KR102629955B1 - Ewsr1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
Ewsr1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현정도를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 비알콜성 지방간질환 진단용 조성물, 이를 이용한 비알콜성 지방간질환을 진단하는 방법, 비알콜성 지방간질환 진단 키트 및 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 정도를 측정할 수 있는 제제를 포함하는 비알콜성 지방간질환 진단용 조성물, 이를 이용한 비알콜성 지방간질환을 진단하는 방법, 비알콜성 지방간질환 진단 키트 및 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
간은 영양소 대사의 중심 역할을 하는 장기로서, 정상적인 사람의 간은 약 1,500g의 무게를 가지며 간질환이 발병하여 간 기능 이상이 초래되면 생체의 영양소 대사에 문제가 생기는 바, 구체적으로 포도당을 글리코겐으로 만들거나 또는 단백질을 알부민으로 전환하거나 불필요한 것을 분해하여 쓸개즙으로 전달하는 등의 간 기능에 이상이 생긴다.
다양한 간질환 중 비알콜성 지방간질환(Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)은 가장 흔하게 나타나는 간질환으로, 술을 마시지 않거나 거의 마시지 않는 사람에게 주로 생기는 지방간을 일컫는다. 비알콜성 지방간의 증상은 간 손상을 일으키지 않는 단순한 지방증에서 비알콜성 지방간염(Nonalcoholic Steatohepatitis, NASH)에 이르기까지 그 정도가 다양한데, 이중 가장 심각한 형태인 비알콜성 지방간염은 간경변 및 간암으로까지 진행할 수 있다. 이러한 비알콜성 지방간질환의 원인은 비만, 혈중 지방질의 농도가 높은 고지혈증 또는 당뇨병 등의 질병, 약물, 심각한 영양 부족 등으로 추정되고 있다.
RNA 결합 단백인 Ewing sarcoma breakpoint region 1 (EWSR1) 단백은 multifunctional RNA/ssDNA 결합 단백질로 Fli-1이나 ERG와 같은 oncogene들과 fusion되어 암의 형성에 관여하며 정상 세포에서는 transformation하는 dominant oncogene으로 알려져 있다. 이 이러한 연구를 바탕으로 현재 EWSR1을 각종 암의 진단으로 사용을 많이 한다. 그러나 현재까지 EWSR1을 이용하여 비알콜성 지방간질환을 진단, 예후 바이오마커와 치료제에 대한 연구는 미비하다.
이에 본 발명에서는 비알콜성 지방간질환을 진단할 수 있는 바이오마커를 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 비알콜성 간질환 환자의 간 조직에서 EWSR1이 감소하고, 혈청 내 발현은 증가하는 것을 확인하였고, 이를 통해 고지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1 유전자를 삽입한 결과 몸무게 감소와 간 조직 내 지방 축적 정도가 억제되는 것을 확인하였으므로, EWSR1은 비알콜성 지방간 진단, 예후용 바이오 마커 및 이를 포함하는 비알콜성 지방간질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 개선용 건강기능식품조성을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 비알콜성 지방간염 진단용 바이오 마커 조성물을 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비알콜성 지방간염 진단용 조성물을 이용한 비알콜성 지방간염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 비알콜성 지방간염 진단용 조성물을 이용하여 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 개선용 건강기능식품조성을 제공할 수 있다.
본 발명은 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 EWSR1유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 EWSR1 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 비알콜성 지방간염 진단용 바이오 마커 조성물을 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 환자의 생물학적 시료로부터 EWSR1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 EWSR1 유전자의 mRNA의 발현 정도가 대조군에 비해 증가하면 비알콜성 지방간염인 것으로 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 mRNA 발현 정도 측정은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 환자의 생물학적 시료가 간 조직일 경우 EWSR1 단백질의 발현 정도가 대조군에 비해 감소하면 비알콜성 지방간염인 것으로 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 환자의 생물학적 시료가 혈청일 경우 EWSR1 단백질의 발현 정도가 대조군에 비해 증가하면 비알콜성 지방간염인 것으로 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 단백질 발현 정도 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 동물의 간에서 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 EWSR1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질을 처리한 동물의 간에서 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 EWSR1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a)에서 측정한 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 EWSR1 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 단계 (c)에서 측정한 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준이 낮아지거나 EWSR1 단백질의 발현 수준이 증가한 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 비알콜성 지방간을 유도한 세포 모델에서 EWSR1의 RNA이 크게 증가한 반면 EWSR1 단백질의 발현은 유의적으로 감소하였고, EWSR1 knock-out mice의 간 조직 DNA micro-array를 수행한 결과 EWSR1의 발현 저하가 간 세포내 지방 대사의 항상성 조절에 영향을 준다는 사실을 확인하였으며, 임상적으로도 비알콜성 지방간염환자의 간 조직내 EWSR1의 발현은 감소하였고, 혈청 내 발현은 증가하는 확인함으로써, EWSR1이 비알콜성 지방간질환을 진단할 수 있는 효과가 있다. 고지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1을 과발현한 결과 몸무게 증가와 간 조직내 지방 축적이 감소하는 효과가 있다. 이를 이용하여 EWSR1을 발현 또는 촉진제로 비알콜성 지방간을 치료할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 간 세포주인 FL83B에서 지방 축적에 따른 EWSR1 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 비알콜성 지방간질환이 진행됨에 따른 EWSR1의 발현을 확인한 결과이다.
도 3는 단순지방간과 비알콜성지방간염 환자의 간조직과 혈청에서의 EWSR1 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 간세포주에 PA와 pFlag-EWSR1 발현 벡터를 세포내 주입 시켰을 때 지방 축적 정도와 신호전달기전을 확인한 결과이다.
도 5은 고지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1 유전자를 쥐에 주입했을 때 몸무게 와 간 조직내 지방 축적을 확인한 결과이다.
도 2는 비알콜성 지방간질환이 진행됨에 따른 EWSR1의 발현을 확인한 결과이다.
도 3는 단순지방간과 비알콜성지방간염 환자의 간조직과 혈청에서의 EWSR1 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 간세포주에 PA와 pFlag-EWSR1 발현 벡터를 세포내 주입 시켰을 때 지방 축적 정도와 신호전달기전을 확인한 결과이다.
도 5은 고지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1 유전자를 쥐에 주입했을 때 몸무게 와 간 조직내 지방 축적을 확인한 결과이다.
하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1 과발현 벡터(pFlag-EWSR1)를 이용하여 EWSR1을 과발현한 결과 몸무게 증가와 간 조직내 지방 축적이 감소하였다 (도 5).
본 발명에서 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1)의 “발현 또는 활성 촉진제”란 EWSR1에 직접 또는 간접적으로 작용하여 EWSR1의 발현 또는 활성을 개선, 유도, 자극, 증가시키는 물질을 의미한다. 이런 물질은 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물, 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 포함한다. 상기 물질이 상기 EWSR1의 발현 또는 활성을 촉진시키는 기작은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 물질은 전사, 번역 등의 유전자 발현을 증대시키거나, 비활성형을 활성형으로 전환시키는 기작으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, EWSR1의 발현 또는 활성을 촉진시키는 물질은 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물이다. 핵산 및 단백질 서열이 이미 공지된 EWSR1에 대하여 당업자는 촉진제로 작용하는 유기 또는 무기 화합물과 같은 단일 화합물 펩타이드, 단백질, 핵산, 탄수화물 및 지질과 같은 생체 고분자 화합물 및 복수 화합물의 복합체 등을 당 분야의 기술을 이용하여 제조하거나 스크리닝 할 수 있다.
본 발명의 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제는 유전자 치료 등에 사용되기 위하여 세포 내에서 EWSR1을 발현할 수 있는 벡터의 형태로 제공될 수 있다. 이에, 본 발명은 EWSR1을 코딩하는 핵산, 바람직하게는 이 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
EWSR1을 코딩하는 핵산 서열은, 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA) 분자일 수 있다.
본 발명의 벡터는, 리포좀, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서, 바람직한 바이러스 벡터의 예로는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노부속바이러스(adeno-associated virus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 단순포진 바이러스(herpes simplex virus), 알파바이러스(alpha virus) 등이 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 EWSR1을 코딩하는 핵산과 이의 전사 또는 해독을 위한 조절서열을 포함할 수 있다. 특히 중요한 조절서열은 프로모터, 인핸서와 같이 전사 개시를 조절하는 것이다. 또한, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 코작(Kozak), 인핸서, 막 표적화 및 분비를 위한 신호서열, IRES(Internal Ribosome Entry Site) 등으로 이루어진 조절 서열을 포함할 수 있다. 이러한 조절서열과 EWSR1을 코딩하는 핵산은 작동가능하게 연결되어야 할 것이다.
여기서, 이용된 용어 '작동가능하게 연결된'이란 핵산 서열간의 결합이 기능적으로 연관되어 있는 것을 의미한다. 임의의 핵산서열이 작동가능하게 연결된 경우는 임의의 핵산서열이 다른 핵산서열과 기능적으로 관련성을 가지도록 위치해 있는 경우이다. 본 발명에 있어서, 임의의 전사 조절서열이 EWSR1을 코딩하는 핵산분자의 전사에 영향을 미치는 경우, 상기 전사 조절서열이 상기 핵산분자와 작동가능하게 연결되어 있다고 말한다. 본 발명에서, 치료는 비알콜성 지방간염을 억제, 예방하거나, 비알콜성 지방간염과 관련된 증상을 감소, 경감, 역전시키고 비알콜성 지방간염의 진행을 억제하는 것을 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고 뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 EWSR1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 이의 발현 단백질을 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 개선용 건강기능식품조성을 제공할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강기능식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품 안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
본 발명은 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 비알콜성 지방간염 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "진단용 바이오마커"란 정상 대조군에 비해 만성 간질환이 진행된 개체에 비해, 특정 유전자 발현 수준 또는 단백질 발현 수준의 유의적인 증가 또는 감소 양상을 보이는 폴리펩티드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함하며, 바람직하게는EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1)이다.
본 발명의 구체적인 일구현예에서, 비알콜성 지방간을 유도한 세포 모델에서 EWSR1의 RNA이 크게 증가한 반면 EWSR1 단백질의 발현은 유의적으로 감소하였고 (도 1), 지방 식이를 이용해 유도된 비알코올성 지방간 마우스의 간 조직에서 EWSR1의 발현을 WB와 Immunohistochemistry를 통해 확인한 결과, 정상 간 조직에 비해 비알콜성 지방간질환이 진행될수록 EWSR1의 발현이 감소한다는 것을 확인하였다 (도 2). EWSR1 knock-out mice의 간 조직 DNA micro-array를 수행한 결과 EWSR1의 발현 저하가 간 세포내 지방 대사의 항상성 조절에 영향을 준다는 사실을 확인하였다 (도 3). 임상적으로도 비알콜성 지방간염 환자의 간 조직내 EWSR1의 발현은 감소하였고, 혈청 내 발현은 증가하는 확인하였다 (도 4). EWSR1이 AMPK의 활성화 시키고 이로 인해 지방산의 합성을 억제하고 지방산의 산화를 촉진함으로써 세포내 지방 축적을 감소시킨다는 사실을 확인하였다 (도 5).
본 발명에 사용된 용어 "mRNA 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 만성 간질환 진단을 위한 바이오마커의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1)의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 EWSR1의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인 것을 특징으로 하며, 상기 유전자들의 핵산 정보가 GeneBank 등에 알려져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드를 디자인할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다.
본 발명에서 사용된 용어 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA 일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다.
본 발명에서 사용된 용어 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 EWSR1의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 만성 간질환 진단을 위한 바이오 마커로서, 상기 EWSR1의 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "단백질 발현수준 측정"이란 생물학적 시료에서 만성 간질환 진단을 위한 바이오마커로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. 상기 유전자의 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자 (nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
상기 단백질 발현 수준 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏 및 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 용어 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 바이오마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
본 발명은 상기 비알콜성 지방간염 진단용 바이오 마커 조성물을 포함하는 비알콜성 지방간염 진단용 키트에 관한 것이다.
상기 키트는 당업계에 알려져 있는 통상의 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 키트는 예를 들면, 동결 건조 형태의 항체와 완충액, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다.
상기 키트는 검출 가능한 표지를 더 포함할 수 있다. 용어 "검출 가능한 표지"는 표지가 없는 동일한 종류의 분자들 중에서 표지를 포함하는 분자를 특이적으로 검출하도록 하는 원자 또는 분자를 의미한다. 상기 검출 가능한 표지는 상기 단백질 또는 그의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자, 또는 압타머에 부착된 것일 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 방사종(radionuclide), 형광원(fluorophore), 효소(enzyme)를 포함할 수 있다.
상기 키트는 당업계에 알려진 다양한 면역분석법 또는 면역염색법에 따라 이용될 수 있다. 상기 면역분석법 또는 면역염색법은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, ELISA, 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석, 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 키트는 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(multiple reaction monitoring)인 것일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, (a) 환자의 생물학적 시료로부터 EWSR1의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법에 관한 것이다.
상기 방법에서 "생물학적 시료(biological sample)"란 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 의미하며, 바람직하게는 혈액, 혈장, 혈청, 간 조직을 의미한다.
상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법에서 EWSR1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준 측정 방법은 상술한 바와 같다.
상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 EWSR1 유전자의 mRNA의 발현 정도가 대조군에 비해 증가하면 비알콜성 지방간염인 것으로 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 환자의 생물학적 시료가 간 조직일 경우 EWSR1 단백질의 발현 정도가 대조군에 비해 감소하면 비알콜성 지방간염인 것으로 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
기 만성간질환 진단에 대한 정보 제공방법은 환자의 생물학적 시료가 혈청일 경우 EWSR1 단백질의 발현 정도가 대조군에 비해 증가하면 비알콜성 지방간염인 것으로 정보를 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 a) 동물의 간에서 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 EWSR1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 동물에 시험 물질을 처리하는 단계; (c) 상기 시험물질을 처리한 동물의 간에서 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 EWSR1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (a)에서 측정한 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 EWSR1 단백질의 발현 수준과 비교하여, 상기 단계 (c)에서 측정한 EWSR1 유전자의 mRNA 발현 수준이 낮아지거나 EWSR1 단백질의 발현 수준이 증가한 물질을 선별하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 비알콜성 지방간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 재료 및 방법
1-1 세포 배양
사람 간암세포주(Human hepatoma cell line)인 Huh7과 마우스 정상간세포주(Mouse hepatocyte)인 FL83B는 from American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)에서 구매하였다. Huh7은 Dulbecco's Modified Eagle's medium (DMEM,Hyclone, UT, USA) 배지에, FL83B는 F-12K(Kaighn's Modification of Ham's F-12 Medium, Gibco, MA, USA) 배지에 각각 항생제(100μg/ml 페니실린 및 0.25μg/ml 스트렙토마이신)와 10% FBS(Fetal bovine medium,(Invitrogen, MA, USA)를 첨가하여 배양하였다. 세포는 일정한 습도를 유지하는 37℃ 항온기에서 배양하고 3~4일마다 계대배양하였다. Huh7과 FL83B에 EWSR1 과발현 벡터(pFlag-EWSR1, provided by Dr.Sean Bong Lee, Tulane University School of Medicine, New Orleans, LA 70112, USA)를 lipofectamine 방법으로 세포내로 도입하였다. 과발현시킨 후 대조군으로 Bovine Serum Albumin (BSA)과 실험군으로 palmitic acid를 처리하여 비알콜성 지방간질환 in vitro 모델을 확립하였다.
1-2 Nile red 염색
세포에서의 지방축적을 알아보기 위해 Huh7과 FL83B에 BSA와 Palmitic acid (PA)를 각각 24시간 처리 후 PBS로 media를 씻어주었다. 그 후 4% 파라포름알데하이드에 3분 고정하였고 이를 다시 PBS로 씻어주었다. Nile red (sigma)로 5분 동안 염색한 후 PBS로 씻어주고 형광현미경으로 관찰하였다.
1-3 Total RNA추출
동결 보관되어 있던 세포나 간조직을 trizol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 1 ㎖을 넣고 혼합하여 상온에서 5분간 방치하였다. 여기에 0.2 ㎖의 클로로폼(chloroform)을 첨가하여 잘 섞은 다음 상온에서 2-3분간 방치한 후, 4℃, 12,000 g에서 15분간 원심 분리하여 얻은 무색의 상층액을 새로운 튜브(tube)로 옮겼다. 이 상층액에 0.5㎖의 아이소프로판올(isopropanol)을 혼합하고 실온에서 10분간 방치한 다음 4℃, 12,000 g에서 10분간 원심 분리하여 RNA를 침전시키고 상층을 제거하였다. 침전된 RNA에 75% 에탄올 1㎖을 잘 혼합한 후 4℃, 12 000 g에서 10분간 원심 분리하여 상층을 제거 하고 실온에서 10분간 건조시켰다. 건조된 RNA에 100 ㎕의 증류수를 첨가하여 녹인 후, 그 중 1㎕를 취하여 분광기(spectrometer)로 흡광도를 측정하고, 1% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 RNA의 순도를 확인하였다.
1-4 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR)
TRIzol(Ambion)을 사용하여 RNA를 추출한 후 reverse transcriptase(Promega)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이를 SYBR Green I(Takara)과 함께 EWSR1 primer와 반응시켜 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 EWSR1의 발현을 분석하였다. EWSR1 primer의 염기서열은 다음과 같다. EWSR1 Forward primer 5‘ -GTGCAATTTATGTGCAAGGATTA- 3’ & EWSR1 Reverse primer 5‘ - TCCAGTTCTCTTGTTCATCTTGA- 3’ 상기 유전자의 발현에 보정을 위한 대조군으로서, β-액틴의 유전자의 발현을 상기와 동일한 방법을 수행하여 확인하고, 이를 기준으로 보정 한 다음, EWSR1 유전자의 발현 수준을 정량적으로 비교하였다.
1-5 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석
Huh7과 FL83B에 RIPA 완충액(20 mM Tris-HCl at pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1 % sodium deoxycholate, and 0.1 % SDS), protease inhibitor (Roche, Basel, Swiss), phosphatase inhibitor cocktail (Sigma, MO, USA))를 처리하여 단백질을 추출하였다. 각각의 단백질을 RIPA 완충액과 섞어 5분 끓인 후 상온에서 식혔다. SDS(Sodium dodecyl sulfate) 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하여 단백질을 크기별로 분리한 후, Nitrocellulose membrane(GE Healthcare, WI, USA)으로 이동시켰다. 차단 완충액(Blocking buffer)으로 1시간 차단하고 EWSR1과 Actin 항체로 4℃에서 18시간 반응시킨 후, horseradish peroxidase(HRP)가 표지된 이차항체로 2시간 반응시켰다. ECL 완충액(GE Healthcare)을 사용하여 단백질의 발현을 확인하였다.
1-6 동물 실험
실험동물로는 약 6주령이 된 C57BL/6 종 마우스를 구입하여 실험을 진행하였다. 실험은 두 가지 방식으로 진행되었는데 우선 정상대조군, 고지방식이군으로 나눠 9개월 동안 식이를 진행하고 간을 분리하여 EWSR1의 발현을 웨스턴 블롯과 면역조직화학염색으로 확인하였다. 다음으로 정상 대조군, 고지방식이군, 고지방식이에 EWSR1 과발현군, 이렇게 3군으로 나누어 식이를 4주 동안 진행하며 EWSR1 과발현 실험군은 4일에 한 번 꼬리 정맥으로 EWSR1 발현벡터를 PBS와 함께 주입하였다. 이들도 간을 분리하여 간 내에서 지방이 축적되어 만들어지는 분자 중 하나인 triglyceride (TG)를 측정하였고, VetTest 8008(IDEXX)을 사용하여 혈액내의 효소 활성 alanine Aminotransferase(ALT))이나 TG, Cholesterol을 측정하였다.
1-7 H&E 염색과 면역조직화학염색, Oil red O 염색
간 조직의 형태를 확인하기 위해 H&E 염색법을 사용하였고 박절한 조직에 Harry’s hematoxylin 염색액으로 1분간 염색한 후 흐르는 물에 수세하였다. 이후 eosin염색액으로 1분간 대조염색을 하고 함수(100%- 95%- 90%- 80%- 70% EtOH)의 역방향으로 탈수과정을 거친 후 봉입하여 현미경으로 관찰하였다. 조직 내의 EWSR1의 발현을 확인하기 위해 사용한 면역조직화학염색법은 박절한 조직에 EWSR1 항체로 4℃에서 18시간 반응시킨 후 세척하여 Dako envision Plus 시스템 (Dako)으로 상온에서 30분 조절하고, 디아미노벤지딘으로 상온에서 1분 30초 동안 면역 반응을 수행한 후 hematoxylin 염색액으로 1분간 염색하였다. 그 후 함수(100%- 95%- 90%- 80%- 70% EtOH)의 역방향으로 탈수과정을 거친 후 봉입하여 현미경으로 관찰하였다. 간 조직 내의 지방 축적의 정도를 확인하기 위해 Oil red O 염색법을 사용하였는데 박절한 조직을 이소프로판올에 녹인 oil red o 시약을 15분 염색한 후 hematoxylin 염색액으로 1분간 염색하였다. 그 후 물로 수세 후 봉입하여 현미경으로 관찰하였다.
[실시예 2] 지방의 축적에 따른 EWSR1의 발현을 in vitro 실험에서 확인
간 세포주인 FL83B에 우리 몸을 이루는 지방산 중 하나인 Palmitic acid(PA)를 24시간 처리하여 비알코올성 지방 간 in vitro 모델로 재현하였고, 이에 따라 EWSR1 발현과 세포 내 위치를 real-time PCR, Western blot(WB)과 immunofluorescence staining을 통해 확인하였다. 그 결과, 간세포에 PA 처리로 EWSR1의 mRNA 발현은 유의적으로 증가하지만 (P < 0.001) protein에서의 발현은 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 간세포에 PA를 처리하였을 때 지방이 축적되는 것을 Nile-Red staining 후 형광현미경을 통해 확인하였고 이에 따라 EWSR1의 발현이 정상 간세포에서는 주로 핵에서 발현되는 반면, PA를 처리하였을 때 핵에서 세포질로 발현 위치가 바뀜을 확인하였다 (도 1).
[실시예 3] 비알콜성 지방 간질환 마우스 모델에서 EWSR1의 발현 확인
고지방 식이를 이용해 유도된 비알코올성 지방간 마우스의 간 조직에서 EWSR1의 발현을 웨스턴 블롯과 면역조직화학 분석 (Immunohistochemistry analysis)을 통해 확인하였다. 그 결과, 정상 간 조직과 비교하여 비알콜성 지방 간질환이 진행될수록 EWSR1의 protein 발현이 감소한다는 것을 확인하였고 (P = 0.0015) 면역조직화학분석을 통한 EWSR1의 발현도 비알코올성 지방간 마우스의 간 조직에서 감소한 것을 확인하였다 (도 2).
[실시예 4] 지방 간질환 환자의 샘플에서 EWSR1 발현 확인
임상적으로 비알콜성 지방간 진단 마커로서의 유용성을 확인하고자 단순 지방간(Fatty liver)과 비알콜성 지방 간염 환자(Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)의 간 조직과 혈청을 이용해 EWSR1의 발현을 각각 면역조직화학 분석과 ELISA분석을 통해 확인하였다 (도 3). 그 결과, 단순 지방간과 비알콜성 지방 간염 환자의 간 조직 내 EWSR1의 발현은 감소하였고 혈청 내 발현이 증가함을 확인하였다. 이러한 결과로 EWSR1 단백이 비알콜성 지방 간질환의 진단 마커로서의 가능성을 확인하였다.
[실시예 5] 간 세포주에 pFlag-EWSR1 발현 벡터를 세포 내 주입 시킨 후, PA 처리에 따른 지방축적 정도와 신호전달 기전 확인
비알콜성 지방 간질환이 진행될 때 감소했던 EWSR1의 발현을 다시 과발현시켰을 때 세포 내 지방축적 정도와 관련 신호전달 기전을 확인하였다. 간세포에 pFlag-EWSR1 발현 벡터를 세포 내 transfection 시켜 과발현시킨 후, PA를 처리하여 지방이 축적되는 정도를 Nile-Red staining과 Fluorescence-activated cell sorting (FACS) 분석을 통해 비교 분석하였다. 그리고 이와 연관이 있을 것으로 보이는 신호전달기전을 WB을 통해 확인하였다. 그 결과, PA 처리에 따라 유도되는 세포 내 지방축적은 EWSR1의 과발현에 따라 억제되어 짐을 확인하였다 (P = 0.0444). 또한, 이때 세포 내 변화가 있는 신호전달 기전을 확인한 결과, EWSR1 발현은 세포 내의 에너지 항상성 유지에 센서 역할을 하는 효소인 AMPK의 활성을 조절함을 확인하였다. 이에 따라 EWSR1이 AMPK의 활성화를 촉진하고 그로 인해 지방산의 합성을 억제하고 지방산의 산화를 촉진하는 ACC(acetyl CoA carboxylase)와 CPT1a의 발현을 증가시킴으로써 세포 내 지방축적을 감소시킨다는 사실을 확인하였다 (도 4).
[실시예 6] 고지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1 유전자를 처리한 뒤 마우스의 몸무게 및 간 조직 내 지방의 축적 확인
in vivo 실험을 통해 고지방 식이로 유도된 비알콜성 지방간 마우스 모델에 EWSR1 유전자를 쥐에 주입(Hydrodynamic gene delivery)하여 EWSR1을 과발현시킨 후 마우스의 지방간질환의 변화를 관찰하였다. 그 결과, EWSR1을 과발현시킨 그룹에서 몸무게와 간의 무게가 감소한 것을 확인하였다. 또한, TG가 EWSR1을 과발현시킨 그룹에서 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 EWSR1 단백이 비알콜성 지방 간질환의 치료와 예방에 대한 가능성을 가지고 있음을 확인하였다 (도 5).
Claims (10)
- EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1)을 과발현하는 벡터(pFlag-EWSR1)를 포함하는, 체중 및 간의 지방 축적 저해용 조성물.
- EWSR1(Ewing sarcoma breakpoint region 1) 유전자의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 비알콜성 지방간염 진단용 조성물에서,
상기 측정은 환자의 시료에서 측정되는 것이고,
상기 시료는 환자의 간 조직 또는 혈청인, 비알콜성 지방간염 진단용 조성물. - 제 2항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 EWSR1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오타이드인, 비알콜성 지방간염 진단용 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 EWSR1 단백질 또는 펩타이드 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 상호작용 단백질, 리간드, 나노입자(nanoparticles) 또는 압타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 비알콜성 지방간염 진단용 조성물.
- 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 비알콜성 지방간염 진단용 조성물을 포함하는, 비알콜성 지방간염 진단용 키트.
- 제 5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR(Reverse transcription polymerase chain reaction) 키트, DNA 칩 키트, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인 것을 특징으로 하는, 비알콜성 지방간염 진단용 키트.
- (a) 환자의 생물학적 시료로부터 EWSR1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 수준을 측정하는 단계;
(b) 상기 mRNA 또는 단백질 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) EWSR1 유전자의 mRNA의 발현 정도가 대조군에 비해 증가하는 경우, EWSR1 단백질의 발현 정도가 간 조직 내에서 대조군에 비해 감소하는 경우 또는 혈청 내에서 대조군에 비해 증가하는 경우 비알콜성 지방간염인 것으로 판단하는 단계를 포함하며,
상기 시료는 환자의 간 조직 또는 혈청인,
비알콜성 지방간염 진단을 위한 정보를 제공하는 방법. - 삭제
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210022657A KR102629955B1 (ko) | 2021-02-19 | 2021-02-19 | Ewsr1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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| KR1020210022657A KR102629955B1 (ko) | 2021-02-19 | 2021-02-19 | Ewsr1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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| KR1020210022657A KR102629955B1 (ko) | 2021-02-19 | 2021-02-19 | Ewsr1의 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 비알콜성 지방간염 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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| WO2020109316A1 (en) | 2018-11-26 | 2020-06-04 | Asociación Centro De Investigación Cooperativa En Biociencias-Cic Biogune | Methods for diagnosing and/or treating acute or chronic liver, kidney or lung disease |
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| Title |
|---|
| 허원희, 과학기술정보통신부 개인기초연구 최종보고서. 2019.11.* |
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