WO2024186142A1 - 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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WO2024186142A1
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interleukin
cancer
analog
conjugate
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김진영
박준섭
최재혁
김유연
허용호
박다현
김민영
이아람
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한미약품 주식회사
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an interleukin 2 analogue or a combination thereof.
  • Interleukin 2 is an important immunostimulant with a molecular weight of approximately 15 kDa consisting of a total of 133 amino acid residues, which activates various cells of the immune system, including T cells and B cells.
  • the high efficacy of IL-2 as an immunostimulant can be used to treat various immune-related diseases, including cancer and AIDS (Korean Patent Publication No. 10-2017-0070091).
  • IL-2 (trade name Proleukin) is a drug approved by the FDA for the treatment of metastatic renal cell carcinoma and metastatic melanoma.
  • Toxicity associated with IL-2 includes vascular leak syndrome, which causes severe fever, nausea, vomiting, vascular leak, severe hypotension, pulmonary edema, and liver damage.
  • the subunits are composed of an alpha chain (IL-2R ⁇ , CD25), a beta chain (IL-2R ⁇ or CD122), and a gamma chain (IL-2R ⁇ or CD132), and interleukin 2 can exert various functions by binding to various combinations of receptor subunits.
  • the single interleukin 2 alpha receptor is called the low-affinity interleukin 2 receptor and is not involved in signal transduction.
  • the complex of interleukin 2 beta and gamma receptors binds to interleukin 2 with intermediate affinity.
  • the complex of interleukin 2 alpha, beta, and gamma receptors binds to interleukin 2 with high affinity.
  • interleukin 2 beta and gamma receptors The complex of interleukin 2 beta and gamma receptors is necessary for efficient signal transduction through kinase activation of multiple signal transduction pathways.
  • the interleukin 2 beta and gamma-coupled receptors are prominent on CD8+ cells and natural killer (NK) cells.
  • high-affinity interleukin 2 alpha, beta, and gamma receptor complexes are commonly found in CD4 + T regulatory cells (Tregs) as well as recently activated T cells.
  • Interleukin 2 beta receptors are distributed in CD8 + T cells or natural killer cells (NK cells) and are involved in the immune response in the body, so research is being conducted to develop therapeutic agents by increasing the activity of beta receptors for immune activation.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising a step of administering to a subject in need thereof an interleukin 2 analog, a long-acting conjugate thereof, or a composition comprising the same.
  • Another object of the present invention is to provide a use of the interleukin 2 analog, a sustained-release conjugate thereof, or a composition comprising the same for the prevention or treatment of cancer.
  • Another object of the present invention is to provide a use for providing a medicament for preventing or treating cancer, comprising the interleukin 2 analogue or a sustained-release conjugate thereof, or a composition comprising the same.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an interleukin 2 analog or a sustained-release complex thereof according to the present invention can be used as an excellent anticancer treatment agent by exhibiting a tumor growth inhibitory effect while reducing side effects.
  • Figure 1 shows the SDS-PAGE results of interleukin 2 analog long-acting conjugates (analogs 21, 41, and 52).
  • Figures 2a to 2c show the purity analysis results of interleukin 2 analog long-acting conjugates (analogs 21, 41, and 52).
  • Figure 3 shows the results of evaluating the antitumor efficacy of an interleukin 2 analog long-acting conjugate in an animal model of malignant melanoma.
  • A shows the tumor size of the model administered with aldesleukin and interleukin 2 analog 86 conjugate
  • B shows the results of confirming the survival rate of the model administered with aldesleukin and interleukin 2 analog 86 conjugate.
  • the dosage of the long-acting conjugate in Figure 3 is a value expressed only based on the weight of the interleukin 2 analog portion in the entire conjugate.
  • Figure 4 shows the results of evaluating the antitumor efficacy of an interleukin 2 analog long-acting conjugate in an animal model of colon cancer.
  • A shows the tumor size of the model administered with aldesleukin and interleukin 2 analog 86 conjugate
  • B shows the results of confirming the survival rate of the model administered with aldesleukin and interleukin 2 analog 86 conjugate.
  • the dosage of the long-acting conjugate in Figure 4 is a value expressed only based on the weight of the interleukin 2 analog portion in the entire conjugate.
  • Figure 5 shows the results of evaluating the antitumor efficacy of an interleukin 2 analog long-acting conjugate in an animal model of lung cancer.
  • A shows the tumor size of the model administered with aldesleukin and interleukin 2 analog 86 conjugate
  • B shows the tumor size on day 11 of the model administered with aldesleukin and interleukin 2 analog 86 conjugate.
  • the dosage of the long-acting conjugate in Figure 5 is a value expressed only based on the weight of the interleukin 2 analog portion in the entire conjugate.
  • Figure 6 shows the results of evaluating the antitumor efficacy of the interleukin 2 analog long-acting conjugate in an animal model of renal cell carcinoma.
  • A shows the results of confirming the tumor size of the model to which the excipient control group and the interleukin 2 analog 86 conjugate were respectively administered using an in vivo fluorescence image analyzer
  • B shows the results of showing the survival rate of the model to which the excipient control group and the interleukin 2 analog 86 conjugate were respectively administered.
  • the dosage of the long-acting conjugate in Figure 6 is a value expressed only based on the weight occupied by the interleukin 2 analog portion of the entire conjugate.
  • Figure 7 shows the results of evaluating the antitumor efficacy of an interleukin 2 analog long-acting conjugate in an animal model of pancreatic cancer.
  • A shows the results of measuring tumor volume in a model administered with a negative control group and interleukin 2 analog 86 conjugate.
  • the dosage of the long-acting conjugate in Figure 7 is a value expressed only based on the weight occupied by the interleukin 2 analog portion in the entire conjugate.
  • Figure 8 shows the results of evaluating the immune memory response in an animal model of renal cell carcinoma administered with an interleukin 2 analog sustained-release conjugate.
  • the dose of the sustained-release conjugate in Figure 8 is a value expressed only based on the weight occupied by the interleukin 2 analog portion of the entire conjugate.
  • One aspect of the present invention is a composition comprising a novel interleukin 2 analog (or IL-2 analog) or a sustained binding agent thereof.
  • the interleukin 2 (IL-2) analog is an interleukin 2 analog having enhanced binding affinity to the interleukin 2 beta receptor compared to natural interleukin 2 or aldesleukin, an interleukin 2 analog, and may include a sequence in which one or more amino acids are mutated in natural interleukin 2.
  • the interleukin 2 analog is characterized by comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • the persistent conjugate is characterized by being a persistent conjugate represented by the following chemical formula 1:
  • X is an interleukin 2 analog comprising any one sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 106;
  • L is a polyethylene glycol linker
  • F is the immunoglobulin Fc region in dimeric form
  • the above-mentioned persistent complex has one end of L covalently linked to only one polypeptide chain among the Fc regions of the dimer form, and X is covalently linked to the other end of L.
  • composition according to any one of the preceding specific examples, wherein the sustained-release conjugate comprises, as a part of the conjugate, an interleukin 2 analog having altered interleukin 2 alpha receptor binding affinity and enhanced interleukin 2 beta receptor binding affinity compared to native interleukin 2 or aldesleukin.
  • interleukin 2 analogue is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 10, 13 to 15, 17, 20 to 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58 to 60, 62, 71, 72, 74 to 78, 85, 87, 89, 91 to 94, and 97 to 106 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, and It is characterized by comprising any one sequence selected from the group consisting of 105 amino acid sequences.
  • interleukin 2 analogue comprises any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17, 22, 42, 53, 56, 58 to 60, 62, 71, 72, 74 to 77, 87, 89, 91 to 93, 98 to 101, and 103 to 106.
  • interleukin 2 analogue comprises any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 42, 53, 87, 105 and 106.
  • interleukin 2 analogue further comprises one or more amino acids at the C-terminus.
  • composition according to any one of the preceding specific examples characterized in that the sustained binding agent comprises an IgG4 Fc region.
  • composition according to any one of the preceding specific examples characterized in that one end of the linker is linked to only one Fc region chain of the two Fc region chains of the dimeric immunoglobulin Fc region.
  • composition according to any one of the preceding specific examples, characterized in that the composition further comprises a pharmaceutically acceptable excipient.
  • compositions according to any one of the preceding specific examples wherein the composition is characterized in that it is administered by an intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration route.
  • composition according to any one of the preceding specific examples, characterized in that the composition is administered at time intervals ranging from 1 week to 1 month.
  • Another aspect of the present invention is a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject an interleukin 2 analog, a sustained-release conjugate thereof, or a composition comprising the same.
  • Another aspect of the present invention is the use of the interleukin 2 analog, a sustained-release conjugate thereof, or a composition comprising the same for the prevention or treatment of cancer.
  • Another aspect of the present invention is a use for providing a medicament for preventing or treating cancer comprising the interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof.
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof.
  • composition of the present invention may include, but is not limited to, an interleukin 2 analog comprising, consisting essentially of, or consisting of any one sequence selected from the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is characterized by having altered binding affinity for an interleukin 2 receptor, particularly having enhanced binding affinity for an interleukin 2 beta receptor.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have enhanced binding affinity for an interleukin 2 beta receptor compared to natural interleukin 2 or known aldesleukin, and more specifically, may have altered (increased or decreased) binding affinity for an interleukin 2 alpha receptor, and may include a sequence in which one or more amino acids are mutated in natural interleukin 2.
  • Interleukin 2 in the present invention refers to an immune modulator, a type of cytokine that transmits signals in the immune system in a living body. Interleukin 2 is generally known as an important immune stimulant of about 15 kDa.
  • the term "interleukin 2 analog” means one or more amino acids mutated in a natural sequence, and in particular, in the present invention, it may be an interleukin 2 analog in which an amino acid of a natural interleukin 2 is mutated, such that the binding affinity for an interleukin 2 receptor is reduced or increased compared to the natural type. Specifically, the interleukin 2 analog of the present invention may be non-naturally occurring.
  • the above natural interleukin 2 may be human interleukin 2, and its sequence may be obtained from a known database, etc. Specifically, it may be the amino acid sequence of sequence number 1, but is not limited thereto.
  • the meaning that the natural interleukin 2 can be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is that not only the sequence identical to SEQ ID NO: 1, but also the sequence having 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homology with SEQ ID NO: 1 belongs to the category of the natural interleukin 2 of the present invention, and the position of the amino acid mutation means that when the sequence having 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more homology with SEQ ID NO: 1 is aligned, the corresponding position on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is mutated.
  • aldesleukin in the present invention refers to a commercially available interleukin 2 analog, which may be aldesleukin (trade name: Proleukin®), and specifically, may have an amino acid sequence of sequence number 2. In the present invention, it is used interchangeably with “interleukin 2 analog 1”.
  • the interleukin 2 analog according to the present invention may have an altered interleukin 2 alpha receptor binding affinity and/or an increased interleukin 2 beta receptor binding affinity compared to the interleukin 2 analog 1.
  • Interleukin 2 alpha receptor is known to not be involved in the signaling pathway of interleukin 2, but it increases the binding affinity of other interleukin 2 receptors (beta or gamma) with interleukin 2 by 10- to 100-fold and is expressed on CD4 + regulatory T cells, etc.
  • Interleukin 2 beta receptor is mainly distributed in CD8 + T cells or natural killer cells (NK cells), and performs a major function in activating immune responses and macrophage action and in proliferating tumor-killing cells. Therefore, tumor cell death and activation of the body's immune response can be expected through activation of interleukin 2 beta receptor.
  • the interleukin 2 analog with increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor of the present invention can have a therapeutic effect with increased therapeutic effects such as tumor suppression and apoptosis and reduced side effects.
  • the interleukin 2 analog may comprise, consist essentially of, or consist of, an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog consists of an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 10, 13 to 15, 17, 20 to 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58 to 60, 62, 71, 72, 74 to 78, 85, 87, 89, 91 to 94, and 97 to 106 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, and 105. It may comprise, consist essentially of, or consist of, but is not limited to, any one sequence selected from the group.
  • the interleukin 2 analog may comprise, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 17, 22, 42, 53, 56, 58 to 60, 62, 71, 72, 74 to 77, 87, 89, 91 to 93, 98 to 101, and 103 to 106, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog may comprise, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, and 106, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog may comprise, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, and 105, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog may comprise, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 42, 53, 87, 105, and 106, but is not limited thereto.
  • interleukin 2 analog may additionally comprise one or more amino acids at the C-terminus, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may include an amino acid sequence having at least 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology or identity to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 106, but is not limited thereto.
  • the term 'homology' or 'identity' means the degree to which two given amino acid sequences or base sequences are related to each other, and can be expressed as a percentage.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides is determined by standard alignment algorithms, and may be used together with a default gap penalty established by the program being used. In practice, homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of the sequence under moderate or high stringent conditions. It will be appreciated that hybridization also includes hybridization with polynucleotides containing common codons or codons that take codon degeneracy into account in the polynucleotide.
  • Whether any two base sequences or peptide sequences are homologous, similar or identical can be determined using known computer algorithms such as the "FASTA" program with default parameters as in, for example, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444.
  • the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) as implemented in the Needleman program of the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (version 5.0.0 or later) can be used.
  • nucleotide sequences or peptides can be determined by comparing sequence information, for example, as disclosed in Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482, or using, for example, the GAP computer program, such as Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443.
  • the GAP program defines the total number of symbols in the shorter of the two sequences as the number of similarly arranged symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program include (1) a univariate comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and (2) a linear comparison matrix, as disclosed in Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 weighted comparison matrix (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or gap opening penalty 10, gap extension penalty 0.5); and (3) no penalty for terminal gaps.
  • the term "homology” or "identity” refers to relevance between sequences.
  • the interleukin 2 analog of the present invention can be used as a novel alternative to interleukin 2 that changes in vitro activity by weakening or increasing the binding affinity for interleukin 2 alpha and/or beta receptors.
  • it can be used as an effective therapeutic agent due to its activity against both receptors by changing (increasing or decreasing) the binding affinity for alpha receptors in addition to increasing the binding affinity for beta receptors.
  • modifications for the production of an analogue of interleukin 2 include all modifications using L- or D-type amino acids, and/or non-natural amino acids; and/or modifications of the native sequence, for example, modification of side chain functional groups, intramolecular covalent bonds, such as ring formation between side chains, methylation, acylation, ubiquitination, phosphorylation, aminohexaoxidation, biotinylation, and the like.
  • the above substituted or added amino acids may use non-standard or non-naturally occurring amino acids as well as the 20 amino acids commonly observed in human proteins.
  • Commercial sources of non-standard amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep, and Genzyme pharmaceuticals. Peptides containing these amino acids and standard peptide sequences can be synthesized and purchased from commercial peptide synthesis companies, such as American Peptide Company or Bachem in the United States, or Anygen in Korea.
  • Amino acid derivatives can also be obtained in a similar manner, examples of which include 4-imidazoacetic acid.
  • interleukin 2 analog according to the present invention may be in a modified form in which the N-terminus and/or the C-terminus, etc. are chemically modified or protected with an organic group, or an amino acid is added to the peptide terminus, etc., in order to protect against protein cleavage enzymes in the body and increase stability.
  • the N-terminus may be acetylated and/or the C-terminus may be amidated to remove the charge, but is not particularly limited thereto.
  • the interleukin 2 analog of the present invention can be synthesized through a solid phase synthesis method, can be produced by a recombinant method, and can be manufactured commercially, but is not limited thereto.
  • interleukin 2 analog of the present invention can be synthesized according to its length by a method well known in the art, for example, by an automatic peptide synthesizer, and can also be produced by genetic engineering technology.
  • the interleukin 2 analog of the present invention can be prepared by standard synthetic methods, recombinant expression systems, or any other method in the art. Accordingly, the interleukin 2 analog according to the present invention can be synthesized by a number of methods, including, for example, methods including:
  • the binding affinity of any interleukin 2 analog (or a sustained binding agent comprising the same) to a natural interleukin 2 receptor can be measured using surface plasmon resonance (SPR) as a method for measuring affinity for the receptor.
  • SPR surface plasmon resonance
  • the method may include, but is not limited to, immobilizing an interleukin 2 receptor on a sensor chip using the protein-ligand binding principle during SPR analysis, flowing an interleukin 2 analog diluted in an experimental buffer using a serial dilution method to induce binding to the immobilized receptor, and then flowing only the experimental buffer at the same flow rate to induce dissociation of the receptor and interleukin 2 analog to measure the binding strength, or first immobilizing an antibody against the human immunoglobulin Fc region on the sensor chip, then immobilizing the interleukin 2 receptor bound to the Fc region, and flowing an interleukin 2 analog to measure the binding strength.
  • biotin-labeled human interleukin 2 receptor is immobilized on a streptavidin biosensor chip, and an interleukin 2 analog persistent conjugate diluted in HBS-EP+ buffer is flowed at a flow rate of 20 ⁇ L/min for 3 minutes by a 2-fold serial dilution method, and then only HBS-EP+ buffer is flowed at the same flow rate for 3 minutes to induce dissociation of the interleukin 2 receptor and the interleukin 2 analog persistent conjugate, and then the obtained binding constant and dissociation constant can be measured using a Bioaevaluation program according to a 1:1 binding fitting model, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have reduced or increased interleukin 2 alpha receptor binding affinity compared to native interleukin 2 or aldesleukin (or interleukin 2 analog 1).
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have an interleukin 2 alpha receptor binding affinity of about 0.001 times or more, about 0.005 times or more, about 0.01 times or more, about 0.05 times or more, about 0.1 times or more, about 0.3 times or more, about 0.5 times or more, about 0.7 times or more, about 0.9 times or more, about 1.1 times or more, about 1.3 times or more, about 1.5 times or more, or about 1.7 times or more compared to the interleukin 2 alpha receptor binding affinity of natural interleukin 2 or aldesleukin, but the numerical value is not limited, and if the binding affinity is changed compared to natural interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may completely lose the binding affinity, or may have a binding affinity of about 1% or more, about 5% or more, about 7% or more, about 10% or more, about 15% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 50% or more, about 70% or more, about 90% or more, about 100% or more, about 150% or more, or about 200% or more, but the numerical value is not limited, and if the binding affinity is changed compared to natural interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have an interleukin 2 beta receptor binding affinity of about 0.1 times or more, about 0.3 times or more, about 0.5 times or more, about 0.7 times or more, about 1.0 times or more, about 10 times or more, about 20 times or more, about 30 times or more, about 40 times or more, about 50 times or more, about 60 times or more, about 70 times or more, about 80 times or more, about 90 times or more, or about 100 times or more compared to the interleukin 2 beta receptor binding affinity of natural interleukin 2 or aldesleukin, but the numerical value is not limited, and if the binding affinity is changed or increased compared to natural interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have a binding affinity of about 5% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 50% or more, about 100% or more, about 200% or more, about 500% or more, about 700% or more, about 1000% or more, about 1500% or more, about 3000% or more, about 5000% or more, about 7000% or more, about 10000% or more, about 12000% or more, about 15000% or more, about 20000% or more, or about 25000% or more, but the numerical value is not limited, and if the binding affinity is increased compared to natural interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the term "about” includes all ranges including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all numerical values in a range equal to or similar to the numerical value following the term "about,” but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is characterized by having altered binding affinity for the interleukin 2 alpha receptor and increased binding affinity for the interleukin 2 beta receptor compared to natural interleukin 2 or aldesleukin.
  • an interleukin 2 analog having a mutation introduced based on natural interleukin 2 (SEQ ID NO: 1) was manufactured.
  • the interleukin 2 analog manufactured in the present invention may include any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 106, or may be encoded by any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 108 to 211.
  • the nucleic acid encoding the interleukin 2 analog of the present invention may be modified so as to introduce a mutation (amino acid deletion, substitution, and/or addition) into an amino acid at a specific position in the base sequence encoding the native interleukin 2 of SEQ ID NO: 1, and specifically may include a base sequence encoding any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • the nucleic acid of the present invention may have or include any one of the base sequences of SEQ ID NOs: 108 to 211.
  • the base sequence of the present invention can be modified in various ways in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the interleukin 2 analog of the present invention, taking into account the degeneracy of the codon or the codon preferred in an organism that is intended to express the nucleic acid of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention has or includes a base sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and less than 100% homology or identity with any one of SEQ ID NOs: 108 to 211, or may consist of or consist essentially of a base sequence having at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and less than 100% homology or identity with any one of SEQ ID NOs: 108 to 211, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid of the present invention may include, without limitation, a probe that can be prepared from a known genetic sequence, for example, a sequence that can hybridize under stringent conditions with a complementary sequence to all or a part of the nucleic acid sequence of the present invention.
  • stringent conditions mean conditions that enable specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are specifically described in the literature (see J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • nucleic acids of the present invention may also include isolated nucleic acid fragments that are complementary in their entirety, as well as substantially similar nucleic acid sequences.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have an increased half-life in the body compared to natural interleukin or aldesleukin, but is not particularly limited thereto.
  • a biocompatible material for increasing half-life e.g., an immunoglobulin Fc region
  • the sustained-release complex according to the present invention not only includes an interleukin 2 analog having enhanced binding affinity to the interleukin 2 beta receptor, but also binds to an immunoglobulin Fc region as a representative carrier for increasing the half-life thereof, thereby increasing the half-life of the interleukin 2 analog, increasing its exposure in the blood, and increasing an immune response in a living body, thereby effectively achieving the inhibition and reduction of cancer cell growth.
  • composition of the present invention may include, but is not limited to, a sustained-release complex of the interleukin 2 analog.
  • the interleukin 2 analog sustained-release conjugate may be in a form in which a biocompatible material for increasing the in vivo half-life of the interleukin 2 analog is combined.
  • the biocompatible material may be used in combination with a carrier.
  • the sustained conjugate can exhibit increased persistence of efficacy compared to an interleukin 2 analog not bound to a carrier, and such a conjugate is referred to as a “sustained conjugate” or “conjugate” in the present invention.
  • the sustained bond is a sustained bond represented by the following chemical formula 1:
  • X is the interleukin 2 analog
  • L is a polyethylene glycol linker
  • F is the immunoglobulin Fc region in dimeric form
  • the above-mentioned persistent complex has one end of L covalently linked to only one polypeptide chain among the Fc regions of the dimer form, and X is covalently linked to the other end of L.
  • the sustained conjugate may be one in which one molecule of X is linked to one polypeptide chain in the Fc region via L.
  • X and L, and L and F may be linked to each other via a covalent bond, and at this time, the conjugate may be a conjugate in which X, L, and F are each linked via a covalent bond in the order of chemical formula 1.
  • the interleukin 2 analog of the sustained-release complex of the present invention is characterized by having altered binding affinity for an interleukin 2 receptor, particularly, increased binding affinity for an interleukin 2 beta receptor, when it exists alone without forming a part of the complex.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have enhanced binding affinity for an interleukin 2 beta receptor compared to natural interleukin 2 or known aldesleukin when it exists alone without forming a part of the complex, and more specifically, may have changed (increased or decreased) binding affinity for an interleukin 2 alpha receptor.
  • the interleukin 2 analog may correspond to the composition of one moiety constituting the above complex. Specifically, it corresponds to X in the above chemical formula 1, and the interleukin 2 analog is as described above.
  • F is a substance capable of increasing the half-life of X, i.e., an interleukin 2 analog, and corresponds to one component of a moiety constituting the complex of the present invention.
  • F may be bonded to X through a covalent chemical bond
  • F and X may be bonded to each other through L through a covalent chemical bond
  • the F is an immunoglobulin Fc region
  • the immunoglobulin Fc region may be an IgG Fc region or an aglycosylated IgG4 Fc region, but is not particularly limited thereto.
  • the F is a dimer composed of two polypeptide chains, and may have a structure in which one terminal of L is connected to only one of the two polypeptide chains, but is not limited thereto.
  • One or more amino acid side chains within the peptides of the present invention may be conjugated to such biocompatible substances to increase the solubility and/or half-life in vivo and/or to increase bioavailability. Such modifications may also decrease the clearance of the therapeutic proteins and peptides.
  • the biocompatible material described above may be water-soluble (amphiphilic or hydrophilic) and/or non-toxic and/or pharmaceutically acceptable.
  • the sustained binding agent of the present invention may be, but is not limited to, an interleukin 2 analog and an immunoglobulin Fc region linked thereto.
  • the "immunoglobulin Fc region” means a region including a heavy chain constant region 2 (CH2) and/or a heavy chain constant region 3 (CH3) portion, excluding the heavy chain and light chain variable regions of an immunoglobulin.
  • the immunoglobulin Fc region may be a component forming a moiety of the complex of the present invention. Specifically, it corresponds to F in the chemical formula 1.
  • Fc region includes not only the native sequence obtained by papain digestion of immunoglobulin, but also derivatives thereof, for example, sequences in which one or more amino acid residues in the native sequence are changed by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof to become different from the native sequence, and even variants. It is assumed that the derivatives, substituted products, and variants have the ability to bind to FcRn.
  • F may be a human immunoglobulin region, but is not limited thereto.
  • biocompatible material or “carrier” may refer to the Fc region.
  • the above F is a structure in which two polypeptide chains are connected by a disulfide bond, and may be a structure in which only the nitrogen atom of one of the two chains is connected, but is not limited thereto.
  • the connection via the nitrogen atom may be connected through reductive amination to the epsilon amino atom of lysine or the N-terminal amino group.
  • Reductive amination reaction is a reaction in which an amine group or amino group of a reactant reacts with an aldehyde of another reactant (i.e., a functional group capable of reductive amination) to generate an amine, and then an amine bond is formed through a reduction reaction. It is an organic synthesis reaction widely known in the relevant technical field.
  • the sustained-release complex may be one in which the immunoglobulin Fc region is linked to a linker via its N-terminal nitrogen atom.
  • immunoglobulin Fc regions may include, but are not limited to, a hinge region in the heavy chain constant region.
  • the immunoglobulin Fc region may include a specific hinge sequence at the N-terminus.
  • hetero sequence refers to a region located in the heavy chain that forms a dimer of the immunoglobulin Fc region through an inter disulfide bond.
  • the hinge sequence may be mutated to have only one cysteine residue by deleting a portion of the hinge sequence having the following amino acid sequence, but is not limited thereto:
  • the above hinge sequence may be one in which the 8th or 11th cysteine residue of the hinge sequence of SEQ ID NO: 418 is deleted, thereby containing only one cysteine residue.
  • the hinge sequence of the present invention may be composed of 3 to 12 amino acids, including only one cysteine residue, but is not limited thereto.
  • the hinge sequence of the present invention may have the following sequences: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 419), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 420), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 421), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 422), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 423), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 424), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro
  • the hinge sequence may include, but is not limited to, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 428 (Pro-Ser-Cys-Pro) or SEQ ID NO: 437 (Ser-Cys-Pro).
  • the N-terminus of the immunoglobulin Fc region in the conjugate is proline, and the conjugate is one in which the Fc region is linked to a linker via the nitrogen atom of the proline.
  • the immunoglobulin Fc region may be in the form of a dimer in which two chains of the immunoglobulin Fc region form a homodimer or a heterodimer by virtue of the presence of a hinge sequence.
  • the complex of chemical formula 1 of the present invention may be in a form in which one end of the linker is connected to one chain of the immunoglobulin Fc region of the dimer, but is not limited thereto.
  • N-terminus of the present invention means the amino terminus of a protein or polypeptide, and may include the most amino acid, or 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 or more amino acids from the most amino acid.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may include a hinge sequence at the N-terminus, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may be an extended Fc region including part or all of the heavy chain constant region 1 (CH1) and/or the light chain constant region 1 (CL1), excluding only the heavy and light chain variable regions of the immunoglobulin, as long as it has substantially the same or improved effect as the native type.
  • it may be a region in which a relatively long part of the amino acid sequence corresponding to CH2 and/or CH3 is deleted.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention may be, but is not limited to, 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain, and a CH4 domain, 2) a CH1 domain and a CH2 domain, 3) a CH1 domain and a CH3 domain, 4) a CH2 domain and a CH3 domain, 5) a combination of one or more of the CH1 domain, the CH2 domain, the CH3 domain, and the CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or a portion of the hinge region), or 6) a dimer of each domain of a heavy chain constant region and a light chain constant region.
  • the immunoglobulin Fc region may be in the form of a dimer or multimer composed of single-chain immunoglobulins consisting of domains of the same origin, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region F is a dimer composed of two polypeptide chains, wherein the Fc region dimer F and X are covalently linked via a linker L containing an ethylene glycol repeating unit.
  • X is covalently linked via the linker L to only one of the two polypeptide chains of the Fc region dimer F.
  • only one molecule of X is covalently linked via L to one of the two polypeptide chains of the Fc region dimer F to which X is linked.
  • the F is a homodimer.
  • the immunoglobulin Fc region F is a dimer composed of two polypeptide chains, and one terminus of L may be linked to only one of the two polypeptide chains, but is not limited thereto.
  • the sustained binding agent of the present invention it is also possible for two molecules of X to symmetrically bind to one Fc region in a dimeric form.
  • the immunoglobulin Fc region and X can be linked to each other by L.
  • L it is not limited to the examples described above.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention includes not only a natural amino acid sequence but also a sequence derivative thereof.
  • An amino acid sequence derivative means a sequence having a different sequence due to deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, of one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence.
  • amino acid residues 214 to 238, 297 to 299, 318 to 322 or 327 to 331, which are known to be important for binding, can be used as suitable sites for modification.
  • various types of derivatives are possible, such as those in which a site capable of forming a disulfide bond is removed, in which several amino acids at the N-terminus of a native Fc are removed, or in which a methionine residue is added to the N-terminus of a native Fc.
  • a complement binding site for example, a C1q binding site, or an ADCC (antibody dependent cell mediated cytotoxicity) site may be removed to eliminate effector function.
  • Techniques for producing such sequence derivatives of the immunoglobulin Fc region are disclosed in International Patent Publication No. WO 97/34631, International Patent Publication No. 96/32478, etc.
  • Amino acid exchanges in proteins and peptides that do not alter the overall activity of the molecule are well known in the art (H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
  • the most common exchanges are between amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
  • Modifications may also occur, such as phosphorylation, sulfation, acrylation, glycosylation, methylation, farnesylation, acetylation, and amidation.
  • the Fc derivative described above exhibits biological activity equivalent to the Fc region of the present invention and may have enhanced structural stability of the Fc region with respect to heat, pH, etc.
  • such Fc region may be obtained from a natural type isolated from an animal such as a human, cow, goat, pig, mouse, rabbit, hamster, rat or guinea pig, or may be a recombinant or a derivative thereof obtained from a transformed animal cell or microorganism.
  • a method for obtaining from a natural type may be a method of isolating the entire immunoglobulin from a human or animal body and then treating it with a protease to obtain it. When treated with papain, it is cleaved into Fab and Fc, and when treated with pepsin, it is cleaved into pF'c and F(ab) 2.
  • Fc or pF'c can be separated using size-exclusion chromatography or the like.
  • the Fc region of human origin is a recombinant immunoglobulin Fc region obtained from a microorganism.
  • the immunoglobulin Fc region may be a native sugar chain, a sugar chain with an increased amount compared to the native type, a sugar chain with a decreased amount compared to the native type, or a form in which the sugar chain is removed.
  • Conventional methods such as a chemical method, an enzymatic method, and a genetic engineering method using microorganisms can be used for the increase or removal of the immunoglobulin Fc sugar chain.
  • the immunoglobulin Fc region from which the sugar chain is removed from the Fc has a significantly reduced binding affinity to complement (c1q), and antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity is reduced or eliminated, so that it does not induce unnecessary immune responses in vivo.
  • the form that is more suitable for the original purpose as a drug carrier is an immunoglobulin Fc region from which the sugar chain is removed or is non-glycosylated.
  • deglycosylation refers to an Fc region from which a sugar has been removed by an enzyme
  • aglycosylation refers to an Fc region that has not been glycosylated and is produced in a prokaryotic animal, or in a more specific embodiment, in E. coli.
  • the immunoglobulin Fc region may be of animal origin such as human or cow, goat, pig, mouse, rabbit, hamster, rat, guinea pig, etc., and in a more specific embodiment, is of human origin.
  • the immunoglobulin Fc region can be an Fc region derived from IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, or a combination thereof, or a hybrid thereof. In a more specific embodiment, it is derived from IgG or IgM, which is most abundant in human blood, and in a still more specific embodiment, it is derived from IgG, which is known to enhance the half-life of a ligand binding protein. In a still more specific embodiment, the immunoglobulin Fc region is an IgG4 Fc region, and in a most specific embodiment, the immunoglobulin Fc region is a non-glycosylated Fc region derived from human IgG4, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be a homodimer in which two monomers are linked via a disulfide bond (inter-chain form) between cysteines at amino acid positions 3 of each monomer, as a fragment of human IgG4 Fc, and wherein the homodimer has/can have a disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and between cysteines at positions 141 and 199 of each monomer, i.e., two disulfide bonds (intra-chain form).
  • Each monomer can be composed of 221 amino acids, and the amino acids forming the homodimer can be composed of a total of 442 amino acids, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc fragment forms a homodimer by forming a disulfide bond between two monomers having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 438 (composed of 221 amino acids) between cysteine amino acids at position 3 of each monomer, and the monomers of the homodimer can independently form an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199, but are not limited thereto.
  • F in the above chemical formula 1 may include a monomer having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 438, and F may be a homodimer of a monomer having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 438, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be a homodimer comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 439 (consisting of 442 amino acids), but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region and X may be non-glycosylated, but are not limited thereto.
  • the term "combination” means that when forming a dimer or multimer, a polypeptide encoding a single-chain immunoglobulin Fc region of the same origin forms a bond with a single-chain polypeptide of different origin. That is, it is possible to produce a dimer or multimer from two or more fragments selected from the group consisting of Fc fragments of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc, and IgE.
  • hybrid means that a sequence corresponding to two or more different origin immunoglobulin Fc fragments exists within a single-chain immunoglobulin constant region.
  • various types of hybrids are possible. That is, a hybrid of a domain consisting of 1 to 4 domains from the group consisting of CH1, CH2, CH3 and CH4 of IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc and IgD Fc is possible, and may include a hinge.
  • IgG can also be divided into subclasses of IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4, and combinations or hybridizations of these are also possible in the present invention. Specifically, it is the IgG2 and IgG4 subclasses, and most specifically, it is the Fc region of IgG4, which has almost no effector function such as complement dependent cytotoxicity (CDC).
  • CDC complement dependent cytotoxicity
  • the above-described complex may have an increased duration of effect compared to natural interleukin 2 or aldesleukin, or compared to X in which F is not modified, and such complex includes, but is not limited to, not only the above-described forms but also forms encapsulated in biodegradable nanoparticles.
  • the "polyethylene glycol linker” includes a biocompatible polymer having two or more ethylene glycol repeating units bonded thereto. The repeating units are linked to each other via any covalent bond other than a peptide bond.
  • the polyethylene glycol linker may be a component forming a moiety of the conjugate of the present invention, and in the present specification, the linker may be used interchangeably with a "non-peptidyl linker” or a "non-peptidyl polymer”.
  • the complex may be one in which F and X are covalently linked to each other via a non-peptide linker comprising reactive groups capable of binding to F (specifically an immunoglobulin Fc region) and X (specifically an interleukin 2 analog) at both ends.
  • the non-peptide linker includes a reactive group at the terminal, and can form a complex through a reaction with another component constituting the complex.
  • a non-peptide linker having reactive functional groups at both terminals binds to X and F of the above chemical formula 1 through each reactive group to form a complex
  • the non-peptide linker or non-peptide polymer may be referred to as a non-peptide polymer linker moiety or a non-peptide linker linkage moiety.
  • the L may be a linker containing ethylene glycol repeating units, for example, polyethylene glycol, but is not limited thereto.
  • the polyethylene glycol is a term encompassing all forms of ethylene glycol homopolymers, PEG copolymers, or monomethyl-substituted PEG polymers (mPEG), but is not particularly limited thereto.
  • mPEG monomethyl-substituted PEG polymers
  • the above polyethylene glycol linker may include an ethylene glycol repeating unit, and may include a functional group at the terminal that is used in the production of the conjugate before being formed into the conjugate.
  • the sustained conjugate according to the present invention may be in a form in which X and F are linked via the functional group, but is not limited thereto.
  • the non-peptide linker may include two or three or more functional groups, and each functional group may be the same or different from each other, but is not limited thereto.
  • the linker may include a repeating unit represented by the following chemical formula 2, including, but not limited to, polyethylene glycol (PEG):
  • PEG polyethylene glycol
  • the PEG moiety may include, but is not limited to, a -(CH 2 CH 2 O) n - structure as well as an oxygen atom intervening between the linking element and the -(CH 2 CH 2 O) n -.
  • the ethylene glycol repeating unit can be represented by, for example, [OCH 2 CH 2 ]n, and the value of n is a natural number and can be determined such that the average molecular weight of the [OCH 2 CH 2 ]n moiety in the interleukin 2 analog conjugate is, for example, a number average molecular weight of greater than O to about 100 kDa, but is not limited thereto.
  • the n value is a natural number
  • the average molecular weight of the [OCH 2 CH 2 ]n moiety in the interleukin 2 analog conjugate for example, a number average molecular weight of about 1 to about 100 kDa, about 1 to about 80 kDa, about 1 to about 50 kDa, about 1 to about 30 kDa, about 1 to about 25 kDa, about 1 to about 20 kDa, about 1 to about 15 kDa, about 1 to about 13 kDa, about 1 to about 11 kDa, about 1 to about 10 kDa, about 1 to about 8 kDa, about 1 to about 5 kDa, about 1 to about 3.4 kDa, about 2 to about 30 kDa, about 3 to about 30 kDa, about 3 to about 27 kDa, about 3 to about 25 kDa, about 3 to about 22 kDa, about 3 to about 20 kDa, about 3 to about 18 k
  • the complex may be a structure in which an interleukin 2 analog and an immunoglobulin Fc region (F) are covalently linked via a linker (L) containing ethylene glycol repeating units, but is not limited thereto.
  • L may be a linker containing ethylene glycol repeating units
  • F may be an immunoglobulin Fc region in a dimeric form. More specifically, one molecule of X may be covalently linked to one Fc region of the dimeric immunoglobulin Fc regions via the linker containing ethylene glycol repeating units, but is not limited thereto.
  • one end of the linker containing ethylene glycol repeating units may be linked to only one Fc region chain of the two Fc region chains of the dimeric immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto.
  • the molecular weight of the polyethylene glycol linker that can be used in the present invention may be in the range of greater than 0 to 200 kDa, specifically, in the range of about 1 to 100 kDa, in the range of about 1 to 50 kDa, in the range of about 1 to 30 kDa, in the range of about 2 to 30 kDa, in the range of about 1 to 20 kDa, more specifically, in the range of about 3.4 kDa to 10 kDa, and more specifically, about 3.4 kDa, but is not limited thereto.
  • the non-peptidyl linker of the present invention that is bound to the polypeptide corresponding to F may use not only one type of polymer but also a combination of different types of polymers.
  • the term "about” includes all ranges including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all numerical values in a range equal to or similar to the numerical value following the term "about,” but is not limited thereto.
  • the non-peptide linker may have reactive groups at both ends while not bonded to F and X, and may bind to F and X through the reactive groups.
  • both ends of the linker can be bound to a thiol group, an amino group, a hydroxyl group of an immunoglobulin Fc region and a thiol group, an amino group, an azide group, a hydroxyl group of an interleukin 2 analog (X), but are not limited thereto.
  • the linker may include, but is not limited to, a reactive group capable of binding to an immunoglobulin Fc region and an interleukin 2 analog (X) at both ends, specifically, a thiol group of cysteine of the immunoglobulin Fc region; an amino group located at the N-terminus, lysine, arginine, glutamine and/or histidine; and/or a hydroxyl group located at the C-terminus, and a reactive group capable of binding to a thiol group of cysteine of interleukin 2 analog (X); an amino group of lysine, arginine, glutamine and/or histidine; an azide group of azidolysine; and/or a hydroxyl group.
  • a reactive group capable of binding to an immunoglobulin Fc region and an interleukin 2 analog (X) at both ends specifically, a thiol group of cysteine of the immunoglobulin Fc region
  • the reactive group of the linker may be, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of an aldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative.
  • aldehyde group examples include, but are not limited to, a propionaldehyde group or a butyraldehyde group.
  • succinimidyl valerate succinimidyl methylbutanoate
  • succinimidyl methylpropionate succinimidyl butanoate
  • succinimidyl propionate N-hydroxysuccinimide
  • hydroxy succinimidyl succinimidyl carboxymethyl or succinimidyl carbonate
  • the above linker can be converted into a linker linkage by being linked to F, an immunoglobulin Fc region, and X, an interleukin 2 analog, through a reaction group as described above.
  • the final product formed by reductive alkylation via an aldehyde bond is much more stable than that linked via an amide bond.
  • the aldehyde reactive group reacts selectively at the N-terminus at low pH, and can form a covalent bond with lysine residues at high pH, e.g., pH 9.0.
  • the reactive groups at both ends of the linker may be the same or different from each other, for example, it may have an aldehyde group at both ends, or it may have a maleimide group at one end and an aldehyde group, a propionaldehyde group, or a butyraldehyde group at the other end.
  • F specifically an immunoglobulin Fc region and X, can be bound to each end of the linker.
  • one end of the linker may include a maleimide group as a reactive group, and the other end may include an aldehyde group, a propionaldehyde group, a butyraldehyde group, or the like.
  • the interleukin 2 analog sustained-release conjugate of the present invention can be prepared by activating the hydroxyl groups into various reactive groups through a known chemical reaction, or by using polyethylene glycol having a commercially available modified reactive group.
  • the linker may be linked to a cysteine residue of X, more specifically, but not limited to, a -SH group of the cysteine.
  • the reactive group of the linker can be linked to the -SH group of the cysteine residue, and all of the above-described reactive groups are applicable.
  • the maleimide group can be linked to the -SH group of X via a thioether bond, and the aldehyde group can be linked to F, specifically, the -NH 2 group of immunoglobulin Fc, via a reductive amination reaction, but is not limited thereto.
  • the linker may be linked to a lysine residue of X, more specifically, but not limited to, to an amino group of lysine.
  • the reactive group of the linker may be linked to -NH 2 located at the N-terminus of the immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog according to the present invention may be linked to a linker having a reactive group via the C-terminus, but this is only one example.
  • the "C-terminus” refers to the carboxyl terminal of the peptide, and refers to a position capable of binding to a linker for the purpose of the present invention.
  • it may include not only the most terminal amino acid residue of the C-terminus, but also all amino acid residues surrounding the C-terminus, and specifically, it may include the first to 20th amino acid residues from the most terminal, but is not limited thereto.
  • the above-described combination may have an increased duration of effect compared to X in which F is not modified, and such combination includes not only the above-described form but also a form encapsulated in biodegradable nanoparticles.
  • the description in the detailed description or claims of the "interleukin 2 analog” or the “conjugate” in which the interleukin 2 analog is covalently linked to a biocompatible material according to the present invention applies to a category including not only the interleukin 2 analog or the conjugate, but also a salt of the interleukin 2 analog or the conjugate (e.g., a pharmaceutically acceptable salt of the interleukin 2 analog), or a solvate thereof. Accordingly, even if the description only describes “interleukin 2 analog” or “conjugate”, the description also applies to the specific salt, the specific solvate, and the specific solvate of the specific salt.
  • the salt form may be, for example, a form using any pharmaceutically acceptable salt.
  • the type of the salt is not particularly limited. However, it is preferable that it is a form that is safe and effective for a subject, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • the type of the above salt is not particularly limited. However, it is preferable that it be in a form that is safe and effective for an individual, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable means a substance that can be effectively used for its intended purpose without causing excessive toxicity, irritation, or allergic reactions, within the scope of pharmaceutical judgment.
  • salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-p-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid, benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzenesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • solvate used in the present invention refers to a complex formed by an interleukin 2 analog or a salt thereof according to the present invention with a solvent molecule.
  • the composition according to the present invention may be a composition comprising the interleukin 2 analog or a sustained-release conjugate thereof, and specifically may be a pharmaceutical composition having a use for preventing or treating cancer.
  • the interleukin 2 analog or a sustained-release conjugate thereof is as described above. More specifically, it may comprise a pharmacologically effective amount of the interleukin 2 analog or a sustained-release conjugate thereof, and additionally comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the composition may include an interleukin 2 analog comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106; or a sustained-release conjugate comprising the same; and more specifically, the composition may include, but is not limited to, an interleukin 2 analog comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22, 42, 53, 87, 105, and 106; or a sustained-release conjugate comprising the interleukin 2 analog.
  • the term “pharmacologically effective amount” means a safe administration dose that allows the interleukin 2 analog or its sustained-release conjugate to exhibit a cancer prevention or treatment effect while not exhibiting toxicity or side effects in the patient, and may mean an administration dose that can exhibit significant activity at interleukin 2 receptors, specifically, beta and/or alpha receptors, but is not limited thereto.
  • composition according to the present invention may exhibit one or more of the following properties, but is not limited thereto, as long as it exhibits an increased immune response and an anticancer effect based on increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor:
  • Interleukin 2 known as T cell growth factor, is a protein involved in immune regulation, and has the activity of proliferating T cells, stimulating B cells, and acting on T cells to secrete ⁇ -interferon. Based on this immune regulation activity of interleukin 2, cancer prevention and treatment effects can be obtained by removing cancer cells using the body's immune system.
  • the interleukin 2 analog of the present invention has an enhanced binding affinity for the interleukin 2 beta receptor, which plays a major role in signal transduction, which leads to a more effective anticancer effect in the immune system of an individual.
  • the sustained conjugate comprising the interleukin 2 analog has an enhanced binding affinity for the interleukin 2 beta receptor, and while the persistence is increased, the blood exposure is increased, thereby showing excellent bioavailability, and ultimately has an excellent tumor growth inhibition ability, so that it can show an effective cancer prevention or treatment effect.
  • it has an excellent memory T cell production ability, so that it can show an effect of suppressing cancer recurrence through an immune memory response of an individual, and thus can be utilized as a safe and effective cancer treatment agent.
  • the interleukin 2 analog sustained-release conjugate of the present invention may have an interleukin 2 alpha receptor binding affinity that is reduced by at least about 0.001 times, at least about 0.005 times, at least about 0.01 times, at least about 0.05 times, at least about 0.1 times, at least about 0.3 times, at least about 0.5 times, at least about 0.6 times, at least about 0.7 times, at least about 0.8 times, at least about 0.9 times, at least about 1.1 times, at least about 1.3 times, at least about 1.5 times, or at least about 1.7 times, compared to the interleukin 2 alpha receptor binding affinity of native interleukin 2, aldesleukin, or a sustained-release conjugate comprising them, but the numerical value is not limited, and if the binding affinity is changed compared to native interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog sustained-release conjugate of the present invention may have an interleukin 2 beta receptor binding affinity of about 0.1 times or more, about 0.3 times or more, about 0.5 times or more, about 0.7 times or more, about 1.0 times or more, about 10 times or more, about 20 times or more, about 30 times or more, about 40 times or more, about 50 times or more, about 60 times or more, about 70 times or more, about 80 times or more, about 90 times or more, about 100 times or more, about 130 times or more, about 150 times or more, or about 200 times or more compared to the interleukin 2 beta receptor binding affinity of native interleukin 2, aldesleukin, or a sustained-release conjugate comprising them, but the numerical value is not limited, and if the binding affinity is changed or increased compared to native interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the cancer is renal cell carcinoma, melanoma, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, lung cancer, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, skin cancer, breast cancer, bladder cancer, stomach cancer, head or neck cancer, esophageal cancer, laryngeal cancer, bone cancer, rectal cancer, anal cancer, colon cancer, fallopian tube carcinoma, endometrial carcinoma, cervical carcinoma, vaginal carcinoma, vulvar carcinoma, Hodgkin's disease, small intestine cancer, endocrine cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, prostate cancer, chronic or acute leukemia, lymphocytic lymphoma, renal pelvic carcinoma, CNS tumor, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brain tumor, glioma (astrocytoma, glioblastoma, oligodendroglioma)
  • the cancer may be any one selected from the group consisting of colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, lung cancer, skin cancer, melanoma, breast cancer, bladder cancer, and stomach cancer.
  • the cancer according to the present invention may be, but is not limited to, primary cancer, recurrent cancer, or metastatic cancer. In addition, it may include metastatic renal cell carcinoma, or metastatic melanoma.
  • prevention in the present invention means any act of inhibiting or delaying cancer or a tumor by administering the interleukin 2 analog (e.g., the interleukin 2 analog itself or a sustained-release complex formed by combining a biocompatible material therewith) or a composition containing the same.
  • interleukin 2 analog e.g., the interleukin 2 analog itself or a sustained-release complex formed by combining a biocompatible material therewith
  • treatment means any act that improves or benefits the symptoms of cancer by administering the interleukin 2 analog (e.g., the interleukin 2 analog itself or a sustained-release complex formed by combining a biocompatible material therewith) or a composition containing the same.
  • interleukin 2 analog e.g., the interleukin 2 analog itself or a sustained-release complex formed by combining a biocompatible material therewith
  • interleukin 2 analog or its sustained-release conjugate of the present invention has a great advantage in that it can reduce the number of administrations to chronic patients who need to be administered daily due to a dramatic increase in blood exposure, blood half-life, and in vivo efficacy duration, thereby improving the quality of life of patients.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent may be non-naturally occurring.
  • pharmaceutically acceptable in the present invention means a sufficient amount to exhibit a therapeutic effect and not causing side effects, and can be easily determined by those skilled in the art based on factors well known in the medical field, such as the type of cancer, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to drugs, administration route, administration method, number of administrations, treatment period, and drugs used in combination or simultaneously.
  • the pharmaceutical composition comprising the interleukin 2 analog or its sustained-release conjugate of the present invention may include a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the excipient is not particularly limited thereto, but may include a binder, a lubricant, a disintegrant, a solubilizer, a dispersant, a stabilizer, a suspending agent, a pigment, a fragrance, etc. for oral administration, and may include a mixture of a buffer, a preservative, an analgesic, a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer, etc. for injection, and may include a base, an excipient, a lubricant, a preservative, etc. for topical administration.
  • the formulation of the composition of the present invention can be variously prepared by mixing it with the pharmaceutically acceptable excipients as described above.
  • it in the case of oral administration, it can be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc., and in the case of injections, it can be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses.
  • it can be formulated in the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, sustained-release preparations, etc.
  • examples of carriers, excipients and diluents suitable for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methyl hydroxybenzoate, propyl hydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil.
  • fillers, anticoagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, preservatives and the like can be additionally included.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may have any one dosage form selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • composition is formulated into a unit dosage form suitable for administration into a patient's body according to a conventional method in the pharmaceutical field, specifically, into a form of a formulation useful for administration of a protein drug, and may be administered orally or parenterally including, but not limited to, dermal, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, pulmonary, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intragastric, topical, sublingual, vaginal, or rectal routes using an administration method conventionally used in the art.
  • the complex can be used by mixing with various carriers acceptable as drugs, such as saline solution or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low-molecular-weight proteins or other stabilizers can be used as drugs to increase stability or absorbability.
  • drugs such as saline solution or organic solvents
  • carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, antioxidants such as ascorbic acid or glutathione, chelating agents, low-molecular-weight proteins or other stabilizers can be used as drugs to increase stability or absorbability.
  • Another aspect of the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering to a subject in need thereof an interleukin 2 analog, a sustained-release complex comprising the same, or a pharmaceutical composition comprising the same.
  • interleukin 2 analogue and/or the sustained-release combination of the interleukin 2 analogue, the composition containing the same, and the prevention and treatment of cancer are as described above.
  • the subject means a subject that has developed or is suspected of having cancer, and includes mammals including humans, mice, livestock, etc., but includes without limitation a subject that can be treated with the interleukin 2 analog and/or conjugate of the present invention, or the composition containing the same.
  • administration means introducing a given substance (e.g., an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof) to a patient by any appropriate method, and the route of administration is not particularly limited thereto, but may be administered via any general route capable of reaching an in vivo target, and may include, for example, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration.
  • a given substance e.g., an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof
  • the method of the present invention may include administering a pharmaceutical composition comprising the interleukin 2 analog or a sustained-release conjugate thereof in a pharmaceutically effective amount.
  • An appropriate total daily dosage may be determined by a treating physician within the scope of sound medical judgment, and may be administered once or in several divided doses.
  • the dosage and frequency of administration are determined according to the type of drug as an active ingredient, along with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease.
  • the composition of the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of the interleukin 2 analog or a sustained-release conjugate containing the same, but is not limited thereto.
  • the inclusion of the interleukin 2 analog or long-acting conjugate in a pharmaceutically effective amount means the extent to which the desired pharmacological activity (e.g., prevention, improvement, or treatment of cancer) can be obtained due to the interleukin 2 analog or long-acting conjugate, and may also mean a pharmaceutically acceptable level where no toxicity or side effects occur or are minimal in the subject to which it is administered, but is not limited thereto.
  • a pharmaceutically effective amount can be determined in comprehensive consideration of the number of administrations, patients, formulations, etc.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the component (active ingredient) in an amount of 0.01 to 99% by weight to volume.
  • the total effective amount of the composition of the present invention can be administered to a patient as a single dose, or can be administered by a fractionated treatment protocol in which multiple doses are administered for a long period of time.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can vary the content of the effective ingredient depending on the degree of the disease.
  • the preferred total dose of the interleukin 2 analog or its sustained-release conjugate of the present invention can be about 0.0001 mg to 500 mg per 1 kg of patient body weight per day.
  • the dose of the interleukin 2 analog or its conjugate is determined as an effective dosage for a patient by considering various factors such as the route of administration of the pharmaceutical composition and the number of treatments, as well as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet, and excretion rate of the patient, considering these points, a person having ordinary knowledge in the art will be able to determine an appropriate effective dosage according to a specific use of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in its formulation, route of administration, and method of administration as long as it exhibits the effect of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention has excellent in vivo persistence and potency, so that the number of times and frequency of administration of the pharmaceutical preparation of the present invention can be significantly reduced.
  • the pharmaceutical composition may be administered by intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or rectal administration routes, but is not limited to a specific administration route as long as the desired pharmacological effect can be obtained.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered once a week, once every two weeks, once every three weeks, once every four weeks, or once a month, or may be administered once or multiple times at time intervals ranging from one week to one month, but is not limited thereto.
  • Another embodiment of the present invention is the use of the interleukin 2 analogue, a sustained-release conjugate thereof, or a composition comprising the same in the manufacture of a medicament for preventing or treating cancer.
  • interleukin 2 analogue and/or the sustained-release conjugate thereof, or the composition containing the same, cancer, prevention, treatment, administration route and number of administrations are as described above.
  • Another embodiment of the present invention provides a use of an interleukin 2 analog, a sustained-release conjugate thereof, or a composition comprising the same for the prevention or treatment of cancer.
  • interleukin 2 analogue and/or the sustained-release conjugate thereof, or the composition containing the same, cancer, prevention, treatment, administration route and number of administrations are as described above.
  • Example 1 Production of native interleukin 2 and interleukin 2 analog expression vectors
  • interleukin 2 synthesized based on the reported interleukin 2 sequence (NM_000586.3; SEQ ID NO: 1) was cloned into the pET-22b vector (Novagen).
  • a novel interleukin 2 analog was produced by modifying the amino acids of interleukin 2 using the interleukin 2 as a template.
  • PCR conditions for amplification of interleukin 2 analog were 95°C for 30 seconds, 55°C for 60 seconds, and 65°C for 6.5 minutes, and this process was repeated 16 times. Sequence analysis was performed on the mutagenesis products obtained under the above conditions, and it was confirmed that each interleukin 2 analog had a mutation at the target mutation position as shown in Table 1 below based on the natural type.
  • the expression vectors obtained in this way were named pET22b-interleukin 2 analog 1 to 105.
  • each analog gene was amplified by PCR using forward (F) and reverse (R) primers.
  • analog 1 is aldesleukin
  • primers #1 to #204 correspond to sequence numbers 214 to 417, respectively.
  • Table 1 summarizes the types of interleukin 2 analogs, mutation locations, and their changed sequences.
  • desA1 means that the first amino acid (alanine) of interleukin 2 is deleted.
  • the full-length amino acid sequence of interleukin 2 analogs is shown in Table 2 below. The bold text in Table 2 below indicates the mutation location. Table 2 summarizes the amino acid sequences of interleukin 2 analogs.
  • each recombinant interleukin 2 analog expression vector was transformed into the expression E. coli strain, E. coli BL21DE3 ( E. coli BF - dcm ompT hsdS (r B - m B - ) gal ⁇ (DE3); Novagen). The transformation method was used using the method recommended by Novagen. Each single colony transformed with each recombinant expression vector was inoculated into 2X Luria Broth medium containing ampicillin (50 ⁇ g/mL), and cultured at 37°C for 15 hours.
  • the recombinant strain culture medium and 2X LB medium containing 30% glycerol were mixed at a ratio of 1:1 (v/v), 1 mL each was dispensed into cryotubes, and stored at -150°C. This was used as a cell stock for production of recombinant proteins.
  • fed-batch culture was performed by adding additional medium (feeding solution).
  • the growth of the strain was monitored by the OD value, and IPTG was introduced at a final concentration of 500 ⁇ M when the absorbance value was 70 or higher. Cultivation was continued for approximately 23 to 25 hours after the introduction of IPTG, and after the completion of the cultivation, the recombinant strain was harvested using a centrifuge and stored at -80°C until use.
  • the supernatant was discarded after centrifugation at 13,900 g for 30 minutes, and the pellet was washed with 400 mL of the first wash buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0). Under the same conditions as above, centrifugation was performed, the supernatant was discarded, and the pellet was washed with 400 mL of a second wash buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100).
  • the first wash buffer solution 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0
  • a second wash buffer solution 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100.
  • centrifugation was performed, the supernatant was discarded, and the pellet was washed with 400 mL of a third wash buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1% sodium deoxycholorate). Under the same conditions as above, centrifugation was performed, the supernatant was discarded, and the pellet was washed with 400 mL of a fourth wash buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1 M NaCl). Under the same conditions as above, centrifugation was performed to obtain a washed E. coli inclusion body pellet.
  • a third wash buffer solution 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1% sodium deoxycholorate.
  • a fourth wash buffer solution 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1 M NaCl.
  • the washed inclusion body pellet was resuspended in 400 mL of solubilizing/reducing buffer (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT) and stirred at 50°C for 30 min.
  • solubilizing/reducing buffer (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT) and stirred at 50°C for 30 min.
  • the solubilized/reduced interleukin-2 analog was diluted from 6 M Guanidine to 4.8 M Guanidine by adding 100 mL of distilled water, and centrifuged at 13,900 g for 30 min to discard the pellet and obtain only the solution.
  • 185.7 mL of distilled water was additionally added to dilute 4.8 M Guanidine to 3.5 M Guanidine, and the pH was adjusted to 5.0 using 100% acetic acid.
  • the pH-adjusted solution was stirred at room temperature for 1 h.
  • the solution from which impurities had precipitated was centrifuged at 13,900 g for 30 minutes, the supernatant was discarded, and the pellet was washed with the final wash buffer solution (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT).
  • the pellet was obtained by centrifugation under the same conditions as above.
  • the washed interleukin 2 analog was dissolved in 400 mL of refolding buffer solution (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl 2 ). The refolding process was performed by stirring the mixed solution at 4°C for 15 to 24 hours.
  • the interleukin 2 analog refolding solution obtained in the above Example 3 was concentrated to 1 mL or less for purification by applying it to a size exclusion column.
  • the column was equilibrated with a buffer solution (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0) before introducing the refolding solution, and eluted by flowing the buffer solution after introducing the refolding solution.
  • the eluted sample contained Guanidine, so it was replaced with a stabilization solution (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose), and then the purity was measured through RP-HPLC and peptide mapping analysis. If the measured purity was 80% or higher, it was used in the experiment.
  • the recombinant interleukin 2 analog prepared above was diluted in HBS-P+ buffer (Cytiva, BR100671) using a 2-fold serial dilution method at each concentration, and flowed through the CM5 chip where the interleukin 2 receptor was finally immobilized, and the binding affinity of each interleukin 2 receptor was measured.
  • the binding affinity was measured using the association rate (K a ) and dissociation rate (K d ).
  • the binding rate was measured by flowing the interleukin-2 analog for 3 minutes at a flow rate of 10 uL/min, and the dissociation rate from each interleukin-2 receptor was measured by flowing only the HBS-P+ buffer at the same time and flow rate. After the measurement was completed, the binding affinity of the receptor was evaluated according to the 1:1 binding fitting model in the Biaevaluation program.
  • K D (%) analog 1 (aldesleukin) dissociation constant (K d ) / analog dissociation constant (K d ) ⁇ 100
  • Table 3 summarizes the relative binding affinity of interleukin-2 analogs to interleukin-2 alpha or beta receptors compared to interleukin-2 analog 1 (aldesleukin).
  • interleukin 2 analogs of the present invention exhibited different interleukin 2 alpha receptor binding affinity from natural interleukin 2 or aldesleukin, such as completely losing interleukin 2 alpha receptor binding affinity or decreasing or increasing it compared to interleukin 2 analog 1.
  • a stronger binding affinity was confirmed for the interleukin 2 beta receptor than natural interleukin 2 or aldesleukin.
  • the amino acid sequence of the interleukin 2 analog affects the binding of the interleukin 2 alpha or beta receptor. This suggests that the binding affinity of the interleukin 2 receptor can be changed by substituting an amino acid at a specific position.
  • interleukin 2 analog according to the present invention has changed interleukin 2 alpha receptor binding affinity and interleukin 2 beta receptor binding affinity, and thus can be used in the development of various drugs utilizing the same.
  • Example 6 Linkage reaction of interleukin 2 analog and polyethylene glycol (3.4K PEG) linker and purification of interleukin 2 analog linker
  • a conjugate was first manufactured in which the interleukin 2 analog is linked to one terminal of a polyethylene glycol (PEG) linker.
  • PEG polyethylene glycol
  • Interleukin 2 analogs 21, 41, 52, 86, 104, and 105 were used for the manufacture of the conjugate, and polyethylene glycol (ALD(2)3.4K PEG, available from NOF, Japan) having a molecular weight of 3.4 kDa and in which the hydroxy hydrogens at both terminals are modified with propylaldehyde groups was used as a PEG linker, and this was linked to the N-terminus of the interleukin 2 analog.
  • ALD(2)3.4K PEG available from NOF, Japan
  • the molar ratio of interleukin 2 analog: PEG linker was 1:15 to 1:20, and the concentration of interleukin 2 analog was 1 mg/mL or less, and the reaction was performed at 2 to 10°C for 1 hour. At this time, the reaction was carried out under 100 mM potassium phosphate (pH 5.5), and 20 mM sodium cyanoborohydride (SCB) was added as a reducing agent.
  • reaction solution was changed to 20 mM triethylamine (pH 8.0) buffer using a desalting column, and then purified using a Fractogel® EMD TMAE (S) (Merck Millipore) or Source 15Q (Cytiva) column using a triethylamine (pH 8.0) and sodium chloride concentration gradient to obtain interleukin 2 analog-3.4K PEG linker.
  • the molar ratio of the interleukin 2 analog-3.4K PEG linker obtained using the method of Example 6 and the immunoglobulin Fc region was made 1:10, and the total protein concentration was 30 mg/mL, and the reaction was performed at 2 to 10°C for 15 to 16 hours.
  • the reaction solution was 100 mM potassium phosphate (pH 6.0), and 20 mM sodium cyanoborohydride was added as a reducing agent.
  • the immunoglobulin region used at this time is composed of two monomers having the amino acid sequence of sequence number 438 (consisting of 221 amino acids) forming a homodimer through a disulfide bond between cysteine, which is the 3rd amino acid of each monomer, and the monomers of the homodimer independently form an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199.
  • Table 4 summarizes the immunoglobulin Fc amino acid sequence.
  • the reaction solution was purified using Bis-Tris (pH 6.5) and sodium chloride to remove unreacted immunoglobulin Fc region from Butyl FF (Cytiva), and purified using sodium citrate buffer (pH 5.5) and ammonium sulfate with Source 15ISO (Cytiva), thereby obtaining an interleukin 2 analog-3.4 kDa PEG-immunoglobulin Fc region conjugate (sustained conjugate) in which the N-terminus of the interleukin 2 analog is linked to one end of a 3.4 kDa PEG linker and the other end of the 3.4 kDa PEG linker is linked to the nitrogen of the N-terminal proline of the Fc region.
  • This sustained conjugate was analyzed using SDS-PAGE, RP-HPLC, and SE-HPLC (Figs. 1 and 2).
  • SPR Surface plasma resonance
  • biotin-labeled human interleukin-2 receptor alpha and beta subunits were immobilized on streptavidin biosensor chips (SA chip, Cytiva), and the interleukin-2 analog long-acting conjugates or aldesleukin diluted in HBS-EP+ buffer (Cytiva, BR100669) were flowed at a flow rate of 20 ⁇ L/min by a 2-fold serial dilution method.
  • the evaluated IL-2 analog conjugates showed unique IL-2 receptor binding affinity, and a clear difference in binding affinity was confirmed among each candidate substance, especially at the IL-2 receptor alpha subunit.
  • a closer look at the results showed that IL-2 analog 21 and 52 conjugates did not bind to the IL-2 receptor alpha subunit, while IL-2 analog conjugates 41, 86, 104, and 105 showed relative binding affinities of 50.8%, 65.2%, 81.0%, and 112.9%, respectively, compared to aldesleukin.
  • all IL-2 analog conjugates, including IL-2 analog 21 and 52 conjugates showed higher binding affinity than aldesleukin.
  • Table 5 summarizes the relative binding affinity (%) of interleukin 2 analog long-acting conjugates manufactured for each alpha and beta receptor, based on the binding affinity of aldesleukin.
  • the long-acting conjugates are indicated by the number of the interleukin 2 analog that constitutes them (e.g., the long-acting conjugate of interleukin 2 analog 21 is indicated as “interleukin 2 analog 21 conjugate”).
  • Table 5 summarizes the binding affinity of interleukin 2 analog conjugates to interleukin 2 receptors.
  • Example 9 Evaluation of anticancer efficacy of interleukin 2 analog long-acting conjugate in malignant melanoma
  • the interleukin 2 analog 86 conjugate was administered to a malignant melanoma mouse model (B16F10 melanoma tumor syngeneic mouse model) into which melanoma cells (B16F10) were allogeneically transplanted, and then the tumor size and individual survival rate were evaluated.
  • B16F10 cells (ATCC) were subcutaneously injected into the thighs of C57BL/6 mice, and when tumors were observed with the naked eye a few days later, 9 mice were assigned to each group so that the tumor sizes were similar.
  • Interleukin-2 analog No. 86 conjugates of 0.08 mg/kg to 10 mg/kg based on the weight of the interleukin-2 analog moiety among the sustained-release conjugates were administered subcutaneously once a week for a total of 4 repeated administrations.
  • the control group (aldesleukin administration group) was administered 3.0 mg/kg Proleukin injection (Novartis) intraperitoneally once a day for 5 consecutive days, with a 2-day rest period, for a total of 4 repeated administrations.
  • a tumor size of more than 2,000 mm 3 was set as the humane endpoint.
  • the tumor size of each group (Fig. 3A) and the survival rate of each individual for 60 days (Fig. 3B) were observed.
  • the group administered the interleukin 2 analog 86 conjugate of the present invention showed a decrease in tumor size and a superior individual survival rate than the control group, and the dose-dependent anticancer efficacy of the sustained-release conjugate of the present invention was confirmed.
  • the group administered the interleukin 2 analog 86 conjugate at a dose of 4.0 mg/kg or more per week complete remission in which the tumor was completely removed was observed in some individuals. On the other hand, complete remission was not found in any individual in the control group.
  • the interleukin 2 analog conjugate of the present invention is designed to have a characteristic of binding to the beta subunit of the human interleukin 2 receptor that is relatively potent compared to aldesleukin, thereby exhibiting excellent anticancer efficacy. Specifically, it was confirmed that no side effects that required discontinuation of administration were observed even in a high-dose administration group of 10 mg/kg or more (based on the weight of the interleukin 2 analog portion in the sustained-release conjugate).
  • Example 10 Evaluation of anticancer efficacy of interleukin 2 analog long-acting conjugate in colorectal cancer
  • the interleukin 2 analog 86 conjugate was administered to a CT26 colon tumor syngeneic mouse model into which colon cancer cells (CT26) were syngeneically transplanted, and then the tumor size and individual survival rate were evaluated.
  • CT26 colon cancer cells
  • CT26 cells were subcutaneously injected into the thighs of BALB/c mice, and when tumors were observed with the naked eye a few days later, nine mice were assigned to each group so that the tumors had similar sizes.
  • the dosage of interleukin-2 analog 86 conjugate was 0.00016 mg/kg to 2 mg/kg based on the weight of the interleukin-2 analog moiety of the interleukin-2 long-acting conjugate, and each was administered subcutaneously once a week for a total of two repeated administrations.
  • control group (aldesleukin administration group) was administered 3.0 mg/kg of Proleukin injection (Novartis) intraperitoneally once a day for 5 consecutive days, with a 2-day rest period, for a total of two repeated administrations.
  • a tumor size of more than 2,000 mm 3 was set as the humane endpoint.
  • the tumor size of each group (Fig. 4A) and the survival rate of each individual for 65 days (Fig. 4B) were observed.
  • excellent anticancer efficacy was confirmed in the interleukin 2 analog 86 complex administration group.
  • complete remission was observed in 8 out of 9 animals in the 0.5 mg/kg administration group and in all animals in the 2.0 mg/kg administration group.
  • complete remission was observed in only 2 out of 9 animals in the control group.
  • survival rate the interleukin 2 analog 86 complex 0.5 mg/kg administration group showed 89% survival rate and the 2.0 mg/kg administration group showed 100% survival rate after 49 days, whereas the group administered aldesleukin showed 22% survival rate.
  • Example 11 Evaluation of anticancer efficacy of interleukin 2 analog long-acting conjugate in Lewis lung cancer mouse model
  • the interleukin 2 analog 86 conjugate was administered to a Lewis lung carcinoma mouse model (LL/2 tumor syngeneic mouse model) into which Lewis lung carcinoma cells (LL/2) were allogeneically transplanted, and then changes in tumor size were observed.
  • LL/2 cells (ATCC) were injected subcutaneously into the thighs of C57BL/6 mice, and when tumors were observed with the naked eye a few days later, eight mice were assigned to each group so that the tumors were similar in size. Each group was administered interleukin-2 analog 86 conjugate or aldesleukin.
  • interleukin-2 analog 86 conjugate based on the weight of the interleukin-2 analog part of the interleukin-2 long-acting conjugate, were administered subcutaneously once a week for a total of two repeated administrations, and 3.0 mg/kg of aldesleukin was administered intraperitoneally once a day for 5 consecutive days, with a 2-day rest period, for a total of two repeated administrations.
  • the interleukin 2 analog 86 conjugate not only exhibited dose-dependent anti-tumor efficacy in the Lewis lung cancer mouse model (Fig. 5A), but also exhibited a significant level of tumor growth inhibition compared to the control group (Fig. 5B). Since interleukin 2 can proliferate tumor-killing cells such as CD8 + T cells and NK cells by binding to the interleukin 2 receptor beta and gamma subunits, the interleukin 2 analog 86 conjugate according to the present invention is expected to enhance the proliferation of tumor-killing cells by strongly binding to the interleukin 2 receptor beta subunit.
  • the interleukin 2 analog 86 conjugate according to the present invention exhibited dose-dependent and statistically significant anticancer efficacy with only one administration per week (Fig. 5A and B).
  • the above results suggest that the interleukin 2 analog 86 complex induces anticancer efficacy by inducing the proliferation of tumor-killing cells, and further suggest that it can exhibit excellent anticancer efficacy regardless of the cancer immune environment.
  • Example 12 Evaluation of anticancer efficacy of interleukin 2 analog long-acting conjugate in a mouse model of renal cell carcinoma orthotopic transplantation
  • interleukin-2 analog 86 conjugates were administered subcutaneously to a renal cell carcinoma orthotopic transplantation mouse model, and then changes in tumor growth were observed using an in vivo imaging system (IVIS).
  • IVIS in vivo imaging system
  • RENCA-luc cells were injected into the kidneys of female Balb/c mice, and a few days later, when a fluorescent signal that could be considered a tumor was observed by imaging with IVIS, 10 mice were assigned to each group so that the average intensity was similar.
  • Each group was administered various doses of interleukin-2 analog 86 conjugate and formulation buffer as a control, respectively.
  • the interleukin-2 analog 86 conjugate administration group was administered 1.5, 6.0, or 25 mg/kg subcutaneously once a week for a total of 4 repeated doses
  • the control group was administered the formulation buffer of interleukin-2 analog 86 conjugate through the same administration route and interval as above.
  • Example 13 Evaluation of anticancer efficacy of interleukin 2 analog long-acting conjugate in a mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC)
  • pancreatic ductal adenocarcinoma pancreatic ductal adenocarcinoma
  • allograft tumor models were generated by subcutaneously injecting panc02 cells, a mouse-derived pancreatic ductal adenocarcinoma cell line, into the flank of 6-week-old female C57BL/6 mice. After 14 days, seven mice per group were randomly assigned based on tumor volume ( ⁇ 80 mm 3 ).
  • TGI tumor growth inhibition
  • % TGI (1-increased tumor volume from Day 0 to Day X in the experimental group / increased tumor volume from Day 0 to Day X in the negative control group) x 100
  • Example 14 Confirmation of memory response by interleukin 2 analog 86 complex in a cancer cure model
  • the interleukin 2 analogue according to the present invention or the sustained-release conjugate comprising the same exhibits binding affinity for altered interleukin 2 alpha receptors and beta receptors, and thus can be used to develop various drugs, particularly anticancer agents, utilizing the same.
  • the interleukin 2 analogue according to the present invention or the sustained-release conjugate comprising the same exhibits excellent anticancer effects on various cancer types, not limited to specific cancer types, and thus can be used to develop anticancer agents for various cancer types as indications.
  • the interleukin 2 analogue according to the present invention or the sustained-release conjugate comprising the same can induce an immune memory response in an individual, thereby inhibiting the recurrence of cancer.

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Abstract

본 발명은 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
인터루킨 2 (Interleukin 2)는 총 133개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로서, T 세포와 B 세포를 포함하는 면역 체계의 다양한 세포를 활성화시킨다. 인터루킨 2의 면역 자극제로서의 높은 효능은 암과 에이즈를 포함한 다양한 면역관련 병증을 치료하기 위해 사용할 수 있다 (대한민국 공개특허 제10-2017-0070091호). 현재 인터루킨 2(상표명 Proleukin)는 전이성 신세포암 및 전이성 흑색종의 치료용으로 FDA 승인을 받은 의약이다. 그러나 높은 복용량의 인터루킨 2 요법과 연관된 심각한 독성 때문에 적용 가능한 환자가 제한되며, 실제로 적합한 환자의 소수에 대해서만 이 치료 요법을 수행하고 있다. 인터루킨 2에 연관된 독성은 심한 열, 메스꺼움, 구토, 혈관 누출(vascular leak), 심한 저혈압, 폐 부종, 및 간 손상을 일으키는 혈관 누출 증후군(Vascular leak syndrome)을 포함한다.
인터루킨 2 수용체에는 3가지 서브유닛 수용체가 있다. 그 서브유닛은 알파 체인(IL-2Rα, CD25), 베타 체인(IL-2Rβ 또는 CD122) 및 감마 체인(IL-2Rγ 또는 CD132)으로 이루어져 있고, 인터루킨 2가 수용체 서브유닛들의 다양한 조합에 결합함으로써 여러가지 기능을 발휘 할 수 있다. 단일의 인터루킨 2 알파 수용체는 낮은 친화성 인터루킨 2 수용체로 불리며, 신호전달에는 관여하지 않는다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 중간 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 높은 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 다중 신호전달 경로의 키나아제 활성화를 통한 효과적인 신호 변환에 필요하다. 특히 인터루킨 2 베타 및 감마 결합 수용체는 CD8+ 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 두드러진다. 또한 높은 친화성의 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 보통 CD4+ T 조절 세포(Treg)뿐 만 아니라 최근 활성화된 T 세포에서 발견된다. 인터루킨 2 베타 수용체는 CD8+ T 세포 혹은 자연 살해 세포(NK cell)에 분포하여 체내 면역 반응에 관여하므로, 면역 활성화를 위해 베타 수용체에 대한 활성을 높임으로써 치료제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다.
특히, 최근 인체의 면역 체계를 활성화해 체내의 면역 세포가 암세포에 작용하여 항암 효과를 얻도록 하는 치료 방법이 연구되고 있다. 다만, 이러한 면역체계를 자극하는 약물을 항암 치료에 이용할 경우, 면역세포 과활성으로 인한 부작용이 문제되기 때문에, 안전하면서도 효과적인 항암 치료제를 발굴하는 것이 필요하다.
면역 체계를 활성화하여 항암 효과를 나타낼 수 있으면서도 안전한 치료제의 개발이 요구된다.
본 발명의 하나의 목적은 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속 형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제공하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 종양 생장 억제 효과를 나타내면서도 부작용을 낮추어 우수한 항암 치료제로 이용될 수 있다.
도 1은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체(아날로그 21, 41 및 52번)의 SDS-PAGE 결과이다.
도 2a 내지 2c는 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체(아날로그 21, 41 및 52번)의 순도 분석 결과이다.
도 3은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 악성 흑색종 동물 모델에서 항종양 효력을 평가한 결과이다. A는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델의 종양 크기, B는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델의 생존률을 확인한 결과이다. 도 3에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 4는 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 대장암종 동물 모델에서 항종양 효력을 평가한 결과이다. A는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델의 종양 크기, B는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델의 생존률을 확인한 결과이다. 도 4에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 5는 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 폐암 동물 모델에서 항종양 효력을 평가한 결과이다. A는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델의 종양 크기, B는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델의 11일차에서의 종양 크기를 나타낸 결과이다. 도 5에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 6은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 신세포암 동물 모델에서 항종양 효력을 평가한 결과이다. A는 부형제 대조군과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 각각 투여된 모델의 종양 크기를 생체 내 형광 이미지 분석기로 확인한 결과이고, B는 부형제 대조군과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 각각 투여된 모델의 생존률을 나타낸 결과이다. 도 6에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 7은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 췌장암 동물 모델에서 항종양 효력을 평가한 결과이다. A는 음성 대조군과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투여된 모델에서 종양 부피를 측정한 결과이다. 도 7에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 8은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체가 투여된 신세포암 동물 모델에서의 면역 기억 반응을 평가한 결과이다. 도 8에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
본 발명의 하나의 양태는 신규한 인터루킨 2 아날로그(interleukin 2 analog, 또는 IL-2 analog) 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물이다. 상기 인터루킨 2 (interleukin 2, IL-2) 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 인터루킨 2 아날로그인 알데스루킨(aldesleukin)에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그로서, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 지속형 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X - L - F
이 때 X는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고;
L은 폴리에틸렌글리콜 링커이며;
F는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 L의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 L의 반대쪽 말단에 X가 공유결합으로 연결됨.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 알데스루킨에 비해 증가된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13 내지 15, 17, 20 내지 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58 내지 60, 62, 71, 72, 74 내지 78, 85, 87, 89, 91 내지 94, 및 97 내지 106 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 17, 22, 42, 53, 56, 58 내지 60, 62, 71, 72, 74 내지 77, 87, 89, 91 내지 93, 98 내지 101, 및 103 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 지속형 결합체는 IgG4 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 지속형 결합체는 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역에서 유래한 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 438의 아미노산 서열을 갖는 단량체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 438의 아미노산 서열의 단량체의 동종이량체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 그 N-말단 프롤린의 질소 원자를 통하여 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 상기 폴리에틸렌글리콜 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 링커의 한 말단이 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역의 두 Fc 영역 사슬 중 하나의 Fc 영역 사슬에만 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 폴리에틸렌글리콜 링커는 분자량 1 kDa 내지 100 kDa의 링커인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 암은 신세포암, 흑색종, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 피부암, 유방암, 방광암, 위암, 두부 또는 경부암, 식도암, 후두암, 골암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌종양, 신경교종(성상세포종(astrocytoma), 교모세포종(glioblastoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 상의세포종(ependymoma), 배아세포종, 수막종, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종, 신경초종, 선천성종양, 두개인두종, 및 뇌종양으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 조성물은 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제공하기 위한 용도이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소류신 I
류신 L 라이신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명의 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그(analog) 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물을 구현하는 한 양태로는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 변경된 것, 특히 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 공지된 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증대된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력도 변화(증가 또는 감소)된 것으로서, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2(interleukin 2, IL-2)"란 생체 내 면역 시스템에서 신호 전달을 하는 사이토카인의 일종으로 면역 조절제를 의미한다. 인터루킨 2는 일반적으로 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 천연형에 비해 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 감소되거나 증가한, 천연형 인터루킨 2의 아미노산이 변이된 인터루킨 2 아날로그일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
상기 천연형 인터루킨 2는 인간 인터루킨 2 일 수 있으며, 이의 서열은 공지된 데이터베이스 등에서 얻을 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 천연형 인터루킨 2가 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다는 의미는 서열번호 1과 동일한 서열뿐만 아니라, 서열번호 1과 상동성 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 역시 본 발명의 천연형 인터루킨 2의 범주에 속한다는 의미이며, 아미노산의 변이 위치는 서열번호 1을 기준으로 상동성 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열을 배열(align) 했을 때 서열번호 1의 아미노산 서열 상에서 상응되는 위치가 변이된 것을 의미한다.
본 발명에서 용어, “알데스루킨(aldesleukin)”는 상업적으로 구매 가능한 인터루킨 2 아날로그로서, aldesleukin(상표명: Proleukin®)일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 본 발명에서는 “인터루킨 2 아날로그 1”과 혼용되어 사용된다. 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 상기 인터루킨 2 아날로그 1에 비해 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및/또는 증대된 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있다.
인터루킨 2 알파 수용체는 인터루킨 2의 신호전달 체계에는 관여하지 않는 것으로 알려져 있지만, 다른 인터루킨 2 수용체(베타 혹은 감마)와 인터루킨 2의 결합력을 10배~100배 증가시키며, CD4+ 조절 T세포 등에 발현되어 있다.
인터루킨 2 베타 수용체는 CD8+ T 세포 혹은 자연 살해 세포 (NK cell)에 주로 분포되어 면역 반응과 대식세포 작용을 활성화하고, 종양 사멸 세포를 증식 시키는데 주요한 기능을 수행하므로, 인터루킨 2 베타 수용체의 활성화를 통해 종양 세포 사멸 및 신체 면역 반응 활성화를 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명의 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증가된 인터루킨 2 아날로그는 종양 억제 및 사멸과 같은 치료효과는 증대되고, 부작용은 감소한 치료효과를 가질 수 있다.
하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13 내지 15, 17, 20 내지 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58 내지 60, 62, 71, 72, 74 내지 78, 85, 87, 89, 91 내지 94, 및 97 내지 106 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 17, 22, 42, 53, 56, 58 내지 60, 62, 71, 72, 74 내지 77, 87, 89, 91 내지 93, 98 내지 101, 및 103 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 명세서에서 '특정 서열번호로 구성되는 인터루킨 2 아날로그'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 인터루킨 2 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
임의의 두 염기 서열 또는 펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
염기 서열 또는 펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 알파 및/또는 베타 수용체와의 결합력을 약화 또는 증가시켜 in vitro 활성을 변화시키는 새로운 인터루킨 2의 대체제로 이용될 수 있다. 특히, 베타 수용체에 대한 결합력을 증가시킬 뿐만 아니라, 알파 수용체에 대한 결합력이 변화(증가 또는 감소)되어 두 수용체에 대한 활성으로 인해 효과적인 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명에서, 인터루킨 2의 아날로그의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 인터루킨 2의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 4-이미다조아세트산 (4-imidazoacetic acid) 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 재조합 방법으로도 생산 가능하고, 상업적으로 의뢰하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:
(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는
(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.
본 발명에서 천연형 인터루킨 2 수용체에 대한 어떠한 인터루킨 2 아날로그 (또는 이를 포함하는 지속형 결합체)의 결합력이란 수용체에 대한 친화력을 측정하는 방법으로, SPR(surface plasmon resonance)를 이용할 수 있다.
구체적으로, SPR 분석 시 단백질-리간드 결합 원리를 이용하여 센서 칩에 인터루킨 2 수용체를 고정화하고, 연속 희석법을 이용하여 실험 버퍼에 희석된 인터루킨 2 아날로그를 흘려주어 고정화된 수용체와의 결합을 유도한 후, 동일한 유속으로 실험 버퍼만을 흘려주어 수용체와 인터루킨 2 아날로그의 해리를 유도하여 결합력을 측정하거나, 센서 칩에 인간 면역글로불린 Fc 영역에 대한 항체를 먼저 고정시킨 뒤 Fc 영역이 결합된 인터루킨 2 수용체를 고정화하고 인터루킨 2 아날로그를 흘려주어 결합력을 측정하는 방법이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 비오틴이 표지된 인간 인터루킨 2 수용체를 스트렙타비딘 바이오 센서칩에 고정화하고, 2배 연속 희석법으로 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체를 분당 20 μL의 유속으로 3분간 흘려준 후, 동일한 유속으로 HBS-EP+ 버퍼만을 3분간 흘려주어 인터루킨 2 수용체와 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 해리를 유도한 다음 얻어진 결합 상수 및 해리 상수를 Bioaevaluation 프로그램을 사용하여 1:1 binding fitting model에 따라 결합력을 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨(aldesleukin; 또는 인터루킨 2 아날로그 1)에 비해 감소되거나 증가된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 가질 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력과 비교하여 약 0.001배 이상, 약 0.005배 이상, 약 0.01배 이상, 약 0.05배 이상, 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 0.9배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.7배 이상의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또는, 알데스루킨의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력(100%)을 기준으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 아예 결합력을 상실하거나, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 7% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 70% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상의 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 1.0배이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 약 100배 이상의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경, 또는 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또는, 알데스루킨의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력(100%)을 기준으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 약 5% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30%이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 약 200% 이상, 약 500% 이상, 약 700% 이상, 약 1000% 이상, 약 1500% 이상, 약 3000% 이상, 약 5000% 이상, 약 7000% 이상, 약 10000%이상, 약 12000%이상, 약 15000% 이상, 약 20000% 이상, 약 25000% 이상의 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 변경되고, 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시 형태에서는 본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 제조하기 위하여, 천연형 인터루킨 2(서열번호 1)를 바탕으로 변이를 도입한 인터루킨 2 아날로그를 제조하였다. 본 발명에서 제조된 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 또는 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열로 코딩되는 것일 수 있다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산은 서열번호 1의 천연형 인터루킨 2를 코딩하는 염기 서열에서 특정 위치의 아미노산에 변이(아미노산 결실, 치환, 및/또는 추가)를 도입할 수 있도록 변형된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 3 내지 106 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 일 예로서, 본 발명의 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열을 가지거나 포함할 수 있다.
본 발명의 염기 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 핵산을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 108 내지 211의 서열 중 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 핵산은 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명의 핵산은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
상동성 또는 동일성에 관해서는 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨, 또는 알데스루킨 대비 체내 반감기가 증가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 반감기 증가를 위한 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)이 인터루킨 2 아날로그에 직접 또는 링커를 통해 결합하여, 반감기가 증가된 지속형 결합체 형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 지속형 결합체는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 높인 인터루킨 2 아날로그를 포함할 뿐만 아니라, 이의 반감기를 증가시키기 위한 대표적인 캐리어로서 면역글로불린 Fc 영역과 결합시켜 인터루킨 2 아날로그의 반감기가 증가되고, 혈중 노출도가 높아지며 생체 내 면역반응이 증가하여 암세포의 성장 억제 및 감소를 효과적으로 달성할 수 있다.
이상의 내용은 본 발명의 다른 구체예 혹은 다른 양태에도 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 구현하는 다른 양태로는 상기 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체는, 인터루킨 2 아날로그에 이의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 생체적합성 물질이 결합된 형태일 수 있다. 본 명세서에서 상기 생체적합성 물질은 캐리어와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 상기 지속형 결합체는 캐리어가 결합되지 않은 인터루킨 2 아날로그에 대비하여 증가된 효력의 지속성을 나타낼 수 있으며, 본 발명에서는 이러한 결합체를 "지속형 결합체" 또는 “결합체”로 지칭한다.
한편, 이러한 결합체는 비자연적으로 발생된(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는, 지속형 결합체이다:
[화학식 1]
X - L - F
이 때 X는 상기 인터루킨 2 아날로그이고;
L은 폴리에틸렌글리콜 링커이며;
F는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 L의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 L의 반대쪽 말단에 X가 공유결합으로 연결됨.
보다 구체적으로, 상기 지속형 결합체는 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에 X 한 분자가 L을 통하여 연결된 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 지속형 결합체에서 X와 L, 및 L과 F는 공유결합으로 서로 연결되는 것일 수 있으며, 이때 상기 결합체는 화학식 1의 순서로, X, L, 및 F가 공유결합을 통하여 각각 연결된 결합체일 수 있다.
본 발명의 지속형 결합체의 인터루킨 2 아날로그는 결합체의 일부를 이루지 않고 단독으로 존재할 때 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 변경된 것, 특히 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 결합체의 일부를 이루지 않고 단독으로 존재할 때 천연형 인터루킨 2 또는 공지된 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증대된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력도 변화(증가 또는 감소)된 것일 수 있다.
본 발명에서, 인터루킨 2 아날로그는 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티의 구성에 해당할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 X에 해당하고, 인터루킨 2 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 결합체에서 F는 X, 즉 인터루킨 2 아날로그의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성에 해당한다.
상기 F는 X와 공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG Fc 영역, 또는 비당쇄화된 IgG4 Fc 영역일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 한 예로, 상기 F(면역글로불린 Fc 영역)는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 펩타이드 내의 하나 이상의 아미노산 측쇄는 생체 내에서 가용성 및/또는 반감기를 증가시키고/시키거나 생체이용율을 증가시키기 위해 이러한 생체적합성 물질에 접합될 수 있다. 이러한 변형은 또한 치료학적 단백질 및 펩타이드의 소거(clearance)를 감소시킬 수 있다.
상술한 생체적합성 물질은 수용성(양친매성 또는 친수성) 및/또는 무독성 및/또는 약학적으로 허용가능한 것일 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 지속형 결합체는 인터루킨 2 아날로그와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F에 해당한다.
본 명세서에서 Fc 영역이라고 하면 면역글로불린의 파파인 소화에서 얻는 천연형 서열뿐 아니라 그 유도체, 예컨대 천연 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 변환되어 천연형과 상이하게 된 서열등 변형체까지 망라하여 포함된다. 상기 유도체, 치환체, 변형체는 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 것을 전제로 한다. 본 발명에서, F는 사람 면역글로불린 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 “생체적합성 물질” 또는 “캐리어”는 상기 Fc 영역을 의미할 수 있다.
상기 F(면역글로불린 Fc 영역)는, 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결되어 있는 구조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소 원자를 통한 연결은 라이신의 입실론 아미노 원자나 N-말단 아미노기에 환원적 아민화를 통하여 연결될 수 있다.
환원적 아민화 반응이란 반응물의 아민기 또는 아미노기가 다른 반응물의 알데히드(즉, 환원적 아민화가 가능한 작용기)와 반응하여 아민을 생성한 다음, 환원 반응에 의해 아민 결합을 형성시키는 반응을 의미하여, 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 유기합성 반응이다.
본 발명의 지속형 결합체의 하나의 구체예로서, 상기 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 그 N-말단 질소 원자를 통하여 링커에 연결된 것일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "힌지 서열"은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 418).
상기 힌지 서열은 서열번호 418의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 419), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(서열번호 420), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 421), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(서열번호 422), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 423), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 424), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 425), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 426), Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 427), Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 428), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 429), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 430), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 431), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 432), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(서열번호 433), Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 434), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 435), Glu-Pro-Ser-Cys(서열번호 436), Ser-Cys-Pro(서열번호 437).
더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 428(Pro-Ser-Cys-Pro)또는 서열번호 437(Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지속형 결합체의 한 더욱 구체적인 형태에서, 상기 결합체내 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단은 프롤린이고, 이 결합체는 상기 프롤린의 질소 원자를 통하여 Fc 영역이 링커에 연결된 것이다.
본 발명의 지속형 결합체의 한 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열이 존재함으로써 면역글로불린 Fc 영역의 사슬 두 개가 동종이량체(homodimer)나 이종이량체(heterodimer)를 형성한 이량체 형태일 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 결합체는 링커의 일 말단이 이량체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄 불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 또는 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린들로 구성된, 이량체 또는 다량체 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 지속형 결합체의 하나의 실시 형태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체(이합체 dimer)이며, 이 때 상기 Fc 영역 이량체 F와 X는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 하나의 링커 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 한 구체예에서, X는 이러한 Fc 영역 이량체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩타이드 사슬에만 링커 L을 통하여 공유결합으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 더욱 구체적인 예시에서, 이러한 Fc 영역 이량체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 X가 연결된 하나의 폴리펩타이드 사슬에는 한 분자의 X만이 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 가장 구체적인 예시에서 상기 F는 동종이량체이다.
다른 구체예에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지속형 결합체의 다른 실시 형태에서는, 이량체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc 영역과 X는 L에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고, 펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체예로서, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc의 단편으로서, 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합(inter-chain 형태)을 통해 2개의 단량체가 연결된 동종이합량체일 수 있으며, 이 때 동종이량체는 각 단량체에서 35번 및 95번의 시스테인 사이 및 141번 및 199번의 시스테인 사이에 이황화 결합, 즉 2개의 이황화 결합(intra-chain 형태)을 가지거나/가질 수 있다.
각 단량체의 아미노산 수는 221개의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 동종이량체를 형성하는 아미노산은 전체 442개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 면역글로불린 Fc 절편은 서열번호 438의 아미노산 서열(221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이량체를 형성하고, 상기 동종이량체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화학식 1의 F는 서열번호 438의 아미노산 서열인 단량체를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 F는 서열번호 438의 아미노산 서열의 단량체의 동종이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 예로, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 439의 아미노산 서열 (442개의 아미노산으로 구성됨)을 포함하는 동종이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 X는 당쇄화되어 있지 않을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해, 또는 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 "폴리에틸렌 글리콜 링커"는 에틸렌글리콜 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 폴리에틸렌 글리콜 링커는 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있으며, 본 명세서에서, 상기 링커는 “비펩타이드성 링커” 또는 “비펩타이드성 중합체”와 혼용되어 사용될 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 양쪽 말단에 F(구체적으로 면역글로불린 Fc 영역) 및 X(구체적으로 인터루킨 2 아날로그)와 결합될 수 있는 반응기를 포함하는 비펩타이드성 링커를 통하여 F와 X가 서로 공유결합적으로 연결된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 비펩타이드성 링커는 말단에 반응기를 포함하여, 결합체를 구성하는 다른 구성 요소와 반응을 통해 결합체를 형성할 수 있다. 양 말단에 반응성 작용기를 갖는 비펩타이드성 링커가 각 반응기를 통해 상기 화학식 1의 X 및 F와 결합하여 결합체를 형성할 경우, 상기 비펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 중합체 연결부(linker moiety) 또는 비펩타이드성 링커 연결부로 명명할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 상기 L(폴리에틸렌글리콜 링커)은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 상기 폴리에틸렌글리콜은 에틸렌글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체(mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 폴리에틸렌글리콜 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함하면서, 결합체로 구성되기 이전에는 결합체의 제조에 이용되는 작용기를 말단에 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 결합체는 상기 작용기를 통해 X와 F가 연결된 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 비펩타이드성 링커는 2개, 또는 3개 이상의 작용기를 포함할 수 있고, 각 작용기는 동일하거나, 서로 상이할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 2로 표시되는 반복단위를 포함하는 것일 수 있다. 그 예로 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 2]
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여기서, n= 10 내지 2400, n= 10 내지 480, 또는 n = 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지속형 결합체에서 PEG 모이어티는, -(CH2CH2O)n-구조 뿐만 아니라 연결 요소와 이 -(CH2CH2O)n- 사이에 개재하는 산소 원자도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체예로, 상기 에틸렌글리콜 반복단위는 그 예로, [OCH2CH2]n로 표시될 수 있으며, n 값은 자연수로 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체 내의 [OCH2CH2]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 O 초과 내지 약 100 kDa이 되도록 정해질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또 하나의 예로, 상기 n 값은 자연수로 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체 내의 [OCH2CH2]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 약 1 내지 약 100 kDa, 약 1 내지 약 80 kDa, 약 1 내지 약 50 kDa, 약 1 내지 약 30 kDa, 약 1 내지 약 25 kDa, 약 1 내지 약 20 kDa, 약 1 내지 약 15 kDa, 약 1 내지 약 13 kDa, 약 1 내지 약 11 kDa, 약 1 내지 약 10 kDa, 약 1 내지 약 8 kDa, 약 1 내지 약 5 kDa, 약 1 내지 약 3.4 kDa, 약 2 내지 약 30 kDa, 약 3 내지 약 30 kDa, 약 3 내지 약 27 kDa, 약 3 내지 약 25 kDa, 약 3 내지 약 22 kDa, 약 3 내지 약 20 kDa, 약 3 내지 약 18 kDa, 약 3 내지 약 16 kDa, 약 3 내지 약 15 kDa, 약 3 내지 약 13 kDa, 약 3 내지 약 11 kDa, 약 3 내지 약 10 kDa, 약 3 내지 약 8 kDa, 약 3 내지 약 5 kDa, 약 3 내지 약 3.4 kDa, 약 8 내지 약 30 kDa, 약 8 내지 약 27 kDa, 약 8 내지 약 25 kDa, 약 8 내지 약 22 kDa, 약 8 내지 약 20 kDa, 약 8 내지 약 18 kDa, 약 8 내지 약 16 kDa, 약 8 내지 약 15 kDa, 약 8 내지 약 13 kDa, 약 8 내지 약 11 kDa, 약 8 내지 약 10 kDa, 약 9 내지 약 15 kDa, 약 9 내지 약 14 kDa, 약 9 내지 약 13 kDa, 약 9 내지 약 12 kDa, 약 9 내지 약 11 kDa, 약 9.5 내지 약 10.5 kDa, 또는 약 10 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 인터루킨 2 아날로그와 면역글로불린 Fc 영역(F)이 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커(L)를 통해 공유 결합으로 연결된 구조 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 하나의 구체적인 실시 형태에서, 상기 지속형 결합체에서, 상기 L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며, F는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 상기 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다른 구체적인 실시 형태에서는 상기 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커의 한 말단이 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역의 두 Fc 영역 사슬 중 하나의 Fc 영역 사슬에만 연결되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 링커의 분자량은 0 초과 200 kDa 범위, 구체적으로, 약 1 내지 100 kDa 범위, 약 1 내지 50 kDa 범위, 약 1 내지 30 kDa 범위, 약 2 내지 30 kDa 범위, 약 1 내지 20kDa 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa 내지 10 kDa, 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 F에 해당하는 폴리펩타이드와 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 F 및 X와 결합하지 않은 상태에서 양 말단에 반응기를 갖고, 상기 반응기를 통해 F 및 X와 결합하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 링커의 양 말단은 면역글로불린 Fc 영역의 티올기, 아미노기, 하이드록실기 및 인터루킨 2 아날로그(X)의 티올기, 아미노기, 아지드기, 하이드록실기에 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 링커는 양쪽 말단에 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인터루킨 2 아날로그(X)와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 시스테인의 티올기; N-말단, 리신, 아르기닌, 글루타민 및/또는 히스티딘에 위치한 아미노기; 및/또는 C-말단에 위치한 하이드록실기와 결합되고, 인터루킨 2 아날로그(X)의 시스테인의 티올기; 리신, 아르기닌, 글루타민 및/또는 히스티딘의 아미노기; 아지도리신의 아지드기; 및/또는 하이드록실기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 링커의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 링커는 상기와 같은 반응기를 통해 면역글로불린 Fc 영역인 F 및 인터루킨 2 아날로그인 X에 연결되어, 링커 연결부로 전환될 수 있다.
또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 링커의 양쪽 말단의 반응기는 서로 동일하거나 또는 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 양 말단에 알데히드기를 갖거나, 또는, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 그러나, 링커의 각 말단에 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역과 X가 결합될 수 있다면, 특별히 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 링커의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드 기를 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기 등을 포함할 수 있다.
양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 링커로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체를 제조할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 링커는 X의 시스테인 잔기, 보다 구체적으로 시스테인의 -SH 기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 시스테인 잔기의 -SH 기에 링커의 반응기가 연결될 수 있으며, 반응기에 대해서는 앞서 기술한 내용이 모두 적용된다. 만약, 말레이미드-PEG-알데히드를 사용하는 경우, 말레이미드 기는 X의 -SH 기와 티오에테르(thioether) 결합으로 연결하고, 알데히드기는 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc의 -NH2기와 환원적 아민화 반응을 통해 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 링커는 X의 라이신 잔기, 보다 구체적으로, 라이신의 아미노기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 결합체에서, 링커의 반응기가 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치한 -NH2와 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 결합체에서, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 반응기를 갖는 링커와 C-말단을 통해 연결될 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.
본 발명에서 "C-말단"은, 펩타이드의 카르복시 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, C-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함한다.
본 명세서에서 따로 가리키는 바가 없으면, 본 발명에 따른 "인터루킨 2 아날로그" 또는 인터루킨 2 아날로그가 생체적합성 물질에 공유결합으로 연결된 "결합체"에 대한 명세서 상세한 설명이나 청구 범위의 기술은 해당 인터루킨 2 아날로그 또는 결합체는 물론이고, 해당 인터루킨 2 아날로그 또는 결합체의 염(예컨대, 상기 인터루킨 2 아날로그의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함하는 범주에도 적용된다. 따라서 명세서에 "인터루킨 2 아날로그" 또는 "결합체"라고만 기재되어 있더라도 해당 기재 내용은 그 특정 염, 그 특정 용매화물, 그 특정 염의 특정 용매화물에도 마찬가지로 적용된다. 이러한 염 형태는 예를 들어 약학적으로 허용되는 임의의 염을 사용한 형태일 수 있다. 상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물일 수 있고, 구체적으로는 암 예방 또는 치료 용도를 갖는 약학적 조성물일 수 있다. 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체는 상기에서 설명한 바와 같다. 더 구체적으로는, 약리학적 유효량의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 구체적인 예로, 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그; 또는 이를 포함하는 지속형 결합체를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 22, 42, 53, 87, 105, 및 106으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그; 또는 상기 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “약리학적 유효량”이란, 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체가 암의 예방 또는 치료 효과를 나타내면서도 환자에게 독성이나 부작용을 나타내지 않는 안전한 투여 용량을 의미하며, 인터루킨 2 수용체, 구체적으로는 베타 및/또는 알파 수용체에 유의미한 활성을 나타낼 수 있는 투여 용량을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 하기 특성 중 하나 이상의 특성을 나타내는 것일 수 있으나, 증대된 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 바탕으로 한 면역 반응 증가 및 항암 효과 등을 나타내는 이상, 제한되는 것은 아니다:
(i) 알데스루킨에 비해 높은 혈중 노출도;
(ii) 알데스루킨에 비해 우수한 종양 생장 억제
(iii) 알데스루킨에 비해 우수한 기억 T 세포 생성 반응, 및
(iv) 알데스루킨에 비해 우수한 종양 사멸 세포 증식 반응.
T 세포 성장 인자로 알려진 인터루킨 2는 면역 조절에 관여하는 단백질로, T세포를 증식시키고, B세포를 자극시키며, T세포에 작용하여 γ-인터페론을 분비시키는 활성을 갖는다. 이러한 인터루킨 2의 면역 조절 활성에 기초하여 체내 면역 시스템을 이용해 암 세포를 제거함으로써 암의 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다.
특히, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 신호 전달에서 주요한 역할을 담당하는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 증대된 결합력을 갖고, 이는 개체의 면역 시스템에서 보다 효과적인 항암 효과로 이어지게 된다. 또한, 상기 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체는 증대된 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 가지면서도 지속성이 높아지면서 혈중 노출도가 높아져 우수한 생체 이용율을 나타내며, 결국 우수한 종양 생장 억제능을 가져 효과적인 암 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 우수한 기억 T 세포 생성능을 가져 개체의 면역 기억 반응을 통한 암의 재발 억제 효과를 나타낼 수 있어, 안전하면서도 효과적인 암 치료제로 활용될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2, 알데스루킨, 또는 이를 포함하는 지속형 결합체의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력과 비교하여, 아예 결합력을 상실하거나, 약 0.001배 이상, 약 0.005배 이상, 약 0.01배 이상, 약 0.05배 이상, 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.6배 이상, 약 0.7배 이상, 약 0.8배 이상, 약 0.9배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.3배이상, 약 1.5배 이상, 약 1.7배이상의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2, 알데스루킨, 또는 이를 포함하는 지속형 결합체의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 1.0배이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 약 100배, 약 130배, 약 150배, 약 200배 이상의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경, 또는 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서, 상기 암은 신세포암, 흑색종, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 피부암, 유방암, 방광암, 위암, 두부 또는 경부암, 식도암, 후두암, 골암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌종양, 신경교종(성상세포종(astrocytoma), 교모세포종(glioblastoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 상의세포종(ependymoma), 배아세포종, 수막종, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종, 신경초종, 선천성종양, 두개인두종, 또는 뇌종양을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 암은 대장암, 간암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 폐암, 피부암, 흑색종, 유방암, 방광암, 및 위암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다. 또는 본 발명에 따른 암은 원발성 암, 재발성 암, 또는 전이성 암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전이성 신세포암, 또는 전이성 흑색종을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 인터루킨 2 아날로그 (예컨대 상기 인터루킨 2 아날로그 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태) 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 암 또는 종양을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 상기 인터루킨 2 아날로그 (예컨대 상기 인터루킨 2 아날로그 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태) 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체의 사용은 혈중 노출도, 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 암의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함한 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투여 앰플 또는 다수회 투여 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 인터루킨 2 아날로그, 이를 포함하는 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 인터루킨 2 아날로그 및/또는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체, 이를 포함하는 조성물, 암, 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 개체는 암이 발병하였거나 의심되는 개체로서, 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 및/또는 결합체, 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질(예를 들어, 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체) 을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 약학적 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 투여시 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인터루킨 2 아날로그 또는 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것은, 인터루킨 2 아날로그 또는 지속형 결합체로 인한 목적하는 약리 활성(예를 들어, 암의 예방, 개선 또는 치료)을 얻을 수 있는 정도를 의미하고, 또한 투여되는 개체에서 독성 또는 부작용이 일어나지 않거나 미미한 수준으로서 약학적으로 허용되는 수준을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 약학적 유효량은 투여 횟수, 환자, 제형 등을 종합적으로 고려하여 결정될 수 있다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학적 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약학적 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하여, 본 발명의 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다. 상기 약학적 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것일 수 있으나, 목적하는 약리 효과를 얻을 수 있다면 특정 투여 경로로 제한되지 않는다.
한 예로, 본 발명의 약학적 조성물은 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 또는 1개월에 1회 투여되는 것일 수 있고, 또는 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 1회 또는 다회 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 이를 포함하는 조성물의 용도이다.
상기 인터루킨 2 아날로그 및/또는 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 암, 예방, 치료, 투여 경로 및 투여 횟수에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 인터루킨 2 아날로그 및/또는 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 암, 예방, 치료, 투여 경로 및 투여 횟수에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
한편, 본원 명세서에서 문맥상 달리 요구하지 않는 한, “포함한다”, “포함하는”, “함유하는”, 등의 표현은 명시된 정수(integer) 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만, 다른 정수 또는 정수의 집합을 배제하는 것이 아니라고 이해되어야 한다.　
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 천연형 인터루킨 2 및 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터의 제작
133개의 아미노산을 코딩하는 천연형 인터루킨 2 발현 벡터를 제작하기 위해, 보고된 인터루킨 2 서열 (NM_000586.3; 서열번호 1)을 바탕으로 합성한 인터루킨 2를 pET-22b 벡터 (Novagen)에 클로닝하였다. 아울러, 상기 인터루킨 2를 주형으로 하여 인터루킨 2의 아미노산을 변형시킨 신규한 인터루킨 2 아날로그를 제작하였다.
인터루킨 2 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 60초, 65℃에서 6.5분으로 이 과정을 16회 반복하였다. 상기 조건에서 얻어진 돌연변이(mutagenesis) 생성물에 대하여 서열 분석을 수행하였으며, 각각의 인터루킨 2 아날로그의 목적하는 변이 위치에 천연형 기준으로 아래 표 1에 표시한 변이가 있는 것을 확인하였다. 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인터루킨 2 아날로그 1 내지 105라 명명하였다.
하기 표 1에 각각의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 이들 인터루킨 2 아날로그를 제작하기 위해 순방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머로PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
아래 표 1에서 아날로그 1은 알데스루킨이고, 프라이머 #1 내지 #204는 서열번호 214 내지 417에 각각 해당한다. 표 1은 인터루킨 2 아날로그 종류와 변이 위치 및 그 변화 서열을 정리한 것이다.
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desA1은 인터루킨 2의 첫번째 아미노산(알라닌)을 결실시킨 것을 의미한다. 하기 표 2에 인터루킨 2 아날로그의 전장 길이 아미노산 서열을 나타냈다. 하기 표 2 내의 볼드체는 변이 위치를 나타낸 것이다. 표 2는 인터루킨 2 아날로그 아미노산 서열을 정리한 것이다.
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실시예 2: 인터루킨 2 아날로그의 발현
상기 실시예 1에서 제조한 발현 벡터를 이용하여, T7 프로모터 조절하의 재조합 인터루킨 2 아날로그를 발현시켰다. 각각의 재조합 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터로 발현 대장균 균주, E.coli BL21DE3(E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB -mB -) gal λ(DE3); 노바젠사)을 형질 전환하였다. 형질전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 이용하였다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여, 암피실린(50 μg/mL)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여, 각 1 mL씩 cryo-튜브에 분주하고, -150℃에 보관하였다. 이를 재조합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인터루킨 2 아날로그의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알(vial)을 녹여 500 mL의 2X LB에 접종하고, 37℃에서 14 ~ 16시간 동안 진탕 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도 값이 4.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(Bioflo-320, NBS, 미국)를 이용하여, 종 배양액을 1.6 L의 발효 배지에 접종하고, 초기 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 2.0 L/min(1vvm), 교반 속도 650 rpm 및 30% 암모니아수를 사용하여, pH 6.7로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가 배지(feeding solution)을 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하고, 흡광도 값 70 이상에서 최종 농도 500 μM의 IPTG를 도입하였다. 배양은 IPTG 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하였으며, 배양 종료 후 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수확하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 인터루킨 2 아날로그의 추출 및 재접힘(refolding)
상기 실시예 2에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 발현 대장균으로부터 인터루킨 2 아날로그를 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 재접힘을 유도하였다. 배양액 100 mL 분량에 해당하는 세포 펠렛을 1 - 200 mL의 파쇄 완충 용액 (20 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM EDTA pH 9.0, 0.2 M NaCl, 0.5% Triton X-100)에 부유시킨 후, 미세용액화(Microfludizer)를 이용하여 15,000 psi로 재조합 대장균을 파쇄하였다. 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 400 mL의 첫번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 두번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 세번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1% sodium deoxycholorate)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 네번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1 M NaCl)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 세척된 대장균 봉입체 (inclusion body) 펠렛을 수득하였다. 세척된 봉입체 펠렛을 400 mL의 가용/환원화 완충액 (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT)에 재부유하여 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 가용/환원된 인터루킨 2 아날로그에 증류수 100 mL를 넣어 6 M Guanidine을 4.8 M Guanidine으로 희석한 후 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 펠렛은 버리고 용액만 수득하였다. 희석된 용액에 증류수 185.7 mL를 추가로 넣어 4.8 M Guanidine을 3.5 M Guanidine으로 희석한 후 100% acetic acid를 이용하여 pH를 5.0로 맞추었다. pH 조정된 용액을 상온에서 1시간 교반하였다. 불순물이 침전된 용액은 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 마지막 세척 완충 용액 (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 세척된 인터루킨 2 아날로그를 400 mL의 재접힘 완충 용액 (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl2)으로 용해시킨다. 혼합용액을 4℃에서 15 - 24 시간 동안 교반함으로서 재접힘 과정을 수행하였다.
실시예 4: 크기 배제 컬럼 크로마토그래피
상기 실시예 3에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 재접힘 용액을 크기 배제 컬럼에 적용하여 정제하기 위하여 1 mL이하로 농축하였다. 컬럼은 재접힘 용액 도입 전 완충 용액 (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0)으로 평형화하였고, 재접힘 용액 도입후 완충 용액 흘려주어 용출하였다. 용출된 시료는 Guanidine을 포함하고 있어 안정화 용액 (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose)로 바꿔준 후 RP-HPLC, peptide mapping 분석을 통해 순도를 측정하였다. 측정된 순도가 80%이상이면 실험에 사용하였다.
실시예 5: 인터루킨 2 아날로그의 수용체 결합력 평가
상기 실시예 4에서 얻은 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 수용체와 베타 수용체 각각의 수용체 결합력을 측정하기 위하여 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR, BIACORE T200, GE healthcare)을 사용하였다. 제조된 아날로그의 알파 수용체 및 베타 수용체에 대한 결합력을 측정하고, 인터루킨 2 아날로그 1(aldesleukin)과 각 결합력을 비교하였다.
먼저 CM5칩(GE healthcare사)에 아민 결합법(amine coupling)을 통해 항 인간 면역글로블린 항체(Abcam사, #ab97221)를 약 5,000 RU (resonance unit)만큼 고정화한 후, 항원 항체 결합 반응을 이용하여 인간 면역글로블린 Fc부위가 결합된 인터루킨 2 알파 수용체(SYMANSIS사, #4102H) 또는 인터루킨 2 베타 수용체(SYMANSIS사, #4122H)를 각각 면역글로블린 항체에 결합시켜 최종 고정화 하였다. 그 다음으로 상기에서 재조한 재조합 인터루킨 2 아날로그를 농도별로 2배 연속희석법으로 HBS-P+ 버퍼(Cytiva사, BR100671)에 희석하고, 인터루킨 2 수용체가 최종 고정된 CM5칩에 흘려주어 각 인터루킨 2 수용체의 결합력을 측정하였다. 결합력은 결합 속도(Ka)와 해리 속도(Kd)를 이용하여 측정하였으며, 10 uL/분의 유속으로 인터루킨 2 아날로그를 3분간 흘려 결합 속도를 측정하고, 동일한 시간과 유속으로 HBS-P+ 버퍼만 흘려 주어 각 인터루킨 2 수용체로부터의 해리 속도를 측정하였다. 측정이 완료되면, Biaevaluation 프로그램에서 1:1 binding fitting model에 따라 수용체의 결합력 평가를 진행하였다.
상대적 결합력 KD (%) = 아날로그 1(aldesleukin) 해리상수(Kd) / 아날로그 해리상수(Kd) × 100
아래 표 3에서 “정의 불가”는 표면 플라스몬 공명 측정에서 해당 수용체에 대한 결합이 관측되지 않음에 따라 그 수용체에 한해서는 해당 물리량을 정의할 수 없다는 것을 가리킨다. 표 3은 인터루킨 2 아날로그 1(aldesleukin) 대비 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체 상대적 결합력을 정리한 것이다.
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상기 시험 결과(표 3)에서 명시된 바와 같이 본 발명의 인터루킨 2 아날로그들은 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 아예 상실하거나, 인터루킨 2 아날로그 1에 비하여 감소 또는 증가하는 등 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 상이한 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, 인터루킨 2 베타 수용체에 대해서는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비하여 더 강한 결합력이 확인되었다. 이를 통해 인터루킨 2 아날로그의 아미노산 서열이 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체의 결합에 영향력이 있음을 확인하였다. 이는 특정 위치의 아미노산을 치환 함으로써 인터루킨 2 수용체의 결합력을 변화시킬 수 있음을 시사하는 바이다.
상기와 같은 실험 결과는 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그가 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 가져, 이를 활용한 다양한 약물 개발에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 6: 인터루킨 2 아날로그와 폴리에틸렌 글리콜 (3.4K PEG) 링커의 연결 반응 및 인터루킨 2 아날로그 연결체의 정제
상기 실시예 4에서 얻은 인터루킨 2 아날로그를 면역글로불린 Fc 영역에 결합한 지속형 결합체를 제조하기 위하여 인터루킨 2 아날로그를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커의 한 말단에 연결시킨 연결체를 먼저 제조하였다. 연결체 제조에는 21번, 41번, 52번, 86번, 104번과 105번의 인터루킨 2 아날로그를 사용하였고, PEG 링커로는 분자량이 3.4 kDa이고, 양 말단의 히드록시 수소가 프로필알데히드기로 개질된 폴리에틸렌글리콜(일본 NOF사의 ALD(2)3.4K PEG)을 사용하여 이를 상기 인터루킨 2 아날로그의 N-말단에 연결 반응 시켰다. 인터루킨 2 아날로그 : PEG 링커의 몰 비율은 1:15~1:20으로, 인터루킨 2 아날로그 농도는 1 mg/mL 이하로 하여 2 내지 10℃에서 1시간 반응 시켰다. 이때 반응은 100 mM 인산칼륨(pH 5.5) 하에서 이루어 졌고, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드(Sodium cyanoborohydride, SCB)를 첨가하였다. 반응액은 탈염 컬럼을 이용하여 20 mM 트리에틸아민(Triethylamine)(pH 8.0) 버퍼로 바꿔준 후, 트리에틸아민(pH 8.0)과 염화나트륨 농도 구배를 이용한 Fractogel® EMD TMAE (S) (Merck Millipore) 혹은 Source 15Q (Cytiva)컬럼을 사용하여 정제하여 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG 연결체를 얻었다.
실시예 7: 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG- 면역글로불린 Fc 영역 지속형 결합체의 제조
인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 영역 지속형 결합체를 제조하기 위하여, 실시예 6의 방법을 이용하여 얻은 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG 연결체와 면역글로불린 Fc 영역(서열번호 438)의 몰 비가 1:10이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 30 mg/mL로 하여 2 내지 10℃에서 15 내지 16시간 반응 시켰다. 이때 반응액은 100 mM 인산칼륨(pH 6.0)이며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
이 때 이용된 면역글로불린 영역은 서열번호 438의 아미노산 서열 (221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이량체를 형성하고, 상기 동종이량체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합이 형성된 것이다.
표 4는 면역 글로불린 Fc 아미노산 서열을 정리한 것이다.
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반응이 종료된 후, 상기 반응액은 비스트리스 (Bis-Tris)(pH 6.5)와 염화 나트륨을 이용하여 Butyl FF (Cytiva)에서 미반응 면역글로불린 Fc 영역을 제거하고, 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5)과 황산암모늄을 이용하여 Source 15ISO (Cytiva)으로 정제함으로써 인터루킨 2 아날로그의 N-말단이 3.4 kDa PEG 링커의 한 말단에 연결되고, 3.4 kDa PEG 링커의 반대쪽 말단이 Fc 영역의 N-말단 프롤린의 질소에 연결된 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 영역 결합체(지속형 결합체)를 얻었다. 이 지속형 결합체는 SDS-PAGE, RP-HPLC, SE-HPLC를 이용하여 분석하였다 (도 1 및 2).
실시예 8: 인터루킨 2 아날로그 결합체의 인터루킨 2 수용체 결합력 평가
상기 실시예 7에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체와 인터루킨 2 알파, 베타 수용체 각각의 수용체 결합력을 측정하기 위하여 표면 플라스마 공명 (SPR, BIACORE T200, GE healthcare)을 사용하였다.
구체적으로, 비오틴이 표지된 인간 인터루킨 2 수용체 알파 및 베타 서브유닛(ACROBiosystems) 각각을 스트렙타비딘 바이오 센서칩(SA chip, Cytiva사)에 약 100 RU 및 500 RU씩 고정화하고 2배 연속 희석법으로 HBS-EP+ 버퍼(Cytiva사, BR100669)에 희석된 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체들 또는 알데스루킨을 분당 20 μL의 유속으로 흘려주었다. 3분간의 결합 과정 뒤, 동일한 유속으로 HBS-EP+ 버퍼만을 3분간 흘려주어 인터루킨 2 수용체에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체 또는 알데스루킨의 해리를 유도하였으며, 이때 얻어진 결합 상수 및 해리 상수를 통해 결합력을 산출하였다. 결합력 평가는 Biaevaluation 프로그램에서 1:1 binding fitting model에 따라 진행하였다.
평가된 인터루킨 2 아날로그 결합체들은 고유의 인터루킨 2 수용체 결합력이 확인되었으며 특히 인터루킨 2 수용체 알파 서브유닛에서 각 후보 물질들 간에 명백한 결합력 차이가 확인되었다. 결과를 자세히 살펴보면, 인터루킨 2 아날로그 21번과 52번 결합체는 인터루킨 2 수용체 알파 서브유닛에 결합하지 않았으며 인터루킨 아날로그 41번, 86번, 104번, 그리고 105번 결합체는 알데스루킨에 비하여 각각 50.8%, 65.2%, 81.0%, 그리고 112.9%의 상대적인 결합력이 확인되었다. 인터루킨 2 수용체 베타 서브유닛의 경우, 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체와 52번 결합체를 포함하는 모든 인터루킨 2 아날로그 결합체에서 알데스루킨에 비하여 높은 결합력이 확인되었다.
아래 표 5에 알파와 베타 수용체별로 제조한 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체들의 알데스루킨의 결합력을 기준으로 비교한 상대적 결합력(%)을 정리하였다. 표 5에서 해당 지속형 결합체는 이를 구성하는 인터루킨 2 아날로그의 번호로 표시하였다(예: 인터루킨 2 아날로그 21번의 지속형 결합체는 “인터루킨 2 아날로그 21번 결합체”로 표시). 표 5는 인터루킨 2 아날로그 결합체의 인터루킨 2 수용체 결합력을 정리한 것이다.
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실시예 9: 악성 흑색종에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능평가
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체의 항암 효능을 평가하고자, 흑색종 세포(B16F10)가 동종 이식된 악성 흑색종 마우스 모델(B16F10 melanoma tumor syngeneic mouse model)에 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 투여한 후종양 크기와 개체 생존율을 평가하였다.
구체적으로, B16F10 세포(ATCC)를 C57BL/6 마우스 허벅다리에 피하 주사하고 며칠 뒤 육안으로 종양이 관찰되면 종양의 크기가 비슷하도록 각 그룹당 9마리씩을 배정하였다. 지속형 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위의 무게를 기준으로 0.08 mg/kg부터 10 mg/kg의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 각각 피하 경로로 1주에 1회씩 총 4회 반복 투여하였다. 또한 대조군(알데스루킨 투여군)은 3.0 mg/kg의 프로류킨 주(Novartis)를 복강내 경로로 하루에 1회씩 5일간 연속 투여하고, 2일 휴지기를 갖는 방식으로 총 4회 반복 투여하였다. 종양의 크기 2,000 mm3 초과를 인도적 종료시점으로 설정하였다.
투여 15일 차에 각 그룹의 종양 크기(도 3의 A) 및 60일간 각 개체의 생존율(도 3의 B)을 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 투여군이 대조군보다 종양의 크기가 줄어들고 개체 생존률도 우수한 것을 확인하였으며, 본 발명의 지속형 결합체의 용량 의존적인 항암 효능을 확인하였다. 특히, 주당 4.0 mg/kg 이상의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 투여군에서는 일부 개체에서 종양이 완전히 제거된 완전관해가 관찰되었다. 반면, 대조군에서는 어떠한 개체에서도 완전관해가 발견되지 않았다.
이는, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 결합체는 알데스루킨에 비하여 상대적으로 강력한 인간 인터루킨 2 수용체의 베타 서브유닛에 결합하는 특징을 갖도록 설계되었으며 이를 통해 우수한 항암효력을 나타낼 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로 10 mg/kg (지속형 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위의 무게 기준)이상의 고용량 투여군에서도 투여를 중단할 정도의 부작용이 관찰되지 않음을 확인하였다.
실시예 10: 대장암종에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능평가
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체의 항암 효능을 평가하고자, 대장암종 세포(CT26)가 동종 이식된 CT26 대장암종 마우스 모델(CT26 colon tumor syngeneic mouse model)에 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 투여한 후 종양 크기와 개체 생존율을 평가하였다.
구체적으로, CT26 세포(ATCC)를 BALB/c 마우스의 허벅다리에 피하 주사하고 며칠 뒤 육안으로 종양이 관찰되면 종양의 크기가 비슷하도록 각 그룹당 9마리씩을 배정하였다. 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 투여량은, 인터루킨 2 지속형 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위의 무게를 기준으로 0.00016 mg/kg부터 2 mg/kg이며 각각 피하 경로로 1주에 1회씩 총 2회 반복 투여하였다. 또한 대조군(알데스루킨 투여군)은 3.0 mg/kg 의 프로류킨 주(Novartis)를 복강내 경로로 하루에 1회씩 5일간 연속 투여하고, 2일 휴지기를 갖는 방식으로 총 2회 반복 투여하였다. 종양의 크기 2,000 mm3 초과를 인도적 종료시점으로 설정하였다.
첫 투여 15일 차에 각 그룹의 종양 크기(도 4의 A) 및 65일간 각 개체의 생존율(도 4의 B)을 관찰하였다. 그 결과를 바탕으로 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 투여군에서 우수한 항암 효능이 확인되었다. 특히 0.5 mg/kg 투여군에서는 9마리 중 8마리, 2.0 mg/kg 투여군에서는 모든 개체에서 완전관해가 관찰되었다. 반면, 대조군에서는 9마리 중 2마리에서만 완전관해가 나타났다. 생존율에 있어서도, 49일을 기준으로 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 0.5 mg/kg 투여군은 89%, 2.0 mg/kg 투여군은 100% 생존율을 보인 반면, 알데스루킨을 투여한 군에서는 22%의 생존율을 보였다.
실시예 11: Lewis 폐암 마우스 모델에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능평가
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체의 항암 효능을 평가하고자, Lewis lung carcinoma 세포(LL/2)가 동종 이식된 Lewis 폐암 마우스 모델(LL/2 tumor syngeneic mouse model)에 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를투여한 후 종양 크기의 변화를 관찰하였다.
LL/2 세포(ATCC)를 C57BL/6 마우스 허벅다리에 피하 주사하고 며칠 뒤 육안으로 종양이 관찰되면 종양의 크기가 비슷하도록 각 군당 8마리씩을 배정하였다. 각 그룹에는 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 또는 알데스루킨을 투여하였다. 구체적으로 인터루킨 2 지속형 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위의 무게를 기준으로 0.4, 2.0, 그리고 6.0 mg/kg의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 각각 피하 경로로 1주에 1회씩 총 2회 반복 투여하였고, 대조군은 3.0 mg/kg의 알데스루킨을 복강 경로로 하루에 1회씩 5일간 연속 투여하고, 2일 휴지기를 갖는 방식으로 총 2회 반복 투여하였다.
투여 11일 차까지 각 그룹의 종양 크기를 관찰하였으며, 그 결과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체는 Lewis 폐암 마우스 모델에서 투여 용량 의존적인 항 종양 효능을 나타내었을 뿐만 아니라(도 5의 A), 대조군에 비하여 유의적인 수준의 종양 성장 억제 효력을 나타내었다(도 5의 B). 인터루킨 2는 인터루킨 2 수용체 베타 및 감마 서브 유닛에 결합하여 CD8+ T cell 및 NK cell과 같은 종양 사멸 세포를 증식시킬 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체는 인터루킨 2 수용체 베타 서브 유닛에 강력하게 결합함으로써 종양 사멸 세포의 증식을 강화할 수 있을 것으로 기대된다. 대조군에서는 5일 동안 매일 반복적인 투여에도 불구하고 약물 비처리군에 비하여 유의적인 종양 개선이 확인되지 않은 반면, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체는 주당 1회의 투여만으로도 용량 의존적이며 통계적으로 유의미한 항암 효능을 나타내었다(도 5의 A 및 B). 상기의 결과는 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 종양 사멸 세포의 증식을 유도하여 항암 효능을 유도한 것으로 풀이되며, 더 나아가 암의 면역 환경에 관계없이 우수한 항암 효능을 나타낼 수 있음을 시사한다.
실시예 12: 신세포암 동소 이식 마우스 모델에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능평가
신세포암(신장암)에 대한 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능을 평가하기 위하여, 신세포암 동소 이식 마우스 모델에 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 피하 경로로 투여한 후 종양 성장의 변화를 생체 내 형광 이미지 분석기(in vivo imaging system, IVIS)로 관찰하였다.
RENCA-luc 세포(ATCC)를 암컷 Balb/c 마우스의 신장에 주사하고 며칠 뒤 IVIS로 촬영하여 종양으로 간주할 형광 시그널이 관찰되면, 평균 세기가 비슷하도록 각 군당 10마리씩을 배정하였다. 각 군에는 다양한 용량의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체와 대조군으로서 제형 버퍼를 각각 투여하였다. 구체적으로 인터루킨 2 아날로그 결합체 86번 투여군은 1.5, 6.0, 또는 25 mg/kg의 용량을피하 경로로 1주에 1회씩 총 4회 반복 투여하였고, 대조군은 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체의 제형 버퍼를 상기와 동일한 투여 경로와 간격으로 투여하였다.
투여 104일 차까지 각 그룹의 IVIS 시그널 및 생존율을 관찰한 결과, 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체는 신세포암 동소 이식 마우스 모델에서 용량 의존적인 항 종양 효능을 나타내었다(도 6의 A). 특히 25 mg/kg 용량 투여군의 모든 개체는은 104일차까지 생존하였으나, 대조군은 52일차를 끝으로 모든 개체가 사망하였다(도 6의 B).
실시예 13: 췌장암(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC) 마우스 모델에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능평가
췌장암(췌장 도관 선암종)에 대한 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능을 평가하기 위하여, 마우스 유래 췌장 도관 선암종 세포인 panc02 세포를 6주령 암컷 C57BL/6 마우스의 측면에 피하 주사하여 동종이식 종양 모델을 제작하였다. 14일 후, 종양부피(~80 mm3)를 기준으로 그룹당 7마리를 무작위로 배정하였다.
시험은 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 총 6주간 투여하였다. 각 실험군에 대한 항 종양 효능은 아래 식을 이용하여 종양 성장 억제능(tumor growth inhibition, TGI)으로 평가하였다. 자세한 각 군의 약물 용량, 투여 경로, 횟수 및 항 종양 효능은 표 6과 같다.
% TGI = (1-실험군의 Day 0부터 Day X까지 증가된 종양부피/ 음성 대조군의 Day 0부터 Day X까지 증가된 종양부피) x 100
Figure PCTKR2024002945-appb-img-000026
*각 그룹에서 종양의 괴사가 발생하기 전 마지막 계측일인 약물 투약 후, 32일차를 기준으로 분석
결과를 자세히 살펴보면, 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체는 1.7 mg/kg 용량부터 항 종양 효능이 관찰되어 최대 25 mg/kg까지 투여 용량 의존적으로 증가하였다. 특히, 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 8.5 mg/kg 이상으로 투여한 그룹에서 완전 관해가 관찰되었고 25 mg/kg을 투여한 그룹은 모든 개체에서 완전 관해가 유도되었다. (도 7).
실시예 14: 암 완치 모델에서 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체에 의한 기억 반응 확인
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체에 의해 면역 기억 반응이 유도될 수 있는지 확인하고자 하였다. 상기 실시예 12에서 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 투여받은 개체 중 104일차까지 어떠한 형광 시그널도 관찰되지 않아 종양의 완치로 간주할 수 있는 개체들을 선별하고, 이 개체들에 RENCA-luc 세포를 꼬리 정맥으로 재주입시켜, 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체에 의해 유도된 신세포암에 대한 기억 반응을 조사하였다.
그 결과, 종양에 대한 경험이 없는 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체 미처리 대조군 (non-treatment control)은 RENCA-luc 세포 주입 후, 약 19일 차부터 모든 개체의 폐 부위에서 IVIS 시그널이 감지된 반면, 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체로 원발성 신장암이 완치된 개체들은 약물의 용량과 관계없이 모든 개체들의 폐 부위에서 어떠한 IVIS 시그널도 관찰되지 않았다(도 8). 이는 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 원발성 신세포암의 치료에 효과적일 뿐만 아니라, 동일한 종양 세포의 재발에 대한 예방 가능성을 시사한다.
상기와 같은 실험 결과는 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체가 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 및베타 수용체에 대한 결합력을 나타내므로, 이를 활용한 다양한 약물 개발, 특히 항암제 개발에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다. 특히, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체는 특정 암종에 국한되지 않고 다양한 암종에 대해 우수한 항암 효과를 나타내기 때문에 이를 통해 다양한 암종을 적응증으로 하는 항암제 개발에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다. 더 나아가, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체는 개체의 면역 기억 반응을 유도하여 암의 재발을 억제할 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
[국가지원 연구개발에 대한 설명]
본 연구는 과학기술정보통신부, 산업통상자원부, 보건복지부의 재원으로 국가신약개발사업단의 국가신약개발사업 지원에 의하여 이루어진 것임(RS-2022-00165557).

Claims (16)

  1. 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그(analog)를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 지속형 결합체의 형태이고, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 조성물:
    [화학식 1]
    X - L - F
    이 때 X는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고;
    L은 폴리에틸렌글리콜 링커이며;
    F는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
    -는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
    상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 L의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 L의 반대쪽 말단에 X가 공유결합으로 연결됨.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13 내지 15, 17, 20 내지 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58 내지 60, 62, 71, 72, 74 내지 78, 85, 87, 89, 91 내지 94, 및 97 내지 106 의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 17, 22, 42, 53, 56, 58 내지 60, 62, 71, 72, 74 내지 77, 87, 89, 91 내지 93, 98 내지 101, 및 103 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것인 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 알데스루킨에 비해 증가된 것인 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)인 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인 조성물.
  11. 제2항에 있어서, 상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X가 상기 폴리에틸렌글리콜 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 것인 조성물.
  12. 제2항에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜 링커는 분자량 1 kDa 내지 100 kDa의 링커인 조성물.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 암은 신세포암, 흑색종, 대장암, 간암, 자궁암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 폐암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 피부암, 유방암, 방광암, 위암, 두부 또는 경부암, 식도암, 후두암, 골암, 직장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장골반 암종, CNS 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌종양, 신경교종(성상세포종(astrocytoma), 교모세포종(glioblastoma), 핍지교종(oligodendroglioma) 상의세포종(ependymoma), 배아세포종, 수막종, 뇌간신경교종, 뇌하수체 선종, 신경초종, 선천성종양, 두개인두종, 및 뇌종양으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 조성물.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것인 조성물.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 투여되는 것인 조성물.
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