KR20130124106A - Ｓｃｆ 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Ｓｃｆ 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물 Download PDF

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KR20130124106A
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Abstract

본 발명은 SCF(stem cell factor) 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 혈관 투과성 관련 질환 의심환자의 시료에 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) SCF 또는 이의 수용체의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명은 혈관 투과성의 조절에 대한 새로운 표적으로서의 SCF를 규명하였으며, 본 발명의 SCF 또는 이의 수용체를 억제하는 조성물을 이용하는 경우, 혈관 투과성이 증가된 안구질환에 있어서 혈관 투과성을 감소시켜 혈관 투과성 관련 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있으며, 또한 상기 조성물을 이용하여 혈관 투과성을 효과적으로 조절할 수 있다. 또한 SCF 및 C-Kit의 발현 조절을 측정하여 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝을 위한 효과적인 수단으로 제공될 수 있다.

Description

ＳＣＦ 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물{Composition for preventing or treating vascular permeability disease comprising inhibitors of stem cell factor or a receptor thereof}
본 발명은 SCF(stem cell factor) 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 (a) 혈관 투과성 관련 질환 의심환자의 분리된 시료에 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) SCF 또는 이의 수용체의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
혈관계는 정상적인 생리적 기능을 유지하는데 있어 중요한 역할을 한다. 예를 들어, 혈관계의 내피 세포는 정상적으로는 유체, 전해질 및 단백질이 조직과 기관 내로 이동하는 것을 조절하는 작용을 하는 세포성 장벽을 형성한다. 이와 같은 혈관계를 구성하는 혈관은 인체를 구성하는 모든 세포의 생존 및 정상적 기능 유지에 필수적인 기관으로, 특히 혈관의 부족으로 인한 다양한 허혈성 질환 및 혈관의 항상성 상실에 의한 질환은 그 발생 빈도가 높아 중요한 치료 타겟 질환으로 인식되고 있는 실정이다.
혈관 투과성과 관련되어, 내피 장벽의 기능 상실을 초래하는 사건들은 다소 복잡하고 완전히 이해되고 있지는 않지만, 혈관계의 투과성을 발달시키고 유지시키는 것에 관한 연구가 광범위하게 이루어져 왔다 (Kagsbrun & Moses, Chemistry & Biology (1999), 6:R217-R224; Ferrara, Endocrine Reviews (2004), 25(4):581-611). 그러나, 혈관 투과성을 교란시키는 정확한 기전에 관해서는 명확하게 알려져 있지 않으며, 암에서부터 자가면역 질환과 같은 염증 질환에 이르기까지 다양한 질병과 병리학적 질환의 병인과 매우 밀접하게 관련되어 있는 것으로 추정되고 있다. 또한, 혈관계와 연관된 염증은 혈관 투과성의 교란과 관련이 있는 세포외 혈관 형성을 자극하는 것으로 보고되었다 (Kirkpatrick et al., Int. J. Microcirc. (1997), 17:231-240). 예를 들면, 표면 부착 분자 및 그의 리간드의 발현 증가, 염증성 세포 침윤, 사이토카인 생성, 케모카인 방출, 산화적 스트레스 및 선천 면역의 활성화 등을 들 수 있다. 이러한 염증 반응은 전형적으로 혈관 투과성 상의 변경, 백혈구 혈관 외 유출(부착, 이주 및 화학주성) 및 조직의 재생능과 관련되어 있다.
혈관의 생성 및 혈관 투과성의 조절은 저산소증(hypoxia)과 밀접한 연관성이 있는 것으로 보고되어 있다. 특히, 배아 발생 단계나 세포 증식이 활발한 암 조직, 혹은 혈관이 손상된 조직에서 나타나는 저산소증 상태는 기존 혈관과 내피 세포 간의 결합이 끊어지고 투과성이 증가하는 불안정한 상태가 되며, 이러한 상황에서 혈관 내피세포의 증식 및 이동이 촉진되어 새로운 혈관이 형성된다. 이러한 혈관 불안정화 및 혈관 신생과정을 조절하는 기전에는 저산소 상태에서 HIF-1(hypoxia inducible factor-1) 등의 전사인자를 통해 차등발현되는 다양한 유전자가 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 유전자들의 상당수는 성장인자/사이토카인으로 혈관 내피세포의 세포간 결합을 감소시켜 혈관의 투과성을 높이거나 혈관 내피세포의 성장/이동능을 촉진하여 신생 혈관을 형성한다.
한편, 비정상적인 혈관신생 및 혈관 투과성 조절 과정은 배아 발생 과정에서의 기관 형성뿐 아니라, 출생 후 성인에서의 수많은 질병의 발생과 직결되어 있다. 과다한 혈관 신생은 암의 증식 및 당뇨성 망막증, 류마티스성 관절염 등의 질환과 관련되어 있으며, 반대로 혈관 신생이 부족한 경우 만성상처, 허혈성 심혈관 질환 등이 발생하는 것으로 알려져 있다. 또한, 혈관의 투과성 조절도 다양한 질환과 밀접히 연관되어 있으며, 특히 허혈성 뇌질환 혹은 심근경색의 경우 혈관의 투과성이 높으면 부종을 유발하여 신경세포 혹은 심근세포의 사멸을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 질환의 근원적인 치료방법을 개발하기 위해서는 혈관 신생 및 혈관 투과성 조절의 분자적 기전을 규명하는 것이 시급한 실정이다. 이러한 혈관 신생 및 혈관 투과성 조절의 분자적 기전을 규명하기 위한 다양한 연구가 시도되고 있다. 그 예로, 혈관 내피세포 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)는 혈관의 투과성을 조절하는 대표적인 유전자로서 저산소(Hypoxia) 상태에서 과발현되어 혈관 내피세포의 VEGF 수용체와 결합하여 혈관 투과성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. VEGF 수용체는 혈관 내피세포 간의 결합을 조절하는 VE-cadherin과 복합체를 이루고 있어, VEGF에 의해 VE-cadherin의 엔도사이토시스를 유도하여 혈관 투과성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 VEGF/eNOS에 의해 생성된 NO가 β-카테닌의 S-nitrosylation을 유도하여 VE-cadherin과의 분리를 촉진하여 혈관내피세포의 투과성을 증가시킴이 알려져 있다(M. Rizwan et al., J. Cell Bol.(2011)193;841-850). 혈관내피세포의 투과성을 증가시키는 트롬빈(thrombin)은 eNOS의 NO 생성 및 RhoA의 활성화를 유도하고 이로서 세포의 액틴 세포골격(actin cytoskeleton)과 부착연접분자(adherent junction molecule)의 불안정화를 촉진함으로서 혈관 투과성을 촉진한다는 보고가 있었다(Thibeault et al., Molecular cell(2010) 39;468-476). 이에, VEGF 혹은 VEGF 수용체를 억제하여 혈관 투과성이 증가되어 발생하는 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy)을 치료하려는 시도가 이루어지고 있으며, 투과성 높은 미성숙 혈관 생성에 의해 발생하는 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration) 질환에도 적용되고 있다 (Aiello, New England Journal of Medicine (1994) 331(22):1480-1487; Adamis, American journal of Ophthalmology (1994) 118:445-450; Steinbrook, New England Journal of Medicine (2006) 355(14):1409-1412;Ferrara, American Journal of Physiol Cell Physiol (2001) 280(6):C1358-C1366). 또한, VEGF 혹은 VEGF 수용체를 억제하는 치료법은 종양 내 혹은 주위에 생성되는 투과성 높은 혈관을 정상화하여 항암 약물이 종양의 중심 부위까지 잘 전달될 수 있도록 하여 항암 치료효능을 증대시키는 것으로 보고된바 있다 (Jain, Science (2005)307 (5706):58-62).
그러나, 현재까지 대부분의 혈관 신생 및 혈관 투과성 조절에 관한 연구가 VEGF 또는 VEGF 수용체에 한정되어 있으며, 대부분이 상기 유전자에 대한 저해제 개발에 집중되어 있어, 혈관 신생 및 혈관 투과성 조절에 관한 연구가 미흡한 상황이다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 안구질환에서 혈관 투과성 관련 질환의 치료 물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, SCF(stem cell factor)가 혈관 투과성을 증가시키는 반면, SCF 또는 SCF 수용체인 C-Kit의 발현 또는 인산화를 억제할 경우, 혈관 투과성의 증가를 감소시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 SCF(stem cell factor) 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 이용하여 생체 외에서(in vitro) SCF 또는 이의 수용체의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성의 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 혈관 투과성 관련 질환 의심환자의 분리된 시료에 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) SCF 또는 이의 수용체의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 SCF(stem cell factor) 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "SCF(stem cell factor)"는 kit-리간드(kit-ligand) 또는 steel factor라고도 불리며, C-Kit 수용체(CD117)에 결합하는 사이토카인으로, 막관통 단백질 및 수용성 형태로 존재한다. SCF는 혈액 세포를 형성하는 조혈작용, 정자 형성 작용, 멜라닌 형성 작용 등을 촉진하는 것으로 알려져 있으나, SCF가 혈관 투과성을 증가시키는지 여부에 대해 보고된 바는 없다. 본 발명자들은 SCF가 혈관 투과성을 증가시키는 것을 최초로 규명하였으며, SCF 또는 이의 수용체를 억제하면 혈관 투과성 관련 질환을 치료하는 데 효과가 있음을 확인하였다.
구체적으로, SCF 또는 이의 수용체를 표적으로 하여, 이를 억제하면 혈관 투과성 관련 질환 치료 효과가 있음을 규명하였다. SCF 또는 이의 수용체의 억제는 SCF 또는 이의 수용체의 발현 억제뿐 아니라 인산화의 억제를 통하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 SCF의 서열 정보는 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나 그 예로 NCBI GenBank Accession No. NG_012098일 수 있으며, SCF로서 혈관 투과성을 증가시키는 활성을 나타내는 한 80%, 90%, 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 97% 이상의 서열의 상동성을 갖는 것일 수 있다. 상기 SCF의 수용체는 혈관 투과성을 증진시킬 수 있는 역할을 하는한 제한없이 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 C-Kit일 수 있다.
본 발명에서 용어, "C-Kit(CD117)"은 원발암유전자 C-Kit(proto oncogene C-Kit) 또는 티로신-단백질 키나아제 Kit(tyrosine-protein kinase Kit)라고도 불리며, 인간에서 KIT 유전자를 코딩하는 단백질이다. 상기 C-Kit은 조혈 줄기세포 표면에 발현되는 사이토카인의 수용체로서, SCF에 결합하는 수용체 단백질이며, 상기 수용체의 변형체는 몇몇 암과 관련되어 있다고 알려져 있다. 본 발명의 C-Kit의 서열정보는 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 그 예로 NCBI GenBank Accession No. BC071593.1일 수 있으며, C-Kit으로서 혈관 투과성을 증가시키는 활성을 나타내는 한 80%, 90% 바람직하게는 95% 가장 바람직하게는 97% 이상의 서열의 상동성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 혈관 내피세포를 배양하는 배지에 SCF를 처리하여 배양하는 경우 내피세포의 혈관 투과성이 증가하는 것을 확인하였으며(도 1A), SCF의 수용체를 억제할 경우 혈관 투과성이 감소하는 것을 확인하였다(도 3 및 4). 또한, SCF의 수용체인 C-Kit을 억제하는 siRNA를 사용하여 C-Kit의 발현을 억제하는 경우, 혈관 투과성이 감소하는 것을 확인하였으며(도 1의 B), 혈관 투과성 관련 질환의 하나인 당뇨 망막병증 동물모델에서 SCF의 발현이 증가함을 확인하였다(도 5).
본 발명에서 용어, "SCF 또는 이의 수용체를 억제하는 물질"은 혈관 투과성을 증가시키는 SCF 또는 이의 수용체, 예컨대 C-Kit을 억제하는 물질로, 혈관 투과성을 조절하여 세포외기질로 혈액이 유출되는 것을 억제하는 기능을 하는 물질을 의미하며, 혈관 투과성의 증가로 인해 유발되는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방의 목적으로 사용될 수 있다. 이와 같은 억제는 SCF 또는 이의 수용체의 발현 수준뿐 아니라 SCF에 의한 C-Kit의 인산화를 억제하여 이루어질 수 있다.
상기 SCF 또는 이의 수용체를 억제하는 물질은 SCF 또는 이의 수용체를 표적으로 하여 SCF 또는 이의 수용체의 발현 또는 C-Kit의 인산화를 억제할 수 있는 화합물, 핵산, 펩타이드, 바이러스 또는 상기 핵산을 포함하는 벡터 등을 제한 없이 사용 가능하다. 바람직하게 본 발명에서는 SCF 또는 이의 수용체에 특이적인 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체일 수 있다. 또한, 상기 SCF 또는 이의 수용체 발현의 억제는 SCF 또는 이의 수용체 자체의 발현을 억제시킬 수 있는 물질뿐 아니라, SCF 또는 이의 수용체에 의해 일어나는 신호 전달을 억제하는 물질일 수 있다.
구체적으로 본 발명의 일 실시예에서는 SCF를 처리하는 경우, 혈관 투과성과 관련된 SCF 수용체인 C-Kit의 인산화가 증가되며, Akt 단백질의 인산화가 증가하는 것을 확인하였고, 또한 혈관 투과성과 관련된 eNOS 단백질의 인산화가 증가하여 혈관 투과성을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다(도 1의 C). 이와 같은 결과는 SCF를 억제하여 C-Kit의 인산화 또는 SCF 및 C-Kit에 의해 일어나는 신호전달과 관련된 단백질의 인산화를 억제하면 혈관 투과성을 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
본 발명에서 용어, "siRNA"는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱(silencing)을 매개할 수 있는 핵산 분자로서, 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 녹다운(knockdown) 방법 또는 유전자치료 방법으로 사용된다. 상기 siRNA는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 단백질 발현을 억제할 수 있다. siRNA에 의해 상보적인 염기서열을 갖는 mRNA 분해가 유발되는지 혹은 번역 억제가 유도되는지 여부는, 해당하는 21-25개의 뉴클레오티드 RNA와 mRNA 간의 상보성 정도에 따라 결정된다. 본 발명에서 사용한 SCF의 전사를 억제하는 물질은 siRNA로, 상기 단편의 상보성 부분을 이용하여 혈관 투과성에 관여하는 SCF의 효과를 억제하는 방법으로 혈관 투과성 증가를 억제하는 기작을 한다. 또한, SCF의 수용체인 C-Kit의 발현을 억제하는 방법에 의해서도 혈관 투과성 증가를 억제하는 기작을 한다. 본 발명의 일 실시예에서는 SCF의 수용체를 억제하는데 C-Kit siRNA를 사용하였으며, 상기 C-Kit을 억제하는 siRNA를 사용하여 C-Kit의 발현을 억제하는 경우 혈관 투과성이 감소하는 것을 확인하였다(도 1의 B). 이와 같은 SCF 또는 C-Kit에 대한 siRNA는 공지의 데이터베이스의 상기 유전자 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있으며, 상기 C-Kit siRNA는 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 서열번호 2, 3, 4 또는 5의 염기서열을 갖는 siRNA일 수 있다.
본 발명에서 용어, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체로서, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 상기 SCF 또는 이의 수용체 mRNA에 상보적이고 상기 mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 상기 SCF 또는 이의 수용체 mRNA의 번역, 세포질 내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이는 6 내지 100 염기, 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는 통상의 방법으로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한가지 예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 디자인은 SCF 또는 C-Kit 유전자의 염기서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할 수 있다.
본 발명에서 용어, "압타머(aptamer)"는 단일가닥 올리고 뉴클레오티드로서, 20~60 뉴클레오티드 정도의 크기이며, 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 말한다. 서열에 따라 다양한 3차원 구조를 가지며, 항원-항체 반응처럼 특정 물질과 높은 친화력을 가질 수 있다. 압타머는 소정의 표적 분자에 대하여 결합함으로써, 소정의 표적 분자의 활성을 저해할 수 있다. 본 발명의 압타머는 RNA, DNA, 변형된(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 또한 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있다. 바람직하게 상기 압타머는 SCF에 결합하여 SCF의 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 또는 SCF 수용체인 C-Kit에 결합하고, SCF 수용체의 활성을 저해하여, SCF와 SCF 수용체가 결합하지 못하도록 하는 역할을 통해서, 간접적으로 SCF 활성을 저해하는 역할을 할 수 있다. 이와 같은 SCF 또는 C-Kit에 의한 siRNA는 공지의 데이터베이스의 상기 유전자 서열로부터 당업자가 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다.
본 발명에서 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B세포가 생산해서 체액으로 흘려보내는 단백질로 항원과 특이적으로 결합하며, 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬(heavy chain)과 두 개의 경사슬(light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 그의 N-터미널 말단에 가변영역을 갖고 있다. 각각의 가변영역은 3개의 상보성 결정부위(Complementarity determining region: CDR)와 4개의 구조형성부위(framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다. 바람직하게 상기 항체는 SCF와 결합하여 SCF의 활성을 억제할 수 있는 항체 또는 SCF 수용체(C-Kit) 억제 항체일 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 SCF 수용체 억제 항체를 사용하는 경우 혈관 투과성이 감소됨을 확인하였다(도 3 및 4).
본 발명에서 용어, "L-NAME(L-N-nitro arginine methyl ester)"은 산화질소 합성 효소(nitric oxide synthase, NOS)의 억제자로, 혈관 내피세포에서 산화질소의 합성을 억제하여, 혈관 투과성을 조절하는 역할을 한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 SCF에 의해 생성된 NO를 억제하여 혈관 내피세포의 투과성을 억제하는 용도로 L-NAME을 사용하였다.
본 발명에서 용어, "혈관(또는 혈관계)"은 포유류 체내 전반에 걸쳐 혈액 및 림프액을 운반하는 혈관계를 지칭하며, 동맥, 세동맥, 모세혈관, 세정맥, 정맥, 및 맥관벽혈관을 포함한, 포유류 혈관계의 모든 관을 지칭한다. 또한, 본 발명에서 용어, "혈관 투과성(vascular permeability)"은 일반적으로 상기 혈관을 통과하는 성질을 의미하며, 혈관 내피세포의 세포외기질로 혈액이 유출되는 것을 조절하는 기능을 포함한다. 상기 혈관 투과성은 개체 내에 있는 혈관이면 모든 혈관을 통과하는 성질을 제한없이 포함하며, 예컨대 혈관 내피세포의 투과성을 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 혈관 내피세포를 배양하는 배지에 SCF를 처리하여 배양하는 경우 혈관 내피세포의 혈관 투과성이 증가하는 것을 확인하였으며(도 1의 A), 마우스 피하조직(도 3의 A 및 B) 및 마우스 망막혈관(도 4의 A 및 B)에서도 혈관 투과성의 증가를 확인할 수 있었다.
본 발명에서 용어, "혈관 투과성 관련 질환"이란 혈관 투과성의 정상적인 조절이 붕괴되어 일어나는 질환으로, 일반적으로 혈관이 변화되어 투과성이 증가됨으로써 출혈을 일으키는 질병을 의미한다. 상기 혈관 투과성 관련 질환은 이에 제한되지는 않으나, 그 예로 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis pigmentosa), 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration), 녹내장, 각막 이영양증(corneal dystrophy), 망막층간분리(retinoschises), 스타가르트병(Stargardt's disease), 상염색체 우성 드루젠(autosomal dominant druzen), 베스트의 황반 이영양증(Best's macular dystrophy), 낭포황반부종(cystoid macular edema), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 염증-유도 망막 퇴행성 질환(inflammation-induced retinal degenerative disease), X염색체-관련 연소기 망막층간분리(X-linked juvenile retinoschisis), 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese; ML), 도인 벌집 모양 망막 이영양증(Doyne honeycomb retinal dystrophy) 및 혈관 내피 세포 관련 염증 질환일 수 있으며, 바람직하게는 안과질환인 당뇨 망막병증 또는 노인성 황반 변성일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 대표적인 혈관 투과성 관련 질환인 당뇨 망막병증 동물모델에서 기간이 경과함에 따라 SCF의 발현 수준이 증가함을 확인함으로써(도 5의 A), SCF가 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방의 타겟이 될 수 있음을 확인하였으며, SCF 억제 항체를 처리하는 경우 혈관 투과성을 감소시키는 것을 확인함으로써(도 6), SCF를 억제하는 물질이 혈관 투과성 관련 질환의 치료 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명에서 용어, "치료"는 치료하고자 하는 개개인 또는 세포의 천연 과정을 변경시키기 위해 임상적으로 개입하는 것을 지칭하고, 이는 임상 병리 상태가 진행되는 동안 또는 이를 예방하기 위해 수행할 수 있다. 목적하는 치료 효과에는 질병의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질병에 따른 모든 직접 또는 간접적인 병리학적 결과를 저하시키며, 전이를 예방하고, 질병 진행 속도를 감소시키며, 질병 상태를 경감 또는 일시적 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 바람직하게 본 발명에서는 SCF 또는 이의 수용체인 C-Kit을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 혈관 투과성 관련 질환의 경과를 호전시키는 모든 행위를 포함한다.
본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명에 따른 SCF 또는 이의 수용체인 C-Kit을 억제하는 물질을 포함하는 조성물의 투여로 상기 혈관 투과성 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명의 조성물은 혈관 내피세포의 투과성을 억제하여 혈관 투과성 관련 질환을 치료할 수 있는 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어, "혈관 내피세포"는 혈관 안쪽 부분인 내막을 둘러싸고 있는 세포로 새로운 혈관 형성에 핵심적인 역할을 수행한다. 혈관내피세포는 특히 우리 몸에서 가장 작으면서 가장 많은 모세혈관의 형성을 조절한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 혈관 내피 세포에 SCF를 농도별로 첨가하여 배양할 경우 혈관 내피세포의 투과성이 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 혈관 내피 세포에 10, 20 및 50 ng/㎖의 농도로 SCF를 첨가하여 배양한 결과, 농도 의존적으로 내피 세포의 혈관 투과성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 1A). 즉, 이는 SCF가 혈관 내피세포의 투과성을 증가시키며, SCF를 억제할 경우 혈관 투과성을 감소시킬 수 있다는 것을 시사하는 것이다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 SCF 또는 이의 수용체인 C-Kit을 억제하는 물질을 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "개체"는 본 발명의 혈관 투과성 관련 질환을 보유하거나 또는 발병한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 조성물을 개체에 투여함으로써, 혈관 투과성 관련 질환을 완화 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 용어, "완화"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 혈관 투과성 관련 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위를 말한다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 말하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있으며, 비경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 약학적 조성물의 양 및 투여 횟수는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 용도에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 혈관 투과성 증가를 억제 또는 완화하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 SCF 또는 이의 수용체의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성의 조절 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 방법은 SCF 또는 이의 수용체를 억제함으로써, 혈관 투과성을 억제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 SCF의 발현 또는 SCF의 수용체인 C-Kit(CD117)의 발현 또는 인산화를 감소시키고, 혈관 내피형 NO합성 효소인 eNOS(endothelial nitric oxide synthase)의 인산화를 억제하는 방법일 수 있다.
본 발명에서 용어, "eNOS(endothelial nitric oxide synthase)"는 혈관 내피형 NO(nitric oxide)의 생성을 자극하는 효소로, 본 발명에서 개시한 SCF를 처리하는 경우 혈관 내피세포에서 세포내 전달물질인 Akt가 인산화 되고 eNOS가 인산화 되어, 활성화된 Akt-eNOS는 혈관 내피 세포에서 NO의 생성을 촉진하며 결과적으로 혈관 투과성을 증가시킨다.
이에 본 발명의 조성물을 처리하면 eNOS의 인산화를 억제하여 NO 합성을 억제시켜 혈관 투과성을 감소시켜 혈관 투과성 관련 질환의 치료를 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 대조군 siRNA와 C-Kit siRNA을 세포내로 도입시킨 혈관 내피 세포에 SCF를 20 ng/의 농도로 각각 처리한 후, SCF에 의한 혈관 내피 세포 투과성 증가의 C-Kit 의존도를 확인한 결과, SCF는 혈관 내피 세포의 투과성을 증가시키고, C-Kit의 발현양을 감소시켰을때 현저히 감소하는 것을 확인하였으며(도 1B), SCF를 혈관 내피 세포에 처리 후, 내피 세포 신호 전달 물질인 Akt-eNOS의 인산화 정도를 확인한 결과, SCF를 처리하는 경우 Akt-eNOS가 인산화되어 활성화되고(도 1C), 활성화된 효소에 의해 혈관 내피 세포에서 NO의 합성량이 증가하는 것을 확인하였다(도 2A). 또한, 혈관 내피세포의 NO의 합성량이 증가하는 경우, 혈관 투과성이 증가하며, 이러한 투과성의 증가는 내피세포에서 NO의 합성을 억제하는 억제제인 L-NAME을 처리하는 경우 감소하는 것을 확인할 수 있었다(도 2B).
상기 조성물은 SCF 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 조성물로서, 상기에서 설명한 바와 같으며, 혈관 투과성을 감소하는 효과를 가지는 물질로 SCF 및 그 수용체를 표적으로 SCF 또는 그 수용체, 예컨대 C-Kit의 발현 또는 인산화를 억제하는 물질은 제한 없이 사용가능하다.
또 다른 하나의 양태로서 본 발명은 (a) 혈관 투과성 관련 질환 의심환자의 분리된 시료에 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) SCF 또는 SCF 수용체인 C-Kit의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 (b) 단계는 SCF 수용체인 C-Kit의 인산화 수준을 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "시료"는 혈관 투과성 관련 질환 의심환자에서 유래한 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하며, 혈관 투과성의 증가 여부를 검출할 수 있는 세포를 포함하는 시료이면 제한 없이 포함된다.
본 발명에서 용어, "대조군"은 혈관의 투과성이 정상으로 기능하는 개체에서 유래한 전혈, 혈청, 혈액, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 뇌척수액 및 세포간액과 같은 시료 등을 포함하며, SCF 또는 SCF 수용체인 C-Kit의 발현 수준 또는 인산화 수준이 실험군으로 사용되는 혈관 투과성 관련 질환 의심환자에 비해 낮은 것이 특징이다.
또한 본 발명에서 용어, "후보물질"이란 SCF, C-Kit 발현 또는 인산화 변화 활성을 테스트 할 약제를 의미하며, SCF 또는 C-Kit의 발현 수준을 직접 또는 간접적으로 변화시킴으로써 혈관 투과성 관련 질환을 치료할 수 있는 능력을 측정하는 대상으로서, 예컨대 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오타이드 및 광범위한 화합물 등 임의 분자를 포함한다. 이런 후보 물질은 또한 천연 물질 뿐 아니라 합성 물질을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어, "혈관 투과성 관련 질환 치료제"란 혈관 투과성을 조절하는 기작으로 혈관 투과성을 감소시키는 기능을 갖는 물질을 의미한다.
본 발명에서 혈관 투과성의 증가 여부의 확인 및 혈관 투과성 관련 질환 치료제를 스크리닝하는 방법은 상기와 같은 대조군 및 실험군에 혈관 투과성을 억제하는 물질을 처리한 후, 혈관 투과성을 증가시키는 SCF 또는 SCF 수용체인 C-Kit의 발현 수준을 비교하여 SCF 또는 SCF 수용체인 C-Kit의 발현 수준을 정상 개체인 대조군의 수준으로 감소시키는 물질을 혈관 투과성 관련 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는 방법으로 혈관 투과성 관련 질환의 치료제를 스크리닝 할 수 있다. 또한, SCF 수용체인 C-Kit 인산화가 정상 개체인 대조군의 수준으로 감소시키는 물질을 혈관 투과성 관련 치료제라고 판단하는 단계를 포함하는 방법으로 혈관 투과성 관련 질환의 치료제를 스크리닝할 수 있다. 이와 같은 발현 및 인산화의 변화 수준을 C-Kit 및 Akt-eNOS로 연결되는 신호전달계의 인산화 또는 발현을 변화시키는지 여부에 의해 판단할 수 있다.
본 발명은 혈관 투과성의 조절에 대한 새로운 표적으로서의 SCF를 규명하였으며, 본 발명의 SCF 또는 이의 수용체를 억제하는 조성물을 이용하는 경우, 혈관 투과성이 증가된 안구질환에 있어서 혈관 투과성을 감소시켜 혈관 투과성 관련 질환을 효과적으로 치료 또는 예방할 수 있으며, 또한 상기 조성물을 이용하여 혈관 투과성을 효과적으로 조절할 수 있다. 또한 SCF 및 C-Kit의 발현 조절을 측정하여 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝을 위한 효과적인 수단으로 제공될 수 있다.
도 1은 SCF에 의한 혈관 투과성의 증가(A), C-Kit 의존도(B) 및 신호전달경로(C)를 분석한 결과를 나타낸다.
도 2는 SCF에 의해 세포내 신호전달 물질인 AKT-eNOS를 통해서 이루어지는 NO의 생성과 혈관내피세포 표면에 위치하는 세포간 부착 단백질인 VE-cadherin의 내포작용 유도를 확인한 결과를 나타낸다. 도 2의 A는 SCF에 의한 NO의 생성증가를 나타내며, B는 SCF에 의한 내피세포의 투과성 증가가 L-NAME에 의해 억제됨을 확인한 결과를 나타낸다. 도 2의 C는 SCF 및 VEGF에 의하여 감소된 VE-cadherin의 혈관내피세포 표면 발현이 L-NAME 처리 및 eNOS 발현 억제에 의해 회복된 결과를 나타내며, D는 SCF 및 VEGF에 의하여 증가된 VE-cadherin의 내포작용이 L-NAME 처리 및 eNOS 발현 억제에 의해 감소되는 결과를 나타낸다.
도 3은 SCF에 의한 혈관 투과성 증가를 마우스 피하조직 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 도 3의 A 및 B는 SCF에 의한 혈관 투과성 증가를 나타내며, C 및 D는 SCF 수용체 억제 항체에 의하여 혈관 투과성이 감소하는 결과를 나타낸다.
도 4는 SCF에 의한 혈관 투과성 증가를 마우스의 눈 망막혈관 실험을 통해 확인한 결과를 나타낸다. 도 4의 A 및 B는 SCF에 의한 혈관 투과성 증가를 나타내며, C 및 D는 SCF 수용체 억제 항체에 의하여 혈관 투과성이 감소하는 결과를 나타낸다.
도 5는 당뇨 망막병증 동물의 망막에서의 SCF(A) 및 VEGF(B)의 발현 증가를 나타낸다.
도 6은 당뇨 망막병증 동물의 망막에서 SCF 억제 항체에 의하여 혈관 투과성의 증가가 억제되는 결과를 나타낸다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 제시한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시되는 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: Stem cell factor ( SCF )에 의한 혈관내피세포 투과성 분석
혈관내피세포 (Endothelial cell)를 12 well Transwell filter (Corning Costar)의 upper chamber 에 넣고 48시간 배양하였다. 이후 1% FBS 가 함유된 내피세포 기본 배양액 (Endothelial basal medium)으로 교체하여 3시간 배양하였다. SCF (10, 20, 50 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 농도별로 1시간 처리한 후 FITC-conjugated dextran (Fluorescein isothiocyanate-dextran) (1mg/ml)을 처리하였다. 30분 후 lower chamber의 배양액을 채취하여 형광광도계로 측정하였다.
그 결과, SCF 에 의해 혈관내피세포의 투과성이 농도 의존적으로 증가함을 확인하였다(도 1A).
실시예 2: SCF 에 의한 혈관내피세포 투과성 증가의 C- Kit 의존도 분석
혈관내피세포를 60mm 플레이트에 넣고 control siRNA인 5'-AAUGGAAGACCACUCCCACUC-3'(서열번호 1) 과 C-Kit siRNA인 5'-UCAUUCUUGAUGUCUCUGG-3'(서열번호 2); 5'-UUUGAGUUCAGACAUGAGG-3'(서열번호 3); 5'-UCUUAUAAAGUGCAGCUUC-3'(서열번호 4); 5'-UACAAUGCCAUUCUGAAGC-3'(서열번호 5)를 리포펙타민(lipofectamin)을 이용하여 세포 내로 도입시켰다. 24시간 후 내피세포를 12 well Transwell filter (Corning Costar)의 upper chamber 에 넣고 24시간 배양하였다. 이후 1% FBS 가 함유된 내피세포 기본 배양액(Endothelial basal medium)으로 교체하여 3시간 배양하였다. SCF (20ng/ml)를 1시간 처리한 후 FITC-conjugated dextran (1mg/ml) 을 처리하였다. 30분 후 lower chamber 의 배양액을 체취하여 형광광도계로 측정하였다.
그 결과 SCF에 의해 내피세포의 투과성이 증가하고 이러한 효과는 SCF의 수용체인 C-Kit의 발현을 감소시켰을 때 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 1B).
실시예 3: SCF 에 의한 혈관내피세포의 세포 내 신호전달경로 분석
혈관내피세포를 60mm 플레이트에 넣고 24시간 배양하였다. 이후 1% FBS 가 함유된 내피세포 기본 배양액 (Endothelial basal medium) 으로 교체하여 6시간 배양하였다. SCF (20ng/ml)를 처리한 후 시간에 따라 세포를 수합(harvest) 하여 웨스턴 블롯팅을 수행하였다.
그 결과, SCF는 내피세포의 신호전달물질인 C-Kit, Akt-eNOS를 인산화시키는 것을 확인하였다(도 1C).
실시예 4: SCF 에 의한 혈관내피세포의 NO ( Nitric oxide ) 생성 측정
혈관내피세포를 12웰-플레이트에 넣고 24시간 배양하였다. 이후 1% FBS 가 함유된 내피세포 기본 배양액 (Endothelial basal medium)으로 교체한 후 SCF (20ng/ml)를 처리하였다. 시간에 따라 배양액을 수집하여 원심분리 후 상층액을 이용하여 전체 NO (Nitric oxide)의 양을 측정하였다(Total NO/Nitrite/Nitrate Assay Kit).
그 결과 SCF에 의해 내피세포의 NO(Nitric oxide)의 양이 증가함을 확인하였다(도 2A).
실시예 5: SCF에 의한 혈관 내피세포의 투과성 증가의 eNOS 의존도 분석
혈관내피세포 (Endothelial cell)를 12 well Transwell filter (Corning Costar)의 upper chamber 에 넣고 48시간 배양하였다. 이후 1% FBS 가 함유된 내피세포 기본 배양액 (Endothelial basal medium)으로 교체하여 3시간 배양하였다. eNOS 저해제(inhibitor)인 L-NAME (1mM) 을 30분간 전처리 한 후 SCF (20 ng/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 1시간 처리하고 FITC-conjugated dextran (Fluorescein isothiocyanate- dextran) (1mg/ml)을 처리하였다. 30분 후 lower chamber의 배양액을 채취하여 형광광도계로 측정하였다.
그 결과, SCF에 의해 내피세포의 투과성이 증가하고 이러한 효과는 eNOS 저해제(inhibitor)인 L-NAME을 이용한 결과 현저히 억제되는 것을 확인하였다(도 2B).
실시예 6: SCF 에 의한 혈관내피세포의 VE - cadherin 내포작용 분석
혈관내피세포 (Endothelial cell)를 8 well chamber slide (Lab-Tek)에 넣고 48시간 배양하였다. 이후 1% FBS 가 함유된 내피세포 기본 배양액 (Endothelial basal medium)으로 교체하여 16시간 배양하였다. VE-cadherin 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 4℃에서 1시간 처리한 후, SCF (20 ng/ml)와 VEGF (50ng.ml)(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 첨가하여 37℃에서 30분간 VE-cadherin의 세포내 흡수를 유도하였다. 세포 표면의 VE-cadherin를 관찰하기 위하여 4% PFA로 고정 후 면역염색하며, SCF 및 VEGF에 의한 엔도사이토시스로 세포내 위치하는 VE-cadherin을 확인하기 위하여 acid buffer(pH2.7)로 세포표면의 VE-cadherin를 제거한 후 4% PFA로 고정하여 면역염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, SCF에 의하여 혈관내피세포간의 부착에 중요한 VE-cadherin의 세포표면 발현이 감소하고 엔도사이토시스가 유도되었음을 확인하였다(도 2 C,D).
실시예 7: SCF 에 의한 혈관 내피세포의 VE - cadherin 내포작용의 eNOS 의존도 분석
혈관내피세포에 eNOS siRNA인 5'-ACCGGAACAGCACAAGAGUUAU-3'(서열번호 6); 5'-AGCUGCAAGGAUUCAGCAUUAU-3'(서열번호 7); 5'-ACGGAACAGCACAAGAGUUAUA-3'(서열번호 8); 5'-CCAGGAGUAUCUUACCUGUAAA-3'(서열번호 9)를 amaxa 4D nucleofector를 이용하여 세포 내로 도입시켰다. 24시간 후 세포를 8 well chamber slide (Lab-Tek)에 넣고 24시간 배양하였다. 이후 1% FBS가 함유된 내피세포 기본 배양액 (Endothelial basal medium)으로 교체하여 16시간 배양하였다. VE-cadherin 항체를 4℃에서 1시간 반응시킨 후, L-NAME (1mM)을 30분간 전처리 한 후 SCF (20 ng/ml)와 VEGF (50ng/ml)를 첨가하여 37℃에서 30분간 VE-cadherin의 세포내 흡수를 유도하였다. 세포 표면의 VE-cadherin를 관찰하기 위하여 4% PFA로 고정 후 면역염색하며, SCF 및 VEGF에 의한 엔도사이토시스로 세포내 위치하는 VE-cadherin을 확인하기 위하여 acid buffer(pH2.7)로 세포표면의 VE-cadherin를 제거한 후 4% PFA로 고정하여 면역염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
그 결과, SCF에 의한 VE-cadherin의 엔도사이토시스가 eNOS의 발현 억제 및 eNOS 저해제에 의해 억제되며, VE-cadherin의 세포표면의 발현이 유지되고 있음을 확인하였다(도 2의 C 및 D).
실시예 8: 마우스 모델에서 SCF 에 의한 혈관 투과성 증가 분석
C57/BL6 마우스의 꼬리 정맥으로 Evans blue 염색료 100를 주입하였다. 10분후 쥐의 등 피하 (intradermally)에 SCF 및 SCF 수용체 억제항체 (anti-ckit IgG: Monoclonal anti-SCF receptor neutralization antibody : R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 주입하였다. 20분 후 쥐로부터 피부를 수집한 뒤 Evans blue 염색료가 조직으로 투과되어 나온 부위를 사진으로 찍고, 포름아미드 (formamide)에 넣어 상온에서 4일 동안 정치하였다. 이후 분광광도계로 620nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 SCF에 의해 쥐의 피부혈관 투과성이 증가하였으며(도 3의 A 및 B), 이러한 효과는 SCF수용체 억제항체에 의해 현저히 감소함을 확인하였다(도 3의 C 및 D).
실시예 9: 마우스의 망막혈관을 이용하여 SCF 에 의한 혈관 투과성 증가의 혈관조영술 ( Angiography ) 분석
C57/BL6 마우스의 망막에 SCF 및 SCF 수용체 억제항체를 주입하였다. 24시간 후에 마우스를 마취한 후에 심장 내로 FITC-표지된 덱스트란 (Fluorescein isothiocyanate-dextran)을 주사 (intracardiac FITC-Dextran injection)하여 혈액을 따라 형광물질이 흐르도록 하였다. 30분 후 마우스의 망막을 꺼내어 분리한 후 평편 마운팅 (flat mounting)을 하여 형광현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, SCF를 주사한 마우스에서는 망막혈관의 투과성이 증가하여 혈관 주변 조직으로 형광물질이 누출된 것을 확인하였으며(도 4의 A 및 B), 이러한 효과는 SCF 수용체 억제항체를 처리함으로써 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 4의 C 및 D).
실시예 10: 당뇨 망막병증 동물모델을 이용한 SCF 발현 증가 확인
SD 랫드(Sprague Dawley rat)의 복강에 STZ(streptozotocin, Sigma)를 150mg/kg으로 주입하고 삼일 후 혈당을 측정하여 250mg/dL 이상인 동물을 당뇨로 구분하고 당뇨 망막병증을 유도하였다. 당뇨 유도 1주, 4주 후 SD 랫드의 망막을 채취하여 트리졸 시약 (Trizol reagent, Invitrogen)를 이용하여 RNA를 분리하고 real time PCR로 SCF와 VEGF의 발현을 확인하였다.
그 결과, 당뇨 망막병증을 유도한 랫드에서 기간이 경과함에 따라 SCF와 VEGF의 발현량이 증가함을 확인함으로써(도 5의 A 및 B), SCF가 혈관 투과성 관련 질환인 당뇨 망막병증을 야기시키는 중요한 요인으로 작용함을 확인하였다.
실시예 11: 당뇨 망막병증 동물모델에서의 혈관 투과성 증가 및 SCF 억제 항체에 의한 감소효과 확인
상기 실시예 10에서 당뇨 망막병증을 유도한 랫드의 망막에 SCF 억제 항체(anti-SCF IgG: Polyclonal anti-SCF neutralization antibody: R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 주입하였다. 2주일 후, 마취한 랫드의 심장 내로 FITC-표지된 덱스트란((Fluorescein isothiocyanate- dextran)을 주사(intracardiac FITC-Dextran injection)하여 혈액을 따라 형광물질이 흐르도록 하였다. 30분 후, 랫드의 망막을 꺼내어 분리한 후 평편 마운팅(flat mounting)을 하여 형광현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, STZ를 주사하여 당뇨 망막병증을 유도한 랫드에서는 망막혈관의 투과성이 증가하여 혈관 주변 조직으로 형광물질이 누출된 것을 확인하였으며, 이러한 효과는 SCF 억제 항체를 처리함으로써 현저히 감소하는 것을 확인함으로써(도 6), SCF 억제 항체가 당뇨 망막병증의 치료에 효과가 있음을 확인하였다.
상기와 같은 결과들은 본 발명의 SCF가 혈관 투과성을 증가시키는 조절제로 사용될 수 있음을 시사하는 결과이며, SCF 또는 그 수용체인 C-Kit을 억제하는 물질을 사용할 경우 혈관 투과성 관련 질환을 치료 또는 예방할 수 있음을 시사하는 결과이다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Composition for preventing or treating vascular permeability disease comprising inhibitors of stem cell factor or a receptor thereof <130> PA120309/KR <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA <400> 1 aauggaagac cacucccacu c 21 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Kit siRNA <400> 2 ucauucuuga ugucucugg 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Kit siRNA <400> 3 uuugaguuca gacaugagg 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Kit siRNA <400> 4 ucuuauaaag ugcagcuuc 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C-Kit siRNA <400> 5 uacaaugcca uucugaagc 19 <210> 6 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eNOS siRNA <400> 6 accggaacag cacaagaguu au 22 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eNOS siRNA <400> 7 agcugcaagg auucagcauu au 22 <210> 8 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eNOS siRNA <400> 8 acggaacagc acaagaguua ua 22 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eNOS siRNA <400> 9 ccaggaguau cuuaccugua aa 22

Claims (11)

  1. SCF(stem cell factor) 또는 이의 수용체를 억제하는 물질을 포함하는 혈관 투과성 관련 질환의 치료 또는 예방용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SCF의 수용체는 C-Kit인 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SCF 또는 이의 수용체를 억제하는 물질은 SCF 또는 이의 수용체에 특이적인 siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 또는 항체인 것인 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 SCF의 수용체를 억제하는 물질은 C-Kit siRNA 또는 SCF 수용체 억제 항체인 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 C-Kit siRNA는 서열번호 2 내지 5로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 가지는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 혈관 투과성 관련 질환은 당뇨 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 혈관신생(choroidal neovascularization), 녹내장성 망막색소변성(glaucoma retinitis pigmentosa), 미숙아 망막증(ROP: retinopathy of prematurity), 노인성 황반 변성(age-related macular degeneration), 녹내장, 각막 이영양증(corneal dystrophy), 망막층간분리(retinoschises), 스타가르트병(Stargardt's disease), 상염색체 우성 드루젠(autosomal dominant druzen), 베스트의 황반 이영양증(Best's macular dystrophy), 낭포황반부종(cystoid macular edema), 허혈성 망막병증(ischemic retinopathy), 염증-유도 망막 퇴행성 질환(inflammation-induced retinal degenerative disease), X염색체-관련 연소기 망막층간분리(X-linked juvenile retinoschisis), 말라티아 레벤티네스(Malattia Leventinese; ML), 도인 벌집 모양 망막 이영양증(Doyne honeycomb retinal dystrophy) 및 혈관 내피 세포 관련 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 혈관 투과성 관련 질환의 치료는 혈관 내피 세포의 투과성을 억제하여 이루어지는 것인 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 이용하여 생체 외에서(in vitro) SCF 또는 이의 수용체의 발현을 조절하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성의 조절 방법.
  9. (a) 혈관 투과성 관련 질환 의심환자의 분리된 시료에 치료제 후보물질을 처리하는 단계; 및
    (b) SCF 또는 이의 수용체의 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 혈관 투과성 관련 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 SCF의 수용체는 C-Kit인 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 C-Kit의 인산화 수준을 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.

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