WO2016099188A1 - Cage 유래 8개의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 펩티드 - Google Patents

Cage 유래 8개의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 펩티드 Download PDF

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정두일
김영미
김현아
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Definitions

  • the present invention relates to a peptide having 8 amino acid sequences derived from CAGE and having anticancer activity and susceptibility enhancing activity of anticancer drug resistant cancer cells to anticancer agents, specifically, having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (AQTGTGKT) and binding to CAGE protein
  • the present invention relates to a peptide exhibiting anticancer activity and susceptibility enhancing activity of an anticancer drug-resistant cancer cell to an anticancer agent by inhibiting the interaction between CAGE and GSK3 ⁇ , and a pharmaceutical composition for anticancer or anticancer agent containing the peptide.
  • cancer is still an important disease competing for the 1st and 2nd causes of death in Korea.
  • Most of the currently used anticancer drugs are due to chemotherapy, and the pharmacological action varies depending on the type of cancer, and the side effects due to the toxic effects have been pointed out as a problem of cancer treatment.
  • Conventional anticancer drugs penetrate not only cancer cells but also normal tissues and damage the function and activity of normal cells, causing side effects such as bone marrow dysfunction, gastrointestinal disorders, and alopecia, and multi-drug resistance against chemotherapy due to long-term chemotherapy. It is a big problem in cancer treatment. Therefore, researches on the development of innovative anticancer drugs that can solve these serious problems of existing anticancer drugs are being actively conducted.
  • TAA tumor associated antigen
  • cancer / testis antigens including MAGE (Melanoma Associated Antigen), GAGE, and BAGE are antigens that are encoded by genes expressed in various tumors of different tissue origins, but not expressed in normal tissues other than testicular germ cells.
  • MAGE-1 MAGE-1, 2, 3, 4, 6, and 12
  • MAGE-1 MAGE-1, 2, 3, 4, 6, and 12
  • MAGE-1, 2, 3, 4, 6, and 12 represent a significant number of primary and metastatic tumors including melanoma, lung cancer, bladder cancer, ovarian cancer, and breast cancer. It has been reported to be selectively expressed by parts.
  • the cancer / testis antigen CAGE (cancer associated gene) is a novel specificity in the serum of gastric cancer patients using serogiacal analysis of recombiant cDNA library expression (SEREX) technique for cDNA expression libraries produced in gastric cancer cell lines and testes. It was found as a cancer / testis antigen (Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726).
  • SEELX recombiant cDNA library expression
  • CAGE has been shown to induce cFLIP (c-Flice inhibiory proein) and snail expression in Celastrol based resistant rat melanoma cell lines to increase cell mobility and resistance to anticancer agents (Kim Y., 2009, Biotechnol Lett.
  • CAGE has been shown to induce the expression of MMP-2 through the activity of NF-kB / AP-1 (Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763), Cellas In troll-based anticancer resistant cell lines (liver cancer SNU387 R , melanoma Malme3M R ), CAGE has been shown to confer resistance to anticancer agents by inhibiting the expression of p53 through interaction with HDAC2 (Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968), peptides derived from CAGE protein are cytotoxic T limbs. By increasing the sphere activity appeared to exhibit anti-cancer activity (Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515522).
  • peptides have a low molecular weight and are less likely to have an immune response and are more likely to penetrate into tissues.
  • Peptide-based anticancer agents targeting tumor antigens may act selectively on tumor cells, resulting in It was judged that there would be few side effects such as damage.
  • the present inventors have reported through several previous studies that CAGE confers resistance to anticancer agents as a new carcinogen, and based on this background, a study on new anticancer peptides targeting cancer / testis antigen CAGE has been conducted. As a result, it was confirmed that the AQTGTGKT (266-273) based oligopeptide corresponding to the ATP binding region of the CAGE protein inhibits the tumorigenicity and the anticancer drug resistance of CAGE in an anticancer drug resistant cell line, thereby completing the present invention.
  • Patent Document 0001 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2013-0030080
  • Non-Patent Document 0001 Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726.
  • Non-Patent Document 0002 Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 52-63.
  • Non-Patent Document 0003 Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375.
  • Non-Patent Document 0004 Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945-952.
  • Non-Patent Document 0005 Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763.
  • Non-Patent Document 0006 Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968.
  • Non-Patent Document 0007 Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515522.
  • the main object of the present invention is to provide a new anticancer agent excellent in anticancer activity.
  • Another object of the present invention is to provide an anticancer adjuvant that can increase the therapeutic effect of an anticancer agent by increasing the sensitivity of the anticancer agent to cancer cells resistant to the anticancer agent.
  • the invention provides an isolated peptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (AQTGTGKT) and having anticancer activity and susceptibility enhancing activity of anticancer agent resistant cancer cells to anticancer agents.
  • Peptides of the invention can be synthesized with L-amino acids or D-amino acids.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer containing the peptide.
  • the anticancer pharmaceutical composition of the present invention is preferably used for the prevention or treatment of liver cancer or melanoma.
  • the anticancer pharmaceutical composition of the present invention is preferably used for the treatment of cancer caused by cancer cells having resistance to celastrol or taxol.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for adjuvant anticancer agent containing the peptide.
  • the anticancer agent adjuvant pharmaceutical composition of the present invention is preferably used as an adjuvant of the anticancer agent in the prevention or treatment of liver cancer or melanoma.
  • the anticancer agent adjuvant pharmaceutical composition of the present invention is preferably used as an adjuvant of an anticancer agent in the treatment of cancer caused by cancer cells resistant to celastrol or taxol.
  • the peptide of the present invention can inhibit the multi-drug resistance of cancer cells to anticancer drugs by binding to CAGE protein and inhibiting the mutual binding of CAGE and GSK3 ⁇ .
  • CAGE cancer associated gene
  • GSK3 ⁇ glycogen Synthase Kinase-3 beta
  • GCID GC03M119540 on the GeneCards database.
  • the peptide of the present invention is a tumor-specific peptide, and has excellent penetration into tumor tissues having high CAGE expression, rather than normal tissues.
  • Peptides of the invention can inhibit the tumor producing ability by CAGE.
  • Peptides of the invention may be formulated based on the formulation criteria of the Food and Drug Administration (KFDA) into conventional pharmaceutical formulations or the formulation criteria of dietary supplements.
  • KFDA Food and Drug Administration
  • the peptides of the present invention may be used by themselves or in the form of pharmaceutically acceptable acid addition salts or metal complexes such as salts such as zinc, iron and the like. More specifically, acid addition salts may use hydrogen chloride, hydrogen bromide, sulfates, phosphates, maleates, acetates, citrates, benzoates, succinates, dried salts, ascorbates, tartalates.
  • the peptide of the present invention is a conventional method, it is preferable to dilute or encapsulate the oligopeptide with a pharmaceutically acceptable carrier or enclosed in a container form according to the administration method, dosage form and therapeutic purpose.
  • parenteral administration refers to administration of the active ingredient through rectal, intravenous, peritoneal, muscle, arterial, transdermal, nasal, inhalation and the like in addition to oral.
  • the formulation may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavors, emulsifiers, preservatives, and the like, and may be formulated to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the dosage may be adjusted according to the condition of the patient, the route of administration, and the dosage form, and is not limited. Those skilled in the art may obviously use the present invention in various ranges depending on symptoms. In the present invention, it is thought that about 1 mg / kg of peptide of the present invention may be continuously or intermittently administered per day in an experimentally effective amount.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can effectively reduce the anticancer drug resistance of cancer cells or cancer tissues resistant to the anticancer agent, thereby increasing the therapeutic effect using the anticancer agent, as well as having excellent anticancer activity in itself, so as to be used as a new anticancer agent. Can be.
  • oligopeptides which are the active ingredient of the present invention, have a small molecular weight and are less likely to cause an immune response and are easily penetrated into tissues. We believe that we will be able to improve our system effectively.
  • a and B of FIG. 1 show MTT showing that AQTGTGKT or D-AQTGTGKT (peptide synthesized with D-amino acids) peptides inhibit resistance to anticancer agents in cell trastol resistant liver cancer (SNU387 R ) or melanoma (Malme3M R ) cell lines. The result is.
  • FIG. 1B is an MTT result showing that AQTGTGKT or D-AQTGTGKT peptides inhibit resistance to anticancer agents in SNU387 R or Malme3M R cell lines.
  • 2A is a result showing that the peptide moves to the anticancer drug-resistant cells when SNU387 R or Malme3M R cell line was treated with AQTGTGKT peptide (FITC-AQTGTGKT) labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC). .
  • Figure 3 shows the ANUTGTGKT or D-AQTGTGKT peptide SNU387 R Or, the results indicate that the CME and GSK3 ⁇ binding in the Malme3M R cell line.
  • FIG. 6 A left side of FIG. 6 is a result showing that AQTGTGKT or D-AQTGTGKT peptide reduces the migration of Malme3M R cell line.
  • FIG. 6 shows that AQTGTGKT or D-AQTGTGKT peptide reduces the migration of Taxol resistant melanoma cell line (Malme3M R-Taxol ).
  • Figure 6 B shows that the AQTGTGKT or D-AQTGTGKT peptide is Malme3M R The results indicate that the cell line's ability to invasion is reduced.
  • FIG. 7 shows the tumor tissue specific migration of FITC-AQTGTGKT peptide as a result of in vivo homing of AQTGTGKT peptide.
  • An isolated peptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (AQTGTGKT) and having anticancer activity and susceptibility enhancing activity to anticancer agents of anticancer drug resistant cancer cells is disclosed.
  • the peptide is characterized in that synthesized with L-amino acid or D-amino acid.
  • An anticancer pharmaceutical composition containing the peptide of the present invention is disclosed.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is used for the prevention or treatment of liver cancer or melanoma.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is used for the treatment of cancer caused by cancer cells resistant to celastrol or taxol.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is used as an adjuvant of an anticancer agent in the prevention or treatment of liver cancer or melanoma.
  • the pharmaceutical composition is characterized in that it is used as an adjuvant of an anticancer agent in the treatment of cancer caused by cancer cells resistant to celastrol or taxol.
  • a peptide synthesized with L-amino acid (AQTGTGKT) and a peptide synthesized with D-amino acid (D-AQTGTGKT) were used to have the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SNU387 R Hepatocellular carcinoma cell line
  • D-AQTGTGKT peptide D-AQTGTGKT peptide
  • 10 ⁇ M for 1 hour 10 ⁇ M for 1 hour.
  • the MTT assay of FIG. 1B showed that both peptides suppressed the resistance to anticancer drugs in each cancer cell line.
  • each peptide was prepared in the form of FITC (Fluorescein isothiocyanate) conjugated, and these were used to perform immunofluorescence, immunoprecipitation, and Western transfection using known methods. Blots were performed.
  • FITC Fluorescein isothiocyanate
  • the same cell line was transfected with AQTGTGKT or FITC-AQTGTGKT peptide and immunoprecipitation and Western blot showed inhibition of dephosphorylation of GSK3 ⁇ ser9 and expression of Cyclin D1 as shown in FIG. 2B.
  • transfection of AQTGTGKT or D-AQTGTGKT peptide and immunoprecipitation and Western blot resulted in inhibition of dephosphorylation of GSK3 ⁇ ser9 and expression of Cyclin D1, as shown in FIG. 3, and the interaction between CAGE and GSK3 ⁇ protein. Appeared to inhibit.
  • AQTGTGKT peptide (10 ⁇ g / mouse) alone or in combination with celastrol or taxol anticancer agent was injected with tail vein total 6 times every 3 days for 2 weeks to investigate tumor size change.
  • AQTGTGKT peptides have been shown to reduce tumorigenicity and anticancer drug resistance.
  • lung metastasis was performed according to a known method using anticancer drug resistant cell lines and immunodeficient mice.
  • the invasion assay, wound-healing migration was performed according to the conventional method using a cell-resistant resistant melanoma cell line (Malme3M R ). Assay, intravital microscopy was performed.
  • 5000 cells of Celllatrotrol-resistant melanoma cell line (Malme3M R ) were placed in the upper-chamber of the transwell coated with 2 mg / ml of Matrigel with FBS free media and grown as a growth medium (10% FBS-media). After incubation for 24 hours in a low-chamber containing), the number of cells infiltrated was measured. As shown in FIG. 6B, AQTGTGKT and DAQTGTGKT peptides appeared to inhibit the invasiveness of anticancer drug resistant cell lines by about 50% or more.
  • Cellulose-resistant melanoma cell line (Malme3M R ) was treated with AQTGTGKT or DAQTGTGKT peptide, mixed with Matrigel and injected into BALB / C mice, and then injected with FITC-dextran for angiogenesis. The effect was confirmed by intravital microscopy. As a result, AQTGTGKT and D-AQTGTGKT peptides were shown to significantly reduce the angiogenic capacity of the celllatroid resistant melanoma cell line (Malme3M R ) as in FIG. 6C.
  • Tumor-induced tumors were injected by injecting cells with high CAGE-expressing Celllastol-resistant melanoma cell line (Malme3M R ) according to a known method, followed by normal intravenous (brain, heart, heart) 12 hours after tail vein injection of FITC-AQTGTGKT. Spleen, liver, lung, etc.) and the tumor tissue was extracted and confirmed using a small in vivo imaging system, as shown in Figure 7 it was shown that the specific movement of the FITC-AQTGTGKT to the tumor tissue.
  • Malme3M R Celllastol-resistant melanoma cell line
  • the pharmaceutical composition of the present invention can effectively reduce the anticancer drug resistance of cancer cells or cancer tissues resistant to the anticancer agent, thereby increasing the therapeutic effect using the anticancer agent, as well as having excellent anticancer activity in itself, so as to be used as a new anticancer agent. Can be.
  • oligopeptides which are the active ingredient of the present invention, have a small molecular weight and are less likely to cause an immune response and are easily penetrated into tissues. We believe that we will be able to improve our system effectively.

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Abstract

본 발명은 CAGE 유래 8개의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1(AQTGTGKT)의 아미노산 서열을 갖고 있어 CAGE 단백질에 결합하여 CAGE와 GSK3β의 상호결합을 저해함으로써 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 나타내는 펩티드, 이 펩티드를 함유하는 항암용 또는 항암제 보조용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

CAGE 유래 8개의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 펩티드
본 발명은 CAGE 유래 8개의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 펩티드에 관한 것으로, 구체적으로 서열번호 1(AQTGTGKT)의 아미노산 서열을 갖고 있어 CAGE 단백질에 결합하여 CAGE와 GSK3β의 상호결합을 저해함으로써 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 나타내는 펩티드, 이 펩티드를 함유하는 항암용 또는 항암제 보조용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 아직도 우리나라 사망 원인 중 제1, 2위를 다투는 중요한 질환이다. 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료의 문제점으로 지적되고 있다. 기존의 항암제는 암세포 뿐 아니라 정상조직에도 침투하여 정상세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에 골수기능저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점을 보인다. 따라서 기존 항암제의 이러한 심각한 문제점을 해결할 수 있는 혁신적인 항암제의 개발에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다.
1990년대 암 환자들이 자신의 항원에 대한 면역 반응을 일으킬 수 있음(Lloyd et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 5658-5662)이 처음 보고된 이후 종양 특이적 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 사용하여 종양 항원을 암호화하는 몇 개의 유전자를 분리하였다(Van den Eynde, B. J. et al., 1997, Curr. Opin. Immunol., 9, 684-693). 또한 암 환자의 혈청을 이용하여 각종 암조직에서 제조된 재조합 cDNA expression library와의 반응을 통해 암환자에 존재하는 자가 항원들을 발굴하였으며 이를 TAA(tumor associated antigen)라 명명하였다. 이들 중 MAGE(Melanoma Associated Antigen), GAGE 및 BAGE 등을 포함하는 암/정소 항원은 정소 생식세포 이외의 정상조직에서는 발현되지 않고 각기 다른 조직 기원의 다양한 종양에서 발현되는 유전자에 의해 암호화되는 항원이다.
암/정소 항원은 현재 암 진단 표지 단백질 및 항암 면역백신 개발의 주요 연구 대상이다. 일례로, MAGE 과(family) 종양항원 중의 6개, 즉 MAGE-1, 2, 3, 4, 6 및 12가 흑색종, 폐암, 방광암, 난소암 및 유방암을 포함하는 일차 종양 및 전이 종양의 상당한 부분에 의해 선택적으로 발현되는 것으로 보고된 바 있다.
암/정소 항원 CAGE(cancer associated gene)는 위암 세포주들과 정소조직 등에서 제작된 cDNA expression library에 대해 SEREX(serologiacal analysis of recombiant cDNA library expression) 기법을 이용하여 위암 환자의 혈청에 특이적으로 존재하는 신규 암/정소 항원으로 발견되었다(Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726). 그리고 이 CAGE 유전자의 메틸화 여부 연구를 통해 CAGE 유전자 프로모터 CpG 섬(CpG island)의 DNA 탈메틸화(DNA demethylation) 정도와 CAGE 발현의 연관성이 밝혀진 바 있다(Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307, 52-63). 이는 CAGE 유전자의 메틸화 패턴 분석을 통해 새로운 암 진단법 개발 가능성을 시사한다.
CAGE 유전자의 과발현이 세포 이동성을 증가시키며 ERK, p38 MAPK, FAK 등의 인산화가 CAGE에 의한 세포 이동성을 증가시키는 것으로 나타났고(Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375), 셀라스트롤(Celastrol) 기반 내성 쥐 흑색종 세포주에서 CAGE가 cFLIP(c-Flice inhibiory proein)과 snail 발현을 유도하여 세포 이동성 및 항암제에 대한 내성을 증가시키는 것으로 나타났으며(Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945- 952), CAGE가 NF-kB / AP-1의 활성을 통하여 MMP-2의 발현을 유도하는 것으로 나타났고(Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763), 셀라스트롤 기반 항암제 내성 세포주(간암 SNU387R, 흑색종 Malme3MR)에서 CAGE가 HDAC2와 상호 작용을 통해 p53의 발현을 억제함으로써 항암제에 대한 내성을 부여하는 것으로 나타났으며(Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968), CAGE 단백질에서 유래된 펩티드들이 세포독성 T 림프구의 활성을 증가시켜 항암 활성을 보이는 것으로 나타났다(Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515522).
한편, 본 발병자들은 앞서 특허출원을 통해 CAGE가 GSK3β(Glycogen Synthase Kinase-3 beta) ser9 잔기 인산화와 이를 통해 Cyclin D1이 핵 내 축적됨에 따라 항암제 내성을 유발하는 것을 밝힌 바 있다(대한민국 공개특허 제10-2013-0030080호).
종양 세포의 특이적 종양 항원을 표적으로 하는 항체의 개발이 이루어지고 있으나, 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문제점이 있다. 반면 펩티드의 경우 분자량이 작아 항체와는 다르게 면역반응 우려가 적고 조직 내 침투가 용이한 장점이 있을 것이라 판단되며, 종양 항원을 표적으로 하는 펩티드 기반 항암제는 종양에 선택적으로 작용할 수 있기 때문에 정상세포에 손상을 입히는 등의 부작용이 거의 없을 것이라 판단되었다.
본 발명자들은 종래의 여러 가지 연구를 통해 CAGE가 새로운 발암원으로 항암제에 대한 내성을 부여함을 보고하였고, 이러한 배경 하에 암/정소 항원 CAGE를 표적으로 하는 신규 항암 펩티드에 관한 연구를 수행하였다. 이의 결과, CAGE 단백질의 ATP 결합 영역에 해당하는 AQTGTGKT(266-273) 기반 올리고펩티드가 항암제 내성 세포주에서 CAGE의 종양 생성력 및 항암제 내성을 억제하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 0001) 대한민국 공개특허 제10-2013-0030080호
[비특허문헌]
(비특허문헌 0001) Cho B., 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 295, 715-726.
(비특허문헌 0002) Cho B., 2003, Biochem. Biophys. Res. Commun., 307,52-63.
(비특허문헌 0003) Shim H., 2006, Mol Cells, 21, 367-375.
(비특허문헌 0004) Kim Y., 2009, Biotechnol Lett., 31, 945- 952.
(비특허문헌 0005) Kim Y., 2009, BMB reports, 42, 758-763.
(비특허문헌 0006) Kim Y., 2010, J. Biol. Chem., 285, 25957-25968.
(비특허문헌 0007) Shim, E., 2006, Biotechnol. Lett. 28, 515522.
본 발명의 주된 목적은 항암활성이 우수한 새로운 항암제를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 항암제에 내성을 갖는 암세포의 항암제에 대한 감수성을 증가시켜 항암제의 치료 효과를 높일 수 있는 항암 치료 보조제를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1(AQTGTGKT)의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 분리된 펩티드를 제공한다.
본 발명의 펩티드는 L-아미노산 또는 D-아미노산으로 합성될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩티드를 함유하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항암용 약제학적 조성물은 간암 또는 흑색종의 예방 또는 치료에 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항암용 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에 의해 발생하는 암의 치료에 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 펩티드를 함유하는 항암제 보조용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항암제 보조용 약제학적 조성물은 간암 또는 흑색종의 예방 또는 치료에서 항암제의 보조용으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 항암제 보조용 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에 의해 발생하는 암의 치료에서 항암제의 보조용으로 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 펩티드는 CAGE 단백질에 결합하여 CAGE와 GSK3β의 상호 결합을 저해함으로써 암세포의 항암제에 대한 다약제 내성을 억제할 수 있다. CAGE(cancer associated gene)는 암/정소 항원으로 이의 아미노산 서열 및 유전자 염기서열 정보는 GenBank 데이터베이스 상에 AY039237.1로 등록되어 있다. GSK3β(Glycogen Synthase Kinase-3 beta)는 글리코겐 합성 키나아제 3 베타로 GeneCards 데이터베이스 상에 GCID: GC03M119540으로 등록되어 있다.
본 발명의 펩티드는 종양 특이적 펩티드로 정상조직이 아닌 CAGE 발현이 높은 종양조직으로의 특이적으로 침투가 우수하다.
본 발명의 펩티드는 CAGE에 의한 종양 생성력을 억제할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 식품의약안정청(KFDA)의 통상적인 약제학제 제제로의 제형화 기준 또는 건강보조식품의 제형 기준에 의거하여 제형화할 수 있다.
본 발명의 펩티드는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용할 수 있을 것이다. 좀 더 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용할 수 있을 것이다.
그리고 본 발명의 펩티드는 통상적인 방법으로, 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 올리고펩티드를 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다.
상기 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 염수, 완충제, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 링거액, 락토즈, 수크로즈, 칼슘 실리케이트, 메틸 셀룰로오즈 및 에탄올로 이루어진 군에서 선택된 적어도 1종 이상의 담체를 사용한 경구투여와 비경구투여용으로 분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제, 좌약, 페사리(pessaries), 연고, 크림 또는 에어로졸 등과 같은 제형으로 제조할 수 있을 것이다. 다만, 이때 담체가 상기와 같은 종류의 담체로 한정되는 것은 아니다. 이때, 비경구 투여는 경구 이외에 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강, 흡입 등을 통한 유효성분의 투여를 의미한다.
상기 제형에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함하여 포유동물에 투여된 후 활성성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 제형화 할 수 있다. 그리고 투여량은 환자의 상태, 투여 경로 및 투여 형태에 따라 조절될 수 있어 한정되지 않으며 증상에 따라 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 자명하게 다양한 범위 내에서 사용할 수 있으나, 통상적으로 본 발명에서는 실험적인 유효량으로 본 발명의 펩티드를 체중 1㎏ 당 약 1㎎ 정도를 하루에 연속적 또는 간헐적으로 투여가 가능할 것으로 판단된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 항암제에 내성을 갖는 암세포 또는 암조직의 항암제 내성을 효과적으로 감소시킬 수 있어 항암제를 사용한 치료 효과를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 그 자체로도 우수한 항암활성이 있어 새로운 항암제로 사용할 수 있다.
본 발명 약제학적 조성물의 유효성분인 올리고펩티드는 항체와는 달리 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내에 침투가 용이하다는 장점이 있으며, 암세포 또는 암조직에 선택적으로 작용할 수 있어 기존 항암제의 부작용 문제를 효과적으로 개선할 수 있을 것이라 판단된다.
도 1의 A와 B는 셀라스트롤 내성 간암(SNU387R) 혹은 흑색종(Malme3MR) 세포주에서 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT(D-아미노산으로 합성한 펩티드)펩티드가 항암제에 대한 내성을 억제한다는 것을 보여주는 MTT 결과이다.
도 1의 B는 SNU387R 혹은 Malme3MR 세포주에서 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT 펩티드가 항암제에 대한 내성을 억제한다는 것을 보여주는 MTT 결과이다.
도 2의 A는 SNU387R 혹은 Malme3MR 세포주에 녹색형광시약(FITC, fluorescein isothiocyanate)으로 표지된 AQTGTGKT 펩티드(FITC-AQTGTGKT)를 처리하였을 때, 상기 펩티드가 상기 항암제 내성 세포 내로 이동하는 것을 보여주는 결과이다.
도 3은 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT 펩티드가 SNU387R 혹은 Malme3MR 세포주에서 CAGE와 GSK3β의 결합을 억제한다는 것을 나타내는 결과이다.
도 4의 A는 AQTGTGKT 펩티드를 처리할 경우 Malme3MR 세포주의 종양생성력을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 4의 B는 종양조직에서 AQTGTGKT 펩티드가 Cyclin D1, pGSK3β Ser9의 발현을 감소시키고 CAGE-GSK3β 결합을 억제한다는 것을 보여주는 결과이다.
도 5는 AQTGTGKT 펩티드가 Malme3MR 세포주의 전이능력을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 6의 A 좌측은 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT 펩티드가 Malme3MR 세포주의 이동성(migration)을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 6의 A 우측은 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT 펩티드가 택솔 내성 흑색종 세포주(Malme3MR-Taxol)의 이동성(migration)을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 6의 B는 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT 펩티드가 Malme3MR 세포주의 침윤(invasion) 능력을 감소시킨다는 것을 나타내는 결과이다.
도 6의 C는 AQTGTGKT 혹은 D-AQTGTGKT 펩티드가 Malme3MR 세포주의 혈관 신생유도 능력을 현저히 감소시킨다는 것을 보여주는 결과이다.
도 7은 AQTGTGKT 펩티드의 종양 침투능(in vivo homing)에 관한 결과로, FITC-AQTGTGKT 펩티드가 종양조직 특이적으로 이동한다는 것을 나타낸다.
본 발명의 제1구현예에 따르면,
서열번호 1(AQTGTGKT)의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 분리된 펩티드가 개시된다.
상기 펩티드는 L-아미노산 또는 D-아미노산으로 합성된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제2구현예에 따르면,
상기 본 발명의 펩티드를 함유하는 항암용 약제학적 조성물이 개시된다.
상기 약제학적 조성물은 간암 또는 흑색종의 예방 또는 치료에 사용하는 것을 특징으로 한다 .
상기 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에 의해 발생하는 암의 치료에 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 제3구현예에 따르면,
상기 본 발명의 펩티드를 함유하는 항암제 보조용 약제학적 조성물이 개시된다.
상기 약제학적 조성물은 간암 또는 흑색종의 예방 또는 치료에서 항암제의 보조용으로 사용하는 것을 특징으로 한다.
상기 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에 의해 발생하는 암의 치료에서 항암제의 보조용으로 사용하는 것을 특징으로 한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. CAGE 유래 8-mer 펩티드가 항암제 내성에 미치는 영향 조사
본 실시예에서는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖도록 L-아미노산으로 합성한 펩티드(AQTGTGKT)와 D-아미노산으로 합성한 펩티드(D-AQTGTGKT)를 사용하였다.
암세포가 항암제 내성을 나타내는데 있어서, AQTGTGKT 및 DAQTGTGKT 펩티드들이 각각 어떤 영향을 미치는지 조사하기 위하여 기지의 방법에 따라 MTT assay와 웨스턴 블롯을 수행하였다.
항암제인 셀라스트롤에 대한 내성을 나타내는 간암 세포주(SNU387R) 및 흑색종 세포주(Malme3MR) 각각에 AQTGTGKT 또는 D-AQTGTGKT 펩티드를 1μM의 농도로 24시간 동안 형질 주입한 후 셀라스트롤과 택솔을 각각 1μM, 10μM로 1시간 동안 처리하였다. 이의 결과, 도 1 A에서와 같이 각각의 펩티드를 처리하지 않은 세포주에 비해 세포사멸에서 흔히 볼 수 있는 PARP, FAK 단백질의 깨짐(cleavage)이 현저히 나타났다.
또한, 도 1 B의 MTT assay 결과 두 가지 펩티드 모두 각 암세포주의 항암제에 대한 내성을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 2. CAGE 유래 8-mer 펩티드의 세포 내 이동 및 작용 기작 조사
AQTGTGKT 및 D-AQTGTGKT 펩티드들의 세포 내 이동 및 작용 기작을 확인하기 위해 각 펩티드에 FITC(Fluorescein isothiocyanate)가 결합된 형태로 제조하고, 이들을 사용하여 기지의 방법으로 형질 주입 후 면역형광법, 면역침강 및 웨스턴 블롯을 수행하였다.
CAGE의 발현이 높은 셀라스트롤 내성 간암 세포주(SNU387R) 및 흑색종 세포주(Malme3MR)에 FITC-AQTGTGKT 펩티드를 형질 주입하고 24시간 후에 형광현미경으로 조사하였다. 이의 결과, 도 2 A에서와 같이 각 펩티드가 세포 내부로 이동하는 것을 확인하였다.
같은 세포주에 AQTGTGKT 또는 FITC-AQTGTGKT 펩티드를 형질 주입하고 면역침강 및 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 2 B에서와 같이 GSK3β ser9의 탈인산화 및 Cyclin D1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
또한, AQTGTGKT 또는 D-AQTGTGKT 펩티드를 형질 주입하고 면역침강및 웨스턴 블롯을 수행한 결과, 도 3에서와 같이 GSK3β ser9의 탈인산화 및 Cyclin D1의 발현을 억제하며, CAGE와 GSK3β의 단백질 간 상호결합을 저해하는 것으로 나타났다.
실시예 3. CAGE 유래 8-mer 펩티드가 항암제 내성 세포주의 종양생성력에 미치는 영향 조사
AQTGTGKT 펩티드가 종양 특이적 펩티드임을 확인하기 위하여 종래기지의 방법에 따라 항암제 내성 세포주와 면역 결핍 쥐를 이용하여 실험하였다.
CAGE의 발현이 높은 셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR) 1×106개를 누드 마우스(nude mouse)의 측복부에 주사하고, 측정 가능할 정도로 종양이 자라면 일정 간격으로 디지털 측정기(digital gauge)로 종양의 크기를 측정하였으며, 종양의 크기는 기지의 수식(가장 넓은 길이 × 가장 짧은 길이2× 0.5)을 이용하여 계산하였다.
상기 방법대로 종양을 유도한 후 AQTGTGKT 펩티드(10㎍/mouse)를 단독으로 또는 셀라스트롤이나 택솔 항암제와 함께 2주 동안 3일 마다 총 6번 꼬리정맥 주사하여 종양의 크기 변화를 조사한 결과, 도 4 A에서와 같이 AQTGTGKT 펩티드가 종양 생성력 및 항암제 내성을 감소시키는 것으로 나타났다.
상기 실험 종류 후 단백질 발현 및 활성 여부를 조사하였다. 기지의 방법에 따라 종양조직을 액체 질소로 분쇄하고 용해 버퍼와 얼음에서 30분간 반응시킨 후 13,000rpm에서 15분간 원심분리하여 그 상층용액을 단백질 샘플로 수거하였다. 이후 이 단백질 샘플을 사용하여 단백질 발현과 활성화 및 상호 결합 여부를 웨스턴 블롯과 면역침강을 이용하여 확인한 결과, 도 4 B에서와 같이 AQTGTGKT 펩티드가 CAGE와 GSK3β의 단백질 간 상호결합을 억제하여 GSK3β ser9의 탈인산화 및 Cyclin D1의 발현 감소를 유도하며, 항암제 내성 유전자인 MDR1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
실시예 4. CAGE 유래 8-mer 펩티드가 항암제 내성 세포주의 전이능에 미치는 영향 조사
AQTGTGKT 펩티드가 항암제 내성 세포주의 종양 전이능에 미치는 영향을 조사하기 위하여 항암제 내성 세포주와 면역 결핍 쥐를 이용하여 기지의 방법에 따라 폐 전이를 수행하였다.
CAGE의 발현이 높은 셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR) 1×106개를 누드 마우스에 꼬리정맥 주사한 후 2 ~ 3주간 종양이 폐로 전이되는 것을 유도하였다. 종양 세포 주사 4일 후부터 AQTGTGKT 펩티드(10㎍/mouse)를 3일마다 총 6번 꼬리 정맥 주사한 후 기지의 방법으로 폐 조직을 적출하고 종양결절(tumor nodule) 수를 측정하였다. 이의 결과, 도 5의 상단에서와 같이 AQTGTGKT 펩티드가 셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR)에 의한 종양전이를 감소시키는 것으로 나타났다.
상기 폐 조직으로부터 종래의 방법에 따라 단백질을 수거한 후 면역침강과 웨스턴 블롯을 통해 단백질 발현 및 활성화 양상을 확인한 결과, 도 5의 하단에서와 같이 AQTGTGKT 펩티드가 GSK3β ser9의 탈인산화 및 Cyclin D1의 발현을 억제하며, CAGE와 GSK3β의 단백질 간 상호결합을 저해하는 것으로 나타났다.
실시예 5. CAGE 유래 8-mer 펩티드가 항암제 내성 세포주의 이동성, 침윤성, 혈관신생유도능에 미치는 영향 조사
AQTGTGKT 및 D-AQTGTGKT 펩티드들이 항암제 내성 세포주의 이동과 침윤, 혈관신생유도능에 미치는 영향을 확인하기 위하여 셀라스트롤 내성 흑색종세포주(Malme3MR)를 이용하여 종래의 방법에 따라 invasion assay, wound-healing migration assay, intravital microscopy를 수행하였다.
셀라스트롤 내성(Malme3MR) 또는 택솔 내성(Malme3MR - Taxol) 흑색종 세포주를 24 well 배양 접시에서 키운 후 종래의 방법에 따라 1㎖ tip을 이용하여 wounding한 후 이동하는 세포의 수를 24 ~ 48시간동안 측정한 결과, 도 6 A에서와 같이 AQTGTGKT 및 D-AQTGTGKT 펩티드들이 세포의 이동성을 억제하는 것으로 나타났다.
셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR) 5000개를 마트리겔(matrigel) 2㎎/㎖이 도포된 transwell의 upper-chamber에 혈청결핍배지(FBS free media)와 넣고 이를 성장배지(10% FBS-media)가 담겨진 low-chamber에서 24시간 배양한 후 침윤 이동한 세포수를 측정한 결과, 도 6 B에서와 같이 AQTGTGKT 및 DAQTGTGKT 펩티드들이 항암제 내성 세포주의 침윤성을 약 50% 이상 억제하는 것으로나타났다.
셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR)에 AQTGTGKT 또는 DAQTGTGKT 펩티드를 처리하고 수득한 조건화 배지(conditioned media)를 마트리겔과 혼합하여 BALB/C 마우스에 주사한 후, FITC-dextran을 주사하여 혈관신생에 미치는 영향을 intravital microscopy로 확인하였다. 이의 결과 도 6 C에서와 같이 AQTGTGKT 및 D-AQTGTGKT 펩티드들이 셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR)의 혈관신생유도 능력을 현저히 감소시키는 것으로 나타났다.
실시예 6. CAGE 유래 8-mer 펩티드의 종양 특이적 이동 조사
AQTGTGKT 펩티드가 종양 특이적 펩티드임을 확인하기 위하여 FITCAQTGTGKT를 이용하여 종래 기지의 방법에 따라 항암제 저항성 세포주와 면역 결핍 쥐를 이용하여 실험하였다.
CAGE의 발현이 높은 셀라스트롤 내성 흑색종 세포주(Malme3MR)를 기지의 방법에 따라 면역 결핍 쥐에 주사하여 종양을 유도한 다음 FITC-AQTGTGKT를 꼬리정맥 주사한 12시간 후 정상조직(뇌, 심장, 비장, 간, 폐 등)과 종양조직을 적출하여 small in vivo imaging system을 이용하여 확인한 결과, 도 7에서와 같이 종양조직에 특이적으로 FITC-AQTGTGKT가 이동하는 것으로 나타났다.
본 발명의 약제학적 조성물은 항암제에 내성을 갖는 암세포 또는 암조직의 항암제 내성을 효과적으로 감소시킬 수 있어 항암제를 사용한 치료 효과를 높일 수 있을 뿐만 아니라, 그 자체로도 우수한 항암활성이 있어 새로운 항암제로 사용할 수 있다.
본 발명 약제학적 조성물의 유효성분인 올리고펩티드는 항체와는 달리 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고 조직 내에 침투가 용이하다는 장점이 있으며, 암세포 또는 암조직에 선택적으로 작용할 수 있어 기존 항암제의 부작용 문제를 효과적으로 개선할 수 있을 것이라 판단된다.
AQTGTGKT

Claims (8)

  1. 서열번호 1(AQTGTGKT)의 아미노산 서열을 갖으며 항암활성 및 항암제 내성 암세포의 항암제에 대한 감수성 증진 활성을 갖는 분리된 펩티드.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩티드는 L-아미노산 또는 D-아미노산으로 합성된 것을 특징으로 하는 펩티드.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 펩티드를 함유하는 항암용 약제학적 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 간암 또는 흑색종의 예방 또는 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에 의해 발생하는 암의 치료에 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  6. 제 1항 또는 제 2항의 펩티드를 함유하는 항암제 보조용 약제학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 간암 또는 흑색종의 예방 또는 치료에서 항암제의 보조용으로 사용하는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 약제학적 조성물은 셀라스트롤 또는 택솔에 대한 내성을 갖는 암세포에 의해 발생하는 암의 치료에서 항암제의 보조용으로 사용하는 것을 특징으로 하는
    항암용 약제학적 조성물.
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