WO2022211537A1 - 신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 결합체 및 이의 제조 방법 - Google Patents

신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 결합체 및 이의 제조 방법 Download PDF

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WO2022211537A1
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interleukin
amino acids
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amino acid
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허용호
오의림
박다현
김진영
박준섭
김유연
이아람
김상윤
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한미약품 주식회사
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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Definitions

  • the present invention relates to novel interleukin 2 analog conjugates, methods for their preparation, and uses thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the long-acting conjugate.
  • X is an interleukin 2 analogue, which is an interleukin 2 analogue with increased interleukin 2 beta receptor binding capacity compared to aldesleukin when X is alone without forming a part of a long-acting complex;
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other;
  • the long-acting conjugate according to any one of the preceding embodiments is one of the amino acids corresponding to positions 18, 22, 38, 42, 61, 68, 80, 81, 85, 86 and 92. It is characterized in that it comprises an interleukin 2 analog in which one or more amino acids are further substituted with other amino acids as part of the conjugate.
  • the long-acting conjugate according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it comprises an interleukin 2 analog comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • the long-acting conjugate according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it comprises an interleukin 2 analog comprising any one or more amino acid substitutions selected from the group consisting of the following amino acid substitutions:
  • n is determined such that the average molecular weight of the [OCH 2 CH 2 ]n site in the interleukin 2 analog conjugate, such as the number average molecular weight, is 3.4 kDa. do.
  • Another aspect of the present invention is a long-acting conjugate of an interleukin 2 analog represented by the following formula (2):
  • the long-acting conjugate is a long-acting conjugate in which one end of Z is covalently linked to only one of the polypeptide chains of the dimeric Fc region, and one molecule of X is covalently linked to the opposite end of this Z.
  • X1 is a deletion
  • X80 is phenylalanine (F), leucine (L), valine (V), or tyrosine (Y);
  • X86 is isoleucine (I), or valine (V);
  • X38 is alanine (A), or arginine (R),
  • the pharmaceutical composition according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it comprises an interleukin 2 analog having increased interleukin 2 beta receptor binding ability compared to aldesleukin.
  • interleukin 2 analog is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other;
  • F is an immunoglobulin Fc region in dimer form
  • composition according to any one of the preceding embodiments, wherein the pharmaceutical composition is administered intraperitoneally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradermally, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, or It is characterized in that it is administered by an intrarectal route of administration.
  • Aib may be used interchangeably with “2-aminoisobutyric acid” or “aminoisobutyric acid”, and 2-aminoisobutyric acid and aminoiso Butyric acid (aminoisobutyric acid) may be used in combination.
  • One aspect of the present invention provides a long-acting conjugate comprising an interleukin 2 analog.
  • mutation of one or more amino acids in the native sequence means substitution, addition, deletion, modification, and combinations thereof to at least one amino acid in native interleukin 2 A variant selected from the group may have occurred.
  • interleukin 2 analogs including substitution, addition, deletion, modification, etc. of amino acid residues to a degree that can be carried out to increase the stability and half-life of the peptide, known in the art in addition to the above mutation positions, are also included in the scope of the present invention. .
  • Interleukin 2 alpha receptor is known not to be involved in the signaling system of interleukin 2, but it increases the binding force of interleukin 2 with other interleukin 2 receptors (beta or gamma) 10 to 100 times, and is expressed in CD4 + regulatory T cells, etc. have.
  • Interleukin 2 beta receptor is mainly distributed in CD8 + T cells or natural killer cells (NK cells) and plays a major function in activating immune response and macrophage function. Reaction activation can be expected.
  • the interleukin 2 analog may be any one selected from the group consisting of the following analogs:
  • the interleukin 2 analog may be any one selected from the following interleukin 2 analogs:
  • the N-terminus is acetylated and/or the C-terminus is amidated to remove these charges.
  • it is not particularly limited thereto.
  • the interleukin 2 receptor was immobilized on the sensor chip using the protein-ligand binding principle, and the interleukin 2 analog diluted in the experimental buffer was flowed using a serial dilution method to induce binding to the immobilized receptor.
  • the interleukin 2 analog diluted in the experimental buffer was flowed using a serial dilution method to induce binding to the immobilized receptor.
  • interleukin 2 analog of the present invention may have reduced or increased interleukin 2 alpha receptor binding affinity compared to native interleukin 2 or interleukin 2 analog (aldesleukin; or interleukin 2 analog 1).
  • the long-acting conjugate according to the present invention not only contains an interleukin 2 analog with increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor, but also binds to an immunoglobulin Fc region as a representative carrier for increasing its half-life, thereby increasing the half-life of the interleukin 2 analog and , blood exposure is increased and the immune response in vivo is increased, thereby effectively achieving inhibition and reduction of cancer cell growth.
  • Another aspect for implementing the present invention provides a long-acting conjugate of an interleukin 2 analog.
  • the combination may be non-naturally occurring.
  • L is a polyethylene glycol linker
  • a is 0 or a natural number, provided that when a is 2 or more, each L is independent of each other;
  • F is an immunoglobulin Fc region in dimer form
  • F is an immunoglobulin Fc region
  • the immunoglobulin Fc region may be an IgG Fc region or a non-glycosylated IgG4 Fc region, but is not particularly limited thereto.
  • the F immunoglobulin Fc region
  • the F is a dimer consisting of two polypeptide chains, and one end of L is linked to only one of the two polypeptide chains. , but not limited thereto.
  • the long-acting conjugate of the present invention may be one in which an interleukin 2 analog and an immunoglobulin Fc region are linked, but is not limited thereto.
  • Reductive amination reaction refers to a reaction in which an amine group or an amino group of a reactant reacts with an aldehyde (i.e., a functional group capable of reductive amination) of another reactant to form an amine, and then forms an amine bond by a reduction reaction, It is an organic synthesis reaction well known in the art.
  • the hinge sequence of the present invention may have the following sequence: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro (SEQ ID NO: 419), Glu-Ser- Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro (SEQ ID NO: 420), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 421), Glu- Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro (SEQ ID NO: 422), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser (SEQ ID NO: 423), Glu-Ser-Lys- Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO: 424), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys (SEQ ID NO
  • Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 430
  • Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 431
  • Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys SEQ ID NO: 432
  • Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro SEQ ID NO: 433
  • Glu-Ser-Lys-Pro-Ser- Cys-Pro SEQ ID NO: 434
  • Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 435
  • Glu-Pro-Ser-Cys SEQ ID NO: 436
  • Ser-Cys-Pro SEQ ID NO: 437
  • the hinge sequence may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 428 (Pro-Ser-Cys-Pro) or SEQ ID NO: 437 (Ser-Cys-Pro), but is not limited thereto.
  • the N-terminal of the immunoglobulin Fc region in the conjugate is proline, and in this conjugate, the Fc region is linked to a linker through a nitrogen atom of the proline.
  • the immunoglobulin Fc region has a hinge sequence, so that two chains of the immunoglobulin Fc region form a homodimer or a heterodimer.
  • the conjugate of Formula 1 of the present invention may be in a form in which one end of the linker is linked to one chain of the dimer immunoglobulin Fc region, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention comprises 1) a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain, 2) a CH1 domain and a CH2 domain, 3) a CH1 domain and a CH3 domain, 4) a CH2 domain and a CH3 domain, 5) a combination of one or two or more domains of a CH1 domain, a CH2 domain, a CH3 domain and a CH4 domain with an immunoglobulin hinge region (or a part of a hinge region), or 6) a heavy chain constant region each domain and a light chain constant region may be a dimer
  • the present invention is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be in the form of a dimer or multimer composed of single-chain immunoglobulins composed of domains of the same origin, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region of the present invention includes a native amino acid sequence as well as a sequence derivative thereof.
  • An amino acid sequence derivative means that one or more amino acid residues in a natural amino acid sequence have a different sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof.
  • various types of derivatives are possible, such as a site capable of forming a disulfide bond is removed, some amino acids at the N-terminus of the native Fc are removed, or a methionine residue may be added to the N-terminus of the native Fc do.
  • the complement binding site eg, the C1q binding site
  • the ADCC antibody dependent cell mediated cytotoxicity
  • the immunoglobulin Fc region may have a native sugar chain, an increased sugar chain compared to the native type, a decreased sugar chain compared to the native type, or a form in which the sugar chain is removed.
  • Conventional methods such as chemical methods, enzymatic methods, and genetic engineering methods using microorganisms may be used for the increase or decrease or removal of such immunoglobulin Fc sugar chains.
  • the immunoglobulin Fc region from which the sugar chain is removed from the Fc has significantly reduced binding to complement (c1q) and reduced or eliminated antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity, so that unnecessary immune responses in vivo are not induced. does not In this respect, a form more suitable for the original purpose as a drug carrier will be an immunoglobulin Fc region in which sugar chains are removed or non-glycosylated.
  • the number of amino acids of each monomer may consist of 221 amino acids, and the amino acids forming a homodimer may consist of a total of 442 amino acids, but is not limited thereto.
  • two monomers having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 438 (consisting of 221 amino acids) form a homodimer through a disulfide bond between cysteine, the 3rd amino acid of each monomer, and the homodimer
  • the monomers may each independently form an internal disulfide bond between cysteines at positions 35 and 95 and an internal disulfide bond between cysteines at positions 141 and 199, but is not limited thereto.
  • the immunoglobulin Fc region may be a homodimer comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 439 (consisting of 442 amino acids), but is not limited thereto.
  • dimers or multimers can be prepared from two or more fragments selected from the group consisting of IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc and IgE Fc fragments.
  • the PEG moiety in the long-acting conjugate may include not only the -(CH 2 CH 2 O) n -structure, but also an oxygen atom intervening between the linking element and the -(CH 2 CH 2 O) n -, but this It is not limited.
  • the term "about” includes all ranges including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, and the like, and includes all values in a range equal to or similar to the value following the term about, but not limited
  • both ends of the linker may bind to a thiol group, an amino group, a hydroxyl group of the immunoglobulin Fc region, and a thiol group, an amino group, an azide group, or a hydroxyl group of the Interleukin 2 analog (X). , but not limited thereto.
  • the reactive group of the linker may be at least one selected from the group consisting of an aldehyde group, a maleimide group, and a succinimide derivative, but is not limited thereto.
  • polyethylene glycol having a hydroxyl group at both ends is used as a linker
  • the hydroxyl group is activated into the various reactive groups by a known chemical reaction, or a commercially available polyethylene glycol having a modified reactive group is used to obtain the interleukin of the present invention.
  • Two analog long-acting conjugates can be prepared.
  • C-terminal refers to the carboxy terminus of a peptide, and refers to a position capable of binding to a linker for the purpose of the present invention.
  • it may include all amino acid residues around the C-terminus as well as the most terminal amino acid residue at the C-terminus, and specifically includes the first to 20th amino acid residues from the most terminal. may, but is not limited thereto.
  • the above-mentioned binder may have increased durability of effect compared to X in which F is not modified.
  • Another aspect for implementing the present invention provides a long-acting conjugate in which an interleukin 2 analog and an immunoglobulin Fc region comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 106 are linked through a linker. .
  • Another aspect for implementing the present invention provides a long-acting conjugate of an interleukin 2 analog represented by the following Chemical Formula 2:
  • Z is a polyethylene glycol linker with a molecular weight of 2 kDa to 30 kDa;
  • one end of Z is covalently linked to only one of the polypeptide chains of the dimeric Fc region, and one molecule of X is covalently linked to the other end of this Z.
  • interleukin 2 analog, the linker, the Fc region and the long-acting conjugate including the same are as described above.
  • interleukin 2 analog may further include one or more amino acids at the C-terminus, but is not limited thereto.
  • Another aspect for implementing the present invention provides a long-acting conjugate of an interleukin 2 analog represented by the following Chemical Formula 3:
  • X' is an interleukin 2 analog comprising an amino acid sequence represented by the following general formula 1,
  • X84 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X85 is alanine (A), glutamic acid (E), glycine (G), leucine (L), valine (V), tryptophan (W), or tyrosine (Y);
  • X92 is phenylalanine (F), isoleucine (I), or tyrosine (Y);
  • the interleukin 2 analog is SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, with the amino acid sequence of 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, and 106 It may include, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • X85 is leucine (L), valine (V), or tyrosine (Y),
  • X86 is isoleucine (I), or valine (V);
  • X1 is a deletion
  • X61 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X85 is leucine (L) or valine (V),
  • one end of Z is covalently linked to only one of the polypeptide chains of the dimeric Fc region, and one X'' molecule is covalently linked to the opposite end of this Z.
  • Another aspect for implementing the present invention provides a method for preparing a long-acting conjugate comprising an interleukin 2 analog.
  • interleukin 2 analog and the long-acting conjugate including the same are as described above.
  • the method includes 1, 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92 , 94, 95, 96, 125, 126, and an interleukin 2 analog in which a mutation is introduced in one or more amino acids selected from the group consisting of amino acids corresponding to positions 133 (for example, non-peptide It may include a step of linking with a biocompatible material (eg, an immunoglobulin Fc region) through a sex polymer).
  • a biocompatible material eg, an immunoglobulin Fc region
  • the method for producing a long-acting conjugate of the present invention comprises the steps of: a) culturing a transformant containing the nucleic acid encoding the interleukin 2 analog to express the interleukin 2 analog; and b) isolating and purifying the expressed interleukin 2 analog, but is not limited thereto.
  • the nucleic acid encoding the interleukin 2 analog may include or (essentially) a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 109 to 212, but is not limited thereto.
  • the medium used for culturing the transformant in the present invention must meet the requirements for culturing the host cell in an appropriate manner.
  • Carbon sources that can be included in the medium for growth of host cells may be appropriately selected by the judgment of those skilled in the art according to the type of transformant prepared, and appropriate culture conditions may be adopted to control the culture period and amount. .
  • Sugar sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid, fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These substances may be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that may be used include peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen sources may also be used individually or as a mixture.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • precursors suitable for the culture medium may be used.
  • the above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously during the culture by a method suitable for the culture.
  • a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid may be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester may be used to inhibit the formation of bubbles.
  • Oxygen or oxygen-containing gas eg air is injected into the culture to maintain aerobic conditions.
  • Culturing of the transformant according to the present invention is usually carried out at a temperature of 20 °C to 45 °C, specifically 25 °C to 40 °C.
  • the culture is continued until the desired amount of interleukin 2 analog production is maximized, and for this purpose, the culture can usually be continued for 10 to 160 hours.
  • the transformant according to the present invention produces an interleukin 2 analog
  • the interleukin 2 analog produced according to the vector configuration and characteristics of the host cell is the cytoplasm of the host cell. It can be secreted intracellularly, into the periplasmic space, or extracellularly.
  • Proteins expressed in or outside the host cell can be purified in a conventional manner.
  • purification methods include salting out (eg, ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (eg, protein fraction precipitation using acetone, ethanol, etc.), dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography, etc. Techniques such as chromatography and ultrafiltration may be applied alone or in combination.
  • Another aspect for implementing the present invention provides a long-acting conjugate prepared by the above method.
  • Such salt form may be, for example, a form using any pharmaceutically acceptable salt.
  • the type of the salt is not particularly limited. However, it is preferably in a form that is safe and effective for an individual, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • the type of the salt is not particularly limited. However, it is preferably in a form that is safe and effective for an individual, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • solvate used in the present invention refers to the formation of a complex with an interleukin 2 analog or a salt thereof according to the present invention with a solvent molecule.
  • composition according to the present invention may include an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof, and specifically, may include a pharmacologically effective amount of an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof. In addition, it may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • an interleukin 2 analog comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106; Or it may include a long-acting conjugate comprising the same, and more specifically, an interleukin 2 analog comprising any one amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 22, 42, 53, 87, 105, and 106; Alternatively, it may include a long-acting conjugate including the interleukin 2 analog, but is not limited thereto.
  • the term "pharmacologically effective amount” means a safe administration dose in which the interleukin 2 analog or its long-acting conjugate exhibits a preventive or therapeutic effect on cancer and does not show toxicity or side effects to the patient, and interleukin 2 receptor, specifically As may mean an administration dose capable of exhibiting significant activity on beta and/or alpha receptors, but is not limited thereto.
  • composition according to the present invention may exhibit one or more of the following characteristics, but is not limited as long as it exhibits an increased immune response and anticancer effect based on increased binding to interleukin 2 beta receptor:
  • Interleukin 2 known as T cell growth factor, is a protein involved in immune regulation, and has the activity of proliferating T cells, stimulating B cells, and secreting ⁇ -interferon by acting on T cells. Based on the immunomodulatory activity of interleukin 2, cancer prevention and treatment effects can be obtained by removing cancer cells using the body's immune system.
  • the interleukin 2 analog of the present invention has an increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor, which plays a major role in signal transduction, which leads to a more effective anticancer effect in the immune system of an individual.
  • the long-acting conjugate containing the interleukin 2 analog has an increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor, and while the durability is increased, the exposure to blood is increased, thereby exhibiting excellent bioavailability, and as a result, excellent tumor growth inhibition and memory T cell production ability. can exhibit effective cancer prevention or treatment effect.
  • the interleukin 2 analog long-acting conjugate of the present invention loses its binding power at all, or loses its binding power at all, or at least about 0.001 times, compared to the interleukin 2 alpha receptor binding power of the native interleukin 2, aldesleukin, or a long-acting conjugate containing the same; about 0.005 times or more, about 0.01 times or more, about 0.05 times or more, about 0.1 times or more, about 0.3 times or more, about 0.5 times or more, about 0.6 times or more, about 0.7 times or more, about 0.8 times or more, about 0.9 times or more, It may have an interleukin 2 alpha receptor binding affinity of about 1.1 times or more, about 1.3 times or more, about 1.5 times or more, about 1.7 times or more, but the number is not limited and the binding strength is changed compared to native interleukin 2 or aldesleukin If so, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog long-acting conjugate of the present invention is about 0.1 times or more, about 0.3 times or more, compared to the interleukin 2 beta receptor binding force of native interleukin 2, aldesleukin, or a long-acting conjugate comprising the same; about 0.5 times or more, about 0.7 times or more, about 1.0 times or more, about 10 times or more, about 20 times or more, about 30 times or more, about 40 times or more, about 50 times or more, about 60 times or more, about 70 times or more, It may have an interleukin 2 beta receptor binding force of about 80 times or more, about 90 times or more, about 100 times, about 130 times, about 150 times, about 200 times or more, but the number is not limited and the binding strength is natural interleukin 2 or It is within the scope of the present invention if it is altered or increased compared to aldesleukin.
  • the cancer may be any one selected from the group consisting of colon cancer, liver cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, gallbladder cancer, kidney cancer, lung cancer, skin cancer, melanoma, breast cancer, bladder cancer, and stomach cancer, or may be metastatic cancer However, it is not limited thereto. It may also include metastatic renal cell carcinoma, or metastatic melanoma.
  • prevention refers to any act of inhibiting or delaying cancer or tumors by administration of the interleukin 2 analog (eg, the interleukin 2 analog itself or a long-acting conjugated form in which a biocompatible material is bound) or a composition comprising the same.
  • the interleukin 2 analog eg, the interleukin 2 analog itself or a long-acting conjugated form in which a biocompatible material is bound
  • a composition comprising the same.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of cancer are improved or beneficial by administration of the interleukin 2 analogue (eg, the interleukin 2 analogue itself or a long-acting conjugated form in which a biocompatible material is combined) or a composition comprising the same.
  • interleukin 2 analogue eg, the interleukin 2 analogue itself or a long-acting conjugated form in which a biocompatible material is combined
  • a composition comprising the same.
  • an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof of the present invention improves the quality of life of patients by reducing the number of administrations to chronic patients who have to be administered daily due to a dramatic increase in blood exposure, blood half-life, and in vivo efficacy sustained effect There are great advantages to doing it.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or diluent may be non-naturally occurring.
  • the term "pharmaceutically acceptable” means a sufficient amount to exhibit a therapeutic effect and does not cause side effects, and the type of cancer, the patient's age, weight, health, sex, and the patient's sensitivity to the drug , administration route, administration method, frequency of administration, treatment period, combination or drugs used at the same time can be easily determined by those skilled in the art according to factors well known in the medical field.
  • a pharmaceutical composition comprising an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof of the present invention may include a pharmaceutically acceptable excipient.
  • the excipient is not particularly limited thereto, but in the case of oral administration, a binder, a lubricant, a disintegrant, a solubilizer, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a color, a fragrance, etc. may be used, and in the case of an injection, a buffer, a preservative, An analgesic agent, a solubilizer, an isotonic agent, a stabilizer, etc. can be mixed and used, and in the case of topical administration, a base, excipient, lubricant, preservative, etc. can be used.
  • the formulation of the composition of the present invention can be prepared in various ways by mixing with the pharmaceutically acceptable excipients as described above.
  • it may be prepared in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, and the like, and in the case of injections, it may be prepared in the form of unit dose ampoules or multiple doses.
  • it can be formulated as a solution, suspension, tablet, pill, capsule, sustained release formulation, and the like.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil may be used.
  • it may further include a filler, an anti-aggregating agent, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, a preservative, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is any one selected from the group consisting of tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, internal solutions, emulsions, syrups, sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, freeze-dried preparations and suppositories It may have a formulation.
  • composition is formulated in a dosage form suitable for administration in a patient's body according to a conventional method in the pharmaceutical field, specifically, a formulation useful for administration of a protein drug, and the administration method commonly used in the art.
  • Oral, or dermal, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, pulmonary, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, gastrointestinal, topical, sublingual, vaginal or rectal It may be administered by parenteral administration routes including, but not limited to.
  • the conjugate can be used by mixing with various pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (ascorbic acid) to increase stability or absorption. acid) or antioxidants such as glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers, etc. may be used as agents.
  • pharmaceutically acceptable carriers such as physiological saline or organic solvents, and carbohydrates such as glucose, sucrose or dextran, ascorbic acid (ascorbic acid) to increase stability or absorption. acid) or antioxidants such as glutathione, chelating agents, low molecular weight proteins or other stabilizers, etc.
  • the subject is an individual who has or is suspected of having cancer, and refers to mammals including mice, livestock, etc., including humans, but is treated with the interleukin 2 analog and/or conjugate of the present invention, or the composition comprising the same Possible entities are included without limitation.
  • the term "administration” means introducing a predetermined substance (eg, an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof) to a patient by any suitable method, and the route of administration is not particularly limited thereto, but an in vivo target It can be administered through any general route that can reach , or intrarectal administration.
  • a predetermined substance eg, an interleukin 2 analog or a long-acting conjugate thereof
  • the dosage and frequency of administration at the time of administration is determined according to the type of drug as the active ingredient, together with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex and weight of the patient, and the severity of the disease.
  • the composition of the present invention may include the interleukin 2 analog or a long-acting conjugate comprising the same in a pharmaceutically effective amount, but is not limited thereto.
  • the inclusion of the interleukin 2 analog or long-acting conjugate in a pharmaceutically effective amount means the degree to which the desired pharmacological activity (eg, prevention, improvement or treatment of cancer) can be obtained due to the interleukin 2 analog or the long-acting conjugate. And, it may mean a pharmaceutically acceptable level as a level that does not cause toxicity or side effects in the administered subject or is insignificant, but is not limited thereto. Such a pharmaceutically effective amount may be determined by comprehensively considering the number of administration, patient, formulation, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain the component (active ingredient) 0.01 to 99% by weight to volume.
  • Another aspect embodying the present invention is the use of the interleukin 2 analog, a long-acting conjugate thereof, and a composition comprising the same in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of cancer.
  • interleukin 2 analog and/or long-acting conjugate thereof or a composition comprising the same, cancer, prevention, treatment, route of administration, and frequency of administration are the same as described above.
  • Another aspect embodying the present invention is to provide an interleukin 2 analog, a long-acting conjugate thereof, or a cancer prevention or treatment use of a composition comprising the same.
  • interleukin 2 analog and/or long-acting conjugate thereof or a composition comprising the same, cancer, prevention, treatment, route of administration, and frequency of administration are the same as described above.
  • Example 1 Construction of native interleukin 2 and interleukin 2 analog expression vectors
  • interleukin 2 synthesized based on the reported interleukin 2 sequence (NM_000586.3; SEQ ID NO: 1) was cloned into a pET-22b vector (Novagen).
  • a novel interleukin 2 analog in which the amino acid of interleukin 2 was modified using the interleukin 2 as a template was prepared.
  • PCR conditions for interleukin 2 analog amplification were repeated 16 times at 95°C for 30 seconds, 55°C for 60 seconds, and 65°C for 6.5 minutes. Sequence analysis was performed on the mutagenesis product obtained under the above conditions to see if the amino acid at the desired site was normally changed. Confirmed.
  • the expression vectors thus obtained were named pET22b-interleukin 2 analogs 1 to 105.
  • Table 1 below shows the change sequence and analog name of each amino acid.
  • analog 1 is aldesleukin
  • primers #1 to #204 correspond to SEQ ID NOs: 214 to 417 of the specification, respectively.
  • desA1 means that alanine, the first amino acid of interleukin 2, is deleted.
  • Table 2 below shows the full-length protein sequence of the interleukin 2 analog.
  • Bold text in Table 2 below indicates the position of the mutation.
  • each cell stock 1 vial was dissolved, inoculated into 500 mL of 2X LB, and incubated with shaking at 37° C. for 14 to 16 hours.
  • the absorbance value at 600 nm showed 4.0 or more
  • the culture was terminated, and this was used as a seed culture medium.
  • a 5 L fermenter Bioflo-320, NBS, USA
  • the seed culture was inoculated into 1.6 L of fermentation medium and initial fermentation was started.
  • the culture conditions were maintained at a pH of 6.70 using a temperature of 37°C, an air volume of 2.0 L/min (1vvm), a stirring speed of 650 rpm, and 30% aqueous ammonia.
  • fed-batch culture was performed by adding an additional medium (feeding solution).
  • the growth of the strain was monitored by the OD value, and IPTG at a final concentration of 500 ⁇ M was introduced at an absorbance value of 70 or higher.
  • the culture was further carried out for about 23 to 25 hours after the introduction of IPTG, and after completion of the culture, the recombinant strain was harvested using a centrifuge and stored at -80°C until use.
  • Cells were disrupted and refolded in order to convert the interleukin 2 analog to a soluble form from E. coli expressing the interleukin 2 analog obtained in Example 2.
  • Cell pellet corresponding to 100 mL of culture medium was suspended in 1 - 200 mL of lysis buffer solution (20 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM EDTA pH 9.0, 0.2 M NaCl, 0.5% Triton X-100), Recombinant E. coli was disrupted at 15,000 psi using a microfludizer.
  • the supernatant was discarded by centrifugation at 13,900 g for 30 min, and the pellet was washed with 400 mL of first wash buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0). The supernatant was discarded by centrifugation under the same conditions as above, and the pellet was washed with 400 mL of a second wash buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100).
  • first wash buffer 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0
  • a second wash buffer solution 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100.
  • the washed inclusion body pellet was resuspended in 400 mL of solubilization/reduction buffer (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT) and stirred at 50°C for 30 minutes. After diluting 6 M guanidine with 4.8 M guanidine by adding 100 mL of distilled water to the soluble/reduced Interleukin 2 analogue, centrifuged at 13,900 g for 30 minutes to discard the pellet and obtain only a solution. After adding 185.7 mL of distilled water to the diluted solution, 4.8 M Guanidine was diluted with 3.5 M Guanidine, and the pH was adjusted to 5.0 using 100% acetic acid.
  • solubilization/reduction buffer 6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT
  • the pH-adjusted solution was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the impurity precipitated solution was centrifuged at 13,900 g for 30 minutes, the supernatant was discarded, and the pellet was washed with a final wash buffer solution (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT).
  • a pellet was obtained by centrifugation under the same conditions as above.
  • Dissolve the washed interleukin 2 analog with 400 mL of refolding buffer solution (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl 2 ).
  • the refolding process was performed by stirring the mixed solution at 4°C for 15 - 24 hours.
  • the interleukin 2 analog refolding solution obtained in Example 3 was applied to a size exclusion column and concentrated to 1 mL or less for purification.
  • the column was equilibrated with a buffer solution (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0) before introduction of the refolding solution, and eluted by flowing the buffer solution after introduction of the refolding solution. Since the eluted sample contains guanidine, it was changed to a stabilizing solution (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose), and the purity was measured through RP-HPLC and peptide mapping analysis. If the measured purity was 80% or more, it was used for the experiment.
  • the recombinant interleukin 2 analog prepared above was diluted in HBS-P+ buffer (Cytiva, BR100671) by a 2-fold serial dilution method for each concentration, and flowed to the CM5 chip on which the interleukin 2 receptor was finally immobilized.
  • the binding force was measured.
  • the binding force was measured using the association rate (Ka) and dissociation rate (Kd), and the interleukin 2 analog was flowed for 3 minutes at a flow rate of 10 uL/min to measure the binding rate, and only HBS-P+ buffer was flowed at the same time and flow rate.
  • the rate of dissociation from each interleukin 2 receptor was measured.
  • the binding force of the receptor was evaluated according to the 1:1 binding fitting model in the Biaevaluation program.
  • K D (%) analog 1 (aldesleukin) binding force (K D ) / analog binding force (K D ) ⁇ 100
  • Table 3 summarizes the relative binding strength of the interleukin 2 alpha or beta receptor of the interleukin 2 analog compared to analog 1 (aldesleukin).
  • “undefined” indicates that binding to the corresponding receptor was not observed in surface plasmon resonance measurement. Therefore, it indicates that the corresponding physical quantity cannot be defined only for the receptor.
  • the interleukin 2 analogs of the present invention completely lose the interleukin 2 alpha receptor binding force, or decrease or increase compared to the interleukin 2 analog 1, such as naturally occurring interleukin 2 or alde It was confirmed that the interleukin 2 alpha receptor binding ability different from that of sleukin was exhibited.
  • the interleukin 2 beta receptor a binding force up to 100 times stronger than that of the native interleukin 2 or aldesleukin was confirmed.
  • the amino acid sequence of the interleukin 2 analog has an influence on the binding of the interleukin 2 alpha or beta receptor. This suggests that the binding force of the interleukin 2 receptor can be changed by substituting an amino acid at a specific position.
  • Example 6 Coupling reaction of interleukin 2 analog and polyethylene glycol (3.4K PEG) linker and purification of interleukin 2 analog linker
  • a conjugate in which the interleukin 2 analogue obtained in Example 4 was bound to the immunoglobulin Fc region a conjugate in which the interleukin 2 analogue was linked to one end of a polyethylene glycol (PEG) linker was first prepared.
  • PEG polyethylene glycol
  • Interleukin 2 analogs 21, 41, 52, 86, 104 and 105 were used for the preparation of the linker, and the molecular weight was 3.4 kDa as a PEG linker, and hydroxy hydrogens at both ends were modified with propylaldehyde groups.
  • Polyethylene glycol ALD(2)3.4K PEG manufactured by NOF, Japan
  • the interleukin 2 analog PEG linker molar ratio was 1:15 to 1:20, and the interleukin 2 analog concentration was 1 mg/mL or less, and reacted at 2 to 10° C. for 1 hour. At this time, the reaction was carried out under 100 mM potassium phosphate (pH 5.5), and 20 mM sodium cyanoborohydride (SCB) was added as a reducing agent.
  • PEG linker molar ratio was 1:15 to 1:20, and the interleukin 2 analog concentration was 1 mg/mL or less, and reacted at 2 to 10° C. for 1 hour. At this time, the reaction was carried out under 100 mM potassium phosphate (pH 5.5), and 20 mM sodium cyanoborohydride (SCB) was added as a reducing agent.
  • SBCB sodium cyanoborohydride
  • the reaction solution was prepared by removing the unreacted immunoglobulin Fc region from Butyl FF (Cytiva) using Bis-Tris (pH 6.5) and sodium chloride, and sodium citrate buffer (pH 5.5).
  • Source 15ISO Chemical Formula 1
  • the N-terminus of the interleukin 2 analog is linked to one end of the 3.4 kDa PEG linker, and the opposite end of the 3.4 kDa PEG linker is the N-terminal proline nitrogen of the Fc region.
  • An interleukin 2 analog-3.4K PEG-immunoglobulin Fc region conjugate (long-acting conjugate) linked to was obtained. This long-acting conjugate was analyzed using SDS-PAGE, RP-HPLC, and SE-HPLC. ( Figures 1 and 2)
  • SPR Surface plasma resonance
  • biotin-labeled human interleukin 2 receptor alpha and beta subunits were each immobilized on a streptavidin biosensor chip (SA chip, Cytiva) by about 100 RU and 500 RU, followed by 2-fold serial dilution with HBS.
  • Interleukin 2 analog long-acting conjugates or aldesleukin diluted in -EP+ buffer (Cytiva, BR100669) were flowed at a flow rate of 20 ⁇ L per minute. After the binding process for 3 minutes, only HBS-EP+ buffer was flowed for 3 minutes at the same flow rate to induce dissociation of the interleukin 2 analog long-acting conjugate or aldesleukin from the interleukin 2 receptor. calculated. Binding force evaluation was performed according to the 1:1 binding fitting model in the Biaevaluation program.
  • Intrinsic interleukin 2 receptor binding ability of the evaluated interleukin 2 analog conjugates was confirmed, and in particular, a clear difference in binding affinity between each candidate substance was confirmed in the interleukin 2 receptor alpha subunit.
  • the interleukin 2 analogues 21 and 52 conjugates did not bind to the interleukin 2 receptor alpha subunit, and the interleukin analogues 41, 86, 104, and 105 conjugates were 50.8% higher than those of aldesleukin, respectively. , 65.2%, 81.0%, and 112.9% of relative binding strength were confirmed.
  • the interleukin 2 receptor beta subunit higher binding affinity than that of aldesleukin was confirmed in all interleukin 2 analog conjugates including the interleukin 2 analog conjugates No. 21 and No. 52.
  • Table 5 summarizes the relative avidity (%) of the interleukin 2 analog long-acting conjugates prepared for each alpha and beta receptor compared with the binding strength of aldesleukin.
  • the corresponding long-acting conjugate is indicated by the number of the interleukin 2 analogue constituting it (eg, the long-acting conjugate of interleukin 2 analogue 21 is indicated as “interleukin 2 analogue 21 conjugate”)
  • the present inventors compared and analyzed the pharmacokinetics of interleukin 2 analog long-acting conjugates and aldesleukin in ICR and C57BL/6 lineage normal mouse models.
  • control group administered with aldesleukin and the interleukin 2 analog conjugate (interleukin 2 analog 21 conjugate, interleukin 2 analog 41 conjugate, interleukin 2 analog 52 conjugate, interleukin 2 analog 86 conjugate, interleukin 2 analog 104 conjugate Conjugate and interleukin 2 analog conjugate No. 105) were administered to normal mice by subcutaneous, intravenous or intraperitoneal injection.
  • interleukin 2 analog conjugate blood was collected from 3 animals through the orbital vein after 1, 4, 8, 24, 48, 72, and 96 hours, respectively, and aldesleukin was administered by the intravenous or intraperitoneal route.
  • the interleukin 2 analog conjugate according to the present invention exhibited a higher blood distribution than aldesleukin through intravenous or intraperitoneal injection, despite being administered by the subcutaneous route.
  • the interleukin 2 analog 21 conjugate In order to investigate the therapeutic efficacy of the interleukin 2 analog conjugate, the interleukin 2 analog 21 conjugate, the interleukin 2 analog 41 conjugate, and the interleukin 2 analog 52 Tumor size and individual mortality were evaluated after administration of aldesleukin as a conjugate and control material, respectively.
  • CT26 cells ATCC
  • a cell culture flask 7 mice were assigned to each group so that the tumors were similar in size.
  • 0.5 mg/kg of Interleukin 2 Analog Conjugate No. 21, Interleukin 2 Analog Conjugate 41, and Interleukin 2 Analog Conjugate No. 52 were administered subcutaneously, once a week, twice in total.
  • the dose of the long-acting conjugate represents the weight of only the interleukin 2 analog site in the conjugate.
  • Example 10 Following the anticancer efficacy evaluation of Example 10, the response of memory T cells according to repeated exposure of the tumor was evaluated. Specifically, for an individual whose complete remission was confirmed after the anticancer efficacy evaluation was completed, on the 42nd and 70th days after the first drug administration, CT26 cells were administered subcutaneously in the same way as the first exposure, respectively, and re-exposure Whether the tumor grew was observed, and 4 and 7 days after the second re-exposure, the number of memory T cells from the mouse spleen was analyzed using a FACS Canto II (Becton Dickinson) device.
  • FACS Canto II Becton Dickinson
  • the interleukin 2 analog conjugate according to the present invention induces a memory immune response in the allografted CT26 colorectal carcinoma mouse model with only a single agent, and thus, strong anticancer efficacy was maintained not only in the first tumor exposure but also in the re-exposure of the tumor.
  • Example 12 Evaluation of anticancer efficacy of interleukin 2 analog long-acting conjugate in malignant melanoma
  • the interleukin 2 analogue 86 conjugate and the control material were used in a malignant melanoma mouse model (B16F10 melanoma tumor syngeneic mouse model) in which B16F10 melanoma cells were allografted. After each administration of Sleukin, tumor size and individual survival rate were evaluated.
  • mice were assigned to each group so that the size of the tumor was similar.
  • the interleukin 2 analogue conjugate 86 at 0.08 mg/kg to 10 mg/kg was administered subcutaneously, once a week, for a total of 4 repeated doses.
  • the tumor size of each group (FIG. 6A) and the survival rate of each individual for 60 days (FIG. 6B) were observed on the 15th day from the first dosing day.
  • the group administered with the interleukin 2 analog conjugate 86 of the present invention had a smaller tumor size and improved individual survival rate than the group administered with aldesleukin, and the dose-dependent anticancer efficacy of the long-acting conjugate of the present invention was confirmed.
  • the group administered with the interleukin 2 analog 86 conjugate at 4.0 mg/kg or more per week complete remission in which the tumor was completely removed was observed in some subjects.
  • aldesleukin was administered at 3.0 mg/kg continuously for 5 days, no complete remission was found in any subject.
  • the interleukin 2 analog conjugate of the present invention was designed to have a characteristic of binding to the beta subunit of the human interleukin 2 receptor, which is relatively stronger than that of aldesleukin, and thus can exhibit excellent anticancer effect.
  • it effectively controls excessive immune response through binding to the alpha subunit of the human interleukin 2 receptor, which does not cause unwanted side effects, so that in the long-acting conjugate, a high dose group of 10 mg/kg or more based on the weight of the interleukin 2 analog site No side effects were observed to the extent that the drug was discontinued.

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Abstract

본 발명은 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 변화된 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체에 관한 것이다.

Description

신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 결합체 및 이의 제조 방법
본 발명은 신규한 인터루킨 2 아날로그 결합체, 이의 제조 방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.
인터루킨 2 (Interleukin 2)는 총 133개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로서, T 세포와 B 세포를 포함하는 면역 체계의 다양한 세포를 활성화시킨다. 인터루킨 2의 면역 자극제로서의 높은 효능은 암과 에이즈를 포함한 다양한 면역관련 병증을 치료하기 위해 사용할 수 있다 (대한민국 공개특허 제10-2017-0070091호). 현재 인터루킨 2(상표 명 Proleukin)는 전이성 신세포암 및 전이성 흑색종의 치료용으로 FDA 승인을 받은 의약이다. 그러나 높은 복용량의 인터루킨 2 요법과 연관된 심각한 독성 때문에 적용 가능한 환자가 제한되며, 실제로 적합한 환자의 소수에 대해서만 이 치료 요법을 수행하고 있다. 인터루킨 2에 연관된 독성은 심한 열, 메스꺼움, 구토, 혈관 누출(vascular leak), 심한 저혈압, 폐 부종, 및 간 손상을 일으키는 혈관 누출 증후군(Vascular leak syndrome)을 포함한다.
인터루킨 2 수용체에는 3가지 서브유닛 수용체가 있다. 그 서브유닛은 알파 체인(IL-2Rα, CD25), 베타 체인(IL-2Rβ 또는 CD122) 및 감마 체인(IL-2Rγ 또는 CD132)으로 이루어져 있고, 인터루킨 2가 수용체 서브유닛들의 다양한 조합에 결합함으로써 여러가지 기능을 발휘 할 수 있다. 단일의 인터루킨 2 알파 수용체는 낮은 친화성 인터루킨 2 수용체로 불리며, 신호전달에는 관여하지 않는다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 중간 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 높은 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 다중 신호전달 경로의 키나아제 활성화를 통한 효과적인 신호 변환에 필요하다. 특히 인터루킨 2 베타 및 감마 결합 수용체는 CD8+ 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 두드러진다. 또한 높은 친화성의 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 보통 CD4+ T 조절 세포(Treg)뿐 만 아니라 최근 활성화된 T 세포에서 발견된다. 인터루킨 2 베타 수용체는 CD8+ T 세포 혹은 자연 살해 세포(NK cell)에 분포하여 체내 면역 반응에 관여하므로, 면역 활성화를 위해 베타 수용체에 대한 활성을 높임으로써 치료제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다.
한편, 인터루킨 2의 다양한 면역 관련 병증의 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 독성 및 부작용을 감소시키면서도 복용량의 감소를 시킬 수 있는 약제의 존재가 미비한 상태로, 새롭고 향상된 약제에 관한 연구가 더욱 필요하다.
면역 관련 병증의 치료제 개발의 일환으로, 인터루킨 2 아날로그를 포함하면서 지속성이 우수하면서 약리 효과가 우수한 약제의 개발이 요구된다.
본 발명의 하나의 목적은 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 지속형 결합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속 형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제공하기 위한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체는 생체 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 아날로그로서, 항암 치료 목적의 투여 편의성 및 부작용을 개선하는 효과가 있다.
도 1은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체(아날로그 21, 41 및 52번)의 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체(아날로그 21, 41 및 52번)의 순도 분석 결과이다.
도 3은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 ICR 및 C57BL/6 마우스에서 약동학을 분석한 결과이다. A는 ICR 마우스에서 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 및 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체의 약동학, B는 C57BL/6 마우스에서 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 104번 결합체, 및 인터루킨 2 아날로그 105번 결합체의 약동학을 분석한 결과이다. 도 3에서 지속형 결합체의 투여량과 혈청내 농도 수치는 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 4는 마우스에서 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체의 동물 모델에서 항암 효력을 확인한 결과이다. 도 4에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 5는 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 동물 모델에서 기억 T 세포 변화를 확인한 결과이다. A는 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체의 종양 생장 억제 효과, B는 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체의 기억 T 세포 수를 분석한 결과이다. 도 5에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
도 6은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 악성 흑색종 동물 모델에서 항종양 효력을 평가한 결과이다. A는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체의 종양 크기, B는 알데스루킨과 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체의 생존률을 확인한 결과이다. 도 6에서 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 전체에서 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 나타낸 값이다.
본 발명의 하나의 양태는 신규한 인터루킨 2 아날로그(interleukin 2 analog, 또는 IL-2 analog)를 포함하는 지속형 결합체이다. 상기 인터루킨 2 (interleukin 2, IL-2) 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 인터루킨 2 아날로그인 알데스루킨(aldesleukin)에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 지속형 결합체인 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서, X는 인터루킨 2 아날로그(analog)로서, 이 아날로그는 지속형 결합체의 일부를 이루지 않고 X 단독으로 있을 때 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그이고;
L은, 폴리에틸렌 글리콜 링커이며;
a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는, 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타내며;
상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함함.
다른 하나의 구체예로서, 상기 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2 중 하나 이상의 아미노산이 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변이가 일어난 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 133번 위치에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 1개 내지 10개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 인터루킨 2 아날로그 부위의 18번, 19번, 20번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 69번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 18번, 22번, 38번, 42번, 61번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 하기 아날로그 중 어느 하나의 인터루킨 2 아날로그를 결합체의 일부로서 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 32번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 35번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 38번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 43번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 48번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 49번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 76번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 87번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bo) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (bp) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 및 86번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 치환을 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 12번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환; (b) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환; (c) 19번 아미노산 티로신, 발린, 페닐알라닌, 아르기닌으로 치환; (d) 20번 아미노산이 발린 또는 페닐알라니응로 치환; (e) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (f) 32번 아미노산이 시스테인으로 치환; (g) 35번 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산으로 치환; (h) 38번 아미노산이 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환; (i) 42번 아미노산이 라이신, 알라닌, 또는 트립토판으로 치환; (j) 43번 아미노산이 시스테인, 글루탐산, 또는 글루타민으로 치환; (k) 45번 아미노산이 알라닌으로 치환; (l) 48번 아미노산이 시스테인으로 치환; (m) 49번 아미노산이 시스테인으로 치환; (n) 61번 아미노산이 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파르트산으로 치환; (o) 68번 아미노산이 아스파르트산, 또는 글루타민으로 치환; (p) 69번 아미노산이 글리신으로 치환; (q) 74번 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌으로 치환; (r) 76번 아미노산이 시스테인으로 치환; (s) 80번 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 발린, 아스파르트산, 또는 트립토판으로 치환; (t) 81번 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 또는 아스파라긴으로 치환; (u) 82번 아미노산이 글리신, 또는 발린으로 치환; (v) 84번 아미노산이 글루탐산, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (w) 85번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 글루탐산, 또는 페닐알라닌으로 치환; (x) 86번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 또는 류신으로 치환; (y) 87번 아미노산이 시스테인으로 치환; (z) 88번 아미노산이 글루타민, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (aa) 89번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; (ab) 91번 아미노산이 트레오닌, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 치환; (ac) 92번 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 티로신, 또는 트립토판으로 치환; (ad) 94번 아미노산이 페닐알라닌, 또는 발린으로 치환; (ae) 95번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (af) 96번 아미노산이 페닐알라닌, 발린, 또는 이소류신으로 치환; (ag) 125번 아미노산이 세린으로 치환; 및 (ah) 126번 아미노산이 트레오닌으로 치환.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 하기 아날로그 중 어느 하나의 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환; (b) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (c) 38번 아미노산이 알라닌으로 치환; (d) 42번 아미노산이 라이신으로 치환; (e) 61번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (f) 68번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (g) 80번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; (h) 81번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (i) 85번 아미노산이 발린으로 치환; (j) 86번 아미노산이 발린으로 치환; (k) 92번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; 및 (l) 125번 아미노산이 세린으로 치환.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)인 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 IgG4 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역에서 유래한 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 438의 아미노산 서열을 갖는 단량체를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 438의 아미노산 서열의 단량체의 동종이량체인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역은 그 N-말단 프롤린의 질소 원자를 통하여 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하고, 상기 에틸렌글리콜 반복 단위 부위(moiety)의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 상기 폴리에틸렌글리콜 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 에틸렌글리콜 반복 단위는 [OCH2CH2]n으로서, n은 자연수로, 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체 내 [OCH2CH2]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 1 내지 100 kDa이 되도록 정해지는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 n의 값은 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체 내 [OCH2CH2]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 3.4 kDa이 되도록 정해지는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 a는 1이고, 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역 사슬에 X 한 분자가 상기 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 링커의 한 말단이 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역의 두 Fc 영역 사슬 중 하나의 Fc 영역 사슬에만 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체로서, 상기 결합체는 L의 한쪽 말단이 F의 아민기 또는 티올기와, L의 다른 말단이 X의 아민기 또는 티올기에 각각 반응하여 형성된 공유결합으로 F 및 X에 각각 연결되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 하기 화학식 2로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체이다:
[화학식 2]
X - Z - Fc
이 때 X는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고;
Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X 한 분자가 공유결합으로 연결되어 있는 지속형 결합체.
하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 지속형 결합체의 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 하기 화학식 3으로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체이다:
[화학식 3]
X' - Z - Fc
이 때 X'는 하기 일반식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그이고,
[일반식 1]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 1, 서열번호 212)
상기 일반식 1에서,
X1은 결실이고,
X18은 류신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X19는 류신(L), 또는 티로신(Y)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 리신(K), 또는 트립토판(W)이고,
X43은 글루탐산(E), 리신(K), 또는 글루타민(Q)이고,
X45는 알라닌(A), 또는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아르기닌(R)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X74는 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 류신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X81은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 아르기닌(R)이고,
X84는 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 알라닌(A), 글루탐산(E), 글리신(G), 류신(L), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 알라닌(A), 글리신(G), 이소류신(I), 또는 발린(V)이고,
X91은 트레오닌(T), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 이소류신(I), 또는 티로신(Y)이고,
X94는 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)이고,
X96은 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)임;
Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X'와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X' 한 분자가 공유결합으로 연결됨.
하나의 구체예로서, 상기 일반식 1에서,
X43은 리신(K)이고,
X45는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X68은 글루탐산(E)이고,
X74는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)이고,
X85는 류신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 이소류신(I), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 또는 이소류신(I)인 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 하기 화학식 4로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체이다:
[화학식 4]
X'' - Z - Fc
이 때 X''는 하기 일반식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그이고,
[일반식 2]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 2, 서열번호 213)
X1은 결실이고,
X18은 류신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 페닐알라닌(F), 또는 리신(K) 이고,
X61은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X81은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 류신(L), 또는 발린(V)이고,
X86은 이소류신(I), 또는 발린(V)임;
Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X''와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X'' 한 분자가 공유결합으로 연결됨.
하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그를 비펩타이드성 중합체를 통해 면역글로불린 Fc 영역과 연결시키는 단계를 포함하는, 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체를 제조하는 방법이다.
하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그(analog) 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물이다.
하나의 구체예로서, 상기 약학 조성물은 약학적 유효량의 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체와 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 구체예로서, 상기 약학 조성물의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물은 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105, 및 106으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것을 특징으로 한다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서, X는, 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그이고;
L은, 폴리에틸렌 글리콜 링커이며;
a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는, 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타냄.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 암은 전이성 신세포암, 전이성 흑색종, 대장암, 간암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 대장암, 폐암, 피부암, 흑색종, 유방암, 방광암, 및 위암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 조성물은 알데스루킨에 비해 높은 혈중 노출도, 종양 생장 억제, 및/또는 기억 T 세포 반응을 나타내는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 약학 조성물로서, 상기 약학 조성물은 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 투여되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도이다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속 형 결합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제를 제공하기 위한 용도이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소류신 I
류신 L 라이신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 명세서에서 “Aib”는 “2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid)” 또는 “아미노이소부티르산 (aminoisobutyric acid)”으로 혼용될 수 있으며, 2-아미노이소부티르산(2-aminoisobutyric acid)과 아미노이소부티르산 (aminoisobutyric acid)은 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체를 제공한다.
구체적으로, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서, X는, 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그(analog)이고;
L은, 폴리에틸렌 글리콜 링커이며;
a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는, 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타냄.
본 발명의 지속형 결합체의 인터루킨 2 아날로그는 결합체의 일부를 이루지 않고 단독으로 존재할 때 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 변경된 것, 특히 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 결합체의 일부를 이루지 않고 단독으로 존재할 때 천연형 인터루킨 2 또는 공지된 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증대된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력도 변화(증가 또는 감소)된 것으로서, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2(interleukin 2, IL-2)"란 생체 내 면역 시스템에서 신호 전달을 하는 사이토카인의 일종으로 면역 조절제를 의미한다. 인터루킨 2는 일반적으로 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 천연형에 비해 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 감소되거나 증가한, 천연형 인터루킨 2의 아미노산이 변이된 인터루킨 2 아날로그일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
상기 천연형 인터루킨 2는 인간 인터루킨 2 일 수 있으며, 이의 서열은 공지된 데이터베이스 등에서 얻을 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 천연형 인터루킨 2가 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다는 의미는 서열번호 1과 동일한 서열뿐만 아니라, 서열번호 1과 상동성 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 역시 본 발명의 천연형 인터루킨 2의 범주에 속한다는 의미이며, 아미노산의 변이 위치는 서열번호 1을 기준으로 상동성 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열을 배열(align) 했을 때 서열번호 1의 아미노산 서열 상에서 상응되는 위치가 변이된 것을 의미한다.
본 발명에서, 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것이란 천연형 인터루킨 2에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 추가적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 125번 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환될 수 있고, 추가 치환이 일어나는 아미노산은 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이 위치 외에 당업계에 알려진, 펩타이드의 안정성 및 반감기 증가를 위해 수행될 수 있는 정도의 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결실, 수식 등을 포함하는 인터루킨 2 아날로그 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, “알데스루킨(aldesleukin)” 또는 “인터루킨 2 아날로그(aldesleukin)”는 상업적으로 구매 가능한 인터루킨 2 아날로그로서, aldesleukin(상표명: Proleukin®)일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 본 발명에서는 “인터루킨 2 아날로그 1”과 혼용되어 사용된다. 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 상기 인터루킨 2 아날로그 1에 비해 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및/또는 증대된 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있다.
인터루킨 2 알파 수용체는 인터루킨 2의 신호전달 체계에는 관여하지 않는 것으로 알려져 있지만, 다른 인터루킨 2 수용체(베타 혹은 감마)와 인터루킨 2의 결합력을 10배~100배 증가시키며, CD4+ 조절 T세포 등에 발현되어 있다.
인터루킨 2 베타 수용체는 CD8+ T 세포 혹은 자연 살해 세포 (NK cell)에 주로 분포되어 면역 반응과 대식세포 작용을 활성화 하는데 주요한 기능을 수행하므로, 인터루킨 2 베타 수용체의 활성화를 통해 종양 세포 사멸 및 신체 면역 반응 활성화를 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명의 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증가된 인터루킨 2 아날로그는 종양 억제 및 사멸과 같은 치료효과는 증대되고, 부작용은 감소한 치료효과를 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열을 포함하는 것일 수 있고, 1 내지 10개의 아미노산 변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 125번 아미노산이 세린으로 치환되고, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 및 126번 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환되고/되거나, 133번 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 천연형 인터루킨 2 및/또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증가된 인터루킨 2 아날로그는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그의 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 상기 133번 위치에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 추가되는 아미노산은 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대되는 이상, 그 종류나 길이에 제한이 없으며, 천연형 아미노산 외에도 비천연형 아미노산, 화학적 변형을 포함하는 아미노산 역시 추가될 수 있다.
다른 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 18번, 19번, 20번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 69번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 18번, 19번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 18번, 22번, 38번, 42번, 61번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다:
(a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 32번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 35번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 38번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 43번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 48번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 49번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 76번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 87번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bo) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (bp) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 및 86번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
여기에서, 상기 인터루킨 2 아날로그가 포함하는 아미노산 치환은 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다:
(a) 12번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환; (b) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환; (c) 19번 아미노산 티로신, 발린, 페닐알라닌, 아르기닌으로 치환; (d) 20번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환; (e) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (f) 32번 아미노산이 시스테인으로 치환; (g) 35번 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산으로 치환; (h) 38번 아미노산이 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환; (i) 42번 아미노산이 라이신, 알라닌, 또는 트립토판으로 치환; (j) 43번 아미노산이 시스테인, 글루탐산, 또는 글루타민으로 치환; (k) 45번 아미노산이 알라닌으로 치환; (l) 48번 아미노산이 시스테인으로 치환; (m) 49번 아미노산이 시스테인으로 치환; (n) 61번 아미노산이 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파르트산으로 치환; (o) 68번 아미노산이 아스파르트산, 또는 글루타민으로 치환; (p) 69번 아미노산이 글리신으로 치환; (q) 74번 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌으로 치환; (r) 76번 아미노산이 시스테인으로 치환; (s) 80번 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 발린, 아스파르트산, 또는 트립토판으로 치환; (t) 81번 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 또는 아스파라긴으로 치환; (u) 82번 아미노산이 글리신, 또는 발린으로 치환; (v) 84번 아미노산이 글루탐산, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (w) 85번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 글루탐산, 또는 페닐알라닌으로 치환; (x) 86번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 또는 류신으로 치환; (y) 87번 아미노산이 시스테인으로 치환; (z) 88번 아미노산이 글루타민, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (aa) 89번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; (ab) 91번 아미노산이 트레오닌, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 치환; (ac) 92번 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 티로신, 또는 트립토판으로 치환; (ad) 94번 아미노산이 페닐알라닌, 또는 발린으로 치환; (ae) 95번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (af) 96번 아미노산이 페닐알라닌, 발린, 또는 이소류신으로 치환; (ag) 125번 아미노산이 세린으로 치환; 및 (ah) 126번 아미노산이 트레오닌으로 치환.
또 다른 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 인터루킨 2 아날로그 중 선택되는 어느 하나인 것을 수 있다:
(a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
여기에서, 상기 인터루킨 2 아날로그가 포함하는 아미노산 치환은 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다:
(a) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환; (b) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (c) 38번 아미노산이 알라닌으로 치환; (d) 42번 아미노산이 라이신으로 치환; (e) 61번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (f) 68번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (g) 80번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; (h) 81번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (i) 85번 아미노산이 발린으로 치환; (j) 86번 아미노산이 발린으로 치환; (k) 92번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; 및 (l) 125번 아미노산이 세린으로 치환.
본 명세서에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 발명에서 펩타이드 내 아미노산의 특정 위치로 표현되었더라 하더라도, 참조 서열에서 상응하는 위치를 의미하는 것일 수 있다.
또 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 명세서에서 '특정 서열번호로 구성되는 인터루킨 2 아날로그'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 인터루킨 2 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적인 예로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 21, 41, 52, 86, 104, 및 105로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
임의의 두 염기 서열 또는 펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
염기 서열 또는 펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
이상의 내용은 본 발명의 다른 구체예 혹은 다른 양태에도 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 알파 및/또는 베타 수용체와의 결합력을 약화 또는 증가시켜 in vitro 활성을 변화시키는 새로운 인터루킨 2의 대체제로 이용될 수 있다. 특히, 베타 수용체에 대한 결합력을 증가시킬 뿐만 아니라, 알파 수용체에 대한 결합력이 변화(증가 또는 감소)되어 두 수용체에 대한 활성으로 인해 효과적인 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명에서, 인터루킨 2의 아날로그의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 인터루킨 2의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 4-이미다조아세트산 (4-imidazoacetic acid) 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 Solid phase 합성법을 통하여 합성될 수 있으며, 재조합 방법으로도 생산 가능하고, 상업적으로 의뢰하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 그 길이에 따라 이 분야에서 잘 알려진 방법, 예를 들어 자동 펩타이드 합성기에 의해 합성할 수 있으며, 유전자 조작 기술에 의하여 생산할 수도 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 표준 합성 방법, 재조합 발현 시스템, 또는 임의의 다른 당해 분야의 방법에 의해 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는, 예를 들어 하기를 포함하는 방법을 포함하는 다수의 방법으로 합성될 수 있다:
(a) 펩타이드를 고체상 또는 액체상 방법의 수단으로 단계적으로 또는 단편 조립에 의해 합성하고, 최종 펩타이드 생성물을 분리 및 정제하는 방법; 또는
(b) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물을 숙주세포 내에서 발현시키고, 발현 생성물을 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 방법; 또는
(c) 펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물의 무세포 시험관 내 발현을 수행하고, 발현 생성물을 회수하는 방법; 또는
(a), (b) 및 (c)의 임의의 조합으로 펩타이드의 단편을 수득하고, 이어서 단편을 연결시켜 펩타이드를 수득하고, 당해 펩타이드를 회수하는 방법.
본 발명에서 천연형 인터루킨 2 수용체에 대한 어떠한 인터루킨 2 아날로그 (또는 이를 포함하는 지속형 결합체)의 결합력이란 수용체에 대한 친화력을 측정하는 방법으로, SPR(surface plasmon resonance)를 이용할 수 있다.
구체적으로, SPR 분석 시 단백질-리간드 결합 원리를 이용하여 센서 칩에 인터루킨 2 수용체를 고정화하고, 연속 희석법을 이용하여 실험 버퍼에 희석된 인터루킨 2 아날로그를 흘려주어 고정화된 수용체와의 결합을 유도한 후, 동일한 유속으로 실험 버퍼만을 흘려주어 수용체와 인터루킨 2 아날로그의 해리를 유도하여 결합력을 측정하거나, 센서 칩에 인간 면역글로불린 Fc 영역에 대한 항체를 먼저 고정시킨 뒤 Fc 영역이 결합된 인터루킨 2 수용체를 고정화하고 인터루킨 2 아날로그를 흘려주어 결합력을 측정하는 방법이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 비오틴이 표지된 인간 인터루킨 2 수용체를 스트렙타비딘 바이오 센서칩에 고정화하고, 2배 연속 희석법으로 HBS-EP+ 버퍼에 희석된 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체를 분당 20 μL의 유속으로 3분간 흘려준 후, 동일한 유속으로 HBS-EP+ 버퍼만을 3분간 흘려주어 인터루킨 2 수용체와 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 해리를 유도한 다음 얻어진 결합 상수 및 해리 상수를 Bioaevaluation 프로그램을 사용하여 1:1 binding fitting model에 따라 결합력을 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 인터루킨 2 아날로그(aldesleukin; 또는 인터루킨 2 아날로그 1)에 비해 감소되거나 증가된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 가질 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력과 비교하여 약 0.001배 이상, 약 0.005배 이상, 약 0.01배 이상, 약 0.05배 이상, 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 0.9배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.7배 이상의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또는, 알데스루킨의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력(100%)을 기준으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 아예 결합력을 상실하거나, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 7% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 70% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상의 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 1.0배이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 약 100배 이상의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경, 또는 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또는, 알데스루킨의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력(100%)을 기준으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 약 5% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30%이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 약 200% 이상, 약 500% 이상, 약 700% 이상, 약 1000% 이상, 약 1500% 이상, 약 3000% 이상, 약 5000% 이상, 약 7000% 이상, 약 10000%이상, 약 12000%이상, 약 15000% 이상, 약 20000% 이상, 약 25000% 이상의 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 변경되고, 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시 형태에서는 본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 제조하기 위하여, 천연형 인터루킨 2(서열번호 1)를 바탕으로 변이를 도입한 인터루킨 2 아날로그를 제조하였다. 본 발명에서 제조된 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 또는 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열로 코딩되는 것일 수 있다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산은 서열번호 1의 천연형 인터루킨 2를 코딩하는 염기 서열에서 특정 위치의 아미노산에 변이(아미노산 결실, 치환, 및/또는 추가)를 도입할 수 있도록 변형된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 3 내지 106 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 일 예로서, 본 발명의 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열을 가지거나 포함할 수 있다.
본 발명의 염기 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 핵산을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 108 내지 211의 서열 중 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 핵산은 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명의 핵산은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
상동성 또는 동일성에 관해서는 상술한 바와 같다.
또한, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨, 또는 알데스루킨 대비 체내 반감기가 증가된 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 반감기 증가를 위한 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)이 인터루킨 2 아날로그에 직접 또는 링커를 통해 결합하여, 반감기가 증가된 지속형 결합체 형태를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 지속형 결합체는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 높인 인터루킨 2 아날로그를 포함할 뿐만 아니라, 이의 반감기를 증가시키기 위한 대표적인 캐리어로서 면역글로불린 Fc 영역과 결합시켜 인터루킨 2 아날로그의 반감기가 증가되고, 혈중 노출도가 높아지며 생체 내 면역반응이 증가하여 암세포의 성장 억제 및 감소를 효과적으로 달성할 수 있다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체를 제공한다.
본 발명에서 상기 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체는, 인터루킨 2 아날로그에 이의 생체 내 반감기를 증가시키기 위한 생체적합성 물질이 결합된 형태일 수 있다. 본 명세서에서 상기 생체적합성 물질은 캐리어와 혼용될 수 있다.
본 발명에서 상기 지속형 결합체는 캐리어가 결합되지 않은 인터루킨 2 아날로그에 대비하여 증가된 효력의 지속성을 나타낼 수 있으며, 본 발명에서는 이러한 결합체를 "지속형 결합체" 또는 “결합체”로 지칭한다.
한편, 이러한 결합체는 비자연적으로 발생된(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 지속형 결합체는 하기 화학식 1로 표시되는, 지속형 결합체이다:
[화학식 1]
X - La - F
여기서,
X는, 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그(analog)이고;
L은, 폴리에틸렌 글리콜 링커이며;
a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
F는, 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
상기 “-“는 공유결합이다.
보다 구체적으로, X와 L, 및 L과 F는 공유결합으로 서로 연결되는 것일 수 있으며, 이때 상기 결합체는 화학식 1의 순서로, X, L, 및 F가 공유결합을 통하여 각각 연결된 결합체일 수 있다.
또한, 상기 F는 X와 직접적으로 연결되거나(즉, 상기 화학식 1에서 a가 0이거나), 또는 링커(L)를 통해 연결된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 상기 결합체를 구성하는 일 모이어티의 구성에 해당할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 X에 해당하고, 인터루킨 2 아날로그에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
상기 결합체에서 F는 X, 즉 인터루킨 2 아날로그의 반감기를 증가시킬 수 있는 물질로서, 본 발명의 결합체를 구성하는 모이어티의 일 구성에 해당한다.
상기 F는 X와 공유 화학결합으로 서로 결합되는 것일 수 있으며, 공유 화학결합으로 L을 통하여 F와 X가 서로 결합되는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 F는 면역글로불린 Fc 영역이고, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG Fc 영역, 또는 비당쇄화된 IgG4 Fc 영역일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 구체적인 한 예로, 상기 F(면역글로불린 Fc 영역)는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 구조를 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 펩타이드 내의 하나 이상의 아미노산 측쇄는 생체 내에서 가용성 및/또는 반감기를 증가시키고/시키거나 생체이용율을 증가시키기 위해 이러한 생체적합성 물질에 접합될 수 있다. 이러한 변형은 또한 치료학적 단백질 및 펩타이드의 소거(clearance)를 감소시킬 수 있다.
상술한 생체적합성 물질은 수용성(양친매성 또는 친수성) 및/또는 무독성 및/또는 약학적으로 허용가능한 것일 수 있다.
상기 F는 X와 직접적으로 연결되거나(즉, 상기 화학식 1에서 a가 0이거나), 또는 폴리에틸렌 글리콜 링커(L)를 통해 연결된 것일 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 본 발명의 지속형 결합체는 인터루킨 2 아날로그와 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "면역글로불린 Fc 영역"은, 면역글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역을 제외한, 중쇄 불변영역 2(CH2) 및/또는 중쇄 불변영역 3(CH3)부분을 포함하는 부위를 의미한다. 상기 면역글로불린 Fc 영역은 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 1에서 F에 해당한다.
본 명세서에서 Fc 영역이라고 하면 면역글로불린의 파파인 소화에서 얻는 천연형 서열뿐 아니라 그 유도체, 예컨대 천연 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 변환되어 천연형과 상이하게 된 서열등 변형체까지 망라하여 포함된다. 상기 유도체, 치환체, 변형체는 FcRn에 결합하는 능력을 보유하는 것을 전제로 한다. 본 발명에서, F는 사람 면역글로불린 영역일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.본 명세서에서 “생체적합성 물질” 또는 “캐리어”는 상기 Fc 영역을 의미할 수 있다.
상기 F(면역글로불린 Fc 영역)는, 2개의 폴리펩타이드 사슬이 이황화결합으로 연결되어 있는 구조이며, 상기 두 사슬 중 한 사슬의 질소 원자를 통해서만 연결되어 있는 구조일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 질소 원자를 통한 연결은 라이신의 입실론 아미노 원자나 N-말단 아미노기에 환원적 아민화를 통하여 연결될 수 있다.
환원적 아민화 반응이란 반응물의 아민기 또는 아미노기가 다른 반응물의 알데히드(즉, 환원적 아민화가 가능한 작용기)와 반응하여 아민을 생성한 다음, 환원 반응에 의해 아민 결합을 형성시키는 반응을 의미하여, 당해 기술 분야에 널리 알려져 있는 유기합성 반응이다.
본 발명의 지속형 결합체의 하나의 구체예로서, 상기 지속형 결합체는 상기 면역글로불린 Fc 영역이 그 N-말단 질소 원자를 통하여 링커에 연결된 것일 수 있다.
이러한 면역글로불린 Fc 영역은 중쇄 불변영역에 힌지(hinge) 부분을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 면역글로불린 Fc 영역은 N-말단에 특정 힌지 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, "힌지 서열"은 중쇄에 위치하여 이황화결합(inter disulfide bond)를 통하여 면역글로불린 Fc 영역의 이량체를 형성하는 부위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 힌지 서열은 하기의 아미노산 서열을 갖는 힌지 서열 중 일부가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 갖도록 변이된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 418).
상기 힌지 서열은 서열번호 418의 힌지 서열 중 8번째 또는 11번째 시스테인 잔기가 결실되어 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 힌지 서열은 하나의 시스테인 잔기만을 포함하는, 3 내지 12개의 아미노산으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 본 발명의 힌지 서열은 다음과 같은 서열을 가질 수 있다: Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 419), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser-Pro(서열번호 420), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 421), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Pro(서열번호 422), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro-Ser(서열번호 423), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 424), Glu-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 425), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 426), Glu-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 427), Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 428), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 429), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 430), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 431), Glu-Ser-Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys(서열번호 432), Lys-Tyr-Gly-Pro-Pro-Cys-Pro(서열번호 433), Glu-Ser-Lys-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 434), Glu-Ser-Pro-Ser-Cys-Pro(서열번호 435), Glu-Pro-Ser-Cys(서열번호 436), Ser-Cys-Pro(서열번호 437).
더욱 구체적으로는 상기 힌지 서열은 서열번호 428(Pro-Ser-Cys-Pro)또는 서열번호 437(Ser-Cys-Pro)의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지속형 결합체의 한 더욱 구체적인 형태에서, 상기 결합체내 상기 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단은 프롤린이고, 이 결합체는 상기 프롤린의 질소 원자를 통하여 Fc 영역이 링커에 연결된 것이다.
본 발명의 지속형 결합체의 한 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열이 존재함으로써 면역글로불린 Fc 영역의 사슬 두 개가 동종이량체(homodimer)나 이종이량체(heterodimer)를 형성한 이량체 형태일 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 결합체는 링커의 일 말단이 이량체의 면역글로불린 Fc 영역의 한 사슬에 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "N-말단"은 단백질 또는 폴리펩티드의 아미노 말단을 의미하는 것으로, 아미노 말단의 최말단, 또는 최말단으로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 이상의 아미노산까지 포함하는 것일 수 있다. 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 힌지 서열을 N-말단에 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형과 실질적으로 동등하거나 향상된 효과를 갖는 한, 면역 글로불린의 중쇄와 경쇄 가변영역만을 제외하고, 일부 또는 전체 중쇄 불변영역 1(CH1) 및/또는 경쇄불변영역 1(CL1)을 포함하는 확장된 Fc 영역일 수 있다. 또한, CH2 및/또는 CH3에 해당하는 상당히 긴 일부 아미노산 서열이 제거된 영역일 수도 있다.
예컨대, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 1) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인, 2) CH1 도메인 및 CH2 도메인, 3) CH1 도메인 및 CH3 도메인, 4) CH2 도메인 및 CH3 도메인, 5) CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인 중 1개 또는 2개의 이상의 도메인과 면역글로불린 힌지 영역(또는 힌지 영역의 일부)와의 조합, 또는 6) 중쇄 불변 영역 각 도메인과 경쇄 불변영역의 이량체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 동일한 기원의 도메인으로 이루어진 단쇄 면역글로불린들로 구성된, 이량체 또는 다량체 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 지속형 결합체의 하나의 실시 형태로서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체(이합체 dimer)이며, 이 때 상기 Fc 영역 이량체 F와 X는 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 하나의 동일한 링커 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 한 구체예에서, X는 이러한 Fc 영역 이량체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩타이드 사슬에만 링커 L을 통하여 공유결합으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 더욱 구체적인 예시에서, 이러한 Fc 영역 이량체 F의 두 폴리펩타이드 사슬 중 X가 연결된 하나의 폴리펩타이드 사슬에는 한 분자의 X만이 L을 통하여 공유결합적으로 연결되어 있다. 이 실시 형태의 가장 구체적인 예시에서 상기 F는 동종이량체이다.
다른 구체예에서, 상기 면역글로불린 Fc 영역 F는 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이량체며, L의 한 말단이 상기 두 폴리펩타이드 사슬 중 하나의 폴리펩티드 사슬에만 연결되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 지속형 결합체의 다른 실시 형태에서는, 이량체 형태의 하나의 Fc 영역에 X 두 분자가 대칭적으로 결합하는 것 역시 가능하다. 이때 상기 면역글로불린 Fc 영역과 X는 L에 의해 서로 연결될 수 있다. 그러나, 상기 기술된 예에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 아미노산 서열뿐만 아니라 이의 서열 유도체를 포함한다. 아미노산 서열 유도체란 천연 아미노산 서열 중의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 것을 의미한다.
예를 들면, IgG Fc의 경우 결합에 중요하다고 알려진 214 내지 238, 297 내지 299, 318 내지 322 또는 327 내지 331번 아미노산 잔기들이 변형을 위해 적당한 부위로서 이용될 수 있다.
또한, 이황화 결합을 형성할 수 있는 부위가 제거되거나, 천연형 Fc에서 N-말단의 몇몇 아미노산이 제거되거나 또는 천연형 Fc의 N-말단에 메티오닌 잔기가 부가될 수도 있는 등 다양한 종류의 유도체가 가능하다. 또한, 이펙터 기능을 없애기 위해 보체결합부위, 예로 C1q 결합부위가 제거될 수도 있고, ADCC(antibody dependent cell mediated cytotoxicity) 부위가 제거될 수도 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 영역의 서열 유도체를 제조하는 기술은 국제특허공개 제WO 97/34631호, 국제특허공개 제96/32478호 등에 개시되어 있다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 경우에 따라서는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아미드화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
상기 기술한 Fc 유도체는 본 발명의 Fc 영역과 동등한 생물학적 활성을 나타내며 Fc 영역의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성을 증대시킨 것일 수 있다.
또한, 이러한 Fc 영역은 인간, 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트 또는 기니아 픽 등의 동물의 생체 내에서 분리한 천연형으로부터 얻어질 수도 있고, 형질전환된 동물세포 또는 미생물로부터 얻어진 재조합형 또는 이의 유도체일 수 있다. 여기서, 천연형으로부터 획득하는 방법은 전체 면역글로불린을 인간 또는 동물의 생체로부터 분리한 후, 단백질 분해효소를 처리하여 획득하는 방법일 수 있다. 파파인을 처리할 경우에는 Fab 및 Fc로 절단되고,
펩신을 처리할 경우에는 pF'c 및 F(ab)2로 절단된다. 이를 크기 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography) 등을 이용하여 Fc 또는 pF'c를 분리할 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 유래의 Fc 영역을 미생물로부터 수득한 재조합형 면역글로불린 Fc 영역이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 천연형 당쇄, 천연형에 비해 증가된 당쇄, 천연형에 비해 감소한 당쇄 또는 당쇄가 제거된 형태일 수 있다. 이러한 면역글로불린 Fc 당쇄의 증감 또는 제거에는 화학적 방법, 효소학적 방법 및 미생물을 이용한 유전 공학적 방법과 같은 통상적인 방법이 이용될 수 있다. 여기서, Fc에서 당쇄가 제거된 면역글로불린 Fc 영역은 보체(c1q)와의 결합력이 현저히 저하되고, 항체-의존성 세포독성 또는 보체-의존성 세포 독성이 감소 또는 제거되므로, 생체 내에서 불필요한 면역 반응을 유발하지 않는다. 이런 점에서 약물의 캐리어로서의 본래의 목적에 보다 부합하는 형태는 당쇄가 제거되거나 비당쇄화된 면역글로불린 Fc 영역이라 할 것이다.
본 발명에서 "당쇄의 제거(Deglycosylation)"는 효소로 당을 제거한 Fc 영역을 말하며, 비당쇄화(Aglycosylation)는 원핵동물, 더 구체적인 실시 형태에서는 대장균에서 생산하여 당쇄화되지 않은 Fc 영역을 의미한다.
한편, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 또는 소, 염소, 돼지, 마우스, 래빗, 햄스터, 랫트, 기니아 픽 등의 동물기원일 수 있으며, 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 기원이다.
또한, 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 더 구체적인 실시 형태에서는 인간 혈액에 가장 풍부한 IgG 또는 IgM유래이며 보다 더 구체적인 실시 형태에서는 리간드 결합 단백질의 반감기를 향상시키는 것으로 공지된 IgG 유래이다. 더욱 더 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역이며, 가장 구체적인 실시 형태에서 상기 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 유래의 비-당쇄화된 Fc 영역이나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 하나의 구체예로서, 면역글로불린 Fc 영역은 인간 IgG4 Fc의 단편으로서, 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이의 이황화 결합(inter-chain 형태)을 통해 2개의 단량체가 연결된 동종이합량체일 수 있으며, 이 때 동종이량체는 각 단량체에서 35번 및 95번의 시스테인 사이 및 141번 및 199번의 시스테인 사이에 이황화 결합, 즉 2개의 이황화 결합(intra-chain 형태)을 가지거나/가질 수 있다.
각 단량체의 아미노산 수는 221개의 아미노산으로 구성될 수 있으며, 동종이량체를 형성하는 아미노산은 전체 442개의 아미노산으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 면역글로불린 Fc 절편은 서열번호 438의 아미노산 서열(221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이량체를 형성하고, 상기 동종이량체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합을 형성하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화학식 1의 F는 서열번호 438의 아미노산 서열인 단량체를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 F는 서열번호 438의 아미노산 서열의 단량체의 동종이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 예로, 면역글로불린 Fc 영역은 서열번호 439의 아미노산 서열 (442개의 아미노산으로 구성됨)을 포함하는 동종이량체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체예로, 상기 면역글로불린 Fc 영역과 X는 당쇄화되어 있지 않을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명에서 "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 Fc 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 즉, IgG Fc, IgA Fc, IgM Fc, IgD Fc 및 IgE의 Fc 단편으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 단편으로부터 이량체 또는 다량체의 제조가 가능하다.
본 발명에서 "하이브리드(hybrid)"란 단쇄의 면역글로불린 불변영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 Fc 단편에 해당하는 서열이 존재함을 의미하는 용어이다. 본 발명의 경우 여러 형태의 하이브리드가 가능하다. 즉, IgG Fc, IgM Fc, IgA Fc, IgE Fc 및 IgD Fc의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하며, 힌지를 포함할 수 있다.
한편, IgG 역시 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 서브클래스로 나눌 수 있고 본 발명에서는 이들의 조합 또는 이들의 혼성화도 가능하다. 구체적으로는 IgG2 및 IgG4 서브클래스이며, 가장 구체적으로는 보체 의존적 독성(CDC, Complement dependent cytotoxicity)과 같은 이펙터 기능(effector function)이 거의 없는 IgG4의 Fc 영역이다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해, 또는 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함하나 이에 제한되지 않는다.
상기 화학식 1에서 상기 L은 폴리에틸렌 글리콜 링커일 수 있다.
본 발명에서 "폴리에틸렌 글리콜 링커"는 에틸렌글리콜 반복 단위가 2개 이상 결합된 생체 적합성 중합체를 포함한다. 상기 반복 단위들은 펩타이드 결합이 아닌 임의의 공유결합을 통해 서로 연결된다. 상기 폴리에틸렌 글리콜 링커는 본 발명의 결합체의 모이어티를 이루는 일 구성일 수 있으며, 상기 화학식 1에서 L에 해당된다. 본 명세서에서, 상기 링커는 “비펩타이드성 링커” 또는 “비펩타이드성 중합체”와 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 La에서 a는 1 이상일 수 있으며, a가 2 이상일 때 각각의 L은 독립적일 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 양쪽 말단에 F, (구체적으로 면역글로불린 Fc 영역) 및 X(구체적으로 인터루킨 2 아날로그)와 결합될 수 있는 반응기를 포함하는 비펩타이드성 링커를 통하여 F와 X가 서로 공유결합적으로 연결된 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 비펩타이드성 링커는 말단에 반응기를 포함하여, 결합체를 구성하는 다른 구성 요소와 반응을 통해 결합체를 형성할 수 있다. 양 말단에 반응성 작용기를 갖는 비펩타이드성 링커가 각 반응기를 통해 상기 화학식 1의 X 및 F와 결합하여 결합체를 형성할 경우, 상기 비펩타이드성 링커 또는 비펩타이드성 중합체는 비펩타이드성 중합체 연결부(linker moiety) 또는 비펩타이드성 링커 연결부로 명명할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서, 상기 L(폴리에틸렌 글리콜 링커)은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에서 상기 폴리에틸렌글리콜은 에틸렌글리콜 동종 중합체, PEG 공중합체, 또는 모노메틸-치환된 PEG 중합체(mPEG)의 형태를 모두 포괄하는 용어이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 당해 분야에 이미 알려진 이의 유도체 및 당해 분야의 기술 수준에서 용이하게 제조할 수 있는 유도체들도 본 발명의 범위에 포함된다.
상기 폴리에틸렌 글리콜 링커는 에틸렌글리콜 반복 단위를 포함하면서, 결합체로 구성되기 이전에는 결합체의 제조에 이용되는 작용기를 말단에 포함하는 것일 수 있다. 본 발명에 따른 지속형 결합체는 상기 작용기를 통해 X와 F가 연결된 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 상기 비펩타이드성 링커는 2개, 또는 3개 이상의 작용기를 포함할 수 있고, 각 작용기는 동일하거나, 서로 상이할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 링커는 하기 화학식 5로 표시되는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
[화학식 5]
Figure PCTKR2022004620-appb-img-000001
여기서, n= 10 내지 2400, n= 10 내지 480, 또는 n = 50 내지 250이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지속형 결합체에서 PEG 모이어티는, -(CH2CH2O)n-구조 뿐만 아니라 연결 요소와 이 -(CH2CH2O)n- 사이에 개재하는 산소 원자도 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하나의 구체예로, 상기 에틸렌글리콜 반복단위는 그 예로, [OCH2CH2]n로 표시될 수 있으며, n 값은 자연수로 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체 내의 [OCH2CH2]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 O 초과 내지 약 100 kDa이 되도록 정해질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또 하나의 예로, 상기 n 값은 자연수로 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체 내의 [OCH2CH2]n 부위의 평균 분자량, 예컨대 수평균 분자량이 약 1 내지 약 100 kDa, 약 1 내지 약 80 kDa, 약 1 내지 약 50 kDa, 약 1 내지 약 30 kDa, 약 1 내지 약 25 kDa, 약 1 내지 약 20 kDa, 약 1 내지 약 15 kDa, 약 1 내지 약 13 kDa, 약 1 내지 약 11 kDa, 약 1 내지 약 10 kDa, 약 1 내지 약 8 kDa, 약 1 내지 약 5 kDa, 약 1 내지 약 3.4 kDa, 약 3 내지 약 30 kDa, 약 3 내지 약 27 kDa, 약 3 내지 약 25 kDa, 약 3 내지 약 22 kDa, 약 3 내지 약 20 kDa, 약 3 내지 약 18 kDa, 약 3 내지 약 16 kDa, 약 3 내지 약 15 kDa, 약 3 내지 약 13 kDa, 약 3 내지 약 11 kDa, 약 3 내지 약 10 kDa, 약 3 내지 약 8 kDa, 약 3 내지 약 5 kDa, 약 3 내지 약 3.4 kDa, 약 8 내지 약 30 kDa, 약 8 내지 약 27 kDa, 약 8 내지 약 25 kDa, 약 8 내지 약 22 kDa, 약 8 내지 약 20 kDa, 약 8 내지 약 18 kDa, 약 8 내지 약 16 kDa, 약 8 내지 약 15 kDa, 약 8 내지 약 13 kDa, 약 8 내지 약 11 kDa, 약 8 내지 약 10 kDa, 약 9 내지 약 15 kDa, 약 9 내지 약 14 kDa, 약 9 내지 약 13 kDa, 약 9 내지 약 12 kDa, 약 9 내지 약 11 kDa, 약 9.5 내지 약 10.5 kDa, 또는 약 10 kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 결합체는 인터루킨 2 아날로그와 면역글로불린 Fc 영역(F)이 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커(L)를 통해 공유 결합으로 연결된 구조 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 하나의 구체적인 실시 형태에서, 상기 지속형 결합체에서, 상기 L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커이며, a는 1이고, F는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 상기 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 다른 구체적인 실시 형태에서는 상기 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하는 링커의 한 말단이 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역의 두 Fc 영역 사슬 중 하나의 Fc 영역 사슬에만 연결되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용될 수 있는 폴리에틸렌 글리콜 링커의 분자량은 0 초과 200 kDa 범위, 구체적으로, 약 1 내지 100 kDa 범위, 약 1 내지 50 kDa 범위, 약 1 내지 30 kDa 범위, 약 2 내지 30 kDa 범위, 약 1 내지 20kDa 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa 내지 10 kDa, 범위, 보다 더 구체적으로 약 3.4kDa일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 F에 해당하는 폴리펩타이드와 결합되는 본 발명의 비펩타이드성 링커는 한 종류의 중합체뿐만 아니라 상이한 종류의 중합체들의 조합이 사용될 수도 있다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 비펩타이드성 링커는 F 및 X와 결합하지 않은 상태에서 양 말단에 반응기를 갖고, 상기 반응기를 통해 F 및 X와 결합하는 것일 수 있다.
하나의 구체예로, 상기 링커의 양 말단은 면역글로불린 Fc 영역의 티올기, 아미노기, 하이드록실기 및 인터루킨 2 아날로그(X)의 티올기, 아미노기, 아지드기, 하이드록실기에 결합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 링커는 양쪽 말단에 각각 면역글로불린 Fc 영역 및 인터루킨 2 아날로그(X)와 결합될 수 있는 반응기, 구체적으로는 면역글로불린 Fc 영역의 시스테인의 티올기; N-말단, 리신, 아르기닌, 글루타민 및/또는 히스티딘에 위치한 아미노기; 및/또는 C-말단에 위치한 하이드록실기와 결합되고, 인터루킨 2 아날로그(X)의 시스테인의 티올기; 리신, 아르기닌, 글루타민 및/또는 히스티딘의 아미노기; 아지도리신의 아지드기; 및/또는 하이드록실기와 결합될 수 있는 반응기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 상기 링커의 반응기는 알데히드 그룹, 말레이미드 그룹 및 석시니미드 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 알데히드기로 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기를 예로서 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기에서, 석시니미드 유도체로는 석시니미딜 발레르에이트, 석시니미딜 메틸부타노에이트, 석시니미딜 메틸프로피온에이트, 석시니미딜 부타노에이트, 석시니미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석시니미드, 히드록시 석시니미딜, 석시니미딜 카르복시메틸 또는 석시니미딜 카보네이트가 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 링커는 상기와 같은 반응기를 통해 면역글로불린 Fc 영역인 F 및 인터루킨 2 아날로그인 X에 연결되어, 링커 연결부로 전환될 수 있다.
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또한, 알데히드 결합에 의한 환원성 알킬화로 생성된 최종 산물은 아미드 결합으로 연결된 것보다 훨씬 안정적이다. 알데히드 반응기는 낮은 pH에서 N-말단에 선택적으로 반응하며, 높은 pH, 예를 들어 pH 9.0 조건에서는 라이신 잔기와 공유결합을 형성할 수 있다.
또한, 상기 링커의 양쪽 말단의 반응기는 서로 동일하거나 또는 서로 상이할 수 있으며, 예를 들어, 양 말단에 알데히드기를 갖거나, 또는, 한쪽 말단에는 말레이미드기를, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기, 또는 부틸 알데히드기를 가질 수 있다. 그러나, 링커의 각 말단에 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc 영역과 X가 결합될 수 있다면, 특별히 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 상기 링커의 한쪽 말단에는 반응기로서 말레이미드 기를 포함하고, 다른 쪽 말단에는 알데히드기, 프로피온 알데히드기 또는 부틸 알데히드기 등을 포함할 수 있다.
양쪽 말단에 히드록시 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 링커로 이용하는 경우에는 공지의 화학반응에 의해 상기 히드록시기를 상기 다양한 반응기로 활성화하거나, 상업적으로 입수 가능한 변형된 반응기를 갖는 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체를 제조할 수 있다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 링커는 X의 시스테인 잔기, 보다 구체적으로 시스테인의 -SH 기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 시스테인 잔기의 -SH 기에 링커의 반응기가 연결될 수 있으며, 반응기에 대해서는 앞서 기술한 내용이 모두 적용된다. 만약, 말레이미드-PEG-알데히드를 사용하는 경우, 말레이미드 기는 X의 -SH 기와 티오에테르(thioether) 결합으로 연결하고, 알데히드기는 F, 구체적으로 면역글로불린 Fc의 -NH2기와 환원적 아민화 반응을 통해 연결할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 링커는 X의 라이신 잔기, 보다 구체적으로, 라이신의 아미노기에 연결되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 결합체에서, 링커의 반응기가 면역글로불린 Fc 영역의 N-말단에 위치한 -NH2와 연결된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 결합체에서, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 반응기를 갖는 링커와 C-말단을 통해 연결될 수 있으나, 이는 하나의 일례에 해당한다.
본 발명에서 "C-말단"은, 펩타이드의 카르복시 말단을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적상 링커와 결합할 수 있는 위치를 말한다. 그 예로, 이에 제한되지는 않으나, C-말단의 최말단 아미노산 잔기뿐만 아니라 C-말단 주위의 아미노산 잔기를 모두 포함할 수 있으며, 구체적으로는 최말단으로부터 첫 번째 내지 20 번째의 아미노산 잔기를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상술한 결합체는 효력의 지속성이 F가 수식되지 않은 X에 비해 증가된 것일 수 있으며, 이러한 결합체는 상술한 형태뿐만 아니라, 생분해성 나노파티클에 봉입된 형태 등을 모두 포함한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그 및 면역글로불린 Fc 영역이 링커를 통해 연결된, 지속형 결합체를 제공한다.
상기 인터루킨 2 아날로그, 링커, 및 이를 포함하는 지속형 결합체는 상술한 바와 같다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 하기 화학식 2로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체를 제공한다:
[화학식 2]
X - Z - Fc
이 때 X는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고;
Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X 한 분자가 공유결합으로 연결됨.
상기 인터루킨 2 아날로그, 링커, Fc 영역 및 이를 포함하는 지속형 결합체는 상술한 바와 같다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체적인 실시 형태에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 하기 화학식 3으로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체를 제공한다:
[화학식 3]
X' - Z - Fc
이 때 X'는 하기 일반식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그이고,
[일반식 1]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 1, 서열번호 212)
상기 일반식 1에서,
X1은 결실이고,
X18은 류신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X19는 류신(L), 또는 티로신(Y)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 리신(K), 또는 트립토판(W)이고,
X43은 글루탐산(E), 리신(K), 또는 글루타민(Q)이고,
X45는 알라닌(A), 또는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아르기닌(R)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X74는 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 류신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X81은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 아르기닌(R)이고,
X84는 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 알라닌(A), 글루탐산(E), 글리신(G), 류신(L), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 알라닌(A), 글리신(G), 이소류신(I), 또는 발린(V)이고,
X91은 트레오닌(T), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 이소류신(I), 또는 티로신(Y)이고,
X94는 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)이고,
X96은 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)임;
Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X'와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X' 한 분자가 공유결합으로 연결됨.
상기 인터루킨 2 아날로그, 링커, Fc 영역 및 이를 포함하는 지속형 결합체는 상술한 바와 같다.
상기 일반식 1에서 X133에 해당하는 트레오닌(T)에 하나 이상의 아미노산이 추가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 인터루킨 2 아날로그는 알데스루킨 또는 천연형 인터루킨 2 에 비해 증가된 베타 수용체 결합력을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
하나의 구체적인 실시 형태에서 상기 일반식 1에서,
X43은 리신(K)이고,
X45는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X68은 글루탐산(E)이고,
X74는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)이고,
X85는 류신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 이소류신(I), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 또는 이소류신(I)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 하기 화학식 4로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체를 제공한다:
[화학식 4]
X'' - Z - Fc
이 때 X''는 하기 일반식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그이고,
[일반식 2]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 2, 서열번호 213)
X1은 결실이고,
X18은 류신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 페닐알라닌(F), 또는 리신(K) 이고,
X61은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X81은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 류신(L), 또는 발린(V)이고,
X86은 이소류신(I), 또는 발린(V)임;
Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
-는 X''와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X'' 한 분자가 공유결합으로 연결됨.
상기 인터루킨 2 아날로그, 링커, Fc 영역 및 이를 포함하는 지속형 결합체는 상술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 일반식 2에서 X133에 해당하는 트레오닌(T)에 하나 이상의 아미노산이 추가될 수 있고, 또는 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체를 제조하는 방법을 제공한다.
상기 인터루킨 2 아날로그, 및 이를 포함하는 지속형 결합체는 상술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 방법은 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산에 변이가 도입된 인터루킨 2 아날로그를 링커(예를 들어, 비펩타이드성 중합체)를 통해 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)과 연결시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 지속형 결합체 제조 방법은, 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산에 변이를 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 상술한 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그가 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)과 연결된 지속형 결합체가 제조되는 이상, 특정 단계나 그 순서에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 지속형 결합체 제조 방법은 a) 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인터루킨 2 아날로그를 발현시키는 단계; 및 b) 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리 및 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산은 서열번호 109 내지 212 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 성장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인터루킨 2 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인터루킨 2 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 인터루킨 2 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
또는, 펩타이드 합성법에 의해 제조된 인터루킨 2 아날로그를 비펩타이드성 중합체를 통해 생체적합성 물질(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역)과 연결시킬 수도 있다. 이와 같은 펩타이드 합성은 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 서열이 제공되어 있는 바, 공지의 펩타이드 합성법을 이용해 제한없이 제조할 수 있다.
인터루킨 2 아날로그는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 방법으로 제조된 지속형 결합체를 제공한다.
본 명세서에서 따로 가리키는 바가 없으면, 본 발명에 따른 "인터루킨 2 아날로그" 또는 인터루킨 2 아날로그가 생체적합성 물질에 공유결합으로 연결된 "결합체"에 대한 명세서 상세한 설명이나 청구 범위의 기술은 해당 인터루킨 2 아날로그 또는 결합체는 물론이고, 해당 인터루킨 2 아날로그 또는 결합체의 염(예컨대, 상기 인터루킨 2 아날로그의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함하는 범주에도 적용된다. 따라서 명세서에 "인터루킨 2 아날로그" 또는 "결합체"라고만 기재되어 있더라도 해당 기재 내용은 그 특정 염, 그 특정 용매화물, 그 특정 염의 특정 용매화물에도 마찬가지로 적용된다. 이러한 염 형태는 예를 들어 약학적으로 허용되는 임의의 염을 사용한 형태일 수 있다. 상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 조성물을 제공한다. 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있고, 구체적인 한 양태로는 암 예방 또는 치료 용도를 갖는 약학 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 것일 수 있고, 구체적으로 약리학적 유효량의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물의 구체적인 예로, 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그; 또는 이를 포함하는 지속형 결합체를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 22, 42, 53, 87, 105, 및 106으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그; 또는 상기 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, “약리학적 유효량”이란, 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체가 암의 예방 또는 치료 효과를 나타내면서도 환자에게 독성이나 부작용을 나타내지 않는 안전한 투여 용량을 의미하며, 인터루킨 2 수용체, 구체적으로는 베타 및/또는 알파 수용체에 유의미한 활성을 나타낼 수 있는 투여 용량을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 조성물은 하기 특성 중 하나 이상의 특성을 나타내는 것일 수 있으나, 증대된 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 바탕으로 한 면역 반응 증가 및 항암 효과 등을 나타내는 이상, 제한되는 것은 아니다:
(i) 알데스루킨에 비해 높은 혈중 노출도;
(ii) 알데스루킨에 비해 종양 생장 억제, 및
(iii) 알데스루킨에 비해 기억 T 세포 생성 반응.
T 세포 성장 인자로 알려진 인터루킨 2는 면역 조절에 관여하는 단백질로, T세포를 증식시키고, B세포를 자극시키며, T세포에 작용하여 γ-인터페론을 분비시키는 활성을 갖는다. 이러한 인터루킨 2의 면역 조절 활성에 기초하여 체내 면역 시스템을 이용해 암 세포를 제거함으로써 암의 예방 및 치료 효과를 얻을 수 있다.
특히, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 신호 전달에서 주요한 역할을 담당하는 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 증대된 결합력을 갖고, 이는 개체의 면역 시스템에서 보다 효과적인 항암 효과로 이어지게 된다. 또한, 상기 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체는 증대된 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 가지면서도 지속성이 높아지면서 혈중 노출도가 높아져 우수한 생체 이용율을 나타내며, 결국 우수한 종양 생장 억제 및 기억 T 세포 생성능을 가져 효과적인 암 예방 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2, 알데스루킨, 또는 이를 포함하는 지속형 결합체의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력과 비교하여, 아예 결합력을 상실하거나, 약 0.001배 이상, 약 0.005배 이상, 약 0.01배 이상, 약 0.05배 이상, 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.6배 이상, 약 0.7배 이상, 약 0.8배 이상, 약 0.9배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.3배이상, 약 1.5배 이상, 약 1.7배이상의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체는 천연형 인터루킨 2, 알데스루킨, 또는 이를 포함하는 지속형 결합체의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 1.0배이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 약 100배, 약 130배, 약 150배, 약 200배 이상의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경, 또는 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서, 암은 대장암, 간암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 폐암, 피부암, 흑색종, 유방암, 방광암, 및 위암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있고, 또는 전이암일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 전이성 신세포암, 또는 전이성 흑색종을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "예방"은 상기 인터루킨 2 아날로그 (예컨대 상기 인터루킨 2 아날로그 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태) 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 암 또는 종양을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 용어 "치료"는 상기 인터루킨 2 아날로그 (예컨대 상기 인터루킨 2 아날로그 자체 또는 이에 생체적합성 물질이 결합된 지속형 결합체 형태) 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 암의 증세가 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체의 사용은 혈중 노출도, 혈중 반감기 및 생체 내 효력 지속 효과의 획기적인 증가로 인해 매일 투여되야 하는 만성환자에게 투여 횟수를 감소시켜 환자의 삶의 질을 향상시킬 수 있는 큰 장점이 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체, 또는 희석제는 비자연적으로 발생된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한"이란 치료효과를 나타낼 수 있을 정도의 충분한 양과 부작용을 일으키지 않는 것을 의미하며, 암의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여횟수, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함한 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 경구 투여 시에는 결합제, 활택제, 붕해제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있고, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장화제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 인산칼슘, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 스테아르산마그네슘 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제, 구체적으로는 단백질 의약품의 투여에 유용한 제제 형태로 제형화시켜 당업계에서 통상적으로 사용하는 투여 방법을 이용하여 경구, 또는 피부, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 골수 내, 수막강 내, 심실 내, 폐, 경피, 피하, 복 내, 비강 내, 소화관 내, 국소, 설하, 질 내 또는 직장 경로를 포함하는 비경구 투여 경로에 의하여 투여될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 결합체는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 탄수화물, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타티온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트제, 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers) 등이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 인터루킨 2 아날로그, 이를 포함하는 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 인터루킨 2 아날로그 및/또는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체, 이를 포함하는 조성물, 암, 예방 및 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 상기 개체는 암이 발병 하였거나 의심되는 개체로서, 인간을 포함한 쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물을 의미하나, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 및/또는 결합체, 또는 이를 포함하는 상기 조성물로 치료 가능한 개체는 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질(예를 들어, 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체) 을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 특별히 이에 제한되지 않으나, 생체 내 표적에 도달할 수 있는 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 예를 들어 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 등이 될 수 있다.
본 발명의 방법은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 약학 조성물을 약학적 유효량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에서, 투여시 투여량과 횟수는 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다. 구체적으로, 본 발명의 조성물은 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이를 포함하는 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 인터루킨 2 아날로그 또는 지속형 결합체를 약학적 유효량으로 포함하는 것은, 인터루킨 2 아날로그 또는 지속형 결합체로 인한 목적하는 약리 활성(예를 들어, 암의 예방, 개선 또는 치료)을 얻을 수 있는 정도를 의미하고, 또한 투여되는 개체에서 독성 또는 부작용이 일어나지 않거나 미미한 수준으로서 약학적으로 허용되는 수준을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이와 같은 약학적 유효량은 투여 횟수, 환자, 제형 등을 종합적으로 고려하여 결정될 수 있다.
특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 상기 약학 조성물은 상기 성분 (유효성분)을 0.01 내지 99% 중량 대 부피로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 지속형 결합체의 바람직한 전체 용량은 하루에 환자 체중 1 kg당 약 0.0001 mg 내지 500 mg일 수 있다. 그러나 상기 인터루킨 2 아날로그 또는 이의 결합체의 용량은 약학 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 조성물의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 약학 조성물은 생체 내 지속성 및 역가가 우수하여, 본 발명의 약학적 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다. 상기 약학 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것일 수 있으나, 목적하는 약리 효과를 얻을 수 있다면 특정 투여 경로로 제한되지 않는다.
한 예로, 본 발명의 약학 조성물은 1주에 1회, 2주에 1회, 3주에 1회, 4주에 1회, 또는 1개월에 1회 투여되는 것일 수 있고, 또는 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 1회 또는 다회 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 암의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 상기 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 이를 포함하는 조성물의 용도이다.
상기 인터루킨 2 아날로그 및/또는 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 암, 예방, 치료, 투여 경로 및 투여 횟수에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하는 다른 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그, 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물의 암 예방 또는 치료 용도를 제공하는 것이다.
상기 인터루킨 2 아날로그 및/또는 이의 지속형 결합체, 또는 이를 포함하는 조성물, 암, 예방, 치료, 투여 경로 및 투여 횟수에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
한편, 본원 명세서에서 문맥상 달리 요구하지 않는 한, “포함한다”, “포함하는”, “함유하는”, 등의 표현은 명시된 정수(integer) 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만, 다른 정수 또는 정수의 집합을 배제하는 것이 아니라고 이해되어야 한다.　
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 천연형 인터루킨 2 및 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터의 제작
133개의 아미노산을 코딩하는 천연형 인터루킨 2 발현 벡터를 제작하기 위해, 보고된 인터루킨 2 서열 (NM_000586.3; 서열번호 1)을 바탕으로 합성한 인터루킨 2를 pET-22b 벡터 (Novagen)에 클로닝하였다. 아울러, 상기 인터루킨 2를 주형으로 하여 인터루킨 2의 아미노산을 변형시킨 신규한 인터루킨 2 아날로그를 제작하였다.
인터루킨 2 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 60초, 65℃에서 6.5분으로 이 과정을 16회 반복하였다. 원하는 부위의 아미노산이 정상적으로 바뀌어 있는지 상기 조건에서 얻어진 돌연변이(mutagenesis) 생성물에 대하여 서열 분석을 수행하였으며, 각각의 인터루킨 2 아날로그의 목적하는 변이 위치에 천연형 기준으로 아래 표 1에 표시한 변이가 있는 것을 확인하였다. 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인터루킨 2 아날로그 1 내지 105라 명명하였다.
하기 표 1에 각각의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 이들 인터루킨 2 아날로그를 제작하기 위해 순방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머를 합성한 후, PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
아래 표 1에서 아날로그 1은 알데스루킨이고, 프라이머 #1 내지 #204는 명세서의 서열번호 214 내지 417에 각각 해당한다.
인터루킨 2 아날로그 종류와 변이 위치 및 그 변화 서열
아날로그 변이 위치 및 변화 서열 프라이머# (프라이머 번호)
1 desA1, C125S 197, 198, 201, 202
2 desA1, C125S, S87C 197, 198, 201, 202, 149, 150
3 desA1, C125S, K32C 197, 198, 201, 202, 19, 20
4 desA1, C125S, K35C 197, 198, 201, 202, 21, 22
5 desA1, C125S, K43C 197, 198, 201, 202, 47, 48
6 desA1, C125S, K48C 197, 198, 201, 202, 53, 54
7 desA1, C125S, K49C 197, 198, 201, 202, 55, 56
8 desA1, C125S, K76C 197, 198, 201, 202, 73, 74
9 desA1, C125S, R38A 197, 198, 201, 202, 25, 26
10 desA1, C125S, F42K 197, 198, 201, 202, 35, 36
11 desA1, C125S, F42A 197, 198, 201, 202, 33, 34
12 desA1, C125S, R38A, F42K 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36
13 desA1, C125S, R38A, F42A 197, 198, 201, 202, 25, 26, 33, 34
14 desA1, C125S, L19Y, R38A, F42K 197, 198, 201, 202, 13, 14, 25, 26, 35, 36
15 desA1, C125S, R38A, F42K, D84E 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 109, 110
16 desA1, C125S, R38A, F42K, N88Q 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 153, 154
17 desA1, C125S, R38A, F42K, V91T 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 165, 166
18 desA1, C125S, R38A, F42K, E61Q 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 59, 60
19 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 97, 98, 167, 168
20 desA1, C125S, R38A, F42K, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 139, 140, 167, 168
21 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 167, 168
22 desA1, C125S, L12V, R38A, F42K 197, 198, 201, 202, 3, 4, 25, 26, 35, 36
23 desA1, C125S, L12F, R38A, F42K 197, 198, 201, 202, 1, 2, 25, 26, 35, 36
24 desA1, C125S, L19V, R38A, F42K 197, 198, 201, 202, 11, 12, 25, 26, 35, 36
25 desA1, C125S, L19F, R38A, F42K 197, 198, 201, 202, 9, 10, 25, 26, 35, 36
26 DesA1, C125S, R38A, F42K, I89F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 157, 158
27 desA1, C125S, R38A, F42K, V91F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 163, 164
28 desA1, C125S, R38A, F42K, L94V 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36
29 desA1, C125S, R38A, F42K, Q126T 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 199, 200
30 desA1, C125S, R38A, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 97, 98, 169, 170
31 desA1, C125S, R38A, D84E 197, 198, 201, 202, 27, 28, 109, 110
32 desA1, C125S, R38A, R81D, D84E, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 95, 96, 169, 170
33 desA1, C125S, R38A, L80F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 77, 78
34 desA1, C125S, R38A, L80F, D84E 197, 198, 201, 202, 27, 28, 77, 78, 109, 110
35 desA1, C125S, R38A, L94F, L96F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 189, 190
36 desA1, C125S, R38A, L94F, L96V 197, 198, 201, 202, 27, 28, 193, 194
37 desA1, C125S, R38A, L94F, L96I 197, 198, 201, 202, 27, 28, 191, 192
38 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, I92F, L94F, L96F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 97, 98, 175, 176
39 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, I92F, L94F, L96V 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 97, 98, 179, 180
40 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, I92F, L94F, L96I 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 97, 98, 177, 178
41 desA1, C125S, L80F, R81D, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 41, 42, 79, 80, 167, 168
42 desA1, C125S, R38A, F42K, R81E, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 103, 104, 169, 170
43 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, I92L 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 183, 184
44 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, D84V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 113, 114, 169, 170
45 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, D84F, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 111, 112, 169, 170
46 desA1, C125S, D20V, R38A, F42K, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 17, 18, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 169, 170
47 desA1, C125S, D20F, R38A, F42K, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 15, 16, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 169, 170
48 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, N88V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 155, 156, 169, 170
49 desA1, C125S, R38A, F42K, R81D, N88F, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 99, 100, 151, 152, 169, 170
50 desA1, C125S, F42K, L80F, R81D, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 79, 80, 139, 140, 169, 170
51 desA1, C125S, E61Q, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 59, 60, 99, 100, 169, 170
52 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 169, 170
53 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, D84E, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 95, 96, 169, 170
54 desA1, C125S, R38A, F42K, Q74H, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 71, 72, 99, 100, 169, 170
55 desA1, C125S, R38A, F42K, Q74H, L80F, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 71, 72, 79, 80, 169, 170
56 desA1, C125S, R38A, F42K, Y45A, Q74H, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 49, 50, 71, 72, 99, 100, 169, 170
57 desA1, C125S, R38A, F42K, Y45A, Q74H, L80F, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 49, 50, 71, 72, 79, 80, 169, 170
58 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, L85A, I86A, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 115, 116, 167, 168
59 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, L85A, I86A, I92Y 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 115, 116, 187, 188
60 desA1, C125S, R38A, F42K, Y45A, L80Y, L85A, I86A, I92Y 197, 198, 201, 202, 27, 28, 35, 36, 41, 42, 51, 52, 93, 94, 115, 116, 187, 188
61 desA1, C125S, R38A, F42K, L80Y, R81D, L85G, I86V, I92Y 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 87, 88, 125, 126, 187, 188
62 desA1, C125S, R38A, F42K, L80W, R81E, L85G, I86A, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 35, 36, 41, 42, 85, 86, 123, 124, 171, 172
63 desA1, C125S, R38A, F42K, L80D, R81E, L85T, I86G, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 75, 76, 133, 134, 167, 168
64 desA1, C125S, R38A, F42K, L80Y, R81N, L85V, I86V, I92Y 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 91, 92, 139, 140, 167, 168
65 desA1, C125S, R38A, F42K, L80Y, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 89, 90, 139, 140, 167, 168
66 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81E, L85F, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 81, 82, 121, 122, 167, 168
67 desA1, C125S, R38A, F42K, L80Y, R81D, L85F, I86V, I92W, E95D 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 87, 88, 121, 122, 185, 186, 195, 196
68 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81E, L85I, I86V, V91E, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 81, 82, 127, 128, 159, 160, 167, 168
69 desA1, C125S, R38A, F42K, L80Y, R81E, L85F, I86L, V91E, I92W, E95D 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 89, 90, 119, 120, 161, 162, 185, 186, 195, 196
70 desA1, C125S, R38A, F42K, L80Y, R81D, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 87, 88, 139, 140, 167, 168
71 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 81, 82, 139, 140, 167, 168
72 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, L85V, I86G, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 135, 136, 167, 168
73 desA1, C125S, R38A, F42K, L80F, R81D, L85W, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 79, 80, 141, 142, 167, 168
74 desA1, C125S, R38D, F42K, L80Y, R81D, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 31, 32, 35, 36, 87, 88, 139, 140, 167, 168
75 desA1, C125S, R38A, F42K, Y45A, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 35, 36, 51, 52, 81, 82, 139, 140, 167, 168
76 desA1, C125S, R38A, F42K, K43Q, E61R, L80F, R81D, L85V, I86G, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 39, 40, 61, 62, 79, 80, 135, 136, 167, 168
77 desA1, C125S, R38A, F42K, K43E, E61R, L80F, R81D, L85W, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 37, 38, 61, 62, 79, 80, 143, 144, 167, 168
78 desA1, C125S, K35E, R38A, F42K, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 23, 24, 25, 26, 35, 36, 81, 82, 139, 140, 167, 168
79 desA1, C125S, K35E, R38A, F42K, Q74H, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 23, 24, 25, 26, 35, 36, 71, 72, 81, 82, 139, 140, 167, 168
80 desA1, C125S, K35E, R38A, F42K, Q74H, L80F, R81E, P82G, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 23, 24, 25, 26, 35, 36, 71, 72, 81, 82, 105, 106, 139, 140, 167, 168
81 desA1, C125S, K35E, R38A, F42K, Q74H, L80F, R81E, P82V, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 23, 24, 25, 26, 35, 36, 71, 72, 81, 82, 107, 108, 139, 140, 167, 168
82 desA1, C125S, L18R, Q22E, L80F, R81D, L85E, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 7, 8, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 79, 80, 117, 118, 167, 168
83 desA1, C125S, L18R, L19R, Q22E, L80F, R81D, L85E, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 5, 6, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 79, 80, 117, 118, 167, 168
84 desA1, C125S, L18R, Q22E, L80V, R81D, L85E, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 7, 8, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 83, 84, 117, 118, 167, 168
85 desA1, C125S, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 81, 82, 139, 140, 167, 168
86 desA1, C125S, L18R, Q22E, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 7, 8, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 81, 82, 139, 140, 167, 168
87 desA1, C125S, L18R, L19R, Q22E, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 5, 6, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 81, 82, 139, 140, 167, 168
88 desA1, C125S, E61D, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 57, 58, 81, 82, 139, 140, 167, 168
89 desA1, C125S, R38A, E68Q, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 35, 36, 43, 44, 65, 66, 81, 82, 139, 140, 167, 168
90 desA1, C125S, F42W, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 45, 46, 81, 82, 139, 140, 167, 168
91 desA1, C125S, E61Q, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 59, 60, 81, 82, 139, 140, 167, 168
92 desA1, C125S, L80F, R81E, L85V, I86V, V91T, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 81, 82, 139, 140, 147, 148, 167, 168
93 desA1, C125S, L80F, R81E, D84E, L85V, I86V, V91T, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 81, 82, 101, 102, 139, 140, 167, 168
94 desA1, C125S, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F, L94F, L96F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 81, 82, 139, 140, 173, 174
95 desA1, C125S, V69G, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 67, 68, 81, 82, 139, 140, 167, 168
96 desA1, C125S, V69G, Q74A, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 43, 44, 69, 70, 81, 82, 139, 140, 167, 168
97 desA1, C125S, R38A, L80F, R81D, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 35, 36, 41, 42, 79, 80, 167, 168
98 desA1, C125S, R38A, L80F, R81E, L85V, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 35, 36, 41, 42, 81, 82, 137, 138, 167, 168
99 desA1, C125S, R38A, L80F, R81E, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 27, 28, 35, 36, 41, 42, 81, 82, 131, 132, 167, 168
100 desA1, C125S, L80F, R81E, L85Y, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 41, 42, 81, 82, 145, 146, 167, 168
101 desA1, C125S, L80F, R81E, I86A, I92F 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 41, 42, 81, 82, 129, 130, 167, 168
102 desA1, C125S, L80F, R81E, L85V, I86V 197, 198, 201, 202, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 41, 42, 81, 82, 139, 140, 181, 182
103 desA1, C125S, L18R, Q22E, R38A, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 7, 8, 27, 28, 35, 36, 41, 42, 81, 82, 139, 140, 167, 168
104 desA1, C125S, L18R, Q22E, E61D, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 7, 8, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 41, 42, 57, 58, 81, 82, 139, 140, 167, 168
105 desA1, C125S, L18R, Q22E, E68D, L80F, R81E, L85V, I86V, I92F 197, 198, 201, 202, 7, 8, 25, 26, 29, 30, 35, 36, 41, 42, 63, 64, 81, 82, 139, 140, 167, 168
desA1은 인터루킨 2의 첫번째 아미노산인 알라닌을 결실시킨 것을 의미한다.하기 표 2에 인터루킨 2 아날로그의 전장 길이 단백질 서열을 나타냈다. 하기 표 2 내의 볼드체는 변이 위치를 나타낸 것이다.
인터루킨 2 아날로그 서열
아날로그 단백질 서열 단백질 서열서열번호 염기 서열
서열번호
1 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 2 107
2 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLICNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 3 108
3 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YCNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 4 109
4 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPCLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 5 110
5 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFCFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 6 111
6 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPCKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 7 112
7 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKCA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 8 113
8 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSCNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 9 114
9 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 10 115
10 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 11 116
11 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TAKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 12 117
12 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 13 118
13 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TAKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 14 119
14 PTSSSTKKT QLQLEHLLYD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 15 120
15 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRELISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 16 121
16 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISQIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 17 122
17 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN TIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 18 123
18 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE QELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 19 124
19 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 20 125
20 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 21 126
21 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 22 127
22 PTSSSTKKT QVQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 23 128
23 PTSSSTKKT QFQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 24 129
24 PTSSSTKKT QLQLEHLLVD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 25 130
25 PTSSSTKKT QLQLEHLLFD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 26 131
26 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNFN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 27 132
27 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN FIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 28 133
28 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVVELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 29 134
29 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSTSIIS TLT 30 135
30 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 31 136
31 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRELISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 32 137
32 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRELISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 33 138
33 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 34 139
34 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF RPRELISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 35 140
35 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVFEFKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 36 141
36 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVFEVKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 37 142
37 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVFEIKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 38 143
38 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVFEFKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 39 144
39 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVFEVKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 40 145
40 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVFEIKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 41 146
41 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 42 147
42 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL EPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 43 148
43 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VLVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 44 149
44 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRVLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 45 150
45 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRFLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 46 151
46 PTSSSTKKT QLQLEHLLLV LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 47 152
47 PTSSSTKKT QLQLEHLLLF LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 48 153
48 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISVIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 49 154
49 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISFIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 50 155
50 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 51 156
51 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE QELKPLEEVL NLAQSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 52 157
52 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 53 158
53 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRELISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 54 159
54 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 55 160
55 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHF DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 56 161
56 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFAMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHL DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 57 162
57 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFAMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHF DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 58 163
58 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDAASNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 59 164
59 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDAASNIN VYVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 60 165
60 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFAMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY RPRDAASNIN VYVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 61 166
61 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY DPRDGVSNIN VYVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 62 167
62 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHW EPRDGASNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 63 168
63 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHD EPRDTGSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 64 169
64 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY NPRDVVSNIN VYVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 65 170
65 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 66 171
66 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDFVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 67 172
67 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY DPRDFVSNIN VWVLDLKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 68 173
68 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDIVSNIN EFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 69 174
69 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY EPRDFLSNIN EWVLDLKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 70 175
70 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY DPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 71 176
71 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 72 177
72 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDVGSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 73 178
73 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDWVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 74 179
74 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTDML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHY DPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 75 180
75 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKKFAMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 76 181
76 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKQFYMPKKA TELKHLQCLE RELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDVGSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 77 182
77 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TKEFYMPKKA TELKHLQCLE RELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDWVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 78 183
78 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPELTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 79 184
79 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPELTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 80 185
80 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPELTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHF EGRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 81 186
81 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPELTAML TKKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAHSKNFHF EVRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 82 187
82 PTSSSTKKT QLQLEHLRLD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDEVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 83 188
83 PTSSSTKKT QLQLEHLRRD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDEVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 84 189
84 PTSSSTKKT QLQLEHLRLD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHV DPRDEVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 85 190
85 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 86 191
86 PTSSSTKKT QLQLEHLRLD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 87 192
87 PTSSSTKKT QLQLEHLRRD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 88 193
88 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE DELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 89 194
89 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEQVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 90 195
90 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TWKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 91 196
91 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE QELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 92 197
92 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN TFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 93 198
93 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPREVVSNIN TFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 94 199
94 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVFEFKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 95 200
95 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEGL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 96 201
96 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEGL NLAASKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 97 202
97 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF DPRDLISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 98 203
98 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVISNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 99 204
99 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDLVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 100 205
100 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDYVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 101 206
101 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDLASNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 102 207
102 PTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 103 208
103 PTSSSTKKT QLQLEHLRLD LEMILNGINN YKNPKLTAML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 104 209
104 PTSSSTKKT QLQLEHLRLD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE DELKPLEEVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 105 210
105 PTSSSTKKT QLQLEHLRLD LEMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEDVL NLAQSKNFHF EPRDVVSNIN VFVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFSQSIIS TLT 106 211
실시예 2: 인터루킨 2 아날로그의 발현
상기 실시예 1에서 제조한 발현 벡터를 이용하여, T7 프로모터 조절하의 재조합 인터루킨 2 아날로그를 발현시켰다. 각각의 재조합 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터로 발현 대장균 균주, E.coli BL21DE3(E. coli B F- dcm ompT hsdS(rB -mB -) gal λ(DE3); 노바젠사)을 형질 전환하였다. 형질전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 이용하였다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여, 암피실린(50 μg/mL)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여, 각 1 mL씩 cryo-튜브에 분주하고, -150℃에 보관하였다. 이를 재조합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인터루킨 2 아날로그의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알(vial)을 녹여 500 mL의 2X LB에 접종하고, 37℃에서 14 ~ 16시간 동안 진탕 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도 값이 4.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(Bioflo-320, NBS, 미국)를 이용하여, 종 배양액을 1.6 L의 발효 배지에 접종하고, 초기 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 2.0 L/min(1vvm), 교반 속도 650 rpm 및 30% 암모니아수를 사용하여, pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가 배지(feeding solution)을 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 OD 값에 의해 모니터링하고, 흡광도 값 70 이상에서 최종 농도 500 μM의 IPTG를 도입하였다. 배양은 IPTG 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하였으며, 배양 종료 후 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수확하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 인터루킨 2 아날로그의 추출 및 재접힘(refolding)
상기 실시예 2에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 발현 대장균으로부터 인터루킨 2 아날로그를 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 재접힘하였다. 배양액 100 mL 분량에 해당하는 세포 펠렛을 1 - 200 mL의 파쇄 완충 용액 (20 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM EDTA pH 9.0, 0.2 M NaCl, 0.5% Triton X-100)에 부유시킨 후, 미세용액화(Microfludizer)를 이용하여 15,000 psi로 재조합 대장균을 파쇄하였다. 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 400 mL의 첫번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 두번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 세번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1% sodium deoxycholorate)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 네번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1 M NaCl)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 세척된 대장균 봉입체 (inclusion body) 펠렛을 수득하였다. 세척된 봉입체 펠렛을 400 mL의 가용/환원화 완충액 (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT)에 재부유하여 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 가용/환원된 인터루킨 2 아날로그에 증류수 100 mL를 넣어 6 M Guanidine을 4.8 M Guanidine으로 희석한 후 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 펠렛은 버리고 용액만 수득하였다. 희석된 용액에 증류수 185.7 mL를 추가로 넣어 4.8 M Guanidine을 3.5 M Guanidine으로 희석한 후 100% acetic acid를 이용하여 pH를 5.0로 맞추었다. pH 조정된 용액을 상온에서 1시간 교반하였다. 불순물이 침전된 용액은 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 마지막 세척 완충 용액 (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 세척된 인터루킨 2 아날로그를 400 mL의 재접힘 완충 용액 (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl2)으로 용해시킨다. 혼합용액을 4℃에서 15 - 24 시간 동안 교반함으로서 재접힘 과정을 수행하였다.
실시예 4: 크기 배제 컬럼 크로마토그래피
상기 실시예 3에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 재접힘 용액을 크기 배제 컬럼에 적용하여 정제하기 위하여 1 mL이하로 농축하였다. 컬럼은 재접힘 용액 도입 전 완충 용액 (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0)으로 평형화하였고, 재접힘 용액 도입후 완충 용액 흘려주어 용출하였다. 용출된 시료는 Guanidine을 포함하고 있어 안정화 용액 (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose)로 바꿔준 후 RP-HPLC, peptide mapping 분석을 통해 순도를 측정하였다. 측정된 순도가 80%이상이면 실험에 사용하였다.
실시예 5: 인터루킨 2 아날로그의 수용체 결합력 평가
상기 실시예 4에서 얻은 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 수용체와 베타 수용체 각각의 수용체 결합력을 측정하기 위하여 표면 플라스몬 공명 (surface plasmon resonance, SPR, BIACORE T200, GE healthcare)을 사용하였다. 제조된 아날로그의 알파 수용체 및 베타 수용체에 대한 결합력을 측정하고, 인터루킨 2 아날로그 1(aldesleukin)과 각 결합력을 비교하였다.
먼저 CM5칩(GE healthcare사)에 아민 결합법(amine coupling)을 통해 항 인간 면역글로블린 항체(Abcam사, #ab97221)를 약 5,000 RU (resonance unit)만큼 고정화한 후, 항원 항체 결합 반응을 이용하여 인간 면역글로블린 Fc부위가 결합된 인터루킨 2 알파 수용체(SYMANSIS사, #4102H) 또는 인터루킨 2 베타 수용체(SYMANSIS사, #4122H)를 각각 면역글로블린 항체에 결합시켜 최종 고정화 하였다. 그 다음으로 상기에서 재조한 재조합 인터루킨 2 아날로그를 농도별로 2배 연속희석법으로 HBS-P+ 버퍼(Cytiva사, BR100671)에 희석하고, 인터루킨 2 수용체가 최종 고정된 CM5칩에 흘려주어 각 인터루킨 2 수용체의 결합력을 측정하였다. 결합력은 결합 속도(Ka)와 해리 속도(Kd)를 이용하여 측정하였으며, 10 uL/분의 유속으로 인터루킨 2 아날로그를 3분간 흘려 결합 속도를 측정하고, 동일한 시간과 유속으로 HBS-P+ 버퍼만 흘려 주어 각 인터루킨 2 수용체로부터의 해리 속도를 측정하였다. 측정이 완료되면, Biaevaluation 프로그램에서 1:1 binding fitting model에 따라 수용체의 결합력 평가를 진행하였다.
상대적 결합력 KD (%) = 아날로그 1(aldesleukin) 결합력(KD) / 아날로그 결합력(KD) × 100
하기 표 3은 아날로그 1(aldesleukin) 대비 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체 상대적 결합력을 정리한 것으로, 아래 표 3에서 “정의 불가”는 표면 플라스몬 공명 측정에서 해당 수용체에 대한 결합이 관측되지 않음에 따라 그 수용체에 한해서는 해당 물리량을 정의할 수 없다는 것을 가리킨다.
Figure PCTKR2022004620-appb-img-000002
Figure PCTKR2022004620-appb-img-000003
시험 결과(도 1 및 2, 및 표 3)에서 명시된 바와 같이 본 발명의 인터루킨 2 아날로그들은 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 아예 상실하거나, 인터루킨 2 아날로그 1에 비하여 감소 또는 증가하는 등 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 상이한 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, 인터루킨 2 베타 수용체에 대해서는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비하여 최대 100배 더 강한 결합력이 확인되었다. 이를 통해 인터루킨 2 아날로그의 아미노산 서열이 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체의 결합에 영향력이 있음을 확인하였다. 이는 특정 위치의 아미노산을 치환 함으로써 인터루킨 2 수용체의 결합력을 변화시킬 수 있음을 시사하는 바이다.
상기와 같은 실험 결과는 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그가 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 가져, 이를 활용한 다양한 약물 개발에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 6: 인터루킨 2 아날로그와 폴리에틸렌 글리콜 (3.4K PEG) 링커의 연결 반응 및 인터루킨 2 아날로그 연결체의 정제
상기 실시예 4에서 얻은 인터루킨 2 아날로그를 면역글로불린 Fc 영역에 결합한 지속형 결합체를 제조하기 위하여 인터루킨 2 아날로그를 폴리에틸렌글리콜(PEG) 링커의 한 말단에 연결시킨 연결체를 먼저 제조하였다. 연결체 제조에는 21번, 41번, 52번, 86번, 104번과 105번의 인터루킨 2 아날로그를 사용하였고, PEG 링커로는 분자량이 3.4 kDa이고, 양 말단의 히드록시 수소가 프로필알데히드기로 개질된 폴리에틸렌글리콜(일본 NOF사의 ALD(2)3.4K PEG)을 사용하여 이를 상기 인터루킨 2 아날로그의 N-말단에 연결 반응 시켰다. 인터루킨 2 아날로그 : PEG 링커의 몰 비율은 1:15~1:20으로, 인터루킨 2 아날로그 농도는 1 mg/mL 이하로 하여 2 내지 10℃에서 1시간 반응 시켰다. 이때 반응은 100 mM 인산칼륨(pH 5.5) 하에서 이루어 졌고, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드(Sodium cyanoborohydride, SCB)를 첨가하였다. 반응액은 탈염 컬럼을 이용하여 20 mM 트리에틸아민(Triethylamine)(pH 8.0) 버퍼로 바꿔준 후, 트리에틸아민(pH 8.0)과 염화나트륨 농도 구배를 이용한 Fractogel® EMD TMAE (S) (Merck Millipore) 혹은 Source 15Q (Cytiva)컬럼을 사용하여 정제하여 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG 연결체를 얻었다.
실시예 7: 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG- 면역글로불린 Fc 영역 지속형 결합체의 제조
인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 영역 지속형 결합체를 제조하기 위하여, 실시예 6의 방법을 이용하여 얻은 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG 연결체와 면역글로불린 Fc 영역(서열번호 438)의 몰 비가 1:10이 되도록 하고, 전체 단백질 농도를 30 mg/mL로 하여 2 내지 10℃에서 15 내지 16시간 반응 시켰다. 이때 반응액은 100 mM 인산칼륨(pH 6.0)이며, 환원제로서 20 mM 소디움 시아노보로하이드라이드를 첨가하였다.
이 때 이용된 면역글로불린 영역은 서열번호 423의 아미노산 서열 (221개의 아미노산으로 구성됨)을 갖는 단량체 2개가 각 단량체의 3번 아미노산인 시스테인 사이에 이황화 결합을 통해 동종이량체를 형성하고, 상기 동종이량체의 단량체는 각각 독립적으로 35번 및 95번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합 및 141번 및 199번의 시스테인 간의 내부의 이황화 결합이 형성된 것이다.
면역 글로불린 Fc 단백질 서열
이름 단백질 서열 서열번호
면역글로불린 Fc PSCPAPEFLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SQEDPEVQFN WYVDGVEVHN AKTKPREEQF NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK GLPSSIEKTI SKAKGQPREP QVYTLPPSQE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFFL YSRLTVDKSR WQEGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSLG K 438
반응이 종료된 후, 상기 반응액은 비스트리스 (Bis-Tris)(pH 6.5)와 염화 나트륨을 이용하여 Butyl FF (Cytiva)에서 미반응 면역글로불린 Fc 영역을 제거하고, 시트르산나트륨 완충액(pH 5.5)과 황산암모늄을 이용하여 Source 15ISO (Cytiva)으로 정제함으로써 인터루킨 2 아날로그의 N-말단이 3.4 kDa PEG 링커의 한 말단에 연결되고, 3.4 kDa PEG 링커의 반대쪽 말단이 Fc 영역의 N-말단 프롤린의 질소에 연결된 인터루킨 2 아날로그-3.4K PEG-면역글로불린 Fc 영역 결합체(지속형 결합체)를 얻었다. 이 지속형 결합체는 SDS-PAGE, RP-HPLC, SE-HPLC를 이용하여 분석하였다. (도 1 및 2)
실시예 8: 인터루킨 2 아날로그 결합체의 인터루킨 2 수용체 결합력 평가
상기 실시예 7에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체와 인터루킨 2 알파, 베타 수용체 각각의 수용체 결합력을 측정하기 위하여 표면 플라스마 공명 (SPR, BIACORE T200, GE healthcare)을 사용하였다.
구체적으로, 비오틴이 표지된 인간 인터루킨 2 수용체 알파 및 베타 서브유닛(ACROBiosystems) 각각을 스트렙타비딘 바이오 센서칩(SA chip, Cytiva사)에 약 100 RU 및 500 RU씩 고정화하고 2배 연속 희석법으로 HBS-EP+ 버퍼(Cytiva사, BR100669)에 희석된 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체들 또는 알데스루킨을 분당 20 μL의 유속으로 흘려주었다. 3분간의 결합 과정 뒤, 동일한 유속으로 HBS-EP+ 버퍼만을 3분간 흘려주어 인터루킨 2 수용체에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체 또는 알데스루킨의 해리를 유도하였으며, 이때 얻어진 결합 상수 및 해리 상수를 통해 결합력을 산출하였다. 결합력 평가는 Biaevaluation 프로그램에서 1:1 binding fitting model에 따라 진행하였다.
평가된 인터루킨 2 아날로그 결합체들은 고유의 인터루킨 2 수용체 결합력이 확인되었으며 특히 인터루킨 2 수용체 알파 서브유닛에서 각 후보 물질들 간에 명백한 결합력 차이가 확인되었다. 결과를 자세히 살펴보면, 인터루킨 2 아날로그 21번과 52번 결합체는 인터루킨 2 수용체 알파 서브유닛에 결합하지 않았으며 인터루킨 아날로그 41번, 86번, 104번, 그리고 105번 결합체는 알데스루킨에 비하여 각각 50.8%, 65.2%, 81.0%, 그리고 112.9%의 상대적인 결합력이 확인되었다. 인터루킨 2 수용체 베타 서브유닛의 경우, 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체와 52번 결합체를 포함하는 모든 인터루킨 2 아날로그 결합체에서 알데스루킨에 비하여 높은 결합력이 확인되었다.
아래 표 5에 알파와 베타 수용체별로 제조한 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체들의 알데스루킨의 결합력을 기준으로 비교한 상대적 결합력(%)을 정리하였다. 표 5에서 해당 지속형 결합체는 이를 구성하는 인터루킨 2 아날로그의 번호로 표시하였다(예: 인터루킨 2 아날로그 21번의 지속형 결합체는 “인터루킨 2 아날로그 21번 결합체”로 표시)
인터루킨 2 아날로그 결합체의 인터루킨 2 수용체 결합력
평가 물질 인터루킨 2 수용체 알파 서브유닛 인터루킨 2 수용체 베타 서브유닛
상대적 결합력
(%)		 상대적 결합력
(%)
알데스루킨 100.0 100.0
인터루킨 2 아날로그 21번 결합체 - 5,426.6
인터루킨 2 아날로그 41번 결합체 50.8 5,483.0
인터루킨 2 아날로그 52번 결합체 - 2,271.8
인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 65.2 15,393.1
인터루킨 2 아날로그 104번 결합체 81.0 13,423.5
인터루킨 2 아날로그 105번 결합체 112.9 13,293.8
실시예 9: 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 약물 동태학 평가
상기 실시예 5 및 7에서 확인한 인터루킨 2 아날로그와 이를 포함하는 지속형 결합체의 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력을 바탕으로 인터루킨 2 아날로그와 지속형 결합체를 이용한 약제에서 우수한 혈중 노출도 및 생체이용율을 갖는 것을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 본 발명자들은 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체들과 알데스루킨의 약물 동태학을 ICR 및 C57BL/6 혈통 정상 마우스 모델에서 비교 분석하였다.
보다 구체적으로, 알데스루킨을 투여하는 대조군과 인터루킨 2 아날로그 결합체(인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 104번 결합체, 및 인터루킨 2 아날로그 105번 결합체)를 투여하는 실험군을 정상 마우스에 피하, 정맥내 또는 복강내 주사 하였다. 인터루킨 2 아날로그 결합체를 피하 주사한 그룹은 1, 4, 8, 24, 48, 72, 그리고 96시간 후에 각각 3마리의 동물로부터 안와정맥을 통해 채혈하였고, 알데스루킨을 정맥내 또는 복강내 경로로 투약한 그룹은 0.08, 0.25, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 그리고 24시간에 각각 3마리씩 동일한 방법으로 채혈하였다. 채혈된 각 군의 혈액은 원심분리하여 혈청으로 분리하였고 인간 인터루킨 2 항체를 이용한 ELISA 방법으로 혈중 인터루킨 2 아날로그 결합체 및 알데스루킨을 정량하였다. 그 결과, 인터루킨 2 아날로그 결합체는 알데스루킨에 비하여 ICR 및 C57BL/6 혈통의 정상 마우스에서 높은 혈중 노출도를 나타내었다 (도 3, 표 6 및 7). 아래 표에 나타낸 결합체의 용량, AUC, 농도 수치에서는 전체 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위가 차지하는 무게만을 기준으로 결합체량 수치(mg, ng)를 표시하였다.
ICR 마우스에서 인터루킨 2 아날로그 결합체의 약물 동태학
알데스루킨 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체
투약 용량 및 경로 0.8 mg/kg(정맥내 주사) 0.5 mg/kg(피하 주사) 0.5 mg/kg(피하 주사)
AUC (ng/mL×hr) 2,463.8 43,511.2 82,579.4
C0 또는 Cmax (ng/mL) 20,183.2 1,887.9 2,370.5
T1/2 (hr) 1.4 8.5 9.0
C57BL/6 마우스에서 인터루킨 2 아날로그 결합체의 약물 동태학
알데스루킨 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 인터루킨 2 아날로그 104번 결합체 인터루킨 2 아날로그 105번 결합체
투약 용량 및 경로 3.0 mg/kg (복강내 주사) 0.5 mg/kg (피하 주사) 0.5 mg/kg
(피하 주사)		 0.5 mg/kg
(피하 주사)		 0.5 mg/kg
(피하 주사)
AUC (ng/mL×hr) 1,458.2 375,794.2 136,373.5 186,068.4 107,487.6
C0 또는 Cmax(ng/mL) 1,018.6 13,319.0 7,371.1 9,288.3 6302.1
상기 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체는 피하 경로로 투여되었음에도 불구하고 정맥내 주사 혹은 복강내 주사를 통한 알데스루킨에 비하여 높은 혈중 분포도를 나타내었다. 이러한 결과들은 약물 투여 시 상기 인터루킨 2 아날로그 결합체가 인간 재조합 인터루킨 2에 비하여 더욱 적은 양을 투약하여도 더 많은 양이 혈중에 노출되고 뿐만 아니라 투약의 편의성까지 확보할 수 있음을 시사하는 바이다.
실시예 10: 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능 평가
상기 인터루킨 2 아날로그 결합체의 치료적 효능을 조사하고자, 동종 이식된 CT26 대장암종 마우스 모델 (CT26 colon tumor syngeneic mouse mode)에 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 그리고 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체 및 대조 물질로 알데스루킨을 각각 투약 후 종양의 크기와 개체 사망률을 평가하였다.
구체적으로, 세포 배양용 플라스크에서 배양된 CT26 세포(ATCC)를 BALB/c 마우스의 다리에 피하 주사하고 며칠 뒤 육안으로 종양이 관찰되면 종양의 크기가 비슷하도록 각 그룹당 7마리씩을 배정하였다. 각 그룹에는 0.5 mg/kg의 인터루킨 2 아날로그 21번 결합체, 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체, 그리고 인터루킨 2 아날로그 52번 결합체를 각각 피하 경로로 1주에 1회씩 총 2회 반복 투약하였다. 이 때 지속형 결합체의 투여량은 해당 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위만의 무게를 나타낸다. 알데스루킨 투약 그룹에는 3.0 mg/kg의 프로류킨 주(Novartis)를 복강내 경로로 하루에 1회씩 5일간 연속 투약하였으며, 2일 휴식 후 동일한 일정으로 5일간 추가로 투약을 진행하였다.
첫 투약 일을 기준으로 32일간 체중 및 개체 사망을 관찰하였으며, 그 결과를 바탕으로 모든 인터루킨 2 아날로그 결합체 투약 군에서 우수한 항암 효능이 확인되었다. 특히 인터루킨 2 아날로그 41번 결합체가 투약된 그룹은 모든 개체에서 완전관해가 관찰되었다. 반면, 알데스루킨을 투약한 군에서는 7마리 중 2마리가 사망에 이르렀으며, 단지 2마리에서만 완전관해가 나타났다. 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체는 아미노산 서열 변경으로 인간 인터루킨 2 수용체 베타 서브유닛에 강력히 결합하며 이를 통해 우수한 항암 효력이 나타난 것으로 풀이된다 (도 4). 그뿐만 아니라 인간 면역글로불린 Fc 영역이 연결된 지속형 결합체 구조를 통해 높은 혈중 노출을 가능하게 하여 투약 간격을 늘리고 기존 주사 요법을 피하 경로로 전환함으로써 환자 및 의료진에게 투약 편의성을 제공할 수 있음을 시사한다.
실시예 11: 종양의 반복 노출에 따른 기억 T 세포 반응 평가
상기 실시예 10의 항암 효능평가에 이어 종양의 반복 노출에 따른 기억 T 세포의 반응을 평가하였다. 구체적으로 상기 항암 효능평가가 완료된 이후 완전관해가 확인된 개체에 대하여, 첫 약물 투약 후 42일과 70일차에 각각 CT26 세포를 첫번째 노출과 동일한 방법으로 피하경로로 투여하여 재노출 시킨 뒤 종양의 생장 여부를 관찰하였고, 두번째 재 노출 이후 4일과 7일 뒤에는 마우스의 비장으로부터 기억 T 세포의 수를 FACS Canto II (Becton Dickinson) 장치로 분석하였다.
그 결과, 음성 대조군을 제외한 모든 약물 투약 군에서 재 노출에 따른 종양의 생장이 억제되었을 뿐만 아니라 비장에서 기억 T 세포의 유의적인 증가가 관찰되었다(도 5). 결론적으로, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체는 단일 제제 만으로도 동종 이식된 CT26 대장암종 마우스 모델에서 기억 면역반응을 유도하여 첫 번째 종양의 노출뿐만 아니라 종양의 재 노출에도 강력한 항암효능이 유지되었다.
실시예 12: 악성 흑색종에서 인터루킨 2 아날로그 지속형 결합체의 항암 효능평가
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그 결합체의 항암 효능을 평가하고자, 흑색종 세포인 B16F10 세포가 동종 이식된 악성 흑색종 마우스 모델(B16F10 melanoma tumor syngeneic mouse model)에 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 및 대조 물질로 알데스루킨을 각각 투약 후 종양의 크기와 개체 생존율을 평가하였다.
구체적으로, 세포 배양용 플라스크에서 배양된 B16F10 세포(ATCC)를 C57BL/6 마우스 허벅다리에 피하 주사하고 며칠 뒤 육안으로 종양이 관찰되면 종양의 크기가 비슷하도록 각 그룹당 9마리씩을 배정하였다. 지속형 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위의 무게를 기준으로 0.08 mg/kg부터 10 mg/kg의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체를 각각 피하 경로로 1주에 1회씩 총 4회 반복 투약하였다. 또한 대조군으로서 알데스루킨 투약 그룹에는 3.0 mg/kg의 프로류킨 주(Novartis)를 복강내 경로로 하루에 1회씩 5일간 연속 투약하고, 2일 휴지기를 갖는 방식으로 총 4회 반복 투약하였다.
첫 투약 일을 기준으로 15일 차에서 각 그룹의 종양 크기(도 6의 A) 및 60일간 각 개체의 생존율(도6의 B)을 관찰하였다. 그 결과, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체 투약 군이 알데스루킨 투약 그룹 보다 종양의 크기가 줄어들고 개체 생존률도 우수한 것을 확인하였으며, 본 발명의 지속형 결합체의 투약 용량 의존적인 항암 효능을 확인하였다. 특히, 주당 4.0 mg/kg 이상의 인터루킨 2 아날로그 86번 결합체가 투약된 그룹에서는 일부 개체에서 종양이 완전히 제거된 완전관해가 관찰되었다. 반면, 알데스루킨이 3.0 mg/kg으로 5일간 연속적으로 투약된 그룹에서는 어떠한 개체에서도 완전관해가 발견되지 않았다.
이는, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 결합체는 알데스루킨에 비하여 상대적으로 강력한 인간 인터루킨 2 수용체의 베타 서브유닛에 결합하는 특징을 갖도록 설계되었으며 이를 통해 우수한 항암효력을 나타낼 수 있는 것을 의미한다. 뿐만 아니라 원치 않는 부작용을 초래하지 않는 최소한의 인간 인터루킨 2 수용체의 알파 서브유닛에 결합력을 통해 과도한 면역반응을 효과적으로 제어하여 지속형 결합체 중 인터루킨 2 아날로그 부위의 무게 기준으로 10 mg/kg 이상의 고용량 투약군에서도 투약을 중단 할 정도의 부작용이 관찰되지 않았다.
상기와 같은 실험 결과는 본 발명에 따른 천연형 인터루킨 2에 아미노산 변이를 도입한 인터루킨 2 아날로그를 포함하는 지속형 결합체가 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 가져, 이를 활용한 다양한 약물 개발, 특히 항암제 개발에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (32)

  1. 인터루킨 2 아날로그(analog)를 포함하는 지속형 결합체로서, 하기 화학식 1로 표시되는 지속형 결합체:
    [화학식 1]
    X - La - F
    여기서, X는, 알데스루킨(aldesleukin)에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그(analog)이고;
    L은, 폴리에틸렌 글리콜 링커이며;
    a는, 0 또는 자연수이며, 다만 a가 2 이상일 때, 각각의 L은 서로 독립적이고;
    F는, 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
    -는 X와 L 사이, L과 F 사이의 공유결합 연결을 나타내며;
    상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함함.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 알데스루킨과 달라진 것을 특징으로 하는, 지속형 결합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 133번 위치에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 것인, 지속형 결합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 지속형 결합체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 1개 내지 10개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인, 지속형 결합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 18번, 19번, 20번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 69번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것인, 지속형 결합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 18번, 22번, 38번, 42번, 61번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것인, 지속형 결합체.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것인, 지속형 결합체:
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 32번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 35번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 38번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 43번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 48번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 49번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 76번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 87번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (bo) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그; 및
    (bp) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 및 86번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 지속형 결합체:
    (a) 12번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (b) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환;
    (c) 19번 아미노산 티로신, 발린, 페닐알라닌, 아르기닌으로 치환;
    (d) 20번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (e) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환;
    (f) 32번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (g) 35번 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산으로 치환;
    (h) 38번 아미노산이 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환;
    (i) 42번 아미노산이 라이신, 알라닌, 또는 트립토판으로 치환;
    (j) 43번 아미노산이 시스테인, 글루탐산, 또는 글루타민으로 치환;
    (k) 45번 아미노산이 알라닌으로 치환;
    (l) 48번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (m) 49번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (n) 61번 아미노산이 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파르트산으로 치환;
    (o) 68번 아미노산이 아스파르트산, 또는 글루타민으로 치환;
    (p) 69번 아미노산이 글리신으로 치환;
    (q) 74번 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌으로 치환;
    (r) 76번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (s) 80번 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 발린, 아스파르트산, 또는 트립토판으로 치환;
    (t) 81번 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 또는 아스파라긴으로 치환;
    (u) 82번 아미노산이 글리신, 또는 발린으로 치환;
    (v) 84번 아미노산이 글루탐산, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (w) 85번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 글루탐산, 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (x) 86번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 또는 류신으로 치환;
    (y) 87번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (z) 88번 아미노산이 글루타민, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (aa) 89번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환;
    (ab) 91번 아미노산이 트레오닌, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 치환;
    (ac) 92번 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 티로신, 또는 트립토판으로 치환;
    (ad) 94번 아미노산이 페닐알라닌, 또는 발린으로 치환;
    (ae) 95번 아미노산이 아스파르트산으로 치환;
    (af) 96번 아미노산이 페닐알라닌, 발린, 또는 이소류신으로 치환;
    (ag) 125번 아미노산이 세린으로 치환; 및
    (ah) 126번 아미노산이 트레오닌으로 치환.
  10. 제8항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것인, 지속형 결합체:
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그;
    (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그; 및
    (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 인터루킨 2 아날로그.
  11. 제10항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 지속형 결합체:
    (a) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환;
    (b) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환;
    (c) 38번 아미노산이 알라닌으로 치환;
    (d) 42번 아미노산이 라이신으로 치환;
    (e) 61번 아미노산이 아스파르트산으로 치환;
    (f) 68번 아미노산이 아스파르트산으로 치환;
    (g) 80번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환;
    (h) 81번 아미노산이 글루탐산으로 치환;
    (i) 85번 아미노산이 발린으로 치환;
    (j) 86번 아미노산이 발린으로 치환;
    (k) 92번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; 및
    (l) 125번 아미노산이 세린으로 치환.
  12. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 하이브리드(hybrid)인 지속형 결합체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 IgG4 Fc 영역인 지속형 결합체.
  14. 제1항에 있어서, 상기 면역글로불린 Fc 영역은 비당쇄화된 것인 지속형 결합체.
  15. 제1항에 있어서, 상기 L은 에틸렌글리콜 반복 단위를 함유하고, 상기 에틸렌글리콜 반복 단위 부위(moiety)의 화학식량은 1 내지 100 kDa 범위에 있는 지속형 결합체.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태 면역글로불린 Fc 영역 중 하나의 Fc 영역에 X 한 분자가 상기 폴리에틸렌글리콜 링커를 통하여 서로 공유결합적으로 연결된 지속형 결합체.
  17. 하기 화학식 2로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체:
    [화학식 2]
    X - Z - Fc
    이 때 X는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열에서 선택되는 어느 하나의 폴리펩타이드 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고;
    Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
    Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
    -는 X와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
    상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X 한 분자가 공유결합으로 연결되어 있는 지속형 결합체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 지속형 결합체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 지속형 결합체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 인터루킨 2 아날로그.
  21. 제17항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것인 지속형 결합체.
  22. 하기 화학식 3으로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체:
    [화학식 3]
    X' - Z - Fc
    이 때 X'는 하기 일반식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고,
    [일반식 1]
    X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 1, 서열번호 212)
    상기 일반식 1에서,
    X1은 결실이고,
    X18은 류신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
    X19는 류신(L), 또는 티로신(Y)이고,
    X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
    X38은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 아르기닌(R)이고,
    X42는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 리신(K), 또는 트립토판(W)이고,
    X43은 글루탐산(E), 리신(K), 또는 글루타민(Q)이고,
    X45는 알라닌(A), 또는 티로신(Y)이고,
    X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아르기닌(R)이고,
    X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X74는 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이고,
    X80은 페닐알라닌(F), 류신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
    X81은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 아르기닌(R)이고,
    X84는 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X85는 알라닌(A), 글루탐산(E), 글리신(G), 류신(L), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y)이고,
    X86은 알라닌(A), 글리신(G), 이소류신(I), 또는 발린(V)이고,
    X91은 트레오닌(T), 또는 발린(V)이고,
    X92는 페닐알라닌(F), 이소류신(I), 또는 티로신(Y)이고,
    X94는 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)이고,
    X96은 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)임;
    Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
    Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
    -는 X'와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
    상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X' 한 분자가 공유결합으로 연결되어 있는 지속형 결합체.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 일반식 1에서,
    X43은 리신(K)이고,
    X45는 티로신(Y)이고,
    X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
    X68은 글루탐산(E)이고,
    X74는 글루타민(Q)이고,
    X80은 페닐알라닌(F), 또는 류신(L)이고,
    X85는 류신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
    X86은 이소류신(I), 또는 발린(V)이고,
    X92는 페닐알라닌(F), 또는 이소류신(I)임.
  24. 제22항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함하는 것인 인터루킨 2 아날로그.
  25. 하기 화학식 4로 표시되는 인터루킨 2 아날로그의 지속형 결합체:
    [화학식 4]
    X'' - Z - Fc
    이 때 X''는 하기 일반식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이고,
    [일반식 2]
    X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 2, 서열번호 213)
    X1은 결실이고,
    X18은 류신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
    X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
    X38은 알라닌(A), 또는 아르기닌(R)이고,
    X42는 페닐알라닌(F), 또는 리신(K) 이고,
    X61은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X81은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X85는 류신(L), 또는 발린(V)이고,
    X86은 이소류신(I), 또는 발린(V)임;
    Z는 폴리에틸렌글리콜 링커로서 분자량 2 kDa 내지 30 kDa의 링커이며;
    Fc는 이량체 형태의 면역글로불린 Fc 영역이고;
    -는 X''와 Z 사이, Z와 Fc 사이의 공유결합 연결을 나타내며,
    상기 지속형 결합체는 상기 이량체 형태의 Fc 영역 중 한 폴리펩타이드 사슬에만 Z의 일 말단이 공유결합으로 연결되어 있고, 이 Z의 반대쪽 말단에 X'' 한 분자가 공유결합으로 연결되어 있는 지속형 결합체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인 인터루킨 2 아날로그.
  27. 약학적 유효량의 제1항 또는 제17항의 지속형 결합체와 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106로 이루어진 군에서 선택된 것인 약학 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 암은 전이성 신세포암, 전이성 흑색종, 대장암, 간암, 난소암, 췌장암, 담낭암, 신장암, 대장암, 폐암, 피부암, 흑색종, 유방암, 방광암, 및 위암으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 약학 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 약학 조성물은 하기 특성 중 하나 이상의 특성을 나타내는 것인, 약학 조성물:
    (i) 알데스루킨에 비해 높은 혈중 노출도;
    (ii) 알데스루킨에 비해 높은 종양 생장 억제 활성, 및
    (iii) 알데스루킨에 비해 높은 기억 T 세포 생성 반응.
  31. 제27항에 있어서, 상기 약학 조성물은 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피 내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 또는 직장 내 투여 경로로 투여되는 것인 약학 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 상기 약학 조성물은 1주 내지 1개월 범위의 시간 간격으로 투여되는 것인 약학 조성물.
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