ－７５４０９１、ＣＢＴ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＣＢＴ－５０１（ジェノリムズマブ）、ＩｎｃｙｔｅのＩＮＣＳＨＲ１２１０、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔのＪＮＪ－６３７２３２８３、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅのＭＥＤＩ０６８０、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓのＭＧＡ ０１２、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＰＤＲ００１、ＰｆｉｚｅｒのＰＦ－０６８０１５９１、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／ＳａｎｏｆｉのＲＥＧＮ２８１０（ＳＡＲ４３９６８４）、またはＴＥＳＡＲＯのＴＳＲ－０４２などのＰＤ－１阻害剤または活性化モジュレーター、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂのイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）、ＭＤＸ－０１０、ＢＭＳ－７３４０１６、およびＭＤＸ－１０１としても知られる）、Ｐｆｉｚｅｒのトレメリムマブ（ＣＰ－６７５，２０６、チシリムマブ）、またはＡｇｅｎｕｓのＡＧＥＮ１８８４などのＣＴＬＡ－４阻害剤または活性化モジュレーター、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ ＳｑｕｉｂｂのＢＭＳ－９８６０１６、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＩＭＰ７０１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＬＡＧ５２５、またはＲｅｇｅｎｅｒｏｎ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＲＥＧＮ３７６７などのＬＡＧ３阻害剤または活性化モジュレーター、ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓのエノブリツズマブ（ＭＧＡ２７１）などのＢ７－Ｈ３阻害剤または活性化モジュレーター、Ｉｎｎａｔｅ ＰｈａｒｍａのＬｉｒｉｌｕｍａｂ（ＩＰＨ２１０１；ＢＭＳ－９８６０１５）などのＫＩＲ阻害剤または活性化モジュレーター、ｕｒｅｌｕｍａｂ（ＢＭＳ－６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＰＦ－０５０８２５６６（抗４－１ＢＢ、ＰＦ－２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）、またはＸｍＡｂ－５５９２（Ｘｅｎｃｏｒ）などのＣＤ１３７活性化モジュレーター、バビツキシマブなどのＰＳ阻害剤または活性化モジュレーター、ならびに、抗体またはその断片（例えば、モノクローナル抗体、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体）、ＲＮＡｉ分子、またはＴＩＭ３、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ３０、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＬＡＩＲ１、ＴＩＧＨＴ、ＬＩＧＨＴ、ＤＲ３、ＣＤ２２６、ＣＤ２、またはＳＬＡＭを標的化、調節、阻害、活性化、または結合する小分子などの阻害剤または活性化モジュレーターが含まれるが、これらに限定されない。
さらに開示されるのは、治療用ＭＹＸＶウイルスが、対象への細胞の注入の前に、最初にｅｘ ｖｉｖｏで細胞に吸着される送達戦略である。この戦略において、ＭＹＸＶは、ｅｘ ｖｉｖｏでウイルスに接触させた細胞の移動を介して癌部位（例えば、原発部位および／または転移部位）に送達されることができる。この全身送達法は、ウイルスが対象に注入される前に単離された細胞に最初に送達されるため、「ｅｘ ｖｉｖｏウイルス療法」またはＥＶＶ（別名ＥＶ２）と呼ばれることもある。ＭＹＸＶ構築物およびこの送達戦略は、腫瘍の負担を大幅に軽減し、必要としている対象の生存を増加させることができる。
いくつかの実施形態において、細胞は、白血球である。いくつかの実施形態において、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、骨髄由来の細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、初代細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、初代細胞ではなく、例えば、細胞株である。いくつかの実施形態において、細胞は、操作された細胞、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、またはＮＫ受容体などの免疫受容体を発現または過剰発現するように操作された細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、自家造血幹細胞移植または同種造血幹細胞移植の一部として投与される造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。いくつかの実施形態において、細胞は、部分分化幹細胞（ｐａｒｔｉａｌｌｙ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）または最終分化幹細胞である。
いくつかの実施形態において、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで１時間、ＭＹＸＶ構築物で吸着され、次いで、ＭＹＸＶ負荷細胞は、レシピエントに注入されて戻される。いくつかの実施形態において、細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで少なくとももしくは約３０分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、またはそれ以上、ＭＹＸＶ構築物で吸着され、次いで、ＭＹＸＶ負荷細胞は、レシピエントに注入されて戻される。
特定の実施形態において、細胞は、例えば、自己細胞として、対象から得られる。いくつかの実施形態において、細胞は、１個以上の同種異系ドナー、例えば、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または少なくとも８個のＨＬＡ対立遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ａ、および／またはＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子の一方または両方のコピーなど）についてレシピエントに一致するドナーから得られる。ＨＬＡ対立遺伝子は、例えば、ＤＮＡベースの方法を使用した種類であってもよい。いくつかの実施形態において、単核末梢血細胞および／または骨髄細胞は、１人以上の異種ドナーから得られる。
実施形態
実施形態１。粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、インターロイキン１２サブユニットβ（ＩＬ－１２β）をコードする第１の核酸とを含む組換え核酸であって、第１の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または阻害するためにＭＹＸＶゲノムに挿入され、ＩＬ－１２βの発現は、第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、組換え核酸。
実施形態１。粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、インターロイキン１２サブユニットβ（ＩＬ－１２β）をコードする第１の核酸とを含む組換え核酸であって、第１の核酸は、ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または阻害するためにＭＹＸＶゲノムに挿入され、ＩＬ－１２βの発現は、第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、組換え核酸。
実施形態２。前記ＩＬ－１２βは、ヒトＩＬ－１２βである、実施形態１に記載の組換え核酸。
実施形態３。インターロイキン１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする第２の核酸をさらに含む、実施形態１または実施形態２に記載の組換え核酸。
実施形態４。前記ＩＬ－１２αは、ヒトＩＬ－１２αである、実施形態３に記載の組換え核酸。
実施形態５。前記第２の核酸の５’末端は、前記第１の核酸の３’末端に結合される、実施形態３または４に記載の組換え核酸。
実施形態６。前記第１の核酸および前記第２の核酸は、エラスチンリンカーをコードする第３の核酸を介して結合される、実施形態３から５のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態７。デコリンをコードする第４の核酸をさらに含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態８。前記デコリンは、ヒトデコリンである、実施形態７に記載の組換え核酸。
実施形態９。前記デコリンの発現は、第１のｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、実施形態７または実施形態８に記載の組換え核酸。
実施形態１０。前記第４の核酸の５’末端は、前記第２の核酸の３’末端に結合される、実施形態７から９のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１１。前記組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）前記第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）前記ＩＬ－１２βをコードする前記第１の核酸と、（ｃ）前記エラスチンリンカーをコードする前記第３の核酸と、（ｄ）前記ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸と、（ｅ）前記第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｆ）前記デコリンをコードする前記第４の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、実施形態９または実施形態１０に記載の組換え核酸。
実施形態１２。前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１３。前記組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１４。前記組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１５。レポータータグをコードする第５の核酸をさらに含む、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１６。前記レポータータグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、実施形態１５に記載の組換え核酸。
実施形態１７。前記レポータータグの発現は、第２のｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、実施形態１５または実施形態１６に記載の組換え核酸。
実施形態１８。前記組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）ＩＬ－１２βをコードする第１の核酸と、（ｃ）エラスチンリンカーをコードする第３の核酸と、（ｄ）ＩＬ－１２αをコードする第２の核酸と、（ｅ）第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｆ）デコリンをコードする第４の核酸と、（ｇ）第２のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｈ）レポータータグをコードする第５の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、実施形態１５から１７のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態１９。前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態１５から１７のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２０。前記組換え核酸は、配列番号１０または配列番号１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２１。前記組換え核酸は、配列番号１０または配列番号１１であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、前述の実施形態のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２２。腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）をコードする第６の核酸をさらに含む、実施形態１から２１のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２３。前記ＴＮＦ－αは、ヒトＴＮＦ－αである、実施形態２２に記載の組換え核酸。
実施形態２４。前記ＴＮＦ－αは、可溶性ポリペプチドである、実施形態２２または実施形態２３に記載の組換え核酸。
実施形態２５。前記ＴＮＦ－αの発現は、第２のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、実施形態２２から２４のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２６。前記第６の核酸は、ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸とデコリンをコードする前記第４の核酸との間に位置する、実施形態２２から２５のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２７。前記組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）前記第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）前記ＩＬ－１２βをコードする前記第１の核酸と、（ｃ）前記エラスチンリンカーをコードする前記第３の核酸と、（ｄ）前記ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸と、（ｅ）前記第２のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｆ）ＴＮＦ－αをコードする前記第６の核酸と、（ｇ）前記第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｈ）前記デコリンをコードする前記第４の核酸と、（ｉ）任意選択で前記第２のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｊ）任意選択で前記レポータータグをコードする前記第５の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、実施形態２２から２６のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２８。前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－Ｐ１１後期プロモーター－ＴＮＦ－α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２２から２７のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態２９。前記組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２２から２８のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３０。前記組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２２から２８のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３１。前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－Ｐ１１後期プロモーター－ＴＮＦ－α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰ発現カセットを含むか、またはそれからなる、実施形態２２から２８のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３２。前記組換え核酸は、配列番号２０または配列番号２１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２２から２８のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３３。前記組換え核酸は、配列番号２０または配列番号２１であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態２２から２８のいずれか１つに記載の組換え核酸。
実施形態３４。粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または阻害するために前記ＭＹＸＶゲノムに挿入された核酸発現カセットとを含む組換え核酸であって、前記核酸発現カセットは、５’から３’に、ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈＩＬ－１２β－ＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰを含む、組換え核酸。
実施形態３５。前記組換え核酸は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態３４に記載の組換え核酸。
実施形態３６。前記組換え核酸は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態３４に記載の組換え核酸。
実施形態３７。免疫調節活性または抗腫瘍活性が増強された、遺伝子操作されたＭＹＸＶであって、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも８０％は、ノックアウトされ、前記遺伝子操作されたＭＹＸＶは、実施形態１から３６のいずれか１つに記載の組換え核酸を含む、遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態３８。前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた非癌細胞において、前記ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた非癌細胞と比較して、前記ＩＬ－１２βの発現が減少する、実施形態３７に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態３９。前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、前記ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させたＰＢＭＣと比較して、前記ＩＬ－１２βの発現が減少する、実施形態３７または実施形態３８に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４０。前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた細胞によって、前記ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた細胞と比較して、前記ＩＬ－１２βの発現が感染後４時間で減少する、実施形態３７に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４１。サイトカインをコードする核酸を含む、遺伝子操作されたＭＹＸＶであって、前記サイトカインの発現は、ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターによって駆動され、前記ＭＹＸＶは、Ｍ１５３の発現または活性を減衰させるように遺伝子操作される、遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４２。前記サイトカインは、ＩＬ－１２β、ＩＬ－１２α、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４３。前記サイトカインは、ＴＮＦ－αを含む、実施形態４１または実施形態４２に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４４。前記Ｍ１５３をコードする核酸の少なくとも８０％は、前記遺伝子操作されたＭＹＸＶのゲノムにおいて欠失している、実施形態４１から４３のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４５。前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた非癌細胞において、前記サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた非癌細胞と比較して、前記サイトカインの発現が減少する、実施形態４１から４４のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４６。前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させたＰＢＭＣにおいて、前記サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させたＰＢＭＣと比較して、前記サイトカインの発現が減少する、実施形態４１から４４のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４７。前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた細胞によって、前記サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた細胞と比較して、前記サイトカインの発現が感染後４時間で減少する、実施形態４１から４４のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４８。前記ＭＹＸＶは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、核酸配列を含む、実施形態４１から４７のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態４９。前記ＭＹＸＶは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、核酸配列を含む、実施形態４１から４７のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態５０。前記ＭＹＸＶは、遺伝子操作されたローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株ＭＹＸＶである、実施形態３７から４９のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態５１。前記ｐ１１プロモーターは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態３７から５０のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態５２。前記ｐ１１プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、実施形態３７から５０のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
実施形態５３。実施形態１から３６のいずれか１つに記載の組換え核酸、または実施形態３７から５２のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶによってｅｘ ｖｉｖｏで処置された哺乳動物細胞。
実施形態５４。前記哺乳動物細胞は、腫瘍細胞である、実施形態５３に記載の哺乳動物細胞。
実施形態５５。前記哺乳動物細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または骨髄（ＢＭ）細胞である、実施形態５３に記載の哺乳動物細胞。
実施形態５６。実施形態１から３６のいずれか１つに記載の組換え核酸、実施形態３７から５２のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ、または実施形態５３から５５のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞を含む、組成物。
実施形態５７。全身投与用に製剤化される、実施形態５６に記載の組成物。
実施形態５８。局所投与用に製剤化される、実施形態５６に記載の組成物。
実施形態５９。腫瘍に対する免疫応答を増加させる必要のある対象において腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法であって、前記対象に、実施形態５６から５８のいずれか１つに記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
実施形態６０。前記対象は、腫瘍を有するか、腫瘍を有する疑いがある、実施形態５９に記載の方法。
実施形態６１。投与は、全身投与である、実施形態５９または実施形態６０に記載の方法。
実施形態６２。前記投与する工程は、静脈内である、実施形態５９から６１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３。前記投与する工程は、局所である、実施形態５９または実施形態６０に記載の方法。
実施形態６４。前記投与する工程は、腫瘍内である、実施形態５９、６０、および６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５。前記腫瘍は、固形腫瘍を含む、実施形態５９から６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６。前記腫瘍は、肺癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、または黒色腫である、実施形態５９から６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７。投与は、前記対象の生存を改善する、実施形態５９から６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８。投与は、癌細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する、実施形態５９から６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９。投与は、前記対象の前記腫瘍において少なくとも２個のサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で行われる、実施形態５９から６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０。投与は、前記腫瘍の体積を少なくとも１０％減少させるのに有効な用量および計画で行われる、実施形態５９から６９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７１。投与は、前記腫瘍の増殖を少なくとも１０％減少させるのに有効な用量および計画で行われる、実施形態５９から７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２。前記対象は、Ｍ１５３を発現させるか、組換え核酸を欠いているか、またはそれらの組み合わせである対応の対照粘液腫ウイルスが１０倍高い用量で投与された対象に比べて少なくとも１０％長く生存する、実施形態５９から７１のいずれか１つに記載の方法。
これらの実施例は、例示のみを目的として提供されており、本明細書で提供される特許請求の範囲を限定するものではない。
実施例１－ウイルスの構築
この実施例では、Ｍ１５３がノックアウトされており、かつ、ＩＬ－１２、デコリン、ＴＮＦ－α、ＧＦＰ、および／またはｄｓＲｅｄをコードする導入遺伝子がウイルスゲノムに導入されている、新規の操作された粘液腫ウイルスの設計および作製について記載する。これらの操作されたウイルスを作製するために使用した親ウイルスは、粘液腫ウイルスローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１８２９；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＣＦ＿０００８４３６８５．１）であった。
この実施例では、Ｍ１５３がノックアウトされており、かつ、ＩＬ－１２、デコリン、ＴＮＦ－α、ＧＦＰ、および／またはｄｓＲｅｄをコードする導入遺伝子がウイルスゲノムに導入されている、新規の操作された粘液腫ウイルスの設計および作製について記載する。これらの操作されたウイルスを作製するために使用した親ウイルスは、粘液腫ウイルスローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株（ＡＴＣＣ ＶＲ－１８２９；ＧｅｎＢａｎｋ：ＧＣＦ＿０００８４３６８５．１）であった。
ＨＶ１１粘液腫ウイルス
腫瘍溶解性粘液腫ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、デコリン、およびＧＦＰ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図１Ａに示すように、ｐ１１プロモーターは、エラスチンリンカーによって結合されているヒトＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、レポーターとしてＧＦＰの発現を駆動する。
Ｍ１５３遺伝子座に所望の導入遺伝子およびプロモーターを挿入した新たな組換えウイルスを作製するために、組換えプラスミドベクターを設計した。組換えプラスミドは、挿入配列を含み、０．５～１ｋｂのフランキング組換えアームは、図１Ｂに示すように、Ｍ１５３の上流および下流の領域に対して相同性がある配列を含んでいた。
使用したｓＥ／Ｌプロモーターは、配列番号１であった。使用したｐ１１プロモーターは、配列番号２であった。ＩＬ－１２は、５’から３’に、終止コドンを除くヒトＩＬ－１２Ｂ（配列番号３のヌクレオチド１～９８４）、エラスチンリンカー（配列番号６）、およびシグナルペプチドを欠くヒトＩＬ－１２Ａ（配列番号５）を含んでいた。ＩＬ－１２Ｂ－エラスチン－ＩＬ－１２Ａ融合タンパク質をコードする配列を、配列番号９に提示する。デコリン遺伝子は、配列番号７の配列を有していた。ＧＦＰ遺伝子は、配列番号８の配列を有していた。プロモーターおよび導入遺伝子を含む結合挿入配列を、配列番号１０に提示する。ゲノムの粘液腫ウイルスのＭ１５３遺伝子座に組換えを指示するために上流および下流にフランキング配列を含む挿入配列を、配列番号１１に示す。完全組換えプラスミド配列を、配列番号１２に提示する。
親粘液腫ウイルスローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株を感染多重度（ＭＯＩ）１でＶｅｒｏ細胞の単層に感染させた。ウイルス添加後１時間で、Ｖｅｒｏ細胞に配列番号１２の組換えプラスミドをトランスフェクトした。ＧＦＰの発現に基づいて、組換えウイルスの病巣を同定し、クローン選択を４回行って、挿入配列を含む組換え粘液腫ウイルスを単離した。Ｍ１５３の上流および下流の配列を標的とするプライマーでＰＣＲを行って挿入を確認したところ、親ウイルスについてはおよそ０．７ｋｂのバンド、挿入物（配列番号１３のプライマーおよび配列番号１４のプライマー）を持つ組換えウイルスについては４．５ｋｂのバンドが生じていた。
感染細胞培養上清のＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－１２およびデコリンの発現についてクローンを試験した。ＩＬ－１２およびデコリンを発現することが確認されたクローンを、その後の使用のために選択した。
ｐ１１特異的フォワードプライマー（配列番号１５）とＩＬ－１２特異的リバースプライマー（配列番号１６）でＰＣＲを行い、配列決定を行うことによって、ＩＬ－１２の上流にｐ１１プロモーターが存在していることを確認した。その後の実験で使用するために、ＨＶ１１のマスターストックを作製した。
ＨＶ１４粘液腫ウイルス
腫瘍溶解性粘液腫ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、デコリン、およびＧＦＰ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図２Ａに示すように、ｐ１１プロモーターは、エラスチンリンカーによって結合されているヒトＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、ｐ１１プロモーターは、ヒトＴＮＦ－αの発現を駆動し、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、レポーターとしてＧＦＰの発現を駆動する。
Ｍ１５３遺伝子座に所望の導入遺伝子およびプロモーターを挿入した新たな組換えウイルスを作製するために、組換えプラスミドベクターを設計した。組換えプラスミドは、挿入配列を含み、０．５～１ｋｂのフランキング組換えアームは、図２Ｂに示すように、Ｍ１５３の上流および下流の領域に対して相同性がある配列を含む。
使用したｓＥ／Ｌプロモーターは、配列番号１であった。使用したｐ１１プロモーターは、配列番号２であった。ＩＬ－１２は、５’から３’に、終止コドンを除くヒトＩＬ－１２Ｂ（配列番号３のヌクレオチド１～９８４）、エラスチンリンカー（配列番号６）、およびシグナルペプチドを欠くヒトＩＬ－１２Ａ（配列番号５）を含んでいた。ＩＬ－１２Ｂ－エラスチン－ＩＬ－１２Ａ融合タンパク質をコードする配列を、配列番号９に提示する。ＩＬ－１２Ａ遺伝子とＴＮＦ－αの発現を駆動するｐ１１プロモーターとの間に６塩基対のスペーサーを挿入した（配列番号１７）。ＴＮＦ－α遺伝子は、配列番号１８の配列を有していた。ＴＮＦ－α遺伝子とデコリンの発現を駆動するｓＥ／Ｌプロモーターとの間に６塩基対のスペーサーを挿入した（配列番号１９）。デコリン遺伝子は、配列番号７の配列を有していた。ＧＦＰ遺伝子は、配列番号８の配列を有していた。プロモーターおよび導入遺伝子を含む結合挿入配列を配列番号２０に提示する。ゲノムの粘液腫ウイルスのＭ１５３遺伝子座に組換えを指示するために上流および下流にフランキング配列を含む挿入配列を、配列番号２１に示す。完全組換えプラスミド配列を、配列番号２２に提示する。
親粘液腫ウイルスローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株を感染多重度（ＭＯＩ）１でＶｅｒｏ細胞の単層に感染させた。ウイルス添加後１時間で、Ｖｅｒｏ細胞に配列番号２２の組換えプラスミドをトランスフェクトした。ＧＦＰの発現に基づいて、組換えウイルスの病巣を同定し、クローン選択を４回行って、挿入配列を含む組換え粘液腫ウイルスを単離した。Ｍ１５３の上流および下流の配列を標的とするプライマーでＰＣＲを行って挿入を確認したところ、親ウイルスについてはおよそ０．７ｋｂのバンド、挿入物（配列番号１３のプライマーおよび配列番号１４のプライマー）を持つ組換えウイルスについては５．５ｋｂのバンドが生じていた。
感染細胞培養上清のＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、およびデコリンの発現についてクローンを試験した。ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、およびデコリンを発現することが確認されたクローンを、その後の使用のために選択した。
ｐ１１特異的フォワードプライマー（配列番号１５）と、ＩＬ－１２特異的リバースプライマー（配列番号１６）またはＴＮＦ－α特異的リバースプライマー（配列番号２３）でＰＣＲを行い、配列決定を行うことによって、ＩＬ－１２およびＴＮＦ－αの上流にｐ１１プロモーターが存在していることを確認した。その後の実験で使用するために、ＨＶ１４のマスターストックを作製した。
ＨＶ１２粘液腫ウイルス
腫瘍溶解性粘液腫ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にデコリン、ＩＬ－１２、およびＧＦＰ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図３Ａに示すように、合成初期／後期（ｓＥ／Ｌ）プロモーターは、それぞれの導入遺伝子の発現を駆動する。
Ｍ１５３遺伝子座に所望の導入遺伝子およびプロモーターを挿入した新たな組換えウイルスを作製するために、組換えプラスミドベクターを設計した。組換えプラスミドは、挿入配列を含み、０．５～１ｋｂのフランキング組換えアームは、図３Ｂに示すように、Ｍ１５３の上流および下流の領域に対して相同性がある配列を含む。
使用したｓＥ／Ｌプロモーターは、配列番号１または配列番号６１であった。デコリン遺伝子は、配列番号７または配列番号６２の配列を有していた。ＩＬ－１２は、５’から３’に、ヒトＩＬ－１２Ｂ（配列番号３）、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ；配列番号２４または配列番号４２）、およびヒトＩＬ－１２Ａ（配列番号４）を含んでいた。ＧＦＰ遺伝子は、配列番号８の配列を有していた。プロモーターおよび導入遺伝子を含む結合挿入配列を、配列番号２５に提示し、代替配列を、配列番号６３に提示する。ゲノムの粘液腫ウイルスのＭ１５３遺伝子座に組換えを指示するために上流および下流にフランキング配列を含む挿入配列を、配列番号２６に示す。完全組換えプラスミド配列を、配列番号２７に提示する。
親粘液腫ウイルスローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株を感染多重度（ＭＯＩ）１でＶｅｒｏ細胞の単層に感染させた。ウイルス添加後１時間で、Ｖｅｒｏ細胞に配列番号２７の組換えプラスミドをトランスフェクトした。ＧＦＰの発現に基づいて、組換えウイルスの病巣を同定し、クローン選択を５回行って、挿入配列を含む組換え粘液腫ウイルスを単離した。Ｍ１５３の上流および下流の配列を標的とするプライマーでＰＣＲを行って挿入を確認したところ、親ウイルスについてはおよそ０．７ｋｂのバンド、挿入物（配列番号１３のプライマーおよび配列番号１４のプライマー）を持つ組換えウイルスについては４．５ｋｂのバンドが生じていた。
感染細胞培養上清のＥＬＩＳＡによって、ＩＬ－１２およびデコリンの発現についてクローンを試験した。ＩＬ－１２およびデコリンを発現することが確認されたクローンを、その後の使用のために選択した。
その後の実験で使用するために、ＨＶ１２のマスターストックを作製した。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、ＭＶ４、およびＨＶ１３粘液腫ウイルス
同様の技術を使用して、以下のような導入遺伝子挿入を有するさらなる粘液腫ウイルスを作製した。
ＭＶ２ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、デコリン、およびＧＦＰ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図４Ａに示すように、ｐ１１プロモーターは、ＩＲＥＳによって分離されているマウスＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、レポーターとしてＧＦＰの発現を駆動する。
ＭＶ４ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、デコリン、およびＧＦＰ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図４Ｂに示すように、ｐ１１プロモーターは、ＩＲＥＳによって分離されているマウスＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、ｐ１１プロモーターは、ヒトＴＮＦ－αの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、レポーターとしてＧＦＰの発現を駆動する。
ＭＶ１ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、デコリン、およびｄｓＲｅｄ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図４Ａに示すように、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、エラスチンリンカーによって結合されているマウスＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、ｐ１１プロモーターは、レポーターとしてｄｓＲｅｄの発現を駆動する。
ＭＶ３ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、デコリン、およびｄｓＲｅｄ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトし、Ｍ１３５とＭ１３６との間の遺伝子間領域にＴＮＦ－αおよびＧＦＰ導入遺伝子を存在させるように構築した。図４Ｄに示すように、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、エラスチンリンカーによって結合されているマウスＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、ｐ１１プロモーターは、レポーターとしてｄｓＲｅｄの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトＴＮＦ－αの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ＧＦＰの発現を駆動する。
ＨＶ１３ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２およびデコリン導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトし、Ｍ１３５とＭ１３６との間の遺伝子間領域にＴＮＦ－αおよびＧＦＰ導入遺伝子を存在させるように構築した。図４Ｅに示すように、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ＩＲＥＳによって分離されているヒトＩＬ－１２ＢおよびＩＬ－１２Ａの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ＴＮＦ－αの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ＧＦＰの発現を駆動する。
ＭＶ５ウイルスは、Ｍ１５３遺伝子座にＩＬ－１２、デコリン、およびＧＦＰ導入遺伝子を含んでＭ１５３をノックアウトするように構築した。図４Ｆに示すように、ｐ１１プロモーターは、エラスチンリンカーによって結合されているマウスＩＬ－１２ＡおよびＩＬ－１２Ｂの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ヒトデコリンの発現を駆動し、ｓＥ／Ｌプロモーターは、ＧＦＰの発現を駆動する。
実施例２－感染細胞による導入遺伝子の発現
この実施例では、本開示の粘液腫ウイルスを感染させた細胞がＴＮＦ、デコリン、および／またはＩＬ－１２を分泌することを実証する。
この実施例では、本開示の粘液腫ウイルスを感染させた細胞がＴＮＦ、デコリン、および／またはＩＬ－１２を分泌することを実証する。
Ｖｅｒｏ細胞を、２４ウェルプレート上におよそ１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩接着させた。細胞（少なくとも７０％コンフルエント）に、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４粘液腫ウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）１で感染させた。２４時間後、細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行って、ＩＬ－１２、デコリン、およびＴＮＦ－αの産生を測定した。図５Ａおよび図５Ｂにそれぞれ示すように、操作されたウイルスのすべてについて、ＩＬ－１２およびデコリンが上清中で検出され、これによって、ウイルスが感染細胞によってＩＬ－１２およびデコリンの発現および分泌を誘導することができることを示した。ＩＬ－１２ＡサブユニットおよびＩＬ－１２Ｂサブユニットを結合するエラスチンリンカーを有するＨＶ１１およびＨＶ１４ウイルスについて、比較的高レベルのＩＬ－１２が検出された。また、図５Ｃに示すように、ＨＶ１３およびＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞の上清中でＴＮＦ－αが検出された。
０．１から３の異なるＭＯＩ条件で実験を繰り返したところ、導入遺伝子の発現に対するＭＯＩ依存性の効果が観察され、図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃにそれぞれ示すように、より高濃度のウイルスを感染させた培養物について、より高産生のＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリンが検出された。インタクトなＭ１５３遺伝子を含み、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリン導入遺伝子を欠く「空の」粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を感染させた培養物においては、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリンが検出されなかった。
感染から２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、および２４時間後に感染させたＶｅｒｏ細胞によるサイトカインおよびデコリンの産生を測定するために経時実験を行った。時間依存性の効果が観察され、図７Ａ、図７Ｂ、および図７Ｃにそれぞれ示すように、２４時間で最高濃度のＩＬ－１２、デコリン、およびＴＮＦ－αが検出された。ＩＬ－１２ＡサブユニットおよびＩＬ－１２Ｂサブユニットを結合するエラスチンリンカーを有するＨＶ１１およびＨＶ１４を感染させた培養物については、他の操作されたウイルスに比べてより早い時点でＩＬ－１２が検出された（図７Ａ）。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４を感染させたＶｅｒｏ細胞によって産生されるＩＬ－１２の生物学的機能性を測定するためにアッセイを行った。操作されたウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清を、感染から２４時間後に回収し、ＩＬ－１２応答性レポーター細胞株（例えば、ＩＬ－１２シグナル伝達に応答してアルカリホスファターゼを産生するＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ－１２細胞であって、これは、その後ＩＬ－１２活性を定量化するために測定することができる）を使用して上清の機能的なＩＬ－１２の活性を測定した。図８に示すように、操作された粘液腫ウイルスの４個すべてを感染させた培養物由来の上清中に、生物学的に活性なＩＬ－１２が検出された。
ヒト癌細胞株について、ＩＬ－１２、デコリン、およびＴＮＦの産生を評価した。Ａ５４９（肺癌）細胞およびＨｅＬａ（子宮頸部腺癌）細胞に、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４の操作された粘液腫ウイルスをそれぞれＭＯＩ１で感染させた。感染から２４時間後に培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行って導入遺伝子の産生を評価した。表１は、検出されたタンパク質の濃度をｐｇ／ｍＬで示している。これらの結果は、ヒト癌細胞において操作された粘液腫ウイルスがサイトカインおよびデコリン導入遺伝子の産生を誘発することを示している。
感染された細胞によってコードされた導入遺伝子の産生を誘発する能力についても、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の操作されたウイルスを試験した。
Ｖｅｒｏ細胞を、２４ウェルプレート上におよそ１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩接着させた。細胞（少なくとも７０％コンフルエント）に、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４粘液腫ウイルスを感染多重度０．１、０．３、１、または３で感染させた。２４時間後、細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行って、ＩＬ－１２、デコリン、およびＴＮＦ－αの産生を測定した。導入遺伝子の発現に対するＭＯＩ依存性の効果が観察され、図１０Ａ、図１０Ｂ、および図１０Ｃにそれぞれ示すように、より高濃度のウイルスを感染させた培養物について、より高産生のＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリンが検出された。
感染から２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、および２４時間後に感染させたＶｅｒｏ細胞によるＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリンの産生を測定するために経時実験を行った。時間依存性の効果が観察され、図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃにそれぞれ示すように、２４時間で最高濃度のＩＬ－１２、デコリン、およびＴＮＦ－αが検出された。ｐ１１プロモーターによってＴＮＦ－αの発現が駆動されるＭＶ４と比較して、ｓＥ／ＬプロモーターによってＴＮＦ－αの発現が駆動されるＭＶ３については、より早い時点でＴＮＦ－αが検出され（図１１Ｃ）、また、ｓＥ／ＬプロモーターによってＩＬ－１２の発現が駆動され、ＩＬ－１２ＡサブユニットおよびＩＬ－１２Ｂサブユニットを結合するエラスチンリンカーを有するＭＶ１およびＭＶ３を感染させた培養物についても、より早い時点でＩＬ－１２が検出された（図１１Ａ）。
ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４を感染させたＶｅｒｏ細胞によって産生されるＩＬ－１２の生物学的機能性を測定するためにアッセイを行った。操作されたウイルスを感染させたＶｅｒｏ細胞の培養上清を、感染から２４時間後に回収し、ＩＬ－１２応答性レポーター細胞を使用して上清の機能的なＩＬ－１２の活性を測定した。図１２に示すように、操作された粘液腫ウイルスの４個すべてを感染させた培養物由来の上清中に、生物学的に活性なＩＬ－１２が検出された。
感染させた癌細胞株について、ＩＬ－１２、デコリン、およびＴＮＦの産生を評価した。Ｂ１６－Ｆ１０（黒色腫）、Ｋ７Ｍ２（転移性骨肉腫）、およびＣＴ－２６（結腸癌）細胞に、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の操作された粘液腫ウイルスをそれぞれＭＯＩ１で感染させた。感染から２４時間後に培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行って導入遺伝子の産生を評価した。表２は、検出されたタンパク質の濃度をｐｇ／ｍＬで示している。これらの結果は、マウス癌細胞において操作された粘液腫ウイルスがサイトカインおよびデコリン導入遺伝子の産生を誘発することを示している。
実施例３－ｉｎ ｖｉｖｏでの感染細胞による導入遺伝子の発現
この実施例では、ＨＶ１１およびＨＶ１２の操作された粘液腫ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏ癌モデルにおいてＩＬ－１２の産生を誘発することを実証する。
この実施例では、ＨＶ１１およびＨＶ１２の操作された粘液腫ウイルスがｉｎ ｖｉｖｏ癌モデルにおいてＩＬ－１２の産生を誘発することを実証する。
免疫不全マウスに、５×１０６のＡ５４９ヒト非小細胞肺癌細胞を脇腹の皮下に移植した。担癌動物は、平均腫瘍体積が１００～１５０ｍｍ３である場合は無作為化し、１日目に２×１０７フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射または１×１０８ＦＦＵ／用量の静脈内（ＩＶ）注射によって処置した（１群当たりｎ＝動物３匹）。血清サンプルと腫瘍サンプルを、ウイルス注射から４時間後、２４時間後、または７２時間後に収集し、サイトカイン定量用に処理した。サイトカイン分析は、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）社Ｕ－Ｐｌｅｘ ６－ａｓｓａｙ ９６－Ｗｅｌｌ ＳＥＣＴＯＲプレートを使用して行った。記号は個々の動物を表し、線は平均を表す。結果は、処置した担癌マウスの血清（図９Ａ）および腫瘍（図９Ｂ）においてＨＶ１１およびＨＶ１２ウイルスがＩＬ－１２の産生を誘発することを示した。
実施例４－組換え粘液腫ウイルスによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの癌細胞株の増殖の阻害
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの癌細胞株の増殖を阻害するＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４の能力をさらに特徴づけるために、１４例のヒト癌細胞株を、９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００）で感染させ、細胞生存率アッセイを使用して増殖の阻害を求めた。接着細胞を、およそ７０％コンフルエンスで感染させた。表３は、各細胞株について計算したＥＣ５０値を示す。対照と比較して５０％未満の総増殖阻害を示したものの、５０％未満の増殖阻害プラトーを示した細胞株については、括弧内の値は、各ウイルスについて観察された最大増殖阻害である。データは、多くの場合において、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４が導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）よりも低いＭＯＩで増殖阻害を達成することを示している。データはまた、癌細胞の特に強力な阻害を示す、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの例を提示するものであり、阻害は、例えば、プロモーターが導入遺伝子の発現を駆動する導入遺伝子の組み合わせ、ＩＬ－１２ＡサブユニットとＩＬ１２Ｂサブユニットとの間のリンカーの有無、導入遺伝子の向き、および／または癌細胞の種類に依存する場合がある。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの癌細胞株の増殖を阻害するＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４の能力をさらに特徴づけるために、１４例のヒト癌細胞株を、９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００）で感染させ、細胞生存率アッセイを使用して増殖の阻害を求めた。接着細胞を、およそ７０％コンフルエンスで感染させた。表３は、各細胞株について計算したＥＣ５０値を示す。対照と比較して５０％未満の総増殖阻害を示したものの、５０％未満の増殖阻害プラトーを示した細胞株については、括弧内の値は、各ウイルスについて観察された最大増殖阻害である。データは、多くの場合において、ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４が導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）よりも低いＭＯＩで増殖阻害を達成することを示している。データはまた、癌細胞の特に強力な阻害を示す、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの例を提示するものであり、阻害は、例えば、プロモーターが導入遺伝子の発現を駆動する導入遺伝子の組み合わせ、ＩＬ－１２ＡサブユニットとＩＬ１２Ｂサブユニットとの間のリンカーの有無、導入遺伝子の向き、および／または癌細胞の種類に依存する場合がある。
実施例５－マウス乳癌モデルにおける組換え粘液腫ウイルスの抗癌活性
マウス乳癌モデルにおいてＭＶ１およびＭＶ３の抗腫瘍有効性を試験した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１×１０６のＭＴ－６細胞を右脇腹の皮下に移植した。担癌動物を、平均腫瘍体積が７９ｍｍ３（６４ｍｍ３～９９ｍｍ３の範囲）である１群あたり８匹の動物の処置群に無作為化した。動物は、無作為化後４日に１回、２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射でＭＶ１、ＭＶ３、またはＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリン導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を４回投与して処置した。図１３Ａに示すように、粘液腫ウイルスの処置によって腫瘍負荷が減少し、ＭＶ１で処置した動物については、最も低い腫瘍体積が観察された。経時的な動物の生存をモニタリングしたところ、個々の動物の腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上である場合や、最終屠殺についてのＩＡＣＵＣガイドラインを満たす場合に、生存エンドポイントを満たした。図１３Ｂに示すように、粘液腫ウイルスで処置することで生存率が増加し、ＭＶ１で処置した群において最も高い生存率が得られた。最初の粘液腫ウイルス投与後５９日目まで生存していた動物に、１×１０６のＥＭＴ－６細胞を左脇腹の皮下に移植して再接種させ、腫瘍体積の測定値を週３回記録した。予め粘液腫ウイルスで処置していた動物は、図１３Ｃに示すように、腫瘍の再接種に耐性があった。
マウス乳癌モデルにおいてＭＶ１およびＭＶ３の抗腫瘍有効性を試験した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１×１０６のＭＴ－６細胞を右脇腹の皮下に移植した。担癌動物を、平均腫瘍体積が７９ｍｍ３（６４ｍｍ３～９９ｍｍ３の範囲）である１群あたり８匹の動物の処置群に無作為化した。動物は、無作為化後４日に１回、２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射でＭＶ１、ＭＶ３、またはＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびデコリン導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を４回投与して処置した。図１３Ａに示すように、粘液腫ウイルスの処置によって腫瘍負荷が減少し、ＭＶ１で処置した動物については、最も低い腫瘍体積が観察された。経時的な動物の生存をモニタリングしたところ、個々の動物の腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上である場合や、最終屠殺についてのＩＡＣＵＣガイドラインを満たす場合に、生存エンドポイントを満たした。図１３Ｂに示すように、粘液腫ウイルスで処置することで生存率が増加し、ＭＶ１で処置した群において最も高い生存率が得られた。最初の粘液腫ウイルス投与後５９日目まで生存していた動物に、１×１０６のＥＭＴ－６細胞を左脇腹の皮下に移植して再接種させ、腫瘍体積の測定値を週３回記録した。予め粘液腫ウイルスで処置していた動物は、図１３Ｃに示すように、腫瘍の再接種に耐性があった。
実施例６－マウス黒色腫モデルにおける組換え粘液腫ウイルスの抗癌活性
マウス黒色腫モデルにおいてＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の抗腫瘍有効性を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６のＢ１６－Ｆ１０黒色腫細胞を皮下に移植した。腫瘍を有する動物を、７５～１００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する群あたり８匹の動物の処置群に無作為化した。
マウス黒色腫モデルにおいてＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の抗腫瘍有効性を試験した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０６のＢ１６－Ｆ１０黒色腫細胞を皮下に移植した。腫瘍を有する動物を、７５～１００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有する群あたり８匹の動物の処置群に無作為化した。
第１の実験では、動物は、無作為化後１日目および８日目に、２×１０７ＦＦＵ／用量の腫瘍内（ＩＴ）注射でＭＶ１、ＭＶ３、またはＭＶ４を処置した。図１４Ａに示すように、粘液腫ウイルスでの処置によって、ビヒクルで処置した対照動物と比較して腫瘍負荷が減少した。経時的な動物の生存をモニタリングしたところ、個々の動物の腫瘍体積が１５００ｍｍ３以上である場合や、最終屠殺についてのＩＡＣＵＣガイドラインを満たす場合に、生存エンドポイントを満たした。図１４Ｂに示すように、粘液腫ウイルスでの処置によって、平均生存時間が増加した。
第２の実験では、動物は、４日に１回、２×１０７フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／用量の静脈内（ＩＶ）注射でＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を４回投与して処置した。図１４Ｃに経時的な腫瘍体積をプロットし、図１４Ｄに生存率データをプロットする。粘液腫ウイルスでの処置によって、腫瘍体積が減少し、平均生存期間が増加した。
第３の実験では、動物は、無作為化後１日目および８日目に、記載の用量（２×１０５、５×１０５、２×１０６、または２×１０７ＦＦＵ／用量）のＩＴ注射でＭＶ１を処置した。図１５Ａおよび図１５Ｂに示すように、ＭＶ１で処置したマウスについて、腫瘍負荷および生存に用量依存性の改善が観察され、低用量の腫瘍溶解性ウイルスでさえ、デコリンおよびＩＬ－１２導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルスで処置したマウスと比較して、生存（例えば、生存率および／または平均生存時間）の改善が達成された。
第４の実験では、動物は、無作為化後４日に１回、記載の用量（２×１０５、２×１０６、２×１０７、または１×１０８ＦＦＵ／用量）のＩＶ注射でＭＶ１を４回投与して処置した。図１５Ｃおよび図１５Ｄに示すように、ＭＶ１で処置したマウスについて、腫瘍負荷および生存に用量依存性の改善が観察された。
実施例７－マウス転移性黒色腫モデルにおける組換え粘液腫ウイルスの抗癌活性
マウス転移性黒色腫モデルにおいてＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の抗腫瘍有効性を試験した。アルビノＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．３３×１０６のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ黒色腫細胞を尾静脈に静脈内注射して移植した。
マウス転移性黒色腫モデルにおいてＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の抗腫瘍有効性を試験した。アルビノＣ５７ＢＬ／６マウスに、０．３３×１０６のＢ１６－Ｆ１０－Ｌｕｃ黒色腫細胞を尾静脈に静脈内注射して移植した。
第１の実験では、動物は、腫瘍細胞注射後３日目から４日に１回、２×１０７ＦＦＵ／用量の静脈内（ＩＶ）注射でＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を４回投与して処置した。ルシフェラーゼ生物発光強度シグナル（ＢＬＩ）を、黒色腫負荷の指標として測定した。図１６Ａに示すように、ビヒクルで処置した動物と比較して、ならびに、ＩＬ－１２、デコリン、および／またはＴＮＦ－α導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）で処置した動物と比較して、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４粘液腫ウイルスを投与した動物において黒色腫負荷が減少した。経時的な動物の生存をモニタリングしたところ、最終屠殺についてのＩＡＣＵＣガイドラインを満たす場合に、生存エンドポイントを満たした。図１６Ｂに示すように、粘液腫ウイルスでの処置によって、一部の動物／群において死までの平均時間または生存時間が増加した。
第２の実験では、動物を、腫瘍細胞注射後３日目から４日に１回、記載の用量（０．３×１０６、１×１０６、１×１０７、または１×１０８）ＦＦＵ／用量の静脈内（ＩＶ）注射でＭＶ１またはＭＶ２を４回投与して処置した。図１７Ａおよび図１７Ｂに示すように、ＭＶ１またはＭＶ２で処置した一部の群、特に高用量を投与した群において黒色腫負荷の減少および生存の増加が観察された。
実施例８－マウス転移性骨肉腫モデルにおける組換え粘液腫ウイルスの抗癌活性
マウス転移性骨肉腫モデルにおいてＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の抗腫瘍有効性を試験した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２×１０６のＫ７Ｍ２－Ｌｕｃ骨肉腫細胞を尾静脈に静脈内注射して移植した。経時的な動物の生存をモニタリングしたところ、最終屠殺についてのＩＡＣＵＣガイドラインを満たす場合に、生存エンドポイントを満たした。
マウス転移性骨肉腫モデルにおいてＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、およびＭＶ４の抗腫瘍有効性を試験した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２×１０６のＫ７Ｍ２－Ｌｕｃ骨肉腫細胞を尾静脈に静脈内注射して移植した。経時的な動物の生存をモニタリングしたところ、最終屠殺についてのＩＡＣＵＣガイドラインを満たす場合に、生存エンドポイントを満たした。
第１の実験では、動物は、腫瘍細胞注射後３日目に、２×１０７ＦＦＵ／用量の単回静脈内（ＩＶ）注射でＭＶ１またはＭＶ２を処置した。図１８Ａに示すように、ＭＶ１またはＭＶ２で処置した動物において死までの時間が遅延した。
第２の実験では、動物は、腫瘍細胞注射後３日目から４日に１回、２×１０７ＦＦＵ／用量のＩＶ注射でＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４を４回投与して処置した。図１８Ｂに示すように、４用量レジメンによって、ビヒクルで処置した動物と比較して、ならびに、ＩＬ－１２、デコリン、および／またはＴＮＦ－α導入遺伝子を欠く粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）で処置した動物と比較して、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ３、またはＭＶ４で処置したマウスにおいて生存時間が増加した。
実施例９－感染細胞による導入遺伝子の発現
この実施例では、本開示の粘液腫ウイルスを感染させた細胞がデコリンおよびＩＬ－１２を分泌することと、どのプロモーターが利用されるかに基づいて導入遺伝子の産生の時間経過が調節可能であることを実証する。
この実施例では、本開示の粘液腫ウイルスを感染させた細胞がデコリンおよびＩＬ－１２を分泌することと、どのプロモーターが利用されるかに基づいて導入遺伝子の産生の時間経過が調節可能であることを実証する。
Ｖｅｒｏ細胞またはＢ１６－Ｆ１０黒色腫細胞を、２４ウェルプレート上におよそ１．５×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩接着させた。細胞（少なくとも７０％コンフルエント）に、ＭＶ１、ＭＶ２、ＭＶ５、およびＨＶ１１粘液腫ウイルスを感染多重度（ＭＯＩ）０．１、０．３、１、または３で感染させた。感染から４時間後および２４時間後に細胞培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡを行ってＩＬ－１２およびデコリンの産生を測定した。
感染から２４時間後に導入遺伝子の発現に対するＭＯＩ依存性の効果が観察され、より高濃度のウイルスを感染させた培養物について、より高産生のＩＬ－１２およびデコリンが検出された（図１９Ａ：Ｖｅｒｏ細胞によるＩＬ－１２の産生。図１９Ｂ：Ｂ１６－Ｆ１０細胞によるＩＬ－１２の産生。図１９Ｃ：Ｖｅｒｏ細胞によるデコリンの産生。図１９Ｄ：Ｂ１６－Ｆ１０細胞によるデコリンの産生）。ＩＬ－１２ＡサブユニットおよびＩＬ－１２Ｂサブユニットを結合するエラスチンリンカーを有するＩＬ－１２を発現するウイルスにおいて、概して比較的高レベルのＩＬ－１２が検出された。
ＭＯＩ１で感染させた細胞について、時間依存性の効果が観察され、感染から４時間後と比較して、２４時間後で高濃度のＩＬ－１２およびデコリンが検出された（図２０Ａ：Ｖｅｒｏ細胞によるＩＬ－１２の産生。図２０Ｂ：Ｂ１６－Ｆ１０細胞によるＩＬ－１２の産生。図２０Ｃ：Ｖｅｒｏ細胞によるデコリンの産生。図２０Ｄ：Ｂ１６－Ｆ１０細胞によるデコリンの産生）。
感染後の初期の時点（４時間）で、それぞれｐ１１プロモーターからエラスチン結合ＩＬ－１２を発現するＭＶ５およびＨＶ１１ウイルスと比較して、ｓＥ／Ｌプロモーターからエラスチン結合ＩＬ－１２を発現するＭＶ１ウイルスにおいてＩＬ－１２の濃度の増加が観察された。これらのデータは、導入遺伝子産生の時間経過が、どのプロモーターが利用されるかに基づいて調節可能であることを実証する。例えば、感染の初期に導入遺伝子の産生を減少させたり、および／または、ウイルスの複製がより高頻度で起きる癌細胞への導入遺伝子の発現を制限したりするために、ｐ１１プロモーターを利用することができ、これは、いくつかの実施形態において、ｓＥ／Ｌプロモーターなどの代替プロモーターからのより高レベルの導入遺伝子の発現に関連する毒性を低減する。
実施例１０－組換え粘液腫ウイルスによるｉｎ ｖｉｔｒｏでの固形腫瘍細胞株の増殖の阻害
ヒト癌の増殖を阻害するＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４の能力をさらに特徴づけるために、ヒト固形腫瘍細胞株を９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００）で感染させ、感染から７２時間後にｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ生存率アッセイを使用して増殖阻害を求めた。接着細胞株を、およそ７０％コンフルエンスで感染させた。
ヒト癌の増殖を阻害するＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４の能力をさらに特徴づけるために、ヒト固形腫瘍細胞株を９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００）で感染させ、感染から７２時間後にｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ生存率アッセイを使用して増殖阻害を求めた。接着細胞株を、およそ７０％コンフルエンスで感染させた。
試験した細胞株には、ＮＣＩ－Ｎ８７（胃癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－１（黒色腫）、ＣＯＬＯ２０５（結腸癌）、ＬｏＶｏ（結腸直腸癌）、ＨＣＣ１８０６（棘融解型平上皮癌／乳癌）、ＨＣＣ１５９９（乳癌）、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＳＷ６２０（結腸直腸癌）、ＨＥＰ３Ｂ（肝細胞癌）、ＭＫＮ－４５（転移性胃腺癌）、ＳＪＳＡ－１（骨肉腫）、ＨＵＨ－７（肝細胞癌）、Ａ６７３（ユーイング肉腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５（転移性黒色腫）、Ｈ１９７５（肺腺癌／非小細胞肺癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（黒色腫）、ＨＴ－２９（結腸直腸腺癌）、Ａ２０４（横紋筋肉腫）、Ａ５４９（肺腺癌）、ＤＬＤ－１（結腸直腸腺癌）、Ａ３７５（黒色腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（転移性乳腺癌）、ＳＫ－ＭＥＳ－１（肺扁平上皮癌）、Ｈ３５８（細気管支肺胞腺癌／非小細胞肺癌）、ＨＥＰ－Ｇ２（肝芽細胞腫／肝細胞癌）、およびＭＤＡ－ＭＢ－１５７（転移性乳癌）が含まれていた。
ＥＣ５０値は、最大増殖阻害パーセントを示すものに対して計算してプロットし、各ウイルスがどれ程強力に癌細胞株の増殖を阻害するかを可視化した（図２１Ａ：ＨＶ１１。図２１Ｂ：ＨＶ１２。図２１Ｃ：ＨＶ１３。図２１Ｄ：ＨＶ１４）。ＥＣ５０値は、発光シグナルから決定し、対照と比較して最大反応阻害の５０％を示すものとして計算した。細胞の生き残った分画は、試験薬の平均発光値を未処置対照の平均発光値で割って求めた。試験薬および対照の有効濃度値は、Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用して、非線形回帰分析を使用して正規化応答データをカーブフィットすることで推定した。
これらのデータはまた、癌細胞の強力な阻害を示す、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの例を提示するものであり、阻害は、例えば、プロモーターが導入遺伝子の発現を駆動する導入遺伝子の組み合わせ、ＩＬ－１２ＡサブユニットとＩＬ－１２Ｂサブユニットとの間のリンカーの有無、導入遺伝子の向き、癌細胞の種類、癌細胞の特性、またはそれらの組み合わせに依存する場合がある。
実施例１１－ＨＶ１１によるｉｎ ｖｉｔｒｏでの多発性骨髄腫細胞株の阻害
多発性骨髄腫の増殖を阻害するＨＶ１１の能力をさらに特徴づけるために、細胞株をおよそ１×１０５細胞／ウェルで播種し、９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００）で感染させ、感染から２４時間後および７２時間後にｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ生存率アッセイを使用して増殖阻害を求めた。
多発性骨髄腫の増殖を阻害するＨＶ１１の能力をさらに特徴づけるために、細胞株をおよそ１×１０５細胞／ウェルで播種し、９つの異なる感染多重度（ＭＯＩ＝０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００）で感染させ、感染から２４時間後および７２時間後にｃｅｌｌ ｔｉｔｅｒ ｇｌｏｗ生存率アッセイを使用して増殖阻害を求めた。
試験した細胞株には、ＫＭＳ－３４（ｒ）、ＬＰ－１、ＲＭＰＩ－８２２６、Ｌ３６３、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ１．ｓ、Ｕ２６６、ＫＭＳ－３４、およびＡＮＢＬ－６が含まれていた。
ＥＣ５０値は、最大増殖阻害パーセントを示すものに対して計算してプロットし、各ウイルスがどれ程強力に多発性骨髄腫細胞株の増殖を阻害するかを可視化した（図２２Ａ：２４時間。図２２Ｂ：７２時間）。ＥＣ５０値は、発光シグナルから決定し、対照と比較して最大反応阻害の５０％を示すものとして計算した。細胞の生き残った分画は、試験薬の平均発光値を未処置対照の平均発光値で割って求めた。試験薬および対照の有効濃度値は、Ｐｒｉｓｍ ８ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｉｎｃ．）を使用して、非線形回帰分析を使用して正規化応答データをカーブフィットすることで推定した。
実施例１２－組換え粘液腫ウイルスを感染させた固形腫瘍細胞株によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのデコリン、ＩＬ－１２、およびＴＮＦ－αの産生
癌細胞を感染させるとデコリン、ＩＬ－１２、および／またはＴＮＦ－αの産生を誘発する、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの能力をさらに特徴づけるために、ヒト固形腫瘍細胞株にＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染多重度１で感染させ、感染から２４時間後に上清中で各タンパク質の濃度を定量化した。接着細胞を、およそ７０％コンフルエンスで感染させた。対照として、細胞に、インタクトなＭ１５３遺伝子を含み、デコリン、ＩＬ－１２、またはＴＮＦ－αをコードしていない「空の」粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を感染させた。
癌細胞を感染させるとデコリン、ＩＬ－１２、および／またはＴＮＦ－αの産生を誘発する、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの能力をさらに特徴づけるために、ヒト固形腫瘍細胞株にＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、またはＨＶ１４を感染多重度１で感染させ、感染から２４時間後に上清中で各タンパク質の濃度を定量化した。接着細胞を、およそ７０％コンフルエンスで感染させた。対照として、細胞に、インタクトなＭ１５３遺伝子を含み、デコリン、ＩＬ－１２、またはＴＮＦ－αをコードしていない「空の」粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を感染させた。
試験した細胞株には、ＮＣＩ－Ｎ８７（胃癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－１（黒色腫）、ＣＯＬＯ２０５（結腸癌）、ＬｏＶｏ（結腸直腸癌）、ＨＣＣ１８０６（棘融解型平上皮癌／乳癌）、ＨＣＣ１５９９（乳癌）、ＨＴ１０８０（線維肉腫）、ＳＷ６２０（結腸直腸癌）、ＨＥＰ３Ｂ（肝細胞癌）、ＭＫＮ－４５（転移性胃腺癌）、ＳＪＳＡ－１（骨肉腫）、ＨＵＨ－７（肝細胞癌）、Ａ６７３（ユーイング肉腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５（転移性黒色腫）、Ｈ１９７５（肺腺癌／非小細胞肺癌）、ＳＫ－ＭＥＬ－２８（黒色腫）、ＨＴ－２９（結腸直腸腺癌）、Ａ２０４（横紋筋肉腫）、Ａ５４９（肺腺癌）、ＤＬＤ－１（結腸直腸腺癌）、Ａ３７５（黒色腫）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（転移性乳腺癌）、ＳＫ－ＭＥＳ－１（肺扁平上皮癌）、Ｈ３５８（細気管支肺胞腺癌／非小細胞肺癌）、ＨＥＰ－Ｇ２（肝芽細胞腫／肝細胞癌）、およびＭＤＡ－ＭＢ－１５７（転移性乳癌）が含まれていた。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４は、固形腫瘍細胞によるデコリンの産生を誘発したが（図２３Ａおよび図２４Ａ～Ｆ）、ＭＹＸＶ－ＧＦＰは、あまりデコリンを誘発しなかったか、デコリンを誘発しなかったか、または実質的にデコリンを誘発しなかった（図２３Ａ）。すべてのウイルスにおいて、デコリンの発現はｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動されていたにもかかわらず、多くの場合において、ＨＶ１１およびＨＶ１４に応答してより高レベルのデコリンが観察された（図２３Ａ）。
ＨＶ１１、ＨＶ１２、ＨＶ１３、およびＨＶ１４は、固形腫瘍細胞によるＩＬ－１２の産生を誘発したが（図２３Ｂおよび図２４Ａ～Ｄ）、ＭＹＸＶ－ＧＦＰは、ＩＬ－１２を誘発しなかったか、または実質的にＩＬ－１２を誘発しなかった（図２３Ｂ）。ＨＶ１１またはＨＶ１４を感染させた細胞によってより高レベルのＩＬ－１２が産生された（図２３Ｂ）。
ＨＶ１３およびＨＶ１４は、固形腫瘍細胞によるＴＮＦ－αの産生を誘発したが（図２３Ｃおよび図２４Ｅ～Ｆ）、ＭＹＸＶ－ＧＦＰは、あまりＴＮＦ－αを誘発しなかったか、ＴＮＦ－αを誘発しなかったか、または実質的にＴＮＦ－αを誘発しなかった（図２３Ｃ）。多くの場合において、ＨＶ１３を感染させた細胞によってより高レベルのＴＮＦ－αが産生され（図２３Ｃ）、このＴＮＦ－αは、ｐ１１プロモーターではなくｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される。
実施例１３－ＨＶ１１を感染させた多発性骨髄腫細胞株によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのデコリンおよびＩＬ－１２の産生
癌細胞を感染させるとデコリンおよびＩＬ－１２の産生を誘発する、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの能力をさらに特徴づけるために、ヒト多発性骨髄腫細胞株をおよそ１×１０５細胞／ウェルで播種し、ＨＶ１１を感染多重度１で感染させ、感染から２４時間後にデコリンおよびＩＬ－１２の濃度を定量化した。対照として、細胞に、インタクトなＭ１５３遺伝子を含み、デコリンまたはＩＬ－１２をコードしていない「空の」粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を感染させた。
癌細胞を感染させるとデコリンおよびＩＬ－１２の産生を誘発する、本明細書に開示される粘液腫ウイルスの能力をさらに特徴づけるために、ヒト多発性骨髄腫細胞株をおよそ１×１０５細胞／ウェルで播種し、ＨＶ１１を感染多重度１で感染させ、感染から２４時間後にデコリンおよびＩＬ－１２の濃度を定量化した。対照として、細胞に、インタクトなＭ１５３遺伝子を含み、デコリンまたはＩＬ－１２をコードしていない「空の」粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ－ＧＦＰ）を感染させた。
試験した細胞株には、ＫＭＳ－３４（ｒ）、ＬＰ－１、ＲＭＰＩ－８２２６、Ｌ３６３、ＮＣＩ－Ｈ９２９、ＭＭ１．ｓ、Ｕ２６６、ＫＭＳ－３４、およびＡＮＢＬ－６が含まれていた。
試験したいくつかの細胞株内で、ＨＶ１１は、ＩＬ－１２およびデコリンを誘発したが、ＭＹＸＶ－ＧＦＰは、あまりデコリンを誘発しなかったか、またはデコリンを誘発せず（図２５Ａ）、および／または、あまりＩＬ－１２を誘発しなかったか、またはＩＬ－１２を誘発しなかった（図２５Ｂ）。
追加の配列
本明細書に記載される組成物および方法に対応する例示的な配列を表４に示す。
本明細書に記載される組成物および方法に対応する例示的な配列を表４に示す。
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が単なる例として提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者に今や起こるであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態に対する様々な代替案が、本発明を実施する際に用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによって包含されることが意図されている。
Claims (72)
- 粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、インターロイキン１２サブユニットベータ（ＩＬ－１２β）をコードする第１の核酸とを含む組換え核酸であって、
前記第１の核酸は、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または破壊するために前記ＭＹＸＶゲノムに挿入され、
前記ＩＬ－１２βの発現は、第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、組換え核酸。 - 前記ＩＬ－１２βは、ヒトＩＬ－１２βである、請求項１に記載の組換え核酸。
- インターロイキン１２サブユニットアルファ（ＩＬ－１２α）をコードする第２の核酸をさらに含む、請求項１に記載の組換え核酸。
- 前記ＩＬ－１２αは、ヒトＩＬ－１２αである、請求項３に記載の組換え核酸。
- 前記第２の核酸の５’末端は、前記第１の核酸の３’末端に結合される、請求項３に記載の組換え核酸。
- 前記第１の核酸および前記第２の核酸は、エラスチンリンカーをコードする第３の核酸を介して結合される、請求項５に記載の組換え核酸。
- デコリンをコードする第４の核酸をさらに含む、請求項６に記載の組換え核酸。
- 前記デコリンは、ヒトデコリンである、請求項７に記載の組換え核酸。
- 前記デコリンの発現は、第１のｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、請求項７に記載の組換え核酸。
- 前記第４の核酸の５’末端は、前記第２の核酸の３’末端に結合される、請求項７に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）前記第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）前記ＩＬ－１２βをコードする前記第１の核酸と、（ｃ）前記エラスチンリンカーをコードする前記第３の核酸と、（ｄ）前記ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸と、（ｅ）前記第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｆ）前記デコリンをコードする前記第４の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、請求項９に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％に対して配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１に記載の組換え核酸。
- レポータータグをコードする第５の核酸をさらに含む、請求項９に記載の組換え核酸。
- 前記レポータータグは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む、請求項１５に記載の組換え核酸。
- 前記レポータータグの発現は、第２のｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される、請求項１５に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）前記第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）前記ＩＬ－１２βをコードする前記第１の核酸と、（ｃ）前記エラスチンリンカーをコードする前記第３の核酸と、（ｄ）前記ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸と、（ｅ）前記第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｆ）前記デコリンをコードする前記第４の核酸と、（ｇ）前記第２のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｈ）前記レポータータグをコードする前記第５の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、請求項１７に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１５に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号１０または配列番号１１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号１０または配列番号１１であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項１に記載の組換え核酸。
- 腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）をコードする第６の核酸をさらに含む、請求項７に記載の組換え核酸。
- 前記ＴＮＦ－αは、ヒトＴＮＦ－αである、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記ＴＮＦ－αは、可溶性ポリペプチドである、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記ＴＮＦ－αの発現は、第２のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターによって駆動される、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記第６の核酸は、ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸とデコリンをコードする前記第４の核酸との間に位置する、請求項２５に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、５’から３’に、（ａ）前記第１のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｂ）前記ＩＬ－１２βをコードする前記第１の核酸と、（ｃ）前記エラスチンリンカーをコードする前記第３の核酸と、（ｄ）前記ＩＬ－１２αをコードする前記第２の核酸と、（ｅ）前記第２のポックスウイルスＰ１１後期プロモーターと、（ｆ）ＴＮＦ－αをコードする前記第６の核酸と、（ｇ）前記第１のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｈ）前記デコリンをコードする前記第４の核酸と、（ｉ）任意選択で前記第２のｓＥ／Ｌプロモーターと、（ｊ）任意選択で前記レポータータグをコードする前記第５の核酸とを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、請求項２５に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－Ｐ１１後期プロモーター－ＴＮＦ－α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ発現カセットを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、ｖＭｙｘ－Ｐ１１後期プロモーター－ｈＩＬ－１２β－エラスチンリンカー－ｈＩＬ－１２α－Ｐ１１後期プロモーター－ＴＮＦ－α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰ発現カセットを含むか、またはそれからなる、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号２０または配列番号２１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号２０または配列番号２１であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項２２に記載の組換え核酸。
- 粘液腫ウイルス（ＭＹＸＶ）ゲノムの少なくとも一部と、前記ＭＹＸＶゲノムのＭ１５３遺伝子の発現を減少または阻害するために前記ＭＹＸＶゲノムに挿入された核酸発現カセットとを含む組換え核酸であって、前記核酸発現カセットは、５’から３’に、ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈｄｅｃｏｒｉｎ－ｓＥ／Ｌプロモーター－ｈＩＬ－１２β－ＩＲＥＳ－ｈＩＬ－１２α－ｓＥ／Ｌプロモーター－ＧＦＰを含む、組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項３４に記載の組換え核酸。
- 前記組換え核酸は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４であるヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項３４に記載の組換え核酸。
- 免疫調節活性または抗腫瘍活性が増強された、遺伝子操作されたＭＹＸＶであって、ＭＹＸＶゲノム中のＭ１５３タンパク質をコードする核酸の少なくとも８０％は、ノックアウトされ、前記遺伝子操作されたＭＹＸＶは、請求項１から３６のいずれか１つに記載の組換え核酸を含む、遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた非癌細胞において、前記ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた非癌細胞と比較して、前記ＩＬ－１２βの発現が減少する、請求項３７に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、前記ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させたＰＢＭＣと比較して、前記ＩＬ－１２βの発現が減少する、請求項３７に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた細胞によって、前記ＩＬ－１２βの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた細胞と比較して、前記ＩＬ－１２βの発現が感染後４時間で減少する、請求項３７に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- サイトカインをコードする核酸を含む、遺伝子操作されたＭＹＸＶであって、前記サイトカインの発現は、ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターによって駆動され、前記遺伝子操作されたＭＹＸＶは、Ｍ１５３の発現または活性を減衰させるように遺伝子操作される、遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記サイトカインは、ＩＬ－１２β、ＩＬ－１２α、またはそれらの組合せを含む、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記サイトカインは、ＴＮＦ－αを含む、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記Ｍ１５３をコードする核酸の少なくとも８０％は、前記遺伝子操作されたＭＹＸＶのゲノムにおいて欠失している、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた非癌細胞において、前記サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた非癌細胞と比較して、前記サイトカインの発現が減少する、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させたＰＢＭＣにおいて、前記サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させたＰＢＭＣと比較して、前記サイトカインの発現が減少する、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶに感染させた細胞によって、前記サイトカインの発現がｓＥ／Ｌプロモーターによって駆動される対応の対照粘液腫ウイルスに感染させた細胞と比較して、前記サイトカインの発現が感染後４時間で減少する、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、核酸配列を含む、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２６、配列番号６３、配列番号１０のヌクレオチド１～２７６２、配列番号２０のヌクレオチド１～３５０７、配列番号２５のヌクレオチド１～３２８８、または配列番号６３のヌクレオチド１～３５３４を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、核酸配列を含む、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記遺伝子操作されたＭＹＸＶは、遺伝子操作されたローザンヌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）株ＭＹＸＶである、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 前記ポックスウイルスｐ１１後期プロモーターは、配列番号２のヌクレオチド配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、請求項４１に記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ。
- 請求項１から３６のいずれか１つに記載の組換え核酸、または請求項３７から５２のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶによってｅｘ ｖｉｖｏで処置された哺乳動物細胞。
- 前記哺乳動物細胞は、腫瘍細胞である、請求項５３に記載の哺乳動物細胞。
- 前記哺乳動物細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または骨髄（ＢＭ）細胞である、請求項５３に記載の哺乳動物細胞。
- 請求項１から３６のいずれか１つに記載の組換え核酸、請求項３７から５２のいずれか１つに記載の遺伝子操作されたＭＹＸＶ、または請求項５３から５５のいずれか１つに記載の哺乳動物細胞を含む、組成物。
- 全身投与用に製剤化される、請求項５６に記載の組成物。
- 局所投与用に製剤化される、請求項５６に記載の組成物。
- 腫瘍に対する免疫応答を増加させる必要のある対象において腫瘍に対する免疫応答を増加させる方法であって、前記対象に、請求項５６から５８のいずれか１つに記載の組成物を投与する工程を含む、方法。
- 前記対象は、前記腫瘍を有するか、前記腫瘍を有する疑いがある、請求項５９に記載の方法。
- 投与は、全身投与である、請求項５９に記載の方法。
- 前記投与する工程は、静脈内である、請求項５９に記載の方法。
- 前記投与する工程は、局所である、請求項５９に記載の方法。
- 前記投与する工程は、腫瘍内である、請求項５９に記載の方法。
- 前記腫瘍は、固形腫瘍を含む、請求項５９に記載の方法。
- 前記腫瘍は、肺癌、結腸癌、胃癌、肝臓癌、乳癌、または黒色腫である、請求項６５に記載の方法。
- 投与は、前記対象の生存を改善する、請求項５９に記載の方法。
- 投与は、癌細胞の生存率を低下させるか、または癌における免疫原性細胞死を活性化する、請求項５９に記載の方法。
- 投与は、前記対象の前記腫瘍において少なくとも２つのサイトカインの発現を増加させるのに有効な用量および計画で行われる、請求項５９に記載の方法。
- 投与は、前記腫瘍の体積を少なくとも１０％減少させるのに有効な用量および計画で行われる、請求項５９に記載の方法。
- 投与は、前記腫瘍の増殖を少なくとも１０％減少させるのに有効な用量および計画で行われる、請求項５９に記載の方法。
- 前記対象は、Ｍ１５３を発現させるか、前記組換え核酸を欠いているか、またはそれらの組合せである対応の対照粘液腫ウイルスが１０倍高い用量で投与された対象に比べて少なくとも１０％長く生存する、請求項５９に記載の方法。
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