KR101540319B1 - cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR101540319B1
KR101540319B1 KR1020130117527A KR20130117527A KR101540319B1 KR 101540319 B1 KR101540319 B1 KR 101540319B1 KR 1020130117527 A KR1020130117527 A KR 1020130117527A KR 20130117527 A KR20130117527 A KR 20130117527A KR 101540319 B1 KR101540319 B1 KR 101540319B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
cyb5r3
protein
cells
expression
Prior art date
Application number
KR1020130117527A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150039264A (ko
Inventor
원미선
반현승
김보경
남순우
이경
이영주
이홍섭
김동욱
박기철
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020130117527A priority Critical patent/KR101540319B1/ko
Priority to CN201480064255.2A priority patent/CN105792853B/zh
Priority to EP14851311.2A priority patent/EP3053601B1/en
Priority to PCT/KR2014/009204 priority patent/WO2015050364A1/ko
Publication of KR20150039264A publication Critical patent/KR20150039264A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101540319B1 publication Critical patent/KR101540319B1/ko
Priority to US15/087,563 priority patent/US10973884B2/en

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12N9/0038—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12N9/004—Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y106/00—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6)
    • C12Y106/02—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with a heme protein as acceptor (1.6.2)
    • C12Y106/02002—Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57492—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds localized on the membrane of tumor or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10071—Demonstrated in vivo effect
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/90209—Oxidoreductases (1.) acting on NADH or NADPH (1.6), e.g. those with a heme protein as acceptor (1.6.2) (general), Cytochrome-b5 reductase (1.6.2.2) or NADPH-cytochrome P450 reductase (1.6.2.4)

Abstract

본 발명은 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 상기 cyb5R3을 과다발현하는 암세포에서 저산소 유도 인자-1(Hypoxia-inducible factor-1; HIF-1)의 발현이 유의적으로 감소하여 암세포의 생장을 억제하며, 생체 내에서 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 cyb5R3 유전자 또는 단백질은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmacological composition containing a cyb5R3 protein or a polynucleotide encoding cyb5R3 for the prevention and treatment of cancer}
본 발명은 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 인류의 지난 수십 년간의 부단한 노력에도 불구하고 난치병 중의 하나로 여전히 남아 있다. 암은 인류의 건강을 위협하는 최대의 질병 중의 하나로서 세포가 일련의 돌연변이 과정을 거쳐, 무제한 적이고, 비 조절적 방식으로 증식 및 불사화되어 발생하는 질병이다. 암과 관련된 다양한 생화학적 기전이 규명되어 그에 따른 치료제가 개발되어 오고 있으나, 아직까지 근본적인 치료방법은 제시되지 않고 있다.
이에 따라 암과 관련된 다양한 생체 내 분자의 동정 및 상기 분자를 표적으로 하는 약물의 개발에 대한 요구가 계속되고 있으며, 상기 약물 중 일부를 조합하여 암의 치료 효과를 증진하기 위한 노력 또한 계속되고 있다. 최근에 암세포생물학, 의약 화학 등의 제반 학문의 눈부신 발전과 더불어 탁솔, 라파마이신 및 17-알릴아미노젤다나마이신(17-allylaminogeldanamycin; 17-AAG)과 같은 다수의 항암제들이 개발되었으며, 글리벡(Gleevec)과 같은 새로운 작용 기전을 가진 항암제가 개발되고 있다.
암의 전이(cancer metastasis)를 억제하기 위한 약물은 세포 외 기질(extracellular matrix) 구성성분인 비트로넥틴(vitronectin), 라미닌(laminin) 및 피브로넥틴(fibronectin) 등과 같은 인테그린 패밀리(integrin family)를 포함하는 접착분자(adhesion molecule)의 기능을 제어하거나, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (matrix metalloproteinase; MMP) 및 5형 콜라게나제(IV collagenase)를 저해하는 물질로 개발되고 있다(Cancer Research 53, 2087-2091, 1993). 암 전이의 주요 타겟은 하기와 같다; Src, 국소 부착 키나아제(focal adhesion kinase), 인테그린 수용체(the integrin receptor), 혈관 내피 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor; VEGF receptor), 표피생장인자 수용체(epidermal growth factor receptor; EGF receptor), Her-2/neu, c-Met, Ras/Rac GTPases, Raf kinase, 파르네실 이인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase) 및 매트릭스 메탈로프로테아제(matrix metalloproteases).
저산소 유도 인자-1(Hypoxia-inducible factor-1; HIF-1)은 저산소증(hypoxia)에서 유도되는 전사인자로서, 저산소 상태에 대하여 암세포의 적응을 조절하는 데에 가장 중요한 분자로서 알려져 있으며, 특히 HIF-1α 단백질의 양은 암 환자의 예후와 밀접한 상관관계를 가지는 것으로 알려져 있다. HIF-1은 암세포 성장 인자 자극, 저산소 조건, 발암유전자(oncogene) 활성화 또는 pVHL과 같은 암 억제유전자의 불활성화에 의해 활성화되며, 활성화된 HIF-1은 헥소키나아제 2(hexokinase 2), 글루코스 전달체 1(glucose transporter 1), 에리쓰로포이에틴 (erythropoietin), IGF-2, 엔도글린(endoglin), VEGFA, MMP-2, uPAR 및 MDR1과 같은 유전자의 발현을 유도하여 세포사멸(apoptosis)에 대한 내성, 혈관 신생능력 향상, 세포 증식능력 증가, 세포 이동(cell migration, meatastasis) 및 침윤(invasion)능의 증가와 같은 형질을 획득하게 되어 결국 암 세포는 악성화된다.
싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3)은 소포체 막(endoplasmic reticulum membranes), 미토콘드리아 막(mitochondrial membranes) 및 다른 막에 결합하여 존재하거나 적혈구(erythrocytes)에서 용해된 상태로 존재한다. 적혈구의 cyb5R3는 메트헤모글로빈(methemoglobin)의 환원에 관여하며, 이를 발현하는 cyb5R3 유전자의 돌연변이는 메트헤모글로빈 혈증(methemoglobinemias)을 유도하여, 혈중에 과량의 메트헤모글로빈이 존재하게 되고 감소된 산소 전달 능력을 나타내므로 청색증(cyanosis) 및 저산소증(hypoxia) 증상을 나타낸다. 또한 막에 존재하는 cyb5R3는 막결합 부위(membrane-bound domain) 및 활성 부위(active domain)으로 구성되어, 지방산의 연장(elongation) 및 포화(desaturation), 콜레스테롤 생합성, 및 약물 대사에 관여하는 것으로 알려져 있어 cyb5R3를 이용한 질병의 진단 및 치료용 조성물에 대한 연구가 계속되고 있다.
cyb5R3을 암과 관련하여 사용하기 위하여, 국제특허 PCT/NL2007/000112에는 유방암(breast cancer)에서 항-에스트로겐(anti-estrogen) 치료에 대한 민감도를 예측하기 위해 유방암 환자로부터 시료를 분리하여 항-에스트로겐에 민감한 것으로 예상되는 단백질의 발현을 확인한 결과, cyb5R3는 유방암에서 타모시펜(tamoxifen)-저항을 예상할 수 있는 지표로 사용될 수 있으므로 항-에스트로겐 치료에 대한 진단용 키트로 사용할 수 있음을 개시하고 있다. 또한, LEE. 등은 디아포라제 1(diaphorase 1)로 불리우는 cyb5R3이 K-ras 형질전환된 폐암 마우스에서 상향조절(up-regulation)되어, cyb5R3을 암 진단 마커 및 암 예방을 위한 타겟 분자로 사용할 수 있음을 보고한 바 있다(LEE et al, Int . J. Oncol ., 34: 161-172, 2009). 그러나, HIF-1α 및 cyb5R3의 연관성, 및 이를 이용한 암 억제용 약학적 조성물에 관하여는 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 cyb5R3의 암 억제 효과에 대하여 규명하고자 노력한 결과, cyb5R3을 과다발현하는 암세포에서 HIF-1α의 발현이 유의적으로 감소하여 암세포의 생장을 억제하며, 생체 내에서 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제하므로, 상기 cyb5R3 유전자 또는 단백질은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 cyb5R3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 cyb5R3 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강 식품을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 cyb5R3 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 cyb5R3 단백질의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 cyb5R3 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) cyb5R3 단백질의 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 cyb5R3 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 상기 cyb5R3 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 cyb5R3 단백질의 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3)을 과다발현하는 암세포에서 저산소 유도 인자-1(Hypoxia-inducible factor-1; HIF-1)의 발현이 유의적으로 감소하여 암세포의 생장을 억제하며, 생체 내에서 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 cyb5R3 유전자 또는 단백질은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 다양한 암 세포주에서 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질의 발현을 확인한 도이다.
도 2는 대장암 조직에서 cyb5R3의 발현을 확인한 도이다.
도 3은 cyb5R3의 억제에 따른 암세포주의 저산소 유도 인자-1(Hypoxia-inducible factor-1; HIF-1)의 발현을 확인한 도이다.
도 4는 cyb5R3의 과발현에 따른 암세포주의 HIF-1 발현을 확인한 도이다;
도 4a는 cyb5R3의 과발현을 위해 사용한 벡터의 지도를 나타내며; 및
도 4b는 cyb5R3의 과발현을 유도한 암세포주의 cyb5R3 및 HIF-1 단백질의 발현을 나타낸다.
도 5는 cyb5R3의 과발현에 따른 암세포주의 미토콘드리아 호흡량을 확인한 도이다;
도 5a는 cyb5R3의 과발현에 따른 암세포주의 기초 호흡량 및 최대 호흡량의 변화를 나타내며; 및
도 5b는 cyb5R3의 과발현에 따른 암세포주의 총호흡량 감소를 나타낸다.
도 6은 cyb5R3의 과발현에 따른 암세포주의 세포 성장 저해 효과를 확인한 도이다;
도 6a는 cyb5R3의 과발현을 유도에 사용된 벡터 DNA의 양에 따른 HCT116 세포주에서 cyb5R3 과발현의 확인을 나타내며; 및
도 6b는 cyb5R3의 과발현을 유도에 사용된 벡터 DNA의 양에 따른 암세포주의 세포 성장 저해 효과를 나타낸다.
도 7은 정상 및 저산소 조건에서 cyb5R3 과발현 세포주의 cyb5R3 및 HIF-1 단백질의 발현을 비교한 도이다.
도 8은 종양을 이식한 마우스에서 cyb5R3의 종양 성장 억제 효과를 나타내는 도이다.
도 9는 종양을 이식한 마우스에서 cyb5R3의 종양 형성 억제 효과를 나타내는 도이다;
도 9a는 종양을 이식한 마우스에서 시간에 따른 종양 크기의 성장을 나타내며; 및
도 9b는 이식 17 일 후 종양의 무게를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 cyb5R3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 cyb5R3 단백질의 단편은 하기 1) 내지 3)의 아미노산 서열로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다:
1) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열(Genebank 등록 번호: AAH04821);
2) 서열번호 1의 일부분으로 나타내는 아미노산 서열; 및
3) 서열번호 1과 80% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열.
상기 cyb5R3 단백질은 암세포에서 저산소 유도 인자-1(Hypoxia-inducible factor-1)를 억제하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 암은 흑색종, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 신경교종, 간암, 갑상선 종양, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 방광암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 교모세포종, 자궁내막암, 신장암, 결장암, 췌장암, 식도암종, 머리 및 목암, 중피종, 육종, 담관암, 소장 선암, 소아 악성암 및 표피암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상인 것이 바람직하고, 구체적으로는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상인 것이 보다 바람직하며, 더욱 구체적으로는 대장암인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 벡터는 인체 또는 동물세포에서 발현되는 선형 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스성 발현벡터를 포함하는 벡터 또는 재조합 레트로바이러스(retrovirus) 벡터, 재조합 아데노 바이러스(adenovirus) 벡터, 재조합 아데노 부속 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 벡터, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus) 벡터 또는 재조합 렌티바이러스(lentivirus) 벡터를 포함하는 재조합 바이러스 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 세포는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cells), 수지상 세포(dendritic cells), 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 암세포주에서 cyb5R3 및 HIF-1 발현의 확인한 결과, 정상세포에 비해 암세포주 및 암 조직에서 cyb5R3 발현이 현저하게 감소하였고, HIF-1α 단백질의 발현은 유의적으로 증가하여 HIF-1α 및 cyb5R3의 발현이 역상관 관계인 것을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 cyb5R3의 발현을 억제 및 과발현한 암세포주에서 HIF-1 단백질의 발현을 확인한 결과, 저산소 조건에서 HIF-1α을 유도하였을 때 cyb5R3 발현 억제 세포에서는 HIF-1α이 발현되며 cyb5R3이 발현되지 않았고, cyb5R3 과발현 세포에서는 cyb5R3이 발현되어 HIF-1α의 발현이 억제된 것을 확인하였다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 cyb5R3의 암세포주 생장 억제 효과를 확인한 결과, cyb5R3의 과발현을 유도한 암세포주에서 미토콘드리아 호흡률 및 암세포주의 세포 성장이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5 및 도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 생체 내(in vivo)에서 cyb5R3의 암세포 생장 및 전이 억제 효과를 확인한 결과, 종양을 이식한 마우스에 cyb5R3 과발현 세포주를 주입하였을 때, 종양의 크기 및 무게가 효과적으로 감소하는 것을 확인하였다([표 2] 및 [표 3], 및 도 8 및 도 9 참조).
따라서, 본 발명의 cyb5R3을 과다발현하는 암세포에서 HIF-1α의 발현이 유의적으로 감소하여 암세포의 생장을 억제하며, 생체 내에서 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 cyb5R3 유전자 또는 단백질은 암 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 치료상으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질의 단편을 0.0001 내지 10 중량%로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%를 포함한다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 cyb5R3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터의 경우 0.05 내지 500 mg을 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 내지 300 mg을 함유하는 것이 더욱 바람직하며, C12orf59 유래 펩타이드를 암호화는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 바이러스의 경우, 103 내지 1012 IU(10 내지 1010 PFU)를 함유하는 것이 바람직하고, 105 내지 1010 IU를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 cyb5R3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포의 경우, 103 내지 108 개를 함유하는 것이 바람직하고, 104 내지 107개를 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 cyb5R3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 또는 세포를 유효성분으로 함유하는 조성물의 유효 용량은 체중 1 ㎏당 벡터의 경우에는 0.05 내지 12.5 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 107 내지 1011 바이러스 입자(105 내지 109 IU)/㎏, 세포의 경우에는 103 내지 106 세포/㎏이고, 바람직하게는 벡터의 경우에는 0.1 내지 10 ㎎/㎏, 재조합 바이러스의 경우에는 108 내지 1010 입자(106 내지 108 IU)/㎏, 세포의 경우에는 102 내지 105 세포/㎏이며, 하루 2 내지 3회 투여될 수 있다. 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 신경 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.
또한, 본 발명은 cyb5R3 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 개선용 건강 식품을 제공한다.
본 발명의 cyb5R3을 과다발현하는 암세포에서 HIF-1α의 발현이 유의적으로 감소하여 암세포의 생장을 억제하며, 생체 내에서 종양의 성장 및 전이를 효과적으로 억제하므로, 본 발명의 cyb5R3 단백질은 암 예방 및 개선용 건강식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스킷, 떡, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제, 유제품 및 유가공 제품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 cyb5R3 단백질은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 cyb5R3 단백질은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 cyb5R3 단백질은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 cyb5R3 단백질 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은
1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 cyb5R3 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
2) 단계 1)의 cyb5R3 단백질의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 cyb5R3 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
3) cyb5R3 단백질의 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 cyb5R3 단백질의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은
1) 피검 화합물 또는 조성물을 cyb5R3 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 상기 cyb5R3 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
3) 단계 2)의 cyb5R3 단백질의 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 cyb5R3은 정상세포주 또는 정상조직에 비하여 암세포주 또는 암 조직에서 발현 수준이 현저하게 감소하며, cyb5R3를 과발현하는 세포주에서 HIF-1α 단백질의 발현 수준이 유의적으로 감소하므로, 본 발명의 cyb5R3 단백질은 암 진단의 정보를 제공하기 위한 방법 및 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법에서 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 암세포주에서 싸이토크롬 b5 환원효소 3( cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 및 저산소 유도 인자-1( Hypoxia - inducible factor -1; HIF -1) 발현의 확인
<1-1> 암세포 배양 및 HIF -1의 축적 유도
본 발명의 실험예를 수행하기 위해 다양한 암세포주를 배양하였다.
구체적으로, 미국 세포주은행(American Type Culture Collection; ATCC)에서 하기 [표 1]에 나타난 다양한 인간 암세포주를 구입하여 5% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)를 포함하는 RPMI1640 배지를 세포배양용기에 담고, 5×105 세포/㎖로 접종하여 5 % 이산화탄소를 유지하는 37℃ 항온 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, HIF-1의 축적을 유도하기 위하여 1% 산소, 94% 질소 및 5% 이산화탄소의 저산소 조건에서 12 시간 동안 배양하였다.
다양한 암세포주의 종류
출처 세포주명 ATCC 번호


대장암 세포주

 DLD-1 CCL-221
HCC2998 CCL-119
HCT116 CCL-247
KM12
LoVo CCL-229
SW620 CCL-227
WiDr CCL-218
유방암 세포주 MCF-7 HTB-22
췌장암 세포주 MIA-Paca2 CRL-1420
전립선암 세포주 PC-3 CRL-1435
폐암 세포주 A549 CCL-185

신장암 세포주
 Caki-1 HTB-46
786-O CRL-1932
RCC-4
정상 세포주 WI-38
<1-2> HIF -1 유도된 암세포주에서 HIF -1 및 cyb5R3 발현의 확인
HIF-1가 유도된 암세포주에서 HIF-1 및 cyb5R3의 발현을 확인하기 위하여, 암세포주의 세포 추출물을 수득하여 웨스턴블럿(western blot)을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 HIF-1의 축적을 유도한 다양한 암세포주를 수득하였으며, 방사선면역 침전 분석 완충용액(radioimmuno precipitation assay buffer,RIPA buffer; 셀 시그날링 테크놀로지 사, 미국)을 이용해 각각의 세포를 파쇄하여 세포 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 세포 추출물 각 30 ㎍을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 전개하여 분리한 다음, 폴리비닐리덴 플루오라이드 막(polyvinylidene fluoride membrane)에 옮겨 cyb5R3 항체(산타 쿠르즈 생명공학 사, 미국) 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase; HRP)로 표식된 2차 항체(야머샴-파라시아 사, 미국)를 순차적으로 cyb5R3의 발현을 확인하였으며, 상기와 동일한 방법으로 HIF-1α(R,D 시스템 사) 및 HRP로 표식된 2차 항체를 사용하여 HIF-1α의 발현을 확인하였고, 대조 단백질로 토끼의 다클론 항체인 GAPDH(Ab 프론티어 사, 한국)항체 또는 토끼의 다클론 항체인 베타 액틴(β-actin; 셀 시그날링 테크놀로지 사, 미국) 항체를 상기와 동일한 방법으로 사용하여 GAPDH(glyceradehyde 3- phosphate dehydrogenase) 또는 액틴(actin)의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 1에서 나타난 바와 같이 정상 세포주인 WI-38 세포주에 비하여 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암 및 신장암 세포주에서 cyb5R3 발현이 현저하게 감소하였고, HIF-1α 단백질의 발현은 유의적으로 증가하여 HIF-1α 및 cyb5R3의 발현이 역상관 관계인 것을 확인하였다(도 1).
< 실시예 2> 암 조직에서 cyb5R3 발현의 확인
암 조직에서 cybR3 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 조직면역염색(Immunohistochemistry stain)을 수행하여 대장암 조직을 염색하였다.
구체적으로, 진단용 검체를 가톨릭대학교 대전 성모병원(한국)에서 입수하여 이를 포르말린(Formalin)으로 고정하여 20 종의 대장암 조직의 파라핀 블록을 제작하였고, 상기 파라핀 블록에 자일렌(xylene)을 처리하여 파라핀 구역(section)의 파라핀을 제거한 다음, 100℃에서 가열하여 항원을 복원한 후, 인산 완충용액(phosphate buffered saline; PBS)로 3 회 세척하였다. 그런 다음, 항체희석 완충용액(코밴스 사, 미국)을 사용하여 1:200으로 희석한 항-cyb5R3 항체(시그마-알드리치 사, 미국)를 1차 항체로 하고 바이오틴(biotin)이 결합된 항체를 2차 항체로 하여, 스트렙타빈 바이오틴 유니버셜 검출 시스템(Streptavidin Biotin Universal Detection System; 이뮤노테크 사, 핀란드)의 제조사의 제공되는 프로토콜에 따라 cyb5R3의 양을 확인하였으며, AEC 크로모젠 키트(AEC Chromogen Kit; 이뮤노테크 사, 핀란드)으로 발색하여 관찰하였다. 양성 대조군으로 정상 조직인 WI-38을 상기와 동일한 방법으로 조직면역염색하여 발색 정도를 비교하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 정상 조직에서는 cyb5R3을 포함하는 세포가 정상적인 선구조(glandular structures) 사이에 나타나는 것을 확인하였으나, 대장암 조직에서는 뒤틀린 선구조(distorted glands)와 함께 cyb5R3 발현 세포가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 2).
< 실시예 3> 암세포주에서 cyb5R3 발현에 따른 HIF -1 발현의 확인
<3-1> cyb5R3 억제 암세포주에서 HIF -1 발현 확인
cyb5R3 및 HIF-1의 발현 사이의 연관성을 확인하기 위해, cyb5R3의 발현을 억제한 암세포주에서 HIF-1 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 20 nM의 cyb5R3 siRNA(써모 사; 제품 명: siGENOME human cyb5R3 (1727) siRNA SMART pool)을 다르마펙트(Dharmafect; 써모 사)로 처리하여 대장암 세포주 HCT116에 형질주입(transfection)하여 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium)에서 24 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, HIF-1의 축적을 유도하기 위하여 1% 산소, 94% 질소 및 5% 이산화탄소의 저산소 조건에서 12 시간 동안 배양하고, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 cyb5R3 및 HIF-1 단백질의 발현을 확인하였다. 음성 대조군으로 상기 형질 주입한 세포를 20% 유산소 조건에서 배양하고 상기와 동일한 방법을 수행하여 cyb5R3 및 HIF-1 단백질의 발현을 확인하였으며, 대조 단백질로는 토끼의 다클론 항체인 GAPDH(Ab 프론티어 사, 한국)항체를 상기와 동일한 방법으로 사용하여 GAPDH(glyceradehyde 3- phosphate dehydrogenase)의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 유산소 조건인 음성 대조군은 cyb5R3 및 HIF-1α 모두를 발현하지 않는 것을 확인하였고, 저산소 조건에서 HIF-1α을 유도하였을 때 cyb5R3이 발현되지 않는 것을 확인하였다(도 3).
<3-2> cyb5R3 과발현 암세포주에서 HIF -1 발현 확인
cyb5R3 및 HIF-1의 발현 사이의 연관성을 확인하기 위해, 암세포주에서 cyb5R3 과발현을 유도한 후 HIF-1 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, cyb5R3 유전자를 포함하는 pCMV6-AV 벡터인 pCMV-AC-cyb5R3(도 4a; 오리진 사, 미국)을 증폭한 후, 60 ㎜ 디쉬의 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 상기 벡터 4 ㎍ 및 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 첨가하였으며, 4×105 세포의 대장암 세포주 HCT116를 접종하고 24 시간 동안 배양하여 DNA 형질주입하였다. 그런 다음, HIF-1의 축적을 유도하기 위하여 1% 산소, 94% 질소 및 5% 이산화탄소의 저산소 조건에서 12 시간 동안 배양하고, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 cyb5R3 및 HIF-1 단백질의 발현을 확인하였다. 음성 대조군으로 상기 형질 주입한 세포를 20% 유산소 조건에서 배양하여 상기와 동일한 방법을 수행하여 cyb5R3 및 HIF-1 단백질의 발현을 확인하였으며, 대조 단백질로는 토끼의 다클론 항체인 GAPDH(Ab 프론티어 사, 한국)항체를 상기와 동일한 방법으로 사용하여 GAPDH(glyceradehyde 3- phosphate dehydrogenase)의 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 4b에서 나타난 바와 같이 cyb5R3 과발현 유도 세포에서 cyb5R3의 발현이 증가됨에 따라 저산소 조건에서 HIF-1α의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(도 4b).
< 실시예 4> cyb5R3의 암세포주 생장 억제 효과 확인
<4-1> cyb5R3 과발현 암세포주의 미토콘드리아 호흡량 확인
cyb5R3의 암세포 생장 억제 효과를 확인하기 위해서, cyb5R3의 과발현을 유도한 암세포주의 미토콘드리아 호흡률(Oxygen Consumption Rate; OCR)을 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <3-2>와 동일한 방법으로 cyb5R3의 과발현을 유도한 대장암 세포주 HCT116을 배양하여 1×105 세포를 XF24 세포 배양 플레이트(XF24 cell culture plate)에서 두 시간 동안 배양한 뒤, XF 측정 전용 배지로 교환하고 이산화탄소가 없는 조건의 세포배양기에서 한 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, XF24 세포외 유동 분석기(XF24 extracellular flux analyzer; 시호스 생명과학사, 미국)을 사용하여 미토콘드리아의 산소호흡률을 3 회 측정하고, ATP 합성 저해제인 1 μM 올리고마이신(oligomycin)을 처리한 다음 산소호흡률을 3 회 측정한 후, 화학적 짝풀림제인 0.5 μM 카르보닐시아니드 파라-트리플루오로메톡시페닐하이드라존(carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)을 처리하여 산소호흡률을 3 회 측정하였다. 그런 다음, 전자전달계 저해제인 1 μM 로테논(rotenone)을 처리하여 산소호흡률을 2 회 측정한 후, 1 μM 안티마이신 A을 처리하여 산소호흡률을 2 회 측정하였다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이 cyb5R3 과발현 유도 세포의 총 호흡량이 40% 감소하는 것을 확인하였으며(도 5b), 기초 호흡량(basal respiration) 및 최대 호흡률 또한 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다(도 5a).
<4-2> cyb5R3 과발현 암세포주의 세포 성장 저해효과 확인
cyb5R3의 암세포 생장 억제 효과를 확인하기 위해서, cyb5R3의 과발현을 유도한 암세포주의 세포 성장 저해 효과를 확인하였다.
구체적으로, cyb5R3 유전자를 포함하는 pCMV6-AV 벡터인 pCMV-AC-cyb5R3(오리진 사, 미국)을 증폭한 후, 상기 벡터 0.5 ㎍, 1 ㎍ 또는 2 ㎍, 및 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 DMEM 배지에 대장암 세포주 HCT116를 24 시간 동안 배양하여 DNA 형질주입하였다. 배양 후, DNA 형질주입된 HCT116 세포주를 96웰 플레이트에 3×103 세포/ 100 ㎕로 분주하여 5% 이산화탄소 조건의 37℃ 배양기에서 72 시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 4% 포름알데하이드(formaldehyde)를 처리하여 실온에서 1 시간 동안 고정하고 PBS로 세척한 후, 0.5% 메틸렌블루(methylene blue) 용액 50 ㎕를 첨가하여 실온에서 1 시간 동안 염색하고 증류수로 세척하여 건조하고, 0.06 N 염산(HCl) 100 ㎕을 분주하여 실온에서 10 분간 혼합한 다음, 엘라이자 플레이트 리더기(ELISA plate reader)를 사용하여 600 ㎚에서 흡광도를 측정하여 세포의 성장 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 HCT116 세포에서 cyb5R3 과발현을 유도하기 위해 형질주입한 pCMV6-AC-cyb5R3 발현벡터 농도에 의존하여 암세포의 성장이 억제되는 것을 확인하였다(도 6a 및 도 6b).
< 실시예 5> cyb5R3의 생체 내( in vivo ) 암세포 생장 억제 효과 확인
<5-1> cyb5R3 과발현 세포주 제조
cyb5R3을 과발현하는 세포주를 제조하기 위하여, cyb5R3을 안정적으로 과발현하는 HCT116 세포주를 제조하였다.
구체적으로, 4×105 세포의 대장암 세포주 HCT116를 60 ㎜ 디쉬의 5% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 접종하여 37℃의 5% 이산화탄소 배양기에서 24 시간 동안 배양한 후, cyb5R3 유전자를 포함하는 pCMV6-AV 벡터인 pCMV-AC-cyb5R3(오리진 사, 미국) 4 ㎍ 및 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 상기 배지에 첨가하고, 37℃에서 48 시간 동안 배양하여 DNA 형질주입하였다. 그런 다음, HCT116 세포를 0.5 ㎎/㎖ G418(깁코 사, 미국)을 포함하는 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에서 2 주 동안 배양하여 cyb5R3 과발현을 위한 벡터가 형질주입된 세포를 선별하였고, 상기 세포의 단일 집락(single colony)을 수득하여 배양한 후, 상기 실시예 <1-2>와 동일한 방법을 수행하여 cyb5R3의 발현을 확인하여 안정적으로 cyb5R3을 과발현하는 HCT116 세포주를 선별하여 확인하였다. 음성 대조군으로 cyb5R3 유전자를 포함하지 않는 발현벡터인 pCMV-AC(오리진 사, 미국)을 사용하여 상기와 동일한 방법을 수행하여 cyb5R3 비발현 HCT116 세포주를 제조하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이 안정적으로 cyb5R3을 과발현하는 HCT116 세포주를 수득하였으며, 상기 HCT116 세포주는 저산소 조건에서 감소된 HIF-1α의 발현 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 7).
<5-2> cyb5R3의 생체 내( in vivo ) 종양 억제 효과 확인
cyb5R3의 생체 내에서 암세포 생장을 억제하는 효과를 확인하기 위하여, cyb5R3을 과발현하는 세포주를 생체 내에 주입하여 종양크기의 변화를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 cyb5R3 과발현 HCT116 세포주를 트립신(trypsin) 처리하여 수득한 다음, 무혈청 배지(serum-free medium)로 세척하여 5×107 세포/㎖ 농도로 희석하였다. 그런 다음, Balb/c 계통의 특정병원체 부재(specific pathogen free; SPF) 마우스인 6주령의 암컷 누드마우스(SLC-중앙실험동물 사, 한국) 5 마리의 옆구리에 상기 희석한 세포 1×107 세포/ 200 ㎕를 각각 피하 주사(subcutaneous injection)로 주입하여 종양세포를 이식하였다. 이식 후 3, 5, 7, 12, 14 및 17 일에 상기 누드마우스의 체중 및 종양 크기를 하기 [수학식 1]을 사용하여 측정하였고, 이식 후 17 일에 마우스를 희생하여 적출한 종양의 무게 및 크기를 확인하여 종양 형성 및 성장을 확인하였다. 음성 대조군으로는 상기 실시예 <5-1>에서 제조한 cyb5R3 비발현 HCT116 세포주로 상기와 동일한 방법을 수행하여 종양 생장을 확인하였다.
Figure 112013089295731-pat00001
그 결과, 하기 [표 2] 및 [표 3], 및 도 8 및 도 9에서 나타난 바와 같이 종양을 이식한 후 마우스의 체중에 유의적인 변화를 나타내지 않았고(표 2), 음성 대조군에 비하여 cyb5R3 과발현 HCT116 세포를 주입한 마우스에서 종양의 형성 정도가 65% 감소하는 것을 확인하였으며(도 8 및 표 3), 종양 이식 17 일 후 종양의 무게를 11.0±32.1 ㎎으로 나타내어 음성 대조군의 종양 무게인 210.0±36.1 ㎎에 비하여 48% 감소한 수준을 나타내는 것을 확인하였다(도 9).
cyb5R3 과발현 세포 주입 및 종양 이식 마우스의 체중 변화
시간
(일)		 체중
(g)
3 19.0±0.4
5 19.5±0.4
7 19.5±0.1
10 18.7±0.6
12 18.8±0.3
14 18.6±0.3
17 18.3±0.4
cyb5R3의 생체 내 종양 억제 효과 확인
시간
(일)		 종양 크기 (㎜3)
cyb5R3 발현 음성 대조군
3 32.7±3.7 37.3±2.0
5 27.0±7.0 46.0±4.6
7 38.9±9.4 98.9±33.2
10 65.6±23.0 238.9±79.4
12 88.0±31.5 360.1±83.4
14 119.0±28.4 430.5±117.2
17 216.0±60.1 603.2±123.3
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Pharmacological composition containing a cyb5R3 protein or a polynucleotide encoding cyb5R3 for the prevention and treatment of cancer <130> 13P-07-047 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 301 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Ala Gln Leu Ser Thr Leu Gly His Met Val Leu Phe Pro Val 1 5 10 15 Trp Phe Leu Tyr Ser Leu Leu Met Lys Leu Phe Gln Arg Ser Thr Pro 20 25 30 Ala Ile Thr Leu Glu Ser Pro Asp Ile Lys Tyr Pro Leu Arg Leu Ile 35 40 45 Asp Arg Glu Ile Ile Ser His Asp Thr Arg Arg Phe Arg Phe Ala Leu 50 55 60 Pro Ser Pro Gln His Ile Leu Gly Leu Pro Val Gly Gln His Ile Tyr 65 70 75 80 Leu Ser Ala Arg Ile Asp Gly Asn Leu Val Val Arg Pro Tyr Thr Pro 85 90 95 Ile Ser Ser Asp Asp Asp Lys Gly Phe Val Asp Leu Val Ile Lys Val 100 105 110 Tyr Phe Lys Asp Thr His Pro Lys Phe Pro Ala Gly Gly Lys Met Ser 115 120 125 Gln Tyr Leu Glu Ser Met Gln Ile Gly Asp Thr Ile Glu Phe Arg Gly 130 135 140 Pro Ser Gly Leu Leu Val Tyr Gln Gly Lys Gly Lys Phe Ala Ile Arg 145 150 155 160 Pro Asp Lys Lys Ser Asn Pro Ile Ile Arg Thr Val Lys Ser Val Gly 165 170 175 Met Ile Ala Gly Gly Thr Gly Ile Thr Pro Met Leu Gln Val Ile Arg 180 185 190 Ala Ile Met Lys Asp Pro Asp Asp His Thr Val Cys His Leu Leu Phe 195 200 205 Ala Asn Gln Thr Glu Lys Asp Ile Leu Leu Arg Pro Glu Leu Glu Glu 210 215 220 Leu Arg Asn Lys His Ser Ala Arg Phe Lys Leu Trp Tyr Thr Leu Asp 225 230 235 240 Arg Ala Pro Glu Ala Trp Asp Tyr Gly Gln Gly Phe Val Asn Glu Glu 245 250 255 Met Ile Arg Asp His Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu Pro Leu Val Leu 260 265 270 Met Cys Gly Pro Pro Pro Met Ile Gln Tyr Ala Cys Leu Pro Asn Leu 275 280 285 Asp His Val Gly His Pro Thr Glu Arg Cys Phe Val Phe 290 295 300

Claims (12)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 싸이토크롬 b5 환원효소 3(cytochrome b5 reductase 3; cyb5R3) 단백질을 유효성분으로 함유하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 cyb5R3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효성분으로 함유하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서 상기 cyb5R3 단백질은 암세포에서 저산소 유도 인자-1(Hypoxia-inducible factor-1; HIF-1)를 억제하는 것을 특징으로 하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 삭제
  6. 제 2항에 있어서, 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 제 2항에 있어서, 상기 세포는 조혈 줄기세포, 수지상 세포, 자가이식 종양세포(autologous tumor cells) 및 정착 종양세포(established tumor cells)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 cyb5R3 단백질을 유효성분으로 함유하는 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 예방 및 개선용 건강 식품.
  10. 1) 실험군으로서 피검체 유래 시료에서 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 cyb5R3 단백질의 발현량을 측정하는 단계;
    2) 단계 1)의 cyb5R3 단백질의 발현량과 대조군으로서 정상 개체 유래 시료의 cyb5R3 단백질의 발현량을 비교하는 단계; 및
    3) cyb5R3 단백질의 발현량이 대조군에 비해 감소하는 경우 암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 단계 1)의 cyb5R3 단백질의 발현량은 웨스턴블랏(Western blotting), 효소-면역화학 검출법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 면역조직화학 염색법(immunohistochemical staining), 면역침강(immunoprecipitation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 방법으로 검출하는 것을 특징으로 하는, 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 진단의 정보를 제공하기 위한 단백질 검출 방법.
  12. 1) 피검 화합물 또는 조성물을 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 cyb5R3 단백질을 발현하는 세포주에 처리하는 단계;
    2) 단계 1)의 처리된 세포주에서 상기 cyb5R3 단백질의 발현 정도를 측정하는 단계; 및
    3) 단계 2)의 cyb5R3 단백질의 발현량이 피검 화합물 또는 조성물을 무처리한 대조군 세포주와 비교하여 증가된 피검 화합물 또는 조성물을 선별하는 단계를 포함하는, 대장암, 유방암, 췌장암, 전립선암, 폐암, 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되어지는 하나 또는 그 이상의 암 치료제 후보물질의 스크리닝 방법.
KR1020130117527A 2013-10-01 2013-10-01 cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물 KR101540319B1 (ko)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130117527A KR101540319B1 (ko) 2013-10-01 2013-10-01 cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
CN201480064255.2A CN105792853B (zh) 2013-10-01 2014-09-30 用于预防和治疗癌症的含有cyb5R3基因或蛋白作为活性成分的药物组合物
EP14851311.2A EP3053601B1 (en) 2013-10-01 2014-09-30 Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer, containing cyb5r3 gene or protein as active ingredient
PCT/KR2014/009204 WO2015050364A1 (ko) 2013-10-01 2014-09-30 cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
US15/087,563 US10973884B2 (en) 2013-10-01 2016-03-31 Pharmaceutical composition for preventing and treating cancer, containing CYB5R3 gene or protein as active ingredient

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130117527A KR101540319B1 (ko) 2013-10-01 2013-10-01 cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150039264A KR20150039264A (ko) 2015-04-10
KR101540319B1 true KR101540319B1 (ko) 2015-07-30

Family

ID=52778911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130117527A KR101540319B1 (ko) 2013-10-01 2013-10-01 cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물

Country Status (5)

Country Link
US (1) US10973884B2 (ko)
EP (1) EP3053601B1 (ko)
KR (1) KR101540319B1 (ko)
CN (1) CN105792853B (ko)
WO (1) WO2015050364A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102393402B1 (ko) * 2021-03-26 2022-05-04 (주)와이디생명과학 세포 내 존재 단백질과 세포 외부로 분비되는 단백질을 동시 발현하는 이중발현벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4013788A1 (en) 2019-08-12 2022-06-22 Purinomia Biotech, Inc. Methods and compositions for promoting and potentiating t-cell mediated immune responses through adcc targeting of cd39 expressing cells

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1303926A (zh) * 1999-10-27 2001-07-18 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——nadh－细胞色素b5还原酶33和编码这种多肽的多核苷酸

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4314556A1 (de) * 1993-05-04 1994-11-10 Behringwerke Ag Modifizierte Antikörperenzymkonjugate und Fusionsproteine sowie ihre Anwendung zur tumorselektiven Therapie
AU2003235789A1 (en) * 2002-01-11 2003-07-24 Xantos Biomedicine Ag Novel apoptosis-inducing dna sequences
CN1754002B (zh) * 2002-08-12 2010-09-08 杰能斯有限公司 涉及痘病毒和癌的组合物及制备方法
WO2005017123A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 Exelixis, Inc. Mptens as modifiers of the pten pathway and methods of use
US20060204503A1 (en) * 2005-01-31 2006-09-14 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of cancer using antibodies to polypeptides differentially expressed in human lung tumors
US20100152055A1 (en) * 2005-09-02 2010-06-17 Satoko Kozono Composition and method for diagnosing kidney cancer and for predicting prognosis for kidney cancer patient
KR100811744B1 (ko) * 2006-12-28 2008-03-11 주식회사 인섹트 바이오텍 아라자임을 유효성분으로 하는 암 예방 및 치료용 약학적조성물

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1303926A (zh) * 1999-10-27 2001-07-18 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——nadh－细胞色素b5还原酶33和编码这种多肽的多核苷酸

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102393402B1 (ko) * 2021-03-26 2022-05-04 (주)와이디생명과학 세포 내 존재 단백질과 세포 외부로 분비되는 단백질을 동시 발현하는 이중발현벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물
WO2022203451A1 (ko) * 2021-03-26 2022-09-29 (주) 와이디생명과학 세포 내 존재 단백질과 세포 외부로 분비되는 단백질을 동시 발현하는 이중발현벡터를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150039264A (ko) 2015-04-10
US10973884B2 (en) 2021-04-13
CN105792853B (zh) 2021-02-26
EP3053601A1 (en) 2016-08-10
CN105792853A (zh) 2016-07-20
WO2015050364A1 (ko) 2015-04-09
EP3053601B1 (en) 2017-11-08
US20160235821A1 (en) 2016-08-18
EP3053601A4 (en) 2016-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102011957B1 (ko) Slit-robo 시스템을 이용한 근감소증 예방 또는 치료용 조성물
US10611797B2 (en) Peptide having anticancer activity, and pharmaceutical composition and dietary supplement composition for preventing and treating cancer, both of which contain same as active ingredient
KR102119150B1 (ko) N-1h-벤지미다졸-2-일-3-(1h-피롤-1-일) 벤자미드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101540319B1 (ko) cyb5R3 유전자 또는 단백질을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101652010B1 (ko) p34의 발현 억제제 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 전이 억제용 조성물
KR20200038412A (ko) IF1 (ATPase inhibitory factor 1)을 유효성분으로 함유하는 항암용 약학 조성물
KR102194537B1 (ko) 피어스 1의 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 함유하는, 암 예방, 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물
KR102629955B1 (ko) Ewsr1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101430310B1 (ko) 등심초 추출물을 포함하는 대장암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR101965363B1 (ko) Ｃ１２ｏｒｆ５９ 유래 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR101987970B1 (ko) 아스파라기닐 tRNA 합성효소 (Asparaginyl tRNA synthetase, NRS)의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR20230075172A (ko) 에모딘을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
KR20240013528A (ko) 천연물 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 암의 개선, 예방, 또는 치료용 조성물
KR20240056697A (ko) 펜플루리돌을 유효성분으로 포함하는 stk32c 과발현 암, 비알코올성 지방간염(nash), 또는 간섬유화 예방 또는 치료용 약학 조성물
KR20240012182A (ko) 칸타리딘을 유효성분으로 포함하는 교모세포종 예방 또는 치료용 조성물
KR20230098489A (ko) Taf10 억제제를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물
KR20210111043A (ko) HopQ를 포함하는 암전이 억제용 조성물
KR20120062299A (ko) 평활근－２２α 를 이용한 항암제 또는 감마선에 의한 세포 노화 유도 방법

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190604

Year of fee payment: 5