CN105792853B

CN105792853B - 用于预防和治疗癌症的含有cyb5R3基因或蛋白作为活性成分的药物组合物

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Publication number: CN105792853B
Application number: CN201480064255.2A
Authority: CN
Inventors: 元美善; 潘铉承; 金俌京; 南淳祐; 李炅; 李永珠; 李洪燮; 金东旭; 朴基哲; 任珠英; 吴庆珍
Original assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Current assignee: Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology KRIBB
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2034-09-30
Also published as: CN105792853A; WO2015050364A1; EP3053601B1; US10973884B2; US20160235821A1; KR20150039264A; EP3053601A4; KR101540319B1; EP3053601A1

Abstract

本发明涉及用于预防和治疗癌症的含有细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白作为活性成分的药物组合物。在过表达cyb5R3的癌细胞中，缺氧诱导因子‑1(HIF‑1)的表达显著降低，从而抑制了癌细胞生长和有效地抑制了体内肿瘤生长和转移，并因此本发明的cyb5R3基因或蛋白作为用于预防和治疗癌症的药物组合物的活性成分是有用的。

Description

用于预防和治疗癌症的含有cyb5R3基因或蛋白作为活性成分的药物组合物

发明的背景

1.技术领域

本发明涉及一种用于预防和治疗癌症的含有细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白作为活性成分的药物组合物。

2.相关技术的概述

尽管人类在过去几十年已经做了一切努力，但是癌症仍然是无法治愈的疾病之一。癌症是最严重威胁人类健康的疾病中的一种，其是由因一系列突变所造成的细胞的无限、不可控增殖和永生化所引起的。已经公开了许多涉及癌症的生物化学机制，并且此后开发了多种治疗剂。但是，目前这些治疗剂中没有一个是根本治疗。

因此，识别涉及癌症的体内分子并开发靶向所述分子的新的药物是一个连续的需求。为了提高疗效，尝试将一些药物组合。根据癌症细胞生物学、药物化学等领域的显著进步，已经开发了许多抗癌剂，例如紫杉醇(Taxol)、纳巴霉素(rapamycin)和17-烯丙基氨基格尔德霉素(17-allylaminogeldanamycin)(17-AAG)。此外，一种以新的功能机制为特点的新的抗癌剂格列卫(Gleevec)正在开发中。

设计为抑制肿瘤转移的药物大部分通过抑制粘附分子(包括整合素家族，如玻连蛋白、层粘连蛋白和纤维连接蛋白，它们是细胞外基质的主要组成部分)的功能或抑制基质金属蛋白酶(MMP)和胶原蛋白酶IV来发挥作用(Cancer Research 53,2087-2091,1993)。抑制肿瘤转移的药物的主要靶点如下：Src、粘着斑激酶、整合素受体、血管内皮生长因子受体(VEGF受体)、表皮生长因子受体(EGF受体)、Her-2/neu、c-Met、Ras/Rac GTP酶、Raf激酶、法呢基二磷酸合酶和基质金属蛋白酶。

缺氧诱导因子-1(HIF-1)是一种在缺氧时诱导的转录因子，其已知是调节癌细胞对缺氧条件的适应性的最重要分子。特别地，HIF-1α蛋白的水平与癌症患者的预后密切相关。癌细胞生长因子、缺氧条件、致癌基因的活化或肿瘤抑制基因如pVHL的失活的刺激活化HIF-1。活化的HIF-1诱导如己糖激酶2、葡萄糖转运蛋白1、促红细胞生成素、IGF-2、内皮糖蛋白(endoglin)、VEGFA、MMP-2、uPAR和MDR1的基因的表达，结果对凋亡的抗性、血管生成、细胞增殖、细胞迁移或转移和细胞侵袭增加，从而导致癌细胞恶性。

细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)以结合至内质网膜、线粒体膜及其它膜的形式或以溶于红细胞的形式存在。红细胞中的cyb5R3涉及高铁血红蛋白的还原。突变的cyb5R3基因诱导高铁血红蛋白血症，结果是血液中高铁血红蛋白的浓度过高，从而使氧输送降低，导致了紫绀和缺氧。膜中的cyb5R3由膜结合结构域和活性结构域组成，已知其参与脂肪酸的延伸和去饱和、胆固醇的生物合成以及药物代谢。因此，正在积极进行关于采用cyb5R3来开发诊断和治疗组合物的研究。

作为一个与癌症有关的采用cyb5R3的实例，PCT/NL2007/000112描述了从乳腺癌患者中分离样品，并且为了测量抗-雌激素治疗在乳腺癌中的敏感性，研究了预期对抗-雌激素敏感的蛋白的表达，由于cyb5R3可以用作可预测乳腺癌患者中三苯氧胺耐药的指标，因此确定cyb5R3作为用于抗-雌激素治疗的诊断试剂盒可能是有用的。LEE等报道了称为心肌黄酶1(diaphorase 1)的cyb5R3在转化了K-ras的肺癌小鼠模型中被上调，因此cyb5R3可用作癌症诊断的标记物或用作预防癌症的靶分子(LEE等，Int.J.Oncol.,34:161-172,2009)。然而，并没有解释HIF-1α和cyb5R3之间的关系和考虑将其用于抑制癌症的的药物组合物中的报道。

因此，本发明尝试公开cyb5R3的癌症抑制作用。结果，发明人确证在癌细胞中，特别是在过表达cyb5R3的癌细胞中，HIF-1α表达的表达显著降低，从而导致了癌细胞生长、体内肿瘤生长和转移的抑制；并且此后进一步确证cyb5R3作为用于预防和治疗癌症的药物组合物的活性成分是有用的，从而完成了本发明。

发明概述

本发明的一个目的是提供一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白作为活性成分。

为了达到上述目的，本发明提供一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白作为活性成分。

本发明还提供一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用cyb5R3蛋白的步骤。

本发明进一步提供一种用于预防癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用cyb5R3蛋白的步骤。

本发明还提供cyb5R3蛋白作为用于预防和治疗癌症的药物组合物的活性成分的用途。

本发明还提供一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有所述载体的细胞作为活性成分。

本发明还提供一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有所述载体的细胞的步骤。

本发明还提供一种用于预防癌症的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有所述载体的细胞的步骤。

本发明还提供含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有所述载体的细胞作为用于预防和治疗癌症的药物组合物的活性成分的用途。

本发明还提供一种用于预防和改善癌症的健康食品，所述健康食品包含cyb5R3蛋白作为活性成分。

本发明还提供一种用于检测蛋白以便为诊断癌症提供必需信息的方法，所述方法包括以下步骤：

1)测量源自实验组的测试受试者的样品中cyb5R3蛋白的表达；

2)将步骤1)中测量的cyb5R3蛋白的表达与对照组的正常样品的cyb5R3蛋白的表达相比较；和

3)通过与对照组相比较cyb5R3蛋白的表达的下降来确定癌症爆发的风险。

此外，本发明提供一种用于筛选抗癌剂候选物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)用测试化合物或组合物处理表达cyb5R3蛋白的细胞系；

2)测量步骤1)中处理的细胞系中cyb5R3蛋白的表达；和

3)选择与未用测试化合物或组合物处理的对照组细胞系相比较，能够使步骤2)的细胞系中cyb5R3蛋白的表达增加的测试化合物或组合物。

有益效果

在过表达细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)的癌细胞中，缺氧诱导因子-1(HIF-1)的表达显著降低，从而抑制了癌细胞生长并抑制了体内肿瘤的生长和转移。因此，本发明的cyb5R3基因或蛋白可有效地用作用于预防和治疗癌症的药物组合物的活性成分。

附图说明

参照附图可更好地理解本发明的优选的实施方案的应用，其中：

图1是说明细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白在多种癌症细胞系中的表达的图。

图2是说明cyb5R3在结肠癌组织中的表达的图。

图3是说明在癌细胞系中根据cyb5R3抑制的缺氧诱导因子-1(HIF-1)的表达的图。

图4是说明在癌细胞系中根据cyb5R3过表达的HIF-1的表达的一组图；

图4A表示用于cyb5R3的过表达的载体的图；和

图4B表示cyb5R3和HIF-1在过表达cyb5R3的癌细胞系中的表达。

图5是说明在癌细胞系中根据cyb5R3过表达的线粒体的耗氧速率(OCR)的一组图；

图5A表示根据cyb5R3过表达的癌细胞系的基础呼吸速率和最大呼吸速率的变化；和

图5B表示根据cyb5R3过表达的癌细胞系的总呼吸速率的下降。

图6是说明根据cyb5R3过表达在癌细胞系中的细胞生长抑制作用的一组图；

图6A表示根据为了诱导cyb5R3过表达而采用的载体DNA的量，cyb5R3在HCT116细胞系中的过表达；和

图6B表示根据为了诱导cyb5R3过表达而采用的载体DNA的量，在癌细胞系中所显示的细胞生长抑制作用。

图7是说明在正常条件和缺氧条件下，cyb5R3和HIF-1蛋白在过表达cyb5R3的细胞系中的表达的比较的图。

图8是说明cyb5R3在移植了肿瘤的小鼠中的肿瘤生长抑制作用的图。

图9是说明cyb5R3在移植了肿瘤的小鼠中的肿瘤形成抑制作用的一组图。

图9A表示在移植了肿瘤的小鼠中的肿瘤随时间的生长；和

图9B表示在肿瘤移植后17天肿瘤的重量。

具体实施方式

以下将详细说明本发明。

本发明提供一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白作为活性成分。

cyb5R3蛋白片段优选地由选自以下1)-3)的氨基酸序列中的一个氨基酸序列组成，但并不总是局限于此：

1)SEQ.ID.NO:1(Genebank登录号：AAH04821)所示的氨基酸序列；

2)SEQ.ID.NO:1所示的序列的部分所示的氨基酸序列；和

3)显示与SEQ.ID.NO:1所示的序列具有至少80％同源性的氨基酸序列。

本文所述cyb5R3蛋白优选地抑制癌细胞中的缺氧诱导因子-1(HIF-1)，但并不总是局限于此。

本文所述癌症优选地为选自黑色素瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、肝癌、甲状腺肿瘤、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、结肠直肠癌、神经胶质母细胞瘤、子宫内膜癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、食管癌、头颈癌、间皮瘤、肉瘤、胆囊癌、小肠腺癌、儿童肿瘤和鳞状细胞癌中的一种或多种癌症，和更优选地为选自结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，和最优选地为结肠直肠癌，但是并不总是局限于此。

本文所述载体优选地为含有在人或动物细胞中表达的线性DNA的载体、质粒载体、含有病毒表达载体的载体或包括重组逆转录病毒载体、重组腺病毒载体、重组腺相关病毒(AAV)载体、重组单纯疱疹病毒载体或重组慢病毒载体的重组病毒载体，但并不总是局限于此。

本文所述细胞优选地选自造血干细胞、树突状细胞、自体肿瘤细胞和建立的肿瘤细胞，但是并不总是局限于此。

在本发明的优选的实施方案中，研究了cyb5R3和HIF-1在癌细胞系中的表达。结果显示，与正常细胞中cyb5R3的表达相比，癌细胞系和癌组织中cyb5R3的表达显著降低。同时，HIF-1α的表达显著增加，这表明HIF-1α与cyb5R3负相关(参见图1和图2)。

本发明的发明人还研究了HIF-1蛋白在下调或上调了cyb5R3蛋白的癌细胞系中的表达。结果显示，当在缺氧条件下诱导HIF-1α时，HIF-1α在cyb5R3表达被抑制的(即cyb5R3未表达)细胞系中表达。同时，在过表达cyb5R3的细胞系中的HIF-1α的表达被抑制(参见图3和图4)。

本发明的发明人研究了cyb5R3对癌细胞生长的抑制作用。结果显示，确证了在过表达cyb5R3的癌细胞系中线粒体的耗氧速率(OCR)和癌细胞生长显著地被抑制(参见图5和图6)。

本发明的发明人还研究了cyb5R3对癌细胞体内生长的抑制作用。结果显示，确证了当将过表达cyb5R3的细胞系嵌入移植了肿瘤的小鼠中时，有效地降低了肿瘤尺寸和重量(参见表2和表3，及图8和图9)。

综上所述，在本发明的过表达cyb5R3的癌细胞系中，HIF-1α的表达显著地降低，从而导致了癌细胞生长的抑制以及体内肿瘤生长和转移的抑制。因此，本发明的cyb5R3基因或蛋白可有效地用作用于预防和治疗癌症的药物组合物的活性成分。

通过考虑多个因素如给药方法、靶区域、患者病情等可确定本发明的组合物的药物有效剂量。因此，用于人体的剂量的确定必须同时考虑安全性和有效性。还可以基于动物试验确认的有效剂量来预测有效剂量。在确定有效剂量时必须考虑的各种因素描述于以下文献中：Hardman和Limbird编辑，Goodman和Gilman's The Pharmacological Basis ofTherapeutics,第10版(2001)，Pergamon Press；和E.W.Martin编辑，Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版(1990)，Mack Publishing Co.。

本发明的组合物可包括任何常用的媒介(carrier)、稀释剂、赋形剂或它们的至少两种的组合。药学上可接受的媒介可以是能够无限制地在人体中递送本发明的组合物的任何媒介，以描述于Merck Index，第13版，Merck&Co.Inc.中的化合物为例，如盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇和包含这些组分的一种或多种的混合物。若需要，可另外添加如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂的一般添加剂。本发明的组合物可以通过与稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂混合而制成不同的形式，包括水性溶液、用于注射的混悬剂和乳剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。通过按照Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company,Easton PA,18th,1990)中所示的方法，该组合物针对每一疾病或根据成分可进一步制成适宜的形式。

除了活性成分，本发明的组合物可另外包含一种或多种与该活性成分具有相同或相似作用的有效成分。相对于组合物的总重量，本发明的组合物包含优选地0.0001～10重量％、更优选地0.001～1重量％的蛋白质片段。

本发明的组合物可口服或非肠道给药(例如，静脉内、皮下、腹腔或局部注射)。可根据体重、年龄、性别、健康状况、饮食、给药频率、给药方法、排泄物和疾病的严重程度来确定组合物的有效剂量。所述剂量为每天0.0001～10mg/ml和优选地每天0.0001～5mg/ml，和给药频率为每天一次或优选地每天几次。

本发明的组合物包含优选地0.05～500mg、和更优选地0.1～300mg的含有编码cyb5R3的多核苷酸的载体。本发明的组合物包含优选地10³～10¹²IU(10～10¹⁰PFU)、和更优选地10⁵～10¹⁰IU的含有编码C12或f59来源的肽的多核苷酸的重组病毒，但并不总是局限于此。

本发明的组合物包含优选地10³～10⁸、和更优选地10⁴～10⁷的含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的细胞，但并不总是局限于此。

在包含含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有该载体的细胞的组合物中，所述载体的有效剂量为0.05～12.5mg/kg和优选地为0.1～10mg/kg；所述重组病毒载体的有效剂量为10⁷～10¹¹个病毒颗粒(10⁵～10⁹IU)/kg，和优选地10⁸～10¹⁰个病毒颗粒(10⁶～10⁸IU)/kg；和所述细胞的有效剂量为10³～10⁶个细胞/kg，和优选地10²～10⁵个细胞/kg。所述组合物每天可施用2～3次。所述剂量和组合并局限于上述内容，其可以根据患者的病情和神经障碍的严重程度来调节。

本发明提供一种用于预防和改善癌症的健康食品，所述健康食品包含cyb5R3蛋白作为活性成分。

在本发明的过表达cyb5R3的癌细胞系中，HIF-1α的表达显著地降低，从而导致了癌细胞生长的抑制以及体内肿瘤生长和转移的抑制。因此，本发明的cyb5R3蛋白可有效地用作用于预防和改善癌症的健康食品的活性成分。

本文所述食品是不受限制的。例如，本发明的组合物可添加至肉类、香肠、面包、巧克力、糖果、点心、饼干、披萨、拉面(ramyun)、面粉制品、口香糖(gum)、包括冰淇淋的乳制品、汤、饮品(beverage)、茶、饮料(drink)、酒精饮料和复合维生素等，从广泛意义而言，可包括几乎每种适用于健康食品生产的食品。

本发明的cyb5R3蛋白可用作食品添加剂。在这种情况下，本发明的cyb5R3蛋白可以以其原样添加或根据传统方法与其他食品组分混合添加。根据使用目的(预防或改善)可调节活性成分的混合比例。通常，为了生产健康食品或饮品，本发明的cyb5R3蛋白优选地以0.1～90重量份添加。然而，若为了健康、保健或调节健康状况而需要长期施用本发明的cyb5R3蛋白，其含量可低于上述含量，但是由于已证明本发明的cyb5R3蛋白是非常安全的，因此也可接受更高含量。

含有本发明的组合物的健康饮品可另外包含多种香料或天然碳水化合物等，如其它饮品。上述天然碳水化合物可以是如葡萄糖和果糖的单糖、如麦芽糖和蔗糖的二糖、如糊精和环糊精的多糖、和如木糖醇(xilytole)、山梨醇和赤藓糖醇的糖醇中的一种。此外，天然甜味剂(索马甜(thaumatin)、甜菊提取物，例如莱鲍迪苷A(rebaudioside A)、甘草甜素等)和合成甜味剂(糖精、阿斯巴甜等)可作为甜味剂包含。在100ml的组合物中，天然碳水化合物的含量优选地为1～20g和更优选地为5～12g。

除了以上提及的成分外，本发明的cyb5R3蛋白可包含多种营养物、维生素、矿物质(电解质)、包括天然香料和合成香料的香料、着色剂和填充剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增粘剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇及被添加至苏打汽水中的碳酸化物(carbonator)等等。本发明的cyb5R3蛋白还可包含天然果汁、果汁饮品和/或可添加果肉的蔬菜饮品。可以单独或共同添加所有提及的成分。实际上，这些成分的混合比例无关紧要，但是通常每一成分可以以每100重量份的本发明的cyb5R3蛋白的0.1～20重量份添加。

1)测量源自实验组的测试受试者的样品中cyb5R3蛋白的表达；

3)通过与对照组相比较cyb5R3蛋白的表达的下降来确定癌症的风险。

优选地，步骤1)中cyb5R3蛋白的表达通过选自以下的检测方法之一测定：蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组化染色、免疫沉淀和免疫荧光，但并不总是局限于此。

1)用测试化合物或组合物处理表达cyb5R3蛋白的细胞系；

2)测量步骤1)中处理的细胞系中cyb5R3蛋白的表达；和

与在正常细胞系或正常组织中相比较，本发明的cyb5R3在癌细胞或癌组织中被显著地下调。同时，在过表达cyb5R3的细胞系中HIF-1α的表达显著地降低。因此，本发明的cyb5R3蛋白可有效地用于筛选抗癌剂候选物的方法中和用于为诊断癌症提供必需信息的方法中。

本发明的实际上和目前优选的实施方案示于以下的实施例中。

但是，应当认识到，当考虑这些公开内容时，本领域技术人员可以在本发明的精神和范围内做出调整和改进。

实施例1：细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)和缺氧诱导因子-1(HIF-1)在癌细胞系中的表达

<1-1>HIF-1累积的癌细胞的培养和诱导

为了完成本发明的实施例，培养了多种癌细胞系。

特别地，如下表1所示，自ATCC(American Type Culture Collection)购买多种人癌细胞系。将补充了5％胎牛血清(FBS)的RPMI1640装载在细胞培养容器中，将培养的细胞以5×10⁵个细胞/ml的密度接种在该容器中，随后在37℃5％CO₂的培养箱中培养24小时。为了诱导HIF-1累积，将细胞在缺氧条件(1％氧气、94％氮气和5％CO₂)下进一步培养12小时。

【表1】

多种癌细胞系

<1-2>cyb5R3和HIF-1在HIF-1诱导的癌细胞系中的表达

为了确定cyb5R3和HIF-1在HIF-1诱导的癌细胞系中的表达，从癌细胞系获得细胞提取物，随后实施蛋白质印迹法。

特别地，在实施例<1-1>中获得HIF-1累积诱导的多种癌细胞系。通过采用RIPA缓冲液(放射免疫沉淀法缓冲液；Cell Signaling Technology，USA)将每一细胞系裂解，从而获得每一细胞提取物。将30μg获得的每一细胞提取物装载在SDS-FAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)上，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。将上述膜逐步与cyb5R3抗体(SantaCruz Biotechnology,USA)和HRP标记的二级抗体(Amersham-Pharmacia,USA)反应从而确定cyb5R3的表达。通过与上述相同的方式，采用HIF-1α抗体(R,D Systems)和HRP标记的二级抗体确定HIF-1α的表达。对于对照组，通过与上述相同的方式，采用兔多克隆GAPDH抗体(Ab Frontier,Korea)或兔多克隆β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling Technology,USA)测量GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)或激动蛋白的表达。

结果显示，如图1所示，与在正常细胞系WI-38中相比较，cyb5R3在如直肠结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌细胞系的细胞系中的表达显著地下降。同时，HIF-1α的表达显著增加，这表明HIF-1α与cyb5R3负相关(图1)。

实施例2：cyb5R3在癌组织中的表达

为了研究cyb5R3蛋白在癌组织中的表达，用结肠直肠癌组织实施免疫组化染色。

确切地，用于诊断的样品由The Catholic University of Korea Daejeon SaintMary Hospital(Korea)提供，然后将所述样品固定在福尔马林中从而制备20个结肠直肠癌组织的石蜡块。用二甲苯处理这些石蜡块从而消除石蜡切片中的石蜡。将块在100℃下加热以恢复抗原，随后用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤三次。用抗体稀释缓冲液(Covance,USA)以1:200的比例稀释的抗-cyb5R3抗体(Sigma-Aldrich,USA)用作一级抗体，生物素缀合的抗体用作二级抗体，从而通过采用链霉亲和素生物素通用检测系统(Streptavidin BiotinUniversal Detection System)(Immunotech,Finland)，根据制造商的规程来测量cyb5R3水平。用AEC色原试剂盒(Immunotech,Finland)诱导显色。对于阳性对照组，通过与上述相同的方式，用正常组织WI-38实施免疫组化染色，并将颜色强度进行比较。

结果显示，如图2所示，包含cyb5R3的细胞定位于正常组织的腺体结构中，尽管表达cyb5R3的细胞显著地减少并同时在结肠直肠癌组织中观察到了变形的腺体(图2)。

实施例3：在癌细胞系中根据cyb5R3表达的HIF-1的表达

<3-1>在cyb5R3抑制的癌细胞系中HIF-1的表达

为了研究cyb5R3与HIF-1表达之间的相互关系，测量了cyb5R3表达被抑制的癌细胞系中的HIF-1的表达。

特别地，用Dharmafect(thermo Co.)处理20nM的cyb5R3siRNA(Thermo Co.；货号：siGENOME人cyb5R3(1727)siRNA SMART pool)，用其转染结肠癌细胞系HCT116。将转染的细胞系在补充了5％FBS的DMEM(Dulbecco`s Modified Eagle`s Medium)中培养24小时。为了诱导HIF-1累积，将细胞系在缺氧条件(1％氧气、94％氮气和5％CO₂)下培养12小时。通过与实施例<1-2>中所述的相同的方式测量cyb5R3和HIF-1蛋白的表达。对于阴性对照组，将转染的细胞系在20％氧气存在下培养，并通过与上述相同的方式测量cyb5R3和HIF-1蛋白的表达。对于对照组的蛋白，采用兔多克隆GAPDH抗体(Ab Frontier,Korea)并通过与上述相同的方式测量GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的表达。

结果显示，如图3所示，在好氧条件下的阴性对照组既未表达cyb5R3也未表达HIF-1α。当在缺氧条件下诱导HIF-1α时，cyb5R3未表达(图3)。

<3-2>HIF-1在过表达cyb5R3的癌细胞系中的表达

为了研究cyb5R3与HIF-1表达之间的相互关系，在癌细胞系中使cyb5R3过表达，从而测定其中的HIF-1的表达。

特别地，扩增pCMV-AC-cyb5R3(图4A；Origin，USA)，即含有cyb5R3基因的pCMV6-AV载体。将4μg所述载体和lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)装载在含有补充了5％FBS的DMEM的60mm平皿中，该平皿上接种了直肠结肠癌细胞系HCT116的4×10⁵个细胞，随后培养24小时用于DNA转染。然后为了诱导HIF-1累积，将细胞系在缺氧条件(1％氧气、94％氮气和5％CO₂)下培养12小时。通过与实施例<1-2>中所述的相同的方式测量cyb5R3和HIF-1蛋白的表达。对于阴性对照组，将转染的细胞系在20％氧气存在下培养，并通过与上述相同的方式测量cyb5R3和HIF-1蛋白的表达。对于对照组的蛋白，采用兔多克隆GAPDH抗体(Ab Frontier,Korea)并通过与上述相同的方式测量GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)的表达。通过与实施例<2-1>中所述的相同的方式测量cyb5R3和HIF-1蛋白的表达。

结果显示，如图4B所示，随着cyb5R3在用过表达cyb5R3诱导的细胞系中的表达增加，在缺氧条件下的HIF-1α的表达降低(图4B)。

实施例4：cyb5R3对癌细胞生长的抑制作用

<4-1>线粒体在过表达cyb5R3的癌细胞系中的耗氧速率(OCR)

为了研究cyb5R3的癌细胞生长抑制作用，测量了线粒体在过表达cyb5R3的癌细胞系中的耗氧速率。

通过与实施例<3-2>中所述的相同的方式培养用cyb5R3过表达诱导的结肠癌细胞系HCT116。将1×10⁵个培养的细胞在XF24细胞培养板上进一步培养2小时。用XF测量培养基替代该培养基，随后在无CO₂的培养箱中培养1小时。采用XF24细胞外流量分析仪(XF24extracellular flux analyzer)(Seahorse Bioscience,USA)测量OCR三次。用1μM浓度的ATP合成酶抑制剂寡霉素进行处理。然后再次测量OCR三次。用0.5μM浓度的化学解偶联剂羰基氰对-三氟甲氧基苯腙(carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone)处理并随后测量OCR三次。用1μM浓度的电子传递系统抑制剂鱼藤酮处理，并随后测量OCR两次。用1μM的抗霉素A处理，并再次测量OCR两次。

结果显示，如图5所示，过表达cyb5R3的细胞系中总OCR降低了40％(图5B)。基础呼吸和最大呼吸也显著地降低(图5A)。

<4-2>在过表达cyb5R3的癌细胞系中的细胞生长抑制

为了研究cyb5R3的癌细胞生长抑制作用，测量了过表达cyb5R3的癌细胞系中的细胞生长抑制率。

特别地，扩增pCMV-AC-cyb5R3(Origin,USA)，即含有cyb5R3基因的pCMV6-AV载体。将结肠直肠癌细胞系HCT116在补充了0.5μg、1μg或2μg的所述载体和lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)的DMEM中培养24小时用于DNA转染。当培养完成时，将DNA转染的HCT116细胞系以3×10³个细胞/100μl的密度分布在96孔板上，随后在37℃5％CO₂的培养箱中培养72小时。在室温下，将细胞用4％的甲醛固定1小时，然后用PBS洗涤。然后在室温下，将细胞用0.5％亚甲基蓝(50μl/孔)染色1小时。将细胞用蒸馏水洗涤并干燥。将100μl的0.06N HCl分布于其中并在室温下使细胞与其良好混合10分钟。采用ELISA读板仪测量OD₆₀₀从而确定细胞生长。

结果显示，如图6所示，插入到HCT116细胞系中的以剂量依赖方式诱导cyb5R3过表达的pcMV6-AC-cyb5R3表达载体抑制了癌细胞生长(图6A和6B)。

实施例5：cyb5R3对体内癌细胞生长的抑制作用

<5-1>过表达cyb5R3的细胞系的构建

为了制备过表达cyb5R3的细胞系，构建了稳定地过表达cyb5R3的HCT116细胞系。

特别地，将4×10⁵个HCT116细胞接种在含有补充了5％FBS的DMEM的60mm平皿中，随后在37℃5％CO₂的培养箱中培养24小时。然后向其中添加4μg的pCMV-AV-cyb5R3(Origin,USA)，即含有cyb5R3基因的PCMV6-AV载体，和lipofectamine 2000(Invitrogen,Carlsbad,CA)，然后在37℃下培养48小时用于DNA转染。将HCT116细胞在补充了0.5mg/ml的G418(Gibco,USA)的DMEM(Dulbecco's改良Eagle's培养基)中培养2周。选择转染了用于cyb5R3过表达的载体的细胞。获得并培养这些细胞的单一集落。通过与实施例<1-2>中所述的相同的方式研究cyb5R3的表达。之后，选择稳定地过表达cyb5R3的HCT细胞系。对于阴性对照组，将不含cyb5R3基因的表达载体pCMV-AC(Origin,USA)引入至HCT116细胞系中，即，用与上述相同的方法构建了cyb5R3敲除的HCT116。

结果显示，如图7所示，收集稳定地过表达cyb5R3的HCT116细胞系，并在缺氧条件下确定了所述HCT116细胞系中HIF-1α表达的下降(图7)。

<5-2>cyb5R3对体内肿瘤生长的抑制作用

为了研究cyb5R3的体内癌细胞生长抑制作用，将过表达cyb5R3的细胞系嵌入体内，从而确定体内肿瘤尺寸的变化。

特别地，用胰蛋白酶处理在实施例<5-1>中制备的过表达cyb5R3的HCT116细胞系，并收集。将细胞用无血清培养基洗涤并稀释至5×10⁷个细胞/ml的浓度。通过皮下注射将稀释的细胞从侧部注射至5个6周大的雌性Balb/c无特定病原(SPF)的裸鼠中(SLC-CentralLab.Animal Inc.,Korea)，从而完成肿瘤细胞的移植(1×10⁷个细胞/200μl)。在移植后的第3、5、7、12、14和17天，采用如下的数学公式1来测量每只裸鼠的体重以及肿瘤的尺寸和生长。在移植后的第17天，将所述动物处死并测量肿瘤的重量和体积，从而研究肿瘤的形成和生长。对于阴性对照组，采用实施例<5-1>中构建的cyb5R3敲除的HCT116细胞系，并采用与上述相同的方式测量肿瘤生长。

【数学公式1】

肿瘤尺寸(mm²)＝(长度×宽度×高度)/2

结果显示，如表2和表3、图8和图9所示，在肿瘤移植后，小鼠的体重没有发生显著变化(表2)。与对照组相比较，在引入了过表达cyb5R3的HCT116细胞系的小鼠中，肿瘤生长被抑制了约65％(图8和表3)。在肿瘤移植后的第17天，肿瘤的重量为11.0±32.1mg，这比阴性对照组的肿瘤重量(210.0±36.1mg)低48％(图9)。

【表2】

移植了cyb5R3过表达的细胞和肿瘤的小鼠的体重变化

【表3】

cyb5R3对体内肿瘤生长的抑制作用

Claims

1.一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白作为活性成分，其中所述癌症为选自结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，其中所述cyb5R3蛋白由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的用于预防和治疗癌症的药物组合物，其中所述cyb5R3蛋白抑制癌细胞中的缺氧诱导因子-1(HIF-1)。

3.一种用于预防和治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包含含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有所述载体的细胞作为活性成分，其中所述癌症为选自结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，其中所述cyb5R3蛋白由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求3所述的用于预防和治疗癌症的药物组合物，其中所述cyb5R3蛋白抑制癌细胞中的缺氧诱导因子-1(HIF-1)。

5.根据权利要求3所述的用于预防和治疗癌症的药物组合物，其中所述载体为线性DNA、质粒DNA或重组病毒载体。

6.根据权利要求5所述的用于预防和治疗癌症的药物组合物，其中所述重组病毒选自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和慢病毒。

7.根据权利要求3所述的用于预防和治疗癌症的药物组合物，其中所述细胞选自造血干细胞、树突状细胞、自体肿瘤细胞和建立的肿瘤细胞。

8.细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白用于制备检测癌症的试剂的用途，其中所述癌症为选自结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，其中所述检测包括以下步骤：

1)测量源自实验组的测试受试者的样品中cyb5R3蛋白的表达，其中所述cyb5R3蛋白由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列组成；

3)通过与对照组相比较的cyb5R3蛋白的表达的下降来确定癌症的风险。

9.根据权利要求8所述的细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白用于制备检测癌症的试剂的用途，其中步骤1)中cyb5R3蛋白的表达通过选自以下的方法之一测量：蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫组化染色、免疫沉淀和免疫荧光。

10.一种用于筛选抗癌症剂候选物的方法，其中所述癌症为选自结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，所述方法包括以下步骤：

1)用测试化合物或组合物处理表达cyb5R3蛋白的细胞系，其中所述cyb5R3蛋白由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列组成；

2)测量步骤1)中处理的细胞系中cyb5R3蛋白的表达；和

3)选择与未用所述测试化合物或组合物处理的对照组细胞系相比较，能够使步骤2)的细胞系中cyb5R3蛋白的表达增加的测试化合物或组合物。

11.细胞色素b5还原酶3(cyb5R3)蛋白用于制备治疗癌症的试剂的用途，其中所述癌症为选自结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，其中所述cyb5R3蛋白由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列组成。

12.含有编码cyb5R3蛋白的多核苷酸的载体或含有所述载体的细胞用于制备治疗癌症的试剂的用途，其中所述癌症为选自结肠直肠癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌和肾癌中的一种或多种癌症，其中所述cyb5R3蛋白由SEQ.ID.NO:1所示的氨基酸序列组成。