WO2021201615A1 - 신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 - Google Patents

신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그 Download PDF

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WO2021201615A1
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interleukin
amino acids
analog
amino acid
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오의림
김상윤
허용호
김진영
박초롱
박준섭
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한미약품 주식회사
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
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Definitions

  • the present invention relates to novel interleukin 2 analogs.
  • Interleukin 2 is an important immune stimulant with a molecular weight of about 15 kDa composed of a total of 133 amino acid residues, and activates various cells of the immune system, including T cells and B cells.
  • the high efficacy of interleukin 2 as an immune stimulant can be used to treat various immune-related diseases, including cancer and AIDS (Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2017-0070091).
  • Interleukin 2 (trade name: Proleukin) is an FDA-approved drug for the treatment of metastatic renal cell carcinoma and metastatic melanoma.
  • Interleukin 2 related toxicities include severe fever, nausea, vomiting, vascular leak, severe hypotension, pulmonary edema, and Vascular leak syndrome causing liver damage.
  • the interleukin 2 receptor has three subunit receptors. Its subunits are composed of an alpha chain (IL-2R ⁇ , CD25), a beta chain (IL-2R ⁇ or CD122) and a gamma chain (IL-2R ⁇ or CD132), function can be performed.
  • the single interleukin 2 alpha receptor is called the low affinity interleukin 2 receptor and is not involved in signaling.
  • a complex of interleukin 2 beta and gamma receptors binds interleukin 2 with medium affinity.
  • a complex of interleukin 2 alpha, beta and gamma receptors binds interleukin 2 with high affinity.
  • interleukin 2 beta and gamma receptors The complex of interleukin 2 beta and gamma receptors is required for effective signal transduction through kinase activation of multiple signaling pathways.
  • interleukin 2 beta and gamma-coupled receptors are prominent in CD8+ cells and natural killer (NK) cells.
  • NK natural killer
  • a complex of high affinity interleukin 2 alpha, beta and gamma receptors is usually found in CD4 + T regulatory cells (Tregs) as well as recently activated T cells.
  • Interleukin 2 beta receptors are distributed in CD8 + T cells or natural killer cells (NK cells) and are involved in the immune response in the body. Therefore, research is being conducted to develop therapeutic agents by increasing the activity of beta receptors for immune activation.
  • One object of the present invention is to provide an Interleukin 2 analog.
  • Another object of the present invention is an isolated nucleic acid encoding the interleukin 2 analog; a recombinant expression vector comprising the nucleic acid; And to provide a transformant comprising the vector.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the interleukin 2 analog.
  • Another object of the present invention is to provide a method for increasing interleukin 2 beta receptor binding force, comprising the step of mutating one or more amino acids in native interleukin 2 .
  • the interleukin 2 analog is an interleukin 2 analog with increased interleukin 2 beta receptor binding ability compared to native interleukin 2 or aldesleukin, which is an interleukin 2 analog. It may include a sequence.
  • the interleukin 2 analog is 1, 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 91, 92, 94, 95, 96, 125, 126, and characterized in that one or more of the amino acids corresponding to positions 133 include a mutated sequence.
  • the interleukin 2 analog according to any one of the above embodiments is characterized in that the interleukin 2 alpha receptor binding force is changed and the interleukin 2 beta receptor binding force is increased compared to the native interleukin 2 or aldesleukin.
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that one or more amino acids are added to the amino acid corresponding to position 133.
  • the interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it includes a sequence in which amino acid 1 among native interleukin 2 is removed and amino acid 125 is substituted with another amino acid.
  • the interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it further comprises 1 to 10 amino acid substitutions.
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is 18 times, 19 times, 20 times, 22 times, 38 times, 42 times, 43 times, 45 times, 61 times, 68 times, 69 times, 74 times, 80 times. , characterized in that one or more amino acids of the amino acids corresponding to positions 81, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, and 96 are further substituted with another amino acid do it with
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is 18, 19, 22, 38, 42, 43, 45, 61, 68, 74, 80, It is characterized in that one or more amino acids of the amino acids corresponding to positions 81, 84, 85, 86, 88, 91, 92, 94, and 96 are further substituted with another amino acid.
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it is any one of the following analogs:
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it comprises any one or more selected from the group consisting of the following amino acid substitutions:
  • amino acid 12 is replaced with valine or phenylalanine
  • amino acid 18 is substituted with arginine
  • amino acid 20 is replaced with valine or phenylalanine
  • amino acid 22 is substituted with glutamic acid
  • amino acid 32 is substituted with cysteine
  • amino acid 35 is replaced with cysteine or glutamic acid
  • amino acid 38 is substituted with alanine or aspartic acid
  • amino acid 42 is substituted with lysine, alanine, or tryptophan
  • amino acid 43 is replaced with cysteine, glutamic acid, or glutamine
  • amino acid 45 is substituted with alanine
  • amino acid 48 is substituted with cysteine
  • amino acid 49 is substituted with cysteine
  • amino acid 61 is substituted with glutamine
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it is selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • Another aspect for implementing the present invention is an isolated nucleic acid encoding the interleukin 2 analog; a recombinant expression vector comprising the nucleic acid; It is a transformant comprising the vector.
  • Another aspect for implementing the present invention is a method for producing the interleukin 2 analog.
  • Another aspect for implementing the present invention is a method of increasing interleukin 2 beta receptor binding ability, comprising mutating one or more amino acids in native interleukin 2, wherein the mutation is 1, 12 in native interleukin 2 , 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76 , 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92, 94, 95, 96, 125, 126 and One or more amino acids selected from the group consisting of amino acids corresponding to position 133 may be mutated.
  • Another aspect for implementing the present invention is an interleukin 2 analog comprising any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • Another aspect for implementing the present invention is an interleukin 2 analog comprising an amino acid sequence represented by the following general formula 1:
  • X1 is a deletion
  • X18 is leucine (L), or arginine (R),
  • X19 is leucine (L) or tyrosine (Y),
  • X22 is glutamic acid (E), or glutamine (Q),
  • X38 is alanine (A), aspartic acid (D), or arginine (R);
  • X42 is alanine (A), phenylalanine (F), lysine (K), or tryptophan (W);
  • X43 is glutamic acid (E), lysine (K), or glutamine (Q),
  • X45 is alanine (A), or tyrosine (Y),
  • X61 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), glutamine (Q), or arginine (R);
  • X68 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X74 is histidine (H) or glutamine (Q),
  • X80 is phenylalanine (F), leucine (L), valine (V), or tyrosine (Y);
  • X81 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), or arginine (R);
  • X84 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X85 is alanine (A), glutamic acid (E), glycine (G), leucine (L), valine (V), tryptophan (W), or tyrosine (Y);
  • X86 is alanine (A), glycine (G), isoleucine (I), or valine (V);
  • X91 is threonine (T), or valine (V),
  • X92 is phenylalanine (F), isoleucine (I), or tyrosine (Y);
  • X94 is phenylalanine (F), or leucine (L),
  • X96 is phenylalanine (F), or leucine (L).
  • the interleukin 2 analog is SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60 , 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, and 106 of It is characterized in that it comprises any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences.
  • X43 is lysine (K)
  • X45 is tyrosine (Y)
  • X61 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), or glutamine (Q);
  • X68 is glutamic acid (E)
  • X74 is glutamine (Q)
  • X80 is phenylalanine (F), or leucine (L),
  • X85 is leucine (L), valine (V), or tyrosine (Y);
  • X86 is isoleucine (I), or valine (V);
  • X92 is phenylalanine (F) or isoleucine (I).
  • Interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is SEQ ID NO: 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, It is characterized in that it comprises any one sequence selected from the group consisting of 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, and 105 amino acid sequences.
  • interleukin 2 analog according to any one of the preceding embodiments is characterized in that it further comprises one or more amino acids at the C-terminus.
  • Another aspect for implementing the present invention is an interleukin 2 analog comprising an amino acid sequence represented by the following general formula 2:
  • X1 is a deletion
  • X18 is leucine (L), or arginine (R),
  • X22 is glutamic acid (E), or glutamine (Q),
  • X38 is alanine (A), or arginine (R),
  • X42 is phenylalanine (F) or lysine (K),
  • X61 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X68 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X81 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X85 is leucine (L) or valine (V),
  • X86 is isoleucine (I), or valine (V).
  • the interleukin 2 analog is characterized in that it comprises any one sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 42, 53, 87, 105 and 106.
  • the interleukin 2 analog is characterized in that one or more amino acids are further included at the C-terminus.
  • the interleukin 2 analog according to the present invention is an analog with increased interleukin 2 beta receptor binding ability in vivo, and can be used for various purposes.
  • A is interleukin 2 analog #86
  • B is interleukin 2 analog #104
  • C is interleukin 2 analog #105.
  • interleukin 2 is a result confirming the binding affinity of the interleukin 2 analog to the interleukin 2 beta receptor.
  • A is interleukin 2 analog #86
  • B is interleukin 2 analog #104
  • C is interleukin 2 analog #105.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is characterized in that the binding ability to the interleukin 2 receptor is altered, in particular, the interleukin 2 beta receptor binding ability is increased.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor compared to the native interleukin 2 or known aldesleukin, and more specifically, a change in binding affinity to the interleukin 2 alpha receptor ( increased or decreased).
  • Interleukin 2 refers to a type of cytokine that performs signal transduction in an in vivo immune system and refers to an immune modulator. Interleukin 2 is generally known as an important immune stimulator of about 15 kDa.
  • the term “interleukin 2 analog” means that one or more amino acids are mutated in the native sequence, and in particular, in the present invention, the amino acid of native interleukin 2 that has reduced or increased binding affinity to the interleukin 2 receptor compared to the native sequence. This may be a mutated interleukin 2 analog. Specifically, the interleukin 2 analog of the present invention may be non-naturally occurring.
  • the native interleukin 2 may be human interleukin 2, and its sequence may be obtained from a known database or the like. Specifically, it may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • native interleukin 2 may be the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • mutation of one or more amino acids in the native sequence means substitution, addition, deletion, modification, and combinations thereof to at least one amino acid in native interleukin 2 A variant selected from the group may have occurred.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is 1, 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45 in natural interleukin 2 , 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91
  • At least one of the amino acids corresponding to positions 92, 94, 95, 96, 125, 126 and 133 may include a mutated sequence.
  • amino acid 1 is removed from natural interleukin 2
  • amino acid 125 is substituted with another amino acid
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10 or more amino acid substitutions may be included.
  • cysteine at amino acid 125 may be substituted with serine, and the amino acids to which additional substitution occurs are 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87 , may be an amino acid corresponding to positions 88, 89, 91, 92, 94, 95, 96, 126, and 133, but is not limited thereto.
  • interleukin 2 analogs including substitution, addition, deletion, modification, etc. of amino acid residues to a degree that can be performed for increasing the stability and half-life of the peptide, known in the art in addition to the above mutation positions, are also included in the scope of the present invention. .
  • aldesleukin or “interleukin 2 analog (aldesleukin)” refers to a commercially available interleukin 2 analog, aldesleukin (trade name: Proleukin®), and specifically, SEQ ID NO: 2 It may have an amino acid sequence. In the present invention, it is used interchangeably with “Interleukin 2 Analog 1”.
  • the interleukin analog according to the present invention may have a changed interleukin 2 alpha receptor binding affinity and/or an increased interleukin 2 beta receptor binding affinity compared to the interleukin 2 analog 1 above.
  • Interleukin 2 alpha receptor is known not to be involved in the signaling system of interleukin 2, but it increases the binding force of interleukin 2 with other interleukin 2 receptors (beta or gamma) 10 to 100 times, and is expressed on CD4 + regulatory T cells, etc. have.
  • Interleukin 2 beta receptor is mainly distributed in CD8 + T cells or natural killer cells (NK cells) and plays a major function in activating immune response and macrophage function. Reaction activation can be expected.
  • the interleukin 2 analog of the present invention having an increased binding affinity to the interleukin 2 beta receptor may have a therapeutic effect such as tumor suppression and death, and a reduced side effect.
  • the interleukin 2 analog may include a sequence in which amino acid 1 is removed among natural interleukin 2 and amino acid 125 is substituted with another amino acid, and may further include 1 to 10 amino acid mutations. have.
  • amino acid 125 is substituted with serine, 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49 No.
  • the interleukin 2 analog may be one in which one or more amino acids are added to the amino acid corresponding to position 133, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 alpha receptor binding force is changed and the interleukin 2 beta receptor binding force is increased compared to the native interleukin 2 or aldesleukin, there is no limitation in the type or length of the added amino acid.
  • non-natural amino acids and amino acids containing chemical modifications may also be added.
  • amino acid 1 of natural interleukin 2 is removed, amino acid 125 is substituted with another amino acid, and amino acids 18, 19, 20, 22, 38, and 42 are substituted.
  • 43, 45, 61, 68, 69, 74, 80, 81, 84, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, and 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or more amino acids among amino acids 96 may be substituted with other amino acids, but is not limited thereto.
  • amino acid 1 of natural interleukin 2 is removed, amino acid 125 is substituted with another amino acid, and amino acids 18, 19, 22, 38, 42, 43 1, 2 of amino acids 45, 61, 68, 74, 80, 81, 84, 85, 86, 88, 91, 92, 94, and 96 Dog, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or more amino acids may be additionally substituted with other amino acids, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog may be any one selected from the group consisting of the following analogs:
  • amino acid substitution included in the interleukin 2 analog may be any one or more selected from the group consisting of the following amino acid substitutions:
  • amino acid 12 is replaced with valine or phenylalanine
  • amino acid 18 is substituted with arginine
  • amino acid 20 is replaced with valine or phenylalanine
  • amino acid 22 is substituted with glutamic acid
  • amino acid 32 is substituted with cysteine
  • amino acid 35 is replaced with cysteine or glutamic acid
  • amino acid 38 is substituted with alanine or aspartic acid
  • amino acid 42 is substituted with lysine, alanine, or tryptophan
  • amino acid 43 is replaced with cysteine, glutamic acid, or glutamine
  • amino acid 45 is substituted with alanine
  • amino acid 48 is substituted with cysteine
  • amino acid 49 is substituted with cysteine
  • amino acid 61 is substituted with glutamine
  • corresponding to (corresponding to) refers to an amino acid residue at a position listed in a peptide, or an amino acid residue similar to, identical to, or homologous to a residue listed in a peptide. Identifying the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid of a sequence that refers to the specific sequence.
  • any amino acid sequence is aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 1. .
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needle program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277), etc., but is not limited thereto, and a sequence alignment program, pairwise sequence comparison algorithm, etc. known in the art may be appropriately used.
  • the interleukin 2 analog may include, consist essentially of, or consist of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 3 to 106, but is not limited thereto.
  • Interleukin 2 analog of the present invention has an amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 106 and 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% It may include an amino acid sequence having more homology or identity, but is not limited thereto.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to the degree to which two given amino acid sequences or nucleotide sequences are related to each other and may be expressed as a percentage.
  • Sequence homology or identity of a conserved polynucleotide or polypeptide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of a sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with a polynucleotide containing a common codon in a polynucleotide or a codon in consideration of codon degeneracy.
  • GAP program is defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • the term "homology” or "identity” refers to a relevance between sequences.
  • the interleukin 2 analog of the present invention can be used as a new substitute for interleukin 2 that changes in vitro activity by weakening or increasing the binding ability of interleukin 2 to alpha and/or beta receptors.
  • it can be used as an effective therapeutic agent not only to increase the binding force to the beta receptor, but also to change (increase or decrease) the binding force to the alpha receptor due to the activity to both receptors.
  • modifications for the production of an analog of interleukin 2 include modifications using L-form or D-form amino acids, and/or non-natural amino acids; and/or modifying the native sequence by modifying, for example, modification of side chain functional groups, intramolecular covalent bonds, such as inter-side chain ring formation, methylation, acylation, ubiquitination, phosphorylation, aminohexylation, biotinylation, etc. includes all that
  • amino acids to be substituted or added may be atypical or non-naturally occurring amino acids as well as the 20 amino acids commonly found in human proteins.
  • Commercial sources of atypical amino acids include Sigma-Aldrich, ChemPep and Genzyme Pharmaceuticals. Peptides containing these amino acids and canonical peptide sequences can be synthesized and purchased from commercial peptide synthesis companies, for example, American peptide company or Bachem in the United States, or Anygen in Korea.
  • Amino acid derivatives can also be obtained in the same way, and to name just a few examples, 4-imidazoacetic acid and the like can be used.
  • N-terminus and/or C-terminus are chemically modified or protected with an organic group, or at the end of a peptide, etc. It may be in a modified form by adding amino acids.
  • the N-terminus is acetylated and/or the C-terminus is amidated to remove these charges.
  • it is not particularly limited thereto.
  • the interleukin 2 analog according to the present invention is in the form of a peptide, and includes all forms of the peptide itself, a salt thereof (eg, a pharmaceutically acceptable salt of the peptide), or a solvate thereof.
  • the peptide may be in any pharmaceutically acceptable form.
  • the type of the salt is not particularly limited. However, it is preferably in a form that is safe and effective for an individual, such as a mammal, but is not particularly limited thereto.
  • pharmaceutically acceptable means a material that can be effectively used for a desired purpose without causing excessive toxicity, irritation, or allergic reaction within the scope of medical judgment.
  • salts derived from pharmaceutically acceptable inorganic acids, organic acids, or bases include hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, nitric acid, perchloric acid, fumaric acid, maleic acid, phosphoric acid, glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, succinic acid, toluene-P-sulfonic acid, tartaric acid, acetic acid, citric acid, methanesulfonic acid, formic acid , benzoic acid, malonic acid, naphthalene-2-sulfonic acid, benzonesulfonic acid, and the like.
  • Salts derived from suitable bases may include alkali metals such as sodium and potassium, alkaline earth metals such as magnesium, and ammonium.
  • solvate refers to a compound in which the peptide or a salt thereof according to the present invention forms a complex with a solvent molecule.
  • the binding ability of any interleukin 2 analog to the native interleukin 2 receptor is a method of measuring the affinity for the receptor and can be measured using various known techniques.
  • SPR surface plasma resonance
  • the interleukin 2 analog of the present invention may have reduced or increased interleukin 2 alpha receptor binding ability compared to native interleukin 2 or aldesleukin.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is about 0.001 fold or more, about 0.005 fold or more, about 0.01 fold or more, about 0.05 fold or more, about 0.1 fold compared to the interleukin 2 alpha receptor binding force of native interleukin 2 or aldesleukin. or more, about 0.3 times or more, about 0.5 times or more, about 0.7 times or more, about 0.9 times or more, about 1.1 times or more, about 1.3 times or more, about 1.5 times or more, about 1.7 times or more.
  • the numerical value is not limited and if the binding force is changed compared to native interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog of the present invention loses binding ability at all, or about 1% or more, about 5% or more, about 7% or more, about 10% More than, about 15% or more, about 20% or more, about 30% or more, about 50% or more, about 70% or more, about 90% or more, about 100% or more, about 150% or more, about 200% or more.
  • the numerical value is not limited and if the binding force is changed compared to the native interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is about 0.1 times or more, about 0.3 times or more, about 0.5 times or more, about 0.7 times or more, about 1.0 times or more, about 10 times or more, about 20 times or more, about 30 times or more, about 40 times or more, about 50 times or more, about 60 times or more, about 70 times or more, about 80 times or more, about 90 times or more, about It may have 100-fold or more interleukin 2 beta receptor binding force, but the numerical value is not limited and if the binding force is changed or increased compared to native interleukin 2 or aldesleukin, it falls within the scope of the present invention.
  • the interleukin 2 analog of the present invention is about 5% or more, about 9% or more, about 10% or more, about 20% or more, about 30% or more , about 50% or more, about 100% or more, about 200% or more, about 500% or more, about 700% or more, about 1000% or more, about 1500% or more, about 3000% or more, about 5000% or more, about 7000% or more , about 10000% or more, about 12000% or more, about 15000% or more, about 20000% or more, may have a binding force of about 25000% or more, but the numerical value is not limited and if the binding force is increased compared to aldesleukin, the present invention belongs to the category of
  • the term "about” includes all ranges including ⁇ 0.5, ⁇ 0.4, ⁇ 0.3, ⁇ 0.2, ⁇ 0.1, etc., and includes all values in a range equal to or similar to the value following the term about, but not limited
  • the interleukin 2 analog of the present invention is characterized in that the binding ability to the interleukin 2 alpha receptor is changed and the binding ability to the interleukin 2 beta receptor is increased compared to the native interleukin 2 or aldesleukin.
  • an interleukin 2 analog in which a mutation is introduced based on native interleukin 2 (SEQ ID NO: 1) was prepared.
  • the interleukin 2 analog prepared in the present invention may include the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 106, or may be encoded by the base sequence of any one of SEQ ID NOs: 108 to 211.
  • nucleic acid polynucleotide
  • a recombinant expression vector comprising the nucleic acid
  • a transformant comprising the nucleic acid or the recombinant expression vector
  • the nucleic acid encoding the interleukin 2 analog of the present invention has been modified to introduce a mutation (amino acid deletion, substitution, and/or addition) to an amino acid at a specific position in the nucleotide sequence encoding the native interleukin 2 of SEQ ID NO: 1 and, specifically, may include a nucleotide sequence encoding an amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • the nucleic acid of the present invention may have or include the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 108 to 211.
  • the nucleotide sequence of the present invention is a coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the interleukin 2 analog of the present invention in consideration of codon degeneracy or preferred codons in an organism to express the nucleic acid of the present invention.
  • the nucleic acid of the present invention has 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% homology or identity to any one of SEQ ID NOs: 108 to 211 It has or contains a nucleotide sequence that is greater than or equal to 97%, greater than or equal to 98%, and less than 100%, or has 70% or greater, 75% or greater, or 80% homology or identity to any one of the sequences of SEQ ID NOs: 108 to 211 % or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of the base sequence, but may consist essentially of, but is not limited thereto.
  • nucleic acid of the present invention can be included without limitation as long as it can hybridize under stringent conditions with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence complementary to all or part of the nucleic acid sequence of the present invention. have.
  • stringent condition refers to a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the nucleic acids of the invention may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the overall sequence.
  • the appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, and the parameters are well known in the art (eg, J. Sambrook et al., supra).
  • the recombinant vector according to the present invention can be typically constructed as a vector for cloning or as a vector for expression, and can be constructed as a vector for using a prokaryotic or eukaryotic cell as a host cell.
  • vector is a recombinant vector capable of expressing a target protein in a suitable host cell, and refers to a nucleic acid construct including essential regulatory elements operably linked to express a nucleic acid insert.
  • the present invention can prepare a recombinant vector containing a nucleic acid encoding an interleukin 2 analog. By transforming or transfecting the recombinant vector into a host cell, the interleukin 2 analog of the present invention can be obtained.
  • transformation refers to introducing DNA into a host cell so that DNA can be replicated as a factor of chromosomes or by chromosomal integration completion. It refers to a phenomenon that causes change.
  • a suitable host for the present invention is not particularly limited as long as it allows expression of the nucleic acid of the present invention.
  • the host that can be used in the present invention include Escherichia bacteria such as E. coli; Bacillus subtilis ( Bacillus subtilis ), such as Bacillus ( Bacillus ) genus bacteria; Pseudomonas putida ( Pseudomonas putida ), such as Pseudomonas ( Pseudomonas ) genus bacteria; Yeasts such as Pichia pastoris , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe; insect cells such as Spodoptera frugiperda (Sf9); and animal cells such as CHO, COS, and BSC.
  • Escherichia bacteria such as E. coli
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Pseudomonas putida Pseudomonas
  • Another aspect for implementing the present invention provides a method for producing an interleukin 2 analog comprising one or more amino acid mutations.
  • the method includes 1, 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92 , 94, 95, 96, 125, 126, and may include the step of introducing a mutation in one or more amino acids selected from the group consisting of amino acids corresponding to positions 133.
  • Interleukin 2 analogs, and mutations are as described above.
  • the method for producing an interleukin 2 analog comprises: a) culturing a transformant comprising a nucleic acid encoding the interleukin 2 analog to express the interleukin 2 analog; and b) isolating and purifying the expressed interleukin 2 analog, but is not limited to a specific method as long as the interleukin 2 analog can be prepared and may be a method known in the art.
  • the nucleic acid encoding the interleukin 2 analog may include or (essentially) a nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 108 to 211, but is not limited thereto.
  • the medium used for culturing the transformant in the present invention must meet the requirements for culturing the host cell in an appropriate manner.
  • Carbon sources that can be included in the medium for growth of host cells may be appropriately selected by the judgment of those skilled in the art according to the type of transformant prepared, and appropriate culture conditions may be adopted to control the culture period and amount. .
  • Sugar sources that can be used include sugars and carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, maltose, starch, cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, stearic acid, fatty acids such as linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid. These substances can be used individually or as a mixture.
  • Nitrogen sources that can be used include peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soybean wheat and urea or inorganic compounds such as ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate.
  • the nitrogen sources may also be used individually or as a mixture.
  • the phosphorus that may be used includes potassium dihydrogen phosphate or dipotassium hydrogen phosphate or the corresponding sodium-containing salt.
  • the culture medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate necessary for growth.
  • essential growth substances such as amino acids and vitamins can be used.
  • precursors suitable for the culture medium may be used.
  • the above-mentioned raw materials may be added batchwise or continuously during the culture in a manner appropriate to the culture.
  • a basic compound such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, or an acid compound such as phosphoric acid or sulfuric acid may be used in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester may be used to inhibit the formation of bubbles.
  • Oxygen or oxygen-containing gas eg air is injected into the culture to maintain aerobic conditions.
  • Culturing of the transformant according to the present invention is usually carried out at a temperature of 20 °C to 45 °C, specifically 25 °C to 40 °C.
  • the culture is continued until the desired amount of interleukin 2 analog production is maximized, and for this purpose, the culture can usually be continued for 10 to 160 hours.
  • the transformant according to the present invention produces an interleukin 2 analog, and the interleukin 2 analog produced according to the vector construction and the characteristics of the host cell is transformed into the cytoplasm of the host cell. It can be secreted intracellularly, into the periplasmic space, or extracellularly.
  • Proteins expressed in or outside the host cell can be purified in a conventional manner.
  • purification methods include salting out (eg, ammonium sulfate precipitation, sodium phosphate precipitation, etc.), solvent precipitation (eg, protein fraction precipitation using acetone, ethanol, etc.), dialysis, gel filtration, ion exchange, reverse phase column chromatography, etc. Techniques such as chromatography and ultrafiltration may be applied alone or in combination.
  • the method for producing an interleukin 2 analog comprises:
  • Another aspect for implementing the present invention provides a method for producing the interleukin 2 analog by a peptide synthesis method.
  • Such peptide synthesis can be prepared without limitation by using a known peptide synthesis method since the interleukin 2 analog sequence of the present invention is provided.
  • Interleukin 2 analogs, and mutations are as described above.
  • Another aspect for implementing the present invention is a method of increasing interleukin 2 beta receptor binding force, comprising the step of mutating one or more amino acids in native interleukin 2.
  • the method of increasing the interleukin 2 beta receptor binding ability according to the present invention may be to increase the binding affinity to the interleukin 2 beta receptor as compared to the native interleukin 2 or aldesleukin, as well as to change the binding ability to the interleukin 2 alpha receptor. have.
  • the method includes 1, 12, 18, 19, 20, 22, 32, 35, 38, 42, 43, 45, 48, 49, 61, 68, 69, 74, 76, 80, 81, 82, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 92 , 94, 95, 96, 125, 126, and one or more amino acids corresponding to positions 133 may include the step of introducing a mutation in one or more amino acids.
  • the method comprises: (a) removing amino acid 1 from natural interleukin 2 and substituting amino acids 125 and 32 with other amino acids; (b) removing amino acid 1 from natural interleukin 2 and substituting amino acids 125 and 35 with other amino acids; (c) removing amino acid 1 and substituting other amino acids for amino acids 125 and 38 in native interleukin 2; (d) removing amino acid 1 and substituting amino acids 125 and 42 with other amino acids in native interleukin 2; (e) removing amino acid 1 from natural interleukin 2 and replacing amino acids 125 and 43 with other amino acids; (f) removing amino acid 1 and substituting amino acids 125 and 48 with other amino acids in native interleukin 2; (g) removing amino acid 1 and substituting other amino acids for amino acids 125 and 49 in native interleukin 2; (h) removing amino acid 1 and substituting amino acids 125 and 76 with other amino acids in native interleukin 2; (i) amino acid 1 of natural interleukin 2 is removed and
  • Interleukin 2 analogs, and mutations are as described above.
  • Another aspect for implementing the present invention provides an interleukin 2 analog comprising any one sequence selected from the group consisting of amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 to 106.
  • Interleukin 2 analogs, mutations, and definitions of analogs represented by SEQ ID NOs are the same as described above.
  • the interleukin 2 analog may include, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 3 to 106, but is not limited thereto.
  • Another aspect for implementing the present invention provides an interleukin 2 analog comprising an amino acid sequence represented by the following general formula 1:
  • X1 is a deletion
  • X18 is leucine (L), or arginine (R),
  • X19 is leucine (L) or tyrosine (Y),
  • X22 is glutamic acid (E), or glutamine (Q),
  • X38 is alanine (A), aspartic acid (D), or arginine (R);
  • X42 is alanine (A), phenylalanine (F), lysine (K), or tryptophan (W);
  • X43 is glutamic acid (E), lysine (K), or glutamine (Q),
  • X45 is alanine (A), or tyrosine (Y),
  • X61 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), glutamine (Q), or arginine (R);
  • X68 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X74 is histidine (H) or glutamine (Q),
  • X80 is phenylalanine (F), leucine (L), valine (V), or tyrosine (Y);
  • X81 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), or arginine (R);
  • X84 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X85 is alanine (A), glutamic acid (E), glycine (G), leucine (L), valine (V), tryptophan (W), or tyrosine (Y);
  • X86 is alanine (A), glycine (G), isoleucine (I), or valine (V);
  • X91 is threonine (T), or valine (V),
  • X92 is phenylalanine (F), isoleucine (I), or tyrosine (Y);
  • X94 is phenylalanine (F), or leucine (L),
  • X96 is phenylalanine (F), or leucine (L).
  • one or more amino acids may be added to threonine (T) corresponding to X133 in Formula 1, but is not limited thereto.
  • the interleukin 2 analog is SEQ ID NO: 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, with the amino acid sequence of 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, and 106 It may include, consist essentially of, or consist of any one sequence selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • Such an interleukin 2 analog may have an increased beta receptor binding ability compared to aldesleukin or native interleukin 2, but is not limited thereto.
  • interleukin 2 analog of the present invention is in the general formula 1,
  • X43 is lysine (K)
  • X45 is tyrosine (Y)
  • X61 is aspartic acid (D), glutamic acid (E), or glutamine (Q);
  • X68 is glutamic acid (E)
  • X74 is glutamine (Q)
  • X80 is phenylalanine (F), or leucine (L),
  • X85 is leucine (L), valine (V), or tyrosine (Y);
  • X86 is isoleucine (I), or valine (V);
  • X92 may have, but is not limited to, phenylalanine (F), or isoleucine (I).
  • the interleukin 2 analog is SEQ ID NO: 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, It is characterized in that it comprises any one sequence selected from the group consisting of 98, 99, 100, 101, 103, 104, and 105 amino acid sequences.
  • the interleukin 2 analog of the present invention may further include one or more amino acids at the C-terminus, but is not limited thereto.
  • Another aspect for implementing the present invention provides an interleukin 2 analog comprising an amino acid sequence represented by the following general formula 2:
  • X1 is a deletion
  • X18 is leucine (L), or arginine (R),
  • X22 is glutamic acid (E), or glutamine (Q),
  • X38 is alanine (A), or arginine (R),
  • X42 is phenylalanine (F) or lysine (K),
  • X61 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X68 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X81 is aspartic acid (D) or glutamic acid (E),
  • X85 is leucine (L) or valine (V),
  • X86 is isoleucine (I), or valine (V).
  • the interleukin 2 analog may include any one sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 22, 42, 53, 87, 105 and 106, but is not limited thereto.
  • one or more amino acids may be added to threonine (T) corresponding to X133 in Formula 2, or one or more amino acids may be additionally included at the C-terminus of the interleukin 2 analog, but is not limited thereto.
  • Example 1 Construction of native interleukin 2 and interleukin 2 analog expression vectors
  • interleukin 2 synthesized based on the reported interleukin 2 sequence (NM_000586.3; SEQ ID NO: 1) was cloned into a pET-22b vector (Novagen).
  • a novel interleukin 2 analog in which the amino acid of interleukin 2 was modified was prepared.
  • PCR conditions for interleukin 2 analog amplification were repeated 16 times at 95°C for 30 seconds, 55°C for 60 seconds, and 65°C for 6.5 minutes. Sequence analysis was performed on the mutagenesis product obtained under the above conditions to determine whether the amino acid at the desired site was normally changed. Confirmed.
  • the expression vectors thus obtained were named pET22b-interleukin 2 analogs 1 to 105.
  • Table 1 below shows the change sequence and analog name of each amino acid.
  • analog 1 is aldesleukin
  • primers #1 to #204 correspond to SEQ ID NOs: 214 to 417 of the specification, respectively.
  • desA1 means that alanine, the first amino acid of interleukin 2, is deleted.
  • Table 2 below shows the full-length protein sequence of the interleukin 2 analog.
  • Bold text in Table 2 below indicates the position of the mutation.
  • each recombinant interleukin 2 analog expression vector was transformed into an expression E. coli strain, E. coli BL21DE3 ( E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal ⁇ (DE3); Novagen).
  • E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal ⁇ (DE3); Novagen As the transformation method, a method recommended by Novagen was used.
  • Each single colony transformed with each recombinant expression vector was taken, inoculated in 2X Luria Broth medium containing ampicillin (50 ⁇ g/ml), and cultured at 37° C. for 15 hours.
  • the recombinant strain culture medium and 2X LB medium containing 30% glycerol were mixed at a ratio of 1:1 (v/v), each 1 mL each was dispensed in a cryo-tube, and stored at -150°C. This was used as a cell stock for the production of recombinant protein.
  • each cell stock 1 vial was dissolved, inoculated into 500 ml of 2X LB, and incubated with shaking at 37° C. for 14 to 16 hours.
  • the absorbance value at 600 nm showed 4.0 or more
  • the culture was terminated, and this was used as a seed culture medium.
  • a 5 L fermenter Bioflo-320, NBS, USA
  • the seed culture was inoculated into 1.6 L of fermentation medium and initial fermentation was started.
  • the culture conditions were maintained at a pH of 6.70 using a temperature of 37°C, an air volume of 2.0 L/min (1vvm), a stirring speed of 650 rpm, and 30% aqueous ammonia.
  • fed-batch culture was performed by adding an additional medium (feeding solution).
  • the growth of the strain was observed by absorbance, and IPTG at a final concentration of 500 ⁇ M was introduced at an absorbance value of 70 or higher.
  • the culture was further carried out for about 23 to 25 hours after the introduction of IPTG, and after completion of the culture, the recombinant strain was harvested using a centrifuge and stored at -80°C until use.
  • Cells were disrupted and refolded in order to convert the interleukin 2 analogue into a soluble form from E. coli expressing the interleukin 2 analogue obtained in Example 2.
  • Cell pellet corresponding to 100 mL of culture medium was suspended in 1 - 200 mL of lysis buffer solution (20 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM EDTA pH 9.0, 0.2 M NaCl, 0.5% Triton X-100), Recombinant E. coli was disrupted at 15,000 psi using a microfludizer.
  • the supernatant was discarded by centrifugation at 13,900 g for 30 min, and the pellet was washed with 400 mL of first wash buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH9.0). The supernatant was discarded by centrifugation under the same conditions as above, and the pellet was washed with 400 mL of a second wash buffer solution (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100).
  • first wash buffer 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH9.0
  • a second wash buffer solution 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100.
  • the washed inclusion body pellet was resuspended in 400 mL of solubilization/reduction buffer (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT) and stirred at 50°C for 30 minutes. After diluting 6 M guanidine with 4.8 M guanidine by adding 100 mL of distilled water to the soluble/reduced interleukin 2 analog, centrifugation was performed at 13,900 g for 30 minutes to discard the pellet and obtain only a solution. After adding 185.7 mL of distilled water to the diluted solution, 4.8 M Guanidine was diluted with 3.5 M Guanidine, and the pH was adjusted to 5.0 using 100% acetic acid.
  • solubilization/reduction buffer 6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT
  • the pH-adjusted solution was stirred at room temperature for 1 hour.
  • the impurity precipitated solution was centrifuged at 13,900 g for 30 minutes, the supernatant was discarded, and the pellet was washed with a final wash buffer solution (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT).
  • a pellet was obtained by centrifugation under the same conditions as above.
  • Dissolve the washed interleukin 2 analog with 400 mL of refolding buffer solution (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl 2 ).
  • the refolding process was performed by stirring the mixed solution at 4°C for 15 - 24 hours.
  • the interleukin 2 analog refolding solution obtained in Example 3 was applied to a size exclusion column and concentrated to 1 mL or less for purification.
  • the column was equilibrated with a buffer solution (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0) before introduction of the refolding solution, and eluted by flowing the buffer solution after introduction of the refolding solution. Since the eluted sample contains guanidine, it was changed to a stabilizing solution (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose), and the purity was measured through RP-HPLC and peptide mapping analysis. If the measured purity was 80% or more, it was used for the experiment.
  • the recombinant interleukin 2 analog prepared above was diluted by concentration and flowed to a CM5 chip in which the interleukin 2 receptor was finally immobilized, and the binding force of each interleukin 2 receptor was measured.
  • the binding force consisted of measuring the association rate constant (k a ) and the dissociation rate constant (k d ).
  • the interleukin 2 analog was flowed for 3 minutes at a flow rate of 10 ⁇ L/min to measure the association rate, and the experiment was performed at the same time and flow rate. Only the buffer was flowed to measure the rate of dissociation from each interleukin 2 receptor.
  • the binding force of the receptor was evaluated according to the 1:1 binding fitting model in the Biaevaluation program.
  • K D (%) analog 01 (aldesleukin) binding force (K D ) / analog binding force (K D ) ⁇ 100
  • the interleukin 2 analogs of the present invention either lose their interleukin 2 alpha receptor binding ability, or decrease or increase compared to the interleukin 2 analog 1, such as naturally occurring interleukin 2 or alde. It was confirmed that the interleukin 2 alpha receptor binding ability different from that of sleukin was exhibited. On the other hand, for the interleukin 2 beta receptor, a binding force up to 100 times stronger than that of the native interleukin 2 or aldesleukin was confirmed. Through this, it was confirmed that the amino acid sequence of the interleukin 2 analog has an influence on the binding of the interleukin 2 alpha or beta receptor. This suggests that the binding force of the interleukin 2 receptor can be changed by substituting an amino acid at a specific position.
  • interleukin 2 analog according to the present invention has altered interleukin 2 alpha receptor binding and interleukin 2 beta receptor binding ability, and thus can be used for the development of various drugs.

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Abstract

본 발명은 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 변화 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그에 관한 것이다.

Description

신규한 면역 활성 인터루킨 2 아날로그
본 발명은 신규한 인터루킨 2 아날로그에 관한 것이다.
인터루킨 2(Interleukin 2)는 총 133개의 아미노산 잔기로 구성된 분자량 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로서, T 세포와 B 세포를 포함하는 면역 체계의 다양한 세포를 활성화시킨다. 인터루킨 2의 면역 자극제로서의 높은 효능은 암과 에이즈를 포함한 다양한 면역관련 병증을 치료하기 위해 사용할 수 있다(대한민국 공개특허 제10-2017-0070091호). 현재 인터루킨 2(상표 명 Proleukin)는 전이성 신세포암 및 전이성 흑색종의 치료용으로 FDA 승인을 받은 의약이다. 그러나 높은 복용량의 인터루킨 2 요법과 연관된 심각한 독성 때문에 적용 가능한 환자가 제한되며, 실제로 적합한 환자의 소수에 대해서만 이 치료 요법을 수행하고 있다. 인터루킨 2에 연관된 독성은 심한 열, 메스꺼움, 구토, 혈관 누출(vascular leak), 심한 저혈압, 폐 부종, 및 간 손상을 일으키는 혈관 누출 증후군(Vascular leak syndrome)을 포함한다.
인터루킨 2 수용체에는 3가지 서브유닛 수용체가 있다. 그 서브유닛은 알파 체인(IL-2Rα, CD25), 베타 체인(IL-2Rβ 또는 CD122) 및 감마 체인(IL-2Rγ 또는 CD132)으로 이루어져 있고, 인터루킨 2가 수용체 서브유닛들의 다양한 조합에 결합함으로써 여러가지 기능을 발휘 할 수 있다. 단일의 인터루킨 2 알파 수용체는 낮은 친화성 인터루킨 2 수용체로 불리며, 신호전달에는 관여하지 않는다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 중간 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 높은 친화성으로 인터루킨 2에 결합한다. 인터루킨 2 베타 및 감마 수용체의 복합체는 다중 신호전달 경로의 키나아제 활성화를 통한 효과적인 신호 변환에 필요하다. 특히 인터루킨 2 베타 및 감마 결합 수용체는 CD8+ 세포 및 자연 살해(NK) 세포에서 두드러진다. 또한 높은 친화성의 인터루킨 2 알파, 베타 및 감마 수용체의 복합체는 보통 CD4+ T 조절 세포(Treg)뿐 만 아니라 최근 활성화된 T 세포에서 발견된다. 인터루킨 2 베타 수용체는 CD8+ T 세포 혹은 자연 살해 세포(NK cell)에 분포하여 체내 면역 반응에 관여하므로, 면역 활성화를 위해 베타 수용체에 대한 활성을 높임으로써 치료제를 개발하려는 연구가 이루어지고 있다.
한편, 인터루킨 2의 다양한 면역 관련 병증의 치료제로서의 가능성에도 불구하고, 독성 및 부작용을 감소시키면서도 복용량의 감소를 시킬 수 있는 약제의 존재가 미비한 상태로, 새롭고 향상된 약제에 관한 연구가 더욱 필요하다.
본 발명의 하나의 목적은 인터루킨 2 아날로그를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 분리된 핵산; 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터; 및 상기 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 상기 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 증대시키는 법을 제공하는 것이다.
본 발명의 하나의 양태는 신규한 인터루킨 2 아날로그(interleukin 2 analog, 또는 IL-2 analog)이다. 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 인터루킨 2 아날로그인 알데스루킨(aldesleukin)에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 상기 133번 위치에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 1개 내지 10개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 18번, 19번, 20번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 69번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 18번, 19번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다:
(a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 32번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 35번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 38번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 43번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 48번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 49번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 76번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 87번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 한다:
(a) 12번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환; (b) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환; (c) 19번 아미노산 티로신, 발린, 페닐알라닌, 아르기닌으로 치환; (d) 20번 아미노산이 발린 또는 페닐알라니응로 치환; (e) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (f) 32번 아미노산이 시스테인으로 치환; (g) 35번 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산으로 치환; (h) 38번 아미노산이 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환; (i) 42번 아미노산이 라이신, 알라닌, 또는 트립토판으로 치환; (j) 43번 아미노산이 시스테인, 글루탐산, 또는 글루타민으로 치환; (k) 45번 아미노산이 알라닌으로 치환; (l) 48번 아미노산이 시스테인으로 치환; (m) 49번 아미노산이 시스테인으로 치환; (n) 61번 아미노산이 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파르트산으로 치환; (o) 68번 아미노산이 아스파르트산, 또는 글루타민으로 치환; (p) 69번 아미노산이 글리신으로 치환; (q) 74번 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌으로 치환; (r) 76번 아미노산이 시스테인으로 치환; (s) 80번 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 발린, 아스파르트산, 또는 트립토판으로 치환; (t) 81번 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 또는 아스파라긴으로 치환; (u) 82번 아미노산이 글리신, 또는 발린으로 치환; (v) 84번 아미노산이 글루탐산, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (w) 85번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 글루탐산, 또는 페닐알라닌으로 치환; (x) 86번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 또는 류신으로 치환; (y) 87번 아미노산이 시스테인으로 치환; (z) 88번 아미노산이 글루타민, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (aa) 89번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; (ab) 91번 아미노산이 트레오닌, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 치환; (ac) 92번 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 티로신, 또는 트립토판으로 치환; (ad) 95번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (ae) 96번 아미노산이 페닐알라닌, 발린, 또는 이소류신으로 치환; 및 (af) 126번 아미노산이 트레오닌으로 치환.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는, 분리된 핵산; 상기 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터; 상기 벡터를 포함하는, 형질전환체이다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법이다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 증대시키는 방법으로, 상기 변이는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산이 변이된 것일 수 있다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그이다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 하기 일반식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그이다:
[일반식 1]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 1, 서열번호 212)
상기 일반식 1에서,
X1은 결실이고,
X18은 루신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X19는 루신(L), 또는 티로신(Y)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 리신(K), 또는 트립토판(W)이고,
X43은 글루탐산(E), 리신(K), 또는 글루타민(Q)이고,
X45는 알라닌(A), 또는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아르기닌(R)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X74는 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 루신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X81은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 아르기닌(R)이고,
X84는 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 알라닌(A), 글루탐산(E), 글리신(G), 루신(L), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 또는 발린(V)이고,
X91은 트레오닌(T), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 이소루신(I), 또는 티로신(Y)이고,
X94는 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)이고,
X96은 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)임.
하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 일반식 1에서,
X43은 리신(K)이고,
X45는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X68은 글루탐산(E)이고,
X74는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)이고,
X85는 루신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 이소루신(I), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 또는 이소루신(I)인 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 하기 일반식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그이다:
[일반식 2]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T (일반식 2, 서열번호 213)
상기 일반식 2에서,
X1은 결실이고,
X18은 루신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 페닐알라닌(F), 또는 리신(K) 이고,
X61은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X81은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 루신(L), 또는 발린(V)이고,
X86은 이소루신(I), 또는 발린(V)임.
하나의 구쳬에로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
다른 하나의 구체예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 생체 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 아날로그로서, 다양한 용도로 사용될 수 있다.
도 1은 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 수용체의 결합력을 확인한 결과이다. (A)는 인터루킨 2 아날로그 #86, (B)는 인터루킨 2 아날로그 #104, (C)는 인터루킨 2 아날로그 #105이다.
도 2은 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 베타 수용체의 결합력을 확인한 결과이다. (A)는 인터루킨 2 아날로그 #86, (B)는 인터루킨 2 아날로그 #104, (C)는 인터루킨 2 아날로그 #105이다.
본 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 설명하면 다음과 같다. 한편, 본원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.
본 명세서 전반을 통하여, 아미노산에 대한 통상의 1문자 및 3문자 코드가 사용된다. 또한 본 명세서에서 약어로 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 기재하였다.
알라닌 A 아르기닌 R
아스파라긴 N 아스파르트산D
시스테인 C 글루탐산 E
글루타민 Q 글리신 G
히스티딘 H 이소루신 I
루신 L 리신 K
메티오닌 M 페닐알라닌 F
프롤린 P 세린 S
트레오닌 T 트립토판 W
티로신 Y 발린 V
본 발명의 하나의 양태는 인터루킨 2 아날로그를 제공한다. 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 변경된 것, 특히 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 공지된 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증대된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력도 변화(증가 또는 감소)된 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2(interleukin 2, IL-2)"란 생체 내 면역 시스템에서 신호 전달을 하는 사이토카인의 일종으로 면역 조절제를 의미한다. 인터루킨 2는 일반적으로 약 15 kDa의 중요한 면역 자극제로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "인터루킨 2 아날로그"란 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것을 의미하며, 특히 본 발명에서는 천연형에 비해 인터루킨 2 수용체에 대한 결합력이 감소되거나 증가한, 천연형 인터루킨 2의 아미노산이 변이된 인터루킨 2 아날로그일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 비자연적인(non-naturally occurring) 것일 수 있다.
상기 천연형 인터루킨 2는 인간 인터루킨 2 일 수 있으며, 이의 서열은 공지된 데이터베이스 등에서 얻을 수 있다. 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 천연형 인터루킨 2가 서열번호 1의 아미노산 서열일 수 있다는 의미는 서열번호 1과 동일한 서열뿐만 아니라, 서열번호 1과 상동성 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 역시 본 발명의 천연형 인터루킨 2의 범주에 속한다는 의미이며, 아미노산의 변이 위치는 서열번호 1을 기준으로 상동성 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열을 배열(align) 했을 때 서열번호 1의 아미노산 서열 상에서 상응되는 위치가 변이된 것을 의미한다.
본 발명에서, 천연형 서열에서 하나 이상의 아미노산이 변이된 것이란 천연형 인터루킨 2에서 적어도 하나 이상의 아미노산에 치환(substitution), 추가(addition), 제거(deletion), 수식(modification) 및 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택된 변형이 일어난 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 추가적으로 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것일 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 125번 아미노산인 시스테인이 세린으로 치환될 수 있고, 추가 치환이 일어나는 아미노산은 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산이 될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 변이 위치 외에 당업계에 알려진, 펩타이드의 안정성 및 반감기 증가를 위해 수행될 수 있는 정도의 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결실, 수식 등을 포함하는 인터루킨 2 아날로그 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명에서 용어, “알데스루킨(aldesleukin)” 또는 “인터루킨 2 아날로그(aldesleukin)”는 상업적으로 구매 가능한 인터루킨 2 아날로그로서, aldesleukin(상표명: Proleukin®)일 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 본 발명에서는 “인터루킨 2 아날로그 1”과 혼용되어 사용된다. 본 발명에 따른 인터루킨 아날로그는 상기 인터루킨 2 아날로그 1에 비해 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및/또는 증대된 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있다.
인터루킨 2 알파 수용체는 인터루킨 2의 신호전달 체계에는 관여하지 않는 것으로 알려져 있지만, 다른 인터루킨 2 수용체(베타 혹은 감마)와 인터루킨 2의 결합력을 10배~100배 증가시키며, CD4+ 조절 T세포 등에 발현되어 있다.
인터루킨 2 베타 수용체는 CD8+ T 세포 혹은 자연 살해 세포 (NK cell)에 주로 분포되어 면역 반응과 대식세포 작용을 활성화 하는데 주요한 기능을 수행하므로, 인터루킨 2 베타 수용체의 활성화를 통해 종양 세포 사멸 및 신체 면역 반응 활성화를 기대할 수 있다.
따라서, 본 발명의 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증가된 인터루킨 2 아날로그는 종양 억제 및 사멸과 같은 치료효과는 증대되고, 부작용은 감소한 치료효과를 가질 수 있다.
본 발명에서 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열을 포함하는 것일 수 있고, 1 내지 10개의 아미노산 변이를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 125번 아미노산이 세린으로 치환되고, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 및 126번 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환되고/되거나, 133번 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 천연형 인터루킨 2 및/또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증가된 인터루킨 2 아날로그는 제한 없이 포함된다.
하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 상기 133번 위치에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, 상기 추가되는 아미노산은 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체 결합력이 변화되고, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대되는 이상, 그 종류나 길이에 제한이 없으며, 천연형 아미노산 외에도 비천연형 아미노산, 화학적 변형을 포함하는 아미노산 역시 추가될 수 있다.
다른 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 18번, 19번, 20번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 69번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고, 18번, 19번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산 중 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 그 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다:
(a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 32번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 35번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 38번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 43번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 48번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 49번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 76번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 87번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및 (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
여기에서, 상기 인터루킨 2 아날로그가 포함하는 아미노산 치환은 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다:
(a) 12번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환; (b) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환; (c) 19번 아미노산 티로신, 발린, 페닐알라닌, 아르기닌으로 치환; (d) 20번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환; (e) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환; (f) 32번 아미노산이 시스테인으로 치환; (g) 35번 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산으로 치환; (h) 38번 아미노산이 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환; (i) 42번 아미노산이 라이신, 알라닌, 또는 트립토판으로 치환; (j) 43번 아미노산이 시스테인, 글루탐산, 또는 글루타민으로 치환; (k) 45번 아미노산이 알라닌으로 치환; (l) 48번 아미노산이 시스테인으로 치환; (m) 49번 아미노산이 시스테인으로 치환; (n) 61번 아미노산이 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파르트산으로 치환; (o) 68번 아미노산이 아스파르트산, 또는 글루타민으로 치환; (p) 69번 아미노산이 글리신으로 치환; (q) 74번 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌으로 치환; (r) 76번 아미노산이 시스테인으로 치환; (s) 80번 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 발린, 아스파르트산, 또는 트립토판으로 치환; (t) 81번 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 또는 아스파라긴으로 치환; (u) 82번 아미노산이 글리신, 또는 발린으로 치환; (v) 84번 아미노산이 글루탐산, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (w) 85번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 글루탐산, 또는 페닐알라닌으로 치환; (x) 86번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 또는 류신으로 치환; (y) 87번 아미노산이 시스테인으로 치환; (a) 88번 아미노산이 글루타민, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환; (aa) 89번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환; (ab) 91번 아미노산이 트레오닌, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 치환; (ac) 92번 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 티로신, 또는 트립토판으로 치환; (ad) 95번 아미노산이 아스파르트산으로 치환; (ae) 96번 아미노산이 페닐알라닌, 발린, 또는 이소류신으로 치환; 및 (af) 126번 아미노산이 트레오닌으로 치환.
본 명세서에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needle 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 발명에서 펩타이드 내 아미노산의 특정 위치로 표현되었더라 하더라도, 참조 서열에서 상응하는 위치를 의미하는 것일 수 있다.
또 하나의 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 명세서에서 '특정 서열번호로 구성되는 인터루킨 2 아날로그'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 인터루킨 2 아날로그와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열과 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 서로 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
임의의 두 염기 서열 또는 펩타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다. (GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
염기 서열 또는 펩타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol.48: 443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의한다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 일진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "상동성" 또는 "동일성"은 서열들간의 관련성(relevance)를 나타낸다.
이상의 내용은 본 발명의 다른 구체예 혹은 다른 양태에도 적용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2의 알파 및/또는 베타 수용체와의 결합력을 약화 또는 증가시켜 in vitro 활성을 변화시키는 새로운 인터루킨 2의 대체제로 이용될 수 있다. 특히, 베타 수용체에 대한 결합력을 증가시킬 뿐만 아니라, 알파 수용체에 대한 결합력이 변화(증가 또는 감소)되어 두 수용체에 대한 활성으로 인해 효과적인 치료제로 이용될 수 있다.
본 발명에서, 인터루킨 2의 아날로그의 제조를 위한 이러한 변형은 L-형 혹은 D-형 아미노산, 및/또는 비-천연형 아미노산을 이용한 변형; 및/또는 천연형 서열을 개질, 예를 들어 측쇄 작용기의 변형, 분자 내 공유결합, 예컨대, 측쇄 간 고리 형성, 메틸화, 아실화, 유비퀴틴화, 인산화, 아미노헥산화, 바이오틴화 등과 같이 개질함으로써 변형하는 것을 모두 포함한다.
또한, 천연형 인터루킨 2의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 하나 또는 그 이상의 아미노산이 추가된 것을 모두 포함한다.
상기 치환되거나 추가되는 아미노산은 인간 단백질에서 통상적으로 관찰되는 20개의 아미노산뿐만 아니라 비정형 또는 비-자연적 발생 아미노산을 사용할 수 있다. 비정형 아미노산의 상업적 출처에는 Sigma-Aldrich, ChemPep과 Genzyme pharmaceuticals가 포함된다. 이러한 아미노산이 포함된 펩타이드와 정형적인 펩타이드 서열은 상업화된 펩타이드 합성 회사, 예를 들어 미국의 American peptide company나 Bachem, 또는 한국의 Anygen을 통해 합성 및 구매 가능하다.
아미노산 유도체도 마찬가지 방식으로 입수할 수 있는데, 그 예를 일부만 들자면 4-이미다조아세트산 (4-imidazoacetic acid) 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 생체 내의 단백질 절단 효소들로부터 보호하고 안정성을 증가시키기 위하여 이의 N-말단 및/또는 C-말단 등이 화학적으로 수식되거나 유기단으로 보호되거나, 또는 펩타이드 말단 등에 아미노산이 추가되어 변형된 형태일 수 있다.
특히, 화학적으로 합성한 펩타이드의 경우, N- 및 C-말단이 전하를 띠고 있기 때문에, 이러한 전하를 제거하기 위하여 N-말단을 아세틸화 (acetylation) 및/또는 C-말단을 아미드화 (amidation)할 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그는 펩타이드 형태인 바, 펩타이드 그 자체, 이의 염 (예컨대, 상기 펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염), 또는 이의 용매화물의 형태를 모두 포함한다. 또한, 펩타이드는 약학적으로 허용되는 임의의 형태일 수 있다.
상기 염의 종류는 특별히 제한되지는 않는다. 다만, 개체, 예컨대 포유류에게 안전하고 효과적인 형태인 것이 바람직하나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어, "약학적으로 허용되는"은 의약학적 판단의 범위 내에서，과도한 독성，자극, 또는 알레르기 반응 등을 유발하지 않고 원하는 용도에 효과적으로 사용 가능한 물질을 의미한다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용되는 염" 이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다. 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산，말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산，숙신산, 톨루엔-P-설폰산, 타르타르산, 아세트산，시트르산, 메탄설폰산，포름산, 벤조산, 말론산, 나프탈렌-2-설폰산，밴젠설폰산 등을 들 수 있다. 적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속，마그네슘 등의 알칼리 토금속，및 암모늄 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용된 용어 "용매화물"은 본 발명에 따른 펩타이드 또는 이의 염이 용매 분자와 복합체를 형성한 것을 말한다.
본 발명에서 천연형 인터루킨 2 수용체에 대한 어떠한 인터루킨 2 아날로그의 결합력이란 수용체에 대한 친화력을 측정하는 방법으로 공지의 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 그 예로, SPR(surface Plasmon resonance)를 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 감소되거나 증가된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 가질 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력과 비교하여 약 0.001배 이상, 약 0.005배 이상, 약 0.01배 이상, 약 0.05배 이상, 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 0.9배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.3배이상, 약 1.5배 이상, 약 1.7배이상의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또는, 알데스루킨의 인터루킨 2 알파 수용체 결합력(100%)을 기준으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 아예 결합력을 상실하거나, 약 1% 이상, 약 5% 이상, 약 7% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 50% 이상, 약 70% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 150% 이상, 약 200% 이상의 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또한, 구체적으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력과 비교하여 약 0.1배 이상, 약 0.3배 이상, 약 0.5배 이상, 약 0.7배 이상, 약 1.0배이상, 약 10배 이상, 약 20배 이상, 약 30배 이상, 약 40배 이상, 약 50배 이상, 약 60배 이상, 약 70배 이상, 약 80배 이상, 약 90배 이상, 약 100배 이상의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 대비하여 변경, 또는 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
또는, 알데스루킨의 인터루킨 2 베타 수용체 결합력(100%)을 기준으로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 약 5% 이상, 약 9% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30%이상, 약 50% 이상, 약 100% 이상, 약 200% 이상, 약 500% 이상, 약 700% 이상, 약 1000% 이상, 약 1500% 이상, 약 3000% 이상, 약 5000% 이상, 약 7000% 이상, 약 10000%이상, 약 12000%이상, 약 15000% 이상, 약 20000% 이상, 약 25000% 이상의 결합력을 갖는 것일 수 있으나, 그 수치는 한정되지 않으며 결합력이 알데스루킨과 대비하여 증가되었으면 본 발명의 범주에 속한다.
본 발명에서 용어, "약"은 ±0.5, ±0.4, ±0.3, ±0.2, ±0.1 등을 모두 포함하는 범위로, 약 이란 용어 뒤에 나오는 수치와 동등하거나 유사한 범위의 수치를 모두 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 변경되고, 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력이 증가된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시 형태에서는 본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 제조하기 위하여, 천연형 인터루킨 2(서열번호 1)를 바탕으로 변이를 도입한 인터루킨 2 아날로그를 제조하였다. 본 발명에서 제조된 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있고, 또는 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열로 코딩되는 것일 수 있다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산(폴리뉴클레오티드), 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터, 및 상기 핵산 또는 재조합 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산은 서열번호 1의 천연형 인터루킨 2를 코딩하는 염기 서열에서 특정 위치의 아미노산에 변이(아미노산 결실, 치환, 및/또는 추가)를 도입할 수 있도록 변형된 것일 수 있고, 구체적으로는 서열번호 3 내지 106 중 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함할 수 있다. 일 예로서, 본 발명의 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열을 가지거나 포함할 수 있다.
본 발명의 염기 서열은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 발명의 핵산을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 108 내지 211의 서열 중 어느 하나의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 핵산은 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 발명의 핵산 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York,9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 발명의 핵산은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
상동성 또는 동일성에 관해서는 상술한 바와 같다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있고, 원핵세포 또는 진핵세포를 숙주세포로 사용하기 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "벡터"는 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 핵산 삽입물이 발현되도록 작동 가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 핵산 구조물(construct)을 의미한다. 본 발명은 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 벡터를 제조할 수 있는데, 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환(transformation) 또는 형질감염(transfection) 시킴으로써, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그를 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "형질전환(transformation)"는 DNA를 숙주세포 내로 도입하여 DNA가 염색체의 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제 가능하게 되는 것으로, 외부의 DNA를 세포 내로 도입하여 인위적으로 유전적인 변화를 일으키는 현상을 의미한다.
본 발명에 적합한 숙주는 본 발명의 핵산을 발현하도록 하는 한 특별히 제한되지 않는다. 본 발명에 사용될 수 있는 숙주의 특정한 예로는 대장균(E. coli)과 같은 에스케리키아(Escherichia) 속 세균; 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스(Bacillus) 속 세균; 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)와 같은 슈도모나스(Pseudomonas) 속 세균; 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)와 같은 효모; 스포도프테라 프루기페르다(Sf9)와 같은 곤충세포; 및 CHO, COS, BSC 등과 같은 동물세포가 있다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 방법은 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산에 변이를 도입시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로는, (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 32번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 35번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 38번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 43번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 48번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 49번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 76번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환시키거나; (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 87번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
인터루킨 2 아날로그, 및 변이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그의 제조 방법의 다른 예로서, 상기 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법은 a) 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산을 포함하는 형질전환체를 배양하여 인터루킨 2 아날로그를 발현시키는 단계; 및 b) 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 인터루킨 2 아날로그를 제조할 수 있는 한 특정 방법에 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법일 수 있다.
본 발명에서, 상기 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는 핵산은 서열번호 108 내지 211 중 어느 하나의 염기 서열을 포함하거나, (필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 형질전환체의 배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 숙주세포 배양의 요건을 충족해야 한다. 숙주세포의 성장을 위하여 배지 중에 포함될 수 있는 탄소원은 제조된 형질전환체의 종류에 따라 당업자의 판단에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 배양 시기 및 양을 조절하기 위해 적당한 배양 조건을 채택할 수 있다.
사용될 수 있는 당원으로는 글루코스, 사카로스, 락토스, 프룩토스, 말토스, 전분, 셀룰로스와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다.
마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양 도중에 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예: 공기)를 주입한다.
본 발명에 따른 형질전환체의 배양은 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 또한 배양은 원하는 인터루킨 2 아날로그의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 지속되는데, 이러한 목적으로 배양은 보통 10 내지 160시간 동안 지속될 수 있다.
전술한 바와 같이 숙주세포에 따라 적절한 배양 조건을 조성해주면 본 발명에 따른 형질전환체는 인터루킨 2 아날로그를 생산하게 되며, 벡터의 구성 및 숙주세포의 특징에 따라 생산된 인터루킨 2 아날로그는 숙주세포의 세포질 내, 원형질막 공간(periplasmic space) 또는 세포 외로 분비될 수 있다.
숙주세포 내 또는 외에서 발현된 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있다. 정제 방법의 예로는 염석(예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전 등), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합하여 적용할 수 있다.
본 발명의 구체예로서, 인터루킨 2 아날로그를 제조하는 방법은
(a) 상기 인터루킨 2 아날로그를 발현시키는 단계; 및
(b) 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리해 내는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체예로서, 형질전환체로부터 봉입체 형태로 발현된 인터루킨 2 아날로그를 분리 및 정제하기 위하여 하기 단계를 추가적으로 포함할 수 있다:
b-1) 상기 a) 단계의 배양액으로부터 형질전환체를 수확하여 파쇄하는 단계;
b-2) 파쇄된 세포 용해물로부터 발현된 인터루킨 2 아날로그를 회수하여 리폴딩하는 단계; 및
b-3) 리폴딩된 인터루킨 2 아날로그를 크기 배제 크로마토그래피로 정제하는 단계.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 상기 인터루킨 2 아날로그를 펩타이드 합성법에 의해 제조하는 방법을 제공한다. 이와 같은 펩타이드 합성은 본 발명의 인터루킨 2 아날로그 서열이 제공되어 있는 바, 공지의 펩타이드 합성법을 이용해 제한없이 제조할 수 있다.
인터루킨 2 아날로그, 및 변이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는, 천연형 인터루킨 2에서 하나 이상의 아미노산을 변이시키는 단계를 포함하는, 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 증대시키는 방법이다.
본 발명에 따른 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 증대시키는 방법은, 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비해 인터루킨 2 베타 수용체에 대한 결합력을 증가시킬 뿐만 아니라, 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력을 변화시키는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 방법은 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상의 아미노산에 변이를 도입시키는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 방법은 (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 32번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 35번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 38번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 43번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 48번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 49번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 76번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환시키거나; (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 및 87번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키거나; (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산을 제거하고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산을 다른 아미노산으로 치환시키는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
인터루킨 2 아날로그, 및 변이는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 양태는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그를 제공한다.
인터루킨 2 아날로그, 변이, 및 서열번호로 표현되는 아날로그의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 하기 일반식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그를 제공한다:
[일반식 1]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 1, 서열번호 212)
상기 일반식 1에서,
X1은 결실이고,
X18은 루신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X19는 루신(L), 또는 티로신(Y)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 리신(K), 또는 트립토판(W)이고,
X43은 글루탐산(E), 리신(K), 또는 글루타민(Q)이고,
X45는 알라닌(A), 또는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아르기닌(R)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X74는 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 루신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X81은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 아르기닌(R)이고,
X84는 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 알라닌(A), 글루탐산(E), 글리신(G), 루신(L), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 또는 발린(V)이고,
X91은 트레오닌(T), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 이소루신(I), 또는 티로신(Y)이고,
X94는 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)이고,
X96은 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)임.
또한, 상기 일반식 1에서 X133에 해당하는 트레오닌(T)에 하나 이상의 아미노산이 추가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하거나, 필수적으로 구성되거나, 구성되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이와 같은 인터루킨 2 아날로그는 알데스루킨 또는 천연형 인터루킨 2 에 비해 증가된 베타 수용체 결합력을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 예로, 본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 상기 일반식 1에서,
X43은 리신(K)이고,
X45는 티로신(Y)이고,
X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X68은 글루탐산(E)이고,
X74는 글루타민(Q)이고,
X80은 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)이고,
X85는 루신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
X86은 이소루신(I), 또는 발린(V)이고,
X92는 페닐알라닌(F), 또는 이소루신(I)을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명을 구현하기 위한 또 하나의 양태는 하기 일반식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그를 제공한다:
[일반식 2]
X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T (일반식 2, 서열번호 213)
상기 일반식 2에서,
X1은 결실이고,
X18은 루신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
X38은 알라닌(A), 또는 아르기닌(R)이고,
X42는 페닐알라닌(F), 또는 리신(K) 이고,
X61은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X81은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
X85는 루신(L), 또는 발린(V)이고,
X86은 이소루신(I), 또는 발린(V)임.
구체적으로, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 일반식 2에서 X133에 해당하는 트레오닌(T)에 하나 이상의 아미노산이 추가될 수 있고, 또는 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본원 명세서에서 문맥상 달리 요구하지 않는 한, “포함한다”, “포함하는”, “함유하는”, 등의 표현은 명시된 정수(integer) 또는 정수 그룹의 포함을 의미하지만, 다른 정수 또는 정수의 집합을 배제하는 것이 아니라고 이해되어야 한다.　
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 천연형 인터루킨 2 및 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터의 제작
133개의 아미노산을 코딩하는 천연형 인터루킨 2 발현 벡터를 제작하기 위해, 보고된 인터루킨 2 서열 (NM_000586.3; 서열번호 1)을 바탕으로 합성한 인터루킨 2를 pET-22b 벡터 (Novagen)에 클로닝하였다. 아울러, 상기 인터루킨 2를 주형으로 하여 인터루킨 2의 아미노산을 변형시킨 신규한 인터루킨 2 아날로그를 제작하였다. 인터루킨 2 아날로그 증폭을 위한 PCR 조건은 95℃ 30초, 55℃에서 60초, 65℃에서 6.5분으로 이 과정을 16회 반복하였다. 원하는 부위의 아미노산이 정상적으로 바뀌어 있는지 상기 조건에서 얻어진 돌연변이(mutagenesis) 생성물에 대하여 서열 분석을 수행하였으며, 각각의 인터루킨 2 아날로그의 목적하는 변이 위치에 천연형 기준으로 아래 표 1에 표시한 변이가 있는 것을 확인하였다. 이렇게 얻어진 발현 벡터를 pET22b-인터루킨 2 아날로그 1 내지 105라 명명하였다.
하기 표 1에 각각의 아미노산의 변화 서열 및 아날로그 이름을 나타냈다. 이들 인터루킨 2 아날로그를 제작하기 위해 순방향 (F) 및 역방향 (R) 프라이머를 합성한 후, PCR을 진행하여 각각의 아날로그 유전자를 증폭하였다.
아래 표 1에서 아날로그 1은 알데스루킨이고, 프라이머 #1 내지 #204는 명세서의 서열번호 214 내지 417에 각각 해당한다.
Figure PCTKR2021004028-appb-T000001
Figure PCTKR2021004028-appb-I000001
Figure PCTKR2021004028-appb-I000002
Figure PCTKR2021004028-appb-I000003
Figure PCTKR2021004028-appb-I000004
Figure PCTKR2021004028-appb-I000005
Figure PCTKR2021004028-appb-I000006
Figure PCTKR2021004028-appb-I000007
Figure PCTKR2021004028-appb-I000008
Figure PCTKR2021004028-appb-I000009
desA1은 인터루킨 2의 첫번째 아미노산인 알라닌을 결실시킨 것을 의미한다.
하기 표 2에 인터루킨 2 아날로그의 전장 길이 단백질 서열을 나타냈다. 하기 표 2 내의 볼드체는 변이 위치를 나타낸 것이다.
Figure PCTKR2021004028-appb-T000002
Figure PCTKR2021004028-appb-I000010
Figure PCTKR2021004028-appb-I000011
Figure PCTKR2021004028-appb-I000012
Figure PCTKR2021004028-appb-I000013
Figure PCTKR2021004028-appb-I000014
Figure PCTKR2021004028-appb-I000015
Figure PCTKR2021004028-appb-I000016
Figure PCTKR2021004028-appb-I000017
실시예 2: 인터루킨 2 아날로그의 발현
상기 실시예 1에서 제조한 발현 벡터를 이용하여, T7 프로모터 조절하의 재조합 인터루킨 2 아날로그를 발현시켰다. 각각의 재조합 인터루킨 2 아날로그 발현 벡터로 발현 대장균 균주, E.coli BL21DE3(E. coli B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-) gal λ(DE3); 노바젠)을 형질 전환하였다. 형질전환 방법은 노바젠사에서 추천하는 방법을 이용하였다. 각 재조합 발현 벡터가 형질 전환된 각각의 단일 콜로니를 취하여, 암피실린(50㎍/ml)이 포함된 2X 루리아 브로스(Luria Broth) 배지에 접종하고, 37℃에서 15시간 동안 배양하였다. 재조합 균주 배양액과 30% 글리세롤이 포함된 2X LB 배지를 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여, 각 1 mL씩 cryo-튜브에 분주하고, -150℃에 보관하였다. 이를 재조합 단백질의 생산을 위한 세포 스톡(cell stock)으로 사용하였다.
재조합 인터루킨 2 아날로그의 발현을 위하여, 각 세포 스톡 1 바이알(vial)을 녹여 500 ml의 2X LB에 접종하고, 37℃에서 14 ~ 16시간 동안 진탕 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도 값이 4.0 이상을 나타내면 배양을 종료하고, 이를 종 배양액으로 사용하였다. 5 L 발효기(Bioflo-320, NBS, 미국)를 이용하여, 종 배양액을 1.6 L의 발효 배지에 접종하고, 초기 발효를 시작하였다. 배양조건은 온도 37℃, 공기량 2.0 L/min(1vvm), 교반 속도 650 rpm 및 30% 암모니아수를 사용하여, pH 6.70으로 유지시켰다. 발효 진행은 배양액 내의 영양소가 제한되었을 때, 추가 배지(feeding solution)을 첨가하여 유가배양을 진행하였다. 균주의 성장은 흡광도로 관측하였고, 흡광도 값 70 이상에서 최종 농도 500 μM의 IPTG를 도입하였다. 배양은 IPTG 도입 후 약 23~25시간까지 더 진행하였으며, 배양 종료 후 원심 분리기를 사용하여 재조합 균주를 수확하여 사용 시까지 -80℃에 보관하였다.
실시예 3: 인터루킨 2 아날로그의 추출 및 재접힘(refolding)
상기 실시예 2에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 발현 대장균으로부터 인터루킨 2 아날로그를 가용성 형태로 바꾸기 위해 세포를 파쇄하고 재접힘하였다. 배양액 100 mL 분량에 해당하는 세포 펠렛을 1 - 200 mL의 파쇄 완충 용액 (20 mM Tris-HCl pH 9.0, 1 mM EDTA pH 9.0, 0.2 M NaCl, 0.5% Triton X-100)에 부유시킨 후, 미세용액화(Microfludizer)를 이용하여 15,000 psi로 재조합 대장균을 파쇄하였다. 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 400 mL의 첫번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH9.0)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 두번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 2% Triton X-100)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 세번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1% sodium deoxycholorate)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 400 mL의 네번째 세척 완충 용액(50 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM EDTA pH 9.0, 1 M NaCl)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 세척된 대장균 봉입체 (inclusion body) 펠렛을 수득하였다. 세척된 봉입체 펠렛을 400 mL의 가용/환원화 완충액 (6 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 2 mM EDTA pH 9.0, 50 mM DTT)에 재부유하여 50℃에서 30분 동안 교반하였다. 가용/환원된 인터루킨 2 아날로그에 증류수 100 mL를 넣어 6 M Guanidine을 4.8 M Guanidine으로 희석한 후 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 펠렛은 버리고 용액만 수득하였다. 희석된 용액에 증류수 185.7 mL를 추가로 넣어 4.8 M Guanidine을 3.5 M Guanidine으로 희석한 후 100% acetic acid를 이용하여 pH를 5.0로 맞추었다. pH 조정된 용액을 상온에서 1시간 교반하였다. 불순물이 침전된 용액은 13,900 g에서 30분간 원심분리하여 상층액을 버리고, 펠렛을 마지막 세척 완충 용액 (3.5 M Guanidine, 20 mM Sodium Acetate pH 5.0, 5 mM DTT)으로 펠렛을 세척하였다. 상기와 동일 조건으로 원심분리하여 펠렛을 수득하였다. 세척된 인터루킨 2 아날로그를 400 mL의 재접힘 완충 용액 (6 mM Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM CuCl2)으로 용해시킨다. 혼합용액을 4℃에서 15 - 24 시간 동안 교반함으로서 재접힘 과정을 수행하였다.
실시예 4: 크기 배제 컬럼 크로마토그래피
상기 실시예 3에서 얻은 인터루킨 2 아날로그 재접힘 용액을 크기 배제 컬럼에 적용하여 정제하기 위하여 1 mL이하로 농축하였다. 컬럼은 재접힘 용액 도입 전 완충 용액 (2 M Guanidine, 100 mM Tris pH 8.0)으로 평형화하였고, 재접힘 용액 도입후 완충 용액 흘려주어 용출하였다. 용출된 시료는 구아니딘을 포함하고 있어 안정화 용액 (10 mM Sodium Acetate pH 4.5, 5% Trehalose)로 바꿔준 후 RP-HPLC, peptide mapping 분석을 통해 순도를 측정하였다. 측정된 순도가 80%이상이면 실험에 사용하였다.
실시예 5: 인터루킨 2 아날로그의 수용체 결합력 평가
상기 실시예 4에서 얻은 인터루킨 2 아날로그의 인터루킨 2 알파 수용체와 베타 수용체 각각의 수용체 결합력을 측정하기 위하여 표면 플라스몬 공명 측정(BIACORE T200, GE healthcare사)을 사용하였다. 제조된 아날로그들의 알파 수용체 및 베타 수용체에 대한 결합력을 측정하고, 인터루킨 2 아날로그 01(aldesleukin)과 각 결합력을 비교하였다.
먼저 CM5칩(GE healthcare사)에 아민 결합법(amine coupling)을 통해 항 인간 면역글로불린 항체(Abcam사, #ab97221)를 약 5,000 RU (resonance unit)만큼 고정화한 후, 항원 항체 결합 반응을 이용하여 인간 면역글로블린 Fc부위가 결합된 인터루킨 2 알파 수용체(SYMANSIS사, #4102H) 또는 인터루킨 2 베타 수용체(SYMANSIS사, #4122H)를 각각 면역글로불린 항체에 결합시켜 최종 고정화 하였다. 그 다음으로 상기에서 재조한 재조합 인터루킨 2 아날로그를 농도별로 희석하고 인터루킨 2 수용체가 최종 고정된 CM5칩에 흘려주어 각 인터루킨 2 수용체의 결합력을 측정하였다. 결합력은 결합 속도 상수(ka)와 해리 속도 상수(kd)를 측정하는 것으로 이루어졌는데, 10 μL/분의 유속으로 인터루킨 2 아날로그를 3분간 흘려 결합 속도를 측정하고, 동일한 시간과 유속으로 실험 버퍼만 흘려 주어 각 인터루킨 2 수용체로부터의 해리 속도를 측정하였다. 측정이 완료되면, Biaevaluation 프로그램에서 1:1 binding fitting model에 따라 수용체의 결합력 평가를 진행하였다.
상대적 결합력 KD (%) = 아날로그 01(aldesleukin) 결합력(KD) / 아날로그 결합력(KD) × 100
아래 표 3에서 “정의 불가”는 표면 플라스몬 공명 측정에서 해당 수용체에 대한 결합이 관측되지 않음에 따라 그 수용체에 한해서는 해당 물리량을 정의할 수 없다는 것을 가리킨다.
Figure PCTKR2021004028-appb-T000003
Figure PCTKR2021004028-appb-I000018
Figure PCTKR2021004028-appb-I000019
시험 결과(도 1 및 2, 및 표 3)에서 명시된 바와 같이 본 발명의 인터루킨 2 아날로그들은 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 아예 상실하거나, 인터루킨 2 아날로그 1에 비하여 감소 또는 증가하는 등 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨과 상이한 인터루킨 2 알파 수용체 결합력을 나타내는 것을 확인하였다. 반면, 인터루킨 2 베타 수용체에 대해서는 천연형 인터루킨 2 또는 알데스루킨에 비하여 최대 100배 더 강한 결합력이 확인되었다. 이를 통해 인터루킨 2 아날로그의 아미노산 서열이 인터루킨 2 알파 또는 베타 수용체의 결합에 영향력이 있음을 확인하였다. 이는 특정 위치의 아미노산을 치환 함으로써 인터루킨 2 수용체의 결합력을 변화시킬 수 있음을 시사하는 바이다.
상기와 같은 실험 결과는 본 발명에 따른 인터루킨 2 아날로그가 변화된 인터루킨 2 알파 수용체 결합력 및 인터루킨 2 베타 수용체 결합력을 가져, 이를 활용한 다양한 약물 개발에 이용될 수 있음을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있음을 이해할 수 있다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 제한적인 것이 아닌 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술되는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (21)

  1. 알데스루킨(aldesleukin)에 비해 인터루킨 2 베타 수용체 결합력이 증대된 인터루킨 2 아날로그(analog)로서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2에서 1번, 12번, 18번, 19번, 20번, 22번, 32번, 35번, 38번, 42번, 43번, 45번, 48번, 49번, 61번, 68번, 69번, 74번, 76번, 80번, 81번, 82번, 84번, 85번, 86번, 87번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 95번, 96번, 125번, 126번 및 133번 위치에 상응하는 아미노산 중 하나 이상이 변이된 서열을 포함하는 인터루킨 2 아날로그.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 인터루킨 2 알파 수용체에 대한 결합력이 알데스루킨과 달라진 것을 특징으로 하는 인터루킨 2 아날로그.
  3. 제1항에 있어서, 상기 133번 위치에 상응하는 아미노산에 하나 이상의 아미노산이 추가된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  4. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  5. 제4항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 1개 내지 10개의 아미노산 치환을 추가로 포함하는 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  6. 제5항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 18번, 19번, 20번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 69번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 89번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  7. 제6항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 18번, 19번, 22번, 38번, 42번, 43번, 45번, 61번, 68번, 74번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 88번, 91번, 92번, 94번, 및 96번 중 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 추가로 치환된 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  8. 제1항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 하기 아날로그 중 어느 하나인 것인 인터루킨 2 아날로그:
    (a) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 32번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (b) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 35번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (c) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 38번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (d) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (e) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 43번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (f) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 48번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (g) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 49번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (h) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 76번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (i) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 92번, 94번 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (j) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 및 87번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (k) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (l) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 80번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (m) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (n) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 19번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (o) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 12번, 38번, 및 42번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (p) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 61번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (q) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (r) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 88번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (s) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 89번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (t) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 91번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (u) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 94번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (v) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 및 126번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (w) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 및 84번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (x) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (y) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (z) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (aa) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ab) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ac) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ad) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 20번, 38번, 42번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ae) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (af) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 81번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ag) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 84번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ah) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 81번, 88번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ai) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (aj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ak) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (al) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (am) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (an) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ao) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 84번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ap) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 45번, 80번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (aq) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ar) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (as) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (at) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (au) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (av) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (aw) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ax) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 74번, 80번, 81번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ay) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (az) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 69번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (ba) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 84번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bb) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 94번, 및 96번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bc) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 19번, 22번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bd) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 38번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (be) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bf) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 18번, 22번, 68번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bg) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bh) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 45번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bi) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bj) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bk) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bl) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 43번, 61번, 80번, 81번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그;
    (bm) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 38번, 42번, 80번, 81번, 85번, 86번, 91번, 92번, 및 95번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그; 및
    (bn) 천연형 인터루킨 2 중 1번 아미노산이 제거되고, 125번, 35번, 38번, 42번, 74번, 80번, 81번, 82번, 85번, 86번, 및 92번 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 인터루킨 2 아날로그.
  9. 제8항에 있어서, 상기 아미노산 치환은 하기 아미노산 치환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인, 인터루킨 2 아날로그:
    (a) 12번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (b) 18번 아미노산이 아르기닌으로 치환;
    (c) 19번 아미노산 티로신, 발린, 페닐알라닌, 아르기닌으로 치환;
    (d) 20번 아미노산이 발린 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (e) 22번 아미노산이 글루탐산으로 치환;
    (f) 32번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (g) 35번 아미노산이 시스테인 또는 글루탐산으로 치환;
    (h) 38번 아미노산이 알라닌 또는 아스파르트산으로 치환;
    (i) 42번 아미노산이 라이신, 알라닌, 또는 트립토판으로 치환;
    (j) 43번 아미노산이 시스테인, 글루탐산, 또는 글루타민으로 치환;
    (k) 45번 아미노산이 알라닌으로 치환;
    (l) 48번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (m) 49번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (n) 61번 아미노산이 글루타민, 아르기닌, 또는 아스파르트산으로 치환;
    (o) 68번 아미노산이 아스파르트산, 또는 글루타민으로 치환;
    (p) 69번 아미노산이 글리신으로 치환;
    (q) 74번 아미노산이 히스티딘 또는 알라닌으로 치환;
    (r) 76번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (s) 80번 아미노산이 페닐알라닌, 티로신, 발린, 아스파르트산, 또는 트립토판으로 치환;
    (t) 81번 아미노산이 아스파르트산, 글루탐산, 또는 아스파라긴으로 치환;
    (u) 82번 아미노산이 글리신, 또는 발린으로 치환;
    (v) 84번 아미노산이 글루탐산, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (w) 85번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 트립토판, 티로신, 트레오닌, 이소류신, 글루탐산, 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (x) 86번 아미노산이 발린, 알라닌, 글리신, 또는 류신으로 치환;
    (y) 87번 아미노산이 시스테인으로 치환;
    (z) 88번 아미노산이 글루타민, 발린, 또는 페닐알라닌으로 치환;
    (aa) 89번 아미노산이 페닐알라닌으로 치환;
    (ab) 91번 아미노산이 트레오닌, 페닐알라닌, 또는 글루탐산으로 치환;
    (ac) 92번 아미노산이 페닐알라닌, 류신, 티로신, 또는 트립토판으로 치환;
    (ad) 95번 아미노산이 아스파르트산으로 치환;
    (ae) 96번 아미노산이 페닐알라닌, 발린, 또는 이소류신으로 치환; 및
    (af) 126번 아미노산이 트레오닌으로 치환.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 인터루킨 2 아날로그를 코딩하는, 분리된 핵산.
  11. 제10항에 따른 핵산을 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  12. 제11항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체.
  13. 서열번호 3 내지 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그.
  14. 하기 일반식 1로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그:
    [일반식 1]
    X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-X19-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-X43-F-X45-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-X74-S-K-N-F-H-X80-X81-P-R-X84-X85-X86-S-N-I-N-X91-X92-V-X94-E-X96-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 1, 서열번호 212)
    상기 일반식 1에서,
    X1은 결실이고,
    X18은 루신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
    X19는 루신(L), 또는 티로신(Y)이고,
    X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
    X38은 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 아르기닌(R)이고,
    X42는 알라닌(A), 페닐알라닌(F), 리신(K), 또는 트립토판(W)이고,
    X43은 글루탐산(E), 리신(K), 또는 글루타민(Q)이고,
    X45는 알라닌(A), 또는 티로신(Y)이고,
    X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 글루타민(Q), 또는 아르기닌(R)이고,
    X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X74는 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이고,
    X80은 페닐알라닌(F), 루신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
    X81은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 아르기닌(R)이고,
    X84는 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X85는 알라닌(A), 글루탐산(E), 글리신(G), 루신(L), 발린(V), 트립토판(W), 또는 티로신(Y)이고,
    X86은 알라닌(A), 글리신(G), 이소루신(I), 또는 발린(V)이고,
    X91은 트레오닌(T), 또는 발린(V)이고,
    X92는 페닐알라닌(F), 이소루신(I), 또는 티로신(Y)이고,
    X94는 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)이고,
    X96은 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)임.
  15. 제14항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 15, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 56, 58, 59, 60, 62, 71, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 85, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 105, 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 일반식 1에서,
    X43은 리신(K)이고,
    X45는 티로신(Y)이고,
    X61은 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
    X68은 글루탐산(E)이고,
    X74는 글루타민(Q)이고,
    X80은 페닐알라닌(F), 또는 루신(L)이고,
    X85는 루신(L), 발린(V), 또는 티로신(Y)이고,
    X86은 이소루신(I), 또는 발린(V)이고,
    X92는 페닐알라닌(F), 또는 이소루신(I)임.
  17. 제16항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 10, 13, 14, 16, 17, 20, 21, 22, 32, 35, 36, 42, 53, 54, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 98, 99, 100, 101, 103, 104, 및 105의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  18. 제14항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함하는 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  19. 하기 일반식 2로 표현되는 아미노산 서열을 포함하는, 인터루킨 2 아날로그:
    [일반식 2]
    X1-P-T-S-S-S-T-K-K-T-Q-L-Q-L-E-H-L-X18-L-D-L-X22-M-I-L-N-G-I-N-N-Y-K-N-P-K-L-T-X38-M-L-T-X42-K-F-Y-M-P-K-K-A-T-E-L-K-H-L-Q-C-L-E-X61-E-L-K-P-L-E-X68-V-L-N-L-A-Q-S-K-N-F-H-F-X81-P-R-D-X85-X86-S-N-I-N-V-F-V-L-E-L-K-G-S-E-T-T-F-M-C-E-Y-A-D-E-T-A-T-I-V-E-F-L-N-R-W-I-T-F-S-Q-S-I-I-S-T-L-T(일반식 2, 서열번호 213)
    X1은 결실이고,
    X18은 루신(L), 또는 아르기닌(R)이고,
    X22는 글루탐산(E), 또는 글루타민(Q)이고,
    X38은 알라닌(A), 또는 아르기닌(R)이고,
    X42는 페닐알라닌(F), 또는 리신(K) 이고,
    X61은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X68은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X81은 아스파르트산(D), 또는 글루탐산(E)이고,
    X85는 루신(L), 또는 발린(V)이고,
    X86은 이소루신(I), 또는 발린(V)임.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 서열번호 22, 42, 53, 87, 105 및 106의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 서열을 포함하는 것인, 인터루킨 2 아날로그.
  21. 제19항에 있어서, 상기 인터루킨 2 아날로그는 C-말단에 하나 이상의 아미노산이 추가로 포함하는 것인, 인터루킨 2 아날로그.
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