WO2019132610A1 - Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2019132610A1
WO2019132610A1 PCT/KR2018/016903 KR2018016903W WO2019132610A1 WO 2019132610 A1 WO2019132610 A1 WO 2019132610A1 KR 2018016903 W KR2018016903 W KR 2018016903W WO 2019132610 A1 WO2019132610 A1 WO 2019132610A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
fusion protein
cancer
cells
baf57
present
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/016903
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김정호
김범석
Original Assignee
주식회사 굳티셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 굳티셀 filed Critical 주식회사 굳티셀
Publication of WO2019132610A1 publication Critical patent/WO2019132610A1/ko
Priority to US16/728,216 priority Critical patent/US11345729B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a novel BAF57 recombinant fusion protein and a composition which can effectively prevent or treat inflammatory diseases, immune-related diseases or cancers.
  • Histone is a basic protein that exists in the nucleus of eukaryotic cells and ionically binds to genomic DNA, ranging from multicellular organisms such as humans to single celled organisms represented by fungi (fungi, yeast). Histones are usually composed of five components (H1, H2A, H2B, H3 and H4) and are highly similar, exceeding species. For example, in the case of histone H4, an amino acid sequence of 92% is identical in the emergence yeast histone H4 (102 amino acids in total length) and human histone H4 (102 amino acids in total length), and the difference is only 8 residues.
  • histones are known to be the most highly conserved proteins among eukaryotic species. Genomic DNA is superimposed by regular bonds with this histone, and the complex of both forms a basic structural unit called a nucleosome. The chromosome structure of the chromosome is formed by aggregation of this nucleosome. The histone is subjected to a modification such as acetylation, methylation, phosphorylation, ubiquitination, and sumoylation at the N-terminal portion called histone tail, thereby maintaining or specifically converting the chromatin structure, The reaction that occurs on chromosomal DNA, such as DNA repair, is regulated.
  • Post-translational modification of histones is a post-sexual regulatory mechanism and is considered essential for gene regulation of eukaryotic cells.
  • chromatin remodeling factors such as SWI / SNF, RSC, NURF, and NRD, which modify the nucleosome structure and facilitate access to transcription factors and DNA, regulate the acetylation status of the histone Histone acetyltransferases (HATs) and histone deacetylases (HDACs) have been shown to be important regulators (Korean Patent Application No. 10-2011-0081688).
  • a bromo domain is known as a domain structure of a protein that binds to the acetylated lysine of histone.
  • the BAF complex is one of various chromosomal remodeling involved in the chromosomal remodeling process known to be important in T cell development and activation signal transduction.
  • Such a remodeler plays a role of changing the chromosome using ATP .
  • the BAF complex is composed of several subunits. Among these subunits, BRG1 is a protein interacting with acetylated histone. It is well known as a key constituent protein of the chromatin remodeling factor SWI / SNF complex. Many studies have been made on the role of activation in signal transduction. However, the role of BAF57 (BRG1 or HBRM-associated factors 57), another subunit, in T cells is not well known.
  • One object of the present invention is a novel BAF57 recombinant fusion protein.
  • all or part of BAF57 (BRG1 or HBRM-associated factors 57) protein is linked to BAF57 (BRG1 or HBRM-associated factors 57) protein; And a protein delivery domain.
  • all or a part of the BAF57 protein may be derived from mammals including primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats, and the like.
  • the BAF57 protein may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or may be encoded by a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a part of the BAF57 protein refers to any one fragment of the BAF57 protein.
  • the specific site is not particularly limited, BAF57 or another BAF complex subunit binds to the BAF57 protein.
  • Polypeptide fragments that can act as competitive inhibitors can be included without limitation.
  • a part of the BAF57 protein is a protein having an HMG domain which is a DNA binding domain and a proline-rich domain which is an N-terminal part in the BAF57 protein 3, more preferably, it may be composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or may be encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the protein transport domain is a hydrophobic short peptide consisting of 7 to 50 amino acids. It means a domain capable of transferring not only a protein having a molecular weight of 120 kDa or more but also DNA or RNA into cells.
  • Pep-1 peptide-1
  • PTD-5 protein transduction domain-5
  • MAP protein transduction domain-5
  • K-FGF protein transduction domain-5
  • Phe net but are not limited to, those selected from the group consisting of penetratin, transportan, polyarginine, 11R, 7R and cytoplamic transduction peptide.
  • 11R and “7R” means peptides each consisting of 11 and 7 arginines.
  • the protein transport domain may be Hph-1, preferably comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 .
  • the protein transport domain may be connected to the N-terminal or C-terminal of all or part of the BAF57 protein, preferably to the N-terminal have.
  • the fusion protein of the present invention may further include a tag for separation and purification.
  • the tag may be at least one of an affinity tag and an epitope tag.
  • the affinity tag includes a histidine tag, a glutathione transferase (GST), an Intein, a chitin binding protein (CBP), a maltose binding protein But are not limited to, a maltose binding protein (MBP), an avidin tag, or a streptavidin tag.
  • the epitope tag may be a FLAG tag, a Myc tag, a V5 tag, a HA tag, a spot tag, or an NE tag, but is not limited thereto.
  • the tag may be a flag tag, preferably composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or may be encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO:
  • the tag may be connected to the N-terminal or the C-terminal of all or part of the BAF57 protein, preferably to the N-terminal.
  • the fusion protein may be composed of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 9 to 11.
  • the fusion protein of the present invention is delivered into the cell and binds to a subunit of BAF155 or another BAF complex to act as a competitive inhibitor of BAF57 present in the cell, thereby lowering the expression level of BAF57 by the proteolytic mechanism and increasing the expression of BAF155 Can also be suppressed.
  • nucleic acid molecule encoding the fusion protein provided by the present invention.
  • the nucleic acid molecule of the present invention includes all of the nucleic acid molecules that have been translated into a polynucleotide sequence as known to those skilled in the art by the amino acid sequence of the fusion protein provided herein. Therefore, various polynucleotide sequences by ORF (open reading frame) can be produced, and these are all included in the nucleic acid molecule of the present invention.
  • ORF open reading frame
  • the nucleic acid molecule may comprise a nucleotide sequence represented by any one of SEQ ID NOS: 12 to 14.
  • an expression vector into which the nucleic acid molecule provided by the present invention is inserted.
  • the "vector” is a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to which a nucleic acid molecule is linked.
  • a vector is a "plasmid” that refers to a circular double stranded DNA to which additional DNA segments may be ligated.
  • a phage vector is another type of vector.
  • a viral vector Another type of vector is a viral vector, and additional DNA segments can be ligated to the viral genome.
  • Some vectors can autonomously replicate in the host cells into which they are introduced (e. G., Bacterial vectors are episomal mammalian vectors with bacterial replication origin). Other vectors (e.
  • Non-episomal mammalian vectors can be incorporated into the genome of the host cell while being introduced into the host cell, thereby replicating with the host genome.
  • some vectors can direct expression of the genes to which they are linked at the activation level.
  • Such a vector is referred to herein as a " recombinant expression vector "or simply an” expression vector ".
  • expression vectors useful in recombinant DNA techniques are often present in the form of plasmids.
  • plasmid and vector can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used form of vector.
  • the expression vector in the present invention include commercially available pCDNA vector, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti vector; Cosmids; Lambda, lambdoid, M13, Mu, p1 P22, Q ⁇ , T-even, T2, T3, T7 and the like; Plant virus, but not limited thereto.
  • Any expression vector known to the person skilled in the art as an expression vector can be used in the present invention, and the selection of the expression vector depends on the nature of the intended host cell.
  • the vector contains one or more selectable markers, but is not limited thereto, and a vector containing no selectable marker can be used to select the product according to whether the product is produced or not. Selection of the selection marker is selected by the desired host cell, and the present invention is not limited thereto since it uses a method already known to those skilled in the art.
  • nucleic acid molecule of the present invention can be fused by inserting a tag sequence into an expression vector.
  • the tag may be at least one of an affinity tag and an epitope tag.
  • the affinity tag includes a histidine tag, a glutathione transferase (GST), an Intein, a chitin binding protein (CBP), a maltose binding protein But are not limited to, a maltose binding protein (MBP), an avidin tag, or a streptavidin tag.
  • the epitope tag may be a FLAG tag, a Myc tag, a V5 tag, a HA tag, a spot tag, or an NE tag, but is not limited thereto.
  • the tag is not limited to the above-mentioned types, and tags that facilitate purification, which are known to those skilled in the art, are all usable in the present invention.
  • a host cell transformed with the expression vector provided by the present invention.
  • the "host cell” includes individual cells or cell cultures that may or may not be a recipient of the vector (s) for incorporation of the polypeptide insert.
  • the host cell contains the offspring of a single host cell and the offspring may not necessarily be identical (morphologically or in a genomic DNA complement) to the original parental cell because of natural, accidental or deliberate mutations.
  • Host cells include cells transfected in vivo with the polypeptide (s) herein.
  • the host cell may include cells of mammalian, plant, insect, fungal or cellular origin, for example, bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; Yeast cells, fichia pastoris, and the like; Insect cells such as Drosophila and Spodoptera Sf9 cells; CHO (Chinese hamster ovary cells), SP2 / 0 (mouse myeloma), human lymphoblastoid, COS, NSO (mouse osteoma), 293T, Bowmanella cells, HT-1080, BHK (Baby Hamster Kidney cells), HEK (Human Embryonic Kidney cells), or PERC.6 (human retinal cells); Or plant cells, but is not limited thereto, and cells usable as a host cell known to a person skilled in the art are all usable.
  • bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease or an immune-related disease comprising the fusion protein provided by the present invention as an active ingredient.
  • the fusion protein of the present invention is delivered into the cell and binds to a subunit of BAF155 or another BAF complex to act as a competitive inhibitor of BAF57 present in the cell, thereby lowering the expression level of BAF57 by the proteolytic mechanism and increasing the expression of BAF155 Can also be suppressed.
  • the fusion protein of the present invention can inhibit the activation of T cells and lower the expression level of inflammatory cytokines, thereby effectively preventing, ameliorating, or treating inflammatory diseases and immune-related diseases.
  • inflammatory diseases refers to inflammatory diseases such as TNF-a, IL-1, IL-6 and prostaglandin (hereinafter, referred to as " inflammatory diseases ") secreted from immune cells such as macrophages by excessive stimulation of the immune system due to harmful stimuli, prostaglandin, leukotriene, or inflammatory agents such as NO (inflammatory cytokines).
  • inflammatory diseases such as TNF-a, IL-1, IL-6 and prostaglandin (hereinafter, referred to as " inflammatory diseases ") secreted from immune cells such as macrophages by excessive stimulation of the immune system due to harmful stimuli, prostaglandin, leukotriene, or inflammatory agents such as NO (inflammatory cytokines).
  • inflammatory diseases in the present invention include asthma, eczema, psoriasis, allergies, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis, atopic dermatitis, acne, atopic rhinitis, lung inflammation, allergic dermatitis, chronic sinusitis, contact dermatitis ), Seborrheic dermatitis, gastritis, gout, gouty arthritis, ulcer, chronic bronchitis, Crohn's disease, ulcerative colitis, ankylosing spondylitis, sepsis, vasculitis, bursitis, rheumatism, multiple myalgia, temporal arteritis , Multiple sclerosis, solid tumors, Alzheimer ' s disease, arteriosclerosis, obesity or viral infection, and the like.
  • the "immune related disease” is a disease caused by transient activation and expression of various immune cells and inflammatory cells, for example, autoimmune diseases; Graft versus host disease; Or transplantation rejection of cells, tissues or organs; But are not limited thereto.
  • autoimmune disease refers to a disease caused by a problem in inducing self-tolerance or maintaining self-tolerance and causing an immune response to self-antigen, .
  • magnetic tolerance refers to immunologic unresponsiveness that does not react harmful to an antigenic substance constituting self.
  • autoimmune diseases in the present invention include rheumatoid arthritis, systemic scleroderma, systemic lupus erythematosus, atopic dermatitis, psoriasis, alopecia areata, asthma, Crohn's disease, Bechsiosis, Sjogren's syndrome, Hashimoto's thyroiditis, multiple sclerosis, multiple myositis, ankylosing spondylitis, fibroids, nodular polyarteritis, insulin-dependent diabetes mellitus, experimental autoimmune encephalomyelitis, experimental autoimmune arthritis, myasthenia gravis, experimental uveitis, primary mucinous adenoma, Anemia, autoimmune atrophic gastritis, Addison's disease, early menopause, male infertility, pediatric diabetes mellitus, Goodpasture syndrome, pemphigus vulgaris, pemphigus vulgaris, migraineuritis, autoimmune hemolytic anemia
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the fusion protein provided by the present invention as an active ingredient.
  • BAF57 plays an important role in gene expression of estrogen receptor and androgen receptor, which plays an important role in cancer development such as breast cancer and prostate cancer (THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281 , Cancer Res 2008; 68: (12) June 15, 2008), which is incorporated herein by reference in its entirety.
  • BAF155 is known to activate cancer stem cells such as liver cancer (Nature Communications volume 7, Article number: 13608 (2016)).
  • the fusion protein of the present invention is intracellularly transmitted to bind to a subunit of BAF155 or another BAF complex to act as a competitive inhibitor of BAF57 present in the cell, thereby lowering the expression level of BAF57 by proteolytic cleavage, Can also be suppressed. Accordingly, when the fusion protein of the present invention is used, cancer can be effectively prevented, improved or treated.
  • the cancer typically represents a physiological condition characterized by uncontrolled cell growth.
  • the cancer may be cancer of the ovary, colon, pancreas, stomach, liver, Lymphoma, hematologic cancer, bladder cancer, renal cancer, melanoma, colon cancer, bone cancer, skin cancer, head cancer, uterine cancer, rectal cancer, brain cancer, cancer of the liver, lung cancer, non-small cell lung cancer, prostate cancer, gallbladder cancer, Endometrioid cancer, adrenal cancer, soft tissue sarcoma, urethral cancer, penile cancer, ureteral cancer, renal cell carcinoma, renal pelvic carcinoma, central nervous system (CNS) CNS central nervous system) tumors, primary CNS lymphoma, spinal cord tumor, brainstem glioma, or pituitary adenoma.
  • CNS central nervous system
  • composition of the present invention may exhibit an adjuvant effect that is combined with other anticancer drugs to enhance the anticancer effect of the anticancer drugs.
  • the anticancer agent include nitrogene mustard, imatinib, oxaliplatin, rituximab, elotinib, neratib, lapatinib, zetitib, vandetanib, nilotinib, semathanib,
  • the present invention relates to the use of a compound of formula I as an active ingredient in a medicament for the treatment and / or prophylaxis of nausea, vomiting, diarrhea, nerves, cediranip, lestaurtinib, trastuzumab, gepetinib, bortezomib, sunitinib, parzapanib, toceranib, Cisplatin, cetuximab, biscum alum bromide, asparaginase, tretinoin, hydroxycarbamide, dasatini
  • Drazole, Tamoxifen, Tremem Pen, Tess Lactone, anastrozole, letrozole, but can use the rutile bikal imide, Romuald sustaining, barley no stats, no entity stat and at least one member selected from the group consisting of carboxylic estramustine, without being limited thereto.
  • prevention may include, without limitation, any action that blocks the symptoms of the disease or inhibits or delays the symptoms using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment can include without limitation any action that improves or alleviates symptoms of a disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be in the form of capsules, tablets, granules, injections, ointments, powders or beverages.
  • the pharmaceutical composition may be a human.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated into oral formulations, such as powders, granules, capsules, tablets, aqueous suspensions, etc., external preparations, suppositories and sterilized injection solutions according to a conventional method, .
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may comprise a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a binder, a lubricant, a disintegrant, an excipient, a solubilizing agent, a dispersing agent, a stabilizer, a suspending agent, a coloring matter, a perfume or the like in the case of oral administration.
  • a solubilizing agent, an isotonic agent, a stabilizer and the like may be mixed and used.
  • a base In the case of topical administration, a base, an excipient, a lubricant, a preservative and the like may be used.
  • Formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention may be prepared in various manners by mixing with pharmaceutically acceptable carriers as described above.
  • oral administration may be in the form of tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups, wafers, etc.
  • injections they may be formulated in unit dosage ampoules or in multiple dosage forms have.
  • suitable carriers, excipients and diluents for formulation include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltoditol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate or mineral oil. Further, it may further include a filler, an anticoagulant, a lubricant, a wetting agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, an antiseptic, and the like.
  • the route of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not limited to the oral route, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, Sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally depending on various factors including the activity, age, body weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, rate of excretion, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, And the dose of the pharmaceutical composition may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the condition of the patient, the body weight, the degree of disease, the type of administration, the route of administration and the period of time, and is preferably from 0.0001 to 50 mg / kg Or 0.001 to 50 mg / kg. The administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be formulated into pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, and suspensions.
  • a method of preventing or treating an inflammatory disease or an immune-related disease comprising administering the fusion protein or pharmaceutical composition of the present invention to a subject in need of treatment.
  • the subject in need of the treatment may be an inflammatory disease or an immune-related disease, or a subject suspected of having the symptoms.
  • the fusion protein and the pharmaceutical composition, the inflammatory disease and the immune-related disease are overlapped with each other as described above, and the description thereof will be omitted in order to avoid the excessive complexity of the specification.
  • a method of preventing or treating cancer comprising administering to a subject in need thereof a fusion protein or pharmaceutical composition of the present invention.
  • the fusion protein and the pharmaceutical composition and the cancer are omitted in the following description in order to avoid the excessive complexity of the specification.
  • the fusion protein provided by the present invention can effectively prevent, ameliorate, or treat various diseases such as inflammatory diseases, immune-related diseases or cancer.
  • Figure 1 is a graph showing the effect of BAF57 nocturnal protein, ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, And a BAF57-? PH recombinant fusion protein as a control group.
  • Figure 2 is a Western blot result of the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in Example 1;
  • FIG. 3 shows the results of analysis of the expression level of the recombinant fusion protein in cells after treatment of the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention in CD4 + T cells according to the concentration in Example 2.
  • FIG. 4 shows the result of analyzing the expression level of the recombinant fusion protein in cells after treatment of the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention with time in CD4 + T cells in Example 2.
  • FIG. 5 is a photograph showing the position of the recombinant fusion protein transferred into the cell using a confocal microscope after treating the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention with HeLa cells in Example 2 Lt; / RTI >
  • FIG. 6 shows the results of analysis of the survival rate of the ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in mouse CD4 + T cells according to the concentration in Example 3.
  • FIG. 6 shows the results of analysis of the survival rate of the ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in mouse CD4 + T cells according to the concentration in Example 3.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of analysis of the survival rate of the ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in Jurkat T cells treated at different concentrations in Example 3.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of analysis of the survival rate of the ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in Jurkat T cells treated at different concentrations in Example 3.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression levels of CD69, an early activation marker of T cells, after treatment of ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention after activating Naive CD4 + T cells in Example 4 The results are shown.
  • FIG. 9 shows the results of analysis of the expression level of CD25, which is an activation marker of T cells, after treatment of ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention after activating Na ⁇ ve CD4 + T cells in Example 4 .
  • FIG. 10 is a graph showing the results of analysis of the secretion amount of interleukin-2 in the cell culture after treatment of ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention after activating Na ⁇ ve CD4 + T cells in Example 4 will be.
  • FIG. 11 shows the results of analysis of CD69 expression level after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention after activation of Naive CD4 + T cells in Example 4.
  • FIG. 11 shows the results of analysis of CD69 expression level after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention after activation of Naive CD4 + T cells in Example 4.
  • FIG. 12 shows the results of analysis of the expression level of CD69 after activating naive CD4 + T cells in Example 4 and treating the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention with time.
  • FIG. 13 shows the result of analyzing the expression level of phosphorylated protein after treating and activating ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in Na ⁇ ve CD4 + T cells in Example 5.
  • FIG. 14 shows the results of analysis of the expression levels of phosphorylated ZAP70 and Erk after treating and activating ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in naive CD4 + T cells in Example 5.
  • FIG. 15 is a graph showing the expression levels of Erk and Akt and the expression levels of phosphorylated Erk and Akt after treatment and activation of ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention in Jurkat T cells in Example 5 .
  • FIG. 16 shows the results of analysis of NFAT1 expression level after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 6.
  • FIG. 16 shows the results of analysis of NFAT1 expression level after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 6.
  • FIG. 17 shows the results of analysis of the expression level of p65 after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 6.
  • FIG. 17 shows the results of analysis of the expression level of p65 after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 6.
  • FIG. 18 shows the results of analysis of c-Fos expression level after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention which activates naive CD4 + T cells in Example 6.
  • FIG. 19 shows the results of analysis of the expression level of phospho-c-Fos after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention which activates naive CD4 + T cells in Example 6.
  • FIG. 20 shows the results of analysis of the presence of the recombinant fusion protein in the precipitated BAF155 complex after treatment of ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention which activates naive CD4 + T cells in Example 7 .
  • FIG. 21 shows the results of analyzing the expression level of BAF57 in CD4 + T cells after treating ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 7.
  • FIG. 22 shows the results of analysis of the expression level of BAF57 in CD4 + T cells after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 7.
  • FIG. 22 shows the results of analysis of the expression level of BAF57 in CD4 + T cells after treatment of ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 7.
  • FIG. 23 shows the results of analysis of mRNA expression levels of BAF57 and BAF155 after treatment of ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention, which activates naive CD4 + T cells in Example 8.
  • FIG. 24 is a graph showing the results of activation of naive CD4 + T cells in Example 9, followed by treatment with a proteasome inhibitor MG132 or a lysosomal inhibitor NH 4 Cl together with an ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • a proteasome inhibitor MG132 or a lysosomal inhibitor NH 4 Cl together with an ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 26 shows an experimental design of an ntBAF57- [Delta] PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention for the LPS-induced septicemia mouse model of Example 10.
  • FIG. 27 shows the results of analysis of the survival rate after treatment of the ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention for the LPS-induced sepsis mouse model in Example 10.
  • FIG. 27 shows the results of analysis of the survival rate after treatment of the ntBAF57-.DELTA.HP recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention for the LPS-induced sepsis mouse model in Example 10.
  • FIG. 28 shows the results of analysis of TNF- ⁇ expression level in serum after treatment of ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention with respect to a mouse model of LPS-induced septicemia in Example 10.
  • FIG. 28 shows the results of analysis of TNF- ⁇ expression level in serum after treatment of ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention with respect to a mouse model of LPS-induced septicemia in Example 10.
  • FIG. 29 shows the results of analyzing the level of IL-1 beta expression in serum after treating the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention with respect to the LPS-induced sepsis mouse model in Example 10.
  • FIG. 29 shows the results of analyzing the level of IL-1 beta expression in serum after treating the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention with respect to the LPS-induced sepsis mouse model in Example 10.
  • FIG. 30 shows the results of the analysis of the ratio of spleen CD4 + CD69 + T cells after treatment of the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention with respect to the LPS-induced septicemia mouse model in Example 10 .
  • FIG. 31 shows the expression level of BAF57 protein in the spleen CD4 + CD69 + T cells after treatment of the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention for the LPS-induced sepsis mouse model in Example 10 The results are shown.
  • a part of BAF57 (BRG1 or HBRM-associated factors 57) protein a part of BAF57 (BRG1 or HBRM-associated factors 57) protein; And a protein delivery domain.
  • a part of the BAF57 protein is a protein having an HMG domain which is a DNA binding domain and a proline-rich domain which is an N-terminal part in the BAF57 protein 3, more preferably, it may be composed of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or may be encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the protein transport domain is selected from the group consisting of Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antnapedia, Pep-1, PTD- But are not limited to, MAP, K-FGF, penetratin, transportan, polyarginine, 11R, 7R and cytoplamic transduction peptide.
  • the protein transport domain may be Hph-1, preferably consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, or encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 .
  • the fusion protein may further include a tag for separation and purification.
  • the tag may be at least one of an affinity tag and an epitope tag.
  • the affinity tag may include a histidine tag, a glutathione transferase (GST), an Intein, a chitin binding protein (CBP), a maltose binding protein , MBP), avidin tag or streptavidin tag, and the epitope tag may be a FLAG tag, a Myc tag, a V5 tag, a HA tag (Hemagglutinin tag), a spot tag Spot tag) or an NE tag.
  • the tag may be a flag tag, preferably consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7, or encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 .
  • the fusion protein may be composed of the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 9 to 11.
  • composition for preventing or treating an inflammatory disease or an immune-related disease comprising the fusion protein of the present invention as an active ingredient.
  • composition for preventing or treating cancer comprising the fusion protein of the present invention as an active ingredient.
  • Recombinant DNA was prepared as shown in Fig. Specifically, the protein transport domain Hph-1 (SEQ ID NO: 3) was added to the N-terminus of the BAF57-PH domain (SEQ ID NO: 4) in which the HMG domain, which is the DNA binding domain of BAF57 and the proline- SEQ ID NO: 6) and FLAG tag (SEQ ID NO: 8) were fused to prepare recombinant DNA (ntBAF57-? PH; SEQ ID NO: 14). As a control, a recombinant DNA (BAF57-?
  • PH SEQ ID NO: 16 in which only the FLAG tag (SEQ ID NO: 8) was fused to the N-terminal of the BAF57-PH domain (SEQ ID NO: 4) was prepared.
  • These recombinant DNAs were cloned into the pET28a (+) plasmid and transformed into the BL21 Codon Plus (DE3) -RIPL strain. The transformed strains were cultured at 37 ° C., and then 1 mM IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside, Duchefa) was added and cultured at 37 ° C. for 6 hours.
  • a buffer for dissolution (10 mM imidazole, 300 mM NaCl, 50 mM NaH 2 PO 4, pH 8.0) over the cells for 10 minutes in a semi-mill after 4 °C released.
  • the supernatant was separated from the pulverized solution and Ni-NTA beads were mixed and allowed to bind at 4 ° C for 1 hour.
  • Proteins were identified by coomassie blue staining via SDS-PAGE to confirm the size and concentration of the purified protein (ntBAF57-? PH: SEQ ID NO: 11 / BAF57-? PH: SEQ ID NO: 15) Protein size and purity were analyzed using Western blot. The results are shown in Fig.
  • the protein was confirmed in the cells from when the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein was treated with CD4 + T cells for 1 hour, and the protein was present in the cells for 24 hours there was.
  • ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein 5 ⁇ 10 4 HeLa cells were treated with ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein for 1 hour and washed with PBS. The cells were then fixed with 4% formaldehyde and 0.2% Triton X-100 (Sigma Aldrich) and stained with anti-FLAG-FITC antibody. After that, DAPI staining was performed to intracellular nuclei staining, and the location of the recombinant fusion protein transferred into the cell was confirmed using a confocal microscope (Carl Zeiss), and the results are shown in FIG.
  • ntBAF57-? PH recombinant fusion protein produced by the method of Example 1 was transferred into cells and showed side effects due to cytotoxicity.
  • a cytotoxicity experiment was conducted. 1 ⁇ 10 5 mouse CD4 + T cells or Jurkat T cells were treated with ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein for 24 hours at a concentration (0.1 ⁇ M to 4 ⁇ M), treated with CCK-8 and incubated for 4 hours at 37 ° C. The cell viability was measured after culturing and the results are shown in FIGS. 6 and 7.
  • mice naive CD4 + T cells were extracted from spleen cells of normal C57BL / 6 mice and cultured with anti-CD3, CD28 antibody (BD Pharmingen; 2 [mu] g / ml).
  • ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein was treated with cells (1 ⁇ M to 4 ⁇ M), and the level of expression of CD69, an early marker of T cell activation, was determined by flow cytometry. 8.
  • mice naive CD4 + T cells were activated with anti-CD3, CD28 antibody
  • concentration (1 ⁇ M to 4 ⁇ M) was treated with concentration (1 ⁇ M to 4 ⁇ M) and cultured for 48 hours.
  • the cell culture medium was collected and the expression level of interleukin-2 was measured by interleukin-2 ELISA assay (eBioscience). The results are shown in FIG.
  • the treatment of the recombinant fusion protein was varied over time to confirm that T cell activation was inhibited. More specifically, when mouse naive CD4 + T cells were isolated and activated for 24 hours by anti-CD3 and CD28 antibodies, ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein was treated at different concentrations (1 ⁇ M to 4 ⁇ M) after 24 hours And the expression level of CD69 was confirmed using a flow cytometer.
  • CD4 + T cells 2 x 10 6 mouse naive CD4 + T cells were isolated and treated with ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein (1 ⁇ M or 4 ⁇ M) for 1 h at 37 ° C followed by anti-CD3, CD28 antibody (5 ⁇ g / ml) was bound to the cell surface at 4 ° C for 30 minutes and then the cells were activated at 37 ° C for 10 minutes. After 10 minutes, the cells were lysed with RIPA buffer and Western blot was performed using phospho tyrosine antibody (1: 1,000; Cell Signaling).
  • tBAF57-PH protein in human T cells in addition to mouse T cells, 2 x 10 6 Jurkat T cells were treated with ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein (1 ⁇ M or 4 ⁇ M) for 1 hour at 37 ° C Then, the anti-CD3 and CD28 antibodies were bound to the cells at 4 ° C for 30 minutes and then activated at 37 ° C for 10 minutes. The cells were then lysed with RIPA buffer and Western blot was performed using anti-Erk, Akt, phosphorylated Erk, and phosphorylated Akt antibody.
  • Example 5 the inhibitory effect of the CD3 and CD28 receptor sub-signaling mediators of T cells on inhibition of phosphorylation was confirmed. Similarly, the ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein was transfected with major transcription factors NFAT, NF-kB, and AP-1).
  • mouse naive CD4 + T cells were treated with anti-CD3, CD28 antibody (5 ⁇ g / ml) and treated with ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein (1 ⁇ M or 4 ⁇ M) and cyclosporin A at the same time ≪ / RTI > Cells were immobilized to measure the expression and phosphorylation of intracellular transcription factors, and anti-NFAT1, p65, c-Fos and phospho-cFos antibodies were added and the intracellular transcription factor Lt; / RTI > Expression levels of NFAT1, p65, c-Fos and phospho c-Fos were confirmed by flow cytometry and the results are shown in Figs.
  • ntBAF57- ⁇ PH recombinant fusion protein plays an important role in the T cell receptor sub-signaling system and regulates the expression of transcription factors, thereby suppressing the fundamental activation mechanism.
  • mouse naive CD4 + T cells were activated through anti-CD3, CD28 antibody, and at the same time, ntBAF57-? PH recombinant fusion protein was treated and cultured for 24 hours.
  • the cells were then lysed with RIPA buffer and bound with BAF155 at 4 ° C for 12 hours using anti-BAF155 antibody.
  • the antibody bound to BAF155 was immunoprecipitated via Protein A beads.
  • Western blot was performed using anti-FLAG antibody to confirm the presence of the ntBAF57-? PH recombinant fusion protein delivered in the precipitated BAF155 complex, and the results are shown in FIG.
  • ntBAF57-? PH recombinant fusion protein binds to BAF155 competitively with the BAF57 present in the cells to reduce the amount of BAF57 in the cells.
  • the following experiment was conducted. Concretely, nive CD4 + T cells were activated and ntBAF57-? PH recombinant fusion protein was simultaneously treated and cultured for 24 hours. To confirm the expression level of BAF57 in the cells, the cells were immobilized and anti-BAF57 antibody was injected to confirm the expression level in the cells.
  • mRNA expression levels of BAF57 and BAF155 were increased in CD3 / 28-activated T cells.
  • BAF57 and BAF155 There was no change in the mRNA expression level.
  • BAF155 binds to BAF57 in the cell and secures stability against the proteolytic mechanism.
  • BAF57 does not bind to BAF57, the protein is degraded by proteasome.
  • ntBAF57-PH recombinant fusion protein The proteolytic mechanism of BAF57 and BAF155 was confirmed by treatment. Specifically treated to na ⁇ ve CD4 + T the proteasome inhibitor MG132 in which the active or other proteolytic mechanism of lysosomal inhibitors NH 4 Cl cell along with ntBAF57 PH-recombinant fusion protein.
  • BAF57 expression level decreased when ntBAF57-PH recombinant fusion protein was treated.
  • expression level of BAF57 and activation marker CD69 was not changed in the expression levels of BAF57 and CD69 when treated with NH 4 Cl.
  • the expression level of BAF155 was decreased when ntBAF57-PH recombinant fusion protein was treated, but it was confirmed that the expression level of BAF155 was increased depending on the concentration in MG132-treated cells.
  • LPS was intraperitoneally injected at a dose of 15 mg / kg using 7-week-old C57BL / 6 female mice. After 2 hours and 12 hours, the ntBAF57-PH recombinant fusion protein prepared in Example 1 BAF57-PH recombinant fusion proteins were intraperitoneally injected at 25 ⁇ g and 100 ⁇ g, respectively. The survival rate of the mice was measured up to 144 hours, and the results are shown in Fig. 27.
  • TNF- ⁇ and IL-1 ⁇ which are inflammatory cytokines in mouse serum, were measured at 48 hours, , And the presence level of spleen T cells and the expression level of BAF57 protein were analyzed using a flow cytometer, and the results are shown in FIGS. 30 and 31, respectively.
  • the present invention relates to a novel recombinant fusion protein and a method for effectively preventing or treating an inflammatory disease, an immune-related disease or cancer using the recombinant fusion protein.
  • SEQ ID NO: 1 BAF57 full length amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 2 BAF57 full nucleotide sequence
  • SEQ ID NO: 3 BAF57 fragment amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 4 BAF57 fragment sequence
  • GAGCGCAGTC AGAGCAGCAT CGTTCCTGAG GAAGAACAAG CAGCTAACAA AGGCGAGGAG 600
  • AACAGTGCAA CAGTGGAGGA GCCACCAACA GATCCCATAC CAGAAGATGA GAAAAAAGAA
  • SEQ ID NO: 5 Hph-1 amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 6 Hph-1 base sequence
  • SEQ ID NO: 7 FLAG tag amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 8 FLAG tag sequence
  • SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of the recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of the recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention
  • SEQ ID NO: 11 The amino acid sequence of the recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention (ntBAF57- DELTA PH)
  • SEQ ID NO: 12 The nucleotide sequence of the recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention
  • SEQ ID NO: 13 The nucleotide sequence of the recombinant fusion protein according to one embodiment of the present invention
  • SEQ ID NO: 14 The nucleotide sequence (ntBAF57- DELTA PH) of the recombinant fusion protein according to an embodiment of the present invention
  • gaaattctta gtgagagtgt ggtgccagac gttcggtcag ttgtcacaac agctagaatg 420
  • SEQ ID NO: 15 As a comparative example, the amino acid sequence of the recombinant fusion protein (BAF57-? PH)
  • SEQ ID NO: 16 As a comparative example, the nucleotide sequence of the recombinant fusion protein (BAF57-? PH)

Abstract

본 발명은 신규한 BAF57 재조합 융합 단백질과 이의 용도로 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮출 수 있고, 이에 따라 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

BAF57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도
본 발명은 신규한 BAF57 재조합 융합 단백질과 이의 용도로 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
히스톤(histone)은, 사람을 비롯한 다세포 생물부터 진균류(곰팡이, 효모)로 대표되는 단세포 생물에 이르기까지, 진핵 세포의 핵 내에 공통으로 존재하고, 게놈 DNA와 이온 결합하는 염기성 단백질이다. 히스톤은 통상 5종류의 성분(H1, H2A, H2B, H3 및 H4)으로 이루어져 있고, 생물종을 초월하여 고도로 유사하다. 예컨대 히스톤 H4의 경우, 출아효모 히스톤 H4(전체 길이 102 아미노산 배열)와 사람 히스톤 H4(전체 길이 102 아미노산 배열)에서는 92%의 아미노산 배열이 일치하고, 차이는 겨우 8잔기 뿐이다. 생물 중에 수만 종류 존재하는 것으로 상정되고 있는 천연 단백질 중에서, 히스톤은 진핵 생물 종 간에서 가장 고도로 보존된 단백질인 것이 알려져 있다. 게놈 DNA는 이 히스톤과의 규칙적인 결합에 의해 포개져 있고, 양자의 복합체는 뉴클레오솜(nucleosome)이라는 기본적인 구조 단위를 형성한다. 그리고, 이 뉴클레오솜이 응집하는 것에 의해 염색체의 크로마틴 구조가 형성되어 있다. 히스톤은 히스톤테일이라고 불리는 N-말단 부분에서, 아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화 및 SUMO화 등의 수식을 받고, 크로마틴 구조를 유지 또는 특이적으로 구조 변환하는 것에 의해 유전자 발현, DNA 복제, DNA 수복 등의 염색체 DNA상에서 생기는 반응이 조절된다. 히스톤의 번역 후 수식은 후성적인 조절 메커니즘이고, 진핵세포의 유전자 조절에 대하여 필수로 생각되고 있다. 최근의 연구를 통해 뉴클레오좀 구조를 변형하여 전사인자와 DNA와의 접근을 촉진시키는 SWI/SNF, RSC, NURF, NRD 등과 같은 염색질 재형성 인자(chromatin remodeling factor), 히스톤의 아세틸화 상태를 조절하는 히스톤 아세틸전이효소(histone acetyltransferases, HATs)와 히스톤 디아세틸라제(HDACs)가 중요한 조절 인자로 작용함이 밝혀졌다(국내출원특허 10-2011-0081688).
한편, 히스톤의 아세틸화 리신에 결합하는 단백질의 도메인 구조로서 브로모도메인이 알려져 있다. 사람에서는 30여 종류의 브로모도메인 함유 단백질이 존재한다. 이러한 브로모도메인 함유 단백질 중 BAF 콤플렉스는 T 세포 발달 및 활성화 신호 전달에서 중요하다고 알려져 있는 염색체 리모델링 과정에 관여하는 다양한 염색체 리모델러 중에 하나인데, 이러한 리모델러는 ATP를 이용하여 염색체를 변화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. BAF 콤플렉스는 여러 서브 유닛(subunit)으로 이루어져 있으며, 이러한 서브 유닛 중 BRG1은 아세틸화 히스톤과 상호 작용하는 단백질로서 염색질 재형성 인자인 SWI/SNF 복합체의 핵심 구성 단백질로 잘 알려져 있고, T 세포 발달 및 활성화 신호 전달에서의 역할에 대해서는 많은 연구가 되고 있다. 그러나 다른 종류의 서브 유닛인 BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57)의 경우에는 T 세포 내 역할에 대해서 잘 알려지지 않은 실정이다.
본 발명의 일 목적은 신규한 BAF57 재조합 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 BAF57 재조합 융합 단백질을 이용하여 염증성 질환 또는 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 BAF57 재조합 단백질을 이용하여 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
명세서에서 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57) 단백질의 전부 또는 일부; 및 단백질 운반 도메인을 포함하는, 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등을 포함하는 포유류로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 BAF57 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 혹은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 BAF57 단백질의 일부는 상기 BAF57 단백질의 어느 일 단편을 의미하는 것으로, 구체적인 부위를 특별히 제한하지 않으나, BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스 서브 유닛(subunit)과 결합하여 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용할 수 있는 폴리펩티드 단편이라면 제한없이 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예시로 상기 BAF57 단백질의 일부는, 상기 BAF57 단백질에서 DNA-결합(DNA binding) 도메인인 HMG 도메인과 N-터미널(N-terminal) 부분인 프롤린 리치 (proline-rich) 도메인이 제거된 폴리펩티드 단편일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 단백질 운반 도메인은 7 ~ 50개의 아미노산으로 이루어져 있는 소수성이 강한 짧은 펩타이드로, 120 kDa 이상의 분자량을 단백질뿐만 아니라, DNA 또는 RNA를 세포 내로 전달할 수 있는 도메인을 의미하는 것으로, 예를 들면, Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), MAP, K-FGF, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포탄(transportan), 폴리아르기닌, 11R, 7R 및 CTP(cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 상기 "11R" 및 "7R"은 알기닌(arginine)이 각각 11개 및 7개로 구성된 펩타이드를 의미한다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서 상기 단백질 운반 도메인은 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부의 N-터미널(N-terminal) 또는 C-터미널(C-terminal)에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 N-터미널에 연결될 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 분리 및 정제를 위한 태그(tag)를 추가로 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag) 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 예시로 상기 친화성 태그는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 아비딘 태그(avidin tag) 또는 스트렙트아비딘 태그(streptavidin tag)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로 상기 에피토프 태그는 플래그 태그(FLAG tag), Myc 태그, V5 태그, HA 태그(Hemagglutinin tag), 스팟 태그(Spot tag) 또는 NE 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로서, 상기 태그는 플래그 태그일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 8로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예시로서 상기 태그는 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부의 N-터미널 또는 C-터미널에 연결될 수 있으며, 바람직하게는 N-터미널에 연결될 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예시로, 상기 융합 단백질은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮추고, BAF155의 발현이 증가되는 것 또한 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 핵산 분자는 본 발명에서 제공하는 융합 단백질의 아미노산 서열을 당업자에게 알려진 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열로 번역된 핵산 분자 모두를 포함한다. 그러므로 ORF(open reading frame)에 의한 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 제조될 수 있으며 이 또한 모두 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 바람직한 일 예시로 상기 핵산 분자는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 상기 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터를 제공한다.
본 발명에서 상기 "벡터"는 어떤 핵산 분자가 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 상기 핵산 분자이다. 벡터의 한 가지 유형은, 추가적인 DNA 세그멘트가 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA를 가리키는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 파지 벡터이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스성 벡터로, 추가적인 DNA 세그멘트가 바이러스 게놈에 결찰될 수 있다. 어떤 벡터들은 그들이 유입된 숙주세포에서 자율적인 복제를 할 수 있다(예컨대, 박테리아성 벡터는 박테리아성 복제 기원을 갖는 에피솜 포유류 벡터). 기타 벡터(예컨대, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주세포에 유입되면서 숙주세포의 게놈에 통합될 수 있고, 그럼으로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 어떤 벡터는 이들이 작동차원에서 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같은 벡터는 본원에서 "재조합 발현 벡터" 또는 단순히 "발현 벡터"라 명명된다. 일반적으로 재조합 DNA 기법에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다. 본 명세서에서, "플라스미드"와 "벡터"는, 플라스미드가 벡터 중 가장 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, 상호 교환하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 벡터의 구체적인 예시로는 상업적으로 널리 사용되는 pCDNA 벡터, F, R1, RP1, Col, pBR322, ToL, Ti 벡터; 코스미드; 람다, 람도이드(lambdoid), M13, Mu, p1 P22, Qμ, T-even, T2, T3, T7 등의 파아지; 식물 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 발현 벡터로 알려진 모든 발현 벡터는 본 발명에 사용 가능하고, 발현 벡터를 선택할 때에는 목적으로 하는 숙주 세포의 성질에 따른다. 숙주 세포로의 벡터 도입 시 인산칼슘 트랜스펙션, 바이러스 감염, DEAE-덱스트란 조절 트랜스펙션, 리포펙타민 트랜스펙션 또는 전기천공법에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며 당업자는 사용하는 발현 벡터 및 숙주 세포에 알맞은 도입 방법을 선택하여 이용할 수 있다. 바람직하게 벡터는 하나 이상의 선별 마커를 함유하나 이에 한정되지 않으며, 선별 마커를 포함하지 않은 벡터를 이용하여 생산물 생산 여부에 따라 선별이 가능하다. 선별 마커의 선택은 목적하는 숙주 세포에 의해 선별되며, 이는 이미 당업자에게 알려진 방법을 이용하므로 본 발명은 이에 제한을 두지 않는다.
본 발명의 핵산 분자를 정제를 용이하게 하기 위하여 태그 서열을 발현 벡터 상에 삽입하여 융합시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag) 중 적어도 하나일 수 있다.
본 발명의 일 예시로 상기 친화성 태그는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 아비딘 태그(avidin tag) 또는 스트렙트아비딘 태그(streptavidin tag)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로 상기 에피토프 태그는 플래그 태그(FLAG tag), Myc 태그, V5 태그, HA 태그(Hemagglutinin tag), 스팟 태그(Spot tag) 또는 NE 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다만, 본 발명에서 상기 태그는 상기 열거한 종류로 한정되는 것은 아니며 당업자에게 알려진 정제를 용이하게 하는 태그는 모두 본 발명에서 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 다르면, 본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명에서 상기 "숙주 세포"에는 폴리펩티드 삽입물의 편입을 위한 벡터(들)의 수령자(recipient)일 수 있거나 또는 수령자였던 개별적인 세포 또는 세포 배양물이 포함된다. 숙주 세포에는 단일 숙주 세포의 자손이 포함되고, 상기 자손은 자연적인, 우발적인 또는 고의의 돌연변이 때문에 반드시 원래 모세포와 완전히 동일(형태학상 또는 게놈 DNA 보완체에서)하지 않을 수 있다. 숙주 세포에는 본원의 폴리펩티드(들)로 체내에서 형질 주입된 세포가 포함된다.
본 발명에 있어서, 상기 숙주 세포로는 포유동물, 식물, 곤충, 균류 또는 세포성 기원의 세포를 포함할 수 있고, 예를 들면 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포, 피치아 파스 토리스 등의 균류 세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, Chinese hamster ovary cells), SP2/0(생쥐 골수종), 인간 림프아구(Human lymphoblastoid), COS, NSO(생쥐 골 수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, Baby Hamster Kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, Human Embryonic Kidney cells) 또는 PERC.6(인간 망막 세포)의 동물 세포; 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 숙주 세포로 사용 가능한 세포는 모두 이용 가능하다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮추고, BAF155의 발현이 증가되는 것 또한 억제할 수 있다. 또한, 본 발명의 융합 단백질은 T 세포의 활성화를 억제하고, 염증성 사이토카인의 발현 수준을 낮춰 염증성 질환 및 면역 관련 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 "염증성 질환"은 염증 유발 인자 또는 방사선 조사 등 유해한 자극으로 인해 면역 체계를 과도하게 항진시켜 대식 세포와 같은 면역 세포에서 분비되는 TNF-α, IL-1, IL-6, 프로스타글란딘(prostaglandin), 루코트리엔(leukotriene) 또는 NO와 같은 염증 유발 물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 의미한다. 본 발명에서 상기 염증성 질환의 예시로는 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비만 또는 바이러스 감염 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 "면역 관련 질환"은 다양한 면역 세포 및 염증 세포들의 과도화된 활성화 및 발현에 의하여 유도되는 질환으로, 예를 들면, 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식 거부 질환; 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 "자가면역질환"은 자기 관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 발생하여 자기항원에 대한 면역 반응이 일어나, 이로 인해 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는 과정에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 상기 자기 관용이란 자기(self)를 구성하고 있는 항원 물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness)을 말한다. 본 발명에서 상기 자가면역질환의 예시로는 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 결절성 다발성 동맥염, 인슐린-의존성 당뇨병, 실험적 자가면역 뇌척수염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 실험적 형태의 포도막염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 또는 원판상 LE 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에서 제공하는 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일반적으로 유방암 및 전립선 암 등의 암 발생에 중요한 역할을 수행하는 에스트로겐 수용체(estrogen receptor)와 안드로겐 수용체(androgen receptor)의 유전자 발현에 BAF57이 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 281, NO. 32, pp. 22656-22664, August 11, 2006; MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Mar. 2005, p. 2200-2215; Cancer Res 2008; 68: (12). June 15, 2008). 그 외에 BAF155가 간암 등의 암 줄기세포를 활성시킨다고 알려져 있다(Nature Communications volume 7, Article number: 13608 (2016)).
그런데 본 발명의 융합 단백질은 세포 내로 전달되어 BAF155 또는 다른 BAF 콤플렉스의 서브 유닛과 결합하여, 세포 내에 존재하는 BAF57의 경쟁적 저해제로써 작용함으로써 단백질 분해 기작에 의해 BAF57의 발현 수준을 낮추고, BAF155의 발현이 증가되는 것 또한 억제할 수 있다. 이에 따라, 본 발명의 융합 단백질을 사용하는 경우 암을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 상기 암은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리키는 것으로, 그 발생 부위에 따라 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 다른 항암제와 함께 병용 투여되어 항암제의 항암 효과를 증강시키는 어쥬번트 효과(adjuvant effect)를 나타낼 수 있다. 여기서 상기 항암제로는 나이트로젠 머스타드, 이마티닙, 옥살리플라틴, 리툭시맙, 엘로티닙, 네라티닙, 라파티닙, 제피티닙, 반데타닙, 니로티닙, 세마사닙, 보수티닙, 악시티닙, 마시티닙, 세디라닙, 레스타우르티닙, 트라스투주맙, 게피티니브, 보르테조밉, 수니티닙, 파조파닙, 토세라닙, 닌테다닙, 레고라페닙, 세막사닙, 티보자닙, 포나티닙, 카보잔티닙 카보플라틴, 소라페닙, 렌바티닙, 베바시주맙, 시스플라틴, 세툭시맙, 비스쿰알붐, 아스파라기나제, 트레티노인, 하이드록시카바마이드, 다사티닙, 에스트라머스틴, 겜투주맵오조가마이신, 이브리투모맙튜세탄, 헵타플라틴, 메칠아미노레불린산, 암사크린, 알렘투주맙, 프로카르바진, 알프로스타딜, 질산홀뮴 키토산, 젬시타빈, 독시플루리딘, 페메트렉세드, 테가푸르, 카페시타빈, 기메라신, 오테라실, 아자시티딘, 메토트렉세이트, 우라실, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 플루다가빈, 에노시타빈, 플루타미드, 케페시타빈, 데시타빈, 머캅토푸린, 티오구아닌, 클라드리빈, 카르모퍼, 랄티트렉세드, 도세탁셀, 파클리탁셀, 이리노테칸, 벨로테칸, 토포테칸, 비노렐빈, 에토포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 테니포시드, 독소루비신, 이다루비신, 에피루비신, 미톡산트론, 미토마이신, 블레로마이신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 피라루비신, 아클라루비신, 페프로마이신, 템시롤리무스, 테모졸로마이드, 부설판, 이포스파미드, 사이클로포스파미드, 멜파란, 알트레트민, 다카바진, 치오테파, 니무스틴, 클로람부실, 미토락톨, 레우코보린, 트레토닌, 엑스메스탄, 아미노글루테시미드, 아나그렐리드, 올라파립, 나벨빈, 파드라졸, 타목시펜, 토레미펜, 테스토락톤, 아나스트로졸, 레트로졸, 보로졸, 비칼루타미드, 로무스틴, 보리노스텟, 엔티노스텟 및 카르무스틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 본 발명에서, "예방"은 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상을 차단하거나, 그 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 질환의 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 경구 투여 시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다. 기타, 용액, 현탁액, 정제, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항 응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다.
본 발명에서 상기 "비경구"란, 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여 시간, 투여 경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약무 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 의약 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 융합 단백질 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 치료를 필요로 하는 대상은 염증성 질환 또는 면역 관련 질환이 있거나, 그 증상이 의심되는 개체일 수 있다.
본 발명에서 상기 융합 단백질 및 약학 조성물과 염증성 질환 및 면역 관련 질환은 앞서 기재한 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하의 기재에서는 생략한다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 치료를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 융합 단백질 또는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 융합 단백질 및 약학 조성물과 암은 앞서 기재한 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하의 기재에서는 생략한다.
본 발명에서 제공하는 융합 단백질은 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암 등의 다양한 질환을 효과적으로 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 BAF57 야행성 단백질, 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질; 및 대조군인 BAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 모식도를 나타낸 도면이다.
도 2는 실시예 1에서 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 웨스턴 블럿 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 실시예 2에서 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 세포 내 상기 재조합 융합 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 실시예 2에서 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 시간 별로 처리한 뒤 세포 내 상기 재조합 융합 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예 2에서 HeLa 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 공초점 현미경을 이용하여 상기 세포 내 전달된 상기 재조합 융합 단백질의 위치를 촬영한 사진을 나타낸 것이다.
도 6은 실시예 3에서 마우스 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 상기 세포의 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 실시예 3에서 Jurkat T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 상기 세포의 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 T 세포 초기 활성화 표지 마커인 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 뒤 T 세포의 활성화 마커인 CD25의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 후 세포 배양액 내 인터루킨-2의 분비량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별로 처리한 후 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 실시예 4에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 시간 별로 처리한 후 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 실시예 5에서 나이브 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하고 활성화시킨 뒤 인산화된 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 5에서 나이브 CD4+ T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하고 활성화시킨 뒤 인산화된 ZAP70 및 Erk의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 실시예 5에서 Jurkat T 세포에 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하고 활성화시킨 뒤 Erk 및 Akt의 발현 수준과, 인산화된 Erk 및 Akt의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 NFAT1의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 17은 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 p65의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 c-Fos의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 실시예 6에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 phospho c-Fos의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 실시예 7에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 침전된 BAF155 콤플렉스 내에 상기 재조합 융합 단백질이 존재하는 지 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 실시예 7에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 상기 CD4+ T 세포 내 BAF57의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 실시예 7에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 상기 CD4+ T 세포 내 BAF57의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 실시예 8에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시키며 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 BAF57 및 BAF155의 mRNA 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 실시예 9에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질과 함께 프로테아좀 억제제인 MG132 또는 리소좀 억제제인 NH4Cl을 처리한 후 CD69의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 25는 실시예 9에서 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 뒤 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질과 함께 프로테아좀 억제제인 MG132 또는 리소좀 억제제인 NH4Cl을 처리한 후 BAF155의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 26은 실시예 10의 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 실험 설계도를 나타낸 것이다.
도 27은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 생존율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 28은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 혈청 내 TNF-α의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 혈청 내 IL-1β의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 30은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 비장 내 CD4+CD69+ T 세포의 비율을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 실시예 10에서 LPS-유도 패혈증 마우스 모델에 대한 본 발명의 일 실시예에 따른 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 뒤 비장 내 CD4+CD69+ T 세포에서 BAF57 단백질의 발현 수준을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
본 발명의 바람직한 일 구현 예에 따르면, BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57) 단백질의 일부; 및 단백질 운반 도메인을 포함하는, 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 일 예시로 상기 BAF57 단백질의 일부는, 상기 BAF57 단백질에서 DNA-결합(DNA binding) 도메인인 HMG 도메인과 N-터미널(N-terminal) 부분인 프롤린 리치 (proline-rich) 도메인이 제거된 폴리펩티드 단편일 수 있고, 보다 바람직하게는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 4로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예시로 상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), MAP, K-FGF, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포탄(transportan), 폴리아르기닌, 11R, 7R 및 CTP(cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 예시로서, 상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 6으로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 예시로서, 상기 융합 단백질은 분리 및 정제를 위한 태그(tag)를 추가로 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag) 중 적어도 하나일 수 있다. 이때 상기 친화성 태그는 히스티틴 태그(histidine tag), 글루타치온 전이효소(glutathione s transferase, GST), 인테인(Intein), 키틴 결합 단백질(chitin binding protein, CBP), 말토스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP), 아비딘 태그(avidin tag) 또는 스트렙트아비딘 태그(streptavidin tag)일 수 있고, 상기 에피토프 태그는 플래그 태그(FLAG tag), Myc 태그, V5 태그, HA 태그(Hemagglutinin tag), 스팟 태그(Spot tag) 또는 NE 태그일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일 예시로서, 상기 태그는 플래그 태그일 수 있고, 바람직하게는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있고, 혹은 서열번호 8로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예시로, 상기 융합 단백질은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] BAF57의 기능 저해용 재조합 융합 단백질의 제작
하기 도 1과 같이 재조합 DNA를 제작하였다. 구체적으로는, BAF57의 DNA 결합 도메인인 HMG 도메인과 N-터미널 부분인 프롤린 리치 (proline-rich) 도메인을 제거한 BAF57-PH 도메인(서열번호 4)의 N-터미널에 단백질 운반 도메인인 Hph-1(서열번호 6)과 FLAG 태그(서열번호 8)를 융합시켜 재조합 DNA(ntBAF57-△PH; 서열번호 14)를 제작하였다. 또한 대조군으로 BAF57-PH 도메인(서열번호 4)의 N-터미널에 FLAG 태그(서열번호 8)만을 융합시킨 재조합 DNA(BAF57-△PH; 서열번호 16)를 제작하였다. 이들 재조합 DNA를 pET28a(+) 플라스미드에 클로닝한 뒤, BL21 Codon Plus (DE3)-RIPL 균주에 형질 전환 시켰다. 형질 전환된 균주를 37 ℃에서 배양한 후 1 mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, Duchefa)를 첨가하고 37 ℃에서 6 시간 동안 배양하였다. 6 시간 후 배양된 세포를 모아 용해용 완충액(10 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 풀어준 뒤 4 ℃에서 10 분간 분쇄기를 통해 세포를 분쇄시켰다. 분쇄된 용액에서 상층액을 분리하고 Ni-NTA 비드를 섞어 4 ℃에서 1 시간 동안 결합시켜주었다. 이후 비드와 결합된 용액을 컬럼(Poly-prep Chromatography Columns, BIO-RAD)에 첨가하고 세척용 완충액(30 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)으로 비특이적으로 결합한 단백질을 충분히 세척한 후 용출용 완충액 (250 mM 이미다졸, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)을 통해 재조합 단백질을 비드에서 분리하였다. 세포 실험에 적용하기 위해서 완충액 조성을 PBS로 변화시키고자 PD-10 컬럼(GE Healthcare)에 정제된 단백질을 넣어 10 % 글리세롤 PBS 완충액으로 단백질을 정제하였으며, 이 후 -80 ℃에 단백질을 저장하였다. 정제된 단백질(ntBAF57-△PH: 서열번호 11/ BAF57-△PH: 서열번호 15)의 사이즈와 농도를 확인하기 위해 SDS-PAGE를 통해 쿠마시 블루 염색으로 단백질을 확인하였으며, FLAG 태그를 이용하여 웨스턴 블럿을 이용하여 단백질의 크기 및 순도를 분석하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
[실시예 2] 재조합 융합 단백질의 세포 내 전달능 확인
1. 재조합 융합 단백질의 처리 농도 별 세포 내 전달능 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제작된 재조합 융합 단백질이 세포막을 세포질 및 세포의 핵 내로 전달되는지 확인하기 위해 106 개의 마우스 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별(0.5 μM ~ 4 μM)로 1 시간 동안 처리하고, 음성 대조군으로 BAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 4 μM의 농도로 처리하였다. 이후 세포 내에 존재하는 단백질의 양을 확인하기 위해 세포를 고정/투과 버퍼(fixation/permeabilization buffer)(eBioscience)를 통해 고정시킨 뒤 항 FLAG-FITC 항체(Sigma Aldrich)를 이용하여 염색하였다. 그리고 염색된 세포의 양을 확인하기 위해 FACS Calibur (BD Bioscience)를 이용하여 측정하였고, Flowjo V10 프로그램을 이용하여 분석하였다.
그 결과 도 3에서 보는 바와 같이 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 높은 농도로 처리할수록 세포 내 단백질의 발현 수준이 증가되는 것을 확인되었다. 하지만, 단백질 운반 도메인이 포함되지 않은 BAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 경우에는 세포 내로 단백질이 투과되지 못하는 것을 확인할 수 있었다.
2. 재조합 융합 단백질의 처리 시간 별 세포 내 전달능 확인
106 개의 마우스 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 시간 별(1 ~ 24 시간)로 처리하고, 상기 1.과 동일한 방법으로 세포 내 단백질의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 CD4+ T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 1 시간 동안 세포에 처리하였을 때부터 세포 내에서 단백질이 확인되었으며, 24 시간까지도 세포 내에 단백질이 존재하고 있음을 확인할 수 있었다.
3. 재조합 융합 단백질의 세포 내 위치 확인
이 후 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 세포 내 위치를 확인하기 위해서, 5 x 104 개의 HeLa 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 1시간 동안 처리한 뒤 PBS로 남은 단백질을 세척하였다. 이 후 4 % 포름알데히드와 0.2 % Triton X-100(Sigma Aldrich)을 이용하여 세포를 고정화시킨 뒤 항 FLAG-FITC 항체를 이용하여 단백질을 염색하였다. 그 이후 DAPI 염색을 통해 세포 내 핵을 염색한 뒤 공초점 현미경(Carl zeiss)을 이용하여 세포 내 전달된 재조합 융합 단백질의 위치를 확인하여 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이 세포 내로 전달된 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 대부분은 세포 내 핵으로 이동하여 위치하였으며, 일부 세포질 내에서도 관찰되었다.
[실시예 3] 재조합 융합 단백질의 세포 독성 확인
실시예 1의 방법으로 제작된 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 세포 내로 전달되어 세포 독성으로 인한 부작용을 나타내는지 확인하기 위하여, 세포 독성 실험을 실시하였다. 1 x 105 개의 마우스 CD4+ T 세포 또는 Jurkat T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별 (0.1 μM ~ 4 μM)로 24 시간 동안 처리한 뒤 CCK-8을 처리하고 4 시간 동안 37 ℃에서 배양한 뒤 세포 생존율을 측정하여 그 결과를 도 6 및 7에 나타내었다.
도 6 및 7에서 보는 바와 같이, 마우스 CD4+ T 세포 또는 Jurkat T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 최대 4 μM까지 처리하더라도 세포 생장에 영향이 없음을 확인할 수 있었다.
[실시예 4] T 세포 활성화 과정에서 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질의 기능 확인
1. T 세포 초기 활성화 표지 마커인 CD69의 발현 확인
상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 이용하여 T 세포 활성화 과정에서 BAF57의 기능을 확인하기 위하여, 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 정상 C57BL/6 마우스의 비장 세포로부터 추출하여 항 CD3, CD28 항체 (BD Pharmingen; 2 μg/ml)를 통해 활성화시켰다. 활성화와 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 세포에 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리한 뒤 12 시간 후 T 세포 초기 활성화 표지 마커인 CD69의 발현 수준을 유세포 분석기를 통해 확인하여 그 결과를 도 8에 나타내었다.
그 결과 도 8에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 CD69의 발현이 농도 의존적으로 현저히 낮아짐을 확인하였으며, 면역 억제제로 사용되고 있는 사이클로스포린 A(cyclosporin A)를 처리한 세포와 비슷한 정도로 활성화가 저해됨을 확인하였다.
2. T 세포 활성화 마커인 CD25 확인
또한 다른 T 세포 활성화 마커인 CD25의 발현 수준을 확인하기 위하여, 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체로 활성화시키는 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 세포에 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리한 뒤 48 시간 후 CD25의 발현 수준을 유세포 분석기를 통해 확인하여 그 결과를 도 9에 나타내었다.
그 결과 도 9에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 CD69와 마찬가지로 상기 재조합 융합 단백질의 농도 의존적으로 CD25의 발현이 감소하였으며, 사이클로스포린 A을 처리한 군에 비해 억제 효과가 더 높게 나타나는 것을 확인하였다.
3. T 세포 활성화에 의해 분비되는 인터루킨-2의 분비 억제 효과 확인
또한 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의해 T 세포 활성화에 의해 분비되는 인터루킨-2(interleukin-2; IL-2)의 분비가 억제되는지 확인하기 위해 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체로 활성화 신호를 제공하며, 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 그리고 세포 배양액을 모아 인터루킨-2 엘라이자 어세이 키트 (eBioscience)를 통해 인터루킨-2의 발현 수준을 측정해 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 인터루킨-2의 분비가 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었다.
4. T 세포 활성화 억제 기작 확인
상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의해 T 세포 활성화 신호가 어떠한 기작을 통해 억제되는지 확인하기 위하여, 상기 재조합 융합 단백질 처리를 시간 별로 다르게 해 T 세포의 활성화가 억제되는지 확인하였다. 구체적으로는 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 분리한 뒤 24시간 동안 항 CD3, CD28 항체를 통해 활성화시킨 후 24시간이 경과하였을 때에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 농도 별(1 μM ~ 4 μM)로 처리하고 유세포 분석기를 이용하여 CD69의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과 도 11에서 보는 바와 같이 T 세포의 활성화와 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하였을 때는 CD69의 발현이 억제되었지만, 24 시간 경과 후 상기 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 CD69의 발현이 억제되지 않는 것을 확인할 수 있었다.
또한, T 세포 활성화 신호가 빠른 시간 내에 전달된다는 기존 문헌을 참고하여, 상기 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 후 10 분, 30 분, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간 및 24 시간이 경과하였을 때에 상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 4 μM을 처리하고 유세포 분석기를 이용하여 CD69의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 T 세포의 활성화 신호 이후 빠르게 처리할수록 CD69의 발현 억제 효과가 더욱 크게 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과들을 통해 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화 억제 효과는 활성화 신호 초기에 발생하는 T 세포 수용기 근위 신호 전달이나 유전자 발현을 억제하는 것으로 예측할 수 있었다.
[실시예 5] ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화 신호 전달 단백질 인산화 저해 효과 확인
상기 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의한 T 세포 활성화 억제 효과의 기작을 확인하기 위해 초기 신호 전달 시스템에서 가장 중요한 역할을 하는 신호 전달 매개 단백질의 인산화를 확인하였다. T 세포의 CD3, CD28에 의해 자극이 주어지면 10분 이내에 신호 전달 단백질은 인산화를 통해 빠르게 세포 내부로 신호를 전달하며, 이로 인해 NFAT, NF-kB 및 AP-1과 같은 주요 전사 인자들이 발현하게 된다. 따라서 상기 실험을 통해 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 T 세포 활성화 초기에 억제 효과를 나타내었기 때문에 활성화 신호에 의한 타이로신 인산화에 영향이 있는지 확인하였다. 이를 위해 2 x 106 개의 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 분리하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM)을 1 시간 동안 37 ℃에서 처리한 뒤 항 CD3, CD28 항체 (5 μg/ml)을 4 ℃에서 30 분간 세포 표면에 결합시킨 후 37 ℃에서 10 분간 세포를 활성화하였다. 10 분 뒤 세포를 RIPA 완충액을 통해 용해시켜준 뒤 항 포스포 티로신(phospho tyrosine) 항체 (1:1,000; Cell Signaling)를 이용하여 웨스턴 블럿을 진행하였다.
그 결과 도 13에서 보는 바와 같이, 나이브 CD4+ T 세포에 비해 활성화된 T 세포의 경우 인산화된 단백질이 상당히 증가됨을 확인할 수 있었는데, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 또는 사이클로스포린 A를 처리할 경우 인산화 단백질의 양이 감소하여 활성화가 저해됨을 확인할 수 있었다.
또한, T 세포 활성화 과정에서 가장 중요한 신호 전달 단백질로 알려진 ZAP70와 Erk의 인산화 정도를 비교해 보았다. 구체적으로는 2 x 106 개의 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 분리하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM)을 1 시간 동안 37 ℃에서 처리한 뒤 항 CD3, CD28 항체 (5 μg/ml)을 4 ℃에서 30 분간 세포 표면에 결합시킨 후 37 ℃에서 10 분간 세포를 활성화하고, 이후 RIPA 완충액을 이용하여 세포를 용해시킨 뒤 항 인산화 ZAP70, 인산화 Erk 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
그 결과 도 14에서 보는 바와 같이, 항 CD3, CD28 항체를 이용하여 활성화한 T 세포에 비하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 또는 사이클로스포린 A를 처리한 경우 인산화된 ZAP70, Erk의 양이 감소됨을 확인할 수 있었다.
마우스 T 세포 이외에도 인간 T 세포에서도 tBAF57-PH 단백질의 효과가 나타나는지 확인하기 위해 2 x 106개의 Jurkat T 세포에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM)을 1 시간 동안 37 ℃에서 처리한 뒤 항 CD3, CD28 항체를 4 ℃에서 30 분간 세포에 결합시킨 뒤 37 ℃에서 10분간 활성화시켰다. 이후 RIPA 완충액을 이용하여 세포를 용해시킨 뒤 항 Erk, Akt, 인산화 Erk, 인산화 Akt 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 수행하였다.
도 15에서 보는 바와 같이, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질에 의해 인산화 되지 않은 Erk 및 Akt의 발현 수준에는 변화가 없었지만, 인산화된 Erk, Akt의 경우 활성화된 T 세포에 비해 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 또는 사이클로스포린 A를 처리한 군에서 그 발현 수준이 상당히 감소함을 확인할 수 있었다.
[실시예 6] T 세포 활성화 및 증식에 관련된 전사 인자의 발현 억제 확인
상기 실시예 5에서 T 세포의 CD3, CD28 수용체 하위 신호 전달체의 인산화의 억제 효과를 확인하였고, 이와 동일하게 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 T 세포 활성화 및 증식에 관련된 단백질을 전사시키는 주요 전사인자 (NFAT, NF-kB, AP-1)의 발현 또는 기능을 하기 위한 인산화에는 어떠한 영향을 미치는 지 확인하였다. 구체적으로, 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체 (5 μg/ml)를 통해 활성화한 뒤 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질 (1 μM 또는 4 μM) 및 사이클로스포린 A를 처리하고 24 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이 후 세포 내 전사 인자의 발현 및 인산화를 측정하기 위해 세포를 고정화시킨 뒤 항 NFAT1, p65, c-Fos 및 phospho c-Fos 항체를 넣고 APC 형광이 표지된 2차 항체를 통해 세포 내 전사 인자를 염색하였다. 유세포 측정기를 통해 NFAT1, p65, c-Fos 및 phospho c-Fos의 발현 수준을 확인하여 그 결과를 도 16 내지 19에 나타내었다.
도 16 내지 19에서 보는 바와 같이, 활성화가 진행된 T 세포에 비하여 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 NFAT1, p65, c-Fos 및 phospho c-Fos의 발현 수준이 나이브 T 세포에서 발현하는 수준 정도까지 감소하였으며, 사이클로스포린 A를 처리한 경우와 유사한 발현 수준을 나타내었다.
상기 결과를 통하여, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 T 세포 수용체 하위 신호 전달 체계에서 중요한 역할을 하고 있으며, 전사 인자의 발현까지 조절하여 근본적인 활성화 기작을 억제하고 있음을 알 수 있었다.
[실시예 7] tBAF57-PH 단백질 및 세포 내부 BAF 콤플렉스의 관계
BAF57이 세포 내에서 또 다른 BAF 콤플렉스 서브 유닛인 BAF155와 결합하여 단백질 안정성을 확보해 결합하지 못할 경우, 프로테아좀에 의해 BAF57의 단백질이 분해되는 지 확인하기 위하여, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 다른 BAF 콤플렉스 서브 유닛과의 상호 작용을 통해 BAF 콤플렉스의 형성을 경쟁적으로 억제하는지 확인하였다.
1. BAF155의 발현 억제 확인
구체적으로 마우스 나이브 CD4+ T 세포를 항 CD3, CD28 항체를 통해 활성화시키고, 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이 후 RIPA 완충액을 통해 세포를 용해시키고, 항 BAF155 항체를 이용하여 12 시간 동안 4 ℃에서 세포 내 BAF155와 결합시킨 뒤 단백질 A(Protein A) 비드를 통해 BAF155와 결합한 항체를 면역 침전시켰다. 침전된 BAF155 콤플렉스 내에 전달한 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 존재하는지 확인하기 위해 항 FLAG 항체를 이용해서 웨스턴 블럿을 수행하고 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20에서 보는 바와 같이 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포 내에서만 FLAG가 감지됨을 확인하였다. 또한 BAF155 발현 수준의 경우 나이브 T 세포에 비하여 활성화시킨 T 세포에서 BAF155가 높은 수준으로 발현되었으나, ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리하자 BAF155의 발현 수준이 증가하지 못한 것을 확인할 수 있었다.
2. BAF57의 발현 억제 확인
또한 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질이 세포 내에 존재하는 BAF57와 경쟁적으로 BAF155에 결합하여 세포 내 BAF57의 양이 감소됨을 확인하기 위하여 이하의 실험을 수행하였다. 구체적으로는 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킴과 동시에 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 동시에 처리하여 24 시간 동안 배양하였다. 이 후 세포 내 BAF57의 발현 수준을 확인하기 위해 세포를 고정화한 뒤 항 BAF57 항체를 주입하여 세포 내 발현 수준을 확인하였다.
그 결과 도 21 및 22에서 보는 바와 같이 활성화 신호를 준 뒤 1일 만에 세포 내 BAF57의 발현 수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그런데 ntBAF57-△PH 재조합 융합 단백질을 처리한 군에서 세포 내 BAF57의 발현 수준이 감소함을 확인할 수 있었다.
[실시예 8] ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의한 BAF57 mRNA 및 BAF155 mRNA의 발현 수준의 증감 확인
ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의해 세포 내 BAF57 또는 BAF155 단백질의 발현 수준이 감소하는 효과가 유전자 수준에서의 감소에 의한 것인지 확인하기 위하여, 나이브 CD4+ T 세포, 1일간 활성화된 T 세포 및 활성화 시 2 μM의 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서 TRIzol을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이 후 MMLV 역전사 효소(reverse transcriptase)를 이용하여 단일 가닥 cDNA(single strand cDNA)를 합성한 뒤 Ex Taq 폴리머레이즈를 이용하여 RT-PCR을 진행하였다 (95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초간 40 사이클 진행). 사용한 프라이머의 시퀀스는 하기 표 1과 같다. 이 후 전기 영동을 통해 젤을 이용하여 밴드를 확인하였다.
그 결과 도 23에서 보는 바와 같이, CD3/28에 의해 활성화된 T 세포에서는 BAF57 및 BAF155의 mRNA 발현 수준이 증가하였는데, 상기 실시예 7에서와는 달리 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 세포에서는 BAF57 및 BAF155의 mRNA 발현 수준에는 아무런 변화가 없었다.
프라이머 종류 서열
BAF57 정방향 프라이머 5'-TATGCCCCACCTCCCAC-3'
BAF57 역방향 프라이머 5'-GGTCAGGGTTGGAAGCC-3'
BAF155 정방향 프라이머 5'-GGTGCTAGTGCTGGAAGG-3'
BAF155 역방향 프라이머 5'-CAGTGCTCATCACCGGG-3'
GAPDH 정방향 프라이머 5'-AACTTTGGCATTGTGGAAGG-3'
GAPDH 역방향 프라이머 5'-ACACATTGGGGGTAGGAAC-3'
[실시예 9] ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의한 세포 내 BAF57 및 BAF155 단백질 분해 메카니즘 확인
기존의 연구에서 BAF155 단백질이 세포 내에서 BAF57과 결합하여 단백질 분해 기작에 대해 안정성을 확보하며, BAF57과 결합하지 않는 경우 프로테아좀에 의해 단백질이 분해된다는 결과를 통해, ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질의 처리에 따른 BAF57 및 BAF155의 단백질 분해 기작을 확인하였다. 상세하게는 나이브 CD4+ T 세포를 활성화시킨 상태에서 프로테아좀 억제제인 MG132 또는 다른 단백질 분해 기작인 리소좀 억제제인 NH4Cl을 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질과 함께 처리하였다.
그 결과 도 24에서 보는 바와 같이 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 BAF57의 발현 수준이 감소하였으나, MG132를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 BAF57의 발현 수준과 활성화 마커인 CD69의 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, NH4Cl을 처리하였을 경우 BAF57과 CD69의 발현 수준에 변화가 없었다.
또한, 도 25에서 보는 바와 같이, ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 BAF155의 발현 수준이 감소하였으나, MG132를 처리한 세포에서는 농도에 의존적으로 BAF155의 발현 수준이 증가함을 확인할 수 있었다.
따라서 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의해 BAF57 및 BAF155 단백질이 분해되는 기작은 프로테아좀에 의해 분해되는 것임을 알 수 있었다.
[실시예 10] ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질에 의한 LPS-유도 패혈증(sepsis) 모델의 치료 효과 확인
인 비트로(in vitro)에서 T 세포의 활성화를 강하게 억제하는 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질의 효능을 인 비보(in vivo)에서도 확인하기 위해 LPS 감염에 의해 나타나는 패혈증(sepsis) 마우스 모델을 이용하였다. 도 26에서 나타낸 바와 같이 7주령 C57BL/6 암컷 마우스를 이용하여 15 mg/kg의 용량으로 LPS를 복강 내 주사한 뒤 2 시간, 12 시간 째에 실시예 1에서 제작한 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질 및 BAF57-PH 재조합 융합 단백질을 각각 25 μg, 100 μg씩 복강 내 주사하였다. 이 후 144 시간까지 마우스의 생존율을 측정하여 그 결과를 도 27에 나타내었고, 48 시간 째에 마우스 혈청 내 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 농도를 측정하여 그 결과를 도 28 및 29에 나타내었으며, 유세포 분석기를 이용하여 비장 내 T 세포의 존재 수준과 BAF57 단백질의 발현 수준을 분석하여 그 결과를 각각 도 30 및 31에 나타내었다.
도 27에서 보는 바와 같이 패혈증 마우스 모델에 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 결과 마우스의 생존율이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 28 및 29에서 보는 바와 같이, 패혈증 마우스 모델에 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 혈청 내 TNF-α 및 IL-1b의 농도가 상당히 낮아짐을 확인할 수 있었다.
또한, 도 30 및 31에서 보는 바와 같이, 패혈증 마우스 모델에 ntBAF57-PH 재조합 융합 단백질을 처리한 경우 마우스의 비장 내 CD4+CD69+ T 세포의 비율이 상기 재조합 융합 단백질의 농도 의존적으로 감소하였고, CD4+ T 세포 내 BAF57 단백질의 발현 수준 또한 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술 하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명은 신규한 재조합 융합 단백질과 이를 이용하여 염증성 질환, 면역 관련 질환 또는 암을 효과적으로 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
서열번호 1: BAF57 전장 아미노산 서열
MSKRPSYAPP PTPAPATQMP STPGFVGYNP YSHLAYNNYR LGGNPGTNSR VTASSGITIP 60
KPPKPPDKPL MPYMRYSRKV WDQVKASNPD LKLWEIGKII GGMWRDLTDE EKQEYLNEYE 120
AEKIEYNESM KAYHNSPAYL AYINAKSRAE AALEEESRQR QSRMEKGEPY MSIQPAEDPD 180
DYDDGFSMKH TATARFQRNH RLISEILSES VVPDVRSVVT TARMQVLKRQ VQSLMVHQRK 240
LEAELLQIEE RHQEKKRKFL ESTDSFNNEL KRLCGLKVEV DMEKIAAEIA QAEEQARKRQ 300
EEREKEAAEQ AERSQSSIVP EEEQAANKGE EKKDDENIPM ETEETHLEET TESQQNGEEG 360
TSTPEDKESG QEGVDSMAEE GTSDSNTGSE SNSATVEEPP TDPIPEDEKK E
서열번호 2: BAF57 전장 염기 서열
atgtcaaaaa gaccatctta tgccccacct cccaccccag ctcctgcaac acaaatgccc 60
agcacaccag ggtttgtggg atacaatcca tacagtcatc tcgcctacaa caactacagg 120
ctgggaggga acccgggcac caacagccgg gtcacggcat cctctggtat cacgattcca 180
aaacccccaa agccaccaga taagccgctg atgccctaca tgaggtacag cagaaaggtc 240
tgggaccaag taaaggcttc caaccctgac ctaaagttgt gggagattgg caagattatt 300
ggtggcatgt ggcgagatct cactgatgaa gaaaaacaag aatatttaaa cgaatacgaa 360
gcagaaaaga tagagtacaa tgaatctatg aaggcctatc ataattcccc cgcgtacctt 420
gcttacataa atgcaaaaag tcgtgcagaa gctgctttag aggaagaaag tcgacagaga 480
caatctcgca tggagaaagg agaaccgtac atgagcattc agcctgctga agatccagat 540
gattatgatg atggcttttc aatgaagcat acagccaccg cccgtttcca gagaaaccac 600
cgcctcatca gtgaaattct tagtgagagt gtggtgccag acgttcggtc agttgtcaca 660
acagctagaa tgcaggtcct caaacggcag gtccagtcct taatggttca tcagcgaaaa 720
ctagaagctg aacttcttca aatagaggaa cgacaccagg agaagaagag gaaattcctg 780
gaaagcacag attcatttaa caatgaactt aaaaggttgt gcggtctgaa agtagaagtg 840
gatatggaga aaattgcagc tgagattgca caggcagagg aacaggcccg caaaaggcag 900
gaggaaaggg agaaggaggc cgcagagcaa gctgagcgca gtcagagcag catcgttcct 960
gaggaagaac aagcagctaa caaaggcgag gagaagaaag acgacgagaa cattccgatg 1020
gagacagagg agacacacct tgaagaaaca acagagagcc aacagaatgg tgaagaaggc 1080
acgtctactc ctgaggacaa ggagagtggg caggaggggg tcgacagtat ggcagaggaa 1140
ggaaccagtg atagtaacac tggctcggag agcaacagtg caacagtgga ggagccacca 1200
acagatccca taccagaaga tgagaaaaaa gaa
서열번호 3: BAF57 단편 아미노산 서열
AYHNSPAYLA YINAKSRAEA ALEEESRQRQ SRMEKGEPYM SIQPAEDPDD YDDGFSMKHT 60
ATARFQRNHR LISEILSESV VPDVRSVVTT ARMQVLKRQV QSLMVHQRKL EAELLQIEER 120
HQEKKRKFLE STDSFNNELK RLCGLKVEVD MEKIAAEIAQ AEEQARKRQE EREKEAAEQA 180
ERSQSSIVPE EEQAANKGEE KKDDENIPME TEETHLEETT ESQQNGEEGT STPEDKESGQ 240
EGVDSMAEEG TSDSNTGSES NSATVEEPPT DPIPEDEKKE
서열번호 4: BAF57 단편 염기 서열
GCCTATCATA ATTCCCCCGC GTACCTTGCT TACATAAATG CAAAAAGTCG TGCAGAAGCT 60
GCTTTAGAGG AAGAAAGTCG ACAGAGACAA TCTCGCATGG AGAAAGGAGA ACCGTACATG 120
AGCATTCAGC CTGCTGAAGA TCCAGATGAT TATGATGATG GCTTTTCAAT GAAGCATACA 180
GCCACCGCCC GTTTCCAGAG AAACCACCGC CTCATCAGTG AAATTCTTAG TGAGAGTGTG 240
GTGCCAGACG TTCGGTCAGT TGTCACAACA GCTAGAATGC AGGTCCTCAA ACGGCAGGTC 300
CAGTCCTTAA TGGTTCATCA GCGAAAACTA GAAGCTGAAC TTCTTCAAAT AGAGGAACGA 360
CACCAGGAGA AGAAGAGGAA ATTCCTGGAA AGCACAGATT CATTTAACAA TGAACTTAAA 420
AGGTTGTGCG GTCTGAAAGT AGAAGTGGAT ATGGAGAAAA TTGCAGCTGA GATTGCACAG 480
GCAGAGGAAC AGGCCCGCAA AAGGCAGGAG GAAAGGGAGA AGGAGGCCGC AGAGCAAGCT 540
GAGCGCAGTC AGAGCAGCAT CGTTCCTGAG GAAGAACAAG CAGCTAACAA AGGCGAGGAG 600
AAGAAAGACG ACGAGAACAT TCCGATGGAG ACAGAGGAGA CACACCTTGA AGAAACAACA 660
GAGAGCCAAC AGAATGGTGA AGAAGGCACG TCTACTCCTG AGGACAAGGA GAGTGGGCAG 720
GAGGGGGTCG ACAGTATGGC AGAGGAAGGA ACCAGTGATA GTAACACTGG CTCGGAGAGC 780
AACAGTGCAA CAGTGGAGGA GCCACCAACA GATCCCATAC CAGAAGATGA GAAAAAAGAA
서열번호 5: Hph-1 아미노산 서열
YARVRRRGPR R
서열번호 6: Hph-1 염기 서열
tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgc
서열번호 7: FLAG tag 아미노산 서열
DYKDDDDK
서열번호 8: FLAG tag 염기 서열
gactacaagg acgacgatga caag
서열번호 9: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열
YARVRRRGPR RAYHNSPAYL AYINAKSRAE AALEEESRQR QSRMEKGEPY MSIQPAEDPD 60
DYDDGFSMKH TATARFQRNH RLISEILSES VVPDVRSVVT TARMQVLKRQ VQSLMVHQRK 120
LEAELLQIEE RHQEKKRKFL ESTDSFNNEL KRLCGLKVEV DMEKIAAEIA QAEEQARKRQ 180
EEREKEAAEQ AERSQSSIVP EEEQAANKGE EKKDDENIPM ETEETHLEET TESQQNGEEG 240
TSTPEDKESG QEGVDSMAEE GTSDSNTGSE SNSATVEEPP TDPIPEDEKK E
서열번호 10: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열
YARVRRRGPR RDYKDDDDKA YHNSPAYLAY INAKSRAEAA LEEESRQRQS RMEKGEPYMS 60
IQPAEDPDDY DDGFSMKHTA TARFQRNHRL ISEILSESVV PDVRSVVTTA RMQVLKRQVQ 120
SLMVHQRKLE AELLQIEERH QEKKRKFLES TDSFNNELKR LCGLKVEVDM EKIAAEIAQA 180
EEQARKRQEE REKEAAEQAE RSQSSIVPEE EQAANKGEEK KDDENIPMET EETHLEETTE 240
SQQNGEEGTS TPEDKESGQE GVDSMAEEGT SDSNTGSESN SATVEEPPTD PIPEDEKKE
서열번호 11: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열(ntBAF57-△PH)
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASGYARVRR RGPRRGDYKD DDDKEFGAYH NSPAYLAYIN 60
AKSRAEAALE EESRQRQSRM EKGEPYMSIQ PAEDPDDYDD GFSMKHTATA RFQRNHRLIS 120
EILSESVVPD VRSVVTTARM QVLKRQVQSL MVHQRKLEAE LLQIEERHQE KKRKFLESTD 180
SFNNELKRLC GLKVEVDMEK IAAEIAQAEE QARKRQEERE KEAAEQAERS QSSIVPEEEQ 240
AANKGEEKKD DENIPMETEE THLEETTESQ QNGEEGTSTP EDKESGQEGV DSMAEEGTSD 300
SNTGSESNSA TVEEPPTDPI PEDEKKE
서열번호 12: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 염기 서열
tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgcgcctatc ataattcccc cgcgtacctt 60
gcttacataa atgcaaaaag tcgtgcagaa gctgctttag aggaagaaag tcgacagaga 120
caatctcgca tggagaaagg agaaccgtac atgagcattc agcctgctga agatccagat 180
gattatgatg atggcttttc aatgaagcat acagccaccg cccgtttcca gagaaaccac 240
cgcctcatca gtgaaattct tagtgagagt gtggtgccag acgttcggtc agttgtcaca 300
acagctagaa tgcaggtcct caaacggcag gtccagtcct taatggttca tcagcgaaaa 360
ctagaagctg aacttcttca aatagaggaa cgacaccagg agaagaagag gaaattcctg 420
gaaagcacag attcatttaa caatgaactt aaaaggttgt gcggtctgaa agtagaagtg 480
gatatggaga aaattgcagc tgagattgca caggcagagg aacaggcccg caaaaggcag 540
gaggaaaggg agaaggaggc cgcagagcaa gctgagcgca gtcagagcag catcgttcct 600
gaggaagaac aagcagctaa caaaggcgag gagaagaaag acgacgagaa cattccgatg 660
gagacagagg agacacacct tgaagaaaca acagagagcc aacagaatgg tgaagaaggc 720
acgtctactc ctgaggacaa ggagagtggg caggaggggg tcgacagtat ggcagaggaa 780
ggaaccagtg atagtaacac tggctcggag agcaacagtg caacagtgga ggagccacca 840
acagatccca taccagaaga tgagaaaaaa gaa
서열번호 13: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 염기 서열
tatgcacgtg ttcggaggcg tggaccccgc cgcgactaca aggacgacga tgacaaggcc 60
tatcataatt cccccgcgta ccttgcttac ataaatgcaa aaagtcgtgc agaagctgct 120
ttagaggaag aaagtcgaca gagacaatct cgcatggaga aaggagaacc gtacatgagc 180
attcagcctg ctgaagatcc agatgattat gatgatggct tttcaatgaa gcatacagcc 240
accgcccgtt tccagagaaa ccaccgcctc atcagtgaaa ttcttagtga gagtgtggtg 300
ccagacgttc ggtcagttgt cacaacagct agaatgcagg tcctcaaacg gcaggtccag 360
tccttaatgg ttcatcagcg aaaactagaa gctgaacttc ttcaaataga ggaacgacac 420
caggagaaga agaggaaatt cctggaaagc acagattcat ttaacaatga acttaaaagg 480
ttgtgcggtc tgaaagtaga agtggatatg gagaaaattg cagctgagat tgcacaggca 540
gaggaacagg cccgcaaaag gcaggaggaa agggagaagg aggccgcaga gcaagctgag 600
cgcagtcaga gcagcatcgt tcctgaggaa gaacaagcag ctaacaaagg cgaggagaag 660
aaagacgacg agaacattcc gatggagaca gaggagacac accttgaaga aacaacagag 720
agccaacaga atggtgaaga aggcacgtct actcctgagg acaaggagag tgggcaggag 780
ggggtcgaca gtatggcaga ggaaggaacc agtgatagta acactggctc ggagagcaac 840
agtgcaacag tggaggagcc accaacagat cccataccag aagatgagaa aaaagaa
서열번호 14: 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 융합 단백질의 염기 서열(ntBAF57-△PH)
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagcg gctatgcacg tgttcggagg cgtggacccc gccgcggcga ctacaaggac 120
gacgatgaca aggaattcgg agcctatcat aattcccccg cgtaccttgc ttacataaat 180
gcaaaaagtc gtgcagaagc tgctttagag gaagaaagtc gacagagaca atctcgcatg 240
gagaaaggag aaccgtacat gagcattcag cctgctgaag atccagatga ttatgatgat 300
ggcttttcaa tgaagcatac agccaccgcc cgtttccaga gaaaccaccg cctcatcagt 360
gaaattctta gtgagagtgt ggtgccagac gttcggtcag ttgtcacaac agctagaatg 420
caggtcctca aacggcaggt ccagtcctta atggttcatc agcgaaaact agaagctgaa 480
cttcttcaaa tagaggaacg acaccaggag aagaagagga aattcctgga aagcacagat 540
tcatttaaca atgaacttaa aaggttgtgc ggtctgaaag tagaagtgga tatggagaaa 600
attgcagctg agattgcaca ggcagaggaa caggcccgca aaaggcagga ggaaagggag 660
aaggaggccg cagagcaagc tgagcgcagt cagagcagca tcgttcctga ggaagaacaa 720
gcagctaaca aaggcgagga gaagaaagac gacgagaaca ttccgatgga gacagaggag 780
acacaccttg aagaaacaac agagagccaa cagaatggtg aagaaggcac gtctactcct 840
gaggacaagg agagtgggca ggagggggtc gacagtatgg cagaggaagg aaccagtgat 900
agtaacactg gctcggagag caacagtgca acagtggagg agccaccaac agatcccata 960
ccagaagatg agaaaaaaga atag
서열번호 15: 비교예로서 재조합 융합 단백질의 아미노산 서열(BAF57-△PH)
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASDYKDDDD KEFGAYHNSP AYLAYINAKS RAEAALEEES 60
RQRQSRMEKG EPYMSIQPAE DPDDYDDGFS MKHTATARFQ RNHRLISEIL SESVVPDVRS 120
VVTTARMQVL KRQVQSLMVH QRKLEAELLQ IEERHQEKKR EFLESTDSFN NELKRLCGLK 180
VEVDMEKIAA EIAQAEEQAR KRQEEREKEA AEQAERSQSS IVPEEEQAAN KGEEKKDDEN 240
IPMETEETHL EETTESQQNG EEGTSTPEDK ESGQEGVDSM AEEGTSDSNT GSESNSATVE 300
EPPTDPIPED EKKE
서열번호 16: 비교예로서 재조합 융합 단백질의 염기 서열(BAF57-△PH)
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagcg actacaagga cgacgatgac aaggaattcg gagcctatca taattccccc 120
gcgtaccttg cttacataaa tgcaaaaagt cgtgcagaag ctgctttaga ggaagaaagt 180
cgacagagac aatctcgcat ggagaaagga gaaccgtaca tgagcattca gcctgctgaa 240
gatccagatg attatgatga tggcttttca atgaagcata cagccaccgc ccgtttccag 300
agaaaccacc gcctcatcag tgaaattctt agtgagagtg tggtgccaga cgttcggtca 360
gttgtcacaa cagctagaat gcaggtcctc aaacggcagg tccagtcctt aatggttcat 420
cagcgaaaac tagaagctga acttcttcaa atagaggaac gacaccagga gaagaagagg 480
gaattcctgg aaagcacgga ttcatttaac aatgaactta aaaggttgtg cggtctgaaa 540
gtagaagtgg atatggagaa aattgcagct gagattgcac aggcagagga acaggcccgc 600
aaaaggcagg aggaaaggga gaaggaggcc gcagagcaag ctgagcgcag tcagagcagc 660
atcgttcctg aggaagaaca agcagctaac aaaggcgagg agaagaaaga cgacgagaac 720
attccgatgg agacagagga gacacacctt gaagaaacaa cagagagcca acagaatggt 780
gaagaaggca cgtctactcc tgaggacaag gagagtgggc aggagggggt cgacagtatg 840
gcagaggaag gaaccagtga tagtaacact ggctcggaga gcaacagtgc aacagtggag 900
gagccaccaa cagatcccat accagaagat gagaaaaaag aatag

Claims (22)

  1. BAF57(BRG1 or HBRM-associated factors 57) 단백질의 전부 또는 일부; 및 단백질 운반 도메인을 포함하는, 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 BAF57 단백질은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 융합 단백질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 BAF57 단백질은 서열번호 2로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것인, 융합 단백질.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 BAF57 단백질의 일부는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 융합 단백질.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 BAF57 단백질의 일부는 서열번호 4로 표시되는 염기 서열에 의해 암호화되는 것인, 융합 단백질.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 운반 도메인은 Hph-1, Mph-1, Sim-2, Tat, VP22, Antp(antennapedia), Pep-1(peptide-1), PTD-5(protein transduction domain-5), MAP, K-FGF, 페네트라틴(penetratin), 트랜스포탄(transportan), 폴리아르기닌, 11R, 7R 및 CTP(cytoplamic transduction peptide)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 융합 단백질.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 운반 도메인은 상기 BAF57 단백질의 전부 또는 일부의 N-터미널(N-terminal)에 연결되는 융합 단백질.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 분리 및 정제를 위한 태그(tag)를 추가로 더 포함하는, 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 태그는 친화성 태그(affinity tag) 및 에피토프 태그(epitope tag) 중 적어도 하나인, 융합 단백질.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 융합 단백질은 서열번호 9 내지 11 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 핵산 분자는 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 것인, 핵산 분자.
  13. 제11항의 핵산 분자가 삽입된 발현 벡터.
  14. 제13항의 발현 벡터가 형질 전환된 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 천식, 습진, 건선, 알러지, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 아토피성 피부염, 여드름, 아토피성 비염, 폐염증, 알레르기성 피부염, 만성 부비동염, 접촉성 피부염(contact dermatitis), 지루성 피부염(seborrheic dermatitis), 위염, 통풍, 통풍 관절염, 궤양, 만성 기관지염, 크론병, 궤양성 대장염, 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 패혈증, 맥관염, 활액낭염, 루프스, 류마티스 다발성 근육통, 측두 동맥염, 다발성 경화증, 고형암, 알츠하이머병, 동맥경화증, 비만 또는 바이러스 감염인, 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 면역 관련 질환은 자가면역질환; 이식편대숙주 질환; 또는 세포, 조직 또는 기관의 이식 거부 질환;인, 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 자가면역질환은 류마티스성 관절염, 전신성 경피증, 전신 홍반성 낭창, 아토피 피부염, 건선, 원형탈모증, 천식, 크론씨병, 베체시병, 쇼그렌 증후군, 길리아-바레 증후군, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 다발성 근염, 강직성 척추염, 섬유조직염, 결절성 다발성 동맥염, 인슐린-의존성 당뇨병, 실험적 자가면역 뇌척수염, 실험적 자가면역 관절염, 중증 근무력증, 실험적 형태의 포도막염, 원발성 점액수종, 갑상샘 중독증, 악성 빈혈, 자가면역 위축 위염, 애디슨 질환, 조기 폐경, 남성 불임증, 소아 당뇨병, 굿파스처 증후군, 보통 천포창, 유천포창, 교감성 안염, 수정체성 포도막염, 자가면역 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소, 원발성 담관 경화증, 만성 활동성 간염 Hbs-ve, 잠재성 간경변증, 궤양성 대장염, 경피증, 베게너 육아종증, 다발근육염/피부근육염 또는 원판상 LE인, 약학 조성물.
  19. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 유효 성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 암은 난소암, 대장암, 췌장암, 위암, 간암, 유방암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종인, 약학 조성물.
  21. 치료를 필요로 하는 대상에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 또는 면역 관련 질환의 예방 또는 치료 방법.
  22. 치료를 필요로 하는 대상에게 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 융합 단백질을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
PCT/KR2018/016903 2017-12-28 2018-12-28 Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도 WO2019132610A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/728,216 US11345729B2 (en) 2017-12-28 2019-12-27 Recombinant fusion protein of BAF57 and uses thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2017-0181969 2017-12-28
KR20170181969 2017-12-28

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US16/728,216 Continuation US11345729B2 (en) 2017-12-28 2019-12-27 Recombinant fusion protein of BAF57 and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2019132610A1 true WO2019132610A1 (ko) 2019-07-04

Family

ID=67067952

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2018/016903 WO2019132610A1 (ko) 2017-12-28 2018-12-28 Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR102315997B1 (ko)
WO (1) WO2019132610A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114920816A (zh) * 2022-06-06 2022-08-19 孙英贤 Baf155突变基因及其制药用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002356436A (ja) * 2000-06-20 2002-12-13 Switch Biotech Ag 皮膚障害および創傷治癒の診断または処置ならびに薬理活性物質の同定のためのポリペプチドまたは核酸の使用
KR20120115913A (ko) * 2011-04-11 2012-10-19 이화여자대학교 산학협력단 Ｂｒｇ－１ 유래의 브로모도메인 또는 이의 단편, 또는 이를 코드화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는, 암세포 방사선 치료용 방사선 민감제 조성물

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008008923A2 (en) * 2006-07-12 2008-01-17 Oncotx, Inc. Compositions and methods for targeting cancer-specific transcription complexes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002356436A (ja) * 2000-06-20 2002-12-13 Switch Biotech Ag 皮膚障害および創傷治癒の診断または処置ならびに薬理活性物質の同定のためのポリペプチドまたは核酸の使用
KR20120115913A (ko) * 2011-04-11 2012-10-19 이화여자대학교 산학협력단 Ｂｒｇ－１ 유래의 브로모도메인 또는 이의 단편, 또는 이를 코드화하는 핵산을 유효성분으로 포함하는, 암세포 방사선 치료용 방사선 민감제 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE NUCLEOTIDE 15 July 2006 (2006-07-15), ANONYMOUS: "Homo sapiens SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1, mRNA (cDNA clone MGC:14622 IMAGE:4076036), complete cds", XP055623120, retrieved from NCBI Database accession no. BC007082 *
DATABASE PROTEIN 25 July 2016 (2016-07-25), ANONYMOUS: "Homo sapiens SWI/SNF related, matrix associated, actin dependent regulator of chromatin, subfamily e, member 1, partial [synthetic construct]", XP055623112, retrieved from NCBI Database accession no. AAP36982 *
WANG, L. ET AL.: "The BRGl-and hBRM-associated Factor BAF57 Induces Apoptosis by Stimulating Expression of the Cylindromatosis Tumor Suppressor Gene", MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, vol. 25, no. 18, September 2005 (2005-09-01), pages 7953 - 7965, XP055623109 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114920816A (zh) * 2022-06-06 2022-08-19 孙英贤 Baf155突变基因及其制药用途
CN114920816B (zh) * 2022-06-06 2024-04-05 孙英贤 Baf155突变基因及其制药用途

Also Published As

Publication number Publication date
KR102315997B1 (ko) 2021-10-25
KR20190080814A (ko) 2019-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017034335A1 (en) Improved cell-permeable (icp)-socs3 recombinant protein and uses thereof
WO2011142514A1 (ko) Pias3을 유효성분으로 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2017003267A1 (ko) 항바이러스 활성 효능을 가지는 펩티드 및 이를 포함하는 조성물
WO2016032209A2 (ko) 야누스인산화효소 억제제로서의 치환된 n-(피롤리딘-3-일)-7h-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
WO2018208011A2 (ko) β-아밀로이드 단백질의 응집을 억제하는 생체친화적 펩타이드
EP4010340A1 (en) Fused ring heteroaryl compounds as ripk1 inhibitors
WO2020222461A1 (ko) 면역항암 보조제
EP3337815A1 (en) Cell-permeable (cp)- socs3 recombinant protein and uses thereof
WO2019132610A1 (ko) Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도
WO2018004065A1 (ko) 신규한 아릴에텐 유도체 및 이를 유효성분으로 함유하는 약제학적 조성물
WO2022197100A1 (ko) 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물
WO2023080765A1 (ko) 신규 옥사다이아졸 유도체 및 이의 용도
WO2021194228A1 (ko) 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021066573A1 (ko) 신규 화합물 및 이의 자가면역질환 치료 용도
WO2011155643A1 (ko) 포그 ２ 다섯 번째 징크 핑거 도메인을 포함하는 포스파티딜이노시톨３키나아제 활성 조절제
WO2023043269A1 (ko) 면역반응을 조절하기 위한 약학적 조성물
WO2021100897A1 (ko) 바이구아나이드 계열, 및 페로센 또는 페로센 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019231262A1 (ko) 신규 바이페닐 유도체 화합물 및 이의 용도
WO2023043271A1 (ko) 암 치료용 cage 저해제에 대한 반응자 특성화 방법
WO2015026170A1 (ko) 세포괴사 저해제로서의 인돌 화합물
WO2022203219A1 (ko) 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022065899A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 다발성 경화증의 치료 용도
WO2022139493A1 (ko) TGF-β 신호전달을 억제할 수 있는 신규한 펩타이드 및 이의 용도
WO2022177307A1 (ko) 벤즈이미다졸 유도체를 유효 성분으로 포함하는 인터페론 유전자 자극제 조성물
WO2022035302A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체를 포함하는 혈압 강하용 약학 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18894018

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 18894018

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1