WO2022203219A1 - 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
Definitions
- the present invention relates to a novel oligopeptide analog compound of AQTGTGKT, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same as an active ingredient, and a method for preparing the same.
- cancer is still an important disease that competes as the first and second cause of death in Korea.
- Most of the currently used anticancer drugs are chemotherapy, which is pointed out as a problem in cancer treatment because pharmacological actions vary depending on the type of cancer and side effects due to toxicity vary.
- the antibody has problems such as concerns about immune response and low efficiency of infiltration into tissues.
- the molecular weight is small, so unlike antibodies, there is less concern about an immune response, easy penetration into tissues, and peptide-based anticancer drugs that target tumor antigens can selectively act on tumors. It is expected that there will be few side effects such as damage to cells.
- it is only used for very limited carcinomas, and in particular, it is decomposed within a short time immediately after administration to humans and it is difficult to exert its effect.
- amidation, esterification, acylation, acetylation, PEGylation, cyclization, or alkylation of a peptide It is possible to improve the yield, increase in vivo activity, increase the affinity of the peptide for the receptor, delay the degradation of the protein, etc. by modifying it by There is a risk that it may lose its in vivo activity or cause unexpected side effects. Therefore, studies on modification of peptides to minimize these negative effects and maximize the desired effects are being actively conducted.
- the present invention has been devised to solve the problems of the prior art as described above, and the anticancer effect and half-life in the blood of the oligopeptide AQTGTGKT (alanine-glutamine-threonine-glycine-threonine-glycine-lysine-threonine) is further improved.
- the present invention has been completed.
- the amidation analog compound of the AQTGTGKT peptide had an excellent anticancer effect and an increased half-life.
- A is alanine
- Q is glutamine
- T is threonine
- G is glycine
- K is lysine
- Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, comprising the compound represented by the above general formula as an active ingredient.
- Another object of the present invention is to provide a method for preparing a compound represented by the above general formula.
- the present invention provides a compound represented by the following general formula:
- A is alanine
- Q is glutamine
- T is threonine
- G is glycine
- K is lysine
- the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer, comprising a compound represented by the following general formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient:
- A is alanine
- Q is glutamine
- T is threonine
- G is glycine
- K is lysine
- the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering a compound represented by the general formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual in need thereof.
- the compound may be administered in an effective amount.
- the present invention provides the use of the compound represented by the above general formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof for preventing, improving or treating cancer.
- the present invention provides the use of the compound represented by the above general formula or a pharmaceutically acceptable salt thereof for producing a medicament for the treatment of cancer.
- the cancer may be a cancer selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, blood cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, and combinations thereof, but is not limited thereto.
- the lung cancer may be non-small cell lung cancer, but is not limited thereto.
- the hematologic cancer may be selected from the group consisting of leukemia, lymphoma, multiple myeloma, and combinations thereof, but is not limited thereto.
- X is
- At least one selected from the group consisting of, the cancer may be lung cancer, but is not limited thereto.
- At least one selected from the group consisting of, the cancer may be breast cancer, but is not limited thereto.
- the cancer may be a blood cancer, but is not limited thereto.
- At least one selected from the group consisting of, the cancer may be pancreatic cancer, but is not limited thereto.
- At least one selected from the group consisting of, the cancer may be colorectal cancer, but is not limited thereto.
- X is In the case of , the compound may have a half-life in human blood of 100 to 150 minutes, but is not limited thereto.
- the compound may have a half-life in human blood of 45 minutes to 70 minutes, but is not limited thereto.
- X is In another embodiment of the present invention, X is In the case of , the compound may have a half-life in human blood of 20 to 30 minutes, but is not limited thereto.
- the present invention also provides a method for preparing an oligopeptide X-AQTGTGKT comprising the steps of:
- A is alanine
- Q is glutamine
- T is threonine
- G is glycine
- K is lysine
- the present invention relates to a novel analog compound of the oligopeptide AQTGTGKT, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same as an active ingredient, and a method for preparing the same, wherein the analog of the oligopeptide AQTGTGKT exhibits excellent anticancer effects, and It was confirmed that it was stably present in the blood.
- the pharmaceutical composition according to the present invention has a smaller molecular weight than an antibody, which is an advantage of an oligopeptide, so there is less concern about an immune response, and in addition to being easy to penetrate into the tissue, the effect of inhibiting the proliferation of cancer cells is more excellent, and the human It is expected that it can be used as a useful anticancer agent to treat cancer because it exhibits the effect of being stably present in the blood.
- FIG. 1 to 7 are diagrams showing the results of UPLC-MS (top) and 1 H NMR (bottom) for identifying the compound according to the present invention and confirming the structure of the compound
- FIG. 1 is 4-PhPh-AQTGTGKT
- FIG. 2 is Ac-AQTGTGKT
- FIG. 3 is 3-PhPh-AQTGTGKT
- FIG. 4 is 4-MeOPh-AQTGTGKT
- FIG. 5 is 2-PhPh-AQTGTGKT
- FIG. 6 is Ph-AQTGTGKT
- FIG. 7 is the measurement result of Naphthyl-AQTGTGKT it has been shown
- FIG. 8 is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the compound treatment of the present invention in lung cancer cell line H1299 by CTG assay ( * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001; same).
- FIG. 9 is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the compound treatment of the present invention in the lung cancer cell line H1975 by CTG assay.
- FIG. 10 is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the compound of the present invention in the lung cancer (papillary adenocarcinoma) cell line H820 by MTT assay.
- Figure 11a is a diagram showing the results of analysis by CTG assay on the cell activity inhibition effect of the compound treatment of the present invention in the breast cancer cell line MDA-MB-231.
- 11B is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the treatment with the compound of the present invention in the breast cancer cell line HCC1937 by MTT assay.
- FIG. 12 is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the compound treatment of the present invention in the hematological cancer cell line Jurkat clone E6-1 by MTT assay.
- FIG. 13 is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the compound treatment of the present invention in the pancreatic cancer cell line CFPAC-1 by MTT assay.
- FIG. 14 is a diagram showing the results of analyzing the cell activity inhibitory effect of the compound of the present invention in the colorectal cancer cell line HT29 by MTT assay.
- 15 is a diagram showing the results of analysis of tumor growth inhibition according to the compound treatment of the present invention after inoculation of the lung cancer cell line H820 into nude mice to form tumors.
- Figure 16 is a diagram showing the results of analysis of tumor growth inhibition according to the compound treatment of the present invention after inoculation of the lung cancer cell line H1975 into nude mice to form tumors.
- 17 is a diagram showing the results of analysis of tumor growth inhibition by treatment with the compound of the present invention after inoculation of the breast cancer cell line HCC1806 into mice to form tumors.
- FIG. 18 is a diagram showing the results of analysis of tumor growth inhibition according to treatment with the compound of the present invention by inoculating a colorectal cancer cell line CT26 into a mouse to form a tumor, measuring the tumor volume.
- 19 to 26 are diagrams showing the results of measuring the residual amount of each compound according to the present invention over time in human blood.
- the present inventors newly synthesized amidation analogs of the oligopeptide AQTGTGKT, confirmed that they exhibit excellent anticancer effects (see Example 2) and excellent stability in blood (see Example 3).
- the invention was completed. Accordingly, the present invention can provide a compound represented by the following general formula:
- A is alanine
- Q is glutamine
- T is threonine
- G is glycine
- K is lysine
- X is
- the present invention may provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer, comprising the compound represented by the above general formula as an active ingredient.
- the present invention may provide a method for preventing or treating cancer comprising administering to an individual a compound represented by the above general formula.
- prevention refers to any action that blocks, suppresses, or delays symptoms caused by cancer by administering the composition according to the present invention.
- treatment refers to any action in which symptoms of cancer are improved or beneficially changed by administration of the composition according to the present invention.
- the term "subject" refers to a subject in need of prevention or treatment of a disease.
- the subject can be a human or a mammal, including non-human primates, mice, dogs, cats, horses, sheep and cattle.
- oligopeptide refers to a linear molecule formed by bonding amino acid residues to each other by peptide bonds.
- the oligopeptide of the present invention can be prepared according to chemical synthesis methods known in the art (eg, solid-phase synthesis techniques) along with molecular and biological methods (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111 (1984)).
- the scope of the compound according to the present invention may also include a pharmaceutically acceptable salt thereof.
- pharmaceutically acceptable means that the benefit/risk ratio is reasonable without undue toxicity, irritation, allergic reaction, or other problems or complications, so that it is suitable for use in contact with the tissues of a subject (eg, a human). Suitable and means a compound within the scope of sound medical judgment.
- the pharmaceutically acceptable salts include, for example, acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids and pharmaceutically acceptable metal salts.
- the scope of the compound according to the present invention may include biologically functional equivalents having a mutation in the amino acid sequence exhibiting biological activity equivalent to that of the compound of the present invention.
- Such amino acid sequence variation can be made based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge and size, and the like.
- alanine and glycine have similar sizes; Lysine is a positively charged residue; It can be seen that glutamine and threonine are not charged. Therefore, based on these considerations, alanine and glycine; And glutamine and threonine can be said to be biologically functional equivalents.
- the hydropathic index of the amino acid may be considered.
- Each amino acid is assigned a hydrophobicity index according to its hydrophobicity and charge as follows: isoleucine (+4.5); valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine (+2.5); methionine (+1.9); alanine (+1.8); glycine (-0.4); threonine (-0.7); serine (-0.8); tryptophan (-0.9); tyrosine (-1.3); proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamic acid (-3.5); glutamine (-3.5); aspartic acid (-3.5); asparagine (-3.5); lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
- the hydrophobic amino acid index is very important in conferring an interactive biological function of a protein. It is a known fact that amino acids having a similar hydrophobicity index must be substituted to retain similar biological activity. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, the substitution is made between amino acids showing a difference in the hydrophobicity index, preferably within ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
- the substitution is made between amino acids that show a difference in the hydrophilicity value within preferably ⁇ 2, more preferably within ⁇ 1, and even more preferably within ⁇ 0.5.
- Amino acid exchanges in proteins that do not entirely alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).
- the most commonly occurring exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly.
- the protein of the amino acid sequence (AQTGTGKT) of the compound represented by the general formula of the present invention is interpreted as including a sequence showing substantial identity thereto.
- the substantial identity is at least when the sequence of the present invention and any other sequences are aligned to correspond as much as possible, and the aligned sequence is analyzed using an algorithm commonly used in the art. It means a sequence that exhibits 62.5% homology, more preferably 75% or more homology, and most preferably 87.5% or more homology. Alignment methods for sequence comparison are known in the art.
- the pharmaceutical composition of the present invention is used for the prevention or treatment of cancer.
- Cancers for which the pharmaceutical composition of the present invention can be used may be cancers selected from the group consisting of lung cancer, breast cancer, blood cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, and combinations thereof, but is not limited thereto.
- the lung cancer may be non-small cell lung cancer, but is not limited thereto.
- the compound according to the present invention may be for the treatment of lung cancer in T790M mutation-positive patients, EGFR m - patients, and/or Osimertinib-resistant patients, but is not limited thereto.
- the breast cancer may be Hormone receptor (HR) positive breast cancer, but is not limited thereto.
- the breast cancer may be triple negative breast cancer, but is not limited thereto.
- the hematologic cancer may be a hematologic cancer selected from the group consisting of leukemia, lymphoma, multiple myeloma, and combinations thereof, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition according to the present invention exhibits excellent anticancer activity against lung cancer, breast cancer, blood cancer, pancreatic cancer and colorectal cancer (see Example 2).
- the pharmaceutical composition when used for the prevention or treatment of lung cancer, it contains a compound represented by the general formula X-AQTGTGKT as an active ingredient, wherein X is
- It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition when used for the prevention or treatment of breast cancer, it contains a compound represented by the general formula X-AQTGTGKT as an active ingredient, wherein X is
- It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition when used for the prevention or treatment of hematologic cancer, it contains a compound represented by the general formula X-AQTGTGKT as an active ingredient, wherein X is
- It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition when used for the prevention or treatment of pancreatic cancer, it contains a compound represented by the general formula X-AQTGTGKT as an active ingredient, wherein X is
- It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
- the pharmaceutical composition when used for the prevention or treatment of colorectal cancer, it contains a compound represented by the general formula X-AQTGTGKT as an active ingredient, wherein X is
- It may be one or more selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
- the compounds represented by the general formula according to the present invention can be stably present in human blood and have an improved half-life compared to AQTGTGKT (see Example 3). Therefore, the results of the above examples show that the compounds according to the present invention have improved anticancer effect and stability.
- X is In the case of , the half-life of the compound in human blood may be 20 minutes or more, but is not limited thereto.
- the half-life is, for example, 20 minutes to 30 minutes, 21 minutes to 30 minutes, 22 minutes to 30 minutes, 23 minutes to 30 minutes, 24 minutes to 30 minutes, 25 minutes to 30 minutes, 26 minutes to 30 minutes, 27 minutes.
- the half-life may be 1900% to 2900% increased compared to the half-life of AQTGTGKT, but is not limited thereto.
- the increase rate is for example 1900% to 2700%, 2000% to 2700%, 2100% to 2700%, 2200% to 2700%, 2300% to 2700%, 2400% to 2700%, 2500% to 2700%, 2600 % to 2700%, 1900% to 2600%, 2000% to 2600%, 2100% to 2600%, 2100% to 2500%, 2100% to 2400%, 2100% to 2300%, 2100% to 2200%, 2200% to 2700%, 2200% to 2600%, 2200% to 2500%, 2200% to 2400%, 2200% to 2300%, 2300% to 2700%, 2300% to 2500%, 2400% to 2700%, 2400% to 2600% , or 2500% to 2700%, and the like.
- the half-life in human blood of the compound may be 45 minutes or more, but is not limited thereto.
- the half-life is for example 45 minutes to 70 minutes, 46 minutes to 70 minutes, 47 minutes to 70 minutes, 48 minutes to 70 minutes, 49 minutes to 70 minutes, 50 minutes to 70 minutes, 51 minutes to 70 minutes, 53 minutes. to 70 minutes, 55 minutes to 70 minutes, 57 minutes to 70 minutes, 59 minutes to 70 minutes, 65 minutes to 70 minutes, 45 minutes to 65 minutes, 50 minutes to 65 minutes, 55 minutes to 65 minutes, 60 minutes to 65 minutes minutes, 45 minutes to 60 minutes, 50 minutes to 60 minutes, 55 minutes to 60 minutes, 45 minutes to 55 minutes, 50 minutes to 55 minutes, or 60 minutes to 70 minutes, and the like.
- the half-life may be increased by 4400% to 6900% compared to the half-life of AQTGTGKT, but is not limited thereto.
- the increase rate is for example 4400% to 6900%, 4500% to 6900%, 4600% to 6900%, 4700% to 6900%, 4800% to 6900%, 4900% to 6900%, 5000% to 6900%, 5100 % to 6900%, 5200% to 6900%, 5300% to 6900%, 5400% to 6900%, 5500% to 6900%, 5600% to 6900%, 5700% to 6900%, 5800% to 6900%, 5900% to 6900%, 6000% to 6900%, 6100% to 6900%, 6200% to 6900%, 6300% to 6900%, 6400% to 6900%, 6500% to 6900%, 6600% to 6900%, 6700% to 6900% , 6800% to 6900%, 4400% to 6500%, 450
- the half-life of the compound in human blood may be 100 minutes or more, but is not limited thereto.
- the half-life is, for example, 100 minutes to 150 minutes, 102 minutes to 150 minutes, 103 minutes to 150 minutes, 104 minutes to 150 minutes, 105 minutes to 150 minutes, 106 minutes to 150 minutes, 107 minutes to 150 minutes, 108 minutes.
- the half-life may be increased by 9900% to 14900% compared to the half-life of AQTGTGKT, but is not limited thereto.
- the increase rate is for example 9900% to 14900%, 10000% to 14900%, 10100% to 14900%, 10200% to 14900%, 10300% to 14900%, 10400% to 14900%, 10500% to 14900%, 10700 % to 14900%, 11000% to 14900%, 11500% to 14900%, 12000% to 14900%, 12500% to 14900%, 13000% to 14900%, 13500% to 14900%, 14000% to 14900%, 14500% to 14900%, 9900% to 12000%, 10000% to 12000%, 10200% to 12000%, 10500% to 12000%, 10700% to 12000%, 11000% to 12000%, 11500% to 12000%, 11700% to 12000% , 9900% to 11000%, 10000% to 11000%, or 990
- the pharmaceutical composition according to the present invention may further include an appropriate carrier, excipient and/or diluent commonly used to prepare a pharmaceutical composition in addition to the active ingredient.
- an appropriate carrier excipient and/or diluent commonly used to prepare a pharmaceutical composition in addition to the active ingredient.
- it can be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, and sterile injection solutions.
- Carriers, excipients and diluents that may be included in the composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose , microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxy benzoate, propylhydroxy benzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
- a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, and a surfactant usually used.
- composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
- pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type, severity, and drug activity of the patient. , sensitivity to drug, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field.
- a preferred dosage may be selected according to the condition and weight of the subject, the severity of the disease, the drug form, the route of administration, and the duration.
- the pharmaceutical composition may be administered in an amount of 0.001 to 1000 mg/kg, 0.01 to 100 mg/kg, 0.01 to 10 mg/kg, 0.1 to 10 mg/kg, or 0.1 to 1 mg/kg once a day to It can be administered in several divided doses.
- the effective amount of the pharmaceutical composition according to the present invention may vary depending on the patient's age, sex, condition, weight, absorption of the active ingredient in the body, inactivation rate and excretion rate, disease type, and drugs used in combination.
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes.
- it may be administered by oral administration, intranasal administration, transbronchial administration, arterial injection, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection or intraperitoneal injection.
- the daily dose may be administered once to several times a day.
- the present invention may provide a method for preparing an oligopeptide X-AQTGTGKT comprising the steps of:
- A is alanine
- Q is glutamine
- T is threonine
- G is glycine
- K is lysine
- the degree of cell proliferation was measured through CTG analysis. Specifically, 5 ⁇ 10 3 /100 ⁇ l of cells per well were seeded in a 96-well plate and cultured for 24 hours, followed by transfection with 7 types of AQTGTGKT analogs according to the present invention, respectively. After 48 hours, CellTiter-Glo ® (Promega Co., USA) reagent was mixed in the same amount as the cell culture solution and reacted on an orbital shaker for 2 minutes. After reacting at room temperature for 10 minutes, the emission signal was measured using a luminometer (GloMax ® , Promega).
- the degree of cell proliferation was measured through MTT analysis. Specifically, 5 ⁇ 10 3 /100 ⁇ l cells were dispensed per well in a 96-well plate, and after culturing for 24 hours, 7 kinds of AQTGTGKT analogs according to the present invention were introduced respectively. After 72 hours, 10 ⁇ l of CellTiter-96 ® (Promega Co., USA) reagent was added to each well and reacted at 5% CO 2 , 37°C. After 3 hours, the absorbance was measured at 490 nm using a spectrophotometer (SPECTROstar Nano , BMG).
- SPECTROstar Nano SPECTROstar Nano
- H1975 cells were inoculated once by subcutaneous injection into the flank of the mouse at a concentration of 4 ⁇ 10 6 cells/mouse by 150 ⁇ l. After confirming that the volume of the tumor mass formed after completion of inoculation reached 70 to 130 mm 3 , random group separation was performed. The test substance was administered intravenously 5 times at 3-day intervals and 5 times at 2-day intervals.
- H820 cells were inoculated once by subcutaneous injection into the flank of the mouse at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells/mouse and 200 ⁇ l at a ratio of 1:1 with matrigel. After confirming that the volume of the tumor mass formed after completion of inoculation reached 70 to 130 mm 3 , random group separation was performed. The test substance was administered intravenously 14 times daily.
- the breast cancer cell line, HCC1806 cells was inoculated once by subcutaneous injection into the flank of the mouse at a concentration of 5 ⁇ 10 6 cells/mouse and 200 ⁇ l of matrigel and 1:1 ratio. After completion of inoculation, it was confirmed that the volume of the formed tumor reached 70 to 130 mm 3 , and random group separation was performed.
- the test substance was administered intravenously 7 times at 2 day intervals at a concentration of 10 mpk, and the start date of administration was set as 1 day.
- the volume of the tumor was measured twice a week, and the length of the major axis and the minor axis was measured to calculate the volume, and the absolute weight of the individual was measured at the same time.
- the CT26 cell line induced to express the CAGE gene was inoculated once by subcutaneous injection into the flank of the mouse by 200 ⁇ l of matrigel 1:1 at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/mouse. After completion of inoculation, it was confirmed that the volume of the formed tumor reached 70 mm 3 , and random group separation was performed.
- the test substance was administered intravenously 7 times at 2 day intervals at a concentration of 10 mpk, and the start date of administration was set as 1 day.
- the volume of the tumor was measured twice a week, and the length of the major axis and the minor axis was measured to calculate the volume, and the absolute weight of the individual was measured at the same time.
- BocThr(OBn)OH compound 1; 25.0 g, 80.8 mmol, 1.0 equiv
- NOSu 9.77 g, 84.8 mmol, 1.05 equiv
- dichloromethane 150 mL
- the mixture was cooled to 0° C. and placed under an inert atmosphere.
- 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride (16.3 g, 84.8 mmol, 1.05 equiv).
- the mixture was warmed to room temperature and stirred for 20 h.
- the mixture was then washed with NH 4 Cl (sat. aq) and the phases were separated.
- the organic layer was dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure to give compound 2 as a product as a pale yellow oil (35.7 g, >100% yield, assuming quantitative yield).
- BocThr(OBn)OSu (32.8 g, 80.8 mmol, 1.0 equiv) was dissolved in 1,4-dioxane (200 mL) and a solution of glycine sodium salt hydrate in distilled water (100 mL) was added in one portion. After stirring at room temperature for 6 h, the mixture was partitioned between ethyl acetate and citric acid (sat. aq.). The organic layer was dried over MgSO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure. The crude material was purified on a C18 (400 g) column with 30-70% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) eluent.
- BocLys(CBz)OH compound 4; 27.0 g, 70.9 mmol, 1.0 equiv
- NOSu 9.80 g, 85.1 mmol, 1.2 equiv
- dichloromethane 128 mL
- the mixture was cooled to 0° C. and placed under an inert atmosphere.
- 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethyl carbodiimide hydrochloride (16.3 g, 85.1 mmol, 1.05 equiv).
- the mixture was warmed to room temperature and stirred for 20 h.
- the mixture was then washed with NH 4 Cl (sat. aq) and the phases were separated.
- the organic layer was dried over MgSO 4 and concentrated under reduced pressure to give compound 5 as a product as a pale yellow oil (36.7 g, >100% yield, assuming quantitative yield).
- BocThr(OBn)GlyOH compound 3; 5.61 g, 15.3 mmol, 1.00 equiv
- compound 8 Lis(Cbz)Thr(OBn)OBn; 10.0 g, 15.3 mmol; 1.0 equiv
- N,N-diisopropylethylamine 5.90 mL, 33.7 mmol, 2.2 equiv
- the mixture was stirred at room temperature under an inert atmosphere and HATU (7.00 g, 18.4 mmol, 1.20 equiv) was added.
- the resulting mixture was stirred for 2 h, then washed with NH 4 Cl (sat. aq.) followed by NaHCO 3 (sat. aq.).
- the organic layer was dried over Na 2 SO 4 , filtered and concentrated under reduced pressure to give compound 9 as a product as a pale orange oily solid (25.0 g, >100% yield, assuming quantitative yield).
- BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (compound 9; 13.9 g, 15.3 mmol, 1.0 equiv from the previous step) was dissolved in 1,4-dioxane (150 mL) at room temperature under nitrogen did it To this solution was added 4N HCl in 1,4-dioxane (20 mL). The mixture was stirred at room temperature for 20 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure and purified on a C18 (400 g) column using 20% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) eluent. The desired fractions were combined and lyophilized.
- BocThr(OBn)GlyOH (Compound 3; 5.10 g, 14.0 mmol, 1.05 equiv) and BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn (Compound 10; 10.8 g, 13.3 mmol, 1.0 equiv) was added N,N -diisopropylethyl amine (5.10 mL, 29.3 mmol, 2.2 equiv). The mixture was stirred at room temperature under an inert atmosphere and HATU (5.60 g, 14.7 mmol, 1.1 equiv) was added. The resulting mixture was stirred for 2 h, washed with NH 4 Cl (sat. aq.) and NaHCO 3 (sat. aq.). The organic layer was concentrated under reduced pressure to give compound 11 as a product as a pale yellow gum (21.4 g, >100% yield, assuming quantitative yield).
- the obtained compound 11 (BocThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr (OBn)OBn; 15.4 g, 13.3 mmol, 1.00 equiv from the previous step) was mixed with 1,4-dioxane at room temperature under nitrogen (150 mL). To this solution was added 4N HCl in 1,4-dioxane (50 mL) and the mixture was stirred at room temperature for 5 hours. The mixture was concentrated under reduced pressure and purified on a C18 (120 g) column using 20% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) eluent.
- Thr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (Compound 12; 12.7 g, 12.0 mmol) in ethyl acetate (150 mL) and N,N -dimethylformamide (25 mL) , 1.0 equiv) and BocGlnOH (3.25 g, 13.2 mmol, 1.1 equiv) was added N,N-diisopropylethylamine (4.60 mL, 26.4 mmol, 2.2 equiv). The mixture was stirred at room temperature under an inert atmosphere and HATU (5.47 g, 14.4 mmol, 1.20 equiv) was added.
- 3-PhPh-AQTGTGKT (Compound 19-1) was synthesized by reacting Compound 17-1 obtained according to Scheme 8 with Compound 14 according to Scheme 9 to synthesize a final target compound, 3-PhPh-AQTGTGKT.
- H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 equiv) was suspended in ethyl acetate (10 mL) and N,N-diisopropylethylamine (653 ⁇ L, 3.75 mmol, 2.5 equiv) was added. After stirring at room temperature for 5 min, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 equiv) and [1,1'-biphenyl]-3-carboxylic acid (297 mg, 1.50 mmol, 1 equiv) were added and the mixture was stirred at room temperature. was stirred for 2 hours.
- reaction mixture was diluted with ethyl acetate and then washed with NH 4 Cl (sat. aq.), NaHCO 3 (sat. aq.) and brine.
- the obtained organics were dried (Na 2 SO 4 ), filtered and concentrated under reduced pressure.
- the residue was purified by a gradient of 2-40% ethyl acetate in heptane on a 25 g column to give compound 16-1 as a colorless solid (493 mg, 91% yield).
- the material was then purified on a 60 g C18 column using 5-50% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) and lyophilized to give the desired compound as a colorless solid (2.9 mg, 5% yield) 19-1 was obtained.
- 4-MeOPh-AQTGTGKT (Compound 19-2) was prepared by reacting Compound 17-2 obtained according to Scheme 10 with Compound 14 according to Scheme 11 to synthesize a final target compound, 4-MeOPh-AQTGTGKT.
- H-Ala-OBzl.HCl (425 mg, 1.97 mmol, 1.2 equiv) was suspended in ethyl acetate (10 mL) and N,N -diisopropylethylamine (715 ⁇ L, 4.11 mmol, 2.5 equiv) was added. After stirring at room temperature for 5 minutes, HATU (937 mg, 2.46 mmol, 1.5 equiv) and 4-methoxybenzoic acid (250 mg, 1.64 mmol, 1 equiv) were added and the mixture was stirred at room temperature for 2 h. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate and then washed with NH 4 Cl (sat.
- the dried material was purified on a 30 g C18 column using a gradient of 5-30% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) and lyophilized to give the compound as a colorless solid (7.0 mg, 10% yield) 19-2 was obtained.
- 2-PhPh-AQTGTGKT (Compound 19-3) was prepared by reacting Compound 17-3 obtained according to Scheme 12 with Compound 14 according to Scheme 13 to synthesize a final target compound, 2-PhPh-AQTGTGKT.
- H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 equiv) was suspended in ethyl acetate (10 mL) and N,N -diisopropylethylamine (653 ⁇ L, 3.75 mmol, 2.5 equiv) was added. After stirring at room temperature for 5 minutes, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 equiv) and [1,1'-biphenyl]-2-carboxylic acid (297 mg, 1.50 mmol, 1 equiv) were added and the mixture was stirred at room temperature. was stirred for 2 hours.
- reaction mixture was diluted with ethyl acetate and then washed with NH 4 Cl (sat. aq.), NaHCO 3 (sat. aq.) and brine.
- the obtained organics were dried (Na 2 SO 4 ), filtered and concentrated under reduced pressure.
- the residue was purified on a 25 g column with a gradient of 2-40% ethyl acetate in heptane to give compound 16-3 as a colorless oil (416 mg, 77% yield).
- the dried material was purified on a 30 g C18 column with a gradient of 5-50% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) and lyophilized to give compound 19 as a colorless solid (22.7 mg, 31% yield) -3 was obtained.
- Ph-AQTGTGKT (Compound 19-4) was prepared by reacting Compound 17-4 obtained according to Scheme 14 with Compound 14 according to Scheme 15 to synthesize a final target compound, Ph-AQTGTGKT.
- H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 equiv) was suspended in ethyl acetate (10 mL) and N,N -diisopropylethylamine (653 ⁇ L, 3.75 mmol, 2.5 equiv) was added. After stirring at room temperature for 5 min, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 equiv) and benzoic acid (183 mg, 1.50 mmol, 1 equiv) were added and the mixture was stirred at room temperature for 18 h. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate and then washed with NH 4 Cl (sat. aq.), NaHCO 3 (sat.
- Naphthyl-AQTGTGKT (Compound 19-5) was synthesized by reacting Compound 17-5 obtained according to Scheme 16 with Compound 14 according to Scheme 17 to synthesize a final target compound, Naphthyl-AQTGTGKT.
- H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 equiv) was suspended in ethyl acetate (10 mL) and N,N -diisopropylethylamine (653 ⁇ L, 3.75 mmol, 2.5 equiv) was added. After stirring at room temperature for 5 minutes, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 equiv) and 2-naphthoic acid (258 mg, 1.50 mmol, 1 equiv) were added and the mixture was stirred at room temperature for 2 h. The reaction mixture was diluted with ethyl acetate and then washed with NH 4 Cl (sat.
- the dried material was purified on a 30 g C18 column with a gradient of 5-40% acetonitrile (0.1% formic acid) in water (0.1% formic acid) and lyophilized to give compound 19 as a colorless solid (23.2 mg, 33% yield) -5 was obtained.
- Schemes 19 to 23 are almost similar to Schemes 1 to 5 except for the presence or absence of a benzyl protecting group, and overlapping descriptions will be omitted.
- the lung cancer cell line H1299 was treated with an AQTGTGKT analog at a concentration of 100 ⁇ M for 48 hours, or the lung cancer cell line H820 or H1975 was treated with an AQTGTGKT analog at a concentration of 10 ⁇ M for 72 hours. Cytotoxicity was compared.
- the breast cancer cell line MDA-MB-231 was treated with an AQTGTGKT analog at a concentration of 100 ⁇ M for 48 hours, and then the cell activity was compared by measuring the amount of ATP in the cells.
- the breast cancer cell line was treated with an AQTGTGKT analog to compare the cell proliferation inhibitory effect.
- HCC1937 was used as the breast cancer cell line.
- HCC1937 cell line was treated with Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, Naphtyl-AQTGTGKT at a concentration of 100 ⁇ M, and the cell proliferation inhibitory effect was compared after 72 hours. .
- the cytotoxicity was compared by treating the AQTGTGKT analog in a hematological cancer cell line according to the MTT assay method described in the above experimental method.
- Jurkat clone E6-1 was used as a blood cancer cell line.
- Jurkat clone E6-1 was treated with 4-PhPh-AQTGTGKT, Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, and Naphtyl-AQTGTGKT at a concentration of 10 ⁇ M, respectively, and , the cell proliferation inhibitory effect was compared after 48 hours. As a result, as shown in FIG.
- pancreatic cancer cell line CFPAC-1 was treated with an AQTGTGKT analog at a concentration of 10 ⁇ M for 72 hours to compare cytotoxicity.
- the colorectal cancer cell line HT29 was treated with an AQTGTGKT analog at a concentration of 50 ⁇ M for 72 hours to compare cytotoxicity.
- AQTGTGKT analog was treated with an AQTGTGKT analog at 10 mpk dose, 5 times at 3 day intervals, 5 times at 2 day intervals, in nude mice transplanted with lung cancer cell line H820, for a total of 10 times to prevent tumor growth. compared.
- tumor growth was compared by treating nude mice transplanted with H1975 lung cancer cells with an AQTGTGKT analog at a dose of 10 mpk for 14 days.
- the compound of the present invention has an excellent anticancer effect in an animal model transplanted with lung cancer cells.
- AQTGTGKT and three AQTGTGKT analogs (3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, and Ph-AQTGTGKT) were administered at a dose of 10 mpk to immunodeficient mice transplanted with a breast cancer cell line according to the animal test analysis method described above. Tumor growth was compared by intravenous administration for a total of 7 times with an interval of 2 days.
- the compound of the present invention has an excellent anticancer effect without affecting the body weight of the mouse in an animal model transplanted with breast cancer cells.
- AQTGTGKT and two analogs of AQTGTGKT were administered at a dose of 10 mpk each to mice transplanted with the CT26 cell line induced by CAGE gene expression according to the animal test analysis method described above. Tumor growth was compared by intravenous administration for a total of 7 times at daily intervals.
- the tumor growth was inhibited in the analog administration group after 10 days, and the tumor volume was calculated on the 14th day, the day after the 7 analog administration. mm3, it was confirmed that the average of the 3-PhPh-AQTGTGKT group was 880.35 mm 3 , and the average of the Naphthyl-AQTGTGKT group was 880.35 mm 3 ( FIG. 18 ).
- the 3-PhPh-AQTGTGKT administration group showed inhibition of tumor growth by about 65.79% and the Naphthyl-AQTGTGKT administration group by about 62.04%.
- tumor growth was significantly inhibited with p ⁇ 0.001 in the two analog administration groups of 3-PhPh-AQTGTGKT and Naphtyl-AQTGTGKT compared to the AQTGTGKT administration group.
- the present invention relates to a novel analog compound of the oligopeptide AQTGTGKT, a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the same as an active ingredient, and a method for preparing the same, wherein the analog of the oligopeptide AQTGTGKT exhibits excellent anticancer effects, and It was confirmed that it was stably present in the blood.
- the pharmaceutical composition according to the present invention has a smaller molecular weight than an antibody, which is an advantage of the oligopeptide, so there is less concern about an immune response, and in addition to being easy to penetrate into the tissue, the effect of inhibiting the proliferation of cancer cells is more excellent, and the human It is expected that it can be used as a useful anticancer agent to treat cancer because it exhibits the effect of being stably present in the blood.
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Abstract
본 발명은 신규한 올리고펩티드 AQTGTGKT 아날로그 화합물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 우수한 항암 효과를 나타내고, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재하는 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그 화합물, 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 아날로그 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 올리고펩티드 제제가 가지고 있는 장점인 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 점에 더하여 암 세포의 증식 억제 효과가 더욱 뛰어나고, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재할 수 있는 효과를 나타내므로 암을 치료하는데 유용한 항암제로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그 화합물, 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 2021년 3월 22일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0036803호 및 2022년 2월 18일에 출원된 PCT 출원 제PCT/KR2022/002399호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원들의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 아직도 우리나라 사망 원인 중 제1, 2위를 다투는 중요한 질환이다. 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료의 문제점으로 지적되고 있다.
기존의 항암제는 암 세포뿐만 아니라, 정상 세포에도 침투하여 정상 세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에, 골수 기능 저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고, 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점을 보인다. 따라서, 기존 항암제의 이러한 심각한 문제점을 해결할 수 있는 혁신적인 항암제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 종양 세포의 특이적 종양 항원을 표적으로 하는 항체의 개발이 이루어지고 있으나, 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제점이 있다. 반면, 펩티드(peptide)의 경우 분자량이 작아 항체와는 다르게 면역반응 우려가 적고, 조직 내 침투가 용이한 장점이 있으며, 종양 항원을 표적으로 하는 펩티드 기반 항암제는 종양에 선택적으로 작용할 수 있기 때문에 정상세포에 손상을 입히는 등의 부작용이 거의 없을 것으로 기대되고 있다. 그러나 이러한 장점에도 불구하고 매우 제한적인 암종에만 사용되고 있으며, 특히 인간에게 투여 직후 짧은 시간 내에 분해되어 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있었다.
상기 문제점을 해결하기 위한 방법으로 펩티드를 아미드화(amidation), 에스터화(esterification), 아실화(acylation), 아세틸화(acetylation), 페길화 (PEGylation), 고리화(cyclization) 또는 알킬화(alkylation) 등에 의해 변형시킴으로써 수율의 향상, 생체 내 활성의 증가, 수용체에 대한 펩티드의 친화성 증가, 단백질의 분해 지연 등을 꾀할 수 있으나, 상기 변형에 의하더라도 원하는 효과가 향상되는 것은 보장되지 않으며, 오히려 펩티드가 본래 가지고 있던 생체 내 활성을 잃어버리거나 예기치 못한 부작용이 발생할 수 있는 위험이 있다. 따라서 이러한 부정적 효과를 최소화함과 동시에 목적하는 효과를 극대화하기 위한 펩티드의 변형에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 올리고펩티드 AQTGTGKT(alanine-glutamine-threonine-glycine-threonine-glycine-lysine-threonine)의 항암 효과 및 혈액 내에서의 반감기를 더욱 향상시키기 위해 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하였다. 특히, AQTGTGKT 펩티드의 아미드화(amidation)된 아날로그 화합물은 우수한 항암 효과 및 증가된 반감기를 가지는 것을 확인하였다.
이에, 본 발명의 목적은 하기의 일반식으로 표시되는 화합물을 제공하는 것이다:
[일반식]
X-AQTGTGKT
상기 일반식에서, A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,
X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
본 발명의 다른 목적은 상기의 일반식으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 일반식으로 표시되는 화합물의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 화합물을 제공한다:
[일반식]
X-AQTGTGKT
상기 일반식에서, A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,
X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
또한, 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[일반식]
X-AQTGTGKT
상기 일반식에서, A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,
X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
또한, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 화합물은 유효량으로 투여될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 암에 대한 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.
더욱이, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 암 치료용 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 유방암, 혈액암, 대장암, 췌장암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 폐암은 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 폐암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 X는
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 혈액암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 췌장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 대장암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 X가 
인 경우, 상기 화합물은 인간 혈액 내에서의 반감기가 100분 내지 150분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 X가
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 경우, 상기 화합물은 인간 혈액 내에서의 반감기가 45분 내지 70분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 상기 X가 
인 경우, 상기 화합물은 인간 혈액 내에서의 반감기가 20분 내지 30분일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 올리고펩티드 X-AQTGTGKT의 제조방법을 제공한다:
(상기 A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,
상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나임.)
(1) TG 및 KT를 각각 합성하는 단계;
(2) 상기 TG와 KT를 결합하여 TGKT를 합성하는 단계;
(3) 상기 TGKT의 N-말단에 TG를 결합하여 TGTGKT를 합성하는 단계;
(4) 상기 TGTGKT의 N-말단에 Q를 결합하여 QTGTGKT를 합성하는 단계; 및
(5) 상기 QTGTGKT의 N-말단에 알라닌 유도체(X-A)를 결합하여 X-AQTGTGKT를 합성하는 단계.
본 발명은 신규한 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그 화합물, 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그가 우수한 항암 효과를 나타내고, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 올리고펩티드가 가지고 있는 장점인 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 점에 더하여 암 세포의 증식 억제 효과가 더욱 뛰어나고, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재할 수 있는 효과를 나타내므로 암을 치료하는데 유용한 항암제로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1 내지 도 7은 본 발명에 따른 화합물을 동정하고, 화합물의 구조 확인을 위한 UPLC-MS(상단) 및 1H NMR(하단) 결과를 나타낸 도로서, 도 1은 4-PhPh-AQTGTGKT, 도 2는 Ac-AQTGTGKT, 도 3은 3-PhPh-AQTGTGKT, 도 4는 4-MeOPh-AQTGTGKT, 도 5는 2-PhPh-AQTGTGKT, 도 6은 Ph-AQTGTGKT, 도 7은 Naphthyl-AQTGTGKT의 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 폐암 세포주 H1299에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 CTG assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001; 이하 동일).
도 9는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 CTG assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 폐암(유두상선암종) 세포주 H820에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11a는 유방암 세포주 MDA-MB-231에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포의 활성 억제 효과를 CTG assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11b는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 혈액암 세포주 Jurkat clone E6-1에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 췌장암 세포주 CFPAC-1에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 14는 대장암 세포주 HT29에서 본 발명의 화합물 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay에 의해 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 폐암 세포주 H820을 누드마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후, 본 발명의 화합물 처리에 따른 종양성장 억제를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 16은 폐암 세포주 H1975를 누드마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후, 본 발명의 화합물 처리에 따른 종양성장 억제를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 17은 유방암 세포주 HCC1806를 마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후, 본 발명의 화합물 처리에 따른 종양성장 억제를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 대장암 세포주 CT26을 마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후, 종양 부피를 측정하여 본 발명의 화합물을 처리에 따른 종양성장 억제를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 19 내지 도 26은 인간 혈액 내에서 본 발명에 따른 각각의 화합물의 시간대별 잔류량을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명자들은 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아미드화 아날로그(amidation analog)를 새롭게 합성하고, 이들이 우수한 항암 효과(실시예 2 참조) 및 혈액 내에서의 뛰어난 안정성(실시예 3 참조)을 나타낸다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 이에 본 발명은 하기의 일반식으로 표시되는 화합물을 제공할 수 있다:
[일반식]
X-AQTGTGKT
상기 일반식에 있어서, A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고, X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증상을 차단하거나, 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "치료"란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "개체"란 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 예를 들어, 상기 개체는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐, 개, 고양이, 말, 양 및 소를 포함하는 포유류일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "올리고펩티드"는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형(linear)의 분자를 의미한다. 본 발명의 올리고펩티드는 분자·생물학적인 방법과 함께 당업계에 공지된 화학적 합성 방법(예를 들어, 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques))에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명에 따른 화합물의 범위에는 이의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, "약학적으로 허용 가능한"이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체(예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 금속염을 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 범위에는 본 발명의 화합물과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 갖는 생물학적 기능 균등물이 포함될 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 및 크기 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 알라닌과 글라이신은 유사한 크기를 가지고; 라이신은 양전하를 띤 잔기이며; 글루타민과 트레오닌은 전하를 띠지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 알라닌과 글라이신; 그리고 글루타민과 트레오닌은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 다음과 같이 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인 (+2.5); 메싸이오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루탐산 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파트산 (-3.5); 아스파라진 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파트산(+3.0±1); 글루탐산 (+3.0±1); 세린 (+0.3); 아스파라진 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5±1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메싸이오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 아이소류신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 상기 일반식으로 표시되는 화합물의 아미노산 서열(AQTGTGKT)의 단백질은 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 62.5%의 상동성, 보다 바람직하게는 75% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 87.5% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 암의 예방 또는 치료에 사용된다. 본 발명의 약학적 조성물이 사용 가능한 암은 폐암, 유방암, 혈액암, 대장암, 췌장암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 폐암은 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 화합물은 T790M 돌연변이 양성 환자, EGFR m- 환자, 및/또는 Osimertinib 내성 환자의 폐암 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 유방암은 Hormone receptor (HR) 양성 유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유방암은 삼중음성유방암(Triple negative breast cancer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액암 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 약학적 조성물이 폐암, 유방암, 혈액암, 췌장암 및 대장암에 대하여 우수한 항암 활성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물이 폐암의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물이 유방암의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물이 혈액암의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물이 췌장암의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물이 대장암의 예방 또는 치료에 사용되는 경우, 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하고, 상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 상기 일반식으로 표시되는 화합물들이 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재할 수 있으며 AQTGTGKT와 비교하여 향상된 반감기를 갖는다는 사실을 확인하였다(실시예 3 참조). 따라서, 상기 실시예의 결과는 본 발명에 따른 화합물들이 향상된 항암 효과 및 안정성을 갖는다는 것을 보여주는 것이다.
본 발명의 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물에서, 상기 X가 
인 경우, 상기 화합물의 인간 혈액 내에서의 반감기는 20분 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 반감기는 예를 들어 20분 내지 30분, 21분 내지 30분, 22분 내지 30분, 23분 내지 30분, 24분 내지 30분, 25분 내지 30분, 26분 내지 30분, 27분 내지 30분, 28분 내지 30분, 29분 내지 30분, 20분 내지 29분, 21분 내지 29분, 21분 내지 28분, 21분 내지 27분, 21분 내지 26분, 21분 내지 25분, 21분 내지 24분, 21분 내지 23분, 21분 내지 22분, 22분 내지 30분, 22분 내지 28분, 22분 내지 26분, 22분 내지 24분, 23분 내지 30분, 23분 내지 28분, 23분 내지 26분, 23분 내지 24분, 24분 내지 30분, 24분 내지 27분, 25분 내지 30분, 25분 내지 27분, 26분 내지 30분, 26분 내지 28분, 27분 내지 30분, 27분 내지 29분, 28분 내지 30분, 28분 내지 29분, 또는 29분 내지 30분 등일 수 있다. 또한, 상기 반감기는 AQTGTGKT의 반감기와 비교하여 1900% 내지 2900% 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증가 비율은 예를 들어 1900% 내지 2700%, 2000% 내지 2700%, 2100% 내지 2700%, 2200% 내지 2700%, 2300% 내지 2700%, 2400% 내지 2700%, 2500% 내지 2700%, 2600% 내지 2700%, 1900% 내지 2600%, 2000% 내지 2600%, 2100% 내지 2600%, 2100% 내지 2500%, 2100% 내지 2400%, 2100% 내지 2300%, 2100% 내지 2200%, 2200% 내지 2700%, 2200% 내지 2600%, 2200% 내지 2500%, 2200% 내지 2400%, 2200% 내지 2300%, 2300% 내지 2700%, 2300% 내지 2500%, 2400% 내지 2700%, 2400% 내지 2600%, 또는 2500% 내지 2700% 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물에서, 상기 X가
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 경우, 상기 화합물의 인간 혈액 내에서의 반감기는 45분 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 반감기는 예를 들어 45분 내지 70분, 46분 내지 70분, 47분 내지 70분, 48분 내지 70분, 49분 내지 70분, 50분 내지 70분, 51분 내지 70분, 53분 내지 70분, 55분 내지 70분, 57분 내지 70분, 59분 내지 70분, 65분 내지 70분, 45분 내지 65분, 50분 내지 65분, 55분 내지 65분, 60분 내지 65분, 45분 내지 60분, 50분 내지 60분, 55분 내지 60분, 45분 내지 55분, 50분 내지 55분, 또는 60분 내지 70분 등일 수 있다. 또한, 상기 반감기는 AQTGTGKT의 반감기와 비교하여 4400% 내지 6900% 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증가 비율은 예를 들어 4400% 내지 6900%, 4500% 내지 6900%, 4600% 내지 6900%, 4700% 내지 6900%, 4800% 내지 6900%, 4900% 내지 6900%, 5000% 내지 6900%, 5100% 내지 6900%, 5200% 내지 6900%, 5300% 내지 6900%, 5400% 내지 6900%, 5500% 내지 6900%, 5600% 내지 6900%, 5700% 내지 6900%, 5800% 내지 6900%, 5900% 내지 6900%, 6000% 내지 6900%, 6100% 내지 6900%, 6200% 내지 6900%, 6300% 내지 6900%, 6400% 내지 6900%, 6500% 내지 6900%, 6600% 내지 6900%, 6700% 내지 6900%, 6800% 내지 6900%, 4400% 내지 6500%, 4500% 내지 6500%, 4700% 내지 6500%, 5000% 내지 6500%, 5200% 내지 6500%, 5500% 내지 6500%, 5700% 내지 6500%, 6000% 내지 6500%, 6300% 내지 6500%, 4400% 내지 6000%, 4600% 내지 6000%, 4800% 내지 6000%, 5000% 내지 6000%, 5500% 내지 6000%, 4400% 내지 5500%, 4700% 내지 5500%, 5000% 내지 5500%, 5200% 내지 5500%, 4400% 내지 5000%, 4800% 내지 5000%, 4400% 내지 4700%, 또는 4500% 내지 4700% 등일 수 있다.
또한, 본 발명의 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물에서, 상기 X가 
인 경우, 상기 화합물의 인간 혈액 내에서의 반감기는 100분 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 반감기는 예를 들어 100분 내지 150분, 102분 내지 150분, 103분 내지 150분, 104분 내지 150분, 105분 내지 150분, 106분 내지 150분, 107분 내지 150분, 108분 내지 150분, 109분 내지 150분, 110분 내지 150분, 111분 내지 150분, 112분 내지 150분, 115분 내지 150분, 117분 내지 150분, 120분 내지 150분, 123분 내지 150분, 125분 내지 150분, 127분 내지 150분, 130분 내지 150분, 132분 내지 150분, 135분 내지 150분, 137분 내지 150분, 140분 내지 150분, 142분 내지 150분, 145분 내지 150분, 147분 내지 150분, 148분 내지 150분, 100분 내지 140분, 102분 내지 140분, 104분 내지 140분, 106분 내지 140분, 108분 내지 140분, 120분 내지 140분, 125분 내지 140분, 130분 내지 140분, 135분 내지 140분, 100분 내지 130분, 102분 내지 130분, 105 내지 130분, 110분 내지 130분, 115분 내지 130분, 120분 내지 130분, 125분 내지 130분, 100분 내지 120분, 105분 내지 120분, 110분 내지 120분, 115분 내지 120분, 100분 내지 110분, 105분 내지 110분, 또는 100분 내지 105분 등일 수 있다. 또한, 상기 반감기는 AQTGTGKT의 반감기와 비교하여 9900% 내지 14900% 증가한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 증가 비율은 예를 들어 9900% 내지 14900%, 10000% 내지 14900%, 10100% 내지 14900%, 10200% 내지 14900%, 10300% 내지 14900%, 10400% 내지 14900%, 10500% 내지 14900%, 10700% 내지 14900%, 11000% 내지 14900%, 11500% 내지 14900%, 12000% 내지 14900%, 12500% 내지 14900%, 13000% 내지 14900%, 13500% 내지 14900%, 14000% 내지 14900%, 14500% 내지 14900%, 9900% 내지 12000%, 10000% 내지 12000%, 10200% 내지 12000%, 10500% 내지 12000%, 10700% 내지 12000%, 11000% 내지 12000%, 11500% 내지 12000%, 11700% 내지 12000%, 9900% 내지 11000%, 10000% 내지 11000%, 또는 9900% 내지 10000% 등일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg 또는 0.1 내지 1 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 올리고펩티드 X-AQTGTGKT의 제조방법을 제공할 수 있다:
(상기 A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,
상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나임.)
(1) TG 및 KT를 각각 합성하는 단계;
(2) 상기 TG와 KT를 결합하여 TGKT를 합성하는 단계;
(3) 상기 TGKT의 N-말단에 TG를 결합하여 TGTGKT를 합성하는 단계;
(4) 상기 TGTGKT의 N-말단에 Q를 결합하여 QTGTGKT를 합성하는 단계; 및
(5) 상기 QTGTGKT의 N-말단에 알라닌 유도체(X-A)를 결합하여 X-AQTGTGKT를 합성하는 단계.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 방법
1. CTG(CellTiter-Glo Luminescent) 분석
본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그 화합물을 암 세포주에 처리한 후 CTG 분석을 통해 세포의 증식 정도를 측정하였다. 구체적으로, 96-well 플레이트에 각 well 당 5 × 103/100 μl 세포를 시딩(seeding)하고, 24시간 동안 배양한 후 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그 7종을 각각 트랜스펙션(transfection) 하였다. 48시간 경과 후 CellTiter-Glo®(Promega Co., 미국) 시약을 세포 배양액과 동일한 양으로 섞고 2분간 회전 교반기(orbital shaker)에서 반응시켰다. 실온에서 10분간 반응시킨 후 루미노미터(luminometer; GloMax®, Promega)를 사용하여 발광 신호를 측정하였다.
2. MTT(tetrazolium) 분석
본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그 화합물을 암 세포주에 처리한 후 MTT 분석을 통해 세포의 증식 정도를 측정하였다. 구체적으로, 96-well 플레이트에 각 well 당 5 × 103/100 μl 세포를 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그 7종을 각각 도입하였다. 72시간 경과 후 CellTiter-96®(Promega Co., 미국) 시약을 각 well 당 10 μl씩 첨가하고 5% CO2, 37℃에서 반응시켰다. 3시간 경과 후 분광광도계(spectrophotometer; SPECTROstarNano, BMG)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
3. 폐암 동물모델
H1975 세포를 4×106 cells/mouse의 농도로 150 ㎕씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후 형성된 tumor mass의 volume이 70 내지 130 ㎣에 도달한 것을 확인 한 후 무작위 군분리를 실시하였다. 시험물질은 3일 간격으로 5회, 2일 간격으로 5회 미정맥투여 하였다.
H820 세포를 5×106 cells /mouse의 농도로 matrigel과 1:1의 비율로 200 ㎕씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후 형성된 tumor mass의 volume이 70 내지 130 ㎣에 도달한 것을 확인 한 후 무작위 군분리를 실시하였다. 시험물질은 매일 14회 미정맥투여 하였다.
4. 유방암 동물모델
유방암 세포주인 HCC1806 세포를 5×106 cells/mouse의 농도로, matrigel과 1:1의 비율로 200 ㎕씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후 형성된 종양의 부피가 70 내지 130 ㎣에 도달한 것을 확인하고, 무작위 군분리를 실시하였다. 시험물질은 10 mpk의 농도로 2일 간격 7회 미정맥 투여하였고 투여 시작일을 1일으로 설정하였다. 종양의 부피는 주 2회 측정하였으며 장축과 단축의 길이를 측정하여 부피를 산출하였고 동시에 개체의 절대 무게를 측정하였다.
5. 대장암 동물모델
CAGE 유전자의 발현을 유도한 CT26 세포주를 1×106 cells/mouse의 농도로 matrigel 1:1로 200 ㎕씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후 형성된 종양의 부피가 70 ㎣에 도달한 것을 확인하고, 무작위 군분리를 실시하였다. 시험물질은 10 mpk의 농도로 2일 간격 7회 미정맥 투여하였고 투여 시작일을 1일으로 설정하였다. 종양의 부피는 주 2회 측정하였으며 장축과 단축의 길이를 측정하여 부피를 산출하였고 동시에 개체의 절대 무게를 측정하였다.
실시예 1: AQTGTGKT 아날로그(analog)의 제조
1.1. 반응 일반
모든 반응은 달리 언급되지 않는 한 추가 반응 없이 상업적으로 판매되는 물질 및 시약을 사용하여 수행하였다. 반응들은 실리카겔 플레이트(Keiselgel 60 F254, Merck) 및/또는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 상의 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링 하였다. TLC 플레이트 상의 반점의 가시화는 UV 광에 의해 그리고 과망간산 칼륨 및/또는 닌하이드린에서 TLC 플레이트를 염색하고 히트건(heat gun)으로 탄화시킴으로써 달성되었다. 모든 생성물은 1H NMR 및/또는 UPLC-MS를 사용하여 특정하였다.
1.2. Boc/OBn-TG의 합성
먼저 작용기가 벤질로 보호된 TG를 하기의 반응식 1에 따라 합성하였다. 이하 각 반응식에서 화합물 하기에 병기한 아라비아 숫자(n)에 따라 화합물 n으로 지칭하기로 한다.
[반응식 1]
구체적으로, BocThr(OBn)OH (화합물 1; 25.0 g, 80.8 mmol, 1.0 당량) 및 NOSu (9.77 g, 84.8 mmol, 1.05 당량)를 다이클로로메탄 (150 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 두었다. 그 후, 상기 혼합물에 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (16.3 g, 84.8 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 NH4Cl(포화 수성)로 세척하고 상을 분리하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 생성물로서 담황색 오일 (35.7 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 2를 수득하였다.
상기 화합물 2 BocThr(OBn)OSu (32.8 g, 80.8 mmol, 1.0 당량)를 1,4-다이옥세인 (200 mL)에 용해시키고, 증류수 (100 mL) 중의 글라이신 나트륨 염 수화물 용액을 한번에 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 및 시트르산(포화 수성)으로 분획하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 30-70% 아세토 나이트릴 (0.1% 포름산)으로 C18 (400 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 에틸 아세테이트 및 NaHCO3(포화 수성)으로 분획하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 생성물로서 담황색 검 (21.9 g, 74% 수율)의 화합물 3을 수득하였다.
1.3. CBz/OBn/CO
2
Bn-KT의 합성
OH 작용기가 벤질로 보호된 KT를 하기의 반응식 2에 따라 합성하였다.
[반응식 2]
구체적으로, BocLys(CBz)OH (화합물 4; 27.0 g, 70.9 mmol, 1.0 당량) 및 NOSu (9.80 g, 85.1 mmol, 1.2 당량)를 다이클로로메탄 (128 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 두었다. 그 후, 상기 혼합물에 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸 카보다이이미드 하이드로 클로라이드 (16.3 g, 85.1 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 교반하였다. 이이서 혼합물을 NH4Cl (포화 수성)로 세척하고 상을 분리하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 생성물로서 옅은 황색 오일 (36.7 g, >100% 수율, 정량 수율로 가정)의 화합물 5를 수득하였다.
이어서, 상기 화합물 5 (BocLys(Cbz)OSu; 36.7 g, 70.9 mmol, 1.0 당량) 및 Thr(OBn)OBn.HCl (25.0 g, 74.4 mmol, 1.05 당량)을 실온에서 1,4-다이옥세인 (477 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 증류수 (326 mL) 중 NaHCO3 (6.85 g, 81.5 mmol, 1.15 당량)의 용액을 첨가하였다. 이 후 생성된 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 (수성) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축하여 생성물로서 황색의 유성 고체 55.9 g (>100% 수율, 정량적 수율로 가정)의 화합물 6을 수득하였다.
마지막으로, 상기 화합물 6 (BocLys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 55.9 g, 70.9 mmol, 1.00 당량)을 1,4-다이옥세인 (360 mL)에 용해시키고 1,4-다이옥세인 (177 mL) 중 4N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 NaHCO3의 포화 수용액을 pH 값이 8이 될 때까지 첨가하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 생성된 유기 용액을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과한 다음 감압하에서 농축하여 생성물로서 황색 유성 고체(38.7 g, 97% 수율)의 화합물 7을 수득하였다.
1.4. CBz/OBn/OBn/CO
2
Bn-TGKT의 합성
상기 1.2. 및 1.3.에서 합성한 TG와 KT를 하기의 반응식 3에 따라 결합하여 TGKT를 합성하였다.
[반응식 3]
보다 구체적으로, 다이클로로메탄 (50 mL) 중 BocThr(OBn)GlyOH(화합물 3; 5.61 g, 15.3 mmol, 1.00 당량) 및 화합물 8(Lys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 10.0 g, 15.3 mmol, 1.0 당량) 용액에, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (5.90 mL, 33.7 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (7.00 g, 18.4 mmol, 1.20 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (포화 수성)으로 세척하고, 이어서 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 농축하여 생성물로서 옅은 주황색 오일성 고체 (25.0 g, >100% 수율, 정량 수율로 가정)의 화합물 9를 수득하였다.
상기 수득한 BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 9; 이전 단계로부터 취한 13.9 g, 15.3 mmol, 1.0 당량)를 질소하에 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (20 mL) 중의 4N HCl을 첨가하였다. 상기 혼합물은 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 20% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 C18 (400 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 동결 건조시켰다. 생성된 분말은 NaHCO3 (포화 수성) 및 다이클로로메탄에 용해시키고 15분 동안 교반하였다. 층을 분리시키고 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과한 다음 감압하에 농축시켜 생성물로서 무색 검 (10.9 g, 88% 수율)의 화합물 10을 수득하였다.
1.5. CBz/OBn/OBn/OBn/CO
2
Bn-TGTGKT의 합성
상기 1.2. 및 1.4.에서 합성한 TG(화합물 3)와 TGKT(화합물 10)를 하기의 반응식 4에 따라 결합하여 벤질로 보호된 TGTGKT를 합성하였다.
[반응식 4]
보다 구체적으로, 다이클로로메탄 (100mL) 중의 BocThr(OBn)GlyOH (화합물 3; 5.10 g, 14.0 mmol, 1.05 당량) 및 BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn(화합물 10; 10.8 g, 13.3 mmol, 1.0 당량) 용액에 N,N-다이아이소프로필에틸 아민 (5.10 mL, 29.3 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (5.60 g, 14.7 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하고, NH4Cl(포화 수성) 및 NaHCO3(포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 감압하에서 농축하여 생성물로서 담황색 검 (21.4 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 11을 수득하였다.
이어서, 상기 수득한 화합물 11 (BocThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr (OBn)OBn; 이전 단계에서 취한 15.4g, 13.3mmol, 1.00 당량)을 질소하의 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (50 mL) 중 4N HCl을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 20% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 C18 (120 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 절반의 부피로 농축한 후 NaHCO3 (포화 수성) 및 에틸 아세테이트로 분획하였다. 층을 분리하고 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축하여 생성물로서 회백색 고체 (14.6 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 12를 수득하였다.
1.6. CBz/OBn/OBn/OBn/CO
2
Bn-QTGTGKT의 합성
상기 1.5.에서 합성한 화합물 12(TGTGKT)에 하기 반응식 5에 따라 Q를 추가로 결합하여 화합물 14(QTGTGKT)를 합성하였다.
[반응식 5]
보다 구체적으로, 에틸 아세테이트 (150 mL) 및 N,N-다이메틸포름아마이드 (25 mL) 중 Thr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 12; 12.7 g, 12.0 mmol, 1.0 당량) 및 BocGlnOH (3.25 g, 13.2 mmol, 1.1 당량)의 용액에 N,N-다이아이소 프로필에틸아민 (4.60 mL, 26.4 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (5.47 g, 14.4 mmol, 1.20 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 다이클로로메탄으로 추가 추출하였다. 이어서 유기층을 합하고 감압하에 농축시켰다. 조 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 20-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 400 g C18 컬럼으로 정제하였다. 원하는 분획을 합한 후, 에틸 아세테이트 및 NaHCO3 (포화 수성) 용액으로 분획하였다. 유기층을 농축시키고, 동결 건조 공정에 의해 잔류수를 제거하였다. 합한 분획으로 총 12.9 g (89% 총 수율)의 화합물 13을 수득하였다.
상기 수득한 화합물 13 (BocGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn; 7.00 g, 5.40 mmol, 1.00 당량)을 질소하에 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (43.5 mL) 중 4N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물/ 아세토나이트릴 (2/1) 용액을 사용하여 동결 건조시켰다. 최종적으로 담황색 분말 (6.36 g, 96% 수율)의 화합물 14를 분리하였다.
1.7. AQTGTGKT 아날로그의 합성
4-PhPh-AQTGTGKT를 제외한 나머지 6 종의 아날로그는 상기 반응식 5의 최종 생성물인 화합물 14 및 하기 반응식 6의 생성물인 화합물 17n을 하기 반응식 7에 따라 결합시켜 합성하였다.
[반응식 6]
[반응식 7]
상기 반응식 7에 따라 순도 90% 이상의 3-PhPh-AQTGTGKT 2.9 mg, 순도 89%의 4-MeOPh-AQTGTGKT 7.0 mg, 순도 95% 이상의 2-PhPh-AQTGTGKT 22.7 mg, 순도 90% 이상의 Ph-AQTGTGKT 23.2 mg, 및 순도 85%의 Naphthyl-AQTGTGKT 23.2 mg을 최종적으로 수득하였다.
이하, 각각의 아날로그 합성 과정에 대하여 구체적으로 설명한다.
1.7.1. 3-PhPh-AQTGTGKT의 합성
3-PhPh-AQTGTGKT(화합물 19-1)는 하기 반응식 8에 따라 수득한 화합물 17-1을 상기 화합물 14와 반응식 9에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 3-PhPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 8]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 [1,1'-바이페닐]-3-카복실산 (297 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물은 25 g 컬럼에서 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 정제하여 무색 고체 (493 mg, 91% 수율)의 화합물 16-1 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (49 mg)를 메탄올 (30 mL) 중의 화합물 16-1(3-PhPh-AlaOBn; 493 mg, 1.37 mmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물은 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 메탄올 및 에틸 아세테이트로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 거품 (337 mg, 91% 수율)의 화합물 17-1을 수득하고, 이를 하기 반응식 9에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 9]
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 3-PhPh-AlaOH (화합물 17-1; 68.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기물을 감압하에서 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60g C18 컬럼으로 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (140 mg, 38% 수율)의 화합물 18-1을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (85.0 mg)를 2M 염산(수성, 0.5 mL) 및 2-프로판올 (10 mL) 중의 3-PhPh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-1; 85.0 mg, 59.1 μmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 4.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축하고, 잔류물을 동결 건조하였다. 그 후 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 60 g C18 컬럼에서 물질을 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (2.9 mg, 5% 수율)의 목적 화합물 19-1을 수득하였다.
화합물 19-1(3-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 8.01-7.99 (m, 1H), 7.86-7.82 (m, 1H), 7.75-7.66 (m, 3H), 7.55 (t, J 7.7 Hz, 1H), 7.49 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.43-7.38 (m, 1H), 4.48-4.24 (m, 5H), 4.23-4.12 (m, 3H), 4.09 (d, J 3.8 Hz, 1H), 4.00- 3.96 (m, 2H), 3.88 (s, 2H), 2.90 (t, J 7.4Hz, 2H), 2.35 (t, J 7.5Hz, 2H), 2.15-2.06 (m, 1H), 2.03-1.91 (m , 1H), 1.84-1.72 (m, 1H), 1.70-1.52 (m, 3H), 1.45 (d, J 7.2Hz, 3H), 1.40-1.24 (m, 2H), 1.15-1.05 (m, 9H) , 16 exchangeable protons not visible.
1.7.2. 4-MeOPh-AQTGTGKT의 합성
4-MeOPh-AQTGTGKT(화합물 19-2)는 하기 반응식 10에 따라 수득한 화합물 17-2를 상기 화합물 14와 반응식 11에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 4-MeOPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 10]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (425 mg, 1.97 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (715 μL, 4.11 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (937mg, 2.46mmol, 1.5 당량) 및 4-메톡시벤조산 (250mg, 1.64mmol, 1 당량)을 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 15-50% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼 상에서 정제하여 무색 고체 (360 mg, 70% 수율)의 화합물 16-2를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (18 mg)를 메탄올 (15 mL) 중의 4-OMePh-AlaOBn (화합물 16-2; 180 mg, 0.574 mmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 110시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 오일 (128 mg, 100% 수율)의 화합물 17-2를 수득하고, 이를 하기 반응식 11에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 11]
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (63.0 μL, 0.360 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys (Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 200 mg, 0.164 mmol, 1 당량) 및 4-OMePh-AlaOH (화합물 17-2; 36.6 mg, 0.164 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (74.5 mg, 0.196 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 64시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 메탄올로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 물로 세척하였다. 유기물을 감압하에서 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (113 mg, 50% 수율)의 화합물 18-2를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (100 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 4-OMePh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-2; 108 mg, 77.6 μmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-30% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 30g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (7.0 mg, 10% 수율)의 화합물 19-2를 수득하였다.
화합물 19-2(4-MeOPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 7.76-7.71 (m, 2H), 7.02-6.98 (m, 2H), 4.42-4.28 (m, 5H), 4.24-4.13 (m, 3H), 4.09 (d, J 3.9 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.91 (t, J 7.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.85-1.75 (m, 1H), 1.71-1.54 (m, 3H), 1.42 (d, J 7.2 Hz, 3H), 1.40-1.25 (m, 3H), 1.16-1.07 (m, 8H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.3. 2-PhPh-AQTGTGKT의 합성
2-PhPh-AQTGTGKT(화합물 19-3)는 하기 반응식 12에 따라 수득한 화합물 17-3을 상기 화합물 14와 반응식 13에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 2-PhPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 12]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 [1,1'-바이페닐]-2-카복실산 (297 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척 하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 오일 (416 mg, 77% 수율)의 화합물 16-3을 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (42 mg)를 메탄올 (20 mL) 중 2-PhPh-AlaOBn (화합물 16-3; 416 mg, 1.16 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 오일 (308 mg, 99% 수율)의 화합물 17-3을 수득하고, 이를 하기 반응식 13에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 13]
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (63.0 μL, 0.360 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 200 mg, 0.164 mmol, 1 당량) 및 2-PhPh-AlaOH (화합물 17-3; 44.2 mg, 0.164 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (74.5 mg, 0.196 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 64시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 메탄올로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 물로 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (115 mg, 49% 수율)의 화합물 18-3을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (100 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 2-PhPh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-3; 110 mg, 76.5 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조하였다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 30 g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (22.7 mg, 31% 수율)의 화합물 19-3을 수득하였다.
화합물 19-3(2-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 7.56-7.48 (m, 2H), 7.44-7.33 (m, 7H), 4.38-4.26 (m, 4H), 4.25-4.13 (m, 4H), 4.08 (d, J 3.9 Hz, 1H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.91 (t, J 7.5 Hz, 2H), 2.25 (t, J 7.5 Hz, 2H), 2.09-2.01 (m, 1H), 1.93-1.77 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 3H), 1.41-1.29 (m, 2H), 1.18 (d, J 7.2 Hz, 3H), 1.12 (d, J 5.6 Hz, 6H), 1.08 (d, J 6.4 Hz, 3H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.4. Ph-AQTGTGKT의 합성
Ph-AQTGTGKT(화합물 19-4)는 하기 반응식 14에 따라 수득한 화합물 17-4을 상기 화합물 14와 반응식 15에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 Ph-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 14]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5 분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 벤조산 (183 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-50% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 오일 (375 mg, 88% 수율)의 화합물 16-4를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (38 mg)를 메탄올 (30 mL) 중 Ph-Ala-OBn (화합물 16-4; 375 mg, 1.32 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 유리 (glass; 254 mg, 99% 수율)의 화합물 17-4를 수득하고, 이를 하기 반응식 15에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 15]
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메탄 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr (OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 Ph-Ala-OH (화합물 17-4; 49.0 mg, 0.253 mmol, 1)의 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기물을 감압하에 농축하고 수득한 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (200 mg, 58%)의 화합물 18-4를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (110 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 Ph-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-4; 110 mg, 80.8 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 60 g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (23.2 mg, 33% 수율)의 화합물 19-4를 수득하였다.
화합물 19-4(Ph-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 7.74-7.70 (m, 2H), 7.58-7.53 (m, 1H), 7.48-7.43 (m, 2H), 4.45-4.34 (m, 3H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.25-4.14 (m, 3H), 4.11 (d, J 3.8 Hz, 1H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.91 (t, J 7.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.85-1.76 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.43 (d, J 7.3 Hz, 3H), 1.40-1.30 (m, 2H), 1.16-1.07 (m, 9H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.5. Naphthyl-AQTGTGKT의 합성
Naphthyl-AQTGTGKT(화합물 19-5)는 하기 반응식 16에 따라 수득한 화합물 17-5를 상기 화합물 14와 반응식 17에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 Naphthyl-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 16]
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 2- 나프토산 (258 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 고체 (385 mg, 77% 수율)의 화합물 16-5를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (39 mg)를 메탄올 (20 mL) 중 2-Naphthyl-AlaOBn (화합물 16-5; 385 mg, 1.15 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 고체 (266 mg, 95% 수율)의 화합물 17-5를 수득하고, 이를 하기 반응식 17에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 17]
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 2-Naphthyl-Ala-OH (화합물 17-5; 61.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 (포화 수성) NaHCO3로 세척하였다. 수득한 유기층을 감압하에 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (230 mg, 64% 수율)의 화합물 18-5를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (101 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 2-Naphthyl-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-5; 101 mg, 71.5 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-40% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 30 g C18 컬럼상에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (23.2 mg, 33% 수율)의 화합물 19-5를 수득하였다.
화합물 19-5(Naphthyl-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 8.32 (s, 1H), 8.01-7.90 (m, 3H), 7.79-7.73 (m, 1H), 7.64-7.55 (m, 2H), 4.51-3.70 (m, 13H), 2.96-2.81 (m, 2H), 2.39-2.30 (m, 2H), 2.18-2.04 (m, 1H), 2.03-1.93 (m, 1H), 1.85-1.72 (m, 1H), 1.71-1.53 (m, 3H), 1.50-1.43 (m, 3H), 1.39-1.24 (m, 2H), 1.19-1.04 (m, 9H), 16 exchangeable protons not visible.
1.8. Ac-AQTGTGKT의 합성
Ac-AQTGTGKT(화합물 19-6)는 하기 반응식 18에 따라 수행되어 최종 목적 화합물인 Ac-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 18]
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (94.0 μL, 0.540 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (30 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.245 mmol, 1 당량) 및 Ac-Ala-OH (32.1 mg, 0.245 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (112 mg, 0.294 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 (포화 수성) NH4Cl, NaHCO3 및 물로 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하고, 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배에서 60 g C18 컬럼으로 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 동결 건조하여 무색 고체 (104 mg, 33% 수율)의 화합물 18-6을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (10 mg)를 2M 염산(수성, 0.19 mL) 및 2-프로판올 (5 mL) 중의 Ac-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-6; 33 mg, 25 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 14시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 물에 용해시킨 다음 동결 건조하였다. 상기 건조된 물질을 메탄올 중 0.5M 암모니아로 용리시키면서 500 mg SCX-2 카트리지에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 감압하에 농축한 다음 동결 건조하여 무색 고체 (7.6 mg, 37% 수율)의 화합물 19-6을 수득하였다.
화합물 19-6(Ac-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 4.40-4.33 (m, 2H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.24-4.12 (m, 4H), 4.08 (d, J 4.0 Hz, 1H), 4.03-3.88 (m, 4H), 2.92 (t, J 7.2 Hz, 2H), 2.32 (t, J 7.8 Hz, 2H), 2.15-2.02 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 4H), 1.86-1.76 (m, 1H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.45-1.31 (m, 2H), 1.29 (t, J 7.4 Hz, 2H), 1.20-1.06 (m, 10H), 16 exchangeable protons not visible.
1.9. 4-PhPh-AQTGTGKT의 합성
1.9.1. QTGTGKT 중간체의 합성
4-PhPh-AQTGTGKT 합성을 위한 중간체 QTGTGKT는 하기 반응식 19 내지 반응식 23에 따라 합성하였다:
[반응식 19]
[반응식 20]
[반응식 21]
[반응식 22]
[반응식 23]
상기 반응식 19 내지 반응식 23은 상기 반응식 1 내지 반응식 5와 벤질 보호기 유무 여부를 제외하고는 거의 유사한 과정으로서, 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
1.9.2. 4-PhPh-AQTGTGKT의 합성
상기 반응식 23에서 수득한 화합물 31은 하기 반응식 24에서 합성된 알라닌 유도체와 반응식 25에 따라 결합되어 최종 생성물 4-PhPh-AQTGTGKT를 수득하였다.
[반응식 24]
[반응식 25]
상기 반응식 24 및 반응식 25 또한 전술한 반응식과 거의 유사한 과정에 의해 진행되었는바 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 최종적으로 무색 고체 (583 mg, 68% 수율)의 화합물 36을 수득하였다.
화합물 36(4-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ= 7.85 (d, J 8.8 Hz, 2H), 7.77 (d, J 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J 7.2 Hz, 2H), 7.49 (t, J 7.2 Hz, 2H), 7.42 (t, J 7.1 Hz, 1H), 4.34-4.04 (m, 6H), 4.07 (d, J 3.6 Hz, 1H), 3.93 (d, J 2.0 Hz, 2H), 2.82 (t, J 7.0 Hz, 2H), 1.82-1.67 (m, 1H), 1.66-1.55 (m, 1H), 1.54-1.44 (m, 2H), 1.37-1.22 (m, 2H), 1.18 (d, J 6.4 Hz, 3H), 1.06 (t, J 6.5 Hz, 3H), 10 exchangeable protons not visible.
1.10. 화합물 확인
상기 제법에 의해 수득한 AQTGTGKT 아날로그 7종은 1H NMR 및 UPLC-MS(ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry) 기법으로 분석하여 화학 구조를 확인하였다. 분석 결과는 도 1 내지 도 7에 나타내었으며, 화합물은 표 1에 정리하였다.
| 이름 | 화학식 |
| AQTGTGKT |
 |
| 4-PhPh-AQTGTGKT |
 |
| Ac-AQTGTGKT |
 |
| 3-PhPh-AQTGTGKT |
 |
| 4-MeOPh-AQTGTGKT |
 |
| 2-PhPh-AQTGTGKT |
 |
| Ph-AQTGTGKT |
 |
| Naphthyl-AQTGTGKT |
 |
실시예 2: AQTGTGKT 아날로그의 항암 효과 확인
2.1. 폐암 세포 활성 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 CTG 분석 방법에 따라 폐암 세포주 H1299에 AQTGTGKT 아날로그를 100 μM 농도로 48시간 동안 처리하거나, 폐암 세포주 H820 또는 H1975에 AQTGTGKT 아날로그를 10 μM 농도로 72시간 동안 처리한 후 각 아날로그의 세포 독성을 비교하였다.
그 결과 도 8에 나타난 바와 같이 H1299 세포주에 4-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)과 비교하여 세포의 활성이 약 10% 감소하였으며, Ac-AQTGTGKT는 4.2%, 3-PhPh-AQTGTGKT는 15%, 4-MeOPh-AQTGTGKT는 12%, 2-PhPh-AQTGTGKT는 20%, Ph-AQTGTGKT는 18%, Naphthyl-AQTGTGKT는 14%의 세포활성 억제 효과를 보였다.
H1975 세포주의 경우, 도 9에 나타난 바와 같이 Ac-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)과 비교하여 세포의 활성이 약 16% 감소하였으며, 3-PhPh-AQTGTGKT는 33%, 4-MeOPh-AQTGTGKT는 4%, 2-PhPh-AQTGTGKT는 3%의 세포활성 억제 효과를 보였다.
또한, H820 세포주의 경우, 도 10에 나타난 바와 같이 3-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)과 비교하여 세포의 활성이 약 12% 감소하였으며, 4-MeOPh-AQTGTGKT는 10%의 세포활성 억제 효과를 보였다.
이러한 결과는 상기 아미드화 아날로그가 폐암 세포의 분열을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주는 것이다.
2.2. 유방암 세포의 활성 및 증식 억제 효과
(1) 유방암 세포의 활성 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 CTG 분석 방법에 따라 유방암 세포주 MDA-MB-231에 AQTGTGKT 아날로그를 100 μM 농도로 48시간 동안 처리한 후 세포 내의 ATP 양을 측정함으로써 세포의 활성을 비교하였다.
그 결과 도 11a에 나타난 바와 같이 4-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)과 비교하여 세포의 활성이 약 30% 감소 효과를 보여 유방암 세포의 분열을 억제하는데 탁월한 효과가 있음을 입증하였다.
(2) 유방암 세포의 성장 및 증식능 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 MTT 분석 방법에 따라 유방암 세포주에 AQTGTGKT 아날로그를 처리하여 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 유방암 세포주로 HCC1937을 사용하였다.
HCC1937 세포주에 Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, Naphtyl-AQTGTGKT를 100 μM 농도로 처리하고, 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 도 11b에 나타난 바와 같이, Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, 및 Naphtyl-AQTGTGKT는 대조군(AQTGTGKT)과 비교하여 세포 증식을 각각 약 11.1%, 17.1%, 14.3%, 15.9%, 13.6%, 및 9.5% 억제한 것으로 나타났다.
상기 실험 결과들은 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그가 유방암에 대해 뛰어난 항암 효과를 발휘한다는 것을 보여준다.
2.3. 혈액암 세포의 성장 및 증식능 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 MTT 분석 방법에 따라 혈액암 세포주에 AQTGTGKT 아날로그를 처리하여 세포 독성을 비교하였다. 혈액암 세포주로 Jurkat clone E6-1를 사용하였다.
Jurkat clone E6-1에 4-PhPh-AQTGTGKT, Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, 및 Naphtyl-AQTGTGKT를 각각 10 μM 농도로 처리하고, 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 4-PhPh-AQTGTGKT, Ac-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, 및 Naphtyl-AQTGTGKT는 대조군(AQTGTGKT)과 비교하여 세포 증식을 각각 약 4.8%, 7.9%, 6.4%, 4%, 6.7%, 10.2%, 및 10.4% 억제한 것으로 나타났다.
상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그가 혈액암 세포에 대해 뛰어난 항암 효과가 있음을 보여주는 것이다.
2.4. 췌장암 세포의 성장 및 증식능 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 MTT 분석 방법에 따라 췌장암 세포주 CFPAC-1에 AQTGTGKT 아날로그를 10 μM 농도로 72시간 동안 처리하여 세포 독성을 비교하였다.
그 결과 도 13에 나타난 바와 같이 4-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)와 비교하여 세포의 활성이 약 12% 감소하였으며, 3-PhPh-AQTGTGKT는 2%, 4-MeOPh-AQTGTGKT는 6%, Ph-AQTGTGKT는 3%, Naphthyl-AQTGTGKT는 3%의 세포활성 억제효과를 보였다. 상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그가 췌장암 세포에 대한 뛰어난 항암 효과가 있음을 보여주는 것이다.
2.5. 대장암 세포의 성장 및 증식능 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 MTT 분석 방법에 따라 대장암 세포주 HT29에 AQTGTGKT 아날로그를 50 μM 농도로 72시간 동안 처리하여 세포 독성을 비교하였다.
그 결과 도 14에 나타난 바와 같이 4-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)와 비교하여 세포의 증식이 약 8% 감소하였으며, Ac-AQTGTGKT는 58%, 3-PhPh-AQTGTGKT는 59%, 4-MeOPh-AQTGTGKT는 48%, 2-PhPh-AQTGTGKT는 7%, Ph-AQTGTGKT는 40%, Naphthyl-AQTGTGKT는 58%의 세포 증식 억제 효과를 보였다. 상기와 같은 결과는 본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그가 대장암 세포에 대한 뛰어난 항암 효과가 있음을 보여주는 것이다.
2.6. 폐암 세포를 접종한 동물 모델에서의 종양성장 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 동물실험 분석 방법에 따라 폐암 세포주 H820이 이식된 누드마우스에 AQTGTGKT 아날로그를 10 mpk 용량으로 3일 간격으로 5회, 2일 간격으로 5회 총 10회 처리하여 종양의 성장을 비교하였다.
그 결과 도 15에 나타난 바와 같이, H820 폐암세포주를 이식한 후 3-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)와 비교하여 종양의 성장이 약 16.5% 감소하였으며, 2-PhPh-AQTGTGKT는 27%, Ph-AQTGTGKT는 20%, Naphthyl-AQTGTGKT는 26%의 종양성장의 억제 효과를 보였다.
또한, H1975 폐암 세포를 이식한 누드마우스에 AQTGTGKT 아날로그를 10 mpk 용량으로 14일 동안 처리하여 종양의 성장을 비교하였다.
그 결과 도 16에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 처리한 경우에는 대조군(AQTGTGKT)와 비교하여 종양의 성장이 약 16.5% 감소하여 종양성장의 억제효과를 보였다.
종합적으로, 상기와 같은 결과들은 폐암 세포를 이식한 동물 모델에서 본 발명의 화합물에 뛰어난 항암 효과가 있음을 보여주는 것이다.
2.7. 유방암 세포를 접종한 동물 모델에서의 종양성장 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 동물실험 분석 방법에 따라 유방암 세포주가 이식된 면역결핍마우스에 AQTGTGKT와 AQTGTGKT 아날로그 3종 (3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 및 Ph-AQTGTGKT)를 10 mpk 용량으로 2일 간격, 총 7회 미정맥 투여하여 종양의 성장을 비교하였다.
아날로그 7회 투여를 마치고 2일 후인 15일차에 종양의 부피를 산출한 결과, AQTGTGKT 투여 그룹은 평균 1884.17 ㎣, 3-PhPh-AQTGTGKT 투여 그룹은 944.70 ㎣, 4-MeOPh-AQTGTGKT 투여 그룹은 812.69 ㎣, Ph-AQTGTGKT 투여 그룹은 1133.80 ㎣로 측정되었고, AQTGTGKT 그룹의 종양 부피 대비 약 49.86%, 56.86%, 39.82%로 종양의 성장을 억제하였다 (도 17).
종합적으로, 상기와 같은 결과들은 유방암 세포를 이식한 동물 모델에서 마우스의 체중에는 영향을 미치지 않으면서 본 발명의 화합물에 뛰어난 항암 효과가 있음을 보여주는 것이다.
2.8. 대장암 세포를 접종한 동물 모델에서의 종양성장 억제 효과
상기 실험 방법에서 기술한 동물실험 분석 방법에 따라 CAGE 유전자의 발현을 유도한 CT26 세포주가 이식된 마우스에 AQTGTGKT 및 AQTGTGKT 아날로그 2종 (3-PhPh-AQTGTGKT 및 Naphthyl-AQTGTGKT)을 각각 10 mpk 용량으로 2일 간격, 총 7회 미정맥 투여하여 종양의 성장을 비교하였다.
그 결과, 대조군(AQTGTGKT 투여군) 대비 아날로그 투여 그룹은 10일 이후부터 종양의 성장이 억제된 것으로 나타났고, 아날로그 7회 투여 다음날인 14일에 종양의 부피를 산출한 결과, AQTGTGKT 투여 그룹은 평균 2573.07 ㎣, 3-PhPh-AQTGTGKT 투여 그룹은 평균 880.35 ㎣, Naphthyl-AQTGTGKT 투여 그룹은 평균 880.35 ㎣ 인 것으로 확인되었다 (도 18). AQTGTGKT 투여 그룹과 비교하여, 3-PhPh-AQTGTGKT 투여 그룹은 약 65.79%, Naphthyl-AQTGTGKT 투여 그룹은 약 62.04%로 종양의 성장이 억제된 것으로 나타났다. 12일 및 14일 기준, AQTGTGKT 투여 그룹 대비하여 3-PhPh-AQTGTGKT, Naphtyl-AQTGTGKT의 2종의 아날로그 투여 그룹에서 p<0.001로 통계적으로 유의하게 종양의 성장을 억제하였다.
종합적으로, 상기와 같은 결과들은 CAGE의 발현을 유도한 CT26 세포를 이식한 동물 모델에서 마우스의 체중에는 영향을 미치지 않으면서 본 발명의 화합물에 뛰어난 항암 효과가 있음을 보여주는 것이다.
실시예 3: AQTGTGKT 아날로그의 혈액 내 안정성 확인
본 발명에 따른 AQTGTGKT 아날로그가 혈액 내에서 몇 분 동안 안정적으로 존재하는지 확인하기 위해 100% 인간 혈액에 10 μM의 각 화합물을 넣어주고 0, 5, 10, 15, 30, 60 및 120분이 경과한 시점에서 혈액 내 잔류량을 측정하였다.
그 결과 도 19 내지 도 26에 나타난 바와 같이, AQTGTGKT의 경우에는 반감기가 1분도 채 되지 않았고, 20분 이내에 혈액 내에서 거의 분해되어 잔류 AQTGTGKT가 거의 검출되지 않는 것이 확인되었다. 이에 반해 본 발명에 따른 7종의 AQTGTGKT 아날로그는 모두 현저하게 향상된 안정성을 보였는데, 특히 4-PhPh-AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 4-MeOPh-AQTGTGKT, 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT 및 Naphthyl-AQTGTGKT의 경우에는 47분 내지 105분의 반감기를 나타내었으며, 120분이 경과된 후에도 20 내지 40%가 혈액 내 잔류하여 높은 안정성을 나타내었다. 이러한 결과는 아미드화 아날로그가 더 뛰어난 항암 효과를 나타낼 뿐만 아니라 더욱 향상된 혈액 내 안정성을 나타내어 표적에 도달하기까지 분해되지 않고 안정적으로 존재할 수 있음을 보여주는 결과이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 신규한 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그 화합물, 이를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 상기 올리고펩티드 AQTGTGKT의 아날로그가 우수한 항암 효과를 나타내고, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 올리고펩티드가 가지고 있는 장점인 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 점에 더하여 암 세포의 증식 억제 효과가 더욱 뛰어나고, 인간의 혈액 내에서 안정적으로 존재할 수 있는 효과를 나타내므로 암을 치료하는데 유용한 항암제로 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
Claims (17)
- 하기 일반식으로 표시되는 화합물:[일반식]X-AQTGTGKT(상기 일반식에 있어서,A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상임.) - 하기 일반식으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:[일반식]X-AQTGTGKT(상기 일반식에 있어서,A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상임.) - 제2항에 있어서,상기 암은 폐암, 유방암, 혈액암, 대장암, 췌장암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,상기 폐암은 비소세포성 폐암(non-small cell lung cancer)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제3항에 있어서,상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 혈액암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 폐암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 혈액암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 췌장암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,상기 X가인 경우, 인간 혈액 내에서의 반감기가 100분 내지 150분인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제2항에 있어서,상기 X가
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 경우, 인간 혈액 내에서의 반감기가 45분 내지 70분인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물. - 제2항에 있어서,상기 X가인 경우, 인간 혈액 내에서의 반감기가 20분 내지 30분인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 하기의 단계를 포함하는 올리고펩티드 X-AQTGTGKT의 제조방법:(상기 A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,상기 X는
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나임.)(1) TG 및 KT를 각각 합성하는 단계;(2) 상기 TG와 KT를 결합하여 TGKT를 합성하는 단계;(3) 상기 TGKT의 N-말단에 TG를 결합하여 TGTGKT를 합성하는 단계;(4) 상기 TGTGKT의 N-말단에 Q를 결합하여 QTGTGKT를 합성하는 단계; 및(5) 상기 QTGTGKT의 N-말단에 알라닌 유도체(X-A)를 결합하여 X-AQTGTGKT를 합성하는 단계. - 제1항의 화합물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
- 제1항의 화합물의 암의 예방 또는 치료 용도.
- 암 치료용 약제의 제조를 위한 제1항의 화합물의 용도.
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