CN111201035A - Il-2超激动剂、激动剂及其融合体的用途和方法 - Google Patents

Il-2超激动剂、激动剂及其融合体的用途和方法 Download PDF

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Abstract

提供了人白细胞介素2(IL‑2)突变蛋白或其变体。具体而言，提供了与野生型IL‑2相比，对IL‑2Rp受体的结合能力增加的IL‑2突变蛋白，其与抗PD‑1抗体一起用于组合疗法中以治疗癌症。还提供了包含此类抗PD‑1抗体和所公开的IL‑2突变蛋白的药物组合物。

Description

IL-2超激动剂、激动剂及其融合体的用途和方法
相关申请的交叉引用
本申请根据美国法典第35篇第119条要求2017年6月19日提交的美国专利申请号62/521,957和2018年6月1日提交的美国专利申请号62/679,687的优先权，全部专利申请明确地以引用方式整体并入本文。
背景技术
白细胞介素2(IL-2)是主要由活化CD4+T细胞产生的多能细胞因子，其在产生正常的免疫响应中起着至关重要的作用。IL-2促进活化T淋巴细胞的增殖和扩增，加强B细胞生长，并激活单核细胞和自然杀伤细胞。正是由于这些活性，对IL-2进行了测试，并将其用作批准的癌症治疗(阿地白介素，
Figure BDA0002387189880000011
)。在真核细胞中，人IL-2合成为153个氨基酸的前体多肽，从中去除20个氨基酸生成成熟的分泌性IL-2(Taniguchi 1983)。已在大肠杆菌(E.coli)(Rosenberg 1984)、昆虫细胞(Smith 1985)和哺乳动物COS细胞(Taniguchi1983)中产生了重组人IL-2。
白细胞介素2(IL-2)是四个α螺旋束的I型细胞因子，最初被鉴定为T细胞生长因子(Morgan等人，Science 193:1007(1976))，但随后经证实具有广泛的作用。IL-2促进辅助性T细胞的分化(Zhu等人，Annual review of immunology 28:445(2010)；Liao等人，NatImmunol 9:1288(2008)；和Liao等人，Nat Immunol 12:551(2011))和调节性T(Treg)细胞的发育(Cheng等人，Immunol Rev 241:63(2011))，诱导自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞活性(Liao等人，Immunity 38:13(2013))，并且介导激活诱导的细胞死亡(AICD)(Lenardo等人，Nature 353:858(1991))。
IL-2通过与以下三种不同的受体相互作用而起作用：白细胞介素2受体α(IL-2Rα；CD25)、白细胞介素2受体β(IL-2Rβ；CD122)和白细胞介素2受体γ(IL-2Rγ；CD132；共同的γ链)。首先要鉴定的受体是IL-2Rα，它是一种在T细胞活化后出现的55kD多肽(p55)，并且最初称为Tac(对于T活化)抗原。IL-2Rα以大约10-8M的Kd结合IL-2，并且也被称为“低亲和力”IL-2受体。IL-2与仅表达IL-2Rα的细胞结合不会产生任何可检测的生物学响应。在大多数情况下，IL-2通过三种不同的受体起作用：IL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ。大多数细胞，诸如静息T细胞，对IL-2无响应，因为它们仅表达对IL-2亲和力低的IL-2Rβ和IL-2Rγ。刺激后，静息T细胞表达相对较高亲和力的IL-2受体IL-2Rα。IL-2与IL-2Rα结合导致该受体依次接合IL-2Rβ和IL-2Rγ，从而引起T细胞活化。先前开发了由于对IL-2Rβ的结合亲和力增强而具有强化作用的IL-2“超级因子”(Levin等人，Nature 484:529(2012))。
尽管关于IL-2(包括IL-2超激动剂)的知识很丰富，但是本领域仍然需要更好的组合疗法来治疗癌症，包括与抗PD-1抗体的组合疗法以及与溶瘤病毒或CAR-T细胞的组合。本发明满足这一需求，提供了用于治疗癌症的IL-2超激动剂或激动剂的组合疗法，尤其是抗PD-1抗体与IL-2突变蛋白的组合，这些突变蛋白包含根据野生型IL-2编号的取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
发明内容
IL-2对免疫系统发挥广泛的作用，并且在调节免疫激活和体内平衡方面起着至关重要的作用。作为免疫系统刺激剂，本发明的IL-2突变蛋白已与抗PD-1抗体组合用于癌症治疗。
另一方面，本文提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括与抗PD-1抗体或抑制剂组合施用IL-2突变蛋白。在一些实施方案中，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含本文公开的任一种IL-2突变蛋白的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物包含具有氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白。
这样，在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括施用组合治疗，所述组合治疗包括：(i)抗PD-1抗体或抑制剂和(ii)包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗(nivolumab)、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011和MK-3475(派姆单抗(pembrolizumab))、塞普利单抗(cemiplimab)(REGN2810)、SHR-1210(CTR20160175和CTR20170090)、SHR-1210(CTR20170299和CTR20170322)、JS-001(CTR20160274)、IBI308(CTR20160735)、BGB-A317(CTR20160872)以及如美国专利公开号2017/0081409中叙述的PD-1抗体。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体或抑制剂选自由阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(Durvalumab)组成的组。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，还包含F42A取代的IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含K43N取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，还包含K43N取代的IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，还包含Y45A取代的IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，还包含E62A取代的IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是融合蛋白。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与白蛋白连接的所述IL-2。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与Fc抗体片段连接的所述IL-2。在一些实施方案中，所述Fc抗体片段是人Fc抗体片段。在一些实施方案中，所述Fc抗体片段包含N297A取代。
在一些实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌和脑癌。在一些实施方案中，所述癌症是结肠癌。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，IL-2突变蛋白表现出对IL-2Rβ的结合能力增加。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，IL-2突变蛋白表现出对IL-2Rβ的结合亲和力更高。
如权利要求3至7中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
另一方面，本文提供了一种药物组合物，其包含本文所述的IL-2突变蛋白或IL-2突变蛋白融合蛋白中的任一种和药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物包含具有氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白。
在一些实施方案中，药物组合物包含抗PD-1抗体或抑制剂、如本文所述的任何IL-2突变蛋白和药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种免疫细胞靶向或表达构建体，其包含：白细胞介素2受体β(IL-2Rβ)结合蛋白，其中所述结合蛋白的IL-2Rβ的平衡解离常数小于野生型人IL-2(hIL-2)的平衡解离常数；连接至包含至少一个其他靶向部分的免疫细胞靶向或表达构建体。
在一些实施方案中，免疫细胞靶向或表达构建体对T细胞例如CD8+T细胞或CD4+T细胞表现出细胞毒性作用。
在一些实施方案中，所述构建体是嵌合抗原受体(CAR)，并且其中所述IL-2突变蛋白与跨膜结构域融合；连接至细胞内信号传导区。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含CD3信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域、OX-40信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、DAP10信号传导结构域中的一个或多个。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白或其他靶向部分融合至结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体；融合至T细胞受体信号传导结构域多肽。
在一些实施方案中，与TCR复合物相关联的蛋白质是CD3。
在一些实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含CD4胞质结构域和CD4跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述构建体是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)，其包含以高亲和力与IL-2或其他靶向部分突变蛋白结合的嵌合抗原受体组分。
在一些实施方案中，CAR组分包含CD16，并且IL-2突变蛋白或其他靶向部分与Fc序列融合。
在一些实施方案中，所述构建体是双特异性T细胞交换因子(BiTE)，其包含融合至与T细胞受体组分结合的抗体可变区的IL-2突变蛋白。
在一些实施方案中，T细胞受体的BiTE组分是CD3。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含根据野生型hIL-2编号的以下氨基酸取代：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
在一些实施方案中，提供了编码根据上文的构建体的核酸。
在一些实施方案中，提供了包含所述核酸的载体。
在一些实施方案中，提供了包含根据上文的构建体或载体的T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
在一些实施方案中，提供了包含根据上文的构建体或载体的NK细胞。
还提供了根据上文的分离的免疫细胞群。
还提供了包含根据上文的免疫细胞群的药物制剂。
在一些实施方案中，提供了靶向表达IL-2受体的细胞(包括表达IL-2受体的细胞)的方法，其中所述方法包括使细胞与包含根据上文的免疫细胞群的制剂接触。在一些实施方案中，接触是在体外。在一些实施方案中，接触是在体内。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括使患有癌症的个体与有效剂量的包含根据上文的免疫细胞群的制剂接触。
在一些实施方案中，所述癌症是白血病、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、卡波西肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、急性骨髓性白血病、B谱系恶性肿瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌或间皮瘤。
本发明还提供了将IL-2突变蛋白靶向癌细胞的方法，该方法包括使所述癌细胞与IL-2突变蛋白溶瘤病毒组合接触，其中所述组合包含与溶瘤病毒缀合或由溶瘤病毒表达的IL-2突变蛋白，并且其中所述溶瘤病毒能够靶向癌细胞。
在一些实施方案中，所述接触发生在体外。在一些实施方案中，所述接触发生在体内。
在一些实施方案中，所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：腺病毒、自我复制型甲病毒、牛痘病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valley Virus)、新城疫病毒(Newcastle diseaseVirus)、马拉巴病毒(Maraba virus)、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、慢病毒、麻疹病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒(Sinbis virus)、粘液瘤病毒和逆转录病毒。
在一些实施方案中，牛痘病毒基因组包含胸苷激酶基因，胸苷激酶基因因胸苷激酶(TK)基因中的取代和/或开放阅读框至少一个核苷酸的消融缺失而失活，从而提供了部分缺失的胸苷激酶基因，牛痘生长因子基因缺失，并且经修饰的牛痘病毒载体包含至少一个编码如本文所述的IL-2突变蛋白的核酸序列。
在一些实施方案中，和未与溶瘤病毒缀合的IL-2突变蛋白的浓度相比，体内接触导致肿瘤微环境中IL-2突变蛋白的浓度增加。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒将IL-2突变蛋白靶向肿瘤微环境(TME)的免疫抑制细胞，诸如肿瘤相关巨噬细胞和MDSC(骨髓来源的抑制细胞)，以具有提高的治疗益处。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒将IL-2突变蛋白靶向表达一种或多种肿瘤抗原的一种或多种免疫抑制细胞。
在一些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒将IL-2突变蛋白靶向TME。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白增强效应T细胞和/或NK细胞。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白抑制Treg活性。
在一些实施方案中，IL-2包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
根据本发明，还提供了经修饰的牛痘病毒载体，其特征在于所述载体包含牛痘病毒基因组，其中胸苷激酶基因因胸苷激酶(TK)基因中的取代和/或开放阅读框至少一个核苷酸的消融缺失而失活，从而提供了部分缺失的胸苷激酶基因，牛痘生长因子基因缺失，并且经修饰的牛痘病毒载体包含至少一个编码如本文所述的IL-2突变蛋白的核酸序列。
根据本发明，还提供了经修饰的溶瘤腺病毒，其包含(i)经修饰的核酸，其中任选地，缺失编码所编码的E1A多肽的氨基酸122-129的核苷酸，和(ii)包含编码如本文所述的IL-2突变蛋白的多核苷酸的表达盒。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白将经修饰的溶瘤病毒引导至肿瘤微环境(TME)的免疫抑制细胞，诸如肿瘤相关巨噬细胞和MDSC(骨髓来源的抑制细胞)，以具有提高的治疗益处。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白将经修饰的溶瘤病毒引导至一种或多种肿瘤抗原。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白将经修饰的溶瘤病毒引导至TME。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白增强效应T细胞和NK细胞。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白抑制Treg活性。
本发明还提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用能够表达IL-2突变蛋白的溶瘤病毒。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2溶瘤病毒选自由以下组成的组：腺病毒、自我复制型甲病毒、牛痘病毒、塞内加谷病毒(Seneca Valley Virus)、新城疫病毒(Newcastle disease Virus)、马拉巴病毒(Maraba virus)、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、慢病毒、麻疹病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒(Sinbisvirus)、粘液瘤病毒和逆转录病毒。
附图说明
图1.H9与抗PD-1免疫疗法协同作用。组合疗法以剂量依赖性方式产生稳健响应。抗PD-1抗体以10mg/kg静脉施用，每4天施用3个剂量(10mg/kg IV q4dx3)。根据相同的给药方案，以每天一次5μg或每天一次25μg的指定剂量(给药按μg/只小鼠计)，施用H9(具有氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2)。然后在肿瘤植入后监测MC38结肠癌模型小鼠长达40天。抗PD-1抗体加H9的组合在低剂量和高剂量下均导致治愈数增加，在每天一次25ug H9的剂量下大幅增加。
图2.提供了IgG1、IgG2、IgG3和IgG4序列的实例。
图3.提供了示例性的H9-Fc融合序列。
图4.IL-13Rα1-和IL-13Rα2-选择性IL-13变体的对比分析。给出了人IL-13以及IL-13Rα1和IL-13Rα2选择性变体序列的指定残基数。动力学和亲和力参数通过表面等离子体共振确定。
图5.H9-Fc对关键免疫细胞H9具有提高的效力并且H9-Fc对关键效应T细胞，尤其是负责肿瘤细胞杀伤的CD8+T细胞具有大大提高的效力。H9及其Fc变体不会失去对Treg的效力，而是实现了大大提高的抗肿瘤效应CD8+T细胞的相对活化。
图6.与H9相比，H9-Fc具有相似的体内效力和扩展的PK谱。已经鉴定了H9的扩展PK变体的最佳剂量和方案。H9-Fc以两周一次的方案(与小鼠中使用的抗PD-1抗体相似的方案)实现了有效的B16F10肿瘤控制。因此，我们预测每周一次或每两周一次施用H9-Fc。皮下施用：皮下H9-Fc是未来免疫治疗药物的一种有利施用方法。检查点抑制剂、Proleukin和竞争剂IL-2疗法(NKTR-214，ALKS 4230)都需要静脉输注，并且要在临床中长期施用和监测。皮下施用提供了快速方便的施用方式，这是患者对于常见靶向癌症疗法通常优选的。
图7.与本发明的组合一起使用的示例性抗PD-1抗体。
图8.与本发明的组合一起使用的示例性抗PD-L1抗体。
图9:示例性溶瘤病毒。
具体实施方式
为了使本公开更容易理解，在下文以及说明书全篇定义了某些术语和短语。
定义
本文引用的所有参考文献均以引用方式整体并入，如同进行了全面阐述一样。除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语均具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人，Dictionary of Microbiology and MolecularBiology第3版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；March,Advanced Organic ChemistryReactions,Mechanisms and Structure第5版，J.Wiley&Sons(New York,NY 2001)；以及Sambrook和Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual第3版，Cold Springharbor Laboratory Press(Cold Spring Harbor,NY 2001)，向本领域技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用指南。视情况而定，除非另有说明，否则通常根据制造商定义的方案和/或参数进行涉及使用市售试剂盒和试剂的程序。
如本文所用，“IL-2”意指野生型IL-2，无论是天然的还是重组的。如Fujita等人，PNAS USA,80,7437-7441(1983)所述，成熟的人IL-2作为133个氨基酸的序列出现(较少的信号肽，由另外的20个N-端氨基酸组成)。在Genbank中的登录号NP_000577.2下找到人IL-2的氨基酸序列(SEQ ID NO:1；全长)。在SEQ ID NO:2(人野生型成熟；取代的位置编号基于该序列)中描绘了成熟的人IL-2的氨基酸序列。在Genbank中的登录定位符(SEQ ID NO:3)下找到鼠(小家鼠(Mus musculus))IL-2氨基酸序列。在SEQ ID NO:4中描绘了成熟的鼠IL-2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：1
Figure BDA0002387189880000111
SEQ ID NO：2
Figure BDA0002387189880000112
SEQ ID NO：3
Figure BDA0002387189880000113
SEQ ID NO：4
Figure BDA0002387189880000114
如本文所用，“IL-2突变蛋白”意指其中已经对白细胞介素-2蛋白产生了特异性取代的IL-2多肽。IL-2突变蛋白的特征在于在天然IL-2多肽链的其他残基内或其他残基处的一个或多个位点处有氨基酸插入、缺失、取代和修饰。根据本公开，任何此类插入、缺失、取代和修饰均产生保持了IL-2Rβ结合活性的IL-2突变蛋白。示例性突变蛋白可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸的取代。
突变蛋白还包括在IL-2其他位置的保守性修饰和取代(即，对突变蛋白的二级或三级结构影响最小的那些)。此类保守性取代包括Dayhoff在The Atlas of ProteinSequence and Structure 5(1978)中，以及Argos在EMBO J.,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，属于以下各类之一的氨基酸代表保守性变化：I类：ala、pro、gly、gln、asn、ser、thr；II类：cys、ser、tyr、thr；III类：val、ile、leu、met、ala、phe；IV类：lys、arg、his；V类：phe、tyr、trp、his；和VI类：asp、glu。
“根据IL-2编号”意指参照所选氨基酸在野生型IL-2的成熟序列中通常出现的位置来标识该氨基酸，例如R81是指在SEQ ID NO:2中出现的第八十一个氨基酸，即精氨酸。L80是指在SEQ ID NO:2中出现的第八十个氨基酸，即亮氨酸。L85是指在SEQ ID NO:2中出现的第八十五个氨基酸，即亮氨酸。I86是指在SEQ ID NO:2中出现的第八十六个氨基酸，即异亮氨酸。I92是指在SEQ ID NO:2中出现的第九十二个氨基酸，即异亮氨酸。F42是指在SEQID NO:2中出现的第四十二个氨基酸，即苯丙氨酸。K43是指在SEQ ID NO:2中的出现第四十三个氨基酸，即赖氨酸。
如本文所用，在本公开方法中使用的遗传编码的L-对映体氨基酸的缩写是常规的，并且如下表1所示。
表1：氨基酸缩写
Figure BDA0002387189880000121
Figure BDA0002387189880000131
“亲水性氨基酸”是指根据Eisenberg等人，1984,J.Mol.Biol.179:125-142的标准化共同疏水性量表，表现出低于零的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包括Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。
术语“具有IL-2Rαβγ受体的细胞类型”意指已知具有这一受体类型的细胞，即T细胞、活化T细胞、B细胞、活化单核细胞和活化NK细胞。术语“具有IL-2Rβγ受体的细胞类型”意指已知具有该受体类型的细胞，即B细胞、静息单核细胞和静息NK细胞。
如本文关于多肽或DNA序列所用，术语“同一性”是指两个分子之间的亚基序列同一性。当两个分子中的亚基位置被相同的单体亚基(即，相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，则所述分子在该位置是相同的。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置数量的直接函数。一般而言，比对序列以便获得最高阶匹配。如有必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序诸如GCS程序包(Devereux等人，Nucleic Acids Res.12:387,1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molecular Biol.215:403,1990)计算同一性。可以使用序列分析软件，诸如威斯康星大学生物技术中心(University ofWisconsin Biotechnology Center)(1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的遗传学计算机组序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package of the GeneticsComputer Group)以其默认参数来测量序列同一性。
术语“多肽”、“蛋白”或“肽”是指任何氨基酸残基链，无论其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)如何。
如果本公开的突变IL-2多肽是“基本上纯的”，则它们可以是至少约60重量％(干重)的感兴趣的多肽(例如含有突变IL-2氨基酸序列的多肽)。例如，多肽可以是至少约75重量％、约80重量％、约85重量％、约90重量％、约95重量％或约99重量％的感兴趣的多肽。纯度可以通过任何适当的标准方法测量，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。
“激动剂”是与靶标相互作用以引起或促进靶标活化增加的化合物。
“部分激动剂”是和激动剂与相同靶标相互作用，但即使增加部分激动剂的剂量也不会产生与激动剂同样大幅度的生化和/或生理作用的化合物。
“超激动剂”(也称为“超级因子”)是一种能够产生比靶受体的内源激动剂更强的最大响应，因此具有超过100％的功效的激动剂。
“可操作地连接”旨在意指感兴趣的核苷酸序列(即编码IL-2突变蛋白的序列)以允许核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中表达或将载体引入宿主细胞时在宿主细胞中表达)的方式与调控序列连接。“调控序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号)。参见例如Goeddel(1990)在Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,Calif.)中。调控序列包括那些在许多类型的宿主细胞中指导核苷酸序列组成性表达的调控序列以及仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如组织特异性调控序列)。本领域技术人员将认识到，表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择，所需蛋白质的表达水平等因素。可以将本发明的表达构建体引入宿主细胞中，从而产生本文公开的人IL-2突变蛋白或产生其生物活性变体。
术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文可互换使用。应当理解，此类术语不仅是指特定的受试者细胞，而且是指此类细胞的后代或潜在后代。因为由于突变或环境影响在下一代中可能出现某些修饰，所以事实上此类后代可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用术语的范围内。
如本文所用，术语“转化”和“转染”是指各种本领域公认的用于将外源核酸(例如DNA)引入宿主细胞中的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、粒子枪或电穿孔。
如本文使用，术语“药学上可接受的载体”包括但不限于与药物施用相容的盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。补充活性化合物(例如抗生素)也可以掺入组合物中。
如本文所用，术语“抗PD-1抗体”是指与PD-1结合的任何抗体，包括抑制性抗体。“抗PD-1抑制剂”是指结合并抑制PD-1的抑制剂。此类抗PD-1抗体和/或抑制剂包括但不限于纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011和MK-3475等。
如本文所用，术语“癌症”(或“癌性”)、“过度增殖性”和“肿瘤性”是指具有自主生长能力(即，特征在于迅速增殖性细胞生长的异常状态或状况)的细胞。过度增殖性和肿瘤性疾病状态可以分类为病理性(即，表征或构成疾病状态)，或者可以将其分类为非病理性(即，与正常有偏差但与疾病状态不相关)。这些术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵入性阶段无关。“病理性过度增殖性”细胞出现在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态中。非病理性过度增殖性细胞的实例包括与伤口修复相关的细胞增殖。术语“癌症”或“赘生物”用于指各种器官系统的恶性肿瘤，包括影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴腺和淋巴组织、生殖系统、胃肠器官和泌尿生殖道的那些恶性肿瘤，以及指腺癌，通常认为包括恶性肿瘤，诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。癌症通常包括前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌和脑癌。
术语“癌”是本领域公认的，是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、生殖泌尿系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。“腺癌”是指源自腺组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺样结构的癌。
如本文所用，术语“造血肿瘤性病症”是指涉及造血起源的增生/肿瘤细胞的疾病，例如由髓系、淋巴或红细胞谱系或其前体细胞引起的疾病。优选地，所述疾病由低分化急性白血病(例如，成红细胞白血病和急性成巨核细胞白血病)。其他示例性骨髓病症包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)(在Vaickus,L.(1991)Crit Rev.in Oncol./Hemotol.11:267-97中进行了综述)；淋巴恶性肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)(包括B谱系ALL和T谱系ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、前淋巴细胞性白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和华氏巨球蛋白血症(WM)。恶性淋巴瘤的其他形式包括但不限于非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)、霍奇金病(Hodgkin′s disease)和里德-斯德伯格病(Reed-Stembergdisease)。
如本文所用，术语“治疗”等是指获得所需药理学和/或生理学效应。这种效应就完全或部分预防疾病或其症状而言，可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于该疾病的副作用而言，可以是治疗性的。如本文中所用，“治疗”覆盖对哺乳动物，特别是人类疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病在易患该疾病或有获得该疾病的风险但尚未被诊断为患有此病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；以及(c)缓解该疾病，即引起该疾病消退。治疗有效量可以是减少肿瘤数量，减小肿瘤大小和/或增加存活率的量。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括但不限于人和非人灵长类动物，包括猿猴和人；哺乳类运动动物(例如马)；哺乳类家畜(例如绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；和啮齿动物(例如小鼠、大鼠等)。
术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”是指适于一种或多种施用途径、体内递送或接触的生物学上可接受的配制剂、其气态、液态或固态，或其混合物。“药学上可接受的”或“生理上可接受的”组合物是并非生物学上或其他方面不良的材料，例如，该材料可以施用给受试者而不会引起实质性的不良生物学效应。因此，此类药物组合物可以用于例如向受试者施用IL-2突变蛋白。具体而言，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与抗PD-1组合施用给患有癌症的受试者。在一些实施方案中，施用的IL-2突变蛋白还包含位置F42A处的取代。在一些实施方案中，施用的IL-2突变蛋白还包含位置K43N处的取代。
如本文中所用的短语“单位剂型”是指适合作为待治受试者的单位剂量的物理离散单位；每个单位含有预定量，任选地与药物载体(赋形剂、稀释剂、媒介物或填充剂)结合，当以一个或多个剂量施用时，产生所需作用(例如，预防或治疗作用)。在一些实施方案中，治疗作用是减少肿瘤数量。在一些实施方案中，治疗作用是减小肿瘤大小。在一些实施方案中，治疗作用是增加存活率。
在一些实施方案中，单位剂型可以处于例如安瓿和小瓶内，包括液体组合物，或呈冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可以在施用或体内递送之前添加无菌液体载体。单个单位剂型可以包括在多剂量试剂盒或容器中。与抗PD-1抗体组合的IL-2突变蛋白及其药物组合物可以呈单个或多个单位剂型包装，以便于施用和剂量均一。
“治疗有效量”将落入相对较宽的范围内，该范围可通过实验和/或临床试验测定。例如，对于体内注射，例如，直接注射到受试者的组织或脉管系统(例如，肝组织或静脉)中。本领域的普通技术人员通过建立剂量响应曲线的常规试验可以容易地确定其他有效剂量。
“有效量”或“足够量”是指以单剂量或多剂量，单独地或与一种或多种其他组合物(治疗剂，诸如药物)、治疗、方案或治疗方案试剂(包括，例如疫苗方案)组合，提供任何持续时间(长期或短期)的可检测响应、受试者中任何可测量或可检测程度或任何持续时间(例如，几分钟、几小时、几天、几月、几年或治愈)的预期或期望结果或益处的量。
虽然降低、减少、抑制、阻遏、限制或控制疾病进展或恶化也是令人满意的结果，但用于治疗(例如，改善或提供治疗益处或好转)的“有效量”或“足够量”的剂量通常有效地在可测量的程度上提供对疾病的一种、多种或所有不良症状、后果或并发症，由该疾病引起或与该疾病相关的一种或多种不良症状、病症、疾态、病理或并发症的响应。在一些实施方案中，有效量是足以减少肿瘤数量的量。在一些实施方案中，有效量是足以减小肿瘤大小的量。在一些实施方案中，有效量是足以增加存活率的量。
“预防”及其语法变型意指在疾病之前接触、施用或体内递送给受试者的方法。可以在由疾病引起或与疾病相关的不良症状、病状、并发症等发展之前进行对受试者的施用或体内递送。例如，筛选(例如遗传)可以用于鉴定此类受试者作为所述方法和用途的候选者，但受试者可能不表现出该疾病。因此，此类受试者包括那些因功能基因产物(蛋白质)量不足或缺乏，或产生导致疾病的异常、部分功能性或非功能性基因产物(蛋白质)而筛选呈阳性的受试者；和因导致疾病的异常或缺陷(突变)基因产物(蛋白质)筛选呈阳性的受试者，即使此类受试者没有表现出疾病的症状。
I.具体实施方式
本文所述的IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，其对IL-2Rβ受体的结合能力增强并且可与抗PD-1抗体用于组合治疗。在一些实施方案中，包含根据野生型人IL-2(SEQ IDNO:2；野生型hIL-2)编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白称为H9。此类IL-2突变蛋白具有用途，例如当与抗PD-1抗体组合用于癌症治疗时。还提供了编码此类IL-2突变蛋白的核酸，制备此类IL-2突变蛋白的方法，包括此类IL-2突变蛋白的药物组合物以及使用此类IL-2突变蛋白的治疗方法。
A.IL-2突变蛋白
经取代的氨基酸残基可以是但不一定是保守性取代，通常包括以下类别中的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。这些突变可以是在与IL-2Rβ和/或IL-2Rγ接触的氨基酸残基处。
更具体地，可以在一个或多个位置产生突变(无论是保守的还是非保守的，通过添加或缺失产生突变)。例如，突变可以是：I24V、P65H、Q74R、Q74H、Q74N、Q74S、L80F、L80V、R81I、R81T、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、V93I。示例性IL-2突变蛋白的序列如下：5-1 SEQID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的F42A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的F42A、Y45A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的F42A、E62A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的F42A、Y45A、E62A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的E62A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的Y45A、E62A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的Y45A和E62A。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中导致IL-2Rβ结合增加和/或增强的取代包括根据SEQ ID NO：2的野生型人IL-2编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，用于本发明的IL-2突变蛋白包含L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，并且表现出增加的IL-2Rβ结合。在一些实施方案中，用于本发明的IL-2突变蛋白还包含位置F42A处的取代。在一些实施方案中，用于本发明的IL-2突变蛋白还包含位置K43N处的取代。在一些实施方案中，全部与野生型人IL-2(SEQ ID NO：2)相比，突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，以及一个或多个选自由F42A、Y45A和E62A组成的组的取代。
在一些实施方案中，增加IL-2Rβ结合亲和力的氨基酸取代包括：L80F、R81D、L85V、186V和I92F。在一些实施方案中，增加IL-2Rβ结合亲和力的氨基酸取代包括：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，对IL-2Rβ具有更强结合亲和力的主题IL-2突变蛋白包括氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：5；如实施例1中使用的H9)。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激依赖于IL-2Rβ/IL-2Rγc异二聚化的一种或多种信号传导途径的能力增加。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，主题IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的STAT5磷酸化的能力增强。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的STAT5磷酸化，其水平是野生型IL-2刺激相同细胞中的STAT5磷酸化的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的STAT5磷酸化，其水平是野生型IL-2刺激相同细胞中的STAT5磷酸化的水平的105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％或更高。在一些实施方案中，IL-2Rβ+细胞是T细胞。在特定实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是新鲜分离的CD8+T细胞。在其他实施方案中，CD8+T细胞T细胞是活化的CD8+T细胞。在其他实施方案中，IL-2Rβ+细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，与野生型人IL-2(SEQ ID NO:2)相比，IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，所述突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的ERK1/ERK2信号传导的能力增强。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的pERK1/ERK2信号传导，其水平是野生型IL-2刺激相同细胞中的pERK1/ERK2信号传导的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的pERK1/ERK2磷酸化，其水平是野生型IL-2刺激相同细胞中的pERK1/ERK2磷酸化的水平的105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％或更高。在一些实施方案中，IL-2Rβ+细胞是T细胞。在特定实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞是新鲜分离的CD8+T细胞。在其他实施方案中，CD8+T细胞T细胞是活化的CD8+T细胞。在其他实施方案中，IL-2Rβ+细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，与野生型人IL-2(SEQ ID NO:2)相比，IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
可以例如，使用本领域已知的任何合适的方法，通过STAT5和ERK1/2的磷酸化来测量STAT5和ERK1/2信号传导。例如，可以使用对这些分子的磷酸化型式具有特异性的抗体，与本文所述的流式细胞术分析组合来测量STAT5和ERK1/2的磷酸化。在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，所述突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的PI 3激酶信号传导的能力增强。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的PI 3-激酶信号传导，其水平是野生型IL-2刺激相同细胞中的PI 3-激酶信号传导的水平的1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更低。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白刺激IL-2Rβ+细胞中的PI 3-激酶信号传导，其水平是野生型IL-2刺激相同细胞中的PI 3-激酶信号传导的水平的105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％、155％、160％、165％、170％、175％、180％、185％、190％、195％或更高。在一些实施方案中，IL-2Rβ+细胞是T细胞。在特定实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，CD8+T细胞T细胞是活化的CD8+T细胞。在其他实施方案中，IL-2Rβ+细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，与野生型人IL-2(SEQ IDNO:2)相比，IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。可以使用本领域已知的任何合适的方法来测量PI3-激酶信号转导。例如，可以使用对磷酸-S6核糖体蛋白具有特异性的抗体，与本文所述的流式细胞术分析组合来测量PI 3-激酶信号传导。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是CD8+T细胞中IL-2和/或IL-15STAT5磷酸化的刺激物。在一些实施方案中，突变蛋白是IL-2和/或IL-15诱导的CD8+T细胞增殖的促进物。在一些实施方案中，突变蛋白是IL-2依赖性、TCR诱导的细胞增殖的刺激物。在一些实施方案中，与野生型人IL-2(SEQ ID NO:2)相比，IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
IL-2促进Th1、Th9和Treg T细胞分化，而抑制Th17分化。因此，不受任何特定操作理论的约束，据信起到IL-2超激动剂的作用的IL-2突变蛋白能够促进Th1、Th9和/或Treg细胞分化或抑制Th17细胞分化。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是IL-2依赖性Th1、Th9和/或Treg分化的促进物。在一些实施方案中，所述突变蛋白是Th17分化的抑制剂。在一些实施方案中，与野生型人IL-2(SEQ IDNO:2)相比，IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，IL-2突变蛋白信号传导更少和/或独立于CD25(例如，具有的CD25结合降低或消除)。在一些实施方案中，关于CD25的减少的和/或独立的信号传导允许优先活化效应T细胞，同时限制了对Treg的刺激。在一些实施方案中，关于CD25的减少的和/或独立的信号传导使毒性减少。在一些实施方案中，全部与野生型人IL-2(SEQ ID NO:2)相比，突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，以及一个或多个选自由F42A、Y45A和E62A组成的组的取代。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白能够增加和/或恢复对无能NK细胞的响应性。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白能够增加和/或恢复对肿瘤微环境中的无能NK细胞的响应性。在一些实施方案中，与野生型人IL-2(SEQ ID NO:2)相比，IL-2突变蛋白包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
在一些实施方案中，所述突变蛋白是自然杀伤(NK)细胞的IL-2依赖性活化的抑制剂。NK细胞的IL-2活化可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量，例如，通过测量IL-2诱导的CD69表达和/或细胞毒性，如本文所述。
在一些实施方案中，IL-2Rβ结合亲和力的增加是大于野生型人IL-2对IL-2Rβ的结合亲和力的任何IL-2Rβ结合亲和力。在一些实施方案中，结合亲和力是与野生型人IL-2对IL-2Rβ的结合亲和力相比，对IL-2Rβ的结合亲和力增加2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、150倍、170倍、190倍、200倍、220倍、240倍或更多。
在一些实施方案中，对IL-2Rβ结合能力的增加是大于野生型人IL-2对IL-2Rβ的结合能力的任何IL-2Rβ结合能力。在一些实施方案中，结合能力是与野生型人IL-2对IL-2Rβ的结合能力相比，对IL-2Rβ的结合能力增加2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、150倍、170倍、190倍、200倍、220倍、240倍或更多。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，对IL-2Rβ具有更强结合亲和力的主题IL-2突变蛋白还表现出与CD25的结合减少，并且包括氨基酸取代F42A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，结合亲和力降低约220倍，即从野生型人IL-2为约6.6nM的Kd降至包含F42A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的突变蛋白的约1.4μM。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO:6；也称为H9-F42A)。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，对IL-2Rβ具有更强结合亲和力的主题IL-2突变蛋白还表现出与CD25的结合减少，并且包括氨基酸取代K43N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，结合亲和力降低是由于允许在位置43处用K43N取代进行糖基化。通过用赖氨酸取代天冬酰胺(K43N)，在包含氨基酸取代K43N、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白中，CD25结合减少和/或消除。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFNFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：7；也称为H9-K43N)。
在一些实施方案中，对CD25的结合亲和力的降低是小于野生型人IL-2结合亲和力的任何CD25结合亲和力。在一些实施方案中，结合亲和力是与野生型人IL-2对CD25的结合亲和力相比，对CD25的结合亲和力降低10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、150倍、170倍、190倍、200倍、220倍、240倍或更多。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，对IL-2Rβ具有更强结合亲和力而对CD25的结合亲和力降低的主题IL-2突变蛋白包括氨基酸取代F42A、Y45A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：8；H9-F42A/Y45A；H9-FYAA)。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，对IL-2Rβ具有更强结合亲和力而对CD25的结合亲和力降低的主题IL-2突变蛋白包括氨基酸取代F42A、E62A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFYMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：9；H9-F42A/E62A；H9-FEAA)。
在一些实施方案中，与野生型人IL-2相比，对IL-2Rβ具有更强结合亲和力而对CD25的结合亲和力降低的主题IL-2突变蛋白包括氨基酸取代F42A、Y45A、E62A、L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白具有以下氨基酸序列：
APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTAKFAMPKKATELKHLQCLEEALKPLEEVLNLAQSKNFHFDPRDVVSNINVFVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT(SEQ ID NO：10；H9-F42A/Y45A/E62A；H9-FYEAAA)。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6至SEQ IDNO：10或SEQ ID NO：16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：10中的任一个95％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：10中的任一个98％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：6至SEQ ID NO：10中的任一个99％相同。
下表中提供了其他示例性IL-2序列。
表2：示例性IL-2突变蛋白列表
Figure BDA0002387189880000271
Figure BDA0002387189880000281
Figure BDA0002387189880000291
B.IL-2突变蛋白融合蛋白
可以将IL-2突变蛋白制备成融合体或嵌合多肽，其包括主题IL-2突变蛋白和异源多肽(即，不是IL-2或其突变体的多肽)(参见例如美国专利号6,451,308)。示例性的异源多肽可以增加嵌合多肽在体内的循环半衰期，因此可以进一步增强突变IL-2多肽的特性。在各种实施方案中，增加循环半衰期的多肽可以是血清白蛋白(诸如人血清白蛋白)、PEG、PEG衍生物或缺乏IgG重链可变区的抗体IgG亚类的Fc区。示例性的Fc区可以包含抑制补体固定和Fc受体结合的突变，或者可以具有裂解性，即能够结合补体或通过另一种机制，诸如抗体依赖性补体裂解(ADCC；1994年12月12日提交的USSN 08/355,502)来裂解细胞。
“Fc区”可以是与通过木瓜蛋白酶消化IgG而产生的IgG C端结构域同源的天然存在的或合成的多肽。IgG Fc的分子量为大约50 kDa。突变IL-2多肽可包括整个Fc区，或保持延长作为其一部分的嵌合多肽的循环半衰期的能力的较小部分。另外，全长或片段化Fc区可以是野生型分子的变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白融合蛋白(例如，如本文所述的IL-2突变蛋白)包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc区(参见例如图2A-2B中的序列)。在一些实施方案中，Fc区包含取代N297A。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白与异源融合多肽直接或间接连接。
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白与Fc区直接连接。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白经由接头肽诸如GGGGS与Fc区连接。在一些实施方案中，接头为(GGGGS)n，其中n是1至10之间的整数。在一些实施方案中，接头为GGGGS。在一些实施方案中，接头为GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:16)。在一些实施方案中，接头为GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:17)。在一些实施方案中，接头为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:18)。在一些实施方案中，接头为GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:19)。
Fc区可以是“裂解性的”或“非裂解性的”，但通常是非裂解性的。非裂解性Fc区通常缺乏高亲和力Fc受体结合位点和C′1q结合位点。鼠IgG Fc的高亲和力Fc受体结合位点在IgG Fc的位置235处包括Leu残基。因此，可以通过使Leu 235突变或缺失而破坏Fc受体结合位点。例如，用Glu取代Leu 235会抑制Fc区结合高亲和力Fc受体的能力。可以通过使IgG的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基突变或缺失来功能性破坏鼠C′1q结合位点。例如，用Ala残基取代Glu 318、Lys 320和Lys 322致使IgG1Fc无法指导抗体依赖性补体裂解。相反，裂解性IgG Fc区具有高亲和力Fc受体结合位点和C′1q结合位点。高亲和力Fc受体结合位点在IgG Fc的位置235处包括Leu残基，C′1q结合位点包括IgG1的Glu 318、Lys 320和Lys 322残基。裂解性IgGFc在这些位点具有野生型残基或保守性氨基酸取代。裂解性IgG Fc可以靶向细胞以产生抗体依赖性细胞毒性或补体指导的细胞裂解(CDC)。人IgG的适当突变也是已知的(参见例如Morrison等人，TheImmunologist 2:119-124,1994；和Brekke等人，TheImmunologist 2:125,1994)。
在其他实施方案中，嵌合多肽可以包括主题IL-2突变蛋白和起到抗原标签作用的多肽，诸如FLAG序列。如本文所述，FLAG序列被生物素化的高度特异性抗FLAG抗体识别(另见Blanar等人，Science 256:1014,1992；LeClair等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8145,1992)。在一些实施方案中，嵌合多肽还包含C端c-myc表位标签。
在其他实施方案中，嵌合多肽包括突变IL-2多肽和起到增强突变IL-2多肽的表达或直接细胞定位作用的异源多肽，诸如Aga2p凝集素亚基(参见例如Boder和Wittrup，Nature Biotechnol.15:553-7,1997)。
在其他实施方案中，可以产生包括突变IL-2和抗体或其抗原结合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗体或抗原结合组分可以用作靶向部分。例如，它可以用于将嵌合蛋白定位于细胞的特定子集或靶分子。产生细胞因子-抗体嵌合多肽的方法，例如在美国专利号6,617,135中有描述。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗体或其抗原结合部分的融合体，该抗体或其抗原结合部分破坏PD-1受体与其配体PD-L1之间的相互作用，和/或是针对PD-1/PD-L1信号传导途径的组分的抗体。本领域已知的与PD-1结合并破坏PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用，并刺激抗肿瘤免疫响应的抗体适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。例如，靶向PD-1并且可以用于本发明的抗体包括，例如，但不限于纳武单抗(BMS-936558，Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(兰博利单抗(lambrolizumab)，MK03475或MK-3475，Merck)、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君实)、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro,Inc.)、匹利珠单抗(Pidilizumab)(抗PD-1mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞)、人单克隆抗体REGN2810(塞普利单抗，Regeneron)、人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-Myers Squibb)和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(Novartis)。在一些实施方案中，PD-1抗体来自以下克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。其他合适的抗体包括以引用方式并入本文的美国专利号8,008,449中公开的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-L1特异性结合并抑制其与PD-1的相互作用，从而增强免疫活性。本领域已知的与PD-L1结合并破坏PD-1与PD-L1之间的相互作用，并刺激抗肿瘤免疫响应的任何抗体均适合用于本文公开的嵌合多肽中。例如，靶向PD-L1且正在临床试验中的抗体包括BMS-936559(Bristol-MyersSquibb)和MPDL3280A(Genetech)。在以引用方式并入本文的美国专利号7,943,743中公开了靶向PD-Ll的其他合适的抗体。普通技术人员将理解，与PD-1或PD-L1结合，破坏PD-1/PD-L1相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的任何抗体均适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗PD-1抗体的融合体。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗PD-L1抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向CTLA-4并破坏其与CD80和CD86的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。靶向CTLA-4的示例性抗体包括已获FDA批准的伊匹木单抗(ipilimumab)(MDX-010,MDX-101,Bristol-Myers Squibb)和目前正在进行人体试验的曲美木单抗(tremelimumab)(替西木单抗(ticilimumab),CP-675,206,Pfizer)。在以引用方式并入本文的WO 2012/120125、美国专利号6,984720、6,682,7368和美国专利申请2002/0039581、2002/0086014和2005/0201994中公开了靶向CTLA-4的其他合适的抗体。普通技术人员将理解，与CTLA-4结合，破坏其与CD80和CD86的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的任何抗体均适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗CTLA-4抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向LAG-3并破坏其与MHC II类分子的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。靶向LAG-3的示例性抗体是目前正在进行人体试验的IMP321(Immutep)。在以引用方式并入本文的美国专利申请2011/0150892中公开了靶向LAG-3的其他合适的抗体。普通技术人员将理解，与LAG-3结合，破坏其与MHC II类分子的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的任何抗体均适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗LAG-3抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向B7-H3或B7-H4的抗体或其抗原结合部分的融合体。B7家族没有任何限定的受体，但是这些配体在肿瘤细胞或肿瘤浸润细胞上被上调。靶向B7-H3的示例性抗体是目前正在进行人体试验的MGA271(Macrogenics)。在以引用方式并入本文的美国专利申请2013/0149236中公开了靶向B7家族成员的其他合适的抗体。普通技术人员将理解，与B7-H3或H4结合并刺激抗肿瘤免疫响应的任何抗体均适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗B7-H3或B7-H4抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向TIM-3并破坏其与半乳凝素9的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。在以引用方式并入本文的美国专利申请2013/0022623中公开了靶向TIM-3的合适抗体。普通技术人员将理解，与TIM-3结合，破坏其与半乳凝素9的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的任何抗体均适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗TIM-3抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向4-1BB/CD137并破坏其与CD137L的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与4-1BB/CD137结合，破坏其与CD137L或另一种配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗4-1BB/CD137抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向GITR并破坏其与配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与GITR结合，破坏其与GITRL或另一种配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗GITR抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向OX40并破坏其与配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与OX40结合，破坏其与OX40L或另一种配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗OX40抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向CD40并破坏其与配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与CD40结合，破坏其与配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗CD40抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向ICOS并破坏其与配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与ICOS结合，破坏其与配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗ICOS抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向CD28并破坏其与配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与CD28结合，破坏其与配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗CD28抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与靶向IFNα并破坏其与配体的相互作用的抗体或其抗原结合部分的融合体。普通技术人员将理解，与IFNα结合，破坏其与配体的相互作用并刺激产生抗肿瘤活性的抗肿瘤免疫响应或免疫刺激响应的任何抗体总的来说，适合用于本文公开的嵌合多肽中。在一些实施方案中，嵌合多肽包含与抗IFNα抗体的融合体。
在一些实施方案中，嵌合多肽包含与肿瘤抗原或靶向肿瘤抗原的多肽的融合体。通常，肿瘤抗原允许将肿瘤细胞与其正常的细胞对应物区分开，并且可以包括，例如肿瘤特异性抗原(TSA)以及肿瘤相关抗原(TAA)。在一些实施方案中，肿瘤抗原是原癌基因和/或肿瘤抑制因子，以及过表达或异常表达的细胞蛋白，由致癌病毒产生的肿瘤抗原，瘤胎抗原，改变的细胞表面糖脂和糖蛋白，和/或细胞类型特异性分化抗原。此类肿瘤抗原可以包括黑素瘤抗原、癌-睾丸抗原、上皮肿瘤抗原、细胞周期调节蛋白、前列腺特异性抗原(包括前列腺癌抗原，例如在美国专利号5,538,866中公开的那些)、淋巴瘤(美国专利号4,816,249、5,068,177和5,227,159)。肿瘤抗原可以包括，例如但不限于与2G3和369F10结合的HMW粘蛋白，c-erbB-2相关肿瘤抗原(大约42kD或55kD的糖蛋白)，113F1、9-O-乙酰基GD3、p97、甲胎蛋白(AFP)结合的大约40、60、100和200kD的抗原(例如，对于生殖细胞肿瘤和/或肝细胞癌而言)，癌胚抗原(CEA)(例如，对于肠癌、偶发性肺癌或乳腺癌而言)，CA-125(例如，对于卵巢癌而言)，MUC-1(例如，对于乳腺癌而言)，上皮肿瘤抗原(ETA)(例如，对于乳腺癌而言)，酪氨酸酶(例如，对于恶性黑素瘤而言)，黑素瘤相关抗原(MAGE)(例如，对于恶性黑素瘤而言)，癌/睾丸抗原1(CTAG1B)，黑素瘤相关抗原1(MAGEA1)，异常Ras产物，异常p53产物，过表达的细胞周期蛋白(包括例如，细胞周期蛋白B1)，突变的纤连蛋白，翻译后改变的MUC1糖蛋白，分泌型肿瘤抗原(包括，例如神经节苷脂)。
其他融合体可以包括与促凋亡有效载荷的融合体。下表中提供了此类示例性序列。在一些实施方案中，如本文所述的IL-2突变蛋白与促凋亡有效载荷，例如BAD、BAX、BAK、BIK和/或BID序列融合。在一些实施方案中，促凋亡有效载荷是含有Bcl-2结构域的肽和/或BAD、BAX、BAK、BIK和/或BID序列的序列。下表3中提供了示例性的促凋亡融合体。
表3：选择的促凋亡融合伴侣列表
Figure BDA0002387189880000361
Figure BDA0002387189880000371
在一些特定实施方案中，IL-2拮抗剂可与促凋亡有效载荷融合以治疗癌症。“拮抗剂”是例如通过阻止、降低、抑制或中和激动剂的活性，对抗激动剂的作用的化合物。即使在没有鉴定的激动剂的情况下，“拮抗剂”也可以阻止、抑制或降低靶标(例如靶标受体)的组成活性。虽然通常将与野生型IL-2相比具有激动剂或超激动剂活性的IL-2突变蛋白与本发明的癌症治疗方法一起使用，但是当此类拮抗剂与促凋亡有效载荷融合时，也可以使用具有拮抗特性的IL-2突变蛋白。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的野生型IL-2相比，IL-2拮抗剂包含以下氨基酸取代L18R、Q22E、Q126T和S130R。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的野生型IL-2相比，IL-2拮抗剂包含以下氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V和Q126T。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:2的野生型IL-2相比，IL-2拮抗剂包含以下氨基酸取代L18R、Q22E、L80F、R81D、L85V、I86V、Q126T和S130R。下表4中提供了可以与促凋亡有效载荷(诸如上面提供的那些)融合的示例性拮抗剂。
表4：用于与促凋亡有效载荷融合的IL-2拮抗剂
Figure BDA0002387189880000381
Figure BDA0002387189880000391
其他融合体可以包括与抗凋亡有效载荷的融合体，用于延长CD8细胞、NK细胞和无能NK细胞的活化，并且下表中提供了此类示例性序列。可以证明这样延长T细胞的活化在癌症治疗方法中是有益的。
表4：示例性IL-2抗凋亡融合氨基酸序列表
Figure BDA0002387189880000401
Figure BDA0002387189880000411
其他示例性IL-2融合体包括下表中列出的那些：
表5：示例性的半衰期延长的IL-2融合体氨基酸序列表
Figure BDA0002387189880000421
Figure BDA0002387189880000431
Figure BDA0002387189880000441
Figure BDA0002387189880000451
Figure BDA0002387189880000461
Figure BDA0002387189880000471
Figure BDA0002387189880000481
Figure BDA0002387189880000491
Figure BDA0002387189880000501
Figure BDA0002387189880000511
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白-Fc融合体包含以下序列之一：
表6：氨基酸序列表
Figure BDA0002387189880000512
Figure BDA0002387189880000521
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15和/或SEQID NO:20至SEQ ID NO:80中的任何一个(例如，本文提供的任何IL-2序列)90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:80中的任何一个(例如，本文提供的任何IL-2序列)95％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:80中的任何一个(例如，本文提供的任何IL-2序列)98％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:12至SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:20至SEQ ID NO:80中的任何一个(例如，本文提供的任何IL-2序列)99％相同。
C.用于与IL-2融合的IL-4、IL-13IL-10、IL-12、IL15和IL-18
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可与如本文所述的IL-4突变蛋白融合。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可与如本文所述的IL-13突变蛋白融合。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可与IL-10融合。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可与IL-12融合。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可与IL-15融合。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可与IL-18融合。在一些实施方案中，此类融合体起到特异性靶向癌细胞和/或癌干细胞并减少或抑制癌干细胞生长，以及靶向肿瘤微环境(TME)中的免疫抑制细胞的作用。
任何IL-13序列或其变体均可与如本文所述的IL-2突变蛋白融合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在SEQ ID NO:81-SEQ ID NO:128以及下表中提供了示例性的IL-13多肽序列。在一些实施方案中，IL-13多肽序列是如SEQ ID NO:81-SEQ ID NO:128中任一个所提供的那样。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:81。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:82。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:83。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:84。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:85。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:86。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:87。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:88。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:89。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:90。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:91。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:92。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:93。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:94。在一些实施方案中，所述多肽序列是SEQ ID NO:95。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:96。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:97。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:98。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:99。在一些实施方案中，所述多肽序列是SEQ ID NO:100。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:101。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:102。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:103。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:104。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:105。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:106。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:107。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:108。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:109。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:110。在一些实施方案中，所述多肽序列是SEQ ID NO:111。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:112。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:113。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:114。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:115。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:116。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:117。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:118。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:119。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:120。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:121。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:122。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:123。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ IDNO:124。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:125。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:126。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:127。在一些实施方案中，IL-13多肽序列为SEQ ID NO:128。IL-13在一些实施方案中，IL-13多肽序列与SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:128中的任一个90％相同。在一些实施方案中，IL-13多肽序列与SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:128中的任一个95％相同。在一些实施方案中，IL-13多肽序列与SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:128中的任一个98％相同。在一些实施方案中，IL-13多肽序列与SEQ ID NO:81至SEQ ID NO:128中的任一个99％相同。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:81-SEQ ID NO:128中的任一个与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:81与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:82与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:83与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:84与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:85与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:86与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:87与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:88与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:89与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:90与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:91与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:92与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ IDNO:93与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:94与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:94与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:96与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:97与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:98与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:99与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ IDNO:100与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:101与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:102与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:103与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:104与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:105与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:106与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:107与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ IDNO:108与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:109与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:110与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:111与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:112与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:113与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:114与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:115与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ IDNO:116与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:117与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:118与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:119与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:120与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:121与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:122与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:123与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ IDNO:124与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:125与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:126与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:127与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:128与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。
在一些实施方案中，本发明的IL-13肽包含以下氨基酸取代中的一种或多种：(1)L10F、L10I、L10V、L10A、L10D、L10T、L10H；(2)R11S、R11N、R11H、R11L、R11I；(3)I14L、I14F、114V、I14M；(4)V18L、V18F、V18I；(5)E12A；(6)R65D；(7)R86K、R86T、R86M；(8)D87E、D87K、D87R、D87G、D87S；(9)T88I、T88K、T88R；(10)K89R、K89T、K89M；(11)L101F、L101I、L101Y、L101H、L101N；(12)K104R、K104T、K104M；(13)K105T、K105A、K105R、K105E；(14)F107L、F107I、F107V、F107M；和(15)R108K、R108T、R108M，这些取代引起对IL-13Rα1和IL-13Rα2之一或两者的亲和力改变。在其他实施方案中，经修饰的残基在以上定义的接触残基的组合集合内的两个或更多个，三个或更多个，四个或更多个，五个或更多个以及不超过14个氨基酸处。如国际专利公开WO 2013/112871中所述，其公开内容以引用方式整体并入本文。在一些实施方案中，氨基酸取代包括但不限于图4中提供的那些。
修饰集合可以包括以下具体变化：(1)L10H；L10A；(2)R11L；(4)V18I；(7)R86M；R86K；R86T；(8)D87K；D87G；(9)T88R、T88S；T88K；(10)K89R；(11)L101N；(12)K104R；(13)K105A；K105E；(14)R108K。在一些实施方案中，修饰包括所列举的具体变化中的任何一个。在一些实施方案中，修饰包括L10H。在一些实施方案中，修饰包括L10A。在一些实施方案中，修饰包括R11L。在一些实施方案中，修饰包括V18I。在一些实施方案中，修饰包括R86M。在一些实施方案中，修饰包括R86K。在一些实施方案中，修饰包括R86T。在一些实施方案中，修饰包括D87K。在一些实施方案中，修饰包括D87G。在一些实施方案中，修饰包括T88R。在一些实施方案中，修饰包括T88S。在一些实施方案中，修饰包括T88K。在一些实施方案中，修饰包括K89R。在一些实施方案中，修饰包括L101N。在一些实施方案中，修饰包括K104R。在一些实施方案中，修饰包括K105A。在一些实施方案中，修饰包括K105E。在一些实施方案中，修饰包括R108K。在一些实施方案中，包含所述一种或多种修饰的多肽与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，氨基酸取代包括但不限于图4中提供的那些。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2SEQID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ IDNO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。
相对于天然IL-13序列，在与IL-13Rα2(相比于IL-13Rα1)的结合方面提供更高选择性的特定修饰集合可以包括但不限于：
·[L10D、R11I、V18I、R86K、D87K、k89R、R108K](例如，C2，例如SEQ ID NO:31或SEQID NO:49)
·[L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A、R108K](例如，C3，例如SEQID NO:32或SEQ ID NO:50)
·[L10V、K89R、L101N、K105E、R108T](例如，C4，例如SEQ ID NO:33或SEQ ID NO:31)
·[R11S、I14M、T88S、L101N、K105A、R108K](例如，C7，例如SEQ ID NO:34或SEQ IDNO:52)
·[L10H、R11L、V18I、R86K、D87E、K89R、L101N、K105T、R108K](C9，例如SEQ ID NO:53)
·[L10H、R86T、D87G、T88R、R108K](C11，例如SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:55)
·[L10A、V18F、R86K、D87K、K89R、L101I、K104R、R108K](D7，例如SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:57)
·[L10T/D；R11I；V18I；R86K；D87K/G；T88S；K89R；L101Y；K104R；K105T；R108K]
·[L10A/V；R86T；D87G；T88K；K89R；L101N；K104R；K105A/E；R108K/T]
在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、K89R、L101N、K105E、R108T。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、I14M、T88S、L101N、K105A和R108K(C7，例如SEQ ID NO:35或SEQID NO:52)。在一些实施方案中，修饰集合包括L10H、R11L、V18I、R86K、D87E、K89R、L101N、K105T和R108K(C9，例如SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:53)。在一些实施方案中，修饰集合包括L10H、R86T、D87G、T88R和R108K(C11，例如SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:55)。在一些实施方案中，修饰集合包括L10A、V18F、R86K、D87K、K89R、L101I、K104R和R108K(D7，例如SEQ ID NO:40或SEQ ID NO:57)。在一些实施方案中，修饰集合包括L10T/D、R11I、V18I、R86K、D87K/G、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10T、R11I、V18I、R86K、D87K、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10T、R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10D、R11I、V18I、R86K、D87K、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10D、R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、K89R、L101Y、K104R、K105T、R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10A/V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A/E和R108K/T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10A、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108K。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105A和dR108T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、R86T、D87G、T88K、K89R、L101N、K104R、K105E和R108T。在一些实施方案中，氨基酸序列90％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列95％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列98％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列99％相同。在一些实施方案中，包含所述一种或多种修饰的多肽与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，氨基酸取代包括但不限于图4中提供的那些。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ IDNO：5、5-2 SEQ ID NO：6、6-6 SEQ ID NO：7、A2 SEQ ID NO：8、B1 SEQ ID NO：9、B11 SEQ IDNO：10、C5 SEQ ID NO：11、D10 SEQ ID NO：12、E10 SEQ ID NO：13、G8 SEQ ID NO：14、H4SEQ ID NO：15和H9 SEQ ID NO：16中的任一种。
相对于天然IL-13序列，在与IL-13Rα1(相比于IL-13Rα2)的结合方面提供更高选择性的特定修饰集合可以包括但不限于：
·[L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T]
·[R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T]
·[L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T]
·[L10V/I；D87S；T88S；K89R；L101H/F；K104R；K105T]
·[L10I；V18I；R86T；D87G；T88S；K89R；L101Y/H；K104R；K105A]
·[L10V；V18I；D87S；T88S；L101F；K104R；K105T]
·[V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A]
·[R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M]
这些取代任选地与取代[E12A/G/S、R65D/E]组合。
在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R和K105T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R和K105T。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R和K105A。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R和K105A。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A和F107M。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12G和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12S和R65D/E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12G和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12S和R65D。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12A和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12A/G/S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12G和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、D88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11S、V18I、R86K、D87G、T88S、K89M、L101Y、K104R、K105T、E12A/G/S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V/I、D87S、T88S、K89R、L101H/F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10I、V18I、R86T、D87G、T88S、K89R、L101Y/H、K104R、K105A、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、V18I、D87S、T88S、L101F、K104R、K105T、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括V18I、R86T、D87G、T88S、L101Y、K104R、K105A、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括R11I、V18I、R86K、D87G、T88S、L101H、K104R、K105A、F107M、E12S和R65E。在一些实施方案中，修饰集合包括L10V、E12A、V18I、R65D、D87S、T88S、L101F、K104R和K105T(参见例如IL-13dn；SEQ ID NO:38)。在一些实施方案中，氨基酸序列90％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列95％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列98％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列99％相同。在一些实施方案中，包含所述一种或多种修饰的多肽与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，氨基酸取代包括但不限于图4中提供的那些。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ IDNO:6、6-6 SEQ IDNO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5SEQ IDNO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ IDNO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9SEQ ID NO:16中的任一种。
下面提供了IL-13序列的表格。
表7：IL-13氨基酸序列表
Figure BDA0002387189880000671
Figure BDA0002387189880000681
Figure BDA0002387189880000691
Figure BDA0002387189880000701
Figure BDA0002387189880000711
Figure BDA0002387189880000721
Figure BDA0002387189880000731
任何IL-4序列或其变体均可与IL-2突变蛋白或变体(包括如本文所述的那些)融合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ IDNO:16中的任一种。在SEQ ID NO:130-SEQ ID NO:135中提供了示例性的多肽序列，包括本文提供的那些中的任一个。在一些实施方案中，IL-4多肽序列是如SEQ ID NO:130至SEQ IDNO:135中任一个所提供的那样。在一些实施方案中，IL-4多肽序列为SEQ ID NO:130。在一些实施方案中，IL-4多肽序列为SEQ ID NO:131。在一些实施方案中，IL-4多肽序列为SEQID NO:132。在一些实施方案中，IL-4多肽序列为SEQ ID NO:133。在一些实施方案中，IL-4多肽序列为SEQ ID NO:134。在一些实施方案中，IL-4多肽序列为SEQ ID NO:135。在一些实施方案中，IL-4多肽序列与SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:135中的任一个98％相同。在一些实施方案中，IL-4多肽序列与SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:135中的任一个99％相同。在一些实施方案中，SEQ ID NO:130-SEQ ID NO:135中的任一个与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:130与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:131与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:132与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:133与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ IDNO:134与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:135与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ IDNO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ IDNO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。
下面提供了IL-4序列的表格。
表8：IL-4氨基酸序列表
Figure BDA0002387189880000741
Figure BDA0002387189880000751
在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可以与IL-10、IL-12、IL-15和/或IL-18序列融合。在一些实施方案中，此类融合体起到将融合构建体特异性地靶向NK细胞和/或CD8+细胞的作用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ IDNO:16中的任一种。在一些实施方案中，SEQ ID NO:136与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:137与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:138与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:139与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQID NO:140与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，SEQ ID NO:141与如本文所述的IL-2或IL-2突变蛋白连接。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白可以与下表在SEQ ID NO:136-141中提供的IL-IL-10、IL-12、IL-15和/或IL-18序列融合。
表9：示例性的IL-10、IL-12、IL-15和/或IL-18序列
Figure BDA0002387189880000752
Figure BDA0002387189880000761
示例性IL-2突变蛋白的序列包括5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。
在一些实施方案中，细胞因子-细胞因子融合体是下表中所包括那些的融合体之一。
表10：示例性IL-2融合氨基酸序列表
Figure BDA0002387189880000762
Figure BDA0002387189880000771
D.IL-2突变蛋白的重组表达、表达载体及宿主细胞
在各种实施方案中，用于本发明实践的多肽是合成的，或是通过重组核酸分子表达产生的。如果多肽是嵌合体(例如，至少含有突变IL-2多肽和异源多肽的融合蛋白)，则它可以由含有一个编码整个或部分IL-2突变蛋白的序列，以及编码整个或部分异源多肽的第二序列的杂合核酸分子编码。例如，本文所述的主题IL-2突变蛋白可以与六组氨酸标签融合以促进细菌表达的蛋白质的纯化，或与血凝素标签融合以促进在真核细胞中表达的蛋白质的纯化。
用于构建编码IL-2突变蛋白的DNA序列并在适当转化的宿主中表达那些序列的方法包括但不限于使用PCR辅助的诱变技术。由IL-2多肽的氨基酸残基的缺失或添加组成的突变也可以用标准重组技术进行。在缺失或添加的情况下，任选地用适当的限制性核酸内切酶消化编码IL-2的核酸分子。所得片段可以直接表达，也可以通过例如将其连接至第二片段进行进一步操纵。如果核酸分子的两个末端含有彼此重叠的互补核苷酸，则可以促进所述连接，但是平末端片段也可以连接。PCR产生的核酸也可以用于产生各种突变序列。
完整的氨基酸序列可用于构建反向翻译基因。可以合成含有编码IL-2突变蛋白的核苷酸序列的DNA寡聚物。例如，可以合成几种编码所需多肽的多个部分的小寡核苷酸，然后连接。单个寡核苷酸通常含有5′或3′突出端以互补组装。
除了通过表达已经通过重组分子生物学技术改变的核酸分子来产生突变多肽之外，还可以化学合成主题IL-2突变蛋白。化学合成的多肽由本领域技术人员常规地生成。
一经组装(通过合成、定点诱变或其他方法)，就将编码IL-2突变蛋白的DNA序列插入表达载体中，并与适于在所需转化宿主中表达IL-2突变蛋白的表达控制序列操作性连接。正确的组装可以通过核苷酸测序、限制性酶切作图和生物学活性多肽在合适宿主中的表达来确认。如本领域众所周知的，为了在宿主中获得转染基因的高表达水平，该基因必须与在所选表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列操作性连接。
不管是通过定点诱变、化学合成还是其他方法制备的编码IL-2突变蛋白的DNA序列也可以包括编码信号序列的DNA序列。如果存在，则此类信号序列应该是被选择用于表达IL-2突变蛋白的细胞所识别的信号序列。它可以是原核的、真核的或两者的组合。也可以是天然IL-2的信号序列。信号序列的包含取决于是否需要使IL-2突变蛋白从产生它的重组细胞中分泌。如果所选细胞是原核的，则通常优选DNA序列不编码信号序列。如果所选细胞是真核的，则通常优选编码信号序列且最优选使用野生型IL-2信号序列。
E.溶瘤病毒靶向部分
在一些实例中，本文所述的IL-2突变蛋白可用于靶向溶瘤病毒(例如，参见Allen等人，Mol.Ther.16:1556-64,2008)。在一些实例中，溶瘤病毒可用于将IL-2突变蛋白靶向肿瘤或TME。可以使用多种病毒作为溶瘤病毒，包括腺病毒以及自我复制型甲病毒，以及溶瘤牛痘病毒(参见例如WO2013038066，其以引用方式整体并入本文；尤其是图17)。其他溶瘤病毒可以包括塞内加谷病毒、新城疫病毒(也称为新城病毒)、马拉巴病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(包括HSV-1)、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、慢病毒、麻疹病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒和逆转录病毒(参见例如Twumasi-Boateng等人，“Oncolytic viruses as engineering platforms for combinationimmunotherapy”,Nature Reviews Cancer,2018)，和Kaufman等人，CancerImmunotherapy,14:642-662(2015)，其全部以引用方式整体并入本文)。在一些实施方案中，所述溶瘤病毒包括但不限于腺病毒、自我复制型甲病毒、牛痘病毒、塞内加谷病毒、新城疫病毒、马拉巴病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、慢病毒、麻疹病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒和/或逆转录病毒。IL-2超级因子(如本文所述的H9和IL-2变体)也可用于将T细胞/OV引导至TME。IL-2变体(诸如H9)可以加强效应T细胞和NK细胞，而IL-2变体可以抑制T reg活性。其他溶瘤病毒可以包括，例如oncoVex/T-VEC，其涉及瘤内注射优先感染癌细胞的条件复制型单纯疱疹病毒。该病毒，还经工程改造以表达GM-CSF，能够在癌细胞内复制，使其裂解，释放出新病毒和一系列肿瘤抗原，并在此过程中分泌出GM-CSF。此类溶瘤病毒疫苗增强了肿瘤微环境中的DC功能，以刺激抗肿瘤免疫响应。这些溶瘤病毒可用于将本文所述的IL-2突变蛋白靶向或递送至肿瘤。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ IDNO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含能够表达如本文所述的IL-2突变蛋白的转基因。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含能够表达IL-2突变蛋白的转基因，所述IL-2突变蛋白包含根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含编码IL-2突变蛋白的核酸，所述IL-2突变蛋白包含根据SEQID NO:2的野生型人IL-2编号的以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，溶瘤病毒包含表达为治疗有效载荷的转基因。在一些实施方案中，治疗有效载荷是如本文所述的II-2。在一些实施方案中，治疗有效载荷是IL-2突变蛋白，其包含根据SEQ IDNO:2的野生型人IL-2编号的以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
在一些实施方案中，溶瘤病毒是溶瘤牛痘病毒。在一些实施方案中，溶瘤牛痘病毒载体的特征在于病毒颗粒为胞内成熟病毒(IMV)、胞内包膜病毒(IEV)、细胞相关包膜病毒(CEV)或胞外包膜病毒(EEV)类型。在一些实施方案中，溶瘤牛痘病毒颗粒为EEV或IMV类型。在一些实施方案中，溶瘤牛痘病毒颗粒为EEV类型。
通常，构建溶瘤牛痘病毒重组体和细胞以及包含所述载体的药物组合物，所述载体优先在肿瘤细胞中复制并表达至少一种转基因(例如，本文所述的IL-2突变蛋白)，以促进抗肿瘤功效和细胞凋亡诱导，并调节受试者的宿主免疫响应。根据本发明，溶瘤腺病毒和溶瘤牛痘病毒可以与本文所述的IL-2表达或靶向部分组合，以靶向溶瘤牛痘病毒或溶瘤腺病毒和/或表达IL-2突变蛋白。溶瘤作用会释放肿瘤抗原并提供共刺激危险信号。然而，武装病毒可以进一步提高功效。例如，已知CD40配体(CD40L、CD154)会诱导肿瘤细胞凋亡，并且还会触发几种免疫机制。其中之一是1型T辅助细胞(Thl)响应，可导致细胞毒性T细胞活化和免疫抑制作用降低。本发明提供了表达本发明的IL-2突变蛋白的溶瘤病毒。在一些实施方案中，本发明提供了被本发明的IL-2靶向部分靶向(例如，“武装”)的溶瘤病毒。
在一些实施方案中，溶瘤病毒是经修饰的牛痘病毒载体、病毒颗粒、宿主细胞、药物组合物和包含牛痘病毒基因组的试剂盒，其中胸苷激酶基因因胸苷激酶(TK)基因中的取代和/或开放阅读框至少一个核苷酸的消融缺失而失活，从而提供了部分缺失的胸苷激酶基因，所述牛痘生长因子基因缺失，并且所述经修饰的牛痘病毒载体包含至少一个编码非病毒蛋白(例如，如本文所述的能够表达的IL-2突变蛋白)的核酸序列。在另一方面，提供了经修饰的牛痘病毒载体、病毒颗粒、药物组合物或试剂盒，其可用于癌症治疗，在受试者中引发免疫响应，用于抑制哺乳动物中恶性细胞增殖的方法中，用于癌症治疗或预防，用于检测受试者中经修饰的牛痘病毒的存在，以及用作原位癌疫苗，任选地与腺病毒组合。在一些实施方案中，本发明提供了产生包含牛痘病毒基因组的经修饰的牛痘病毒的方法，其中胸苷激酶基因因胸苷激酶(TK)基因中的取代和/或开放阅读框至少一个核苷酸的消融缺失而失活，从而提供了部分缺失的胸苷激酶基因，所述牛痘生长因子基因缺失，并且所述经修饰的牛痘病毒载体包含至少一个编码非病毒蛋白(例如，如本文所述的能够表达的IL-2突变蛋白)的核酸序列，所述方法包括以下步骤：提供能够维持牛痘病毒颗粒的产生并携带经修饰的牛痘载体的生产细胞；在适于病毒复制和产生的条件下培养生产细胞；并收获病毒颗粒。
在一些实施方案中，本发明提供了施用溶瘤病毒的方法，所述溶瘤病毒用编码如本文所述的IL-2突变蛋白的核酸“武装”或包括该核酸，其中所述IL-2突变蛋白在肿瘤位置表达或在受试者全身表达。在一些实施方案中，本发明还提供了施用如本文所述的IL-2突变蛋白的“武装”或靶向的溶瘤病毒的方法。施用途径随肿瘤的位置和性质而自然变化，并且包括例如，皮内、透皮、肠胃外、静脉内、肌肉内、鼻内、皮下、区域性(例如在肿瘤附近，尤其是肿瘤的脉管系统或邻近脉管系统)、经皮、气管内、腹膜内、动脉内、膀胱内、肿瘤内、吸入、灌注、灌洗和口服施用。相对于特定的施用途径来配制组合物。
1.溶瘤牛痘病毒
牛痘病毒是痘病毒科的正痘病毒属的成员。它具有大的双链DNA基因组(～200kb，～200个基因)，复杂的形态发生途径从每个感染细胞中产生不同形式的感染性病毒体。病毒颗粒在核周围含有脂质膜。病毒核含有病毒结构蛋白、紧密压缩的病毒DNA基因组和转录酶。牛痘病毒的尺寸为～360x 270x 250nm，重量为～5-10fg。基因紧密地填充有少量非编码DNA并且开放阅读框(ORF)缺乏内含子。存在三类基因(早期、中期、晚期)。早期基因(～100个基因；立即早期基因和延迟早期基因)编码主要与免疫调节和病毒DNA复制有关的蛋白质。中期基因编码晚期基因表达所需的调节蛋白(例如转录因子)，晚期基因编码产生病毒颗粒和包装在新的病毒体中以引发下一轮感染的酶所需的蛋白质。牛痘病毒在细胞质中复制。
已鉴定出不同的牛痘病毒株(例如：哥本哈根毒株、改良安卡拉病毒(MVA)毒株、李斯特毒株、天坛株、惠氏毒株(＝纽约市卫生局)、西部保留地(WR)毒株。WR牛痘的基因组已测序(登录号AY243312)。在一些实施方案中，溶瘤牛痘病毒是哥本哈根、改良安卡拉病毒(MVA)、李斯特、天坛、惠氏或西部保留地(WR)牛痘病毒。
不同形式的病毒颗粒在病毒生命周期中的作用不同。存在几种形式的病毒颗粒：胞内成熟病毒(IMV)、胞内包膜病毒(IEV)、细胞相关包膜病毒(CEV)、胞外包膜病毒(EEV)。EEV颗粒具有源自反面高尔基网的额外膜。该外膜具有两个重要作用：a)保护内部IMV免受免疫攻击，以及b)介导病毒与细胞表面的结合。
CEV和EEV因包裹在宿主来源的膜中而帮助病毒躲避宿主抗体和补体。IMV和EEV颗粒在生物学特性上有几个差异，并且它们在病毒生命周期中起着不同的作用。EEV和IMV与不同的(未知的)受体结合(1)，并且它们通过不同的机制进入细胞。EEV颗粒通过内吞作用进入细胞，并且该过程对pH敏感。内化后，EEV的外膜在酸化的内体中破裂，暴露的IMV与内体膜融合，并且病毒核释放到细胞质中。另一方面，IMV通过细胞膜和病毒膜的融合进入细胞，并且该过程与pH无关。除此之外，CEV还诱导了细胞表面肌动蛋白尾的形成，肌动蛋白尾将病毒体推向未感染的相邻细胞。
此外，EEV可以抵抗抗体(NAb)的中和作用和补体毒性，而IMV则不能。因此，EEV介导了体内外的远程传播。彗星抑制试验已成为一种测量EEV特异性抗体的方法，因为即使EEE NAb无法中和游离EEV，EEV NAb也会阻止EEV从感染细胞中释放，并且看不到彗星状的噬斑。与IMV颗粒相比，EEV具有较高的特异性传染性(较低的颗粒/pfu比率)，这使得EEV成为治疗用的有趣候选者。然而，EEV的外膜是极其脆弱的结构并且EEV颗粒需要谨慎处理，这使得难以获得治疗应用所需量的EEV颗粒。EEV外膜在低pH(pH～6)下破裂。一旦EEV外膜破裂，包膜内的病毒颗粒就保持与IMV一样的完全感染性。
一些宿主细胞来源的蛋白质与EEV制剂共定位，但与IMV不共定位，并且细胞来源的蛋白质的量取决于宿主细胞系和病毒株。例如，与VV IHD-J毒株相比，WR EEV含有更多的细胞来源的蛋白质。宿主细胞来源的蛋白质可以改变EEV颗粒的生物学效应。例如，宿主膜蛋白CD55掺入EEV表面使其具有对补体毒性的抗性。在本发明中，证实EEV颗粒表面中的人A549细胞来源的蛋白质可将病毒靶向人癌细胞。在人类免疫缺陷病毒1型的研究中已经证明了类似的现象，其中宿主来源的ICAM-1糖蛋白增加了病毒的感染性。IEV膜含有至少9种蛋白质，其中两种在CEV/EEV中不存在。F12L和A36R蛋白参与IEV向细胞表面的转运，将其留在细胞表面，不是CEV/EEV的一部分(9，11)。有7种蛋白质在(IEV)/CEV/EEV中常见：F13L、A33R、A34R、A56R、B5R、E2、(K2L)。对于西部保留地牛痘病毒株，通常最多1％的病毒颗粒是EEV，并在生产细胞溶瘤前释放到培养上清液中。从国际卫生署(IHD)-J牛痘毒株中释放出多50倍的EEV颗粒。然而，尚未研究过将IHD用于人类癌症治疗。IHD-W表型主要归因于A34REEV凝集素样蛋白内的点突变。此外，A34R的缺失会增加EEV释放量。可以在感染后6小时(如CEV)首先在细胞表面检测到EEV颗粒并且在5小时后在上清液(IHD-J毒株)中检测到EEV颗粒。与高病毒剂量相比，低感染复数(MOI)的感染导致EEV比率更高。CEV和EEV之间的平衡受宿主细胞和病毒株的影响。
牛痘已用于天花的根除，后来用作外源基因的表达载体以及用作感染性疾病和癌症的活重组疫苗。牛痘病毒是人类中使用最广泛的痘病毒，因此人类使用的安全性数据广泛。在世界范围的天花疫苗接种计划中，成千上万人已经安全接种了改良的牛痘病毒株，并且仅报告了非常罕见的严重不良事件。那些不良事件是扩散性牛痘(牛痘在体内全身扩散)、多形性红斑(毒性/过敏反应)、牛痘性湿疹(皮肤广泛感染)、进行性牛痘(组织破坏)和牛痘疫苗后脑炎。
1960年代至1990年代，在早期临床试验中总共有44名黑素瘤患者接受了野生型牛痘病毒的治疗，注射肿瘤的总体客观响应率为50％。还看到了一些有益的免疫响应(36)。野生型牛痘病毒也已用于治疗膀胱癌、肺癌和肾癌以及骨髓瘤，仅见轻度不良事件。JX-594，是一种编码GM-CSF的溶瘤性惠氏毒株牛痘病毒，已在三个I期研究中成功进行了评估，科学会议上已呈现了随机II期试验的初步结果。
牛痘病毒由于具有几个特征而引人注意用于癌症基因疗法。它对癌细胞具有天然嗜性，并且可以通过使一些病毒基因删除来显著提高选择性。本发明涉及双缺失牛痘病毒(vvdd)的用途，其中两个病毒基因，即病毒胸苷激酶(TK)和牛痘生长因子(VGF)至少部分缺失。病毒需要TK和VGF基因才能在正常细胞而不是癌细胞中复制。可以在赋予活性的TK区域中对部分TK缺失进行工程改造。
TK缺失型牛痘病毒依赖于分裂细胞中存在的细胞核苷酸库进行DNA合成和复制。在一些实施方案中，TK缺失显著限制了静息细胞中的病毒复制，从而仅允许在活跃分裂细胞(例如癌细胞)中进行有效的病毒复制。VGF从感染细胞中分泌出来，并通过充当有丝分裂原而对周围细胞产生旁分泌启动作用。VGF缺失型牛痘病毒的复制在静息(非癌)细胞中高度减弱。已经证实TK和VGF缺失的作用是协同作用。
2.溶瘤性腺病毒
通常，腺病毒是36kb的线性双链DNA病毒(Grunhaus和Horwitz，1992)。术语“腺病毒”或“AAV”包括AAV 1型(AAV1)、AAV 2型(AAV2)、AAV 3型(AAV3)、AAV 4型(AAV4)、AAV 5型(AAV5)、AAV 6型(AAV6)、AAV 7型(AAV7)、AAV 8型(AAV8)、AAV 9型(AAV9)、AAV 9_hu14、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类AAV、非灵长类AAV和绵羊AAV。“灵长类AAV”是指能够感染灵长类的AAV，“非灵长类AAV”是指能够感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指能够感染牛哺乳动物的AAV等等。
宿主细胞的腺病毒感染导致腺病毒DNA保持为附加型，从而降低了与整合载体相关的潜在基因毒性。而且，腺病毒在结构上稳定，并且在广泛扩增后未检测到基因组重排。腺病毒可以感染几乎所有的上皮细胞，无论它们的细胞周期阶段如何。(参见例如US20060147420，以引用方式整体并入本文)。而且，腺病毒的E1a和E4区对于人类细胞的有效和高效感染至关重要。E1a基因是在生产性感染中转录的第一个病毒基因，其转录不依赖于任何其他病毒基因产物的作用。然而，其余早期病毒基因的转录需要E1a基因表达。E1a启动子，除了调节E1a基因的表达外，还整合了用于包装病毒基因组的信号以及启动病毒DNA复制所需的位点。参见Schmid,S.I.和Hearing,P.在Current Topics in Microbiologyand Immunology中,第199卷：第67–80页(1995)。
在一些实施方案中，溶瘤病毒是溶瘤腺病毒。已经确定，可以对天然存在的病毒进行工程改造，以在肿瘤细胞中产生溶瘤作用(Wildner,2001；Jacotat,1967；Kim,2001；Geoerger等人，2002；Yan等人，2003；Vile等人，2002，其各自以引用方式并入本文)。在腺病毒的情况下，其腺病毒基因组内的特定缺失可减弱其在正常休眠细胞内复制的能力，而它们保持了在肿瘤细胞内复制的能力。Fueyo等人(2000)已经描述了一种这样的条件复制型腺病毒Δ24，另见美国专利申请号20030138405，其各自以引用方式并入本文。Δ24腺病毒源自5型腺病毒(Ad-5)，并且在E1A基因的CR2部分内含有24个碱基对的缺失。参见例如WO2001036650A2(以引用方式整体并入本文)。
溶瘤腺病毒包括条件复制型腺病毒(CRAD)，诸如Δ24，其具有几种使其成为用作生物治疗剂候选物的特性。一种此类性质是能够在受纳细胞或组织中复制，这种性质放大了溶瘤病毒的原始输入剂量并且帮助该试剂扩散到相邻肿瘤细胞，从而提供直接的抗肿瘤作用。
在一些实施方案中，Δ24的溶瘤组分结合转基因表达方法以产生武装Δ24。武装Δ24腺病毒可用于在肿瘤内产生或增强旁观者效应和/或产生或增强对患者或肿瘤相关组织和/或细胞中的溶瘤腺病毒的检测/成像。在一些实施方案中，溶瘤腺病毒与各种转基因策略(例如，IL-2突变蛋白的表达)的组合将会改善治疗潜力，包括例如针对多种难治性肿瘤的潜力，以及提供改善的成像能力。在某些实施方案中，溶瘤腺病毒可以与复制缺陷型腺病毒、另一种溶瘤病毒、具有复制能力的腺病毒和/或野生型腺病毒一起施用。其中的每一种均可以与其他腺病毒同时，在其之前或之后施用。
在一些实施方案中，E1a腺病毒载体涉及用表现出肿瘤特异性的基本启动子置换基本腺病毒E1a启动子(包括CAAT盒、TATA盒和转录起始位点)，并且所述基本启动子优选具有E2F响应性，并且更优选为人E2F-1启动子。因此，该病毒将在缺乏激活从E2F响应性启动子开始转录的分子(或者此类分子无功能性)的细胞中受到阻遏。正常的非分裂细胞或休眠细胞属于这一类，因为转录因子E2F与pRb或成视网膜细胞瘤蛋白结合，从而使E2F无法结合并激活E2F响应性启动子。相反，含有游离E2F的细胞应支持基于E2F的转录。此类细胞的实例是缺乏pRb功能的肿瘤细胞，从而允许发生生产性病毒感染。在一些实施方案中，使用本文所述的IL-2部分靶向E1a腺病毒载体。
保留处于E1a启动子内的增强子序列、包装信号和DNA复制起始位点将确保腺病毒感染在缺乏pRb功能的赘生性细胞中进行达到野生型水平。本质上，经修饰的E1a启动子赋予肿瘤特异性转录活化，导致实质性的肿瘤特异性杀伤，但在正常细胞中提供增强的安全性。
在一些实施方案中，通过用E2F响应性启动子取代内源性E1a启动子来制备E1a腺病毒载体，使腺病毒5基因组中核苷酸375上游的元件保持完整。参见Schmid,S.I.和Hearing,P.Current Topics in Microbiology and Immunology中,第199卷：第67–80页(1995)中描述了核苷酸编号。这包括针对病毒基因组的包装而鉴定的所有七个A重复基序。通过BsaAI到BsrBI限制性起始位点，使核苷酸375到核苷酸536的序列缺失，同时仍保留了E1A蛋白翻译起始密码子上游的23个碱基对。使用已知的材料和方法，用E2F响应性启动子，优选人E2F-1取代缺失的内源E1a启动子序列。E2F-1启动子可以如实施例1中所述进行分离。
E4区已经牵涉到腺病毒感染晚期发生的许多事件中，并且是病毒DNA有效复制、晚期mRNA积累和蛋白质合成、剪接以及宿主细胞蛋白质合成关闭所需的。缺乏大多数E4转录单位的腺病毒是严重的复制缺陷型，通常必须在E4互补细胞系中传播才能获得高滴度。E4启动子位于病毒基因组的右端附近，并控制多个开放阅读框(ORF)的转录。在该启动子中已经表征了许多调控元件，这些元件对于介导最大转录活性至关重要。除了这些序列，E4启动子区还含有病毒DNA复制所需的调控序列。E4启动子的描述和这些调控序列的位置可见于美国专利号7,001,596的图2和3，该专利以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，腺病毒载体的E4基本启动子用已经证明显示出肿瘤特异性的基本启动子，优选为E2F响应性启动子，且更优选为人E2F-1启动子取代。优选E2F响应性启动子来驱动E4表达的原因与以上在E1a腺病毒载体的E1a启动子用E2F响应性启动子取代的背景下讨论的原因相同。pRb的肿瘤抑制功能与其阻遏E2F响应性启动子诸如E2F-1启动子的能力有关(Adams,P.D.和W.G.Kaelin,Jr.1995,Cancer Biol.6:99–108；Sellers,W.R.和W.G.Kaelin.1996，出版更正出现在1996年12月9日的Biochim Biophys Acta中；1288(3):E-1,Biochim Biophys Acta.1288:M1–5.Sellers,W.R.,J.W.Rodgers和W.G.Kaelin,Jr.1995,Proc Natl Acad Sci USA.92:11544–8)。人E2F-1启动子已得到广泛表征，并且证实对pRb信号传导途径，包括pRb/p107、E2F-1/-2/-3和G1细胞周期蛋白/cdk复合物以及E1A具有响应性(Johnson,D.G.,K.Ohtani和J.R.Nevins.1994,Genes Dev.8:1514–25；Neuman,E.,E.K.Flemington,W.R.Sellers和W.G.Kaelin,Jr.1995.Mol Cell Biol.15:4660；Neuman,E.,W.R.Sellers,J.A.McNeil,J.B.Lawrence和W.G.Kaelin,Jr.1996,Gene.173:163-9)。大部分(如果不是全部的话)的这种调节已归因于E2F-1启动子内存在多个E2F位点。因此，预计携带这种(这些)修饰的病毒在含有完整(野生型)pRb途径的正常细胞中减毒，而在缺乏pRb抑制功能的细胞中却表现出正常的感染/复制特性。为了维持该突变病毒的正常感染/复制特征，我们在E4启动子的远端保留了末端反向重复序列(ITR)，因为这个序列含有病毒DNA复制所需的所有调控元件(Hatfield,L.和P.Hearing.1993,J.Virol.67:3931-9；Rawlins,D.R.,P.J.Rosenfeld,R.J.Wides,M.D.Challberg和T.J.Kelly,Jr.1984,Cell.37:309-19；Rosenfeld,P.J.,E.A.O′Neill,R.J.Wides和T.J.Kelly.1987,Mol CellBiol.7:875-86；Wides,R.J.,M.D.Challberg,D.R.Rawlins和T.J.Kelly.1987,Mol CellBiol.7:864–74)。这促进在受该病毒感染的pRb途径缺陷型肿瘤细胞中达到病毒的野生型水平。
在一些实施方案中，E4启动子位于病毒基因组的右端附近，并且它控制多个开放阅读框(ORF)的转录(Freyer,G.A.,Y.Katoh和R.J.Roberts.1984,Nucleic Acids Res.12:3503-19；Tigges,M.A.和H.J.Raskas.1984.Splice junctions in adenovirus 2earlyregion 4mRNAs:multiple splice sites produce 18to 24RNAs.J.Virol.50:106-17；Virtanen,A.P.Gilardi,A.Naslund,J.M.LeMoullec,U.Pettersson和M.Perricaudet.1984,J.Virol.51:822-31)。在该启动子中已经表征了许多介导转录活性的调控元件(Berk,A.J.1986,Annu Rev Genet.20:45-79；Gilardi,P.和M.Perricaudet.1986,Nucleic Acids Res.14:9035-49；Gilardi,P.和M.Perricaudet.1984,Nucleic Acids Res.12:7877-88；Hanaka,S.,T.Nishigaki,P.A.Sharp和H.Handa.1987,Mol Cell Biol.7:2578-87；Jones,C.和K.A.Lee.1991,MolCell Biol.11:4297-305；Lee,
K.A.和M.R.Green.1987,Embo J.6:1345–53)。除这些序列外，E4启动子区还含有涉及病毒DNA复制的元件(Hatfield,L.和P.Hearing.1993,J Virol.67:3931-9；Rawlins,D.R.,P.J.Rosenfeld,R.J.Wides,M.D.Challberg和T.J.Kelly,Jr.1984,Cell.37:309-19；Rosenfeld,P.J.,E.A.O′Neill,R.J.Wides和T.J.Kelly.1987,Mol Cell Biol.7:875-86；Wides,R.J.,M.D.Challberg,D.R.Rawlins和T.J.Kelly.1987,Mol Cell Biol.7:864-74)。E4启动子的描述和这些调控序列的位置可见于图1和2中。另见Jones,C.和K.A.Lee.MolCell Biol.11:4297–305(1991)。考虑到这些因素，通过产生两个新型限制性核酸内切酶位点来设计E4启动子穿梭：在核苷酸35,576处的XhoI位点和在核苷酸35,815处的SpeI位点(参见图3)。用XhoI和SpeI进行消化都可以去除核苷酸35,581至35,817。这有效地消除了相对于E4转录起始位点的碱基-208至+29，包括已证实对E4转录具有最大影响的所有序列。具体而言，这涵盖E4F结合位点的两个反向重复序列，已证明所述重复序列对启动子激活具有最显著的作用的。然而，保留了所有三个Sp1结合位点，五个ATF结合位点中的两个以及对病毒DNA复制至关重要的NF1和NFIII/Oct-1结合位点。
在一些实施方案中，E2F响应性启动子是人E2F-1启动子。E2F-1启动子中介导对pRb途径的响应的关键调控元件已在体内和体外进行了定位(Johnson,D.G.,K.Ohtani和J.R.Nevins.1994,Genes Dev.8:1514-25；Neuman,E.,E.K.Flemington,W.R.Sellers和W.G.Kaelin,Jr.1995,Mol Cell Biol.15:4660；Parr,M.J.,Y.Manome,T.Tanaka,P.Wen,D.W.Kufe,W.G.Kaelin,Jr.和H.A.Fine.1997,Nat Med.3:1145-9)。因此，我们通过用向其中并入了SpeI和XhoI位点的引物进行PCR，分离了相对于转录起始位点的碱基对-218至+51的人E2F-1启动子片段。这样产生了E4启动子穿梭中存在的相同位点，并允许E2F-1启动子直接取代E4启动子。
F.编码突变IL-2的核酸分子
在一些实施方案中，可以通过核酸分子表达获得单独的或作为诸如上述那些的嵌合多肽的一部分的主题IL-2突变蛋白。正如可以就其与野生型IL-2多肽的同一性来描述IL-2突变蛋白一样，编码它们的核酸分子也必须与编码野生型IL-2的核酸分子具有一定的同一性。例如，编码主题IL-2突变蛋白的核酸分子可以与编码野生型IL-2的核酸(例如，SEQID NO:2)至少50％，至少65％，优选至少75％，更优选至少85％，且最优选至少95％(例如99％)相同。
所提供的核酸分子可以含有天然存在的序列，或与天然存在的序列不同，但是由于遗传密码的简并性而编码相同多肽的序列。这些核酸分子可以由RNA或DNA(例如，基因组DNA、cDNA或合成DNA，例如通过基于亚磷酰胺的合成产生的DNA)或这些类型的核酸内的核苷酸的组合或修饰组成。另外，核酸分子可以是双链或单链(即，有义链或反义链)。
核酸分子不限于编码多肽的序列；也可以包括位于编码序列(例如，IL-2编码序列)上游或下游的一些或全部非编码序列。分子生物学领域的普通技术人员熟悉用于分离核酸分子的常规程序。它们可以例如通过用限制性核酸内切酶处理基因组DNA，或通过进行聚合酶链反应(PCR)来产生。如果核酸分子是核糖核酸(RNA)，则可以例如通过体外转录产生分子。
本公开的示例性的分离的核酸分子可包括未像这样在天然状态下发现的片段。因此，本公开涵盖重组分子，诸如其中将核酸序列(例如，编码突变IL-2的序列)并入载体(例如，质粒或病毒载体)中或异源细胞的基因组中(或同源细胞基因组中除天然染色体位置以外的位置)的那些重组分子。
如上所述，主题IL-2突变蛋白可以作为嵌合多肽的一部分存在。除上述异源多肽之外或代替上述异源多肽，主题核酸分子可以含有编码“标志物”或“报告因子”的序列。标志物或报告基因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neor、G418r)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、lacz(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。本领域的技术人员将知道其他有用的试剂，例如可以起到标志物或报告因子功能的其他序列。
可以通过向从任何生物细胞诸如哺乳动物细胞获得的编码IL-2的DNA中引入突变来获得本发明的核酸分子。因此，主题核酸(及其编码的多肽)可以是小鼠、大鼠、豚鼠、牛、绵羊、马、猪、兔、猴、狒狒、狗或猫的那些。在一个实施方案中，核酸分子将是人的核酸分子。
G.嵌合抗原受体(CARS)
靶向免疫疗法已成为治疗恶性肿瘤的有前景的研究领域，并且近年来受到了广泛的关注。实际上，已经报道了具有靶向CD19恶性肿瘤细胞的经工程改造或基因改造的T细胞的淋巴瘤患者的治疗。这增加了对癌细胞上存在的作为基因和免疫疗法靶标的抗原的关注。这些CARS可用于将本文所述的IL-2突变蛋白靶向或递送至肿瘤，或甚至允许全身性的IL-2突变蛋白表达。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
对自体或同种异体T细胞或NK细胞进行基因操纵以特异性靶向特定肿瘤抗原，提供了一种回避大多数肿瘤细胞诱导细胞毒性免疫响应失败的策略。在一些实施方案中，这些经过遗传操纵的T细胞或NK细胞可用于例如将本文所述的IL-2突变蛋白靶向肿瘤，从而使IL-2突变蛋白在肿瘤位置表达。这些技术基于人类免疫细胞的遗传修饰，其中可以通过白细胞除去法从患者或供体中提取细胞。将特定细胞(通常是T细胞)纯化并进行工程改造以表达靶向感兴趣的癌抗原的受体。工程改造可以利用逆转录病毒、慢病毒、转座子、mRNA电穿孔等进行转导。免疫细胞可以扩增至所需剂量，并引入患者体内。经工程改造的细胞可以通过细胞介导的毒性(细胞毒性T细胞)和/或通过对肿瘤的免疫识别、细胞因子释放和免疫细胞募集引发对癌细胞的免疫响应来特异性杀伤癌细胞。
例如，将嵌合抗原受体(CAR)用于恶性肿瘤的免疫基因疗法是一种有前景的策略，其中抗体或配体结合结构域与T细胞受体的ζ信号传导链融合。所得的CAR免疫细胞通过新特异性重定向以攻击表达表面抗原或被基因修饰的T细胞受体识别的受体的肿瘤，并提供通过正常宿主免疫响应以高度调控的方式攻击肿瘤的细胞疗法。这些细胞可以自由地在整个大脑和全身循环中循环，使得对共定位和生物利用率的需要不成问题。
已经开发了多代CAR免疫细胞。通过将肿瘤特异性scFv抗体或其他胞外配体结合结构域与TCR相关的CD3ζ信号传导结构域或另外的来自共刺激蛋白受体的胞内信号传导结构域融合而产生CAR。这种结构使CAR具有B细胞抗原受体的肿瘤特异性，并独立于MHC结合而通过T细胞抗原受体激活T细胞。第一代CAR含有一个胞内信号传导结构域，通常带有CD3ζ信号传导结构域，以允许TCR信号传导。第二代CAR具有两个胞内信号传导结构域：包含CD28或4-1BB信号传导结构域的共刺激结构域，加上CD3ζ信号传导结构域。这种排列使得在CAR的scFv区识别抗原后实现T细胞活化和增殖。第三代CAR具有两个共刺激结构域和一个CD3ζ信号传导结构域。第一共刺激结构域是CD28或4-1BB结构域，而第二共刺激结构域由CD28、4-1BB或OX40结构域组成。第四代“铠装CAR T细胞”将第二代CAR与增加的各种基因(包括细胞因子和共刺激配体)相结合，以增强CAR T细胞的杀肿瘤作用。参见例如Batlevi等人(2016)Nature Reviews Clinical Oncology 13:25-40。另见美国专利号7,741,465和国际专利公开号WO2014127261；它们均以引用方式整体并入。
T细胞靶向的替代方法包括T细胞抗原偶联剂，如标题为“Trifunctional T cellantigen Coupler and Methods and Uses thereof”，以引用方式明确并入本文的国际申请WO2015/117229中所述。T细胞抗原偶联剂系统包含三个连接的结构域：靶特异性多肽配体；结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体，例如与CD3(TCR，T细胞受体)结合以刺激T细胞活化的scFv；和放大T细胞活化的T细胞受体信号传导结构域，例如CD4跨膜结构域和胞内结构域。通过TCR刺激T细胞活化，将TAC工程改造为与T细胞的基本分子机制一起作用。
抗体偶联的T细胞受体是T细胞靶向的另一种方法。ACTR是CAR和已确立的单克隆抗体肿瘤治疗剂的混合方法。ACTR由典型的CAR构建体组成，该构建体可以通过Fc受体CD16的高亲和力变体而结合抗体的重链。ACTR-T细胞可以通过结合靶向特定癌抗原的配体来靶向肿瘤。T细胞激活由CAR模块进行。
双特异性T细胞交换剂(BiTE)是双特异性抗体，其可以通过两个模块结合T细胞的TCR并靶向肿瘤细胞：癌症靶向配体；和将T细胞桥接至肿瘤的CD3结合型scFv结构域。
已经开发出针对IL13Rα2的靶向疗法，包括与IL13缀合的细菌毒素、纳米颗粒、溶瘤病毒，以及使用单克隆抗体、IL13Rα2脉冲树突细胞和靶向IL13Rα2的嵌合抗原受体的免疫疗法(参见Kahlon等人(2004)Cancer Research.64(24):9160–9166；Kong等人(2012)Clinical Cancer Research.18(21):5949-5960；Thaci等人(2014)Neuro-Oncology；和临床试验NCT02208362、NCT00730613和NCT01082926)。在一些正常情况下，这些靶向疗法可用于将IL-2突变蛋白递送至肿瘤。
提供对IL-13活性的选择性改变的生物制品对于许多治疗目的而言是令人感兴趣的，包括通过工程改造T细胞特异性来治疗某些癌症。本发明解决了这个问题。
提供了用靶向组合物增强抗肿瘤免疫效应细胞，例如T细胞、NK细胞等的方法和组合物，所述靶向组合物包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)；T细胞抗原偶联剂(TAC)；抗体偶联的T细胞受体(ACTR)；以及双特异性T细胞交换剂(BiTE)，其中IL-13或IL-4超级因子提供了靶标特异性配体。在其他实施方案中，免疫效应细胞表达IL-2突变蛋白。
提供了包含IL-2超级因子序列的免疫细胞靶向或表达构建体，其可以包括本文所述的任何IL-2序列。超级因子可用于将免疫细胞靶向表达至少一种受体的细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
所述构建体的IL-2超级因子或突变蛋白组分的长度可以是至少约50个氨基酸，长度为至少约75个、至少约100个、至少约110个、至少约115个氨基酸，至跨膜结构域处野生型蛋白的全长，即长度为约116个氨基酸。例如，超级因子或突变蛋白可以与CAR的铰链、跨膜或信号传导结构域融合。提供了示例性的多肽序列
作为超级因子或突变蛋白而包括在内的是与这些序列90％、95％、98％或99％相同的核酸编码序列，包含那些序列但在3′或5′末端还包含附加核苷酸，例如任意数量的附加核苷酸或密码子，诸如3、6、9、12个或更多个核苷酸，或最多约12、20、50或100个附加核苷酸的较长序列，以及由于遗传密码的简并性而与这些核酸编码相同的氨基酸序列的任何序列。具体而言，将密码子优化以便由所需宿主表达的(CO)序列视为本发明的一部分。在一些实施方案中，氨基酸序列90％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列95％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列98％相同。在一些实施方案中，氨基酸序列99％相同。在一些实施方案中，多肽与IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体连接。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含一个或多个源自CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体或表达包含一个或多个源自CD3-ζ的信号传导结构域。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含一个或多个源自CD28的信号传导结构域。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含一个或多个源自DAP10的信号传导结构域。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含一个或多个源自OX-40的信号传导结构域。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含一个或多个源自CD137的信号传导结构域。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含IL-2变体/IL-2超级因子，包括本文提供的那些。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含IL-2变体/IL-2超级因子，包括SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:38中提供的那些。
1.NK细胞
在一些实施方案中，免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞。NK细胞通过多种细胞表面受体(包括NKG2D、CD16)和天然细胞毒性受体(NCR)(诸如NKp44、NKp46和NKp30)来识别感染的或转化的细胞。这些受体活化信号传导衔接蛋白(诸如DAP10、DAP12和CD3ζ)，它们含有免疫酪氨酸活化基序(ITAM)，这些基序促使含有穿孔素和粒酶的细胞裂解颗粒的释放，并且介导细胞因子和趋化因子(诸如IFN-γ和TNF-α)的产生和释放。重要的是，NK细胞介导的细胞毒性不依赖于自身HLA的呈递。所以，由于NK细胞可用于同种异体环境并且能够提供现成的细胞产物，因此NK细胞作为基于细胞的癌症疗法，具有重要的临床意义。
由于自然杀伤细胞不需要HLA匹配，因此可以替代T细胞用于过继性免疫疗法，所以可以用作同种异体效应细胞。过继性转移的同种异体NK细胞的临床试验表明，这些细胞可以在患者中存活数周至数月。另外，与通常更具NK细胞敏感性的血液恶性肿瘤(尤其是急性粒细胞性白血病)相比，NK细胞中的CAR表达使这些细胞能够更有效地杀死通常对NK细胞介导的活性具有耐受性的实体瘤。可用于NK细胞靶向的CAR包括例如第一代CAR构建体，所述第一代CAR构建体包含作为唯一信号传导结构域的CD3ζ。第二代和第三代CAR也可用于NK细胞。在一些实施方案中，NKG2D(NK细胞活化受体)的胞外结构域被直接连接至CD3ζ。
用于修饰的NK细胞包括细胞系或外周血NK细胞，如果需要大量细胞，可以通过简单采血或通过单采血液成分术从供体分离这些细胞系或外周血NK细胞。活化的PB-NK细胞表达更广泛的活化受体，诸如CD16、NKp44和NKp46以及KIR，它们在NK细胞许可中发挥重要作用。此外，PB-NK细胞可以在不照射细胞的情况下产生，所以具有体内扩增能力。适用于CAR表达的NK细胞的另一个来源是来源于人多能干细胞(即诱导性多能干细胞(iPSC)或人胚胎干细胞(hESC)二者)的NK细胞。这些NK细胞显示出与PB-NK细胞类似的表型，并且hESC/iPSC-NK细胞可以以临床规模生长。
2.嵌合抗原受体(CAR)
除超级因子序列之外，CAR还含有针对CD3ζ的信号传导结构域和一种或多种共刺激受体的信号传导结构域，这些受体还促进表达CAR的免疫细胞的再循环、存活和/或扩增。共刺激受体的信号传导结构域是在细胞内产生活化信号的每种受体蛋白的胞内部分。实例是天然CD28分子的氨基酸180-220和天然4-1BB分子的氨基酸214-255。
将超级因子连接至信号传导区的合适的铰链和跨膜区的实例可以包括但不限于免疫珠蛋白、人CD8a和人工接头的恒定(Fc)区，它们用于将靶向部分移开细胞表面，以改善与靶细胞的接触和结合。合适的跨膜结构域的实例包括白细胞CD标记物的跨膜结构域，优选地CD4或CD28的跨膜结构域。胞内受体信号传导结构域的实例包括T细胞抗原受体复合物，优选地CD3的ζ链，然而可以使用足以将CAR锚定在膜中的任何跨膜区。技术人员知道许多跨膜区和在许多膜蛋白中产生跨膜结构域的结构元件(诸如亲脂性氨基酸区)，因此可以替代任何简便序列。适用于改善CAR表达细胞的功能和活性的T细胞共刺激信号传导受体包括但不限于CD28、CD137和OX-40。
经由CD28的信号传导是IL2产生和增殖必须的，但是在T细胞功能和活性的维持中并不起主要作用。CD137(在CD28活化后表达的肿瘤坏死因子受体家族成员)和OX-40涉及T细胞的长期存活的驱动和T细胞的积聚。这些受体的配体通常在专业抗原呈递细胞(诸如树突细胞和活化的巨噬细胞)上表达，但是不在肿瘤细胞上表达。与仅含有CD3ζ信号传导结构域的CAR的表达相比，在CD4+T细胞中掺有CD28和/或4-1BB信号传导结构域的CAR的表达增强了这些细胞的活性和抗肿瘤效力，这些构建体可以称为第二代或第三代CAR。
作为感兴趣的CAR构建体包括在内的是串联CAR，例如参见Hegde等人，(2016)J.Clin.Invest 126(8):3036-3052，其特别地以引用的方式并入。在此类构建体中，针对肿瘤特异性抗原的结合部分与IL-13超级因子串联组合。结合部分可以是例如对肿瘤细胞抗原具有特异性的scFv，包括但不限于本领域已知的HER-2、EGFR、CD20等。
在多个实施方案中，抗原结合结构域结合至靶细胞(例如癌细胞)上的抗原。抗原结合结构域可以结合抗原，诸如但不限于肿瘤靶抗原。在一些情况下，抗原结合结构域结合一种或多种抗原。示例性抗原结合结构域可以结合抗原，所述抗原包括但不限于D19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcαSer/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白介素13受体亚基α-2(IL-13Rα2或CD213A2)；间皮素；白介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；路易斯(Lewis)(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；延伸因子2突变(ELF2M)；EphrinB2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-1受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体(Prosome)、巨蛋白因子(Macropain))亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp 100)；癌基因融合蛋白，由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1(Abl)(bcr-abl)组成；酪氨酸酶；ephrin A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸路易斯(Lewis)粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；谷氨酰胺转胺酶5(TGS5)；高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物7相关(TEM7R)；封闭蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C型家族5，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲肝病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；威尔姆斯(Wilms)瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；prostein；存活；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖凝集素8)，由T细胞1(MelanA或MART 1)识别的黑素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑素瘤凋亡抑制蛋白(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶，丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰氨基葡萄糖转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽骨髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源物家庭成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印迹位点调节物兄弟因子)，由T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚定蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断裂点2(SSX2)；糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在1(RU1)；肾遍在2(RU2)；豆荚蛋白酶；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧基酯酶；热激蛋白70-2突变(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚醣-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、人抗体、人源化抗体、非人抗体、纳米体、单链可变片段(scFv)、F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv等等。抗原结合结构域可以连接至CAR的跨膜结构域。在一些实施方案中，编码抗原结合结构域的核酸被可操作地连接至编码CAR的跨膜结构域的核酸。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以来源于膜结合蛋白或跨膜蛋白。在某些实施方案中，与膜结合蛋白或跨膜蛋白的跨膜结构域的野生型氨基酸序列相比，跨膜结构域包括一个或多个，例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入和缺失)。CAR的跨膜结构域的非限制性实例包括至少T细胞受体、CD28、CD3ε(CD3ξ)、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或促红细胞生成素受体的α、β或ζ链的一个或多个跨膜区。在一些实施方案中，跨膜结构域包含人免疫球蛋白(Ig)铰链区，例如IgG4Fc铰链。在其他实施方案中，跨膜结构域是包含疏水性氨基酸残基(例如，亮氨酸和缬氨酸)的重组或合成结构域。在一些情况下，跨膜结构域在该结构域的一个或两个末端包含苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。
跨膜结构域将抗原结合结构域连接至CAR的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，编码抗原结合结构域的核酸被可操作地连接至编码跨膜结构域的核酸，所述编码跨膜结构域的核酸被可操作地连接至编码胞内信号传导结构域的核酸。
在一些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域包括信号活化或信号转导结构域。因此，胞内信号传导结构域包含蛋白质的胞内信号传导结构域的任何部分，所述部分足以转导或传输信号(例如活化信号)或介导细胞内的细胞响应。非限制性实例包括TCR、CD2、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD7、CD27、CD86、常见FcRγ、FcRβ、CD79a、CD79b、FcγRIIa、DAP10、DAP12、T细胞受体(TCR)、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD127、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D、它们的任何衍生物、变体或片段。在某些实施方案中，胞内信号传导结构域包括共刺激分子(诸如来自CD3、CD27、CD28、CD127、ICOS、4-1BB(CD137)、PD-1、T细胞受体(TCR))的胞内结构域，它们的任何衍生物或它们的任何变体。在一些实施方案中，CAR的胞内信号传导结构域选自由MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体组成的组。
3.BiTE
双特异性T细胞衔接子(BiTE)是融合蛋白，其包含与特异性结合CD3的抗体可变区融合的IL-13超级因子。在一些实施方案中，抗体可变区在单链可变片段(scFv)中。超级因子可以通过接头与可变区融合。任选地提供Fc区。
4.TAC
TAC构建体包含融合至配体的IL-2超级因子，所述配体结合与TCR复合物相关联的蛋白质；融合至T细胞受体信号传导结构域多肽。结构域可以通过接头分隔开。与TCR复合物相关联的蛋白质可以是CD3。结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体可以是单链抗体。结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体可以是UCHT1或它们的变体。T细胞受体信号传导结构域多肽可以包含胞质结构域和跨膜结构域。胞质结构域可以是CD4胞质结构域，跨膜结构域是CD4跨膜结构域。
5.ACTR
ACTR是CAR和已确立的单克隆抗体肿瘤治疗剂的混合方法。ACTR由典型的CAR构建体组成，该构建体可以通过Fc受体CD16的高亲和力变体而结合抗体的重链。超级因子融合至由CAR识别的部分，该部分可包括但不限于对CD16具有高亲和力的抗体的Fc区。
免疫细胞靶向或表达构建体编码序列可以通过本领域已知的任何方式产生，包括重组DNA技术。可以通过本领域已知的标准分子克隆技术(基因组文库筛选、PCR、引物辅助的连接、定点诱变等)来制备编码嵌合受体的若干区域的核酸，并将这些核酸组装成完整的编码序列，这是方便的。可以将所得的编码区插入表达载体中，并用于转化合适的表达宿主细胞系，例如异体或自体T淋巴细胞、异体或自体NK细胞(包括原代培养物、细胞系、iPSC衍生的细胞等)的群体。这些方法可用于体外细胞(例如，在无细胞系统中)、培养中的细胞，例如体外或离体细胞。例如，可以在培养基中培养表达IL-2超级因子CAR的细胞并在体外扩增。
还可以使用非IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体特异性地引导免疫细胞靶向特异性肿瘤细胞。通过向T细胞中引入一种超级因子免疫细胞靶向或表达构建体，产生抗肿瘤效应细胞(例如CD4+或CD8+效应T细胞)，以重新定向而识别这些肿瘤细胞，所述构建体包含一个或多个来源于CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞可以进一步包含能够表达如本文所述的IL-2突变蛋白的转基因。IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体可以特异性地指导免疫细胞靶向IL-2R表达细胞，包括肿瘤细胞。通过向T细胞中引入一种IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体，产生抗肿瘤效应细胞(例如CD4+或CD8+效应T细胞)，以重新定向而识别这些肿瘤细胞，所述构建体包含一个或多个来源于CD3-ζ、CD28、DAP10、OX-40、ICOS和CD137的信号传导结构域。
将IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体感染或转染到人免疫细胞中，例如使用非病毒质粒载体和电穿孔方法；病毒载体和感染方法等，如本领域已知的那样。包含共刺激信号传导结构域的CAR可以以可以显著改善过继治疗方案的临床功效的方式来增强抗肿瘤活性的持续时间和/或保留。CD4+和CD8+T细胞效应子功能以及NK细胞功能可以通过这些受体而触发，因此这些细胞类型被设想用于本发明。表达本发明的IL13超级因子CAR的CD8+T细胞可用于裂解靶细胞并在靶细胞存在下产生IL-2，以及这些细胞的其他功能。在CD4+和/或CD8+T细胞中表达适当的共刺激CAR被用于提供用于过继免疫治疗的最有效的细胞群，因此由表现出增强的和/或长期的生存力和抗肿瘤活性的专职辅助T细胞和杀伤T细胞之一或两者组成。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含IL-2变体/IL-2超级因子，包括图2中提供的那些。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含IL-2变体/IL-2超级因子，包括本文提供的任何那些。
出于多种目的，本发明的多肽可以被进一步修饰，例如与多种其他寡肽或蛋白质连接。例如，翻译后修饰，例如通过异戊烯基化、乙酰化、酰胺化、羧化、糖基化、聚乙二醇化等。此类修饰还可以包括糖基化修饰，例如，通过在多肽的合成和加工过程中或在进一步的加工步骤中修饰多肽的糖基化模式而得到的那些；例如通过使多肽暴露于影响糖基化的酶，诸如哺乳动物糖基化或去糖基化酶。
本领域技术人员熟知的方法可用于构建含有编码序列和适当的转录/翻译控制信号的T细胞靶向构建体表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。替代性地，可以化学合成能够编码感兴趣的多肽的RNA。本领域技术人员可以容易地利用熟知的密码子使用表和合成方法来为本发明的任何多肽提供合适的编码序列。可以分离核酸并以高纯度获得。通常，获得的核酸(无论是DNA还是RNA)将基本上不含其他天然存在的核酸序列，通常纯度为至少约50％，通常至少约90％，并且通常是“重组的”，例如，在侧翼上具有一个或多个核苷酸，所述一个或多个核苷酸在天然存在的染色体上通常不与其相关联。本发明的核酸可以作为线性分子或在环状分子内提供，并且可以在自主复制的分子(载体)内或在没有复制序列的分子内提供。核酸的表达可以通过其自身或通过本领域已知的其他调控序列来调控。可以使用本领域中可用的多种技术将本发明的核酸引入合适的宿主细胞中。
根据本发明，可以在适于治疗用途(例如，适于人类治疗)的药物组合物中提供免疫细胞靶向或表达构建体载体和免疫细胞靶向或表达构建体修饰的细胞。在一些实施方案中，本发明的药物组合物包含本发明的一种或多种治疗实体，或其药学上可接受的盐、酯或溶剂化物。在一些其他实施方案中，本发明的药物组合物包含与另一种治疗剂(例如另一种抗肿瘤剂)组合的本发明的一种或多种治疗实体。
本发明的治疗实体通常以包含活性治疗剂和另一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物的形式施用。此类制剂可以包含一种或多种无毒的药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。优选的形式取决于预期的施用模式和治疗应用。取决于所需的制剂，组合物还可以包含药学上可接受的无毒载剂或稀释剂，其被定义为通常用于配制供动物或人类施用的药物组合物的媒介物。稀释剂的选择不应影响组合物的生物活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、葡萄糖溶液和汉克氏溶液(Hank′s solution)。另外，药物组合物或制剂还可以包含其他载剂、佐剂或无毒、非治疗性、非免疫原性的稳定剂等。
在另外一些其他实施方案中，本发明的药物组合物还可以包含大的、缓慢代谢的大分子诸如蛋白质、多糖诸如壳聚糖、聚乳酸、聚乙醇酸和共聚物(诸如胶乳官能化的SepharoseTM、琼脂糖、纤维素等)、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和脂质聚集体(诸如油滴或脂质体)。
可以在临床试验开发过程中确定CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)，例如，高达约104个T细胞/kg体重，高达约105个细胞/kg体重，高达约106个细胞/kg体重，高达约5×106个细胞/kg体重，高达约107个细胞/kg体重，高达约5×107个细胞/kg体重，或更高，如根据经验所确定的。在一些实施方案中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)高达约104个T细胞/kg体重。在一些实施方案中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)高达约105个T细胞/kg体重。在一些实施方案中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)高达约106个T细胞/kg体重。在一些实施方案中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)高达约107个T细胞/kg体重。在一些实施方案中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)高达约5×106个T细胞/kg体重。在一些实施方案中，CAR免疫细胞的最大耐受剂量(MTD)高达约5×107个T细胞/kg体重。
可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学程序来确定本文所述的细胞的毒性，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定对人类使用无毒的剂量范围。本文所述的剂量优选地在包括具有很少或没有毒性的有效剂量的循环浓度范围内。剂量可以在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。各个医师可以根据患者的状况来选择确切的制剂、施用途径和剂量。
在剂量递增期后，用MTD的免疫细胞治疗扩展组中的患者。示例性治疗方案采用每两周一次或每月一次或每3至6个月一次施用。本发明的治疗实体通常在多个场合施用。单剂之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中治疗实体的血液水平所指示，间隔也可以是不规则的。
在预防性应用中，例如为了维持患者的缓解，可以在很长一段时间内以相对不频繁的间隔施用相对低的剂量。一些患者终生继续接受治疗。在其他治疗应用中，有时需要相对短间隔的相对高剂量，直到疾病的进展减少或终止，优选地直到患者显示出疾病症状的部分或完全改善。此后，可以对患者施用预防性方案。
可以与免疫细胞靶向或表达构建体共同施用和/或共同配制的另外的治疗剂的实例包括：抗增殖或细胞减少疗法，其在治疗上用于消除宿主中的肿瘤细胞和其他不需要的细胞，并且包括使用诸如递送电离辐射和施用化疗剂之类的疗法。化疗剂是本领域熟知的，并且以常规剂量和方案使用，或者以降低的剂量或方案使用，包括例如拓扑异构酶抑制剂，诸如蒽环类，包括化合物柔红霉素、阿霉素(多柔比星)、表柔比星、伊达比星、阿霉素、MEN10755等。其他拓扑异构酶抑制剂包括鬼臼毒素类似物依托泊苷和替尼泊苷，以及蒽二酮类、米托蒽醌和安吖啶。其他抗增殖剂干扰微管组装，例如长春花生物碱家族。长春花生物碱的实例包括长春碱、长春新碱；长春瑞滨(NAVELBINE)；长春地辛；文多灵；长春胺等等。DNA破坏剂包括核苷酸类似物、烷化剂等。烷化剂包括氮芥类，例如二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑(左旋苯丙氨酸氮芥)等；以及亚硝基脲类，例如卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、链脲霉素、氯脲霉素等。核苷酸类似物包括嘧啶类，例如阿糖胞苷(CYTOSAR-U)、胞嘧啶阿拉伯糖苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟尿苷(FUdR)等；嘌呤类，例如硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤)、巯基嘌呤(6-MP)、喷司他丁、氟尿嘧啶(5-FU)等；以及叶酸类似物，例如甲氨蝶呤、10-炔丙基-5,8-二去氮杂叶酸(PDDF，CB3717)、5,8-二去氮杂四氢叶酸(DDATHF)、甲酰四氢叶酸等。感兴趣的其他化疗剂包括金属络合物，例如顺铂(cis-DDP)、卡铂、奥沙利铂等；脲类，例如羟基脲；以及肼类，例如N-甲基肼。
例如，电离辐射(IR)通过沉积损伤或破坏所治疗区域中的细胞的能量而用于治疗约60％的癌症患者，并且出于本发明的目的，可以以常规剂量和方案或以减少的剂量递送。细胞的辐射损伤是非特异性的，对DNA具有复杂的作用。治疗的功效取决于对癌细胞的损伤大于对正常细胞的损伤。辐射疗法可用于治疗每种类型的癌症。一些类型的辐射疗法涉及光子，诸如X射线或伽马射线。将辐射递送到癌细胞的另一种技术是内部辐射疗法，该疗法将辐射性植入物直接置于肿瘤或体腔中，从而使辐射剂量集中在很小的区域。电离辐射的合适剂量可以在至少约2Gy至不超过约10Gy的范围内，通常为约5Gy。合适的紫外线辐射剂量可以在至少约5J/m2至不超过约50J/m2的范围内，通常为约10J/m2。可以在紫外线辐射后至少约4小时且不超过约72小时，通常约4小时左右收集样品。
还可将治疗与免疫调节剂组合，包括激动免疫共刺激分子例如CD40、OX40等的药剂；和/或(iii)拮抗免疫抑制分子例如CTLA-4、PD-1、PD-L1等的药剂。在一段时间内施用活性剂以对宿主中癌细胞的耗竭产生加和效应或协同效应。施用方法包括但不限于全身施用、肿瘤内施用等。
在一些实施方案中，选择个体癌症用组合疗法治疗，因为该癌症是对检查点抑制剂例如PD-1拮抗剂、PD-L1拮抗剂、CTLA4拮抗剂、TIM-3拮抗剂、BTLA拮抗剂、VISTA拮抗剂、LAG3拮抗剂等有响应的癌症类型。在一些实施方案中，这样的免疫调节剂是CTLA-4、PD1或PDL1拮抗剂，例如阿维鲁单抗、纳武单抗、派姆单抗、伊匹木单抗等。在一些这样的实施方案中，癌症是但不限于黑素瘤或小细胞肺癌。在一些这样的实施方案中，癌症是具有高新抗原或诱变负担的类型(参见Vogelstein等人(2013)Science 339(6127):1546-1558，以引用方式特别并入本文)。
在一些实施方案中，选择个体癌症用本发明的组合疗法治疗，因为该癌症是对免疫响应激动剂例如CD28激动剂、OX40激动剂、GITR激动剂、CD137激动剂、CD27激动剂、HVEM激动剂等有响应的癌症类型。在一些实施方案中，这样的免疫调节剂是OX40、CD137或GITR激动剂，例如曲美木单抗等。在一些这样的实施方案中，癌症是但不限于黑素瘤或小细胞肺癌。在一些这样的实施方案中，癌症是具有高新抗原或诱变负担的类型。
在一些实施方案中，组合疗法包括本领域已知的抗体，该抗体结合PD-1并破坏PD-1与其配体PD-L1之间的相互作用，且刺激抗肿瘤免疫响应。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-1特异性结合。例如，靶向PD-1并可用于本发明的抗体包括例如但不限于纳武单抗(BMS-936558,Bristol-Myers Squibb)、派姆单抗(兰博利单抗、MK03475或MK-3475，Merck)、人源化抗PD-1抗体JS001(上海君实)、单克隆抗PD-1抗体TSR-042(Tesaro,Inc.)、匹利珠单抗(抗PD-1mAb CT-011，Medivation)、抗PD-1单克隆抗体BGB-A317(BeiGene)和/或抗PD-1抗体SHR-1210(上海恒瑞)、人单克隆抗体REGN2810(Regeneron)、人单克隆抗体MDX-1106(Bristol-MyersSquibb)和/或人源化抗PD-1IgG4抗体PDR001(Novartis)。在一些实施方案中，PD-1抗体来自以下克隆：RMP1-14(大鼠IgG)-BioXcell目录号BP0146。其他合适的抗体包括以引用方式并入本文的美国专利号8,008,449中公开的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分与PD-L1特异性结合并抑制其与PD-1的相互作用，从而增强免疫活性。结合PD-L1并破坏PD-1与PD-L1之间的相互作用且刺激抗肿瘤免疫响应的本领域已知的任何抗体均适用于本文公开的组合治疗方法。例如，靶向PD-L1且正在临床试验中的抗体包括BMS-936559(Bristol-Myers Squibb)和MPDL3280A(Genetech)。在以引用方式并入本文的美国专利号7,943,743中公开了靶向PD-Ll的其他合适的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何与PD-1或PD-L1结合、破坏PD-1/PD-L1相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的抗体都适用于该组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合CTLA-4并破坏其与CD80和CD86的相互作用的本领域已知的抗体。靶向CTLA-4的示例性抗体包括已获FDA批准的伊匹木单抗(MDX-010,MDX-101,Bristol-Myers Squibb)和目前正在进行人体试验的曲美木单抗(替西木单抗,CP-675,206,Pfizer)。在以引用方式并入本文的WO2012/120125、美国专利号6,984720、6,682,7368和美国专利申请2002/0039581、2002/0086014和2005/0201994中公开了靶向CTLA-4的其他合适的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何与CTLA-4结合、破坏其与CD80和CD86的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的抗体都适用于组合治疗方法。在一些实施方案中，组合疗法包括结合LAG-3并破坏其与MHC II类分子的相互作用的本领域已知的抗体。靶向LAG-3的示例性抗体是目前正在进行人体试验的IMP321(Immutep)。在以引用方式并入本文的美国专利申请2011/0150892中公开了靶向LAG-3的其他合适的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合LAG-3、破坏其与MHC II类分子的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合TIM-3并破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用的本领域已知的抗体。在以引用方式并入本文的美国专利申请2013/0022623中公开了靶向TIM-3的合适抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合TIM-3、破坏其与半乳糖凝集素9的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合4-1BB/CD137并破坏其与CD137L的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合4-1BB/CD137、破坏其与CD137L或另一种配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合GITR并破坏其与其配体的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合GITR、破坏其与GITRL或另一种配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合OX40并破坏其与其配体的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合OX40、破坏其与OX40L或另一种配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合CD40并破坏其与其配体的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合CD40、破坏其与配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合ICOS并破坏其与其配体的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合ICOS、破坏其与配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合CD28并破坏其与其配体的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合CD28、破坏其与配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
在一些实施方案中，组合疗法包括结合IFNα并破坏其与其配体的相互作用的本领域已知的抗体。本领域普通技术人员将理解，任何结合IFNα、破坏其与配体的相互作用并刺激抗肿瘤免疫响应或总体上导致抗肿瘤活性的免疫刺激响应的抗体都适用于组合治疗方法。
“抗癌疗法”是预防或延迟癌细胞的生长和/或转移的化合物、组合物或治疗(例如手术)。此类抗癌疗法包括但不限于手术(例如，摘除全部或部分肿瘤)、化疗药物治疗、辐射、基因疗法、激素治疗、免疫疗法(例如，治疗性抗体和癌症疫苗)以及反义或RNAi寡核苷酸疗法。有用的化学治疗药物的实例包括但不限于羟基脲、白消安、顺铂、卡铂、苯丁酸氮芥、美法仑、环磷酰胺、异环磷酰胺、道诺霉素(danorubicin)、阿霉素、表柔比星、米托蒽醌、长春新碱、长春碱、Navelbine.RTM.(长春瑞滨)、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、胞嘧啶、阿糖苷、博来霉素、新癌抑素、苏拉明、紫杉酚、丝裂霉素C、阿瓦斯汀、Herceptin.RTM.、氟尿嘧啶和替莫唑胺等。这些化合物也适合与采用两种或多种化疗剂的标准组合疗法一起使用。应当理解，抗癌疗法包括未来开发的新型化合物或治疗。
上述药物组合物和/或制剂包含有效达到预期目的的量的一种或多种治疗实体。因此，术语“治疗有效剂量”是指改善癌症症状的治疗实体的量。化合物的治疗有效剂量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。例如，可以首先在细胞培养试验或动物模型(诸如本文所述的那些)中估计治疗有效剂量。动物模型也可用于确定适当的浓度范围和施用途径。然后，可以使用本领域普通技术人员已知的标准方法，将此类信息用于确定在其他动物(包括人)中的有用剂量和途径。
包含本发明的组合物和使用说明书的试剂盒也在本发明的范围内。试剂盒可进一步包含至少一种另外的试剂，例如化疗药物、抗肿瘤抗体等。试剂盒通常包括指示试剂盒内容物的预期用途的标签。术语标签包括在试剂盒上或与试剂盒一起提供的或以其他方式伴随试剂盒的任何书写或记录材料。
现在已经充分描述了本发明，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的精神或范围的情况下，可以进行各种改变和修改。在一些实施方案中，试剂盒包含IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体，该构建体包含如本文所述的IL-2变体/IL-2超级因子。在一些实施方案中，试剂盒包含IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体，该构建体包含IL-2变体/IL-2超级因子，包括本文提供的那些。在一些实施方案中，IL-2超级因子免疫细胞靶向或表达构建体包含IL-2变体/IL-2超级因子，包括本文提供的那些。
6.示例性免疫细胞靶向或表达构建体实施方案
一种免疫细胞靶向或表达构建体，包含：白介素2受体β(IL-2Rβ)结合蛋白，其中所述结合蛋白的IL-2Rβ的平衡解离常数小于野生型人IL-2(hIL-2)的平衡解离常数；连接至免疫细胞靶向或表达构建体。
在一些实施方案中，免疫细胞靶向或表达构建体对T细胞例如CD8+T细胞或CD4+T细胞表现出细胞毒性作用。
在一些实施方案中，构建体是嵌合抗原受体(CAR)，并且其中IL-2超级因子与跨膜结构域融合；连接至细胞内信号传导区。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含CD3信号传导结构域。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域、OX-40信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、DAP10信号传导结构域中的一个或多个。
在一些实施方案中，构建体是T细胞抗原偶联剂(TAC)，其中IL-2超级因子融合至结合与TCR复合物相关联的蛋白质的配体；融合至T细胞受体信号传导结构域多肽。
在一些实施方案中，与TCR复合物相关联的蛋白质是CD3。
在一些实施方案中，T细胞受体信号传导结构域多肽包含CD4胞质结构域和CD4跨膜结构域。
在一些实施方案中，构建体是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)，其包含以高亲和力结合至IL-2超级因子的嵌合抗原受体组分。
在一些实施方案中，CAR组分包含CD16，并且IL-2超级因子与Fc序列融合。
在一些实施方案中，构建体是双特异性T细胞交换剂(BiTE)，其包含与结合至T细胞受体的组分的抗体的可变区融合的IL-2超级因子。
在一些实施方案中，T细胞受体的BiTE组分是CD3。
在一些实施方案中，IL-2Rβ结合蛋白包含以下氨基酸取代：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，其根据野生型hIL-2编号。
在一些实施方案中，提供了编码本文所述的IL-2的核酸。在一些实施方案中，提供了包含该核酸的载体。
在一些实施方案中，提供了包含根据以上任一项的构建体的T细胞。在一些实施方案中，提供了包含根据以上任一项的构建体的NK细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8+T细胞。
还提供了上述免疫细胞的分离群体。还提供了包含上述免疫细胞群的药物制剂。
H.突变体IL-2基因产物的表达
上述核酸分子可以包含在载体中，该载体能够指导这些核酸分子在例如已被该载体转导的细胞中表达。因此，除了主题IL-2突变蛋白外，包含编码主题IL-2突变蛋白的核酸分子的表达载体和用这些载体转染的细胞也是优选的实施方案。
当然应该理解，不是所有的载体和表达控制序列都将同样好地表达本文所述的DNA序列。也不是所有的宿主都能用相同的表达系统同样好地起作用。然而，本领域技术人员可以在这些载体、表达控制序列和宿主之间进行选择，而无需进行过多的实验。例如，在选择载体时，必须考虑宿主，因为载体必须在其中复制。还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力以及该载体所编码的任何其他蛋白质(例如抗生素标记)的表达。例如，可以使用的载体包括允许编码IL-2突变蛋白的DNA以拷贝数扩增的那些载体。这样的可扩增载体是本领域熟知的。它们包括例如能够通过DHFR扩增(参见例如Kaufman,美国专利号4,470,461,Kaufman和Sharp,“Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase cDNAGene:Analysis of Signals Utilized for Efficient Expression”,Mol.Cell.Biol.,2,第1304-1319页(1982))或谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增(参见例如美国专利号5,122,464和欧洲公开申请338,841)而扩增的载体。
在一些实施方案中，本公开的人IL-2突变蛋白将从载体，优选表达载体表达。载体可用于在宿主细胞中的自主复制，或者可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制(例如，非游离型哺乳动物载体)。表达载体能够指导与其可操作连接的编码序列的表达。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒(载体)的形式。但是，也包括其他形式的表达载体，诸如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
示例性重组表达载体可以包括一个或多个调节序列，其基于要用于表达的宿主细胞而选择，可操作地连接至要表达的核酸序列。
可以设计表达构建体或载体以在原核或真核宿主细胞中表达IL-2突变蛋白或其变体。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞中。转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)和其他标准分子生物学实验室手册。
蛋白质在原核生物中的表达最常见的是在大肠杆菌(Escherichia coli)中使用含有组成型或诱导型启动子的载体进行。使大肠杆菌中重组蛋白表达最大化的策略可见于例如Gottesman(1990),Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,Calif.),第119-128页和Wada等人(1992)Nucleic AcidsRes.20:2111-2118。从细胞中生长、收获、破坏或提取IL-2突变蛋白或其变体的方法在例如美国专利号4,604,377、4,738,927、4,656,132、4,569,790、4,748,234、4,530,787、4,572,798、4,748,234和4,931,543中公开，它们以引用方式整体并入本文。
在一些实施方案中，重组IL-2突变蛋白或其生物学活性变体也可以在真核生物如酵母或人细胞中制备。合适的真核宿主细胞包括昆虫细胞(可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体的实例包括pAc系列(Smith等人(1983)Mol.CellBiol.3:2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170:31-39))、酵母细胞(用于在酿酒酵母(S.cerenvisiae)中表达的载体的实例包括pYepSec1(Baldari等人(1987)EMBO J.6:229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30:933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene 54:113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)和pPicZ(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.))或哺乳动物细胞(哺乳动物表达载体包括pCDM8(Seed(1987)Nature 329:840)和pMT2PC(Kaufman等人(1987)EMBOJ.6:187:195))。合适的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞。在哺乳动物细胞中，表达载体的控制功能通常由病毒调控元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。对于原核和真核两种细胞的其他合适的表达系统，参见Sambrook等人(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Plainview,N.Y.)的第16和17章。参见Goeddel(1990),GeneExpression Technology:Methods in Enzymology 185(Academic Press,San Diego,Calif.)。
可以优化编码本公开的人IL-2突变蛋白的序列以在感兴趣的宿主细胞中表达。如参考在宿主细胞中表达的已知基因所计算的，可以将序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平。密码子优化的方法是本领域熟知的。可优化IL-2突变蛋白编码序列内的密码子以增强在宿主细胞中的表达，使得编码序列内约1％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或高达100％的密码子已被优化用于在特定宿主细胞中表达。
适合使用的载体包括用于细菌的基于T7的载体(参见例如Rosenberg等人,Gene56:125,1987)、用于哺乳动物细胞的pMSXND表达载体(Lee和Nathans,J.Biol.Chem.263:3521,1988)以及用于昆虫细胞的杆状病毒衍生载体(例如，来自Clontech,Palo Alto,Calif.的表达载体pBacPAK9)。
在一些实施方案中，在此类载体中编码主题IL-2突变蛋白的核酸插入物可以与启动子可操作地连接，该启动子基于例如寻求表达的细胞类型而选择。
在选择表达控制序列时，还应考虑多种因素。这些因素包括例如序列的相对强度、其可控制性及其与编码主题IL-2突变蛋白的实际DNA序列的相容性，特别是关于潜在的二级结构。宿主的选择应考虑到它们与所选载体的相容性、本发明的DNA序列所编码的产物的毒性、它们的分泌特性、它们正确折叠多肽的能力、它们的发酵或培养要求、以及DNA序列所编码的产物的纯化容易性。
在这些参数内，本领域技术人员可以选择各种载体/表达控制序列/宿主组合，这些组合将在发酵或大规模动物培养中表达期望的DNA序列，例如使用CHO细胞或COS 7细胞。
在一些实施方案中，表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以使用多种表达宿主/载体组合。对于真核宿主有用的表达载体包括例如具有来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对于细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括col El、pCRI、pER32z、pMB9和它们的衍生物，更宽宿主范围的质粒诸如RP4，噬菌体DNA，例如λ噬菌体的许多衍生物，如NM989，以及其他DNA噬菌体，如M13和丝状单链DNA噬菌体。对于酵母细胞有用的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。对于昆虫细胞有用的载体包括pVL 941和pFastBacTM1(GibcoBRL,Gaithersburg,Md.)。Cate等人,“Isolation Of The Bovine And Human Genes For MullerianInhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells”,Cell,45,第685-698页(1986)。
另外，在这些载体中可以使用多种表达控制序列中的任一种。这样的有用的表达控制序列包括与前述表达载体的结构基因相关的表达控制序列。有用的表达控制序列的实例包括例如SV40或腺病毒的早期和晚期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域例如PL、fd外壳蛋白的控制区域、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶如PhoA的启动子、酵母a交配系统的启动子、杆状病毒的多角体启动子、和其他已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的序列、以及它们的各种组合。
T7启动子可以用于细菌，多角体蛋白启动子可以用于昆虫细胞，并且巨细胞病毒或金属硫蛋白启动子可以用于哺乳动物细胞。另外，在高级真核生物的情况下，组织特异性和细胞类型特异性启动子是广泛可用的。这些启动子因其指导核酸分子在体内给定组织或细胞类型中表达的能力而得名。技术人员非常了解可用于指导核酸表达的许多启动子和其他调控元件。
除了有助于插入的核酸分子转录的序列外，载体还可以包含复制起点和其他编码选择性标记的基因。例如，新霉素抗性(neor)基因赋予表达它的细胞G418抗性，并因此允许对转染细胞的表型选择。本领域技术人员可以容易地确定给定的调控元件或选择性标记是否适用于特定的实验环境。
可用于本发明的病毒载体包括例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体、疱疹病毒、猿猴病毒40(SV40)和牛乳头瘤病毒载体(参见例如Gluzman(编),Eukaryotic ViralVectors,CSH Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.)。
包含并表达编码本文公开的主题IL-2突变蛋白的核酸分子的原核或真核细胞也是本发明的特征。本发明的细胞是转染的细胞，即，已经通过重组DNA技术将核酸分子(例如编码突变体IL-2多肽的核酸分子)引入其中的细胞。这种细胞的子代也被认为在本发明的范围内。
表达系统的精确组分并不重要。例如，IL-2突变蛋白可在原核宿主诸如细菌大肠杆菌中或在真核宿主诸如昆虫细胞(例如，Sf21细胞)或哺乳动物细胞(例如CHO、HEK293、COS细胞、NIH 3T3细胞或HeLa细胞)中产生。这些细胞可从许多来源获得，包括美国典型培养物保藏中心(Manassas,Va.)。在选择表达系统时，重要的是组分之间彼此相容。技术人员或普通技术人员能够做出这样的决定。此外，如果在选择表达系统时需要指导，技术人员可以查阅Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,New York,N.Y.,1993)和Pouwels等人(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,1985增刊1987)。
可以使用常规生化程序从表达系统中纯化所表达的多肽，并且可以例如如本文所述将其用作治疗剂。
在一些实施方案中，取决于用于产生突变蛋白的宿主生物，获得的IL-2突变蛋白将是糖基化或未糖基化的。如果选择细菌作为宿主，则产生的IL-2突变蛋白将是未糖基化的。另一方面，真核细胞将使IL-2突变蛋白糖基化，但是可能与天然IL-2糖基化的方式不同。可以根据任何合适的方法纯化由转化的宿主产生的IL-2突变蛋白。已知多种用于纯化IL-2的方法。参见例如Current Protocols in Protein Science,第2卷.编辑:JohnE.Coligan,Ben M.Dunn,Hidde L.Ploehg,David W.Speicher,Paul T.Wingfield,第6.5单元(版权1997,John Wiley and Sons,Inc.。IL-2突变蛋白可以从大肠杆菌中产生的包涵体中分离，或使用阳离子交换、凝胶过滤和/或反相液相色谱法从产生给定突变蛋白的哺乳动物或酵母培养物的条件培养基中分离。
构建编码IL-2突变蛋白的DNA序列的另一种示例性方法是通过化学合成。这包括通过化学手段由编码表现出所述性质的IL-2突变蛋白的蛋白质序列直接合成肽。该方法可以在影响IL-2与IL-2Rα、IL-2Rβ和/或IL-2Rγ的相互作用的位置上掺入天然和非天然氨基酸。替代性地，可以使用寡核苷酸合成仪通过化学手段合成编码期望的IL-2突变蛋白的基因。基于所需IL-2突变蛋白的氨基酸序列设计此类寡核苷酸，并优选地选择在产生重组突变蛋白的宿主细胞中有利的那些密码子。在这方面，众所周知的是遗传密码是简并的，即一个氨基酸可以被不止一个密码子编码。例如，Phe(F)由两个密码子TIC或TTT编码，Tyr(Y)由TAC或TAT编码，而his(H)由CAC或CAT编码。Trp(W)由单个密码子TGG编码。因此，将认识到，对于编码特定IL-2突变蛋白的给定DNA序列，将存在许多编码该IL-2突变蛋白的DNA简并序列。例如，将认识到，除了突变蛋白H9的优选DNA序列之外，还将存在许多编码所示IL-2突变蛋白的简并DNA序列。这些简并的DNA序列被认为在本公开的范围内。因此，在本发明的上下文中，“其简并变体”是指编码并因此使得能够表达特定突变蛋白的所有DNA序列。
IL-2突变蛋白的生物学活性可以通过本领域已知的任何合适的方法来测定。这样的测定法包括PHA-母细胞增殖和NK细胞增殖。
I.抗PD-1抗体和组合
根据本发明和本文所述的方法使用的抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011、和MK-3475(派姆单抗)、塞普利单抗(REGN2810)、SHR-1210(CTR20160175和CTR20170090)、SHR-1210(CTR20170299和CTR20170322)、JS-001(CTR20160274)、IBI308(CTR20160735)、BGB-A317(CTR20160872)和/或如美国专利公开号2017/0081409中所述的PD-1抗体。有两种已获批准的抗PD-1抗体即派姆单抗(
Figure BDA0002387189880001211
MK-3475-033)和纳武单抗(
Figure BDA0002387189880001212
CheckMate078)以及更多正在开发中的抗体可以用于本文所述的组合中。示例性抗PD-1抗体序列在图10中示出，并且这些序列中的任一种可以与如本文所述的IL-2突变蛋白的组合方法一起使用。
在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与抗PD-1抗体或抑制剂组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与纳武单抗组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与派姆单抗组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与塞普利单抗组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与BMS-936558组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与MDX-1106组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与ONO-4538组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与AMP224组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与CT-011组合使用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与MK-3475组合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与参考抗体中的任一种组合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10或SEQID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ IDNO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在一些实施方案中，与抗PD-1抗体组合使用的IL-2突变蛋白是如本文所述的融合突变蛋白。在一些实施方案中，与抗PD-1抗体组合使用的IL-2突变蛋白是如本文所述的融合突变蛋白。
J.抗PD-L1抗体和组合
在一些实施方案中，本文所述的任何IL-2突变蛋白可与抗PD-1抗体组合使用。有三种已获批准的抗PD-L1抗体阿特珠单抗(
Figure BDA0002387189880001231
MPDL3280A)、阿维鲁单抗(
Figure BDA0002387189880001232
MSB001071 8C)和德瓦鲁单抗(MEDI4736)以及其他正在开发中的抗PD-L1抗体。有许多抗PD-L1抗体可供使用，并且更多正在开发中的抗体可以与如本文所述的IL-2突变蛋白组合使用。在一些实施方案中，PD-L1抗体是美国专利公开号2017/0281764以及国际专利公开号WO 2013/079174(阿维鲁单抗)和WO 2010/077634(或美国专利申请号20160222117或美国专利号8,217,149；阿特珠单抗)中所述的抗体。在一些实施方案中，PD-L1抗体包含SEQ ID NO:34的重链序列和SEQ ID NO:36的轻链序列(来自US 2017/281764)。在一些实施方案中，PD-L1抗体是阿特珠单抗(
Figure BDA0002387189880001241
MPDL3280A；IMpower110)。在一些实施方案中，PD-L1抗体是阿维鲁单抗(
Figure BDA0002387189880001242
MSB001071 8C)。在一些实施方案中，PD-L1抗体是德瓦鲁单抗(MEDI4736)。在一些实施方案中，PD-L1抗体包括例如阿特珠单抗(IMpower133)、BMS-936559/MDX-1105和/或RG-7446/MPDL3280A和/或YW243.55.S70，以及本文图11中提供的示例性抗PD-L1抗体中的任一种。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与参考抗体中的任一种组合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在一些实施方案中，与抗PD-L1抗体组合使用的IL-2突变蛋白是本文所述的融合突变蛋白。在一些实施方案中，与抗PD-L1抗体组合使用的IL-2突变蛋白是如本文所述的融合突变蛋白。
K.其他免疫疗法组合
根据本发明的方法使用的其他抗体和/或免疫疗法包括但不限于抗CTLA4mAb，诸如伊匹木单抗、曲美木单抗；以及抗PD-L1拮抗性抗体，诸如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A；抗LAG-3，诸如IMP-321；靶向免疫刺激蛋白的激动性抗体，包括抗CD40mAb，诸如CP-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)、达西妥珠单抗(dacetuzumab)；抗CD137mAb(抗4-1-BB抗体)，诸如BMS-663513乌瑞鲁单抗(urelumab)(抗4-1BB抗体；参见例如美国专利号7,288,638和8,962,804，其以引用方式整体并入本文)；丽瑞鲁单抗(lirilumab)(抗KIR mAB；IPH2102/BMS-986015；阻断NK细胞抑制受体)和PF-05082566(乌托米鲁单抗(utomilumab)；参见例如美国专利号8,821,867、8,337,850和9,468,678以及国际专利申请公开号WO 2012/032433，其以引用方式整体并入本文)；抗-OX40mAb(参见例如WO 2006/029879或WO 2010/096418，其以引用方式整体并入本文)；抗GITR mAb，诸如TRX518(参见例如美国专利号7,812,135，其以引用方式整体并入本文)；抗CD27mAb，诸如瓦力鲁单抗(varlilumab)CDX-1127(参见例如WO 2016/145085以及美国专利公开号US 2011/0274685和US 2012/0213771，其以引用方式整体并入本文)；抗ICOS mAb(例如MEDI-570、JTX-2011以及抗TIM-3抗体(参见例如WO 2013/006490或美国专利公开号US 2016/0257758，其以引用方式整体并入本文)。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与参考抗体中的任一种组合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ IDNO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。
其他抗体也可包括针对前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、脑癌的单克隆抗体(一般参见www.clinicaltrials.gov)。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与参考抗体中的任一种组合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ IDNO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6至SEQID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1 SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。
抗体还可包括用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体组合使用。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
L.治疗方法
在一些实施方案中，可以将主题IL-2突变蛋白和/或表达它们的核酸施用给受试者以治疗与异常凋亡或分化过程相关的病症(例如，细胞增殖病症或细胞分化病症，诸如癌症，例如通过产生主动或被动免疫)。在此类疾病的治疗中，所公开的IL-2突变蛋白可具有有利的性质，诸如减少的血管渗漏综合征。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是本文公开的任何IL-2突变蛋白或变体。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白序列与SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:6至SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:16中的任何一个90％相同。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白包含5-1 SEQ ID NO:5、5-2 SEQ ID NO:6、6-6 SEQ ID NO:7、A2 SEQ ID NO:8、B1SEQ ID NO:9、B11 SEQ ID NO:10、C5 SEQ ID NO:11、D10 SEQ ID NO:12、E10 SEQ ID NO:13、G8 SEQ ID NO:14、H4 SEQ ID NO:15和H9 SEQ ID NO:16中的任一种。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白中的取代包括根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2编号的L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白是融合蛋白。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白与CAR-T构建体相关联和/或由CAR-T构建体表达。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白由溶瘤病毒表达和/或与溶瘤病毒相关联。
细胞增殖和/或分化病症的实例包括癌症(例如癌、肉瘤、转移性疾病或造血性肿瘤疾病，例如白血病)。转移性肿瘤可能来自多种原发性肿瘤类型，包括但不限于前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌和脑癌。
突变体IL-2多肽可用于治疗怀疑患有或可能具有发展为包括肾癌或黑色素瘤或任何病毒性疾病在内的任何类型的癌症的高风险中的患者。示例性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈、结肠和卵巢的组织形成的那些。该术语还包括癌肉瘤，其包括由癌组织和肉瘤组织组成的恶性肿瘤。
增殖病症的另外实例包括造血性肿瘤疾病。
替代性地，或除了直接施用于患者的方法外，在一些实施方案中，突变体IL-2多肽也可用于离体方法中。例如，可以在培养基中体外培养细胞(例如，从患者分离并放置或保持在培养物中的外周血淋巴细胞或纯化的淋巴细胞群)，并且可以通过向培养基添加IL-2突变体来实现接触步骤。培养步骤可以包括进一步的步骤，其中用其他试剂刺激或处理细胞，例如以刺激增殖或扩大对感兴趣的抗原(例如，癌抗原或病毒抗原)具有反应性的细胞群。然后在细胞被处理后将其施用给患者。
与本文公开的IL-2突变蛋白组合用于治疗方法的抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011和MK-3475。
在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与抗PD-1抗体或抑制剂组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与纳武单抗组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与BMS-936558组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与MDX-1106组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与ONO-4538组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与AMP224组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与CT-011组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与MK-3475组合使用以治疗癌症。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含K43N取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与抗体和/或免疫疗法组合使用以治疗癌症，所述抗体和/或免疫疗法包括但不限于抗CTLA4mAb，诸如伊匹木单抗、曲美木单抗；抗PD-L1拮抗性抗体，诸如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A；抗LAG-3，诸如IMP-321；靶向免疫刺激蛋白的激动性抗体，包括抗CD40mAb，诸如CP-870,893、鲁卡木单抗、达西妥珠单抗；抗CD137mAb(抗4-1-BB抗体)，诸如BMS-663513乌瑞鲁单抗(urelumab)(抗4-1BB抗体；参见例如美国专利号7,288,638和8,962,804，其以引用方式整体并入本文)；丽瑞鲁单抗(抗KIR mAB；IPH2102/BMS-986015；阻断NK细胞抑制受体)和PF-05082566(乌托米鲁单抗；参见例如美国专利号8,821,867、8,337,850和9,468,678以及国际专利申请公开号WO2012/032433，其以引用方式整体并入本文)；抗-OX40mAb(参见例如WO 2006/029879或WO2010/096418，其以引用方式整体并入本文)；抗GITR mAb，诸如TRX518(参见例如美国专利号7,812,135，其以引用方式整体并入本文)；抗CD27mAb，诸如瓦力鲁单抗(varlilumab)CDX-1127(参见例如WO 2016/145085以及美国专利公开号US 2011/0274685和US 2012/0213771，其以引用方式整体并入本文)；抗ICOS mAb(例如MEDI-570、JTX-2011以及抗TIM-3抗体(参见例如WO 2013/006490或美国专利公开号US 2016/0257758，其以引用方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与另一种抗体组合使用以治疗癌症，该抗体可包括针对前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌、脑癌的单克隆抗体(一般参见www.clinicaltrials.gov)。
在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，将包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白与用于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的抗体组合使用以治疗癌症。
M.药物组合物和施用方法
在一些实施方案中，主题IL-2突变蛋白和核酸可以掺入组合物(包括药物组合物)中。此类组合物通常包含多肽或核酸分子和药学上可接受的载剂。此类组合物也可以包含抗PD-1抗体。在一些实施方案中，组合物包含IL-2突变蛋白，其是融合蛋白和/或与CAR-T构建体相关联和/或由溶瘤病毒表达或与溶瘤病毒相关联。
抗PD-1抗体和IL-2突变蛋白可以作为共组合物施用，作为两种单独的组合物同时施用，和/或作为两种单独的组合物依次施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抑制剂和IL-2突变蛋白作为单一共组合物(即，共配制)一起施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抑制剂和IL-2突变蛋白作为两种单独的组合物(即，单独的制剂)同时施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体或抑制剂和IL-2突变蛋白作为单独的组合物(即，单独的制剂)依次施用。在一些实施方案中，当抗PD-1抗体或抑制剂和IL-2突变蛋白作为单独的组合物依次施用时，抗PD-1抗体或抑制剂在IL-2突变蛋白之前施用。在一些实施方案中，当抗PD-1抗体或抑制剂和IL-2突变蛋白作为单独的组合物依次施用时，IL-2突变蛋白在抗PD-1抗体或抑制剂之前施用。在一些实施方案中，抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011和MK-3475。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，IL-2突变蛋白是包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含K43N取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQID NO:2的野生型人IL-2。
所述的其他免疫治疗剂和IL-2突变蛋白可以作为共组合物、作为两种单独的组合物同时地和/或作为两种单独的组合物依次地施用。在一些实施方案中，其他免疫治疗剂和IL-2突变蛋白作为单一共组合物(即，共配制)一起施用。在一些实施方案中，其他免疫治疗剂和IL-2突变蛋白作为两种单独的组合物(即，单独的制剂)同时施用。在一些实施方案中，其他免疫治疗剂和IL-2突变蛋白作为单独的组合物(即，单独的制剂)依次施用。在一些实施方案中，当其他免疫治疗剂和IL-2突变蛋白作为单独的组合物依次施用时，抗PD-1抗体或抑制剂在IL-2突变蛋白之前施用。在一些实施方案中，当其他免疫治疗剂和IL-2突变蛋白作为单独的组合物依次施用时，IL-2突变蛋白在其他免疫治疗剂之前施用。在一些实施方案中，根据人野生型IL-2(SEQ ID NO:2)编号，IL-2突变蛋白是包含取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含K43N取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。在一些实施方案中，IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
将药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。可以口服给予本发明的抗PD-1抗体和/或突变体IL-2多肽，但是它们更有可能通过肠胃外途径施用，包括例如静脉内施用。肠胃外施用途径的实例包括例如静脉内、皮内、皮下、透皮(局部)、透粘膜和直肠施用。用于肠胃外应用的溶液或悬浮液可以包含以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，诸如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，诸如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱诸如磷酸二氢钠和/或磷酸氢二钠、盐酸或氢氧化钠来调节pH(例如，调节至约7.2-7.8的pH，例如7.5)。肠胃外制剂可以装入由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(如果为水溶性的)或分散体，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM.(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应该是无菌的，并且应该以易于注射的程度流动。它在生产和储存条件下应该是稳定的，并且必须进行防腐处理以防止微生物(诸如细菌和真菌)的污染。载剂可以是溶剂或分散介质，其包括例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣、在分散体的情况下通过维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂例如十二烷基硫酸钠来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选的是在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇、氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现注射用组合物的延长吸收。
可以通过将所需量的活性化合物与所需的一种或上述成分的组合掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射用溶液。通常，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物包含基本分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射用溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
如果使用口服组合物，则通常包含惰性稀释剂或可食用载剂。为了口服治疗施用的目的，可以将活性化合物与赋形剂结合并以片剂、锭剂或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用流体载剂制备以用作漱口水。药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料可以作为组合物的一部分包括在内。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可以包含以下任何成分或类似性质的化合物：粘合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂诸如淀粉或乳糖，崩解剂诸如藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或SterotesTM；助流剂，诸如胶体二氧化硅；甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如薄荷、水杨酸甲酯或橙子香精。
在通过吸入而施用的情况下，抗PD-1抗体和/或IL-2突变蛋白或编码它们的核酸以气溶胶喷雾的形式从包含合适推进剂(例如，诸如二氧化碳的气体)的压力容器或分配器或从雾化器中递送。此类方法包括美国专利号6,468,798中所述的那些。
抗PD-1抗体和/或IL-2突变蛋白或核酸的全身施用也可以通过透粘膜或透皮方式进行。对于透粘膜或透皮施用，在制剂中使用适合于要渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域中通常是已知的，并且包括例如用于经粘膜施用的去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。透粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于透皮施用，将活性化合物配制成软膏、油膏、凝胶或乳剂，如本领域通常已知的。
在一些实施方案中，化合物(抗PD-1抗体和/或突变体IL-2多肽或核酸)也可以栓剂(例如，具有常规栓剂基质，诸如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备，以用于直肠递送。
在一些实施方案中，还可以使用本领域已知的方法通过转染或感染来施用化合物(主题IL-2突变蛋白或核酸)，这些方法包括但不限于McCaffrey等人(Nature 418:6893,2002)、Xia等人(Nature Biotechnol.20:1006-1010,2002)或Putnam(Am.J.HealthSyst.Pharm.53:151-160,1996,勘误见于Am.J.Health Syst.Pharm.53:325,1996)中所述的方法。
在一个实施方案中，将抗PD-1抗体和/或IL-2突变蛋白或核酸用载剂制备，这些载剂将保护抗PD-1抗体和/或突变IL-2多肽免于从体内快速清除，诸如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，诸如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。可以使用标准技术来制备此类制剂。材料也可以从Alza Corporation和Nova Pharmaceuticals,Inc.商购获得。脂质体悬浮液(包括具有针对病毒抗原的单克隆抗体的靶向受感染细胞的脂质体)也可用作药学上可接受的载剂。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利号4,522,811中所述。
此类抗PD-1抗体、IL-2突变蛋白或核酸化合物的剂量、毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物中通过例如用于测定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中治疗有效的剂量)的标准药学程序来测定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。尽管可以使用表现出毒副作用的化合物，但是应注意设计一种将此类化合物靶向受影响组织部位的递送系统，以最大程度地减少对未感染细胞的潜在损害并因而减少副作用。
从细胞培养试验和动物研究中获得的数据可用于制定用于人类的剂量范围。此类化合物的剂量优选在包括具有很少或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。剂量可在该范围内变化，这取决于所采用的剂型和所采用的施用途径。对于本发明方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以首先从细胞培养试验中估计。可以在动物模型中制定剂量，以达到包括在细胞培养中所确定的IC50(即，达到症状的半数最大抑制的试验化合物的浓度)的循环血浆浓度范围。此类信息可用于更准确地确定对人体有用的剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法测量。
如本文所定义，主题IL-2突变蛋白的治疗有效量(即，有效剂量)和/或抗PD-1抗体或抑制剂取决于所选择的多肽或抗体。在一些实施方案中，可以施用的IL-2突变蛋白的单个剂量的量可以在约0.001mg/kg至0.1mg/kg患者体重的范围内。在一些实施方案中，可以施用的抗PD-1抗体或抑制剂的单个剂量的量可以在约1mg/kg至20mg/kg、或约5mg/kg至约15mg/kg、或约10mg/kg患者体重的范围内。在一些实施方案中，可以施用约0.005mg/kg、0.01mg/kg、0.025mg/kg、0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、1.0mg/kg、5.0mg/kg、10.0mg/kg剂量的抗PD-1抗体或抑制剂和/或IL-2突变蛋白。在一些实施方案中，施用600,000IU/kg(IU可以通过淋巴细胞增殖生物测定法确定并以国际单位(IU)表示，如通过世界卫生组织第1个白介素-2(人)国际标准所确立的)。剂量可以类似于但预期小于
Figure BDA0002387189880001361
的处方剂量。组合物可以每天施用一次或多次至每周施用一次或多次；包括隔天一次。技术人员将理解，某些因素可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间，包括但不限于疾病或病症的严重性、先前的治疗、受试者的总体健康和/或年龄以及所存在的其他疾病。此外，用治疗有效量的主题IL-2突变蛋白对受试者的治疗可以包括单次治疗，或者可以包括一系列治疗。在一个实施方案中，每8小时施用组合物持续五天，然后停止2至14天(例如9天)，然后每8小时施用再持续五天。在一些实施方案中，施用是每4天施用3剂。
药物组合物可以与施用说明书一起包含在容器、包装或分配器中。
提供以下实例以描述本文提供的本发明的某些实施方案，而不应被解释为限制性的。
示例性实施方案
1.一种治疗癌症的方法，其包括施用包含以下的组合治疗：
(i)抗PD-1抗体或抑制剂或抗PD-L1抗体或抑制剂和
(ii)包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011和MK-3475(派姆单抗)、塞普利单抗(REGN2810)、SHR-1210(CTR20160175和CTR20170090)、SHR-1210(CTR20170299和CTR20170322)、JS-001(CTR20160274)、IBI308(CTR20160735)、BGB-A317(CTR20160872)以及如美国专利公开号2017/0081409中叙述的PD-1抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体或抑制剂选自由阿特珠单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗组成的组。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含K43N取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
8.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白是融合蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述融合蛋白包含与Fc抗体片段连接的所述IL-2。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述Fc抗体片段是人Fc抗体片段。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述Fc抗体片段包含N297A取代。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述融合蛋白包含与白蛋白连接的所述IL-2。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌和脑癌。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对IL-2Rβ的结合能力增加。
17.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对IL-2Rβ的结合亲和力更高。
18.如权利要求4至8中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
19.一种药物组合物，其包含抗PD-1抗体或抑制剂、如权利要求1至13或16至18中任一项所述的IL-2突变蛋白和药学上可接受的载体。
20.一种免疫细胞靶向或表达构建体，包含：白介素2受体β(IL-2Rβ)结合蛋白，其中所述结合蛋白的IL-2Rβ的平衡解离常数小于野生型人IL-2(hIL-2)的平衡解离常数；连接至包含至少一个其他靶向部分的免疫细胞靶向或表达构建体。
21.如权利要求20所述的构建体，其中所述免疫细胞靶向或表达构建体对T细胞例如CD8+T细胞或CD4+T细胞表现出细胞毒性作用。
22.如权利要求20至21中任一项所述的构建体，其中所述构建体是嵌合抗原受体(CAR)，并且其中所述IL-2突变蛋白或其他靶向部分与跨膜结构域融合；连接至细胞内信号传导区。
23.如权利要求22所述的构建体，其中所述细胞内信号传导区包含CD3信号传导结构域。
24.如权利要求23所述的构建体，其中所述细胞内信号传导区包含CD28信号传导结构域、CD137信号传导结构域、OX-40信号传导结构域、ICOS信号传导结构域、DAP10信号传导结构域中的一个或多个。
25.如权利要求21所述的构建体，其中所述构建体是T细胞抗原偶联剂(TAC)，其中所述IL-2突变蛋白或其他靶向部分融合至结合与所述TCR复合物相关联的蛋白质的配体；融合至T细胞受体信号传导结构域多肽。
26.如权利要求25所述的构建体，其中与所述TCR复合物相关联的蛋白质是CD3。
27.如权利要求26所述的构建体，其中所述T细胞受体信号传导结构域多肽包含CD4胞质结构域和CD4跨膜结构域。
28.如权利要求20所述的构建体，其中所述构建体是抗体偶联的T细胞受体(ACTR)，其包含以高亲和力与IL-2突变蛋白或其他靶向部分结合的嵌合抗原受体组分。
29.如权利要求20所述的构建体，其中所述CAR组分包含CD16，并且所述IL-2突变蛋白与Fc序列融合。
30.如权利要求20所述的构建体，其中所述构建体是双特异性T细胞交换因子(BiTE)，其包含融合至与T细胞受体组分结合的抗体可变区的IL-2突变蛋白或其他靶向部分。
31.如权利要求30所述的构建体，其中所述T细胞受体的BiTE组分是CD3。
32.如权利要求31所述的构建体，其中IL-2Rβ结合蛋白包含根据野生型hIL-2编号的以下氨基酸取代：L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。
33.一种编码根据权利要求20至32中任一项所述的构建体的核酸。
34.一种包含如权利要求33所述的核酸构建体的载体。
35.一种T细胞，其包含根据权利要求33所述的构建体或根据权利要求34所述的载体。
36.一种NK细胞，其包含根据权利要求33所述的构建体或根据权利要求34所述的载体。
37.如权利要求35所述的T细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞。
38.如权利要求35所述的T细胞，其中所述T细胞是CD8+T细胞。
39.一种如权利要求35或36所述的分离的免疫细胞群。
40.一种包含如权利要求39所述的免疫细胞群的药物制剂。
41.一种靶向癌细胞，包括表达IL-2受体的细胞的方法，所述方法包括使细胞与如权利要求40所述的制剂接触。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述接触是在体外。
43.如权利要求41所述的方法，其中所述接触是在体内。
44.一种治疗癌症的方法，所述方法包括使患有癌症的个体与有效剂量的如权利要求40所述的制剂接触。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述癌症是白血病、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、肾癌、卵巢癌、卡波西肉瘤、急性骨髓性白血病、B谱系恶性肿瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾癌或间皮瘤。
46.一种将IL-2突变蛋白靶向癌细胞的方法，其包括使所述癌细胞与IL-2突变蛋白溶瘤病毒组合接触，其中所述组合包含与溶瘤病毒缀合或由溶瘤病毒表达的IL-2突变蛋白，并且其中所述溶瘤病毒能够靶向癌细胞。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述接触发生在体外。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述接触发生在体内。
49.如权利要求46至48中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：腺病毒、自我复制型甲病毒、牛痘病毒、塞内加谷病毒、新城疫病毒、马拉巴病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、慢病毒、麻疹病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒和逆转录病毒。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述牛痘病毒基因组包含胸苷激酶基因，胸苷激酶基因因胸苷激酶(TK)基因中的取代和/或开放阅读框至少一个核苷酸的消融缺失而失活，从而提供了部分缺失的胸苷激酶基因，所述牛痘生长因子基因缺失，并且所述经修饰的牛痘病毒载体包含至少一个编码如本文所述的IL-2突变蛋白的核酸序列。
51.如权利要求48所述的方法，其中和未与溶瘤病毒缀合的IL-2突变蛋白的浓度相比，所述体内接触导致所述肿瘤微环境中所述IL-2突变蛋白的浓度增加。
52.如权利要求46或48至51中任一项所述的方法，其中所述经修饰的溶瘤病毒将所述IL-2突变蛋白靶向肿瘤微环境(TME)的免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞和MDSC(骨髓来源的抑制细胞)，以具有提高的治疗益处。
53.如权利要求46或48至52中任一项所述的方法，其中所述经修饰的溶瘤病毒将所述IL-2突变蛋白靶向表达一种或多种肿瘤抗原的一种或多种免疫抑制细胞。
54.如权利要求46或48至53中任一项所述的方法，其中所述镜修饰的溶瘤病毒将所述IL-2突变蛋白靶向所述TME。
55.如权利要求46或48至54中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白增强效应T细胞和/或NK细胞。
56.如权利要求46或48至55中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白抑制Treg活性。
57.如权利要求46或48至56中任一项所述的方法，其中所述IL-2包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
58.一种经修饰的牛痘病毒载体，其特征在于所述载体包含牛痘病毒基因组，其中所述胸苷激酶基因因胸苷激酶(TK)基因中的取代和/或开放阅读框至少一个核苷酸的消融缺失而失活，从而提供了部分缺失的胸苷激酶基因，所述牛痘生长因子基因缺失，并且所述经修饰的牛痘病毒载体包含至少一个编码如本文所述的IL-2突变蛋白的核酸序列。
59.一种经修饰的溶瘤腺病毒，其包含(i)经修饰的核酸，其中任选地，缺失编码所编码的E1A多肽的氨基酸122-129的核苷酸，和(ii)包含编码如本文所述的IL-2突变蛋白的多核苷酸的表达盒。
60.如权利要求58或权利要求59所述的经修饰的病毒，其中所述IL-2突变蛋白将所述经修饰的溶瘤病毒引导至所述肿瘤微环境(TME)的免疫抑制细胞，如肿瘤相关巨噬细胞和MDSC(骨髓来源的抑制细胞)，以具有提高的治疗益处。
61.如权利要求58或权利要求59所述的经修饰的病毒，其中所述IL-2突变蛋白将所述经修饰的溶瘤病毒引导至一种或多种肿瘤抗原。
62.如权利要求58或权利要求59所述的经修饰的病毒，其中所述IL-2突变蛋白将经修饰的溶瘤病毒引导至TME。
63.如权利要求58或权利要求59所述的经修饰的病毒，其中所述IL-2突变蛋白增强效应T细胞和/或NK细胞。
64.如权利要求58或权利要求59所述的经修饰的病毒，其中所述IL-2突变蛋白抑制Treg活性。
65.一种治疗癌症的方法，其包括向有此需要的受试者施用能够表达IL-2突变蛋白的溶瘤病毒。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，其中编号根据SEQID NO:2的野生型人IL-2。
67.如权利要求65至66中任一项所述的方法，其中所述溶瘤病毒选自由以下组成的组：腺病毒、自我复制型甲病毒、牛痘病毒、塞内加谷病毒、新城疫病毒、马拉巴病毒、水疱性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、呼肠孤病毒、柯萨奇病毒、慢病毒、麻疹病毒、流感病毒、辛德毕斯病毒、粘液瘤病毒和逆转录病毒。
实施例
实施例1：H9与抗PD-1免疫疗法在小鼠MC38结肠癌模型中协同作用。
该实施例提供的数据表明组合疗法以剂量依赖性方式产生稳健响应。
下表11显示了在该实施例中使用的H9IL-2突变蛋白的取代矩阵。
表11：H9取代矩阵
Figure BDA0002387189880001441
抗PD-1抗体以10mg/kg静脉施用，每4天施用3个剂量(10mg/kgIV q4dx3)。根据相同的给药方案，以5μg q.d.或25μg q.d.的指定剂量(μg/只小鼠)，施用H9(具有氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2)。然后在肿瘤植入后监测MC38结肠癌模型小鼠长达40天。抗PD-1抗体加H9的组合在低剂量和高剂量下均导致治愈小鼠的数量增加，在25ug q.d.H9的剂量下大幅增加。
如图1的数据所提供的那样，单独的H9和抗PD-1仅产生有限的功效。然而，组合治疗足以以耐受良好的H9剂量治愈大多数小鼠。组合的功效增加不会导致新的或增加的毒性。
提供上述实施例以便为本领域的普通技术人员提供关于如何实现和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开内容和描述，并非旨在限制发明人所认为的发明的范围。对于本领域的技术人员显而易见的，对用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入以下权利要求的范围内。本说明书中提及的所有专利和公开表示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献均以引用方式并入，达到如同各参考文献单独以引用方式整体并入的相同程度。
所有标题和章节名称仅用于澄清和参考的目的，不应视为以任何方式进行限制。例如，本领域的技术人员将会理解根据本文所述的本发明的精神和范围适当组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。
本文引用的所有参考文献据此以引用方式整体并入本文并用于所有目的，达到如同具体和单独指示各个公开或专利或专利申请以引用方式整体并入用于所有目的的相同程度。
如本领域技术人员将显而易见的，可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下对本申请进行许多修改和变型。本文描述的特定实施例和实例仅以举例的方式提供，并且本申请仅由所附权利要求的术语以及权利要求所赋予的等同项的全部范围限制。

Claims (19)

1.一种治疗癌症的方法，其包括施用包含以下的组合治疗：
(i)抗PD-1抗体或抑制剂或抗PD-L1抗体或抑制剂和
(ii)包含以下氨基酸取代L80F、R81D、L85V、I86V和I92F的IL-2突变蛋白，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗PD-1抗体或抑制剂选自由以下组成的组：纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、AMP224、CT-011和MK-3475(派姆单抗)、塞普利单抗(REGN2810)、SHR-1210(CTR20160175和CTR20170090)、SHR-1210(CTR20170299和CTR20170322)、JS-001(CTR20160274)、IBI308(CTR20160735)、BGB-A317(CTR20160872)以及如美国专利公开号2017/0081409中叙述的PD-1抗体。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗PD-L1抗体或抑制剂选自由阿特珠单抗、阿维鲁单抗和德瓦鲁单抗组成的组。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
5.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含K43N取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
6.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含F42A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
7.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含Y45A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
8.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白还包含E62A取代，其中编号根据SEQ ID NO:2的野生型人IL-2。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述IL-2突变蛋白是融合蛋白。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述融合蛋白包含与Fc抗体片段连接的所述IL-2。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述Fc抗体片段是人Fc抗体片段。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述Fc抗体片段包含N297A取代。
13.如权利要求9所述的方法，其中所述融合蛋白包含与白蛋白连接的所述IL-2。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、淋巴瘤、包括小细胞肺癌的肺癌、肾癌、肝癌、结肠癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃癌和脑癌。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述癌症是结肠癌。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对IL-2Rβ的结合能力增加。
17.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对IL-2Rβ的结合亲和力更高。
18.如权利要求4至8中任一项所述的方法，其中与野生型人IL-2相比，所述IL-2突变蛋白表现出对CD25的结合亲和力降低。
19.一种药物组合物，其包含抗PD-1抗体或抑制剂、如权利要求1至13或16至18中任一项所述的IL-2突变蛋白和药学上可接受的载体。
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