WO2023090546A1 - 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2023090546A1
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tcf4
twist1
emodin
pthrp
expression
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PCT/KR2022/005081
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임우종
임지홍
김영선
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임우종
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    • A23V2250/00—Food ingredients
    • A23V2250/30—Other Organic compounds

Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating cancer comprising emodin as an active ingredient.
  • TCF4-TWIST1 binding increases the expression of PTHrP, and it is known that the expression of PTHrP greatly increases in cancer cells. Therefore, the emodin of the present invention can be used as a composition for preventing or treating cancer by suppressing the expression of PTHrP.
  • Cancer cells formed from epithelial cells can be converted into mesenchymal cells through the increase and activation of EMT-promoting transcription factors through TGF ⁇ 1 (transforming growth factor beta-1) signals, and these cell morphological changes is called the epithelial-mesenchymal transition (EMT).
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • Cancer cells transformed into mesenchymal cells have a strong metastatic effect, immune cell evasion effect, anticancer drug resistance, and the ability as cancer stem cells to evolve into malignant cancer.
  • PTHrP thyroid hormone-related protein
  • PTHrP mRNA expression is greatly increased in cancer cells, and that in breast cancer, as PTHrP increases, cancer cachexia and bone metastasis are promoted.
  • Lung cancer is classified as the most dangerous cancer with high mortality worldwide because primary lung cancer cells metastasize to various distant organs including bone, liver, and brain.
  • tumor-driven osteoclastogenic factors such as TGF ⁇ 1 and PTHrP are known to promote osteolysis and bone metastasis of cancer cells.
  • TGF ⁇ 1 is known to regulate cellular behavior including cell cycle progression, motility, proliferation, and differentiation, and to play a key role in cancer development. It has been reported that cancer cells exposed to TGF ⁇ 1 signals regulate epithelial-mesenchymal transition (EMT)-related gene expression, such as CDH1, CDH2, VIM, SNAI1, and SNAI2.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • cancer cells exposed to the TGF ⁇ 1 signal increase the PTHrP gene, and the PTHrP protein synthesized from the PTHrP gene acts as a hormone to have cancer cell metastasis, proliferation, immune cell evasion, and the like. It has also been reported that SMAD3 transcription factor and TWIST1 transcription factor activated by TGb1 signal increase PTHrP gene expression, thereby inducing cancer malignancy.
  • TCF4 transcription factor 4
  • bHLH basic helix-loop-helix
  • the bHLH region promotes gene expression by specifically binding to the E-box region among DNA sequences. acts as a deterrent.
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • TWIST1 Twist-related protein 1 is an epithelial-mesenchymal transition (EMT) promoting factor, and is known to induce metastasis in epithelial type cancer.
  • An object of the present invention is to provide a composition capable of preventing, improving, or treating the evolution of malignant cancer by EMT promotion.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by increased binding of TCF4-TWIST1, including emodin as an active ingredient.
  • the cancer caused by increased TCF4-TWIST1 binding may preferably be lung cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer caused by increased expression of an EMT-promoting transcription factor or PTHrP containing emodin as an active ingredient.
  • the EMT promoting transcription factor may be preferably SNAI2 or CDH2.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving cancer caused by increased binding of TCF4-TWIST1 containing emodin as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving cancer caused by increased expression of an EMT-promoting transcription factor or PTHrP containing emodin as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer, comprising administering the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer to a subject.
  • the present invention provides a composition excellent in preventing, improving or treating the evolution of malignant cancer by EMT promotion.
  • the present invention inhibits the binding of TCF4-TWIST1 to inhibit the function of an EMT-promoting transcription factor, or inhibits the expression of PTHrP, thereby exhibiting effects of preventing, ameliorating, or treating cancer.
  • 1 is a diagram confirming the binding of TCF4-TWIST1 through immunoprecipitation.
  • Figure 2 is a diagram confirming the binding region of TCF4-TWIST1 through immunoprecipitation.
  • Figure 3 is a diagram showing the increase in the expression of PTHrP and SNAI2 by TCF4 overexpression.
  • FIG. 4 is a diagram showing TCF4 expression according to Ad-GFP and Ad-TCF4 in A549, Calu-1, and NCI-H358 lung cancer cells.
  • FIG. 5 is a diagram showing the increase in the expression of PTHrP and SNAI2 according to the increase in TCF4 expression in A549, Calu-1, and NCI-H358 lung cancer cells.
  • FIGS. 6 and 7 are diagrams showing the mRNA expression levels of PTHrP, TCF4, and SNAI2 according to TCF4 expression inhibition in A549 lung cancer cells and Calu-1 lung cancer cells, respectively.
  • FIGS. 8 and 9 are diagrams showing the mRNA expression levels of PTHrP, TCF4, and SNAI2 according to the double overexpression of TCF4 and TWIST1 in A549 lung cancer cells and NCI-H358 lung cancer cells, respectively.
  • FIG. 10 is a diagram showing the principle of a two-type mammalian hybrid system. Luciferase activity was significantly increased in the full length (FL) of cells expressing GAL4-TWIST1 and VP16-TCF4, and the C-terminal domain of VP16-TCF4 increased luciferase activity together with GAL4-TWIST1 (FL: Full length). , N:N-terminal domain, M:Middle domain, C:C-terminal domain).
  • FIG. 11 is a diagram showing the luciferase activity of a library containing 501 kinds of natural product-derived single substances.
  • 12 is a diagram showing the results of cytotoxicity tests of 12 natural product-derived single substances having low luciferase activity.
  • FIG. 13 is a diagram showing luciferase activity according to the treatment concentration of emodin.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of immunoprecipitation experiments for Myc-tagged TCF4 and Flag-tagged TWIST1.
  • 15 is a diagram showing the results of immunoprecipitation experiments for the Flag-HA tagged TWIST1-NT2 vector and Myc-tagged TCF4.
  • 16 and 17 are diagrams showing the expression levels of CDH2 and PTHrP according to emodin treatment in A549 lung cancer cells and NCI-H358 lung cancer cells, respectively.
  • 18 is a diagram showing the cell viability of lung cancer cells against emodin.
  • FIG. 19 is a diagram showing the cell viability of breast cancer cells against emodin.
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving, or treating cancer caused by increased TCF4-TWIST1 binding, including emodin as an active ingredient.
  • an object of the present invention is to provide a composition for preventing, improving or treating cancer caused by increased expression of PTHrP containing emodin as an active ingredient.
  • Emodin is an orange needle-shaped crystal or powder, and refers to a substance having a structure represented by the following [Formula 1].
  • TCF4 transcription factor 4
  • PTHrP parathyroid hormone-related protein
  • EMT epithelial-mesenchymal transition
  • TCF4 and TWIST1 Twist-related protein 1 bind in a specific region.
  • PTHrP TCF4-TWIST1 binding, that is, dual overexpression of TCF4 and TWIST1.
  • an object of the present invention is to provide a composition having excellent effects in improving, treating, and preventing cancer by inhibiting the binding of TCF4-TWIST1. It is known that when the expression of PTHrP is further promoted by TCF4-TWIST1 binding, the growth of breast cancer, lung cancer, and colorectal cancer is promoted, and the possibility of bone metastasis increases.
  • emodin has low luciferase activity and low cytotoxicity, so it is selected as a candidate substance that inhibits TCF4-TWIST1 binding, and emodin inhibits luciferase activity by GAL16-TWIST1 and VP16-TCF4 binding.
  • luciferase activity was suppressed as the treatment concentration of emodin increased.
  • emodin inhibits TCF4-TWIST1 binding.
  • the present invention confirmed that the expression of EMT promoting genes and PTHrP decreased according to emodin treatment.
  • the present invention confirmed that lung cancer cells and breast cancer cells were significantly killed by emodin treatment.
  • the present invention relates to a health functional food composition for improving or preventing cancer containing emodine as an active ingredient, in addition to containing emodine as an active ingredient, various flavoring agents or natural carbohydrates, etc. may be included as an additional component.
  • natural carbohydrates examples include monosaccharides such as glucose, fructose, and the like; disaccharides such as maltose, sucrose and the like; and polysaccharides such as conventional sugars such as dextrins, cyclodextrins, and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents thaumatin
  • stevia extracts eg rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.
  • synthetic flavoring agents sacharin, aspartame, etc.
  • the food composition of the present invention is formulated in the same way as the following pharmaceutical composition and can be used as a functional food or added to various foods.
  • Foods to which the composition of the present invention can be added include, for example, beverages, meat, chocolate, foods, confectionery, pizza, ramen, other noodles, chewing gum, candy, ice cream, alcoholic beverages, vitamin complexes and health supplements, etc. there is
  • the food composition includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and enhancers (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, in addition to extracts that are active ingredients. , alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonating agents used in carbonated beverages, and the like.
  • the food composition of the present invention may contain natural fruit juice and fruit flesh for preparing fruit juice beverages and vegetable beverages.
  • the health functional food composition of the present invention may be prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids, pills, and the like.
  • 'health functional food composition' refers to a food manufactured and processed using raw materials or ingredients having useful functionalities for the human body according to the Health Functional Food Act No. 6727, and the structure and function of the human body It refers to intake for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients or physiological functions.
  • the health functional food of the present invention may contain ordinary food additives, and the suitability as a food additive is determined according to the general rules of the Food Additive Code and general test methods approved by the Ministry of Food and Drug Safety, unless otherwise specified. It is judged according to the relevant standards and standards.
  • Examples of the items listed in the 'Food Additive Code' include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid; natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum; and mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, calcium citrate, nicotinic acid, and cinnamic acid
  • natural additives such as persimmon pigment, licorice extract, crystalline cellulose, kaoliang pigment, and guar gum
  • mixed preparations such as sodium L-glutamate preparations, noodle-added alkali preparations, preservative preparations, and tar color preparations.
  • a health functional food in the form of a tablet is obtained by granulating a mixture obtained by mixing the active ingredient of the present invention with an excipient, a binder, a disintegrant, and other additives in a conventional manner, and then adding a lubricant or the like to compression molding, or The mixture can be directly compression molded.
  • the health functional food in the form of a tablet may contain a flavoring agent or the like, if necessary.
  • hard capsules can be prepared by filling a mixture in which the active ingredient of the present invention is mixed with additives such as excipients in a normal hard capsule. It can be prepared by filling a mixture mixed with gelatin in a capsule base.
  • the soft capsule may contain a plasticizer such as glycerin or sorbitol, a colorant, a preservative, and the like, if necessary.
  • the health functional food in the form of a pill can be prepared by molding a mixture of the active ingredient of the present invention mixed with an excipient, binder, disintegrant, etc. by a conventionally known method, and can be coated with sucrose or other coating agent if necessary, Alternatively, the surface may be coated with a material such as starch or talc.
  • Health functional food in the form of granules can be prepared in granular form by a conventionally known method of mixing the excipients, binders, disintegrants, etc. of the active ingredients of the present invention, and if necessary, flavoring agents, flavoring agents, etc. can
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising emodin as an active ingredient, and the pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant in addition to the active ingredient.
  • an adjuvant in addition to the active ingredient. Any of the adjuvants known in the art may be used without limitation.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be prepared in the form of incorporating the active ingredient into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutically acceptable carrier includes carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • Pharmaceutically acceptable carriers usable in the pharmaceutical composition of the present invention include, but are not limited to, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated and used in the form of oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations contain at least one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and gelatin in addition to active ingredients. It can be prepared by mixing etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • compositions for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • Witepsol, TweenW 61, cacao paper, laurin paper, glycerogelatin, etc. may be used as a base for suppositories.
  • composition according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration are contemplated, eg oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the pharmaceutical composition may be formulated into various oral or parenteral dosage forms.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard and soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, etc. chlorose, mannitol, sorbitol, cellulose and/or glycine), lubricants such as silica, talc, stearic acid and magnesium or calcium salts thereof and/or polyethylene glycol.
  • the tablet may contain a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and in some cases starch, agar, alginic acid or a disintegrant or effervescent mixture, such as its sodium salt, and/or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
  • a binder such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and/or polyvinylpyrrolidine, and in some cases starch, agar, alginic acid or a disintegrant or effervescent mixture, such as its sodium salt, and/or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners.
  • the formulation may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • a typical formulation for parenteral administration is an injection formulation, and water, Ringer's solution, isotonic physiological saline or suspension may be used as a solvent for the injection formulation.
  • Sterile fixed oils of the above injectable preparations may be used as a solvent or suspension medium, and any bland fixed oil may be used for this purpose, including mono- and di-glycerides.
  • the formulation for injection may use a fatty acid such as oleic acid.
  • Adenoviral particles expressing TCF4 (Gene Accession Number: BC031056) or GFP (green fluorescent protein) were purchased from Applied Biological Materials (abm). Each lung cancer cell (A549(10185), Calu-1(30054), NCI-H358(25807), NCI-H460(30177), Korean Cell Line Bank (Seoul, South Korea)) was treated with DMEM containing 10% FBS. and Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640.
  • Lung cancer cells were incubated for 72 hours with GFP expressing TCF4 or adenoviral particles at a concentration of 1 ⁇ 10 4 pfu/ml. TCF4 expression was confirmed using qRT-PCR.
  • total RNA was isolated using TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) and isopropanol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
  • cDNA was synthesized from total RNA using reverse transcriptase and a cDNA synthesis kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). SYBR Green qPCR mixture (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was used for qRT-PCR and experimental Ct values were normalized and calculated with the 36B4 gene.
  • TCF4 overexpression by adenovirus transduction increased the expression of PTHrP in all lung cancer cells (A549, Calu-1, NCI-H358, NCI-H460), and EMT promoting gene SNAI2, known as , also showed a tendency to increase.
  • TCF4 expression in Ad-GFP or Ad-TCF4 expressed in each lung cancer cell is shown in FIG. 4 .
  • a mammalian expression vector such as Myc-tagged TCF4 expression vector is temporarily transfected into cultured lung cancer cells and PTHrP The expression of was confirmed.
  • Myc-tagged TCF4 and partial domain mutants (TCF4-ND, -MD, -CD) were provided from Seoul National University.
  • Flag-HA-TWIST1 and domain mutants were generated using PCR with a V5 tagged TWIST1 plasmid containing primers with EcoR I and Xhol restriction sites, and then the amplified PCR fragments were pc- It was inserted into DNA Flag-HA vector (Addgene).
  • 0.5 ⁇ g/ml of Myc-tagged TCF4 expression vector was transfected into lung cancer cells using Polyfect (Qiagen, Hilden, Germany) at 1 ⁇ l/ml. 20 nM SiRNA control and TCF4 (Integrated DNA Technologies, Inc. USA) were transfected using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), followed by further incubation for 48 hours for stabilization and protein expression.
  • TCF4 expression knockdown on PTHrP and SNAI2 expression was confirmed.
  • the transfected cells were treated with 20 ng/ml of TGF ⁇ 1 and further cultured for 48 hours.
  • the mRNA levels of PTHrP, TCF4, and SNAI2 were measured by qRT-PCR.
  • FIGS. 6 and 7 show the mRNA expression levels of PTHrP, TCF4, and SNAI2 in A549 lung cancer cells and Calu-1 lung cancer cells, respectively.
  • TCF4 and TWIST1 bind according to Experimental Example 1, the TCF4-TWIST1 binding, that is, the effect of promoting PTHrP expression by double overexpression of TCF4 and TWIST1 was confirmed.
  • Adenovirus-expressing negative controls, GFP or TCF4 were transduced into Flag-tagged empty or TWIST1 ectopic lung cancer cells.
  • the mRNA levels of PTHrP, TCF4, and SNAI2 were measured by qRT-PCR.
  • TCF4 and TWIST1 show the mRNA expression levels of PTHrP, TCF4, and SNAI2 in A549 lung cancer cells and NCI-H358 lung cancer cells, respectively.
  • Double overexpression of TCF4 and TWIST1 greatly increased the expression of PTHrP. That is, TCF4 maximizes PTHrP expression by promoting the transcriptional activity of TWIST1, and double overexpression of TCF4 and TWIST1 increases the expression of PTHrP up to 8-fold compared to overexpression of TCF4 or TWIST1 alone.
  • SNAI2 known as an EMT promoting gene, also showed a 6-fold increase in expression.
  • PTHrP is particularly expressed in cancer cells and is known to induce cancer cachexia.
  • PTHrP induces browning of adipose tissue and promotes the expression of thermogenic genes, which is known to cause rapid weight loss and decreased muscle function (Serkan Kir et al., Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia, Nature, 2014 Sep 4;513(7516): 100-104).
  • PTHrP is known to promote cancer cell growth and bone metastasis in breast, lung and colorectal cancers.
  • the present invention was intended to suppress the expression of PTHrP for suppressing the induction of cancer cachexia, inhibiting the growth of cancer cells, and inhibiting bone metastasis of cancer, and based on Experimental Example 3, a substance inhibiting the binding of TCF4-TWIST1 explored.
  • a Mammalian Two hybrid system based on GAL4-VP16 was constructed (CheckMateTM/Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System Kit (Promega)) .
  • TCF4 The full length (1-671 a.a), N-terminal domain (1-250 a.a), intermediate domain (251-500 a.a) and C-terminal domain (501-671 a.a) of TCF4 were synthesized with Sgf I and Pme I restriction enzymes. It was inserted into the pFN10A vector expressing VP16-tagged TCF4. The full length of TWIST1 was inserted into the pFN11A vector expressing GAL4-tagged TWIST1 with Sgf I and Pme I restriction enzymes, and the pGL4.31 (luc2P/GAL4UAS/Hygro) vector was used to mediate VP16-TCF4 and GAL4-TWIST1 interaction with luciferase. Raise expression was measured (see Figure 10).
  • the luciferase activity was significantly increased in the full length (FL) of the cells expressing GAL4-TWIST1 and VP16-TCF4, and the C-terminal domain of VP16-TCF4 had luciferase activity together with GAL4-TWIST1. was confirmed to increase.
  • HEK239T cells were transiently transfected with pGL4.31-Luc, pFN10A-TCF4, and pFN11A-TWIST1, and the cells were incubated for 24 days. It was stabilized by additional incubation time. Then, the cells were divided into 96 well cell culture plates and incubated for 24 hours. Cells expressing pGL4.31-Luc, pFN10A-TCF4, and pFN11A-TWIST1 were treated with 10 ⁇ M of the library containing single substances derived from natural products, and incubated for 24 hours.
  • the cell lysate was reacted with a luciferase assay buffer and a luciferin substrate, and then the luciferase activity was measured using a Luminometer (BioTek, Winooski, VT, USA).
  • HEK239T cells were treated with 10 ⁇ M of 12 kinds of natural product-derived single substances and cultured for 48 hours. The cultured cells were washed with PBS, fixed in a 4% paraformaldehyde solution for 10 minutes, and then stained with a 0.5% crystal violet (Sigma aldrich) solution for 10 minutes. The stained cells were dried at room temperature for 24 hours, lysed using a solution containing 1% SDS, and then analyzed by absorbance.
  • FIG. 14 shows the experimental results for Myc-tagged TCF4 and Flag-tagged TWIST1
  • FIG. 15 shows the experimental results for the Flag-HA tagged TWIST1-NT2 vector and Myc-tagged TCF4. It was confirmed that TCF4-TWIST1 binding was inhibited when emodin was treated.
  • CDH2 (Cadherin-2) is known as an EMT promoting gene.
  • TGF ⁇ 1 (20 ng/ml) for 1 hour
  • Emodin 20 ⁇ M
  • 16 and 17 show the expression levels of CDH2 and PTHrP according to emodin treatment in A549 lung cancer cells and NCI-H358 lung cancer cells, respectively. It was confirmed that CDH2 and PTHrP, which were increased by TGF ⁇ 1, decreased with emodin treatment.
  • A549, Calu-1, NCI-H460 lung cancer cells were treated with DMSO as a negative control (emodin 0 uM) and emodin at different concentrations (2.5-40 uM) and cultured for 48 hours.
  • the cultured cells were washed with PBS, fixed in a 4% paraformaldehyde solution for 10 minutes, and then stained with a 0.5% crystal violet (Sigma aldrich) solution for 10 minutes.
  • the stained cells were dried at room temperature for 24 hours, lysed using a solution containing 1% SDS, and analyzed through absorbance.

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Abstract

본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, EMT 촉진에 의한 악성 암으로의 진화를 예방, 개선 또는 치료할 수 있으며, EMT 촉진 전사인자의 기능을 억제하여 암을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 에모딘(emodin)을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. TCF4-TWIST1 결합에 의해 PTHrP의 발현이 증가하는데, PTHrP의 발현은 암세포에서 크게 증가한다고 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 에모딘은 PTHrP의 발현을 억제하여 암 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있다.
상피세포(epithelial cell)로부터 형성된 암세포는 TGFβ1(transforming growth factor beta-1) 신호를 통한 EMT촉진 전사인자의 증가와 활성화를 통해 중간엽세포(mesenchymal cell)로 전환될 수 있으며, 이러한 세포형태의 변화를 EMT(epithelial-mesenchymal transition, 상피-중간엽 전이)이라 한다. 중간엽세포로 변형된 암세포는 강한 전이효과, 면역세포 회피효과, 항암제 저항성, 암 줄기세포로서의 능력을 가져 악성 암으로 진화한다.
한편, PTHrP(parathyroid hormone-related protein)는 정상적인 유전자 산물로 다양한 신경 내분비조직과 태반에서 발현되며, 성장판에서 연골내 뼈 성장과 혈중 칼슘 농도를 조절하는 것으로 알려져 있다. PTHrP mRNA 발현은 암세포에서 크게 증가하며, 유방암에서 PTHrP가 증가함에 따라 암악액질과 골전이를 촉진하는 점이 알려져 있다. 또한, 폐암 종양 유래 PTHrP가 암악액질을 유도하며, PTHrP를 중화(neutralization)할 경우 지방조직의 갈변과 근육량, 근력의 손실을 차단할 수 있다고 보고된 바 있다(Serkan Kir et al., Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia, Nature, 2014 Sep 4; 513(7516): 100-104).
폐암은 주로 원발성 폐암세포가 뼈, 간, 뇌를 포함한 다양한 원거리 장기로 전이되기 때문에 전 세계적으로 사망률이 높은 가장 위험한 암으로 분류된다. 폐암, 유방암 등의 골전이 과정에서 TGFβ1, PTHrP 등과 같은 종양 유발 파골세포 형성 인자(tumor-driven osteoclastogenic factors)는 골용해(osteolysis)와 암세포의 골전이를 촉진한다고 알려져 있다.
TGFβ1은 세포 주기의 진행, 운동성, 증식, 분화 등을 포함하는 세포 행동(cellular behavior)을 조절하고, 암 발달에 대한 핵심 기능을 한다고 알려져 있다. TGFβ1 신호에 노출된 암세포는 CDH1, CDH2, VIM, SNAI1, SNAI2와 같은 상피-중간엽 전이(EMT) 관련 유전자 발현을 조절한다고 보고된 바 있다.
또한, TGFβ1 신호에 노출된 암세포는 PTHrP유전자를 증가시키고, PTHrP유전자로부터 합성된 PTHrP단백질은 호르몬으로 작용하여 암세포의 전이, 증식, 면역세포 회피 등의 능력을 가진다고 알려져 있다. 또한 TGb1 신호에 의해 활성화된 SMAD3 전사인자와 TWIST1 전사인자가 PTHrP유전자 발현을 증가시킴으로써 암의 악성화를 유도한다고 보고된 바 있다.
한편, TCF4(transcription factor 4)는 DNA binding 기능을 가진 bHLH(basic helix-loop-helix) 영역을 가지고 있는데, bHLH 영역은 DNA 염기서열 중 특이적으로 E-box 영역에 결합함으로써 유전자 발현을 촉진하거나 억제하는 역할을 한다. 암의 성장과 전이에서 TCF4의 기능이 부분적으로 보고되고 있으며, 최근 TGFβ1 신호에 의해 TCF4가 증가되어 상피-중간엽 전이(EMT)가 촉진되는 점이 보고된 바 있다. 또한 TWIST1(Twist-related protein 1)은 상피-중간엽 전이(EMT) 촉진인자로, 상피 유형의 암에서 전이를 유발한다고 알려져 있다.
본 발명은 EMT 촉진에 의한 악성 암으로의 진화를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암은 바람직하게는 폐암인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 EMT 촉진 전사인자 또는 PTHrP 발현이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 EMT 촉진 전사인자는 바람직하게는 SNAI2 또는 CDH2인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 EMT 촉진 전사인자 또는 PTHrP 발현이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 EMT 촉진에 의한 악성 암으로의 진화를 예방, 개선 또는 치료 효과가 우수한 조성물을 제공한다. 본 발명은 TCF4-TWIST1의 결합을 억제하여 EMT 촉진 전사인자의 기능을 억제하거나, PTHrP 발현을 억제함에 따라 암의 예방, 개선 또는 치료 효과를 발휘한다.
도 1은 면역침강법을 통해 TCF4-TWIST1의 결합을 확인한 도이다.
도 2는 면역침강법을 통해 TCF4-TWIST1의 결합영역을 확인한 도이다.
도 3은 TCF4 과발현에 의한 PTHrP와 SNAI2의 발현 증가를 나타낸 도이다.
도 4는 A549, Calu-1, NCI-H358 폐암세포에서 Ad-GFP와 Ad-TCF4에 따른 TCF4 발현을 나타낸 도이다.
도 5는 A549, Calu-1, NCI-H358 폐암세포에서 TCF4 발현 증가에 따라 PTHrP와 SNAI2의 발현 증가를 나타낸 도이다.
도 6 및 도 7은 각각 A549 폐암세포와 Calu-1 폐암세포에서 TCF4 발현 억제에 따른 PTHrP, TCF4, SNAI2의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
도 8 및 도 9는 각각 A549 폐암세포와 NCI-H358 폐암세포에서 TCF4 및 TWIST1의 이중 과발현에 따른 PTHrP, TCF4, SNAI2의 mRNA 발현량을 나타낸 도이다.
도 10은 포유류 2종 하이브리드 시스템의 원리를 나타낸 도이다. GAL4-TWIST1 및 VP16-TCF4 발현 세포의 전장(FL)에서 루시퍼레이즈 활성이 크게 증가하였으며, VP16-TCF4의 C-terminal 도메인은 GAL4-TWIST1와 함께 루시퍼레이즈 활성을 증가시키는 것으로 나타났다(FL:Full length, N:N-terminal domain, M:Middle domain, C:C-terminal domain).
도 11은 501종의 천연물 유래 단일물질을 포함하는 라이브러리의 루시퍼레이즈 활성을 나타낸 도이다.
도 12는 루시퍼레이즈 활성이 낮은 12종의 천연물 유래 단일물질의 세포독성 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 에모딘의 처리 농도에 따른 루시퍼레이즈 활성을 나타낸 도이다.
도 14는 Myc-tagged TCF4 및 Flag-tagged TWIST1에 대한 면역침강법 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 Flag-HA tagged TWIST1-NT2 벡터 및 Myc-tagged TCF4에 대한 면역침강법 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 16 및 도 17은 각각 A549 폐암세포와 NCI-H358 폐암세포에서 에모딘 처리에 따른 CDH2 및 PTHrP의 발현 정도를 나타낸 도이다.
도 18은 폐암세포의 에모딘에 대한 세포생존율을 나타낸 도이다.
도 19는 유방암세포의 에모딘에 대한 세포생존율을 나타낸 도이다.
본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 PTHrP 발현이 증가하여 발생하는 암 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
에모딘(emodin)은 주황색 침상 결정체 또는 분말로, 하기 [화학식 1]의 구조를 가지는 물질을 말한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2022005081-appb-img-000001
본 발명은 TCF4(transcription factor 4)의 발현이 PTHrP(parathyroid hormone-related protein)의 발현량에 영향을 미치는 점을 확인하였으며, EMT(epithelial-mesenchymal transition, 상피-중간엽 전이)촉진 유전자 역시 유사한 발현 양상을 보이는 점을 확인하였다.
또한, 본 발명은 TCF4와 TWIST1(Twist-related protein 1)이 특정 영역에서 결합하는 점을 확인하였다. 또한, TCF4-TWIST1 결합, 즉 TCF4 및 TWIST1의 이중 과발현(dual overexpression)에 의해 PTHrP의 발현이 더욱 촉진되는 점을 확인하였다.
한편, 본 출원의 발명자는 TCF4-TWIST1의 결합에 따라 EMT 촉진 유전자 발현이 증가되어 폐암의 골전이 가능성을 확인한 바 있다(PGC1α Loss Promotes Lung Cancer Metastasis through Epithelial-Mesenchymal Transition. Cancers (Basel). 2021 Apr 8;13(8):1772). 암세포는 EMT가 촉진됨에 따라 전이 능력이 강해지고, 면역세포 회피능력과 항암제 저항능력이 강해진다. 이에 본 발명은 TCF4-TWIST1의 결합을 억제함에 따른 암의 개선, 치료, 예방 효과가 우수한 조성물을 제공하고자 하였다. TCF4-TWIST1의 결합에 의해 PTHrP의 발현이 더욱 촉진될 경우, 유방암, 폐암, 대장암의 성장이 촉진되며, 이들의 골전이 발생 가능성이 높아진다고 알려져 있다.
본 발명은 에모딘(emodin)이 루시퍼레이즈 활성이 낮으며, 세포독성도 낮아 TCF4-TWIST1 결합을 억제하는 후보물질로 선정하고, 에모딘이 GAL16-TWIST1과 VP16-TCF4 결합에 의한 루시퍼레이즈 활성에 미치는 영향을 확인한 결과, 에모딘의 처리 농도가 증가할수록 루시퍼레이즈 활성이 억제되는 것을 확인하였다. 또한 면역침강법을 수행하여 확인한 결과, 에모딘이 TCF4-TWIST1 결합을 억제하는 점을 확인하였다. 또한, 본 발명은 에모딘 처리에 따라 EMT 촉진 유전자와 PTHrP의 발현이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명은 에모딘 처리에 의해 폐암세포와 유방암세포가 현저하게 사멸되는 것을 확인하였다.
한편, 본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 개선 또는 예방용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 유효성분인 에모딘을 포함하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 하기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화 되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알콜 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀 기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(Adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(Witepsol), 트윈(TweenW) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수 있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
<실험예 1> TCF4 및 TWIST1의 결합 확인
본 실험에서는 면역침강법(immunoprecipitation)을 이용하여 TCF4-TWIST1의 결합과 이들의 결합영역을 확인하였다. 세포를 Myc-TCF4 및 Flag-HA-TWIST1로 일시적으로 형질감염시킨 뒤 48시간 인큐베이션하였다. 1% CHAPS, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl(pH 7.9) 및 0.1 mM EDTA 함유 용해 완충액을 사용하여 총 세포 용해물(total cell lysates)을 얻었다. 1mg의 세포 용해물을 15 ㎕ Flag-M2-affinity agarose gel(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)에서 4℃에서 16시간 인큐베이션하였다. 웨스턴블롯을 위해 면역침강 후 용출된 단백질과 총 단백질에 대하여 SDS-PAGE을 수행한 뒤, 전기 영동 된 단백질을 PVDF 멤브레인(Millipore, Burlington, MA, USA)으로 옮겼다(tranfer). PVDF 멤브레인에 옮겨진 단백질을 각각 4℃에서 16시간 1차 항체(anti-Flag 및 anti-Myc)와 반응시키고 실온에서 1시간 2차 항체와 반응시켰다. ECL Prime 키트(GE Healthcare, Milwaukee, USA)를 이용하여 단백질 발현을 시각화하였다. 표 1에 항체 정보를 기재하였다.
Figure PCTKR2022005081-appb-img-000002
실험결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1에서 보듯이, TWIST1과 TCF4의 결합을 확인하였으며, 도 2에서 보듯이, TCF4단백질이 TWIST1단백질의 bHLH(basic helix-loop-helix) 영역에 결합하는 것을 확인하였다.
<실험예 2> TCF4 발현 증가에 따른 PTHrP 발현 증가 확인
TCF4(Gene Accession Number: BC031056) 또는 GFP(green fluorescent protein)를 발현하는 아데노바이러스 입자는 Applied Biological Materials(abm)에서 구입하였다. 각각의 폐암세포(A549(10185), Calu-1(30054), NCI-H358(25807), NCI-H460(30177), Korean Cell Line Bank (Seoul, South Korea))는 10 % FBS가 포함된 DMEM 및 Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640에서 배양하였다.
2-1. 형질도입(transduction)
폐암세포를 1×104 pfu/㎖의 농도로 TCF4 또는 아데노바이러스 입자를 발현하는 GFP와 함께 72시간 인큐베이션하였다. TCF4 발현은 qRT-PCR을 이용하여 확인하였다. 배양된 폐암세포의 mRNA 발현을 측정하기 위해 TRIZOL(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)과 isopropanol(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. cDNA는 역전사효소와 cDNA 합성 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 총 RNA로부터 합성되었다. SYBR Green qPCR 혼합물(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 qRT-PCR에 사용하고 실험적 Ct값을 정규화하고 36B4 유전자로 계산하였다.
Figure PCTKR2022005081-appb-img-000003
도 3에서 보듯이, 아데노바이러스 형질도입(transduction)에 의한 TCF4 과발현은 각각의 폐암세포(A549, Calu-1, NCI-H358, NCI-H460) 모두에서 PTHrP의 발현을 증가시켰으며, EMT 촉진 유전자로 알려진 SNAI2 역시 증가하는 경향을 보였다. 또한, 도 4에 각각의 폐암세포(A549, Calu-1, NCI-H358)에서 발현되는 Ad-GFP 또는 Ad-TCF4에서의 TCF4 발현을 나타내었다.
2-2. 형질주입(transfection)
한편, 아데노바이러스 시스템의 경우 비특이적인 유전자발현이 발생할 수 있으므로, 이러한 기술적 오류를 극복하기 위해 Myc-tagged TCF4 발현 벡터와 같은 포유동물 발현 벡터를 배양된 폐암세포에 일시적으로 형질주입(transfection)하여 PTHrP의 발현을 확인하였다. Myc-tagged TCF4 및 부분 도메인 돌연변이체(TCF4-ND, -MD, -CD)는 서울대학교로부터 제공되었다. Flag-HA-TWIST1 및 도메인 돌연변이체(TWIST1-NT1, -NT2)는 EcoR Ⅰ 및 Xhol 제한부위가 있는 프라이머를 포함하는 V5 tagged TWIST1 플라스미드와 PCR을 사용하여 생성한 다음, 증폭된 PCR 단편을 pc-DNA Flag-HA 벡터(Addgene)에 삽입하였다.
Figure PCTKR2022005081-appb-img-000004
Myc-tagged TCF4 발현 벡터 0.5 ㎍/㎖를 폐암세포에서 1 ㎕/㎖의 Polyfect(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 형질주입하였다. 20 nM SiRNA 대조군 및 TCF4(Integrated DNA Technologies, Inc. USA)는 Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 형질주입한 뒤, 안정화 및 단백질 발현을 위해 48시간 추가배양하였다.
도 5에 TCF4의 이소성(ectopic) 발현 결과를 나타내었다. 각각의 폐암세포(A549, Calu-1, NCI-H358)에서 TCF4단백질 발현 증가에 따라 PTHrP가 증가하는 것을 확인하였으며, SNAI2 또한 증가하는 것으로 나타났다.
한편, TCF4 발현 억제(knockdown)가 PTHrP와 SNAI2 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 대조군 또는 TCF4에 대한 siRNA를 폐암세포에 일시적으로 형질주입한 뒤, 형질주입된 세포에 TGFβ1 20 ng/㎖를 처리하고 48시간 추가 배양하였다. PTHrP, TCF4, SNAI2의 mRNA 수준은 qRT-PCR에 의해 측정되었다.
도 6 및 도 7에 각각 A549 폐암세포와 Calu-1 폐암세포에서 PTHrP, TCF4, SNAI2의 mRNA 발현량을 나타내었다. TGFβ1 처리를 통해 발현이 증가된 PTHrP와 SNAI2는 TCF4 발현 억제에 따라 모두 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
<실험예 3> TCF4 및 TWIST1의 이중 과발현(dual overexpression)에 의한 PTHrP 발현 촉진 효과 확인
본 실험에서는 상기 실험예 1에 따라 TCF4와 TWIST1이 결합한다는 사실을 바탕으로, TCF4-TWIST1의 결합, 즉 TCF4 및 TWIST1의 이중 과발현에 의한 PTHrP 발현 촉진 효과를 확인하였다. 아데노바이러스를 발현하는 음성 대조군인 GFP 또는 TCF4를 Flag-tagged empty 또는 TWIST1 이소성 폐암세포로 형질도입하였다. PTHrP, TCF4, SNAI2의 mRNA 수준은 qRT-PCR에 의해 측정되었다.
도 8 및 도 9에 각각 A549 폐암세포와 NCI-H358 폐암세포에서 PTHrP, TCF4, SNAI2의 mRNA 발현량을 나타내었다. TCF4 및 TWIST1의 이중 과발현은 PTHrP의 발현을 크게 증가시켰다. 즉, TCF4는 TWIST1의 전사활성을 촉진함으로써 PTHrP 발현을 극대화 시키며, TCF4 및 TWIST1 이중 과발현은 TCF4를 단독으로 또는 TWIST1을 단독으로 과발현시킨 경우에 비해 PTHrP가 최대 8배 이상 발현이 증가하는 것으로 나타났으며, EMT 촉진 유전자로 알려진 SNAI2도 6배 이상 발현이 증가하는 것으로 나타났다.
<실험예 4> TCF4 및 TWIST1의 결합 억제 물질 스크리닝
본 실험에서는 TCF4-TWIST1의 결합, 즉 TCF4 및 TWIST1의 이중 과발현에 의한 PTHrP 발현 촉진 효과를 억제하기 위해, TCF4-TWIST1의 결합을 억제하는 물질을 탐색하였다.
PTHrP는 암세포에서 특히 발현이 증가하며, 암악액질을 유도하는 물질로 알려져 있다. PTHrP는 지방조직의 갈변을 유도하여 열 발생 유전자의 발현을 촉진시키고, 이를 통해 급격한 체중감소, 근육기능 저하 등을 일으킨다고 알려져 있다(Serkan Kir et al., Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia, Nature, 2014 Sep 4; 513(7516): 100-104). 또한 PTHrP는 유방암, 폐암, 대장암에서 암세포의 성장과 암의 골전이를 촉진한다고 알려져 있다. 이에, 본 발명은 암악액질의 유도를 억제하고, 암세포의 성장 억제, 암의 골전이 억제 효과를 위해 PTHrP의 발현을 억제하고자 하였으며, 상기 실험예 3을 바탕으로 TCF4-TWIST1의 결합을 억제하는 물질을 탐색하였다.
TCF4와 TWIST1의 결합을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위해 GAL4-VP16을 기반으로 한 포유류 2종 하이브리드 시스템(Mammalian Two hybrid system)을 구축하였다(CheckMateTM/Flexi® Vector Mammalian Two-Hybrid System Kit(Promega)).
TCF4의 전장(1-671 a.a), N-terminal 도메인(1-250 a.a), 중간 도메인(251-500 a.a) 및 C-terminal 도메인(501-671 a.a)을 Sgf Ⅰ 및 Pme Ⅰ 제한효소가 있는 VP16-tagged TCF4를 발현하는 pFN10A 벡터에 삽입하였다. TWIST1의 전장을 Sgf Ⅰ 및 Pme Ⅰ 제한효소가 있는 GAL4-tagged TWIST1를 발현하는 pFN11A 벡터에 삽입하고 pGL4.31(luc2P/GAL4UAS/Hygro) 벡터를 이용하여 VP16-TCF4 및 GAL4-TWIST1 상호작용 매개 루시퍼레이즈 발현을 측정하였다(도 10 참조).
Figure PCTKR2022005081-appb-img-000005
도 10에서 보듯이, GAL4-TWIST1 및 VP16-TCF4 발현 세포의 전장(FL)에서 루시퍼레이즈 활성이 크게 증가하는 것으로 나타났으며, VP16-TCF4의 C-terminal 도메인은 GAL4-TWIST1와 함께 루시퍼레이즈 활성을 증가시키는 것을 확인하였다.
이에, 501종의 천연물 유래 단일물질을 사용하여 HTS(High Throughput Screening)를 수행하기 위해, HEK239T세포에 pGL4.31-Luc, pFN10A-TCF4 및 pFN11A-TWIST1을 일시적으로 형질주입한 뒤, 세포를 24시간 추가 배양하여 안정화하였다. 이후, 세포를 96 well 세포 배양 플레이트에 분할하고 24시간 인큐베이션하였다. 천연물 유래 단일물질을 포함한 라이브러리를 pGL4.31-Luc, pFN10A-TCF4 및 pFN11A-TWIST1 발현 세포에 10 μM로 처리하고 24시간 추가 인큐베이션하였다. 루시퍼레이즈 활성을 측정하기 위해 세포 용해물을 루시퍼레이즈 분석 완충액 및 루시페린 기질과 반응시킨 후 Luminometer(BioTek, Winooski, VT, USA)를 사용하여 루시퍼레이즈 활성을 측정하였다.
도 11에서 보듯이, 약 12여가지의 천연물 유래 단일물질에서 루시퍼레이즈 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
한편, 천연물 유래 물질은 일반적으로 세포독성을 나타내며, 세포독성에 의해 루시퍼레이즈 활성이 감소되는 기술적 오류를 극복하기 위해, 12종류의 천연물 유래 단일물질 각각에 대하여 세포독성을 분석하였다. HEK239T 세포에 12종의 천연물 유래 단일물질을 10 μM로 처리하여 48시간 배양하였다. 배양된 세포를 PBS 세척 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액에서 10분간 고정한 뒤, 0.5% Crystal violet(Sigma aldrich) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 상온에서 24시간 건조한 뒤 1% SDS를 포함한 용액을 이용하여 용해시킨 후 흡광도를 통해 분석하였다.
도 12에서 보듯이, 에모딘을 제외한 11종류의 천연물 유래 단일물질은 대부분 세포독성이 강하게 나타나는 반면, 에모딘은 세포독성이 상대적으로 낮은 것으로 나타났다.
또한, 에모딘이 GAL16-TWIST1과 VP16-TCF4 결합에 의한 루시퍼레이즈 활성에 미치는 영향을 확인하고자 에모딘을 다양한 농도로 처리한 결과, 도 13에서 보듯이, 에모딘의 처리 농도가 증가할수록 루시퍼레이즈 활성이 억제되는 것을 확인하였다.
<실험예 5> 에모딘(emodin)에 의한 TCF4-TWIST1 결합 억제 효과 확인
본 실험에서는 면역침강법(실험예 1 참조)을 이용하여 에모딘에 의한 TCF4-TWIST1 결합 억제 효과를 확인하였다. 일시적으로 형질주입된 Myc-tagged TCF4와 Flag-tagged TWIST1을 에모딘 20 μM을 처리한 뒤 24시간 추가 배양하여 면역침강법을 수행하였다.
도 14에 Myc-tagged TCF4 및 Flag-tagged TWIST1에 대한 실험 결과를, 도 15에 Flag-HA tagged TWIST1-NT2 벡터 및 Myc-tagged TCF4에 대한 실험 결과를 나타내었다. 에모딘을 처리한 경우 TCF4-TWIST1 결합이 억제되는 것을 확인하였다.
<실험예 6> 에모딘의 PTHrP 발현 억제 효과 확인
본 실험에서는 TCF4-TWIST1의 결합이 PTHrP와 EMT 촉진 유전자 발현을 증가시키는 점을 바탕으로 에모딘의 CDH2 및 PTHrP 발현 억제 효과를 확인하였다. CDH2(Cadherin-2)는 EMT 촉진 유전자로 알려져있다. 각각의 A549, NCI-H356 폐암세포를 TGFβ1(20 ng/㎖)와 함께 1시간 인큐베이션 한 뒤 24시간 에모딘(20 μM)과 인큐베이션하고 CDH2 및 PTHrP의 mRNA 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 측정하였다.
도 16 및 도 17에 각각 A549 폐암세포와 NCI-H358 폐암세포에서 에모딘 처리에 따른 CDH2 및 PTHrP의 발현 정도를 나타내었다. TGFβ1에 의해 증가된 CDH2와 PTHrP는 에모딘 처리에 따라 감소하는 것을 확인하였다.
<실험예 7> 에모딘에 대한 암세포의 세포생존율 실험
A549, Calu-1, NCI-H460 폐암세포에 DMSO를 음성대조군(에모딘 0 uM)으로 하고 에모딘을 농도별(2.5-40 uM)로 처리하여 48시간 배양하였다. 배양된 세포를 PBS 세척 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde) 용액에서 10분간 고정한 뒤, 0.5% Crystal violet(Sigma aldrich) 용액을 이용하여 10분간 염색하였다. 염색된 세포는 상온에서 24시간 건조한 뒤 1% SDS를 포함한 용액을 이용하여 용해시킨 후 흡광도를 통해 분석하였다.
도 18에서 보듯이, 에모딘을 처리할 경우 폐암세포 3종은 세포생존율이 낮은 것으로 나타났다.
또한, MDA-MB231(estrogen receptor-) 및 MCF-7(estrogen receptor+) 유방암 세포에 에모딘을 처리하여 상기 실험방법에 따라 세포생존율을 확인한 결과, 도 19에서 보듯이, 에모딘을 처리할 경우 유방암세포의 세포생존율이 낮은 것으로 나타났다.

Claims (7)

  1. 에모딘을 유효성분으로 포함하는 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암은 폐암인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 에모딘을 유효성분으로 포함하는 EMT 촉진 전사인자 또는 PTHrP 발현이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 EMT 촉진 전사인자는 SNAI2 또는 CDH2인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 에모딘을 유효성분으로 포함하는 TCF4-TWIST1의 결합이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  6. 에모딘을 유효성분으로 포함하는 EMT 촉진 전사인자 또는 PTHrP 발현이 증가하여 발생하는 암 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  7. 제1항 또는 제3항 중 선택되는 어느 한 항의 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료 방법.
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