CN114502736A

CN114502736A - 编码白介素-2变体(vIL-2)多肽的溶瘤病毒载体

Info

Publication number: CN114502736A
Application number: CN202080071078.6A
Authority: CN
Inventors: 萨迪亚·扎法尔; 达夫内·基沙贝拉; 里卡·哈武宁; 阿克塞·赫敏基
Original assignee: Tilt Biotherapeutics Oy
Current assignee: Tilt Biotherapeutics Oy
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2022-05-13
Also published as: CA3157255A1; BR112022006926A2; EP4041758A1; AU2020361565A1; JP2023505925A; US20240102047A1; WO2021069806A1; KR20220092523A

Abstract

本发明提供了一种溶瘤腺病毒载体，该溶瘤腺病毒载体包括编码作为转基因的白介素2变体(vIL‑2)多肽的核酸序列。本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括所述溶瘤载体和以下中的至少一种：生理上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、抗菌剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂。本发明的特定目的是提供所述溶瘤病毒载体或药物组合物用于治疗癌症或肿瘤，优选实体瘤。

Description

编码白介素-2变体(vIL-2)多肽的溶瘤病毒载体

技术领域

本发明涉及生命科学和医学领域。具体而言，本发明涉及人的癌症疗法。更具体而言，本发明涉及一种溶瘤病毒载体，包括编码白介素-2变体(vIL-2)多肽的核酸序列。

背景技术

免疫刺激性细胞因子白介素2(IL-2)属于γ链细胞因子家族。它是白细胞诸如T细胞和自然杀伤(NK)细胞的生长因子。IL-2主要由活化的CD4+和CD8+T淋巴细胞产生，并且具有各种免疫学作用，诸如诱导T细胞增殖和活化、增强B细胞生长以及活化单核细胞和自然杀伤细胞。已对IL-2作为多种多样的免疫疾患的治疗剂进行了研究，但与全身施用高剂量IL-2有关的副作用限制了IL-2的临床应用。IL-2通过与其受体结合进行信号传导，受体由三个亚基组成：IL-2Rγ(或CD132)、IL-2Rβ(或CD122)和IL-2Rα(或CD25)。CD8+和CD4+T细胞两者，包括调节性T细胞(CD4+Foxp3+；Treg)，都组成型表达三聚体形式。IL-2受体的二聚中间体形式，由IL-2Rγ和IL-2Rβ亚基组成，在NK细胞和静息CD8+和CD4+T细胞上表达。

IL-2扩增和活化CD8+效应细胞的能力促进了其在治疗肾细胞癌和黑素瘤中的应用。不利的是，IL-2在免疫抑制调节细胞(主要是Treg)的扩增和维持中也起着核心作用。尽管IL-2疗法已在一些患者中示出持久的应答，但全身递送已在一些临床试验中显示出局限性。有效治疗需要高剂量IL-2，引起肝脏、心脏和肺问题，而抗肿瘤功效通过Treg诱导而折中。

在现有技术中，Levin et al.,2012通过工程化出对IL-2Rβ具有增加的结合亲和力的IL-2“超级因子(superkine)”(也称为super-2)消除了IL-2对CD25表达的功能要求。与IL-2相比，IL-2超级因子诱导细胞毒性T细胞的更优异扩增，导致改进体内抗肿瘤应答，并引起调节性T细胞的扩增成比例减少以及肺水肿减少。

US9428567公开了人白介素2(hIL-2)变体，其对IL-2Rβ亚基的平衡解离常数小于野生型人IL-2对IL-2Rβ亚基的平衡解离常数。相对于野生型IL-2而言，这些变体还可以表现出与IL-2Rα或IL-2Rγ亚基的结合减少。

鉴于IL-2刺激T细胞的能力，编码IL-2的病毒将具有增强T细胞疗法的潜力(Itzhaki et al.,2013；Schwartz et al.,2002)。T细胞疗法包括肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、受体修饰的T细胞(TCR)和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。从患者的血液或肿瘤中提取T细胞，在实验室中活化和/或修饰，扩增，并作为治疗方案返回至患者(

et al.,2016)。然而，由于高度免疫抑制的肿瘤微环境使过继转移的T细胞功能减退，T细胞输注需要分别用化学疗法和高剂量全身性IL-2进行预治疗和后治疗，化学疗法和高剂量全身性IL-2两者都会引起严重的毒性(Schwartz,Stover et al.2002,Itzhaki,Levy etal.2013)。

经过多年的发展，目前开始将溶瘤病毒用作癌症治疗剂。虽然已经有涉及影响病毒功效的作用机制和因素的一些发现，但是仍然需要鉴定出决定对病毒疗法的总体应答的途径。在临床试验中，溶瘤病毒已显示出良好的安全性和有前景的功效。

WO2014170389涉及单独的溶瘤腺病毒载体或者溶瘤腺病毒载体连同治疗组合物用于癌症的治疗用途和治疗方法。例如，公开了单独施用过继细胞治疗组合物和溶瘤腺病毒载体。过继细胞疗法(ACT)是用于治疗癌症的有效方法，而且用于治疗其他疾病，诸如感染和移植物对抗宿主病。过继细胞转移是将离体生长的细胞(最常见的是免疫源性细胞)被动转移至宿主中，目的是转移移植物的免疫功能和特征。WO2014170389还公开了溶瘤腺病毒载体的核酸序列。

WO2016146894公开了编码双特异性单克隆抗体的溶瘤腺病毒载体。

US2019062395公开了经修饰的溶瘤痘苗病毒载体，其包括编码IL-2变体的转基因。

在对溶瘤病毒治疗的应答仍有改进的空间，对于转移负担显著的患者而言尤其如此。与溶瘤病毒活性有关的通路的进一步表征可以揭示改进病毒疗法功效的潜在靶标。因此，仍然可以提高溶瘤病毒载体的功效，无论是单独的溶瘤病毒载体还是溶瘤病毒载体连同其他疗法都是如此。本发明通过利用特异性病毒载体例如与过继细胞疗法一起为癌症治疗提供了有效的工具和方法。

发明内容

本发明的目的是克服在使用IL-2疗法中所见的限制，主要是刺激免疫抑制性Treg。我们设计了一种溶瘤腺病毒载体，该载体将IL-2变体(vIL-2)多肽作为转基因表达。vIL-2基因在天然IL-2基因中具有点突变，以取消其与CD25(受体亚基α)的结合。因此，如此表达的vIL2不能刺激Treg细胞，使得优选扩增细胞毒性T细胞。在该构建体中，病毒复制仅限于癌症细胞，而转基因(vIL-2)的表达与病毒复制有关。因此，vIL-2只在需要它的地方：在肿瘤微环境中表达。癌症细胞内的病毒复制引起危险的信号传导及肿瘤相关抗原的扩散，这有助于免疫系统识别癌症细胞以杀伤这些细胞。此外，免疫刺激性细胞因子的表达进一步增强了这种效应。

因此，本发明的目的是提供用于克服低效、不安全和不可预测的癌症疗法问题的简单方法和工具。在一种实施方式中，本发明提供了用于细胞疗法的新方法和手段。本发明的目的通过特定的病毒载体、方法和布置来实现，其通过独立权利要求中所述的内容来表征。本发明的特定实施方式公开在从属权利要求中。

具体而言，本发明提供了一种溶瘤腺病毒载体，所述溶瘤腺病毒载体包括编码作为转基因的白介素2变体(vIL-2)多肽的核酸序列。本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括所述溶瘤载体和以下中的至少一种：生理上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、抗菌剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂。本发明的特定目的是提供所述溶瘤病毒载体或药物组合物用于治疗癌症或肿瘤，优选实体瘤。

附图说明

图1.IL-2变体(vIL-2)对免疫细胞群增殖比常规IL-2具有更有益的作用。与常规rhIL-2相比，重组人(rh)vIL-2在A)CD3+CD8+T细胞和B)CD3-T CD56+NK细胞群中诱导相当可观的增加。C)rhIL-2诱导CD3+T CD4+T细胞群增殖比(rh)vIL-2更多。3天后，(rh)vIL-2在诱导CD8+效应T细胞和NK细胞增殖方面比rhIL-2更强，而变体中CD4+T细胞(包括Treg)的水平仍然较低。数据以平均值+平均值的标准差(SEM)示出。**p<0.01。

图2.vIL-2对效应T细胞和耗竭性(Exhausted)T细胞的作用。A)将CD3+T细胞亲本群的CD8/CD4+T细胞比率预活并且用rhIL-2、(rh)vIL-2或仅培养基来培养的。可替代地，在未经感染的癌症细胞(B)或经感染的癌症细胞(C)的存在下，用rhIL-2、(rh)vIL-2或仅培养基来培养预活化的T细胞。在存在癌症细胞和不存在癌症细胞(A和B)下，rhIL-2和(rh)vIL-2对CD8/CD4细胞比率具有相似的作用。然而，当癌症细胞被溶瘤病毒感染时，相对于CD4+细胞而言，rh vIL-2诱导CD8+CD27-CD62L-CD45RO+细胞的趋势处于优势(C)。示出平均值。病毒：Ad5/3-E2F-d24；CC：癌症细胞。

图3.vIL-2对中央记忆T细胞的作用。A)将CD3+T细胞亲本群的CD8/CD4+T细胞比率预活化并且用rhIL-2、(rh)vIL-2或仅培养基培养。可替代地，在未经感染的癌症细胞(B)或经感染的癌症细胞(C)的存在下，用rhIL-2、(rh)vIL-2或仅培养基来培养预活化的T细胞。在不存在癌症细胞(A)下，我们未发现rhIL-2和(rh)vIL-2之间CD8/CD4 Tcm比率的任何差异。在肿瘤细胞的存在下，我们首先在第2天观察到该比率下降，随后在第4天该比率增加。再次，(rh)vIL-2在Tcm群中诱导的CD8与CD4比率比常规的rhIL-2更高(B)。在骨架病毒的存在下，(rh)vIL-2组中的CD8/CD4Tcm细胞在第2天更高，并且直至第4天仍然稳定，与(rh)vIL-2组相比，其他组中这些细胞的比率增加(C)。这表明，(rh)vIL-2以与rhIL-2相似的方式影响Tcm区室。示出平均值。病毒：Ad5/3-E2F-d24，CC：癌症细胞。

图4.vIL-2对效应记忆T细胞的作用。A)将CD3+T细胞亲本群的CD8/CD4+T细胞比率预活化并且用rhIL-2、(rh)vIL-2或仅培养基培养。可替代地，在未经感染的癌症细胞(B)或经感染的癌症细胞(C)的存在下，用rhIL-2、(rh)vIL-2或仅培养基来培养预活化的T细胞。如果不存在癌症细胞(A)，我们未观察到rhIL-2和(rh)vIL-2之间CD8/CD4 Tem比率的差异。对于癌症细胞，rhIL-2和(rh)vIL-2在第4天诱导高比率的CD8/CD4 Tem(B)。当癌症细胞被感染时，我们在第4天观察到(rh)vIL-2组中高CD8/CD4 Tem比率的趋势(C)。示出平均值。病毒：Ad5/3-E2F-d24，CC：癌症细胞。

图5.构建的病毒是溶瘤病毒，并且具有来自普通感冒病毒腺病毒血清型5的骨架。A)具有E2F启动子的嵌合5/3溶瘤腺病毒的示意图；E1A中24个碱基对缺失；E1B的失能缺失(disabling deletion)；插入E3区中的人vIL-2转基因；和Ad5纤突中的Ad3血清型头节(knob)。B)病毒具有离体溶瘤效力。BB表示没有转基因的骨架病毒C)病毒感染的细胞将转基因产物分泌到生长培养基中。Ad5/3-E2F-d24-IL-2和Ad5/3-E2F-d24-vIL-2之间的病毒细胞杀伤能力之间没有显著差异，由此表明，vIL-2转基因的存在不会降低病毒的溶瘤效力(B)。此外，感染了Ad5/3-E2F-d24-vIL-2的细胞能够分泌细胞因子(C)。

图6.溶瘤腺病毒Ad5/3-E2F-d24-vIL-2诱导CD8+效应细胞优势而不诱导Treg分化。A)与编码常规IL-2的病毒不同，相对于活化的CD4+T细胞，Ad5/3-E2F-d24-vIL-2诱导活化的效应T细胞(CD3+CD8+CD25+CD69+)的存在。B)与Ad5/3-E2F-d24-vIL-2不同，编码常规IL-2的病毒刺激免疫抑制性Treg的分化。在第3天和第6天，用Ad5/3-E2F-d24-vIL-2治疗的组中CD25+CD69+活化的效应T细胞的CD8/CD4比率比用表达常规IL-2的病毒治疗的显著更高(A)。Ad5/3-E2F-d24-vIL-2不会如Ad5/3-E2F-d24-IL-2那样诱导Treg分化(B)。数据表示为平均值+SEM。****p<0.0001；**p＝0.01。Ad5/3-vIL-2:Ad5/3-E2F-d24-vIL2；Ad5/3-IL-2:Ad5/3-E2F-d24-IL2；Ad5/3:Ad5/3-E2F-d24；PBMC:人外周血单核细胞。

图7.Ad5/3-E2F-d24-vIL2在仓鼠中增强抗肿瘤功效和总体存活率：将2*10⁶个HapT1肿瘤经皮下植入叙利亚仓鼠中。(A-D)在第1、4、8和13天用1*10⁹VP的Ad5/3-E2F-d24-IL-2、Ad5/3-E2F-d24-vIL-2或无携带对照病毒Ad5/3-E2F-d24治疗的仓鼠及接受PBS的模拟者直至第16天的个体肿瘤生长。与其他组相比，Ad5/3-E2F-d24-vIL-2示出更好的肿瘤控制。(E)在第1、4、8、13天用不同的腺病毒治疗具有已建成HapT1肿瘤的仓鼠。从第18天开始，各组每5天接受额外6轮治疗。与包括Ad5/3-E2F-d24-IL-2在内的其他组相比，Ad5/3-E2F-d24-vIL2显著降低了肿瘤的生长。当肿瘤不再可见时，认为仓鼠被治愈。归一化的中位肿瘤体积和SEM。***，P<0.001；*，P<0.05。(F)到第30天被治愈肿瘤的百分比。(G)总体存活率和统计学显著性。

图8：用携带细胞因子的腺病毒治疗后肿瘤特异性免疫记忆的诱导：用(A)HapT1(相同的肿瘤)和用(B)DDT1-MF2(不同的肿瘤)再次攻击治愈了HapT1肿瘤的全部仓鼠，植入仓鼠的上背部。用携带细胞因子的腺病毒的先前治疗似乎降低了再次攻击后HapT1细胞的生长。最重要的是，在HapT1再次攻击之后，携带vIL-2的腺病毒能够在40％(5只中有2只)的动物中诱导完全肿瘤排斥。

图9.IL-2变体病毒治疗在肿瘤微环境中实现了显著的肿瘤减少和CD4+和CD8+的中等浸润水平。用肿瘤内注射PBS(模拟者)或Ad5/3-E2F-d24或Ad5/3-E2F-d24-IL-2或Ad5/3-E2F-d24-vIL-2治疗带有HapT1的仓鼠4次。在第16天(4次治疗后)从仓鼠中收集肿瘤用于通过流式细胞术检测免疫细胞。(A)第0天和第16天的肿瘤体积。(B)CD4+细胞的频率，(C)CD8+细胞的频率。数据表示为平均值+SEM。*p<0.05

图10.IL-2变体病毒治疗在肿瘤微环境中获得了高水平的IL-2。在第16天(4次治疗后)从仓鼠中收集肿瘤用于通过RT-qPCR进行相对mRNA定量。仓鼠IL-2(下部的棒)、人IL-2和IL-2变体(上部的棒)的瘤内相对mRNA表达水平。数据表示为平均值+SEM。*p<0.05，****p<0.0001

图11.经病毒治疗的动物的总mRNA表达谱。在第16天从仓鼠中收集肿瘤，并通过Nanostring确定mRNA表达谱。(A)Ad5/3-E2F-d24的mRNA表达谱，(B)Ad5/3-E2F-d24-IL-2的mRNA表达谱(C)Ad5/3-E2F-d24-IL-2变体的mRNA表达谱。显示了与参比组(-1>log2倍数变化>1)相比在统计学上表达显著不同(调整后的p值<0.05)的基因的名称。

图12.用编码野生型人IL-2或IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗的肿瘤中T细胞受体信号传导和细胞毒性化合物的mRNA表达水平。在第16天从仓鼠中收集肿瘤，并通过Nanostring确定mRNA表达水平。(A)与T细胞受体(TCR)复合物和信号传导有关的基因的mRNA计数，(B)与细胞毒性化合物有关的基因的mRNA计数，(C)IL-2变体mRNA相对表达与GZMK或SAP1mRNA计数之间的皮尔逊相关性(Pearson’s correlation)，或后两个基因GZMK与SAP1 mRNA计数之间的皮尔逊相关性。数据表示为与参比组(模拟者)有统计学上差异的基因的平均值+SEM。ns–不显著

图13.用编码人IL-2或IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗的肿瘤中抗炎性和促炎性信号基因的mRNA表达水平。在第16天从仓鼠中收集肿瘤，并通过Nanostring确定mRNA表达水平。(A)与共刺激分子和共抑制分子有关的基因的mRNA计数。(B)与抗原呈递细胞和抑制性骨髓细胞有关的基因的mRNA计数。(C)与抗炎性和促炎性信号相关的信号有关的基因的mRNA计数。数据表示为与参比组(模拟者)有统计学上差异的基因的平均值+SEM。*p<0.05,**p<0.01

具体实施方式

白介素2(IL-2)及其变体

如本文所用，“IL-2”意指野生型IL-2，无论是天然的还是重组的。成熟的人IL-2以133个氨基酸序列存在(无信号肽，由额外的20个N端氨基酸组成)。人IL-2的氨基酸序列(SEQIDNO:1)可在Genbank中以登录号NP000577.2找到。成熟的人IL-2的氨基酸序列如SEQID No:2所示。

如本文所用，“IL-2变体”、“变体IL-2”、“vIL2”或“vIL-2”意指多肽或编码所述多肽的核酸(即基因)，其中已对白介素-2多肽进行了特定置换。术语“多肽”在本文中是指任何氨基酸残基链，无论其长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)为何。IL-2变体多肽的特征还可以在于在天然IL-2多肽链的其他残基中或其他残基处的一个或多个位点处的氨基酸插入、缺失、置换和修饰。根据本公开，任何此类插入、缺失、置换和修饰都会产生IL-2变体，该IL-2变体优选地表现出与受体亚基IL-2α的结合减少，但保留或提高IL-2Rβ结合活性。示例性变体可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸置换。变体还可以包括在IL-2其他位置处的保守性修饰和置换(即，对变体的活性或者二级或三级结构具有最小影响的那些)。

示例性IL-2变体多肽包括与SEQ ID NO:2具有至少约80％同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列与IL-2Rα结合的亲和力低于SEQ ID NO:2所示的多肽与IL-2Rα结合的亲和力。示例性IL-2变体多肽可以与野生型IL-2具有至少约50％、至少约65％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约87％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的同一性。变体多肽可以包括氨基酸残基的数量或内容的变化。例如，IL-2变体可以具有比野生型IL-2更多或更少数量的氨基酸残基。可替代地或另外，示例性变体多肽可以包含存在于野生型IL-2中的一个或更多个氨基酸残基的置换。在各种实施方式中，IL-2变体多肽与野生型IL-2的不同之处可以在于单个氨基酸残基的添加、缺失或置换，例如SEQ ID NO：2的第80位处残基的置换。类似地，示例性变体多肽与野生型的不同之处可以在于两个或更多个氨基酸残基，例如，SEQ ID NO:2的第24、45、65、72、74、80、81、85、86、89、92、93、109和117位处的残基的置换。例如，突变可以选自由以下项组成的组：I24V、Y45AP65H、L72G、Q74R、Q74H、Q74N、Q74S、L80F、L80V、R81I、R81T、R81D、L85V、I86V、I89V、I92F、V93I、D109L、F117A。优选地，该变体多肽包括置换L80F、R81D、L85V、I86V和I92F。

在另一实施方式中，还可以将IL-2变体多肽制备为包括IL-2变体多肽和另一种异源多肽的融合多肽或嵌合多肽。可以生成包括IL-2变体和抗体或其抗原结合部分的嵌合多肽。嵌合蛋白的抗体或抗原结合组分可以用作靶向部分。例如，它可以用于将嵌合蛋白定位到特定的细胞亚群(subset)或靶分子。

本发明特别地涉及溶瘤病毒载体的设计，该溶瘤病毒载体包括编码作为转基因的任意上述IL-2变体多肽的核酸序列。

病毒载体

溶瘤病毒载体是在治疗上有用的抗癌病毒，其可以选择性地感染和破坏癌症细胞。大多数当前的溶瘤病毒都针对肿瘤选择性进行了适应或工程化，尽管有些病毒诸如呼肠孤病毒和腮腺炎病毒对癌症细胞具有天然的偏好。许多经工程化的溶瘤病毒载体利用肿瘤特异性启动子元件，使它们只在癌症细胞中具有复制能力。癌症细胞选择性表达的表面标志物也可以通过将它们用作用于病毒进入的受体来靶向。现在已将许多病毒包括腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹、单纯疱疹病毒、新城疫病毒和牛痘作为溶瘤剂进行了临床测试。

优选地，在本发明中使用的溶瘤载体是适用于治疗人或动物的腺病毒载体。如本文所用，“溶瘤腺病毒载体”是指能够通过相对于正常细胞而言在肿瘤细胞中的选择性复制来感染并杀伤癌症细胞的腺病毒载体。

在本发明的一种实施方式中，腺病毒载体是人病毒的载体。在一种实施方式中，腺病毒载体选自由Ad5、Ad3和Ad5/3载体组成的组。如本文所用，表达“腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架”是指Ad5的基因组。类似地，“腺病毒血清型3(Ad3)核酸骨架”是指Ad3的基因组。“Ad5/3载体”是指包括或具有Ad5和Ad3载体两者的部分的嵌合载体。在特定的实施方式中，腺病毒载体的骨架是具有特定突变的腺病毒血清型5(Ad5)或血清型3(Ad3)核酸骨架。例如，可以修饰载体的纤突区域。在一种实施方式中，骨架是进一步包括Ad3纤突头节(纤突顶球)的Ad5核酸骨架。换言之，构建体具有来自Ad3的纤突头节，而基因组的其余部分或其余部分的大部分来自Ad5(参见，例如，WO2014170389)。

可以以本领域中已知的任何方式，例如，通过缺失、插入、突变或修饰任何病毒区域来修饰腺病毒载体。使载体在复制方面具有肿瘤特异性。例如，腺病毒载体可以包括E1、E3和/或E4中的修饰，诸如插入肿瘤特异性启动子(例如，以驱动E1)、缺失区域(例如，用于“Δ24”的E1恒定区2、E3/gp19k、E3/6.7k)以及插入一个或多个转基因。

在特定的实施方式中，通常已知支持腺病毒载体复制的E1B 19K基因(SEQ ID NO：3)在本载体中具有失能缺失dE1B 19K(SEQ ID NO：4)。已知缺失E1B19K使癌症细胞对TNFα敏感，并且因此它会促进细胞凋亡(White et al.,1992)。

野生型E1B19K基因的序列如下(可缺失区带下划线)：

atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgctggaacagagctctaacagta cctcttggtt ttggaggttt ctgtggggct catcccaggc aaagttagtc tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact ttggattttt ccacaccggggcgcgctgcg gctgctgttg cttttttgag ttttataaag gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagcggggggtacc tgctggattt tctggccatg catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgctactgttgtc ttccgtccgc ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg aggaagccaggcggcggcgg caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc ctcgggaatg a (SEQ IDNO:3)

因此，在实施方式中，本发明病毒载体中dE1B 19K的序列是

atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagctgggtcaccagg cgcttttcca agagaaggtc atcaagactt tggatttttc cacaccgggg cgcgctgcggctgctgttgc ttttttgagt tttataaagg ataaatggag cgaagaaacc catctgagcg gggggtacctgctggatttt ctggccatgc atctgtggag agcggttgtg agacacaaga atcgcctgct actgttgtcttccgtccgcc cggcgataat accgacggag gagcagcagc agcagcagga ggaagccagg cggcggcggcaggagcagag cccatggaac ccgagagccg gcctggaccc tcgggaatga (SEQ ID NO:4)

一种用于生成肿瘤特异性溶瘤腺病毒的方法是工程化影响E1的恒定区2(CR2)的24个碱基对(bp)缺失(“Δ24”或“d24”)。在野生型中，腺病毒CR2负责结合细胞Rb肿瘤阻抑/细胞周期调节蛋白以诱导合成(S)阶段，即DNA合成或复制阶段。pRb和E1A之间的相互作用需要E1A蛋白保守区的第121至127位氨基酸。根据Heise C.et al.(2000,Nature Med 6,1134-1139)和Fueyo J.et al.(2000,Oncogene 19(1):2-12)，该载体可以包括对应于载体的第122至129位氨基酸的核苷酸缺失。已知具有Δ24的病毒克服G1-S检查点的能力降低，并且只在这种相互作用不必要的细胞例如Rb-p16途径有缺陷的肿瘤细胞中有效复制，其包括即使不是全部也是大部分的人肿瘤。在本发明的一种实施方式中，载体在腺病毒E1的Rb结合恒定区2中包括24bp缺失(“Δ24”或“d24”)(参见图5)。

也可以例如通过肿瘤特异性启动子取代E1A内源性病毒启动子。例如，E2F1(例如，在基于Ad5的载体中)或hTERT(例如，在基于Ad3的载体中)启动子可以用于E1A内源性病毒启动子的位置处。该载体可以包括用于E1A的肿瘤特异性表达的E2F1启动子。

E3区不是离体病毒复制所必需的，但E3蛋白在调节宿主免疫应答(即抑制先天和特异性免疫应答两者)中具有重要作用。在本发明的一种实施方式中，在溶瘤腺病毒载体的E3区中核酸序列的缺失是病毒gp19k和6.7k阅读框的缺失。E3中的gp19k/6.7K缺失是指从腺病毒E3A区缺失965个碱基对。在所得腺病毒构建体中，gp19k和6.7K基因两者都缺失(Kanerva A et al.2005,Gene Therapy 12,87-94)。已知gp19k基因产物结合和隔离内质网中的主要组织相容性复合体I(MHC1，在人中称为HLA1)分子，并防止细胞毒性T淋巴细胞识别受感染的细胞。由于许多肿瘤缺乏HLA1/MHC1，gp19k的缺失增加了病毒的肿瘤选择性(病毒比野生型病毒从正常细胞中清除得更快，但在肿瘤细胞中没有差异)。6.7K蛋白在细胞表面表达，并且它们参与下调TNF有关的凋亡诱导配体(TRAIL)受体2。

在本发明的一种实施方式中，将转基因，即编码白介素2变体(vIL2)的基因，置于在E3启动子下的gp19k/6.7k缺失的E3区中。这将转基因表达限制在允许病毒复制及随后激活E3启动子的肿瘤细胞中。在特定的实施方式中，将编码白介素2变体的核酸序列插入缺失核酸序列病毒gp19k和6.7k阅读框的位置。在本发明的另一实施方式中，E3 gp19k/6.7k保留在载体中，但一个或多个其他E3区域已缺失(例如E3 9-kDa、E3 10.2kDa、E3 15.2kDa和/或E3 15.3kDa)。

E3启动子可以是本领域中已知的任何外源性启动子(例如，CMV或E2F启动子)或内源性启动子，尤其是内源性E3启动子。虽然E3启动子主要通过复制活化，但一些表达在E1表达时发生。由于Δ24型病毒的选择性发生在E1表达之后(当E1无法结合Rb时)，这些病毒确实也在转导的正常细胞中表达E1。因此，同样调节E1表达以将E3启动子介导的转基因表达限制在肿瘤细胞是至关重要的。

本发明的特定实施方式包括溶瘤腺病毒载体(例如Ad5或Ad3载体)，其复制通过双重选择性手段限制在p16/Rb途径：将E2F(例如E2F1)肿瘤特异性启动子置于腺病毒E1A基因之前，腺病毒E1A基因在恒定区2中已有突变，使得所得E1A蛋白无法在细胞中与Rb结合。此外，通过5/3嵌合对纤突进行修饰以使得有效地进入肿瘤细胞中。

在本发明的特定实施方式中，溶瘤腺病毒载体包括：

1)腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp缺失(Δ24)；

2)病毒gp19k和6.7k阅读框的核酸序列缺失；和

3)编码白介素2变体(vIL2)转基因的核酸序列在第2)点中定义的缺失的核酸序列的位置处。

在下文的实验部分中，我们构建并表征了基于Ad5/3-E2F-d24骨架并使其携带vIL2的溶瘤腺病毒。该病毒在E1A恒定区2中具有E2F启动子和24个碱基对缺失(“D24”)，使其只在视网膜母细胞瘤/p16途径缺陷型细胞中复制，视网膜母细胞瘤/p16途径缺陷型细胞是所有癌症细胞的共同特征之一。缺失E1B区以诱导癌症细胞凋亡(dE1B19K)。此外，为了提高其转导癌症细胞的能力并增强其抗肿瘤功效，该病毒的特征在于纤突头节来自血清型3，而基因组的其余部分来自血清型5。最重要的是，Ad5/3病毒在人中具有良好的安全性。优选地，将携带vIL-2的溶瘤病毒与伴随的T细胞疗法或检查点抑制剂一起使用，作为安全有效地治疗目前无法治愈的实体瘤的潜在平台。尤其，优选地治疗其中Treg起到重要作用的肿瘤类型。

在实施方式中，本发明涉及溶瘤病毒载体，优选溶瘤腺病毒载体，其包括编码白介素2变体(vIL2)转基因的核酸序列。

在优选的实施方式中，溶瘤腺病毒载体的骨架是腺病毒血清型5(Ad5)或血清型3(Ad3)核酸骨架。

在更优选的实施方式中，所述编码白介素2变体(vIL2)转基因的核酸序列在所述溶瘤腺病毒载体的E3区中缺失的核酸序列的位置处。更优选地，E3区中核酸序列的缺失是病毒gp19k和6.7k阅读框的缺失。

在另一优选的实施方式中，载体还包括在所述溶瘤腺病毒载体的腺病毒E1序列中的24bp缺失(Δ24)。

在另一优选的实施方式中，该载体还包括E1B((dE1B 19K)的失能缺失。

在另一优选的实施方式中，该载体还包括Ad5/3纤突头节。

在另一优选的实施方式中，该载体包括编码另外的转基因的核酸序列。更优选地，另外的转基因编码细胞因子。在实施方式中，细胞因子选自由以下项组成的列表：TNFα、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5(＝RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7以及XCL2。

在更优选的实施方式中，细胞因子是TNFα。

在本发明中使用的病毒载体还可以包括除上述之外的其他修饰。可以任选地使用任何额外的组分或修饰，但这些额外的组分或修饰对于本发明而言不是必须的。

外源性元件的插入可以增强载体在靶细胞中的作用。外源性组织或肿瘤特异性启动子的使用在重组载体中是常见的，并且它们也可以用于本发明中。

过继细胞疗法

本发明的一种方法是使用能够与癌症反应并破坏癌症的免疫淋巴细胞的转移来开发用于癌症患者的治疗。在培养物中大量生长分离的肿瘤浸润性淋巴细胞被并输注入患者内。在本发明中，编码白介素2变体(vIL2)转基因的溶瘤载体可以用于提高淋巴细胞的作用。如本文所用，“提高过继细胞疗法的功效”是指以下的情况，其中，与单独的过继细胞治疗组合物的治疗作用相比，当本发明的溶瘤载体连同过继细胞治疗组合物一起使用时，本发明的溶瘤载体能够在受试者中引起更强的治疗作用。本发明的特定实施方式是治疗受试者的癌症的方法，其中，该方法包括向受试者施用本发明的溶瘤载体，所述方法进一步包括向受试者施用过继细胞治疗组合物。本发明的过继细胞治疗组合物和载体分开施用。过继细胞治疗组合物和腺病毒载体的分开施用可以在清髓(myeloablating)或非清髓预处理化学疗法和/或放射之后进行。过继细胞疗法治疗旨在降低或消除患者中的癌症。

本发明的特定实施方式涉及使用腺病毒载体和过继细胞治疗组合物例如肿瘤浸润性淋巴细胞、TCR修饰的淋巴细胞或CAR修饰的淋巴细胞的疗法。在本发明中可以使用尤其是T细胞疗法，而且还有任何其他过继疗法，诸如NK细胞疗法或其他细胞疗法。实际上，根据本发明，过继细胞治疗组合物可以包括未经修饰的细胞诸如TIL疗法中的未经修饰的细胞或经遗传修饰的细胞。有两种常见的方法可以实现T细胞对肿瘤特异性靶标的基因靶向。一种是转移具有已知特异性和具有匹配的人白细胞抗原(HLA，在啮齿动物中称为主要组织相容性复合体)类型的T细胞受体(TCR)。另一种是用人工分子诸如嵌合抗原受体(CAR)修饰细胞。这种方法不依赖于HLA，并且在靶向分子方面更灵活。例如，可以使用单链抗体，并且CAR也可以纳入共刺激结构域。然而，CAR细胞的靶标需要在靶细胞的膜上，而TCR修饰可以利用细胞内的靶标。

如本文所用，“过继细胞治疗组合物”是指包括适用于过继细胞转移的细胞的任何组合物。在本发明的一种实施方式中，过继细胞治疗组合物包括选自由以下项组成的组的细胞类型：肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、TCR(即，异源性T细胞受体)修饰的淋巴细胞和CAR(即，嵌合抗原受体)修饰的淋巴细胞。在本发明的另一实施方式中，过继细胞治疗组合物包括选自由以下项组成的组的细胞类型：T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK-细胞、树突细胞、δ-γT细胞、调节性T细胞和外周血单核细胞。在另一种实施方式中，TIL、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞、NK-细胞、δ-γT细胞、调节性T细胞或外周血单核细胞形成过继细胞治疗组合物。在本发明的一种特定实施方式中，过继细胞治疗组合物包括T细胞。如本文所用，“肿瘤浸润性淋巴细胞”或TIL是指已离开血流并迁移到肿瘤中的白细胞。可以将淋巴细胞分为三组，包括B细胞、T细胞和自然杀伤细胞。在本发明的另一特定实施方式中，过继细胞治疗组合物包括已用靶标特异性嵌合抗原受体或特异性地选择的T细胞受体修饰的T细胞。如本文所用，“T细胞”是指CD3+细胞，包括CD4+辅助细胞、CD8+细胞毒性T细胞和γδT细胞。

除了合适的细胞，在本发明中使用的过继细胞治疗组合物可以包括任何其他剂，诸如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、抗菌剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂，和/或通常见于相应产品中的任何组分。选择用于配制组合物的合适的成分和适当的制造方法属于本领域技术人员的常识。

过继细胞治疗组合物可以是适用于施用的任何形式，诸如固体、半固体或液体形式。制剂可以选自由以下项组成的组，但不限于溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。组合物不限于某一制剂；作为替代的，可以将该组合物配制成任何已知的药学上可接受的制剂。该药物组合物可以通过本领域中已知的任何常规过程来生产。

本发明的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物的组合是指将溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物一起使用但作为分开的组合物使用。本领域技术人员清楚本发明的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物不作为一种组合物使用。事实上，腺病毒载体不用于修饰过继细胞，而是用于修饰靶肿瘤，使得肿瘤更易于经受细胞移植物的期望作用。尤其，本发明增强过继移植物对肿瘤的募集，并提高其活性。在本发明的特定实施方式中，组合的溶瘤腺病毒载体和过继细胞治疗组合物用于同时或以任何顺序依次向受试者施用。

检查点抑制剂

免疫检查点蛋白与特定的配体相互作用，向T细胞发送抑制T细胞功能的信号。癌症细胞通过驱动其表面的检查点蛋白的高水平表达来利用这一点，从而抑制抗癌免疫应答。

如本文所述的检查点抑制剂(也称为CPI)是能够抑制免疫检查点蛋白功能的任何化合物。抑制包括功能降低和完全阻断。尤其，免疫检查点蛋白是人检查点蛋白。因此，免疫检查点抑制剂优选地为人免疫检查点的抑制剂。

检查点蛋白包括但不限于CTLA-4、PD-1(及其配体PD-L1和PD-L2)、B7-H3、B7-H4、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT和/或IDO。涉及LAG3、BTLA、B7-H3、B7-H4、TIM3和KIR的途径在本领域中被公认为构成与CTLA-4和PD-1依赖途径相似的免疫检查点途径。免疫检查点抑制剂可以是CTLA-4、PD-1(及其配体PD-L1和PD-L2)、B7-H3、B7-H4、HVEM、TIM3、GAL9、LAG3、VISTA、KIR、BTLA、TIGIT和/或IDO的抑制剂。在一些实施方式中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂。优选地，免疫检查点抑制剂是选择性地与PD-L1结合的单克隆抗体，更优选地选自由以下项组成的组：BMS-936559、LY3300054、阿替利珠单抗(atezolizumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)和阿维鲁单抗(avelumab)。

在一些实施方式中，该组合的检查点抑制剂是抗体。如本文所用，术语“抗体”涵括天然存在和工程抗体以及能够结合例如靶免疫检查点或表位(例如保留抗原结合部分)的全长抗体或者其功能片段或类似物。根据本文所述的方法使用的抗体可以来自任何来源，包括但不限于人、人源化的、动物或嵌合的，并且可以是任何同种型，优选IgG1或IgG4同种型，并且另外可以是糖基化的或非糖基化的。术语抗体还包括双特异性或多特异性抗体，只要一种或多种抗体表现出本文所述的结合特异性即可。

癌症

本发明的重组载体在肿瘤细胞中复制。在本发明的一种实施方式中，载体能够在Rb-途径、特别是Rb-p16途径中具有缺陷的细胞中复制。这些缺陷细胞包括动物和人中的全部肿瘤细胞。如本文所用，“Rb途径中的缺陷”是指该途径的任何基因或蛋白中的突变和/或表观遗传变化。由于这些缺陷，肿瘤细胞过表达E2F，并且因此，通常为有效复制所需的E1ACR2与Rb的结合是不必要的。进一步的选择性由E2F启动子介导，该启动子仅在存在游离的E2F的情况下活化，如在Rb/p16途径缺陷型细胞中所见的那样。在不存在游离的E2F下，不会发生E1A的转录，并且病毒也不复制。包括E2F启动子对于防止E1A在正常组织中的表达是重要的，E1A在正常组织中表达可以通过允许E3启动子的转基因表达而直接和间接地引起毒性。

本发明涉及在受试者中治疗癌症的方法。在本发明的一种实施方式中，受试者是人或哺乳动物，特别是哺乳动物或人患者，更特别是患有癌症的人或哺乳动物。

该方法可以用于治疗任何癌症或肿瘤，包括恶性和良性肿瘤两者，原发性肿瘤和转移两者都可以是该方法的靶标。在本发明的一种实施方式中，癌症以肿瘤浸润性淋巴细胞为特征。本发明的工具对于以肿瘤浸润性淋巴细胞为特征的转移性实体瘤的治疗特别有吸引力。在另一实施方式中，T细胞移植已被肿瘤或嵌合抗原受体的组织特异性T细胞受体修饰。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指向受试者，优选哺乳动物或人受试者施用至少溶瘤腺病毒载体，其目的不仅包括完全治愈而且还包括预防、改善或减轻与癌症或肿瘤有关的疾患或症状。可以通过监测患者的症状、血液中的肿瘤标志物或例如肿瘤的大小或患者的存活时间来评估治疗作用。

在本发明的另一实施方式中，癌症或肿瘤选自由以下项组成的组：鼻咽癌症、滑膜癌症、肝细胞癌症、肾癌症、结缔组织癌症、黑素瘤、肺癌症、肠癌症、结肠癌症、直肠癌症、结直肠癌症、脑癌症、喉癌症、口腔癌症、肝癌症、骨癌症、胰腺癌症、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、冯希佩尔-林道综合征(von Hippel-Lindau disease)、佐林格-埃利森综合征(Zollinger-Ellison syndrome)、肾上腺癌症、肛门癌症、胆管癌症、膀胱癌症、输尿管癌症、脑癌症、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌症、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌症、佩吉特病、宫颈癌症、食道癌症、胆囊癌症、头颈癌症、眼癌症、肾癌症、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、前列腺癌症、睾丸癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌症、皮肤癌症、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌症、内分泌胰腺癌症、胰高血糖素瘤、甲状旁腺癌症、阴茎癌症、垂体癌症、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌症、胃癌症、胸腺癌症、甲状腺癌症、滋养层细胞癌症(trophoblasticcancer)、水泡状胎块、子宫癌症、子宫内膜癌症、阴道癌症、外阴癌症、听神经瘤、蕈样肉芽肿病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌症、心脏癌症、唇癌症、脑膜癌症、口癌症、神经癌症、腭癌症、腮腺癌症、腹膜癌症、咽癌症、胸膜癌症、唾液腺癌症、舌癌症以及扁桃体癌症。优选地，所治疗的癌症或肿瘤选自由以下项组成的组：肾癌症、卵巢癌症、膀胱癌症、前列腺癌症、乳腺癌症、结直肠癌症、肺癌症(诸如小细胞肺癌、非小细胞肺癌)和鳞状非小细胞肺癌)、胃癌症、经典霍奇金淋巴瘤、间皮瘤和肝癌症。在更优选的实施方式中，癌症或肿瘤类型是头颈癌症，最优选人头颈癌症。

在将人或动物患者分类为适用于本发明的疗法之前，临床医生可以对患者进行检查。基于偏离正常并揭示肿瘤或癌症的结果，临床医生可以建议患者进行本发明的治疗。

药物组合物

本发明的药物组合物包括本发明的病毒载体的至少一种类型。优选地，本发明提供了包含(a)溶瘤病毒本身或与(b)过继细胞组合物或(c)检查点抑制剂组合的药物组合物。本发明还提供了所述药物组合，用于治疗癌症。此外，该组合物可以包括至少两种、三种或四种不同的载体。除了载体和过继细胞组合物或检查点抑制剂之外，药物组合物还可以包括其他治疗有效的剂、任何其他剂诸如药学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、防腐剂、抗菌剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂，和/或通常见于相应产品中的任何组分。选择用于配制组合物的合适的成分和适当的制造方法属于本领域技术人员的常识。

该药物组合物可以是适用于施用的任何形式，诸如固体、半固体或液体形式。制剂可以选自由以下项组成的组，但不限于溶液、乳剂、悬浮液、片剂、丸剂和胶囊。本发明的组合物不限于某一制剂，作为替代的，可以将组合物配制成任何已知的药学上可接受的制剂。该药物组合物可以通过本领域中已知的任何常规方法来生产。

本发明的药物试剂盒包括编码作为转基因的IL-2变体的溶瘤腺病毒载体和一种或更多种免疫检查点抑制剂。将编码作为转基因的IL-2变体的溶瘤腺病毒载体配制在第一制剂中并且将所述一种或更多种免疫检查点抑制剂配制在第二制剂中。替代地，本发明的药物试剂盒包括第一制剂中的编码作为转基因的IL-2变体的溶瘤腺病毒载体和第二制剂中的过继细胞组合物。在本发明的另一实施方式中，第一和第二制剂用于向受试者同时或以任何顺序依次施用。在另一实施方式中，所述试剂盒用于治疗癌症或肿瘤。

施用

可以向任何哺乳动物受试者施用本发明的载体或药物组合物。在本发明的特定实施方式中，受试者是人。哺乳动物可以选自由宠物、家畜和生产动物组成的组。

可以使用任何常规方法用于向受试者施用载体或组合物。施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤的位置、患者、合并症及其他因素。因此，组合中每种治疗剂的剂量和给药频率部分取决于特定治疗剂、所治疗的癌症的严重程度以及患者特征。优选地，剂量方案使递送给患者的每种治疗剂的量最大化，与可接受的副作用水平相一致。

载体的有效剂量至少取决于需要治疗的受试者、肿瘤类型和肿瘤的位置以及肿瘤的阶段。剂量可以例如为约1×10⁸个病毒颗粒(VP)至约1×10¹⁴VP，特别约5×10⁹VP至约1×10¹³VP，以及更特别约3×10⁹VP至约2×10¹²VP不等。在一种实施方式中，编码IL-2变体的溶瘤腺病毒载体以1×10¹⁰至1×10¹⁴个病毒颗粒的量施用。在本发明的另一实施方式中，剂量在约5x10¹⁰-5x10¹¹的范围内。

在本发明的一种实施方式中，溶瘤病毒的施用通过肿瘤内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内、结内或腹膜注射或口服施用进行。任何施用组合也是可以的。尽管局部注射，该方法仍可以产生全身功效。

在本发明的一种实施方式中，向受试者分开施用(a)编码作为转基因的IL-2变体的溶瘤腺病毒载体和(b)一种或多种免疫检查点抑制剂是同时或以任何顺序相继进行的。这意指(a)和(b)可以以单一单位剂型提供，以便一起服用或作为分开的实体(例如，在单独的容器中)同时或以一定的时间差施用。该时间差可以在1小时至2周之间，优选12小时至3天之间，更优选地长达24或48小时。在优选的实施方式中，腺病毒载体的首次施用是在检查点抑制剂的首次施用之前进行。另外，可以经由检查点抑制剂以外的其他施用方式来施用病毒。鉴于此，将病毒或检查点抑制剂经肿瘤内及经全身或口服施用可能是有利的。在特别优选的实施方式中，病毒是经肿瘤内施用，并且检查点抑制剂经静脉内施用。优选地，病毒和检查点抑制剂作为分开的化合物施用。也可以同时用这两种剂治疗。

在优选的实施方式中，检查点抑制剂以约2mg/kg至50mg/kg，更优选约2mg/kg至25mg/kg的量施用。

如本文所用，“分开施用”或“分开的”是指以下的情况，其中，(a)编码作为转基因的IL-2变体的溶瘤腺病毒载体和(b)一种或多种免疫检查点抑制剂是彼此不同的两种不同的产品或组合物。

除了本发明的疗法之外，还可以使用任何其他治疗或治疗组合。在特定的实施方式中，本发明的方法或用途进一步包括并行或依次施用放射疗法、化学疗法、抗血管生成剂或靶向疗法诸如烷化剂、核苷类似物、细胞骨架修饰剂、细胞生长抑制剂、单克隆抗体、激酶抑制剂或其他抗癌症药物或对受试者的干预(包括手术)。

如本文所用，术语“治疗”或“增加”以及以此为词干的词语不必然提示100％或完全的治疗或增加。而是，本领域普通技术人员认为具有不同程度的潜在益处或治疗作用。

对于本领域技术人员而言显而易见的是，随着技术的进步，可以以各种方式实现本发明的概念。本发明及其实施方式不限于上述实施例，而是可以在权利要求的范围内变化。

实验部分

材料和方法

细胞系

人肺腺癌A549、人黑素瘤SK-MEL-28和仓鼠平滑肌肉瘤DDT1-MF2细胞系维持在DMEM中，并且仓鼠胰腺癌症HapT1维持在RPMI中。DMEM或RPMI两者都补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺(全部均来自Sigma-Aldrich)。两种细胞系均在+37℃和5％CO₂下培养。

重组人细胞因子

在离体实验中，将重组人(rh)IL-2(Peprotech)和rh vIL-2(Adipogen)细胞因子以0.1-100U/mL的浓度用作阳性对照。

病毒和vIL-2转基因构建

本研究中使用的全部病毒都具有Ad5/3-E2F-d24的骨架。这个和Ad5/3-E2F-d24-IL-2的构建此前已有解释(Havunenetal.,2017)。

通过在IL-2序列的80L->F、81R->D、85L->V、86I->V和92I->F位置处进行五个点突变来构建vIL-2转基因。Ad5/3-E2F-d24-vIL-2病毒是用细菌人工染色体(BAC)重组策略生成的，该策略使用galk选择(Warming et al.,2005；Muck-Hausl et al.,2015)。通过同源重组将转基因vIL-2插入E3区。将PCR扩增的vIL-2电穿孔到包含BAC-Ad5/3-E2F-Δ24-GalK/amp的SW102细菌中，并利用脱氧葡萄糖选择来鉴定具有vIL-2转基因的阳性克隆。通过限制酶分析对序列进行验证。用PacI限制酶(ThermoScientific)从BAC释放病毒基因组，并用Lipofectamine2000试剂(Invitrogen)转染到A549细胞中。然后用氯化铯梯度离心纯化携带vIL-2的Ad5/3病毒两次。分别使用光密度和组织培养感染剂量(TCID50)测定来确定病毒颗粒(VP)浓度和感染单位。

在离体下，病毒的细胞因子表达

A549细胞用Ad5/3-E2F-d24-IL-2、Ad5/3-E2F-d24-vIL-2感染，或者不感染，持续48小时。收集上清液并过滤(Amicon ultra100K)，并且然后根据制造商的说明书用IL-2人ELISA试剂盒(Abcam)分析以确定病毒产生的细胞因子的量。

裂解效力测定

将10,000个A549细胞/孔铺板于在96孔板中的100ul的2％DMEM测定培养基中。用Ad5/3-E2F-d24、Ad5/3-E2F-d24-IL-2或Ad5/3-E2F-d24-vIL-2以0-1000VP/细胞来感染细胞，一式三份。3天后，根据制造商的说明书(细胞效价96Aqueous One Solution CellProliferation Assay，Promega，Madison，WI)用MTS细胞毒性测定法确定细胞生存力。

细胞增殖测定

外周血单核细胞(PBMC)获自健康供体，并使用Lymphoprep(StemCelltechnologies)通过密度梯度离心分离。用不同浓度(0.1U、1U、10U和100U)的rh vIL-2和rhIL-2温育PBMC三天，并通过流式细胞术分析CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和NK细胞。为了测量相对细胞扩增，我们将第3天的阳性细胞百分比与第0天的相应数字进行了比较。

T细胞分离和刺激

通过CD3+ T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从新鲜分离的PBMC中富集T细胞。用CD3/CD28珠粒(Invitrogen)以1:5珠粒/T细胞比率活化分选的T淋巴细胞，并且然后用(1)100U/mL的rh IL-2；(2)100U/mL的rh vIL-2，或(3)无任何细胞因子培养4天，但以完全培养基作为对照。分三组对这三种条件进行研究：在第一组中，仅活化的T细胞；在第二组中，除了活化的T细胞外，还有肿瘤细胞；以及在第三组中，活化的T细胞和具有无携带的病毒Ad5/3-E2F-d24的肿瘤细胞。在第2天更换细胞因子和一半的测定培养基。在第0、2和4天用SonySH800Z(Sony，日本，东京)通过流式细胞术分析细胞。

离体病毒感染后的免疫亚群分析

肿瘤细胞用以100VP/细胞的无携带的Ad5/3-E2F-d24、Ad5/3-E2F-d24-IL-2或Ad5/3-E2F-d24-vIL-2病毒感染，或者不感染。在感染后24小时，将从健康供体中分离的PBMC添加到受感染的癌症细胞上。将单独的PBMC用作模拟对照。用抗CD3、抗CD8、抗CD4、抗CD25、抗CD69、抗CD127和抗CD56对细胞进行免疫荧光染色，并在第0、3和6天通过BD AccuriC6流式细胞术进行分析。接下来，在类似的设置中对特定免疫细胞群(即T细胞和NK细胞)的作用进行了更详细的研究。

动物实验

为了研究治疗诱导的肿瘤变化，将每只动物2*10⁶个HapT1细胞经皮下植入5周龄具有免疫活性的叙利亚仓鼠的下背部。当平均肿瘤直径达到0.5cm时，将动物随机分成四组(n＝13)。以1*10⁹VP经瘤内施用病毒Ad5/3-E2F-d24、Ad5/3-E2F-d24-IL-2和Ad5/3-E2F-d24-vIL-2，以及模拟者只接受PBS。在第1、4、8和13天注射病毒。

在第16天对每组五只动物实施安乐死，并收集肿瘤和选定的器官以评价组织病理学特征和存在的免疫细胞亚群。监测其余动物的存活。从第18天开始，这些动物每5天后接受6轮额外的病毒治疗。直到第30天，在所有偶数日用数显卡尺测量肿瘤。终点标准包括20.0mm肿瘤大小限制和皮肤溃疡。

在160天的观察时期之后，用相同的HapT1肿瘤(2*10⁶个细胞/肿瘤)或用不同的肿瘤DDT-MF2(1.5*10⁵个细胞/肿瘤)再次攻击已治愈的动物的上背部。之前未暴露于任何癌症细胞或治疗的初始动物(n＝3)被包括为模拟组。跟踪肿瘤生长21天，直至DDT1-MF2肿瘤达到最大耐受直径。应当注意，由于存在可见的肿瘤(即用无携带的病毒未治愈肿瘤)，三分之二的Ad5/3-E2F-d24治疗动物未再次受到攻击。

组织病理学

对于病理学评价，在第16天从每组5只仓鼠中收集仓鼠器官，诸如肝脏、脾、肺、肾脏、心脏和肿瘤样品。收集的样品首先在10％福尔马林中固定，48小时后转移到70％乙醇中并包埋在石蜡中。对于显微镜评价，用苏木精和伊红对5μm厚的组织切片染色。病理学家评价了经染色组织样品的组织学变化。

统计学分析

采用SPSS版本25Statistics(IBM)使用线性混合模型与对数转换的肿瘤体积进行肿瘤生长评价。分别使用双向ANOVA和时序(Log-rank)(Mantel-Cox)检验来分析再次攻击和存活曲线的组变化。使用GraphPad Prism(版本8.0.0)来呈现个体和分组的肿瘤生长数据并绘制存活曲线。认为当p<0.05时，P值显著。

实施例1.在离体下，效应细胞在vIL-2存在下增殖比在常规IL-2存在下更多

我们将rh vIL-2和rhIL-2关于它们刺激免疫细胞(诸如CD8+T细胞、NK细胞和CD4+T细胞)的能力进行了比较。我们用以不同浓度(0.1–100U/ml)的重组人(rh)vIL-2或rhIL-2培养PBMC，或者在没有重组人(rh)vIL-2或rhIL-2下培养PBMC。3天后，rh vIL-2在诱导CD8+效应T细胞和NK细胞增殖方面比IL-2更有效，而CD4+T细胞(包括Treg)的水平在变体的情况下仍然较低(图1)。这些结果表明vIL-2对T细胞和NK细胞的作用优于常规的IL-2。应当注意，当活化的T细胞产生IL-2时，即使在vIL-2组中IL-2也会存在于培养物中。例如，这预计会削弱(缺乏)vIL-2对Treg的作用。

实施例2.rh vIL-2对不同T细胞亚群的作用为构建编码细胞因子的病毒提供了理论基础

为了研究在腺病毒的存在下rh vIL-2对T细胞的作用，我们用CD3/CD28珠粒分离T细胞并用100U/ml的rh vIL-2或rh IL-2活化它们4天，并及感染癌症细胞/不感染癌症细胞。在的癌症细胞存在和不存在下，IL-2和vIL-2对CD8/CD4细胞比率具有相似的作用(图2A和B)。然而，当癌症细胞被溶瘤病毒感染时，相对于CD4+细胞而言，vIL-2诱导CD8+CD27-CD62L-CD45RO+细胞的趋势占优势(图2C)。

获得性免疫的标志是记忆应答，这是抗原特异性淋巴细胞克隆扩增和分化持续一生的结果(Sallusto等，2004)。我们评价了在rh IL-2或rh vIL-2的存在下，感染或未感染癌症细胞的中央记忆T细胞(T cm；CD45RO+、CD62L+、CD27+)的百分比变化。Tcm介导反应性记忆应答并在抗原刺激后分化为效应细胞。在不存在癌症细胞下，我们未发现IL-2和vIL-2之间的CD8/CD4Tcm比率有任何差异(图3A)。在肿瘤细胞的存在下，我们首先在第2天观察到该比率下降，随后在第4天该比率增加。再次，vIL-2在Tcm群中诱导的CD8与CD4比率比常规的IL-2更高(图3B)。

除了Tcm，我们还在与Tcm细胞相同的条件下对效应记忆T细胞(Tem；CD45RO+、CD62L-、CD27+)进行了评价。Tem提供保护性记忆，并且特征在于即时的效应功能。如果不存在癌症细胞，我们没有观察到IL-2与vIL-2之间CD8/CD4 Tem比率的差异(图4A)。对于癌症细胞，IL-2和vIL-2在第4天诱导高比率的CD8/CD4 Tem(图4B)。当癌症细胞被感染时，我们在第4天观察到在rh vIL-2组中高CD8/CD4Tem比率的趋势(图4C)。总而言之，在rh IL-2和rh vIL-2对促炎性T细胞区室的作用中，我们未见到rhIL-2和rh vIL-2之间的显著差异。这些结果为我们构建携带vIL-2的溶瘤腺病毒提供了坚实的基础。

实施例3.在离体下，Ad5/3-E2F-d24-vIL-2病毒表达vIL-2并有效杀伤肿瘤细胞

腺病毒5/3的特征在于腺病毒血清型5的骨架和腺病毒血清型3的纤突头节，以增强肿瘤转导，因为其受体在晚期肿瘤中高表达(Wang et al.,2011)。为了将病毒复制限制于肿瘤细胞，在E1A基因的恒定区2中进行突变并进行引入异源肿瘤特异性E2F启动子。为了增强细胞凋亡，使得能够缺失E1B19K基因区域。将IL-2变体转基因置于E3启动子控制下的E3区域，以将表达与病毒复制联系起来(图5A)。转基因盒取代了gp19k和6.7k的开放阅读框。

为了研究所构建的病毒的溶瘤效力，使用人肺癌症A549细胞进行细胞毒性测定。Ad5/3-E2F-d24-IL-2和Ad5/3-E2F-d24-vIL-2之间的病毒细胞杀伤能力没有显著差异，因此表明vIL-2转基因的存在不降低病毒的溶瘤效力(图5B)。此外，感染了Ad5/3-E2F-d24-vIL-2的细胞能够分泌细胞因子(图5C)。

实施例4.在离体下，Ad5/3-E2F-d24-vIL-2刺激效应细胞但不刺激Treg

人癌症细胞A549用Ad5/3-E2F-d24、Ad5/3-E2F-d24-IL-2或Ad5/3-E2F-d24-vIL-2感染，或不感染。24h后，将癌症细胞与PBMC一起温育。在第3天和第6天，用Ad5/3-E2F-d24-vIL-2治疗的组中CD25+CD69+活化的效应T细胞的CD8/CD4比率比用表达常规的IL-2的病毒治疗的显著更高(图6A)。实际上，我们未见到对照病毒之间活化的效应T细胞的CD8/CD4比率有任何显著差异。因此，携带vIL-2的Ad5/3病毒是效应细胞的有效刺激剂。

为了研究对Treg的影响，我们对CD4+CD3+亲本群的CD25+CD127^低表达细胞进行了分析。Ad5/3-E2F-d24-vIL-2未如Ad5/3-E2F-d24-IL-2那样诱导Treg分化(图6B)。因此，病毒产生的vIL-2似乎保留了重组vIL-2的关键有吸引力的特征：相对于Treg，优先刺激效应细胞。

实施例5.携带IL-2变体的溶瘤腺病毒在仓鼠中显著增强抗肿瘤功效和存活

在有前景的离体结果之后，然后在具有免疫功能的叙利亚仓鼠中对携带IL-2变体的腺病毒进行了研究。由于人腺病毒能够在仓鼠中复制(与小鼠中不同)，并且一些人细胞因子(诸如人IL-2)在仓鼠中具有生物活性(Havunen et al.,2017；Gowen et al.,2008)，因此仓鼠是用于研究携带溶瘤腺病毒的最佳模型(Havunen et al.,2017)。

与模拟者相比，用携带骨架Ad5/3-E2F-d24或IL-2的病毒(Ad5/3-E2F-d24-IL-2)治疗的动物示出肿瘤控制趋势(差异不显著)。令人印象深刻的是，我们在用Ad5/3-E2F-d24-vIL-2治疗的组中获得了最佳的肿瘤控制，并且到第30天，与所有其他组相比，这一结果是统计学显著的。这强调了vIL-2作为抗肿瘤效应T细胞的刺激剂的效用，而对Treg没有非期望的免疫抑制作用。因此，Ad5/3-E2F-d24-vIL-2似乎是肿瘤微环境朝着与完全肿瘤根除相容的方向的有效调节剂。

为了研究该疗法的作用机制，我们在第1、4、8和13天用骨架Ad5/3-E2F-d24、Ad5/3-E2F-d24-IL-2、Ad5/3-E2F-d24-vIL-2或PBS治疗仓鼠。在第16天对仓鼠安乐死，收集肿瘤，通过流式细胞术和Nanostring评估深入分析肿瘤微环境。为了研究与治疗有关的变化，收集肿瘤和选定的器官进行组织病理学评价。病理学结果披露模拟者和经溶瘤腺病毒治疗组之间没有差异，因此，我们的病毒没有引起任何全身毒性作用。

存活数据示出，用骨架病毒治疗的组能够治愈一只仓鼠。此外，具有有稳定肿瘤的两只仓鼠存活到实验结束。Ad5/3-E2F-d24-IL-2治愈了三只仓鼠。Ad5/3-E2F-d24-vIL-2能够治愈60％的经治疗的仓鼠，并且这种差异相对于模拟者而言是显著的(图7)。

实施例6.用携带细胞因子的腺病毒治疗诱导肿瘤特异性免疫记忆

为了研究溶瘤病毒治疗是否已经诱导了肿瘤特异性免疫记忆，用相同的HapT1癌症细胞和用不同的DDT1-MF2癌症细胞对所有经治愈的仓鼠进行再次攻击。将两种癌症细胞都植入经治愈的仓鼠的上背部。在这个再次攻击实验中，每组的动物数量不同，因为不同的病毒已治愈了不同数量的仓鼠。在经初始或无携带的病毒治疗的动物中，HapT1(图8A)或DDT1-MF2(图8B)肿瘤再次攻击无阻碍。相比之下，此前用Ad5/3-E2F-d24-IL-2或Ad5/3-E2F-d24-vIL-2治愈HapT1似乎提供了针对HapT1再次攻击的保护。应当注意，用Ad5/3-E2F-d24-vIL-2治疗的40％的动物在再次攻击后仍然没有HapT1肿瘤。然而，DDT-MF2肿瘤在这些动物中正常生长，突显了由有携带的病毒诱导的表位特异性免疫记忆。这些发现与先前的数据一致，表明细胞因子诸如IL-2在建立全身性和肿瘤特异性抗肿瘤免疫中的重要性(Havunen et al.,2017)。

我们已经示出，携带IL-2变体的腺病毒Ad5/3-E2F-d24-vIL-2在免疫活性正常的叙利亚仓鼠中似乎是安全且有效的。Ad5/3-E2F-d24-vIL-2在肿瘤微环境中表现出强抗肿瘤功效和IL-2变体的表达。对人淋巴细胞的研究表明抗肿瘤免疫作用的诱导。具体而言，相对于抑制性Treg，vIL-2似乎优先活化效应T细胞。

实施例7.编码IL-2变体的溶瘤腺病毒以中度免疫细胞浸润和最高的IL-2肿瘤内表达诱导显著的肿瘤减少

细胞系

将仓鼠胰腺癌症HapT1维持在补充有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100mg/mL链霉素和2mM L-谷氨酰胺(全部均来自Sigma-Aldrich)的RPMI中。两种细胞系均在+37℃和5％CO₂下培养。

病毒和vIL-2转基因构建

本研究中使用的所有病毒都具有Ad5/3-E2F-d24的骨架。后者和Ad5/3-E2F-d24-IL-2的构建先前已在Havunen et al.,2017中进行了解释。通过在IL-2序列的80L->F、81R->D、85L->V、86I->V和92I->F位置处进行五个点突变来构建vIL-2转基因。Ad5/3-E2F-d24-vIL-2病毒是用细菌人工染色体(BAC)重组策略生成的，该策略使用galk选择(Warming etal.,2005；Muck-Hausl et al.,2015)。通过同源重组将转基因vIL-2插入E3区中。将PCR扩增的vIL-2电穿孔到包含BAC-Ad5/3-E2F-Δ24-GalK/amp的SW102细菌中，并利用脱氧葡萄糖选择来鉴定具有vIL-2转基因的阳性克隆。通过限制酶分析对序列进行验证。用PacI限制酶(Thermo Scientific)从BAC释放病毒基因组，并用Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen)转染到A549细胞中。然后用氯化铯梯度离心纯化携带vIL-2的Ad5/3病毒两次。分别使用光密度和组织培养感染剂量(TCID50)测定来确定病毒颗粒(VP)浓度和感染单位。

动物实验

为了研究治疗诱导的肿瘤变化，将每只动物2×10⁶个HapT1细胞经皮下植入5周龄具有免疫活性的叙利亚仓鼠的下背部。当平均肿瘤直径达到0.5cm时，将动物随机分成四组(n＝13)。以1×10⁹VP经瘤内施用病毒Ad5/3-E2F-d24、Ad5/3-E2F-d24-IL-2和Ad5/3-E2F-d24-vIL-2，以及模拟者只接受PBS。在第1、4、8和13天注射病毒。

在第16天对每组5只动物安乐死，并收集肿瘤以评价免疫学变化和mRNA表达水平。

流式细胞术

将在第16天收集的仓鼠肿瘤样品处理为单细胞悬浮液，并按照先前建立的方案(Havunen et al.,2017；Siurala et al.,2016)进一步分析。然后用针对CD8+(PE，12-0080-82)、CD4+(PE-Cyanine7,25-0041-82)和MHC II+细胞(FITC,11-5980-82)细胞的抗体对这些样品染色。按照此前所述(Havunen et al.,2017)，用多克隆抗体抗Asialo-GM1(Alexa Fluor-488,53-6507-80)对NK+细胞标记，并用抗Galectin(PE,12-5301-82)对巨噬细胞+细胞标记。在获得每个样本100.000个事件后，使用Sony SH800Z细胞仪(Sony，日本，东京)检测细胞荧光。使用FlowJo v.10.6.1(

NewJersey,USA)进行细胞数据处理和门控。

基因表达分析

将在第16天收获的动物肿瘤样品的片段保存在RNAlater(R0901；Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)中，并在-20℃储存直至进一步处理。然后按照制造商的说明书，使用RNAeasy Mini Kit(74104；QIAGEN,Hilden,Germany)纯化这些样品中的RNA。使用ThermoScientific NanoDrop^TM1000分光光度计(ThermoFisherScientific，Massachusetts，USA)测量最终RNA产率，并将样品的RNA浓度调整为20ng/μl。

逆转录酶(RT)-定量聚合酶链反应(qPCR)

使用Quantitect逆转录试剂盒(205313,QIAGEN,Hilden,Germany)，将从第16天的肿瘤中纯化的RNA用于合成cDNA，以用于病毒转基因表达的相对定量以及仓鼠IL-2相对表达。按照Santos et al.,2017之前所述进行逆转录实时PCR(RT-qPCR)。用针对人IL-2设计的引物和探针检测野生型IL-2病毒转基因。对于IL-2变体病毒转基因，使用针对人IL-2v设计的引物和探针。使用仓鼠GAPDH基因对仓鼠IL-2和病毒转基因进行归一化(Siurala etal.,2015)。

统计学分析

使用GraphPad Prism(版本8.0.0.)呈现肿瘤体积数据、相对和绝对mRNA表达水平。进行带有Welch校正的非配对t检验以评估不同治疗组之间的差异。计算Pearson相关系数以确定颗粒酶产生与SAP基因或IL-2变体转基因产生之间的相关性。认为当p<0.05时，P值显著。

结果

为了进一步了解由溶瘤腺病毒治疗诱导的生物学事件，我们在实验开始后的16天收集了肿瘤。对第0天和第16天的肿瘤体积的比较示出，用Ad5/3-E2F-D24治疗在控制仓鼠肿瘤的生长中具有最小的作用(图9A)。另一方面，编码人IL-2和IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗显著延迟了仓鼠胰腺肿瘤的肿瘤生长。考虑到第16天，该组表现出最低肿瘤负荷的趋势(图9A)，这种作用在经编码IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗的仓鼠中更为突出。

对免疫区室的进一步分析揭示，在经野生型人IL-2溶瘤腺病毒治疗的仓鼠中，肿瘤中CD4+和CD8+细胞的频率最高(图9B-C)。相比之下，来自经历IL-2变体病毒疗法的仓鼠的肿瘤具有这些细胞浸润的出人意料的中等水平(图9B-C)。考虑到在第16天没有观察到携带细胞因子的病毒之间肿瘤体积存在显著差异，这表明表达IL-2变体的病毒相对于野生型对应物诱导了质量上更好的抗肿瘤应答。

另外，野生型人IL-2的主要限制是其药代动力学(半衰期短)，并且，因此，其在靶病变处的积累最小(Arenas-Ramirez et al.,2015)。图10中的结果表明，上述问题可以用Ad5/3-E2F-D24-vIL-2溶瘤腺病毒消除。例如，在用野生型IL-2或IL-2变体溶瘤腺病毒治疗的仓鼠的肿瘤之间，可以观察到IL-2的产生存在显著差异(图10)。事实上，与所有其他组相比，Ad5/3-E2F-D24-vIL-2治疗组呈现出最高的整体细胞因子表达(宿主IL-2和IL-2变体转基因)。此外，即使在最后一次病毒治疗3天后，IL-2变体的水平也是高的(图10)。重要的是要注意，这些结果对于性质相似的蛋白而言是不可预见的，这是非常值得注意的，考虑到开发重组IL-2变体蛋白的努力，专注于改进安全性和肿瘤内相关高水平IL-2变体蛋白(Arenas-Ramirez et al.,2015)。

实施例8.编码IL-2变体的溶瘤腺病毒疗法引起免疫重构以提高效应T细胞功能和低免疫抑制

细胞系

病毒和vIL-2转基因构建

动物实验

基因表达分析

利用

数字分析仪(NanoString Technologies，西雅图，USA)对来自所有仓鼠肿瘤的RNA样品进行NanoString

基因表达分析。使用针对仓鼠细胞设计的定制面板评估基因表达，该面板包括通过nSolver软件4.0(NanoString Technologies，西雅图，USA)分析的101个基因。差异表达显示为火山图中每个基因的基因-log10(p值)和log2倍数变化的值。同样，在条形图中以RNA计数(Log2)显示差异表达。将治疗组中每个基因的表达水平归一化为对照(模拟)组中它们的相应的基因。

统计学分析

使用GraphPad Prism(版本8.0.0.)呈现绝对mRNA表达水平。进行带有Welch校正的非配对t检验以评估不同治疗组之间的差异。计算Pearson相关系数以确定颗粒酶产生与SAP基因或IL-2变体转基因产生之间的相关性。认为当p<0.05时，P值显著。

结果

通过评价经历病毒疗法的肿瘤的转录组来进行额外的表征。与Ad5/3-E2F-D24病毒治疗相比，用编码野生型IL-2或IL-2变体的溶瘤病毒治疗的肿瘤表现出看似相似数量的上调基因。在评价两组中的下调谱时，野生型IL-2具有的下调基因比IL-2变体组多大约34.5％(图11)。值得注意的是，与IL-2变体相比，野生型IL-2组对被上调或下调的几乎所有基因都显示出更高的值，这与文献中先前有关的IL-2强效生物学作用一致(图11)(Jianget al.,2016)。然而，在这里，升高的值并不必然意味着更好的总体反应，因为Ad5/3-E2F-D24-vIL-2病毒是促进肿瘤缩小和总体存活最成功的组。

然而，差异表达分析的详细视图表明，相对于免疫抑制相关基因，Ad5/3-E2F-D24-vIL-2病毒优先刺激与T细胞受体复合物及下游信号传导基因相关的已知基因的表达(图12和图13)。重要的是，用编码IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗来诱导TCR复合物基因(CD3E、CD3D)的最高表达(图12A)，这些基因在人中负责在MHC结合时容纳TCR并启动TCR诱导的信号传导(Ngoenkam et al.,2018)。此外，与编码野生型IL-2的病毒相比，编码IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗上调了已知的关键下游信号传导基因(LCK、ITK、ZAP70)(图12A)。出人意料的是，用编码IL-2变体的病毒治疗刺激了用于TCR表达、锚定和信号传导(CD3G、SAP)的一些关键基因的上调，而它们在野生型IL-2病毒组中的水平保持不变(图12A)。尽管在统计学上不显著，但这些数据表明，在用编码IL-2变体的溶瘤腺病毒治疗后，T细胞的TCR功能的活性出乎意料地增加，其据我们所知，这在现有技术中没有记载。事实上，只有IL-2变体病毒能够诱导颗粒酶和穿孔蛋白(GZMK、GZMM、PRF1)的高表达(图12B)。当由效应细胞毒性细胞(T细胞和自然杀伤细胞)分泌时，颗粒酶和穿孔蛋白诱导肿瘤细胞凋亡(Voskoboinik et al.,2015)。事实上，IL-2变体转基因mRNA相对表达与GZMK或SAP1基因mRNA计数两者之间的相关程度高且呈正相关，而在GZMK和SAP1基因之间可以看到额外的正相关(图12C)。特别地，从现有技术中不知道GranzymeK和GranzimeM的表达既不是由溶瘤腺病毒诱导的也不是由IL-2变体蛋白诱导的。

在用编码野生型IL-2的病毒治疗的肿瘤中观察到TIM-3和CTLA-4基因的最高表达(图13A)。通常已知这些基因抑制人的T细胞功能(Ngoenkam et al.,2018)，因此它们可以与增加的免疫抑制环境潜在地有关。另一个基因PD-L1在用IL-2变体病毒治疗后保持不变(图13A)。考虑到PD-L1在小鼠和人免疫抑制中的作用，这可能有助于属于经IL-2变体病毒治疗的动物的肿瘤中可能较低的免疫抑制。虽然在用编码野生型IL-2的病毒治疗的动物的肿瘤中观察到CD137(人肿瘤反应性TIL的活化标志物)的最高表达水平(图13A)，但它可能不足以对抗这些肿瘤中的免疫抑制。相比之下，在IL-2-变体病毒组中，CD27(共刺激标志物)的表达增加，而在野生型对应物中没有改变(图13A)。先前已在表达CD27的TIL中报道了更长的端粒，因此提示IL-2变体可能增加较少末端分化的TIL的存在。另一方面，已知CD27在记忆T细胞中高表达，而记忆T细胞被认为会产生多功能应答。这表明IL-2变体溶瘤病毒能够在肿瘤中产生更高质量的应答。

另一方面，野生型IL-2的病毒来源的分泌引起人和小鼠中已知抗原呈递细胞(CD80、CD86、CD40)的最高表达(图13B)。然而，出人意料的是，与其变体对应物相比，编码野生型IL-2的病毒治疗在仓鼠中的抗肿瘤功效较差。与野生型IL-2病毒相比，在编码IL-2变体的病毒中，免疫抑制细胞(诸如骨髓细胞)的存在和活性(CD11b、CD206、Arg1)也降低或未改变(图13B)。与普通技术相反，考虑到IL-2变体蛋白中的某些突变主要旨在防止不希望的靶向调节性T细胞而不是其他免疫抑制细胞，这种作用是出人意料的。

进一步的分析揭示了来自用野生型IL-2或IL-2变体-病毒疗法(图13C)治疗的仓鼠的肿瘤中IL-6、TGFb、IL-10(图13C)的基因表达总体降低。有趣的是，虽然前者引起CCL3、TNF、IL-1b(图13C)(在人和小鼠中编码促炎性细胞因子的基因)的表达增加，但经野生型IL-2病毒治疗的肿瘤仍然大于经IL-2变体病毒治疗的肿瘤。对此，可能解释是TNF在抗肿瘤免疫中的已知作用不明确，在慢性水平上，它可以促进人中肿瘤的发展。

总之，IL-2变体-病毒促进T细胞携带TCR、信号传导、降低T细胞抑制和来自骨髓细胞区室的免疫抑制的能力。与其他治疗组相比，这些作用可能有助于改进效应细胞的细胞毒性功能，从而使编码IL-2变体的溶瘤腺病毒疗法能够提供最佳的存活和抗肿瘤功效。

参考文献

Arenas-Ramirez,N.,Woytschak,J.&Boyman,O.Interleukin-2:Biology,Designand Application.Trends Immunol.36,763–777(2015).

Gowen BB,Judge JW,Wong MH,Jung KH,Aylsworth CF,Melby PC,Rosenberg B,Morrey JD:Immunoprophylaxis of Punta Toro virus(Phlebovirus,Bunyaviridae)infection in hamsters with recombinant Eimeria profilin-like antigen.IntImmunopharmacol 2008,8:1089-1094.

Havunen R,Siurala M,Sorsa S,Gronberg-Vaha-Koskela S,Behr M,TahtinenS,Santos JM,Karell P,Rusanen J,Nettelbeck DM,et al.:Oncolytic AdenovirusesArmed with Tumor Necrosis Factor Alpha and Interleukin-2 Enable SuccessfulAdoptive Cell Therapy.Mol Ther Oncolytics 2017,4:77-86.

Itzhaki O,Levy D,Zikich D,Treves AJ,Markel G,Schachter J,Besser MJ:Adoptive T-cell transfer in melanoma.Immunotherapy 2013,5:79-90.

Jiang,T.,Zhou,C.&Ren,S.Role of IL-2 in cancerimmunotherapy.Oncoimmunology5,e1163462–e1163462(2016).

Klein C,Waldhauer I,Nicolini VG,Freimoser-Grundschober A,Nayak T,Vugts DJ,Dunn C,Bolijn M,Benz J,Stihle M,Lang M,Roemmele M,Hofer T,vanPuijenbroek E,Wittig D,Moser S,Ast O,Brünker P,Gorr IH,Neumann S,Mudry MCV,Hinton H,CramericF,Saro J,Evers S,Gerdes C,Bacac M,van Dongen G,Moessner E&

P.(2017)Cergutuzumab amunaleukin(CEA-IL2v),a CEA-targeted IL-2variant-based immunocytokine for combination cancer immunotherapy:Overcominglimitations of aldesleukin and conventional IL-2-based immunocytokines,OncoImmunology,6:3,DOI:10.1080/2162402X.2016.1277306

Levin,Aron M.,Darren L.Bates,Aaron M.Ring,Carsten Krieg,Jack T.Lin,Leon Su,Ignacio Moraga,Miro E.Raeber,Gregory R.Bowman,Paul Novick,VijayS.Pande,C.Garrison Fathman,Onur Boyman and K.Christopher Garcia.Exploiting anatural conformational switch to engineer an interleukin-2‘superkine’.Naturevol.484,pages 529–533(2012).

Muck-Hausl M,Solanki M,Zhang W,Ruzsics Z,Ehrhardt A:Ad 2.0:a novelrecombineering platform for high-throughput generation of tailoredadenoviruses.Nucleic Acids Res 2015,43:e50.

Ngoenkam,J.,Schamel,W.W.&Pongcharoen,S.Selected signalling proteinsrecruited to the T-cell receptor-CD3 complex.Immunology153,42–50(2018).Sallusto F,Geginat J,Lanzavecchia A:Central memory and effector memory Tcell subsets:function,generation,and maintenance.Annu Rev Immunol 2004,22:745-763.

Santos,J.M.et al.Adenoviral production of interleukin-2 at the tumorsite removes the need for systemic postconditioning in adoptive celltherapy.Int.J.Cancer141,(2017).

Schwartz RN,Stover L,Dutcher JP:Managing toxicities of high-doseinterleukin-2.Oncology(Williston Park)2002,16:11-20.

Siurala,M.et al.Oncolytic adenovirus and doxorubicin-basedchemotherapy results in synergistic antitumor activity against soft-tissuesarcoma.Int.J.Cancer136,945–954(2015).

Siurala,M.et al.Syngeneic syrian hamster tumors feature tumor-infiltrating lymphocytes allowing adoptive cell therapy enhanced by oncolyticadenovirus in a replication permissive setting.Oncoimmunology5,e1136046–e1136046(2016).

Sockolosky JT,Trotta E,Parisi G,Picton L,Su LL,Le AC,Chhabra A,Silveria SL,George BM,King IC,Mr T,Jude K,Sibener LV,Baker D,Shizuru JA,RibasA,Bluestone JA,Garcia KC.(2018)Selective targeting of engineered T cellsusing orthogonal IL-2 cytokine-receptor complexes,Science,359(6379):1037,DOI:10.1126/science.aar3246.

S,Blattner C,Vaha-Koskela M,Saha D,Siurala M,Parviainen S,Utikal J,Kanerva A,Umansky V,Hemminki A:T-Cell Therapy Enabling AdenovirusesCoding for IL2 and TNFalpha Induce Systemic Immunomodulation in Mice WithSpontaneous Melanoma.J Immunother 2016,39:343-354.

Voskoboinik,I.,Whisstock,J.C.&Trapani,J.A.Perforin and granzymes:function,dysfunction and human pathology.Nat.Rev.Immunol.15,388–400(2015).

Wang H,Li ZY,Liu Y,Persson J,Beyer I,Moller T,Koyuncu D,Drescher MR,Strauss R,Zhang XB,et al.:Desmoglein 2is a receptor for adenovirusserotypes3,7,11and 14.Nat Med 2011,17:96-104.

Warming S,Costantino N,Court DL,Jenkins NA,Copeland NG:Simple andhighly efficient BAC recombineering using galK selection.Nucleic AcidsRes2005,33:e36.

White,E.,Sabbatini,P.,Debbas,M.,Wold,W.S.M.,Kusher,D.I.,and Gooding,L.(1992).The 19-kilodalton adenovirus E1B transforming protein inhibitsprogrammed cell death and prevents cytolysis by tumor necrosis factoralpha.Mol.Cell.Biol.1992；12:2570–2580.).

引用的公开专利：

US9428567

US2019062395

WO 2014170389

WO 2016146894。

序列表

<110> 蒂尔坦生物制药有限公司(TILT BIOTHERAPEUTICS OY)

<120> 编码白介素-2变体(vIL-2)多肽的溶瘤病毒载体

<130> PPI22170537FI

<150> FI20195876

<151> 2019-10-11

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 153

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210> 2

<211> 133

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 531

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 3

atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagagc 60

tctaacagta cctcttggtt ttggaggttt ctgtggggct catcccaggc aaagttagtc 120

tgcagaatta aggaggatta caagtgggaa tttgaagagc ttttgaaatc ctgtggtgag 180

ctgtttgatt ctttgaatct gggtcaccag gcgcttttcc aagagaaggt catcaagact 240

ttggattttt ccacaccggg gcgcgctgcg gctgctgttg cttttttgag ttttataaag 300

gataaatgga gcgaagaaac ccatctgagc ggggggtacc tgctggattt tctggccatg 360

catctgtgga gagcggttgt gagacacaag aatcgcctgc tactgttgtc ttccgtccgc 420

ccggcgataa taccgacgga ggagcagcag cagcagcagg aggaagccag gcggcggcgg 480

caggagcaga gcccatggaa cccgagagcc ggcctggacc ctcgggaatg a 531

<210> 4

<211> 390

<212> DNA

<213> 腺病毒

<400> 4

atggaggctt gggagtgttt ggaagatttt tctgctgtgc gtaacttgct ggaacagctg 60

ggtcaccagg cgcttttcca agagaaggtc atcaagactt tggatttttc cacaccgggg 120

cgcgctgcgg ctgctgttgc ttttttgagt tttataaagg ataaatggag cgaagaaacc 180

catctgagcg gggggtacct gctggatttt ctggccatgc atctgtggag agcggttgtg 240

agacacaaga atcgcctgct actgttgtct tccgtccgcc cggcgataat accgacggag 300

gagcagcagc agcagcagga ggaagccagg cggcggcggc aggagcagag cccatggaac 360

ccgagagccg gcctggaccc tcgggaatga 390

Claims

1.一种溶瘤腺病毒载体，所述溶瘤腺病毒载体包括编码作为转基因的白介素2变体(vIL-2)多肽的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的溶瘤病毒载体，其中，所述IL-2变体表现出与受体亚基IL-2Rα的结合降低但保留IL-2Rβ和IL-2Rγ结合活性或具有提高的IL-2Rβ和IL-2Rγ结合活性。

3.根据权利要求2所述的溶瘤载体，其中，所述溶瘤腺病毒载体的骨架是腺病毒血清型5(Ad5)或血清型3(Ad3)核酸骨架或具有腺病毒血清型3(Ad3)的纤突头节的腺病毒血清型5(Ad5)骨架。

4.根据权利要求2或3所述的溶瘤载体，其中，编码白介素2变体(vIL-2)多肽的所述核酸序列在所述溶瘤腺病毒载体的E3区中缺失的核酸序列的位置处。

5.根据权利要求4所述的溶瘤载体，其中，E3区中核酸序列的缺失是病毒gp19k和6.7k阅读框的缺失。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的溶瘤载体，其中，所述载体在所述溶瘤腺病毒载体的腺病毒E1序列中包括24bp缺失(Δ24)。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的溶瘤载体，其中，所述载体包括Ad5/3纤突头节。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的溶瘤载体，其中，所述载体包括Ad5/3-E2F-d24骨架。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的溶瘤载体，其中，所述载体具有结构Ad5/3-E2F-d24-vIL-2。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的溶瘤载体，其中，所述核酸序列编码IL-2变体多肽，所述IL-2变体多肽包括置换L80F、R81D、L85V、I86V和I92F，位置SEQ ID NO：2中所限定。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的溶瘤载体，其中，所述载体包括编码另外的转基因的核酸序列。

12.根据权利要求11所述的溶瘤载体，其中，所述另外的转基因编码细胞因子。

13.根据权利要求12所述的溶瘤载体，其中，所述细胞因子选自由以下项组成的列表：TNFα、干扰素α、干扰素β、干扰素γ、补体C5a、CD40L、IL12、IL-23、IL15、IL17、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14-1、CCL14-2、CCL14-3、CCL15-1、CCL15-2、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23-1、CCL23-2、CCL24、CCL25-1、CCL25-2、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL3L1、CCL4、CCL4L1、CCL5(＝RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCR10、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCRL1、CCRL2、CX3CL1、CX3CR、CXCL1、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7以及XCL2。

14.根据权利要求12所述的溶瘤载体，其中，所述细胞因子是TNFα。

15.一种药物组合物，所述药物组合物包括根据权利要求1至14中任一项所述的溶瘤腺病毒载体和以下中的至少一种：生理学上可接受的载体、缓冲剂、赋形剂、佐剂、添加剂、抗菌剂、防腐剂、填充剂、稳定剂和/或增稠剂。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的溶瘤腺病毒载体或根据权利要求15所述的药物组合物，用于治疗癌症或肿瘤，优选实体瘤的用途。

17.根据权利要求16所述的溶瘤载体或药物组合物，用于治疗癌症或肿瘤的用途，其中，所述癌症或肿瘤选自由以下项组成的组：鼻咽癌症、滑膜癌症、肝细胞癌症、肾癌症、结缔组织癌症、黑素瘤、肺癌症、肠癌症、结肠癌症、直肠癌症、结直肠癌症、脑癌症、喉癌症、口腔癌症、肝癌症、骨癌症、胰腺癌症、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、冯希佩尔-林道综合征、佐林格-埃利森综合征、肾上腺癌症、肛门癌症、胆管癌症、膀胱癌症、输尿管癌症、脑癌症、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌症、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌症、佩吉特病、宫颈癌症、食道癌症、胆囊癌症、头癌症、眼癌症、颈癌症、肾癌症、维尔姆斯瘤、卡波西氏肉瘤、前列腺癌症、睾丸癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌症、皮肤癌症、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌症、内分泌胰腺癌症、胰高血糖素瘤、胰腺癌症、甲状旁腺癌症、阴茎癌症、垂体癌症、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌症、胃癌症、胸腺癌症、甲状腺癌症、滋养细胞癌症、水泡状胎块、子宫癌症、子宫内膜癌症、阴道癌症、外阴癌症、听神经瘤、蕈样肉芽肿病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌症、心癌症、唇癌症、脑膜癌症、口癌症、神经癌症、腭癌症、腮腺癌症、腹膜癌症、咽癌症、胸膜癌症、唾液腺癌症、舌癌症以及扁桃体癌症。

18.根据权利要求16或17所述溶瘤载体或药物组合物与过继细胞治疗组合物一起用于治疗癌症的用途。

19.根据权利要求18所述溶瘤载体或药物组合物用于治疗癌症的用途，用于提高受试者中过继细胞疗法的功效。

20.根据权利要求16至19中任一项所述的溶瘤载体或药物组合物，与向受试者的放射疗法、单克隆抗体、化学疗法、小分子抑制剂、激素疗法或其他抗癌药物或干预一起用于治疗癌症的用途。

21.一种治疗受试者中癌症或肿瘤的方法，其中，向受试者施用药学有效量的根据权利要求1至14中任一项所述的溶瘤腺病毒载体或根据权利要求15所述的药物组合物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述癌症或肿瘤选自由以下项组成的组：鼻咽癌症、滑膜癌症、肝细胞癌症、肾癌症、结缔组织癌症、黑素瘤、肺癌症、肠癌症、结肠癌症、直肠癌症、结直肠癌症、脑癌症、喉癌症、口腔癌症、肝癌症、骨癌症、胰腺癌症、绒毛膜癌、胃泌素瘤、嗜铬细胞瘤、催乳素瘤、T细胞白血病/淋巴瘤、神经瘤、冯希佩尔-林道综合征、佐林格-埃利森综合征、肾上腺癌症、肛门癌症、胆管癌症、膀胱癌症、输尿管癌症、脑癌症、少突胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、脑膜瘤、脊髓肿瘤、骨癌症、骨软骨瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、原发部位不明的癌症、类癌、胃肠道类癌、纤维肉瘤、乳腺癌症、佩吉特病、宫颈癌症、食道癌症、胆囊癌症、头癌症、眼癌症、颈癌症、肾癌症、维尔姆斯瘤、卡波西氏肉瘤、前列腺癌症、肺癌症、睾丸癌症、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、口腔癌症、皮肤癌症、间皮瘤、多发性骨髓瘤、卵巢癌症、内分泌胰腺癌症、胰高血糖素瘤、甲状旁腺癌症、阴茎癌症、垂体癌症、软组织肉瘤、视网膜母细胞瘤、小肠癌症、胃癌症、胸腺癌症、甲状腺癌症、滋养层细胞癌症、水泡状胎块、子宫癌症、子宫内膜癌症、阴道癌症、外阴癌症、听神经瘤、蕈样肉芽肿病、胰岛素瘤、类癌综合征、生长抑素瘤、牙龈癌症、心癌症、唇癌症、脑膜癌症、口癌症、神经癌症、腭癌症、腮腺癌症、腹膜癌症、咽癌症、胸膜癌症、唾液腺癌症、舌癌症以及扁桃体癌症。

23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，所述载体连同过继细胞治疗组合物施用。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，向受试者施用过继细胞治疗组合物和溶瘤病毒载体是同时进行或以任何顺序相继进行的。

25.根据权利要求21至24中任一项所述的方法，进一步包括向受试者并行或依次施用放射疗法、单克隆抗体、化学疗法、小分子抑制剂、激素疗法、过继细胞疗法或其他抗癌药物或干预。

26.根据权利要求1至14中任一项所述的溶瘤载体在制备用于治疗癌症或肿瘤的药物中的用途。